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ES2973521T3 - Lípidos ionizables para la administración de ácidos nucleicos - Google Patents

Lípidos ionizables para la administración de ácidos nucleicos Download PDF

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ES2973521T3
ES2973521T3 ES20826513T ES20826513T ES2973521T3 ES 2973521 T3 ES2973521 T3 ES 2973521T3 ES 20826513 T ES20826513 T ES 20826513T ES 20826513 T ES20826513 T ES 20826513T ES 2973521 T3 ES2973521 T3 ES 2973521T3
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Spain
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mmol
alkyl
pni
group
cells
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English (en)
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Nikita Jain
Anitha Thomas
Andrew William Brown
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Precision Nanosystems ULC
Original Assignee
Prec Nanosystems Ulc
Precision Nanosystems ULC
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Abstract

El presente documento describe compuestos, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, de una fórmula central (I) donde R1 presenta un grupo amina, particularmente útil en la formulación de partículas lipídicas que incluyen agentes terapéuticos de ácido nucleico, o proteínas, o ambos, y para la administración de Terapéuticas de ácidos nucleicos y proteínas para células in vivo o ex vivo, incluidas aplicaciones anticancerígenas y de vacunas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Lípidos ionizables para la administración de ácidos nucleicos
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica la prioridad bajo 35USC§119(e) de las Solicitudes de Patente de EE.UU provisionales 62/864,064 presentada el 20 de junio de 2019, y 62/877,536 presentada el 23 de julio de 2019, y 63/009,104 presentada el 13 de abril de 2020.
Antecedentes
(a) Campo
El tema divulgado se refiere generalmente a lípidos ionizables, específicamente aquellos lípidos ionizables capaces de transfectar células vivas con material genético.
(b) Estado de la técnica relacionada
El número de estrategias de tratamiento con ácidos nucleicos para enfermedades, incluso aquellas enfermedades que no tienen una causa genética inicial, está creciendo. Cada ácido nucleico terapéutico tiene una forma, una química y una carga diferentes y, por lo general, requiere una modalidad de administración diferente.
La lipofección se ha utilizado como un medio para alterar la genética de las células mediante la administración de genes mediada por lípidos desde al menos 1987. A lo largo de los años, se han realizado mejoras en dichos lípidos para adaptarlos a más situaciones. Los lípidos catiónicos como DODAC, DOTMA, DDAB y DOTAP se utilizaron en la década de 1990, pero resultaron demasiado tóxicos para contemplarlos en aplicaciones clínicas.
Un enfoque clínicamente relevante ha sido el desarrollo de lípidos ionizables para uso humano. Ejemplos de lípidos ionizables incluyen, 1,2-dilinoleiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-DMA), dilinoleilmetil-4-dimetilaminobutirato (DLin-MC3-DMA, (véase, por ejemplo, el documento de Patente de EE.UU No. 8,158,601), y 2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioxolano (DLin-KC2-DMA). DLin-MC3-DMA se emplea en Onpattro™ patisirán. Sigue existiendo la necesidad de más opciones para los lípidos de transfección clínicamente relevantes.
Compendio
Según realizaciones de la invención, se proporciona un compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de fórmula (I):
en donde:
L1 es un enlace directo o un alquileno de C1-C5;
E1 se selecciona entre _O_, _OC(O)O_, _OC(O)_C1 , _OC(O)N(Q)_C1, OC(O)S_C1 , _N(Q)C(O)_C<1>,_N(Q)C(O)O_0<1>, _C(O)O_5<1>y _C(O)N(Q)_5<1>; Q es H o alquilo de C1-C5; 61 representa el enlace unido al grupo R1;
R1 se selecciona de:
en donde:
R4 y R5 se selecciona cada uno independientemente del grupo que consiste en alquilo de C1-C6, alquenilo de C2-C6 y alquinilo de C2-C6; alternativamente R4 y R5 pueden unirse para formar un anillo heterocíclico de 4 a 6 miembros que contiene oxígeno (O) o hasta 2 nitrógeno (N), opcionalmente sustituido con 1 - 2 sustituyentes, seleccionado cada uno independientemente de un alquilo de C1-C6, ciclopropilo, OH y un grupo alcoxi de C1-C3;
R<6>se selecciona de alquilo de C1-C6, alquenilo de C2-C6, alquinilo de C2-C6, cicloalquilo de C3-C6 y un grupo 2-hidroxietilo;
R7 se selecciona de H, alquilo de C1-C6, alquenilo de C2-C6 y un grupo alquinilo de C2-C6;
a y c' son independientemente 1,2, 3, 4 o 5;
b, c y e son independientemente 0, 1 o 2 ;
d es 1 o 2 ;
R2 se selecciona de H, alquilo de C1-C12, alquenilo de C2-C12, alquinilo de C2-C12, y
L2 es un enlace directo o 6<2>_(CR<8>R<8>')k_6<3>en donde R<8>y R<8>' son cada uno independientemente H, alquilo de C1-C12, alquenilo de C2-C12 o alquinilo de C2-C12; 62 representa el enlace unido al grupo E2 y 63 representa el enlace unido al esqueleto de ciclopentilo descrito en la fórmula (I);
k es 1,2, 3, 4 o 5;
E2 se selecciona de _O_, _OC(O)O_, _OC(O)_6<4>, _OC(O)N(Q)_6<4>, _N(Q)C(O)_6<4>, _N(Q)C(O)O_6<4>, _C(O)N(Q)_6<4>o _C(O)O_6<4>; Q es H o alquilo de C1-C5; donde 64 representa el enlace unido al grupo R3;
R3 se selecciona de alquilo de C8-C20, alquenilo de C8-C20, alquinilo de C8-C20,
en donde:
f es 0 o 1 ;
g es 1 o 2 ;
g' es 1, 2, 3, 4 o 5;
h es 0, 1,2, 3 o 4;
R9 es una cadena de C6-C20 que tiene la fórmula _(CH<2>)i_[L<4>-(CH<2>)]j_R<12>, en donde:
L<4>se selecciona de
H H H V w
'% f•¿A=<SH<l i-- -= -l>y> T Y .
i es un número entero en el intervalo 6-20;
j es 0, 1,2 o 3;
R12 se selecciona entre H y alquilo de C4-C8;
R9' se selecciona de H, alquilo de C4-C10, alquenilo de C4-C10 y alquinilo de C4-C10;
R10 y R10' se seleccionan cada uno, independientemente de alquilo de C4-C10, alquenilo de C4-C10 y alquinilo de C4-C<10>;
L3 es _OC(O)_6<5>, _O_6<5>, o un enlace directo; 65 representa el enlace unido a R10 y R10;
R11 = R9, o tiene la fórmula:
Según otras realizaciones de la invención, se proporciona un compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de fórmula (I):
en donde:
L1 es un enlace directo o alquileno de C1-C5;
Ei se selecciona de _OC(O)O_, _OC(O)_61 , _OC(O)N(Q)_61 , _OC(O)S_5i ; Q es H o alquilo de C1-C5; 61 representa el enlace unido al grupo Ri ;
Ri se selecciona de:
en donde:
R4 y R5 se seleccionan cada uno, independientemente de alquilo de C1-C6, alquenilo de C2-C6 y alquinilo de C2-C6; alternativamente R4 y R5 pueden unirse para formar un anillo heterocíclico de 5 a 6 miembros que contiene hasta 2 nitrógenos (N), opcionalmente sustituido con 1 a 2 sustituyentes, cada uno seleccionado independientemente de un alquilo de C1-C6 y un grupo ciclopropilo;
R6 se selecciona de alquilo de C1-C6 y un grupo cicloalquilo de C3-C6;
R7 se selecciona de H y grupo alquilo de C1-C6;
a es 1,2 o 3;
b y c son independientemente 0, 1 o 2 ;
c' es 2, 3 o 4;
d es 1 o 2 ;
e es 0 o 1 ;
R2 se selecciona de H, alquilo de C1-C5, alquenilo de C2-C5, alquinilo de C2-C5, y
L2 es un enlace directo o 6<2>_(CR<8>R<8>')k_6<3>en donde R<8>y R<8>' son cada uno independientemente H, alquilo de C1-C12, alquenilo de C2-C12 o alquinilo de C2-C12; 62 representa el enlace unido al grupo E2 y 63 representa el enlace unido al esqueleto de ciclopentilo descrito en la fórmula (I);
k es 1 ;
E2 se selecciona de _O_, _OC(O)O_, _OC(O)_6<4>, _OC(O)N(Q)_6<4>, _C(O)N(Q)_6<4>o _C(O)O_6<4>; Q es H o alquilo de C1-C5; donde 64 representa el enlace unido al grupo R3;
R3 se selecciona de alquilo de C8-C20, alquenilo de C8-C20, alquinilo de C8-C20,
en donde:
f y h son cada uno 0;
g es 1 o 2;
R9 es una cadena de C6-C20 que tiene la fórmula _(CH<2>)_[L<4>-(CH<2>)]j_R i<2>, en donde:
L<4>se selecciona de
i es un número entero en el intervalo 6-20;
j es 0, 1 o 2;
R12 se selecciona de H y un grupo alquilo de C4-C8;
R9' se selecciona de H y alquilo de C4-C10;
R10 y R10' se seleccionan cada uno, independientemente de alquilo de C4-C10, alquenilo de C4-C10 y alquinilo de C4-C<10>;
L3 es _OC(O)_6<5>, o un enlace directo; 65 representa el enlace unido a R10 y R10;
R11 es lo mismo que R9.
Según otras realizaciones de la invención, se proporciona un compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de fórmula (II):
en donde:
L1 es un enlace directo;
E1 se selecciona de _OC(O)O_, _OC(O)_61, _OC(O)N(Q)_61, _OC(O)S_61; Q es H o alquilo de C1-C5; 61 representa el enlace unido al grupo R1;
R1 se selecciona de
en donde:
R4 y R5 se seleccionan cada uno, independientemente de alquilo de C1-C6; alternativamente R4 y R5 pueden unirse para formar un anillo heterocíclico de 5 a 6 miembros que contiene hasta 2 nitrógenos (N), opcionalmente sustituido con 1 a 2 sustituyentes, cada uno seleccionado independientemente de un alquilo de C1-C6;
R6 se selecciona de alquilo de C1-C6 y un grupo ciclopropilo;
R7 se selecciona de H y un grupo alquilo de C1-C6;
a es 1,2 o 3;
b es 0 o 1;
c es 0, 1 o 2;
c' es 2, 3 o 4;
d es 2;
e es 1;
R2 se selecciona de H, alquilo de C1-C5, alquenilo de C2-C5, y
R3 se selecciona de:
en donde:
f y h son cada uno 0;
g es 1 o 2;
R9 es una cadena de C6-C20 que tiene la fórmula _(CH<2>)_[L<4>-(CH<2>)]j_R<12>, en donde:
L4 se selecciona de
V / H VVH
o ,
i es un número entero en el intervalo 6-20;
j es 0, 1 o 2;
R12 se selecciona de H y un grupo alquilo de C4-C8;
R9' se selecciona de H y alquilo de C4-C10;
R10 y R10' se seleccionan cada uno, independientemente de alquilo de C4-C10;
L<3>es un enlace directo;
R13 es lo mismo que R11.
Según otras realizaciones de la invención, se proporciona un compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de fórmula (111):
en donde:
R1 se selecciona de:
en donde:
R<4>y R<5>se seleccionan cada uno, independientemente de alquilo de C1-C6; alternativamente, R<4>y R<5>pueden unirse para formar un anillo heterocíclico de 5 a 6 miembros que contiene hasta 2 nitrógenos (N), opcionalmente sustituido con 1 a 2 sustituyentes, cada uno seleccionado independientemente de un alquilo de C1-C6;
R<6>se selecciona de alquilo de C1-C6 y un grupo ciclopropilo;
R7 se selecciona de H y un grupo alquilo de C1-C6;
a es 1,2 o 3;
b es 0 o 1 ;
c es 0, 1 o 2 ;
c' es 2, 3 o 4;
d es 2 ;
e es 1 ;
R2 se selecciona de H, alquilo de C1-C5, alquenilo de C2-C5, y
R3 se selecciona de:
en donde:
f y h son 0;
g es 1 o 2;
R9 es una cadena de C6-C20 que tiene la fórmula _(CH2)i_[L4-(CH2)]j_R12, en donde:
L4 se selecciona de
i es un número entero en el intervalo 6-20;
j es 0, 1 o 2;
R12 se selecciona de H y un grupo alquilo de C4-C8;
R9' se selecciona de H y alquilo de C4-C10;
R10 y R10' se seleccionan cada uno, independientemente de alquilo de C4-C10;
L3 es un enlace directo;
R11 es lo mismo que R9.
Según realizaciones de la invención, R1 es uno de:
En realizacio nes ad icionales, cada R3 e s independientemente:
En otras realizaciones de la invención, R2 se selecciona de:
En otras realizaciones más de la invención, Ei se selecciona de:
en donde 5i representa el enlace unido al grupo Ri; 5r representa el enlace unido al grupo Li.
En otras realizaciones más de la invención, E2 se selecciona de:
en donde 54 representa el enlace unido al grupo R3.
Según realizaciones de la invención, se proporciona un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:
o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.
Según realizaciones de la invención, también se proporcionan los compuestos enumerados en la Tabla 2.
rico
PNI 589 9,14
PNI 590 8,45
PNI 611 9.15
PNI 614 9.18
9,45
PNI 2828,67PNI 284 8,94PNI 288 8,33PNI 289 8,29
PNI 2939,44PNI 294 9,44
PNI295 9,45
iPredicho a través de ChemDraw.
Los lípidos ionizables de la presente invención tienen centros asimétricos y se presentan como racematos, mezclas racémicas, enantiómeros individuales, mezclas enantioméricas, diastereómeros individuales y como mezclas diastereoméricas, con todos los isómeros posibles y mezclas de los mismos.
En realizaciones de la invención, el pKa teórico de los lípidos en la Tabla 2 se predice usando ChemDraw™ Profesional. El pKa experimental de nanopartículas lipídicas formuladas que comprenden lípidos en la Tabla 1 se calcula utilizando un ensayo TNS. El procedimiento para el ensayo TNS se describe en el Ejemplo 25.
Según realizaciones de la invención, se proporciona una composición de mezcla de lípidos que incluye uno cualquiera de los compuestos anteriores combinados con un lípido estructural, un esteroide y un agente estabilizante, así como al menos un agente terapéutico.
En realizaciones, el lípido estructural incluye uno o más lípidos estructurales seleccionados del grupo que consiste en DSPC, DSPE, DPPC, DMPC, DOPC, P<o>P<c>, DOPE y<s>M. En realizaciones preferidas, el lípido estructural es DSPC. En otras realizaciones preferidas, el lípido estructural es DOPE.
En realizaciones, el agente estabilizante incluye uno o más tensioactivos y/o lípidos conjugados con polímeros.
En realizaciones, la relación molar del compuesto con respecto al resto de los componentes es del 30 % en moles al 70 % en moles. En realizaciones, el esterol es colesterol. En realizaciones, el agente terapéutico incluye uno o más ácidos nucleicos. En realizaciones, el agente terapéutico incluye uno o más polipéptidos. En algunas realizaciones, el agente terapéutico incluye tanto un ácido nucleico como un componente polipeptídico.
Según la invención, se proporciona un compuesto como aparece anteriormente, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el pKa experimental de las nanopartículas está en el intervalo de 5,6 a 7,1.
Según la invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto como se define anteriormente y al menos un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Según la invención, se proporciona una composición de mezcla de lípidos en donde el compuesto está presente de aproximadamente un 40% en moles a un 49% en moles, el lípido estructural está presente de aproximadamente un 11 a un 30% en moles, el colesterol está presente de aproximadamente un 35 a un 39% en moles, y el agente estabilizante está presente de aproximadamente 0,5 a 3% en moles. En realizaciones, el compuesto está presente en un 37,5% en moles. En realizaciones, el compuesto está presente en un 38,5% en moles. En realizaciones, el lípido estructural está presente en aproximadamente un 20 % en moles. En realizaciones, el agente estabilizante está presente en aproximadamente un 1,5 % en moles. En realizaciones, el agente estabilizante está presente en aproximadamente un 2,5 % en moles.
Según la invención, se proporciona una composición de mezcla de lípidos en donde el agente estabilizante se selecciona del grupo que consiste en PEG-DMG 2000, polioxietilen (10) estearil éter, estearato de polioxietileno (40), polisorbato 80, polioxietilen (4) lauril éter, polioxietilen (20) estearil éter, polioxietilen (23) lauril éter y succinato de polietilenglicol 1000 de D-a-tocoferol;
Según la invención, se proporciona el uso de un compuesto descrito anteriormente para preparar un agente terapéutico para administrar un agente terapéutico a una célula exvivo.
Según la invención, se proporciona el uso de un compuesto descrito anteriormente en la preparación de una formulación farmacéutica.
En realizaciones, el agente terapéutico incluye además un ácido nucleico terapéutico.
En realizaciones, el ácido nucleico terapéutico es un mRNA, siRNA, miRNA, RNA guía, RNA guía sintético, un cromosoma artificial, DNA circular o linealizado, minicírculos de DNA o msDNA. En realizaciones, el uso de la composición es para su uso en la preparación de una vacuna. En realizaciones, la vacuna está dirigida a la prevención de la infección por coronavirus. Según realizaciones de la invención, el mRNA es un RNA viral autoensamblable.
Según la invención se proporciona el uso de una cualquiera de las composiciones descritas anteriormente para el tratamiento de enfermedades. En realizaciones adicionales, el uso es para la preparación o administración de una vacuna profiláctica.
En realizaciones, los compuestos o composiciones son para su uso en una vacuna terapéutica o contra el cáncer. En realizaciones, la vacuna está dirigida a la prevención de la infección por coronavirus.
Según la invención, se proporciona el uso de la composición de mezcla de lípidos descrita anteriormente en la preparación de un producto farmacéutico para modular las células T humanas; CAR-T, TCR, de edición de genes o células T alogénicas. En realizaciones, el producto farmacéutico se usa para modular células T, en donde las células T se aíslan de pacientes, o células T que han sido diseñadas genéticamente específicamente para células T o células T alogénicas. En realizaciones, el producto farmacéutico se usa para modificar células NKT y células iNKT.
En realizaciones, el producto farmacéutico incluye además un polipéptido. En realizaciones, el producto farmacéutico incluye además una ribonucleoproteína. En realizaciones adicionales, las composiciones están en forma de partículas de lípidos.
También se proporcionan según otras realizaciones más de la invención composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto y al menos un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. En realizaciones, las composiciones toman la forma de partículas de lípidos.
Breve descripción de los dibujos
Otras características y ventajas de la presente divulgación resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, tomada en combinación con los dibujos adjuntos, en donde:
La Figura 1 es un gráfico de barras que muestra los niveles de expresión relativos de GFP en células T CD4+/CD8+ vivas mediadas por nanopartículas lipídicas de mRNA (LNP) que comprenden DODMA, DLin-MC3-DMA o PNI 101 usando una composición CT10 en una proporción N/P de 10, y analizado para la expresión génica mediante citometría de flujo 48 horas después del tratamiento;
La Figura 2 es un gráfico que muestra la expresión de GFP en células T humanas primarias aisladas de seis donantes individuales mediadas por mRNA-LNPs que contienen lípido ionizable DLin-MC3-DMA o lípido PNI 101 en una composición CT10, y con una relación N/P de 10. Se midieron la eficiencia de la transfección y el MFI mediante citometría de flujo 48 horas después de que las células T recibieran 500 ng de mRNA encapsulado por 125000 células en LNPs 7 días después de la activación de las células T;
La Figura 3 muestra dos gráficos de barras que muestran la expresión de GFP en células T humanas primarias aisladas mediadas por mRNA-LNPs que contienen el lípido ionizable MC3, o cada uno de varios lípidos ionizables PNI novedosos, usando una composición CT10 y una relación N/P de 8, tratamiento 3 días después de la activación. Se midieron la eficiencia de transfección (superior) y el MFI (inferior) mediante citometría de flujo 48 h después de la adición de LNP;
La Figura 4 es un gráfico de barras que muestra la expresión de GFP en células T humanas primarias aisladas previamente crioconservadas mediada 4 días después de la activación con 500 ng de mRNA encapsulado por 125000 células mediante mRNA-LNPs que contienen DLin-MC3-DMA, lípido de PNI 132, lípido de PNI 516, lípido de PNI 545 o lípido de PNI 565, con composición CT10, con N/P de 8. MFI de GFP (primera columna), eficiencia de transfección (columna central) y viabilidad (tercera columna) se midieron mediante citometría de flujo 48 horas después de la adición de LNP;
La Figura 5 es un gráfico de barras que muestra los niveles de expresión de eritropoyetina humana (EPO) recombinante citosólica y secretada determinados mediante ELISA después de la transfección mediada por LNP de mRNA de células T CD4+/CD8+. El control fueron los estándares de sueros humanos normales proporcionados por el fabricante;
La Figura 6 muestra los niveles de expresión de EPO a las 6 h (superior) y 24 h (inferior) en ratones C56BL/6 después de la administración i.v. de una dosis de 0,5 mg/Kg de mRNA-LNPs codificados por EPO humana recombinante que contienen los lípidos ionizables MC3, PNI-101 y PNI 123 usando la composición IL/DSPC/colesterol/PEG-DMG (50:10:38,5:1,5 % en moles) a N/P 6;
La Figura 7 muestra los niveles de expresión de EPO a las 6 h (superior) y 24 h (inferior) en ratones C56BL/6 después de la administración i.v de una dosis de 1 o 3 mg/Kg de mRNA-LNPs codificados por EPO humana recombinante que contienen los lípidos ionizables DLin-MC3-DMA y PNI 123 usando la composición IL/DSPC/colesterol/PEG-DMG (50:10:38,5:1,5 % en moles) en N/P 6;
La Figura 8 es un diagrama de dispersión que muestra los niveles de expresión de EPO en mlU/mL 6 h después de la administración de mRNA de EPO de 5 moU encapsulado en LM02 LNAP que comprende una variedad de 15 lípidos ionizables en una relación N/P de 6 y una dosis de 0,5 mg/Kg;
La Figura 9 son dos ilustraciones de los niveles de expresión de CD19 CAR en células T humanas primarias aisladas mediadas por LNPs de mRNA CT10 N/P 8 que contienen PNI 545, PNI 516, PNI132, PNI 542, PNI 565 que incorporan mRNA de CD19 CAR (receptor de antígeno quimérico). La intensidad de fluorescencia media geométrica del fluoróforo anti-CD19-PE (gráfico de barras superior) y la población de células T CD19 CAR positivas (histograma inferior) se midieron mediante citometría de flujo 24 horas después de la adición de LNP con 500 ng de mRNA encapsulado por 125000 células T 3 días después de la triple activación;
La Figura 10 es un gráfico de dispersión que muestra los títulos de anticuerpos IgG específicos de OVA en el suero de ratones inmunizados con 5 ug de vacunas de LNP de mRNA de OVA. Se realizaron dos inmunizaciones con 10 días de diferencia (día 1, día 10), seguidas de mediciones de títulos de IgG específicas de OVA que se evaluaron mediante ELISA; y
La Figura 11 es un gráfico que muestra las curvas de TNS que indican mediciones de pKa de superficie de diversos lípidos ionizables<i>D nos. PNI 143, PNI 557, PNI 559, PNI 132, PNI 516 y PNI 560 utilizando la composición LM02 de LNP.
Se observará que, en todos los dibujos adjuntos, características similares se identifican con números de referencia similares.
Descripción detallada
En esta divulgación, la palabra "que comprende" se usa en un sentido no limitante para significar que los elementos que siguen a la palabra están incluidos, pero los elementos que no se mencionan específicamente no están excluidos. Se entenderá que en realizaciones que comprenden o pueden comprender una característica o variable o parámetro específico, realizaciones alternativas pueden consistir, o consistir esencialmente en tales características o variables o parámetros. Una referencia a un elemento mediante el artículo indefinido "un" no excluye la posibilidad de que más de uno de los elementos esté presente, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y sólo uno de los elementos.
En esta divulgación, la recitación de intervalos numéricos mediante puntos finales incluye todos los números subsumidos dentro de ese intervalo, incluyendo todos los números completos, todos los números enteros y todos los intermedios fraccionarios (por ejemplo, 1 a 5 incluye 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4 y 5, etcétera). En esta divulgación, las formas singulares de "un" y "el" incluyen referentes en plural, a menos que el contenido indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a una composición que contiene "un compuesto" incluye una mezcla de dos o más compuestos.
En esta divulgación, el término "o" se emplea generalmente en el sentido que incluye "y/o", a menos que el contenido indique claramente lo contrario.
"Lípido" se refiere a un grupo estructuralmente diverso de compuestos orgánicos que son derivados de ácidos grasos 0 esteroles o podrían ser materiales similares a lípidos como en los lipidoides (por ejemplo C12-200) y se caracterizan por ser insolubles en agua pero solubles en muchos disolventes orgánicos.
"Composiciones de mezclas de lípidos". Las composiciones de mezclas de lípidos se refieren a los tipos de componentes, las proporciones de los componentes y la proporción de los componentes totales con respecto a las cargas útiles de ácidos nucleicos. Por ejemplo, una composición de mezcla de lípidos del 40 % en moles de lípido ionizable, 20 % en moles de lípido estructural, 17 % en moles de esterol y 2,5 % en moles de agente estabilizante sería una composición de mezcla de lípidos. PNI123/DSPC/Colesterol/PEG-DMG (50:10:38,5:1,5 % en moles) sería una composición más específica. PNI123/DOPE/Colesterol/PEG-DMG (47,5:10: 38,5:1,5) sería otra composición específica más.
Como se usa en la presente memoria, "N/P" es la proporción en moles de los grupos amino de lípidos ionizables con respecto a los de los grupos fosfato de ácido nucleico. En realizaciones de la invención, las proporciones N/P son de 6 a 10, y las proporciones más preferidas son de N/P 4 -12. En una realización, la proporción N/P es 6, 8 o 10. El componente de ácido nucleico se asocia con esta composición de mezcla de lípidos para formar una partícula de ácido nucleico lipídico, o LNP, en una proporción premeditada tal como amina lipídica ionizable (N) con respecto a fosfato de ácido nucleico (P) de N/P 4, N/P 6, N/P 8, N/P 10, N/P 12 u otra relación N/P particular relevante.
"Partículas lipídicas". La invención proporciona partículas de lípidos fabricadas a partir de las composiciones de mezclas de lípidos descritas anteriormente. La partícula de lípido representa la organización física de la composición de la mezcla de lípidos con el agente terapéutico y entre los componentes. Una nanopartícula lipídica es una partícula lipídica. Las partículas lipídicas son generalmente conjuntos esféricos de lípidos, ácido nucleico, colesterol y agentes estabilizantes. Las cargas positivas y negativas, las proporciones, así como la hidrofilicidad e hidrofobicidad dictan la estructura física de las partículas lipídicas en términos de tamaño y orientación de los componentes. La organización estructural de estas partículas lipídicas puede conducir a un interior acuoso con una bicapa mínima como en los liposomas o puede tener un interior sólido como en una nanopartícula lipídica de ácido nucleico sólido. Puede haber monocapas o bicapas de fosfolípidos en formas únicas o múltiples. Las partículas de lípidos tienen un tamaño de entre 1 y 1000 |um.
"Viabilidad" cuando se hace referencia a las célulasin vitro,significa la capacidad de continuar creciendo, dividiéndose y continuar creciendo y dividiéndose, como es normal para el tipo de célula o cepa de cultivo de tejido. La viabilidad celular se ve afectada por condiciones o tratamientos severos. La viabilidad celular es crítica en la terapia ex vivo o la administración parenteral.
"Lípido ionizable". Las composiciones de la invención comprenden lípidos ionizables. Como se usa en la presente memoria, el término "lípido ionizable" se refiere a un lípido que es catiónico o se vuelve ionizable (protonado) a medida que el pH desciende por debajo del pKa del grupo ionizable del lípido, pero es más neutro a valores de pH más altos. A valores de pH inferiores al pKa, el lípido puede entonces asociarse con ácidos nucleicos cargados negativamente (por ejemplo, oligonucleótidos). Como se usa en la presente memoria, el término "lípido ionizable" incluye lípidos que asumen una carga positiva al disminuir el pH desde el pH fisiológico, y cualquiera de una serie de especies de lípidos que llevan una carga positiva neta a un pH selectivo, tal como un pH fisiológico. Los lípidos catiónicos permanentes tales como DOTMA han demostrado ser demasiado tóxicos para uso clínico. El lípido ionizable está presente en formulaciones lipídicas según otras realizaciones de la invención, preferiblemente en una proporción de aproximadamente 30 a aproximadamente 70 % en moles, en algunas realizaciones, aproximadamente 30 % en moles, en otras realizaciones, aproximadamente 40 % en moles, en otras realizaciones, aproximadamente 45 % en moles, en otras realizaciones, aproximadamente 47,5 % en moles, en otras realizaciones, aproximadamente 50 % en moles, en otras realizaciones más, y aproximadamente 60 % en moles en otras más ("% en moles" significa el porcentaje de los moles totales que es de un componente en particular). El término "aproximadamente" en este párrafo significa un intervalo más o menos del 5% en moles. DODMA, o 1,2-dioleiloxi-3-dimetilaminopropano, es un lípido ionizable, al igual que DLin-MC3-DMA u O-(Z,Z,Z,Z-heptatriaconta-6,9,26,29-tetraen-19 -il)-4-(N,N-dimetilamino) ("MC3").
Se pueden generar partículas de lípidos a partir de las formulaciones de lípidos que incluyen los lípidos ionizables de la invención.
Los lípidos estructurales, también conocidos como "lípidos auxiliares" o "lípidos neutros", se incorporan en las formulaciones de lípidos y partículas de lípidos de la invención en algunas realizaciones. Las formulaciones de lípidos y partículas de lípidos de la invención incluyen uno o más lípidos estructurales en aproximadamente de 10 a 40 % en moles de la composición. Los lípidos estructurales adecuados favorecen la formación de partículas durante la fabricación. Los lípidos estructurales se refieren a una cualquiera de una serie de especies de lípidos que existen en forma aniónica, sin carga o zwitteriónica neutra a pH fisiológico. Los lípidos estructurales representativos incluyen diacilfosfatidilcolinas, diacilfosfatidiletanolaminas, diacilfosfatidilgliceroles, ceramidas, esfingomielinas, dihidroesfingomielinas, cefalinas y cerebrósidos.
Los lípidos estructurales ejemplares incluyen lípidos zwitteriónicos, por ejemplo, distearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilcolina (POPC), palmitoiloleoil-fosfatidiletanolamina (POPE) y 4-( N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de dioleoil-fosfatidiletanolamina (DOPE-mal), dipalmitoil fosfatidil etanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina (DMPE), distearoil-fosfatidiletanolamina (DSPE), 16-O-monometil PE, 16-O-dimetil PE, 18-1- trans PE, 1-estearoil-2-oleoil-fosfatidietanolamina (SOPE) y 1,2-dielaidoil-sn-glicero-3-fofoetanolamina (trans DOPE). En una realización preferida, el lípido estructural es distearoilfosfatidilcolina (DSPC).
En otra realización, el lípido estructural es cualquier lípido que esté cargado negativamente a pH fisiológico. Estos lípidos incluyen fosfatidilgliceroles tales como dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), palmitoiloleoilfosfatidilglicerol (POPG), cardiolipina, fosfatidilinositol, diacilfosfatidilserina, ácido diacilfosfatídico y otros grupos modificadores aniónicos unidos a lípidos neutros. Otros lípidos estructurales adecuados incluyen glicolípidos (por ejemplo, monosialogangliósido GM1).
Se incluyen estabilizadores o agentes estabilizantes en las realizaciones de formulaciones lipídicas para garantizar la integridad de las mezclas tras el autoensamblaje. Los agentes estabilizantes son una clase de moléculas que interrumpen o ayudan a formar interacciones hidrófobas-hidrófilas entre moléculas. El agente estabilizante adecuado incluye, pero no se limita a, polisorbato 80 (también conocido como Tween 80, nombre IUPAC octadec-9-enoato de 2- [2-[3,4-bis(2-hidroxietoxi)oxolan-2-il]-2-(2-hidroxietoxi)etoxi]etilo), Myrj52 (estearato de polioxietileno (40), Brij™ S10 (polioxietilen (10) estearil éter, BRIJ™ L4 = Polioxietilen (4) lauril éter; BRIJ™ S20 = polioxietilen (20) estearil éter; BRIJ™ S35= polioxietilen (23) lauril éter; TPGS 1000 = polietilenglicol 1000 succinato de D-a-tocoferol; Tween 20/Polisorbato 80/ Tridecil-D-maltósido en proporciones iguales. En otras realizaciones preferidas, el agente estabilizante incluye lípidos PEGilados que incluyen PEG-DMG 2000. También se pueden usar lípidos conjugados con polietilenglicol. El agente estabilizante se puede usar solo o en combinación entre sí.
En algunas realizaciones, el agente estabilizante incluye aproximadamente del 0,1 al 3% en moles de la mezcla de lípidos total. En algunas realizaciones, el agente estabilizante incluye aproximadamente del 0,5 al 2,5% en moles de la mezcla lipídica total. En algunas realizaciones, el agente estabilizante está presente en más del 2,5% en moles. En algunas realizaciones, el agente estabilizante está presente al 5% en moles. En algunas realizaciones, el agente estabilizante está presente al 10% en moles. En algunas realizaciones, el agente estabilizante es aproximadamente 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, etcétera. En otras realizaciones, el agente estabilizante es del 2,6 al 10 % en moles de la mezcla de lípidos. En otras realizaciones, el agente estabilizante está presente en más del 10% en moles de la mezcla de lípidos.
Los esteroles se incluyen en las composiciones de mezclas de lípidos preferidas para ciertas aplicaciones, y las partículas de lípidos preparadas a partir de los mismos incluyen colesterol y fitosterol. En las mezclas de lípidos de la invención, el colesterol está presente en aproximadamente del 30 al 50 % en moles de la mezcla de lípidos final en algunas realizaciones. Alternativamente, el colesterol está presente en aproximadamente del 35 al 41% en moles de la mezcla de lípidos final. En algunas realizaciones, el colesterol está presente de un 17 % a un 38,5 %. En otras realizaciones, el esterol está ausente. En algunas realizaciones está presente un esterol modificado o un esterol derivado sintéticamente.
Ácidos nucleicos. Las composiciones de mezclas de lípidos y las partículas de lípidos de la presente invención son útiles para la administración sistémica o local de ácidos nucleicos. Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término " ácido nucleico terapéutico" (NAT) pretende incluir cualquier oligonucleótido o polinucleótido cuya administración en una célula provoque un efecto deseable. La definición incluye agentes de diagnóstico y reactivos de investigación que siguen los mismos principios físicos proporcionados por la invención. Los fragmentos que contienen hasta 50 nucleótidos generalmente se denominan oligonucleótidos y los fragmentos más largos se denominan polinucleótidos. En realizaciones particulares, los oligonucleótidos de la presente invención tienen una longitud de 20 a 50 nucleótidos. En realizaciones de la invención, los oligonucleótidos tienen una longitud de 996 a 4500 nucleótidos, como en el caso del RNA mensajero. En realizaciones particulares, los oligonucleótidos de la invención incluyen hasta 14000 nucleótidos.
El término "ácido nucleico" también se refiere a ribonucleótidos, desoxinucleótidos, ribonucleótidos modificados, desoxirribonucleótidos modificados, oligonucleótidos de cadena principal de fosfato-azúcar modificados, otros nucleótidos, análogos de nucleótidos y combinaciones de los mismos, y pueden ser monocatenarios, bicatenarios o contener porciones de secuencia tanto bicatenaria como monocatenaria, según corresponda. El mRNA puede estar modificado o no, modificado con bases y puede incluir diferentes tipos de estructuras de protección, tal como Cap1. En algunas realizaciones, el ácido nucleico se refiere a RNA de auto-amplificación ("saRNA"). Lundstrom, K. Nanoparticle-based delivery of self-amplifying RNA. Gene Ther 27, 183-185 (2020).
Como se usan en la presente memoria, los términos "polinucleótido" y "oligonucleótido" se usan indistintamente y significan polímeros monocatenarios y bicatenarios de monómeros de nucleótidos, incluyendo 2'-desoxirribonucleótidos (DNA) y ribonucleótidos (RNA) unidos por enlaces de unión fosfodiéster internucleotídicos, por ejemplo, 3'-5' y 2'-5', enlaces invertidos, por ejemplo, 3'-3' y 5'-5', estructuras ramificadas o análogos de internucleótidos. Los polinucleótidos tienen contraiones asociados, tales como H+, NH4+, trialquilamonio, Mg2+, Na+ y similares. Un polinucleótido puede estar compuesto enteramente de desoxirribonucleótidos, enteramente de ribonucleótidos o mezclas quiméricas de los mismos. Los polinucleótidos pueden incluir internucleótidos, nucleobases y/o análogos de azúcar.
