ES2974307T3 - PERM como marcador de cáncer de endometrio - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un método de diagnóstico o pronóstico del carcinoma de endometrio, comprendiendo el método determinar el nivel de expresión de MMP9 en una muestra de líquido aspirado uterino del tracto genital femenino. La presente invención proporciona además kits para el diagnóstico de la enfermedad. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

PERM como marcador de cáncer de endometrio

Campo técnico

Está solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente europea EP16168328.9 presentada el 4 de mayo de 2016.

La invención se refiere al diagnóstico y al pronóstico de carcinoma endometrial.

Antecedentes de la técnica

El cáncer de endometrio (CE) es el tumor invasivo del aparato genital femenino observado con mayor frecuencia y el cuarto cáncer más común en mujeres en los países desarrollados, representando 54.870 casos diagnosticados y 10.170 muertes estimadas en 2015 en los Estados Unidos. Hoy en día, el 70 % de los casos de CE se diagnostican en estadios tempranos de la enfermedad, donde el tumor todavía está localizado dentro del endometrio y está asociado con una tasa de supervivencia general a 5 años del 96 %. Sin embargo, al 30 % de las pacientes con CE se les diagnostica sólo en un estadio avanzado de la enfermedad asociado con una drástica disminución de la tasa de supervivencia a 5 años, que se reduce al 67 % cuando ya está presente invasión miometrial y/o afectación de los ganglios linfáticos y al 18 % en casos de metástasis a distancia. Por tanto, mejorar el diagnóstico precoz es una cuestión importante para gestionar adecuadamente el CE y disminuir la mortalidad asociada con la enfermedad. La detección precoz de pacientes con CE se ve favorecida por la presencia de síntomas como metrorragia presente en el 93 % de las mujeres diagnosticadas con CE. Sin embargo, muchos otros trastornos benignos generan síntomas similares. La discriminación de pacientes con patologías endometriales benignas y con CE sólo se logra después de un tedioso proceso diagnóstico que consiste en un examen pélvico y una ecografía transvaginal seguida de un examen histopatológico confirmatorio de una biopsia endometrial. La biopsia preferible usada en este procedimiento se denomina aspirado uterino y/o biopsia con cánula de Pipelle y se obtiene mediante una aspiración mínimamente invasiva de líquido endometrial desde el interior de la cavidad uterina. Debido a que los procedimientos de diagnóstico actuales sobre aspirados uterinos se basan en la presencia de material celular, este proceso lamentablemente tiene un fallo diagnóstico y una tasa de muestreo inadecuada asociada del 8 % y el 15 %, respectivamente. Esto aumenta hasta un 12 % y un 22 % en mujeres posmenopáusicas. En esos casos, es necesario realizar una biopsia guiada por histeroscopia, donde esta técnica invasiva presenta un mayor riesgo de complicaciones, incluyendo perforación uterina, hemorragia y posible daño a otros órganos.

Hasta ahora, el desarrollo de ensayos de diagnóstico basados en proteómica seguía siendo un desafío, a pesar de los muchos estudios sobre tejidos tumorales de CE y endometrio normal. La ausencia de traducción de los resultados producidos por esos estudios en la clínica se explica por dos factores determinantes: i) falta de estudios en líquidos corporales para alcanzar biomarcadores de CE. La mayoría de los estudios se basaron en tejidos y/o suero o plasma. Sin embargo, la búsqueda de biomarcadores en plasma o suero es extremadamente desafiante debido a la baja concentración de los posibles biomarcadores y la amplia gama dinámica en la abundancia de proteínas; y ii) falta de estudios de verificación como puente entre las fases de descubrimiento y validación de los biomarcadores en fase de desarrollo. Los experimentos de descubrimiento de biomarcadores están plagados de descubrimientos falsos que resultan de la variabilidad biológica y del pequeño número de muestras incluidas.

Song M. y colaboradores (Song M.et al.,:“Increased Myeloperoxidase and Lipid Peroxide-Modified Protein in Gynecological Malignancies”, la medición de Antioxidants and Redox Signaling, vol. 3, n.° 6, páginas 1139-1146) divulgan la correlación de mieloperoxidasa (MPO) en el plasma de sujetos con cánceres ginecológicos.

Yurkovetsky Z. y colaboradores (Yurkovetsky Z.et al.:“Development of multimarker panel for early detection of endometrial cancer. High diagnostic power of prolactin”, Gynecologic Oncology, 2007, vol. 107, 58-65) correlacionan la prolactina con la discriminación precoz entre grupos con cáncer y de control. La tabla 2 proporciona pruebas múltiples disponibles para varios marcadores, entre los que se menciona MPO.

Kaneko S. y colaboradores (Kaneko S.et al.,“A case of MPO- and PR3-ANCA-negative pauci-immune renal-limited small-vessel vasculitis associated with endometrial neuroendocrine small cell carcinoma”, CEN Case Rep, 2013, vol.

2, páginas 123-127) informan de un caso de SVV limitada renal pauciinmunitaria negativa para MPO y PR3-ANCA asociada con NSCC endometrial.

Riley C. F. y colaboradores (Riley C. F.et al.,“ Inflammatory markers in endometriosis: reduced peritoneal neutrophil response in minimal endometriosis”, Acta Obstetricia et Gynecologica, 2007, vol. 86, páginas 877-881) divulgan la determinación de mieloperoxidasa, entre otros marcadores, en muestras de líquido peritoneal aspirado y sangre. Concluyendo que las concentraciones de mieloperoxidasa eran significativamente menores en pacientes con endometriosis en estadio I en comparación con pacientes de control y pacientes con endometriosis con la enfermedad en estadio III/IV.

A pesar de los esfuerzos realizados, existe todavía la necesidad de biomarcadores que permitan el diagnóstico del cáncer de endometrio en estadios tempranos con alta sensibilidad y especificidad.

Sumario de la invención

Los presentes inventores han hallado que las muestras de líquido uterino comprenden varios marcadores robustos que las convierten en muestras adecuadas para el diagnóstico de cáncer de endometrio con alta sensibilidad y especificidad.

Tal como se muestra a continuación, los presentes inventores han sido capaces de identificar, por primera vez, 27 proteínas que se expresan de manera diferente en muestras de líquido uterino de pacientes que padecen cáncer de endometrio. Sorprendentemente, las 27 proteínas muestran una sensibilidad y especificidad muy altas (véase la tabla 1 a continuación), minimizando así el riesgo de un diagnóstico positivo o negativo falso.

Estos hallazgos abren la puerta al uso de muestras de líquido uterino como muestras biológicas para el diagnóstico de la enfermedad en lugar de sangre/suero o una biopsia de tejido. Un biomarcador de diagnóstico útil no sólo tiene que mejorar la discriminación entre pacientes que padecen la enfermedad y casos benignos, sino que también debe ser económicamente rentable y ventajoso en un contexto clínico. En el caso de biomarcadores de diagnóstico para CE, la reducción del número de biopsias invasivas y los costes de diagnóstico son valores muy importantes. Por tanto, la identificación de los biomarcadores, objeto de la presente invención, en un líquido corporal de fácil acceso tal como una muestra de líquido uterino, que se obtiene en un procedimiento mínimamente invasivo ya implementado en el procedimiento de diagnóstico actual, significa un avance notable en el diagnóstico precoz de la enfermedad.

Por tanto, la presente invención significa un gran avance en el diagnóstico precoz de cáncer de endometrio.

Por tanto, en un primer aspecto la presente invención proporcionar un método de diagnóstico o pronóstico de carcinoma endometrial, comprendiendo el método determinar el nivel de expresión de PERM en una muestra de líquido aislada del aparato genital femenino.

Es notable que el biomarcador del primer aspecto de la invención se asoció individual y colectivamente con cáncer, concluyendo que mantenía una fuerte asociación con procesos moleculares habitualmente alterados en cáncer tal como el movimiento celular, la muerte celular y la supervivencia, entre otros.

