ES2973670T3

ES2973670T3 - Conjugados penetrantes de membrana celular para la edición de genes

Info

Publication number: ES2973670T3
Application number: ES20712835T
Authority: ES
Inventors: Nusrat Sanghamitra
Original assignee: Cygenica Ltd
Current assignee: Cygenica Ltd
Priority date: 2019-02-27
Filing date: 2020-02-27
Publication date: 2024-06-21
Anticipated expiration: 2040-02-27
Also published as: JP2022522001A; EP3930760B1; EP3930760A1; CN113966233A; KR20210135260A; CA3130820A1; WO2020174070A1; US12331310B2; GB201902648D0; EP3930760C0; US20220056483A1; JP7582956B2

Abstract

Un complejo de edición de genoma para modificar un polinucleótido diana que comprende una proteína β helicoidal recombinante unida a una o más moléculas de un sistema de edición de genoma o un plásmido que codifica una o más moléculas de un sistema de edición de genoma, en el que la proteína β helicoidal la longitud está en el intervalo de 5 nm a 25 nm, y la anchura está en el intervalo de 1 nm a 5 nm. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Conjugados penetrantes de membrana celular para la edición de genes

Campo de invención

La presente divulgación se relaciona ampliamente con el campo de administración de una o más moléculas de edición de genes al citoplasma de las células y particularmente divulga un conjugado que comprende una proteína recombinante unida a una o más moléculas de edición de genes para penetrar membranas celulares, métodos para preparar dichos conjugados y usos de los mismos. La presente divulgación también se refiere a conjugados que comprenden una proteína recombinante unida a un ácido nucleico o plásmido que codifica una o más moléculas de edición de genes para penetrar membranas celulares, métodos para preparar dichos conjugados y usos de los mismos.

Antecedentes de la invención

Una membrana celular es una membrana semipermeable que separa el ambiente interno de una célula de su ambiente externo. Las membranas de las células procarióticas y eucariotas, aunque difieren en algunas propiedades y composición, comprenden una estructura bicapa semipermeable de fosfolípidos. La naturaleza semipermeable de la membrana celular la hace selectiva para el tipo de moléculas capaces de atravesarla. Aquellas moléculas capaces de penetrar las membranas celulares son prometedoras para su uso en el etiquetado celular, la penetración celular, la administración celular, la absorción de fármacos, la terapia génica y muchas otras aplicaciones que implican la penetración de la membrana celular.

Hay ciertos péptidos que pueden penetrar la membrana celular y trasladarse al citosol; dichos péptidos se denominan péptidos penetrantes en las células (CPP). Los conjugados de CPP, en los que el CPP está unido a una o más moléculas funcionales, se han estudiado como un medio para transportar varias moléculas biológicamente activas a través de la membrana. Por ejemplo, la absorción de insulina aumentó drásticamente (6-8 veces) en las células Caco-2 cuando se trataron con el conjugado CPP, CPP-insulina (Liang et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.; 2005; 335(3): 734-738). Se observaron resultados similares para un conjugado que comprende el péptido Tat (ibídem.). Otro estudio ha informado sobre el uso de un péptido anfipático corto Pep-1 que podría penetrar la membrana y administrar varios péptidos y proteínas en varias líneas celulares (Morris et al., Nature Biotechnol, 2001, 1173-1176).

Los CPP también se han utilizado para estudiar la administración eficiente de varios fármacos contra el cáncer como conjugados fármaco-CPP que podrían penetrar las membranas celulares de manera más eficiente que el fármaco solo debido a las propiedades del CPP. Uno de esos estudios informó el uso de la proteína Tat conjugada con un inhibidor de CK2 (P15) para tratar tumores sólidos (Perea et al., Cancer Res. 2004, 7127-7129).

También existen varios transportadores moleculares que pueden transportar moléculas a través de las membranas celulares. Se ha demostrado que los transportadores moleculares ricos en guanidinio (GR-MoTrs) que comprenden agentes peptídicos y no peptídicos penetran la membrana celular debido a su número y disposición espacial de grupos de guanidinio. Los GR-MoTrs pueden mejorar la entrega de diversas cargas, incluidas moléculas pequeñas, metales, agentes de formación de imágenes, partículas de hierro y proteínas dentro de las células de los mamíferos (Wender et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 2008, 452-472; Wender et al., Drug Discov. Today Technol. 2012, e49-e55).

El documento US20130137644 divulga un conjugado formado por un péptido que penetra en las células, ácido nucleico y un polímero hidrófilo que puede penetrar las membranas celulares con mayor eficacia. Se describe que el ácido nucleico usado en el conjugado es preferiblemente un ARNip, con polietilenglicol (PEG) como polímero hidrófilo.

El documento US20040176282 divulga métodos y usos de composiciones para la administración celular de ácidos nucleicos, polipéptidos, fluoróforos y complejos moleculares. La liberación intracelular de las moléculas biológicamente activas después de la penetración celular se estimula mediante la dispersión del complejo activada por la luz. Este sistema ayuda a reprimir las funciones biológicas de las moléculas mientras forma parte del complejo, pero una vez dentro de la célula y tras la activación de la luz se puede dispersar y restaurar su actividad biológica.

Además, y en general para la entrega de todas las moléculas funcionales a las células, la mayoría de los mecanismos desarrollados para la entrega celular dependen de un mecanismo dependiente de la endocitosis para ingresar al interior de las células. La eficiencia de la translocación es un área importante de preocupación en las vías dependientes de la endocitosis debido, por ejemplo, a la posibilidad de que los fármacos queden atrapados en los endosomas o se degraden en los lisosomas. Por tanto, existe una necesidad apremiante de idear nuevos mecanismos para penetrar las membranas celulares, que puedan ser más fiables y eficaces.

Un ejemplo de una técnica prometedora y ampliamente utilizada que involucra moléculas funcionales que cruzan la barrera de la membrana celular es la ingeniería genómica en la que se edita el ADN (es decir, se insertan, eliminan, modifican o reemplazan uno o más nucleótidos) en el genoma de un organismo vivo.

Un tipo de ingeniería genómica es la terapia génica. La terapia génica implica administrar un gen de interés a las células para compensar la actividad anormal de los genes o proporcionar una proteína beneficiosa. La terapia génica ha demostrado ser beneficiosa en el tratamiento de enfermedades como la leucemia linfocítica crónica, la SCID ligada al cromosoma X, el mieloma múltiple y la hemofilia, entre muchas otras. Muchas enfermedades potencialmente mortales tienen un origen genético subyacente, es decir, las enfermedades se deben a un mal funcionamiento o a una falta de funcionamiento adecuado de uno o más genes asociados. La terapia génica se ha mostrado prometedora para el tratamiento de dichas enfermedades. Sin embargo, la terapia génica todavía enfrenta un desafío en términos de entregar los genes necesarios a través de la membrana celular. Hasta la fecha, se han utilizado dos enfoques para administrar los genes: uno viral y otro no viral.

El enfoque viral para la terapia génica utiliza virus atenuados como vectores en los que el gen deseado se clona y se transfiere a las células requeridas mediante un proceso conocido como transducción. Este enfoque tiene la ventaja de una integración adecuada del gen administrado en el genoma de las células, pero adolece de otras desventajas, siendo una de ellas la tendencia a inducir cáncer en caso de una integración genómica inadecuada. El enfoque no viral incluye el uso de inyectar ADN aislado en las células y el uso de lípidos catiónicos para rodear un ADN plásmido (lipofección). Los enfoques no virales no requieren ninguna integración del gen en el genoma y son ineficaces a la hora de transferir los genes necesarios a otras células de los tejidos. Por lo tanto, la terapia génica, aunque es una técnica prometedora y excelente para tratar una serie de trastornos potencialmente mortales, adolece del problema de la introducción de genes en las células.

Para los trastornos hereditarios más comunes, como la fibrosis quística o la distrofia muscular, es probable que la terapia génica eficaz siga siendo un desafío debido a las dificultades para introducir el material genético en la célula. Todavía no existe una forma sencilla de administrar genes a una proporción significativa de células en tejidos como el epitelio pulmonar o el músculo esquelético (Collins et al., Proc. R. Soc. B. vol. 282. No. 1821. The Royal Society, 2015). Por lo tanto, se requiere un mecanismo eficaz de administración de células que pueda mejorar en gran medida los beneficios de la terapia génica y ampliar las vías para proporcionar tratamientos prometedores para muchas enfermedades potencialmente mortales.

Otro tipo de ingeniería genómica en el que se requieren moléculas funcionales para cruzar la barrera de la membrana celular es la edición de genes o genoma. La edición del genoma permite crear roturas de doble cadena específicas de un sitio en ubicaciones deseadas del genoma, generalmente mediante el uso de nucleasas diseñadas. Estas roturas pueden luego repararse mediante unión de extremos no homólogos (NHEJ), recombinación homóloga (HR) o reparación dirigida por homología (HDR), lo que da como resultado mutaciones específicas de sitio o “ediciones” de un genoma. Las nucleasas diseñadas conocidas incluyen nucleasas con dedos de zinc (ZFN), nucleasas basadas en efectores similares a activadores de la transcripción (TALEN®), endonucleasas dirigidas (como una nucleasa ARC™) o una endonucleasa guiada por ácido nucleico, como una endonucleasa guiada por ADN, y endonucleasas guiadas por ARN, como el sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR), basado en gran medida, aunque no exclusivamente, en la endonucleasa Cas9.

Las nucleasas con dedos de zinc (ZFN) son una clase de proteínas de unión al ADN diseñadas que facilitan la edición dirigida del genoma mediante la creación de roturas de doble hebra en el ADN en ubicaciones especificadas por el usuario. Cada Zinc Finger Nuclease (ZFN) consta de dos dominios funcionales: a) Un dominio de unión al ADN compuesto por una cadena de módulos de dos dedos, cada uno de los cuales reconoce una secuencia única de ADN hexámero (6 pb). Se unen módulos de dos dedos para formar una proteína con dedos de zinc, cada uno con una especificidad de > 24 pb. b) Un dominio de escisión de ADN compuesto por el dominio de nucleasa de Fok I. Cuando los dominios de unión y de escisión de ADN se fusionan, se crea un par de “tijeras genómicas” altamente específicas.

La tecnología de nucleasa efectora similar al activador de la transcripción (TALEN®) aprovecha las enzimas de restricción artificiales generadas mediante la fusión de un dominio de unión al ADN efector TAL con un dominio de escisión del ADN. Las enzimas de restricción son enzimas que cortan cadenas de ADN en una secuencia específica. Efectores similares a activadores de la transcripción (TALEN®) se puede diseñar rápidamente para unirse prácticamente a cualquier secuencia de ADN deseada. Al combinar un TALEN diseñado de este tipo® con un dominio de escisión de ADN (que corta cadenas de ADN), se pueden diseñar enzimas de restricción que cortarán específicamente cualquier secuencia de ADN deseada. Cuando estas enzimas de restricción se introducen en las células, se pueden utilizar para la edición de genes o para la edición del genoma in situ.

La edición de genes CRISPR utiliza un sistema molecular de múltiples componentes que comprende una endonucleasa, típicamente una endonucleasa Cas o Cpf1, y una o más moléculas de ARN guía (ARNg) que tienen la capacidad de dirigir dicha nucleasa a secuencias genómicas específicas. Cuando el ARNg hibrida la secuencia del genoma, la endonucleasa actúa para escindir la cadena de ADN. Al administrar la nucleasa Cas9 complejada con un ARNg sintético en una célula, el genoma de la célula se puede cortar en la ubicación deseada, lo que permite eliminar genes existentes y/o agregar otros nuevos. Ledford, h, Nature, 2015, 522, 7554; Zetsche et al., Cell, 2015, 163(3), 759-771).

Una etapa clave de cualquier técnica CRISPR es administrar el ARNg y la endonucleasa, por ejemplo Cas9, en el citoplasma y/o el núcleo de las células diana. La entrega de ácidos nucleicos a las células se llama transfección. El gRNA y Cas9 se pueden introducir como ADN, ARN o ARN precomplejado y una proteína llamada ribonucleoproteína (RNP). El transporte de materiales extraños a través de múltiples barreras celulares (por ejemplo, membrana plasmática, membrana nuclear) es un desafío.

Los métodos de transfección se pueden clasificar ampliamente en categorías físicas, químicas y mediadas por virus. Cada método tiene diferentes ventajas y desventajas con respecto a la eficiencia, el rendimiento, el equipo, la habilidad y el coste. La elección del método de transfección también depende del formato de los componentes CRISPR.

La translocación de la maquinaria de edición de genes CRISPR como ribonuceloproteína preformada que comprende la enzima Cas9 con ARN (CRISPR-RNP) significa que no se requiere más transcripción o traducción antes de la edición de genes. Esto puede permitir que la edición se realice rápidamente debido a que se requieren menos pasos. Esto puede ser útil en algunas situaciones, por ejemplo en la transfección transitoria donde los componentes CRISPR se introducen en la célula pero no se incorpora ningún ADN que codifique un ARN guía o Cas9 al genoma de la célula. CRISPR-Cas9 sólo puede escindir el ADN genómico de la célula durante un período de tiempo limitado. Sin embargo, la translocación de un conjunto tan grande y diverso de macromoléculas a través de la membrana celular presenta desafíos únicos en términos de eficiencia de transferencia a través de la membrana celular.

Las partículas virales adenoasociadas se han utilizado comúnmente como agentes de administración de genes; sin embargo, debido a problemas de seguridad y límites de capacidad de carga, los portadores virales no son vehículos de administración ideales (Swiech et al., Nat. Biotechnol, 2015, 33, 102-106). Los medios no virales para administrar moléculas del sistema de edición del genoma incluyen vectores basados en lípidos, nanopartículas de lípidos, vectores poliméricos, polietilenimina y poli(L-lisina), por nombrar algunos, aunque la aplicación de la edición del genoma (como mediante el uso de herramientas CRISPR) in vivo sigue siendo un desafío debido a las limitaciones de los enfoques de administración que se utilizan actualmente (Li et al., Human Gene Therapy, 2015, 26(7), 452-462; Wang et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, 2016, 113(11), 2868-2873).

También se sabe que los péptidos que penetran en las células transportan la maquinaria de edición de genes CRISPR al interior de las células (Ramakrishna et al., Genome Research, 2014, 24(6), 1020-1027). El documento WO2017/205846 describe el uso de los péptidos que penetran en las células VEPEP-3a/b y ADGN-100a/b para facilitar la transfección de CRISPR-RNP. Sin embargo, queda claro que los péptidos que penetran en las células VEPEP-9 y CADY son solo aglutinantes moderados, y que el péptido que penetra en las células VEPEP-6 interactúa mal con Cas9 marcado y con los complejos Cas9-ARNg marcados. Por tanto, está claro que la elección del CPP es un determinante esencial para la eficiencia de la transfección de la maquinaria de edición de genes. Los péptidos que penetran en las células utilizados en la literatura para la edición de genes tienen una posibilidad limitada de uso in vivo debido a la inmunorreactividad y la alteración en la reactividad de Cas9 debido a la fuerte interacción electrostática entre el CPP cargado positivamente y el complejo Cas9-ARNg cargado negativamente. Analytical Biochemistry 345 (2005) 55-65, Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 626; doi: 10.3390/ijms17050626.

Quedan en la técnica medios eficientes mejorados o alternativos para facilitar la transferencia de maquinaria de edición de genes a través de las diversas membranas celulares.

Resumen de la invención

Estas y otras características, aspectos y ventajas del presente tema se entenderán mejor con referencia a la siguiente descripción y las reivindicaciones adjuntas. Este resumen se proporciona para presentar una selección de conceptos de forma simplificada. Este resumen no pretende identificar características clave o características esenciales del tema reivindicado.

En un primer aspecto, se proporciona un complejo de edición de genoma para modificar un polinucleótido diana que comprende una clase de proteína p helicoidal recombinante unida a una o más moléculas de un sistema de edición de genoma, en donde la longitud de la proteína p helicoidal está en el rango de desde 5 nm a 25 nm, y el ancho está en el rango de 1 nm a 5 nm.

En un segundo aspecto, se proporciona un complejo de edición de genoma para modificar un polinucleótido diana que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a un plásmido que codifica una o más moléculas de un sistema de edición de genoma, en el que la longitud de la proteína p helicoidal está en el rango de 5 nm a 25 nm, y el ancho está en el rango de 1 nm a 5 nm.

En realizaciones, la una o más moléculas de un sistema de edición del genoma se seleccionan del grupo que consiste en:

a. Una endonucleasa guiada por ARN y/o un ARN guía (ARNg);

b. Una nucleasa con dedos de zinc (ZFN);

c. Una nucleasa efectora similar al activador del transcriptor (TALEN®);

d. Una endonucleasa guiada por ADN y/o un ADN guía;

e. Una endonucleasa dirigida;

f. Una integrasa.

Convenientemente, el sistema de edición del genoma es CRISPR-Cas9.

En realizaciones, el ARNg tiene una secuencia complementaria a una secuencia diana en el polinucleótido diana. En realizaciones, la modificación resultante de la edición del genoma es la adición, eliminación o sustitución de uno o más nucleótidos en el polinucleótido diana.

En realizaciones, la proteína p helicoidal tiene una forma de punta generalmente cuadrangular con una longitud en el intervalo de 5 nm a 25 nm, y una anchura en el intervalo de 1 nm a 5 nm.

En realizaciones, la proteína p helicoidal comprende una o más estructuras de escalera de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en una escalera de arginina; una escalera de lisina; una escalera de asparagina; una escalera de ácido aspártico; y una escalera de ácido glutámico.

En realizaciones, la escalera de arginina comprende de 10 a 20 residuos de arginina; la escalera de lisina comprende de 10 a 30 residuos de lisina; la escalera de asparagina comprende de 10 a 40 residuos de asparagina; la escalera de ácido aspártico comprende de 10 a 40 residuos de ácido aspártico; y la escalera de ácido glutámico comprende de 10 a 40 residuos de ácido glutámico.

En realizaciones, la proteína p helicoidal tiene una carga total menor que cero.

En realizaciones, la proteína p helicoidal tiene una carga total de -20 a -60.

En realizaciones, la proteína p helicoidal tiene una estructura p helicoidal con un parámetro de rigidez K (beta hélice) de 0.2 a 12 N/m2, medido mediante microscopía de fuerza atómica.

En realizaciones, la proteína p helicoidal es una proteína de repetición de pentapéptido.

En realizaciones, la proteína p helicoidal comprende pentapéptido repetido en tándem con secuencia consenso (STAV)-,(DN)2(LF)3(STR)4(G)5.

En realizaciones, la proteína p helicoidal está representada por una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, y combinaciones de los mismos. En realizaciones, la proteína p helicoidal recombinante está unida a una o más moléculas de un sistema de edición del genoma o al plásmido mediante interacciones no covalentes.

En realizaciones, las interacciones no covalentes se seleccionan del grupo que comprende enlaces de hidrógeno, interacciones electrostáticas, interacciones de van der Waal, interacciones hidrófobas o combinaciones de las mismas. En realizaciones, la proteína p helicoidal recombinante está unida a una o más moléculas de un sistema de edición del genoma o al plásmido mediante una molécula conectora seleccionada del grupo que consiste en: polietilenglicol (PEG); etilendiamina; péptido; conjugado de metal, conjugado de fármaco-metal, dominio de unión al ADN, molécula intercaladora de ácido nucleico y combinaciones de los mismos.

En realizaciones, cuando la molécula conectora es un péptido, el péptido comprende aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en: aminoácidos alifáticos; aminoácidos aromáticos; y combinaciones de los mismos.

En realizaciones, el conector está unido a la proteína p helicoidal recombinante mediante enlaces covalentes, enlaces no covalentes y combinaciones de los mismos.

En realizaciones, la proteína p helicoidal recombinante está unida a una o más moléculas de un sistema de edición del genoma o al plásmido mediante un enlace éster o un enlace amida.

En realizaciones, el complejo de edición del genoma comprende además una secuencia señal en la que la secuencia señal dirige el complejo de edición del genoma a una célula particular o parte de una célula.

En realizaciones, la secuencia señal se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, y SEQ ID NO: 17.

En realizaciones, el complejo de edición del genoma comprende además una molécula de fosfatidilcolina.

En realizaciones, el complejo de edición del genoma transfiere una o más moléculas de un sistema de edición del genoma o el plásmido a una ubicación seleccionada del grupo que consiste en: orgánulos celulares; núcleo; y P-cadherina que sobreexpresa células de cáncer de mama.

En realizaciones, el complejo de edición del genoma se usa para la edición del genoma.

En un tercer aspecto, se proporciona un método para preparar el complejo de edición del genoma del primer aspecto de la invención, que comprende combinar la proteína de penetración celular con una o más moléculas del sistema de edición del genoma, formando así el complejo de edición del genoma.

En realizaciones del tercer aspecto, la una o más moléculas del sistema de edición del genoma están en un tampón de reacción que contiene moléculas que estabilizan la formación de complejos entre la proteína que penetra en las células y el sistema de edición del genoma. El tampón de reacción puede seleccionarse basándose en la fuerza iónica para optimizar las interacciones electrostáticas entre los diversos componentes del complejo. La fuerza iónica se puede variar mediante la elección de los componentes de la solución tampón, por ejemplo cloruro de sodio (NaCl). Alternativamente, en un cuarto aspecto, se proporciona un método para preparar el complejo de edición del genoma del segundo aspecto, que comprende combinar la proteína que penetra en las células con el plásmido, formando así el complejo de edición del genoma.

En un quinto aspecto, se proporciona un proceso para transferir una o más moléculas de un sistema de edición del genoma a una célula, dicho proceso comprende:

a) unir una o más moléculas de un sistema de edición del genoma a una proteína p helicoidal recombinante para obtener un conjugado o complejo de edición del genoma;

b) poner en contacto el conjugado o complejo de edición del genoma con al menos una célula;

en el que poner en contacto el conjugado o complejo de edición del genoma de la etapa (b) transfiere una o más moléculas de un sistema de edición del genoma al interior de la célula; y en el que la longitud de la proteína p helicoidal está en el intervalo de 5 nm a 25 nm y la anchura está en el intervalo de 1 nm a 5 nm. Convenientemente, el proceso comprende, después de la etapa (b), detectar la transferencia del complejo de edición del genoma dentro de la célula. En un sexto, se proporciona pero no forma parte de la invención un proceso para transferir una o más moléculas de un sistema de edición del genoma a una célula, dicho proceso comprende:

d) unir un plásmido a una proteína p helicoidal recombinante para obtener un conjugado o complejo de edición del genoma;

e) poner en contacto el conjugado o complejo de edición del genoma con al menos una célula;

en el que poner en contacto el conjugado o el complejo de edición del genoma de la etapa (d) transfiere el plásmido al interior de la célula; y en el que la longitud de la proteína p helicoidal está en el intervalo de 5 nm a 25 nm y la anchura está en el intervalo de 1 nm a 5 nm. Convenientemente, el proceso comprende, después de la etapa (d), detectar la transferencia del complejo de edición del genoma dentro de la célula.