El término "polipéptidos" en la presente memoria abarca "oligopéptidos" y "proteínas" y estructuras terciarias y cuaternarias de los mismos, que son agentes terapéuticos en algunas realizaciones. Un oligopéptido generalmente consiste en dos a veinte aminoácidos. Un polipéptido es una cadena lineal única de muchos aminoácidos de cualquier longitud unidos por enlaces amida. Una proteína consiste en una o más y puede incluir proteínas estructurales, catalizadores energéticos, albúmina, hemoglobina, inmunoglobulinas y enzimas.
Una "ribonucleoproteína" es un complejo de proteína Cas9 y RNA guía en algunas realizaciones. En algunas realizaciones, una ribonucleoproteína es el agente terapéutico al que se hace referencia en aspectos de la invención.
Actualmente, las terapias con ácidos nucleicos incluyen ácido desoxirribonucleico, ácido desoxirribonucleico complementario, genes completos, ácido ribonucleico, oligonucleótidos y ribozimas para terapias génicas dirigidas a una variedad de enfermedades, tales como cáncer, enfermedades infecciosas, trastornos genéticos y enfermedades neurodegenerativas. Como se describe en la presente memoria, el ácido nucleico terapéutico (NAT) se incorpora en una partícula lipídica durante su formación con compuestos de la invención. De esta manera se puede incorporar más de un ácido nucleico terapéutico. Pueden derivarse de fuentes naturales o, más comúnmente, sintetizarse o cultivarse. Los ejemplos de ácidos nucleicos terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, oligonucleótidos antisentido, ribozimas, microRNA, mRNA, ribozima, tRNA, tracrRNA, sgRNA, snRNA, siRNA, shRNA, ncRNA, miRNA, mRNA, DNA precondensado, pDNA o un aptámero. Los reactivos de ácido nucleico se utilizan para silenciar genes (con, por ejemplo, siRNA), expresar genes (con, por ejemplo, mRNA), editar genomas (con, por ejemplo, CRISPR/Cas9) y reprogramar células para regresar al organismo de origen (por ejemplo, terapia celular ex vivo para reprogramar células inmunitarias para la terapia contra el cáncer; transferencia autóloga o transferencia alogénica).
El ácido nucleico que está presente en una partícula lipídica según esta invención incluye cualquier forma de ácido nucleico conocida. Los ácidos nucleicos utilizados en la presente memoria pueden ser DNA o RNA monocatenario, o DNA o RNA bicatenario, o híbridos de DNA-RNA. Ejemplos de DNA bicatenario incluyen genes estructurales, genes que incluyen regiones de control y terminación y sistemas de autoreplicación tales como el DNA viral o plasmídico. Ejemplos de RNA bicatenario incluyen siRNA y otros reactivos de interferencia de RNA. Los ácidos nucleicos monocatenarios incluyen oligonucleótidos antisentido, RNA guía, incluyendo gRNA de CRISPR-Cas9, ribozimas, microRNA, mRNA y oligonucleótidos formadores de triplex. Se puede incorporar más de un ácido nucleico a la partícula lipídica, por ejemplo mRNA y RNA guía juntos, o diferentes tipos de cada uno, o en combinación con proteína.
El DNA plasmídico es un ácido nucleico preferido para formular en realizaciones de la invención. Un plásmido es una molécula de DNA que está separada del DNA cromosómico en una célula y puede replicarse de forma independiente. Los plásmidos varían desde menos de 1000 nucleótidos hasta decenas de miles de nucleótidos de tamaño. La forma más común es el DNA pequeño, circular y bicatenario. Los plásmidos pueden sintetizarse y administrarse a células de mamíferos para fines terapéuticos. Los plásmidos sintéticos se utilizan como vectores en la clonación molecular sirviendo para impulsar la replicación de secuencias de DNA recombinante dentro de los organismos huéspedes. Los plásmidos pueden introducirse en las células mediante transformación utilizando métodos físicos tales como electroporación, o medios químicos como en la presente invención, mediante transfección potenciada con partículas lipídicas. Estas composiciones de mezclas de lípidos de la invención tienen varias ventajas sobre las técnicas físicas, incluyendo i) alta biocompatibilidad y baja toxicidad en sistemas celulares y tisulares ii) relativa facilidad de fabricación iii) las matrices lipófilas son menos susceptibles a los fenómenos de erosión observados en sistemas poliméricos iv) una mayor vida media circulatoria in vivo debido a su invisibilidad del sistema inmunológico.
En algunos casos, un ácido nucleico codifica un receptor diseñado genéticamente que se une específicamente a un ligando, tal como un receptor recombinante, y una molécula implicada en una vía metabólica, o porción funcional de la misma. Alternativamente, la molécula implicada en una vía metabólica es una molécula recombinante, que incluye una entidad exógena. Un receptor modificado genéticamente y la molécula implicada en una vía metabólica pueden estar codificados por un ácido nucleico o dos o más ácidos nucleicos diferentes. En algunos ejemplos, un primer ácido nucleico podría codificar un receptor modificado genéticamente que se une específicamente a un ligando y un segundo ácido nucleico podría codificar la molécula implicada en una vía metabólica.
Los "agentes terapéuticos" como se usan en la presente memoria incluyen ácidos nucleicos terapéuticos como se describen en la presente memoria, polipéptidos como se describen en la presente memoria y polisacáridos, sales, moléculas pequeñas, iones inorgánicos y radionúclidos.
Las partículas de lípidos según algunas realizaciones de la invención se pueden caracterizar mediante microscopía electrónica. Las partículas de la invención que tienen un núcleo sustancialmente sólido tienen un núcleo denso en electrones como se ve mediante microscopía electrónica. Una de estas estructuras se describe en el documento de Patente United States Pat. No. 9,758,795 de Cullis et al. La densidad electrónica se define de manera que la densidad electrónica promedio del área del interior del 50% del área proyectada de una partícula de núcleo sólido (como se ve en una imagen crioEM 2-D) no es menor que x % (x = 20%, 40%, 60%) de la densidad máxima de electrones en la periferia de la partícula. La densidad electrónica se calcula como el valor absoluto de la diferencia en la intensidad de la imagen de la región de interés con respecto a la intensidad del fondo en una región que no contiene nanopartículas.
Las partículas lipídicas de la invención se pueden evaluar en cuanto a su tamaño utilizando dispositivos que dimensionan las partículas en solución, tal como el Malvern™ Zetasizer™. Las partículas tienen generalmente un diámetro medio de partícula de 30 nm a 1000 nm. Un subgrupo de partículas de lípidos son las "nanopartículas de lípidos" o LNP con un diámetro medio de aproximadamente 15 a aproximadamente 300 nm. En algunas realizaciones, el diámetro medio de partícula es superior a 300 nm. En algunas realizaciones, la partícula de lípidos tiene un diámetro de aproximadamente 300 nm o menos, 250 nm o menos, 200 nm o menos, 150 nm o menos, 100 nm o menos, o 50 nm o menos. En una realización, la partícula de lípidos tiene un diámetro de aproximadamente 50 a aproximadamente 150 nm. Las partículas más pequeñas generalmente presentan una mayor vida circulatoria in vivo en comparación con las partículas más grandes. Las partículas más pequeñas tienen una mayor capacidad para llegar a los sitios de los tumores que las nanopartículas más grandes. En una realización, la partícula de lípidos tiene un diámetro de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 nm.
Mezcla. Las partículas de lípidos según realizaciones de la invención se pueden preparar mediante técnicas estándar de mezclado en tubo en T, mezclado turbulento, mezclado por trituración, autoensamblaje de órdenes que promueven la agitación o mezclado pasivo de todos los elementos con autoensamblaje de elementos en nanopartículas. Se han desarrollado diversos métodos para formular nanopartículas de lípidos (LNP) que contienen fármacos genéticos. Los métodos adecuados se describen en el documento de Patente de EE.UU. No. 5,753,613 por Ansell, Mui and Hope y el documento de Patente de EE.UU No. 6,734,171 por Saravolac et al., a modo de ejemplo. Estos métodos incluyen mezclar partículas lipídicas preformadas con ácido nucleico terapéutico (NAT) en presencia de etanol o mezclar lípidos disueltos en etanol con un medio acuoso que contiene NAT y dar como resultado partículas de lípidos con eficiencias de encapsulación de NAT del 65-99 %. Ambos métodos se basan en la presencia de lípidos ionizables para lograr la encapsulación de NAT y un agente estabilizante para inhibir la agregación y la formación de grandes estructuras. Las propiedades de los sistemas de partículas de lípidos producidas, incluyendo el tamaño y la eficiencia de encapsulación de NAT, son sensibles a una variedad de parámetros de composición de la mezcla de lípidos, tales como la fuerza iónica, la concentración de lípidos y etanol, el pH, la concentración de NAT y las velocidades de mezcla. 1
Se han aplicado técnicas de microfluidos de gotitas de dos fases para producir micropartículas poliméricas monodispersas para la administración de fármacos o para producir vesículas grandes para la encapsulación de células, proteínas u otras biomoléculas. Se ha demostrado el uso de enfoque de flujo hidrodinámico, una técnica de microfluidos común para proporcionar una mezcla rápida de reactivos, para crear liposomas monodispersos de tamaño controlado.
En general, parámetros tales como las concentraciones relativas de lípidos y NAT en el momento de la mezcla, así como las velocidades de mezcla, son difíciles de controlar utilizando los procedimientos de formulación actuales, lo que da como resultado una variabilidad en las características de los NAT producidos, tanto dentro como entre preparaciones. Instrumentos de micromezcla automática tal como el instrumento NanoAssemblr® (Precision NanoSystems Inc, Vancouver, Canadá) permiten la fabricación rápida y controlada de nanomedicinas (liposomas, nanopartículas de lípidos y nanopartículas poliméricas). El instrumento NanoAssemblr® logra un autoensamblaje molecular controlado de nanopartículas a través de cartuchos de mezcla de microfluidos que permiten la mezcla en milisegundos de componentes de nanopartículas a escala de nanolitros, microlitros o mayor con personalización o paralelización. La mezcla rápida a pequeña escala permite un control reproducible sobre la síntesis y la calidad de las partículas que no es posible en instrumentos más grandes.
Los métodos preferidos incorporan instrumentos tales como los dispositivos de mezcla de microfluidos como el NanoAssemblr® Spark™, Ignite™, Benchtop™ y NanoAssamblr® Blaze™ para lograr que casi el 100% del ácido nucleico utilizado en el proceso de formación quede encapsulado en las partículas en una sola etapa. En una realización, las partículas de lípido se preparan mediante un proceso mediante el cual de aproximadamente el 90 % a aproximadamente el 100 % del ácido nucleico utilizado en el proceso de formación se encapsula en las partículas.
Los documentos de Patente de EE.UU Nos. 9,758,795 y 9,943,846, de Cullis et al. describen métodos de uso de tecnología de mezcla de pequeño volumen y nuevas formulaciones derivadas de la misma. La solicitud de Patente U.S. Application Pub. No. 20160022580 de Ramsay et al. describe métodos más avanzados de uso de tecnología y productos de mezcla de pequeños volúmenes para formular diferentes materiales. El documento de Patente de EE.UU No. 9,943,846 de Walsh, et al. describe mezcladores de microfluidos con diferentes recorridos y pocillos para los elementos a mezclar. El documento de Patente PCT Publication WO2017117647 de Wild, Leaver y Taylor describe mezcladores de microfluidos con vías estériles desechables. El documento de Patente de EE.UU No. 10,076,730 de Wild, Leaver y Taylor describe geometrías de micromezcla toroidales bifurcadas y su aplicación a la micromezcla. El documento de Patente PCT Publication No. WO2018006166 de Chang, Klaassen, Leaver et al. describe un micromezclador automatizado programable y chips de mezcla para el mismo. Los diseños estadounidenses Nos. D771834, D771833, D772427 y D803416 de Wild y Leaver, y D800335, D800336 y D812242 de Chang et al., describen cartuchos de mezcla que tienen microcanales y geometrías de mezcla para instrumentos de mezclas vendidos por Precision NanoSystems Inc.
En realizaciones de la invención, se usan dispositivos para mezcla de microfluidos biológicos para preparar las partículas de lípidos según realizaciones de la invención. Los dispositivos incluyen una primera y una segunda corriente de reactivos, que se introducen en el mezclador de microfluidos y las partículas de lípidos se recogen de la salida o emergen a un entorno estéril.
La primera corriente incluye un agente terapéutico en un primer disolvente. Los primeros disolventes adecuados incluyen disolventes en los que los agentes terapéuticos son solubles y que son miscibles con el segundo disolvente. Los primeros disolventes adecuados incluyen tampones acuosos. Los primeros disolventes representativos incluyen tampones de citrato y acetato u otros tampones de pH bajo.
La segunda corriente incluye materiales de mezcla de lípidos en un segundo disolvente. Los segundos disolventes adecuados incluyen disolventes en los que los lípidos ionizables según las realizaciones de la invención son solubles y que son miscibles con el primer disolvente. Los segundos disolventes adecuados incluyen 1,4-dioxano, tetrahidrofurano, acetona, acetonitrilo, dimetilsulfóxido, dimetilformamida, ácidos y alcoholes. Los segundos disolventes representativos incluyen etanol acuoso al 90% o etanol anhidro.
En una realización de la invención, un dispositivo adecuado incluye uno o más microcanales (es decir, un canal que tiene su mayor dimensión inferior a 1 milímetro). En un ejemplo, el microcanal tiene un diámetro de aproximadamente 20 a aproximadamente 300 pm. En ejemplos, al menos una región del microcanal tiene una dirección de flujo principal y una o más superficies que tienen al menos una ranura o protuberancia definida en la misma, teniendo la ranura o protuberancia una orientación que forma un ángulo con la dirección principal (por ejemplo, un mezclador en espiga escalonada), como se describe en el documento de Patente de Estadios Unidos Pub. No. 9,943,846, o un flujo toroidal bifurcado como se describe en el documento de Patente de Estados Unidos No. 10,076,730. Para lograr velocidades de mezclado máximas, es ventajoso evitar una resistencia fluídica indebida antes de la región de mezclado. Por lo tanto, un ejemplo de dispositivo tiene canales no microfluídicos que tienen dimensiones superiores a 1000 pm, para suministrar los fluidos a un único canal de mezcla.
Métodos e instrumentos de mezcla menos automatizados tales como los descritos en Zhang, S-h et al.,2 y Stroock A et al., Solicitud de Patente de EE.UU publicada US20040262223 y Jeffs, LB et al.3, también son útiles para crear composiciones de partículas de lípidos de la invención.
Los lípidos ionizables de la presente invención se pueden usar para administrar un agente terapéutico a una célula, in vitro o in vivo. En realizaciones particulares, el agente terapéutico es un ácido nucleico, que se suministra a una célula usando partículas de ácido nucleico-lípido de la presente invención. El ácido nucleico puede ser un siRNA, un miRNA, un LNA, un plásmido, un replicón, un mRNA, un RNA guía, un transposón o un gen único. En otras realizaciones, el agente terapéutico que se administrará a una célula o células es una tecnología de edición de genes. Las tecnologías de edición de genes son un grupo de tecnologías que cambian el DNA de un organismo y permiten la adición, eliminación o alteración de material genético en localizaciones particulares del genoma. Existen varios métodos para la edición del genoma, incluyendo CRISPR-Cas9 (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas y proteína 9 asociada a CRISPR), TALEN y ZFN4.
En otras realizaciones, el agente terapéutico es un oligopéptido, polipéptido o proteína que se administra a una célula usando partículas de péptido-lípido de la presente invención. En otras realizaciones, el agente terapéutico es una mezcla de ácido nucleico y componentes proteicos, tal como Cas9. Los métodos y las composiciones de mezclas de lípidos pueden adaptarse fácilmente para la administración de cualquier agente terapéutico adecuado para el tratamiento de cualquier enfermedad o trastorno que se beneficiaría de dicho tratamiento.
En determinadas realizaciones, la presente invención proporciona métodos para introducir un ácido nucleico en una célula (es decir, transfección). La transfección es una técnica comúnmente utilizada en biología molecular para la introducción de ácidos nucleico terapéuticos (o NATs) desde el espacio extracelular al intracelular con el propósito de transcripción, traducción y expresión de los genes administrados o para regular negativamente la expresión de un gen relacionado con la enfermedad. La eficiencia de la transfección se define comúnmente como i) el porcentaje de células en la población total tratada que muestran una expresión positiva del gen administrado, medida mediante imágenes de células vivas o fijadas (para la detección de proteínas fluorescentes) y citometría de flujo o ii) la intensidad o cantidad de proteína expresada por las células tratadas según se analiza mediante imágenes de células vivas o fijadas o citometría de flujo o iii) usando técnicas de cuantificación de proteínas tales como ELISA o transferencia de Western. Estos métodos se pueden llevar a cabo poniendo en contacto las partículas o composiciones de mezclas de lípidos de la presente invención con las células durante un período de tiempo suficiente para que se produzca la administración intracelular.
Las aplicaciones típicas incluyen el uso de procedimientos bien conocidos para proporcionar administración intracelular de siRNA para derribar o silenciar objetivos celulares específicos in vitro e in vivo. Alternativamente, las aplicaciones incluyen la administración de secuencias de DNA o mRNA que codifican polipéptidos terapéuticamente útiles. De esta manera se proporciona terapia para enfermedades genéticas mediante el suministro de productos genéticos deficientes o ausentes. Los métodos de la presente invención se pueden practicar in vitro, ex vivo o in vivo. Por ejemplo, las composiciones de mezclas de lípidos de la presente invención también se pueden usar para administrar ácidos nucleicos a células in vivo, usando métodos que son conocidos por los expertos en la técnica. En otro ejemplo, las composiciones de mezcla de lípidos de la invención se pueden usar para administrar ácidos nucleicos a una muestra de células del paciente que son ex vivo y después se devuelven al paciente.
La administración de ácidos nucleicos terapéuticos mediante una partícula de lípidos de la invención se describe a continuación.
Para la administración in vivo, las composiciones farmacéuticas se administran preferiblemente por vía parenteral (por ejemplo, por vía intraarticular, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intratecal, intradérmica, intratraqueal, intraósea, intramuscular o intratumoral). En realizaciones particulares, las composiciones farmacéuticas se administran por vía intravenosa, intratecal o intraperitoneal mediante una inyección en bolo. Otras vías de administración incluyen tópica (piel, ojos, membranas mucosas), oral, pulmonar, intranasal, sublingual, rectal y vaginal.
Para aplicaciones ex vivo, las composiciones farmacéuticas se administran preferiblemente a muestras biológicas que han sido extraídas del organismo, después las células se lavan y se devuelven al organismo. El organismo puede ser un mamífero y, en particular, puede ser un ser humano. Este proceso se utiliza para la reprogramación celular, la restauración genética, la inmunoterapia, por ejemplo.
En una realización, la presente invención proporciona un método para modular la expresión de un polinucleótido o polipéptido objetivo. Estos métodos generalmente comprenden poner en contacto una célula con una partícula de lípido de la presente invención que está asociada con un ácido nucleico capaz de modular la expresión de un polinucleótido o polipéptido objetivo. Como se usa en la presente memoria, el término "modular" se refiere a alterar la expresión de un polinucleótido o polipéptido objetivo. Modular puede significar aumentar o mejorar, o puede significar disminuir o reducir.
En la presente memoria se describe un método para tratar una enfermedad o trastorno caracterizado por la sobreexpresión de un polipéptido en un sujeto, que comprende proporcionar al sujeto una composición farmacéutica de la presente invención, en donde el agente terapéutico se selecciona de un siRNA, un microRNA, un oligonucleótido antisentido y un plásmido capaz de expresar un siRNA, un microRNA o un oligonucleótido antisentido, y en donde el siRNA, microRNA o RNA antisentido incluye un polinucleótido que se une específicamente a un polinucleótido que codifica el polipéptido, o un complemento del mismo.
En la presente memoria se describe un método para tratar una enfermedad o trastorno caracterizado por la sub expresión de un polipéptido en un sujeto, que comprende proporcionar al sujeto una composición farmacéutica de la presente invención, en donde el agente terapéutico se selecciona de un mRNA, un RNA de autoamplificación (SAM o saRNA), un DNA de autoreplicación o un plásmido, incluye un ácido nucleico terapéutico que codifica o expresa específicamente el polipéptido sub-expresado, o un complemento del mismo.
Los métodos de administración de agentes biológicos activos para el tratamiento de enfermedades incluyen, en una realización, los compuestos, composiciones, métodos y usos de la invención que son para administrar un agente biológicamente activo a células hepáticas (por ejemplo, hepatocitos). En una realización, los compuestos, composiciones, métodos y usos de la invención son para administrar un agente biológicamente activo a un tumor o a células tumorales (por ejemplo, un tumor primario o células cancerosas metastásicas). En otra realización, los compuestos, composiciones, métodos y usos son para administrar un agente biológicamente activo a la piel grasa, los músculos y los ganglios linfáticos (dosificación subcutánea).
Para la administración de un agente biológicamente activo al hígado o a las células hepáticas, en una realización, una composición de la invención se pone en contacto con el hígado o las células hepáticas mediante administración parenteral (por ejemplo, administración intravenosa, intramuscular, subcutánea) o administración local (por ejemplo, inyección directa, inyección en la vena porta, cateterismo, colocación de stent), para facilitar la administración. Para la administración de un agente biológicamente activo al riñón o a las células del riñón, en una realización una composición de la invención se pone en contacto con el riñón o las células del riñón del paciente mediante administración parenteral (por ejemplo, administración intravenosa, intramuscular, subcutánea) o administración local (por ejemplo, inyección directa, cateterismo, colocación de stent), para facilitar la administración. Para la administración de un agente biológicamente activo a un tumor o células tumorales, en una realización, una composición de la invención se pone en contacto con el tumor o las células tumorales del paciente mediante administración parenteral (por ejemplo, administración intravenosa, intramuscular, subcutánea) o administración local (por ejemplo, inyección directa, cateterismo, colocación de stent) para facilitar la administración.
Para la administración de un agente biológicamente activo al CNS o células del CNS, en una realización, una composición de la invención se pone en contacto con el CNS o células del CNS (por ejemplo, células cerebrales y/o células de la médula espinal) del paciente mediante administración parenteral (por ejemplo, administración intravenosa, intramuscular, subcutánea) o administración local (por ejemplo, inyección directa, cateterismo, colocación de stent, administración de bomba osmótica (por ejemplo, intratecal o ventricular)), para facilitar la administración. Para la administración de un agente biológicamente activo al sistema nervioso periférico (PNS) o células del PNS, en una realización una composición de la invención se pone en contacto con el PNS o las células del PNS del paciente mediante administración parenteral (por ejemplo, administración intravenosa, intramuscular, subcutánea) o administración local (por ejemplo, inyección directa), para facilitar la administración. Para la administración de un agente biológicamente activo a un pulmón o células pulmonares, en una realización una composición de la invención se pone en contacto con el pulmón o células pulmonares del paciente mediante administración parenteral (por ejemplo, administración intravenosa, intramuscular, subcutánea) o administración local (por ejemplo, administración pulmonar directamente a los tejidos y células pulmonares), para facilitar la administración.
Para la administración de un agente biológicamente activo a la vasculatura o las células vasculares, en una realización, una composición de la invención se pone en contacto con la vasculatura o las células vasculares del paciente mediante administración parenteral (por ejemplo, administración intravenosa, intramuscular, subcutánea) o administración local (por ejemplo, pinzamiento, cateterismo, colocación de stent), para facilitar la administración.
Para la administración de un agente biológicamente activo a la piel o a las células de la piel (por ejemplo, células de la dermis y/o células foliculares), en una realización, una composición de la invención se pone en contacto con la piel o las células de la piel (por ejemplo, células de la dermis y/o células foliculares) del paciente mediante administración parenteral (por ejemplo, administración intravenosa, intramuscular, subcutánea) o administración local (por ejemplo, aplicación dérmica directa, iontoforesis), para facilitar la administración. Para la administración de un agente biológicamente activo a un ojo o a células oculares (por ejemplo, mácula, fóvea, córnea, retina), en una realización, una composición de la invención se pone en contacto con el ojo o las células oculares (por ejemplo, mácula, fóvea, córnea, retina) del paciente mediante administración parenteral (por ejemplo, administración intravenosa, intramuscular, subcutánea) o administración local (por ejemplo, inyección directa, inyección intraocular, inyección periocular, subretiniana, iontoforesis, uso de gotas para los ojos, implantes), para facilitar la administración. Para la administración de un agente biológicamente activo a un oído o células del oído (por ejemplo, células del oído interno, oído medio y/u oído externo), en una realización la composición de la invención se pone en contacto con el oído o las células del oído ( por ejemplo, células del oído interno, oído medio y/u oído externo) del paciente como se conoce generalmente en la técnica, tal como mediante administración parenteral (por ejemplo, administración intravenosa, intramuscular, subcutánea) o administración local (por ejemplo, inyección directa), para facilitar la administración. Para la administración de un agente biológicamente activo (por ejemplo, RNA que codifica un inmunógeno) a células del sistema inmunológico (por ejemplo, células presentadoras de antígenos, incluyendo células presentadoras de antígenos profesionales), en una realización la composición de la invención se administra por vía intramuscular, después de lo cual las células inmunes pueden infiltrarse en el sitio de administración y procesar el RNA administrado y/o procesar el antígeno codificado producido por células no inmunes, tales como células musculares. Dichas células immunes pueden incluir macrófagos (por ejemplo, macrófagos derivados de la médula ósea), células dendríticas (por ejemplo, células dendríticas plasmocitoides derivadas de la médula ósea y/o células dendríticas mieloides derivadas de la médula ósea), monocitos (por ejemplo, monocitos de sangre periférica humana), etc. (véase, por ejemplo, el documento de Patente WO2012/006372 de Geall, Andy et al.).
Inmunización. Para fines de inmunización, una composición de la invención generalmente se preparará como un inyectable, un aerosol pulmonar o nasal, o en un dispositivo de administración (por ejemplo, jeringa, nebulizador, pulverizador, inhalador, parche dérmico, etc.). Este dispositivo de administración se puede usar para administrar una composición farmacéutica a un sujeto, por ejemplo, a un ser humano, para la inmunización.
Según la invención, para fines de inmunización, en algunas realizaciones, la invención abarca la administración de un RNA que codifica un inmunógeno. Este inmunógeno provoca una respuesta inmunitaria que reconoce el inmunógeno para proporcionar inmunidad contra un patógeno, o contra un alérgeno o contra un antígeno tumoral. Se prefiere la inmunización contra enfermedades y/o infecciones provocadas por un patógeno.
El RNA se administra con una composición de lípidos de la invención (por ejemplo, formulada como un liposoma o LNP). En algunas realizaciones, la invención utiliza LNPs dentro de los cuales se encapsula el RNA que codifica el inmunógeno. La encapsulación dentro de LNPs puede proteger el RNA de la digestión con RNasa. La eficiencia de encapsulación no tiene por qué ser del 100%. Es aceptable la presencia de moléculas de RNA externas (por ejemplo, en la superficie exterior de un liposoma o LNP) o moléculas de RNA "desnudas" (moléculas de RNA no asociadas con un liposoma o LNP). Preferiblemente, para una composición que comprende lípidos y moléculas de RNA, al menos la mitad de las moléculas de RNA (por ejemplo, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 % o al menos el 99 % de las moléculas de RNA) están encapsuladas en LNPs o LNPs complejados.
Algunas nanopartículas lipídicas pueden comprender un núcleo lipídico (por ejemplo, la composición puede comprender una mezcla de LNPs y nanopartículas con un núcleo lipídico). En tales casos, las moléculas de RNA pueden encapsularse mediante LNPs que tienen un núcleo acuoso y formar complejos con las LNPs que tienen un núcleo lipídico mediante interacciones no covalentes (por ejemplo, interacciones iónicas entre RNA cargado negativamente y lípidos catiónicos). La encapsulación y formación de complejos con LNPs (ya sea con un núcleo lipídico o acuoso) pueden proteger el RNA de la digestión con RNasa. La eficiencia de encapsulación/complejación no tiene que ser del 100%. Es aceptable la presencia de moléculas de RNA "desnudas" (moléculas de<r>N<a>no asociadas a un liposoma). Preferiblemente, para una composición que comprende una población de LNPs y una población de moléculas de RNA, al menos la mitad de la población de moléculas de RNA (por ejemplo, al menos, por ejemplo, al menos el 50 %, al menos el 55 %, al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 % o al menos el 95 % de las moléculas de RNA) están encapsuladas en LNPs o formando complejos con LNPs.
Para la administración de RNA que codifica un inmunógeno, el intervalo preferido de diámetros de LNP está en el intervalo de 60 a 180 nm y, en realizaciones más particulares, en el intervalo de 80 a 160 nm. Una LNP puede ser parte de una composición que comprende una población de LNPs, y las LNPs dentro de la población pueden tener una variedad de diámetros. Para una composición que comprende una población de LNPs con diferentes diámetros, se prefiere que (i) al menos el 80% en número de las LNPs tengan diámetros en el intervalo de 60-180 nm, por ejemplo, en el intervalo de 80-160 nm, (ii) el diámetro promedio (por intensidad, por ejemplo, promedio Z) de la población está idealmente en el intervalo de 60-180 nm, por ejemplo, en el intervalo de 80-160 nm; y/o los diámetros dentro de la pluralidad tienen un índice de polidispersidad <0,2. Para obtener LNPs con los diámetros deseados, la mezcla se puede realizar usando un proceso en donde se combinan dos corrientes de alimentación de solución acuosa de RNA en una única zona de mezcla con una corriente de una solución lipídica etanólica, todas con el mismo caudal, por ejemplo, en un canal de microfluidos. Véase otra descripción relacionada con mezcladores de microfluidos NanoAssemblr® vendidos por Precision NanoSystems Inc., Vancouver, Canadá.
Las mezclas útiles de lípidos, para formar composiciones lipídicas (por ejemplo, LNPs) para usos de inmunización, comprenden: un lípido de fórmula (I); un lípido estructural, el colesterol; y un agente estabilizante, tal como PEG-DMG. El lípido estructural es un lípido zwitteriónico neutro, tal como DSPC (1,2-diastearoil-sn-glicero-3-fosfocolina) o DSPE en algunas realizaciones. En determinadas realizaciones, las composiciones lipídicas proporcionadas por la invención (tales como LNPs) tienen actividad adyuvante, es decir, en ausencia de un inmunógeno, tal como un antígeno proteico o un ácido nucleico (DNA o RNA), tal como un ácido nucleico que codifica dicho un antígeno.
Moléculas de RNA. Después de la administración in vivo de una composición de inmunización, el RNA administrado se libera y se traduce dentro de una célula para proporcionar el inmunógeno in situ. En determinadas realizaciones, el RNA tiene una cadena positiva ("+"), por lo que las células pueden traducirlo sin necesidad de ningún etapa de replicación intermedia, tal como la transcripción inversa. En determinadas realizaciones, el RNA es un RNA de autoreplicación. Una molécula de RNA de auto-replicación (replicón) puede, cuando se administra a una célula de vertebrado incluso sin ninguna proteína, conducir a la producción de múltiples RNA hijos mediante la transcripción de sí mismo (mediante una copia antisentido que genera a partir de sí misma). Una molécula de RNA de auto-replicación es, por lo tanto, en determinadas realizaciones: una molécula de cadena (+) que puede traducirse directamente después de su administración a una célula, y esta traducción proporciona una RNA polimerasa dependiente de RNA que después produce transcritos tanto antisentido como sentido a partir del RNA adiministrado. Por lo tanto, el RNA administrado conduce a la producción de múltiples RNAs hijos. Estos RNAs hijos, así como los transcritos subgenómicos colineales, pueden traducirse ellos mismos para proporcionar la expresión in situ de un inmunógeno codificado, o pueden transcribirse para proporcionar transcritos adicionales con el mismo sentido que el RNA administrado que se traducen para proporcionar la expresión in situ del inmunógeno. El resultado global de esta secuencia de transcripciones es una amplificación en el número de replicones de RNAs introducidos y, por lo tanto, el inmunógeno codificado se convierte en un producto polipeptídico importante de las células huésped.
Un sistema adecuado para lograr la autorreplicación es utilizar un replicón de RNA basado en alfavirus. Estos replicones de cadena (+) se traducen después de su administración a una célula para producir una replicasa (o replicasa-transcriptasa). La replicasa se traduce como una poliproteína que se autoescinde para proporcionar un complejo de replicación que crea copias genómicas de la cadena (-) del RNA administrado de cadena (+). Estos transcritos de cadena (-) pueden transcribirse ellos mismos para dar copias adicionales del RNA original de cadena (+) y también para dar un transcrito subgenómico que codifica el inmunógeno. La traducción del transcrito subgenómico conduce así a la expresión in situ del inmunógeno mediante la célula infectada. Los replicones de alfavirus adecuados pueden utilizar una replicasa de un virus sindbis, un virus del bosque semliki, un virus de la encefalitis equina oriental, un virus de la encefalitis equina venezolana, etc.
En los replicones se pueden utilizar secuencias de virus mutantes o de tipo nativo tales como el mutante TC83 atenuado de VEEV. Por lo tanto, una molécula de RNA de auto-replicación preferida codifica (I) una RNA polimerasa dependiente de RNA que puede transcribir RNA a partir de la molécula de RNA de auto-replicación y (ii) un inmunógeno. La polimerasa puede ser una replicasa de alfavirus, por ejemplo, que comprende una o más de las proteínas de alfavirus nsPI, nsP2, nsP3 y nsP4. Mientras que los genomas de alfavirus naturales codifican proteínas estructurales del virión además de la poliproteína replicasa no estructural en realizaciones particulares, una molécula de RNA de auto-replicación de la invención no codifica proteínas estructurales de alfavirus. Por lo tanto, un determinado RNA de auto-replicación puede conducir a la producción de copias de RNA genómico de sí mismo en una célula, pero no a la producción de viriones que contengan RNA. Las proteínas estructurales de alfavirus que son necesarias para la perpetuación en virus de tipo nativo están ausentes en los RNAs de auto-replicación de la invención y su lugar lo ocupan genes que codifican el inmunógeno de interés, de modo que el transcrito subgenómico codifica el inmunógeno en lugar de las proteínas estructurales del virión del alfavirus. Por lo tanto, una molécula de RNA de auto-replicación útil con la invención puede tener dos marcos de lectura abiertos: uno codifica una replicasa, por ejemplo, el primer marco de lectura abierto (5'); el otro marco de lectura abierto codifica un inmunógeno, por ejemplo, el segundo marco de lectura abierto (3'). En algunas realizaciones, el RNA puede tener marcos de lectura abiertos adicionales (por ejemplo, posteriores), por ejemplo, para codificar inmunógenos adicionales o para codificar polipéptidos accesorios. Una molécula de RNA de auto-replicación puede tener una secuencia 5' que sea compatible con la replicasa codificada. Las moléculas de RNA de auto-replicación pueden tener varias longitudes, pero normalmente tienen entre 5000 y 25000 nucleótidos de largo, por ejemplo, 8000-15000 nucleótidos o 9000-12000 nucleótidos. Por lo tanto, el RNA es más largo que el observado en la administración de mRNA convencional. En algunas realizaciones, el RNA de auto-replicación tiene más de aproximadamente 2000 nucleótidos, tal como más de aproximadamente: 9000, 12000, 15000, 18000, 21000, 24000 o más nucleótidos de longitud.
Una molécula de RNA puede tener un cap 5' (por ejemplo, una 7-metilguanosina). Este cap puede mejorar la traducción in vivo del RNA. El nucleótido 5' de una molécula de RNA útil con la invención puede tener un grupo trifosfato 5’. En un RNA con cap, este puede estar unido a una 7-metilguanosina mediante un puente 5' a 5'. Un trifosfato 5’ puede mejorar la unión de RIG-I y promover, por lo tanto, efectos adyuvantes. Una molécula de RNA puede tener una cola poli A en 3'. También puede incluir una secuencia de reconocimiento de poli A polimerasa (por ejemplo, AAUAAA) cerca de su extremo 3'. Una molécula de RNA útil con la invención con fines de inmunización normalmente será monocatenaria. Los RNAs monocatenarios generalmente pueden iniciar un efecto adyuvante uniéndose a TLR7, TLR8, RNA helicasas y/o PKR. El RNA administrado en forma bicatenaria (dsRNA) puede unirse a TLR3, y este receptor también puede ser activado por dsRNA que se forma durante la replicación de un RNA monocatenario o dentro de la estructura secundaria de un RNA monocatenario.
