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ES2977951T3 - Sistemas, aparatos y métodos para clasificación de células y citometría de flujo - Google Patents

Sistemas, aparatos y métodos para clasificación de células y citometría de flujo Download PDF

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ES2977951T3
ES2977951T3 ES16815271T ES16815271T ES2977951T3 ES 2977951 T3 ES2977951 T3 ES 2977951T3 ES 16815271 T ES16815271 T ES 16815271T ES 16815271 T ES16815271 T ES 16815271T ES 2977951 T3 ES2977951 T3 ES 2977951T3
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ES16815271T
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Jose M Morachis
Sung Hwan Cho
Zhe Mei
Phillip Poonka
Constance Ardila
Gerardo Narez
William Alaynick
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NANOCELLECT BIOMEDICAL Inc
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Abstract

Un sistema incluye una cámara de clasificación y un canal de fluido en comunicación fluida con la cámara de clasificación. Una bomba peristáltica está en comunicación fluida con el canal de fluido para bombear fluido a través del canal de fluido hacia la cámara de clasificación a un caudal de fluido. Un amortiguador de fluido está en comunicación fluida con el canal de fluido de muestra. El amortiguador de fluido incluye un gas y reduce las variaciones en el caudal de fluido mediante la compresión y expansión del gas en respuesta al flujo de fluido en el canal de fluido. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Sistemas, aparatos y métodos para clasificación de células y citometría de flujo
Antecedentes
Los instrumentos de citometría de flujo y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés) normalmente utilizan bombas para hacer fluir muestras biológicas o partículas suspendidas en una solución a través del instrumento. Comúnmente se usa una segunda corriente de fluido de envoltura (típicamente solución salina tamponada con fosfato) para el enfoque hidrodinámico de la corriente de muestra. Dado que la clasificación de células puede ser sensible al tiempo, y que el tiempo de tránsito de las células depende del caudal, es deseable que los caudales de estos sistemas fluídicos sean estables para lograr un rendimiento de clasificación satisfactorio.
Los instrumentos FACS tradicionales se basan en costosos y sofisticados sistemas de bombas accionadas por alta presión para forzar la muestra y los fluidos envolventes a través de una cubeta o boquilla. Estas bombas accionadas por presión suelen ser muy sensibles, voluminosas y costosas, y no permiten calcular la concentración de células que se analizan. Otro problema con las bombas tradicionales accionadas por presión en los sistemas FACS consiste en que los componentes fluídicos pueden ser demasiado costosos de reemplazar en cada experimento y, por lo general, se necesita una limpieza exhaustiva. Esto genera riesgos de contaminación y/o pérdida de tiempo limpiando y enjuagando los instrumentos entre ejecuciones.
Problemas similares dificultan el uso de otros sistemas de bombas en instrumentos FACS. Por ejemplo, es posible que no se utilice un sistema sofisticado de bombas accionadas por presión con retroalimentación de caudal en un sistema FACS ejemplar porque las muestras entrarían en contacto con los sensores de caudal, que generalmente son costosos y no desechables, y los contaminarían. Las bombas de jeringa pueden ser una alternativa, ya que todos los componentes de las bombas de jeringa se pueden desechar fácilmente. Sin embargo, un problema con las bombas de jeringa consiste en que la utilización es típicamente compleja y requiere mucho uso, ya que el usuario puede necesitar fijar una conexión Luer a una jeringa, sujetar la jeringa a la bomba, ajustar el émbolo de la bomba y/o similares.
El documento US 8,366,667 B2 describe un sistema de infusión de fluidos médicos que incluye: una vía de fluido para transportar un flujo pulsátil de fluido; un elemento amortiguador en comunicación con la vía de fluido, estando configurado el elemento amortiguador para amortiguar activamente las fluctuaciones de presión del flujo pulsátil para suavizar el flujo pulsátil de fluido, siendo el elemento amortiguador operable en cualquier orientación; y un sensor de flujo de fluido dispuesto a lo largo de la vía de fluido aguas abajo del elemento amortiguador para medir el caudal del flujo de fluido suavizado.
El documento US 7,258,774 B2 describe un dispositivo microfluídico que comprende bombas, válvulas y amortiguadores de oscilación de fluido. En un dispositivo empleado para clasificación, la bomba hace fluir una entidad a lo largo de un canal de flujo a través de una región de detección hasta una unión.
El documento US 8,277,764 B2 describe un único cartucho desechable para realizar un proceso en una partícula, tal como clasificación de partículas, que encapsula todas las superficies de contacto con fluidos en el cartucho para su uso con tecnología de procesamiento de partículas microfluídicas.
El documento US 2011/0229872 A1 describe un dispositivo microfabricado para clasificar células en función de una característica deseada, por ejemplo las células marcadas con un indicador se pueden clasificar según la presencia o el nivel de un indicador en las células.
El documento US 8,715,573 B2 describe un sistema fluídico que incluye una bomba de envoltura para bombear fluido de envoltura desde un contenedor de envoltura a través de un puerto de muestra hacia una zona de interrogación y una bomba de desechos para bombear el fluido de envoltura y un fluido de muestra como fluido de desecho desde la zona de interrogación a un contenedor de desechos, y un procesador para calcular una ventana de tiempo basada en el caudal del fluido de muestra.
Compendio
La invención proporciona un sistema (600), que comprende:
un canal microfluídico en comunicación fluida con una cámara (710) de clasificación, un canal (610) de fluido de envoltura y un canal (720) de fluido de muestra; una bomba (525) de fluido de muestra en comunicación fluida con el canal (720) de fluido de muestra, estando configurada la bomba (525) de fluido de muestra para bombear fluido de muestra a través del canal (720) de fluido de muestra a la cámara (710) de clasificación con un caudal de fluido de muestra;
una bomba peristáltica (535) de envoltura en comunicación fluida con el canal (610) de fluido de envoltura, estando configurada la bomba peristáltica (535) de envoltura para bombear un fluido a través del canal (610) de fluido de envoltura con un caudal de fluido de envoltura; y
un amortiguador (620) de fluido de envoltura que incluye un gas y que está en comunicación fluida con el canal (610) de fluido de envoltura, estando configurado el amortiguador (620) de fluido de envoltura para reducir las variaciones en el caudal de fluido de envoltura mediante la compresión y expansión del gas en respuesta al flujo de fluido en el canal (610) de fluido de envoltura.
En algunas realizaciones, un cartucho desechable para un sistema de clasificación de células incluye un sustrato. El cartucho desechable también incluye una cámara de clasificación fabricada en el sustrato. Se fabrica un canal de fluido en el sustrato y en comunicación fluida con la cámara de clasificación para transportar fluido desde una entrada de fluido hasta la cámara de clasificación. El cartucho desechable incluye además un amortiguador de burbujas de fluido fabricado en el sustrato y en comunicación fluida con el canal de fluido para reducir las variaciones en el caudal del fluido desde la entrada de fluido hasta la cámara de clasificación a través del canal de fluido.
En algunas realizaciones se divulga un método para cebar un chip microfluídico. El chip microfluídico incluye una entrada en comunicación fluida con una cámara de clasificación a través de un canal microfluídico. El método incluye introducir líquido desgasificado en la cámara de clasificación a través de la entrada y el canal microfluídico. El líquido desgasificado absorbe gas atrapado en la cámara de clasificación.
Debe apreciarse que todas las combinaciones de los conceptos anteriores y conceptos adicionales analizados con mayor detalle más abajo (siempre que dichos conceptos no sean mutuamente inconsistentes) se contemplan como parte de la materia inventiva divulgada en la presente memoria. El alcance de la protección está definido por la materia respectiva de las reivindicaciones adjuntas.
Breve descripción de los dibujos
El experto entenderá que los dibujos tienen principalmente fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la materia inventiva descrita en la presente memoria. Los dibujos no están necesariamente a escala; en algunos casos, varios aspectos de la materia inventiva descrita en la presente memoria pueden mostrarse exagerados o ampliados en los dibujos para facilitar la comprensión de diferentes características. En los dibujos, los caracteres de referencia similares generalmente se refieren a características similares (por ejemplo, elementos funcionalmente similares y/o estructuralmente similares).
La FIG. 1 ilustra un esquema de un sistema de clasificación de células que utiliza bombas peristálticas para bombear fluido de muestra y fluido de envoltura.
La FIG. 2 ilustra un esquema de un sistema de clasificación de células que incluye amortiguadores, según realizaciones.
La FIG. 3A ilustra esquemas de amortiguadores de aire que se pueden usar en el sistema de clasificación de células mostrado en la FIG. 2, según realizaciones.
La FIG. 3B ilustra caudales de sistemas que utilizan amortiguadores de aire mostrados en la FIG. 3A, según realizaciones.
