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ES2975412T3 - Proceso enzimático para la preparación de droxidopa - Google Patents

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ES2975412T3
ES2975412T3 ES18179043T ES18179043T ES2975412T3 ES 2975412 T3 ES2975412 T3 ES 2975412T3 ES 18179043 T ES18179043 T ES 18179043T ES 18179043 T ES18179043 T ES 18179043T ES 2975412 T3 ES2975412 T3 ES 2975412T3
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hydrogen
droxidopa
kred
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Paolo Stabile
Pierluigi Padovan
Poli Matteo De
Angelo Restelli
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Abstract

La presente invención se refiere a un proceso para la preparación de droxidopa mediante una reducción enzimática mejorada de un compuesto de fórmula (II): en la que R1, R2 es hidrógeno independiente, acetilo, R3 es hidrógeno , un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado y R4 es hidrógeno o un grupo protector de amina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Proceso enzimático para la preparación de droxidopa
Campo técnico
La presente invención se refiere a un proceso para la preparación de droxidopa por medio de reducción enzimática.
Antecedentes de la técnica
La droxidopa se conoce químicamente como ácido (2S,3R)-2-amino-3-(3,4-dihidroxifenil)-3-hidroxipropanoico y está estructuralmente representada por la siguiente fórmula (I-a). También se conoce como L-treo-dihidroxifenilserina, L-treo-DOPS, L-DOPS. La droxidopa está disponible en el mercado como Northera® como cápsulas con dosis de 100 mg, 200 mg y 300 mg para administración oral.
La droxidopa es un precursor sintético de norepinefrina activo por vía oral que se lanzó originalmente en 1989 en Japón para el tratamiento oral del bloqueo motor o los mareos asociados con la enfermedad de Parkinson y para el tratamiento de la hipotensión ortostática, el síncope o los mareos asociados con el síndrome de Shy-Drager y la polineuropatía amiloidótica familiar.
En 2011, el producto se presentó para su aprobación en los EE. UU. y en 2014 Northera® fue aprobado para el tratamiento del mareo ortostático, el aturdimiento o la "sensación de que está a punto de desmayarse" en pacientes adultos con hipotensión ortostática neurogénica sintomática causada por insuficiencia autónoma primaria, deficiencia de dopamina beta-hidroxilasa y neuropatía autónoma no diabética.
La droxidopa repone la noradrenalina agotada, lo que permite la recaptación de noradrenalina en las neuronas del sistema nervioso periférico. Esta recaptación, a su vez, estimula los receptores de vasoconstricción, proporcionando una mejoría fisiológica en pacientes con hipotensión ortostática neurogénica sintomática.
También ha demostrado eficacia en otras enfermedades, tales como la depresión.
La droxidopa es un análogo de aminoácido sintético que se metaboliza directamente a noradrenalina por la dopadescarboxilasa, que se distribuye ampliamente por todo el cuerpo.
Su preparación química generalmente implica una síntesis de múltiples etapas.
La droxidopa se divulga en la patente estadounidense n.° 3.920.728 (en lo sucesivo denominada patente estadounidense 728). La patente estadounidense 728 también proporciona un proceso para la preparación de droxidopa que comprende las etapas de (i) reacción de 3,4-dibenciloxibenzaldehído con glicina, seguida de tratamiento con acetato de sodio trihidrato y dietilamina para obtener treo/eritro-3-(3,4-dibenciloxifenil)-serina racémica; (ii) tratamiento del compuesto obtenido en la etapa (i) con cloruro de carbobenzoxi para obtener treo/eritro-3-(3,4-dibenciloxifenil)-N-carbobenzoxiserina racémica; (iii) tratamiento del compuesto obtenido en la etapa (ii) con diciclohexilamina para obtener sal de diciclohexilamina de treo-3-(3,4-dibenciloxifenil)-N-carbobenzoxiserina racémica, que mediante tratamiento con HCl gaseoso en presencia de acetato de etilo produce treo-3-(3,4-dibenciloxifenil)-N-carbobenzoxiserina racémica; (iv) tratamiento del compuesto obtenido en la etapa (iii) con (+)-efedrina para producir sal de (+)-efedrina de L-treo-3-(3,4-dibenciloxifenil)-N-carbobenzoxiserina; (v) hidrólisis del compuesto obtenido en la etapa (iv) para producir L-treo-3-(3,4-dibenciloxifenil)-N-carbobenzoxiserina y (vi) reducción del compuesto obtenido en la etapa (v) sobre Pd/C para producir L-treo-3-(3,4-dibenciloxifenil)-serina. El proceso divulgado en la patente estadounidense 728 es un proceso elaborado y tedioso para la fabricación comercial. Además, la resolución quiral para obtener el isómero treo/eritro da como resultado una pérdida del 50 % del isómero no deseado, lo que afecta al rendimiento global del proceso.
Típicamente, una o más de las etapas necesarias en la síntesis requieren que los sitios reactivos, distintos del sitio objetivo de la reacción, estén protegidos temporalmente.
Por tanto, la síntesis de droxidopa típicamente comprende al menos una etapa de protección y una de desprotección asociada. Por ejemplo, el resto catecol, el resto amina y/o el resto carboxilo pueden requerir protección y desprotección posterior, dependiendo de la ruta sintética y los reactivos usados en la preparación de droxidopa.
En la bibliografía se han descrito varios enfoques sintéticos y enzimáticos para droxidopa.
La mayoría de ellos implican el acoplamiento entre un 3,4-dihidroxi benzaldehído convenientemente protegido con glicina para producir una mezcla diastereoméricamente enriquecida de treo-DOPS.
Este enfoque se ha descrito en la solicitud de patente JP 2007190009(A) e implica el acoplamiento de glicina o una sal de la misma con 3,4-dihidroxibenzaldehído en presencia de una treonina aldolasa para formar el correspondiente derivado de aminoácido enantioméricamente enriquecido.
La Microbiochemical Research Foundation ha descrito una alternativa en la solicitud de patente EP0112606 A1, que no es estereoselectiva y se basa en cristalizaciones fraccionadas para separar una mezcla treo/eritro.
La mezcla diastereoméricamente enriquecida de la treo-DOPS protegida se puede convertir en D- y L-treo-DOPS ópticamente activas resolviendo ópticamente una mezcla racémica de treo-2-(3,4-metilendioxifenil)-N-carbobenciloxiserina o treo-2-(3,4-dibenciloxi-fenil)-N-carbobenciloxiserina, como se detalla en las patentes US 4319040 y US 4480109, respectivamente. Después de la resolución óptica de estas mezclas racémicas para dar el enantiómero L deseado, los grupos metilendioxi o bencilo deben eliminarse del resto catecol y el grupo carbobenciloxi (Cbz) debe eliminarse del grupo amina para dar droxidopa.
La patente estadounidense 4562263 divulga un proceso para la preparación de droxidopa que comprende la resolución óptica de N-ftaloil-3-(3,4-metilendioxifenil)serina usando una amina ópticamente activa seleccionada del grupo que consiste en estricinina, cinconidina, L-norefedrina, S-2-amino-1,1-difenil-1-propanol y L-3-hidroxi-3-(4-nitrofenil)-2-amino-1-propanol para producir L-N-ftaloil-3-(3,4-metilendioxifenil)serina, hacer reaccionar el compuesto resultante con un ácido de Lewis para formar N-ftaloil-3-(3,4-dihidroxifenil)-serina; que a continuación se desprotege mediante la eliminación del grupo ftaloílo con hidrazina para producir L-treo-3-(3,4-dihidroxifenil)-serina. El proceso implica el uso de agentes complejos para la separación de isómeros, lo que también da como resultado < 50 % del isómero deseado. Además, se sabe que la hidrazina utilizada para la desprotección del grupo ftaloílo es genotóxica y, por tanto, es necesario eliminar trazas de hidrazina del producto final.