Las moléculas de RNA con fines de inmunización pueden prepararse convenientemente mediante transcripción in vitro (lVT). IVT puede utilizar una plantilla (cDNA) creada y propagada en forma de plásmido en bacterias, o creada sintéticamente (por ejemplo, mediante síntesis de genes y/o métodos de ingeniería de reacción en cadena de la polimerasa (PCR)). Como se discutió en el documento de Patente WO2011/005799 de Hekele, Armin et al., el RNA de auto-replicación puede incluir (además de cualquier estructura de cap 5') uno o más nucleótidos que tengan una nucleobase modificada. Por ejemplo, un RNA de auto-replicación puede incluir una o más nucleobases de pirimidina modificadas, tales como pseudouridina y/o 5 residuos de metilcitosina. En algunas realizaciones, sin embargo, el RNA no incluye nucleobases modificadas y puede incluir nucleótidos no modificados, es decir, todos los nucleótidos en el RNA son ribonucleótidos A, C, G y U estándar (excepto cualquier estructura de cap 5', que puede incluir una 7' metilguanosina). En otras realizaciones, el RNA puede incluir un cap en 5' que comprende una 7’ metilguanosina, y los primeros I, 2 o 35’ ribonucleótidos pueden estar metilados en la posición 2' de la ribosa. Un RNA usado con la invención con fines de inmunización idealmente incluye solo enlaces fosfodiéster entre nucleósidos, pero en algunas realizaciones, contiene enlaces fosforamidato, fosforotioato y/o metilfosfonato. La invención incluye realizaciones en donde se formulan múltiples especies de RNAs con una composición lipídica proporcionada por la invención, tales como dos, tres, cuatro o más especies de RNA, incluyendo diferentes clases de RNA (tales como mRNA, siRNA, RNAs de auto-replicación, y combinaciones de los mismos).
Las moléculas de RNA de inmunógeno utilizadas con la invención con fines de inmunización, en algunas realizaciones, codifican un inmunógeno polipeptídico. En estas realizaciones, después de la administración, el RNA se traduce in vivo y el inmunógeno puede provocar una respuesta inmune en el receptor. El inmunógeno puede provocar una respuesta inmune contra un patógeno (por ejemplo, una bacteria, un virus, un hongo o un parásito) pero, en algunas realizaciones, provoca una respuesta inmune contra un alérgeno o un antígeno tumoral. La respuesta inmune puede comprender una respuesta de anticuerpos (que generalmente incluye IgG) y/o una respuesta inmune mediada por células. El inmunógeno polipeptídico normalmente provocará una respuesta inmunitaria que reconoce el polipéptido patógeno (o alérgeno o tumor) correspondiente, pero en algunas realizaciones el polipéptido puede actuar como un mimotopo para provocar una respuesta inmunitaria que reconoce un sacárido. El inmunógeno normalmente será un polipéptido de superficie, por ejemplo, una adhesina, una hemaglutinina, una glicoproteína de la envoltura, una glicoproteína de pico, etc. La molécula de RNA puede codificar un inmunógeno polipeptídico único o múltiples polipéptidos. Se pueden presentar múltiples inmunógenos como un inmunógeno polipeptídico único (polipéptido de fusión) o como polipéptidos separados. Si los inmunógenos se expresan como polipéptidos separados a partir de un replicón, entonces uno o más de ellos pueden estar provistos de un IRES anterior o de un elemento promotor viral adicional. Alternativamente, se pueden expresar múltiples inmunógenos a partir de una poliproteína que codifica inmunógenos individuales fusionados a una proteasa autocatalítica corta (por ejemplo, proteína 2A del virus de la fiebre aftosa), o como inteínas. En determinadas realizaciones, se pueden usar inmunógenos polipeptídicos (por ejemplo, I, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más inmunógenos), ya sea solos o junto con una molécula de RNA, tal como un RNA de auto-replicación, que codifica uno o más inmunógenos (ya sean iguales o diferentes que los inmunógenos polipeptídicos).
En algunas realizaciones, el inmunógeno provoca una respuesta inmune contra el coronavirus, cuyos inmunógenos incluyen, pero no se limitan a, los derivados de un SARS CoV-1, SARS-CoV-2 (Roujian Lu 1, Xiang Zhao 1, Juan Li 2, et al. "Genomic Characterisation and Epidemiology of 2019 Novel Coronavirus: Implications for Virus Origins and Receptor Binding" Lancet 2020 Feb 22 395(10224):565-574. doi: 10.1016/S0140-6736(20)30251-8. Epub 2020 Jan 30); La meningiditis de Neisseria para la cual los inmunógenos útiles incluyen, pero no se limitan a, proteínas de membrana tales como adhesinas, autotransportadores, toxinas, proteínas de adquisición de hierro y proteínas de unión al factor H. Una combinación de tres polipéptidos útiles se describe en Giuliani et al. (2006) Proc Natl Head Sci USA 103(29):10834-9; Streptococcus pneumoniae, para el cual se describen inmunógenos polipeptídicos útiles en el documento de Patente WO2009/016515 de Veja, Masignani et al. incluyendo la subunidad del pilus RrgB, el precursor de la beta-N-acetil-hexosaminidasa (spr0057), spr0096, la proteína de estrés general GSP-781 (spr2021, SP2216), la serina/treonina quinasa StkP (SP1732) y la adhesina de superficie neumocócica PsaA;
Virus de la hepatitis, cuyos inmunógenos pueden incluir antígenos de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg), virus de la hepatitis C, virus de la hepatitis delta, virus de la hepatitis E o antígenos del virus de la hepatitis G; Rabdovirus: los inmunógenos incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un rabdovirus, tales como un Lyssavirus (por ejemplo, un virus de la rabia) y Vesiculovirus (VSV); Caliciviridae, cuyos inmunógenos incluyen, pero no se limitan a, los derivados de Calciviridae, tales como el virus Norwalk (Norovirus) y virus similares a Norwalk, tales como el virus Hawaii y el virus de la Montaña Nevada; bronquitis infecciosa aviar (IBV), virus de la hepatitis del ratón (MHV) y virus de la gastroenteritis transmisible porcina (TGEV); Retrovirus, cuyos inmunógenos incluyen los derivados de un Oncovirus, un Lentivirus (por ejemplo, HIV-I o HIV-2) o un Espumavirus; Reovirus: los inmunógenos incluyen, pero no se limitan a, aquellos derivados de un Ortoreovirus, un Rotavirus, un Orbivirus o un Coltivirus; Parvovirus, cuyos inmunógenos incluyen los derivados del Parvovirus B19; Herpesvirus, cuyos inmunógenos incluyen los derivados de un herpesvirus humano, tal como los virus del herpes simple (HSV) (por ejemplo, HSV tipos I y 2), el virus varicela-zoster (VZV), el virus de EpsteinBarr (EBV), el citomegalovirus (CMV), el herpesvirus humano 6 (HHV6), Herpesvirus Humano 7 (HHV7) y Herpesvirus Humano 8 (HHV8); Papovavirus, cuyos inmunógenos incluyen los derivados de Papilomavirus y Adenovirus.
En algunas realizaciones, el inmunógeno provoca una respuesta inmune al virus Chikungunya; en otras realizaciones, el inmunógeno provoca una respuesta inmune al virus Zika.
En algunas realizaciones, el inmunógeno provoca una respuesta inmune contra un virus que infecta a los peces.
Los inmunógenos fúngicos pueden derivar de dermatofitos y otros organismos oportunistas.
En algunas realizaciones, el inmunógeno provoca una respuesta inmune contra un parásito del género Plasmodium, tal como P. falciparum, P. vivax, P. malariae o P. ovale. Por lo tanto, la invención puede usarse para inmunizar contra la malaria. En algunas realizaciones, el inmunógeno provoca una respuesta inmune contra un parásito de la familia Caligidae, particularmente aquellos de los géneros Lepeophtheirus y Caligus, por ejemplo, piojos de mar tales como Lepeophtheirus salmonis o Caligus rogercresseyi.
En algunas realizaciones, el inmunógeno es un mRNA específico de neoantígenos en células cancerosas o tumores sólidos. Peng, M., Mo, Y., Wang, Y. et al. Neoantigen vaccine: an emerging tumor immunotherapy. Mol Cancer 18, 128 (2019)).
En algunas realizaciones, el inmunógeno es un antígeno tumoral seleccionado de: (a) antígenos de cáncer de testículo tales como NY-ESO-I,<s>SX2, SCPI así como polipéptidos de la familia RAGE,<b>A<g>E, GAGE y MAGE, por ejemplo, GAGE-1, GAGE-2, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6 y MAGE-12 (que pueden usarse, por ejemplo, para tratar melanoma, tumores de pulmón, cabeza y cuello, NSCLC, mama, gastrointestinal y de vejiga; (b) antígenos mutados, por ejemplo, p53 (asociado con diversos tumores sólidos, por ejemplo, cáncer colorrectal, de pulmón, cabeza y cuello), p21/Ras (asociado con, por ejemplo, melanoma , cáncer de páncreas y cáncer colorrectal), CDK4 (asociado con, por ejemplo, melanoma), MUMI (asociado con, por ejemplo, melanoma), caspasa-8 (asociado con, por ejemplo, cáncer de cabeza y cuello), CIA 0205 (asociado con, por ejemplo, cáncer de vejiga), HLA-A2-R1701, beta catenina (asociada con, por ejemplo, melanoma), TCR (asociada con, por ejemplo, linfoma no Hodgkins de células T), BCR-abl (asociada con, por ejemplo, leucemia mielógena crónica), triosafosfato isomerasa, KIA 0205, CDC-27 y LDLRFUT; (c) antígenos sobre-expresados, por ejemplo, Galectina 4 (asociada con, por ejemplo, cáncer colorrectal), Galectina 9 (asociada con, por ejemplo, la enfermedad de Hodgkin), proteinasa 3 (asociada con, por ejemplo, leucemia mielógena crónica), WT I (asociada con, por ejemplo, diversas leucemias), anhidrasa carbónica (asociada con, por ejemplo, cáncer renal), aldolasa A (asociada con, por ejemplo, cáncer de pulmón), PRAME (asociada con, por ejemplo, melanoma), HER-2/neu ( asociado con, por ejemplo, cáncer de mama, colon, pulmón y ovario), mamaglobina, alfafetoproteína (asociada con, por ejemplo, hepatoma), KSA (asociada con, por ejemplo, cáncer colorrectal), gastrina (asociada con, por ejemplo, cáncer de páncreas y cáncer gástrico), proteína catalítica de telomerasa, MUC-I (asociada con, por ejemplo, cáncer de mama y de ovario), G-250 (asociada con, por ejemplo, carcinoma de células renales), p53 (asociada con, por ejemplo, cáncer de mama y colon), y antígeno carcinoembrionario (asociado con, por ejemplo, cáncer de mama, cáncer de pulmón y cánceres del tracto gastrointestinal tales como cáncer colorrectal); (d) antígenos compartidos, por ejemplo, antígenos de melanomamelanocitos tales como MART-1/Melan A, gp100, MCIR, receptor de la hormona estimulante de melanocitos, tirosinasa, proteína I relacionada con tirosinasa/TRPI y proteína relacionada con tirosinasa-2/TRP2 (asociado con, por ejemplo, melanoma); (e) antígenos asociados a la próstata tales como PAP, PSA, PSMA, PSH-PI, PSM-PI, PSM-P2, asociados con, por ejemplo, cáncer de próstata; (f) idiotipos de inmunoglobulinas (asociados con mieloma y linfomas de células B, por ejemplo). En determinadas realizaciones, los inmunógenos tumorales incluyen, pero no se limitan a, p15, Hom/Mel-40, H-Ras, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR, antígenos del virus de Epstein Barr, EBNA, antígenos del virus del papiloma humano (HPV), incluyendo E6 y E7, antígenos del virus de la hepatitis B y C, antígenos del virus linfotrópico de células T humanas, TSP-180, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, mn-23HI, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, p16, TAGE, PSCA, CT7, 43-9F, 5T4, 791 Tgp72, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15- 3 (CA 27.29 y BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68 y KPI, CO-029, FGF-5, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-I, RCASI, SDCCAG16, TA-90 (proteína de unión a Mac-2/proteína asociada a ciclofilina C), TAAL6, TAG72, TLP, TPS y similares.
Composiciones farmacéuticas para vacunas. Una composición farmacéutica de la invención, particularmente una útil para la inmunización, puede incluir uno o más inmunopotenciadores de molécula pequeña. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir uno o más conservantes, tales como tiomersal o 2 fenoxietanol. Se pueden preparar vacunas sin mercurio y sin conservantes.
Las composiciones comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de las composiciones lipídicas descritas en la presente memoria (por ejemplo, LNPS), así como cualquier otro componente, según sea necesario. Cantidad inmunológicamente eficaz se refiere a la cantidad administrada a un individuo, ya sea en una dosis única o como parte de una serie, que es eficaz para el tratamiento (por ejemplo, respuesta inmunitaria profiláctica contra un patógeno). Esta cantidad varía dependiendo de la salud y condición física del individuo a tratar, la edad, el grupo taxonómico del individuo a tratar (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmunológico del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la valoración de la situación médica por parte del médico tratante y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad caiga dentro de un intervalo relativamente amplio que puede determinarse mediante ensayos de rutina.
Las composiciones de la invención generalmente se expresarán en términos de cantidad de RNA por dosis. Una dosis preferida tiene ~ 100 pg de RNA (por ejemplo, de 10 a 100 pg, tal como aproximadamente 10 pg, 25 pg, 50 pg, 75 pg o 100 pg), pero la expresión se puede observar a niveles mucho más bajos, por ejemplo, ~1 pg/dosis, ~ 100 ng/dosis, ~10 ng/dosis, ~1 ng/dosis, etc. En algunas realizaciones, la dosis preferida es 100 pg. En otras realizaciones, la dosis preferida es de hasta 250 pg. La invención también proporciona un dispositivo de administración (por ejemplo, jeringa, nebulizador, pulverizador, inhalador, parche dérmico, etc.) que contiene una composición farmacéutica de la invención. Este dispositivo puede usarse para administrar la composición a un sujeto vertebrado.
El RNA formulado con LNP y las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria son para uso in vivo para inducir una respuesta inmune contra un inmunógeno de interés. La invención proporciona un método para inducir una respuesta inmune en un vertebrado que comprende administrar una cantidad eficaz del RNA formulado con LNP, o composición farmacéutica, como se describe en la presente memoria. La respuesta inmune es preferiblemente protectora y preferiblemente implica inmunidad mediada por anticuerpos y/o células. Las composiciones pueden usarse tanto para fines de cebado como de refuerzo. Alternativamente, un programa de inmunización de cebadorefuerzo puede ser una mezcla de RNA y el inmunógeno polipeptídico correspondiente (por ejemplo, cebado de RNA, refuerzo de proteínas).
La invención también proporciona una LNP o una composición farmacéutica para su uso en la inducción de una respuesta inmune en un vertebrado. La invención también proporciona el uso de una LNP o una composición farmacéutica en la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmune en un vertebrado. Al inducir una respuesta inmune en el vertebrado mediante estos usos y métodos, el vertebrado puede protegerse contra diversas enfermedades y/o infecciones, por ejemplo, contra enfermedades bacterianas y/o virales como se discutió anteriormente. Las vacunas según la invención pueden ser profilácticas (es decir, para prevenir infecciones) o terapéuticas (es decir, para tratar infecciones), pero normalmente serán profilácticas. El vertebrado es preferiblemente un mamífero, tal como un ser humano o un mamífero veterinario grande (por ejemplo, caballos, ganado vacuno, ciervos, cabras, cerdos).
Las composiciones de la invención generalmente se administrarán directamente a un paciente. La administración directa se puede lograr mediante inyección parenteral (por ejemplo, por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, intradérmica o en el espacio intersticial de un tejido). Las vías de administración alternativas incluyen rectal, oral (por ejemplo, comprimido, aerosol), bucal, sublingual, vaginal, tópica, transdérmica o transcutánea, intranasal, ocular, auditiva, pulmonar u otra administración mucosa. La administración intradérmica e intramuscular son dos vías preferidas. La inyección puede realizarse mediante una aguja (por ejemplo, una aguja hipodérmica), pero se puede utilizar alternativamente la inyección sin aguja. La dosis intramuscular típica es de 0,5 mL. La invención puede usarse para inducir inmunidad sistémica y/o mucosa, preferiblemente para provocar una inmunidad sistémica y/o mucosa mejorada. La dosificación puede ser mediante un programa de dosis única o un programa de dosis múltiples. Se pueden utilizar múltiples dosis en un calendario de vacunación primaria y/o en un calendario de vacunación de refuerzo.
En un programa de dosis múltiples, las distintas dosis pueden administrarse por la misma vía o por diferentes vías, por ejemplo, una preparación parenteral y un refuerzo mucoso, una preparación mucosa y un refuerzo parenteral, etc. Normalmente se administrarán dosis múltiples con al menos una semana de diferencia (por ejemplo, aproximadamente dos semanas, aproximadamente tres semanas, aproximadamente cuatro semanas, aproximadamente seis semanas, aproximadamente ocho semanas, aproximadamente diez semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc.). En una realización, se pueden administrar dosis múltiples aproximadamente seis semanas, diez semanas y 14 semanas después del nacimiento, por ejemplo, a una edad de seis semanas, diez semanas y 14 semanas, como se utiliza a menudo en el World Health Organization’s Expanded Program on Immunization (“EPI”). En una realización alternativa, se administran dos dosis primarias con aproximadamente dos meses de diferencia, por ejemplo, con un intervalo de aproximadamente siete, ocho o nueve semanas, seguidas de una o más dosis de refuerzo aproximadamente seis meses y un año después de la segunda dosis primaria, por ejemplo, aproximadamente seis, ocho, diez o 12 meses después de la segunda dosis primaria. En una realización adicional, se administran tres dosis primarias con un intervalo de aproximadamente dos meses, por ejemplo, con siete, ocho o nueve semanas de diferencia, seguidas de una o más dosis de refuerzo aproximadamente seis meses y un año después de la tercera dosis primaria.
Edición de genes. La edición de genes es un grupo de tecnologías que se pueden utilizar para cambiar el DNA de un organismo añadiendo, eliminando o modificando la secuencia genética en localizaciones particulares en el genoma. Se han desarrollado varios enfoques para la edición del genoma, incluyendo CRISPR-Cas9 (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas) y la proteína 9 asociada a CRISPR. CRISPR-Cas9 se adaptó de un sistema de edición del genoma en bacterias que capturan fragmentos de DNA de virus invasores y crean segmentos de DNA conocidos como matrices CRISPR. Las matrices CRISPR permiten que las bacterias "recuerden" los virus, por lo que si los virus atacan nuevamente, las bacterias producen segmentos de RNA a partir de las matrices CRISPR para dirigirse al DNA de los virus. Después, la bacteria usa Cas9 o una enzima similar para cortar el DNA, lo que desactiva el virus.
El sistema CRISPR-Cas9 adaptado para la edición de genes funciona de manera similar. Se genera un pequeño trozo de RNA con una secuencia "guía" corta que se adjunta (se une) a una secuencia objetivo específica del DNA en un genoma. El RNA también se une a la enzima Cas9. Al igual que en las bacterias, el RNA modificado se utiliza para reconocer la secuencia de DNA y la enzima Cas9 corta el DNA en el lugar objetivo. Aunque Cas9 es la enzima que se usa con mayor frecuencia, también se pueden usar otras enzimas (por ejemplo Cpf1). Una vez que se corta el DNA, los investigadores utilizan la propia maquinaria de reparación del DNA de la célula para añadir o eliminar fragmentos de material genético, o para realizar cambios en el DNA sustituyendo un segmento existente con una secuencia de DNA personalizada.
En realizaciones de la invención, los nuevos lípidos ionizables encuentran uso como parte de la administración de, por ejemplo, una secuencia de polinucleótidos de RNA quimérico del sistema CRISPR-Cas para modificar un organismo mediante la manipulación de una secuencia objetivo en un locus genómico de interés. Otros componentes de ácido nucleico podrían incluir una secuencia guía capaz de hibridarse con una secuencia objetivo en una célula eucariota, una secuencia tracr mate y una secuencia tracr tal como la descrita en el documento de Patente WO14204726 A1 de CHZHAN Fen et al.
Los sistemas CRISPR~Cas9 se usan en realizaciones para dirigirse a genes en células vivas mediante la administración del sistema CRISPR-Cas9 a la localización apropiada (es decir, a células dentro de los órganos o tejidos de interés). Los tejidos preferidos se encuentran dentro de los siguientes órganos: riñón; sistema digestivo incluyendo estómago, páncreas, duodeno, íleon y/o colon; pulmón; cerebro, en particular neuronas, y/o CNS en general; ojo, incluyendo el tejido de la retina; oído, incluyendo el oído interno; piel; músculo; hueso; y/o hígado en general.
Los genes sujetos a edición usando lípidos ionizables y composiciones según realizaciones de la invención serán aquellos asociados con enfermedades.
En realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria se pueden preparar mediante cualquier método conocido o desarrollado en lo sucesivo en la técnica de la farmacología. En general, dichos métodos preparatorios incluyen la etapa de asociar el ingrediente activo con un excipiente y/o uno o más ingredientes accesorios.
Una composición farmacéutica según la presente divulgación se puede preparar, envasar y/o vender a granel, como una dosis unitaria única y/o como una pluralidad de dosis unitarias únicas. Como se usa en la presente memoria, una "dosis unitaria" se refiere a una cantidad discreta de la composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del ingrediente activo. La cantidad del ingrediente activo puede ser generalmente igual a la dosis del ingrediente activo que se administraría a un sujeto y/o una fracción conveniente de dicha dosis que incluye, pero no se limita a, la mitad o un tercio de dicha dosis.
Las cantidades relativas del ingrediente activo, el excipiente farmacéuticamente aceptable y/o cualquier ingrediente adicional en una composición farmacéutica según la presente divulgación pueden variar, dependiendo de la identidad, tamaño y/o condición del sujeto que se está tratando y dependiendo además de la vía por la cual se va a administrar la composición. Por ejemplo, la composición puede comprender entre 0,1 por ciento y 99 por ciento (p/p) del ingrediente activo.
Las formulaciones farmacéuticas pueden comprender adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable, que, como se usa en la presente memoria, incluye, pero no se limita a, todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, diluyentes u otros vehículos líquidos, auxiliares de dispersión o suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes y similares, según sea adecuado para la forma de dosificación particular deseada. En la técnica se conocen varios excipientes para formular composiciones farmacéuticas y técnicas para preparar la composición (véase Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro, Lippincott, Williams and Wilkins, Baltimore, MD, 2006). En la presente memoria se contempla el uso de un medio excipiente convencional, excepto en la medida en que cualquier medio excipiente convencional pueda ser incompatible con una sustancia o sus derivados, tal como al producir cualquier efecto biológico indeseable o interactuar de otra forma de manera nociva con cualquier otro componente de la composición farmacéutica.
En algunas realizaciones, el tamaño de partícula de las partículas lipídicas se puede aumentar y/o disminuir. El cambio en el tamaño de las partículas puede ayudar a contrarrestar reacciones biológicas tales como, pero no limitado a, la inflamación o puede aumentar el efecto biológico de la NAT administrada a los mamíferos al cambiar la biodistribución. El tamaño también se puede utilizar para determinar el tejido objetivo, con las partículas más grandes siendo eliminadas rápidamente y las más pequeñas llegando a diferentes sistemas de órganos.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables usados en la fabricación de composiciones farmacéuticas incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, agentes tensioactivos y/o emulsionantes, conservantes, agentes tamponantes, agentes lubricantes y/o aceites. Dichos excipientes pueden incluirse opcionalmente en las formulaciones farmacéuticas de la invención.
En algunas realizaciones, el mRNA, plásmido u otro NAT ejemplar codifica la proteína o enzima seleccionada de hormona de crecimiento humana, eritropoyetina, transportador del casete de unión a ATP (ABC), alfa-1-antitripsina, alfa glucosidasa ácida, arilsulfatasa A, carboxipeptidasa N, a-galactosidasa A, alfa-L-iduronidasa, iduronato-2-sulfatasa, iduronato sulfatasa, N-acetilglucosamina-1-fosfato transferasa, N-acetilglucosaminidasa, alfa-glucosaminida acetiltransferasa, N-acetilglucosamina 6-sulfatasa, N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa, beta-glucosidasa, galactosassulfato sulfatasa, beta-galactosidasa, beta-glucuronidasa, BMPER-2, glucocerebrosidasa, heparán sulfamidasa, heparina-N-sulfatasa, lipasa ácida lisosomal, hialuronidasa, galactocerebrosidasa, ornitina transcarbamilasa (OTC), carbamoilfosfato sintetasa 1 (CPS 1), argininosuccinato sintetasa (ASS 1), argininosuccinato liasa (ASL), arginasa 1 (ARGI), regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), neurona motora de supervivencia (SMN), factor VIII, factor IX, nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción como TALENS, nucleasas con dedos de zinc (ZFNs), proteína 9 asociada a (CRISPR) (Cas9), RNA de auto-replicación y receptores de lipoproteínas de baja densidad (LDLR).
Se pueden aplicar otros plásmidos o ácidos nucleicos a sistemas basados en células usando esta invención en el contexto de una plataforma de investigación o detección. Estos incluyen la introducción de material genético con el fin de inducir cambios fisiológicos o funcionales específicos en las células, tales como en el proceso de reprogramación para la generación de células madre pluripotentes inducidas. En este caso, se introducen genes específicos (conocidos como factores de Yamanaka) en las células somáticas derivadas del paciente, lo que desencadena una reversión de la célula a un estado similar a una célula madre. Estos permiten que las células se dividan indefinidamente y se vuelvan pluripotentes (capaces de diferenciarse en muchos otros tipos de células posteriores) que pueden usarse tanto para investigación como para aplicaciones clínicas. Estos y otras etapas similares de manipulación genética pueden mejorarse mediante las partículas lipídicas de la invención para mejorar la eficiencia de los procesos comúnmente utilizados cuando se trabaja con células madre inducidas.
La siguiente es una descripción de partículas lipídicas representativas preparadas con ácido nucleico (LNP), cómo se fabrican, evidencia de sus ventajas y métodos para usarlas para administrar beneficios terapéuticos.
La composición de la mezcla de lípidos de partículas lipídicas se generó mezclando rápidamente una solución de lípido-etanol con un tampón acuoso dentro de un mezclador de microfluidos diseñado para inducir una advección caótica y proporcionar un entorno de mezcla controlado con un número de Reynolds intermedio (24 < Re < 1000). Los canales de microfluidos tienen características de espiga o están configurados de la manera que se muestra en el documento de Patente PCT Publication WO2017117647 de Wild, Leaver and Taylor.
Los tamaños de partícula y el "índice de polidispersidad" (PDI) de la partícula lipídica se midieron mediante dispersión dinámica de luz (DLS). PDI indica el ancho de la distribución de partículas. Este es un parámetro calculado a partir de un análisis acumulativo de la función de autocorrelación de intensidad medida mediante (DLS) suponiendo un modo de tamaño de partícula único y un ajuste exponencial único a la función de autocorrelación. Desde un punto de vista biofísico, un PDI inferior a 0,1 indica que la muestra es monodispersa. Las partículas producidas por micromezcladores mecánicos tal como el NanoAssemblr® Spark™ y NanoAssamblr® Benchtop (Precisión NanoSystems Inc.) tienen un tamaño sustancialmente homogéneo, asumiendo que todas las demás variables son neutrales. Un PDI más bajo indica una población más homogénea de partículas lipídicas. El instrumento Spark™ se utiliza en un entorno de detección para identificar las composiciones principales. Una vez seleccionada la composición, la partícula lipídica se puede ajustar utilizando el NanoAssemblr® Benchtop. Una vez que se identifican los parámetros del proceso, relación de caudal y velocidad de flujo total para la composición de nanopartículas específica, la tecnología de nanopartículas se puede escalar utilizando los mismos valores de los parámetros del proceso.
En realizaciones preferidas, el ácido nucleico es un plásmido compuesto de ácido desoxirribonucleico bicatenario. Un plásmido es una estructura genética que reside en el citoplasma de una célula (a diferencia del núcleo nucleico donde reside la genética celular tradicional) que puede replicarse independientemente de los cromosomas, generalmente una pequeña cadena circular de DNA. Los plásmidos también se pueden utilizar para crear nuevos modelos celulares o animales para la investigación médica. Los plásmidos son una herramienta importante en biología molecular y como terapia emergente debido a su i) facilidad de manipulación y aislamiento ii) capacidad de autorreplicación para fabricación a mayor escala iii) estabilidad a largo plazo iv) funcionalidad en una variedad de organismos y aplicaciones. Un plásmido modificado genéticamente tendrá, además de un origen de replicación (o no, según el uso previsto), sitios de reconocimiento de enzimas de restricción que permitan romper el círculo para introducir nuevo material genético y un marcador selectivo, tal como un gen de resistencia a los antibióticos. Un plásmido puede tener desde aproximadamente 1000 bp hasta aproximadamente 20 kilopares de bases (bp).
Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "aproximadamente" se define en el sentido de 10 % más o menos el número citado. Se utiliza para indicar que la concentración objetivo deseada podría ser, por ejemplo, 40 % en moles, pero que debido a inconsistencias en la mezcla, el porcentaje real podría diferir en /- 5 % en moles.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "sustancialmente" se define como 5% más o menos el número citado. Se utiliza para indicar que la concentración objetivo deseada podría ser, por ejemplo, 40 % en moles, pero que debido a inconsistencias en la mezcla, el porcentaje real podría diferir en /- 5 % en moles.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "ácido nucleico" se define como una sustancia destinada a tener un efecto directo en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento o prevención de enfermedades, o a tener un efecto directo en la restauración, corrección o modificación de funciones fisiológicas, o actuar como reactivo de investigación. En realizaciones preferidas, el ácido nucleico es un oligonucleótido. En realizaciones preferidas, el agente terapéutico es un ácido nucleico terapéutico, tal como un polinucleótido de RNA. En realizaciones preferidas, el agente terapéutico es DNA circular bicatenario (plásmido), DNA plasmídico linealizado, minicírculos o msDNA (DNA monocatenario multicopia).
En esta divulgación, la palabra "que comprende" se usa en un sentido no limitante para significar que los elementos que siguen a la palabra están incluidos, pero los elementos que no se mencionan específicamente no están excluidos. Se entenderá que en realizaciones que comprenden o pueden comprender una característica, variable o parámetro específico, realizaciones alternativas pueden consistir, o consistir esencialmente en dichas características, variables o parámetros. Una referencia a un elemento por el artículo indefinido "un" no excluye la posibilidad de que más de uno de los elementos esté presente, a menos que el contexto requiera claramente que haya uno y sólo uno de los elementos.
En esta divulgación, "transfección" significa la transferencia de ácido nucleico en células con el fin de inducir la expresión de uno o varios genes específicos de interés tanto en laboratorio como en entornos clínicos. Normalmente incluye un lípido ionizable para asociarse con ácido nucleico y lípidos estructurales. LIPOFECTIN™ y LIPOFECTAMlNE™ son reactivos de transfección comerciales establecidos vendidos por ThermoFisher Scientific. Estos reactivos de investigación contienen lípidos catiónicos permanentemente y no son adecuados para su uso in o ex vivo.
En esta divulgación, la recitación de intervalos numéricos por puntos finales incluye todos los números subsumidos dentro de ese intervalo, incluyendo todos los números completos, todos los números enteros y todos los intermedios fraccionarios (por ejemplo, 1 a 5 incluye 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4 y 5, etcétera). En esta divulgación, las formas singulares "un" y "el" incluyen referentes en plural, a menos que el contenido indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a una composición que contiene "un compuesto" incluye una mezcla de dos o más compuestos. En esta divulgación, el término "o" se emplea generalmente en el sentido que incluye "y/o", a menos que el contenido indique claramente lo contrario.
"Estabilizador" o agente estabilizante es un término utilizado para identificar el agente que se añade al lípido ionizable, al lípido estructural y al esterol que forman la composición lipídica según la invención. Los estabilizadores son no iónicos como se describe en la presente memoria. Ejemplos de agentes estabilizantes no iónicos incluyen: polisorbatos (Tweens), Brij™ S20 (polioxietilen (20) estearil éter, Brij™35 (polioxietilen lauril éter, polietilenglicol lauril éter), Brij™S10 (polietilenglicol octadecil éter, polioxietilen (10) estearil éter), Myrj™52 (estearato de polioxietileno (40)). En algunas realizaciones también se usan combinaciones de agentes estabilizantes, incluyendo polisorbato y maltósido, alquilpoliglucósidos (TBD), lípidos conjugados con PEG u otros lípidos conjugados con polímeros.
"Alquilo" significa un hidrocarburo alifático saturado, cíclico o no, de cadena lineal o ramificada, que contiene de 1 a 24 átomos de carbono. Los alquilos saturados de cadena lineal representativos incluyen metilo, etilo, n-propilo, nbutilo, n-pentilo, n-hexilo y similares; mientras que los alquilos ramificados saturados incluyen isopropilo, sec-butilo, isobutilo, terc-butilo, isopentilo y similares. Los alquilos cíclicos saturados representativos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y similares; mientras que los alquilos cíclicos insaturados incluyen ciclopentenilo y ciclohexenilo y similares.
"Alquenilo" significa un alquilo, como se define anteriormente, que contiene al menos un doble enlace entre átomos de carbono adyacentes. Los alquenilos incluyen tanto isómeros cis como trans. Los alquenilos de cadena lineal y ramificada representativos incluyen etilenilo, propilenilo, 1-butenilo, 2-butenilo, isobutilenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-metil-1-butenilo, 2-metil-2-butenilo, 2,3-dimetil-2-butenilo y similares.
"Alquinilo" significa cualquier alquilo o alquenilo, como se definió anteriormente, que contiene adicionalmente al menos un triple enlace entre carbonos adyacentes. Alquinilos de cadena lineal y ramificada representativos incluyen acetilenilo, propinilo, 1 -butinilo, 2-butinilo, 1 -pentinilo, 2-pentinilo, 3-metil-1 -butinilo y similares.
El término "acilo" se refiere a grupos carbonilo sustituidos con hidrógeno, alquilo, cicloalquilo parcialmente saturado o completamente saturado, heterociclo parcialmente saturado o completamente saturado, arilo y heteroarilo. Por ejemplo, acilo incluye grupos tales como alcanoilo de (C1-C20) (por ejemplo, formilo, acetilo, propionilo, butirilo, valerilo, caproilo, t-butilacetilo, etc.), cicloalquilcarbonilo de (C3-C20) (por ejemplo, ciclopropilcarbonilo, ciclobutilcarbonilo, ciclopentilcarbonilo, ciclohexilcarbonilo, etc.), carbonilo heterocíclico (por ejemplo, pirrolidinilcarbonilo, pirrolid-2-ona-5-carbonilo, piperidinilcarbonilo, piperazinilcarbonilo, tetrahidrofuranilcarbonilo, etc.), aroilo (por ejemplo, benzoílo) y heteroaroilo (por ejemplo, tiofenil-2-carbonilo, tiofenil-3-carbonilo, furanil-2-carbonilo, furanil-3-carbonilo, 1 H-pirroil-2-carbonilo, 1 H-pirroil-3-carbonilo, benzo[b]tiofenilo-2-carbonilo, etc.).
El término "arilo" se refiere a un sistema de anillos hidrocarbonado monocíclico, bicíclico o tricíclico aromático, en donde cualquier átomo del anillo puede estar sustituido. Los ejemplos de restos arilo incluyen, pero no se limitan a, fenilo, naftilo, antracenilo y pirenilo.
"Heterociclo" significa un anillo heterocíclico monocíclico de 3 a 7 miembros, o bicíclico de 7 a 10 miembros, que es saturado, insaturado o aromático, y que contiene de 1 a 2 heteroátomos seleccionados independientemente de nitrógeno, oxígeno y azufre, y en donde los heteroátomos de nitrógeno y azufre pueden estar opcionalmente oxidados, y el heteroátomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternizado, incluyendo anillos bicíclicos en donde uno cualquiera de los heterociclos anteriores están fusionados a un anillo de benceno. El heterociclo puede estar unido mediante cualquier heteroátomo o átomo de carbono. Los heterociclos incluyen heteroarilos como se definen a continuación. Los heterociclos incluyen morfolinilo, pirrolidinonilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperizinilo, hidantoinilo, valerolactamilo, oxiranilo, oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, tetrahidropiridinilo, tetrahidroprimidinilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo, tetrahidropirimidinilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo y similares.
