ES2974691T3 - Métodos para eliminar toxinas bacterianas de un fluido biológico - Google Patents

Abstract

Esta invención se refiere a métodos para eliminar toxinas bacterianas tales como lipopolisacáridos y ácido lipoteicoico de un fluido biológico. En dicho método, un péptido, seleccionado de la lista de KKIRVRLSA, RRIRVRLSA, KRIRVRLSA y RKIRVRLSA, se une covalentemente a un soporte sólido a través de su extremo C, opcionalmente con la interposición de un conector, y se usa para capturar las toxinas. Esta invención también se refiere a dichos soportes sólidos derivatizados y a cartuchos, columnas y aparatos médicos que comprenden tales soportes sólidos derivatizados. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para eliminar toxinas bacterianas de un fluido biológico

Esta invención se refiere a métodos para eliminar toxinas bacterianas tales como lipopolisacáridos y ácido lipoteicoico de un fluido biológico. En tal método, el péptido KKIRVRLSA se une covalentemente a un soporte sólido a través de su extremo C, opcionalmente con la interposición de un enlazador, y se usa para capturar las toxinas.

Esta invención también se refiere a tales soportes sólidos modificados y a cartuchos, columnas y aparatos médicos que comprenden tales soportes sólidos modificados.

Antecedentes de la invención

La sepsis es un síndrome clínico causado por los sistemas inmunitario y de coagulación del cuerpo. El shock séptico es una afección potencialmente mortal que se caracteriza por presión arterial baja a pesar de la reposición adecuada de fluidos y disfunción o insuficiencia orgánica. La sepsis es una causa importante de muerte en personas de todas las edades (Pemer y otros, 2017).

Durante más de dos décadas, la sepsis se definió como una infección microbiana que produce fiebre (o hipotermia), taquicardia, taquipnea y cambios leucocitarios en la sangre. Actualmente, la sepsis se considera cada vez más una respuesta inflamatoria e inmunitaria sistémica desregulada, ante la invasión microbiana, que produce lesión orgánica. El shock séptico se define como sepsis con hiperlactatemia e hipotensión simultánea que requiere una terapia vasopresora, con tasas de mortalidad intrahospitalaria cercanas al 30-50 %.

La sepsis y los trastornos relacionados se encuentran entre las principales causas de muerte en todo el mundo y representan 19 millones de casos cada año y 1400 muertes cada día. Se estima que, solo en un país desarrollado como Estados Unidos, la incidencia de la sepsis es de 1655 000, lo que resulta en más de 250 000 muertes cada año. Esto se ha convertido en una carga económica importante para Estados Unidos, que representa un total de 16 700 millones de dólares para la atención sanitaria (Lakshmikanth y otros, 2016).

Los pacientes que padecen sepsis suelen ser tratados con antibióticos por vía intravenosa, oxígeno, fluidos y fármacos para estimular el corazón y mantener un nivel aceptable de presión arterial. En algunos casos, se usa la diálisis.

No se ha encontrado ningún tratamiento médico específico para la sepsis, aunque se llevan a cabo investigaciones intensivas en este campo. Con un reconocimiento más temprano y un mayor cumplimiento de las mejores prácticas, la sepsis ha pasado a ser menos un trastorno inminente y potencialmente mortal y más una enfermedad crítica crónica a largo plazo, a menudo asociada con inflamación prolongada, inmunosupresión, lesión orgánica y desgaste del tejido magro. Además, los pacientes que sobreviven a la sepsis tienen un riesgo continuo de mortalidad después del alta, así como también déficits cognitivos y funcionales a largo plazo. El reconocimiento temprano y la mejor implementación de las mejores prácticas han reducido la mortalidad intrahospitalaria, pero los resultados del uso de agentes inmunomoduladores han sido decepcionantes hasta la fecha. De manera similar, ningún biomarcador puede diagnosticar definitivamente la sepsis o predecir su desenlace clínico. Debido a su complejidad, es probable que las mejoras en el desenlace clínico de la sepsis continúen siendo lentas e incrementales (Hotchkiss y otros, 2016).

