ES2972793T3

ES2972793T3 - Células diseñadas para inducir tolerancia

Info

Publication number: ES2972793T3
Application number: ES18701425T
Authority: ES
Inventors: Ugur Sahin; Vincenzo Bronte; Stefano Ugel; Alessandra Fiore
Original assignee: Of Verona, University of; Biontech SE
Current assignee: Of Verona, University of; Biontech SE
Priority date: 2017-01-19
Filing date: 2018-01-17
Publication date: 2024-06-17
Anticipated expiration: 2038-01-17
Also published as: AU2018209163A1; JP7308750B2; JP2020508642A; AU2018209163B2; WO2018133937A1; CA3047878A1; US20210283177A1; JP2025069165A; EP3571296B1; EP4335444A2; WO2018134253A1; EP4335444A3; JP2023040034A; EP3571296A1

Abstract

La presente invención se refiere a células que están diseñadas para aumentar el nivel celular de FLICE celular [enzima convertidora β de IL-1 similar al dominio de muerte asociado a Fas (FADD)] - proteína inhibidora (CFLAR). Las células diseñadas tienen la capacidad de inducir tolerancia. La tolerogenicidad mejorada es útil para prolongar la supervivencia de un trasplante extraño y para el tratamiento de enfermedades autoinmunes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Células diseñadas para inducir tolerancia

Campo técnico

La actual enseñanza se refiere a células que están diseñadas para aumentar el nivel celular de proteína inhibidora de FLICE celular [dominio de muerte asociado a Fas (FADD) similar a enzima convertidora IL-1 p] (CFLAR). Las células diseñadas tienen la capacidad de inducir tolerancia. La tolerogenicidad mejorada es útil para prolongar la supervivencia de un trasplante extraño y para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias.

La presente invención se refiere a poblaciones de células para uso en terapia, dicha población comprende células mieloides o células progenitoras de las mismas que están diseñadas para aumentar el nivel celular de proteína inhibidora de FLICE celular [dominio de muerte asociado a Fas (FADD) similar a enzima convertidora IL-1 p] (CFLAR), a poblaciones farmacéuticas que comprenden una población de células que comprenden células mieloides o células progenitoras de las mismas que están diseñadas para aumentar el nivel celular de proteína inhibidora de FLICE celular [dominio de muerte asociado a Fas (FADD) similar a enzima convertidora IL-1p] (CFLAR) y a un ácido nucleico que codifica CFLAR, o una composición farmacéutica que comprende dicho ácido nucleico, para uso en terapia.

Antecedentes

La evolución del sistema inmunitario dio como resultado en los vertebrados una red altamente efectiva basada en dos tipos de defensa: la inmunidad innata y la adaptativa. A diferencia del antiguo sistema inmunitario innato evolutivo que se basa en receptores invariantes que reconocen patrones moleculares comunes asociados con patógenos, la inmunidad adoptiva se basa en receptores de antígenos altamente específicos en las células B (linfocitos B) y T (linfocitos T) y en la selección clonal. Mientras que las células B aumentan las respuestas inmunitarias humorales mediante la secreción de anticuerpos, las células T median las respuestas inmunitarias celulares que conducen a la destrucción de células reconocidas y cumplen una función principal en la inmunidad mediada por células en humanos y animales.

Las células T maduras reconocen y responden al antígeno a través de sus receptores específicos de antígeno (TCR) que interactúan con péptidos inmunogénicos (epítopos) unidos a moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) y presentados en la superficie de las células diana. Por ejemplo, las células T citotóxicas responden a un antígeno que se presenta asociado con proteínas MHC-I. Las células T auxiliares reconocen el antígeno presentado en las proteínas MHC-II. La consecuencia más inmediata de la activación de TCR es el inicio de vías de señalización que dan como resultado la expansión clonal de las células T, la regulación positiva de los marcadores de activación en la superficie celular, la diferenciación en células efectoras, la inducción de citotoxicidad o secreción de citocinas y la inducción de apoptosis. El TCR es parte de una compleja maquinaria de señalización, que incluye el complejo heterodimérico de las cadenas a y p del TCR, el correceptor CD4 o CD8 y el módulo de transducción de señales CD3. Mientras que las cadenas CD3 transfieren la señal de activación al interior de la célula, el heterodímero a/p del TCR es el único responsable del reconocimiento del antígeno.

Además de las funciones críticas que desempeñan las células T en la respuesta inmunitaria, las células dendríticas (CD) son igualmente importantes. Las CD son células presentadoras de antígenos profesionales que tienen un papel regulador clave en el mantenimiento de la tolerancia a los autoantígenos y en la activación de la inmunidad innata y adaptativa contra antígenos extraños.