En realizaciones de los aspectos quinto y sexto, la una o más moléculas de un sistema de edición del genoma se seleccionan del grupo que consiste en:

a. Una endonucleasa guiada por ARN y/o un ARN guía (ARNg);

b. Una nucleasa con dedos de zinc (ZFN);

c. Una nucleasa efectora similar al activador del transcriptor (TALEN®);

d. Una endonucleasa guiada por ADN y/o un ADN guía;

e. Una endonucleasa dirigida;

f. Una integrasa.

En realizaciones, el sistema de edición del genoma es CRISPR-Cas9.

En realizaciones, la unión de una o más moléculas de un sistema de edición del genoma a una proteína p helicoidal recombinante para obtener un complejo de edición del genoma en la etapa a) se lleva a cabo en un tampón de reacción que contiene moléculas que estabilizan la formación del complejo entre la proteína recombinante de hélice 13 y la una o más moléculas de un sistema de edición génica; y/o la transferencia de una o más moléculas de un sistema de edición génica a la célula se realiza en medios libres de suero.

En realizaciones, cuando está presente, la escalera de arginina comprende de 10 a 20 residuos de arginina; la escalera de lisina comprende de 10 a 30 residuos de lisina; la escalera de asparagina comprende de 10 a 40 residuos de asparagina; la escalera de ácido aspártico comprende de 10 a 40 residuos de ácido aspártico; y la escalera de ácido glutámico comprende de 10 a 40 residuos de ácido glutámico.

En realizaciones, la proteína p helicoidal tiene una carga total de -20 a -60.

En realizaciones, la proteína p helicoidal está representada por una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, y combinaciones de los mismos. En realizaciones, el complejo de edición del genoma es el complejo de edición del genoma del primer o segundo aspecto.

En realizaciones, la célula se selecciona del grupo que consiste en células eucariotas, células procarióticas y combinaciones de las mismas.

En realizaciones, las células eucariotas son células de mamífero, células bacterianas, células de levadura, células de plantas, células de insectos o células de peces.

En un séptimo aspecto, se proporciona, pero no forma parte de la invención, un método para modificar un polinucleótido diana en una célula, que comprende poner en contacto la célula con el complejo de edición del genoma del primer o segundo aspecto, en el que el complejo de edición del genoma se dirige a una secuencia en el polinucleótido diana.

En un octavo aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el complejo de edición del genoma del primer o segundo aspecto.

En un noveno aspecto, se proporciona, pero no forma parte de la invención, un método para tratar una enfermedad en un individuo que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición farmacéutica del séptimo aspecto.

En un décimo aspecto, se proporciona pero no forma parte de la invención el uso del complejo de edición del genoma del primer o segundo aspecto para la edición de genes.

En un undécimo aspecto, se proporciona pero no forma parte de la invención el uso del complejo de edición del genoma del primer o segundo aspecto para terapia génica.

También se divulga en el presente documento un conjugado de penetración celular que comprende al menos una molécula de proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional, en donde la longitud de la proteína p helicoidal está en el rango de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y el ancho está en el rango de 1 nm a 5 nm, adecuadamente de 1 nm a 3 nm.

Además se divulga un proceso para transferir una molécula funcional a una célula, dicho proceso comprende: (a) unir la molécula funcional a una proteína p helicoidal recombinante para obtener un conjugado; y (b) poner en contacto el conjugado de penetración celular con al menos una célula; en el que el contacto del conjugado con al menos una célula transfiere la molécula de ácido nucleico al interior de la célula, y en el que la longitud de la proteína p helicoidal está en el intervalo de 5 nm a 25 nm, adecuadamente, de 10 nm a 15 nm y el ancho está en el intervalo de 1 nm a 5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm.

También se divulga en el presente documento el uso del conjugado de penetración celular del primer aspecto para administrar una molécula funcional al interior de las células, en el que la molécula funcional se selecciona del grupo que consiste en colorantes, fármacos, metales, fármaco-metal, proteínas, enzimas, anticuerpos, ácidos nucleicos, polisacáridos, señales de localización nuclear, nanopartículas y combinaciones de los mismos.

En el presente documento se divulga además el uso del conjugado de penetración celular del primer aspecto de la invención para la penetración celular.

Además, en el presente documento se divulga el uso del conjugado de penetración celular del primer aspecto para el etiquetado celular.

También se divulga en el presente documento un conjugado que comprende: (a) al menos una proteína p helicoidal recombinante; (b) al menos un enlazador; y (c) al menos una molécula de ácido nucleico, en la que la al menos una proteína p helicoidal recombinante tiene una longitud en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y una anchura está en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm.

Además se divulga en el presente documento un proceso para transferir una molécula de ácido nucleico a una célula, dicho proceso comprende: (i) unir la molécula de ácido nucleico a al menos una proteína p helicoidal recombinante mediante al menos un conector para obtener un conjugado; y (ii) poner en contacto el conjugado con al menos una célula, en donde el contacto del conjugado con al menos una célula transfiere la molécula de ácido nucleico al interior de la célula, y en donde la longitud de la proteína p helicoidal recombinante está en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y el ancho está en el rango de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm.

Además, en el presente documento se divulga el uso del conjugado de penetración celular del sexto aspecto de la invención como agente transfectante.

En el presente documento se divulga además el uso del conjugado de penetración celular del sexto aspecto de la invención para terapia génica.

Breve descripción de los dibujos adjuntos

Los siguientes dibujos forman parte de la presente especificación y se incluyen para ilustrar adicionalmente aspectos de la presente divulgación. La divulgación puede entenderse mejor haciendo referencia a los dibujos en combinación con la descripción detallada de las realizaciones específicas presentadas en el presente documento.

La Figura 1 muestra los espectros CD (dicroísmo circular) de la proteína AlbG aislada, de acuerdo con la presente divulgación.

La Figura 2 muestra un gel de agarosa que contiene plásmidos purificados (que contienen genes AlbG y EfsQNR), de acuerdo con la presente divulgación.

La Figura 3 muestra un gel de poliacrilamida que contiene proteínas purificadas (AlbG y EfsQNR), de acuerdo con la presente divulgación.

La Figura 4 muestra el análisis espectral de masas MALDI-TOF de las proteínas EfsQNR y AlbG.

La Figura 5 muestra la representación gráfica de la caracterización de proteínas marcadas (AlbG-NHSC y EfsQNR-NHSC) mediante espectrofotometría UV-visible, de acuerdo con una realización de la presente divulgación.

La Figura 6 muestra el marcaje diferencial de células Hela mediante proteínas marcadas (conjugados) AlbG-NHSC, EfsQNR-NHSC y TtCuA-NHSC, de acuerdo con realizaciones de la presente divulgación.

La Figura 7 muestra el mareaje de células Hela mediante EfsQNR marcadas con ATTO-520 (tinte fluorescente verde disponible comercialmente), de acuerdo con una realización de la presente divulgación.

La Figura 8 muestra el marcaje de células Hela mediante EfsQNR marcadas con ATTO-390 (tinte fluorescente azul disponible comercialmente), de acuerdo con una realización de la presente divulgación.

La Figura 9 muestra el marcaje de células microgliales mediante EfsQNR marcadas con ATTO-520 (tinte fluorescente verde disponible comercialmente), de acuerdo con una realización de la presente divulgación (Panel A); y etiquetado diferencial de células microgliales mediante EfsQNR marcadas con ATTO-520 (Panel B).

La Figura 10 muestra el marcaje de células queratinocitos mediante EfsQNR marcado con ATTO-520 (tinte fluorescente verde disponible comercialmente), de acuerdo con una realización de la presente divulgación (Panel A); y etiquetado diferencial de células de queratinocitos mediante EfsQNR marcado con ATTO-520 (Panel B).

La Figura 11 muestra el marcaje de células SH-SY5Y mediante EfsQNR marcadas con ATTO-520 (tinte fluorescente verde disponible comercialmente), de acuerdo con una realización de la presente divulgación.

La Figura 12 muestra el marcaje de células ES de ratón mediante EfsQNR marcadas con ATTO-520 (tinte fluorescente verde disponible comercialmente), de acuerdo con una realización de la presente divulgación.

La Figura 13 muestra el marcaje de células de E. coli mediante EfsQNR marcadas con ATTO-520 (tinte fluorescente verde disponible comercialmente), de acuerdo con una realización de la presente divulgación.

La Figura 14 muestra el marcaje de células de levadura (kluveromyces) mediante EfsQNR marcadas con ATTO-520 (tinte fluorescente verde disponible comercialmente), de acuerdo con una realización de la presente divulgación. La Figura 15 muestra los resultados de la clasificación FACS estándar de células HeLa tratadas con un conjugado marcado con el conjugado EfsQNR-ATTO-647N durante 10 minutos (Panel B), 1 h (Panel C) y 3 h (Panel D) en comparación con células no tratadas (Panel A).

La Figura 16 muestra el porcentaje de absorción celular de un fármaco como parte de un conjugado de acuerdo con una realización de la presente divulgación, en comparación con el fármaco no conjugado.

La Figura 17 muestra el porcentaje de viabilidad de las células (Hela y HepG2) después del tratamiento con Cisplatino® un fármaco de quimioterapia como parte de un conjugado con la proteína EfsQNR (marcada CYDD) de acuerdo con una realización de la presente divulgación, en comparación con un fármaco no conjugado.

La Figura 18 muestra un vector plásmido que porta el gen mcherry, de acuerdo con una realización de la presente divulgación.

La Figura 19 muestra un proceso para preparar un conjugado, de acuerdo con una realización de la presente divulgación.

La Figura 20 muestra una representación de la transfección usando un conjugado, de acuerdo con una realización de la presente divulgación.

La Figura 21 muestra imágenes de microscopía confocal de células HeLa después de la transfección con un conjugado de acuerdo con la presente invención; el conjugado comprende el gen mcherry que codifica RFP (proteína fluorescente roja) unido mediante fenantrolina de cobre [II] a la proteína EfsQNR.

La Figura 22 muestra la penetración directa en tiempo real de una membrana celular mediante un conjugado EfsQNR-ATTO 520 de acuerdo con la presente invención.

La Figura 23 muestra el marcaje de células vegetales de Arabidopsis mediante CPP marcadas con ATTO-520 (tinte fluorescente verde disponible comercialmente), de acuerdo con una realización de la presente divulgación.

La Figura 24 muestra el marcaje de células vegetales de Arabidopsis mediante A) CPP marcadas con ATTO-520 (tinte fluorescente verde disponible comercialmente); B) CPP marcado con ATTO-594 (tinte fluorescente rojo disponible comercialmente); y C) CPP marcado con ATTO-390 (tinte fluorescente azul disponible comercialmente), de acuerdo con una realización de la presente divulgación.

La Figura 25 muestra el marcaje de células de levadura mediante CPP marcadas con ATTO-520 (tinte fluorescente verde disponible comercialmente), de acuerdo con una realización de la presente divulgación.

La Figura 26 muestra el mareaje de células bacterianas mediante CPP marcadas con ATTO-520 (tinte fluorescente verde disponible comercialmente), de acuerdo con una realización de la presente divulgación.

La Figura 27 muestra el marcaje de células embrionarias de Drosophila mediante CPP marcadas con ATTO-520 (tinte fluorescente verde disponible comercialmente), de acuerdo con una realización de la presente divulgación.

La Figura 28 muestra el etiquetado de células embrionarias de pez cebra mediante CPP marcadas con ATTO-520 (tinte fluorescente verde disponible comercialmente), de acuerdo con una realización de la presente divulgación.

La Figura 29 muestra los resultados de la edición genética de células HEK293 que expresan eGFP después de la administración asistida por CPP de CRISPR-Cas9 y ARNg específico de eGFP como se observa mediante la reducción en la intensidad de fluorescencia debido a eGFP (medida por un lector de placas de fluorescencia).

La Figura 30 muestra los resultados de un experimento de transfección en células MCF7 usando (A) el conjugado obtenido en el Ejemplo 1 (EfsQNR) (SEQ ID NO: 2) y un ADN plasmídico circular marcado en rojo de 2.7 kb, obtenido comercialmente de Mirus Bio (código de producto MIR 7904) y (B) plásmido de control marcado en rojo como se usó anteriormente en ausencia del conjugado. (i) muestra la proyección máxima de las células después de la incubación; (ii) imagen correspondiente a las gráficas de intensidad de las células después de la incubación; y (iii) muestra las gráficas de intensidad de las células después de la incubación.

La Figura 31 muestra los resultados de un experimento de transfección en células MCF-7 usando el conjugado obtenido en el Ejemplo 1 (EfsQNR) y la endonucleasa Cas9, marcada con (i) proteína fluorescente roja o (ii) el tinte fluorescente verde Atto520. (A) muestra la proyección máxima de las células después de la incubación; (B) muestra las gráficas de intensidad de las células después de la incubación; y (C) muestra imágenes de profundidad en 3D de las células.

La Figura 32 muestra los resultados de un experimento de transfección en células MCF-7 usando (A) el conjugado obtenido en el Ejemplo 1 (EfsQNR) y el ARNg marcado con el colorante fluorescente verde MFP488; y (B) control de ARNg marcado con el colorante fluorescente verde MFP488. (i) muestra la proyección máxima de las células después de la incubación; (ii) muestra imágenes de profundidad en 3D de las células; (iii) imagen correspondiente a las gráficas de intensidad de las células después de la incubación; y (iv) muestra las gráficas de intensidad de las células después de la incubación.

Descripción detallada de la invención

Los expertos en la técnica sabrán que la presente divulgación está sujeta a variaciones y modificaciones distintas a las descritas específicamente. Debe entenderse que la presente divulgación incluye todas esas variaciones y modificaciones. La divulgación también incluye todas esas etapas, características, composiciones y compuestos a los que se hace referencia o se indican en esta especificación, individual o colectivamente, y cualquiera y todas las combinaciones de cualquiera o más de dichas etapas o características.

Definiciones

Por conveniencia, antes de una descripción adicional de la presente divulgación, aquí se detallan ciertos términos empleados en la especificación y ejemplos. Estas definiciones deben leerse a la luz del resto de la divulgación y entenderse como por una persona experta en la técnica. Los términos utilizados en el presente documento tienen los significados reconocidos y conocidos por los expertos en la técnica; sin embargo, por conveniencia y exhaustividad, a continuación se exponen términos particulares y sus significados.

A menos que se indique lo contrario, la práctica de la presente invención emplea técnicas convencionales de química, biología molecular, microbiología, tecnología de ADN recombinante y métodos químicos, que están dentro de las capacidades de una persona con conocimientos habituales en la técnica. Estas técnicas también se explican en la literatura, por ejemplo, SEÑOR Green, J. Sambrook, 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, cuarta edición, libros 1 a 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York; Ausubel, F. M. et al. (1995 y suplementos periódicos; Current Protocols in Molecular Biology, cap. 9, 13 y 16, John Wiley & Sons, Nueva York, N. Y..); B. Roe, J. Crabtree y A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; JM Polak y James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridisation: Principles and Practice, Oxford University Press; MJ Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; y DMJ Lilley y JE Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press.

Los artículos 'un', 'uno' y 'la se utilizan para referirse a uno o más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “que comprende” significa que cualquiera de los elementos enumerados está necesariamente incluido y opcionalmente también se pueden incluir otros elementos. “Consta esencialmente de” significa que todos los elementos enumerados están necesariamente incluidos, se excluyen los elementos que afectarían materialmente las características básicas y novedosas de los elementos enumerados y, opcionalmente, se pueden incluir otros elementos. “Consiste de” significa que se excluyen todos los elementos distintos de los enumerados. Las realizaciones definidas por cada uno de estos términos están dentro del alcance de esta invención.

El término “ incluido” se utiliza para significar “ incluido, pero no se limita a”, “que incluye” y “que incluye pero no limitado a” se utilizan indistintamente.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “membrana celular” es una membrana biológica que está presente en células tanto procarióticas como eucariotas y separa el entorno interno y externo de una célula. Actúa como una barrera semipermeable que controla el transporte de sustancias dentro y fuera de la célula y normalmente está formada por una bicapa de fosfolípidos. La membrana actúa como soporte y ayuda a mantener la forma y estructura de una célula.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “proteína p helicoidal” significa una proteína que forma una estructura secundaria de hélice p. Las proteínas de hélice p se forman a partir de una asociación generalmente paralela entre cadenas p adyacentes de una cadena peptídica. Una proteína p helicoidal puede ser una p helicoidal derecha o una p helicoidal izquierda dependiendo de la dirección de enrollamiento de la estructura de hélice.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “proteína de repetición de pentapéptido (PRP)” significa proteínas de hélice p que consisten en un pentapéptido repetido en tándem. En realizaciones, el pentapéptido repetido en tándem tiene la secuencia consenso (StAV)i (DN)<2>(LF)<3>(STR)<4>(G)<5>. La familia PRP tiene más de 500 miembros en el reino procariota y eucariota.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “molécula funcional” es cualquier molécula que tiene una utilidad dentro de una célula. Ejemplos de moléculas funcionales adecuadas para su uso en la presente invención incluyen colorantes, moléculas de fármacos, proteínas, enzimas, anticuerpos y ácidos nucleicos.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “péptido penetrante celular” o “CPP” se refiere a secuencias de péptidos que facilitan la ingesta/captación celular de diversas moléculas funcionales. Los péptidos que penetran en las células generalmente liberan la molécula funcional directamente a través de la membrana celular, evitando la necesidad de vías mediadas por endocitosis para la entrada celular.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “P-cadherina” se refiere a una molécula de adhesión de célula a célula que tiene una función homeostática en tejidos normales. La sobreexpresión de esta molécula se asocia con importantes efectos promotores de tumores en neoplasias de mama, ovario, próstata, endometrio, piel, gástrico, páncreas y colon.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “NHS-cumarina” o “NHSC” se refiere a un tinte fluorescente ampliamente utilizado en técnicas de biología celular. Es un nombre común para el éster N-succinimidílico del ácido 7-(dietilamino)cumarin-3-carboxílico que tiene un peso molecular de 358.35 g/mol. La cumarina NHS (NHSC) tiene una longitud de onda de excitación de 445 nm y una longitud de onda de emisión de 482 nm. Al observarlo bajo microscopía de fluorescencia, emite una fluorescencia verde que indica la ubicación y cuantificación de la molécula conjugada con este tinte.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “fosfatidilcolina” define una clase de moléculas de fosfolípidos que incorporan una colina como grupo principal. La fosfatidilcolina se puede utilizar como molécula de señalización que facilita la unión selectiva y la unión con las membranas celulares.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “Hoechst 33342” se refiere a una solución de colorante fluorescente que se utiliza para la tinción de ADN y núcleos de células vivas y fijas en técnicas de imágenes celulares. Hoechst 33342 es una tinción de ADN permeable a las células que tiene una longitud de onda de excitación de 460 nm y una longitud de onda de emisión de 490 nm y se une preferentemente a la región de adenina (A) -timina (T) del ADN.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término 'ATTO 520' o 'A-520', 'ATTO 390' o 'A-390' y 'ATTO 647N' o 'A-647N' se refieren respectivamente a tintes fluorescentes desarrollados por ATTO-Tec GmbH y disponible comercialmente en Sigma Aldrich.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “complejo de rutenio metálico” se refiere al complejo de coordinación de rutenio metálico que se sabe que posee actividades anticancerígenas. Los complejos octaédricos de rutenio (III) y rutenio (II) muestran actividades antineoplásicas en muchos tumores experimentales. El complejo metálico de rutenio se considera una excelente alternativa para evitar los efectos secundarios de los compuestos a base de platino. Un ejemplo no limitante de un complejo metálico de rutenio cuyo uso se ha demostrado en la presente invención es tricarbonil dicloro rutenio (II) (ex-Sigma Aldrich).

El término “ácido nucleico”, tal como se utiliza en el presente documento, es una secuencia de nucleótidos unida covalentemente de cadena simple o doble en la que los extremos 3' y 5' de cada nucleótido están unidos mediante enlaces fosfodiéster. El polinucleótido puede estar formado por bases desoxirribonucleotídicas o bases ribonucleotídicas. Los ácidos nucleicos pueden incluir ADN y ARN y normalmente se fabrican sintéticamente, pero también pueden aislarse de fuentes naturales. Los ácidos nucleicos pueden incluir además ADN o ARN modificado, por ejemplo ADN o ARN que ha sido metilado o que ha sido sujeto a modificación química, por ejemplo protección en 5' con 7-metilguanosina, procesamiento en 3' tal como escisión y poliadenilación, y empalme o marcaje con fluoróforos u otros compuestos. Los ácidos nucleicos también pueden incluir ácidos nucleicos sintéticos (XNA), tales como ácido nucleico de hexitol (HNA), ácido nucleico de ciclohexeno (CeNA), ácido nucleico de treosa (TNA), ácido nucleico de glicerol (GNA), ácido nucleico bloqueado (LNA) y ácido péptido nucleico (ANP). Por lo tanto, cuando en el presente documento se utilizan los términos “ADN” y “ARN”, debe entenderse que estos términos no se limitan a incluir únicamente nucleótidos de origen natural. Los tamaños de los ácidos nucleicos, también denominados en el presente documento “polinucleótidos”, se expresan normalmente como el número de pares de bases (pb) para polinucleótidos bicatenarios, o en el caso de polinucleótidos monocatenarios como el número de nucleótidos (nt). Mil pb o nt equivalen a una kilobase (kb). Los polinucleótidos de menos de 100 nucleótidos de longitud suelen denominarse “oligonucleótidos”.

Tal como se utilizan en el presente documento, los términos “3'” (“3 prima”) y “5'” (“5 prima”) toman sus significados habituales en la técnica, es decir, distinguir los extremos de los polinucleótidos. Un polinucleótido tiene un extremo 5' y un extremo 3' y las secuencias de polinucleótidos se escriben convencionalmente en una dirección de 5' a 3'.