De acuerdo con un enfoque alternativo descrito en la solicitud de patente EP 201039 A1, una mezcla racémica de treo-2-(3,4-dibenciloxi-fenil)-N-acetilserina se puede convertir en L-treo-2-(3,4-dibenciloxi)-fenil)-serina mediante tratamiento con una L-amino acilasa.
Una desventaja asociada con todas las rutas sintéticas citadas anteriormente es que al convertir un material de partida racémico usando una enzima enantioselectiva o una amina ópticamente activa, se puede alcanzar un rendimiento máximo del 50 % del producto final enantioméricamente puro.
El uso de agente de resolución hace que el proceso sea costoso. El reciclaje parcial del agente de resolución es viable, pero dicho reciclaje es costoso ya que requiere procesamiento adicional y también está asociado con la generación de desechos. El enantiómero no deseado no se puede reciclar y se desecha.
Este rendimiento puede reducirse aún más debido a la necesidad de una alta pureza quiral (> 95 % de exceso enantiomérico).
Un procedimiento alternativo para la preparación estereoselectiva de droxidopa se ha descrito en la solicitud de patente EP375554 A1. De acuerdo con esta última, los dos estereocentros se introducen simultáneamente con una hidrogenación asimétrica de tipo Noyori con resolución cinética dinámica (AH-DKR).
El proceso es particularmente interesante porque está catalizado por los más baratos de los metales de transición (rutenio) y de las fosfinas quirales (Binap) empleadas en las hidrogenaciones asimétricas.
Sin embargo, las condiciones propuestas no son convenientemente adecuadas para una producción industrial de droxidopa, porque: 100 bar de presión de hidrógeno están fuera de alcance en recipientes industriales normales; el tiempo de reacción informado no es práctico (casi 1 semana); el mejor disolvente es el diclorometano (que debe evitarse por motivos medioambientales); y la desprotección del resto metilendioxi requiere grandes excesos de AlCh o AlBr3.
Por lo tanto, dichos procesos de la técnica anterior son desventajosos para la fabricación comercial debido a la inviabilidad del proceso de reacción debido al uso de reactivos genotóxicos, y debido a la naturaleza elaborada y tediosa del proceso, que proporciona un bajo rendimiento del isómero deseado.
Por tanto, existe una clara necesidad de desarrollar una mejor ruta de síntesis que proporcione el isómero L-treo deseado de una manera eficiente y más específica.
Por tanto, existe una necesidad de desarrollar un proceso para la preparación de droxidopa, que evite el proceso sintético que implica resolución quiral para obtener el isómero L-treo deseado, haciendo así que el proceso de la presente invención sea simple, eficiente, rentable e industrialmente viable.
Los compuestos relacionados se describen específicamente en:
- Journal of the Chemical Society (1947), 658-62;
- Solicitud japonesa JP 5504601(A);
- Solicitud china CN 107137338(A);
que divulga un proceso completamente diferente de síntesis y uso de estos compuestos.
Resumen de la invención
El problema abordado por la presente invención es, por tanto, el de proporcionar un mejor proceso para la preparación del isómero L-treo de droxidopa, el compuesto representado por la fórmula (I-a), que es un proceso enantioselectivo.
Este problema se resuelve mediante un proceso para la preparación de droxidopa como se describe en las reivindicaciones adjuntas, cuyas definiciones son parte integral de la presente descripción.
Particularmente, la presente invención proporciona un proceso para producir el principio activo droxidopa por medio de reducción enzimática del compuesto de fórmula (II):
en donde R1, R2 es independientemente hidrógeno, acetilo, R3 es hidrógeno, un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado y R4 es hidrógeno o un grupo protector de amina, por medio de una enzima cetorreductasa.
Preferentemente, dicha reducción enzimática se lleva a cabo mediante la cetorreductasa KRED-130.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de una cetorreductasa para la reducción enzimática del compuesto de fórmula (II).
El objetivo de esta invención es proporcionar un método quimioenzimático para preparar droxidopa o intermedios útiles en la síntesis de la misma, caracterizado por altos rendimientos y niveles de estereocontrol evitando el uso de reactivos peligrosos y proporcionando los compuestos deseados con una pureza apropiada para el uso en productos farmacéuticos.
Descripción de realizaciones
El objeto de la presente invención es un proceso para la preparación de droxidopa de fórmula (I) o una sal de la misma:
que comprende las siguientes etapas:
A) reducción enzimática de un compuesto de fórmula (II):
en donde R1, R2 son independientemente hidrógeno o acetilo, R3 es hidrógeno o un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado y R4 es hidrógeno o un grupo protector de amina;
para dar el compuesto de fórmula (III):
en donde R1, R2, R3, R4 tienen el mismo significado que anteriormente;
por medio de una enzima cetorreductasa;
B) conversión del compuesto de fórmula (III) obtenido en la etapa a) en droxidopa de fórmula (I).
De acuerdo con la invención, el proceso proporciona la L-treo-3,4-Dihidroxifenilserina de fórmula (I):
El compuesto de fórmula (I) que tiene la configuración, en los dos carbonos estereogénicos, es decir, C unido al grupo hidroxilo y C unido al grupo amino, respectivamente R y S. De acuerdo con el nombre ácido (2S,3R)-3-(3,4-dihidroxifenil)-2-amino-3-hidroxipropanoico.
También se describe en el presente documento que en los compuestos de fórmula (II) y (III), R1 y R2 podrían ser grupos metilo, bencilo o alquilo C1-C4 independientes unidos para formar un ciclo.
De acuerdo con la realización preferida, en los compuestos de fórmula (II) y (III) el R3 es etilo o metilo. El R3 más preferido es etilo.
La definición de alquilo C1-C4 lineal o ramificado también incluye metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo.
R4 podría ser hidrógeno o un grupo protector de amina que puede seleccionarse en el grupo que comprende bencilo, formilo, acetilo, benzoílo, fenilsulfonilo, tolilsulfonilo, metilsulfonilo, (CO)OR5 o (CO)R5 donde R5 es alquilo C1-C5 lineal o ramificado o R5 es aril-alquilo C0-4 o alquil C0-4-(arilo sustituido o no sustituido).
El grupo alquilo C1-5 lineal o ramificado de R5 también puede estar, no sustituido o sustituido con uno, dos o tres sustituyentes elegidos en el grupo de hidroxilo y alcoxi C1-5.
La definición de alquilo C1-C5 lineal o ramificado también incluye metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, n-pentilo, neopentilo, 1 -metilbutilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo, 1,1-dimetilpropilo, 1,2-dimetilpropilo, 2 ,2-dimetilpropilo, 1 -etilpropilo.
Los grupos R4 preferidos son pivaloílo, t-butiloxicarbonilo (sinónimo: terc-butiloxicarbonilo, Boc, terbutilcarbamato), metilcarbamato, etilcarbamato o benciloxicarbonilo (Z o Cbz). Los grupos R4 más preferidos son terbutilcarbamato, metilcarbamato, etilcarbamato o benciloxicarbonilo (Z o Cbz).
De acuerdo con la realización preferida, en los compuestos de fórmula (II) y (III), R3 es etilo y R4 es terbutilcarbamato.
De hecho, se ha descubierto sorprendentemente que es posible llevar a cabo la reducción enzimática del grupo ceto y la generación simultánea de un estereocentro en el carbono lateral mediante una enzima cetorreductasa (abreviadamente KRED).
La enzima, además de la reducción enantioselectiva, induce, de hecho, y sorprendentemente, la enantioselección en el carbono adyacente que se une al grupo amino.
En la invención, el compuesto de fórmula (II) se reduce a un compuesto de fórmula (III) usando una cetorreductasa (KRED).
Las enzimas KRED que pertenecen a la clase EC 1.1.1.184 son útiles para la síntesis de alcoholes ópticamente activos a partir de los correspondientes sustratos de cetona pro-estereoisomerismo y mediante la reducción estereoespecífica de los correspondientes sustratos de cetona racémica.