El lipopolisacárido (LPS) o endotoxina, el componente principal de la membrana externa de las bacterias gramnegativas, es el principal producto bacteriano responsable del síndrome clínico por sepsis. La unión de LPS al receptor tipo Toll 4 (TLR4) del huésped desencadena una reacción inflamatoria caracterizada por la liberación de una gran cantidad de mediadores inflamatorios que permiten al huésped responder al patógeno invasor. Cuando esta producción se vuelve descontrolada y excesiva, conduce al desarrollo de shock séptico (Ianaro y otros, 2009).

El ácido lipoteicoico (LTA), un componente principal de la pared celular de las bacterias grampositivas también se asocia con diversas enfermedades inflamatorias que van desde enfermedades cutáneas menores hasta sepsis grave. Se conoce que el LTA es reconocido por el receptor tipo Toll 2 (TLR2), lo que conduce al inicio de respuestas inmunitarias innatas y al desarrollo posterior de la inmunidad adaptativa. Sin embargo, las respuestas inmunitarias excesivas pueden resultar en secuelas inflamatorias implicadas en enfermedades graves tales como la sepsis (Kang y otros, 2016).

TORAYMYXIN (Rocco y Klein 2014; Shoji y otros, 1998) es una estrategia terapéutica, de manera que la polimixina B (PMX), un péptido antimicrobiano típico que ya se usa en la clínica (Roscia y otros, 2013), se inmoviliza en una fibra derivada de poliestireno en un dispositivo de hemoperfusión que se usa para eliminar el LPS circulante. El cartucho de PMX se creó al inmovilizar covalentemente la PMX a fibras derivadas de poliestireno, que luego pueden usarse para filtrar sangre externamente mediante el uso de un circuito extracorporal, de esta manera se elimina el LPS circulante a través de su adsorción al cartucho de PMX.

En una estrategia diferente, se inmovilizó polimixina B (PMX) sobre una fase sólida (Sepharose® 4B), y se desarrolló un sistema de plasmaféresis en la rata consciente, con adsorción plasmática específica en línea de la endotoxina mediante una columna de PMX-Sepharose (Cohen y otros, 1987).

El adsorbente de LPS de Alteco® (Ala-Kokko y otros, 2011) es un dispositivo médico para la eliminación extracorporal de LPS durante la hemoperfusión. La biotecnología del producto se basa en un péptido sintético, adaptado a las necesidades, que se une selectivamente al LPS que se encuentra en la circulación de un paciente séptico.

Sin embargo, existe la necesidad de métodos alternativos para eliminar el LPS de la sangre y, posiblemente, también el TLA, en pacientes sépticos.

Técnica anterior

El documento WO2010038220 describe la secuencia peptídica antibacteriana KKIRVRLSA (M33) y sus análogos funcionales, RRIRVRLSA, KRIRVRLSAy RKIRVRLSA proporcionados en una estructura monomérica, dendrimérica y las formas de péptido de antígeno múltiple (MAP), particularmente en la forma del Compuesto A que, se muestra más abajo, y describe la capacidad de m 33 para neutralizar el LPS. En las 4 secuencias peptídicas antibacterianas del documento WO2010038220 enumeradas anteriormente, todos los aminoácidos están en la configuración L.

Falciani C. y otros, en el documento (PLOS ONE, vol. 7, núm. 10, 2 de octubre de 2012, pág. e46259) describen el isómero peptídico M33 que consiste en D-aminoácidos (M33-D) y su actividad contra bacterias grampositivas y gramnegativas.

El documento WO2012010266 describe que, cuando los L-aminoácidos de M33 y sus análogos funcionales se sustituyen con su correspondiente D-aminoácido equivalente, los péptidos resultantes todavía poseen actividad antibacteriana.

Se conoce, a partir de Falciani y otros (2012), que los péptidos tetraméricos derivados de M33, en donde M33 está en una configuración totalmente L o totalmente D, unen tanto LTA como LPS en un ensayo, de manera que su derivado biotinilado se inmoviliza en células recubiertas de estreptavidina (es decir, unidas de forma no covalente a un soporte sólido).