El término “aminoácido” en el contexto de la presente invención se utiliza en su sentido más amplio y pretende incluir L a-aminoácidos o residuos naturales. En el presente documento se utilizan las abreviaturas de una y tres letras comúnmente utilizadas para los aminoácidos naturales: A=Ala; C=Cis; D=Ásp; E=Glu; F=Phe; G=Gli; H=His; I=Ile; K=Lis; L=Leu; M=Met; N=Asn; P=Pro; Q=Gln; R=Arg; S=Ser; T=Tr; V=Val; W=Trp; y Y=Tyr (Lehninger, AL, (1975) Biochemistry, 2a ed, págs. 71-92, Worth Publishers, Nueva York). El término general “aminoácido” incluye además D-aminoácidos, aminoácidos retroinversos así como aminoácidos modificados químicamente tales como análogos de aminoácidos, aminoácidos naturales que normalmente no se incorporan a proteínas como la norleucina, y compuestos sintetizados químicamente que tienen propiedades conocidas en la técnica como características de un aminoácido, tales como p-aminoácidos. Por ejemplo, los análogos o miméticos de la fenilalanina o la prolina, que permiten la misma restricción conformacional de los compuestos peptídicos que la Phe o Pro natural, se incluyen dentro de la definición de aminoácido. Estos análogos y miméticos se denominan en el presente documento “equivalentes funcionales” del aminoácido respectivo. Otros ejemplos de aminoácidos se enumeran por Roberts y Vellaccio, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Gross and Meiehofer, vol. 5p. 341, Academic Press, Inc, Nueva York. 1983.

Un 'polipéptido' es un polímero de residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, ya sea que se produzcan de forma natural o in vitro por medios sintéticos. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 12 residuos de aminoácidos de longitud se denominan típicamente “péptidos” y aquellos entre aproximadamente 12 y aproximadamente 30 residuos de aminoácidos de longitud se pueden denominar “oligopéptidos”. El término “polipéptido”, tal como se utiliza en el presente documento, denota el producto de un polipéptido, forma precursora o proproteína de origen natural. Los polipéptidos también pueden sufrir procesos de maduración o modificación postraduccional que pueden incluir, entre otros: glicosilación, escisión proteolítica, lipidización, escisión de péptidos señal, escisión de propéptidos, fosforilación y similares. El término “proteína” se utiliza en el presente documento para referirse a una macromolécula que comprende una o más cadenas polipeptídicas.

El término “aislado”, cuando se aplica a una secuencia de polinucleótidos o proteínas, denota que la secuencia ha sido eliminada de su organismo natural de origen y, por lo tanto, está libre de secuencias codificadoras o reguladoras extrañas o no deseadas. La secuencia aislada es adecuada para su uso en el ensamblaje de composiciones y nanoestructuras de la presente divulgación. Dichas secuencias aisladas pueden incluir ADNc y ARN.

De acuerdo con la presente invención, la homología con las secuencias de ácidos nucleicos o proteínas descritas en el presente documento no se limita simplemente al 100 % de identidad de secuencia.

El término “secuencia señal” en el contexto de la presente invención significa secuencia de localización nuclear o secuencias de reconocimiento para diferentes orgánulos celulares o dominios de unión a ácidos nucleicos tales como proteínas de unión a dedos de zinc.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “portador” significa sustancias que sirven como mecanismos para mejorar la administración y la eficacia del fármaco.

Tal como se utiliza en este documento, el término “diluyente” (también denominado carga, diluyente o diluyente) significa un agente diluyente.

Tal como se utiliza en este documento, el término “excipiente” se refiere a una sustancia inactiva que sirve como vehículo o medio para un fármaco u otra sustancia activa. Los excipientes incluyen agentes colorantes, humectantes, conservantes, emolientes y combinaciones de los mismos.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “endonucleasa guiada por ARN” se refiere a un polipéptido cuya actividad y especificidad de endonucleasa dependen de su asociación con al menos una molécula de ARN guía. Un ejemplo de endonucleasa guiada por ARN es Cas9 como parte del sistema Cas9/CRISPR.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “CRISPR” (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas) se refiere a una familia de secuencias de ADN que se encuentran dentro de los genomas de organismos procarióticos tales como bacterias. El término puede usarse para referirse a las técnicas de edición de genes que se basan en el uso de proteínas asociadas a CRISPR, por ejemplo Cas-9 (proteína 9 asociada a CRISPR) que puede asociarse y luego usar secuencias CRISPR como guía para reconocer y escinde hebras específicas de ADN que son complementarias a la secuencia CRISPR. Las nucleasas Cas9 junto con las secuencias CRISPR forman la base de la técnica de edición del gen CRISPR-Cas9.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “Cas9” se refiere a la proteína endonucleasa Cas9. También llamada Csn1 (COG3513), Cas9 es una proteína de gran tamaño que participa tanto en la biogénesis del crRNA como en la destrucción del ADN invasor. El término “Cas9” también pretende abarcar una endonucleasa diseñada o un homólogo de Cas9 que es capaz de procesar una secuencia de ácido nucleico diana. Cas9 puede inducir una escisión en la secuencia diana del ácido nucleico que puede corresponder a una rotura bicatenaria o monocatenaria. Se pretende que el término Cas9 incluya variantes que pueden ser una endonucleasa Cas9 que no existe naturalmente en la naturaleza y que se obtiene mediante ingeniería de proteínas o mediante mutagénesis aleatoria, siempre que dichas variantes de Cas9 sigan siendo funcionales, es decir, conserven la capacidad de procesar una secuencia ácido nucleico diana.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término 'CRISPR-RNP' se refiere a un ribonucleótido CRISPR que comprende una proteína endonucleasa CRISPR y uno o más ARN guía. El uso del término 'CRISPR-RNP-CPP' en el presente documento se refiere al conjugado de un complejo CRISPR-RNP con un péptido que penetra en las células de una realización de la presente invención.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “ARN guía” o “ARNg” se refiere a una secuencia de polinucleótidos de ARN que comprende una secuencia guía. En uso, los ARN guía se pueden asociar con una endonucleasa que actúa para cortar un ADN bicatenario en un sitio determinado por el ARNg. El término “secuencia guía” se refiere a una secuencia preferiblemente más larga que 8 bases de ácido nucleico, más preferiblemente más larga que 10 bases de ácido nucleico, incluso más preferiblemente más larga que 12 bases de ácido nucleico, que tiene la capacidad de especificar una secuencia diana en el genoma. En general, esta molécula de ARN tiene la capacidad de hibridar dicha secuencia diana y de mediar en la actividad endonucleasa de dicha endonucleasa.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “tipo silvestre” se refiere a la forma típica o natural de un organismo, cepa, gen o característica a diferencia de las formas “mutantes” o “variantes”.

Tal como se utiliza en este documento, los términos “de origen no natural” o “diseñado” se utilizan indistintamente. Los términos, cuando se refieren a moléculas de ácido nucleico o polipéptidos, significan que la molécula de ácido nucleico o el polipéptido difiere del que se encuentra en la naturaleza y/o está al menos sustancialmente libre de al menos otro componente con el que están asociados naturalmente en la naturaleza.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “complementariedad” se refiere a la capacidad de un ácido nucleico para asociarse, por ejemplo, con una interacción no covalente mediante enlace(s) de hidrógeno, con otra secuencia de ácido nucleico mediante el emparejamiento de bases tradicional de Watson-Crick u otros tipos no tradicionales. Un porcentaje de complementariedad indica el porcentaje de residuos en una molécula de ácido nucleico que puede formar enlaces de hidrógeno (por ejemplo, emparejamiento de bases de Watson-Crick) con una segunda secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10 de 10 siendo 50%, 60%, 70%, 80%, 90% y 100% complementarios).

Como se usa en el presente documento, el término “expresión” se refiere al proceso mediante el cual se transcribe un polinucleótido a partir de una plantilla de ADN (tal como en un ARNm u otro transcrito de ARN) y/o el proceso mediante el cual un ARNm transcrito se traduce posteriormente en péptidos. polipéptidos o proteínas.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta divulgación. Aunque en la práctica o prueba de la divulgación se puede utilizar cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento, ahora se describen los métodos y materiales preferidos.

Secuencias

SEQ ID NO: 1 representa la secuencia de aminoácidos de la proteína AlbG.

MPAKTLESKDYCGESFVSEDRSGQSLESIRFEDCTFRQCNFTEAELNRCKFRE CEFVDCNLSLISIPQTSFMEVRFVDCKMLGVNW TSAQW PSVKMEGALSFERC ILNDSLFYG LYLAG VKM VECRIHDANFTEADCEDADFTQ SDLKG STFHNTKL TG ASFID AYN YfflD IFHN D IKRAR FSLPEAASLLN SLD IELSD

SEQ ID NO: 2 representa la secuencia de aminoácidos de la proteína EfsQNR.

GSHM KITYPLPPNLPEQLPLLTNCQLEDEAILENHLYQQIDLPNQEVRNLVFR D AVFDH LSL A N GQF ASFD CSNVRFE ACDF SNYEWLS GSFHRVTFLRCNLT GT NF A D S YLKD C LFEDC KAD Y ASFRF AN FN LVHFN Q TRLVESEFFE V T W K K L L L E ACDLTESNW LNTSLKGLDF S QNTFERLTF SPN YLS GLKVTPEQ A I Y L A S ALG LV IT SEQ ID NO: 3 representa la secuencia de aminoácidos de la proteína anticongelante de Tenebrio molitor.

QCTGGADCTSCTGACTGCGNCPNAVTCTNSQHCVKANTCTGSTDCNTAQTC TNSKDCFEANTCTDSTNCYKATACTNSSGCPGH SEQ ID NO: 4 representa la secuencia de aminoácidos de la proteína anticongelante de Rhagium Inquisitor.

GY S CRAV GVDG RAVTDIQGT C H AKA T GAGAMAS GT SEPGS TS T AT A T GRGA TARSTSTGRGTATTTATGTASATSNAIGQGTATTTATGSAGGRATGSATTSSS ASQPTQTQTITGPGFQTAKSFARNTATTTVTASHHHHHH

SEQ ID NO: La Figura 5 representa la secuencia de aminoácidos de la proteína anticongelante del gusano de las yemas del abeto (Choristoneura fumiferana).

DGSCTNTNSQLSANSKCEKSTLTNCYVDKSEVYGTTCTGSRFDGVTITTSTST GSRISGPGCKISTCIITGGVPAPSAACKISGCTFSAN SEQ ID NO: 6 representa la secuencia de aminoácidos de la proteína QNRB1.

G S H M ALALY GEKIDRNRFTGEKIEN S TFFN CDF S GADLS GTEFIGCQF YDRES QKGCNFSRAMLKDAIFKSCDLSMADFRNSSALGIEIRHCRAQGADFRGASFM NM ITTRTW FCSAYITNTNLSYANFSKVYLEKCELW ENRW IGAQVLG ATFSGS DLSGGEFSTFDW RAANFTHCDLTNSELG DLDIRGVDLQGVKLDNYQ ASLLM ER LG IA VIG SEQ ID NO: 7 representa la secuencia de aminoácidos de la proteína UDP-N-acetilglucosamina aciltransferasa. M ID KSA FVH PTAIVEEG ASIG ANAH IG PFC IYG PH VEIG EG TVLKSH VW N G H TKIG RD N EIY QF ASIG EVN Q D LKY AGEPTRVEIGDRNRIRES VTIHRGTVQ GG G LT K V G S D N LLM IN AH IA H D C TVG N R C ILA N N A TL A G H V S VDDF A IIG G M TA VHQF C IIG AEtVM V GGC S GV AQD VPP YVIAQ G NHATPF GVM EG LKRRG F SRE

AITA IR N A Y K LIY R S G K TLD E V K P E IA E LA ETYPEVKAFTDFFARSTRGLIR SEQ ID NO: 8 representa la secuencia de aminoácidos de la proteína NP275 de Nostoc punctiforme.

MGS SHHHHHHS S GLVPRGSHMD VEKLRQ L Y AAGERDF SIVDLRGA V LE N IN

LSG AILH G AM LD EAN LQ Q ANLSR AD LSG ATLN G ADLR G AN LSKAD LSD AIL D N AILEG A ILD E AVLN Q AN LKAA N LE Q AILSH AN IR E AD LS EA N LEA AD LS G A D LA IA D LH Q ANLH Q AALERAN LTG ANLED ANLEG TILEG G N NN LAT SEQ ID NO: 9 representa la secuencia de aminoácidos de pectato liasa C.

ATD TG G Y A A T AG G NVT G AV SKT ATSM Q D IVN IID A AR LD A N G KKVKG G A Y PLVITYTGNEDSLINAAAANICGQ W SKDPRGVEIKEFTKGITIIGANGSSANFGI W IKKS S D V W Q NM RIG YLPG G AKDG DM IRYDD SPNYW VDHNELF A ANHEC DGTPDND TTFES AYD IKG ASN TVTVS Y N Y IH G V K K V GLDGS S S SDTGRNITY H H N Y YN D VNARLPLQRGGLVH A Y N N L Y TN IT GS G LNVRQN GQ ALIENNW F EKAINPVTSRYDG KNFG TW VLKG NNITKPADFSTYSITW TADTKPYVNADS W TSTGTFPTVAY NYSPVSAQCVKDKLPGYAGV G KNLATLTSTAC K SEQ ID NO: 10 representa la secuencia de aminoácidos de pectato liasa de Caldicellulosiruptor bescii

VG TNTG G VLVITDTIIVKSG Q TYDG KG IKIIAQ G M G DG SQ SENQ KPIFKLEKG A N LK N V IIG A P G C D G IH C Y G D N W EN W W E D V G ED ALTVK SEG VVE VIG G S A K E A A D K Y FQ LN A P C TFK V K N FTA TN IG K LV R Q N G N TTFK W IY LE D Y TLN NVKS C V AKSD SP VSELW YH N LN VN N CKTLFEFPS Q S QIHQ Y SEQ ID NO: 11 representa la secuencia de aminoácidos de la anhidrasa carbónica de Metanosarcina thermophila. QEITVDEFSNIRENPVTPW NPEPSAPVIDPTAYIDPQASVIGEVTIGANVMVSP MASIRSDEGMPIF V GDRSNV Q D G W LH ALETIN E EG E PIE D N IV EY D G KEY A V Y IG N N V SL AHQ S Q VHGP A A V GDD TFIGMQ AF V FK S K V GNN C VLEPRS A A IG V T IP D G R YIP AG M YV TS Q AE AD KLPE VTD D YAY SH TN E AW YVN V H LAE G Y KETS SEQ ID NO: 12 representa la secuencia de aminoácidos de la proteína pectina liasa A de Aspergillus niger.

V G V S GS AEGF AKGVTGGGS ATPVYPDTIDELVS YLGDDEARVFYLTKTFDFT DSEGTTTGTGCAPW GTASACQVAIDQDDW CENYEPDAPSVSVEYYNAGTLG IT VTSNKSLIGEGS S G A IKG K G LR IV S G A EN IIIQ N IAVTD IN PK YV W GGD A IT L DDCDFVW IDHVTTARIG RQ HYVFG TSADNRVSFTNNYIDG VSDYSATCDG Y H YW AIYLD G D AD LVTM KG N YIYH TSG R SPKVQ D N TLLH AVN N YW YD ISG H AFEIGEG GYYLAEGNVF QNYDTVLETYEGEAFTVPS STAGEVCST YLGRDC V INGFGSSGT FSEDSTSFLSDFEGKNIASASAYTSVASRW ANAGQG NL SEQ ID NO: 13 representa la secuencia de aminoácidos de la proteína TtCuA.

A Y T L ATH T AGVIP AG KLERVDPTT VRQEGPW ADP AQ A W Q T G P N Q Y T V Y V L AF AF GY QPNPIEVPQ GAEIVFKITSPD VIHG FHVEG TNINVEVLPG E V S TVRYTFKRPGEYRIICNQYCGLGHQNMFGTIWKE

SEQ ID NO: 14 representa una secuencia señal para dirigirse al núcleo de la célula.

PAAKRVKCD

SEQ ID NO: 15 representa una secuencia señal para dirigirse al retículo endoplásmico de la célula.

YPYDVPDYAKDEL SEQ ID NO: 16 representa una secuencia señal para dirigirse a las mitocondrias de la célula.

MLSLRQSIRFFKPATRTLCSSRYLL SEQ ID NO: 17 representa una secuencia señal para dirigirse a las células de cáncer de mama que sobreexpresan P-cadherina.

LSTAADMQGWTDGMASGLDKDYLKPDD SEQ ID NO: 18 representa una secuencia consenso en una proteína de repetición de pentapéptido.

(STAV)1(DN)2(LF)3(STR)4(G)5

SEQ ID NO: 19 representa una secuencia de ácido nucleico del gen AlbG.

ATGCCGGCGAAAACCCTGG AAAGCAAAGATTATTG CG GCGAAAGCTTTG T GAGCGAAGATCGCAGCGGCCAGAGCCTGGAAAGCATTCGCTTTGAAGAT TGCACCTTTCGCCAGTGCAACTTTACCGAAGCGGAACTGAACCGCTGCAA ATTTCGCGAATGCGAATTTGTGGATTGCAACCTGAGCCTGATTAGCATTCC GCAGACCAGCTTTATGGAAGTGCGCTTTGTGGATTGCAAAATGCTGGGCG TGAACTGGACCAGCGCGCAGGCGGGCGCGCTGAGCTTTGAACGCTGCATT CTGAACGATAGCCTGTTTTATGGCCTGTATCTGGCGGGCGTGAAAATGGT GGAATGCCGCATTCATGATGCGAACTTTACCGAAGCGGATTGCGAAGATG CGGATTTT ACCC AG AGCGAT CT G AA AGGC AGC ACCTTT C AT AACACCAAA CTGACCGGCGCGAGCTTTATTGATGCGGTGAACTATCATATTGATATTTTT CATAACGATATTAAACGCGCGCGCTTTAGCCTGCCGGAAGCGGCGAGCCT GCTGAACAGCCTGGATATTGAACTGAGCGAT SEQ ID NO: 20 representa una secuencia de ácido nucleico del gen EfsQNR.

GGCAGCCATATGAAAATTACCTATCCGCTGCCGCCGAACCTGCCGGAACA GCTGCCGCTGCTGACCAACTGCCAGCTGGAAGATGAAGCGATTCTGGAAA ACCATCTGTATCAGCAGATTGATCTGCCGAACCAGGAAGTGCGCAACCTG GTGTTTCGCGATGCGGTGTTTGATCATCTGAGCCTGGCGAACGGCCAGTTT GCGAGCTTTGATTGCAGCAACGTGCGCTTTGAAGCGTGCGATTTTAGCAA CGTGGAATGGCTGAGCGGCAGCTTTCATCGCGTGACCTTTCTGCGCTGCA ACCTGACCGGCACCAACTTTGCGGATAGCTATCTGAAAGATTGCCTGTTT GAAGATTG CAAAGCGGATTATGCGAGCTTTCGCTTTGCGAACTTTAACCT GGTGCATTTTAACCAGACCCGCCTGGTGGAAAGCGAATTTTTTGAAGTGA CCTGGAAAAAACTGCTGCTGGAAGCGTGCGATCTGACCGAAAGCAACTG GCTGAACACCAGCCTGAAAGGCCTGGATTTTAGCCAGAACACCTTTGAAC GCCTGACCTTTAGCCCGAACTATCTGAGCGGCCTGAAAGTGACCCCGGAA C AGGCGATTT AT CTGGCGAGCGCGCTGGGCCT GGT GATT ACC

SEQ ID NO: 21 representa una secuencia de ácido nucleico de gen TtCuAGCGTATACCCTGGCGACCCATACCGCGGGCGTGATTCCGGCGGGCAAACT GGAACGCGTGGATCCGACCACCGTGCGCCAGGAAGGCCCGTGGGCGGAT CCGGCGCAGGCGGTGGTGCAGACCGGCCCGAACCAGTATACCGTGTATGT GCTGGCGTTTGCGTTTGGCTATCAGCCGAACCCGATTGAAGTGCCGCAGG GCGCGGAAATTGTGTTTAAAATTACCAGCCCGGATGTGATTCATGGCTTT CATGTGGAAGGCACCAACATTAACGTGGAAGTGCTGCCGGGCGAAGTGA GCACCGTGCGCTATACCTTTAAACGCCCGGGCGAATATCGCATTATTTGC AACCAGTATTGCGGCCTGGGCCATCAGAACATGTTTGGCACCATTGTGGT GAAAGAA

SEQ ID NO: 22 representa una secuencia señal para dirigirse a actina en la célula.

GDVQKKRWLFETKPLD

SEQ ID NO: 23 representa una secuencia señal para dirigirse a la tubulina en las células.

VQSKCGSKDNIKHVPGGG

SEQ ID NO. 24: representa una secuencia de aminoácidos de una proteína con dedos de zinc.

MERP Y ACPVES CDRRF SD S SNLTRHIRIHT GQKPFQCRICMRNF SRSDHLTTHI RTHT GEKPF ACDICGRKF ARSDERKR HTKIHLRQKD

SEQ ID NO. 25: representa una secuencia de ácido nucleico del gen mcherry.

GT GAGC AAGGGCGAGGAGGAT A AC AT GGCC AT C AT C A AGGAGTT C ATGC GCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATC GAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGC TGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCC CCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACAT CCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCG TGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCC CTCC AGGACGGCGAGTT C ATCT AC A AGGT GA AGC T GCGCGGC ACC AACTT CCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCC TCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCA AGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAA GACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAAC GTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGT GGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGAC GAGCTGTACAAGTAGTAATCTAGAGGGCCCTATTCTATAGTGTCACC.

SEQ ID NO. 26: representa una secuencia de ácido nucleico de un cebador para la amplificación por PCR del gen AlbG.

ATCCCGCTCATATGCCGGCCAAGACCCTTG

SEQ ID NO. 27: representa una secuencia de ácido nucleico de un cebador para la amplificación por PCR del gen AlbG.

ATCCCGCTCTCGAGTCAATCGGACAGCTCGATATC

SEQ ID NO. 28: representa una secuencia de ácido nucleico de un cebador para la amplificación por PCR del gen EfsQNR.

ATCCCGCTCATATGAAAAATAACTTATCCCTTGCCA

SEQ ID NO. 29: representa una secuencia de ácido nucleico de un cebador para la amplificación por PCR del gen EfsQNR.