La FIG. 4A ilustra un esquema de amortiguadores de gas externos acoplados a canales de fluido para sistemas de clasificación de células, según realizaciones.
La FIG. 4B ilustra un sistema ejemplar que utiliza amortiguadores de aire externos, según realizaciones. La FIG. 5 ilustra amortiguadores de gas integrados para bombas peristálticas que bombean fluido de muestra y envoltura a un sistema de clasificación de células microfluídicas, según realizaciones.
La FIG. 6A ilustra un cartucho de clasificación de células que incluye un amortiguador de gas para bombas peristálticas, según realizaciones.
La FIG. 6B ilustra un cartucho de clasificación de células que incluye un amortiguador de gas para bombas peristálticas, según realizaciones.
La FIG. 7 ilustra un cartucho de clasificación de células con amortiguadores de burbujas en cartucho tanto para el canal de fluido de muestra como para el canal de fluido de envoltura, según realizaciones.
La FIG. 8A ilustra un clasificador de células y un chip clasificador de células microfluídicas de vía cerrada que puede usar bombas peristálticas y amortiguadores de gas, según realizaciones.
La FIG. 8B ilustra un sistema que incluye un chip de detección y clasificación que puede usar bombas peristálticas y amortiguadores de gas, según realizaciones.
La FIG. 9 es un gráfico que muestra caudales en función del tiempo con y sin amortiguadores de gas, según realizaciones.
Las FIGS. 10A y 10B son gráficos de caudal en función del tiempo con amortiguadores de gas externos para fluido de muestra y fluido de envoltura, respectivamente, según realizaciones.
Las FIGS. 11A-11B son gráficos de caudal en función del tiempo con y sin un amortiguador en cartucho para fluido de envoltura, según realizaciones.
Las FIGS. 12A-12B son gráficos de caudal en función del tiempo con y sin un amortiguador en cartucho para fluido de muestra, según realizaciones.
La FIG. 13A ilustra un detector y clasificador de células microfluídicas, según una realización.
La FIG. 13B es un gráfico que ilustra la clasificación usando una bomba peristáltica con un amortiguador de burbujas en cartucho, según realizaciones.
La FIG. 14 ilustra un chip clasificador de células ejemplar, según realizaciones.
Las FIGS. 15A-15B ilustran el cebado del chip clasificador de células de la FIG. 14 con un amortiguador regular, según realizaciones.
Las FIGS. 15C-15D ilustran el cebado del chip clasificador de células de la FIG. 14 con un amortiguador desgasificado, según realizaciones.
La FIG. 16 es un diagrama de flujo que ilustra un proceso de calibración de clasificación automática, según realizaciones.
Las FIGS. 17A-17B ilustran la optimización del posicionamiento y sincronización de la clasificación de partículas, según realizaciones.
Descripción detallada
Las realizaciones descritas en la presente memoria se refieren generalmente a sistemas, aparatos y métodos para citometría de flujo y clasificación de células activadas por fluorescencia y, en algunas realizaciones, a sistemas, aparatos y métodos que abarcan citometría de flujo basada en microfluidos y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), opcionalmente en combinación con uno o más subconjuntos descritos en las mismas.
Los clasificadores de células tradicionales como el FACS Aria (BD) utilizan bombas de presión con líneas fluídicas complicadas que no están diseñadas para ser desechables para cada experimento. Los usuarios de clasificadores de células tradicionales suelen realizar rigurosas etapas de lavado entre experimentos para evitar la contaminación cruzada. Los clasificadores de células basados en microfluidos como el Tyto Cell Sorter (Miltenyi Biotec) o el On-chip Sort (On-chip Biotechnologies) utilizan bombas de presión o de jeringa para tener un caudal constante para la clasificación; sin embargo, estas bombas son más caras.
En algunas realizaciones, el uso de una bomba peristáltica para bombear fluido a células de flujo microfluídico desechable y fluidos tal como se describe en la presente memoria puede simplificar la limpieza y reducir la posibilidad de contaminación cruzada. Las bombas peristálticas son asequibles y pueden permitir la fácil sustitución de cualquier línea fluídica que interactúe con el fluido de muestra. Además, las bombas peristálticas pueden ser relativamente más compactas que las bombas de presión existentes, lo que las hace adecuadas para instrumentos relativamente económicos que están dentro del presupuesto de la mayoría de los laboratorios.
La FIG. 1 ilustra un sistema 100 de clasificación de células, según realizaciones. El sistema 100 incluye una cámara 110 de clasificación (también designada a veces como chip o cartucho de clasificación) en comunicación fluida con un canal 120 de fluido de muestra y un canal 130 de fluido de envoltura. El sistema 100 también incluye una bomba peristáltica 125 configurada para bombear fluido de muestra desde una fuente 126 de fluido de muestra a la cámara 110 de clasificación a través del canal 120 de fluido de muestra. El sistema también incluye una bomba peristáltica 135 configurada para bombear fluido de envoltura desde una fuente 136 de fluido de envoltura hasta la cámara 110 de clasificación a través del canal 130 de fluido de envoltura.
Las bombas peristálticas a veces pueden producir grandes pulsaciones de flujo (también designadas a veces como variaciones de caudales) que pueden afectar al rendimiento del análisis y la clasificación en citómetros de flujo y sistemas FACS. Los citómetros de flujo de mesa (pero no los clasificadores), como el BD Accuri™ C6 de<b>D Biosciences o el citómetro de flujo Xitogen, utilizan bombas peristálticas junto con varias combinaciones de amortiguadores y controles de bomba. Esto puede proporcionar una ventaja en cuanto a ahorro de costos, una interfaz más sencilla y menos mantenimiento. En la Solicitud PCT n.° WO 2013/181453 A2 se describen ejemplos de citómetros de flujo con bombas peristálticas.
Algunas realizaciones descritas en la presente memoria se refieren a bombas peristálticas con componentes fluídicos desechables para su uso en la clasificación de células y/o clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) basada en microfluidos. Algunas realizaciones descritas en la presente memoria se refieren a sistemas fluídicos que usan bombas peristálticas para impulsar el fluido de envoltura y/o el fluido de muestra. En dichos sistemas, los fluidos de muestra y de corte se suministran al cartucho de clasificación de células microfluídicas con caudales constantes para lograr un alto rendimiento de análisis y clasificación de partículas. Los caudales constantes se logran utilizando amortiguadores de fluido, que pueden acoplarse a canales de fluido que suministran el fluido de envoltura y de muestra (también designados como amortiguadores externos) o integrarse en el cartucho de clasificación (también designado como amortiguadores integrados o en cartucho). En algunas realizaciones, los amortiguadores de fluidos pueden llenarse con gas, como aire, gases nobles o cualquier otro gas que sea apropiado. En algunas realizaciones, los amortiguadores de fluido se pueden llenar con un fluido comprimible inmiscible, como gas de agua, que normalmente se produce a partir de gas de síntesis y está compuesto de monóxido de carbono e hidrógeno.
La FIG. 2 muestra un esquema de un sistema 200 de clasificación de células que incluye uno o más amortiguadores para reducir las variaciones del caudal de bombas peristálticas, según realizaciones. El sistema 200 incluye una cámara 210 de clasificación configurada para recibir un primer fluido desde un primer canal 220 de fluido (también designado a veces como un "canal de fluido de muestra") y para recibir un segundo fluido (por ejemplo, un fluido de envoltura) desde un segundo canal 230 de fluido (también designado a veces como un "canal de fluido de envoltura"). Una bomba peristáltica 225 bombea el primer fluido desde una primera fuente 226 de fluido a la cámara de clasificación a través del primer canal 220 de fluido. Un primer amortiguador 228 está acoplado al primer canal 220 de fluido para reducir las variaciones del caudal en el primer canal 220 para suministrar un flujo constante a la cámara 210 de clasificación. De manera similar, otra bomba peristáltica 235 está configurada para bombear el segundo fluido desde una segunda fuente 236 de fluido a la cámara de clasificación a través del segundo canal 230 de fluido, y un segundo amortiguador 238 está acoplado al segundo canal 230 de fluido para reducir las variaciones del caudal en el segundo canal 230.
En funcionamiento, los amortiguadores 228 y 238 en el primer canal 220 de fluido y el segundo canal de fluido, respectivamente, se pueden llenar con gas. En algunas realizaciones, todo el sistema 200 puede lavarse con gas antes de la clasificación de las células. Luego se puede bombear un fluido a través del sistema 200 para atrapar algo de gas dentro de los amortiguadores 228 y 238 y expulsar el exceso de gas. Cuando el primer fluido fluye en el primer canal 220, el primer fluido puede entrar en el primer amortiguador 228 y comprimir el gas en el primer amortiguador 228. En otras palabras, una porción del gas en el primer amortiguador 228 puede quedar atrapada en el amortiguador 228 que forma un callejón sin salida. De esta manera, el primer amortiguador 228 puede ralentizar el flujo del primer fluido en el primer canal 220 de fluido. Dado que el caudal volumétrico del fluido que sale de la bomba peristáltica 225 puede fluctuar periódicamente, el volumen de fluido en el primer amortiguador 228 puede fluctuar proporcionalmente a medida que el gas se comprime o expande debido a cambios en la presión del líquido, lo que amortigua las perturbaciones en el caudal. El segundo amortiguador 238 puede funcionar de manera similar al primer amortiguador 228 tal como se ha descrito más arriba.