El documento EP1789436 describe péptidos MPA que tienen secuencias similares, pero no idénticas, al péptido M33 y los análogos funcionales de M33 de esta invención, su síntesis a través de la síntesis en fase sólida (donde los péptidos, cuando se unen a un soporte sólido, están completamente protegidos en sus cadenas laterales) y su actividad contra el LPS en un ensayo de Biacore (donde el resto unido al soporte sólido es LPS, pero no el péptido antimicrobiano).

Gustafsson y otros (2010) describen diversos péptidos antimicrobianos y su actividad de unión a LPS cuando se inmovilizan sobre un soporte sólido. De manera similar, Costa y otros (2011) analizan los péptidos antimicrobianos y las estrategias para su inmovilización covalente sobre un soporte sólido.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 representa una resina compuesta de hidroxietilpoliestireno y polietilenglicol reticulados.

La Figura 2 muestra cómo se forma un enlace covalente entre la resina Sulfolink™ y un tiol libre.

La Figura 3 representa los perfiles de HPLC de una solución que contiene el compuesto B antes (A) y después (B) del acoplamiento a una resina Sulfolink™.

La Figura 4 representa el contenido de LPS de un fluido biológico antes y después de exponerse a una resina modificada con el compuesto B (A) y a la misma resina no modificada (B).

La Figura 5 representa el contenido de LPS de un fluido biológico antes y después de exponerse a una resina modificada con el compuesto A (A) y la misma resina no modificada (B).

La Figura 6 representa los perfiles de electroforesis de proteínas de una muestra de suero (A), una muestra de suero después de ponerse en contacto con una resina modificada con el compuesto B (B), una muestra de suero después de ponerse en contacto con una resina modificada con el compuesto A (C), y los valores de referencia para tales proteínas (D)

La Figura 7 representa el contenido de LTA de un fluido biológico antes y después de exponerse a una resina modificada con el compuesto B (A) y la misma resina no modificada (B).

Descripción detallada de la invención

Hemos determinado, sorprendentemente, que cuando M33 se une covalentemente a un soporte sólido a través de su extremo C, particularmente cuando se une a tal estructura mediante la formación de un enlace covalente con el compuesto A o el compuesto B que se muestran más abajo, permite la eliminación selectiva de LPS del fluido biológico, sin alterar el contenido proteico del fluido.

Tal soporte sólido modificado también es útil para eliminar el LTA del fluido biológico.

En consecuencia, en un primer aspecto de esta invención, se proporciona un método ex vivo para eliminar toxinas bacterianas seleccionadas de la lista de lipopolisacáridos (LPS) y ácido lipoteicoico (LTA) de un fluido biológico, dicho método comprende poner en contacto el fluido biológico con el péptido KKIRVRLSA, que está unido covalentemente a un soporte sólido a través de su extremo C, con la interposición de un enlazador, de esta manera se forma un resto enlazador-péptido, en donde:

- todos los aminoácidos del péptido están en la configuración L o D

- el resto péptido-enlazador es un radical de la fórmula que se muestra más abajo

en donde:

R<i>— , R<2>— R<a>— R<4>— , R<5>—, R<a>—, R<7>— y R<8>—son KKIRVRLSA— ;

X<1>, X<2>, X<3>, X<4>, X<5>, X<6>y X<7>son un residuo de lisina;

w es cero, v es cero, p y q son cero, t es 1, m y n son cero o 1, siempre y cuando al menos uno de m y n sea 1; Y se selecciona de la lista de un residuo de beta-alanina, un residuo de N-(PEG)<y>-CH2-CH2-C(O)-, en donde 1< y <11 y un residuo Cys.

En algunas modalidades, el soporte sólido es poroso.

En una modalidad, el soporte sólido es una resina de agarosa reticulada.

En otra modalidad, el soporte sólido es una resina compuesta de hidroxietilpoliestireno y polietilenglicol reticulados. En algunas modalidades, el fluido biológico se selecciona de la lista de suero, plasma y sangre.

Se pueden combinar todas las modalidades de este primer aspecto de la invención.