ATCCCGCTCTCGAGTTAGGTAATCACCAAACCAAGT

También se proporcionan, pero no forman parte de la invención, conjugados que comprenden una proteína recombinante y una molécula funcional para penetrar membranas celulares, y usos de los mismos que tienen una identidad de secuencia u homología sustancialmente similar a la de las SEQ ID NO: 1 a 12. El término “ identidad de secuencia sustancialmente similar” se usa en el presente documento para indicar un nivel de similitud de secuencia de aproximadamente 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % a aproximadamente 99 % de identidad. El porcentaje de identidad de secuencia se puede determinar usando métodos convencionales, por ejemplo los descritos en Henikoff y Henikoff Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 1992; 89:10915, y Altschul et al. NucleicAcid Res. 1997; 25:3389-3402 para ácidos nucleicos; y para proteínas mediante comparación después de la alineación utilizando sistemas como BLAST®.

Conjugado penetrante celular con moléculas funcionales.

La identificación de nuevos fármacos para curar o prevenir enfermedades potencialmente mortales sigue siendo un área de investigación muy activa. La mayoría de estos fármacos tienden a tener objetivos dentro de las células y, para alcanzarlos, tendrían que cruzar la membrana semipermeable, lo que en muchos casos no es sencillo ni eficaz. Por lo tanto, sigue siendo deseable desarrollar nuevos mecanismos para penetrar la membrana celular. Por otro lado, las investigaciones y estudios científicos destinados a desentrañar diversos mecanismos celulares también buscan encontrar nuevos métodos de penetración de las membranas celulares que puedan ayudar en el marcaje de la célula y sus distintos orgánulos. Además, sería muy útil para entregar los materiales necesarios al interior de las células para experimentos científicos. La mayoría de las moléculas que penetran en las células descritas en informes recientes implican el mecanismo de endocitosis de entrada a las células.

Para evitar las desventajas de la ingesta de moléculas a través de la endocitosis, por ejemplo el atrapamiento y la degradación de fármacos en diferentes tipos de compartimentos endosómicos que eventualmente se fusionan con el compartimento degradativo de las células tales como los lisosomas, en el presente documento se describe un conjugado que penetra la membrana celular y que puede penetrar la membrana celular para acceder al interior de las células y también se puede utilizar para administrar diversas cargas, incluidos tintes, medicamentos, proteínas, enzimas, anticuerpos y ácidos nucleicos dentro de las células.

La presente divulgación no debe estar limitada en alcance por las realizaciones específicas descritas en el presente documento, que están destinadas únicamente a fines de ejemplificación. Los productos, composiciones y métodos funcionalmente equivalentes están claramente dentro del alcance de la divulgación, como se describe en el presente documento.

La presente divulgación divulga un conjugado capaz de penetrar una membrana celular. El conjugado comprende una proteína p helicoidal recombinante, o una porción de proteína p helicoidal recombinante, unida a una molécula funcional en la que la proteína tiene una dimensión más larga, definida como su longitud, en el intervalo de 5 nm-25 nm y una anchura o diámetro, definida como la dimensión de la estructura proteica sustancialmente perpendicular a su longitud, en el intervalo de 1 nm-5 nm. La dimensión de la proteína se define como medida en estado sólido (caracterizada por cristalografía de rayos X o microscopía de fuerza atómica) o en estado de solución (mediciones dinámicas de dispersión de luz).

En realizaciones, la estructura proteica del conjugado puede tener una dimensión más larga o una longitud superior a 5 nm, 7.5 nm, 10 nm, 11 nm, 12 nm, 13 nm o 14 nm. En realizaciones, la estructura proteica del conjugado puede tener una dimensión más larga o una longitud inferior a 25 nm, 20 nm, 17.5 nm, 15 nm, 14 nm, 13 nm, 12 nm o 11 nm. De manera adecuada, la longitud está en el intervalo de 5 nm a 25 nm, más adecuadamente de 10 nm a 15 nm, incluso más adecuadamente de 11 nm a 14 nm o de 12 nm a 13 nm. En realizaciones, la estructura proteica del conjugado puede tener un ancho o diámetro, en una dimensión sustancialmente perpendicular a su longitud, de al menos 1 nm, 1.1 nm, 1.2 nm, 1.3 nm, 1.4 nm, 1.5 nm, 1.6 nm, 1.7 nm, 1.8 nm, 1.9 nm o 2.0 nm. En realizaciones, la estructura proteica del conjugado puede tener una dimensión más larga o una longitud inferior a 5.0 mm, 4.5 nm, 4.0 nm, 3.5 nm, 3.0 nm, 2.9 nm, 2.8 nm, 2.7 nm, 2.6 nm, 2.5 nm, 2.4 nm, 2.3 nm, 2.2 nm, 2.1 nm o 2.0 nm. De manera adecuada, la anchura está en el intervalo de 1 nma 5 nm, más adecuadamente de 1 nma 3 nm, incluso más adecuadamente de 1.5 nm a 2.5 nm. En una realización, la estructura proteica del conjugado de la presente invención puede tener una forma de punta que es generalmente cuadrangular (cuatro lados) en sección transversal a lo largo de un eje longitudinal. Convenientemente, la forma es rectangular. Convenientemente, es la punta o el extremo de la estructura proteica la que es cuadrangular. La punta puede ser generalmente rectangular, es decir, no tener esquinas en ángulo recto preciso o las esquinas pueden estar algo redondeadas. De manera adecuada, la punta tiene una longitud en el intervalo de 5 nm a 25 nm, y una anchura en el intervalo de 1 nm a 5 nm. En realizaciones, la punta puede tener dimensiones como se define para el conjugado de proteína anteriormente.

Un sustituto o una definición alternativa para el tamaño físico de la porción proteica del conjugado de la presente invención es la combinación de su estructura p-helicoidal junto con su peso molecular. La definición del tamaño de la proteína en función de sus dimensiones físicas o de su peso molecular puede usarse indistintamente. En realizaciones de la presente invención, el peso molecular de la porción proteica puede ser al menos 30 kDa. De manera adecuada, el peso molecular de la porción proteica puede ser al menos 35 kDa, 40 kDa, 45 kDa o 50 kDa. En realizaciones de la presente invención, el peso molecular de la porción proteica puede ser como máximo 100 kDa. De manera adecuada, el peso molecular de la porción proteica puede ser como máximo 90 kDa, 80 kDa, 70 kDa, 60 kDa, 55 kDa o 50 kDa. Adecuadamente, el intervalo de peso molecular de la porción proteica del conjugado de la presente invención está en el intervalo de 30-100 kDa, más adecuadamente, 40-60 kDa, incluso más adecuadamente 48-55 kDa.

Sin desear quedar ligado a ninguna teoría, se prevé que las propiedades beneficiosas en la penetración celular demostradas por los conjugados de la presente invención se deben al tamaño físico de la porción proteica, como se define por las dimensiones o el peso molecular descritos anteriormente. Otra característica de las proteínas es la rigidez que se deriva en gran medida de la poco común estructura secundaria de hélice p. Convenientemente, la proteína puede ser más rígida que la membrana que se va a atravesar. Las membranas celulares típicas tienen una rigidez de 0.005 a 0.02 N/m2 (medido mediante microscopía de fuerza atómica; Hayashi, “Propiedades de tracción y rigidez local de las células”; Mecánica del tejido biológico, págs. 137-152) dependiendo del tipo de célula. Adecuadamente, las proteínas de la presente invención tienen una rigidez, o un parámetro de rigidez elevado (K) típico de una hélice p de 0.7 a 12 N/m2 (Keten et al., Cell Mol. Bioeng. 2009; 2; 66-74).

Una característica adicional que se cree que influye en la eficacia de la penetración celular de los conjugados de la presente invención es el perfil de carga y la disposición de los aminoácidos en la estructura p helicoidal de la proteína. Específicamente, la presencia de 'escaleras' cargadas de lisina, arginina asparagina, ácido aspártico y/o ácido glutámico en la estructura de la proteína p-helicoidal facilita la penetración de la membrana celular y la carga negativa total de la secuencia de la proteína.

El término “escalera” con respecto a los residuos de aminoácidos en estructuras proteicas de hélice p se define como la presencia de residuos dispuestos alternativamente con carga positiva (lisina, arginina y/o asparagina) y negativamente (ácido aspártico y/o ácido glutámico) a lo largo de la longitud de la superficie de la proteína.

Sin desear quedar ligado a ninguna teoría, la presencia de estructuras en “escalera” cargadas en la estructura p helicoidal de la proteína de acuerdo con la presente invención podría facilitar la interacción de la proteína con las moléculas lipídicas de la membrana celular (por ejemplo, en la formación de enlace de hidrógeno con los grupos hidroxilo de las moléculas lipídicas) y/o primera unión de la proteína a la membrana celular cargada negativamente.

La carga negativa total de la proteína de acuerdo con la presente invención debido a los residuos cargados negativamente podría facilitar la repulsión que conduce al movimiento angular de la proteína para hacerla permanecer recta sobre la membrana y perforar la membrana.

En realizaciones de la presente invención, la proteína del conjugado comprende escaleras de superficies dispuestas alternativamente expuestas a residuos de aminoácidos cargados positiva y negativamente. En realizaciones, la proteína comprende al menos uno de una escalera de arginina (10-30 residuos Arg), una escalera de lisina (10-30 residuos Lys), una escalera de asparagina (10-40 residuos Asn), ácido aspártico (10-40 residuos Asp residuos) y ácido glutámico (10-40 residuos de Glu).

En realizaciones de la presente invención, la carga formal total de la proteína puede ser cero o puede ser distinta de cero. Convenientemente, la carga formal total es distinta de cero; más adecuadamente, la carga formal total es inferior a cero (negativa). En realizaciones, la carga formal total de la proteína está por debajo (es decir, más negativa que) -10. De manera adecuada, la carga formal total de la proteína está por debajo de -20, -25, -30, -35, -40, -45 o -50. Más adecuadamente, el cargo total del formulario es inferior a -20. En realizaciones, la carga formal total de la proteína está por encima (es decir, menos negativa que) -80. De manera adecuada, la carga formal total de la proteína está por encima de -70, -65, -60, -55, -50, -45, -40, -35 o -30. Más adecuadamente, la carga formal total es superior a -60. En realizaciones, la carga formal total de la proteína está en el intervalo de -10 a -80, más adecuadamente de -20 a -60.

La eficiencia de la penetración celular y el mecanismo de penetración celular se pueden modular optimizando la carga formal total de los conjugados aumentando el número de residuos cargados positivamente (por ejemplo, arginina) a lo largo de la superficie de la proteína y las secuencias se pueden mutar en el nivel de terminal N con las secuencias de señalización (SEQ ID NO: 14, 15, 16 o 17 y/o fosfatidilcolina) para lograr especificidad de orgánulos celulares o especificidad de células cancerosas particulares.

En una realización, la proteína del conjugado de la presente invención adecuada para la penetración celular directa (es decir, no endocítica) puede tener uno o más de los siguientes parámetros estructurales:

- Estructura beta helicoidal con parámetro de rigidez K (beta hélice) de 0.2 a 12 N/m2;

- Longitud entre 5 n m y 25 nm;

- Diámetro entre 1 nm y 5 nm;

- Peso molecular entre 25 KDa y 100 KDa;

- Escaleras de superficie dispuestas alternativamente exponen residuos de carga positiva y negativa en la superficie de la proteína a lo largo de su longitud: una escalera de arginina (10-30 residuos de Arg), una escalera de lisina (10 30 residuos de Lys), una escalera de asparagina (10-40 residuos Asn), ácido aspártico (10-40 residuos Asp) y ácido glutámico (10-40 residuos Glu);

- Carga formal total (-20 a -60).

En realizaciones de la presente invención, el conector entre la proteína p-helicoidal y la molécula funcional puede formarse mediante un enlace directo entre la proteína p-helicoidal y la molécula funcional, por ejemplo mediante una amida (o peptídica), o un enlace éster covalente, o mediante coordinación metálica; o el conector puede tomar la forma de una molécula conectora. De manera adecuada, el enlace es mediante enlaces o interacciones covalentes o no covalentes. Cuando el conector es una molécula conectora, la molécula conectora puede adoptar cualquier forma adecuada que conecte reversiblemente la proteína p-helicoidal y la molécula funcional. En algunas realizaciones, la molécula conectora se puede seleccionar del grupo que consiste en un péptido o proteína, un conector PEG (polietilenglicol), una molécula orgánica, un conjugado metálico, un conjugado fármaco-metal, dominios de unión a ácido nucleico y una molécula intercaladora de ácido nucleico.

En una realización, la presente invención describe un conjugado que tiene una proteína p helicoidal recombinante de longitud en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y ancho está en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm, en el que la proteína p helicoidal tiene una secuencia específica unida a una molécula funcional. Adecuadamente, la secuencia específica es una repetición pentapeptídica. En una realización, la secuencia consenso de la proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional es (STAV)<1>(DN)<2>(LF)<3>(STR)<4>(G)<5>. Ejemplos de proteínas repetitivas de pentapéptido son las SEQ ID Nos: 1,2, 6 y 8.

En realizaciones de la presente divulgación, la proteína p helicoidal recombinante se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, y SEQ ID NO: 12.

En realizaciones de la presente invención, la molécula funcional puede ser cualquier molécula orgánica (fármacos contra el cáncer, antibióticos, NSAIDS, analgésicos o cualquier otra molécula de fármaco, colorantes fluorescentes, insecticidas, pesticidas, etc.), complejo fármaco-metal, metal, anticuerpo, proteínas, polisacáridos, ácidos nucleicos, péptidos, señales de localización nuclear, puntos cuánticos y nanopartículas.

El conjugado se puede utilizar para transferir una molécula funcional al interior de las células, facilitado por la capacidad del conjugado para penetrar la membrana celular. Con señales de localización apropiadas asociadas con o integradas con el conjugado o la molécula funcional o ambos, el conjugado de la presente invención se puede usar para dirigir la molécula funcional a una parte específica del interior de la célula, por ejemplo, los orgánulos presentes en el interior de las celdas.