De esta manera, los amortiguadores 228 y 238 pueden actuar como un filtro mecánico de paso bajo que puede reducir el intervalo dinámico de caudales (o el intervalo de fluctuaciones en los caudales, o la variación en los caudales, y/o similares). Esta reducción en el intervalo de caudal puede estrechar la distribución de las velocidades de las células/partículas, ya que las células/partículas normalmente fluyen a la misma velocidad que el fluido de muestra. Como resultado de ello, el retraso de tiempo entre la detección de células y la clasificación de células se puede derivar de manera más fiable, mejorando así el rendimiento de clasificación. En algunas realizaciones, la pulsación disminuida puede dar como resultado un enfoque hidrodinámico más confinado de la corriente de fluido de muestra, lo que a su vez puede conducir a valores de coeficiente de variación (CV) más altos en las señales fluorescentes en el sistema de detección.
Los amortiguadores 228 y 238 se pueden llenar con diversos tipos de gases. En un ejemplo, los amortiguadores 228 y 238 se pueden llenar con aire atmosférico. En otro ejemplo, los amortiguadores 228 y 238 pueden llenarse con uno o más gases que no son propensos a reaccionar con el fluido de muestra y/o el fluido de envoltura, tales como, por ejemplo, gases nobles (por ejemplo, helio, neón, argón, xenón y/o combinaciones de los mismos). La presión inicial del gas en los amortiguadores 228 y 238 puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 0.1 atmósferas, 0.2 atmósferas, 0.5 atmósferas, 0.8 atmósferas, 1 atmósfera, 1.2 atmósferas, 1.5 atmósferas, o cualquier otra presión que sea apropiada, incluyendo todos los valores y subintervalos intermedios.
En algunas realizaciones, al menos uno de los amortiguadores 228 y 238 puede estar abierto al canal de fluido respectivo (220 o 230) de modo que los fluidos de muestra y envoltura puedan entrar libremente en los amortiguadores 228 y 238. En algunas realizaciones, al menos uno de los amortiguadores 228 y 238 se puede separar del canal 220 o 230 correspondiente mediante un separador. El separador puede incluir membranas flexibles o plegables que permiten fácilmente la expansión y contracción del volumen dentro de los amortiguadores 228 y 238 sin fugas de gas dentro de los amortiguadores 228 y 238.
En algunas realizaciones, uno o más de los amortiguadores 228 y 238 pueden estar hechos de materiales desechables. En algunas realizaciones, los amortiguadores 228 y 238 pueden incluir silicona y/o silicona reforzada con fibra de vidrio. En algunas realizaciones, los amortiguadores 228 y 238 pueden estar hechos de acrílico (también designado como grupo acriloílo, prop-2-enoílo o acrililo). En algunas realizaciones, los amortiguadores 228 y 238 pueden incluir polidimetilsiloxano (PDMS). En otro ejemplo más, los amortiguadores 228 y 238 pueden incluir poli(metacrilato de metilo) (PMMA). El PMMA suele ser transparente a la luz visible y tiene baja fluorescencia, lo que facilita la detección óptica y la clasificación de células, así como la obtención de imágenes microscópicas de las células. En algunas realizaciones, los tubos en el primer canal 220 y el segundo canal 230 también pueden estar hechos de materiales desechables.
La FIG. 3A muestra esquemas de amortiguadores ejemplares (indicados colectivamente con el carácter de referencia 300) que se pueden usar para reducir las variaciones del caudal en citómetros de flujo que usan bombas peristálticas tal como se describe en la presente memoria. Los amortiguadores 300 incluyen ocho configuraciones ejemplares, no limitantes, numeradas del 1 al 8. La primera configuración n.° 1 incluye un canal 310a de fluido (por ejemplo, similar al canal de fluido de muestra o al canal de fluido de envoltura) y una cámara 320a de gas acoplada al canal 310a de fluido para funcionar como un amortiguador. La cámara 320a de gas tiene una forma sustancialmente cuadrada. En una realización ejemplar, el volumen de la cámara 320a de gas puede ser de aproximadamente 92 mm3. La segunda configuración n.° 2 incluye un canal 310b de fluido y una cámara 320b de gas acoplada al canal 310b de fluido. La cámara 320b de gas tiene forma rectangular. En una realización ejemplar, la cámara 320b de gas tiene un volumen de aproximadamente 369 mm3. La tercera configuración n.° 3 incluye un canal 310c de fluido y una cámara 320c de gas acoplada al canal 310c de fluido que tiene forma cuadrada. En una realización ejemplar, el volumen de la cámara 320s de gas puede ser de aproximadamente 184 mm3. Para estas tres configuraciones n.° 1 a n.° 3, las cámaras 320a a 320c de gas están acopladas casi directamente a los canales 310a a 310c de fluido, respectivamente. En otras palabras, los tamaños y/o volúmenes de los conectores entre las cámaras 320a a 320c de gas y los canales 310a a 310c de fluido correspondientes pueden ser insignificantes.
Las configuraciones cuarta a sexta n.° 4 a n.° 6 mostradas en la FIG. 3A incluyen cámaras de gas que tienen diferentes formas. La cuarta configuración n.° 4 incluye un canal 310d de fluido y una cámara 320d de gas acoplada al canal 310d de fluido. La mayor parte de la cámara 320d de gas tiene forma cuadrada pero la cámara 320d de gas también incluye una porción 325d de cuello que conecta la mayor parte de la cámara 320d de gas con el canal 310d de fluido. En una realización ejemplar, la cámara 320d de gas tiene un volumen de 92 mm3, que puede ser igual que el volumen de la cámara 310a de gas, pero la porción 325d de cuello tiene un volumen no despreciable. De manera similar, la quinta configuración n.° 5 incluye un canal 310e de fluido y una cámara 320e de gas acoplada al canal 310e de fluido. La cámara 320e de gas incluye una porción 325e de cuello para conectar la porción principal de la cámara 320e de gas con el canal 310e de fluido. En una realización ejemplar, la cámara 320e de gas tiene un volumen de aproximadamente 369 mm3. La sexta configuración n.° 6 incluye un canal 310f de fluido y una cámara 320f de gas acoplada al canal 310f de fluido. La cámara 320f de gas incluye una porción 325f de cuello para conectar la porción principal de la cámara 320f de gas con el canal 310f de fluido. En una realización ejemplar, la cámara 320f de gas tiene un volumen de aproximadamente 184 mm3.
La séptima configuración n.° 7 incluye un canal 310g de fluido y dos cámaras 320g de gas acopladas al canal 310g de fluido en serie. En una realización ejemplar, el volumen total de las dos cámaras 320g de gas es de aproximadamente 368 mm3. En una realización, cada cámara de gas de las dos cámaras 320g de gas funciona como un amortiguador. En otra realización, las dos cámaras 320g de gas funcionan colectivamente como un amortiguador. La octava configuración n.° 8 incluye un canal 310h de fluido y tres cámaras 320h de gas acopladas al canal 310h de fluido en serie. El volumen total de las tres cámaras 320h de gas es de aproximadamente 552 mm3. Las cámaras 320g y 320h de gas están dispuestas en el mismo lado del canal 310g y 310h de fluido correspondiente con fines ilustrativos. En la práctica, las cámaras de gas pueden estar dispuestas de forma simétrica o asimétrica a ambos lados de los canales de fluido. Además, el número de cámaras de gas también puede ser mayor que tres (por ejemplo, 5 cámaras de gas, 8 cámaras de gas, 10 cámaras de gas o más).
El volumen de las cámaras 320a a 320h de gas, en la práctica, puede ser diferente de los volúmenes mostrados en la FIG. 3A. Por ejemplo, el volumen de las cámaras 320a a 320h de gas puede ser de aproximadamente 60 mm3 a aproximadamente 600 mm3 (por ejemplo, aproximadamente 60 mm3, aproximadamente 80 mm3, aproximadamente 100 mm3, aproximadamente 120 mm3, aproximadamente 150 mm3, aproximadamente 180 mm3, aproximadamente 200 mm3, aproximadamente 240 mm3, aproximadamente 280 mm3, aproximadamente 300 mm3, aproximadamente 350 mm3, aproximadamente 400 mm3, aproximadamente 450 mm3, aproximadamente 500 mm3, aproximadamente 550 mm3, y aproximadamente 600 mm3, incluyendo todos los valores y subintervalos intermedios).