Por tanto, en un segundo aspecto, la presente invención proporciona el uso de PERM como marcadorin vitropara el diagnóstico o el pronóstico de carcinoma endometrial en un líquido aislado del aparato genital femenino.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona el uso de medios para determinar el nivel de expresión de PERM para el diagnóstico o el pronóstico de carcinoma endometrial en el método del primer aspecto de la invención. Es importante destacar que, el biomarcador proteínico objeto de la presente invención puede evaluarse mediante métodos sencillos y de bajo coste, tales como inmunoquímica o ELISA, plataformas que están ampliamente disponibles en hospitales. Por consiguiente, este biomarcador proteínico puede implementarse fácilmente como kits de diagnóstico clínico habitual con costes reducidos para el sistema sanitario. Además, una prueba de kit de diagnóstico basada en el biomarcador proporcionado por la presente invención puede mejorar el procedimiento actual de diagnóstico, que confiere a los aspirados uterinos la capacidad de proporcionar la información de diagnóstico o pronóstico valiosa de la enfermedad.

La invención también proporciona el uso de un kit que comprende un soporte sólido y medios para detectar el nivel de expresión de uno o más del siguiente conjunto de marcadores: Mm P9,PERM; LDHA,PERM; KPYM,PERM; PERM,SPIT1; PERM,NAMPT; MMP9,LDHA,PERM; MMP9,KPYM,PERM; MMP9,PERM,SPIT1; MMP9,PERM,NAMPT; LDHA,KPYM,PERM; LDHA,PERM,SPIT1; LDHA,PERM,NAMPT; KPYM,PERM,SPIT1; KPYM,PERM,NAMPT; PERM,SPIT1,NAMPT; MMP9,LDHA,KPYM,PERM; MMP9,LDHA,PERM,SPIT1; MMP9,LDHA,PERM,NAMPT; MMP9,KPYM,PERM,SPIT1; MMP9,KPYM,PERM,NAMPT; MMP9,PERM,SPIT1,NAMPT; LDHA,KPYM,PERM,SPIT1; LDHA,KPYM,PERM,NAMPT; LDHA,PERM,SPIT1,NAMPT; KPYM,PERM,SPIT1,NAMPT; MMP9,LDHA,KPYM,PERM,SPIT1; MMP9,LDHA,KPYM,PERM,NAMPT; MMP9,LDHA,PERM,SPIT1,NAMPT; MMP9,KPYM,PERM,SPIT1,NAMPT; LDHA,KPYM,PERM,SPIT1,NAMPT; y MMP9, LDHA, KPYM, PERM, SPIT1, NAMPT, y CADH1; para el diagnóstico o el pronóstico de carcinoma endometrial; o para identificar un sujeto sospechoso de padecer carcinoma endometrial; o para decidir o recomendar si iniciar un régimen médico de un sujeto sospechoso de padecer carcinoma endometrial; o determinar la eficacia de un régimen médico en un paciente ya diagnosticado de carcinoma endometrial.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para identificar a un sujeto sospechoso de padecer carcinoma endometrial, comprendiendo el método:

a) determinar,in vitro,el nivel de expresión de PERM en una muestra de líquido del aparato genital femenino del sujeto, y

b) comparar el nivel de la etapa (a) con un nivel de control de referencia, en el que si el nivel determinado en la etapa (a) es mayor que el nivel de control de referencia, es indicativo de que el sujeto es sospechoso de padecer carcinoma endometrial.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método de decidir o recomendar si iniciar un régimen médico de un sujeto sospechoso de padecer carcinoma endometrial, método que comprende las etapas de: a) determinar,in vitro,el nivel de expresión de PERM en una muestra de líquido del aparato genital femenino del sujeto; y

b) diagnosticar el carcinoma endometrial o determinar si el sujeto es sospechoso de padecer carcinoma endometrial, si el nivel de proteína en la muestra de prueba es mayor que un nivel de control de referencia;

en el que:

i) si se diagnostica que el sujeto padece carcinoma endometrial, o de ser sospechoso de padecer carcinoma endometrial, entonces se recomienda el inicio del régimen médico, y

ii) si se diagnostica que la paciente no padece carcinoma endometrial, el seguimiento se realiza opcionalmente teniendo en cuenta el resultado de un examen del paciente por un médico.

Al determinar el nivel de marcador en una muestra de prueba, el experto en la técnica puede establecer, adicionalmente, cuál es la terapia más adecuada que puede recomendarse, porque el nivel detectado en la muestra puede reflejar la extensión (es decir, la gravedad) de la enfermedad.

Además, cuando se decide que un sujeto debe iniciar un régimen médico porque padece, o es sospechoso de tener, carcinoma endometrial, puede monitorizarse cómo de eficiente es el régimen que usa el marcador de la invención: una disminución o vuelta a un nivel normal del marcador (es decir, al nivel de un sujeto de control libre de cáncer) puede indicar que el paciente ha reaccionado favorablemente al régimen médico y, por tanto, dicho régimen es eficaz; si el nivel del marcador no cambia significativamente o aumenta, esto puede indicar que el régimen no es eficaz. Finalmente, el nivel del marcador puede medirse después del final del tratamiento para controlar recaídas. Por tanto, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para determinar la eficacia de un régimen médico en una paciente ya diagnosticada de carcinoma endometrial, comprendiendo el método las etapas de:

(a) medirin vitroel nivel de expresión de PERM en una muestra de líquido del aparato genital femenino del sujeto antes de la administración del régimen médico;

(b) medirin vitroel nivel de dicho marcador en una muestra de líquido del aparato genital femenino del sujeto una vez que comienza la administración del régimen médico; y

(c) comparar los niveles medidos en las etapas (a) y (b), de tal manera que si el nivel medido en la etapa (b) es menor que el nivel medido en la etapa (a), es indicativo de que el régimen médico es eficaz en el tratamiento de carcinoma endometrial;

o, alternativamente, comprendiendo el método las etapas de:

(i) medirin vitroel nivel de expresión de PERM en una muestra de líquido del aparato genital femenino del sujeto una vez comenzada la administración del régimen médico; y

(ii) comparar el nivel medido en la etapa (i) con un nivel de control de referencia del marcador,

en el que, si el nivel medido en la etapa (i) no es mayor que el nivel de control de referencia, es indicativo de que el régimen médico es eficaz en el tratamiento de carcinoma endometrial.

Con este método de la invención, puede determinarse el resultado del tratamiento (evaluación realizada para evaluar los resultados o consecuencias del tratamiento y los procedimientos usados en combatir la enfermedad para determinar la eficacia, efectividad, seguridad, viabilidad, etc., de estas intervenciones en series o casos individuales).

Descripción detallada de la invención

Todos los términos tal como se usan en el presente documento en esta solicitud, a menos que se indique lo contrario, deben entenderse en su significado habitual tal como se conoce en la técnica. Otras definiciones más específicas para determinados términos tal como se usan en la presente solicitud son tal como se exponen a continuación y tienen la finalidad de aplicarse de manera uniforme en toda la memoria descriptiva y las reivindicaciones a menos que una definición expuesta de manera expresa proporcione una definición más amplia. La presente invención proporciona un nuevo biomarcador para el diagnóstico o el pronóstico de carcinoma endometrial en líquido del aparato genital femenino.

El término “diagnóstico” es conocido por el experto en la técnica. Tal como se usa en el presente documento, se entiende por “diagnóstico” tomar conciencia de una complicación o riesgo de una afección médica particular en un sujeto; la determinación de la naturaleza de la enfermedad o afección; o la distinción de una enfermedad o afección de otra. Se refiere tanto al procedimiento de intentar determinar o identificar la posible enfermedad o trastorno, como a la opinión a la que se llega mediante este procedimiento. Un diagnóstico, en el sentido de procedimiento de diagnóstico, puede considerarse como un intento de clasificar la afección de un individuo en categorías separadas y distintas que permitan tomar decisiones médicas sobre el tratamiento y el pronóstico. Posteriormente, una opinión diagnóstica a menudo se describe en cuanto a una enfermedad u otra afección. Sin embargo, un diagnóstico puede adoptar muchas formas. Podría tratarse de detectar la presencia y nombrar la enfermedad, lesión, disfunción o discapacidad. Podría ser un ejercicio para atribuir una categoría para el tratamiento o el pronóstico. Puede indicar un grado de anomalía en un continuo o una clase de anomalía en una clasificación.

El método de diagnósticoin vitrodel primer aspecto de la invención puede realizarse con una muestra de: (a) un sujeto asintomático, (b) un sujeto que ya se ha identificado que es sospechoso de padecer carcinoma endometrial, (c) un sujeto ya diagnosticado de carcinoma endometrial, como ensayo de diagnóstico de confirmación complementario o (d) un sujeto con alto riesgo de padecer la enfermedad.