El término "heteroarilo" se refiere a un sistema de anillos aromático monocíclico de 5-8 miembros, bicíclico de 8-12 miembros o tricíclico de 11-14 miembros que tiene 1 -3 heteroátomos si es monocíclico, 1 -6 heteroátomos si es bicíclico o 1-9 heteroátomos si tricíclico, dichos heteroátomos seleccionados de O, N o S (por ejemplo, átomos de carbono y 1-3, 1-6 o 1 -9 heteroátomos de N, O S si son monocíclicos, bicíclicos o tricíclicos, respectivamente), en donde cualquier átomo del anillo puede sustituirse. Los grupos heteroarilo descritos en la presente memoria también pueden contener anillos fusionados que comparten un enlace carbono-carbono común. El término "alquilheterociclo" se refiere a un heteroarilo en donde al menos uno de los átomos del anillo está sustituido con alquilo, alquenilo o alquinilo.
El término "sustituido" se refiere a la sustitución de uno o más radicales de hidrógeno en una estructura dada con el radical de un sustituyente específico que incluye, pero no se limita a: halo, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heterociclilo, tiol, alquiltio, oxo, tioxi, ariltio, alquiltioalquilo, ariltioalquilo, alquilsulfonilo, alquilsulfonilalquilo, arilsulfonilalquilo, alcoxi, ariloxi, aralcoxi, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo, arilaminocarbonilo, alcoxicarbonilo, ariloxicarbonilo, haloalquilo, amino, trifluorometilo, ciano, nitro, alquilamino, arilamino, alquilaminoalquilo, ario laminoalquilo, aminoalquilamino, hidroxi, alcoxialquilo, carboxialquilo, alcoxicarbonilalquilo, aminocarbonilalquilo, acilo, aralcoxicarbonilo, ácido carboxílico, ácido sulfónico, sulfonilo, ácido fosfónico, arilo, heteroarilo, heterocíclico y alifático. Se entiende que el sustituyente puede estar sustituido adicionalmente. Los sustituyentes ejemplares incluyen compuestos amino, alquilamino, dialquilamino y amino cíclicos.
"Halógeno" significa fluoro, cloro, bromo y yodo.
Los términos "alquilamina" y "dialquilamina" se refieren a los radicales -NH(alquilo) y -N(alquilo)2 respectivamente.
El término "hidroxialquilo" significa radical -O-alquilo.
El término "alquilheterociclo" se refiere a un alquilo en el que al menos un metileno ha sido sustituido por un heterociclo.
En algunas realizaciones, los métodos de la invención pueden requerir el uso de grupos protectores. La metodología de grupos protectores es bien conocida por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Protective Groups in Organic Synthesis, Green, T. W. et. al., Wiley-Interscience, New York City, 1999). Brevemente, los grupos protectores dentro del contexto de esta invención son cualquier grupo que reduce o elimina la reactividad no deseada de un grupo funcional. Se puede añadir un grupo protector a un grupo funcional para enmascarar su reactividad durante ciertas reacciones y después eliminarlo para revelar el grupo funcional original. En algunas realizaciones se utiliza un "grupo protector de alcohol". Un "grupo protector de alcohol" es cualquier grupo que disminuye o elimina la reactividad no deseada de un grupo funcional de alcohol. Los grupos protectores se pueden añadir y eliminar usando técnicas bien conocidas en la técnica.
Además, la invención puede describirse como en la fórmula (I), (II) o (III); Un compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se muestra en la fórmula (I), (II) o (III), en donde el pKa experimental de nanopartículas está en el intervalo 5,6-7,1.
Según la invención, se proporciona un compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de fórmula (I)
en donde:
L1 es un enlace directo;
Ei se selecciona de _OC(O)_6i; 6i representa el enlace unido al grupo Ri;
Ri se selecciona de:
en donde:
R4 y R5 se selecciona cada uno, independientemente de un alquilo de Ci-C6; alternativamente, R4 y R5 pueden unirse para formar un anillo heterocíclico de 5 a 6 miembros que contiene hasta 2 nitrógenos (N), opcionalmente sustituido con i a 2 sustituyentes, cada uno seleccionado independientemente de un alquilo de Ci-C6;
R6 se selecciona de un alquilo de Ci-C6 y un grupo ciclopropilo;
R7 se selecciona de H y un grupo alquilo de Ci-C6;
a es i, 2 o 3;
b es 0 o i;
c es 0, i o 2 ;
c' es 2, 3 o 4;
d es 2 ;
e es i;
R2 se selecciona de H, alquilo de Ci-C5, alquenilo de C2-C5, y
L2 es 52_(CR8R8')k_5s en donde R8 y R8' son cada uno H; 62 representa el enlace unido al grupo E2 y 63 representa el enlace unido al esqueleto de ciclopentilo descrito en la fórmula (I);
k es i;
E2 es _C(O)O_64; donde 64 representa el enlace unido al grupo R3; R3 se selecciona de:
en donde:
f y h son 0;
g es 1 o 2;
R9 es una cadena de C6-C20 que tiene la fórmula _(CH2)i_[L4-(CH2)]j_Ri2, en donde:
L4 se selecciona de
i es un número entero en el intervalo 6-20;
j es 0, 1 o 2;
R12 se selecciona de H y un grupo alquilo de C4-C8; R9' se selecciona de H y alquilo de C4-C10; R10 y R10' se seleccionan cada uno, independientemente de alquilo de C4-C10; L3 es un enlace directo; R11 es lo mismo que R9.
Los compuestos de la presente invención pueden prepararse mediante técnicas de síntesis orgánica conocidas, incluyendo los métodos descritos con más detalle en los Ejemplos.
El alcance de la invención puede incluir diversas sales, hidratos y solvatos del compuesto.
Los compuestos de la invención también pueden incluir diversos isótopos farmacéuticamente aceptables.
Los compuestos de esta invención se pueden sintetizar usando varias rutas sintéticas posibles, que pueden ser seleccionadas fácilmente por un experto en la técnica de la síntesis orgánica.
La frase "farmacéuticamente aceptable" se emplea para describir compuestos, materiales, composiciones, suspensiones de nanopartículas en soluciones o cualquier otra forma tal como liofilizada, en forma de polvo, aerosol u otras formas de dosificación dentro del alcance del sano criterio médico adecuadas para su uso en contacto con tejidos o células humanas y animales con una relación beneficio/riesgo razonable. La relación beneficio/riesgo puede provenir de proteger entidades terapéuticas tales como moléculas pequeñas, ácidos nucleicos, péptidos o proteínas de la degradación en el medio biológicoin vivooex-vivo.
Los compuestos también se pueden evaluar en uno o más modelos preclínicos conocidos por los expertos en la técnica para mostrar la validación terapéutica de una carga farmacéuticamente viable tal como NAT, péptidos y proteínas. Estos incluyen, pero no se limitan a, modelos de roedores y primates no humanos. Las características y ventajas del objetivo de la presente memoria resultarán más evidentes a la luz de la siguiente descripción detallada de realizaciones seleccionadas, como se muestra en las figuras adjuntas. Como se comprenderá, la materia divulgada y reivindicada es susceptible de modificaciones en varios aspectos, todo ello sin apartarse del alcance de las reivindicaciones. En consecuencia, los dibujos y la descripción deben considerarse de naturaleza ilustrativa y no restrictivas, y el alcance completo del objetivo se establece en las reivindicaciones.
EJEMPLOS
Consideraciones generales: Todos los disolventes y reactivos eran productos comerciales y se utilizaban como tales a menos que se indique lo contrario. Las temperaturas se dan en grados Celsius. La estructura de los materiales de partida finales, los intermedios y los productos finales se confirma mediante métodos analíticos estándar, por ejemplo, MS o NMR. A menos que se indique lo contrario, los espectros de 1H NMR se registraron en soluciones de CDCb, a 298 K utilizando el espectrómetro de NMR AVANCE NEO NanoBay Bruker de 400 MHz. Los desplazamientos químicos se reportan en partes por millón (ppm) en relación con TMS (0,00) y las constantes de acoplamiento, J, están en Hertz (Hz) para 1H. Las siguientes abreviaturas se utilizan para indicar patrones de señal: s = singlete, d = doblete, t = triplete, q = cuarteto, p = pentete, m = multiplete, dd = doblete de dobletes, br s = singlete ancho, dt = doblete de tripletes. A menos que se indique lo contrario, la purificación en columna se llevó a cabo usando Isolera™ Prime utilizando un eluyente apropiado de composición isocrática o en gradiente.
Se determinó que todos los compuestos finales tenían una pureza superior al 85 % mediante análisis mediante UHPLC-MS de fase reversa (tiempos de retención RT a temperatura ambiente en minutos) utilizando el instrumento Shimadzu Nexera UHPLC con DAD y ELSD y una columna Acquity Peptide BEH C182,1 mm * 50 mm, 1,7 |jm y un gradiente con bicarbonato de amonio 10 mM en agua (A) y relación Acetonitrilo:Metanol 80:20 (B). El estudio de gradiente se realizó linealmente entre 80 y 100 % de B durante 12 minutos a 0,8 mL/min. El volumen de inyección fue de 2 |uL y la temperatura de la columna fue ambiente. La detección se basó en multimodo con electropulverización e ionización química a presión atmosférica (ESI y APCI) en modo positivo y negativo utilizando el espectrómetro de masas Shimadzu 2020 Single Quad (Science Park, Singapur) y un detector de dispersión de luz evaporativa (ELSD), excepto PNI 101 y PNI 123. Los datos de MS de baja resolución de PNI 101 y PNI 123 se registraron utilizando un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo Bruker micrOTOF™ con una fuente de ionización por electropulverización positiva en un HPLC Agilent™ 1200. Se utilizó formiato de sodio como referencia. Las muestras se introdujeron mediante inyección de flujo mediante HPLC con acetonitrilo/agua (ácido fórmico al 0,1%) como fase móvil.
Abreviaturas
ACD-A = Solución anticoagulante de citrato dextrosa
AcOH = ácido acético
a q .= acuoso
DCM = diclorometano
DMAP = 4-dimetilaminopiridina
DMF = N,N-dimetilformamida
EDCI = 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
EPO = eritropoyetina
ESI = ionización por electropulverización
EtOAc = acetato de etilo
g = gramo
G = gravedad
h = hora(s)
HPLC = Cromatografía líquida de alta resolución
MC3 = DLin-MC3-DMA
MFI = Intensidad de fluorescencia media
min = minuto(s)
mL = mililitro(s)
mmol = milimoles
MS = espectroscopia de masas
MTBE = metil-t-butil éter
NaH = hidruro de sodio
NaOH = hidróxido de sodio
NMR = resonancia magnética nuclear
Pet. = petróleo
ppm = partes por millón
Red Al® = dihidruro de bis-(2-metoxietoxi)aluminio de sodio
satd. = saturado
THF = tetrahidrofurano
TLC = cromatografía en capa fina
TNS = Sal sódica del ácido 6-(p-toluidin)-2-naftalenosulfónico
wt = peso
°C = Grados Celsius
Ejemplo 1
Síntesis de PNI 101, 123, 128, 132, 135, 143, 542, 557, 558, 559, 567
Compuesto 2: A una disolución bien agitada de 3-(aliloxi)propan-1,2-diol (1,2,25 g, 17,02 mmol) en THF seco (95 mL), se añadió hidruro de sodio (3,00 g, 74,9 mmol, dispersión en aceite mineral al 60%) en porciones a temperatura ambiente bajo una atmósfera de nitrógeno. Después de agitar durante 30 minutos, se añadió una solución de bromuro de linoleilo (13,46 g, 40,9 mmol) y 15-crown-5 (0,762 g, 3,46 mmol) en THF seco (20 mL). La mezcla de reacción se sometió a reflujo durante 2 h y después se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Después de completarse la reacción como se indica por TLC, la mezcla de reacción se paró con una solución saturada de NH4Cl aq. (30 mL), y se le añadió después EtOAc (150 mL) y agua (150 mL). La fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con EtOAc (3 x 75 mL). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2SO4 anhidro y se concentraron a presión reducida. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice IsoleraTM (100-200 mesh) usando acetato de etilo al 2% en éter de petróleo como eluyente para proporcionar 2 (4,01<g, 6,25 mmol, rendimiento del 36,7 %) como un aceite incoloro. 1H NMR (500 MHz, c>D<c>I3)<5 5,97-5,87 (m, 1H), 5,42>5,31 (m, 8H), 5,28 (d, 1H,J= 15,0), 5,18 (d, 1H,J= 10,0), 4,02 (d, 2H, J = 5,0), 3,61-3,38 (m, 9H), 2,78 (t, 4H,J= 7,5), 2,06 (q, 8H,J= 15,0, 5,0), 1,60-1,54 (m, 4H ), 1,40-1,27 (m, 32H), 0,90 (t aparente, 6H,J= 5,0). RT = 4,96 min. 98,5% de pureza. ESI-EM: m/z = 652 [M+Na]+ para C42H76O3Na.
Compuesto 3: A una solución de 2 (2,70 g, 4,29 mmol) en EtOH anhidro (45 mL), TFA (4,5 mL) y Pd(PPh3)4 (495 mg, 0,428 mmol) se añadieron bajo atmósfera de N2 y la mezcla de reacción se mantuvo a reflujo durante 16 h. El análisis de TLC mostró cierta cantidad de 2 sin reaccionar. 100 mg más de (Pd(PPh3)4) se añadieron a la mezcla de reacción y se continuó el reflujo durante otras 2 h dando como resultado el consumo completo de 2. La mezcla de reacción se evaporó hasta sequedad, se disolvió en EtOAc (100 mL) y se filtró a través de celite. El disolvente se eliminó en un evaporador rotatorio para proporcionar un crudo como un aceite de color amarillo pálido que se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice usando metanol al 5%/DCM como eluyente. Se obtuvo el compuesto 3 (2,15 g, 3,65 mmol) como un aceite incoloro con un rendimiento del 85 %. 1H NMR (500 MHz, CDCb) 55,42-5,31 (m, 8H), 3,74 (dd, 1H,J= 10,0, 5,0), 3,64-3,59 (m, 2H), 3,56-3,43 (m, 7H), 2,78 (t, 4H,J= 7,5), 2,06 (q, 8H,J= 15,0, 5,0), 1,60 1,54 (m, 4H), 1,40-1,27 (m, 32H), 0,90 (t aparente, 6H,J= 5,0). RT = 3,58 min. 97,4% de pureza. ESI-EM: m/z = 590 [M+H]+ para C39H73O3.
Compuesto 5: A una solución agitada de 3 (1,5 g, 2,55 mmol) en DCM seco (15 mL), se añadió DMAP (0,031 g, 0,255 mmol) seguido de la adición de una solución de 4 (1,071 g, 5,09 mmol) en DCM seco (15 mL) a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno. A la mezcla de reacción se le añadió hidrocloruro de EDCI (0,976 g, 5,09 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. Una vez completada la reacción como lo indica la TLC, el disolvente se evaporó a presión reducida y el residuo se disolvió en EtOAc (100 mL). La fase orgánica se lavó con agua (2 x 35 mL), salmuera (2 x 35 mL), se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró. La cetona cruda, 2-(3-oxo-2-((Z)-pent-2-en-1-il)ciclopentil)acetato de 2,3-bis(((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)oxi)propilo se obtuvo como un aceite amarillo espeso, que se tomó como tal para la siguiente etapa sin purificación adicional. RT = 4,77 min. 95,2% de pureza. ESI-<m>S:<m/z = 804 [M+Na]+ para C51H8sO5Na.>
Una solución agitada de 2-(3-oxo-2-((Z)-pent-2-en-1-il)ciclopentil)acetato de 2,3-bis(((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)oxi)propilo (2,4 g, 3,07 mmol) en MeOH seco (20 mL) y THF seco (5 mL) se enfrió a -10°C y se añadió lentamente borohidruro de sodio (0,465 g, 12,29 mmol) bajo atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos y el análisis por TLC mostró el consumo completo de cetona. El disolvente se evaporó a presión reducida y el residuo se disolvió en EtOAc (75 mL). La fase orgánica se lavó con agua (150 mL) y la fase acuosa se extrajo con EtOAc (2 x 50 mL). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (2 x 75 mL), se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice Isolera™ (100-200 mesh) utilizando EtOAc al 10% en éter de petróleo para dar 5 (1,7 g, 2,170 mmol, rendimiento del 85,1 % en 2 etapas a partir de la cetona) como un aceite de color amarillo claro. 1H NMR (500 MHz, CDCb) 55,52 5,31 (m, 10H), 4,26-4,23 (m, 1H), 4,12-4,08 (m, 1H), 3,91 (br s, 1H), 3,62 (p, 1H,J= 5,0), 3,56 (t aparente, 2H,J= 7,5), 3,51-3,47 (m, 2H), 3,44 (t aparente, 2H,J= 5,0), 2,78 (t, 4H,J= 5,0), 2,60-2,56 (m, 1H) , 2,32 (dd, 1H,J= 15,0, 5,0), 2,24-2,17 (m, 2H), 2,13-2,04 (m, 10H), 2,01-1,85 (m, 3H), 1,66-1,61 (m, 1H), 1,59-1,53 (m, 6H), 1,51-1,44 (m, 1H), 1,39-1,30 (m, 32H), 0,98 (t, 3H,J= 7,5), 0,90 (t, 6H,J= 5,0). RT = 4,71 min. 93,5% de pureza. ESI-EM: m/z = 806 [M+Na]+ para C51Hs0O5Na.
PNI 101:
A una solución de 5 (313 mg, 0,40 mmol) en DCM seco (6 mL), se añadió DMAP (cat.) seguido de la adición de una solución de clorhidrato del ácido 4-(dimetilamino)butanoico (67 mg, 0,40 mmol) en DMF seco (2 mL) bajo atmósfera de N2 a temperatura ambiente. Finalmente, se añadió hidrocloruro de EDCI sólido (115 mg, 0,60 mmol) a la mezcla de reacción y se agitó durante 1 h. El análisis por TLC de la mezcla de reacción mostró un consumo completo de 5. La mezcla de reacción se evaporó hasta sequedad, se disolvió en acetato de etilo (10 mL) y se lavó con agua (3 x 5 mL). La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4 anhidro, se concentró en un evaporador rotatorio para proporcionar una mezcla de reacción cruda que se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice usando metanol al 5 %/CH2Cl2 como eluyente. Se obtuvo PNI 101 (250 mg, 0,28 mmol) como un aceite espeso incoloro con un rendimiento del 70 %. 1H NMR (500 MHz, CDCta) 55,46-5,28 (m, 10H), 4,26-4,22 (m, 1H), 4,13-4,06 (m, 1 H), 3,63-3,60 (m, 1H), 3,57-3,54 (m, 2H), 3,50-3,47 (m, 2H), 3,45-3,42 (m, 2H), 2,78 (t, 4H,J= 5,0), 2,62-2,57 (m, 1H), 2,31 (p, 4H, J = 7,5), 2,24 (s, 6H), 2,15-2,09 (m, 2H), 2,08-2,01 (m, 10H), 1,98-1,92 (m, 2H), 1,79 (p, 2H, J = 7,5), 1,70 1,63 (m, 2H), 1,56 (p, 4H,J= 7,5), 1,39-1,26 (m, 36H), 0,97-0,93 (m, 3<h>), 0,90 (t aparente, 6H,J= 7,5). Peso molecular para C57H102NO6 [M+H]+ Calculado 896,7707. Encontrado 896,7670.
PNI 123:
A una solución de 5 (250 mg, 0,32 mmol) en CH2Cl2 seco (6 mL), se añadió DMAP (cat.) seguido de la adición de una solución de clorhidrato del ácido 1,4-dimetilpiperidin-4-carboxílico (62 mg, 0,32 mmol) en DMF seco (5 mL) en atmósfera de N2 a temperatura ambiente. Finalmente, se añadió hidrocloruro de EDCI sólido (92 mg, 0,48 mmol) a la mezcla de reacción y se calentó a 65°C durante 3 h. El análisis de TLC indicó que algo de 5 todavía no había reaccionado. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se le añadieron clorhidrato del ácido 1,4-dimetilpiperidin-4-carboxílico (62 mg, 0,32 mmol), disuelto en DMF seco (5 mL), DMAP (cat.) y clorhidrato de EDCI (92 mg, 0,48 mmol) secuencialmente y la mezcla de reacción se agitó a 65°C durante una hora más. El análisis de TLC mostró un consumo de la mayoría de 5. La mezcla de reacción se concentró en un evaporador rotatorio para eliminar la mayor parte de DMF, se disolvió en EtOAc (20 mL), y se lavó con agua (3 x 10 mL). La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4 anhidro, se concentró en un evaporador rotatorio para proporcionar una mezcla de reacción cruda que se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice usando metanol al 5 %/CH2Cl2 como eluyente. Se obtuvo PNI 123 (90 mg, 0,0978 mmol) como un aceite espeso de color amarillo pálido con un rendimiento del 30 %. 1H NMR (500 MHz, CDCta) 55,45-5,29 (m, 10H), 4,89-4,86 (m, 1H), 4,27-4,23 (m, 1H), 4,11 4,08 (m, 1H), 3,64-3,60 (m, 1 H), 3,55 (t aparente, 2H,J= 5,0), 3,51 -3,42 (m, 4H), 2,78 (t, 4H,J= 5,0), 2,58 (dd, 1 H,J= 15,0, 5,0), 2,49 (brs, 4H), 2,30 (dd, 1H, J = 15,0, 5,0), 2,23-2,11 (m, 5H), 2,08-2,04 (m, 10H), 2,01 -1,97 (m, 4H), 1,72 1,69 (m, 2H), 1,64- 1,53 (m, 8H), 1,39-1,26 (m, 32H), 1,23 (s, 3H), 0,97 (t aparente, 3H,J= 7,5), 0,90 (t aparente, 6H,J= 7,5). Peso molecular para C59H104NO6 [M+H]+ Calculado 922,7864. Encontrado 922.7837.
PNI 128:
A una solución agitada del clorhidrato del ácido 3-(dimetilamino)propanoico (0,078 g, 0,511 mmol) en DMF seco (2 mL), se añadieron una solución de 5 (0,4 g, 0,511 mmol) en d Cm seco (8 mL) y DMAP (6,24 mg, 0,051 mmol) a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno. Después, se añadió hidrocloruro de EDCI (0,147 g, 0,766 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 16 horas. El análisis de TLC mostró que el alcohol 5 no se consumió por completo. Así, se añadió una solución de clorhidrato del ácido 3-(dimetilamino)propanoico (0,031 g, 0,204 mmol) en DMF (2 mL), seguido de clorhidrato de EDCI (0,098 g, 0,511 mmol), DIPEA (0,312 mL, 1,787 mmol) y DCM seco (4 mL). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. El disolvente se evaporó a presión reducida y el residuo se disolvió en EtOAc (60 mL). La fase orgánica se lavó con agua (150 mL) y la fase acuosa se extrajo con EtOAc (2 x 30 mL). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (2 x 75 mL), se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron. El crudo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílce (100-200 mesh) Isolera™ usando MeOH al 5 % en EtOAc para producir PNI 128 (0,195 g, 0,220 mmol, rendimiento del 43,0 %) como un aceite de color amarillo claro. También se recuperaron 150 mg del alcohol 5. 1H (400 MHz, CDCta) 5 5,47-5,30 (m, 10H), 4,88-4,84 (m, 1H), 4,24 (dd, 1H,J= 12,0, 4,0), 4,10 (dd, 1H,J= 12,0, 8,0), 3,63-3,42 (m, 7H), 2,78 (t aparente, 4H,J= 6,0), 2,70-2,56 (m, 3H), 2,52-2,44 (m, 2H), 2,35-2,21 (m, 7H), 2,14-1,92 (m, 14H), 1,71-1,52 (m, 6H), 1,38-1,26 (m, 34H), 0,98-0,93 (m, 3H), 0,90 (t aparente, 6H,J= 6,0). RT = 5,09 min. 97,7% de pureza. ESI-EM: m/z = 883 [<m>+H]+ para C56H100NO6.
PNI 132:
A una solución agitada del clorhidrato del ácido 1-metilpiperidin-4-carboxílico (0,110 g, 0,613 mmol) en DMF seca (2 mL), se añadieron una solución de 5 (0,4 g, 0,511 mmol) en DCM seco (8 mL) y DMAP (0,012 g, 0,102 mmol) a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno. Después, se añadió hidrocloruro de EDCI (0,147 g, 0,766 mmol) y DCM seco (2 mL) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. Después de completarse la reacción como se indica por TLC, el disolvente se evaporó a presión reducida y el residuo se disolvió en EtOAc (60 mL). La fase orgánica se lavó con agua (150 mL) y la fase acuosa se extrajo con EtOAc (2 x 30 mL). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (2 x 75 mL), se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) (Isolera™) usando MeOH al 8 % en EtOAc para dar PNI 132 (0,27 g, 0,295 mmol, rendimiento del 57,8 %) como un aceite amarillo. También se recuperaron 120 mg de alcohol 5. 1H (400 MHz, CDCh) 55,46-5,28 (m, 10H), 4,86-4,83 (m, 1H), 4,26-4,22 (m, 1H), 4,10 (dd, 1H,J= 12,0, 8,0), 3,65-3,42 (m, 7H), 2,85-2,76 (m, 6H), 2,58 (dd, 1H,J= 12,0, 8.0) , 2,31 -1,89 (m, 23H), 1,82-1,76 (m, 2H), 1,59-1,52 (m, 6H), 1,38-1,26 (m, 34H), 0,97-0,93 (m, 3H), 0,90 (t, 6H,J= 6.0) . RT = 5,20 min. 99,3% de pureza. ESI-MS: m/z = 909 [M+H]+ para C58H102NO6.
PNI 135:
PNI 135 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de PNI 132. La síntesis de PNI 135 se realizó usando ácido 1 -metilpirrolidin-3-carboxílico (0,074 g, 0,575 mmol) en DCM (20 mL), 5 (0,3 g, 0,383 mmol) en DCM seco (5 mL), DMAP (0,023 g, 0,192 mmol) y clorhidrato de EDCI (0,147 g, 0,766 mmol). El producto crudo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) Isolera™ usando MeOH al 5 % en DCM como eluyente para producir PNI 135 (0,170 g, 0,185 mmol, rendimiento del 48,4 %) como un aceite espeso incoloro. 1H (400 MHz, CDCl3) 55,45-5,30 (m, 10H), 4,87-4,83 (m, 1H), 4,26-4,22 (m, 1H), 4,10 (dd, 1H,J= 12,0, 8,0), 3,61 (p, 1H,J= 4,0), 3,55 (t, 2H,J= 6,0), 3,49-3,42 (m, 4H), 3,07-3,00 (m, 1H), 2,97-2,88 (m, 1 H), 2,78 (t aparente, 4H,J= 6,0), 2,68-2,48 (m, 3H), 2,41 (s, 3H), 2,29 (dd, 1H,J= 16,0, 8,0), 2,22-1,91 (m, 18H), 1,73-1,63 (m, 3H), 1,56 (p, 4H,J= 8,0), 1,38 1,26 (m, 32H), 0,96 (t, 3H,J= 6,0), 0,90 (t aparente, 6H,J= 6,0). RT = 3,55 min. 97,6% de pureza. ESI-EM: m/z = 895 [M+H]+ para C57H100NO6.
PNI 143:
PNI 143 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de PNI 132. La síntesis de PNI 143 se realizó usando el ácido 2-(1 -metil-1 H-imidazol-4-il)acético (0,079 g, 0,562 mmol) en DMF seca (2 mL), 5 (0,400 g, 0,511 mmol) en DCM seco (8 mL), DMAP (6,24 mg, 0,051 mmol) y clorhidrato de EDCI (0,196 g, 1,021 mmol). El producto crudo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) Isolera™ usando MeOH al 5 % en EtOAc para producir PNI 143 (0,208 g, 0,230 mmol, rendimiento del 45,0 %) como un aceite amarillo. 1H (400 MHz, CDCta) 5 7,35 (s, 1H), 6,85 (s, 1H), 5,45-5,20 (m, 10H), 4,89-4,86 (m, 1H), 4,27-4,21 (m, 1H), 4,10 (dd, 1H,J= 12,0, 8,0), 3,65 (s, 3H), 3,64-3,59 (m, 3H), 3,55 (t, 2H,J= 8,0), 3,49-3,42 (m, 4H), 2,78 (t, 4H,J= 6,0), 2,62-2,53 (m, 1H), 2,29-1,87 (m, 15H), 1,75-1,66 (m, 2H), 1,56-1,49 (m, 4H), 1,40-1,24 (m, 34H), 0,96- 0,92 (m, 3H), 0,89 (t, 6H,J= 6,0). RT = 4,63 min. 99,4% de pureza. ESI-EM: m/z = 906 [M+H]+ para C57H97NO6.
PNI 542:
PNI 542 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de PNI 132. La síntesis de PNI 542 se realizó usando el clorhidrato del ácido 4-(dietilamino)butanoico (0,094 g, 0,479 mmol) en DCM seco (6 mL), 5 ( 0,25 g, 0,319 mmol) en DCM seco (4 mL), DMAP (0,078 g, 0,638 mmol) y clorhidrato de EDCI (0,122 g, 0,638 mmol). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) (Isolera™) usando MeOH al 5 % en EtOAc para dar PNI 542 (0,125 g, 0,135 mmol, rendimiento del 42,4 %) como un aceite amarillo. 1H (400 MHz, CDCl3) 55,47-5,30 (m, 10H), 4,87-4,84 (m, 1H), 4,26-4,22 (m, 1H), 4,10 (dd, 1H,J= 12,0, 8,0), 3,66-3,42 (m, 7H), 2,78 (t, 4H,J= 6,0), 2,62-2,40 (m, 6H), 2,33-2,25 (m, 2H), 2,22-1,90 (m, 18H), 1,76 (p, 2H,J= 8,0), 1,70-1,52 (m, 6H), 1,38-1,26 (m, 32H), 1,02 (t, 6H,J= 8,0), 0,98-0,93 (m, 3H), 0,90 (t aparente, 6H,J= 6,0). RT = 3,75 min. 98% de pureza. ESI-EM: m/z = 925 [M+H]+ para C59H106NO6.
PNI 557:
PNI 557 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de PNI 132. La síntesis de PNI 557 se realizó usando el clorhidrato del ácido 2-(1-metilpirrolidin-3-il)acético (0,110 g, 0,613 mmol) en DMF seca (2 mL), 5 (0,4 g, 0,511 mmol) en DCM seco (8 mL), DMAP (6,24 mg, 0,051 mmol), EDCI (0,196 g, 1,021 mmol) y DCM seco (2,0 mL). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) IsoleraTM usando MeOH al 7 % en EtOAc para proporcionar PNI 557 (0,275 g, 0,297 mmol, rendimiento del 58,1 %) como un aceite amarillo. También se recuperaron 120 mg de alcohol 5. 1H (400 MHz, CDCta) 55,46-5,28 (m, 10H), 4,86-4,83 (m, 1H), 4,26-4,22 (m, 1H), 4,10 (dd, 1H,J= 12,0, 8,0), 3,62 (p, 1H,J= 4,0), 3,55 (t, 2H,J= 8,0), 3,49-3,37 (m, 4H), 2,89-2,71 (m, 6H), 2,64-2,49 (m, 3H), 2,40-2,13 (m, 5H), 2,09-1,87 (m, 17H), 1,61-1,50 (m, 6H), 1,40-1,26 (m, 35H), 0,98-0,94 (m, 3H), 0,90 (t, 6H,J= 6,0). RT = 5,00 min. 98,0% de pureza. ESI-EM: m/z = 909 [M+H]+ para C58H102NO6.
PNI 558:
PNI 558 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de PNI 132. La síntesis de PNI 558 se realizó usando el clorhidrato del ácido 4-(pirrolidin-1-il)butanoico (0,093 g, 0,479 mmol) en DCM seco (6 mL), 5 (0,25 g, 0,319 mmol) en DCM seco (4 mL), DMAP (0,078 g, 0,638 mmol) y EDCI (0,122 g, 0,638 mmol). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) IsoleraTM usando MeOH al 5 % en EtOAc para dar PNI 558 (0,165 g, 0,179 mmol, rendimiento del 56,0 %) como un aceite amarillo. 1H (400 MHz, CDCh) 55,42-5,30 (m, 10H), 4,86-4,83 (m, 1H), 4,26-4,22 (m, 1H), 4,10 (dd, 1H,J= 12,0, 8,0), 3,62 (p, 1H,J= 4,0), 3,55 (t, 2H,J= 8,0), 3,49-3,42 (m, 4H), 2,78 (t, 4H,J= 6,0), 2,68-2,45 (m, 7H), 2,36-2,29 (m, 3H ), 2,22-2,12 (m, 2H), 2,08-1,89 (m, 14H), 1,87-1,75 (m, 6H), 1,72-1,66 (m, 2H), 1,57-1,50 (m, 4H), 1,40-1,22 (m, 32H), 0,97-0,94 (m, 3H), 0,90 (t, 6H,J= 6,0). RT = 3,82 min. 97,8% de pureza. ESI-EM: m/z = 923 [M+H]+ para C59H104NO6.
PNI 559:
PNI 559 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de PNI 132. La síntesis de PNI 559 se realizó usando el clorhidrato del ácido 2-(1 -metilpiperidin-2-il)acético (0,093 g, 0,479 mmol) en DCM seco (6 mL), 5 (0,25 g, 0,319 mmol) en DCM seco (4 mL), DMAP (0,078 g, 0,638 mmol) y E<d>C<i>(0,122 g, 0,638 mmol). El producto crudo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) Isolera™ usando MeOH al 6 % en EtOAc para proporcionar PNI 559 (0,245 g, 0,266 mmol, rendimiento del 83 %) como un aceite de color amarillo claro. 1H (400 MHz, CDCls) 55,42-5,30 (m, 10H), 4,87-4,82 (m, 1H), 4,24 (dd, 1H,J= 12,0, 4,0), 4,10 (dd, 1H,J= 12,0, 8,0), 3,62 (p, 1H,J= 4,0), 3,55 (t, 2H,J= 8,0), 3,50-3,42 (m, 4H), 2,82-2,74 (m, 5H), 2,65-2,56 (m, 2H), 2,50-2,40 (m , 1H), 2,32 1,92 (m, 21H), 1,75-1,48 (m, 11H), 1,40-1,26 (m, 34H), 0,97-0,94 (m, 3H), 0,90 (t, 6H,J= 6,0). RT = 4,05 min. 98,0% de pureza. ES-EM: m/z = 923 [M+H]+ para C59H104NO6
PNI 567:
PNI 567 se sintetizó utilizando un método similar al utilizado para la síntesis de PNI 132. La síntesis de PNI 567 se realizó usando el ácido 2-(4-metilpiperazin-1-il)acético (0,105 g, 0,664 mmol) en DCM seco (25 mL), 5 (0,4 g, 0,511 mmol) en DCM seco (5 mL), D<m>A<p>(0,086 g, 0,664 mmol) y clorhidrato de EDCI (0,293 g, 1,532 mmol). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) (Isolera™) usando 5% de MeOH en DCM para dar PNI 567 (0,43 g, 0,466 mmol, rendimiento del 91 %) como un aceite espeso de color amarillo pálido.
1H (400 MHz, CDCls) 55,46-5,21 (m, 10H), 4,90-4,87 (m, 1H), 4,26-4,21 (m, 1H), 4,09 (dd, 1H,J= 12,0, 4,0), 3,64 3,58 (m, 1H), 3,54 (t, 2H,J= 6,0), 3,48-3,41 (m, 4H), 3,17 (s, 2H), 2,77 (t, 4H,J= 6,0), 2,69-2,44 (m, 9H), 2,31 (s, 3H), 2,28-1,90 (m, 16H), 1,73-1,63 (m, 1H), 1,59-1,52 (m 5H), 1,43-1,26 (m, 33H), 0,97-0,93 (m, 3H), 0,89 (t aparente, 6H,J= 8,0). RT = 3,21 min. 95,5% de pureza. ESI-<m>S: m/z = 924 [M+H]+ para C58H103N2O6.
Ejemplo 2
Síntesis de PNI 516, 549, 560, 568, 569, 570, 571 y 573
Compuesto 6: A una solución agitada de ácido oleico (58 g, 205 mmol) en etanol seco (580 mL), se añadió lentamente H2SO4 concentrado (1,094 mL, 20,53 mmol) y la mezcla de reacción se mantuvo a reflujo durante 16 h. Una vez completada la reacción como se indica por TLC, el disolvente se evaporó a presión reducida. El residuo se enfrió a 0°C, se neutralizó con una solución acuosa saturada de NaHCO3 y se extrajo con DCM (3 x 250 mL). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron para obtener oleato de etilo (6, 61,6 g, 198 mmol, rendimiento 97 %) como un aceite incoloro. El éster se tomó como tal para la siguiente etapa sin purificación adicional. 1H (400 MHz, CDCh) 5 5,39-5,31 (m, 2H), 4,13 (q, 2H,J= 8,0), 2,29 (t, 2H,J= 8,0), 2,02 (q aparente, 4H,J= 8,0), 1,62 (p, 2H,J= 8,0), 1,35-1,24 (m, 23H), 0,89 (t, 3H,J= 6,0). RT = 3,73 min. 99,5% de pureza. ESI-EM: m/z = 311 [M+H]+ para C20H39O2.