Las secciones transversales bidimensionales (2D) de las cámaras 320a a 320h de gas mostradas en la FIG.
3A tienen una forma rectangular (o cuadrada) con fines ilustrativos. Se puede emplear cualquier forma adecuada de los amortiguadores 320a-320h dependiendo, por ejemplo, de las limitaciones de espacio en el citómetro de flujo resultante y/o del factor de forma deseado del cartucho de clasificación. Por ejemplo, las secciones transversales 2D de las cámaras 320a a 320h de gas pueden ser ovaladas, redondas, poligonales o cualquier otra forma conocida en la técnica. En el espacio tridimensional (3D), las cámaras 320a a 320h de gas pueden ser, por ejemplo, cilíndricas, cuboides, esféricas o cualquier otra forma adecuada conocida en la técnica.
Tal como se describe en la presente memoria, las cámaras 320a a 320h de gas pueden reducir las variaciones de caudal del fluido que se propaga en los canales 310a a 310h de fluido correspondientes. En algunas realizaciones, el rendimiento de las cámaras 320a a 320h de gas se puede caracterizar por la variación del caudal después de usar las cámaras 320a a 320h de gas. Por ejemplo, las variaciones de los caudales pueden ser inferiores al 10 % del caudal medio (por ejemplo, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 8 %, aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 3 %, aproximadamente el 2 %, aproximadamente el 1 %, o menos del 1 %, incluyendo todos los valores y subintervalos intermedios). El caudal medio que se puede implementar en el sistema 300 puede ser, por ejemplo, de aproximadamente 1 pl/min a aproximadamente 10 ml/min (por ejemplo, 1 pl/min, 5 pl/min, 10 pl/min, 20 pl/min, 30 pl/min, 50 pl/min, 75 pl/min, 100 pl/min, 150 pl/min, 200 pl/min, 250 pl/min, 300 pl/min, 400 pl/min, 500 pl/ min, 600 pl/min, 700 pl/min, 800 pl/min, 900 pl/min, 1 ml/min, 2 ml/min, 3 ml/min, 5 ml/min, 7.5 ml/min o 10 ml /min, incluyendo todos los valores y subintervalos intermedios).
Otro parámetro que también puede caracterizar el rendimiento de las cámaras 320a a 320h de gas es la reducción de las variaciones de caudal inducidas por el uso de las cámaras 320a a 320h de gas. Las cámaras 320a a 320h de gas se pueden configurar para reducir las variaciones de los caudales en más del 80 % en comparación con las variaciones de los caudales sin ninguna cámara de gas (por ejemplo, más del 80 %, más del 85 %, más del 90 %, más del 92.5 %, más del 95 %, más del 97.5 %, más del 98 %, más del 99 % o más del 99.5 %, incluyendo todos los valores y subintervalos intermedios). Por ejemplo, los caudales después de las bombas peristálticas pueden estar entre 0 y 200 pl/min, es decir, la variación de los caudales es de aproximadamente 200 pl/min. Después de usar las cámaras 320a a 320h de gas, los caudales pueden ser de aproximadamente 110 pl/min a aproximadamente 115 pl/min, es decir, la variación de los caudales es de aproximadamente 5 pl/min, correspondiente a una reducción del 97.5 %.
La FIG. 3B ilustra los caudales medidos en la quinta ("Número 5") y octava ("Número 8") configuraciones mostradas en la Figura 3A. Para comparación, los caudales en un sistema sin amortiguadores también se incluyen en la FIG. 3B ("Autónomo"). Se puede ver que los tres sistemas tienen caudales medios similares de aproximadamente 12 pl/min, pero la quinta configuración tiene el rendimiento más estable (es decir, la menor cantidad de variaciones de flujo como lo indica la barra de error). En algunas realizaciones, un mayor volumen del amortiguador puede conducir a un mejor rendimiento, ya que el volumen del amortiguador determina, al menos en parte, la cantidad de gas atrapado que se puede comprimir y expandir para amortiguar las pulsaciones. La quinta configuración también demuestra un rendimiento sólido en una amplia gama de caudales (por ejemplo, entre 1 pl/min y 1 ml/min).
La FIG. 4A ilustra un sistema 400 que utiliza amortiguadores externos para regular los caudales después de bombas peristálticas, según realizaciones. El sistema 400 incluye un chip objetivo 410 que recibe fluido (por ejemplo, fluido de muestra y/o fluido de envoltura) suministrado por un canal 420 de fluido. El chip objetivo 410 puede ser una cámara de clasificación, una cámara de detección y/o cualquier otro dispositivo que reciba fluido en caudales constantes. Una bomba peristáltica 425 bombea el fluido hacia el chip objetivo 410 a través de dos cámaras 428. El canal 420 de fluido también puede incluir un filtro 430 en línea opcional para esterilizar o clarificar medios de cultivo.
La FIG. 4B ilustra un sistema ejemplar mostrado esquemáticamente en la FIG. 4A. En este ejemplo, los amortiguadores 428 se pueden construir usando accesorios fluídicos (por ejemplo, Nordson Medical, Fort Collins, CO). Más específicamente, el extremo macho de un Acoplador Estilo Rosca Luer Macho a Luer Hembra (LC78-1) se puede conectar al segmento vertical de un Luer hembra T estilo garra (por ejemplo, FTLT-1). El extremo hembra del mismo Acoplador Estilo Rosca Luer Macho a Luer Hembra se puede tapar con un Tapón de Anillo de Bloqueo Integral Luer Macho (por ejemplo, LP4-1) para crear una cámara que pueda atrapar gases. También se puede construir un segundo conjunto de accesorios idéntico para producir una segunda cámara de gas. Se puede utilizar un Acoplador Luer de Deslizamiento Macho (por ejemplo, MTLCS-1) para conectar los dos conjuntos con los segmentos verticales tapados, ambos orientados hacia arriba. Se puede conectar un Filtro de Jeringa Acrodisc de 0.2 |jm (por ejemplo, 4612, PALL Life Sciences, Port Washington, NY) a un extremo del conjunto combinado. Dos Anillos de Bloqueo Integrales Luer Macho a accesorios de Lengüeta (1/16") de la Serie 500 (MTLL004-1) pueden conectarse a ambos extremos libres del conjunto resultante. Se pueden usar amortiguadores 428 externos sin el filtro 420 para el fluido de muestra. Se puede conectar un tubo de silicona de entrada a la lengüeta en el extremo del filtro del amortiguador 428 de aire, mientras que se puede conectar un tubo de silicona de salida a la lengüeta en el extremo de salida del amortiguador 428 de aire.
La FIG. 5 ilustra un sistema 500 que utiliza uno o más amortiguadores en cartucho para regular los caudales de fluido suministrados por bombas peristálticas. El sistema 500 incluye un cartucho 510 configurado para recibir fluido de muestra desde un canal 520 de muestra y para recibir fluido de envoltura desde un canal 530 de envoltura. Una bomba peristáltica 525 en el canal 520 de muestra bombea el fluido de muestra desde una fuente 526 de fluido de muestra hacia el cartucho 510 y otra bomba peristáltica 535 en el canal 530 de envoltura bombea el fluido de envoltura desde una fuente 536 de fluido de envoltura hacia el cartucho 510. El sistema 500 mostrado en la FIG. 5 es diferente del sistema 100 mostrado en la FIG. 1 en que el cartucho 510 incluye amortiguadores integrados (véanse, por ejemplo, la FIG. 6A, la FIG. 6B o la FIG. 7) para regular los caudales del fluido de muestra y de envoltura.
La FIG. 6A ilustra un sistema 600 e ilustra cómo se puede modificar el espacio vacío en un diseño de sustrato existente para construir/incluir amortiguadores de gas. El sistema 600 incluye un sustrato 601 en donde se fabrica espacio vacío para construir un canal 610 de fluido y una cámara 620 de gas ("bolsa de aire") en comunicación fluida con el canal 610 de fluido. El sustrato 601 puede estar hecho de materiales desechables y de bajo costo tales como silicona, silicona reforzada con fibra de vidrio, acrílico, PDMS, PMMA o cualquier otro material conocido en la técnica. En un ejemplo, la cámara 620 de gas se puede moldear en el cartucho 610 a lo largo del canal 610 de fluido. En otro ejemplo, la cámara 620 de gas se puede fabricar grabando el sustrato 601. Los parámetros de la cámara 620 de gas (por ejemplo, volumen, reducción de las variaciones del caudal, etc.) pueden ser sustancialmente similares a los de las cámaras 320a a 320h de gas mostradas en la FIG. 3A y descritas más arriba.