Al producir factores solubles como citocinas, interleucinas y metabolitos, los tumores inducen una hematopoyesis alternativa que modifica la diferenciación normal de las células mieloides, impulsando la proliferación y expansión de células con funciones inmunosupresoras llamadas células supresoras derivadas de mieloides (MDSC).Ugel S et al., 2015, J Clin Invest. 125:3365-76; Marvel D et al., 2015, J Clin Invest. 125:3356-64). Las características distintivas de las MDSC son el origen mieloide, la composición celular heterogénea y la capacidad de regular negativamente la respuesta inmunitaria adaptativa e innata. La actividad funcional de MDSC está relacionada con la regulación positiva de enzimas inmunosupresoras, como la arginasa 1 (ARG1), la indoleamina 2,3-dioxigenasa 1 (IDO1), la NADPH oxidasa (NOX) y la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS, también conocida como NOS2), así como una mayor producción de óxido nítrico (NO) y especies reactivas de oxígeno y nitrógeno (ROS y RNS), como el radical libre peroxinitrito (ONOO‘) (Bronte V et al., 2005, Nat Rev Immunol. 5:641-54) eso inhibe la vitalidad y aptitud de las células T. La composición de las MDSC es flexible y peculiar para cada tipo de cáncer y a menudo cambia, siguiendo la cinética y el desarrollo de la patología: las MDSC activadas están principalmente presentes en el tumor primario y en los sitios metastásicos, pero también pueden encontrarse en la circulación, lo que sugiere que los marcadores de activación específicos de las MDSC podrían utilizarse para diferenciarlas de las otras células mieloides no supresoras. (Gabrilovich DI et al., 2012, Nat Rev Immunol. 12:253-68; De Sanctis F et al, 2016, Biochim Biophys Acta. 1865:35-48). Hasta la fecha, las MDSC humanas se han clasificado en tres subconjuntos principales: MDSC monocíticas (MO), MDSC polimorfonucleares/granulocíticas (PMN) y (i)-MDSC inmaduras. Sin embargo, las diferencias en los procedimientos de preparación de muestras y en el análisis de los datos citofluorimétricos, junto con la falta de marcadores exclusivos de MDSC, han generado muchas discrepancias entre los estudios, ralentizando la enumeración de MDSC en la rutina clínica. Por el contrario, en los últimos veinte años, la identificación de rutas moleculares y biológicas relacionadas con las MDSC y el esclarecimiento parcial de las redes celulares en el microambiente tumoral, mediante el uso de innovadores modelos de ratón tumoral, han generado un mayor interés en las MDSC y su función en la patobiología del cáncer. Recientemente, se ha informado que la heterogeneidad de MDSC de ratón entre los dos subconjuntos principales se debe a una activación diferente de las vías moleculares que regulan el complejo de señalización inductor de muerte (DISC). La generación de (MO)-MDSC monocíticas requiere constitutivamente la presencia de proteína inhibidora de FLICE celular de molécula antiapoptótica [dominio de muerte asociado a Fas (FADD) similar a enzima convertidora IL-1 p] (CFLAR, también conocida como c-FLIP)] que controla la vía apoptótica extrínseca y la activación de la caspasa 8. Por otro lado, la expansión de las (PMN)-MDSC polimorfonucleares depende del co ntrol mediado por MCL-1 de la vía de muerte mitocondrial intrínseca (Haverkamp JM et al., 2014, Immunity 41:947-59). CFLAR tiene 13 variantes de empalme diferentes, tres de las cuales se transmiten como proteínas: la forma corta de 26 kDa (c-FLIPs), la forma Raji de 24 kDa (c-FLIP<r>, expresada específicamente solo en algunas líneas celulares y células T primarias humanas) y la forma larga de 55 kDa (c-FLIP<l>). Las tres variantes de CFLAR contienen dos dominios efectores de muerte (DED) que interactúan con la proteína adaptadora apoptótica FAAD. El gen que codifica CFLAR está conservado evolutivamente en vertebrados y la estructura de c-FLIPS es similar a la proteína inhibidora FLICE viral (v-FLIP) que es componente de virus de la clase de los gammaherpesvirus, como el virus humano del herpes 8, un virus asociado al sarcoma de Kaposi (Safa AR, 2012, Exp Oncol. 34:176-84; Safa AR et al., 2008, Curr Cancer Drug Targets 8:37-46). Wu et al., Cell death & differentiation 2013, 21: 451-461 describe células THP-1 que sobreexpresan<c>-FLIP<l>, Telieps et al., European Journal of Immunology 2013, 43: 1499-1510 describe ratones transgénicos que sobreexpresan<c>-FLIP<r>en células hematopoyéticas.