“Pronóstico”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la predicción de la probable progresión y resultado de una enfermedad. Incluye: clasificación de neoplasias (intento de expresar en términos replicables el nivel de diferenciación celular en las neoplasias, ya que el aumento de la anaplasia se correlaciona con la agresividad de la neoplasia), estadificación de neoplasias (intento de expresar en términos replicables la extensión de la neoplasia en el paciente).

El término “muestra de líquido del aparato genital femenino” se refiere a un líquido producido por el órgano uterino que forma parte del aparato genital femenino y que se ha tomado mediante aspiración, tal como aspiración a vacío (es decir, una “muestra de aspirado”). Según la presente invención, la aspiración del fluido se realiza sin una etapa previa de infusión salina. Es decir, el término “aspirado” no abarca aquellas muestras que resultan de lavados uterinos.

En otra realización del método del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, el método comprende (a) medir,in vitro,el nivel de expresión de PERM, en la muestra de prueba; y (b) comparar el nivel de expresión de las proteínas sometidas a prueba con un valor de control de referencia. En otra realización del método del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, el método comprende (a) medir,in vitro,el nivel de expresión de PERM, en la muestra de prueba; y (b) comparar el nivel de expresión de la proteína sometida a prueba con un valor de control de referencia, en el que si se sobreexpresa la proteína, es indicativo de carcinoma endometrial o un pronóstico malo.

En la presente invención, el término “nivel de control de referencia” al que se hace referencia en los métodos del primer y segundo aspectos de la invención debe entenderse como un valor predefinido de un marcador molecular dado, en el presente caso cualquiera de las proteínas enumeradas en el primer o segundo aspectos, así como en realizaciones particulares, que se derivan de los niveles de dicho marcador molecular en una muestra o un grupo de muestras. Si el nivel de expresión se determina a nivel de proteína, entonces el “nivel de expresión de referencia” es un valor predefinido de cantidad de proteína, mientras que si el nivel de expresión se determina a nivel de ARNm, entonces el “nivel de expresión de referencia” es un valor predefinido de cantidad de ARNm. Las muestras se toman de un sujeto o grupo de sujetos en los que la presencia, ausencia, estadio o evolución de la enfermedad se ha realizado de manera apropiada anteriormente. Este valor se usa como umbral para discriminar sujetos en los que la afección que va a analizarse está presente de aquellos en los que tal afección está ausente (es decir, un sujeto que tiene cáncer de endometrio de sujetos libres de cáncer de endometrio), para determinar el estadio de la enfermedad, el riesgo de desarrollar o de estar padeciendo carcinoma endometrial, entre otros. Este nivel de control de referencia también es útil para determinar si el sujeto debe iniciar un régimen médico y cómo de eficaz es el régimen. El sujeto o sujetos de los que se deriva el “nivel de control de referencia” pueden incluir sujeto(s) en el/los que la afección está ausente, sujeto(s) en el/los que la afección está presente, o ambos. El experto en la técnica, haciendo uso del conocimiento general, es capaz de elegir al sujeto o grupo de sujetos más adecuado para obtener el nivel de control de referencia para cada uno de los métodos de la presente invención. En el estado de la técnica se conocen bien métodos para obtener el valor de referencia del grupo de sujetos seleccionados (Burtis C. A.et al.,2008, capítulo 14, sección “Statistical Treatment of Reference Values”), En un caso particular, el “nivel de control de referencia” es un valor de corte definido por medio de un análisis de ROC (análisis de rendimiento diagnóstico) convencional. Como apreciará el experto en la técnica, el valor de corte óptimo se definirá según las aplicaciones particulares del método de diagnóstico o pronóstico: propósito, población diana para el diagnóstico o pronóstico, equilibrio entre especificidad y sensibilidad, etc.

En otra realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, el método comprende además determinar el nivel de expresión de una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste en: ENOA, KPYM, PDIA1, ANXA2 y FABP5.

PERM, también conocida como mieloperoxidasa o MPO, tiene el número de registro de la base de datos de Uniprot P05164, 19 de febrero de 2014 - v4. MPO es una proteína liberada por los leucocitos que desempeña un papel crucial en la inflamación y el estrés oxidativo a nivel celular.

En otra realización del método del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, el método comprende (a) medir,in vitro,en una muestra de líquido aislada del aparato genital femenino, el nivel de expresión de PERM, y el nivel de expresión de una o más proteínas seleccionadas de un segundo grupo que consiste en: ENOA, KPYM, PDIA1, ANXA2 y FABP5; y (b) comparar el nivel de expresión de cada una de las proteínas sometidas a prueba con un valor de referencia; en el que si se sobreexpresan las proteínas, es indicativo de carcinoma endometrial o un pronóstico malo.

En una realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, el método comprende determinar el nivel de expresión de uno del siguiente conjunto de marcadores MMP9,PERM; LDHA,PERM; KPYM,PERM; PERM,<s>P<i>T1; y PERM,NAMPT.

En una realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, el método comprende determinar el nivel de expresión de uno del siguiente conjunto de marcadores: MMP9,LDHA,PERM; MMP9,KPYM,PERM; MMP9,PERM,SPIT1; MMP9,PERM,NAMPT; LDHA,KPYM,PERM; LDHA,PERM,SPIT1; LDHA,PERM,NAMPT; KPYM,PERM,SPIT1; KPYM,PERM,NAMPT; y PERM,SPIT1,NAMPT.

En una realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, el método comprende determinar el nivel de expresión de uno del siguiente conjunto de marcadores: MMP9,LDHA,KPYM,PERM; MMP9,LDHA,PERM,SPIT1; MMP9,LDHA,PERM,NAMPT; MMP9,KPYM,PERM,SPIT1; MMP9,KPYM,PERM,NAMPT; MMP9,PERM,SPIT1,NAMPT; LDHA,KPYM,PERM,SPIT1; LDHA,KPYM,PERM,NAMPT; LDHA,PERM,SPIT1,NAMPT; y KPYM,PERM,SPIT1,NAMPT.

En una realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, el método comprende determinar el nivel de expresión de uno del siguiente conjunto de marcadores: MMP9,LDHA,KPYM,PERM,SPIT1; MMP9,LDHA,KPYM,PERM,NAMPT; MMP9,LDHA,PERM,SPIT1,NAMPT; MMP9,KPYM,PERM,SPIT1,NAMPT; y LDHA,KPYM,PERM,SPIT1,NAMPT.

En una realización del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, el método comprende determinar el nivel de expresión de MMP9, LDHA, KPYM, PERM, SPIT1, NAMPT y CADH1.

CADH1, también conocida como cadherina-1 o E-cadherina, tiene el número de registro de la base de datos de Uniprot P12830, 1 de julio de 1993 - v3. Esta proteína está implicada en mecanismos que regulan las adhesiones célula-célula, la movilidad y la proliferación de células epiteliales. Tiene un potente papel supresor invasivo.

SPIT1, también conocido como inhibidor de proteasa de tipo Kunitz 1, tiene el número de registro de la base de datos de Uniprot O43278, 15 de marzo de 2005 - v2. Esta proteína es un inhibidor de un activador de HGF. También actúa como inhibidor de matriptasa (ST14).

MMP9, también conocida como metaloproteinasa de matriz-9, tiene el número de registro de Uniprot P14780, 24 de noviembre de 2009 - v3. Esta proteína puede desempeñar un papel esencial en la proteólisis local de la matriz extracelular y en la migración de leucocitos. Podría desempeñar un papel en resorción osteoclástica ósea. Escinde KiSS1 en un enlace Gly-|-Leu. Escinde colágenos de tipo IV y tipo V en fragmentos de tres cuartos C-terminales grandes y fragmentos de un cuarto N-terminales más cortos. Degrada la fibronectina, pero no la laminina o el péptido Pz

NAMPT, también conocida como nicotinamida fosforibosiltransferasa, tiene el número de registro de la base de datos de Uniprot P43490, 1 de noviembre de 1995 - v1. Esta enzima, que es el componente que limita la velocidad en la ruta de biosíntesis de NAD en mamíferos, cataliza la condensación de nicotinamida con 5-fosforibosil-1-pirofosfato para proporcionar nicotinamida mononucleótido, un producto intermedio en la biosíntesis de NAD.