La FIG. 6B es una fotografía de un cartucho de clasificación de células ejemplar que incluye amortiguadores integrados mostrado esquemáticamente en la FIG. 6A. El uso de amortiguadores integrados (también designados como amortiguadores en cartucho) puede reducir el tamaño y el costo del amortiguador mediante el uso del espacio vacío en el cartucho de chip en lugar de fabricar amortiguadores de gas externos adicionales. El principio de funcionamiento del amortiguador de gas en el cartucho integrado puede ser idéntico al de los amortiguadores externos arriba descritos: el gas queda atrapado en una bolsa encima del canal de fluido y se comprime para amortiguar las pulsaciones del caudal.
La FIG. 7 ilustra un citómetro 700 de flujo ejemplar que utiliza amortiguadores en chip para regular los caudales de fluidos, tales como, por ejemplo, fluidos de muestra y de envoltura. El citómetro 700 incluye un sustrato 701, en donde se fabrica una cámara 710 de clasificación. La cámara 710 de clasificación recibe fluido de muestra, incluidas las células que han de ser clasificadas, desde un canal 720 de muestra y recibe fluido de envoltura desde un canal 730 de envoltura. El canal 720 de muestra incluye un amortiguador 728 de fluido de muestra en comunicación fluida con el canal 720 de fluido de muestra. El canal 730 de envoltura incluye de manera similar un amortiguador 738 de fluido de envoltura en comunicación fluida con el canal 730 de fluido de envoltura. Los dos amortiguadores 728 y 738 (también designados como amortiguadores de burbujas) incluyen espacios vacíos definidos por el sustrato 701 y, por lo tanto, están integrados en el sustrato 701 con alta compactibilidad. Después de la clasificación, diferentes tipos de células en el fluido de muestra se dirigen a tres puertos 742a, 742b y 742c de salida diferentes en un canal 740 de salida. En la práctica, el número de puertos de salida (también el número de diferentes tipos de células que pueden distinguirse mediante el sistema 700 de clasificación) puede ser mayor o menor que tres. El sistema 700 mostrado en la FIG. 7 se fabrica en un solo chip y, por tanto, puede ser muy compacto. Además, el sustrato 701 puede estar hecho de materiales desechables y de bajo costo, evitando así una limpieza extensa entre ejecuciones.
La FIG. 8A muestra un citómetro 800 de flujo ejemplar en donde se pueden emplear amortiguadores de gas descritos en la presente memoria para estabilizar los caudales, tales como los de fluidos de muestra y de envoltura. El citómetro 800 de flujo incluye una cámara 810 de clasificación, donde la muestra 801 de fluido, incluidas las células de interés, se intercala entre dos corrientes de fluido 802a y 802b de envoltura. La relación de presión de las dos corrientes de fluido 820a y 802b de envoltura y el fluido 801 de muestra puede ser consistente y estable para un análisis y clasificación adecuados a lo largo del canal principal. Un factor que puede influir en esta relación de presión puede consistir en los caudales del fluido de muestra y de envoltura. Con este fin se pueden usar bombas peristálticas en combinación con amortiguadores de gas arriba descritos para suministrar el fluido 801 de muestra y el fluido 802a y 802b de envoltura para lograr caudales constantes. Una vez que se detecta una célula de interés, la cámara de clasificación puede usar un actuador piezoeléctrico 802 para desviar el fluido 801 de muestra hacia un canal 830 de salida designado. En la Patente de EE.UU. n.° 9,134,221 se puede encontrar más información sobre citómetros de flujo que utilizan clasificación piezoeléctrica.
La FIG. 8B ilustra un chip 910 de detección y clasificación ejemplar que puede emplear uno o más amortiguadores tal como se describe en la presente memoria. Un chip externo 901 sujeta y/o se acopla generalmente de manera fluida al chip 910 de detección y clasificación. En algunas realizaciones, el chip 910 de detección y clasificación puede ser extraíble del chip externo 901. El chip 910 de detección y clasificación incluye una unión 913 de clasificación donde diferentes células se dirigen a diferentes canales de salida mediante un actuador piezoeléctrico 912. En algunas realizaciones, el actuador piezoeléctrico 912 puede doblarse hacia arriba en respuesta a un voltaje positivo aplicado al actuador piezoeléctrico 912 y doblarse hacia abajo en respuesta a un voltaje negativo aplicado al actuador piezoeléctrico 912. Al doblarse en diferentes direcciones, el actuador piezoeléctrico 912 puede dirigir la o las células en un canal de entrada del chip 910 hacia diferentes canales de salida del chip 910.
El chip externo 901 incluye un puerto 920a de entrada de muestra para transmitir fluido de muestra al sistema 900 y un puerto de entrada de envoltura para transmitir fluido de envoltura al sistema 900. El chip externo 901 incluye además un puerto 925 de salida de purga para eliminar el fluido de purga después, por ejemplo, de que el fluido de purga limpie el sistema 900. Tres puertos 930a-930c de salida están dispuestos en el borde del chip externo 901 para recibir células desde la unión 913 de clasificación y entregar las células recibidas. Los puertos 930 de salida incluyen una salida 930a de tipo A, una salida no clasificada 930c y una salida 930b de tipo B. En algunas realizaciones, la salida 930a de Clasificación A y la salida 930b de Clasificación B reciben células de la unión de clasificación cuando el actuador piezoeléctrico 912 se dobla hacia arriba y hacia abajo, respectivamente, y la salida no clasificada 930c puede recibir células cuando el actuador piezoeléctrico 912 está en su estado natural sin voltaje aplicado. Dicho de otro modo, el chip externo 901 puede tener formados en su interior canales fluídicos (no mostrados) que acoplan los puertos 920a-920b de entrada, el puerto 925 de salida de purga y los puertos 930a-930c de salida posterior a la clasificación a los respectivos puertos de detección y al chip 910 de clasificación. El uso de un chip 910 de detección y clasificación reemplazable puede evitar la contaminación de muestra a muestra.
La FIG. 9 ilustra caudales medidos con y sin amortiguadores de gas en sistemas que utilizan bombas peristálticas. Cuando el tubo de bomba peristáltica está conectado directamente al chip de clasificación sin un amortiguador de gas, se observa una pulsación severa (línea "Sin Amortiguador") con un sensor de caudal (por ejemplo, Fluigent, París) situado aguas abajo en serie con la línea fluídica. Esta pulsación de caudal varía de 0 a más de 200 pl/min. Cuando se conecta un amortiguador de gas entre la bomba y el chip, el intervalo de pulsación de caudal cae a 110 a 113 pl/min (línea "Amortiguador Externo"), lo que demuestra una reducción significativa de las variaciones de los caudales.
Las FIGS. 10A-10B son gráficos de caudales en función del tiempo con amortiguadores de gas externos para el fluido de muestra y el fluido de envoltura, respectivamente. Los análisis repetidos de los caudales tanto del fluido de envoltura como del fluido de muestra muestran una reducción constante de la pulsación cuando se utilizan amortiguadores de gas. En estos experimentos, el caudal medio del fluido de envoltura es de aproximadamente 120 pl/min y el caudal medio del fluido de muestra es de aproximadamente 20 pl/min. En ambos casos, las variaciones resultantes de los caudales son inferiores a 5 pl/min. Esta reducción en la variación del caudal puede permitir que los sistemas de clasificación de células utilicen bombas peristálticas sin sacrificar el rendimiento de la función de clasificación.
Las FIGS. 11A-11B son gráficos de caudales en función del tiempo con y sin un amortiguador en cartucho para el fluido de envoltura. Sin amortiguadores en cartucho, los caudales del fluido de envoltura después de la bomba peristáltica oscilan entre 0 y aproximadamente 145 pl/min a una frecuencia de oscilación de aproximadamente 40 ciclos por minuto. La inclusión de amortiguadores en cartucho en el sistema estabiliza sustancialmente el caudal en alrededor de 115 pl/min, con una variación inferior a 5 pl/min.
Las FIGS. 12A-12B son gráficos de caudal en función del tiempo con y sin un amortiguador en cartucho para el fluido de muestra. Sin amortiguadores en cartucho, los caudales del fluido de muestra después de la bomba peristáltica oscilan entre 0 y aproximadamente 35 pl/min a una frecuencia de oscilación de aproximadamente 6 ciclos por minuto. Además, también se producen algunas oscilaciones de alta frecuencia de los caudales dentro de cada ciclo. La inclusión de amortiguadores en cartucho en el sistema estabiliza sustancialmente el caudal en alrededor de 25 pl/min, con una variación inferior a 3 pl/min.