En un segundo aspecto de esta invención, se proporciona un soporte sólido que porta los radicales, como se describe anteriormente en las modalidades del primer aspecto de esta invención.

En un tercer aspecto de esta invención, se proporciona un artículo seleccionado de la lista de una columna y un cartucho, cada uno de los cuales comprende el soporte sólido del segundo aspecto de esta invención.

En un cuarto aspecto de esta invención, se proporciona un aparato médico que comprende el soporte sólido del segundo aspecto de esta invención o el artículo del tercer aspecto de esta invención.

En una modalidad particular, el aparato médico es un aparato médico para la eliminación de una toxina bacteriana seleccionada de la lista de LPS y LTA de fluidos biológicos.

En un quinto aspecto de esta invención, se proporciona el uso del aparato médico del cuarto aspecto de esta invención para la eliminación de una toxina bacteriana seleccionada de la lista de LPS y LTA de fluidos biológicos.

Ejemplos

La invención se describe ahora por medio de ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1: Síntesis del compuesto A unido a la resina

El compuesto A se sintetizó sobre 100 mg de resina NovaSyn TG (0,24 mmol/g) (Novabiochem).

Esta resina es un compuesto de hidroxietilpoliestireno y polietilenglicol de PM 3000-4000, poco reticulado, que se ha funcionalizado terminalmente con grupos amino. (Figura 1)

La síntesis de péptidos se llevó a cabo en un sintetizador automático Syro (MultiSynTech, Witten, Alemania) mediante el uso de la química del 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) y la activación con hexafluorofosfato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N,N-tetrametiluronio (HBTU)/1,3-isopropiletilamina (DIPEA). Los grupos protectores de las cadenas laterales fueron ferc-butoxicarbonilo para Lys, 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo para Arg, y éter ferc-butílico para Ser. El primer aminoácido fue Fmoc-pAla-OH. Se usaron dos etapas de acoplamiento consecutivas con Fmoc-Lys(Fmoc)-OH para construir el núcleo de lisina, seguidas de la adición secuencial de aminoácidos Fmoc para completar el péptido KKIRVRLSA. Finalmente, se desprotegió la cadena lateral del Compuesto A sobre la resina mediante tratamiento con ácido trifluoroacético que contenía agua y triisopropilsilano (95:2,5:2,5). Luego se lavó la resina unida al péptido cuatro veces con DCM, cuatro veces con MeOH, tres veces con ácido acético 1 M, cuatro veces con H2O y cuatro veces con MeOH.

Ejemplo 2: Síntesis del compuesto B:

El compuesto B se produjo mediante síntesis en fase sólida a través de la química Fmoc estándar con un sintetizador de péptidos múltiple Syro (MultiSynTech, Witten, Alemania). El péptido se sintetizó sobre la resina TentaGel S RAM con Fmoc -NH-Cys(Trt)-COOH como primer aminoácido en el extremo C, se añadió Fmoc-NH-PEG(4)-CH<2>-CH<2>-COOH en la segunda etapa de acoplamiento, luego se añadió dos veces Fmoc-Lys(Fmoc)-OH para construir el núcleo tetramérico. Seguido de las nueve adiciones secuenciales de aminoácidos Fmoc para completar el péptido KKIRVRLSA. Los grupos protectores de la cadena lateral fueron 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo para R, t-butoxicarbonilo para K y t-butilo para S. El producto final se escindió del soporte sólido y se desprotegió mediante el tratamiento con TFA. que contenía triisopropilsilano, agua (95/2,5/2,5) y se precipitó con éter dietílico. Los péptidos crudos se purificaron mediante cromatografía de fase inversa en una columna preparativa (péptido XBridge BEH C18 Waters), en gradiente lineal durante 40 min, del 75 % al 65 % de A, donde A es 0,1 % de TFA/agua y B es acetonitrilo (tr = 22 minutos). La pureza y la identidad del péptido final se confirmaron mediante cromatografía de fase inversa en una columna analítica Phenomenex Jupiter C18 (300 A°, 5 pm, 250 x 4,6 mm) con el mismo gradiente que el anterior y mediante espectrometría de masas MALDI TOF/TOF (Ultraflex III Bruker Daltonics) (M<+>: encontrada 7723,5; calculada 7724,1).