LDHA, también conocida como cadena de L-lactato deshidrogenasa A, tiene el número de registro de la base de datos de Uniprot P00338, 23 de enero de 2007 - v2. Esta proteína está implicada en la etapa 1 de la subruta que sintetiza (S)-lactato a partir de piruvato.

KPYM, también conocida como piruvato cinasa PKM, tiene el número de registro de la base de datos de Uniprot P14618, 23 de enero de 2007 - v4. Es una enzima glicolítica que cataliza la transferencia de un grupo fosforilo de fosfoenolpiruvato (PEP) a ADP, generando ATP y desempeñando un papel general en la muerte celular independiente de caspasa de las células tumorales.

En cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, para cualquiera de los aspectos de la invención, el nivel de expresión se determina a nivel de proteína. En esta realización, el/los marcador(es) proteínico(s) incluye(n), pero no se limita(n) a, polipéptidos de secuencia nativa, isoformas, polipéptidos quiméricos, todos los homólogos, fragmentos y precursores de los marcadores, incluyendo formas modificadas de los polipéptidos y derivados de los mismos.

En cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, el nivel de expresión se determina mediante inmunoquímica.

El término “inmunoquímica” tal como se usa en el presente documento se refiere a una variedad de técnicas para detectar antígenos (habitualmente proteínas y péptidos, y en el presente caso cualquiera de las proteínas enumeradas anteriormente solas o en combinación) en una muestra aprovechando el principio de que los anticuerpos se unen específicamente a dichos antígenos. La visualización de una interacción anticuerpo-antígeno puede lograrse de varias maneras. En el caso más habitual, un anticuerpo se conjuga con una enzima, tal como peroxidasa, que puede catalizar una reacción que produce color. Alternativamente, el anticuerpo también puede etiquetarse con un fluoróforo, tal como fluoresceína o rodamina. La técnica inmunoquímica puede ser directa o indirecta. El método directo es un método de tinción de una etapa e implica un anticuerpo marcado (por ejemplo, antisuero conjugado con FITC) que reacciona directamente con el antígeno. Mientras que esta técnica utiliza sólo un anticuerpo y, por tanto, es simple y rápida, la sensibilidad es menor debido a pequeña amplificación de señal, tal como con métodos indirectos, y se usa menos habitualmente que los métodos indirectos. El método indirecto implica un anticuerpo primario sin marcar (primera capa) que se une al antígeno diana en la muestra y un anticuerpo secundario marcado (segunda capa) que reacciona con el anticuerpo primario. Este método es más sensible que las estrategias de detección directa debido a la amplificación de señal debida a la unión de varios anticuerpos secundarias a cada anticuerpo primario si el anticuerpo secundario se conjuga con el indicador fluorescente o enzimático.

Puede lograrse una amplificación adicional si el anticuerpo secundario se conjuga con varias moléculas de biotina, lo que puede reclutar complejos de avidina-, estreptavidina o neutravidina-enzima. El método indirecto, aparte de su mayor sensibilidad, también tiene la ventaja de que sólo es necesario generar una cantidad relativamente pequeña de anticuerpos secundarios (marcados) conjugados convencionales. Con el método directo, sería necesario marcar cada anticuerpo primario para cada antígeno de interés. Hay que tener en cuenta que las técnicas de inmunoquímica también pueden usarse para detectar determinadas secuencias de ácido nucleico si una sonda de ácido nucleico etiquetada (diseñada para unirse específicamente a una determinada secuencia de ácido nucleico diana) puede detectarse posteriormente con un anticuerpo marcado. Por tanto, la detección de la proteína podría realizarse usando un ácido nucleico etiquetado diseñado para unir a una secuencia específica del ARN de la proteína diana, y luego detectar dicho ácido nucleico etiquetado con un anticuerpo marcado que se une de manera selectiva a la etiqueta.

Los procedimientos de inmunoensayo adecuados incluyen ensayos de inmunoadsorción ligados a enzimas (ELISA), ensayo de inmunotransferencia por puntos, ensayo de aglutinación, ensayo de tipo sándwich de anticuerpoantígeno-anticuerpo, ensayo de tipo sándwich de antígeno-anticuerpo-antígeno, inmunocromatografía, u otros formatos de inmunoensayo bien conocidos por el experto habitual en la técnica.

En una realización, en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, el nivel de expresión de proteína se determina mediante un inmunoensayo.

En otra realización, en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, el nivel de expresión de proteína se determina mediante ELISA.

Alternativamente, el nivel de expresión de proteína puede determinarse mediante bioluminescencia, fluorescencia, quimioluminiscencia, electroquímica o espectrometría de masas.

En otra realización, en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, el nivel de expresión de proteína se determina usando un anticuerpo o un fragmento del mismo capaz de unirse a la(s) proteína(s) diana.

El término “anticuerpo o un fragmento del mismo capaz de unirse a la(s) proteína(s) diana” debe entenderse como cualquier inmunoglobulina o fragmento de la misma capaz de unirse de manera selectiva a la proteína diana. Incluye anticuerpos monoclonales y policlonales. El término “fragmento del mismo” abarca cualquier parte de un anticuerpo que tenga el tamaño y la conformación adecuados para unirse a un epítopo de la proteína diana. Los fragmentos adecuados incluyen F(ab), F(ab') y Fv. Un “epítopo” es la parte del antígeno que es reconocida por el sistema inmunitario (células B, células T o anticuerpos).

Los anticuerpos usados para la detección específica pueden ser policlonales o monoclonales. Existen medios bien conocidos en el estado de la técnica para preparar y caracterizar los anticuerpos. En la técnica anterior son bien conocidos métodos para generar anticuerpos policlonales. En resumen, se preparan anticuerpos policlonales inmunizando a un animal con la proteína; luego, se recoge suero del animal inmunizado y se aíslan los anticuerpos. Puede usarse una amplia gama de especies animales para la producción del antisuero. Normalmente, el animal usado para la producción de antisueros puede ser un conejo, un ratón, una rata, un hámster, una cobaya o una cabra.

Además, pueden prepararse anticuerpos monoclonales (AcM) usando técnicas bien conocidas. Normalmente, el procedimiento implica inmunizar un animal adecuado con la proteína asociada con la enfermedad. La composición inmunizante puede administrarse en una cantidad eficaz para estimular las células que producen anticuerpos.

Los métodos para preparar anticuerpos monoclonales se inician generalmente siguiendo las mismas líneas que la preparación de anticuerpos policlonales. El inmunógeno se inyecta en los animales como antígeno. El antígeno puede mezclarse con adyuvantes tales como adyuvante de Freund completo o incompleto. En intervalos de dos semanas, aproximadamente, se repite la inmunización con el mismo antígeno. En otra realización particular del tercer aspecto, los medios para llevar a cabo la invención forman parte de un kit. El anticuerpo o fragmento del mismo para detectar la(s) proteína(s) diana puede incluirse en un kit. El kit puede comprender adicionalmente medios (aditivos, disolventes) para visualizar las interacciones anticuerpo-proteína.

Estos anticuerpos pueden usarse como “medios” para determinar la expresión de las proteínas diana en el quinto aspecto de la invención.

Todas las realizaciones proporcionadas anteriormente, en el primer aspecto de la invención, en cuanto a las proteínas que van a analizarse (desde 2 hasta 10 de la lista y los conjuntos de proteínas que comprenden 2, 3, 4, 5 ó 6 marcadores particulares), son también realizaciones particulares del uso del tercer aspecto de la invención. Alternativamente, el nivel de expresión se determina a nivel de ARNm.

En una realización, la cantidad de ARNm de cada uno de los marcadores se detectan a través de la reacción en cadena de la polimerasa usando, por ejemplo, cebadores de oligonucleótidos que se hibridan con uno o más marcadores polinucleotídicos de cáncer de endometrio o complementos de tales polinucleótidos. Dentro de otras realizaciones, la cantidad de ARNm se detecta usando una técnica de hibridación, empleando sondas de oligonucleótidos que se hibridan con uno o más marcadores polinucleotídicos de cáncer de endometrio o complementos de tales polinucleótidos.