La FIG. 13A ilustra un enfoque para la verificación de la clasificación, e ilustra un detector/clasificador microfluídico 1500 (por ejemplo, estructural y/o funcionalmente similar a aspectos del sistema 100) que incluye un mecanismo sensor (por ejemplo, caracteres de referencia 1514A-1514C, descrito con mayor detalle más abajo) en uno o más canales fluídicos 1510A-1510C de derivación aguas abajo de una unión 1511 de clasificación de partículas. En algunas realizaciones, la combinación del uso de la detección óptica en una ubicación de clasificación previa y la detección (por ejemplo, detección óptica, detección basada en impedancia y/o similares) en una ubicación de clasificación posterior en un detector microfluídico se puede usar para proporcionar un funcionamiento mejor controlado para mediciones de citometría de flujo más eficientes. En la realización ilustrada, la detección posterior a la clasificación se puede usar para verificar si una clasificación de partículas deseada realizada por el actuador en la unión l5 l1 de clasificación de partículas se ejecuta correctamente. En la realización ilustrada, la detección posterior a la clasificación se puede utilizar como entrada para operar una válvula posterior a la clasificación.
En algunas realizaciones, la realización de la FIG. 13A incluye una estructura de verificación de derivación (por ejemplo, 1514A) que está acoplada a uno de los canales fluídicos de derivación (por ejemplo, el canal 1510a ) para recibir luz desde y/o detectar variación de impedancia en el canal fluídico de derivación y para producir una verificación de derivación que se puede utilizar para verificar si el actuador dirige una partícula objetivo hacia el canal fluídico de derivación. En algunas realizaciones se pueden implementar dos o más de dichas estructuras de verificación de derivación. En la realización de la FIG. 13A, los tres canales fluídicos de derivación 1510A-1510C tienen dichos módulos 1514A-1514C de detección de verificación. En otras realizaciones, algunas derivaciones pueden tener dichas estructuras de verificación, mientras que otras derivaciones no.
En una realización ejemplar de la FIG. 13A, el detector óptico 1520 está ubicado para recibir luz que incluye al menos la o las señales ópticas del módulo 1512 de detección de partículas y la señal óptica de verificación de derivación de los módulos 1514A-1514C de detección de verificación. En algunas realizaciones, un detector óptico produce una señal de detector que transporta información contenida en la luz recibida. El mecanismo de procesamiento de señales en el módulo 1524 de control del clasificador de partículas extrae información de la señal óptica de verificación de derivación para producir un indicador que verifica si el actuador dirige una partícula objetivo hacia el canal fluídico de derivación. En algunas realizaciones, independientemente de si se usa verificación basada en óptica o verificación basada en impedancia, la señal de verificación puede retroalimentarse automáticamente al módulo 1524 de control del clasificador de partículas que puede, en respuesta a una verificación de mal funcionamiento en la clasificación, interrumpir el funcionamiento del sistema (por ejemplo, detener el flujo de muestra entrante y la operación de clasificación mediante el actuador). En algunas realizaciones, el módulo 1524 de control del clasificador de partículas puede generar una señal de alerta (por ejemplo, una señal visual tal como una advertencia emergente y/o una luz parpadeante, una señal de audio tal como un pitido y/o similares) para alertar al operador de un detector microfluídico del mal funcionamiento en la clasificación.
La FIG. 13B es una traza de osciloscopio que muestra las distintas etapas de un proceso de clasificación. En primer lugar se detecta ópticamente el pico más a la izquierda de la señal fluorescente. Los momentos de pico negativo indican la activación del actuador de clasificación (por ejemplo, un actuador piezoeléctrico mostrado en la FIG. 8). El pico más a la derecha es una señal de impedancia de verificación posterior a la clasificación como resultado de una clasificación exitosa. En la solicitud PCT n.° PCT/US2013/065111 se puede encontrar más información sobre la verificación posterior a la clasificación utilizando señales de impedancia.
Si la pulsación del caudal es demasiado alta, se pueden observar pocos eventos de clasificación correctos. Además, la velocidad de desplazamiento de una partícula puede ser menos constante. Por lo tanto, el tiempo de retraso de clasificación, que es el tiempo entre la detección de partículas y la activación de la clasificación de partículas, es correspondientemente menos constante. Esto puede dar como resultado que una partícula se acelere o desacelere, disminuyendo así la eficiencia de clasificación, que puede definirse como la relación entre el número de eventos de clasificación correctos y el número de eventos de detección. Por ejemplo, si el sistema de detección detecta 100 células y 50 células se dirigen al canal de salida correcto, entonces la eficiencia de clasificación es del 50 %. Sin los amortiguadores, la eficiencia de clasificación puede ser pobre y varía mucho entre aproximadamente el 0 y aproximadamente el 70 %. El rendimiento de clasificación se puede mejorar notablemente con bombas peristálticas cuando se utilizan amortiguadores de gas. La FIG. 13 demuestra que se puede lograr una eficiencia de clasificación superior a aproximadamente el 90 % y hasta aproximadamente el 99 %.
En la mayoría de los sistemas microfluídicos puede ser deseable la eliminación completa o sustancialmente completa de las burbujas de aire, ya que las burbujas de aire tienden a degradar la calidad de la señal y pueden dificultar el control del fluido debido a su compresibilidad. Para conseguir un estado de flujo estable y controlable para un rendimiento óptimo del instrumento, por regla general los chips microfluídicos se rellenan previamente con un líquido (un proceso conocido como "cebado") para eliminar cualquier burbuja de gas en los canales microfluídicos. Cebar un chip con líquido y eliminar burbujas de gas antes de procesar una muestra de partículas para su análisis o clasificación de células se puede lograr utilizando una combinación de canales y puertos microfluídicos estratégicamente diseñados.
La FIG. 14 muestra un esquema de un chip microfluídico para ilustrar métodos de cebado. El chip 1400 incluye un sustrato 1401 (o base), sobre el que se pueden disponer otros componentes en el chip 1400. El chip 1400 incluye dos entradas de fluido: una entrada 1422 de fluido de envoltura para suministrar fluido de envoltura y una entrada 1424 de fluido de muestra para suministrar fluido de muestra. El fluido de envoltura y el fluido de muestra se transmiten a una unión 1410 de clasificación, donde diferentes células en el fluido de muestra se dirigen a diferentes canales 1440 de salida. La clasificación se lleva a cabo mediante un actuador piezoeléctrico (PZE) en una cámara PZT 1430 que puede desviar el fluido de muestra hacia diferentes canales 1440 de salida. En algunos ejemplos, el diámetro de la cámara PZT 1430 puede ser de aproximadamente 10 mm a aproximadamente 30 mm (por ejemplo, 10 mm, 15 mm, 20 mm, 25 mm o 30 mm) y la profundidad de la cámara PZT 1430 puede variar entre 2-5 mm (por ejemplo, 2 mm, 2.5 mm, 3 mm, 3.5 mm, 4 mm, 4.5 mm y 5 mm). Esta cámara 1430 puede ser entre 1 y 2 órdenes de magnitud mayor en diámetro y volumen que las cámaras microfluídicas típicas, que miden entre decenas y cientos de micrómetros. Debido al desajuste de dimensiones entre el canal microfluídico y la cámara y su estructura, la introducción de líquido puede no ser suficiente para cebar el chip microfluídico 1400 desplazando el gas.
Dado que la cámara 1430 tiene dimensiones de mesoescala, a diferencia de los microfluidos típicos, la gravedad puede imponer una mayor influencia sobre el flujo y el llenado. Por lo tanto, montar el chip verticalmente y crear un puerto 1450 de purga encima de la cámara PZT 1430 ayuda a llenar la cámara por completo. La cámara PZT 1430 y la cámara de líquido en el lado opuesto se pueden conectar mediante canales fluídicos que ventilan el gas, asegurando que ambas cámaras se llenen por completo de líquido. La orientación y posicionamiento de los canales fluídicos y el puerto 1450 de purga permiten que la gravedad ayude a purgar el gas no deseado.
El canal de flujo principal y el cuello que conecta el canal de flujo principal a la cámara de clasificación pueden ser propensos a pequeñas burbujas de gas debido principalmente a la escasa humectabilidad de la mayoría de los materiales plásticos, incluyendo PDMS, PMMA y Copolímero de Olefina Cíclica COC/Polímero de Olefina Cíclica COP. Las FIGS. 15A-15B ilustran esta cuestión. Después de llenar el tampón normal en el chip 1400, todavía puede haber algo de gas en la cámara PZE 1430.
Las FIGS. 15C-15D ilustran métodos para cebar el chip microfluídico 1400 usando tampón desgasificado. Para eliminar las burbujas de gas restantes después de introducir fluido para llenar las cámaras, se puede cargar un amortiguador desgasificado y una bomba puede dirigir el tampón hacia el chip 1400. Alternativamente, la línea entre la bomba y el chip podría tener un desgasificador "en línea". El líquido de cebado puede desgasificarse antes de la carga en el instrumento o desgasificarse usando un vacío "en línea" que puede situarse entre la o las bombas y el chip. Cuando el líquido desgasificado se introduce en la región del cuello entre el canal microfluídico y la cámara PZT de clasificación, cualquier gas atrapado se disuelve en el fluido y el chip se llena por completo con líquido tal como se ilustra en la FIG. 15D.