Las enzimas KRED típicamente convierten un sustrato cetónico en el producto alcohólico correspondiente, pero también pueden catalizar la reacción inversa, la oxidación de un sustrato alcohólico al producto cetónico correspondiente. La reducción de cetonas y la oxidación de alcoholes mediante enzimas tales como KRED típicamente requieren un cofactor.
Típicamente, la etapa de reducción se lleva a cabo haciendo reaccionar el compuesto de fórmula (II) con la enzima cetorreductasa en presencia de un cofactor para la cetorreducción y opcionalmente un sistema de regeneración de cofactor.
Las enzimas cetorreductasas están disponibles en el mercado, por ejemplo, de Codexis, Inc (EE. UU.).
La KRED se puede encontrar en una amplia gama de bacterias y levaduras, para revisiones: Kraus y Waldman, Enzyme' catalysis in organic synthesis, Vol. 1 y 2.VCH Weinheim 1995; Faber, K., Biotransformations in organic chemistry, 4a Ed. Springer, Berlín
Heidelberg Nueva York. 2000; Hummel y Kuia, 1989, Eur. J. Biochem. 184: 1-13. Se han notificado varias secuencias de enzimas y genes de KRED, por ejemplo, Candida magnoliae (N.° de Ent. del Genbank JC7338; GL 1 1360538) Candida parapsilosis (N.° de Ent. del Genbank BAA24528. I; GI:2815409), Sporobolomyces salmonicolor (N.° de Ent. del Genbank AF160799;GL653973.
La KRED puede ser una enzima de tipo silvestre o una variante. En el documento WO2005/017135 se proporcionan secuencias de enzimas KRED de tipo silvestre y variantes. Las enzimas KRED están disponibles en el mercado. Ejemplos de estas incluyen, pero sin limitación, KRED-101, KRED-119, KRED-130, KRED-NADH-101, KRED.NAbff:.110, KRED-PI-A04, KRED-PI-B02, KRED-PI-BOS, KRED-PI-B05, KRED-PI-B10, KRED-PI-B12, KRED-PI-COI, KRED-PI-H08, KRED-PI-HIO, KRED-P2-B02, KRED-P2-C02, KRED-P2-CI 1, KRED-P2-D03, KRED-P2-DI 1, KRED-P2-D12, KRED-P2-G03, KRED-P2-H07, KRED-P3-B03, KRED-P3-G09, KRED-P3-H12 y combinaciones de las mismas. De la manera más preferente la enzima es KRED-130.
En una realización preferida, la KRED es KRED-130.
De acuerdo con la realización preferida, la reducción enzimática de la presente invención se puede llevar a cabo mediante la cetorreductasa KRED-130 y en el compuesto de fórmula (II) R3 es etilo y R4 es terbutilcarbamato.
Preferentemente, la cetorreductasa se aísla. La cetorreductasa se puede separar de cualquier huésped, tal como mamíferos, hongos filamentosos, levaduras y bacterias. El aislamiento, la purificación y la caracterización de una cetorreductasa dependiente de NADH se describen, por ejemplo, en Kosjek et al., Purification and Characterization of a Chemotolerant Alcohol Dehydrogenase Apply to Coupled Redox Reactions. Biotechnology and Bioengineering, 86:55-62 (2004).
Preferentemente, la cetorreductasa se sintetiza. La cetorreductasa se puede sintetizar químicamente o usando medios recombinantes. La producción química y recombinante de cetorreductasas se describe, por ejemplo, en el documento EP0918090(A2). Preferentemente, la cetorreductasa se sintetiza usando medios recombinantes en Escherichia coli. Preferentemente, la cetorreductasa se purifica, preferentemente con una pureza de aproximadamente el 90 % o más, más preferentemente con una pureza de aproximadamente el 95 % o más. Preferentemente, la cetorreductasa está sustancialmente libre de células.
Como se usa en el presente documento, el término "cofactor" se refiere a un compuesto no proteico que opera en combinación con una enzima cetorreductasa. Los cofactores adecuados para su uso con enzimas cetorreductasa incluyen, pero sin limitación, nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADP+), nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido (NADPH), nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) y nicotinamida adenina dinucleótido reducido (NADH). Generalmente se añade la forma reducida del cofactor a la mezcla de reacción.
Las enzimas KRED a menudo pueden usar el cofactor fosforilado o no fosforilado.
Las enzimas KRED se pueden usar en lugar de procedimientos químicos para la conversión de diferentes compuestos ceto en productos de alcohol quiral. Estas conversiones biocatalíticas pueden emplear células completas que expresan la cetorreductasa para reducciones biocatalíticas de cetonas, o enzimas purificadas, particularmente en aquellos casos en los que la presencia de múltiples cetorreductasas en células completas afectaría negativamente a la pureza enantiomérica y al rendimiento del producto deseado. Para aplicaciones in vitro, típicamente se usa una enzima regeneradora de cofactor (NADH o NADPH) tal como glucosa deshidrogenasa (GDH) y formiato deshidrogenasa junto con la cetorreductasa.
Los ejemplos que ilustran el uso de enzimas KRED naturales o modificadas genéticamente en procesos biocatalíticos para generar compuestos químicos útiles incluyen la reducción asimétrica de ésteres de 4-cloroacetoacetato (Zhou, J. Am. Chem. Soc. 1983 105:5925-5926; Santaniello, J. Chem. Res. (S) 1984:132-133; Patente de EE. UU. n.° 5.559.030; Patente de EE. UU. n.° 5.700.670 y Patente de EE. UU. n.° 5.891.685), reducción de ácidos dioxocarboxílicos (por ejemplo, patente de EE. UU. n.° 6.399.339), reducción de (S)-cloro-5-hidroxi-3-oxohexanoato de terc-butilo (por ejemplo, patente de EE. UU. n.° 6.645.746 y WO 01/40450), reducción de compuestos basados en pirrolotriazina (por ejemplo, solicitud de EE. UU. n.° 2006/0286646); reducción de acetofenonas sustituidas (por ejemplo, patente de EE. UU. n.° 6.800.477); y reducción de cetotiolanos (WO 2005/054491).
Se han notificado varias secuencias de enzimas y genes KRED, que incluyen: Candida magnoliae (N.° de Ent. del Genbank JC7338; GI: 11360538); Candida parapsilosis (N.° de Ent. del Genbank BAA24528.1; GI:2815409), Sporobolomyces salmonicolor (N.° de Ent. del Genbank AF160799; GI:6539734); Lactobacillus kefir (N.° de Ent. del Genbank AAP94029.1; GI: 33112056); Lactobacillus brevis (N.° de Ent. del Genbank 1NXQ_A; GI: 30749782); Exiguobacterium acetylicum (N.° de Ent. del Genbank BAD32703.1) y Thermoanaerobium brockii (N.° de Ent. del Genbank P14941; GI: 1771790).
La reducción catalizada por KRED del compuesto (II) al compuesto (III) requiere que un donante de electrones esté presente en la solución. Generalmente, se usa un cofactor como donante de electrones en la reacción de reducción por KRED. El cofactor opera en combinación con KRED y/o glucosa deshidrogenasa (abreviada GDH) en el proceso. Los cofactores adecuados incluyen, pero sin limitación, NADP+ (nicotinamida adenina dinucleótido fosfato), NADPH (la forma reducida de NADP+), NAD+ (nicotinamida adenina dinucleótido) y NADH (la forma reducida de NAD+). Generalmente, se añade la forma reducida del cofactor a la mezcla de reacción. Por consiguiente, se llevan a cabo los métodos de la presente divulgación en donde está presente un donante de electrones seleccionado entre cofactor NADPH o cofactor NADH. En ciertas realizaciones, se puede llevar a cabo el método en donde las condiciones de reacción comprenden una concentración de cofactor NADH o NADPH de aproximadamente 0,03-0,5 g/l, aproximadamente 0,05-0,3 g/l, aproximadamente 0,1-0,2 g/l, aproximadamente 0,5 g/l, aproximadamente 0,1 g/l o aproximadamente 0,2 g/l.