En una realización, se divulga un proceso para transferir una molécula funcional dentro de las células usando el conjugado de penetración celular de la presente invención. El proceso descrito se puede utilizar además para el etiquetado celular, la penetración celular y el direccionamiento de cualquier molécula funcional a los orgánulos celulares.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional, en el que la longitud de la proteína p helicoidal está en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y el ancho es en el intervalo de 1 nm a 5 nm, adecuadamente de 1 nm a 3 nm.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular como se describe en el presente documento, en el que la proteína p helicoidal es una proteína de repetición de pentapéptido.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular como se describe en el presente documento, en el que la proteína p helicoidal comprende un pentapéptido repetido en tándem con secuencia consenso (STAV)<i>(DN)<2>(LF)<3>(STR)<4>(G)<5>.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional, en el que la longitud de la proteína p helicoidal está en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y el ancho es en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm, y en el que la proteína p helicoidal está representada por una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, y combinaciones de los mismos.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular como se describe en el presente documento, en el que la proteína p helicoidal es AlbG que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 1.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular como se describe en el presente documento, en el que la proteína p helicoidal es EfsQNR que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 2.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional, en el que la longitud de la proteína p helicoidal está en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y el ancho es en el intervalo de 1 nm a 5 nm, adecuadamente de 1 nm a 3 nm, y en el que la proteína p helicoidal es una proteína anticongelante que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 3.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional, en el que la longitud de la proteína p helicoidal está en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y el ancho es en el intervalo de 1 nm a 5 nm, adecuadamente de 1 nm a 3 nm, y en el que la proteína p helicoidal es una proteína anticongelante que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 4.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional, en el que la longitud de la proteína p helicoidal está en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y el ancho es en el intervalo de 1 nm a 5 nm, adecuadamente de 1 nm a 3 nm, y en el que la proteína p helicoidal es una proteína anticongelante que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 5.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional, en el que la longitud de la proteína p helicoidal está en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y el ancho es en el intervalo de 1 nm a 5 nm, adecuadamente de 1 nm a 3 nm, y en el que la proteína p helicoidal es QNRB1 que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 6.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional, en el que la longitud de la proteína p helicoidal está en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y el ancho es en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm, y en el que la proteína p helicoidal es UDP N-acetilglucosamina aciltransferasa que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 7.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional, en el que la longitud de la proteína p helicoidal está en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y el ancho es en el intervalo de 1 nm a 5 nm, adecuadamente de 1 nm a 3 nm, y en el que la proteína p helicoidal es NP275 que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 8.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional, en el que la longitud de la proteína p helicoidal está en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y el ancho es en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm, y en el que la proteína p helicoidal es pectato liasa C que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 9.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional, en el que la longitud de la proteína p helicoidal está en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y el ancho es en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm, y en el que la proteína p helicoidal es una pectato liasa que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 10.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional, en el que la longitud de la proteína p helicoidal está en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y el ancho es en el intervalo de 1 nm a 5 nm, adecuadamente de 1 nm a 3 nm, y en el que la proteína p helicoidal es anhidrasa carbónica que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 11.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional, en el que la longitud de la proteína p helicoidal está en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y el ancho es en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm, y en el que la proteína p helicoidal es pectina liasa A que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 12.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular como se describe en el presente documento, en el que la molécula funcional se selecciona del grupo que consiste en colorantes, fármacos, metales, complejos fármaco-metal, proteínas, enzimas, anticuerpos, ácidos nucleicos, polisacáridos, señales de localización nuclear, nanopartículas y combinaciones de los mismos.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular como se describe en el presente documento, en el que la molécula funcional es un tinte.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular como se describe en el presente documento, en el que la molécula funcional es un fármaco.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular como se describe en el presente documento, en el que la molécula funcional es un metal.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular como se describe en el presente documento, en el que la molécula funcional es un complejo fármaco-metal.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular como se describe en el presente documento, en el que la molécula funcional es una proteína.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular como se describe en el presente documento, en el que la molécula funcional es una enzima.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular como se describe en el presente documento, en el que la molécula funcional es un anticuerpo.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular como se describe en el presente documento, en el que la molécula funcional es un ácido nucleico.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular como se describe en el presente documento, en el que la molécula funcional es un polisacárido.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular como se describe en el presente documento, en el que la molécula funcional es una señal de localización nuclear.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular como se describe en el presente documento, en el que la molécula funcional es una nanopartícula.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular como se describe en el presente documento, en el que la molécula funcional está unida a la proteína p helicoidal recombinante mediante enlaces covalentes, enlaces no covalentes y combinaciones de los mismos.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular como se describe en el presente documento, en el que la molécula funcional está unida a la proteína p helicoidal recombinante mediante enlaces covalentes.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular como se describe en el presente documento, en el que la molécula funcional está unida a la proteína p helicoidal recombinante mediante enlaces no covalentes.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional como se describe en el presente documento, en el que el complejo comprende además una secuencia señal.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional como se describe en el presente documento, en el que el conjugado comprende además una molécula de fosfolípido.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional como se describe en el presente documento, en el que el conjugado comprende además una secuencia señal seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, y SEQ ID NO: 17.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional como se describe en el presente documento, en el que el conjugado comprende además una molécula de fosfatidilcolina.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional como se describe en el presente documento, en donde el conjugado comprende además una secuencia señal como se establece en SEQ ID NO: 14.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional como se describe en el presente documento, en el que el conjugado comprende además una secuencia señal como se establece en SEQ ID NO: 15.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional como se describe en el presente documento, en el que el conjugado comprende además una secuencia señal como se establece en SEQ ID NO: 16.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional como se describe en el presente documento, en el que el conjugado comprende además una secuencia señal como se establece en SEQ ID NO: 17.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional para transferir la molécula funcional al núcleo de la célula, en el que la longitud de la proteína p helicoidal está en el rango de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y el ancho está en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm, y en el que el conjugado comprende además una secuencia señal como se establece en SEQ ID NO: 14.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional para transferir la molécula funcional al núcleo de la célula como se describe en el presente documento, en el que la proteína p helicoidal está representada por una secuencia seleccionado del grupo formado por S E Q ID n O:1, SeQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, y combinaciones de los mismos, y en el que el conjugado comprende además una secuencia señal como se establece en SEQ ID NO: 14.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional para transferir la molécula funcional al núcleo de la célula como se describe en el presente documento, en el que la molécula funcional se selecciona del grupo que consiste de colorantes, fármacos, metales, complejos fármaco-metal, proteínas, enzimas, anticuerpos, ácidos nucleicos, polisacáridos, señales de localización nuclear, nanopartículas y combinaciones de los mismos.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional para transferir la molécula funcional al retículo endoplásmico de la célula, en el que la longitud de la proteína p helicoidal está en el rango de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y el ancho está en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm, y en el que el conjugado comprende además una secuencia señal como se establece en SEQ ID NO: 15.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional para transferir la molécula funcional al retículo endoplásmico de la célula como se describe en el presente documento, en el que la proteína p helicoidal está representada por una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, y combinaciones de los mismos, y en el que el conjugado comprende además una secuencia señal como se establece en SEQ ID NO: 15.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional para transferir la molécula funcional al retículo endoplásmico de la célula como se describe en el presente documento, en el que la molécula funcional se selecciona del grupo que consiste en colorantes, fármacos, metales, complejos fármaco-metal, proteínas, enzimas, anticuerpos, ácidos nucleicos, polisacáridos, señales de localización nuclear, nanopartículas y combinaciones de los mismos.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional para transferir la molécula funcional a las mitocondrias de la célula, en el que la longitud de la proteína p helicoidal está en el rango de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y el ancho está en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm, y en el que el conjugado comprende además una secuencia señal como se establece en SEQ ID NO: 16.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional para transferir la molécula funcional a las mitocondrias de la célula como se describe en el presente documento, en donde la proteína p helicoidal está representada por una secuencia seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, y combinaciones de los mismos, y en el que el conjugado comprende además una secuencia señal como se establece en SEQ ID NO: 16.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional para transferir la molécula funcional a las mitocondrias de la célula como se describe en el presente documento, en el que la molécula funcional se selecciona del grupo que consiste de colorantes, fármacos, metales, complejos fármaco-metal, proteínas, enzimas, anticuerpos, ácidos nucleicos, polisacáridos, señales de localización nuclear, nanopartículas y combinaciones de los mismos.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional para transferir la molécula funcional a células de cáncer de mama que sobreexpresan P-cadherina, en el que la longitud de la proteína p helicoidal está en el rango de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y el ancho está en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm, y en el que el conjugado comprende además una secuencia señal como se establece en SEQ ID NO: 17.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional para transferir la molécula funcional a células de cáncer de mama que sobreexpresan P-cadherina como se describe en el presente documento, en el que la proteína p helicoidal está representada por una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ<i>D NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, y combinaciones de los mismos, y en el que el conjugado comprende además una secuencia señal como se establece en SEQ ID NO: 17.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional para transferir la molécula funcional a células de cáncer de mama que sobreexpresan P-cadherina como se describe en el presente documento, en el que la molécula funcional se selecciona del grupo consta de colorantes, fármacos, metales, complejos fármaco-metal, proteínas, enzimas, anticuerpos, ácidos nucleicos, polisacáridos, señales de localización nuclear, nanopartículas y combinaciones de los mismos.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional para transferir la molécula funcional a la membrana de la célula, en el que la longitud de la proteína p helicoidal está en el rango de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y la anchura está en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm, y en el que el conjugado comprende además una molécula de fosfatidilcolina.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional para transferir la molécula funcional a la membrana de la célula como se describe en el presente documento, en el que la proteína p helicoidal está representada por una secuencia seleccionado del grupo formado por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, y combinaciones de los mismos, y en el que el conjugado comprende además una molécula de fosfatidilcolina.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula funcional para transferir la molécula funcional a la membrana de la célula como se describe en el presente documento, en el que la molécula funcional se selecciona del grupo que consiste de colorantes, fármacos, metales, complejos fármaco-metal, proteínas, enzimas, anticuerpos, ácidos nucleicos, polisacáridos, señales de localización nuclear, nanopartículas y combinaciones de los mismos.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula, dicho proceso comprende: (a) unir la molécula funcional a una proteína p helicoidal recombinante para obtener un conjugado; (b) poner en contacto el conjugado con al menos una célula, en el que el contacto del conjugado transfiere la molécula funcional al interior de la célula, y en el que la longitud de la proteína p helicoidal está en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y el ancho está en el rango de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm. En una realización, el proceso comprende además después de la etapa (c), la etapa (d) detectar la transferencia del conjugado dentro de la célula.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que la proteína p helicoidal es una proteína de repetición pentapeptídica.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que la proteína p helicoidal comprende un pentapéptido repetido en tándem con secuencia consenso (STAV)<i>(DN)<2>(LF)<3>(STR)<4>(G)<5>.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que la proteína p helicoidal está representada por una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ iD NO: 1, SEQ iD NO: 2, SEQ ID<n>O: 3, SEQ iD NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, y combinaciones de los mismos.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que la proteína p helicoidal es AlbG que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 1.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que la proteína p helicoidal es EfsQNR que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 2.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que la proteína p helicoidal es una proteína anticongelante que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 3.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que la proteína p helicoidal es una proteína anticongelante que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 4.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que la proteína p helicoidal es una proteína anticongelante que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 5.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que la proteína p helicoidal es QNRB1 que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 6.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que la proteína p helicoidal es UDP N acetilglucosamina aciltransferasa que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 7.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que la proteína p helicoidal es NP275 que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 8.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que la proteína p helicoidal es pectato liasa C que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 9.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que la proteína p helicoidal es una pectato liasa que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 10.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que la proteína p helicoidal es anhidrasa carbónica que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 11.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que la proteína p helicoidal que tiene una secuencia es como se establece en SEQ ID NO: 12.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que la molécula funcional se selecciona del grupo que consiste en colorantes, fármacos, metales, complejos fármaco-metal, proteínas, enzimas, anticuerpos, ácidos nucleicos, polisacáridos, señales de localización nuclear, nanopartículas y combinaciones de los mismos.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que la molécula funcional es un tinte.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que la molécula funcional es un fármaco.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que la molécula funcional es un metal.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que la molécula funcional es un complejo fármaco-metal. En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que la molécula funcional es una proteína.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que la molécula funcional es una enzima.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que la molécula funcional es un anticuerpo.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que la molécula funcional es un ácido nucleico.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que la molécula funcional es un polisacárido.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que la molécula funcional es una señal de localización nuclear.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que la molécula funcional es una nanopartícula.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que la molécula funcional está unida a la proteína p helicoidal recombinante mediante enlaces covalentes, enlaces no covalentes y combinaciones de los mismos.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que la célula se selecciona del grupo que consiste en células eucariotas, células procarióticas y combinaciones de las mismas.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que la célula es una célula procariótica.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que la célula es una célula eucariota.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que la proteína p helicoidal está representada por una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 1, y la molécula funcional es el colorante de cumarina NHS.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que la proteína p helicoidal está representada por una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 2, y la molécula funcional es el tinte cumarina NHS.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que la proteína p helicoidal está representada por una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 2, y la molécula funcional es un complejo metálico de rutenio.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que el proceso se usa para el marcaje celular.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a una célula como se describe en el presente documento, en el que el proceso se usa para administrar las moléculas funcionales a la célula.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a un orgánulo de una célula, dicho proceso comprende: (a) unir la molécula funcional a una proteína p helicoidal recombinante para obtener un conjugado; (b) incorporar además al conjugado cualquier secuencia señal seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, Se Q iD NO: 15, y SEQ ID NO: 16; (c) poner en contacto el conjugado de la etapa (b) con al menos una célula; en el que el contacto con el conjugado de la etapa (b) transfiere la molécula funcional al orgánulo dentro de la célula, en el que el orgánulo se selecciona del grupo que consiste en núcleo, retículo endoplásmico y mitocondrias, y en el que la longitud de la proteína p helicoidal está en el rango de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y el ancho está en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm. En una realización, el proceso comprende además después de la etapa (c), la etapa (d) detectar la transferencia del conjugado dentro de la célula.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a un orgánulo de una célula como se describe en el presente documento, en el que la proteína p helicoidal recombinante está representada por una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, y combinaciones de los mismos.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir las moléculas funcionales al núcleo de la célula como se describe en el presente documento, en el que la secuencia señal es como se establece en SEQ ID NO: 14.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir las moléculas funcionales al retículo endoplásmico de la célula como se describe en el presente documento, en el que la secuencia señal es como se establece en SEQ ID NO: 15.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir las moléculas funcionales a las mitocondrias de la célula como se describe en el presente documento, en el que la secuencia señal es como se establece en SEQ ID NO: 16.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a un orgánulo de una célula como se describe en el presente documento, en el que la molécula funcional se selecciona del grupo que consiste en colorantes, fármacos, metal, complejo fármaco-metal, proteínas, enzimas, anticuerpos, ácidos nucleicos, polisacáridos, señales de localización nuclear, nanopartículas y combinaciones de los mismos.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a células de cáncer de mama que sobreexpresan P-cadherina, dicho proceso comprende: (a) unir la molécula funcional a una proteína p helicoidal recombinante para obtener un complejo; (b) incorporar además una secuencia señal como se establece en SEQ ID NO: 17 al complejo; (c) poner en contacto el complejo de la etapa (b) con al menos una célula de cáncer de mama que sobreexpresa P-cadherina; en el que el contacto con el complejo de la etapa (b) transfiere la molécula funcional a la célula de cáncer de mama que sobreexpresa P-cadherina, en el que la longitud de la proteína p helicoidal está en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y el ancho está en el rango de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm. En una realización, el proceso comprende además después de la etapa (c), la etapa (d) detectar la transferencia del complejo dentro de la célula.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a células de cáncer de mama que sobreexpresan P-cadherina como se describe en el presente documento, en el que la proteína p helicoidal recombinante que tiene una secuencia se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, y SEQ ID NO: 12.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a células de cáncer de mama que sobreexpresan P-cadherina como se describe en el presente documento, en el que la molécula funcional se selecciona del grupo que consiste en colorantes, fármacos, metales, complejos de metal y fármaco, proteínas, enzimas, anticuerpos, ácidos nucleicos, polisacáridos, señales de localización nuclear, nanopartículas y combinaciones de los mismos.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso como se describe en el presente documento, en el que el proceso se usa para la administración dirigida de la molécula funcional al interior de la célula.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso como se describe en el presente documento, en el que el proceso se usa para marcar la célula.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso como se describe en el presente documento, en el que el proceso se usa para la administración dirigida de fármacos en la célula.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un complejo de penetración celular como se describe en el presente documento, en el que la proteína p helicoidal recombinante se usa para administrar la molécula funcional al interior de la célula, y en el que la molécula funcional se selecciona del grupo que consiste en colorantes, fármacos, metales, conjugados fármaco y metal, proteínas, enzimas, anticuerpos, ácidos nucleicos, polisacáridos, señales de localización nuclear, nanopartículas y combinaciones de los mismos.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a la proteína actina presente en una célula, dicho proceso comprende: (a) unir la molécula funcional a una proteína p helicoidal recombinante para obtener un conjugado; (b) incorporar además una secuencia señal como se establece en SEQ ID NO: 22 al complejo; (c) poner en contacto el conjugado de la etapa (b) con al menos una célula; en el que el contacto con el conjugado de la etapa (b) transfiere la molécula funcional al interior de la célula, en el que la longitud de la proteína p helicoidal está en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y el ancho está en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm -3 nm. En una realización, el proceso comprende además después de la etapa (c), la etapa (d) detectar la transferencia del conjugado dentro de la célula.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula funcional a la proteína tubulina presente en una célula, dicho proceso comprende: (a) unir la molécula funcional a una proteína p helicoidal recombinante para obtener un conjugado; (b) incorporar además una secuencia señal como se establece en SEQ ID NO: 23 al conjugado; (c) poner en contacto el conjugado de la etapa (b) con al menos una célula; en el que el contacto con el conjugado de la etapa (b) transfiere la molécula funcional a la célula de cáncer de mama que sobreexpresa P-cadherina, en el que la longitud de la proteína p helicoidal está en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y el ancho está en el rango de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm. En una realización, el proceso comprende además después de la etapa (c), la etapa (d) detectar la transferencia del conjugado dentro de la célula.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular como se describe en el presente documento, en el que la proteína p helicoidal recombinante se usa para la penetración celular.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado de penetración celular como se describe en el presente documento, en el que la proteína p helicoidal recombinante se usa para el marcaje celular.

Molécula penetrante celular con ácidos nucleicos.

En una realización, la presente invención proporciona una solución al problema de la administración de fragmentos de ácido nucleico, como una molécula funcional, al que se enfrenta la terapia génica o los tratamientos de edición génica. El presente documento describe un conjugado que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a una molécula de ácido nucleico, por ejemplo un plásmido, tal como un plásmido de ARN o ADN, que puede penetrar la membrana celular. En una realización, la proteína p helicoidal recombinante unida puede unirse a una o más moléculas de ácido nucleico, adecuadamente una única molécula de ácido nucleico o plásmido, mediante fuerzas interactivas adecuadas (tales como fuerzas electrostáticas o hidrófobas) o mediante un elemento, molécula, porción o fracción.

Se ha demostrado que el conjugado que comprende proteína p helicoidal recombinante, un conector y un plásmido penetra con éxito la membrana celular para establecer la expresión de un gen que forma parte del plásmido. El conjugado evita la vía de la endocitosis y cruza la membrana celular penetrando directamente en la membrana. Por lo tanto, el conjugado supera los problemas que enfrenta la entrada a través de endocitosis y al mismo tiempo penetra eficazmente en la membrana celular.

En una realización, la presente invención describe un conjugado capaz de penetrar la membrana celular. En algunas realizaciones, el conjugado comprende una proteína p helicoidal recombinante de longitud en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y ancho está en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm unida a una molécula de ácido nucleico a través de un enlazador. En una realización, la proteína p helicoidal recombinante puede ser una proteína repetida pentapeptídica que tiene una secuencia consenso (STAV)i (DN)<2>(LF)<3>(STR)<4>(G)<5>. En otra realización de la presente divulgación, la proteína p helicoidal recombinante se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, y SEQ ID NO: 12.

De acuerdo con la presente divulgación, en una realización la proteína p helicoidal recombinante está unida a una molécula de ácido nucleico mediante un elemento, molécula, porción o fracción de conector. En realizaciones, el elemento conector puede ser un enlace directo mediante enlaces covalentes o no covalentes. Cuando el conector es una molécula conectora, puede seleccionarse del grupo que consiste en proteína, conjugado metálico, conjugado fármaco-metal, dominio de unión al ADN y molécula intercaladora de ácido nucleico. En una realización, la molécula de ácido nucleico que comprende la parte del conjugado comprende al menos un gen de interés. En una realización, la molécula de ácido nucleico está unida a un complejo que comprende la proteína p helicoidal recombinante y el conector para formar el conjugado como se describe en la presente invención. En una realización, el conjugado puede entrar en la célula penetrando la membrana celular y un gen que forma parte de la molécula de ácido nucleico puede expresarse dentro de las células.

También se divulga, pero no forma parte de la invención, un proceso para transferir una molécula de ácido nucleico dentro de las células usando el conjugado de la presente invención. En una realización, el proceso divulgado puede usarse además para técnicas de terapia génica o técnicas de edición de genes para facilitar enfoques no virales para administrar el gen de interés en una célula, permitiendo así de manera efectiva la edición de un gen defectuoso o compensando un gen defectuoso o proteína, dentro de la célula.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado que comprende: (a) al menos una proteína p helicoidal recombinante; (b) al menos un enlazador; y (c) al menos una molécula de ácido nucleico, en la que la al menos una proteína p helicoidal recombinante tiene una longitud en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y una anchura está en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado que comprende: (a) al menos una proteína p helicoidal recombinante; (b) al menos un enlazador; y (c) al menos una molécula de ácido nucleico, en la que la al menos una proteína p helicoidal recombinante tiene una longitud en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y una anchura está en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm, y en el que la proteína p helicoidal está representada por una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, y combinaciones de los mismos.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado que comprende: (a) al menos una proteína p helicoidal recombinante; (b) al menos un enlazador; y (c) al menos una molécula de ácido nucleico, en la que la al menos una proteína p helicoidal recombinante tiene una longitud en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y una anchura está en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm, y en el que la proteína p helicoidal es una proteína de repetición pentapeptídica.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado que comprende: (a) al menos una proteína p helicoidal recombinante; (b) al menos un enlazador; y (c) al menos una molécula de ácido nucleico, en la que la al menos una proteína p helicoidal recombinante tiene una longitud en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y una anchura está en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm, y en el que la proteína p helicoidal comprende pentapéptido repetido en tándem con secuencia consenso (STAV)-i(DN)<2>(LF)<3>(St R)<4>(G)<5>.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado que comprende: (a) al menos una proteína p helicoidal recombinante; (b) al menos un enlazador; y (c) al menos una molécula de ácido nucleico, en la que la al menos una proteína p helicoidal recombinante tiene una longitud en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y una anchura está en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm, y en el que el conector es una molécula conectora seleccionada del grupo que consiste en proteína, conjugado metálico, conjugado fármacometal, dominio de unión a ADN, molécula intercaladora de ácido nucleico y combinaciones de los mismos.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado que comprende: (a) al menos una proteína p helicoidal recombinante; (b) al menos un enlazador; y (c) al menos una molécula de ácido nucleico, en la que la al menos una proteína p helicoidal recombinante tiene una longitud en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y una anchura está en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm, y en el que la proteína p helicoidal está representada por una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, y combinaciones de los mismos, y en el que el conector es una molécula conectora seleccionada del grupo que consiste en proteína, conjugado metálico, conjugado fármaco-metal, dominio de unión a ADN, molécula intercaladora de ácido nucleico y combinaciones de los mismos.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado que comprende: (a) al menos una proteína p helicoidal recombinante; (b) al menos un enlazador; y (c) al menos una molécula de ácido nucleico, en la que la al menos una proteína p helicoidal recombinante tiene una longitud en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y una anchura está en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm, y en el que el conector está unido a la proteína p helicoidal recombinante mediante enlaces covalentes, enlaces no covalentes y combinaciones de los mismos.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado que comprende: (a) al menos una proteína p helicoidal recombinante; (b) al menos un enlazador; y (c) al menos una molécula de ácido nucleico, en la que la al menos una proteína p helicoidal recombinante tiene una longitud en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y una anchura está en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm, y en el que el conector es una molécula conectora seleccionada del grupo que consiste en proteína, conjugado metálico, conjugado fármacometal, dominio de unión a ADN, molécula intercaladora de ácido nucleico y combinaciones de los mismos, y en el que el conector está unido a la proteína p helicoidal recombinante mediante enlaces covalentes, enlaces no covalentes y combinaciones de los mismos.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado que comprende: (a) al menos una proteína p helicoidal recombinante; (b) al menos un enlazador; y (c) al menos una molécula de ácido nucleico, en la que la al menos una proteína p helicoidal recombinante tiene una longitud en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y una anchura está en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm, y en el que la molécula de ácido nucleico comprende al menos un gen de interés.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado que comprende: (a) al menos una proteína p helicoidal recombinante; (b) al menos un enlazador; y (c) al menos una molécula de ácido nucleico, en la que la al menos una proteína p helicoidal recombinante tiene una longitud en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y una anchura está en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm, y en el que la proteína p helicoidal está representada por una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, y combinaciones de los mismos, y en el que la molécula de ácido nucleico comprende al menos un gen de interés.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado que comprende: (a) al menos una proteína p helicoidal recombinante; (b) al menos un enlazador; y (c) al menos una molécula de ácido nucleico, en la que la al menos una proteína p helicoidal recombinante tiene una longitud en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y una anchura está en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm, y en el que la proteína p helicoidal está representada por una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, y combinaciones de los mismos, y en el que el conector es una molécula conectora seleccionada del grupo que consiste en proteína, conjugado metálico, conjugado fármaco-metal, dominio de unión a ADN, molécula intercaladora de ácido nucleico y combinaciones de los mismos, y en el que la molécula de ácido nucleico comprende al menos al menos un gen de interés.

En una realización, la presente invención proporciona una solución al problema de la administración de maquinaria molecular de edición de genes a través de membranas celulares y dentro de una célula y/o compartimentos de la misma proporcionando un medio para transfectar un plásmido o ácido nucleico que codifica una o más moléculas de una sistema de edición del genoma en la célula. Una vez que el plásmido o ácido nucleico está en la célula, una o más moléculas de un sistema de edición del genoma en la célula pueden prepararse usando procesos celulares y opcionalmente combinarse con otros componentes requeridos del sistema de edición del genoma, para proporcionar un sistema de edición de genes dentro de la célula.

En una realización de la presente divulgación, el gen de interés en el ácido nucleico, o plásmido, codifica una o más moléculas de un sistema de edición del genoma. De manera adecuada, la una o más moléculas del sistema de edición del genoma se seleccionan pero no se limitan al, grupo que consiste en: una endonucleasa guiada por ARN y/o un ARN guía (ARNg), por ejemplo Cas9; una nucleasa con dedos de zinc (ZFN); una nucleasa efectora similar al activador del transcriptor (TALEN®); una endonucleasa guiada por ADN y/o un ADN guía; una endonucleasa dirigida; una integrasa; y cualquier combinación de los mismos.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado que comprende: (a) al menos una proteína p helicoidal recombinante; (b) al menos un enlazador; y (c) al menos una molécula de ácido nucleico, en la que la al menos una proteína p helicoidal recombinante tiene una longitud en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y una anchura está en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm, y en el que la proteína p helicoidal es AlbG que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 1.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado que comprende: (a) al menos una proteína p helicoidal recombinante; (b) al menos un enlazador; y (c) al menos una molécula de ácido nucleico, en la que la al menos una proteína p helicoidal recombinante tiene una longitud en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y una anchura está en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm, y en el que la proteína p helicoidal es EfsQNR que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 2.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado que comprende: (a) al menos una proteína p helicoidal recombinante; (b) al menos un enlazador; y (c) al menos una molécula de ácido nucleico, en la que la al menos una proteína p helicoidal recombinante tiene una longitud en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y una anchura está en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm, y en el que la proteína p helicoidal es una proteína anticongelante que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 3.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado que comprende: (a) al menos una proteína p helicoidal recombinante; (b) al menos un enlazador; y (c) al menos una molécula de ácido nucleico, en la que la al menos una proteína p helicoidal recombinante tiene una longitud en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y una anchura está en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm, y en el que la proteína p helicoidal es una proteína anticongelante que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 4.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado que comprende: (a) al menos una proteína p helicoidal recombinante; (b) al menos un enlazador; y (c) al menos una molécula de ácido nucleico, en la que la al menos una proteína p helicoidal recombinante tiene una longitud en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y una anchura está en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm, y en el que la proteína p helicoidal es una proteína anticongelante que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 5.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado que comprende: (a) al menos una proteína p helicoidal recombinante; (b) al menos un enlazador; y (c) al menos una molécula de ácido nucleico, en la que la al menos una proteína p helicoidal recombinante tiene una longitud en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y una anchura está en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm, y en el que la proteína p helicoidal es QNRB1 que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 6.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado que comprende: (a) al menos una proteína p helicoidal recombinante; (b) al menos un enlazador; y (c) al menos una molécula de ácido nucleico, en la que la al menos una proteína p helicoidal recombinante tiene una longitud en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y una anchura está en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm, y en el que la proteína p helicoidal es UDP N acetilglucosamina aciltransferasa que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 7.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado que comprende: (a) al menos una proteína p helicoidal recombinante; (b) al menos un enlazador; y (c) al menos una molécula de ácido nucleico, en la que la al menos una proteína p helicoidal recombinante tiene una longitud en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y una anchura está en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm, y en el que la proteína p helicoidal es NP275 que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 8.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado que comprende: (a) al menos una proteína p helicoidal recombinante; (b) al menos un enlazador; y (c) al menos una molécula de ácido nucleico, en la que la al menos una proteína p helicoidal recombinante tiene una longitud en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y una anchura está en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm, y en el que la proteína p helicoidal es pectato liasa C que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 9.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado que comprende: (a) al menos una proteína p helicoidal recombinante; (b) al menos un enlazador; y (c) al menos una molécula de ácido nucleico, en la que la al menos una proteína p helicoidal recombinante tiene una longitud en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y una anchura está en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm, y en el que la proteína p helicoidal es una pectato liasa que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 10.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado que comprende: (a) al menos una proteína p helicoidal recombinante; (b) al menos un enlazador; y (c) al menos una molécula de ácido nucleico, en la que la al menos una proteína p helicoidal recombinante tiene una longitud en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y una anchura está en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm, y en el que la proteína p helicoidal es anhidrasa carbónica que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 11.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado que comprende: (a) al menos una proteína p helicoidal recombinante; (b) al menos un enlazador; y (c) al menos una molécula de ácido nucleico, en la que la al menos una proteína p helicoidal recombinante tiene una longitud en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y una anchura está en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm, y en el que la proteína p helicoidal es pectina liasa A que tiene una secuencia como se establece en SEQ ID NO: 12.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula de ácido nucleico, o plásmido, a una célula, dicho proceso comprende: (i) unir la molécula de ácido nucleico a un complejo que comprende: (a) al menos una proteína p helicoidal recombinante; y (b) al menos un conector para obtener un conjugado; y (ii) poner en contacto el conjugado con al menos una célula, en el que el contacto del conjugado transfiere la molécula de ácido nucleico al interior de la célula, y en el que la longitud de la proteína p helicoidal recombinante está en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10nm-15nm y ancho está en el rango de 1 nm a 5 nm, adecuadamente de 1 nm a 3 nm.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula de ácido nucleico, o plásmido, a una célula como se describe en el presente documento, en el que la proteína p helicoidal está representada por una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, y combinaciones de los mismos.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula de ácido nucleico a una célula como se describe en el presente documento, en el que la proteína p helicoidal es una proteína de repetición pentapeptídica.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula de ácido nucleico a una célula como se describe en el presente documento, en el que la proteína p helicoidal comprende un pentapéptido repetido en tándem con secuencia consenso (STAV)<1>(DN)<2>(LF)<3>(STR)<4>(G)<5>.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula de ácido nucleico a una célula como se describe en el presente documento, en el que el conector es una molécula conectora seleccionada del grupo que consiste en proteína, conjugado metálico, conjugado fármaco-metal, dominio de unión a ADN, molécula intercaladora de ácido nucleico y combinaciones de los mismos.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula de ácido nucleico a una célula como se describe en el presente documento, en el que la proteína p helicoidal está representada por una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, y combinaciones de los mismos, y en el que el conector es una molécula conectora seleccionada del grupo que consiste en proteína, conjugado metálico, conjugado fármaco-metal, dominio de unión a ADN, molécula intercaladora de ácido nucleico y combinaciones de los mismos.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula de ácido nucleico a una célula como se describe en el presente documento, en el que el conector está unido a la proteína p helicoidal recombinante mediante enlaces covalentes, enlaces no covalentes y combinaciones de los mismos.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula de ácido nucleico a una célula como se describe en el presente documento, en el que el conector es una molécula conectora seleccionada del grupo que consiste en proteína, conjugado metálico, conjugado fármaco-metal, dominio de unión a ADN, molécula intercaladora de ácido nucleico y combinaciones de los mismos, y en el que el conector está unido a la proteína p helicoidal recombinante mediante enlaces covalentes, enlaces no covalentes y combinaciones de los mismos.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula de ácido nucleico a una célula como se describe en el presente documento, en el que la célula es una célula procariótica o una célula eucariota.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir una molécula de ácido nucleico a una célula como se describe en el presente documento, en el que el gen de interés en el ácido nucleico, o plásmido, codifica una o más moléculas de un sistema de edición del genoma. De manera adecuada, la una o más moléculas del sistema de edición del genoma se seleccionan del grupo que consiste en: una endonucleasa guiada por ARN y/o un ARN guía (ARNg), por ejemplo Cas9; una nucleasa con dedos de zinc (ZFN); una nucleasa efectora similar al activador del transcriptor (TALEN®); una endonucleasa guiada por ADN y/o un ADN guía; una endonucleasa dirigida; una integrasa; y cualquier combinación de los mismos.