El sistema inmunitario también puede producir efectos indeseables. Por ejemplo, los trastornos autoinmunitarios se caracterizan por la pérdida de tolerancia contra los autoantígenos, la activación de linfocitos reactivos contra los antígenos “propios” (autoantígenos) y el daño patológico en los órganos diana. Además, el sistema inmunitario puede provocar el rechazo de trasplantes de células, tejidos y órganos de donantes no emparentados. El sistema inmunitario no distingue los intrusos beneficiosos, como un tejido trasplantado, de aquellos que son dañinos y, por lo tanto, rechaza los tejidos u órganos trasplantados. El rechazo de órganos trasplantados generalmente está mediado por células T aloreactivas presentes en el huésped que reconocen aloantígenos o xenoantígenos del donante. Por otro lado, la enfermedad de injerto contra huésped puede ocurrir cuando se introducen, trasplantan o injertan células alogénicas inmunológicamente activas en un huésped, lo que resulta en una reacción severa, incluso fatal, debido a la incompatibilidad inmunológica entre el huésped y el injerto, donde las células inmunocompetentes del injerto atacan inmunológicamente al huésped

Por lo tanto, existe una necesidad de agentes que tengan acciones tolerogénicas o inmunosupresoras. En particular, existe una necesidad de agentes que mejoren la tolerogenicidad en un huésped.

Descripción

Resumen

La presente enseñanza describe composiciones, métodos y usos para inducir inmunosupresión y tolerancia definida por la supresión de una respuesta inmunitaria a un antígeno.

La presente invención está definida y limitada por las reivindicaciones adjuntas.

La presente invención se basa en el concepto de que aumentar el nivel celular de proteína inhibidora de FLICE celular [dominio de muerte asociado a Fas (FADD) similar a enzima convertidora IL-1 p] (CFLAR) en células, en particular células mieloides o células progenitoras del mismo, aumenta la actividad inmunosupresora de las células. Las células en las que aumenta el nivel celular de CFLAR pueden estar presentes, in vitro, es decir, las células pueden ser células aisladas, o en vivo, es decir, las células pueden estar presentes dentro de un sujeto o individuo. Por tanto, la presente enseñanza proporciona un método para potenciar el potencial tolerogénico o inmunosupresor de las células, en particular de las células mieloides o de sus células progenitoras.

Las células tolerogénicas o inmunosupresoras descritas en el presente documento son útiles para prolongar la supervivencia de un injerto extraño en un huésped mamífero y para mejorar enfermedades relacionadas con la inflamación, tales como enfermedades autoinmunitarias. Las células tolerogénicas o inmunosupresoras también son útiles para suprimir una respuesta inmunitaria en el contexto de la terapia génica de un gen deseado o de una terapia basada en proteínas exógenas. Por consiguiente, la presente invención abarca composiciones para reducir y/o eliminar una respuesta inmunitaria a un trasplante en un receptor mediante el tratamiento del receptor con una cantidad de células tolerogénicas o inmunosupresoras descritas en el presente documento para reducir o inhibir el rechazo del trasplante por parte del huésped. El trasplante se refiere a cualquier material que se va a administrar a un huésped. Por ejemplo, un trasplante incluye, pero no limitado a, una red biocompatible, un tejido, un órgano, una célula, un ácido nucleico y un polipéptido. También se incluyen composiciones para reducir y/o eliminar una respuesta inmunitaria en un huésped mediante el trasplante extraño contra el huésped, es decir, enfermedad de injerto contra huésped, mediante el tratamiento del trasplante de donante y/o del receptor del trasplante con células tolerogénicas o inmunosupresoras descritas en el presente documento con el fin de inhibir o reducir una respuesta adversa del donante trasplantado contra el receptor. Además, la presente invención abarca composiciones para reducir y/o eliminar una respuesta inmunitaria a una proteína administrada exógenamente en un receptor tratando al receptor con una cantidad de células tolerogénicas o inmunosupresoras descritas en el presente documento para reducir o inhibir el rechazo de la proteína.

Varios aspectos de la presente invención prevén la modificación genética de células, ya sea in vitro o en vivo, para expresar CFLAR o para expresar niveles aumentados de CFLAR. Se pueden utilizar diferentes formatos de vectores para la modificación genética de células, como ARN, ADN o vectores virales que se pueden aplicar ya sea in vitro o en vivo. Si las células en las que aumenta el nivel celular de CFLAR están presentes in vitro, Las estrategias pueden depender de la modificación genética de las células in vitro y transferir las células a un receptor después de una expansión opcional de las células in vitro. Las células utilizadas para el tratamiento pueden ser autólogas, alogénicas o singénicas de un receptor. Si las células en las que aumenta el nivel celular de CFLAR están presentes en vivo, Puede realizarse ingeniería genética, como por ejemplo mediante transfección con ácido nucleico de las células en el lugar en el paciente y las estrategias pueden depender de la modificación genética de las células en vivo administrando un ácido nucleico apropiado a un receptor, opcionalmente en un vehículo apropiado.