En algunas realizaciones del proceso, se usa un sistema de reciclaje de cofactor para regenerar el cofactor NADPH/NADH a partir de NADP+/NAD+ producido en la reacción. Un sistema de reciclaje de cofactor se refiere a un conjunto de reactivos que reducen la forma oxidada del cofactor (por ejemplo, NADP+ a NADPH), permitiendo así que continúe la catálisis de KRED.
El sistema de reciclaje de cofactor puede comprender además un sustrato secundario y un catalizador, por ejemplo, el sustrato glucosa y la enzima GDH, que cataliza la reducción de la forma oxidada del cofactor por el reductor. Los sistemas de reciclaje de cofactor para regenerar NADH o NADPH a partir de NAD+ o NADP+, respectivamente, son conocidos en la técnica y pueden usarse en los métodos descritos en el presente documento. Los sistemas de reciclaje de cofactores de ejemplo adecuados que pueden emplearse incluyen, pero sin limitación, glucosa y glucosa deshidrogenasa (GDH), formiato y formiato deshidrogenasa (FDH), glucosa-6-fosfato y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, un alcohol secundario y alcohol secundario deshidrogenasa, fosfito y fosfito deshidrogenasa, hidrógeno molecular e hidrogenasa, y similares.
Los alcoholes secundarios adecuados incluyen alcoholes secundarios inferiores y arilalquilcarbinoles. Ejemplos de alcoholes secundarios inferiores incluyen isopropanol, 2-butanol, 3-metil-2-butanol, 2-pentanol, 3-pentanol, 3,3-dimetil-2-butanol y similares. En una realización particularmente preferida, el alcohol secundario es alcohol isopropílico (IPA). Los aril-alquilcarbinoles adecuados incluyen 1-ariletanoles sustituidos y no sustituidos.
Estos sistemas se pueden usar en combinación con NADP+/NADPH o NAD+/NADH como cofactor.
También se puede usar la regeneración electroquímica usando hidrogenasa como sistema de regeneración de cofactor. Véase, por ejemplo, las patentes de EE.U u .N.° 5.538.867 y 6.495.023.
Los sistemas de regeneración de cofactor químico que comprenden un catalizador metálico y un agente reductor (por ejemplo, hidrógeno molecular o formiato) también se pueden usar en combinación con NADP+/NADPH o NAD+/NADH como cofactor. Véase, por ejemplo, la publicación PCT WO 2000/053731.
En algunas realizaciones de la presente divulgación, el sistema de reciclaje de cofactor puede comprender glucosa deshidrogenasa (GDH), que es una enzima dependiente de NAD+ o NADP+ que cataliza la conversión de D-glucosa (dextrosa) y NAD+ o NADP+ en ácido glucónico y NADH o NADPH, respectivamente. Las enzimas GDH adecuadas para su uso en la práctica de los procesos descritos en el presente documento incluyen tanto GDH de origen natural como GDH de origen no natural. En la bibliografía se han notificado genes que codifican la glucosa deshidrogenasa de origen natural, por ejemplo, el gen de Bacillus subtilis 61297 GDH, B. cereus ATCC 14579 y B. megaterium. Las GDH de origen no natural generadas usando, por ejemplo, mutagénesis, evolución dirigida y similares, se proporcionan en la publicación PCT WO 2005/018579 y en las publicaciones de EE. UU. N.° 2005/0095619 y 2005/0153417.
En algunas realizaciones, el sistema de reciclaje de cofactor puede comprender una formiato deshidrogenasa (FDH), que es una enzima dependiente de NAD+ o NADP+ que cataliza la conversión de formiato y NAD+ o NADP+ en dióxido de carbono y NADH o NADPH, respectivamente.
Como se usa en el presente documento, el término "formiato" se refiere al anión formiato (HCOO-), ácido fórmico (HCOOH) y mezclas de los mismos.
Las FDH adecuadas para su uso como sistemas de regeneración de cofactor en la reacción catalizada por KRED descrita en el presente documento incluyen formiato deshidrogenasas de origen natural y no natural. Las formiato deshidrogenasas adecuadas se describen en la publicación PCT WO 2005/018579.
El formiato se puede proporcionar en forma de una sal, típicamente una sal alcalina o de amonio (por ejemplo, HCO2Na, KHCO2, NH4HCO2 y similares), en forma de ácido fórmico, típicamente ácido fórmico acuoso, o mezclas de los mismos. Se puede usar una base o tampón para proporcionar el pH deseado.
En algunas realizaciones, el sistema de regeneración de cofactor puede comprender la misma enzima KRED que cataliza la reducción del compuesto (II) al compuesto (III). En dicha realización, la misma KRED que cataliza la reducción del compuesto (II) al compuesto (III) también cataliza la oxidación de un alcohol secundario (por ejemplo, oxidación de isopropanol a acetona) y, de este modo, reduce simultáneamente el NAD+ o NADP+ a NADH o NADPH. Por consiguiente, en algunas realizaciones, la conversión catalizada por KRED del compuesto (II) en el compuesto (III) se puede llevar a cabo en presencia de un alcohol secundario (por ejemplo, IPA) y sin ninguna coenzima (por ejemplo, GDH) presente en la solución para el reciclaje del cofactor NADPh o NADH. En dichas realizaciones, las condiciones de reacción adecuadas pueden comprender una concentración de IPA de aproximadamente el 55-75 % (v/v), una carga de cofactor NADPH o NAD<h>de aproximadamente 0,03-0,5 g/l, y en donde no está presente ninguna enzima de reciclaje de cofactor aparte de la propia KRED.
En una realización, se usa una enzima KRED acoplada con un sistema de reciclaje de cofactor y un cofactor NADPH para reducir (II) y obtener el compuesto (III). Las condiciones de reacción adecuadas para la reducción catalizada por KRED de (II) al compuesto (III) se proporcionan a continuación y en los ejemplos.
La etapa de reducción enzimática se lleva a cabo en un disolvente acuoso.
La etapa de reducción enzimática se lleva a cabo, preferentemente, en un disolvente acuoso y un codisolvente. El codisolvente ayuda a mejorar la solubilidad de compuestos que tienen solubilidad en agua deficiente, aumentando así la velocidad global de la reacción. Los codisolventes adecuados incluyen disolventes orgánicos, por ejemplo metanol, IPA, 1-octanol, acetato de etilo, acetato de metilo, acetato de butilo, heptano, octano, metil t-butil éter (MTBE), dimetilsulfóxido (DMSO), tetrahidrofurano (THF), 2-metiltertahidrofurano (Me-THF), tolueno y similares (incluyendo sus mezclas) y líquidos iónicos, por ejemplo tetrafluoroborato de 1 -etil-4-metilimidazolio, tetrafluoroborato de 1 -butil-3-metilimidazolio, hexafluorofosfato de 1 -butil-3-metilimidazolio y similares.
En algunas realizaciones, se pueden usar disolventes acuosos, incluyendo agua y sistemas codisolventes acuosos. La proporción de agua respecto a disolvente orgánico en el sistema codisolvente está típicamente en el intervalo de aproximadamente 90:10 a aproximadamente 95:05 (v/v) de agua respecto a disolvente orgánico. Preferentemente, el disolvente no supera el 5 % del volumen total de la solución de reacción.
El disolvente acuoso (agua o sistema codisolvente acuoso) puede tener un pH tamponado o no estar tamponado. Generalmente, la reducción se puede llevar a cabo a un pH de aproximadamente 10 o inferior, normalmente en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 10. En algunas realizaciones, la reducción se lleva a cabo a un pH de aproximadamente 9 o inferior, normalmente en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 9. En algunas realizaciones, la reducción se lleva a cabo a un pH de aproximadamente 8 o inferior, a menudo en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 8, y normalmente en el intervalo de aproximadamente 6 a aproximadamente 8. La reducción también se puede llevar a cabo a un pH de aproximadamente 7,8 o inferior o 7,5 o inferior. En una realización preferida, la reducción se lleva a cabo a pH neutro, es decir, aproximadamente 7.