Cuando se usa detección de ARNm, el método puede llevarse a cabo combinando ARNm aislado con reactivos para convertirlo en ADNc según métodos convencionales bien conocidos en la técnica, tratando el ADNc convertido con reactivos de reacción de amplificación (tal como reactivos de reacción PCR de ADNc) en un recipiente junto con una mezcla apropiada de cebadores de ácido nucleico; haciendo reaccionar el contenido del recipiente para producir productos de amplificación; y analizando los productos de amplificación para detectar la presencia de uno o más de los marcadores polinucleotídicos de cáncer de endometrio en la muestra. Para ARNm, la etapa de análisis puede lograrse usando análisis de transferencia de tipo Northern para detectar la presencia de marcadores polinucleotídicos de cáncer de endometrio en la muestra. La etapa de análisis puede lograrse adicionalmente detectando de manera cuantitativa la presencia de marcadores polinucleotídicos de cáncer de endometrio en el producto de amplificación y comparando la cantidad de marcador detectada frente a un panel de valores esperados para la presencia o ausencia conocida de tales marcadores en tejido normal y maligno derivado usando cebadores similares.

En otra realización, la invención proporciona un método en el que se detecta ARNm: (a) aislando ARNm de una muestra y combinando el ARNm con reactivos para convertirlo en ADNc; (b) tratando el ADNc convertido con reactivos de reacción de amplificación y cebadores de ácido nucleico que se hibridan con uno o más de los marcadores polinucleotídicos de cáncer de endometrio para producir productos de amplificación; (c) analizando los productos de amplificación para determinar la cantidad de ARNm presente que codifica para el marcador proteínico de cáncer de endometrio; y (d) comparando la cantidad determinada de ARNm con una cantidad detectada frente a un panel de valores esperados para tejido normal y enfermo (por ejemplo, tejido maligno) derivado usando métodos similares.

En realizaciones particulares de la invención, puede usarse RT-PCR para amplificar el ARNm para marcadores proteínicos de cáncer de endometrio para la detección y el análisis. Otras realizaciones de la invención usan RT-PCR cuantitativa para determinar de manera cuantitativa la cantidad de ARNm para marcadores proteínicos de cáncer de endometrio. Realizaciones adicionales de la invención usan RT-PCR en tiempo real para la cuantificación y el análisis.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona el uso de un kit que comprende un soporte sólido y medios. En una realización de la invención, los medios para determinar el nivel de expresión son anticuerpo(s) o fragmentos de los mismos que se une(n) específicamente a la(s) proteína(s) diana.

El número de anticuerpos específicos o fragmentos de los mismos incluidos en el kit dependerán del número de proteínas que van a detectarse. A este respecto, las realizaciones anteriores del método del primer aspecto de la invención han proporcionado varios conjuntos de proteínas que van a determinarse para realizar un diagnóstico o pronóstico apropiado del carcinoma endometrial, comprendiendo estos conjuntos de proteínas dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete proteínas. Partiendo de esta información, el experto en la técnica puede ser capaz de elegir uno de los conjuntos mencionados previamente y seleccionar el anticuerpo o fragmento del mismo más apropiado, de aquellos ya disponibles, para la detección de cada proteína. La incorporación de los anticuerpos seleccionados en el soporte sólido apropiado puede realizarse usando métodos habituales.

En una realización de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, el kit comprende medios para determinar el nivel de expresión de uno del siguiente conjunto de marcadores: MMP9,PERM; LDHA,PERMKPYM,PERM; PERM,SPIT1; y PERM,NAMPT.

En una realización de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, el kit comprende medios para determinar el nivel de expresión de uno del siguiente conjunto de marcadores: MMP9,LDHA,PERM;<m>M<p>9,KPYM,PERM; MMP9,PERM,SPIT1; MMP9,PERM,NAMPT; LDHA,KPYM,PERM; LDHA,PERM,SPIT1; LDHA,PERM,NAMPT KPYM,PERM,SPIT1; KPYM,PERM,NAMPT; y PERM,SPIT1,NAMPT.

En una realización de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, el kit comprende medios para determinar el nivel de expresión de uno del siguiente conjunto de marcadores: MMP9,LDHA,KpYm ,PERM; MMP9,LDHA,PERM,SPIT1; MMP9,LDHA,PERM,NAMPT; MMP9,KPYM,PERM,SPIT1; MMP9,KPYM,PERM,NAMPT; MMP9,PERM,SPIT1,NAMPT; LDHA,KPYM,PERM,SPIT1; LDHA,KPYM,PERM,NAMPT; LDHA,PERM,SPIT1,NAMPT; y KPYM,PERM,SPIT1,NAMPT.

En una realización de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, el kit comprende medios para determinar el nivel de expresión de uno del siguiente conjunto de marcadores: MMP9,LDHA,KPYM,PERM,SPIT1; MMP9,LDHA,KPYM,PERM,NAMPT; MMP9,LDHA,PERM,SPIT1,NAMPT; MMP9,KPYM,PERM,SPIT1,NAMPT; y LDHA,KPYM,PERM,SPIT1,NAMPT. En otra realización, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones proporcionadas anteriormente o a continuación, el kit comprende medios para detectar el nivel de expresión de MMP9, LDHA, KPYM, PERM, SPIT1, NAMPT y CADH1.

En cualquiera de las realizaciones anteriores, el kit puede comprender opcionalmente medios para detectar el nivel de expresión de una o más proteínas seleccionadas de ENOA, KPYM, p DiA1, ANXA2 y FABP5.

En otra realización de la invención, el kit es un kit de ELISA. En esta realización, el kit comprende un soporte sólido y medios para determinar el nivel de expresión de cualquiera de los conjuntos de proteínas proporcionados anteriormente. En otra realización, el kit comprende un soporte sólido y anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen específicamente a las proteínas diana que van a detectarse, conjugándose estos anticuerpos con una molécula indicadora capaz de producir una señal.

El “soporte sólido” incluye una membrana de nitrocelulosa, vidrio o un polímero. Siendo los polímeros usados más habitualmente celulosa, poliacrilamida, nailon, poliestireno, poli(cloruro de vinilo) o polipropileno. Los soportes sólidos pueden estar en forma de tiras, tubos, perlas, discos o microplacas, o cualquier otra superficie adecuada para realizar un inmunoensayo.

La “molécula indicadora” tal como se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a una molécula que, por su naturaleza química, proporciona una señal analíticamente identificable que permite la detección de un anticuerpo unido a antígeno. La detección puede ser o bien cualitativa o bien cuantitativa. Las moléculas indicadoras usadas más habitualmente en este tipo de ensayo son moléculas que contienen enzimas, fluoróforos o radionúclidos (es decir, radioisótopos). En el case de un inmunoensayo con enzimas, una enzima se conjuga con el segundo anticuerpo, generalmente por medio de glutaraldehído o peryodato. Como se reconocerá fácilmente, sin embargo, existe una amplia variedad de diferentes técnicas de conjugación, que están fácilmente disponibles para los expertos en la técnica. Las enzimas usadas habitualmente incluyen peroxidasa del rábano, glucosa oxidasa, p-galactosidasa y fosfatasa alcalina, entre otras. Los sustratos que van a usarse con las enzimas específicas se eligen generalmente para la producción, tras la hidrólisis mediante la enzima correspondiente, de un cambio de color detectable. Por ejemplo, fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo/nitroazul de tetrazolio es adecuado para su uso con conjugados de fosfatasa alcalina; para conjugados de peroxidasa, se usan habitualmente 1,2-fenilendiamina, ácido 5-aminosalicílico, 3,3:5,5:tetrametilbencidina o tolidina. También es posible emplear sustratos fluorogénicos, que producen un producto fluorescente en lugar de los sustratos cromogénicos indicados anteriormente. Ejemplos de sustratos fluorogénicos son fluoresceína y rodamina. Cuando se activa mediante iluminación con luz de una longitud de onda particular, el anticuerpo marcado con fluorocromo absorbe la energía de la luz, induciendo un estado de excitabilidad en la molécula, seguido de emisión de la luz en un color característico visualmente detectable con un microscopio óptico. Las técnicas de inmunofluorescencia y EIA están ambas bien establecidas en la técnica y se prefieren particularmente para el presente método. Sin embargo, también pueden emplearse otras moléculas indicadoras, tales como moléculas de radioisótopo, quimioluminescentes y bioluminescentes y/o tintes y otras sustancias cromogénicas.

La elección de un anticuerpo conjugado con una molécula indicadora particular será, en su mayor parte, determinado por el uso previsto y el usuario del kit de prueba de la presente invención.

En otra realización, el kit es un microalineamiento.