Las estrategias para inducir inmunosupresión y/o tolerancia descritas en el presente documento se pueden usar para suprimir respuestas inmunitarias anticipadas no deseadas, por ejemplo, para prolongar la terapia génica o la administración recurrente de proteínas terapéuticas, por ejemplo, expresadas en un huésped mamífero mediante un vector o aplicadas exógenamente a un huésped mamífero, para prolongar la supervivencia del injerto extraño en un huésped, para tratar o prevenir la enfermedad de injerto contra huésped, para tratar o prevenir enfermedades autoinmunitarias, incluidas, entre otras, artritis autoinmune, diabetes autoinmune, asma, shock séptico, fibrosis pulmonar, glomerulonefritis y arterosclerosis.

En un aspecto, la invención se refiere a una población de células para uso en terapia, dicha población comprende células mieloides o células progenitoras de las mismas que están diseñadas para aumentar el nivel celular de proteína inhibidora de FLICE celular [dominio de muerte asociado a Fas (FADD) similar a enzima convertidora IL-1 p] (CFLAR), en la que dicha población comprende células mieloides o células progenitoras de las mismas que comprenden un ácido nucleico recombinante que codifica CFLAR, en la que la terapia comprende tratar a un paciente que necesita inmunosupresión o en la que la terapia comprende el tratamiento de un receptor de trasplante o de enfermedad de injerto contra huésped o de una enfermedad inflamatoria o de una enfermedad inmunitaria. Por ejemplo, el nivel celular de CFLAR puede aumentar incrementando la expresión de CFLAR en las células.

En una realización, aumentar el nivel celular de CFLAR aumenta la actividad inmunosupresora de las células.

En una realización, las células mieloides o sus células progenitoras se diseñan para aumentar la expresión celular de CFLAR.

De acuerdo con la invención, las células mieloides o sus células progenitoras se transfectan con ácido nucleico que codifica CFLAR. En una realización, la expresión de CFLAR aumenta en las células transfectadas en comparación con las células no transfectadas. En una realización, la transfección es una transfección estable o transitoria. En una realización, las células mieloides o sus células progenitoras se transfectan usando vectores virales como portadores, tales como vectores lentivirales. En una realización, dicho ácido nucleico es ARN.

En una realización, el CFLAR es CFLAR<l>y/o CFLARs.

En una realización, las células mieloides o sus células progenitoras son células aisladas y/o purificadas, en particular aisladas y/o purificadas mediante clasificación celular magnética.

En una realización, las células mieloides o sus células progenitoras son monocitos. En una realización, las células mieloides o células progenitoras de las mismas son monocitos CD14+. En una realización, las células mieloides o células progenitoras de las mismas son monocitos CD14+ aislados de capas leucocitarias.

En una realización, las células mieloides o sus células progenitoras son células madre. En una realización, las células mieloides o sus células progenitoras son células CD34+ de médula ósea. En una realización, las células mieloides o células progenitoras de las mismas son células CD34+ de médula ósea aisladas de células mononucleares (MNC) de médula ósea.

En una realización, las células se han tratado para promover la adquisición de actividad inmunosupresora. En una realización, el tratamiento para promover la adquisición de actividad inmunosupresora comprende diferenciación in vitro en presencia de G-CSF y GM-CSF.

En una realización, la población de células de la invención también comprende células mieloides o células progenitoras de las mismas que no están diseñadas para aumentar el nivel celular de CFLAR. En una realización, la población de células de la invención solo comprende células mieloides o células progenitoras de las mismas que están diseñadas para aumentar el nivel celular de CFLAR. En una realización, la población de células de la invención comprende células distintas de las células mieloides o sus células progenitoras. En una realización, la población de células de la invención solo comprende células mieloides o células progenitoras de las mismas.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a la población de células descritas en el presente documento para uso en terapia. En una realización, la terapia requiere inmunosupresión.

En una realización adicional, la invención se refiere a la población de células descrita en el presente documento para tratar a un paciente que necesita inmunosupresión. En una realización, la población de células es autóloga al paciente. En un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición farmacéutica para uso en terapia, dicha composición farmacéutica comprende la población de células descrita en el presente documento, en la que la terapia comprende tratar a un paciente que necesita inmunosupresión o en la que la terapia comprende el tratamiento de un receptor de trasplante o de enfermedad de injerto contra huésped o de una enfermedad inflamatoria o de una enfermedad inmunitaria. Una composición farmacéutica de la invención puede comprender un vehículo farmacéuticamente aceptable y opcionalmente puede comprender uno o más adyuvantes, estabilizadores, etc. En un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición farmacéutica descrita en el presente documento para uso en terapia. En una realización, la terapia requiere inmunosupresión.