Durante el curso de las reacciones de reducción, el pH de la mezcla de reacción puede cambiar. El pH de la mezcla de reacción se puede mantener a un pH deseado o dentro de un intervalo de pH deseado mediante la adición de un ácido o una base durante el curso de la reacción. Como alternativa, el pH se puede controlar usando un disolvente acuoso que comprende un tampón.
En la técnica se conocen tampones adecuados para mantener los intervalos de pH deseados e incluyen, por ejemplo, tampón fosfato, tampón trietanolamina y similares. También se pueden usar combinaciones de tamponamiento y adición de ácido o base.
De acuerdo con una realización preferida, el proceso de la presente invención se puede llevar a cabo en presencia de tampón fosfato a pH 7.
Otra solución tampón que podría usarse para llevar a cabo la reacción mencionada anteriormente, tal como es, por ejemplo, tampón clorhidrato de tris(hidroximetil)aminometano.
Como bases para la neutralización son adecuadas bases orgánicas, por ejemplo aminas, alcóxidos y similares, así como bases inorgánicas; por ejemplo, sales de hidróxido (por ejemplo, NaOH), sales de bicarbonato (por ejemplo, NaHCO), sales de carbonato (por ejemplo, K2CO3), sales de fosfato básicas (por ejemplo, K2HPO4, Na3PO4), y similares.
Los ácidos adecuados para añadir durante el curso de la reacción para mantener el pH incluyen ácidos orgánicos, por ejemplo ácidos carboxílicos, ácidos sulfónicos, ácidos fosfóricos y similares, ácidos minerales, por ejemplo ácidos hidrohálicos (tales como ácido clorhídrico), ácido sulfúrico, ácido fosfórico y similares, sales ácidas, por ejemplo sales de dihidrógenofosfato (por ejemplo, KH2PO4), sales de bisulfato (por ejemplo, NaHSO4) y similares. Algunas realizaciones utilizan ácido fórmico, de modo que se mantienen tanto la concentración de formiato como el pH de la solución.
La etapa de reducción se lleva a cabo típicamente a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 0 °C a aproximadamente 75 °C. Preferentemente, la etapa de reducción se lleva a cabo a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 10°C a aproximadamente 55 °C. En otras realizaciones más, se lleva a cabo a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 45 °C. En una realización particularmente preferida, la reacción se lleva a cabo en condiciones ambientales.
La etapa B) del proceso de acuerdo con la invención puede comprender una etapa b-1) de conversión de R1 y/o R2 de acetilo a hidrógeno.
También se describe en el presente documento que la etapa B) del proceso puede comprender la etapa b-1) de conversión de R1 y R2 de grupos metilo o bencilo o un alquilo C1-C4 unidos para formar un ciclo a hidrógeno.
La etapa B) del proceso puede comprender la etapa b-1a) de conversión de R1 de grupos acetilo, metilo, bencilo, alquilo C1-C4 unidos para formar un ciclo a hidrógeno;
es decir, para obtener el compuesto de fórmula (IV):
La etapa B) del proceso puede comprender la etapa b-1b) de conversión de R2 de grupos acetilo, metilo, bencilo, un alquilo C1-C4 unidos para formar un ciclo a hidrógeno;
es decir, para obtener el compuesto de fórmula (V):
La etapa B) del proceso puede comprender la etapa b-1) de conversión simultánea de R1 y R2 de grupos acetilo, metilo, bencilo, un alquilo C1-C4 unidos para formar un ciclo a hidrógeno;
es decir, para obtener el compuesto de fórmula (VI):
La etapa b-1) del proceso de acuerdo con la invención puede ser una etapa de hidrólisis del grupo estérico cuando R1 y R2 son acetilo.
La etapa b-1) del proceso puede ser una etapa de conversión de R1 y R2 en hidrógeno, dependiendo de la naturaleza de los R1 y R2, se puede llevar a cabo de manera diferente, usando el conocimiento general común del experto en la materia, evidencia del cual se puede encontrar en el libro de Theodora W Greene con título "Protective Groups in Organic Synthesis" o en el libro de Anthony J. Pearson con título "Handbook of Reagents for Organic Synthesis - Activating Agents and Protecting Groups".
La etapa B) del proceso de acuerdo con la invención puede comprender una etapa b-2) de conversión de R3 de un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado a hidrógeno; es decir, para obtener el compuesto de fórmula (VII):
La etapa b-2) del proceso de acuerdo con la invención puede ser una etapa de conversión de R3 en hidrógeno (es decir, hidrólisis del grupo estérico), dependiendo de la naturaleza del R3, se puede llevar a cabo de manera diferente, usando el conocimiento general común del experto en la materia, evidencia del cual se puede encontrar en el libro de Theodora W Greene con el título "Protective Groups in Organic Synthesis" o en el libro de Anthony J. Pearson con el título "Handbook of Reagents for Organic Synthesis - Activating Agents and Protecting Groups". El proceso adecuado para la eliminación (es decir, conversión de R3 en hidrógeno) de R3, cuando es un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado, es una hidrólisis. Este proceso requiere un tratamiento del compuesto de fórmula (III) con una solución de base (por ejemplo, NaOH, KOH, LiOH) en agua o un disolvente alcohólico o una mezcla de los mismos.
La etapa B) del proceso de acuerdo con la invención puede comprender una etapa b-3) de conversión de R4 de grupo protector de amina a hidrógeno; es decir, para obtener el compuesto de fórmula (VIII):
La etapa b-3) del proceso de acuerdo con la invención puede ser una etapa de escisión del grupo protector de amina.
La etapa b-3) del proceso de acuerdo con la invención puede comprender la etapa de conversión de R4 en hidrógeno (es decir, escisión del grupo protector de amina), dependiendo de la naturaleza de R4, se puede llevar a cabo de manera diferente, usando el conocimiento general común del experto en la materia, evidencia del cual se puede encontrar en el libro de Theodora W Greene con título "Protective Groups in Organic Synthesis" o en el libro de Anthony J. Pearson con título "Handbook of Reagents for Organic Synthesis - Activating Agents and Protecting Groups".
De acuerdo con una realización preferida, las etapas b-1), b-2) y b-3) se pueden realizar en cualquier combinación de orden.
De acuerdo con una realización preferida, la etapa B) del proceso de la presente invención puede comprender la etapa de hidrólisis simultánea del grupo estérico y escisión del grupo protector de amina.
De acuerdo con una realización preferida, la etapa B) del proceso de la presente invención puede comprender la etapa de conversión simultánea de R3 de un grupo alquilo lineal o ramificado C1-C4 a hidrógeno y conversión de R4 de un grupo protector de amina a hidrógeno;
es decir, para obtener el compuesto de fórmula (IX):
De acuerdo con una divulgación preferida, la etapa B) del proceso se caracteriza por las simultáneas:
• conversión de R1 y R2 de grupos acetilo, metilo, bencilo, un alquilo C1-C4 unidos para formar un ciclo a hidrógeno;
• conversión de R3 de un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado a hidrógeno;
es decir, para obtener el compuesto de fórmula
De acuerdo con una divulgación preferida, la etapa B) del proceso de la presente invención, se caracteriza por las simultáneas:
• conversión de R1 y R2 de grupos acetilo, metilo, bencilo, un alquilo C1-C4 unidos para formar un ciclo a hidrógeno;
• conversión de R4 del grupo protector de amina a hidrógeno;
es decir, para obtener el compuesto de fórmula (XI):
De acuerdo con una realización preferida, la etapa B) del proceso de la presente invención, se caracteriza por las simultáneas:
• conversión de R1 y R2 de acetilo a hidrógeno;
• conversión de R3 de un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado a hidrógeno;
es decir, para obtener el compuesto de fórmula (X).
De acuerdo con una realización preferida, la etapa B) del proceso de la presente invención, se caracteriza por las simultáneas:
• conversión de R1 y R2 de acetilo a hidrógeno;
• conversión de R4 del grupo protector de amina a hidrógeno;
es decir, para obtener el compuesto de fórmula (XI).