Ejemplo 3: Síntesis del compuesto B unido a la resina.

El compuesto B se unió a través de su sulfhidrilo a una resina Sulfolink™, que es una resina de agarosa reticulada, como se representa en la Figura 2.

Se resuspendió el compuesto B (1 mg/ml) diluido en 4 ml y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente en tampón de acoplamiento (Tris 50 mM, EDTA-Na 5 mM; pH 8,5).

La resina SulfoLink™ (kit de inmovilización para péptidos SulfoLink®, Pierce Biotechnology, Rockford, Illinois, Estados Unidos) en su cartucho/columna (columna de 5 ml, 1 cm de diámetro, volumen de la resina 2 ml) se resuspendió mediante mezcla y el tampón de almacenamiento se eliminó mediante la centrifugación a 1000 xg durante 1 minuto colocando la columna en un tubo de recolección de 15 ml. Se añadieron 2 ml de tampón de acoplamiento (como se describió anteriormente) a la resina, luego se centrifugó la mezcla y se repitió esta etapa una vez. Se añadieron 2 ml de la solución del compuesto B y se mezclaron mediante balanceo o inversión a temperatura ambiente durante 15 minutos. Luego, la columna se colocó en posición vertical y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos sin mezclar. La etapa se repitió dos veces.

La columna se colocó en un tubo de recolección de 15 ml nuevo y se centrifugó para recolectar el péptido sin unir. El flujo continuo se guardó para determinar la eficiencia del acoplamiento mediante HPLC. Como se expone en la Figura 3, donde el compuesto B eluye a los 22,27 minutos, la eficiencia del acoplamiento fue óptima.

La columna se lavó y centrifugó tres veces. Luego, la columna se lavó con 2 ml de tampón de acoplamiento y se centrifugó. Luego se aplicó a la columna cisteína 50 mM en tampón de acoplamiento y se mezcló durante 45 minutos a temperatura ambiente, para bloquear los sitios de unión que no reaccionaron. Después de una centrifugación adicional, se dejó escurrir la columna.

Ejemplo 4: El compuesto B unido a la resina elimina el LPS de un fluido biológico y no altera significativamente el contenido de proteínas séricas.

Se usaron 2 ml de resina cargada con el compuesto B del ejemplo 3, en su columna de 5 ml (columna de 5 ml, diámetro 1 cm, volumen de la resina 2 ml). Se incubaron 2 ml de suero humano que contenía LPS deE. coliO111:B4 (Sigma, St. Louis, MO) (5 ng/ml) con la resina en el cartucho durante 2 horas a temperatura ambiente con un balanceo constante. Luego se recolectó la muestra y se midió la cantidad de LPS mediante la prueba del lisado de amebocitos de Limulus (LAL), como se describe en materiales y métodos.

Como control negativo, se incubó la misma cantidad de resina no cargada con el compuesto B con la misma cantidad de suero y se determinó su contenido de LPS como se describió anteriormente.

Como otro control, también se midió el contenido de LPS de una alícuota de suero sin tratar.

Como se expone en la Figura 4, la resina cargada fue capaz de eliminar el 85 % del LPS deE. colidel suero, mientras que la resina no cargada no eliminó el LPS en absoluto.

Como se expone en las Figuras 6A y 6B, que representan, respectivamente, los perfiles de electroforesis capilar de los sueros antes y después del paso por la resina cargada con el compuesto B, tal paso no altera significativamente el contenido de proteínas séricas.

Ejemplo 5: El compuesto A unido a la resina elimina el LPS de un fluido biológico y no altera significativamente el contenido de proteínas séricas.

Se cargó 1 ml de la resina cargada con el compuesto A del ejemplo 1 en una columna de 5 ml (columna de 5 ml, diámetro 1 cm. Mediante el uso del mismo procedimiento descrito en el ejemplo 4, se determinó, como se expone en la Figura 5, que la resina cargada con el compuesto A era capaz de eliminar más del 74 % del LPS deE. coli,mientras que la resina no cargada eliminó el 43 % del LPS.