Los métodos tradicionales de clasificación de partículas utilizan un transductor piezoeléctrico para dividir la corriente en gotas. Algunas de esas gotas pueden contener partículas (por ejemplo, células) a medida que se desprenden. A medida que se forman las gotas, éstas pueden cargarse con iones positivos o negativos. Luego, la corriente de gotas pasa a través de un par de placas cargadas (por ejemplo, cargadas a ± 5000 V) para que las gotitas cargadas puedan desviarse y recogerse en tubos de ensayo/pocillos.
Un aspecto de la clasificación de flujo consiste, por lo tanto, en aplicar una carga a las gotas correctas (es decir, las que contienen las partículas deseadas) y no a otras. Para hacer esto, un parámetro llamado "retraso de tiempo" o "retraso de clasificación" debe ajustarse con precisión. En los clasificadores de células tradicionales, el retraso de tiempo o retraso de clasificación es el tiempo que tarda una partícula en moverse desde el punto de análisis hasta el punto en donde la gota que la contiene se desprende de la corriente. El retraso de tiempo está determinado por varios factores que incluyen, entre otros: la distancia entre el punto de análisis y el punto de clasificación, la velocidad del flujo, la tasa de generación de gotas, la frecuencia de carga, etc. Si el retraso de tiempo no se ajusta adecuadamente, ello puede afectar negativamente a la pureza de clasificación y la eficiencia. Además, es posible que el usuario no pueda monitorear los resultados de la clasificación en tiempo real. En cambio, el usuario tiene que recoger y analizar la muestra clasificada con un citómetro para obtener la información de clasificación. Esta puede ser una de las razones por las que los clasificadores de células tradicionales suelen ser operados solo por técnicos bien capacitados en una instalación central.
Sin embargo, los clasificadores de partículas tal como se describen en la presente memoria se pueden utilizar para realizar una clasificación de partículas en circuito cerrado. En el sistema mostrado en la FIG. 14, el retraso de tiempo/clasificación es el tiempo entre el momento en que se detecta ópticamente una partícula y el momento en que la partícula alcanza la unión de clasificación (en este caso, el actuador que se acciona para desviar la partícula hacia uno de los tres canales de clasificación). Puede utilizar luz dispersa y/o fluorescencia emitida (detectada por uno o más fotodetectores) como señal para accionar la activación de clasificación. Un actuador piezoeléctrico (PZT) en chip clasifica las partículas cambiando el movimiento del flujo de forma transitoria en la unión de clasificación de chips. El clasificador de partículas utiliza métodos eléctricos (por ejemplo, mediciones de impedancia) y/o métodos ópticos para obtener una señal de validación para confirmar el estado de clasificación. Además, un procesador(hardwareelectrónico) implementa un método para ajustar el tiempo en relación con la señal de detección óptica, la señal de accionamiento PZT y la señal de validación para aumentar la eficiencia de clasificación y monitorear el estado de clasificación en tiempo real.
Se puede utilizar un retraso de clasificación digital para compensar cualquier diferencia menor de alineación del eje Y, diferencias menores de fabricación o diferencias menores de caudal. La alineación en el eje Y puede afectar al tiempo de clasificación adecuado, ya que el actuador de clasificación PZT debe activarse en el momento exacto en donde la partícula se encuentra en la unión de clasificación microfluídica después de su detección aguas arriba en la región de detección. El retraso de clasificación adecuado también puede variar de un chip a otro debido a imperfecciones en la fabricación del chip microfluídico y variaciones en el rendimiento PZT. Generalmente, el retraso de clasificación deseado para un chip determinado permanece constante para un caudal determinado.
Para abordar las imperfecciones de fabricación y las variaciones de rendimiento, el sistema de clasificación puede definir un intervalo para el retraso de clasificación basado en la información de distancia y velocidad en lugar de un valor de retraso de clasificación fijo. Posteriormente, el sistema puede recorrer este intervalo de valores de retraso de clasificación. Por ejemplo, el sistema puede pasar por uno o clasificar valores de retraso separados por tan solo 1 ps por paso. En algunos casos, el sistema puede realizar pasos grandes (por ejemplo, 10 ps) para una calibración aproximada y pasos más pequeños (por ejemplo, 1 ps) para una calibración más precisa.
En cada paso, el sistema mide decenas, cientos o miles de partículas o más para obtener la eficiencia de clasificación, que se define como el porcentaje de señales de confirmación de clasificación en comparación con el número total de eventos de activación PZT. Las señales de verificación de clasificación pueden ser señales eléctricas u ópticas medidas aguas abajo en los canales de clasificación. Un ejemplo es el uso de electrodos de oro aguas abajo de los canales fluídicos en el chip microfluídico. Los electrodos se utilizan para proporcionar un campo eléctrico. Cuando una partícula se desplaza a través de este campo eléctrico, el sistema mide la modulación de una señal eléctrica (por ejemplo, una señal de impedancia) causada por una partícula que fluye a través del canal.
Una vez que el sistema finaliza un cálculo de bucle de un cierto intervalo de distancia (por ejemplo, de 100 pm a 250 pm), notifica al usuario la eficiencia de clasificación lograda. Si esta precisión de clasificación está por encima de un umbral aceptable, el sistema establece el retraso de clasificación que ha producido la precisión de clasificación, reinicia el sistema en preparación para una ejecución de muestra real y notifica al usuario que el proceso de calibración está completo. De lo contrario, el sistema solicita al usuario que repita el proceso de calibración con un intervalo de retraso de clasificación más amplio. Si no se logra la precisión de clasificación deseada (por ejemplo, después de tres pruebas), el sistema notifica al usuario que reemplace el chip y repita esta prueba de calibración automática.
La FIG. 16 ilustra un método de calibración del retraso de clasificación automática arriba descrito. El método 1600 comienza en la etapa 1610 para iniciar la calibración del retraso de clasificación automática, seguido de la etapa 1620, en la que se establece un valor de retraso de clasificación inferior en el intervalo de búsqueda actual. En la etapa 1630 se opera el sistema de detección y clasificación y se registran la precisión de clasificación y la precisión de accionamiento. La precisión de clasificación y la precisión de accionamiento registradas se pueden usar para descubrir el valor del retraso de clasificación que produce la precisión de clasificación máxima, como en la etapa 1640. En la etapa 1650, se examina la señal para determinar si es satisfactoria. En respuesta a una señal no satisfactoria, el método 1600 pasa a la etapa 1660, donde se repite el retraso de clasificación automática o se reemplaza el chip de clasificación. Por otro lado, en respuesta a una señal satisfactoria en la etapa 1650, el método 1600 pasa a la etapa 1670, donde se establece el retraso de clasificación que produce la máxima precisión de clasificación. Además, el sistema también se puede configurar para la ejecución de muestra real, completando así la calibración.
Las FIGS. 17A-17B ilustran la optimización del posicionamiento y sincronización de la clasificación de partículas. La FIG. 17A es un gráfico de la eficiencia de clasificación en función de la posición en el eje Y del canal. La FIG. 17B muestra un esquema de una unión 1700 de clasificación que incluye un canal 1710 de fluido para propagar el fluido de muestra y un actuador PZT 1720 para dirigir las células en el fluido de muestra hacia los canales 1730 de salida designados. El canal 1710 de fluido incluye una región 1715, que se denomina región del eje Y donde la posición se optimiza para controlar la sincronización precisa del accionamiento PZT. Sobre la base del gráfico mostrado en la FIG. 17A, se puede elegir la posición que produzca la máxima eficiencia de clasificación para configurar el chip microfluídico.
Aunque en la presente memoria se han descrito e ilustrado varias realizaciones inventivas, los expertos en la técnica imaginarán fácilmente una variedad de otros medios y/o estructuras para realizar la función y/u obtener los resultados y/o una o más de las ventajas descritas en la presente memoria, y cada una de dichas variaciones y/o modificaciones se considera que está dentro del alcance de las realizaciones inventivas descritas en la presente memoria. De manera más general, los expertos en la técnica apreciarán fácilmente que todos los parámetros, dimensiones, materiales y configuraciones descritos en la presente memoria pretenden ser ejemplares y que los parámetros, dimensiones, materiales y/o configuraciones reales dependerán de la aplicación o las aplicaciones específicas para las que se utilizan las enseñanzas inventivas. Los expertos en la técnica reconocerán o serán capaces de determinar, solamente mediante el uso de experimentos de rutina, muchos equivalentes de las realizaciones específicas de la invención descritas en la presente memoria. Por lo tanto, debe entenderse que las realizaciones anteriores se presentan únicamente a modo de ejemplo.