En otra realización, el kit es un microalineamiento que incluye un conjunto definido de genes que codifican para marcadores proteínicos de cáncer de endometrio. Todas las realizaciones proporcionadas anteriormente para conjuntos particulares de proteínas con 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 proteínas, cuya expresión se altera significativamente por una enfermedad endometrial, también son realizaciones particulares de microalineamientos.

Los métodosin vitrode la invención proporcionan información de diagnóstico y pronóstico. En una realización, los métodos de la invención comprenden además las etapas de (i) recoger la información de diagnóstico o pronóstico, y (ii) guardar la información en un soporte de datos.

En el sentido de la invención un “soporte de datos” debe entenderse como cualquier medio que contenga datos de información significativos para el diagnóstico o pronóstico de carcinoma endometrial, tal como papel. El soporte también puede ser cualquier entidad o dispositivo capaz de portar los datos de pronóstico. Por ejemplo, el soporte puede comprender un medio de almacenamiento, tal como una ROM, por ejemplo, una CD ROM o una ROM semiconductora, o un medio de registro magnético, por ejemplo, un disco flexible o un disco duro. Además, el soporte puede ser un soporte transmisible tal como una señal eléctrica u óptica, que puede transportarse a través de un cable eléctrico u óptico o mediante radio u otros medios. Cuando los datos de pronóstico se materializan en una señal que puede transportarse directamente mediante un cable u otro dispositivo o medio, el soporte puede estar constituido por tal cable u otro dispositivo o medios. Otros soportes se refieren a dispositivos USB y archivos informáticos. Ejemplos de soportes de datos adecuados son papel, CD, USB, archivos informáticos en PC, o registro de sonido con la misma información.

En toda la descripción y las reivindicaciones no se pretende que la expresión “comprenden” y variaciones de la expresión excluyan otras características técnicas. Además, la expresión “comprenden” y sus variaciones abarca el término “que consisten en”. Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Además, la presente invención cubre todas las posibles combinaciones de realizaciones particulares y preferidas descritas en el presente documento.

Ejemplos

Ejemplo 1

Reactivos

Las columnas SpinTrap de agotamiento de albúmina e IgG se adquirieron de GE Healthcare (n.° de cat. 28-9480 20). La endoproteinasa Lys C de grado EM se adquirió de Thermo Scientific (n.° de cat. 90051). Los cartuchos de extracción en fase sólida, Sep Pak tC18, 50 mg, se obtuvieron de Waters (n.° de cat. WAT054960). Todos los demás reactivos se obtuvieron de Sigma-Aldrich.

Pacientes y recogida de muestras

Un total de 38 pacientes (20 mujeres que padecían CE y 18 controles sin CE, es decir, mujeres con síntomas de CE pero sin diagnóstico de CE) que participaron en este estudio prospectivo se reclutaron en el Hospital Universitario Vall d'Hebron (Barcelona, España) durante los años 2012 a 2015. Todos los pacientes firmaron los formularios de consentimiento informado, aprobados por el Comité Ético de Vall d'Hebron (número de aprobación: PR_AMI_50-2012).

Se recogieron muestras de líquido uterino mediante aspiración con una cánula Pipelle de Cornier (Eurogine ref.

03040200) en el consultorio del médico o en el quirófano antes de la cirugía y se transfirieron a microtubos de 1,5 ml. Se añadió solución tampón fosfato salino en una razón de 1:1 (v/v) y se centrifugó a 2500 rcf durante 20 minutos para separar la fracción soluble (sobrenadante) de la fracción sólida (sedimento). Las fracciones separadas se mantuvieron a -80 °C hasta su uso.

Preparación de muestras para el estudio de verificación

Se sonicaron los sobrenadantes de aspirados uterinos proveniente de 20 pacientes con CE y 18 controles sin CE para descomponer posibles microvesículas, agregados de proteínas, y/o moco mediante 5 ciclos al 100 % de amplitud durante 5 segundos (Labsonic M). Luego se agotaron la albúmina y la inmunoglobulina G a partir de 50 |il de muestras de sobrenadante usando el kit SpinTrap de agotamiento de albúmina e IgG según las instrucciones del fabricante. Se midió la concentración de proteína total mediante el ensayo de Bradford realizado por triplicado. Luego se separó cada una de las 38 muestras en dos alícuotas de 25 |ig para generar duplicados para todo el procedimiento, con excepción de una muestra para la que la cantidad de material no era suficiente para la duplicación. Se diluyeron las muestras en una disolución 50 mM de bicarbonato de amonio hasta un volumen final de 120 |il y se desnaturalizaron mediante la adición de 185 |il de urea 10 M suspendida en bicarbonato de amonio 50 mM, se incubaron a 22 °C con agitación durante 20 min, y seguido de 10 min de incubación en un baño ultrasónico (Branson 5510). Luego se redujeron las muestras con 7,8 |il de ditiotreitol 200 mM durante 60 min a 37 °C, y se sometió a alquilación con 12,2 |il de yodoacetamida 400 mM a 22 °C durante 30 min en la oscuridad. Se digirieron las muestras durante 4 h a 37 °C con Lys C (razón de cantidad de proteasa/proteína total de 1/150; p/p). Después de eso, se diluyó la concentración de urea hasta 1 M con tampón bicarbonato de amonio 50 mM, y se incubaron las muestras durante la noche a 37 °C con tripsina (razón de cantidad de proteasa/proteína total de 1/50; p/p). Se extinguió la actividad de tripsina mediante la adición de 1 |il de ácido fórmico puro por 100 |il de disolución. Se sometieron a adiciones conocidas las muestras con la mezcla de péptidos sintéticos pesados y luego se sometió a desalación en cartuchos de extracción en fase sólida (Sep Pak tC18, 50 mg, Waters). Se evaporaron posteriormente los eluatos hasta sequedad en una centrífuga de vacío y luego se resuspendieron en ácido fórmico al 0,1 % antes del análisis de CL-PRM.

Configuración de CL-EM/EM PRM

La configuración de CL/EM consistió en un sistema de cromatografía RSLC Dionex Ultimate 3000 configurado para un gradiente binario de alta presión y hecho funcionar en un modo de cambio de columna. La fase móvil A consistía en ácido fórmico al 0,1 % en agua, la fase B en ácido fórmico al 0,1 % en acetonitrilo y la fase de carga en ácido trifluoroacético al 0,05 % y acetonitrilo al 1 % en agua. Se inyectó el equivalente a 250 ng de cada muestra digerida y se cargó en una columna de desorción (75 * 2 cm, C18 pepmap 100, 3 |im) a 5 |il/min y se eluyó adicionalmente en la columna analítica (75 |im * 15 cm, C18 pepmap 100, 2 |im) a 300 nl/min mediante un gradiente lineal que comienza desde el 2 % de A hasta el 35 % de B en 48 min. El análisis de EM se realizó mediante un espectrómetro de masas Orbitrap con cuadrupolo híbrido (Q Exactive plus, Thermo Scientific) hecho funcionar en modo PRM. El ciclo de EM comenzó con un barrido de MS1 completo realizado con una potencia de resolución de 70.000 (a 200 m/z) seguido de barridos de PRM específicos programados adquiridos con una potencia de resolución de 35.000 (a 200 m/z) con una energía de colisión normalizada de 20. La ventana de aislamiento del cuadrupolo para los eventos PRM se estableció en 1 unidad m/z y la duración de las ventanas de tiempo programadas para cada par de péptidos endógenos y marcados isotópicamente se estableció en 2 min.

Análisis estadístico

Todos los análisis se realizaron en SPSS versión 20.0 (IBM, EE. UU.) y Graph Pad Prism v.6.0 (GraphPad Software, CA, EE. UU.). Las razones promediadas de área ligera/pesada se calcularon entre duplicados. La correlación lineal entre los péptidos distintivos de la misma proteína se calculó usando el coeficiente de correlación de Pearson. Debido al conjunto de datos no distribuidos normalmente, evaluados mediante las pruebas de Kolmogorov-Smirnova y Shapiro-Wilk, la comparación de la expresión de los péptidos monitorizados entre las muestras tumorales y de control se evaluó mediante la prueba de la U de Mann-Whitney no paramétrica. Los valores de p inferiores a 0,05 junto con los cambios en veces por encima de 3 se consideraron estadísticamente significativos. Se usaron curvas de rendimiento diagnóstico (ROC) para calcular la relación entre la sensibilidad y la especificidad del grupo con CE frente al grupo de control sin CE y, por tanto, para evaluar el rendimiento diagnóstico de cada candidato a biomarcador.