En una realización adicional, la invención se refiere a una composición farmacéutica descrita en el presente documento para tratar a un paciente que necesita inmunosupresión. En una realización, la población de células es autóloga al paciente.

La presente divulgación se refiere a un uso de la población de células descrita en el presente documento para la producción de un medicamento para terapia, preferiblemente la terapia requiere inmunosupresión.

La presente divulgación se refiere a un uso de la población de células descrita en el presente documento para la producción de un medicamento para tratar a un paciente que necesita inmunosupresión, preferiblemente la población de células es autóloga al paciente.

La presente divulgación se refiere a un método para tratar a un paciente que necesita inmunosupresión que comprende administrar la población de células descrita en el presente documento, preferiblemente la población de células es autóloga al paciente.

La presente divulgación se refiere a un método para tratar a un paciente que necesita inmunosupresión que comprende aumentar el nivel celular de CFLAR en células mieloides o células progenitoras de las mismas del paciente.

En una realización, aumentar el nivel celular de CFLAR en células mieloides o células progenitoras de las mismas del paciente comprende administrar un ácido nucleico que codifica CFLAR. En una realización, el ácido nucleico que codifica CFLAR transfecta células mieloides o células progenitoras de las mismas. En una realización, dicha transfección es una transfección estable o transitoria. En una realización, las células mieloides o sus células progenitoras se transfectan usando vectores virales como portadores, tales como vectores lentivirales. En una realización, dicho ácido nucleico es ARN.

En una realización, el CFLAR es CFLAR<l>y/o CFLARs.

En una realización, las células mieloides o sus células progenitoras son monocitos. En una realización, las células mieloides o sus células progenitoras son monocitos CD14+.

En una realización, las células mieloides o sus células progenitoras son células madre. En una realización, las células mieloides o sus células progenitoras son células CD34+ de médula ósea.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a un ácido nucleico que codifica CFLAR para uso en terapia. En una realización, la terapia requiere inmunosupresión.

En una realización adicional, la invención se refiere a un ácido nucleico que codifica CFLAR para tratar a un paciente que necesita inmunosupresión.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico que codifica CFLAR para uso en terapia.

En un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición farmacéutica descrita en el presente documento para uso en terapia. En una realización, la terapia requiere inmunosupresión.

En una realización adicional, la invención se refiere a una composición farmacéutica descrita en el presente documento para tratar a un paciente que necesita inmunosupresión.

La presente divulgación se refiere al uso de un ácido nucleico que codifica CFLAR para la producción de un medicamento para terapia, preferiblemente la terapia requiere inmunosupresión.

La presente divulgación se refiere al uso de un ácido nucleico que codifica CFLAR para la producción de un medicamento para tratar a un paciente que necesita inmunosupresión.

En una realización de todos los aspectos descritos en el presente documento, una terapia que requiere inmunosupresión es un trasplante y un paciente que necesita inmunosupresión es un receptor de trasplante. Así, la invención también abarca la población de células, composición farmacéutica o ácido nucleico para uso en el tratamiento de un receptor de trasplante para reducir en el receptor una respuesta inmunitaria contra el trasplante y/o para tratar o prevenir el rechazo del trasplante por parte del receptor. En diferentes realizaciones, el trasplante se selecciona del grupo que consiste en un tejido, un órgano, una célula, un ácido nucleico, una proteína, una red biocompatible y cualquier combinación de los mismos. En algunos aspectos, los tratamientos descritos en el presente documento para inducir inmunosupresión y tolerancia se administran al receptor antes del trasplante. En otros aspectos, los tratamientos descritos en el presente documento para inducir inmunosupresión y tolerancia se administran al receptor simultáneamente con el trasplante. Aún en otros aspectos, los tratamientos descritos en el presente documento para inducir inmunosupresión y tolerancia se administran como parte del trasplante. En otro aspecto más, los tratamientos descritos en el presente documento para inducir inmunosupresión y tolerancia se administran al receptor después del trasplante.

En una realización de todos los aspectos descritos en el presente documento, una terapia que requiere inmunosupresión es el tratamiento o prevención de la enfermedad de injerto contra huésped y un paciente que necesita inmunosupresión es un paciente que tiene enfermedad de injerto contra huésped o que está en riesgo de desarrollar enfermedad de injerto contra huésped.

En una realización de todos los aspectos descritos en el presente documento, una terapia que requiere inmunosupresión es el tratamiento o prevención de una enfermedad inmunitaria y un paciente que necesita inmunosupresión es un paciente que tiene una enfermedad inmunitaria o está en riesgo de desarrollar una enfermedad inmunitaria.