Como se expone en las Figuras 6A y 6C, que representan, respectivamente, los perfiles de electroforesis capilar de los sueros antes y después del paso por la resina cargada con el compuesto A, tal paso no altera significativamente el contenido de proteínas séricas.

Ejemplo 6: El compuesto B unido a la resina elimina el LTA de la solución salina tamponada con fosfato que contiene LTA

Se usaron 2 ml de resina cargada con el compuesto B del ejemplo 3, en su columna de 5 ml (columna de 5 ml, diámetro 1 cm, volumen de la resina 2 ml). Se incubó 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía LTA de S.aureus(MyBiosource, San Diego, CA, Estados Unidos) (500 pg/ml) con la resina en el cartucho durante 2 horas a temperatura ambiente bajo balanceo constante. Luego se recolectó la muestra y se midió la cantidad de LTA mediante el kit ELISA de LTA humano (ácidos lipoteicoicos), como se describe en materiales y métodos.

Como control negativo, se incubó la misma cantidad de resina no cargada con el compuesto B con la misma cantidad de PBS y se determinó su contenido de LTA como se describió anteriormente. Como se expone en la Figura 7, la resina cargada fue capaz de eliminar el 97 % del LTA de S.aureus,mientras que la resina no cargada sólo eliminó el 14 %.

Materiales y Métodos

Medición de LPS mediante la prueba LAL

El análisis de la eliminación del LPS se realizó mediante el uso del kit cromogénico de cuantificación de endotoxinas LAL (ThermoFisher Scientific, Waltham, Estados Unidos), que es un indicador de la presencia de LPS libre.

Se preparó una curva estándar (0,1-1 UE/ml) mediante el uso de una endotoxina estándar de control deEscherichia coli(O111:B4) en agua libre de endotoxinas y se diluyó en serie. Las muestras de suero se diluyeron 50 y 100 veces en agua libre de endotoxinas. Cada muestra se procesó por duplicado.

La microplaca se equilibró en un bloque térmico durante 10 minutos a 37 °C. Luego, se dispensaron 50 pl de cada estándar y muestra en un pocillo de la microplaca y se incubaron durante 5 minutos a 37 °C.

Se añadieron 50 pl de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) a cada pocillo y la placa se incubó durante 10 minutos a 37 °C. Después de exactamente 10 minutos, se añadieron a cada pocillo 100 pl de solución de sustrato cromogénico. La placa se incubó durante 6 minutos a 37 °C. Al final, se añadieron 50 pl de reactivo de parada (ácido acético al 25 %). Se midió la absorbancia a 405-410 nm en un lector de placas (Ascent Software). Las UE se calcularon sobre la base de la curva estándar obtenida como se describió anteriormente.

Medición de LTA mediante ELISA

El contenido de LTA de una muestra puede determinarse fácilmente mediante el uso de kits comerciales a tal efecto. Un ejemplo de tales kits es el kit ELISA LTA de Antibody Research Corporation (St. Charles, Missouri). La muestra se añade a los pocillos de la microplaca previamente recubiertos con anticuerpo contra ácidos lipoteicoicos. Después de la incubación y el lavado, se añade un anticuerpo de detección de ácidos lipoteicoicos marcado con biotina. Después de una incubación adecuada, se añade un conjugado de estreptavidina y peroxidasa de rábano picante (HRP), seguido de incubación y lavado para eliminar las enzimas que no formaron complejos. Después de la adición de una solución cromogénica de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB), la muestra se incuba durante 5 minutos. La reacción de la enzima HRP se detiene mediante la adición de una solución de ácido sulfúrico. La intensidad del color desarrollado es proporcional a la concentración de ácidos lipoteicoicos presentes en la muestra y se lee a 450 nm mediante el uso de un lector de placas. La concentración de ácido lipoteicoico en la muestra se determina mediante la interpolación del valor de absorbancia en la curva estándar.