Resultados

Se comparó la expresión de cada candidato a biomarcador entre 20 pacientes con CE y 18 controles sin CE. Es importante destacar que, tanto las pacientes como los controles eran mujeres posmenopáusicas que padecen metrorragia, ya que el 93%de pacientes que padecen CE presentan estas características clínicas, pero sólo el 15 % de ellas será finalmente diagnosticada con CE.

Basándose en los ensayos de Bradford, se inyectaron 250 ng de la concentración de proteína total después del agotamiento de la albúmina y las IgG para cada muestra. Se confirmó adicionalmente la cantidad constante de proteína inyectada entre las muestras mediante la integración del cromatograma de iones total de los barridos de MS1. Después de la conservación de datos de EM, los niveles relativos (razones ligeras/pesadas) de los 98 péptidos monitorizados en MS2 se sometieron a una prueba de Mann Whitney para su comparación entre muestras tumorales y de control. 58 péptidos correspondientes a 32 proteínas mostraron diferencias significativas entre los dos grupos con valor de p <0,05 y el cambio en veces mayor de 1,5: PERM, CADH1, SPIT1, ENOA, MMP9, LDHA, CASP3, KPYM, PRDX1, OSTP, PDIA1, NAMPT, MIF, CTNB1, K2C8, ANXA2, CAPG, FABP5, MUC1, CAYP1, XPO2, NGAL, SG2A1, ANXA1, HSPB1, PIGR, CH10, CD44, CLIC1, TPIS, GSTP1, y GTR1. Todas estas proteínas se sobreexpresaron en muestras tumorales en comparación con las muestras de control.

Para evaluar adicionalmente su utilidad como biomarcadores para el diagnóstico de CE, se realizó un análisis de ROC para determinar la sensibilidad y especificidad de cada biomarcador. Curiosamente, todas las proteínas lograron excelentes valores de área bajo la curva (AUC) para definir una probabilidad aumentada de CE en aspirados uterinos mínimamente invasivos, que oscilan desde 0,71 hasta 0,95. Las 10 proteínas individuales con mayor rendimiento eran PERM, CADH1, SPIT1, ENOA, MMP9, LDHA, CASP3, isoforma M1-M2 de KPYM, PRDX1 e isoforma A de OSTP, todas ellas con valores de AUC mayores de 0,9.

TABLA1

Estos resultados permiten concluir que estas proteínas presentan sensibilidad y especificidad muy altas en muestras de líquido aisladas del aparato genital femenino.

Además, también se realizó un análisis bioinformático utilizando Ingenuity Pathway Analysis (IPA) para comprender mejor la asociación de estas proteínas con el cáncer y su origen con respecto a la ubicación subcelular. Como se esperaba, la integración de los datos dio como resultado la identificación del cáncer, las enfermedades inflamatorias, las lesiones y anomalías del organismo y las enfermedades del aparato reproductor como las principales enfermedades asociadas a estos biomarcadores. Las cinco funciones moleculares y celulares principales involucradas con estas proteínas incluyeron el movimiento celular, la muerte y supervivencia celular, el desarrollo celular, el crecimiento y la proliferación celular y la señalización e interacción de célula a célula, todos ellos procesos importantes alterados en el cáncer. Estas proteínas se hallan principalmente en el citoplasma, la membrana plasmática y el espacio extracelular, indicando que provienen de la secreción de las células epiteliales e inflamatorias del endometrio o de la necrosis de las células del tejido proximal. Estas características fueron cruciales para facilitar el uso de esos biomarcadores para diagnosticar el CE en líquidos corporales proximales relacionados con el aparato genital femenino.

Ejemplo 2

Se evaluó el rendimiento diagnóstico de varias proteínas mediante cromatografía líquida con detección mediante espectrometría de masas usando un método de adquisición de monitorización de reacción en paralelo (CL-PRM), tal como se divulgó anteriormente, en muestras de aspirado uterino de 116 mujeres.

El procesamiento de aspirados uterinos incluyó su recogida mediante aspiración con un dispositivo especializado, y dilución del aspirado en un tubo con una solución salina PBS1x en una razón 1:1 (v/v). Luego, se realizó centrifugación a 2.500 * g durante 20 min para separar la fracción líquida de la fracción celular. Los sobrenadantes de aspirados uterinos se usaron para evaluar los biomarcadores proteínicos.

De las 116 mujeres, a 69 se les diagnosticó con CE, incluyendo 49 con CE endometrioide (EEC) y 20 con CE seroso no endometrioide (SEC); y las restantes 47 mujeres eran mujeres sin CE con un endometrio normal o al que se les diagnosticó trastornos benignos.

Para obtener biomarcadores de CE significativos, la expresión de cada marcador, que se midió como razón de área ligera/pesada obtenida en el estudio de CL-PRM (la configuración de CL-PRM es la misma que en el ejemplo 1), se comparó en la población tumoral (n=69) frente a la población sin CE (n=47) usando la prueba de la U de Mann-Whitney no paramétrica. Los valores de p ajustados menores de 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. El análisis de rendimiento diagnóstico (ROC) se usó para evaluar la especificidad y sensibilidad de los biomarcadores y el área bajo la curva ROC (AUC) se estimó para cada proteína individual. Los resultados se resumen en la tabla 2 a continuación:

Tabla 2

A partir de los biomarcadores más robustos, los inventores prestaron atención a la mejora de la información de diagnóstico proporcionada por MMP9. Con este fin, se ajustó un modelo de regresión logística a los datos para evaluar la potencia de las diferentes combinaciones de proteínas para clasificar muestras en dos categorías clínicas (cáncer y control). Se generaron curvas de ROC para cada uno de estos modelos de regresión; se obtuvieron el AUC, la sensibilidad y especificidad en el punto de corte “óptimo” para la discriminación entre grupos. El punto de corte óptimo correspondía al umbral que maximizó la distancia a la línea de identidad (diagonal). El criterio de optimalidad era: máx. (sensibilidades especificidades). Se calcularon los intervalos de confianza (IC) del 95 % del AUC con el método de Delong (20). Los IC del 95 % de los valores de sensibilidad y especificidad se calcularon con remuestreo con reposición y los métodos de promedio descritos por Fawcett (Fawcett T., “An Introduction to ROC Analysis”, Pattern Recogn Lett. 2006, v. 27, páginas 861-874). Todos los análisis de ROC se realizaron usando el paquete R “pROC” (Robin X.et al.,“pROC: an open-source package for R y S+ to analyse and compare ROC curves”, BMC Bioinformatics, 2011, v. 12, página 77). Para evaluar la solidez de cada panel de proteínas, se realizó el procedimiento de validación cruzada “dejando uno fuera” aplicando a cada muestra en el conjunto de datos el modelo de regresión logística ajustado a las muestras restantes en el conjunto de datos, de lo que se deriva una nueva curva de ROC y después de eso realizando el análisis de ROC habitual. De una manera similar, la potencia de discriminación del panel de proteínas de diagnóstico se validó adicionalmente aplicando a cada muestra de un conjunto independiente de muestras (cohorte 2: cohorte en el ejemplo 1) el modelo de regresión logística ajustado al conjunto inicial (cohorte 1: cohorte en el ejemplo 2), de lo que se deriva una nueva curva ROC y después de eso realizando el análisis de ROC habitual.

Por tanto, se halló que un valor de biomarcador de MMP9 se mejoró de manera notable cuando su determinación se realizó en combinación con KPYM, ENOA, PRDX1, MIF, GSTP1, CAPG, CADH1, HSPB1, PDIA1, LDHA, CLIC1, CASP3, FABP5, TPIS, LDHA, CTNB1, CH10, NAMPT y ANXA2; al contrario que otras proteínas que, cuando se combinaron con MMP9, afectaron de manera adversa el valor de biomarcador de CE de MMP9 solo.

Un ejemplo específico de una combinación positiva es la combinación MMP9+KPYM que mostró un valor de AUC de 0,96. Este hallazgo fue sorprendente porque MMP9 y KPYM tiene un valor de AUC individual de 0,89 y 0,90, respectivamente, y, cuando se combinaron, se aumentó el valor de AUC de MMP9'.