Péptido penetrante celular para la transferencia eficiente de moléculas de edición de genes a través de las membranas celulares

La presente invención proporciona una solución al problema de la administración de maquinaria molecular de edición de genes a través de membranas celulares y dentro de una célula y/o compartimentos de la misma. El presente documento divulga un conjugado que comprende una proteína p helicoidal recombinante unida a al menos una molécula de edición de genes o un complejo de edición de genes que puede penetrar eficientemente la membrana celular. En una realización, la proteína p helicoidal recombinante puede estar unida mediante interacciones no covalentes a una endonucleasa y una o más moléculas de ARNg. En una realización, la proteína p helicoidal recombinante puede unirse mediante interacciones no covalentes a moléculas de edición de genes CRISPR, por ejemplo endonucleasa Cas9 o ARNg y/o a un complejo de Cas9 y una o más moléculas de ARNg.

Se ha demostrado que el conjugado que comprende proteína p helicoidal recombinante y moléculas de edición de genes CRISPR penetra con éxito la membrana celular para permitir la edición del genoma en un sitio específico. Sin desear quedar ligado a ninguna teoría, se postula que el conjugado evita la vía de endocitosis y cruza la membrana celular penetrando directamente en la membrana. Por lo tanto, el conjugado supera los problemas que enfrenta la entrada a través de endocitosis y al mismo tiempo penetra eficazmente en la membrana celular.

En algunas realizaciones, el conjugado comprende una proteína p helicoidal recombinante de longitud en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y ancho está en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm unida a una molécula de ácido nucleico a través de un enlazador. En una realización, la proteína p helicoidal recombinante puede ser una proteína repetida pentapeptídica que tiene una secuencia consenso (STAV)<i>(DN)<2>(LF)<3>(STR)<4>(G)<5>. En otra realización de la presente divulgación, la proteína p helicoidal recombinante se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID N<o>: 3,<s>E<q>ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:<6>, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:<8>, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, y SEQ ID NO: 12.

De acuerdo con la presente divulgación, en una realización la proteína p helicoidal recombinante está unida a una molécula de ácido nucleico mediante un elemento, molécula, porción o fracción de conector. En realizaciones, el elemento conector puede ser un enlace directo mediante enlaces covalentes o no covalentes. Cuando el conector es una molécula conectora, puede seleccionarse del grupo que consiste en proteína, conjugado metálico, conjugado fármaco-metal, dominio de unión al ADN y molécula intercaladora de ácido nucleico.

En una realización, el conjugado puede ingresar a la célula penetrando la membrana celular y migrar a un genoma relevante en el que puede tener lugar la edición específica del sitio.

También se divulga, pero no forma parte de la invención, un proceso para transferir un CRISPR-RNP dentro de las células usando el conjugado de la presente invención. En una realización, el proceso divulgado se puede usar además para técnicas de edición de genes para facilitar enfoques no virales para permitir que se editen, eliminen y/o se agreguen genes existentes.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un proceso para transferir un CRISPR-RNP a una célula como se describe en el presente documento, en el que la célula es una célula procariótica o una célula eucariota.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado como se describe en el presente documento, en el que el conjugado se usa como agente transfectante.

En una realización de la presente divulgación, se proporciona un conjugado como se describe en el presente documento, en el que el conjugado se usa para terapia génica.

Ejemplos - Molécula penetrante celular con moléculas funcionales

La divulgación se ilustrará ahora con ejemplos prácticos, que pretenden ilustrar el funcionamiento de la divulgación y no pretenden ser restrictivos para implicar limitaciones en el alcance de la presente divulgación. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la técnica a la que pertenece esta divulgación. Aunque en la práctica de los procesos y composiciones divulgados se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, en el presente documento se describen los procesos, dispositivos y materiales ejemplares. Debe entenderse que esta divulgación no se limita a métodos particulares y condiciones experimentales descritas, ya que dichos procesos y condiciones pueden variar.

En los siguientes ejemplos, se proporcionan métodos y protocolos para llevar a cabo estudios de plásmidos y proteínas. También se proporcionan los protocolos para la obtención del conjugado, el marcaje de la proteína y los métodos para realizar estudios de penetración celular utilizando conjugado proteína-fármaco y conjugado proteínamarcador. La sección de resultados describe específicamente la prueba de concepto de la capacidad de penetración celular del conjugado como se describe en la presente invención. El in vitro El marcaje de diferentes líneas celulares se ha llevado a cabo utilizando el conjugado de la presente invención de acuerdo con el método descrito. También se han llevado a cabo ensayos con un conjugado fármaco-proteína para estudiar la capacidad del conjugado para mejorar la absorción del fármaco mediante la penetración celular.

Material y métodos

El tinte Hoechst 33342 se adquirió de Invitrogen; NHS-coumarin y ATTO 520-NHS, ATTO 390-NHS y ATTO 647N-NHS se adquirieron de Sigma. Los disolventes orgánicos y los reactivos utilizados para la espectrofotometría visual UV y los espectros CD se adquirieron de Sigma y Merck. Los reactivos para estudiar la expresión de plásmidos y la purificación de proteínas se adquirieron de Sigma Aldrich y Merck. Los reactivos necesarios para el ensayo MTT se adquirieron de Mp Biomedicals. El complejo metálico de rutenio se adquirió de Sigma.

Ejemplo 1

Estudios de plásmidos/proteínas - El plásmido que contiene el gen AlbG como se muestra en SEQ ID NO: 19, se obtuvo mediante un método publicado anteriormente (Vetting et al. Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 2011: 67(3): 296-; 02).

El marco de lectura abierto de AlbG se amplificó mediante técnicas de PCR estándar utilizando ADN cromosómico de X albilineans (ATCC 29184; Pieretti et al., BMC Genomics, 2009, 10:616, 1-15) como plantilla. Los oligonucleótidos AlbGF (5'-ATCCCCGCTCATATGCCGGCCAAGACCCTTG-3') y AlbGR (5'-ATCCCGCTCTCGAGTCAATCGGACAGCTCGATATC-3') que contienen sitios de restricción Ndeyo y XhoI se utilizaron, respectivamente. El fragmento de PCR se clonó en pET-28a(+) y se expresó AlbG recombinante que llevaba una etiqueta His6 N-terminal escindible por trombina en la cepa BL21 (DE3) de E. coli. Para el crecimiento en matraz agitado, se inoculó 1 litro de medio caldo Luria suplementado con kanamicina (35 pg/ml) con 10 ml de un cultivo durante la noche y se incubó a 37 °C. El cultivo se cultivó hasta la fase media de registro (A<600>de ~0.8), se enfrió a 20 °C, se indujo con IPTG 0.5 mM y se incubó adicionalmente durante la noche a 20 °C. Todos los procedimientos de purificación se llevaron a cabo a 4 °C. Las células se recogieron mediante centrifugación a 3000 g, se resuspendieron en tampón A [Tris-HCl 50 mM, pH 7.8 que contiene NaCl 300 mM, inhibidores de proteasa, lisozima (5 pg/ml) y ADNasa I (0.1 pg/ml)] y se agitaron durante 20 min. Luego, las células se lisaron mediante sonicación y los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación a 10000 g durante 30 minutos. El sobrenadante se cargó en una columna de níquel-ácido nitrilotriacético (Ni-NTA) preequilibrada con tampón A y se lavó con diez volúmenes de columna del mismo tampón. Las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente lineal de imidazol de 0 a 0.3 M y las fracciones de los picos se reunieron y concentraron.

El plásmido que contiene el gen EfsQNR como se muestra en SEQ ID NO: 2 se obtuvo mediante un método publicado anteriormente (Hegde et al., Antimicrob. Agents Chemother. Enero de 2011; 55(1): 110-117).

El marco de lectura abierto de EfsQNR se amplificó mediante técnicas de PCR estándar utilizando E. faecalis V583 (ATCC 700802; ENTFA 226185) A<d>N cromosómico como plantilla. Los oligonucleótidos (5'-ATCCCCGCTCATATGAAAAATAACTTATCCCTTGCCA-3') y (5'-ATCCCGTCCTCGAGTTAGGTAATCACCAAACCAAGT-3'), que contienen sitios de restricción I Ndeyo y xho se utilizaron, respectivamente. El fragmento de PCR se clonó en pET-28a(+), y el EfsQNR recombinante que porta una etiqueta His6 N-terminal escindible por trombina se expresó en la cepa BL21(DE3) de E. coli. Para el crecimiento en matraz agitado, se inoculó 1 litro de medio caldo Luria suplementado con kanamicina (35 pg/ml) con 10 ml de un cultivo durante la noche y se incubó a 37 °C. El cultivo se cultivó hasta la fase media de registro (A<600>~ 0.8), se enfrió a 20 °C, se indujo con isopropil-p-d-tiogalactopiranósido (IPTG) 0.5 mM y se incubó adicionalmente durante la noche a 20 °C.

Las células se recogieron mediante centrifugación a 1200 g y se resuspendieron en tampón A (Tris-HCl 50 mM [pH 7.8], NaCl 300 mM) que contenía inhibidores de proteasa, lisozima (5 pg/ml) y ADNasa I (0.1 pg/ml), y la mezcla se agitó durante 20 min. Luego, las células se lisaron mediante sonicación y los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación a 10000 gramo durante 30 min. El sobrenadante se cargó en una columna de Ni-NTA preequilibrada con tampón A y se lavó con 10 volúmenes de columna del mismo tampón. Las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente lineal de imidazol de 0 a 0.3 M con las fracciones reunidas y concentradas.

Como ejemplo comparativo, se utiliza un plásmido que contiene el gen TtCuA como se muestra en SEQ ID NO: 13 se obtuvo mediante un método en Bioquímica, 2008, 47, 1309-131 8).

Ejemplo 2

Ensayo de toxicidad - Se realizó el ensayo MTT estándar de la industria (ex-Sigma Aldrich) para analizar la toxicidad de los conjugados de fármaco citotóxico y proteína p helicoidal contra células de mamíferos, por ejemplo, células HeLa. Las células se cultivaron utilizando un protocolo estándar. Se sembraron un millón de células en placas confocales (placa de 1 cm) y se cultivaron durante 6-8 h. Se añadió a las células una mezcla del fármaco citotóxico y la proteína EfsQNR (mezcladas en una proporción de 2:1) y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 minutos a 24 h a 72 h. Después de la incubación, las células se lavaron con PBS, se trataron con MTT y se incubaron adicionalmente durante 24 horas. Luego las células se lavaron y analizaron para determinar los valores de absorbancia a 570 nm. Las células viables con metabolismo activo convierten el MTT en un producto de formazán de color púrpura con una absorbancia máxima cercana a los 570 nm. Las células muertas no pueden convertir MTT en formazán, por lo tanto, analizando los valores de absorbancia a 570 nm se puede calcular el porcentaje de células viables para una proteína determinada o cualquier otra molécula.

Ejemplo 3

Marcado de proteínas con colorantes fluorescentes. Los tintes fluorescentes se consideraron como un ejemplo de molécula funcional para investigar la capacidad de penetración del conjugado en la membrana celular. El marcaje de la proteína recombinante con un tinte se llevó a cabo realizando una serie de reacciones en condiciones de oscuridad. La proteína a marcar se recogió en tampón PBS (1X y pH 7.3) y el colorante se recogió en una concentración dos o tres veces mayor que la de la proteína. La proteína se añadió a tampón de carbonato de sodio<0.1>M (pH 8.5) seguido del colorante. El tinte se añadió muy lentamente (3 pl cada vez) al tampón que contenía la proteína mantenido en hielo acompañado de agitación ocasional. La solución resultante se envolvió con papel de aluminio para mantener alejada la luz. La solución se agitó durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se purificó mediante filtración en gel, es decir, se pasó a través de una columna de desalinización o una columna PD 10 con tampón PBS 1X. La proteína marcada resultante se caracterizó mediante espectrofotometría visual UV para determinar la proporción colorante:proteína.

Ejemplo 4

Captación celular de proteínas marcadas. La absorción de proteínas marcadas se comprobó tratando células de mamíferos con diferentes proteínas marcadas como AlbG (SEQ ID NO: 1), EfsQNR (SEQ Id NO: 2) y, como ejemplo comparativo, TtCuA (SEQ ID NO: 13). TtCuA es una proteína citocromo oxidasa c del organismo Thermus termófilo. Está representado por la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 13. Las células se sembraron a una concentración de un millón en placas confocales (placa de 1 cm) y se dejaron crecer durante 6 - 8 horas. Posteriormente, las proteínas marcadas se agregaron a las células en diferentes concentraciones y se incubaron en condiciones estándar de 5 % de CO2 y 37 °C. Luego, las células se lavaron dos veces, después de 3 horas y 24 horas con HBSS (solución salina en blanco de Hanks) o PBS y se observaron bajo microscopía de fluorescencia y/o microscopio de barrido láser confocal.

La absorción de proteínas marcadas se comprobó tratando células de E-Coli y de levadura (Kluveromyces) con diferentes proteínas marcadas tales como AlbG (SEQ ID NO: 1), EfsQNR (SEQ ID NO: 2). Se inocularon células de E coli o Kluveromyces y se cultivaron durante la noche hasta que la DO alcanzó 0.6. Las células se diluyeron 50 veces y se añadieron 3 micromolares de proteína marcada (conjugado). Las células se cultivaron adicionalmente en condiciones de crecimiento estándar (condiciones de agitación a 37 °C) durante 24 h. Luego, las células tratadas se centrifugaron y se lavaron en PBS 3-4 veces. Luego, las células se dispersaron en 100 microlitros de PBS y luego se tomaron imágenes en un microscopio de fluorescencia/confocal.

Además, se pueden utilizar diferentes proteínas como AlbG (SEQ ID NO: 1), EfsQNR (SEQ ID NO: 2) marcadas con un tinte fluorescente verde (A-520) fueron absorbidas por varias cepas de bacterias resistentes a los medicamentos (Pseudovibrio sp. Ad37/5/13/14 y Enterobacter, en las que la cepa Enterobacter sp. es resistente a los antibióticos como eritromicina, cloranfenicol, tetraciclina, ácido nalidíxico, kanamicina y penicilina), células de levadura (Saccharomyces cerevisiae, Kluveromyces marxianus y candida albicans), células vegetales (Arabidopsis), embriones de pez cebra y embriones de drosophila observados mediante microscopía de barrido láser confocal.

Protocolo de absorción en bacterias y células de levadura:

• Se inocularon las respectivas bacterias y cepas de levadura el día anterior al experimento y se dejaron crecer durante la noche;

• Las células se centrifugaron y se añadieron 2 ml de medio nuevo;

• A la mezcla se le añadieron 100-200 pl de células;

• Se añadieron 10 pM de CPP marcado en verde;

• Se añadió medio nuevo para llevar el volumen a 1 ml;

• Después de 24 horas, las células tratadas se centrifugaron y se lavaron en PBS 3-4 veces;

• las células se dispersaron en 100 microlitros de PBS y luego se tomaron imágenes en un microscopio de fluorescencia/confocal (Figuras 25 y 26).

Protocolo de absorción en células vegetales (Arabidopsis):

• Las plantas se cultivaron durante 7 días antes del experimento;

• 20 pM de diferentes proteínas de penetración celular como AlbG (SEQ ID NO: 1), EfsQNR (SEQ ID NO: 2) se agregaron a las plantas marcadas con un tinte fluorescente verde (A-520) en tampón [3 plantas cultivadas durante 7 días] en 500 pl de PBS;

• La mezcla se colocó en una sala de crecimiento durante 24 horas en condiciones de crecimiento estándar (mantenidas estáticas en una sala con suministro continuo de luz y temperatura de 23 °C);

• Las plantas se lavaron con PBS 3 veces y luego se añadió PBS fresco y las células se visualizaron al microscopio. Se eligieron células no coloreadas, como las células de las raíces y los tallos, para la visualización para evitar interferencias (Figuras 23 y 24).

Protocolos de absorción en embrión de pez cebra y embrión de drosophila:

• Se recogieron embriones de pez cebra y drosophila y se lavaron en PBS

• 10 pM de diferentes proteínas de penetración celular como AlbG (SEQ ID NO: 1), EfsQNR (SEQ ID NO: 2) se añadieron marcados con un tinte fluorescente verde (A-520) al vial que contenía los embriones y se incubaron durante<2>h;

• Los embriones se recogieron, se lavaron con PBS tres veces y se dispersaron en PBS y se colocaron en cubreobjetos de vidrio y se visualizaron al microscopio (Figuras 27 y 28).

Estos resultados dan una indicación de que el CPP de la presente invención puede transferir cargas al citoplasma de una amplia variedad de tipos de células cruzando la membrana celular y/o la pared celular. Esto abre la posibilidad de conjugar el CPP con antibióticos como la ciprofloxacina y la penicilina o cualquier otro antibiótico mediante el uso de la química de acoplamiento de ácido activado (EDC/NHS) para conjugar los grupos carboxilato (-COOH) de los fármacos y los grupos amina del CPP (de los residuos de lisina). Estas reacciones son bien conocidas en la literatura y en los libros de texto (Referencia: Bioconjugate Techniques páginas 264-265 por Greg T Hermansen). Uso de enlazadores tales como dihidrazida de ácido adípico,<6>-hidrazinonicotinato de succinimidilo acetona hidrazina,<6>-hidrazinonicotinato de C<6>-succinimidilo acetona hidrazina, clorhidrato de nicotinato de succinimidilo hidrazinio para conjugar CPP con antibióticos. Se sabe que estos conectores son hidrolizables en condiciones intracelulares para liberar los antibióticos dentro de las células.

El conjugado de antibiótico-CPP mejoraría la eficiencia de la absorción celular en comparación con el antibiótico no conjugado y reduciría o eliminaría la expulsión del fármaco a través de mecanismos celulares, como las glicoproteínas. El sitio de unión de las glicoproteínas está en la región de <1 kDa, mientras que los conjugados de CPP-fármaco tienen un tamaño de 48 KDa. Esto podría ayudar a mejorar los antibióticos antiguos y contribuir a abordar el problema de la resistencia a los medicamentos antimicrobianos. De manera similar, la técnica se puede utilizar para mejorar la eficiencia de la administración de antibióticos/pesticidas/nutrientes en peces y plantas.

Ejemplo 5

Captación celular de fármaco. Se usaron células HeLa para determinar la absorción mejorada del fármaco usando el conjugado de penetración celular de la presente invención. Se sembraron células HeLa a una concentración de 10000 en una placa de 96 pocillos y se dejaron crecer durante<6>a<8>horas. El complejo de rutenio metálico y EfsQNR se mezclaron en diferentes proporciones de 1:1, 1:2 y 1:3 para formar un conjugado, que posteriormente se añadió a las células. El conjugado formado de rutenio y EfsQNR en una proporción de 1:2 produjo un resultado mejorado. La muerte celular después de 24 horas se controló mediante el ensayo MTT como se describió anteriormente y se correlacionó con el porcentaje de absorción del conjugado rutenio-EfsQNR por las células HeLa.