De acuerdo con una realización preferida, la etapa B) del proceso de la presente invención, se caracteriza por las simultáneas:
• conversión de R1 y R2 de acetilo a hidrógeno;
• conversión de R3 de un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado a hidrógeno;
• conversión de R4 del grupo protector de amina a hidrógeno;
es decir, para obtener el compuesto de fórmula
La etapa B) del proceso de acuerdo con la invención puede comprender una etapa o etapas de purificación o resolución por cristalización.
De acuerdo con una realización preferida, la etapa B) puede comprender una etapa b-4) de purificación o resolución del compuesto de fórmula (III) o (IV) o (V) o (VI) o (VII) o (VIII) o (IX) o (X) o (XI); Esto permite una purga eficiente del isómero no deseado, para obtener un enriquecimiento eficiente en términos de exceso enantiomérico.
El proceso de la presente invención, al final de la etapa B), proporciona por tanto droxidopa que tiene una alta pureza óptica, es decir, droxidopa que tiene típicamente una pureza óptica superior al 99,0%(es decir), superior al 99,5 % expresada como % A/A de HPLC.
Preferentemente, el proceso de la presente invención proporciona droxidopa que tiene una alta pureza óptica, es decir, droxidopa que tiene típicamente una pureza óptica superior al 99,4 % (es decir, superior al 99,7 % de % A/A de HPLC).
El exceso enantiomérico o "e.e." o "ee" para abreviar se define como la diferencia absoluta entre las fracciones molares de dos enantiómeros y a menudo se presenta como porcentaje de exceso enantiomérico, % de ee, que se obtiene mediante el siguiente cálculo: % de ee=|R-S|/|R+S|*100 %, en donde la cantidad de enantiómeros individuales a menudo se puede medir mediante cromatografía quiral. ;Obviamente y opcionalmente, el proceso de la presente invención se puede volver a aplicar sobre la droxidopa ya purificada ópticamente de modo que se pueda preparar droxidopa que tenga una pureza óptica del 100 %. ;La proporción entre los isómeros ópticos treo y eritro de 50:50 a 99:1 se entiende como una proporción peso a peso, que sin embargo corresponde a la cantidad determinada mediante % A/A de HPLC. ;De acuerdo con una realización preferida del proceso de la presente invención, el compuesto de fórmula (I) tiene una proporción diastereoisomérica de treo y eritro (treo/eritro) comprende de 50/50 a 90/10, más preferentemente de 50/50 y 70/30. ;De acuerdo con una realización más preferida del proceso de la presente invención, el compuesto de fórmula (I) tiene una proporción diastereoisomérica de 70/30 de treo y eritro (treo/eritro). ;De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, en la etapa b-4), la proporción entre los isómeros ópticos del compuesto (III) o (IV) o (V) o (VI) o (VII) o (VIII) o (IX) o (X) o (XI), es de 75:25 a 85:15 ya que esta proporción de isómeros es la que se logra típicamente mediante una reducción enzimática del proceso de la presente invención. ;Ejemplos que ilustran la purificación o resolución mediante procesos de cristalización, usando el conocimiento general común del experto en la materia, evidencia del cual se puede encontrar en las solicitudes de patente japonesa 49.252/75, 36.233/79, 29.551/81 y 32.540/76; las patentes europeas n.° 084928; n.° 128684; la patente estadounidense n.° 3920728. ;De acuerdo con una realización preferida del proceso de la presente invención, la reacción del compuesto de fórmula (II) para dar el compuesto de fórmula (I) se produce con una conversión comprendida en el intervalo del 20 % a al menos el 95 %. ;En particular, cuando la reacción se lleva a cabo con una KRED KRED-130, la conversión es al menos del 95 %. En particular, el compuesto de fórmula (I) tiene una proporción diastereoisomérica de 70/30 de treo y eritro (treo/eritro), cuando el compuesto de reacción de fórmula (II) se lleva a cabo con una KRED KRED-130. ;De acuerdo con una realización preferida del proceso de la presente invención, el compuesto de fórmula (I) tiene una proporción diastereoisomérica de al menos 75/30 y la KRED KRED-130 empleada. ;De acuerdo con una realización preferida del proceso de la presente invención, la reacción del compuesto de fórmula (II) para dar el compuesto de fórmula (III) se produce con una conversión comprendida en el intervalo del 20 % a al menos el 95 %. ;En particular, cuando la reacción se lleva a cabo con una KRED KRED-130, la conversión es al menos del 95 %. De acuerdo con una realización preferida del proceso de la presente invención, el compuesto de fórmula (III) tiene una proporción diastereoisomérica de treo y eritro (treo/eritro) comprende de 50/50 a 90/10, más preferentemente de 50/50 y 70/30. ;De acuerdo con una realización más preferida del proceso de la presente invención, el compuesto de fórmula (III) tiene una proporción diastereoisomérica de 70/30 de treo y eritro (treo/eritro). ;En particular, el compuesto de fórmula (III) tiene una proporción diastereoisomérica de 70/30 de treo y eritro (treo/eritro), cuando el compuesto de reacción de fórmula (II) se lleva a cabo con una KRED KRED-130. ;De acuerdo con una realización preferida del proceso de la presente invención, el compuesto de fórmula (III) tiene una proporción diastereoisomérica de al menos 75/30 y la KRED KRED-130 empleada. ;La proporción diastereoisomérica se define como la proporción absoluta entre las fracciones molares de isómero treo y la fracción molar del isómero eritro, que se obtiene mediante el siguiente cálculo: proporción =|Treo|/|Eritro|, en donde la cantidad de enantiómeros individuales puede medirse a menudo mediante cromatografía quiral. ;El compuesto de fórmula (III): ;;; ;; en donde R1, R2 son independientemente hidrógeno o acetilo, R3 es hidrógeno, un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado y R4 es hidrógeno o un grupo protector de amina; ;puede prepararse, por tanto, mediante un proceso que comprende una etapa de reducción enzimática de un compuesto de fórmula (II): ; ;; en donde R1, R2, R3, R4 tienen el mismo significado que anteriormente; por medio de una enzima cetorreductasa. El compuesto de fórmula (II): ;;; ;; en donde R1, R2 son independientemente hidrógeno o acetilo, R3 es hidrógeno, un grupo alquilo Cr C4 lineal o ramificado y R4 es hidrógeno o un grupo protector de amina; ;se puede usar para las preparaciones del compuesto de fórmula (III): ;;; ;; en donde R1, R2, R3, R4 tienen el mismo significado que anteriormente; ;o para la preparación de droxidopa de fórmula (I) o una sal de la misma: ;;; ;; por medio de una enzima cetorreductasa. ;Por tanto, se usa una cetorreductasa para llevar a cabo la reducción enzimática del compuesto de fórmula (II): ;;; ;; en donde R1, R2 son independientemente hidrógeno o acetilo, R3 es hidrógeno, un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado y R4 es hidrógeno o un grupo protector de amina, para proporcionar un compuesto de fórmula (III): ;;; ;; en donde R1, R2, R3, R4 tienen el mismo significado que anteriormente; ;o para proporcionar droxidopa de fórmula (I) o una sal de la misma: ; ;; Por tanto, de acuerdo con una realización preferida, la cetorreductasa usada para llevar a cabo la reducción enzimática del compuesto de fórmula (II), es KRED-130. ;Además, el proceso de reducción enzimática es ventajoso desde el punto de vista medioambiental en comparación