En un aspecto, la invención proporciona los agentes y composiciones tales como células y composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento para su uso en los métodos de tratamiento descritos en el presente documento.

En un aspecto, la invención proporciona un vector viral que comprende ácido nucleico que codifica CFLAR. En una realización, el vector viral es un vector lentiviral. El vector viral es preferiblemente útil para diseñar o transfectar células mieloides o células progenitoras de las mismas en vivo o in vitro.

Otras características y ventajas de la presente invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra la secuencia genética de CFLAR largo (denominada CFLAR<l>) con el plásmido utilizado para generar el lentivirus que codifica CFLAR<l>(A) y la secuencia del gen CFLAR corto (denominado CFLAR) con el plásmido utilizado para generar el lentivirus que codifica los CFLARs.

La Figura 2 muestra el protocolo y los resultados de los ensayos inmunosupresores de células CD34+ humanas infectadas que expresan CFLAR<l>y CFLARs para inhibir las células T activadas en comparación con células CD34+ que expresa luciferasa utilizadas como control negativo (A), junto con el protocolo y los resultados de los ensayos inmunosupresores de células CD14+ humanas infectadas que expresan CFLARL y CFLARs para inhibir las células T activadas en comparación con células CD14+ que expresan luciferasa utilizadas como control negativo (B).

La Figura 3 muestra el mapa de calor de genes regulados hacia arriba y hacia abajo mediados por la expresión impuesta por CFLAR en células CD14+ en comparación con células CD14+ infectadas con luciferasa. Las células CD14+ se obtuvieron de cuatro capas leucocitarias diferentes de donantes sanos (HD).

La Figura 4 muestra la lista de genes significativamente regulados positivamente por la expresión de CFLAR inducida por lentivirus en células CD14+ en comparación con células CD14+ infectadas con luciferasa.

La Figura 5 muestra la validación de algunos objetivos genéticos modulados por la expresión CFLAR forzada en células CD14+: regulación positiva de CFLARs, CFLAR<l>y genes IDOl mediante PCR en tiempo real (A); producción de IL-10 mediante ensayo ELISA (B); y expresión mejorada de marcadores de superficie CD273, CD274, CD80, CD163, CD44, CD38 y CD124 mediante citometría de flujo.

La Figura 6 muestra el protocolo (A) para tratar ratones sometidos a GVHD injertados con PBMC humanas (el enfoque inmunomodulador se basó en la administración repetida de monocitos que expresan CFLAR) y los resultados de este tratamiento en la prolongación de la supervivencia de los ratones tratados en comparación con los ratones tratados con monocitos no transducidos o transducidos con un vector que codifica luciferasa (usado como control); (B), la evaluación patológica por puntuación histopatológica (C, paneles superiores); y la enumeración de linfocitos humanos que se infiltran en tejidos (definidos como hCD3+ células) mediante inmunohistoquímica (C, paneles inferiores).

La Figura 7 muestra la evaluación inmunitaria de ratones sometidos a GVHD tratados con células CD14+ humanas que expresan CFLAR o luciferasa como se informa en el esquema del protocolo (A): los ratones tratados con células que expresan CFLAR presentan una frecuencia más baja de células T hCD3+ circulantes en la sangre (B, panel i), bazo (B, panel ii) y médula ósea (B, iii); además, los ratones tratados con células CD14+ que expresan CFLAR tienen una frecuencia más baja de células T hCD8+ que liberan IFN-<y>en comparación con los ratones que recibieron células CD14+ que expresan luciferasa después de la estimulación in vitro con PMA (50 ng/ml) más ionomicina (1 mg/ml); finalmente, los ratones tratados con la inyección repetida de células CD14+ que expresan CFLAR mostraron una mayor cantidad de linfocitos T reguladores (Treg) en comparación con los ratones tratados con células CD14+ que expresan luciferasa.

La Figura 8 muestra los resultados del ensayo inmunosupresor de monocitos CD11B+ Ly6G- Ly6Calto (panel A) y granulocitos CD11B+ Ly6G+ Ly6Cbajo (panel B) aislados de Rosa26.vFLIP;LysMcre (en negro) derivado tanto de médula ósea como de bazo en comparación con células CD11B+ Ly6G- Ly6Calto aisladas de ratones de control, Rosa26.vFLIP (en blanco).

Figura 9: c-FLAR induce un programa inmunosupresor independientemente de sus funciones antiapoptóticas. a) Evaluación de la vitalidad in vitro de células CD14+ infectadas con luciferasa (como control) o lentivirus que expresan c-FLAR (monocitos aislados de 4 diferentes capas leucocitarias). b) Solo la expresión forzada de c-FLAR indujo funciones inmunosupresoras. De hecho, los monocitos infectados con lentivirus que expresan BCL-2 o BCL no mostraron capacidad inmunosupresora. Todos estos datos demostraron que CFLAR dirige funciones inmunosupresoras independientemente de la protección contra la apoptosis.