Resultados de los ejemplos 1 a 5

Caracterización de proteínas y conjugados.

Especificidad estructural. El tamaño de la proteína AlbG se determinó a partir de la estructura cristalina publicada pdb id: 2xt2.pdb. Midiendo la distancia de los átomos de un extremo a otro de una estructura dimérica en Pymol®, se determinó que la longitud era de 10.7 nm y el ancho (diámetro) de 2.6 nm. La carga formal total fue -27. Hay residuos de carga positivos y negativos dispuestos alternativamente: Presencia de una escalera de arginina (total de 20 residuos Arg), lisina (14 residuos) y ácido aspártico (30 residuos Asp) y ácido glutámico (31 residuos Glu). La asparagina (20 residuos de Asn) se extiende a lo largo de la superficie de la proteína.

El tamaño de la proteína EfsQNR se determinó a partir de la estructura cristalina publicada pdb id: 2w7z.pdb. Midiendo la distancia de los átomos de un extremo a otro de la estructura dimérica en Pymol®, se determinó que la longitud de la proteína era de 10.9 nm y el ancho (diámetro) de 2.8 nm. Cargo formal total -41. Residuos de carga positivos y negativos dispuestos alternativamente: Presencia de una escalera de arginina (total de 16 residuos Arg), lisina (12 residuos) y ácido aspártico (25 residuos Asp) y ácido glutámico (33 residuos Glu). La asparagina (33 residuos de Asn) se extiende a lo largo de la superficie de la proteína.

A modo de comparación, el tamaño de la proteína TtCuA se determinó a partir de la estructura cristalina publicada pdb id: 2CuA.pdb. Al medir la distancia de los átomos de la estructura de un extremo a otro en Pymol®, se determinó que la longitud era de 3.3 nm y el ancho (diámetro) de 1.9 nm. La estructura comprende 5 residuos de arginina, 4 residuos de lisina, 9 residuos de ácido glutámico y<6>residuos de asparagina con una carga total de -3.

La Figura 1 muestra los espectros de CD de la proteína AlbG purificada (SEQ ID NO: 1) utilizado para el estudio. La proteína se dializó en PBS y se usó una concentración de 1 a 5 micromolar para medir la espectroscopia de CD en la región de 200 a 300 nm. Se realizó una dilución adicional con PBS cuando fue necesario. El valor negativo de CD a<22 0>nm para esta proteína indica la disposición de las láminas p (estructuras de barril p o de hélice p).

La Figura 2 muestra los plásmidos purificados utilizados para expresar proteínas helicoidales p, AlbG y EfsQNR, cada uno de los cuales muestra resultados idénticos por triplicado (AlbG-1 a AlbG-3 y EfsQNR-1 a EfsQNR-3).

La Figura 3 muestra las bandas de proteínas purificadas de las proteínas AlbG y EfsQNR en un gel de poliacrilamida. Después de realizar electroforesis en gel s Ds , se observó que el peso molecular de ambas proteínas en formas monoméricas era de aproximadamente 30 kDa. El peso molecular aproximado en formas dímeras de AlbG y EfsQNR es de alrededor de 48 kDa. Las proteínas AlbG y EfsQNR se utilizaron para formar un conjugado con una molécula funcional, que luego se utilizó para estudiar la eficacia de penetración celular. Las proteínas se analizaron adicionalmente para detectar cualquier citotoxicidad utilizando células HeLa para determinar el curso del estudio (consulte “Estudios de citotoxicidad” a continuación).

La Figura 4 muestra el resultado de un análisis de espectrometría de masas MALDI TOF de la proteína EfsQNR y la proteína AlbG. Para este experimento, la proteína se dializó en agua y la muestra se preparó usando ácido sinápico como matriz con TFA al 0.1 % y acetonitrilo. Se utilizaron 1-10 micromolar de proteína. Los resultados muestran que la proteína EfsQNR tiene un peso molecular de aproximadamente 26.5 kDa y la proteína AlbG tiene un peso molecular de aproximadamente 23 kDa.

Estudios de citotoxicidad

Se empleó el ensayo MTT como se describió anteriormente para estudiar la toxicidad de las proteínas AlbG y EfsQNR contra las células HeLa. Para el ensayo de toxicidad, se utilizaron muestras de Placebo, control, AlbG (30<j>M) y EfsQNR (30<j>M) por triplicado. La Tabla 1 muestra los valores de absorbancia a 570 nm de cada muestra después del tratamiento con MTT Al observar los valores, se puede apreciar que las células tratadas con 30 j M de AlbG y 30 j M de EfsQNR presentan una viabilidad del 95 % en comparación con las células de control. Esto sugiere claramente que la proteína probada en la concentración probada no es tóxica para las células HeLa y, por lo tanto, es una concentración segura para usar en experimentos posteriores.

La Tabla 1 presentada aquí muestra los valores de absorbancia a 570 nm en el ensayo MTT para evaluar la toxicidad de las proteínas:

Tabla 1:

El placebo para este experimento fue tampón Tris 20 mM de pH 8.0, mientras que el control considerado fue solo células HeLa sin agregar ninguna proteína u otro sustrato.

Estudios de etiquetado

La Figura 4 muestra la espectrofotometría visual UV de los conjugados AlbG y EfsQNR marcados mediante el procedimiento mencionado anteriormente (consulte “Etiquetado de proteínas con tintes fluorescentes” más adelante). Se analizó el espectro visual UV para calcular la relación de etiquetado de ambos conjugados. La relación de etiquetado significa la cantidad de colorantes unidos por molécula de proteína. Esto se calcula midiendo la relación entre los valores de absorbancia del tinte (a una longitud de onda que depende del tinte utilizado para el etiquetado) y la absorbancia de la proteína a 280 nm. El tinte utilizado para marcar en este experimento fue NHS-cumarina. En el caso de la proteína AlbG, se observa que la relación colorante:molécula de proteína es 1.95. En el caso de EfsQNR, la relación colorante: molécula de proteína es 5.5. Los espectros UV-vis confirmaron el marcado de las proteínas AlbG y EfsQNR con colorante NHS-cumarina. Las proteínas marcadas se utilizaron además para establecer la penetración celular en este estudio.

Estudios de penetración celular.

La Figura 5 muestra las imágenes microscópicas de fluorescencia de células HeLa tratadas con proteínas AlbG, EfsQNR y TtCuA marcadas con NHS-C (conjugados). La ingesta de proteínas marcadas (conjugados) se comparó con las células HeLa no tratadas que se consideraron como conjunto de control para este estudio. Hoechst Blue es un tinte de marcado nuclear que se utiliza junto con el tinte NHS-C que se utiliza para marcar las proteínas. Las proteínas AlbG y EfsQNR son proteínas helicoidales p con una longitud en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y una anchura en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm, que representa la proteína p helicoidal recombinante de la presente invención. Sin embargo, TtCuA es una proteína de aproximadamente 4 nm de longitud y está compuesta de hebras p que forman barriles p, lo que representa un ejemplo comparativo de la proteína p helicoidal recombinante de la presente invención. Estas dos categorías diferentes de proteínas se consideraron para este estudio para establecer la capacidad superior de penetración celular del conjugado de la presente invención en comparación con diferentes tipos de proteína p helicoidal.

En la Figura 5, el panel A representa las células de control que se tratan solo con tinte de marcado nuclear (Azul Hoechst), lo que significa la falta de tinte más claro, el panel B representa las células tratadas con tinte Azul Hoechst y con proteína marcada con TtCuA-NHSC (conjugado) el panel C representa las células tratadas con tinte azul Hoechst y proteína marcada con AlbG-NHSC (conjugado) y el panel D representa las células tratadas con tinte azul Hoechst y proteína marcada con EfsQNR-NHSC (conjugado). Al observar la figura, se puede apreciar que se puede observar significativamente menos fluorescencia dentro de las células como se muestra en el panel B, lo que significa menos presencia de conjugado TtCuA-NHSC dentro de estas células, mientras que se puede ver una mayor fluorescencia dentro de las células representadas en el panel C y el panel D significa una mayor presencia de conjugado AlbG-NHSC y conjugado EfsQNR-NHSC dentro de las células. Por lo tanto, se puede apreciar que el conjugado TtCuA-NHSC no es capaz de penetrar eficazmente la membrana celular para ingresar al interior de las células en comparación con el conjugado AlbG-NHSC y el conjugado EfsQNR-NHSC.

Al comparar los paneles C y D, se puede observar que el conjugado EfsQNR-NHSC es capaz de penetrar la membrana de manera más eficiente en comparación con el conjugado AlbG-NHSC. Por lo tanto, la capacidad de penetración celular de los tres conjugados se puede resumir en un orden creciente de absorción celular como TtCuA-NHSC <AlbG-NHSC <EfsQNR-NHSC. Esto prueba además la capacidad de penetración celular del conjugado que comprende una proteína p helicoidal recombinante de longitud y anchura en el intervalo de 5 nm-25 nm, adecuadamente, 10 nm-15 nm y la anchura está en el intervalo de 1 nm-5 nm, adecuadamente 1 nm-3 nm respectivamente. Los conjugados que comprenden independientemente AlbG y EfsQNR pueden mostrar una permeabilidad celular mejorada en comparación con el conjugado que comprende TtCuA.

Dado que el conjugado que comprende la proteína EfsQNR mostró la mayor capacidad para penetrar la membrana celular, la proteína EfsQNR se estudió más a fondo con diferentes tintes para mejorar el etiquetado de células de mamíferos.

La Figura 22 muestra el proceso de entrada celular en tiempo real mediante la interacción directa del conjugado con la membrana celular. Para visualizar las células bajo microscopía de fluorescencia, se trataron con el tinte Hoechst 33342 (azul, que aparece oscuro en la Figura 22) que se une al núcleo y el tinte Alexa 594-WGA (rojo, que aparece más claro en la Figura 22) que se une a la membrana plasmática indica que EfsQNR-ATTO-520NHS (verde, que aparece como círculos claros en la Figura 22) penetra eficientemente en el interior de la célula mediante un mecanismo directo evitando cualquier mecanismo endocítico.

Etiquetado de células de mamíferos.

La Figura 7 representa la capacidad de un conjugado que comprende EfsQNR conjugado con un tinte para marcar células HeLa. La Figura<6>representa las células marcadas con EfsQNR-ATTO-520NHS preparadas de acuerdo con el método de etiquetado anterior. El tinte Hoechst 33342 (azul, que aparece oscuro en la Figura 7) se une al núcleo y el tinte Alexa 594-WGA (rojo, que aparece más claro en la Figura 7) se une a la membrana plasmática. El conjugado se forma uniendo la proteína EfsQNR con un tinte fluorescente verde ATTO-520NHS (que aparece como el tinte más claro en la Figura 7). Se puede observar claramente que el conjugado EfsQNR-ATTO-520NHS penetra en las células HeLa para conducir a un marcaje eficaz (Panel B) de las células en comparación con el panel de control A que muestra células HeLa que no se tratan con el conjugado.

La Figura<8>muestra un resultado similar para células HeLa tratadas con el conjugado formado uniendo la proteína EfsQNR con un tinte fluorescente azul ATTO-390NHS. (aparece más claro en la Figura<8>)

La Figura 9 muestra un resultado similar para células microgliales marcadas con EfsQNR-ATTO-520NHS que se preparó de acuerdo con el método de marcado anterior. El panel A muestra una fluorescencia significativa del tinte desde el interior de las células. El panel B muestra células microgliales tratadas adicionalmente con el tinte Hoechst 33342 (azul, que aparece oscuro en la Figura 9) que se une al núcleo y el tinte Alexa 594-WGA (rojo, que aparece más claro en la Figura 9) que se une a la membrana plasmática lo que indica que EfsQNR-ATTO-520NHS ha penetrado eficientemente en el interior de la célula.

La Figura 10 representa un resultado similar para células de queratinocitos marcadas con el conjugado EfsQNR-ATTO-520NHS que se preparó de acuerdo con el método de marcaje anterior. El panel A muestra una fluorescencia significativa del tinte desde el interior de las células. El panel B muestra células de queratinocitos tratadas adicionalmente con el tinte Hoechst 33342 (azul, que aparece oscuro en la Figura 10) que se une al núcleo, lo que indica que EfsQNR-ATTO-520NHS ha penetrado eficientemente dentro de la célula para estar presente cerca del núcleo.

La Figura 11 representa un resultado similar para células SH-SY5Y marcadas con el conjugado EfsQNR-ATTO-520NHS que se preparó de acuerdo con el método de marcaje anterior.

La Figura 12 representa un resultado similar para células ES de ratón marcadas con EfsQNR-ATTO-520NHS que se preparó de acuerdo con el método de marcaje anterior. La Figura 12 muestra células ES de ratón tratadas con el tinte Hoechst 33342 (azul, que aparece oscuro en la Figura 12) que se une al núcleo y el tinte Alexa 594-WGA (rojo, que aparece más claro en la Figura 12) que se une a la membrana plasmática lo que indica que EfsQNR-ATTO-520NHS ha penetrado eficientemente en el interior de la célula.

Etiquetado de células de no mamíferos.

Las Figuras 13 a 14 y 21 a 28 representan la capacidad de un conjugado que comprende EfsQNR conjugado con un colorante para marcar células bacterianas (E coli y Pseudovibrio AD37), células de levadura (kluveromyces y Sachromyces sp.), células vegetales (Arabidopsis sp.), Células de insecto (embrión de Drosophila) y células de pez (embrión de pez cebra). Las Figuras 13 a 14 y 21 a 28 representan respectivamente células de E coli, Pseudovibrio AD37, kluveromyces, Sachromyces sp, Arabidopsis sp, embrión de Drosophila y embrión de pez cebra marcadas con EfsQNR-ATTO-520NHS preparadas de acuerdo con el método de marcaje anterior.

Clasificación FACS de células HeLa tratadas con el conjugado

La Figura 15 muestra los resultados de la clasificación FACS estándar de células HeLa tratadas con un conjugado marcado con el conjugado EfsQNR-ATTO-647N. El tratamiento de las células durante sólo 10 minutos (Panel B) conduce a una absorción significativa del tinte en comparación con el control (Panel A), que continúa aumentando en 1 h (Panel C) hasta el máximo medido de 3 h (Panel D).

Estudios de absorción de fármacos.

La Figura 16 muestra la absorción celular del complejo metálico de rutenio Ru(CO)<3>Glicinato de Cl en células HeLa. El complejo de rutenio metálico se conjugó con la proteína EfsQNR para formar un conjugado que consiste en complejo de rutenio metálico-EfsQNR. Las células HeLa se trataron con el conjugado complejo de rutenio metálico-EfsQNR como se describió anteriormente (consulte “Estudios de penetración celular” más adelante) y la absorción del complejo se detectó verificando la viabilidad de las células realizando un ensayo MTT como se describió anteriormente. Al observar el gráfico (Figura 14), se puede apreciar que con el tratamiento solo con complejo de rutenio metálico, la absorción celular es solo del 0.5 %, mientras que con el tratamiento con complejo de rutenio metálico-conjugado de proteína EfsQNR la absorción celular del complejo aumenta a 24.4 %. Por lo tanto, se puede determinar que el conjugado que comprende la proteína EfsQNR facilitó una absorción celular 50 veces mayor en comparación con el complejo de rutenio metálico solo. Esta absorción mejorada se puede aprovechar aún más utilizando el conjugado de la presente invención para administrar muchos fármacos que salvan vidas al objetivo, reduciendo así la dosis del fármaco y posteriormente disminuyendo los efectos secundarios.

La Figura 17 muestra los resultados de un estudio de viabilidad de células de mamíferos (HeLa y HepG2) cultivadas con un conjugado que comprende la proteína EfsQNR unida al fármaco de quimioterapia, cisplatino® (cisplatino o cisdiaminodicioroplatino(N) (CDDP)) etiquetado como 'CYDD' en la Figura 17. Células de mamífero (HeLa: Panel A; o HepG2: El panel B) se cultivó utilizando el protocolo estándar. Se sembraron un millón de células en placas confocales (placa de 1 cm) y se cultivaron durante<8>h. Un conjugado que comprende cisplatino® Luego se añadió EfsQNR (preparado de acuerdo con el método descrito anteriormente en una proporción molar de<2>:<1>) y el cultivo se mantuvo a temperatura ambiente durante 15 minutos. Las células se mantuvieron en condiciones de crecimiento estándar durante 24 h y 72 h. Luego las células se lavaron con PBS y se añadió solución de MTT Una vez formados los colorantes de formazán, se disolvieron en DMSO y se midió la absorbancia a 550 nm. De los resultados se desprende que en ambos tipos de células se probó una eficacia citotóxica similar del cisplatino® se demuestra con una dosis más baja cuando el fármaco se administra como un conjugado de acuerdo con la presente invención.

Cabe señalar que en todos los experimentos en los que se probaron, se obtuvieron resultados similares cuando la proteína EfsQNR se reemplazó con la proteína AlbG.

Ventajas

En general, se puede concluir que un conjugado que comprende una proteína p helicoidal recombinante de longitud y anchura específicas y una molécula funcional puede actuar como un conjugado altamente eficaz que penetra la membrana celular. La capacidad del conjugado para penetrar directamente la membrana celular proporciona ventajas en comparación con el mecanismo de entrada endocítico. En la presente divulgación se proporcionan ejemplos de trabajo de los conjugados AlbG-NHSC y EfsQNR-NHSC que demuestran su capacidad para penetrar la membrana celular. Se ha demostrado que el conjugado EfsQNR-tinte mejora la capacidad de marcaje de una variedad de células de mamíferos y no mamíferos debido a su capacidad para penetrar eficazmente la membrana celular. Se ha demostrado que el conjugado que comprende EfsQNR y/o AlbG aumenta la absorción celular de fármacos, incluidos los complejos de rutenio metálico y cisplatino® en células HeLa y HepG2. Esta capacidad puede explotarse aún más para elevar la absorción de diferentes fármacos anticancerígenos por parte de las células cancerosas, lo que puede facilitar el tratamiento al atacar selectivamente las células cancerosas de manera eficiente y simultáneamente con una necesidad reducida del fármaco. La reducción de la dosis de fármacos contra el cáncer también puede evitar los efectos secundarios asociados con la administración de dichos fármacos.

Ejemplos - Molécula que penetra en las células con ácido nucleico

En los párrafos siguientes, se proporcionan ejemplos de trabajo para administrar un ácido nucleico, tal como un plásmido, que tiene un gen de interés dentro de la célula al penetrar la membrana celular. La administración es posible gracias al uso de un conjugado (un péptido que penetra en las células como se describe en el presente documento), que comprende además una molécula de ácido nucleico o un plásmido. Los ejemplos también representan la expresión del gen de interés después de atravesar la membrana celular para ingresar al interior de la célula.

Un primer ejemplo describe la transfección de un gen de interés en una célula usando una realización del conjugado de la presente invención, en la que el gen de interés es mcherry que codifica RFP (Proteína Fluorescente Roja). El plásmido que contiene el gen mcherry está unido a una proteína para formar un conjugado, en el que el conjugado comprende proteína EfsQNR y fenantrolina de cobre [II]. El conjugado se utiliza para transfectar células HeLa. La expresión exitosa del gen mcherry en células HeLa se muestra como una prueba de concepto para establecer la capacidad del conjugado para penetrar la membrana celular y transfectar las células.

Material y métodos

Se adquirió comercialmente el complejo de fenantrolina de cobre.

Ejemplo<6>

Estudios de proteínas - Los estudios que rigen la expresión del plásmido EfsQNR, las condiciones de incubación y purificación se siguieron como se publicó anteriormente (Hegde et al. Antimicrobiano. Agentes y Chemother. 2011: 55(1):10-7) para obtener la proteína EfsQNR. La SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida) se realizó utilizando el kit Bio-Rad y las bandas de proteínas se visualizaron utilizando gel de poliacrilamida al 12 %.

Ejemplo 7

Preparación de un conjugado de plásmido - enlace cobre [II] fenantrolina

Como se divulga en la presente invención, se prepara un conjugado para transfectar células, el conjugado EfsQNR (SEQ ID NO: 2), comprende fenantrolina de cobre [II] y un plásmido que tiene un gen de interés.

La Figura 18 representa un mapa vectorial del plásmido que porta el gen mcherry (SEQ ID NO: 25), usado en la preparación del conjugado en el presente ejemplo. Proteína EfsQNR (SEQ ID NO: 2) es una proteína p helicoidal que tiene una repetición pentapeptídica (como se representa en SEQ ID NO: 18) que tiene una longitud en el intervalo de 5 nm a 25 nm, adecuadamente de 10 nm a 15 nm y una anchura en el intervalo de 1 nm a 5 nm, adecuadamente de 1 nm a 3 nm. La fenantrolina de cobre [II] es un agente intercalante de ácido nucleico usado como conector en el presente ejemplo.

La proteína EfsQNR obtenida gobernando la expresión del plásmido EfsQNR se formó un complejo con un complejo de fenantrolina de cobre [II] para obtener un complejo que comprende EfsQNR y fenantrolina de cobre [II]. El complejo obtenido se hizo reaccionar además con un plásmido que tenía el gen mcherry para obtener un conjugado de acuerdo con una realización de la presente invención. El conjugado obtenido se utilizó para transfectar células HeLa.

La Figura 19 muestra dos esquemas para preparar el conjugado que puede usarse para la transfección. El esquema 1 sugiere el uso de fenantrolina de cobre [II] como conector que forma un complejo con una proteína. El complejo obtenido se hace reaccionar además con un plásmido que tiene un gen de interés para obtener el conjugado que se utilizará para la transfección.

El esquema 2 sugiere el uso de una proteína de unión al ADN como conector que forma un complejo con una proteína. El complejo obtenido se hace reaccionar además con un plásmido que tiene un gen de interés para obtener el conjugado que se utilizará para la transfección.

En el presente ejemplo, se usa fenantrolina de cobre [II] como conector para formar un complejo y una proteína p helicoidal recombinante - EfsQNR (SEQ ID NO: 2) se utiliza junto con un plásmido que contiene el gen mcherry. Se utilizó el siguiente protocolo para preparar el complejo y el conjugado:

La proteína EfsQNR se mezcló con fenantrolina de cobre [II] en una proporción molar de 1:2 y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente para obtener el complejo. El plásmido que contenía el gen mcherry se mezcló con el complejo obtenido en la etapa anterior y se incubó durante 30 minutos a 4 °C para obtener el conjugado. El conjugado así obtenido se usó para transfectar células HeLa.