Compuesto 7: Se agitó una solución de diyodometano (31,2 mL, 386 mmol) en tolueno (120 mL) a -15°C en atmósfera de nitrógeno. Se añadió gota a gota dietilzinc (129 mL, 193 mmol, solución 1,5 M en tolueno) a la mezcla de reacción a -15°C durante 30 minutos. Nota: La temperatura interna de la mezcla de reacción debe mantenerse por debajo de 0°C. Después, se añadió gota a gota una solución de 6 (30 g, 97 mmol) en tolueno (30 mL) a la mezcla de reacción anterior de modo que la temperatura interna se mantenga por debajo de 0°C. La mezcla de reacción se agitó a la misma temperatura durante 15 minutos y se dejó calentar gradualmente hasta temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de agitar durante 7 h a temperatura ambiente, el análisis por TLC mostró que la reacción se había completado. La mezcla de reacción se enfrió a 0°C y se paró con una solución acuosa saturada de NH4Cl (100 mL). La fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con tolueno (2 x 75 mL). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron. El producto crudo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) Isolera™ utilizando EtOAc al 6% en éter de petróleo para dar 7 (28,05 g, 86 mmol, rendimiento del 89 %) como un aceite de color amarillo pálido. 1H (400 MHz, CDCh) 54,13 (q, 2H,J= 8,0), 2,29 (t, 2H,J= 8,0), 1,63 (p, 2H,J= 8,0), 1,38-1,24 (m, 25H), 1,19-1,08 (m, 2H), 0,89 (t, 3H,J= 6,0), 0,68-0,62 (m, 2H), 0,59-0,54 (m, 1H), -0,34 (q aparente, 1H,J= 4,0). RT = 4,01 min. 98,7% de pureza. ESI-EM: m/z = 325 [M+H]+ para C21H41O2.
Compuesto 8: A una solución agitada de 7 (26 g, 80 mmol) en THF seco (250 mL) se le añadió gota a gota una solución de Red-Al® (54,1 mL, 160 mmol, 60 % en peso en tolueno) bajo atmósfera de nitrógeno a -10°C. La mezcla de reacción se dejó con agitación a 20°C durante 1 h. Después de completarse la reacción como se indica por TLC, la mezcla se enfrió a -10°C y se paró con una disolución saturada de Na2SO4 (70 mL). La formación de sólido se observó en el matraz de reacción y se diluyó con EtOAc (260 mL). El contenido del matraz se filtró a través de un lecho de SiO2 Celite™ y se lavó con EtOAc, hasta que no se observó ningún compuesto en el filtrado. Los filtrados combinados se concentraron y el residuo se disolvió en EtOAc (700 mL). La fase orgánica se lavó con agua (2 x 200 mL) y salmuera (2 x 200 mL). La fase orgánica se separó, se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró para obtener 8 (22 g, 77 mmol, 96 % de rendimiento) como un aceite amarillo. 1H (400 MHz, CDCb) 54,76 (s, 1H), 3,65 (t, 2H,J= 6,0), 1,57 (p, 2H,J= 8,0), 1,38-1,28 (m, 24H), 1,20-1,10 (m, 2H), 0,89 (t, 3H,J= 6,0), 0,68-0,62 (m, 2H), 0,59-0,54 (m, 1H), -0,33 (q aparente, 1H,J= 4,0).<r>T = 2,88 min. 99,1% de pureza. ESI-EM: m/z = 283 [M+H]+ para C19H39O.
Compuesto 9: A una solución agitada de 8 (21,5 g, 76 mmol) en DCM seco (350 mL), se añadió trifenilfosfina (39,9 g, 152 mmol) a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno. Se añadió lentamente tetrabromuro de carbono (50,5 g, 152 mmol) a la mezcla de reacción y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 4 h. Después de completarse la reacción como se indica por TLC, el disolvente se evaporó a presión reducida. El producto crudo se purificó por (Isolera™, gel de sílice, 100-200 mesh) usando EtOAc al 1 % en éter de petróleo para proporcionar 9 (25,5 g, 73,8 mmol, rendimiento del 97 %) como un aceite incoloro. 1H (400 MHz, CDCh) 53,41 (t, 2H,J= 6,0), 1,86 (p, 2H,J= 8,0), 1,47-1,30 (m, 24H), 1,20-1,10 (m, 2H), 0,89 (t, 3H,J= 8,0), 0,69-0,62 (m, 2H), 0,59-0,54 (m, 1H), -0,33 (q aparente, 1H,J= 4,0). RT = 3,22 min. 99,9% de pureza.
Compuesto 10: Se añadió 1,2-dibromoetano (0,025 mL, 0,290 mmol) a una suspensión agitada de virutas de Mg recién activadas (0,106 g, 4,34 mmol) en THF seco (3 mL) a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno. La mezcla se agitó durante 5 minutos y se añadió una solución de 9 (1,0 g, 2,90 mmol) en THF seco (3 mL). La mezcla de reacción se sometió a reflujo durante 1 hora y el análisis de TLC mostró el consumo completo de 9. La mezcla se enfrió a 20°C y se añadió una solución de formiato de etilo (0,106 mL, 1,303 mmol) en THF seco (2 mL). Después de agitar a 30°C durante 1 hora, la mezcla de reacción se enfrió a 0°C y se añadió gota a gota acetona (1 mL) seguido de agua enfriada con hielo (1 mL). La suspensión se vertió lentamente en una solución acuosa enfriada con hielo de H2SO4 al 10% (10 mL) con agitación lenta y la fase acuosa se extrajo con MTBE (3 x 25 mL). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (2 x 25 mL), se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron. El residuo se disolvió en THF (3 mL) y se añadió una solución de NaOH (1,158 g, 29,0 mmol) en agua (7 mL). La mezcla de reacción se calentó a 65°C durante 18 horas y el análisis de TLC mostró el consumo completo de material de partida. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se extrajo con MTBE (2 x 25 mL). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (2 x 20 mL), se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) (Isolera™) usando EtOAc al 6% en éter de petróleo para proporcionar 10 (0,185 g, 0,330 mmol, rendimiento del 11,39 %) como un aceite amarillo. 1H (400 MHz, CDCh) 53,64-3,54 (m, 1H), 1,45-1,27 (m, 56H), 1,19-1,11 (m, 4H), 0,89 (t, 6H,J= 6,0), 0,68-0,63 (m, 4H), 0,59 0,54 (m, 2H), -0,33 (q aparente, 2H,J= 4,0).
Compuesto 11: Se sintetizó (Z)-2-(3-oxo-2-(pent-2-en-1 -il)ciclopentil)acetato de 1,17-bis(2-octilciclopropil)heptadecan-9-ilo usando el método similar al utilizado para la síntesis del 2-(3-oxo-2-((Z)-pent-2-en-1-il)ciclopentil)acetato de 2,3 bis(((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1 -il)oxi)propilo. La síntesis de esta cetona cruda se realizó usando 10 (1,25 g, 2,228 mmol) en d Cm seco (12 mL), DMAP (0,408 g, 3,34 mmol), 4 (0,937 g, 4,46 mmol) en DCM seco (8 mL) y clorhidrato de EDCI (0,854 g, 4,46 mmol). El producto crudo (1,62 g, 2,151 mmol, rendimiento crudo del 97 %) se obtuvo como un aceite amarillo espeso y se llevó a la siguiente etapa sin purificación adicional.
El compuesto 11 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de 5. La síntesis de 11 se realizó usando (Z)-2-(3-oxo-2-(pent-2-en-1-il)ciclopentil)acetato de 1,17-bis(2-octilciclopropil)heptadecan-9-ilo (1,6 g, 2,124 mmol) en MeOH seco (16 mL) y THF (4 mL) y borohidruro de sodio (0,321 g, 8,50 mmol). El producto crudo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) Isolera™ usando EtOAc al 10% en éter de petróleo para proporcionar 11 (1,51 g, 1,999 mmol, rendimiento del 94 %) como un aceite de color amarillo claro. 1H (400 MHz, CDCl3) 55,50-5,43 (m, 1 H), 5,29-5,26 (m, 1 H), 4,90 (p, 1H,J= 6,0), 3,89-3,78 (m, 1H), 2,72 (dd, 1H,J= 16,0, 4,0), 2,42-1,87 (m, 9H), 1,55-1,48 (m, 6H), 1,37-1,25 (m, 52H), 1,20-1,07 (m, 4H), 0,97 (t, 3H,J= 8,0), 0,89 (t aparente, 6H,J= 6,0), 0,69-0,60 (m, 4H), 0,59-0,54 (m, 2H), -0,33 (q, 2H,J= 8,0). RT = 5,20 min. 56,2% de pureza. ESI-EM: m/z = 778 [M+Na]+ para C51H94O3Na.
PNI 516:
PNI 516 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de PNI 132. La síntesis de PNI 516 se realizó usando el clorhidrato del ácido 4-(dimetilamino)butanoico (0,133 g, 0,794 mmol) en DMF seco (2 mL), 11 ( 0,5 g, 0,662 mmol) en DCM seco (8 mL), DMAP (0,162 g, 1,324 mmol) y clorhidrato de<e>D<ci>(0,254 g, 1,324 mmol). El producto crudo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) Isolera™ usando MeOH al 8 % en EtOAc para producir PNI 516 (0,305 g, 0,349 mmol, rendimiento del 52,7 %) como un aceite de color amarillo claro.
1H (400 MHz, CDCl3) 55,48-5,25 (m, 2H), 4,90-4,84 (m, 2H), 2,78-2,44 (m, 8H), 2,40-2,36 (m, 2H), 2,26-1,90 (m, 11 H), 1,72-1,52 (m, 7H), 1,43-1,22 (m, 52H), 1,20-1,06 (m, 4H), 0,98-0,93 (m, 3H), 0,89 (t, 6H,J= 6,0), 0,69-0,54 (m, 6H), -0,31 - -0,35 (m, 2H). RT = 9,64 min. 99,3% de pureza.<e>S<i>-EM: m/z = 869 [M+H]+ paraC57H106NO4.
PNI 549:
PNI 549 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de PNI 132. La síntesis de PNI 549 se realizó usando el clorhidrato del ácido 3-(dimetilamino)propanoico (0,122 g, 0,794 mmol) en DCM seco (8 mL), 11 ( 0,4 g, 0,530 mmol) en DCM seco (4 mL), DMAP (0,129 g, 1,059 mmol) y EDCI (0,203 g, 1,059 mmol). El producto crudo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) Ilsolera™ usando MeOH al 10 % en EtOAc para dar PNI 549 (0,17 g, 0,197 mmol, rendimiento del 37,2 %) como un aceite de color amarillo claro. Nota: También se recuperaron 140 mg de 11. 1H (400 MHz, CDCh) 55,47-5,40 (m, 1 H), 5,37-5,27 (m, 1H), 4,90-4,84 (m, 2H), 2,67-2,54 (m, 3H), 2,51 -2,40 (m, 2H), 2,32-1,89 (m, 15H), 1,74-1,64 (m, 2H), 1,55-1,48 (m, 4H), 1,42-1,24 (m, 52H), 1,20-1,07 (m, 4H), 0,98-0,93 (m, 3H), 0,89 (t, 6H,J= 8,0), 0,71 -0,54 (m, 6H), -0,33 (q, 2H,J= 4,0). RT = 10,16 min. 98,9% de pureza. ESI-EM: m/z = 877 [M+Na]+ para C56H103NO4Na.
PNI 560:
PNI 560 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de PNI 132. La síntesis de PNI 560 se realizó usando el clorhidrato del ácido 1,4-dimetilpiperidin-4-carboxílico (0,092 g, 0,477 mmol) en DMF seca (2 mL), 11 (0,3 g, 0,397 mmol) en DCM seco (8 mL), DMAP (0,097 g, 0,794 mmol) y clorhidrato de EDCI (0,152 g, 0,794 mmol). El producto crudo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) Isolera™ usando MeOH al 10 % en EtOAc para producir PNI 560 (0,172 g, 0,191 mmol, rendimiento del 48,1 %) como un aceite de color amarillo claro. Nota: Se recuperaron 50 mg de 11. 1H (400 MHz, CDCh) ó 5,43-5,37 (m, 1H), 5,31-5,22 (m, 1H), 4,86-4,81 (m, 2H), 2,63-2,48 (m, 5H), 2,23-1,87 (m, 13H), 1,72-1,43 (m, 7H), 1,38-1,19 (m, 57H), 1,15-1,04 (m, 4H), 0,94-0,91 (m, 3H), 0,85 (t, 6H,J= 6,0), 0,66-0,50 (m, 6H), -0,38 (q aparente, 2H,J= 4,0). RT = 11,40 min. 99,3% de pureza. ESI-EM: m/z = 895 [M+H]+ para C59H108NO4.
PNI 568:
PNI 568 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de PNI 132. La síntesis de PNI 568 se realizó usando el clorhidrato del ácido 2-(1-metilpirrolidin-3-il)acético (0,114 g, 0,636 mmol) en DCM seco ( 20 mL), 11 (0,4 g, 0,530 mmol) en DCM seco (5 mL), D<m>A<p>(0,078 g, 0,636 mmol) y clorhidrato de EDCI (0,244 g, 1,271 mmol). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (malla 100-200) (Isolera™) usando MeOH al 3 % en DCM para proporcionar PNI 568 (0,375 g, 0,426 mmol, rendimiento del 80 %) como un aceite de color amarillo pálido. 1H (400 MHz, CDCb) 55,46-5,26 (m, 2H), 4,90-4,83 (m, 2H), 2,86-2,75 (m, 4H), 2,61-2,52 (m, 3H), 2,39-1,85 (m, 12H), 1,69-1,62 (m, 3H), 1,58-1,46 (m, 5H), 1,44-1,26 (m, 53H), 1,19-1,07 (m, 4H), 0,98-0,94 (m, 3H), 0,89 (t, 6H,J= 8,0), 0,69-0,60 (m, 4H), 0,59-0,54 (m, 2H), -0,33 (q, 2H,J= 4,0). RT = 9,19 min. 99,7% de pureza. ESI-EM: m/z = 881 [M+H]+ para C58H106NO4.
PNI 569:
PNI 569 se sintetizó utilizando un método similar al utilizado para la síntesis de PNI 132. La síntesis de PNI 569 se realizó usando el ácido 1-metilpiperidin-3-carboxílico (0,083 g, 0,583 mmol) en DCM seco (20 mL), 11 (0,4 g, 0,530 mmol) en DCM seco (5 mL), DMAP (0,071 g, 0,583 mmol) y clorhidrato de EDCI (0,234 g, 1,218 mmol). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) (Isolera™) usando MeOH al 3% en DCM para dar PNI 569 (0,38 g, 0,432 mmol, rendimiento 81 %) como un aceite de color amarillo pálido. 1H (400 MHz, CDCl3) 55,48-5,29 (m, 2H), 4,97-4,85 (m, 2H), 2,61 -2,30 (m, 5H), 2,26-1,73 (m, 14H), 1,71 -1,46 (m, 8H), 1,42 1,20 (m, 53H), 1,19-1,04 (m, 4H), 0,96 (t, 3H,J= 8,0), 0,89 (t, 6H,J= 6,0), 0,69-0,61 (m, 4H), 0,59-0,54 (m, 2H), -0,33 (q, 2H,J= 4,0). RT = 8,18 min. 99,6% de pureza.<e>S<i>-MS: m/z = 881 [M+H]+ para C58H106NO4.
PNI 570:
PNI 570 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de PNI 132. La síntesis de PNI 570 se realizó usando el ácido 1 -etilpiperidin-4-carboxílico (0,100 g, 0,636 mmol) en DCM seco (20 mL), 11 (0,4 g, 0,530 mmol) en DCM seco (5 mL),<d>MA<p>(0,078 g, 0,636 mmol) y clorhidrato de EDCI (0,244 g, 1,271 mmol). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) (Isolera™) usando MeOH al 4 % en DCM para dar PNI 570 (0,3 g, 0,335 mmol, rendimiento del 63,3 %) como un aceite de color marrón claro. 1H (400 MHz, CDCh) 55,47-5,28 (m, 2H), 4,97-4,85 (m, 2H), 3,27-2,66 (m, 5H), 2,60-2,52 (m, 2H), 2,26-1,92 (m, 12H), 1,70-1,50 (m, 8H), 1,42-1,26 (m, 55H), 1,19-1,03 (m, 4H), 0,98-0,93 (m, 3H), 0,89 (t, 6H,J= 6,0), 0,68-0,62 (m, 4H), 0,59-0,54 (m, 2H), -0,33 (q, 2H,J= 4,0). RT = 9,25 min. 99,9% de pureza.<e>S<i>-MS: m/z = 895 [M+H]+ para C59H108NO4.
PNI 571:
PNI 571 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de PNI 132. La síntesis de PNI 571 se realizó usando el ácido 1-cidopropilpiperidina-4-carboxílico (0,099 g, 0,583 mmol) en DCM seco (20 mL), 11 (0,4 g, 0,530 mmol) en DCM seco (5 mL), DMAP (0,071 g, 0,583 mmol) y clorhidrato de EDCI (0,234 g, 1,218 mmol). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) (Isolera™) usando MeOH al 4 % en DCM para proporcionar PNI 571 (0,335 g, 0,370 mmol, rendimiento del 69,8 %) como un aceite de color amarillo pálido. 1H (400 MHz, CDCls) 55,47-5,31 (m, 2H), 5,02-4,85 (m, 2H), 3,01-2,98 (m, 2H), 2,60-2,53 (m, 2H), 2,25-1,88 (m, 14H), 1,75-1,47 (m, 8H), 1,43-1,26 (m, 52H), 1,17-1,11 (m, 4H), 0,97-0,93 (m, 3H), 0,89 (t, 6H,J= 6,0), 0,69-0,61 (m, 4H), 0,59-0,54 (m, 2H), 0,50-0,34 (m, 4H), -0,33 (q, 2H,J= 4,0). RT = 10,63 min. 94,6% de pureza. ESI-EM: m/z = 929 [M+Na]+ para C60H107NO4Na.
PNI573:
PNI 573 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de PNI 132. La síntesis de PNI 573 se realizó usando el clorhidrato del ácido quinuclidina-4-carboxílico (5, 0,101 g, 0,530 mmol) en DCM seco (20 mL), 11 (0,4 g, 0,530 mmol) en DCM seco (5 mL), DMAP (0,065 g, 0,530 mmol) y clorhidrato de EDCI (0,234 g, 1,218 mmol). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) (Isolera™) usando MeOH al 5 % en DCM para dar PNI 573 (0,155 g, 0,174 mmol, rendimiento del 32,8 %) como un aceite amarillo. 1H (400 MHz, CDCls) 55,48-5,22 (m, 2H), 5,02-4,86 (m, 2H), 3,29 (t, 6H,J= 8,0), 2,57-2,52 (m, 1H), 2,29-1,96 (m, 15H), 1,74-1,46 (m, 6H), 1,59-1,26 (m, 52H), 1,19-1,06 (m, 4H), 0,96 (t, 3H, = 8,0), 0,89 (t, 6H,J= 6,0), 0,69-0,61 (m, 4H), 0,59-0,54 (m, 2H), -0,33 (q, 2H,J= 4,0). RT = 7,65 min. 97,8% de pureza. ESI-EM: m/z = 893 [M+H]+ para C59H106NO4.
Ejemplo 3. Síntesis de PNI 543 y 544
Compuesto 12: El compuesto 12 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis del compuesto 2. La síntesis de 12 se realizó usando hidruro de sodio (0,666 g, 16,65 mmol, dispersión al 60% en aceite mineral), 3-(aliloxi)propano-1,2-diol (1,0,5 g, 3,78 mmol) en THF seco (40 mL), 9 (3,14 g, 9,08 mmol) en THF seco (10 mL) y 15-corona-5 (0,175 g, 0,794 mmol). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) Isolera™ usando EtOAc al 2% en éter de petróleo como eluyente para proporcionar 12 (0,53 g, 0,787 mmol, rendimiento del 20,81 %) como un aceite amarillo. 1H (400 MHz, CDCb) 55,96-5,86 (m, 1H), 5,28 (dd, 1h ,J= 16,0, 4,0), 5,17 (dd, 1H,J= 12,0, 4,0), 4,02 (d, 2H,J= 4,0), 3,60- 3,43 (m, 9H), 1,59-1,51 (m, 4H), 1,38-1,28 (m, 48H), 1,20-1,06 (m, 4H), 0,89 (t, 6H,J= 6,0), 0,70-0,61 (m, 4H), 0,59-0,54 (m, 2H), -0,33 (q, 2H,J= 8,0). RT = 3,12 min.
98,3% de pureza. ESI-<e>M: m/z = 663 [M+H]+ para C44H85O3.
Compuesto 13: El compuesto 13 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis del compuesto 3. La síntesis de 13 se realizó usando TFA (0,848 mL, 11,01 mmol), Pd(PPh3)4 (0,091 g, 0,079 mmol), 12 (0,52 g, 0,787 mmol) en EtOH seco (10 mL) y Pd(PPh3)4 (0,045 g, 0,039 mmol). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) Isolera™ usando EtOAc al 6 % en éter de petróleo para proporcionar 13 (0,305 g, 0,491 mmol, rendimiento del 62,4 %) como un aceite de color amarillo claro. 1H (400 MHz, CDCh) ó 3,75 3,43 (m, 9H), 1,74-1,53 (m, 4H), 1,38-1,28 (m, 48H), 1,19-1,10 (m, 4H), 0,89 (t, 6H,J= 6,0), 0,68-0,62 (m, 4H), 0,59 0,54 (m, 2H), -0,33 (q, 2H,J= 4,0). RT = 2,27 min. 94,6% de pureza.
Compuesto 14: El compuesto (Z)-2-(3-oxo-2-(pent-2-en-1-il)ciclopentil)acetato de 2,3-bis((8-(2-octilciclopropil)octil)oxi)propilo se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis del 2-(3-oxo-2- ((Z)-pent-2-en-1-il)ciclopentil)acetato de 2,3-bis(((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)oxi)propilo. La síntesis de esta cetona se realizó usando 13 (3,5 g, 5,64 mmol) en DCM seco (20 mL), DMAP (1,033 g, 8,45 mmol), 4 (1,777 g, 8,45 mmol) en DCM seco (10 mL) y clorhidrato de EDCI (1,620 g, 8,45 mmol). El producto crudo se usó para la siguiente etapa sin purificación adicional. 1H (400 MHz, CDCh) 55,49-5,43 (m, 1H), 5,30-5,23 (m, 1H), 4,28 (dd, 1H,J= 12,0, 4,0), 4,14 4,10 (m, 1 H), 3,63 (p, 1H,J= 4,0), 3,55 (t, 2H,J= 8,0), 3,50-3,42 (m, 4H), 2,79-2,69 (m, 1 H), 2,40-2,02 (m, 7H), 1,93 1,87 (m, 2H), 1,65-1,48 (m, 6H), 1,38-1,28 (m, 48H), 1,19-1,06 (m, 4H), 0,96 (t, 3H,J= 6,0), 0,89 (t, 6H,J= 6,0), 0,68 -0,62 (m, 4H), 0,59-0,54 (m, 2H), -0,34 (q, 2H,J= 4,0). R = 6,00 min. 73,6 % de pureza. ESI-MS: m/z = 836 [M+Na]+ para C53H96O5Na.
El compuesto 14 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis del compuesto 5. La síntesis de 14 se realizó usando el (Z)-2-( 3-oxo-2-(pent-2-en-1 -il)ciclopentil)acetato de 2,3-bis((8-(2-octilciclopropil)octil)oxi)propilo (4,8 g, 6,01 mmol) en etanol seco: THF (15 mL, 2:1) y borohidruro de sodio (0,795 g, 21,02 mmol). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) (Isolera™) utilizando EtOAc al 10 % en éter de petróleo como eluyente para dar 14 (2,357 g, 2,5 mmol, rendimiento del 41,6 %) como un aceite espeso e incoloro. 1H (400 MHz, CDCh) 55,50-5,36 (m, 2H), 4,26-4,20 (m, 1H), 4,12-4,04 (m, 1H), 3,94-3,86 (m, 1H), 3,62 (p, 1H,J= 6,0), 3,55 (t, 2H,J= 6,0), 3,49-3,42 (m, 4H), 2,61-2,52 (m, 1H), 2,29-2,04 (m, 7H), 1,95-1,84 (m, 2H), 1,67 1,53 (m, 6H), 1,38-1,28 (m, 48H), 1,19-1,11 (m, 4H), 0,98 (t, 3H,J= 8,0), 0,89 (t, 6H,J= 6,0), 0,68-0,62 (m , 4H), 0,59 0,54 (m, 2H), -0,33 (q, 2H,J= 4,0). RT = 5,78 min. 85,0% de pureza. ESI-EM: m/z = 838 [M+Na]+ para C53H9sO5Na.
PNI 543:
PNI 543 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de PNI 132. La síntesis de PNI 543 se realizó usando el clorhidrato del ácido 4-(dimetilamino)butanoico (0,097 g, 0,578 mmol) en DCM seco (10 mL), 14 ( 0,4 g, 0,511 mmol) en DCM seco (8 mL), DMAP (6,24 mg, 0,051 mmol) y clorhidrato de EDCI (0,147 g, 0,766 mmol). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) IsoleraTM usando MeOH al 5 % en EtOAc para proporcionar PNI 543 (0,240 g, 0,258 mmol, rendimiento del 52,7 %) como un líquido incoloro. 1H (400 MHz, CDCh) 55,45-5,41 (m, 1H), 5,36-5,31 (m, 1H), 4,86-4,83 (m, 1H), 4,24 (dd, 1H,J= 12,0, 4,0), 4,10 (dd, 1 H,J= 12,0, 8,0), 3,62 (p, 1H,J= 4,0), 3,55 (t, 2H,J= 8,0), 3,49-3,42 (m, 4H), 2,59 (dd, 1H,J= 16,0, 4,0), 2,32 -2,26 (m, 4H), 2,22 (s, 6H), 2,20-1,88 (m, 9H), 1,78 (p, 2H,J= 8,0), 1,72-1,65 (m, 2H), 1,56 (p, 4H,J= 8,0), 1,40 1,28 (m, 48H), 1,17-1,11 (m, 4H), 0,96 (t, 3H,J= 6,0), 0,89 (t, 6H,J= 6,0), 0,68-0,62 (m , 4H), 0,59-0,54 (m, 2H), -0,33 (q, 2H,J= 4,0). RT = 6,67 min. 99,9% de pureza. ESI-EM: m/z = 929 [M+H]+ para C59H110NO6.
PNI 544:
PNI 544 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de PNI 132. La síntesis de PNI 544 se realizó usando el clorhidrato del ácido 3-(dimetilamino)propanoico (0,115 g, 0,748 mmol) en DCM seco (10 mL), 14 ( 0,400 g, 0,491 mmol) en DCM seco (10 mL), DMAP (0,018 g, 0,147 mmol) y EDCI (0,141 g, 0,736 mmol). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) (Isolera™) usando acetato de etilo al 60 100 % en éter de petróleo para proporcionar PNI 544 (0,096 g, 0,105 mmol, rendimiento del 21,40 %) como un líquido incoloro. 1H (400 MHz, CDCh) 55,47-5,41 (m, 1H), 5,36-5,30 (m, 1H), 4,88-4,84 (m, 1H), 4,24 (dd, 1H,J= 12,0, 4,0), 4,10 (dd, 1 H,J= 12,0, 8,0), 3,62 (p, 1H,J= 4,0), 3,55 (t, 2H,J= 8,0), 3,49-3,42 (m, 4H), 2,62-2,56 (m, 3H), 2,46-2,42 (m , 2H), 2,32-2,09 (m, 9H), 2,07-1,88 (m, 6H), 1,74-1,67 (m, 2H), 1,56-1,50 (m, 4H), 1,40-1,26 (m, 48H), 1,19 -1,12 (m, 4H), 0,96 (t, 3H,J= 8,0), 0,89 (t, 6H,J= 6,0), 0,69-0,62 (m, 4H), 0,59-0,54 (m, 2H), -0,33 (q, 2H,J= 4,0). RT =<6,68 min. 98,5% de pureza.>E<s>I-EM:<m/z = 915 [M+H]+ para C>58<H>108<NO>6<.>
Ejemplo 4
Síntesis de PNI 545 y 546.
Compuesto 15: En un matraz de fondo redondo de tres bocas de 500 mL que contenía una solución bien agitada de 14 (1,5 g, 1,840 mmol) en tolueno seco (30 mL) se añadió diyodometano (0,712 mL, 8,83 mmol) en atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se enfrió a -40°C y se añadió gota a gota dietilzinc (4,42 mL, 4,42 mmol, solución 1 M en tolueno) mediante un embudo de adición manteniendo la temperatura a -40°C. Después, la temperatura de reacción se elevó lentamente hasta -10°C durante un período de 45 minutos y la temperatura se mantuvo durante 2 h. Se dejó calentar la mezcla hasta temperatura ambiente y se continuó la agitación durante 18 h. Después de completarse la reacción como se indica por TLC, la mezcla de reacción se paró con una solución acuosa saturada de NH4Cl (20 mL). La fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con tolueno (2 x 30 mL). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (50 mL), se secaron sobre Na2SO4 anhidro y se concentraron a presión reducida. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) Isolera™ utilizando EtOAc al 10 % en éter de petróleo para dar 15 (0,995 g, 1,2 mmol, rendimiento del 79 %) como un líquido incoloro. 1H (400 MHz, CDCls) 54,39-4,37 (m, 1H), 4,23 (dd, 1H,J= 12,0, 4,0), 4,12-4,04 (m, 2H), 3,65-3,59 (m, 1H), 3,55 (t, 2H,J= 6,0), 3,52-3,42 (m, 4H), 2,54 (dd, 1H,J= 16,0, 12,0), 2,19-2,10 (m, 4H), 1,95-1,86 (m, 1H), 1,67-1,48 (m, 6H) ), 1,43-1,28 (m, 50H), 1,19-1,10 (m, 6H), 1,00 (t, 3H,J= 8,0), 0,89 (t, 6H,J= 6,0), 0,70-0,63 (m, 7H), 0,59-0,54 (m, 2H), -0,19 - -0,24 (m, 1H), -0,33 (q, 2H,J= 4,0). RT = 7,06 min. 70,6% de pureza. ESI-EM: m/z = 852 [M+Na]+ para C54H100O5Na.
PNI 545:
PNI 545 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de PNI 132. La síntesis de PNI 545 se realizó usando el clorhidrato del ácido 4-(dimetilamino)butanoico (0,067 g, 0,398 mmol) en DCM seco (10 mL), 15 (0,220 g, 0,265 mmol) en DCM seco (10 mL), DMAP (0,016 g, 0,133 mmol) y clorhidrato de EDCI (0,127 g, 0,663 mmol). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) (Isolera™) usando MeOH al 2 % en EtOAc para dar PNI 545 (0,115 g, 0,122 mmol, rendimiento del 46,0 %) como un aceite de color amarillo claro. 1H (400 MHz, CD Cla) 55,36-5,34 (m, 1H), 4,27-4,22 (m, 1H), 4,14-4,07 (m, 1H), 3,62 (p, 1H,J= 4,0), 3,56 (t, 2H,J= 6,0), 3,49-3,52 (m, 4H), 2,58 (d, 1H,J= 12,0), 2,45-2,23 (m, 9H), 2,20-2,13 (m, 2H), 2,09-1,93 (m, 4H), 1,89-1,78 (m, 2H), 1,75-1,48 (m, 6H), 1,40-1,22 (m, 50H), 1,17-1,13 (m, 6H), 0,98 (t, 3H,J= 6,0), 0,89 (t, 6H,J= 6,0), 0,69-0,54 (m, 9H), -0,31-0,37 (m, 3H). RT = 7,38 min. 98,4% de pureza. ESI-EM: m/z = 965 [M+Na]+ para C60HmNO6Na.
PNI 546:
PNI 546 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de PNI 132. La síntesis de PNI 546 se realizó usando el clorhidrato del ácido 3-(dimetilamino)propanoico (0,102 g, 0,663 mmol) en DCM seco (10 mL), 15 ( 0,22 g, 0,265 mmol) en DCM seco (5 mL), DMAP (0,049 g, 0,398 mmol) y EDCI (0,153 g, 0,796 mmol). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) (Isolera™) usando MeOH al 2 % en EtOAc para producir PNI 546 (0,055 g, 0,059 mmol, rendimiento del 22,33 %) como un aceite de color amarillo claro. 1H (400 MHz, CDCb) 55,37-5,33 (m, 1H), 4,27-4,21 (m, 1H), 4,13-4,08 (m, 1H), 3,62 (p, 1H,J= 4,0), 3,56 (t, 2H,J= 6,0), 3,49 3,42 (m, 4H), 2,68 (br s, 2H), 2,60-2,50 (m, 3H), 2,30 (s, 6H), 2,21-1,92 (m, 5H), 1,74-1,66 (m, 6H) ), 1,38-1,26 (m, 50H), 1,17-1,10 (m, 6H), 0,98 (t, 3H,J= 6,0), 0,89 (t, 6H,J= 6,0), 0,70-0,54 (m, 9H) , -0,31 - -0,35 (m, 3H). RT = 7,38 min. 98,2% de pureza. ESI-EM: m/z = 951 [M+Na]+ para C59H109NO6Na.
Ejemplo 5
Síntesis de PNI 547 y 548.
Esquema 8. Síntesis de PNI 547 y 548
Compuesto 16: El compuesto 16 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis del compuesto 2. La síntesis de 16 se realizó usando hidruro de sodio (2,179 g, 91 mmol, dispersión al 60 % en aceite mineral), 3-(aliloxi)propan-1,2-diol (1, 3,0 g, 22,70 mmol) en THF seco (30 mL), 1-bromotetradecano (15,74 g, 56,7 mmol) en THF (30 mL) y 15-corona-5 (1,50 g, 6,81 mmoles). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna (Isolera™) usando gel de sílice (100-200 mesh) usando EtOAc al 10% en éter de petróleo como eluyente para obtener 16 (5,0 g, 9,53 mmol, rendimiento del 42,0 %). 1H (400 MHz, CDCla) 55,96-5,86 (m, 1H), 5,28 (dd, 1H,J= 16,0, 4,0), 5,18 (dd, 1H,J= 12,0, 4,0), 4,02 (d, 2H,J= 4,0), 3,59-3,43 (m, 9H), 1,61-1,53 (m, 4H), 1,34-1,17 (m, 44H), 0,89 (t, 6H,J= 6,0). RT = 4,27 min. 99,9% de pureza. ESI-MS: m/z = 547 [M+Na]+ para Ca4H68OaNa.
Compuesto 17: A una solución agitada de 16 (3,0 g, 5,72 mmol) en EtOH seco (50 mL) se le añadieron TFA (4,5 mL) y Pd(PPh3)4 (0,660 g, 0,572 mmol) en atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se agitó a 85°C durante 16 h y el consumo de material de partida se confirmó mediante análisis por TLC. La mezcla de reacción se concentró a presión reducida y se filtró a través de un lecho de celita. El lecho de celita se lavó con EtOAc (3 x 200 mL) y los filtrados combinados se concentraron. El material crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) usando EtOAc al 30% en éter de petróleo como eluyente para dar 17 (2,5 g, 5,16 mmol, rendimiento del 90 %) como un aceite incoloro. 1H (400 MHz, CDCb) 53,74 (dd, 1H,J= 12,0, 4,0), 3,66-3,43 (m, 8H), 2,14 (br s, 1H), 1,61-1,53 (m, 4H), 1,35-1,22 (m, 44H), 0,89 (t, 6H,J= 6,0). RT = 2,60 min. 99,4% de pureza. ESI-EM: m/z = 485 [M+H]+ para C81H65O8.
Compuesto 18: Se sintetizó (Z)-2-(3-oxo-2-(pent-2-en-1-il)ciclopentil)acetato de 2,3-bis(tetradeciloxi)propilo usando un método similar al usado para síntesis del 2-(3-oxo-2-((Z)-pent-2-en-1-il)ciclopentil)acetato de 2,3-bis(((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)oxi)propilo. La síntesis de esta cetona se realizó usando 17 (3,0 g, 6,19 mmol) en DCM seco (20 mL), DMAP (0,378 g, 3,09 mmol), 4 (1,952 g, 9,28 mmol) en DCM seco (30 mL) y clorhidrato de EDCI (2,97 g, 15,47 mmol). El producto crudo (líquido naranja pálido) se usó como tal para la siguiente etapa sin purificación adicional. 1H (400 MHz, CDCla) 55,49-5,43 (m, 1H), 5,30-5,23 (m, 1H), 4,28 (dd, 1H,J= 12,0, 4,0), 4,14-4,09 (m, 1H), 3,62 (p, 1H,J= 4,0), 3,55 (t, 2H,J= 8,0), 3,49-3,42 (m, 4H), 2,77-2,70 (m, 1H), 2,40-1,98 (m, 9H), 1,59-1,48 (m, 6H), 1,33-1,20 (m, 44H), 0,96 (t, 3H,J= 8,0), 0,88 (t, 6H,J= 6,0). TR = 3,09 min. 59,4% de pureza. ESI-EM: m/z = 700 [M+Na]+ para C4aH8oO5Na.