Por el contrario, la combinación de MMP9 con PERM no mejoró la precisión para detectar el CE. En los ejemplos 1 y 2, los valores de AUC individuales obtenidas para MMP9 eran 0,91 y 0,89; y los valores de AUC para PERm eran de 0,96 y 0,86. Sin embargo, su combinación no informó cualquier valor de a Uc mejorado. Combinación de MMP9 con PERM tiene un valor de AUC de 0,89.

Ejemplo 3

Detección de MMP9 y KPYM a través de tecnología de ELISA. Kits de ELISA (R&D Systems y USCN life Science y Technology Company, respectivamente) según el protocolo del fabricante. Para MMP9, se analizaron 105 muestras de aspirado uterino usando diluciones 1:10; 1:100 ó 1:1000. Para KPYM, sólo pudieron analizarse 39 muestras de aspirado uterino usando diluciones 1:2, 1:4 ó 1:10 debido a una falta de material de muestra. Se sometieron a ensayo todas las muestras en duplicados y se informaron los valores promedio como ng/ml. La correlación lineal entre los resultados de los ensayos de CL-PRM y ELISA se calculó usando el coeficiente de correlación de Pearson. Se halló que los resultados de ELISA tenían una correlación muy alta con los observados en espectrometría de masas. Por tanto, MMP9 y KPYM podían usarse en técnicas basadas en anticuerpos para diagnosticar el CE.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Método de diagnóstico o pronóstico de carcinoma endometrial, comprendiendo el método determinar el nivel de expresión de PERM en una muestra de líquido aislada del aparato genital femenino.

2. Método según la reivindicación 1, que comprende determinar el nivel de expresión de uno o más del siguiente conjunto de marcadores proteínicos: MMP9,PERM; LDHA,PERM; KPYM,PERM; PERM,SPIT1; PERM,NAMPT; MMP9,LDHA,PERM; MMP9,KPYM,PERM; MMP9,PERM,SPIT1; MMP9,PERM,NAMPT; LDHA,KPYM,PERM; LDHA,PERM,SPIT1; LDHA,PERM,NAMPT; KPYM,PERM,SPIT1; KPYM,PERM,NAMPT; PERM,SPIT1,NAMPT; MMP9,LDHA,KPYM,PERM; MMP9,LDHA,PERM,SPIT1; MMP9,LDHA,PERM,NAMPT; MMP9,KPYM,PERM,SPIT1; MMP9,KPYM,PERM,NAMPT; MMP9,PERM,SPIT1,NAMPT; LDHA,KPYM,PERM,SPIT1; LDHA,KPYM,PERM,NAMPT; LDHA,PERM,SPIT1,NAMPT; KPYM,PERM,SPIT1,NAMPT; MMP9,LDHA,KPYM,PERM,SPIT1; MMP9,LDHA,KPYM,PERM,NAMPT; MMP9,LDHA,PERM,SPIT1,NAMPT; MMP9,KPYM,PERM,SPIT1,NAMPT; LDHA,KPYM,PERM,SPIT1,NAMPT; y MMP9, LDHA, KPYM, PERM, SPIT1, NAMPT y CADH1.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el nivel de expresión se determina a nivel de proteína.

4. Método según la reivindicación 3, en el que el nivel de expresión de proteína se determina usando un anticuerpo o un fragmento del mismo capaz de unirse a la proteína.

5. Método según la reivindicación 4, en el que dicho anticuerpo o fragmento del mismo forma parte de un kit.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra aislada es líquido uterino.

7. Uso de PERM como marcadorin vitropara el diagnóstico o el pronóstico de carcinoma endometrial en una muestra de líquido aislada del aparato genital femenino.

8. Uso según la reivindicación 7, en el que la muestra de líquido aislada es un aspirado uterino.

9. Uso de medios para determinar el nivel de expresión de PERM para el diagnóstico o el pronóstico de carcinoma endometrial en el método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1-6.

10. Método para identificar un sujeto sospechoso de padecer carcinoma endometrial, comprendiendo el método:

a) determinar,in vitro,el nivel de expresión de PERM en una muestra de líquido del aparato genital femenino del sujeto, y

b) comparar el nivel de la etapa (a) con un nivel de control de referencia, en el que si el nivel determinado en la etapa (a) es mayor que el nivel de control de referencia, es indicativo de que el sujeto es sospechoso de padecer carcinoma endometrial.

11. Método de decidir o recomendar si iniciar un régimen médico de un sujeto sospechoso de padecer carcinoma endometrial, método que comprende las etapas de:

a) determinar,in vitro, el nivel de expresión de PERM en una muestra de líquido del aparato genital femenino del sujeto; y

b) diagnosticar el carcinoma endometrial o determinar si el sujeto es sospechoso de padecer carcinoma endometrial, si el nivel de proteína en la muestra de prueba es mayor que un nivel de control de referencia; en el que:

i) si se diagnostica que el sujeto padece carcinoma endometrial, o de ser sospechoso de padecer carcinoma endometrial, entonces se recomienda el inicio del régimen médico, y

ii) si se diagnostica que la paciente no padece carcinoma endometrial, el seguimiento se realiza opcionalmente teniendo en cuenta el resultado de un examen de la paciente por un médico.

12. Método para determinar la eficacia de un régimen médico en una paciente ya diagnosticada de carcinoma endometrial, comprendiendo el método las etapas de:

(a) medirin vitroel nivel de expresión de PERM en una muestra de líquido del aparato genital femenino del sujeto antes de la administración del régimen médico;

(b) medirin vitroel nivel de dicho marcador en una muestra de líquido del aparato genital femenino del sujeto una vez comenzada la administración del régimen médico; y

(c) comparar los niveles medidos en las etapas (a) y (b), de tal manera que si el nivel medido en la etapa (b) es menor que el nivel medido en la etapa (a), es indicativo de que el régimen médico es eficaz en el tratamiento de carcinoma endometrial;

o, alternativamente, comprendiendo el método las etapas de:

(i) medirin vitroel nivel de expresión de PERM en una muestra de líquido del aparato genital femenino del sujeto una vez comenzada la administración del régimen médico; y

(ii) comparar el nivel medido en la etapa (i) con un nivel de control de referencia del/de los marcador(es), en el que, si el nivel medido en la etapa (i) no es mayor que el nivel de control de referencia, es indicativo de que el régimen médico es eficaz en el tratamiento de carcinoma endometrial.

Uso de un kit que comprende un soporte sólido y medios para detectar el nivel de expresión de uno o más del siguiente conjunto de marcadores: MMP9,PEr M; LDHA,PERM; KPYM,PERM; PERM,SPIT1; PERM,NAMPT; MMP9,LDHA,PERM; MMP9,KPYM,PERM; MMP9,PERM,SPIT1; MMP9,PERM,NAMPT; LDHA,KPYM,PERM; LDHA,PERM,SPIT1; LDHA,PERM,NAMPT; KPYM,PERM,SPIT1; KPYM,PERM,NAMPT; PERM,SPIT1,NAMPT; MMP9,LDHA,KPYM,PERM; MMP9,LDHA,PERM,SPIT1; MMP9,LDHA,PERM,NAMPT; MMP9,KPYM,PERM,SPIT1; MMP9,KPYM,PERM,NAMPT; MMP9,PERM,SPIT1,NAMPT; LDHA,KPYM,PERM,SPIT1; LDHA,KPYM,PERM,NAMPT; LDHA,PERM,SPIT1,NAMPT; KPYM,PERM,SPIT1,NAMPT; MMP9,LDHA,KPYM,PERM,SPIT1; MMP9,LDHA,KPYM,PERM,NAMPT; MMP9,LDHA,PERM,SPIT1,NAMPT; MMP9,KPYM,PERM,SPIT1,NAMPT; LDHA,KPYM,PERM,SPIT1,NAMPT; y MMP9, LDHA, KPYM, PERM, SPIT1, NAMPT y CADH1; para el diagnóstico o pronóstico de carcinoma endometrial; o para identificar a un sujeto sospechoso de padecer carcinoma endometrial; o para decidir o recomendar si iniciar un régimen médico de un sujeto sospechoso de padecer carcinoma endometrial; o determinar la eficacia de un régimen médico en una paciente ya diagnosticada de carcinoma endometrial.

Uso del kit según la reivindicación 13, en el que los medios para detectar el nivel de expresión de las proteínas son anticuerpos o fragmentos de los mismos.