Figura 10: La expresión forzada de c-FLAR en monocitos impulsa programas moleculares asociados a MDSC. a) Enriquecimiento de términos de BP de GO para los 486 genes únicos regulados positivamente en muestras sobreexpresadas con c-FLAR. El enriquecimiento se determinó utilizando la prueba de sobre-representación de GO implementada en el grupo Profiler y las categorías de GO Biological Process, los valores de p se corrigieron utilizando el procedimiento BH. b) Enriquecimiento de vías de señalización para genes regulados positivamente en muestras sobreexpresadas con c-FLAR (Figuras 3, 4a y 4b). Los genes diferencialmente expresados se identificaron utilizando SAM. Establecer un valor de q<1 % resultó en 486 genes únicos regulados positivamente en muestras sobreexpresadas con c-FLAR (firma de c-FLAR). El enriquecimiento se determinó utilizando una prueba de Fisher en las 267 vías de señalización de GSEA. Los valores de p se corrigieron utilizando el procedimiento BH. FDR q-val, valor de q de tasa de descubrimiento falso.

Figura 11: c-FLAR activa la vía canónica de NF-<k>B en células mieloides. a) Las células THP1 transfectadas con ARN de c-FLAR adquirieron funciones inmunosupresoras en comparación con el control (células THP1 transfectadas con ARN codificante de GFP). La actividad supresora se midió mediante la enumeración del número absoluto de células T CD3+ recolectadas después de la co-cultivo con células THP1 transfectadas. Los datos se presentan como la media ± EEM de tres experimentos independientes. b) Microscopía confocal de inmunofluorescencia de translocación nuclear de p65, p50 y p52 en células THP1 transfectadas. Los núcleos fueron contrastados con DAPI y los portaobjetos fueron visualizados utilizando microscopía confocal. Imágenes originales a x800 para todos los paneles. c) Las células Ly6C+ que expresan v-FLIP fueron purificadas y transfectadas con ARNip IKKa y IKKp y aleatorizado durante al menos 18 horas. Después, las células mieloides fueron incubadas con células OT-I marcadas con Cell-Trace y co-cultivadas en presencia del péptido SIINFEKL durante tres días. La actividad supresora se midió mediante la enumeración del número absoluto de células T CD8+ recolectadas después de co-cultivo. Los datos se presentan como la media ± EEM de cuatro experimentos independientes.

Descripción detallada de la invención

Aunque la presente invención se describe en detalle a continuación, debe entenderse que esta invención no se limita a las metodologías, protocolos y reactivos particulares descritos en el presente documento, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares únicamente y no pretende limitar el alcance de la presente invención, que estará limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen los mismos significados que entiende comúnmente un experto en la técnica.

A continuación se describirán los elementos de la presente invención. Estos elementos se enumeran con realizaciones específicas; sin embargo, debe entenderse que pueden combinarse de cualquier manera y en cualquier número para crear realizaciones adicionales. Los diversos ejemplos descritos y las realizaciones preferidas no deben interpretarse como que limitan la presente invención sólo a las realizaciones descritas explícitamente. Se debe entender que esta descripción respalda y abarca realizaciones que combinan las realizaciones descritas explícitamente con cualquier número de los elementos divulgados y/o preferidos. Además, cualquier permutación y combinación de todos los elementos descritos en esta solicitud debe considerarse divulgada por la descripción de la presente solicitud a menos que el contexto indique lo contrario.

Preferiblemente, los términos utilizados en el presente documento se definen como se describe en “A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)”, H.G.W. Leuenberger, B. Nagel y H. Kolbl, Eds., (1995) Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basilea, Suiza.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de bioquímica, biología celular, inmunología y técnicas de ADN recombinante que se explican en la literatura en el campo (véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

A lo largo de esta especificación y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra “comprende” y variaciones tales como “comprende” y “que comprende” implican la inclusión de un miembro, número entero o etapa o grupo indicado de miembros, enteros o etapas pero sin la exclusión de cualquier otro miembro, entero o etapa o grupo de miembros, enteros o etapas aunque en algunas realizaciones dicho otro miembro, entero o etapa o grupo de miembros, enteros o etapas pueden excluirse, es decir la materia consiste en la inclusión de un miembro, número entero o etapa determinado o grupo de miembros, números enteros o pasos. Los términos “un” y “una” y “el” y referencias similares utilizadas en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) deben interpretarse para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o claramente contradicha por el contexto.

La enumeración de rangos de valores en este documento simplemente pretende servir como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que se encuentre dentro del rango. A menos que se indique lo contrario en este documento, cada valor individual se incorpora a la especificación como si se enumerara individualmente en este documento.