con el proceso de la técnica anterior en donde se usan catalizadores quirales organometálicos en la técnica anterior. El uso de una enzima como agente reductor es más económico en comparación con el uso de un catalizador quiral organometálico. Además, la resolución usando amina quiral de acuerdo con métodos conocidos conduce a aproximadamente un 50 % de pérdida de isómero no deseado y, por tanto, no es industrialmente adecuada. ;SECCION EXPERIMENTAL ;La enzima cetorreductasa está ampliamente disponible en el mercado, por ejemplo, suministrada por Codexis (EE. UU.), por ejemplo el kit de detección de KRED Codexis. ;El compuesto material de partida de fórmula (II) que tiene la siguiente fórmula o: ;;; ;; en donde R1, R2 son independientemente hidrógeno o acetilo, R3 es hidrógeno o un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado y R4 es hidrógeno o un grupo protector de amina; se preparan de acuerdo con el método de síntesis conocido de la técnica anterior. ;Se han descrito algunos métodos para la preparación del compuesto de fórmula (II), por ejemplo, Kazuishi Makino en Journal of the American Chemical Society (2005), 127, (16), 5784-5785; Brinton Seashore-Ludlow en Organic Letters (2010), 12, (22), 5274-5277; Zheng Long-Sheng et al en Chemical Communications, 54(3), 283-286; 2018; Guan, Yu-Qing et al en Chemical Communications, 53(58), 8136-8139; 2017; Seashore-Ludlow, Brinton et al en Chemistry A European Journal, 18(23), 7219-7223, 2012. ;Volúmenes significa volumen de disolvente por unidad de producto, por tanto, por ejemplo, 1 volumen es 1 litro por 1 kilo, o 1 ml por 1 gramo, o 1 microlitro por 1 miligramo. Por tanto, 10 volúmenes significan, por ejemplo, 10 litros por 1 kilogramo de sustancia. ;Ejemplo 1: Detección del kit de detección de KRED Codexis® en la reducción enzimática del compuesto de fórmula (II) en donde R1 y R2 es acetilo, R3 es etilo, R4 es Boc. ;;; ;;; La reacción se realizó en 1 ml en un vial y se agitó durante la noche a temperatura ambiente para las enzimas dependientes de isopropanol, las condiciones de reacción fueron: tampón fosfato de sodio 115,2 mM, sulfato de magnesio 1,53 mM, NADP+ 1 mM, isopropanol al 10 % v/v, 10 mg/ml de compuesto de fórmula (II) en donde R1 y R2 son acetilo, R3 es etilo, R4 es Boc., 10 mg/ml de enzima, pH 7. ;Para las enzimas dependientes de glucosa, las condiciones de reacción fueron: fosfato de sodio 128 mM, sulfato de magnesio 1,7 mM, NADP+ 1,1 mM, NAD+ 1,1 mM, D-glucosa 80 mM, glucosa deshidrogenasa 4,3 U/ml, 10 mg/ml de compuesto de fórmula (II) en donde R1 y R2 son acetilo, R3 es etilo, R4 es Boc., pH 7. ;La reacción se analizó en HPLC-MS para confirmar la masa de producto deseada. También la pureza quiral se evaluó mediante HPLC y se observó entre la forma treo y eritro. ;Ejemplo 2: Síntesis de droxidopa BOC de fórmula (I) mediante reducción enzimática del compuesto de fórmula (II) en donde R1 y R2 es acetilo, R3 es etilo, R4 es Boc. ;;; ;;; Compuesto de fórmula (II) Droxidopa BOC ;;A 1 g de compuesto de fórmula (II) (en donde R1 y R2 son acetilo, R3 es etilo, R4 es Boc) se le añadieron 20 mg de MgSO4, 50 mg de CDX-901 (enzima de regeneración de cofactor, glucosa deshidrogenasa), 200 mg de KRED-130, 50 mg de NADP+, 1 g de glucosa en 50 ml de tampón fosfato 100 mM a pH 7. La reacción se realizó a 25 °C y se mantuvo a pH 7 mediante la adición de NaOH 0,5 M mediante titulación automática. Después de 64 h de análisis de la reacción, se obtiene aproximadamente el 80% de droxidopa BOC. La reacción se interrumpió con 100 ml de EtOAc y 1 g de dicalita y se filtró para eliminar la enzima y se separó la capa orgánica. La capa acuosa se lavó dos veces con 100 ml de EtOAc. La capa orgánica unida se destiló hasta obtener un residuo obteniendo 0,7 g de droxidopa BOC en bruto. Producto analizado mediante análisis por HPLC-MS. ;;Ejemplo 3: Síntesis de droxidopa BOC de fórmula (I) mediante reducción enzimática del compuesto de fórmula (II) en donde R1 y R2 es acetilo, R3 es etilo, R4 es Bo C. ;;; ;;; A 3,0 g del compuesto de fórmula (II) (en donde R1 y R2 son acetilo, R3 es etilo, R4 es BOC) se le añadió una solución de 60 mg de MgSO4, 150 mg de CDX-901 (enzima de regeneración de cofactor, glucosa deshidrogenasa ), 600 mg de KRED-130, 150 mg de NADP+, 3 g de glucosa en 150 ml de tampón fosfato 100 mM a pH 7. La mezcla de reacción se agitó a 25 °C y se mantuvo a pH 7 mediante la adición de NaOH 0,5 M mediante titulación automática. Después de 15 y 24 h de reacción se añadieron 150 mg de NADP+ y 150 mg de CDX-901. La conversión de la reacción se supervisó mediante HPLC y, después de 120 h, la reacción se interrumpió con 100 ml de EtOAc y 1 g de dicalita, a continuación la suspensión se filtró para eliminar la enzima y se separó la capa orgánica. La capa acuosa se lavó dos veces con 50 ml de EtOAc. La capa orgánica unida se secó con Na2SO4 y se destiló hasta obtener un residuo obteniendo 3,0 g de droxidopa BOC en bruto que cristalizó espontáneamente. El análisis del cristal aislado de droxidopa BOC fue de aproximadamente 60 % de A. ;;Ejemplo 4: Síntesis de éster etílico de droxidopa de fórmula (I) mediante escisión química del grupo Boc de protección de N. ;;; ;;; Se disolvieron 70 mg de droxidopa BOC obtenidos en el ejemplo 3 en 1 ml de diclorometano. A 25 °C se añadió 1 ml de TFA y la conversión se supervisó mediante HPLC. Después de la escisión completa de BOC, el producto éster etílico de droxidopa se aisló por concentración hasta obtener un residuo con un flujo de nitrógeno. ;Ejemplo 5: Síntesis de droxidopa de fórmula (I) mediante hidrólisis química de R3, en donde R3 es etilo. ;;; ;;; A 25 mg de éster etílico de droxidopa aislado obtenido en el ejemplo 4 se le añadió 1 ml de NaOH 3M. La reacción se mezcló durante 2 h a temperatura ambiente y se supervisó mediante HPLC. Después de completar la hidrólisis, la reacción se neutralizó con una solución de HCl al 10 % y se aisló la droxidopa en bruto concentrando la solución hasta obtener un residuo con un flujo de nitrógeno. Se analizó la pureza diastereoisomérica de la droxidopa aislada mediante HPLC, donde se observó una proporción de 70:30 % de A entre la forma treo droxidopa y eritro droxidopa. ;Ejemplo 6: Síntesis de éster etílico de droxidopa de fórmula (I) mediante escisión química del grupo Boc protector de N. ;;; ;;; Se disolvió 1 g de droxidopa BOC en bruto obtenida en el ejemplo 3 en 10 ml de diclorometano. A 25 °C se añadieron 1,5 ml de TFA y la conversión se supervisó mediante HPLC. Después de la escisión completa de BOC, el pH se neutralizó con la adición de una solución saturada de NaHCO3. El producto se aisló por concentración hasta obtener un residuo obteniendo aproximadamente 1,3 g de éster etílico de droxidopa en bruto. El producto aislado se analizó en HPLC-MS para confirmar la masa (Mw 241). También se evaluó la pureza diastereoisomérica mediante HPLC, donde se observó una proporción de 72:28 % de A entre la forma treo y eritro. ;;Ejemplo 7: Síntesis de droxidopa de fórmula (I) mediante hidrólisis química de R3, en donde R3 es etilo. ;;; ;;; A 100 mg de éster etílico de droxidopa aislado del ejemplo 6 se le añadió 1 ml de agua. A continuación se añadieron 100 | l de NaOH 10 M y se mezcló durante 30 min. La reacción se supervisó mediante HPLC. Después de la hidrólisis completa, la