El compuesto 18 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de 5. La síntesis de 18 se realizó usando (Z)-2-(3-oxo-2-(pent-2- en-1-il)ciclopentil)acetato de 2,3-bis(tetradeciloxi)propilo (2,5 g, 3,69 mmol) en 25 mL de MeOH seco:THF (4:1) y borohidruro de sodio (0,489 g, 12,92 mmol). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) Isolera™ utilizando EtOAc al 10% en éter de petróleo como eluyente para proporcionar 18 (1,5 g, 2,209 mmol, rendimiento del 59,8 %) como un aceite espeso e incoloro. 1H (400 MHz, CDCb) 55,52-5,36 (m, 2H), 4,24 (dd, 1H,J= 12,0, 4,0), 4,09 (dd, 1H,J= 12,0, 4,0), 3,94-3,86 (m, 1H), 3,62 (p, 1H,J= 4,0), 3,55 (t, 2H,J= 8,0), 3,49-3,42 (m, 4H), 2,60-2,54 (m, 1H), 2,35-2,29 (m, 1H), 2,23-1,83 (m, 8H), 1,65 1,47 (m, 6H), 1,34-1,21 (m, 44H), 0,98 (t, 3H,J= 8,0), 0,89 (t, 6H,J= 6,0).
PNI 547:
PNI 547 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de PNI 132. La síntesis de PNI 547 se realizó usando el clorhidrato del ácido 3-(dimetilamino)propanoico (0,424 g, 2,76 mmol) en DCM seco (30 mL), 18 (0,75 g, 1,104 mmol) en DCM seco (5 mL), DMAP (0,067 g, 0,552 mmol) y clorhidrato de EDCI (0,423 g, 2,209 mmol). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) IsoleraTM usando MeOH al 5 % en EtOAc para dar PNI 547 (0,51 g, 0,655 mmol, rendimiento del 59,3 %) como un aceite incoloro. 1H (400 MHz, CDCh) ó 5,45-5,28 (m, 2H), 4,89-4,85 (m, 1H), 4,26-4,21 (m, 1H), 4,10 (dd, 1H,J= 12,0, 8,0), 3,62 (p, 1H,J= 4,0), 3,55 (t, 2H,J= 6,0), 3,49-3,42 (m, 4H), 3,09-2,92 (m, 2H), 2,78-2,67 (m, 2H), 2,62-2,55 (m, 7H), 2,32-1,89 (m, 9H), 1,73-1,63 (m, 2H), 1,55 (p, 4H,J= 8,0), 1,37-1,16 (m, 44H), 0,97-0,93 (m, 3H), 0,88 (t , 6H,J= 6,0). RT = 3,48 min. 99,5% de pureza. ESI-EM: m/z = 779 [M+H]+ para C48H92NO6.
PNI 548:
Se añadió paladio sobre carbono (0,041 g, 0,385 mmol, 10 % en peso) a una solución agitada de PNI 547 (0,150 g, 0,193 mmol) en EtOH seco (20 mL) en atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente en atmósfera de H2 (cámara de aire) durante 6h. Después de completarse la reacción como se indica por TLC, la mezcla de reacción se filtró a través de un lecho de celita y se lavó con EtOH hasta que no se observó ningún compuesto en los lavados. Los filtrados combinados se concentraron y el residuo se disolvió en EtOAc (30 mL). La fase orgánica se lavó con agua (2 x 20 mL) y salmuera (2 x 20 mL). La fase orgánica se separó, se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) (Isolera™) usando MeOH al 5 % en DCM como eluyente para dar PNI 548 (0,12 g, 0,154 mmol, rendimiento del 80 %) como un aceite espeso de color amarillo claro. 1H (400 MHz, CDCh)ó4,89-4,86 (m, 1H), 4,26 4,22 (m, 1H), 4,10 (dd, 1H,J= 12,0, 8,0), 3,62 (p, 1H,J= 4,0), 3,55 (t, 2H,J= 6,0), 3,49-3,42 (m, 4H), 2,65-2,44 (m, 5H), 2,37-1,79 (m, 11H), 1,69-1,49 (m, 6H), 1,44-1,22 (m, 52H), 0,89 (T aparente, 9H,J= 6,0). RT = 3,87 min. 89,4% de pureza. ESI-EM: m/z = 781 [M+H]+ paraC48Hs4NO6.
Ejemplo 6
Síntesis de PNI 554, 562 y 565.
Compuesto 20: Se añadió gota a gota bromuro de n-octilmagnesio (7,96 mL, 15,93 mmol) a una solución agitada de 19 (2,5 g, 13,27 mmol) en THF seco a 0°C en atmósfera de nitrógeno y la mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente. Después de agitar durante 4 horas, la mezcla de reacción se paró con una disolución acuosa saturada de NH4O (50 mL) y se extrajo con EtOAc (3 x 50 mL). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (2 x 50 mL), se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) (Isolera™) usando EtOAc al 5% en éter de petróleo para dar 20 (1,05 g, 3,47 mmol, rendimiento del 26,1 %) como un aceite de color amarillo claro. 1H (400 MHz, CDCb) 5 3,93-3,89 (m, 1H), 3,85-3,79 (m, 2H), 3,39 (d, 1H,J= 4,0), 1,65 (q, 2H,J= 4,0), 1,52-1,42 (m, 2H), 1,34-1,21 (m, 12H), 0,91-0,87 (m, 12H), 0,09 (s, 6H). RT= 1,13 min. 97,1% de pureza. ESI-MS: m/z = 303 [M+H]+ para C17H39O2SL
Compuesto 22: A una solución agitada de ácido 2-hexildecanoico (21, 1,271 g, 4,96 mmol) en DCM seco (8 mL), se añadieron DMAP (0,686 g, 5,62 mmol) y clorhidrato de EDCI (1,077 g, 5,62 mmol) a temperatura ambiente bajo atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se agitó durante 10 minutos y se añadió una solución de 20 (1,0 g, 3,30 mmol) en DCM seco (4 mL). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas y el análisis de TLC mostró el consumo completo de 20. El disolvente se evaporó a presión reducida y el residuo se disolvió en EtOAc (100 mL). La fase orgánica se lavó con agua (2 x 50 mL), salmuera (2 x 50 mL), se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) Isolera™ usando EtOAc al 5% en éter de petróleo para dar 22 (1,76 g, 3,25 mmol, rendimiento del 98 %) como un aceite de color amarillo claro. 1H (400 MHz, CDCb) 54,97 (p, 1H,J= 6,0), 3,68-3,58 (m, 2H), 2,32-2,25 (m, 1H), 1,81-1,74 (m, 2H), 1,62-1,42 (m, 6H), 1,34 -1,21 (m, 32H), 0,90-0,86 (m, 18H), 0,04 (s, 6H). RT = 4,26 min. 87,5% de pureza.
Compuesto 23: Se añadió gota a gota TBAF (solución 1 M en THF, 3,88 mL, 3,88 mmol) a una solución agitada de 22 (1,75 g, 3,23 mmol) en THF seco (20 mL) a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se agitó durante 16 horas y el análisis de TLC mostró el consumo completo de 22. La mezcla de reacción se paró con HCl 1 N (50 mL) y se extrajo con EtOAc (2 x 75 mL). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (2 x 50 mL), se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) IsoleraTM usando EtOAc al 5 % en éter de petróleo para dar 23 (1,36 g, 3,19 mmol, rendimiento del 99 %) como un aceite de color amarillo claro. 1H (400 MHz, CDCb) 55,06 4,99 (m, 1H), 3,66-3,61 (m, 1H), 3,55-3,49 (m, 1H), 2,38-2,31 (m, 1H), 1,89-1,81 (m, 1H), 1,69-1,40 (m, 7H), 1,37-1,22 (m, 32H), 0,92-0,87 (m, 9H). RT = 1,85 min. 99,2% de pureza. ESI-EM: m/z = 449 [M+Na]+ paraC27H54OsNa.
Compuesto 24: Se sintetizó 2-hexildecanoato de (Z)-1-(2-(3-oxo-2-(pent-2-en-1-il)ciclopentil)acetoxi)undecan-3-ilo usando un método similar al utilizado para la síntesis del 2-(3-oxo-2-((Z)-pent-2 -en-1-il)ciclopentil)acetato de 2,3-bis(((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)oxi)propilo. La síntesis de esta cetona se realizó usando 23 (1,35 g, 3,16 mmol) en DCM seco (5 mL), DMAP (0,773 g, 6,33 mmol), 4 (1,330 g, 6,33 mmol) en DCM seco (15 mL) y clorhidrato de EDCI (1,213 g, 6,33 mmol). El crudo (2,01 g, 3,25 mmol, rendimiento del 100 % del crudo) se obtuvo como un aceite amarillo y se usó para la siguiente etapa sin purificación adicional.
El compuesto 24 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de 5. La síntesis de 24 se realizó usando 2-hexildecanoato de (Z)-1-(2-(3-oxo-2-(pent-2-en-1-il)ciclopentil)acetoxi)undecan-3-ilo (2,0 g, 3,23 mmol) en MeOH seco (20 mL) y THF seco (5 mL) y borohidruro de sodio (0,489 g, 12,92 mmol). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) IsoleraTM usando EtOAc al 10% en éter de petróleo para dar 24 (1,82 g, 2,91 mmol, rendimiento del 90 %) como un aceite de color amarillo claro. 1H (400 MHz, CDCb) 55,52-5,38 (m, 2H), 4,99 (p, 1H,J= 8,0), 4,25-4,19 (m, 1H), 4,17-4,10 (m, 1H), 4,07-4,01 (m, 1H), 3,93-3,86 (m, 1H), 2,58-2,52 (m, 1H), 2,34-2,26 (m, 2H), 2,23-1,81 (m, 8H), 1,67-1,40 (m, 10H), 1,34-1,20 (m, 32H), 0,98 (t, 3H,J= 8,0), 0,88 (t, 9H,J= 8,0). RT = 2,26 min. 99,5% de pureza. ESI-EM: m/z = 622 [M+H]+ para C39H73O5.
PNI 554:
A una solución agitada del clorhidrato del ácido 3-(dimetilamino)propanoico (0,148 g, 0,966 mmol) en DCM seco (10 mL), se añadieron DMAP (0,157 g, 1,288 mmol) y clorhidrato de EDCI (0,247 g, 1,288 mmol) a temperatura ambiente bajo atmósfera de nitrógeno. Después de agitar durante 10 minutos, se añadió una solución de 24 (0,4 g, 0,644 mmol) en DCM seco (5 mL) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. El análisis por TLC mostró que 24 no se consumió por completo. Se añadió una mezcla previamente agitada de clorhidrato del ácido 3 (dimetilamino)propanoico (0,198 g, 1,288 mmol), DMAP (0,157 g, 1,288 mmol) y EDCI (0,370 g, 1,932 mmol) en DCM (10 mL) a la mezcla de reacción y se continuó la agitación durante 16 h. El análisis por TLC mostró que se había consumido 24 y el disolvente se evaporó a presión reducida. El residuo se disolvió en EtOAc (120 mL) y se lavó con agua (2 x 50 mL), salmuera (2 x 50 mL), se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna (100-200 mesh) Isolera™ usando MeOH al 3 % en DCM para dar PNI 554 (0,325 g, 0,451 mmol, rendimiento del 70,1 %) como un aceite de color amarillo claro. 1H (400 MHz, CDCh) 55,47 5,26 (m, 2H), 5,02-4,84 (m, 2H), 4,17-4,11 (m, 1H), 4,07-4,03 (m, 1H), 2,66-2,46 (m, 5H), 2,34-1,85 (m, 18H), 1,72 1,65 (m, 2H), 1,46-1,38 (m, 4H), 1,34-1,17 (m, 34H), 0,97-0,93 (m, 3H), 0,88 (t, 9H,J= 8,0). RT = 2,40 min. 99,3% de pureza. ESI-EM: m/z = 721 [M+H]+ para C44H82NO6.
PNI 562:
PNI 562 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de PNI 132. La síntesis de PNI 562 se realizó usando el clorhidrato del ácido 4-(dimetilamino)butanoico (0,121 g, 0,725 mmol) en DCM seco (8 mL), DMAP ( 0,118 g, 0,966 mmol), clorhidrato de EDCI (0,185 g, 0,966 mmol) y 24 (0,3 g, 0,483 mmol) en DCM seco (4 mL). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) Isolera™ usando MeOH al 4 % en DCM para proporcionar PNI 562 (0,195 g, 0,260 mmol, rendimiento del 53,9 %) como un aceite de color amarillo claro. 1H (400 MHz, CDCh) 55,47-5,29 (m, 2H), 5,03-4,83 (m, 2H), 4,17-4,11 (m, 1H), 4,07-4,01 (m, 1H), 2,59-2,53 (m, 1H), 2,43-1,81 (m, 23H), 1,73-1,65 (m, 3H), 1,48-1,39 (m, 4H), 1,36-1,16 (m, 34H), 0,97-0,93 (m, 3H), 0,88 (t, 9H,J= 8.0). RT = 2,46 min. 98,0% de pureza. ESI-MS: m/z = 735 [M+H]+ para C45H84NO6.
PNI 565:
PNI 565 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de PNI 132. La síntesis de PNI 565 se realizó usando el clorhidrato del ácido 1,4-dimetilpiperidina-4-carboxílico (0,150 g, 0,773 mmol) en DCM seco (10 mL), DMAP (0,126 g, 1,031 mmol), clorhidrato de E<d>C<i>(0,198 g, 1,031 mmol) y 24 (0,32 g, 0,515 mmol) en DCM seco (5 mL). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) Isolera™ usando MeOH al 5 % en DCM para dar PNI 565 (0,27 g, 0,353 mmol, rendimiento del 68,5 %) como un aceite de color amarillo claro.
1H (400 MHz, CDCh) 55,47-5,29 (m, 2H), 5,03-4,95 (m, 1 H), 4,88-4,84 (m, 1 H), 4,17-4,11 (m, 1 H), 4,08-4,01 (m, 1H), 2,76 (br s, 2H), 2,56 (dd, 1H,J= 16,0, 4,0), 2,42-1,87 (m, 21H), 1,58-1,51 (m, 2H), 1,45-1,40 (m, 4H), 1,32-1,19 (m, 37H), 0,98-0,94 (m, 3H), 0,88 (t, 9H,J= 8,0). RT = 2,56 min. 99,4% de pureza. ESI-EM: m/z = 761 [<m>+H]+ para C47H86NO6.
Ejemplo 7
Síntesis de PNI 510, 552 y 563.
El compuesto 25:1,2-dibromoetano (0,114 mL, 1,327 mmol) se añadió a una suspensión bien agitada de virutas de Mg activadas (0,484 g, 19,91 mmol) en THF seco (5 mL) en atmósfera de nitrógeno y la mezcla se agitó durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se añadió una solución de bromuro de linoleilo (5,68 g, 17,26 mmol) en THF seco (8 mL) y la mezcla de reacción se mantuvo a reflujo durante 1 h. Después de completarse la reacción como se indica por TLC, la mezcla de reacción se enfrió a 20°C y se añadió una solución de 19 (2,5 g, 13,27 mmol) en THF seco (7 mL). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas y el análisis por TLC mostró el consumo completo de 19. La mezcla de reacción se enfrió a 0°C y se paró con HCl acuoso 1 N (50 mL) con agitación lenta. La fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con EtOAc (2 x 75 mL). La fase orgánica combinada se lavó con salmuera (2 x 50 mL), se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró. El material crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) Isolera™ utilizando EtOAc al 5% en éter de petróleo para dar 25 (2,25 g, 5,13 mmol, rendimiento del 38,6 %) como un aceite amarillo. 1H (400 MHz, CDCb) 55,42-5,30 (m, 4H), 3,93-3,89 (m, 1H), 3,85-3,79 (m, 2H), 3,40 (d, 1H,J= 4,0), 2,78 (t, 2H,J= 8,0), 2,06 (q, 4H,J= 8,0), 1,65 (q, 2H,J= 4,0), 1,42-1,29 (m, 20H), 0,91 (s, 12H), 0,09 (s, 6H). RT = 1,96 min. 99,1% de pureza. ESI-EM: m/z = 439 [M+H]+ para C27H55O2Si.
Compuesto 26: El compuesto 26 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de 22. La síntesis de 26 se realizó usando el ácido 2-hexildecanoico (21, 1,800 g, 7,02 mmol) en DCM seco (10 mL), DMAP (1,225 g, 10,03 mmol), clorhidrato de EDCI (1,922 g, 10,03 mmol) y 25 (2,2 g, 5,01 mmol) en DCM (10 mL). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) (Isolera™) usando EtOAc al 5% en éter de petróleo para dar 26 (3,25 g, 4,80 mmol, rendimiento del 96 %) como un aceite amarillo. 1H (400 MHz, CDCb) 5 5,42-5,30 (m, 4H), 5,00-4,94 (m, 1H), 3,68-3,58 (m, 2H), 2,78 (t, 2H,J= 6,0), 2,32-2,25 (m, 1H), 2,08 -2,00 (m, 4H), 1,77 (p, 2H,J= 8,0), 1,68-1,47 (m, 4H), 1,38-1,20 (m, 40H), 0,91-0,86 (m, 18H), 0,04 (s, 6H). RT = 4,26 min. 87,5% de pureza. ESI-EM: m/z = 700 [M+Na]+ para C43H84O3SiNa.
Compuesto 27: El compuesto 27 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de 23. La síntesis de 27 se realizó usando TBAF (3,88 mL, 3,88 mmol, solución 1 M en THF) y 26 (1,75 g, 3,23 mmol) en THF (20 mL) a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) Isolera™ utilizando EtOAc al 5% en éter de petróleo para proporcionar 27 (1,36 g, 3,19 mmol, rendimiento del 99 %) como un aceite de color amarillo claro. 1H (400 MHz, CDCb) 55,42-5,32 (m, 4H), 5,06 4,99 (m, 1H), 3,67-3,61 (m, 1H), 3,55-3,49 (m, 1H), 2,78 (t, 2H,J= 6,0), 2,40-2,31 (m, 2H), 2,06 (q, 4H,J= 8,0), 1,89 1,81 (m, 2H), 1,51-1,42 (m, 4H), 1,38-1,26 (m, 40H), 0,92-0,87 (m, 9H). RT = 2,77 min. 92,2% de pureza. ESI-EM: m/z = 585 [M+Na]+ para C37H70O3Na.
Compuesto 28: El 2-hexildecanoato de (12Z,15Z)-1-(2-(3-oxo-2-((Z)-pent-2-en-1-il)ciclopentil)acetoxi)henicosa-12,15-dien-3-ilo se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis del 2-(3- oxo-2-((Z)-pent-2-en-1-il)ciclopentil)acetato de 2,3-bis(((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)oxi)propilo. La síntesis de esta cetona se realizó usando 4 (1,330 g, 6,33 mmol) en DCM (15 mL), DMAP (0,773 g, 6,33 mmol), clorhidrato de EDCI (1,213 g, 6,33 mmol) y 27 (1,35 g, 3,16 mmol) en DCM (5 mL). El producto crudo (2,01 g, 3,25 mmol, aceite amarillo) se tomó como tal para la siguiente etapa sin purificación adicional. 1H (400 MHz, CDCb) 5 5,50-5,24 (m, 6H), 4,99 (p, 1H,J= 6,0), 4,20-4,03 (m, 2H), 2,83-2,69 (m, 3H), 2,42-1,86 (m, 16H), 1,52 -1,41 (m, 6H), 1,38-1,21 (m, 40H), 0,98-0,94 (m, 3H), 0,91-0,86 (m, 9h ). RT = 3,34 min. 99,5% de pureza. ESI-MS: m/z = 778 [M+Na]+ para C49H8sO5Na.
El compuesto 28 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de 5. La síntesis de 28 se realizó usando 2-hexildecanoato de (12Z,15Z)-1 -(2-(3-oxo-2-((Z)-pent-2-en-1 -il)ciclopentil)acetoxi)henicosa-12,15-dien-3-ilo (2,0 g, 3,23 mmol) en MeOH (20 mL) y THF (5 mL) y borohidruro de sodio (0,489 g, 12,92 mmoles). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) Isolera™ utilizando EtOAc al 10% en éter de petróleo para dar 28 (1,82 g, 2,91 mmol, rendimiento del 90 %) como un aceite de color amarillo claro. 1H (400 MHz, CDCl3) ó 5,50-5,30 (m, 6H), 4,99 (p, 1H,J= 8,0), 4,17-4,10 (m, 1H), 4,07-4,01 (m, 1H), 3,93-3,88 (m, 1H), 2,78 (t, 2H,J= 6,0), 2,58-2,52 (m, 1H), 2,39-1,83 (m, 16H), 1,50-1,40 (m, 6H), 1,38-1,26 (m, 40H), 0,98 (t, 3H,J= 8,0), 0,91-0,86 (m, 9H). RT = 3,38 min. 99,3% de pureza. ESI-EM: m/z = 780 [M+Na]+ para C49H8sO5Na.
PNI 510:
PNI 510 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de PNI 132. La síntesis de PNI 510 se realizó usando el clorhidrato del ácido 4-(dimetilamino)butanoico (0,194 g, 1,156 mmol) en DCM seco (10 mL), 28 ( 0,35 g, 0,462 mmol) en DCM (5 mL), Dm Ap (0,141 g, 1,156 mmol) y clorhidrato de Ed C i (0,310 g, 1,618 mmol). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) usando MeOH al 5 % en DCM para dar PNI 510 (0,385 g, 0,439 mmol, rendimiento del 95 %) como un aceite azul. 1H (400 MHz, CDCta) ó 5,47-5,27 (m, 6H), 5,02-4,82 (m, 2H), 4,16-4,09 (m, 1H), 4,07-4,01 (m, 1H), 2,77 (t, 2H,J= 6,0), 2,57-2,52 (m, 1H), 2,41 -2,19 (m, 11H), 2,18-1,79 (m, 14H), 1,71-1,55 (m, 5H), 1,48-1,39 (m, 4H), 1,38-1,17 (m, 40H), 0,97-0,93 (m, 3H), 0,91-0,86 (m, 9H). RT = 3,65 min. 99,3% de pureza. ESI-EM: m/z = 871 [<m>+H]+ para C55H100NO6.
PNI 552:
PNI 552 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de PNI 132. La síntesis de PNI 552 se realizó usando el clorhidrato del ácido 3-(dimetilamino)propanoico (0,243 g, 1,585 mmol) en DCM seco (10 mL), 28 ( 0,4 g, 0,528 mmol) en DCM (5 mL), D<m>A<p>(0,194 g, 1,585 mmol) y clorhidrato de EDCI (0,405 g, 2,113 mmol). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) Isolera™ usando MeOH al 4 % en DCM para producir PNI 552 (0,405 g, 0,468 mmol, rendimiento del 89 %) como un aceite azul claro. 1H (400 MHz, CDCta) ó 5,47-5,30 (m, 6H), 5,02-4,82 (m, 2H), 4,16-4,11 (m, 1H), 4,07-4,01 (m, 1H), 2,78 (t, 2H,J= 6,0), 2,74 -2,62 (m, 2H), 2,60-2,43 (m, 3H), 2,40-2,23 (m, 7H), 2,21 -1,85 (m, 14H), 1,75-1,67 (m, 3H), 1,49-1,40 (m, 4H), 1,38-1,17 (m, 40H), 0,97-0,93 (m, 3H), 0,91-0,86 (m, 9H). RT = 3,62 min. 98,9% de pureza. ESI-EM: m/z = 857 [M+H]+ para C54H98NO6.
PNI 563:
PNI 563 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de PNI 132. La síntesis de PNI 563 se realizó usando el ácido 1,4-dimetilpiperidin-4-carboxílico (0,189 g, 0,977 mmol) en DCM seco (10 mL), 28 (0,37 g, 0,489 mmol) en DCM seco (5 mL), DMAP (0,119 g, 0,977 mmol) y clorhidrato de EDCI (0,281 g, 1,466 mmol). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) (Isolera™) usando MeOH al 5 % en DCM para producir PNI 563 (0,335 g, 0,372 mmol, rendimiento del 76 %) como un aceite azul claro. 1H (400 MHz, CDCb) 5 5,47-5,21 (m, 6H), 5,02-4,84 (m, 2H), 4,17-4,11 (m, 1H), 4,09-4,01 (m, 1H), 2,79-2,64 (m, 4H), 2,61-2,53 (m, 1H), 2,34 1,85 (m, 22H), 1,69-1,49 (m, 3H), 1,46-1,18 (m, 49H), 0,98-0,94 (m, 3H), 0,91-0,86 (m, 9H). RT = 4,03 min. 99,6% de<pureza.>ESI-E<m>:<m/z = 897 [M+H]+ para C>57<H>102<NO>6<.>
Ejemplo 8
Síntesis de PNI 515 y 551.
Esquema 14. Ruta general para la síntesis de PNI 515 y 551
Compuesto 29: Se añadió LiOH (1,660 g, 69,3 mmol) a una solución agitada de 7 (15 g, 46,2 mmol) en EtOH (105 mL) y agua (45 mL) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. Una vez completada la reacción como se indica por TLC, la mezcla de reacción se concentró al vacío para obtener el residuo. El residuo se diluyó con agua (100 mL) y se lavó con MTBE (2 x 100 mL). La fase acuosa se enfrió a 0°C, se acidificó con HCl 6 N y se extrajo con EtOAc (3 x 300 mL). Las fases orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron para obtener 29 (13,05 g, 43,0 mmol, rendimiento del 93 %) como un sólido blanco. 1H (400 MHz, CDCb) 52,36 (t, 2H,J= 6,0), 1,64 (p, 2H,J= 8,0), 1,39-1,28 (m, 22H), 1,19-1,10 (m, 2H), 0,89 (t, 3H,J= 6,0), 0,68 0,62 (m, 2H), 0,59-0,54 (m, 1H), -0,33 (q aparente, 1H,J= 4,0). RT = 2,91 min. 97,7% de pureza. ESI-EM: m/z = 295 [M-H]- para C19H35O2.
Compuesto 30: A una solución agitada de 29 (5,3 g, 17,88 mmol) en DCM seco (25 mL), se le añadieron DMAP (3,28 g, 26,8 mmol) y clorhidrato de EDCI (5,14 g, 26,8 mmol) a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno. La mezcla se agitó durante 10 minutos y se añadió una solución de 3-(aliloxi)propano-1,2-diol (1, 1,039 g, 7,87 mmol) en DCM seco (5 mL). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas y el consumo de material de partida se confirmó mediante análisis por TLC. El disolvente se evaporó hasta sequedad a presión reducida y el residuo se disolvió en EtOAc (200 mL). La fase orgánica se lavó con agua (2 x 100 mL), salmuera (2 x 100 mL), se secó sobre Na2SO4 anhidro, se filtró y se concentró. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) Isolera™ usando EtOAc al 5% éter de petróleo para dar 30 (4,25 g, 6,15 mmol, rendimiento 34,4 %) como un aceite amarillo. 1H (400 MHz, CDCla) 55,92-5,82 (m, 1H), 5,28 (dd, 1H,J= 16,0, 4,0), 5,24-5,18 (m, 2H), 4,35 (dd, 1H,J= 12,0, 4,0), 4,18 (dd, 1H,J= 12,0, 4,0), 4,05-3,96 (m, 2H), 3,58 (d, 2H,J= 4,0), 2,35-2,29 (m, 4H), 1,67-1,60 (m, 4H), 1,40-1,28 (m, 44H), 1,19-1,10 (m, 4H), 0,89 (t, 6H,J= 6,0), 0,68-0,62 (m, 4H), 0,59-0,54 (m, 2H), -0,33 (q, 2H,J= 4,0). RT = 4,13 min. 99,8% de pureza. ESI-EM: m/z = 712 [M+Na]+ para C44Hs0O5Na.
Compuesto 31: El intermedio 31 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis del intermedio 3. La síntesis de 31 se realizó usando TFA (6,57 mL, 85 mmol), Pd(PPh3)4 (0,704 g, 0,609 mmol) y 30 (4,2 g, 6,09 mmol) en EtOH seco (80 mL). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) (Isolera ™) usando EtOAc al 10% en éter de petróleo para dar 31 (1,12 g, 1,726 mmol, rendimiento del 28,3 %) como un aceite amarillo. 1H (400 MHz, CDCb) 54,32-4,08 (m, 5H), 2,36 (t, 4H,J= 8,0), 1,68-1,60 (m, 4H), 1,40-1,26 (m, 44H), 1,16-1,11 (m, 4H), 0,89 (t, 6H,J= 6,0), 0,68-0,62 (m, 4H), 0,59-0,54 (m, 2H), -0,33 (q, 2H,J= 4,0). RT =<3,45 min. 68,9% de pureza.>ESI-<e>M:<m/z = 671 [M+Na]+ para Ca41H76OsNa.>
Compuesto 32: bis(8-(2-octilciclopropilo) octanoato) de (Z)-3-(2-(3-hidroxi-2-(pent-2-en-1-il)ciclopentil)acetoxi)propano-1,2-diilo se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis del 2-(3-oxo-2-((Z)-pent-2-en-1-il)ciclopentil)acetato de 2,3-bis(((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)oxi)propilo. La síntesis de esta cetona se realizó usando 31 (1,1 g, 1,695 mmol) en DCM seco (10 mL), DMAP (0,414 g, 3,39 mmol), 4 (0,713 g, 3,39 mmol) en DCM seco (15 mL) y clorhidrato de EDCI (0,650 g, 3,39 mmol). El producto de cetona crudo (1,72 g) se obtuvo como un aceite amarillo y se tomó como tal para la siguiente etapa sin purificación adicional. 1H (400 MHz, CDCb) 55,50-5,43 (m, 1H), 5,31-5,26 (m, 2H), 4,33 (dd, 2H,J= 12,0, 4,0), 4,16 (dd, 2H,J= 12,0, 8,0), 2,80-2,71 ( m, 1H), 2,41-1,89 (m, 13H), 1,64-1,58 (m, 4H), 1,53-1,48 (m, 2H), 1,38-1,26 (m, 44H), 1,19-1,10 (m, 4H), 0,97 (t, 3H,J= 6,0), 0,89 (t, 6H,J= 6,0), 0,68-0,62 (m, 4H), 0,59-0,54 (m, 2H), -0,33 (q, 2H,J= 4,0 ). RT = 3,98 min. 74,8% de pureza.
El compuesto 32 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de 5. La síntesis de 32 se realizó usando bis(8-(2-octilciclopropil)octanoato de (Z)-3-(2-(3-hidroxi-2-(pent-2-en-1 -il) ciclopentil)acetoxi)propan-1,2-diilo (1,7 g, 2,021 mmol) en MeOH seco (20 mL) y THF seco (5 mL) y borohidruro de sodio (0,306 g, 8,08 mmoles). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) Isolera™ usando EtOAc al 12% en éter de petróleo para dar 32 (1,01 g, 1,170 mmol, rendimiento del 57,9 %) como un aceite amarillo. 1H (400 MHz, CDCh) 55,53-5,36 (m, 2H), 5,29-5,24 (m, 1H), 4,31 (dt, 2H,J= 12,0, 4,0), 4,23-4,20 (m, 1H), 4,15 (dd, 2H,J= 12,0, 4,0), 3,91 (q, 1H,J= 4,0), 2,62-2,53 (m, 1H), 2,38-2,28 (m, 5H), 2,23-1,82 (m, 8H), 1,67-1,60 (m, 4H), 1,51-1,45 (m, 2H), 1,38-1,28 (m, 44H), 1,19-1,10 (m, 4H), 0,98 (t, 3H,J= 8,0), 0,89 (t, 6H,J= 6,0), 0,68-0,62 (m, 4H), 0,59-0,54 (m, 2H), -0,33 (q, 2H,J= 4,0). RT = 3,72 min. 97,7% de pureza. ESI-EM: m/z = 866 [M+Na]+ para C53Hs4O7Na.
PNI 515:
PNI 515 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de PNI 132. La síntesis de PNI 515 se realizó usando el clorhidrato del ácido 4-(dimetilamino)butanoico (0,139 g, 0,830 mmol) en DCM seco (10 mL), DMAP ( 0,101 g, 0,830 mmol), clorhidrato de EDCI (0,239 g, 1,245 mmol) y 32 (0,35 g, 0,415 mmol) en DCM seco (5 mL). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) Isolera™ usando MeOH al 5 % en DCM para producir PNI 515 (0,35 g, 0,365 mmol, rendimiento del 88 %) como un aceite de color amarillo pálido.
1H (400 MHz, CDCh) 55,48-5,26 (m, 3H), 4,87-4,83 (m, 1H), 4,33-4,27 (m, 2H), 4,15 (dd, 2H,J= 12,0, 4,0), 2,64-2,57 (m, 1H), 2,36-1,78 (m, 23H), 1,74-1,50 (m, 8H), 1,42-1,26 (m, 44H), 1,20-1,08 (m, 4H), 0,98-0,93 (m, 3H), 0,89 (t aparente, 6H,J= 6,0), 0,68-0,61 (m, 4H), 0,59-0,54 (m, 2H), -0,34 (q, 2H,J= 4,0). RT = 2,64 min. 99,9% de pureza. ESI-EM: m/z = 957 [M+H]+ paraC59H106NOs.
PNI 551:
PNI 551 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de PNI 132. La síntesis de PNI 551 se realizó usando el clorhidrato del ácido 3-(dimetilamino)propanoico (0,191 g, 1,245 mmol) en DCM seco (10 mL), DMAP ( 0,152 g, 1,245 mmol), clorhidrato de EDCI (0,318 g, 1,660 mmol) y 32 (0,35 g, 0,415 mmol) en DCM seco (5 mL). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) Isolera™ usando MeOH al 4 % en DCM para producir PNI 551 (0,37 g, 0,392 mmol, rendimiento del 94 %) como un aceite de color amarillo pálido.
1H (400 MHz, CDCh) 55,48-5,27 (m, 3H), 4,89-4,82 (m, 1H), 4,32-4,28 (m, 2H), 4,15 (dd, 2H,J= 12,0, 4,0), 2,74-2,57 (m, 3H), 2,54-2,43 (m, 2H), 2,37-2,24 (m, 10H), 2,20-1,89 (m, 9H), 1,75-1,62 (m, 6H), 1,38-1,26 (m, 44H), 1,19-1,07 ( m, 4H), 0,98-0,93 (m, 3H), 0,89 (t aparente, 6H,J= 6,0), 0,69-0,61 (m, 4H), 0,59-0,54 (m, 2H), -0,33 (q, 2H,J= 4,0). RT = 2,68 min. 99,8% de pureza. ESI-EM: m/z = 943 [M+<h>]+ para C58H104NO8.
Ejemplo 9
Síntesis del PNI 269
Esquema 15. Síntesis de PNI 269
Compuesto 33: El compuesto 33 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de 30. La síntesis de 33 se realizó usando el ácido linoleico (2,0 g, 7,13 mmol) en DCM seco (10 mL), DMAP (1,305 g, 10,70 mmol ), clorhidrato de EDCI (2,043 g, 10,70 mmol) y 3-(aliloxi)propan-1,2-diol (1, 0,377 g, 2,85 mmol) en DCM seco (10 mL). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) (Isolera™) usando EtOAc al 5% en éter de petróleo para dar 33 (1,2 g, 1,826 mmol, rendimiento del 25,6 %) como un aceite incoloro. 1H (400 MHz, CDCb) 55,92-5,82 (m, 1H), 5,42-5,29 (m, 9H), 5,26-5,18 (m, 2H), 4,35 (dd, 1H,J= 12,0, 4,0), 4,18 (dd, 1H,J= 12,0, 8,0), 4,05-3,96 (m, 2H), 3,57 (d, 2H,J= 8,0), 2,78 (t, 4H,J= 6,0), 2,32 (q aparente, 4H,J= 8,0), 2,06 ( q, 8H,J= 8,0), 1,66-1,58 (m, 4H), 1,40-1,25 (m, 28H), 0,90 (t, 6H,J= 6,0). RT = 2,63 min. 97,4% de pureza. ESI-EM: m/z = 679 [M+Na]+ para C42H72OsNa.