El análisis de la eliminación de LTA se realizó mediante el uso del kit ELISA de LTA humano (ácidos lipoteicoicos) (MyBiosource, San Diego, CA, Estados Unidos).

Se preparó una curva estándar (7,8-500 pg/ml) mediante el uso de un ácido lipoteicoico estándar de control de S.aureusen tampón de dilución de muestra/estándar y se diluyó en serie.

Las muestras se diluyeron 2 y 10 veces en tampón de dilución de muestra/estándar. Cada muestra se procesó por duplicado.

La microplaca se lavó dos veces antes de añadir el estándar, la muestra y el control (cero) a los pocillos. Luego se dispensaron 100 pl de cada estándar y muestra en un pocillo de la microplaca y se incubaron durante 90 minutos a 37 °C.

Se añadieron 100 pl de solución de trabajo de anticuerpo de detección marcado con biotina a los pocillos anteriores y se incubaron durante 60 minutos a 37 °C.

La placa se lavó tres veces con tampón de lavado.

Se añadieron 100 pl de solución de trabajo de conjugado HRP-estreptavidina (SABC) a cada pocillo y la placa se incubó durante 30 minutos a 37 °C. Después de exactamente 30 minutos, la placa se lavó cinco veces con tampón de lavado.

Se añadieron 90 pl de solución de sustrato TMB a cada pocillo. La placa se incubó en la oscuridad durante 15-30 minutos a 37 °C. Al final, se añadieron 50 pl de solución de parada. La absorbancia se midió a 450 nm en un lector de placas (Ascent Software). La concentración de LTA se calculó sobre la base de la curva estándar obtenida como se describió anteriormente.

Electroforesis capilar

El suero humano se analizó antes y después del paso por las resinas cargadas con el compuesto A o B mediante electroforesis capilar, mediante el dispositivo clínico Capillarys (software 4.51; Sebia), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El instrumento proporcionó la cantidad de proteína presente en las muestras en g/l, también mostró el perfil de las curvas de electroforesis con el contenido relativo en porcentaje, calculado sobre la base del área más allá de la curva.

Referencias

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Claims (5)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método ex vivo para eliminar toxinas bacterianas seleccionadas de la lista de lipopolisacáridos (LPS) y ácido lipoteicoico (LTA) de un fluido biológico, dicho método comprende poner en contacto el fluido biológico con el péptido KKIRVRLSA, que está unido covalentemente a un soporte sólido a través de su extremo C, con la interposición de un enlazador, de manera que se forma un resto enlazador-péptido, en donde: - todos los aminoácidos del péptido están en la configuración L o D - el resto péptido-enlazador es un radical de la fórmula que se muestra más abajo

   en donde: R-<i>— R<2>— R<a>— R<4>— , R<5>— R<a>—, R<t>— y R<8>—son KKIRVRLSA— ; X<1>, X<2>, X<3>, X<4>, X<5>, X<6>y X<7>son un residuo de lisina; w es cero, v es cero, p y q son cero, t es 1, m y n son cero o 1, siempre y cuando al menos uno de m y n sea 1; Y se selecciona de la lista de un residuo de beta-alanina, un residuo de N-(PEG)<y>-CH2-CH2-C(O)-, en donde 1< y <11 y un residuo Cys.
2. 2. El método de la reivindicación 1, en donde el soporte sólido se selecciona de la lista de una resina de agarosa reticulada y una resina compuesta de hidroxietilpoliestireno y polietilenglicol reticulados.
3. 3. Un soporte sólido que se une covalentemente al extremo C del péptido KKIRVRLSA con la interposición de un enlazador, de manera que se forma un resto péptido-enlazador, en donde el resto péptido-enlazador es como se define en la reivindicación 1.
4. 4. Un aparato médico para la eliminación de toxinas bacterianas seleccionadas de la lista de LPS y LTA de un fluido biológico, tal aparato médico comprende el soporte sólido de acuerdo con la reivindicación 3.
5. 5. Uso de un aparato médico que comprende el soporte sólido de acuerdo con la reivindicación 3 para eliminar ex vivo una toxina bacteriana seleccionada de LPS y LTA de un fluido biológico.