reacción se neutralizó con una solución de HCl al 10 % y la droxidopa en bruto se aisló por concentración hasta obtener un residuo con un flujo de nitrógeno. El producto aislado, aproximadamente 100 mg, se analizó para evaluar la pureza diastereoisomérica mediante HPLC. Se observó una proporción de 70:30 % de A entre la forma treo droxidopa y eritro droxidopa. ;;Ejemplo 8: Síntesis de droxidopa BOC de fórmula (I) mediante reducción enzimática del compuesto de fórmula (II) en donde R1 y R2 es acetilo, R3 es etilo, R4 es BOC. ;;; ;; Compuesto de fórmula (II) Droxidopa BOC ;;En 75 ml de tampón fosfato 50 mM a pH 7 se añadieron 20 mg de MgSO4, 25 mg de CDX-901 (enzima de regeneración de cofactor, glucosa deshidrogenasa), 200 mg de KRED-130, 75 mg de NADP+, 1,3 g de glucosa. La suspensión se mezcló a 30 °C y el pH se corrigió a 7 con NaOH 0,5 M. Posteriormente una solución compuesta por 1,5 g de compuesto de fórmula (II) (en donde R1 y R2 es acetilo, R3 es etilo, R4 es BOC) disuelta en 3,25 ml de DMSO se añadió en 10 min a la suspensión. La reacción se realizó a 30 °C y se mantuvo a pH 7 mediante la adición de NaOH 0,5 M mediante titulación automática. Después de 9 h y 17 h de reacción se añadieron 75 mg de NADP+ y 25 mg de CDX-901. La conversión de la reacción se supervisó mediante HPLC y, después de 22 h, la reacción se filtró para eliminar el material no disuelto. A las aguas madres se añadieron 50 ml de EtOAc y 1,5 g de dicalita, se mezclaron durante 30 min, a continuación se filtraron y se lavaron con 50 ml de EtOAc. A la solución obtenida se le añadieron 20 ml de NaCl y se separó la capa orgánica. La capa acuosa se extrajo de nuevo con 20 ml de EtAc y la capa orgánica unida se lavó con 30 ml de agua. La capa orgánica se destiló hasta obtener un residuo y se destiló dos veces con 30 ml de DCM. Finalmente se obtuvieron y analizaron 0,9 g de droxidopa BOC. ;;Ejemplo 9: Síntesis de éster etílico de droxidopa de fórmula (I) mediante escisión química del grupo Boc protector de N. ;;; ;;; Se disolvieron 0,9 g de droxidopa BOC obtenidos en el ejemplo 8 en 10 ml de diclorometano. A continuación, a la solución obtenida a 25 °C se le añadieron 1,5 ml de TFA en 10 min. La mezcla de reacción obtenida se agitó a 25 °C durante 1 h. La conversión se supervisó mediante HPLC. Después de la escisión completa de BOC, el pH se neutralizó con la adición de una solución saturada de NaHCO3. El producto se aisló por evaporación hasta obtener un residuo obteniendo aproximadamente 0,9 g de éster etílico de droxidopa en bruto. El producto aislado se analizó en HPLC-MS para confirmar la masa (Mw 241). También se evaluó la pureza diastereoisomérica mediante HPLC, donde se observó una proporción de 72:28 % de A entre las supuestas formas treo y eritro. ;;Ejemplo 10: Síntesis de droxidopa de fórmula (I) mediante hidrólisis química de R3, en donde R3 es etilo. ;;; ;;; A 0,5 mg de éster etílico de droxidopa aislado obtenido en el ejemplo 9 se le añadieron 6 ml de NaOH 3 M. La mezcla de reacción se agitó durante 1 h a 25 °C y la conversión se supervisó mediante HPLC. Después de completar la hidrólisis, la reacción se neutralizó con una solución de HCl al 10 % y se aisló la droxidopa en bruto concentrando la solución hasta obtener un residuo con un flujo de nitrógeno. El producto aislado, aproximadamente 0,5 g, se analizó para evaluar la pureza diastereoisomérica mediante HPLC, donde se observó una proporción de 72:28 % de A entre la forma treo droxidopa y eritro droxidopa. ;;Ejemplo 11: Método analítico para analizar el producto de reacción. Determinación de pureza, pureza diastereoisomérica y ensayo mediante HPLC: ;;Condiciones cromatográficas: ;;Columna: Luna C18(2) 100 Á, 150 * 4,6 mm, 3,0 |m
Fase móvil A: Disolver 1,0 g de 1-heptanosulfonato de sodio y 1,36 g de dihidrogenofosfato de potasio en 1000 ml de agua y ajustar el pH a 2,0 con ácido fosfórico. A 930 ml de esta solución añadir 70 ml de acetonitrilo.
Detector: UV a 220 nm
Caudal: 1,0 ml/min.
Temperatura de la columna: 25 °C
Volumen de inyección: 50 | l
Tiempo de ejecución: 35 minutos
Diluente: Agua MilliQ.

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES 1. Proceso para la preparación de droxidopa de fórmula (I) o una sal de la misma:
    que comprende las siguientes etapas: A) reducción enzimática de un compuesto de fórmula (II):
    en donde R1, R2 son independientemente hidrógeno o acetilo, R3 es hidrógeno o un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado y R4 es hidrógeno o un grupo protector de amina; para dar el compuesto de fórmula (III):
    en donde R1, R2, R3, R4 tienen el mismo significado que anteriormente; por medio de una enzima cetorreductasa; B) conversión del compuesto de fórmula (III) obtenido en la etapa a) en droxidopa de fórmula (I).
  2. 2. Proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la enzima cetorreductasa es KRED-130.
  3. 3. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde en los compuestos de fórmula (II) y fórmula (III) R3 es etilo o metilo.
  4. 4. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde en los compuestos de fórmula (II) y fórmula (III) R4 es terbutilcarbamato, benciloxicarbonilo, metilcarbamato o etilcarbamato.
  5. 5. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde en los compuestos de fórmula (II) y fórmula (III) R3 es etilo y R4 es terbutilcarbamato.
  6. 6. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la etapa B) comprende una etapa de conversión de R1 y/o R2 de acetilo a hidrógeno.
  7. 7. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la etapa B) comprende una etapa de conversión de R3 de un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado a hidrógeno.
  8. 8. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la etapa B) comprende una etapa de conversión de R4 de grupo protector de amina a hidrógeno.
  9. 9. Proceso para la preparación del compuesto de fórmula (III):
    en donde R1, R2 son independientemente hidrógeno o acetilo, R3 es hidrógeno o un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado y R4 es hidrógeno o un grupo protector de amina; que comprende una etapa de reducción enzimática de un compuesto de fórmula (II):
    en donde R1, R2, R3, R4 tienen el mismo significado que anteriormente; por medio de una enzima cetorreductasa.
  10. 10. Uso del compuesto de fórmula (II):
    en donde R1, R2 son independientemente hidrógeno o acetilo, R3 es hidrógeno o un grupo alquilo C1-C4 lineal o ramificado y R4 es hidrógeno o un grupo protector de amina; para la preparación del compuesto de fórmula (III):
    en donde R1, R2, R3, R4 tienen el mismo significado que anteriormente; o para la preparación de droxidopa de fórmula (I) o una sal de la misma:
  11. 11. Uso de una cetorreductasa para la reducción enzimática del compuesto de fórmula (II):
    en donde R1, R2 son independientemente hidrógeno o acetilo, R3 es hidrógeno o un grupo alquilo C-i-C4 lineal o ramificado y R4 es hidrógeno o un grupo protector de amina, para proporcionar un compuesto de fórmula (III):
    en donde R1, R2, R3, R4 tienen el mismo significado que anteriormente; o para proporcionar droxidopa de fórmula (I) o una sal de la misma:
  12. 12. Uso de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la enzima cetorreductasa es KRED-130.
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