Compuesto 34: El compuesto 34 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis del compuesto 3. La síntesis de 34 se realizó usando TFA (4 mL), Pd(PPh3)4 (1,055 g, 0,913 mmol) y 33 (4,0 g, 6,09 mmol) en EtOH seco (40 mL). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) Isolera™ usando EtOAc al 5% en éter de petróleo para dar 34 (1,8 g, 2,92 mmol, rendimiento del 47,9 %) como un aceite amarillo. 1H (400 MHz, CDCla) 55,42-5,29 (m, 9H), 4,33-4,08 (m, 4H), 2,77 (t, 4H,J= 6,0), 2,37-2,27 (m, 4H), 2,05 (q, 8H,J= 6,0), 1,65-1,59 (m, 4H), 1,38-1,24 (m, 28H), 0,89 (t, 6H,J= 6,0). RT = 2,20 min. 76,1% de pureza. ESI-EM: m/z = 617 [M+H]+ para C39H69O5.
Compuesto 35: (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-bis(octadeca-9,12-dienoato) de 3-(2-(3-oxo-2-((Z)-pent-2-en-1-il)ciclopentil)acetoxi)propan-1,2-diilo se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis del 2-(3-oxo-2-((Z)-pent-2-en-1-il)ciclopentil)acetato de 2,3-bis(((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)oxi)propilo. La síntesis de esta cetona se realizó usando 34 (0,8 g, 1,297 mmol) en DCM (20 mL), DMAP (0,237 g, 1,945 mmol), 4 (0,300 g, 1,426 mmol) en DCM (20 mL) y clorhidrato de EDCI (0,371 g, 1,945 mmol). El producto crudo se obtuvo como un aceite de color naranja pálido. Esta cetona cruda se usó para la siguiente etapa sin purificación adicional. RT = 2,67 min. 58,2%<de pureza. e>S<i>-EM:<m/z = 832 [M+Na]+ para C51H84O7Na.>
El compuesto 35 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de 5. La síntesis de 35 se realizó usando (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-bis(octadeca-9,12-dienoato) de 3-(2-(3-oxo-2-((Z)-pent-2-en-1-il) ciclopentil)acetoxi)propan-1,2-diilo (0,8 g, 0,989 mmol) en 15 mL de MeOH seco:THF (2:1) y borohidruro de sodio (0,128 g, 3,46 mmol). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) Isolera™ utilizando EtOAc al 10% en éter de petróleo como eluyente para proporcionar 35 (0,31 g, 0,382 mmol, rendimiento del 38,7 %) como un aceite espeso incoloro. 1H (400 MHz, CDCb) 55,52-5,24 (m, 11H), 4,33-4,28 (m, 2H), 4,22 (br s, 1H), 4,17 4,12 (m, 2H), 3,93-3,89 (m, 1H), 2,77 (t, 4H,J= 6,0), 2,62-2,53 (m, 1H), 2,34-2,29 (m, 5H), 2,23-1,84 (m, 16H), 1,67 1,60 (m, 6H), 1,40-1,24 (m, 28H), 0,98 (t, 3H,J= 8,0), 0,89 (t, 6H,J= 6,0). RT = 2,62 min. 82,8% de pureza. ESI-EM: m/z = 834 [M+Na]+ para C51Hs6O7Na.
PNI 269:
PNI 269 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de PNI 132. La síntesis de PNI 269 se realizó usando el clorhidrato del ácido 4-(dimetilamino)butanoico (0,073 g, 0,435 mmol) en DCM seco (20 mL), DMAP ( 0,023 g, 0,185 mmol), clorhidrato de EDCI (0,141 g, 0,740 mmol) y 35 (0,3 g, 0,370 mmol) en DCM seco (5 mL). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) Isolera™ usando MeOH al 5 % en DCM como eluyente para producir PNI 269 (0,17 g, 0,147 mmol, rendimiento del 39,8 %) como un aceite espeso incoloro. 1H (400 MHz, CDCls) 55,46-5,18 (m, 11H), 4,86-4,83 (m, 1H), 4,32-4,28 (m, 2H), 4,15 (dd, 2H,J= 12,0, 8,0), 2,77 (t, 4H,J= 6,0), 2,63-2,52 (m, 3H), 2,45-2,25 (m, 13H), 2,20-1,86 (m, 16H), 1,73-1,51 (m, 8H), 1,37-1,26 (m, 28H), 0,97- 0,93 (m, 3H), 0,91-0,87 (m, 6H). RT = 2,88 min. 88,5% de pureza. ESI-EM: m/z = 925 [M+H]+ para C57H98NO8.
Ejemplo 10
Síntesis del PNI 148
Compuesto 37: Se sintetizó 2-(3-oxociclopentil)acetato de 2,3-bis(((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)oxi)propilo usando un método similar al usado para síntesis del 2-(3-oxo-2-((Z)-pent-2-en-1-il)ciclopentil)acetato de 2,3-bis(((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)oxi)propilo. La síntesis de esta cetona se realizó usando 3 (0,33 g, 0,560 mmol) en DCM seco (5 mL), DMAP (0,034 g, 0,280 mmol), 36 (0,119 g, 0,840 mmol) en DCM (20 mL) y clorhidrato de EDCI (0,215 g, 1,121 mmol). El producto crudo (0,43 g, 0,482 mmol, rendimiento del 86 %) se obtuvo como un líquido naranja pálido, que se tomó como tal para la siguiente etapa sin purificación adicional. 1H (400 MHz, CDCb) 55,42-5,30 (m, 8H), 4,29 (dt, 1H,J= 12,0, 4,0), 4,16-4,09 (m, 1H), 3,63 (p, 1H,J= 4,0), 3,55 (t, 2H,J= 8,0), 3,50-3,42 (m, 4H), 2,78 (t, 4H,J= 6,0), 2,67-2,15 (m, 7H), 2,08-2,03 (m, 8H), 1,90 (dd, 1H,J= 16,0.8,0), 1,65-1,52 (m, 5H), 1,40-1,25 (m, 32H), 0,89 (t, 6H,J= 6,0). RT = 2,77 min. 80,0% de pureza. ESI-EM: m/z = 712 [M+H]+ para C46H81O5.
El compuesto 37 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de 5. La síntesis de 37 se realizó usando 2-(3-oxociclopentil)acetato de 2,3-bis(((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)oxi)propilo (0,41 g, 0,575 mmol) en 25 mL de MeOH seco:THF (2:1) y borohidruro de sodio (0,076 g, 2,012 mmol). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) Isolera™ utilizando EtOAc al 10% en éter de petróleo como eluyente para dar 37 (0,34 g, 0,361 mmol, 62,8 % de rendimiento) como un aceite espeso incoloro. 1H (400 MHz, CDCls) 55,41-5,30 (m, 8H), 4,39-4,32 (m, 2H), 4,26-4,22 (m, 1H), 4,10 (dd, 1H,J= 12,0, 4,0), 3,62 (p, 1H,J= 4,0), 3,55 (t, 2H,J= 8,0), 3,49-3,42 (m, 4H), 2,78 (t, 4H,J= 6,0), 2,63-2,15 (m, 4H), 2,08-2,03 (m, 8H), 1,90-1,65 (m, 3H), 1,59-1,47 (m, 6H), 1,38-1,26 (m, 32H), 0,90 (t, 6H,J= 6,0). RT = 2,79 min. 97,2% de pureza. ESI-EM: m/z = 738 [M+Na]+ para C46H82OsNa.
PNI 148:
PNI 148 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de PNI 132. La síntesis de PNI 148 se realizó usando el clorhidrato del ácido 4-(dimetilamino)butanoico (0,147 g, 0,876 mmol) en DCM seco (30 mL), DMAP ( 0,109 g, 0,895 mmol), clorhidrato de EDCI (0,300 g, 1,566 mmol) y 36 (0,320 g, 0,447 mmol) en DCM seco (5 mL). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) IsoleraTM usando MeOH al 5 % en DCM como eluyente para producir PNI 148 (0,16 g, 0,191 mmol, rendimiento del 42,7 %) como un aceite espeso incoloro. 1H (400 MHz, CDCls) 55,42-5,30 (m, 8H), 5,20-5,13 (m, 1H), 4,24 (dt, 1H,J= 12,0, 4,0), 4,12-4,07 (m 1H), 3,61 (p, 1H,J= 4,0), 3,55 (t, 2H,J= 6,0), 3,48-3,42 (m, 4H), 2,77 (t, 4H,J= 6,0), 2,54-2,25 (m, 12H), 2,12-1,76 (m, 15H), 1,55 (p, 4H,J= 8,0), 1,43-1,20 (m, 34H), 0,89 (t, 6H,J= 6,0). RT = 3,03 min. 98,8% de pureza. ESI-EM: m/z = 829 [M+H]+ para C52H94NO6.
Ejemplo 11
Síntesis del PNI 147
Se sintetizó 2-(2-metil-3-oxociclopentil)acetato de 2,3-bis(((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)oxi)propilo utilizando un método similar al utilizado para la síntesis del 2-(3-oxo-2-((Z)-pent-2-en-1-il)ciclopentil)acetato de 2,3-B/s(((9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)oxi)propilo. La síntesis de esta cetona se realizó utilizando 3 (0,4 g, 0,679 mmol) en DCM seco (5 mL), DMAP (0,114 g, 0,883 mmol), 38 (0,138 g, 0,883 mmol) en DCM seco (25 mL) y clorhidrato de EDCI (0,389 g, 2,037 mmol). El producto crudo, 2-(3-hidroxi-2-metilciclopentil)acetato de 2,3-B/s(((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)oxi)propilo (0,56 g, 0,770 mmol, rendimiento del 113 %) se obtuvo como un aceite amarillo pálido, que se usó para siguiente etapa sin purificación. 1H (400 MHz, CDCls) 55,40-5,30 (m, 8H), 4,29 (dd, 1H,J= 12,0, 4,0), 4,15-4,10 (m, 1H), 3,63 (p, 1H,J= 4,0), 3,55 (t, 2H,J= 8,0), 3,51-3,42 (m, 4H), 2,77 (t, 4H,J= 6,0), 2,67 (dd, 1H,J= 16,0, 4,0), 2,42-2,10 (m, 6H), 2,08-2,02 (m, 8H), 1,85-1,73 (m, 1H), 1,59-1,50 (m, 4H), 1,39-1,24 (m, 32H), 1,09 (d, 3H,J= 8,0), 0,89 (t, 6H,J= 8,0). RT = 2,78 min. 96,5% de pureza. E<s>I-MS: m/z = 749 [M+Na]+ para C47Hs2O5Na.
Compuesto 39 se sintetizó utilizando un método similar al utilizado para la síntesis de 5. La síntesis de 39 se realizó utilizando 2-(2-metil-3-oxociclopentil)acetato de 2,3-B/s(((9z,12z)-octadeca-9,12-dien-1-il)oxi)propilo (0,55 g, 0,756 mmol) en MeOH seco:THF (25 mL, 4:1) y borohidruro de sodio (0,100 g, 2,65 mmol). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100 - 200 mesh) (Isolera™) usando EtOAc al 10% en éter de petróleo para dar 39 (0,33 g, 0,453 mmol, rendimiento 59,8 %) como un aceite espeso incoloro. 1H (400 MHz, CDCh) 5 1H (400 MHz, CDCh) 55,42-5,30 (m, 8H), 4,24 (dd, 1H,J= 12,0, 4,0), 4,14-4,05 (m, 1H), 3,75 (q, 1H,J= 8,0), 3,62 (p, 1H,J =4,0), 3,55 (t, 2H,J= 8,0), 3,49-3,42 (m, 4H), 2,78 (t, 4H,J= 6,0), 2,54 (dd, 1H,J= 16,0, 6,0), 2,28 (dd, 1H,J= 12,0, 8,0), 2,20-1,80 (m, 13H), 1,64-1,52 (m, 5H), 1,40-1,24 (m, 32H), 1,04 (d, 3H,J= 8,0), 0,90 (t, 6H,J= 6,0). RT = 2,80 min. 96,6% de pureza. ESI-MS: m/z = 751 [M+Na]+ para C47Hs4O5Na.
PNI 147:
PNI 147 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de PNI 132. La síntesis de PNI 147 se realizó usando el clorhidrato del ácido 4-(dimetilamino)butanoico (0,090 g, 0,535 mmol) en DCM seco (25 mL), DMAP ( 0,065 g, 0,535 mmol), clorhidrato de EDCI (0,276 g, 1,440 mmol) y 39 (0,3 g, 0,411 mmol) en DCM seco (5 mL). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) (Isolera™) usando MeOH al 5 % en DCM para producir PNI 147 (0,21 g, 0,249 mmol, rendimiento del 60,6 %) como un aceite amarillo. 1H (400 MHz, CDCh) 55,42-5,30 (m, 8H), 4,71 (q, 1H,J= 4,0), 4,24 (dd, 1H,J= 12,0, 4,0), 4,13-4,05 (m, 1H), 3,62 (p, 1H,J= 4,0), 3,55 (t, 2H,J= 8,0), 3,49-3,42 (m, 4H), 2,78 (t, 4H,J= 6,0), 2,53 (dd, 1H,J= 12,0, 4,0), 2,48-2,40 (m, 2H), 2,36 (s, 6H), 2,27 (dd, 1H,J= 12,0, 8,0), 2,05 (q, 8H,J= 6,0), 2,00-1,80 (m, 7H), 1,67-1,52 (m, 7H), 1,42-1,26 (m, 32H), 1,03 (d, 3H,J= 8,0), 0,89 (t, 6H,J= 6,0). RT = 3,03 min. 95,6% de pureza. ESI-EM: m/z = 865 [M+Na]+ para C53H95NO6Na.
Ejemplo 12
Síntesis de PNI 584, 585 y 586.
Compuesto 40:
A una suspensión agitada de virutas de Mg recién activadas (0,528 g, 21,71 mmol) en THF seco (10 mL), se le añadió 1.2- dibromoetano (0,136 g, 0,724 mmol) y se agitó durante 5 minutos a 25°C en atmósfera de nitrógeno. Se añadió una solución de 9 (5,0 g, 14,48 mmol) en THF seco (15 mL) y la mezcla de reacción se sometió a reflujo durante 1 h. La finalización de la reacción se confirmó mediante análisis por TLC. La mezcla de reacción se enfrió a 20°C y se añadió una solución de 19 (2,73 g, 14,48 mmol) en THF seco (15 mL). La mezcla de reacción se agitó a 25°C durante 3 h y el progreso de la reacción se controló mediante TLC. La mezcla se enfrió a 0°C y el exceso de reactivo se inactivó con una solución acuosa saturada de NH4Cl (50 mL) con agitación lenta. La fase acuosa se extrajo con EtOAc (2 x 75 mL) y las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (2 x 50 mL), se secaron sobre Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron. El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100 -200 mesh) (Isolera™) usando EtOAc al 5% en éter de petróleo para dar 40 (1,0 g, 1,583 mmol, 10,94%de rendimiento) como un aceite amarillo. 1H (400 MHz, CDCla) 53,93-3,63 (m, 3H), 1,94-1,52 (m, 4H), 1,43-1,28 (m, 26H), 1,20-1,07 (m, 2H), 0,93-0,87 (m, 12H), 0,69-0,61 (m, 2H), 0,59-0,54 (m, 1H), 0,05 (s, 6H), -0,33 (q, 1H,J= 4,0). RT = 2,22 min.
72,7% de pureza. ESI-EM: m/z = 455 [M+H]+ para C2sH59O2Si.
El compuesto 41 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de 22. La síntesis de 41 se realizó usando 21 (0,846 g, 3,30 mmol) en DCM seco (25 mL), DMAP (0,425 g, 3,30 mmol), clorhidrato de EDCI (1,475 g, 7,69 mmol) y 40 (1,0 g, 2,199 mmol) en DCM seco (5 mL). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100 - 200 mesh) (Isolera™) usando EtOAc al 5% en éter de petróleo para dar 41 (0,75 g, 0,603 mmol, 27,4 % de rendimiento) como un aceite de color amarillo pálido y se tomó como tal para la siguiente etapa sin purificación adicional. 1H (400 MHz, CDCla) 55,16-5,13 (m, 1H), 3,75-3,62 (m, 2H), 2,36-2,27 (m, 1H), 1,90-1,74 (m, 2H), 1,65-1,51 (m, 6H), 1,45-1,11 (m, 48H), 0,92-0,84 (m, 18H), 0,68-0,62 (m, 2H), 0,59-0,54 (m, 1H), 0,05 (s, 6H),<-0,33 (q, 1H, J = 4,0). RT = 6,01 min. 55,8% de pureza. e>S|-EM:<m/z = 694 [M+H]+ para C44H89O3Si.>
El compuesto 42 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de 23. La síntesis de 42 se realizó usando TBAF (1,515 mL, 1,515 mmol, solución 1 M en THF) y 41 (0,7 g, 1,010 mmol) en THF seco (20 mL). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) usando EtOAc al 10 % en éter de petróleo para dar 42 (0,32 g, 0,421 mmol, rendimiento del 41,7 %) como un aceite de color amarillo claro. 1H (400 MHz, CDCb) 55,06-4,99 (m, 1H), 3,67-3,61 (m, 1H), 3,57-3,49 (m, 1H), 2,39-2,32 (m, 3H), 1,93-1,43 (m, 6H), 1,39 1,10 (m, 48H), 0,92-0,87 (m, 9H), 0,68-0,62 (m, 2H), 0,59-0,54 (m, 1H), -0,33 (q, 1H,J= 4,0). RT = 3,18 min. 76,2%<de pureza. e>S|-EM:<m/z = 601,5 [M+Na]+ para Ca8H74OaNa.>
Compuesto 43:
2-hexildecanoato de (Z)-11-(2-octilciclopropil)-1-(2-(3-oxo-2-(pent-2-en-1-il)ciclopentil)acetoxi)undecan-3-ilo se sintetizó usando el método similar al utilizado para la síntesis del 2-(3-oxo-2-((z)-pent-2-en-1-il)ciclopentil)acetato de 2.3- bis(((9z,12z)-octadeca-9,12-dien-1-il)oxi)propilo. La síntesis de esta cetona se realizó usando 4 (0,142 g, 0,674 mmol) en DCM seco (15 mL), DMAP (0,083 g, 0,674 mmol), clorhidrato de EDCI (0,346 g, 1,813 mmol) y 42 (0,3 g, 0,518 mmol) en DCM seco (5 mL). El crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (/100-200 mesh) (Isolera™) usando EtOAc al 10% en éter de petróleo para dar el producto (0,15 g, 0,193 mmol, rendimiento del 37,2 %) como un aceite incoloro. 1H (400 MHz, CDCl3) 55,49-5,43 (m, 1 H), 5,30-5,23 (m, 1H), 5,02-4,96 (m, 1H), 4,19 4,01 (m, 2H), 2,73-2,67 (m, 1H), 2,40-1,86 (m, 12H), 1,63-1,49 (m, 8H), 1,46-1,12 (m, 48H), 0,96 (t, 3H,J= 8,0), 0,90 0,86 (m, 9H), 0,69-0,62 (m, 2H), 0,59-0,54 (m, 1H), -0,34 (q, 1H,J= 4,0). RT = 3,88 min. 99,8% de pureza. ESI-EM: m/z = 793,6 [M+Na]+ para C50H90O5Na.
El compuesto 43 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de 5. La síntesis de 43 se realizó usando 2-hexildecanoato de (Z)-11-(2-octilciclopropil)-1-(2-(3-oxo-2-(pent-2-en-1-il)ciclopentil)acetoxi)undecan-3-ilo (0,15 g, 0,194 mmol) en 10 mL de MeOH seco y 4 mL de T<h>F seco y borohidruro de sodio (0,026 g, 0,681 mmol). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) (Isolera™) usando EtOAc al 15% en éter de petróleo para proporcionar 43 (0,09 g, 0,114 mmol, rendimiento del 58,7 %) como un aceite incoloro viscoso. 1H (400 MHz, CDCh) 55,52-5,36 (m, 2H), 5,01-4,97 (m, 1H), 4,23-3,89 (m, 4H), 2,58-2,50 (m, 1H), 2,32-1,82 (m, 12H), 1,64-1,55 (m, 8H), 1,51-1,06 (m, 48H), 0,98 (t, 3H,J= 8,0), 0,90-0,83 (m, 9H), 0,69-0,61 (m, 2H), 0,59-0,54 (m, 1H), -0,34 (q, 1H,J= 4,0). RT = 4,17 min. 98,3% de pureza. ESI-EM: m/z = 795,6 [M+Na]+ para C50H92O5Na.
PNI 584:
PNI 584 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de PNI 132. La síntesis de PNI 584 se realizó usando el clorhidrato del ácido 4-(dimetilamino)butanoico (0,194 g, 1,156 mmol) en DCM seco (10 mL), 43 ( 0,36 g, 0,462 mmol) en DCM (5 mL), D<m>A<p>(0,141 g, 1,156 mmol) y clorhidrato de E<d>C<i>(0,310 g, 1,618 mmol). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) usando MeOH al 5 % en DCM para dar PNI 584 (0,371 g, 0,419 mmol, rendimiento del 91 %) como un aceite de color amarillo pálido.
PNI 585:
PNI 585 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de PNI 132. La síntesis de PNI 585 se realizó usando el clorhidrato del ácido 1,4-dimetilpiperidina-4-carboxílico (0,189 g, 0,977 mmol) en DCM seco (10 mL), 43 (0,38 g, 0,489 mmol) en DCM seco (5 mL), DMAP (0,119 g, 0,977 mmol) y clorhidrato de EDCI (0,281 g, 1,466 mmol). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) (Isolera™) usando MeOH al 4 % en DCM para producir PNI 585 (0,385 g, 0,422 mmol, rendimiento del 86 %) como un aceite de color amarillo claro.
PNI 586:
PNI 586 se sintetizó usando un método similar al usado para la síntesis de PNI 132. La síntesis de PNI 586 se realizó usando el clorhidrato del ácido 1-metilpiperidina-4-carboxílico (0,176 g, 0,977 mmol) en DCM seco (10 mL), 43 (0,38 g, 0,489 mmol) en DCM seco (5 mL), DMAP (0,119 g, 0,977 mmol) y clorhidrato de EDCI (0,281 g, 1,466 mmol). El producto crudo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (100-200 mesh) (Isolera™) usando MeOH al 5 % en DCM para producir PNI 586 (0,345 g, 0,384 mmol, rendimiento del 79 %) como un aceite de color amarillo claro.
Ejemplo 13
Esquemas para la síntesis de compuestos representativos.
Aislam iento de células T primarias de sangre total humana y expansión
A menos que se indique lo contrario, todos los reactivos se adquirieron en STEMCELL Technologies, Vancouver, Canadá.
La IL-2 humana liofilizada se reconstituyó a una concentración de 0,1 mg/mL en 1X PBS estéril sin calcio ni magnesio en una cabina de seguridad biológica. Añadir 50 |jL de esta IL-2 humana a 50 mL del medio de expansión de células T ImmunoCult-XF™ generó el medio para las células T. Se colocaron entre 7 y 30 mL de sangre periférica completa humana con anticoagulante ACD-A en un tubo cónico de polipropileno estéril de 50 mL en una cabina de seguridad biológica.
Protocolo de selección negativa. Se extrajo sangre de donantes humanos sanos y se combinó con ACD-A, un anticoagulante. Un kit de selección negativa de células pan T, un kit de aislamiento directo de células T humanas EasySep™ se utilizó para aislar células T CD4+ y CD8+. Las células se mantuvieron en el medio ImmunoCult-XF™ T Cell Exp Médium suplementado con IL2 recombinante humana (Peprotech). El día del aislamiento, las células se activaron con un triple activador, ImmunoCult™ Human CD3/CD28/CD2 T Cell Activator.
Protocolo de selección positiva. Se extrajo sangre de donantes humanos sanos y se combinó con ACD-A, un anticoagulante. Se preparó una suspensión de PBMC usando centrifugación en gradiente de densidad mediante el uso de Lymphoprep™. Después se seleccionaron positivamente las células T de la suspensión de PBMC utilizando el kit EasySep™ Human CD3 Pos Selection Kit II. Las células se mantuvieron en el medio ImmunoCult-XF™ T Cell Exp Medium suplementado con IL2 recombinante humana (Peprotech). El día del aislamiento, las células se activaron con un triple activador, ImmunoCult™ Human CD3/CD28/CD2 T Cell Activator.
Las células T se aislaron de la sangre utilizando un kit EasySep™ Direct Human T Cell Isolation Kit. Primero 50 pL/mL de Cocktail™ de aislamiento y después 50 pL/mL de EasySep™ RapidSpheres™ se añadieron al tubo de sangre. La sangre se mezcló suavemente y se incubó a temperatura ambiente (RT) durante 5 minutos. El tubo se colocó en un aparato EasySep™ 50 Magnet™ y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. La suspensión celular enriquecida se pipeteó en un nuevo tubo de polipropileno estéril de 50 mL y se repitió el proceso de RapidSpheres™.
Esta suspensión celular doblemente enriquecida se pipeteó en un nuevo tubo cónico de polipropileno estéril de 50 mL y se centrifugó durante 10 minutos a 300 g a temperatura ambiente.
Se eliminó el sobrenadante y el sedimento celular se resuspendió en 10 mL de PBS y se volvió a centrifugar a 300 g durante 10 minutos para lavar cualquier sobrenadante residual de las células. Se eliminó nuevamente el sobrenadante y las células se resuspendieron en medio de células T completo precalentado. Se extrajo una muestra y se realizó una prueba de exclusión de viabilidad celular con azul tripán (Thermo Fisher).
Ejemplo 15
Activación/expansión de células T.
Los antecedentes científicos para la activación de las células T se pueden encontrar en la publicación de 2003 de Trickett A. et al.6 La suspensión celular del Ejemplo 8 se diluyó en medio de células T completo (ThermoFisher) a 1E6 células/mL y las células T se activaron añadiendo 25 pL de ImmunoCult™ Human CD3/CD28/CD2 triple T Cell Activator™ o InmunoCulto™ Human CD3/CD28 dual T Cell Activator™ por mL de medio de células T. El crecimiento celular se controló mediante un recuento celular diario con aumento. Las células se diluyeron con medio de células T completo para mantener concentraciones de aproximadamente 1E6 células/mL. Aproximadamente el día 5, 6 o 7, las células T entraron en la fase logarítmica de crecimiento y se produjo una rápida expansión.
Para confirmar que las células T estaban en fase logarítmica, se evaluó la expresión de CD25 y debía ser superior al 80 % mediante citometría de flujo (BD Biosciences) y se controló la expansión de las células graficando el número total de células T a lo largo del tiempo.
El procesamiento y análisis posteriores de las células T tratadas se realizaron con citometría de flujo y ELISA. Los reactivos fueron de Stemcell Technologies, Vancouver, Canadá, a menos que se indique lo contrario. Las células T se aislaron de un único donante. A las 48 h después de la exposición al mRNA mediada por LNP, las células T tratadas se recolectaron transfiriendo las suspensiones celulares a tubos de 1,5 mL preetiquetados y se centrifugaron a 300 xG a 4 grados C durante 10 minutos. Se eliminó el sobrenadante y el sedimento se resuspendió en PBS. Se añadió una cantidad de 0,5uL de BD Horizon™ Fixable Viability Stain 575V™ (BD Biosciences) y la mezcla se incubó en la oscuridad durante 10 minutos a temperatura ambiente. Este tinte se une a las aminas intracelulares de una membrana celular plasmática permeable de una célula necrótica y puede usarse para diferenciar una célula viable y una célula no viable durante un ensayo de citometría de flujo.
Las células se centrifugaron nuevamente como antes, después se lavaron dos veces con 1 mL de tampón de tinción (BSA, BD Pharminigen) y el sedimento lavado se colocó en 100 pL de BSA. Se añadieron los siguientes anticuerpos a cada tubo de células tratadas en volúmenes de 2 pL: CD25, CD8, CD4, (PerCP-Cy™ 5.5 CD25 antihumano de ratón, clon RPA-T8 de CD8 antihumano de ratón BV786 y clon SK3 de CD4 anti-humana de Ratón APC-Cy™7, todo de BD Pharmingen™) con la excepción de los controles: en la muestra única de eGFP y en el control de viabilidad, no se añadió ningún anticuerpo. En los tubos de compensación de tinción única, sólo se añadió un anticuerpo por tubo.
Los tubos se incubaron a 4 grados C durante 30 minutos, tras lo cual se añadieron 400 pL de tampón de tinción (BSA) y las células se centrifugaron nuevamente. Las células se lavaron una vez con 1 mL de tampón de tinción y se centrifugaron nuevamente. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 1 mL de tampón de tinción y se añadieron a tubos de flujo preetiquetados con tapas de filtro celular (Corning Falcon).
Después de la transfección, se utilizó citometría de flujo para generar niveles de expresión de eGFP o EPO, así como valores de MFI para los estudios.
Crioconservación: si las células se crioconservaban para su uso posterior, se extraía sangre de donantes humanos sanos y se combinaba con ACD-A, un anticoagulante. Se utilizó un kit de selección negativa de células pan T, el kit de aislamiento de células T humanas EasySep Direct, para aislar células T CD4+ y CD8+. Las células se crioconservaron utilizando CryoStor® CS10 y se almacenaron en nitrógeno líquido. En el momento de la descongelación, las células se mantuvieron en medio ImmunoCult-XF™ T Cell Exp Medium suplementado con IL2 recombinante humana (Peprotech). El día del descongelamiento, las células se activaron con un triple activador, ImmunoCult™ Human CD3/CD28/CD2 T Cell Activator.
Ejemplo 16
Mezcla microfluídica de ácidos nucleicos terapéuticos (NAT) en nanopartículas lipídicas (LNP)
Se utilizó una N/P 8 o 10 para todos los experimentos a menos que se indique lo contrario. Las soluciones de composición de mezcla de lípidos (lípidos ionizables/lípidos estructurales/colesterol/agente estabilizante) se prepararon en etanol combinando cantidades prescritas de lípidos (véase Tabla 3) de reservas de lípidos individuales en etanol. Para el NanoAssamblr® SPARK™, se utilizó una concentración de solución de mezcla de lípidos de 37,5 mM, y para el NanoAssemblr® Benchtop o Ignite™, normalmente se utilizó una solución de mezcla de lípidos de 12,5 o 25 mM.
Tabla 3. Composiciones de mezclas de lípidos para su uso con el IL de la invención
IL = lípido ionizable; Tween80 = Polisorbato 80; BRIJ™ L4 = Polioxietilen (4) lauril éter; BRIJ™ S10 = polioxietilen (10) estearil éter; BRIJ™ S20= polioxietilen (20) estearil éter; BRIJ™ S35= polioxietilen (23) lauril éter; TPGS 1000 = succinato de polietilenglicol 1000 de D-a-tocoferol; Lípido H =Tween 20/Polisorbato 80/Tridecil-D-maltósido en proporciones iguales; Agente estabilizante = cualquier agente estabilizante, incluyendo PEG-DMG o según se define en la Descripciónsuprabajo esa categoría.
Los componentes de las mezclas de lípidos incluyen lípidos ionizables, lípidos estructurales, colesterol y agentes estabilizantes. Se pueden utilizar tampones de pH bajo (3-6). Para los aminolípidos ionizables, el pH del tampón suele estar por debajo del pKa del lípido.
La preparación de siRNA, RNA mensajero o NAT plasmídico se describe a continuación. Los atributos de partículas observados generalmente tenían un tamaño de 50 a 200 nm para el mRNA, dependiendo de la composición de los lípidos.
Las partículas de lípidos también se prepararon mediante un instrumento mezclador de microfluidos más grande, el NanoAssemblr® Ignite™ para las pruebas. Brevemente, se diluyeron 350 pL de mRNA usando tampón de acetato de sodio 100 mM hasta la concentración requerida de 0,2 a 0,3 mg/mL. Después se prepararon muestras de partículas lipídicas haciendo funcionar ambos fluidos, a saber, ácidos nucleicos en disolvente acuoso y mezcla de lípidos en etanol con una relación de flujo de 3:1 y un caudal total de 12 mL/min en el mezclador de microfluidos. Después de mezclar en el dispositivo de microfluidos, la muestra de partículas de ácido nucleico lipídico posterior al cartucho se diluyó en tubos libres de RNAsa que contenían de tres a 40 volúmenes de solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4. Finalmente se eliminó el etanol mediante diálisis en PBS, pH 7, o usando filtros de centrífuga Amicon™ (Millipore, USA) a 3000 RPM, o utilizando sistemas TFF. Una vez que se alcanzó la concentración requerida, las partículas de ácido nucleico lipídico se esterilizaron por filtración utilizando filtros de 0,2 pm en condiciones asépticas. La eficiencia de encapsulación final se midió mediante el ensayo Ribogreen™. Quant-iT™ RiboGreen® RNA Reagent and kit (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Reactivos de ácido nucleico
El RNA mensajero o ácido nucleico plasmídico terapéutico (NAT), como se describe a continuación, se diluyó usando tampón de acetato de sodio hasta la concentración requerida. Después se prepararon muestras de partículas de ácido nucleico lipídico (LNAP) ejecutando ambos fluidos utilizando el instrumento NanoAssemblr® Spark. Brevemente, se mezclaron 10-20 pg de ácidos nucleicos en tampón de acetato de sodio 100 mM en un volumen total de 32 pL con 16 pL de solución de mezcla de lípidos 37,5 mM según lo requerido por las proporciones N/P (4, 6 o 10 en los ejemplos ilustrados). Las partículas de ácido nucleico lipídico (LNAP) mezcladas mediante microfluidos fabricadas en el instrumento se diluyeron inmediatamente con 48 pL de 1X PBS libre de Ca++ y Mg++ a pH 7,4 en el pocillo de salida acuosa. Estos LNAp se recogieron inmediatamente en tubos de microcentrífuga que contenían 96 pL del mismo tampón a pH 7,4. La eficiencia de encapsulación se midió mediante un ensayo Ribogreen™ modificado (kit de ensayo de RNA Quanti-iT RiboGreen™, Fisher). Esta información se utilizó para establecer la dosis deseada.
Los reactivos del modelo de ácido nucleico terapéutico utilizados en los siguientes experimentos se describen a continuación. Trilink Cleancap® eGFP mRNA: Cat. L-7601 (Trilink Biotechnologies, San Diego, CA); Trilink Cleancap® EPO mRNA: Cat. L-7209 (Trilink); Milipore Sigma TagRFP Simplicon RNA Kit: Cat. SCR712 (contiene tanto TagRFp RNA como B18R RNA) (MiNipore Sigma Canadá, Oakville Ontario); el plásmido CD19 CAR con un indicador EGFP se adquirió de Creative Biolabs (Shirley, NY) y contiene un casete Car del gen indicador (Mut)-péptido señal-scFv-CD8 bisagra transmembrana-4-1 BB-CD3zeta-T2A-eGFP del promotor T7 (2353 pb) dentro del pcDNA. El tamaño total de esta plantilla de DNA del plásmido CD19 CAR es de aproximadamente 7649-7661 pb.
Se sintetizó un transcripto de RNA mensajero (mRNA) de CAR no modificado que codifica el casete del gen informador CD19 scFv -h (BB±-eGFP) mediante la transcripción in vitro con bases de tipo nativo y se protegió (Cap 1) usando la metodología CleanCap® AG de Trilink Biotechnologies Inc. Este transcrito de mRNA de CAR no modificado se poliadeniló enzimáticamente seguido de un tratamiento con DNasa y fosfatasa. El producto final del transcrito de mRNA se purificó con membrana de sílice y se envasó en una solución de tampón de citrato de sodio 1 mM (pH 6,4) a una concentración de 1 mg/mL. Este vector plasmídico CD19 CAR personalizado y el mRNA que codifica CD19 CAR se adquirieron de Creative Biolab y Trilink Biotechnologies Inc, respectivamente.
El antígeno OVA tiene utilidad en la investigación de vacunas, ya que se ha utilizado como antígeno modelo para estimular las respuestas inmunitariasg. (Por lo general, el antígeno OVA se utiliza con un agente sensibilizante tal como el alumbre, pero cuando el antígeno OVA se administra en forma de mRNA, la hipótesis es que los agentes sensibilizantes tal como el alumbre no son necesarios y el propio mRNA es capaz de producir la respuesta al antígeno por las células inmunes. CleanCap® OVA mRNA L-7610 y CleanCap® OVA mRNA (5moU) L-7210, ambos de TriLink Biotechnologies, se utilizaron en estos estudios.