El diseño y la fabricación de la tecnología descrita en la presente memoria se pueden implementar utilizandohardware, softwareo una combinación de los mismos. Cuando se implementa ensoftware,el código delsoftwarese puede ejecutar en cualquier procesador o conjunto de procesadores adecuado, ya sea proporcionado en un solo ordenador o distribuido entre varios ordenadores.
Además, se debe apreciar que un ordenador puede realizarse en cualquiera de diversas formas, tales como un ordenador montado en bastidor, un ordenador de sobremesa, un ordenador portátil o una tableta. Además, un ordenador puede estar integrado en un dispositivo que generalmente no se considera un ordenador pero que tiene capacidades de procesamiento adecuadas, incluyendo un Asistente Digital Personal (PDA, por sus siglas en inglés), un teléfono inteligente o cualquier otro dispositivo electrónico portátil o fijo adecuado.
Además, un ordenador puede tener uno o más dispositivos de entrada y salida. Estos dispositivos se pueden utilizar, entre otras cosas, para presentar una interfaz de usuario. Los ejemplos de dispositivos de salida que pueden usarse para proporcionar una interfaz de usuario incluyen impresoras o pantallas de visualización para una presentación visual de salida y altavoces u otros dispositivos generadores de sonido para una presentación audible de salida. Los ejemplos de dispositivos de entrada que se pueden utilizar para una interfaz de usuario incluyen teclados y dispositivos de puntero, como ratones, paneles táctiles y tabletas de digitalización. Como otro ejemplo, un ordenador puede recibir información de entrada mediante reconocimiento de voz o en otro formato audible.
Dichos ordenadores pueden estar interconectados por una o más redes en cualquier forma adecuada, incluyendo una red de área local o una red de área amplia, como una red empresarial y una red inteligente (IN, por sus siglas en inglés) o Internet. Dichas redes pueden basarse en cualquier tecnología adecuada y pueden funcionar según cualquier protocolo adecuado y pueden incluir redes inalámbricas, redes cableadas o redes de fibra óptica.
Los diversos métodos o procesos (por ejemplo, de diseño y fabricación de las estructuras de acoplamiento y elementos ópticos de difracción arriba descritos) perfilados en la presente memoria pueden codificarse comosoftwareque es ejecutable en uno o más procesadores que emplean cualquiera de una variedad de sistemas operativos o plataformas. Además, dichosoftwarepuede escribirse utilizando cualquiera de varios lenguajes de programación y/o herramientas de programación o secuencias de comandos adecuados, y también puede compilarse como código ejecutable en lenguaje de máquina o código intermedio que se ejecuta en un marco o máquina virtual.
A este respecto, se pueden incorporar diversos conceptos inventivos como un medio de almacenamiento legible por ordenador (o múltiples medios de almacenamiento legibles por ordenador) (por ejemplo, una memoria de ordenador, uno o más disquetes, discos compactos, discos ópticos, cintas magnéticas, memoriasflash,configuraciones de circuitos en Agrupaciones de Puertas Programables de Campo u otros dispositivos semiconductores, u otro medio no transitorio o medio de almacenamiento informático tangible) codificados con uno o más programas que, cuando se ejecutan en uno o más ordenadores u otros procesadores, realizan métodos que implementan las diversas realizaciones de la invención arriba analizadas. El medio o los medios legibles por ordenador pueden ser transportables, de modo que el programa o los programas almacenados en ellos se puedan cargar en uno o más ordenadores diferentes u otros procesadores para implementar diversos aspectos de la presente invención tal como se han analizado más arriba.
Los términos "programa" o"software"se usan en la presente memoria en un sentido genérico para referirse a cualquier tipo de código informático o conjunto de instrucciones ejecutables por ordenador que se pueden emplear para programar un ordenador u otro procesador. Además se debe apreciar que, según un aspecto, uno o más programas informáticos que, cuando se ejecutan, realizan los métodos de la presente invención no necesitan residir en un único ordenador o procesador, sino que pueden distribuirse de forma modular entre varios ordenadores o procesadores diferentes para implementar diversos aspectos de la presente invención.
Las instrucciones ejecutables por ordenador pueden adoptar muchas formas, como módulos de programa, ejecutadas por uno o más ordenadores u otros dispositivos. Generalmente, los módulos de programación incluyen rutinas, programas, objetos, componentes, estructuras de datos, etc., que realizan tareas concretas o implementan tipos de datos abstractos concretos. Normalmente, la funcionalidad de los módulos de programa se puede combinar o distribuir según se desee.
Además, las estructuras de datos pueden almacenarse en medios legibles por ordenador en cualquier forma adecuada. Para simplificar la ilustración, se puede mostrar que las estructuras de datos tienen campos que están relacionados a través de la ubicación en la estructura de datos. Dichas relaciones también pueden lograrse asignando almacenamiento para los campos con ubicaciones en un medio legible por ordenador que transmita la relación entre los campos. Sin embargo, se puede utilizar cualquier mecanismo adecuado para establecer una relación entre información en campos de una estructura de datos, incluyendo el uso de punteros, etiquetas u otros mecanismos que establezcan relaciones entre elementos de datos.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un sistema (600), que comprende:
un canal microfluídico en comunicación fluida con una cámara (710) de clasificación, un canal (610) de fluido envolvente y un canal (720) de fluido de muestra;
una bomba (525) de fluido de muestra en comunicación fluida con el canal (720) de fluido de muestra, estando configurada la bomba (525) de fluido de muestra para bombear fluido de muestra a través del canal (720) de fluido de muestra a la cámara (710) de clasificación con un caudal de fluido de muestra;
una bomba peristáltica (535) de envoltura en comunicación fluida con el canal (610) de fluido de envoltura, estando configurada la bomba peristáltica (535) de envoltura para bombear un fluido a través del canal (610) de fluido de envoltura con un caudal de fluido de envoltura; y
un amortiguador (620) de fluido de envoltura que incluye un gas y que está en comunicación fluida con el canal (610) de fluido de envoltura, estando configurado el amortiguador (620) de fluido de envoltura para reducir las variaciones en el caudal de fluido de envoltura mediante la compresión y expansión del gas en respuesta al flujo de fluido en el canal (610) de fluido de envoltura.
2. El sistema de la reivindicación 1, que incluye además un sustrato desechable (601) que define al menos una parte de la cámara (710) de clasificación y el canal (610) de fluido de envoltura.
3. El sistema de la reivindicación 2, en donde al menos una parte del amortiguador (620) de fluido de envoltura está formada sobre el sustrato desechable (601).
4. El sistema de la reivindicación 2, en donde el sustrato desechable (601) incluye silicona.
5. El sistema de la reivindicación 1, en donde las variaciones reducidas del caudal de fluido de envoltura corresponden a menos de aproximadamente el 10 % de un caudal medio.
6. El sistema de la reivindicación 1, en donde el caudal de fluido de envoltura es de 1 pl/min a 1 ml/min.
7. El sistema de la reivindicación 1, en donde el amortiguador (620) de fluido de envoltura incluye al menos una de una cámara de gas rectangular, una cámara de gas cilíndrica, una cámara de gas ovalada y una cámara de gas redonda.
8. El sistema de la reivindicación 1, en donde el amortiguador (620) de fluido de envoltura incluye al menos dos cámaras de gas dispuestas en serie a lo largo del canal (610) de fluido de envoltura.
9. El sistema de la reivindicación 1, en donde el amortiguador (620) de fluido de envoltura tiene un volumen de 60 mm3 a 600 mm3.
10. El sistema de la reivindicación 1, en donde el amortiguador (620) de fluido de envoltura está configurado para reducir las variaciones del caudal de fluido de muestra en más del 95 %.
11. El sistema de la reivindicación 1, en donde la bomba (525) de fluido de muestra comprende una bomba peristáltica de fluido de muestra.
12. El sistema de la reivindicación 1, en donde la cámara (710) de clasificación tiene un diámetro de aproximadamente 10 mm a aproximadamente 30 mm y una profundidad de aproximadamente 2 mm a aproximadamente 5 mm.
13. El sistema de la reivindicación 11, que comprende además un amortiguador (728) de fluido de muestra que comprende un segundo gas y está en comunicación fluida con el canal (720) de fluido de muestra, estando configurado el amortiguador (728) de fluido de muestra para reducir las variaciones en el caudal de fluido de muestra por compresión y expansión del segundo gas en respuesta al flujo de fluido en el canal (720) de fluido de muestra.
14. El sistema de la reivindicación 1, que comprende además un cartucho (901), incluyendo el cartucho (901) el amortiguador (620) de fluido de envoltura.
15. El sistema de la reivindicación 14, que comprende además un chip (510) de clasificación acoplable al cartucho (901), incluyendo el chip (510) de clasificación la cámara (710) de clasificación.
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