Ejemplo<8>

Transfección de células HeLa usando el conjugado del Ejemplo 7

La Figura 20 representa un esquema para el experimento de transfección usando el conjugado obtenido en el Ejemplo 7. En el presente ejemplo se utilizaron las siguientes condiciones para realizar el experimento de transfección.

El conjugado que comprende el plásmido mcherry obtenido en el Ejemplo 7(A) se añadió a células HeLa<( 8>horas después de la siembra). Se permitió que las células crecieran incubando a 37 °C y condiciones de 5 % de CO<2>durante 48 horas. Después de la incubación, las células se observaron bajo microscopía confocal.

La Figura 21 muestra imágenes de microscopía confocal de células HeLa después del experimento de transfección. La expresión de RFP se puede observar como puntos más claros (rojos) dentro de las células HeLa, lo que demuestra la penetración celular y la capacidad de transfección del conjugado divulgado en el presente documento.

Ejemplo 9

Preparación de un conjugado de plásmido - enlace etilendiamina

Como se describe además en la presente invención, se preparó un conjugado para transfectar células con un plásmido típico para codificar una o más moléculas de edición de genes. El conjugado comprendía EfsQNR (SEQ ID NO: 2), un conector de etilendiamina y un plásmido. El conjugado se preparó de acuerdo con un protocolo conocido (Ref: Bioconjugate Techs de; Greg T Hermansen; Academic Press; 3a edición; 2013; págs. 264-265). El plásmido utilizado fue un ADN plasmídico circular marcado en rojo de 2.7 kb (Etiqueta IT® Control de entrega de plásmido Cy®3 (Código de producto MIR 7904), obtenido de Mirus Bio).

Ejemplo 10

Transfección de células MCF7 usando el conjugado del Ejemplo 9

El conjugado que comprende el plásmido [Etiqueta IT® Control de entrega de plásmido Cy®3 (Código de producto MIR 7904) obtenido en el Ejemplo 9 se añadió a células MCF-7<( 8>horas después de la siembra). Se permitió que las células crecieran incubando a 37 °C y condiciones de 5 % de CO<2>durante 12-16 horas. Después de la incubación, las células se observaron bajo microscopía confocal.

La Figura 30 muestra los resultados de un experimento de transfección en células MCF7 usando (A) el conjugado obtenido en el Ejemplo 1 (EfsQNR) (SEQ ID NO: 2) y un ADN plasmídico circular marcado en rojo de 2.7 kb, obtenido comercialmente de Mirus Bio (código de producto MIR 7904) y (B) plásmido de control marcado en rojo como se usó anteriormente en ausencia de conjugado. (i) muestra la proyección máxima de las células después de la incubación; (ii) imagen correspondiente a las gráficas de intensidad de las células después de la incubación; y (iii) muestra las gráficas de intensidad de las células después de la incubación.

En las imágenes de proyección máxima (i), se puede ver claramente que el plásmido es capaz de extenderse mucho mejor por toda la célula cuando se conjuga con la proteína EfsQNR. Esto muestra la eficacia del conjugado para transportar y localizar ácidos nucleicos diana, como plásmidos, en las células.

De los gráficos de intensidad (iii) queda claro que el plásmido pudo ingresar a las células con la ayuda de proteínas y la propagación es homogénea y generalizada.

Aunque los ejemplos presentados en el presente documento muestran el uso de la proteína EfsQNR (SEQ ID NO: 2) en la preparación de un conjugado para transfección, las proteínas que tienen la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO: 1 y SEQ I<d>NO: 3 a SEQ ID NO: 12 también se puede utilizar eficazmente para formar el conjugado. Además, proteínas p helicoidales recombinantes que tienen una secuencia repetida de pentapéptido como se representa en SEQ ID NO: 18 y que tiene una longitud en el intervalo de 5 nm a 25 nm, adecuadamente, 10 nm a 15 nm y un ancho en el intervalo de 1 nm a 5 nm, adecuadamente, se puede usar 1 nm a 3 nm para preparar el conjugado como se describe en la presente divulgación. De manera similar, el presente ejemplo representa el uso de fenantrolina de cobre [II] o etilendiamina como conector, pero también se pueden usar otras moléculas como proteína de unión al ADN, conjugado metálico, conjugado metálico de fármaco y otras moléculas intercalantes de ácido nucleico en la formación de un conjugado para ser utilizado eficazmente como agente de transfección. También se puede utilizar para formar el conjugado una clase de proteína de unión a ADN, a saber, proteína con dedos de zinc que tiene un peso molecular inferior a 12 kDa. Una de dichas proteínas con dedos de zinc que se puede utilizar como conector se ha representado en la SEQ ID NO: 24. En la presente divulgación, se ha utilizado un plásmido (Figura 18) que porta el gen mcherry y un ADN plasmídico circular marcado en rojo de 2.7 kb para preparar conjugados para la transfección, y la expresión del gen mcherry se ha demostrado como una prueba de concepto. Se contempla que esencialmente cualquier ácido nucleico o plásmido que comprenda un gen de interés para fines de transfección pueda formar complejos con el complejo como se divulga en el presente documento para formar el conjugado para uso en terapia génica o edición de genes.

Ventajas

La presente divulgación proporciona un conjugado que comprende un ácido nucleico o plásmido que comprende un gen de interés que posee la capacidad de penetrar la membrana celular y expresar el gen de interés. Por lo tanto, el conjugado puede usarse para la transfección y tiene un inmenso potencial para usarse en terapia génica y edición genética. Como se sabe que la entrega de ácidos nucleicos y plásmidos que comprenden el gen a las células es un desafío importante en el campo de la terapia génica y la edición genética, el conjugado divulgado abre una nueva vía en este campo. El conjugado divulgado es sencillo de preparar y puede formar complejos con una amplia variedad de ácidos nucleicos y plásmidos que comprenden genes que se utilizarán para terapia génica y edición de genes.

Ejemplo 11

Transfección de maquinaria molecular de edición de genes con un CPP de la presente invención

Se realizó un experimento de transfección en células de mamífero utilizando el conjugado obtenido en el Ejemplo 1 (EfsQNR: SEQ ID No. 2) y un complejo de edición de genes, CRISPR-RNP basado en la endonucleasa Cas9. Los resultados proporcionados en la Tabla 2 se representan en la Figura 29. Se contempla, basándose en los resultados del Ejemplo 4 anterior, que la aplicación de la técnica es aplicable a una amplia variedad de células, incluidas células de bacterias, células de levadura, células de plantas, células de insectos y células de peces.

Tabla 2:

En una realización de la presente invención, se usaron las siguientes condiciones para realizar el experimento de transfección.

Estrategia: Se ha informado de la edición de genes en células mediante varios métodos diferentes. Un ejemplo particularmente relevante administra el complejo de ribonucleoproteína (RNP) de la endonucleasa, como Cas9, y gRNA a las células. Esta metodología es particularmente atractiva ya que no se requiere una síntesis intracelular intermedia de la maquinaria de edición de genes.

Actualmente se utilizan varios métodos, como la electroporación, la microinyección, las nanopartículas y la administración mediada por lípidos catiónicos, para introducir la maquinaria de edición de genes en el citoplasma de la célula, desde donde puede migrar al genoma.

En una realización, la presente invención utiliza interacciones electrostáticas entre Cas9, ARNg y CPP para transportar el RNP de ARNg de Cas9 (CRISPR-RNP) al interior de las células. También se contempla el uso de un conjugado en el que los diversos componentes están unidos mediante interacciones covalentes y/o no covalentes.

Las células (HEK 293) que expresan eGFP se transfectan con CRISPR-RNP que tiene ARNg específico para eGFP La absorción de CRISPR-RNP estará mediada por el CPP de la presente invención, que puede transportar carga de manera eficiente a las células (Ejemplo 4). Después de la captación celular, ya sea disociada o no inhibida por el CPP, el ARNg dirigirá Cas9 a su secuencia de ADN objetivo, eGFP La desactivación de este gen y, por tanto, la pérdida de fluorescencia en las células es prueba de un método de administración eficiente y eficaz para el complejo de edición de genes.

Para obtener una línea celular estable que exprese eGFP, se utiliza un proceso de selección que utiliza el antibiótico G418. Las células que expresan eGFP y, por tanto, que han adoptado el plásmido eGFP, también conferirán resistencia al antibiótico G418. Las células que no han absorbido el plásmido eGFP no tienen resistencia a G418 y, por lo tanto, durante un período de tiempo morirán cuando se mantengan en medios de selección.

Experimental: Las células (HEK 293) que expresan eGFP (proteína fluorescente verde mejorada) se obtienen transfectando células HEK293 con eGFP utilizando reactivos comerciales basados en lipofectamina. Las células se cultivan durante 48 horas para obtener un 70-80 % de células transfectadas por eGFP Las células se subcultivan y se cultivan en medios de selección que contienen antibiótico G418 para hacer que las células HEK 293 expresen de manera estable eGFP antes de usarlas para los experimentos de edición de genes.

Se siembran aproximadamente 5000 células en una placa de 96 pocilios y se cultivan durante la noche el día 1. El día 2 se formó el complejo Cas9-gRNA-CPP (CRISPR-RNP-CPP) en dos etapas:

Etapa 1: Cas9 se mezcló con ARNg en i) solución salina tampón fosfato (PBS) o ii) en el tampón de reacción que se suministró con Cas9 disponible comercialmente (Genaxxon Biosciences: Cas9-NLS-tagRFP Streptococcus (S.) pyogenes Proteína Cas9 NLS seguida de una secuencia de etiqueta de proteína fluorescente roja Terminal C (tagRFP); Número de producto: S5306.0010; No. SA: 35040090). El tampón de reacción actúa para estabilizar el complejo Cas9 y RNP Luego la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 25 minutos para formar el complejo CRISPR-RNP; Etapa 2: Se añadió 1 microM de CPP en PBS a la mezcla Cas9-gRNA obtenida en la etapa 1 y se incubó a temperatura ambiente durante otros 30 minutos para formar el complejo CRISPR-RNP-CPP;

Etapa 3: El complejo CRISPR-RNP-CPP obtenido en la etapa 2 se agrega a las células en medio (Medio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), con o sin suero; ej. Sigma) y las células se cultivan durante 4 h. Después de 4 h, se añadió medio (DMEM con suero) a las células y se dejó crecer en condiciones de crecimiento celular estándar (temperatura de 37 °C y 5 % de CO<2>) durante 48 h. Después de 48 h, las células se lavaron con PBS y se añadió medio nuevo (DMEM con suero) y se midió la intensidad de la fluorescencia debida a eGFP en un lector de placas de fluorescencia.

Resultados en células HEK293 de riñón de mamífero

El CPP de la presente invención ayuda a la administración eficiente de CRISPR-RNP al interior de la célula. Después de la captación celular, el ARNg dirige Cas9 a su secuencia de ADN objetivo de eGFP. La eliminación de este gen por parte de Cas9 provoca la pérdida de fluorescencia en las células.

El uso de un medio sin suero en la etapa 3 y un tampón de reacción en la etapa 1 (como se proporciona en la fuente comercial para disolver Genaxxon Cas9 y gRNA; Producto No. S5306.0010) dio como resultado una reducción del 30 % en la fluorescencia, lo que indica una transferencia eficiente del CRISPR-RNP al interior de la célula.

Cuando se utiliza PBS (solución salina tampón fosfato) para disolver el complejo CRISPR-RNP no se observó ningún cambio significativo en la intensidad de la fluorescencia.

Sin desear quedar ligado a ninguna teoría, se postula que PBS no es capaz de estabilizar la formación del complejo entre CRISPR-RNP y el CPP

Ejemplo 12

Transfección de endonucleasa cas9 marcada fluorescentemente con una proteína p-helicoidal recombinante de la presente invención

La Figura 31 representa los resultados de un experimento de transfección en células MCF-7 usando el conjugado obtenido en el Ejemplo 1 (EfsQNR: SEQ ID No. 2) y la endonucleasa cas9, marcadas con (i) proteína fluorescente roja o (ii) el colorante fluorescente verde Atto520.

El conjugado obtenido en el Ejemplo 1 (EfsQNR: SEQ ID No. 2) se mezcló con cas9 (ej. Eupheria Biotech) conjugado con proteína fluorescente roja o colorante fluorescente verde ATTO 520 (producto Sigma 77810) en una proporción de 1:1 y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos.

La solución obtenida se añadió a las células y se incubó con las células durante 12-16 h.

La Figura 31 muestra (A) la proyección máxima de las células después de la incubación; (B) las gráficas de intensidad de las células después de la incubación; y (C) las imágenes de profundidad en 3D de las células después de la incubación.

En ambas imágenes de proyección máxima (A), se puede ver claramente que cas9 se transfecta con éxito y puede propagarse por toda la célula independientemente del tinte de etiquetado. Esto muestra la eficacia del conjugado de la presente invención para transportar y localizar proteínas diana en las células.

De los gráficos de intensidad (B) queda claro que cas9, independientemente del colorante acompañante, pudo ingresar a las células mediante el uso del conjugado. La propagación es por toda la célula y homogénea.

Las imágenes de profundidad en 3D (C) muestran que la carga de Cas9 está distribuida por toda la celda. El análisis de profundidad y la representación 3D han demostrado que está presente en todos los planos.

Ejemplo 13

Transfección de ARNg marcado fluorescentemente con una proteína p-helicoidal recombinante de la presente invención

Como se describe además en la presente invención, se preparó un conjugado para transfectar células con un ARNg típico para su uso en la edición de genes con el sistema de edición de genes CRISPR-cas9. El conjugado comprendía EfsQNR (SEQ ID NO: 2), un conector de etilendiamina y un ARNg (ej. Eupheria Biotech: esiCRISPR Kit-wt) etiquetado con tinte fluorescente verde MFP488. El conjugado se preparó de acuerdo con un protocolo conocido (Ref: Técnicas de Bioconjugados; Greg T Hermansen; Prensa académica; 3a edición; 2013; págs. 264-265).

La Figura 32 representa los resultados de un experimento de transfección en células MCF-7 usando (A) el conjugado obtenido en el Ejemplo 1 (EfsQNR) y el ARNg marcado con el colorante fluorescente verde MFP488; y (B) ARNg de control marcado con el colorante fluorescente verde MFP488 en ausencia del conjugado. (i) muestra la proyección máxima de las células después de la incubación; (ii) muestra imágenes de profundidad en 3D de las células; (iii) imágenes correspondientes a las gráficas de intensidad de las células después de la incubación; y (iv) las gráficas de intensidad de las células después de la incubación.

Las imágenes muestran claramente que la intensidad y homogeneidad del ARNg dentro de las células es significativamente menor para el control en comparación con las células incubadas con ARNg y el conjugado. Esto sugiere que el conjugado es capaz de transportar ARNg al interior de las células. Las imágenes de proyección máxima, los gráficos de intensidad y las imágenes de profundidad 3D para el control muestran que la mayor parte del ARNg se localiza en la membrana celular, mientras que con el conjugado, la distribución se observa claramente principalmente en el citoplasma.

Los componentes CRISPR se obtuvieron de dos fuentes comerciales diferentes, a saber, Eupheria Biotech y Genaxxon.

Biociencias Genaxxon: ARN guía de orientación de GFP para CRISPR; Número de producto: P2008.0010, Secuencias objetivo de ARNg purificado que codifican GFP mejorada; No. SA: 29349990).

Biociencias Genaxxon: Cas9-NLS-tagRFP Streptococcus (S.) pyogenes Proteína Cas9 NLS seguida de una secuencia de etiqueta de proteína fluorescente roja Terminal C (tagRFP); Número de producto: S5306.0010; No. SA: 35040090).

Eupheria Biotech: esiCRISPR Kit-wt, un kit que comprende:

• 20 |jg de Streptococcus pyogenes Cas9-NLS (650 ng/jl)

• 15 jg de ARN guía personalizado (g) (400 ng/jl)

• 35 |jl de reactivo de transfección CRISPRfectionTM (un reactivo de transfección patentado a base de lípidos adecuado para la administración de proteínas Cas9 cargadas con ARN guía único (g) en la mayoría de las células adherentes)

• 1 ml de tampón CRISPRfection (diluyente para CRISPRfection)

• 5 jg de ARNg NoTarget (en hombre, ratón, rata) como control negativo

• Tampones de reacción para realizar análisis indel de productos de PCR derivados de ADN aislado de células transfectadas.

• Reactivos de control positivo para confirmar el rendimiento de la proteína Cas9-NLS y del ARNg: ADN diana de control, ARNg de control, tampones de reacción.

• Manual de aplicación con protocolos de transfección, análisis indel y ensayo de actividad Cas9.

[https://www.eupheria.com/products/crisprcas9/esicrispr-kits/; consultado el 25 de febrero de 2019]

Estrategias para confirmar que las células aún conservan el plásmido pero con eGFP no fluorescente editada

Una construcción “m-cherry” que expresa tanto eGFP como RFP: fluorescencia verde y roja. La transfección de células de mamíferos con este plásmido nos permitirá determinar si las células expresan eGFP y si se han administrado con éxito. Las células con fluorescencia roja, pero no verde, indicarían la eliminación de eGFP conferida por la edición de genes después de la administración de CRISPR-RNP-CPP

Estrategias para mejorar la captación celular y la edición de genes (deleción, sustitución o mutagénesis)

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un complejo de edición de genoma para modificar un polinucleótido diana que comprende una proteína p helicoidal recombinante, en el que la proteína p helicoidal recombinante está unida a una o más moléculas de un sistema de edición de genoma o a un plásmido que codifica una o más moléculas de un sistema de edición de genoma, y el peso molecular de la proteína p helicoidal recombinante está en el intervalo de 30 kDa a 100 kDa, en el que la una o más moléculas del sistema de edición del genoma es una endonucleasa guiada por ARN y/o un ARN guía (ARNg).

2. El complejo de edición del genoma como se reivindica en la reivindicación 1, en el que la proteína p helicoidal tiene una forma de punta generalmente cuadrangular.

3. El complejo de edición del genoma como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la proteína p helicoidal comprende una o más estructuras de escalera de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en una escalera de arginina; una escalera de lisina; una escalera de asparagina; una escalera de ácido aspártico; y una escalera de ácido glutámico; preferiblemente en el que, cuando está presente, la escalera de arginina comprende de 10 a 20 residuos de arginina; la escalera de lisina comprende de 10 a 30 residuos de lisina; la escalera de asparagina comprende de 10 a 40 residuos de asparagina; la escalera de ácido aspártico comprende de 10 a 40 residuos de ácido aspártico; y la escalera de ácido glutámico comprende de 10 a 40 residuos de ácido glutámico.

4. Complejo de edición del genoma como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la proteína p helicoidal tiene una carga total inferior a cero; preferiblemente en el que la proteína p helicoidal tiene una carga total de<- 2 0>a -60.

5. Complejo de edición genómica como se reivindica en una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la proteína p-helicoidal presenta una estructura p-helicoidal con un parámetro de rigidez K (hélice beta) de 0.2 a 12 N/m2, medido mediante microscopía de fuerza atómica.

<6>. El complejo de edición del genoma como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la proteína p helicoidal es una proteína de repetición de pentapéptido; preferiblemente en el que la proteína p helicoidal comprende pentapéptido repetido en tándem con secuencia consenso (STAV)<1>(DN)<2>(LF)<3>(STR)<4>(G)<5>.

7. El complejo de edición del genoma como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a<6>, en el que la proteína p helicoidal está representada por una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:<6>, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:<8>, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, y combinaciones de los mismos.

<8>. Complejo de edición del genoma como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la proteína p helicoidal recombinante está unida a una o más moléculas de un sistema de edición del genoma, o al plásmido, mediante interacciones no covalentes; preferiblemente en el que las interacciones no covalentes se seleccionan del grupo que comprende enlaces de hidrógeno, interacciones electrostáticas, interacciones de van der Waal, interacciones hidrófobas o combinaciones de las mismas; o

en el que la proteína p helicoidal recombinante está unida a una o más moléculas de un sistema de edición del genoma, o al plásmido, mediante una molécula conectora seleccionada del grupo que consiste en: polietilenglicol (PEG); etilendiamina; péptido; conjugado de metal, conjugado de fármaco-metal, dominio de unión a ADN, molécula intercaladora de ácido nucleico y combinaciones de los mismos; preferiblemente en el que cuando la molécula conectora es un péptido, el péptido comprende aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en: aminoácidos alifáticos; aminoácidos aromáticos; y combinaciones de los mismos.

9. Complejo de edición genómica como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a<8>, en el que el conector está unido a la proteína p helicoidal recombinante mediante enlaces covalentes, enlaces no covalentes y combinaciones de los mismos; y/o

en el que la proteína p helicoidal recombinante está unida a una o más moléculas de un sistema de edición del genoma, o al plásmido, mediante un enlace éster o un enlace amida.

10. El complejo de edición del genoma como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el complejo de edición del genoma comprende además:

- una secuencia señal en la que la secuencia señal dirige el complejo de edición del genoma a una célula particular o parte de una célula; preferiblemente en el que la secuencia señal se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, y SEQ ID NO: 17; y/o

- una molécula de fosfatidilcolina.

11. El complejo de edición del genoma como se reivindica en la reivindicación 10, en el que el complejo de edición del genoma transfiere una o más moléculas de un sistema de edición del genoma o el plásmido a una ubicación seleccionada del grupo que consiste en: orgánulos celulares; núcleo; y P-cadherina que sobreexpresa células de cáncer de mama.

12. Un método para preparar el complejo de edición del genoma de la reivindicación 1, que comprende combinar una proteína p helicoidal recombinante con la una o más moléculas del sistema de edición del genoma o con un plásmido que codifica una o más moléculas de un sistema de edición del genoma, y el peso molecular de la proteína p helicoidal recombinante está en el intervalo de 30 kDa a 100 kDa,

en el que la una o más moléculas del sistema de edición del genoma es una endonucleasa guiada por ARN y/o un ARN guía (ARNg).

13. El método de la reivindicación 12, en el que la una o más moléculas del sistema de edición del genoma están en un tampón de reacción que contiene moléculas que estabilizan la formación de complejos entre la proteína p helicoidal recombinante y una o más moléculas del sistema de edición del genoma.

14. Una composición farmacéutica que comprende el complejo de edición del genoma de una cualquiera de las reivindicaciones<1>a<11>.