Ejemplo 17
Caracterización y encapsulación de partículas de ácidos nucleicos lipídicos o "LNP"
Después de que las partículas de lípidos se prepararon como se describe en el Ejemplo 17, el tamaño de partícula (diámetro hidrodinámico de las partículas) se determinó mediante dispersión dinámica de luz (DLS) usando un ZetaSizer™ NanoZS™ (Malvern Instruments, Reino Unido). Como fuente de luz se utilizó un láser He/Ne de longitud de onda de 633 nm. Los datos se midieron a partir de los datos de intensidad dispersa realizados en el modo de detección de retrodispersión (ángulo de medición = 173). Las mediciones fueron un promedio de 10 ejecuciones de dos ciclos cada una por muestra. El tamaño promedio Z se reportó como el tamaño de partícula y se define como el diámetro de partícula promedio de intensidad armónica. Estas características de LNP, así como los resultados de la eficiencia de encapsulación del mRNA para varias mezclas de lípidos también se describen en la solicitud y se muestran en las Tablas 4, 5 y 6. Hubo una buena encapsulación en todas las formulaciones, con polidispersidad (PDI) inferior a 0,3.
Tabla 4. Tamaño, PDI y eficiencia de encapsulación de LNPs codificadas con eGFP que comprenden varios lípidos ionizables sintetizados fabricados usando la plataforma NanoAssemblr®. Se utilizó CT10 con una composición N/P 8.
Tabla 5.Tamaño, PDI y eficiencia de encapsulación de LNPs codificadas con EPO de 5 moU que comprenden varios lípidos ionizables sintetizados fabricados usando la plataforma NanoAssemblr®. Se utilizó IL:DSPC:colesterol:DMG-PEG (50:10:38,5:1,5) con una relación N/P de 6.
Tabla 6.Tamaño, PDI y eficiencia de encapsulación de LNPs codificados por OVA que comprenden varios lípidos ionizables sintetizados fabricados utilizando la plataforma NanoAssemblr®. Se utilizó LM02 con una relación N/P de 8.
Ejemplo 18
Procesamiento y análisis posterior de células T tratadas con citometría de flujo.
Se tomaron tres aislamientos de células T de un único donante y se dividieron en tres grupos: células Pan T (todas las células T), células T CD4+ solas, células T CD8+ solas. 48 horas después de la exposición al mRNA de partículas lipídicas, las células T tratadas se recolectaron transfiriendo las suspensiones celulares a tubos de 1,5 mL preetiquetados y se centrifugaron a 300 x g a 4 grados Celsius durante 10 minutos. Se eliminó el sobrenadante y el sedimento se resuspendió en PBS. Se añadió una cantidad de 0,5ul de BD Horizon™ Fixable Viability Stain 575V™ (BD Biosciences) y la mezcla se incubó en la oscuridad durante 10 minutos a temperatura ambiente. Este tinte se une a las aminas.
Las células se centrifugaron nuevamente como antes, después se lavaron dos veces con 1 mL de tampón de tinción (BSA, BD Pharminigen) y el sedimento lavado se colocó en 100 pl de BSA. Se añadieron los siguientes anticuerpos a cada tubo de células tratadas en volúmenes de 2 pl: CD25, CD8, CD4, (CD25 anti-Humano de ratón PerCP-Cy™ 5.5, Clon RPA-T8 de CD8 Anti-Humano de ratón BV786, clon SK3 de CD4 Anti-Humano de ratón APC-Cy™7, todo de BD Pharmingen™) con la excepción de los controles: en la muestra de sólo GFP y en el control de viabilidad, no se añadió ningún anticuerpo, mientras que en los tubos de compensación de tinción única, solo se añadió un anticuerpo por tubo.
Los tubos se incubaron a 4 grados C durante 30 minutos, tras lo cual se añadieron 400 pL de tampón de tinción (BSA) y las células se centrifugaron nuevamente. Las células se lavaron una vez con 1 mL de tampón de tinción y se centrifugaron nuevamente. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 1 mL de tampón de tinción y se añadieron a tubos de flujo preetiquetados con tapas de filtro celular (Corning Falcon).
Protocolo de selección negativa. Los reactivos son de Stemcell Technologies, Vancouver, Canadá, a menos que se indique lo contrario. Se extrajo sangre de donantes humanos sanos y se combinó con ACD-A, un anticoagulante. Se utilizó un kit de selección negativa de células pan T, el kit de aislamiento de células T humanas EasySep™ Direct para aislar células T CD4+ y CD8+. Las células se mantuvieron en un medio ImmunoCult-XF™ T Cell Exp Medium suplementado con IL2 recombinante humana (Peprotech). El día del aislamiento, las células se activaron con un triple activador, ImmunoCult™ Human CD3/CD28/CD2 T Cell Activator.
Congelación y descongelación de células T humanas. Los reactivos son de Stemcell Technologies, Vancouver, Canadá, a menos que se indique lo contrario. Se extrajo sangre de donantes humanos sanos y se combinó con ACD-A, un anticoagulante. Se utilizó un kit de selección negativa de células T, el kit de aislamiento de células T humanas EasySep Direct, para aislar células T CD4+ y CD8+. Las células se crioconservaron utilizando CryoStor® CS10 (StemCell Technologies) y se almacenaron en nitrógeno líquido. En el momento de la descongelación, las células se mantuvieron en un medio ImmunoCult-XF™ T Cell Exp Medium suplementado con IL2 recombinante humana (Peprotech). El día del descongelamiento, las células se activaron con un triple activador, ImmunoCult™ Human CD3/CD28/CD2 T Cell Activator.
Protocolo de selección positiva. Se extrajo sangre de donantes humanos sanos y se combinó con ACD-A, un anticoagulante. Se preparó una suspensión de PBMC usando centrifugación en gradiente de densidad mediante el uso del reactivo Lymphoprep™. Después se seleccionaron positivamente las células T de la suspensión de PBMC utilizando el kit EasySep™ Human CD3 Pos Selection Kit II. Las células se mantuvieron en un medio ImmunoCult-XF™ T Cell Exp Medium suplementado con IL2 recombinante humana (Peprotech). El día del aislamiento, las células se activaron con un triple activador, ImmunoCult™ Human CD3/CD28/CD2.
Después de la transfección, se utilizó citometría de flujo para determinar los niveles generales de expresión de GFP, así como los valores de MFI para los estudios.
Ejemplo 19
Datos comparativos que muestran actividad con LNPs de mRNA de GFP en células T humanas primarias
Se compararon los lípidos ionizables de la invención y MC3 en una composición de CT10 en una relación N/P de 10 para su capacidad para inducir la transfección medida por MFI de mRNA marcado en células T (medida por citometría de flujo).
Las células T se prepararon y trataron como se describió anteriormente utilizando el protocolo de selección negativa y de triple activación.
Para exponer las células T aisladas y activadas (día 0) al mRNA formulado, se añadieron 2 ug de CleanCap™ EGFP (Trilink Biotechnologies, San Diego, CA), LNP que contenía mRNA a 500000 células T en 1 mL de medio de células T completo, con 1 ug/mL de ApoE4 humana recombinante ("ApoE") (Peprotech Inc., Montreal, Canadá). ).
La dosis de mRNA-LNP se calculó basándose en los resultados del ensayo de Ribogreen™. Las células T se contaron mediante exclusión con azul tripán (Sigma) y se diluyeron a 500000 células/mL. Brevemente, en una placa de 12 pocillos, se repartieron alícuotas de 1 mL en cada pocillo. Se añadió ApoE hasta una concentración final de 1 ug/mL en cada pocillo. Según la calibración, se añadió la cantidad requerida de mRNA-LNP (días 3 a 7) y la placa se incubó durante 48 horas.
Se evaluó el efecto sobre la eficiencia de transfección del mRNA LNP preparado con diferentes lípidos ionizables: DODMA, MC3 y PNI101, en composición CT10 (véase Tabla 3) en una relación N/P de 10. Las células se trataron con LNP 7 días después de la activación. Los resultados se muestran en la Figura 1. Se descubrió que ID101 tiene una mayor eficiencia de transfección que DODMA o MC3.
En un experimento relacionado utilizando la misma composición y proporción de NP, se analizó la expresión génica mediante citometría de flujo 48 h después del tratamiento en células T de diferentes donantes, y los resultados se muestran en la Figura 2. Se encontró que la eficiencia de transfección de los LNPs que contenían ID101 era mayor que los que contenían MC3 en seis donantes analizados. No se muestra la viabilidad celular para el mismo experimento, pero no se vio afectada por el tratamiento con ID101 en comparación con las células no tratadas (control).
Se ensayaron una variedad más amplia de lípidos ionizables según la invención en células T vivas a una dosis de 500 ng, utilizando MC3 como control. Se utilizó la composición CT 10. Se analizó el porcentaje positivo para GFP de células T vivas, así como el MFI de GFP. Los resultados se muestran en las dos tablas de la Figura 3. Varios de los nuevos lípidos ionizables fueron sustancialmente tan buenos o mejores que el MC3 en la transfección de células Tin vitro,particularmente ID 132 e ID 565 en la medición más cuantitativa de la intensidad de fluorescencia media (MFI).
Ejemplo 20
La crioconservación previa no tiene ningún efecto
Se investigó la expresión de GFP en células T humanas primarias aisladas sometidas a congelación y descongelación. Se analizaron mRNA-LNPs que contenían MC3, lípido 132 de PNI, lípido 516 de PNI, lípido 545 de PNI o lípido 565 de PNI, en una composición de CT10 a N/P 8. Las células T se aislaron de sangre completa usando el procedimiento de aislamiento negativo y se crioconservaron en nitrógeno líquido. Antes de la adición de LNPs, estas células T se descongelaron y se dejaron reposar en un medio ImmunoCult™ T Cell Expansion Media durante 24 horas de activación como se describe en otra parte. La eficiencia de la transfección, la viabilidad y el MFI de GFP se midieron mediante citometría de flujo 48 horas después de la adición de LNP. Las células T se trataron 4 días después de la activación con 500 ng de mRNA encapsulado por 125000 células. Los resultados del estudio se muestran en la Figura 4, que muestra que los cuatro lípidos ionizables probados funcionaron mejor que MC3 en la expresión total de GFP (MFI) y, en general, por igual en la eficiencia de la transfección y en la toxicidadin vitro(viabilidad).
Ejemplo 21
Administración y expresión de mRNA de eritropoyetina
Se utilizó el ensayo de tipo sándwich de doble-anticuerpo ELISA de Quantikine® IVD Human Epo para demostrar la administración y la actividad del mRNA de hEPOin vitro.Los reactivos se adquirieron de Quantikine, Minneapolis, MN.
El ensayo se realizó según las instrucciones del protocolo de inmunoensayo de Eritropoyetina humana ELISA de Quantikine® IVD® en el prospecto. Brevemente; se aislaron células T humanas primarias a partir de sangre entera fresca utilizando un protocolo de selección negativa y se activaron utilizando un activador triple. Siete días después de la activación, a las células T se les dosificaron mRNA-LNPs que codifican EPO a razón de 2 pg de mRNA por 500000 células y N/P 10. Después de 48 h de exposición, las células T se recogieron y se lisaron para determinar la EPO citosólica y se tomaron muestras del sobrenadante del medio para determinar la EPO secretada. Se utilizaron controles de Quantikine® Human Serum. Los resultados se muestran en la Figura 5 en mUI/mL. Los sueros de control muestran EPO mínima o nula, las células T tratadas con LNP de mRNA de EPO MC3 muestran aproximadamente 545 mUI/mL de EPO secretada y ninguna EPO citosólica, y las células T tratadas con LNP de mRNA de EPO PNI 101 muestran aproximadamente 1016 mUI/mL de EPO secretada y ninguna EPO citosólica.
La Tabla 7 a continuación incluye los datos cuantitativos para MC3 y PNI 101 para la concentración de EPO a las 48 horas en células T humanas primarias, así como el aumento de veces en la concentración de EPO en relación con LNP con PNI 101 versus LNP con MC3. Se encontró que la expresión de EPO mediada por LNPs que contenían PNI 101 era mayor que la de aquellas que contenían MC3.
Ejemplo 22
Suministro in vivo de LNP de mRNA codificado por EPO por vía intravenosa
Se usaron nanopartículas lipídicas con la composición IL/DSPC/colesterol/PEG-DMG2000 (LM 02 - véase Tabla 3) para encapsular mRNA codificado por eritropoyetina humana (EPO) recombinante con modificaciones de 5 moU [TriLink CleanCap® 5 moU EPO mRNA L7201 ]. Para crear la LNP, se mezcló microfluídicamente una mezcla de lípidos en etanol con una solución tamponada con pH bajo de un mezclador de mRNA de EPO de 5 moU en una proporción N/P de 6 usando un mezclador de microfluidos NanoAssemblr® Ignite™. Las partículas mezcladas microfluídicamente se procesaron posteriormente utilizando técnica de filtración Amicon® ultra 15 con unidades MWCO de 10 kDa (EMD Millipore). Después, las partículas lipídicas cargadas con RNA se caracterizaron por su tamaño, PDI y eficiencia de encapsulación (EE). El tamaño y el PDI se midieron usando técnicas de dispersión dinámica de luz descritas anteriormente, y la eficiencia de encapsulación de ácido nucleico se calculó usando un ensayo de RNA Quant-iT RiboGreen como se describió anteriormente, modificado para usar mRNA de hEPO como estándar en lugar del RNA estándar en el kit. El diámetro hidrodinámico de estas mRNA-LNPs fue de ~70 nm con un PDI en el intervalo de 0,02 a 0,1 y una eficiencia de encapsulación de ~ 97,8 %.
Los animales fueron manipulados según los protocolos de ética del Institutional Animal Care and Use Committee. Para los experimentos, se adquirieron ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad en Envigo (South Kent, WA, USA). Para la actividadin vivo,se trataron ratones hembra C57BL/6 por vía intravenosa con LNPs de mRNA de EPO en dosis específicas de 0,5-3 mg/Kg. Se recogieron muestras de sangre de 50 -75 ul 6 h después de la administración a través de la vena safena y a intervalos de tiempo regulares de 24 h o 48 h.
Después de la recolección, la sangre se preparó inmediatamente para producir muestras de suero usando técnicas estándar y se almacenaron a -80 grados C. Brevemente, después de la recolección, se dejó que la sangre coagulara a temperatura ambiente durante 15 a 30 minutos. El coágulo se eliminó centrifugando los tubos a 1000-2000 x g durante 10 minutos a 4 grados Celsius. El sobrenadante transparente de color amarillo dorado se eliminó cuidadosamente y se transfirió a tubos de polipropileno transparente estériles con tapa de rosca en hielo. Después se almacenó el suero, si era necesario, a -80°C hasta el análisis.
Las muestras se descongelaron y después se analizaron en diluciones apropiadas para determinar la expresión de la proteína EPO y los niveles de citocinas/quimiocinas. Los niveles séricos totales de EPO se evaluaron utilizando el kit Quantikine® IVD EPO ELISA kit (Bio-Techne, Minneapolis, MN, USA).
Después de la administración i.v de una dosis de 0,5 mg/Kg de LNPs de mRNA codificados por EPO humana recombinante que contiene los lípidos ionizables MC3, PNI 121 o PNI 123 usando la composición LM02 en N/P de 6, se examinaron los niveles de expresión de EPO a las 6 h (superior, Figura 6) y a las 24 h (inferior, Figura 6) en ratones C56BL/6; La proteína hEPO se midió usando el protocolo de inmunoensayo de eritropoyetina humana ELISA Quantikine® DIV® .
En la Figura 7 se muestran los resultados para muchos de los mismos parámetros, excepto en dosis de 1 y 3 mg/Kg de LNPs de mRNA codificados por EPO humana recombinante. Los diferentes puntos en el gráfico representan diferentes ratones. En estas pruebas, LNP de PNI 123 funcionaron muy bien frente a LNP de MC3 para el suministro de hEPO y la expresión hEPOin vivo.
Se probó un número más amplio de lípidos ionizables en condiciones similares. Se suministraron LNPs de mRNA codificados por H-EPO que contienen varios lípidos ionizables novedosos por vía intravenosa a ratones, a una dosis de 0,5 mg/Kg. En este estudio, varios de los lípidos ionizables de la invención dieron como resultado un mayor nivel de expresión de rhEPO en suero en comparación con el control de PBS, y estaban a la par con MC3, especialmente ID 516. Estos resultados se muestran en la Figura 8.
Ejemplo 23
Expresión de CAR
La expresión de CAR de CD19 en células T humanas primarias aisladas mediadas por LNPs de mRNA que contienen IL con la composición CT10 en N/P 8 se analizó después de la exposiciónin vitro.El vector pcDNA3.1 anti-CD19 - h (BB Lambda) -EGFP-2nd-CAR (T7 Mut) de CAR 7661 bp se adquirió de Creative BioLabs, NY, USA.
Las células T se aislaron de sangre completa usando un procedimiento de aislamiento negativo y activación de células T, y la expansión se llevó a cabo mediante activación triple en un medio ImmunoCult™ Human T Cell Expansion Media como se describe anteriormente.Como se ve en la Figura 9, la expresión de CAR de CD19 fue mayor que la de LNP de MC3 para LNP de PNI 565 en células T transfectadasin vitro.
Ejemplo 24
Administración de LNP de mRNA codificado por OVA in vivo mediante administración intramuscular
Se utilizaron nanopartículas lipídicas para encapsular CleanCap® OVA WT mRNA [TriLink L7610] o CleanCap® OVA 5-moU mRNA [TriLink L7210] codificado por el antígeno OVA para demostrar la utilidad de la vacuna. Se mezcló una mezcla de lípidos de composición LM02b en etanol con una solución tamponada de pH bajo de mRNA de Ova en una relación N/P de 8 usando un mezclador de microfluidos NanoAssemblr® Ignite™. Las LNP se procesaron posteriormente utilizando una técnica de ultrafiltración Amicon™ y se caracterizaron por tamaño, PDI y eficiencia de encapsulación. El tamaño y el PDI se midieron utilizando técnicas de dispersión dinámica de luz y la eficiencia de encapsulación de ácido nucleico se calculó a partir del ensayo de RNA Quant-iT RiboGreen™ modificado. El diámetro hidrodinámico de estas LNPs de mRNA fue de ~76 nm con un índice de polidispersidad de 0,01 a 0,12 y una eficiencia de encapsulación de ~95%.
Todos los animales fueron manipulados según los protocolos de ética del Institutional Animal Care and Use Committee. Para los experimentos, se adquirieron ratones C57BL/6 de 6 a 8 semanas de edad (n = 4) en Envigo. El día 1 y el día 10, los ratones se inmunizaron por vía intramuscular con 50 uL de diversas LNPs de Ova. Cada ratón se vacunó con una dosis de 5 ug de mRNA de OVA encapsulado en LNPs los días 1 y 10. Se utilizó una dosis de 50 ug de antígeno de OVA como control positivo. En intervalos de tiempo definidos, se recogieron entre 110 y 130 pL de sangre mediante la técnica de sangrado safeno y se procesaron hasta obtener suero. Dos semanas después de la segunda inmunización, los animales fueron sacrificados y se extrajo sangre mediante punción cardíaca. Las muestras de sangre se procesaron inmediatamente en suero (como se describió anteriormente) y se almacenaron a -80 grados C. Se descongelaron y analizaron alícuotas de muestras de suero en diluciones apropiadas para la expresión de Ova y para mediciones de IgG usando técnicas ELISA estándar.
ELISA de OVA de muestras de suero: Se recogieron sueros de ratón a las 6 h después de la vacunación mediante sangrado de safena. El antígeno de OVA se midió utilizando ELISA de tipo sándwich estándar utilizando componentes del kit Ovalbumin (OVA)-ELISA Kit abx150365 (Abbexa Biologics, Inc., Arlingtom, TX, USA) y según las recomendaciones del fabricante. Brevemente, a una microplaca Abrexxa™ de 96 pocillos recubierta previamente con anticuerpos se añadieron a los pocillos, los estándares, los sueros adecuadamente diluidos y el reactivo conjugado con biotina y se incubaron durante 1 h. Se añadió reactivo conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) y se incubó durante 20 minutos. Se añadió solución de parada a cada pocillo y se midió la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de placas, a partir del cual se calculó la concentración de OVA (no se muestran los resultados).
ELISA de anti-OVA-IgG de muestras de suero: Se recogieron sueros de los ratones inmunizados 2 semanas después de la segunda inmunización. OVA - la producción específica de IgG en respuesta al mRNA codificado por OVA en diversas LNPs se midió mediante ELISA como se describe anteriormente. Brevemente, se recubrieron placas de ELISA de 96 pocillos con proteína OVA a una concentración de 2 pg de proteína por pocillo en tampón de bicarbonato de sodio 100 mM (pH 9,6) a 4 grados C durante la noche. Después, las placas pre-recubiertas se bloquearon con FBS al 10% (BSA) en PBS-Tween-20™ tamponado 7,4 (0,05%) v/v y se incubaron a 37 grados C durante 2 h. Las muestras de suero y los estándares de inmunoglobulina se diluyeron adecuadamente (de 1:8 a 1:1000) en BSA-PBS al 1 % y se añadieron a la placa de 96 pocillos y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente. Se usó IgG anti-ratón de cabra conjugada con (HRP) (# 7076, señalización celular) a una dilución de 1:5000 en PBS-Tween-10% de FBS para el etiquetado y se incubó durante 1 h. Después del período de incubación, se añadió sustrato de peroxidasa de rábano picante (3,3',5,5'-tetrametilbenciuro - "TMB"). Después de 30 minutos de incubación, se añadió una solución de parada de ácido sulfúrico 2 N y se utilizó un lector de placas para determinar la absorbancia a 450 nm. Los resultados de las pruebas con PNI 123 y PNI 132 se muestran en la Figura 10, en comparación con el control negativo de PBS y el control positivo con 50 ug de proteína OVA. Una dosis de 5 ug de mRNA codificado por OVA fue capaz de generar la misma o mayor respuesta de IgG que la de una dosis 10 veces mayor de proteína OVA, lo que demuestra la eficacia de los lípidos ionizables de la invención para aplicaciones de vacunas.
Ejemplo 25
Determinación del pKa experimental de lípidos ionizables formulados
El pKa de cada lípido catiónico se determinó en nanopartículas lipídicas mediante un ensayo basado en la fluorescencia de la sal sódica del ácido 6-(p-Toluidin)-2-naftalenosulfónico (TNS, Sigma Aldrich), que es una sonda fluorescente para el estado conformacional de las proteínas. Las nanopartículas lipídicas vacías que comprenden lípido catiónico/DSPC/colesterol/PEG-lípido (50/10/38,5/1,5) en agua destilada a una concentración de lípidos totales de 3,125 mM se formulan utilizando NanoAssemblr® Spark™, y después se caracterizaron por su calidad de LNP en el Zetasizer™ utilizando una dilución 30X con 1X PBS en la cubeta de bajo volumen. Las nanopartículas lipídicas se diluyeron aún más 4 X usando agua destilada hasta obtener 0,781 mM de lípido total. Se preparó TNS como una solución madre 25 pM en agua destilada. Después se mezclaron 6,4 pL de muestras de LNP diluidas de lípidos totales 0,781 mM con 10 pL de TNS diluido hasta un volumen final de 250 pL con tampón que contenía HEPES 10 mM, MES 10 mM, NH4OAc 10 mM y NaCl 130 mM donde el pH varió de 3 a 9 en incrementos de pH de 0,5. Cada pocillo tenía una concentración final de 20 pM de lípidos totales, 1 pM de TNS y 233,4 pL de solución tampón (para completar un volumen total de 250 pL).
Las muestras se mezclaron completamente y la intensidad de la fluorescencia se midió a temperatura ambiente en un BioTek™ Sinergy™ H1 Hybrid Multi-Mode Monochromator™ Fluorescence Microplate Reader que utiliza longitudes de onda de excitación y emisión de 321 nm y 445 nm respectivamente. Se aplicó un análisis de mejor ajuste sigmoideo a los datos de fluorescencia utilizando el software GraphPad Prism™, y el pKa se midió como el pH a la mitad de la intensidad de fluorescencia máxima. Los resultados se muestran en la Figura 11.
Ejemplo 26
pka medidos de lípidos ionizables
Se investigó el efecto sobre la expresión transgénica después de la transfección de LNP ejercida por el pKa superficial en la LNP resultante de diferentes lípidos ionizables. Se encontró que los lípidos con valores de pKa más bajos eran inactivos en la expresión transgénica en células T. Se encontró que los lípidos con valores elevados de pKa eran tóxicos para las células T. Se encontró que los lípidos en el intervalo de pKa de 5,5 a 6,9 eran activos para promover la expresión transgénica en las células T. Los resultados de las mediciones experimentales de pKa y la expresión cualitativa de proteínas se encuentran en la Tabla 8. El número de símbolos de asterisco indica los niveles de expresión de proteínas interpretados por los inventores a partir de datos cuantitativos.
Tabla 8. Mediciones de pKa, EPO y GFP
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Claims (14)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de fórmula (I):
    en donde: L1 es un enlace directo o alquileno de C1-C5; Ei se selecciona de -O-, -OC(O)O-, -OC(O)-51, -OC(O)N(Q)-5\ -OC(O)S-51, -N(Q)C(O)-51, -N(Q)C(O)O-51, -C(O)O-51, y -C(O)N(Q)-51; Q es H o alquilo de C1-C5; 51 representa el enlace unido al grupo R1; R1 se selecciona de
    y en donde: R4 y R5 se selecciona cada uno independientemente del grupo que consiste en alquilo de C1-C6, alquenilo de C2-C6 y alquinilo de C2-C6; alternativamente R4 y R5 pueden unirse para formar un anillo heterocíclico de 4 a 6 miembros que contiene oxígeno (O) o hasta 2 nitrógenos (N), opcionalmente sustituido con 1 o 2 sustituyentes cada uno seleccionado independientemente de un alquilo de C1-C6, ciclopropilo, OH y un grupo alcoxi de C1-C3; R6 se selecciona de alquilo de C1-C6, alquenilo de C2-C6, alquinilo de C2-C6, cicloalquilo de C3-C6 y un grupo 2-hidroxietilo; R7 se selecciona de H, un grupo alquilo de C1-C6, alquenilo de C2-C6 y alquinilo de C2-C6; a y c' son independientemente 1,2, 3, 4 o 5; b, c y e son independientemente 0,1 o 2; d es 1 o 2; R2 se selecciona de H, alquilo de C1-C12, alquenilo de C2-C12, alquinilo de C2-C12, y
    L2 es un enlace directo o 52-(CR8R8')k-53 en donde R8 y R8' son cada uno independientemente H, alquilo de C1-C12, alquenilo de C2-C12 o alquinilo de C2-C12; 52 representa el enlace unido al grupo E2, y 53 representa el enlace unido al esqueleto de ciclopentilo descrito en la fórmula (I); k es 1,2, 3, 4 o 5; E2 se selecciona de -O-, -OC(O)O-, -OC(O)-54, -OC(O)N(Q)-54, -N(Q)C(O)-54,-N(Q)C(O)O-54, -C(O)N(Q)-54 o -C(O)O-54; Q es H o alquilo de C1-C5; donde 54 representa el enlace unido al grupo R3; R3 se selecciona de alquilo de C8-C20, alquenilo de C8-C20, alquinilo de C8-C20,
    en donde: f es 0 o 1; g es 1 o 2; g' es 1,2, 3, 4 o 5; h es 0, 1,2, 3 o 4; R9 es una cadena de C6-C20 que tiene la fórmula -(CH2)i-[L4-(CH2)]j-R12, en donde: L4 se selecciona de
    i es un número entero en el intervalo 6-20; j es 0, 1,2 o 3; R12 se selecciona de H y alquilo de C4-C8; R9' se selecciona de H, alquilo de C4-C10, alquenilo de C4-C10 y alquinilo de C4-C10; R10 y R10' se selecciona cada uno, independientemente de alquilo de C4-C10, alquenilo de C4-C10 y alquinilo de C4-C10; L3 es -OC(O)-55, -O-55, o un enlace directo; 55 representa el enlace unido a R10 y R10'; y R11 = R9, o tiene la fórmula:
  2. 2. Un compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de fórmula (I):
    en donde: L1 es un enlace directo o alquileno de C1-C5; E1 se selecciona de -OC(O)O-, -OC(O)-51, -OC(O)N(Q)-51, -OC(O)S-51; Q es H o alquilo de C1-C5; 51 representa el enlace unido al grupo R1; R1 se selecciona de:
    en donde: R4 y R5 se seleccionan cada uno, independientemente de alquilo de C1-C6, alquenilo de C2-C6 y alquinilo de C2-C6; alternativamente R4 y R5 pueden unirse para formar un anillo heterocíclico de 5 a 6 miembros que contiene hasta 2 nitrógenos (N), opcionalmente sustituido con 1 a 2 sustituyentes, cada uno seleccionado independientemente de un alquilo de C1-C6 y un grupo ciclopropilo; R6 se selecciona de un grupo alquilo de C1-C6 y cicloalquilo de C3-C6; R7 se selecciona de H y un grupo alquilo de C1-C6; a es 1, 2 o 3; b y c son independientemente 0,1 o 2; c' es 2, 3 o 4; d es 1 o 2; e es 0 o 1; R2 se selecciona de H, alquilo de C1-C5, alquenilo de C2-C5, alquinilo de C2-C5, y
    L2 es un enlace directo o 52-(CR8R8')k-53 en donde R8 y R8' son cada uno independientemente H, alquilo de C1-C12, alquenilo de C2-C12 o alquinilo de C2-C12; 52 representa el enlace unido al grupo E2 y 53 representa el enlace unido al esqueleto de ciclopentilo descrito en la fórmula (I); k es 1; E2 se selecciona de -O-, -OC(O)O-, -OC(O)-54, -OC(O)N(Q)-54, -C(O)N(Q)-54 o -C(O)O-54; Q es H o alquilo de C1-C5; donde 54 representa el enlace unido al grupo R3; R3 se selecciona de alquilo de C8-C20, alquenilo de C8-C20, alquinilo de C8-C20,
    en donde: f y h son cada uno 0; g es 1 o 2; R9 es una cadena de C6-C20 que tiene la fórmula -(CH2)i-[L4-(CH2)]j-R12, en donde: L4 se selecciona de i
    i es un número entero de 6 a 20; j es 0, 1 o 2; R12 se selecciona de H y un grupo alquilo de C4-C8; R9' se selecciona de H y alquilo de C4-C10; R10 y R10' se selecciona cada uno, independientemente de alquilo de C4-C10, alquenilo de C4-C10 y alquinilo de C4-C10; L3 es -OC(O)-55, o un enlace directo; 55 representa el enlace unido a R10 y R10'; R11 es lo mismo que R9.
  3. 3. Un compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de fórmula (II):
    en donde: L1 es un enlace directo; Ei se selecciona de -OC(O)O-, -OC(O)-51, -OC(O)N(Q)-51, -OC(O)S-51; Q es H o alquilo de C1-C5; 51 representa el enlace unido al grupo R1; R1 se selecciona de
    en donde: R4 y R5 se selecciona cada uno, independientemente de alquilo de C1-C6; alternativamente R4 y R5 pueden unirse para formar un anillo heterocíclico de 5 a 6 miembros que contiene hasta 2 nitrógenos (N), opcionalmente sustituido con 1 a 2 sustituyentes, cada uno seleccionado independientemente de un alquilo de C1-C6; R6 se selecciona de un grupo alquilo de C1-C6 y ciclopropilo; R7 se selecciona de H y un grupo alquilo de C1-C6; a es 1,2 o 3; b es 0 o 1; c es 0, 1 o 2; c' es 2, 3 o 4; d es 2; e es 1; R2 se selecciona de H, alquilo de C1-C5, alquenilo de C2-C5, y
    R3 se selecciona de:
    en donde: f y h son cada uno 0; g es 1 o 2; R9 es una cadena de C6 -C20 que tiene la fórmula -(CH2)i-[L4-(CH2)]j-R12, en donde: L4 se selecciona de
    i es un número entero en el intervalo 6-20; j es 0, 1 o 2; R12 se selecciona de H y un grupo alquilo de C4-C8; R9' se selecciona de H y un grupo alquilo de C4-C10; R10 y R10' se selecciona cada uno, independientemente de alquilo de C4-C10; L3 es un enlace directo; R13 es lo mismo que R11.
  4. 4. Un compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de fórmula (III):
    en donde: R1 se selecciona de:
    en donde: R4 y R5 se selecciona cada uno, independientemente de alquilo de C1-C6; alternativamente, R4 y R5 pueden unirse para formar un anillo heterocíclico de 5 a 6 miembros que contiene hasta 2 nitrógenos (N), opcionalmente sustituido con 1 a 2 sustituyentes, cada uno seleccionado independientemente de alquilo de C1-C6; R6 se selecciona de un grupo alquilo de C1-C6 y ciclopropilo; R7 se selecciona de H, y un grupo alquilo de C1-C6; a es 1,2 o 3; b es 0 o 1; c es 0, 1 o 2; c' es 2, 3 o 4; d es 2; e es 1; R2 se selecciona de H, alquilo de C1-C5, alquenilo de C2-C5, y
    R3 se selecciona de:
    en donde: f y h son 0; g es 1 o 2; R9 es una cadena de C6-C20 que tiene la fórmula -(CH2)i-[L4-(CH2)]j-R12, en donde: L4 se selecciona de
    i es un número entero en el intervalo 6-20; j es 0, 1 o 2; R12 se selecciona de H y un grupo alquilo de C4-C8; R9' se selecciona de H y alquilo de C4-C10; R10 y R10' se selecciona cada uno, independientemente de alquilo de C4-C10; L3 es un enlace directo; R11 es lo mismo que R9.
  5. 5. Un compuesto, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde R1 es uno de:
    y/o en donde R3 es independientemente:
    y/o en donde R2 se selecciona de:
    y/o en donde Ei se selecciona de:
    en donde 51 representa el enlace unido al grupo R1; 5r representa el enlace unido al grupo Li; y/o en donde E2 se selecciona de:
    en donde 54 representa el enlace unido al grupo R3.
  6. 6. Un compuesto seleccionado del grupo que consiste en:
    ı22
    ���
  7. 7. Una composición de mezcla de lípidos que comprende uno cualquiera de los compuestos de las reivindicaciones 1 a 6 combinados con un lípido estructural, un esteroide y un agente estabilizante, así como al menos un agente terapéutico.
  8. 8. La composición de la reivindicación 7, en donde el lípido estructural comprende uno o más lípidos estructurales seleccionados del grupo que consiste en DSPC, DSPE, DPPC, DMPC, DOPC, POPC, DOPE y SM, en particular DSPC o DOPE; y/o en donde el agente estabilizante comprende uno o más tensioactivos y lípidos conjugados con polímeros; y/o en donde la relación molar del compuesto con respecto al resto de los componentes es del 30 % en moles al 70 % en moles; y/o en donde el esterol es colesterol; y/o en donde el agente terapéutico comprende uno o más ácidos nucleicos; y/o en donde el agente terapéutico comprende uno o más polipéptidos; y/o en donde el agente terapéutico comprende tanto un ácido nucleico como un componente polipeptídico.
  9. 9. El compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el pKa experimental de las nanopartículas está en el intervalo de 5,6 a 7,1.
  10. 10. La composición de mezcla de lípidos de una cualquiera de las reivindicaciones 7-8, en donde el compuesto está presente en aproximadamente un 40% en moles - un 49% en moles, el lípido estructural está presente en aproximadamente un 11-20% en moles, el colesterol está presente en aproximadamente un 37,5% en moles y el agente estabilizante está presente en aproximadamente un 2,5 % en moles.
  11. 11. La formulación de mezcla de lípidos de una cualquiera de las reivindicaciones 7, 8 y 10, en donde el agente estabilizante se selecciona del grupo que consiste en PEG-DMG 2000, polioxietileno (10) estearil éter, estearato de polioxietileno (40), polisorbato 80, polioxietileno (4) lauril éter, polioxietileno (20) estearil éter, polioxietileno (23) lauril éter y succinato de polietilenglicol 1000 de D-a-tocoferol; y/o en donde la composición está en forma de una partícula de lípido.
  12. 12. El uso de un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para preparar un agente terapéutico para administrar un agente terapéutico a un célulaex-vivo,en donde preferiblemente el agente terapéutico comprende además un ácido nucleico terapéutico, en particular un mRNA, siRNA, miRNA, RNA guía, RNA guía sintético, un cromosoma artificial, DNA circular o linealizado, minicírculos de DNA o msDNA.
  13. 13. El uso de la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 7, 8, 10 y 11 en la preparación de una vacuna, preferiblemente para la preparación de una vacuna profiláctica, en particular dirigida a la prevención de la infección por coronavirus, o para la preparación de una vacuna terapéutica o vacuna contra el cáncer.
  14. 14. El uso de la composición de mezcla de lípidos de una cualquiera de las reivindicaciones 7-8 en la preparación de un producto farmacéutico para modular las células T humanas; Células T CAR-T, TCR, de edición de genes o alogénicas; o en la preparación de un producto farmacéutico para modular las células T, en donde las células T se aíslan de pacientes, o las células T que han sido modificadas genéticamente específicamente para células T o células T alogénicas.
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