Todos los métodos descritos en el presente documento se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en el presente documento o que el contexto lo contradiga claramente. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o lenguaje ejemplar (por ejemplo, “como”), proporcionados en este documento tiene como objetivo simplemente ilustrar mejor la invención y no representa una limitación en el alcance de la invención reivindicada. Ningún lenguaje en la especificación debe interpretarse como que indica algún elemento no reivindicado esencial para la práctica de la invención.

El término “recombinante” en el contexto de la presente invención significa “producido mediante ingeniería genética”. Preferiblemente, un “objeto recombinante”, tal como una célula o ácido nucleico recombinante en el contexto de la presente invención, no se produce de forma natural.

El término “de origen natural”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere al hecho de que un objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, un péptido o ácido nucleico que está presente en un organismo (incluidos los virus) y que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio es de origen natural.

Como se usa en el presente documento, una célula “aislada” es una célula que está esencialmente libre de otros tipos de células. Una célula aislada también se refiere a una célula que ha sido separada de otros tipos de células con los que normalmente está asociada en su estado natural. En algunos casos, una población de células aisladas se refiere a una población homogénea de células. En otros casos, este término se refiere simplemente a células que han sido separadas de las células con las que están asociadas naturalmente en su estado natural. En algunas realizaciones, las células se cultivan in vitro. En otras realizaciones, las células no se cultivan in vitro. En una realización, una población celular descrita en el presente documento contiene el 50 % o más de las células deseadas en la población celular, preferiblemente el 75 % o más de la población celular, más preferiblemente el 85 % o el 90 % o más de la población celular, y lo más preferiblemente 95 % o más de la población celular.

Como se usa en el presente documento, una célula “purificada” es una célula que está esencialmente libre de componentes no deseados tales como material celular y/o proteínas contaminantes de la fuente tisular de la que deriva la célula. Una célula purificada también se refiere a una célula que ha sido separada de componentes no deseados.

En una realización de la invención, una población de células que comprende células mieloides o células progenitoras de las mismas se refiere a una población de células que está sustancialmente libre de células distintas de las células mieloides o células progenitoras de las mismas y/o componentes no deseados.

Tal como se utiliza el término en el presente documento, “separado de” o “separa” se refiere a la característica de que una población de primeras sustancias se elimina de la proximidad de una población de segundas sustancias, en la que la población de primeras sustancias no está necesariamente desprovista de la segunda sustancia, y la población de segundas sustancias no está necesariamente desprovista de la primera sustancia. Sin embargo, una población de primeras sustancias que está “separada de” una población de segundas sustancias tiene un contenido mensurable menor de segundas sustancias en comparación con la mezcla no separada de primeras y segundas sustancias.

Las células sanguíneas hematopoyéticas se derivan de células madre pluripotentes de la médula ósea mediante proliferación y diferenciación. Las células madre, que se caracterizan por su repertorio de receptores de superficie celular (por ejemplo, CD34+), no están diferenciadas. A través de rondas de autorrenovación y expansión por proliferación, seguidas de diferenciación en respuesta a citocinas y factores de crecimiento, estas células dan lugar a todas las células sanguíneas funcionales maduras (monocitos/macrófagos, eosinófilos, neutrófilos, linfocitos T y linfocitos B).

En la diferenciación de las células sanguíneas, se delinean claramente dos vías de linaje; mieloides (incluidos monocitos/macrófagos, eosinófilos y neutrófilos) y linfoides (incluidos linfocitos T y linfocitos B). En términos generales, las células mieloides desempeñan funciones funcionales asociadas con la rápida destrucción y eliminación de patógenos (como bacterias y parásitos), mientras que las células linfoides están asociadas con la memoria de los patógenos y la generación de una respuesta inmunitaria mediada por anticuerpos. Las células mieloides realizan una función más transitoria y, por lo tanto, se producen en grandes cantidades, sobreviven días/semanas en lugar de meses o años, y son células funcionales especializadas total y terminalmente diferenciadas que no se dividen sino que permanecen en la fase GO/GI del ciclo celular. Una vez que han realizado su función mueren por apoptosis y son eliminados por fagocitosis. Por el contrario, y debido a su función de memoria especializada, los linfocitos T y B pueden vivir mucho tiempo y son capaces de una proliferación y un ciclo celular extensos.

Por consiguiente, el término “células mieloides” designa células de origen mieloide, abarca células terminalmente diferenciadas, que no se dividen (es decir, no proliferativas) derivadas del linaje de células mieloides e incluye neutrófilos o neutrófilos polimorfonucleares (PMN), eosinófilos y fagocitos mononucleares. Estas últimas células se conocen como monocitos cuando están en la sangre y macrófagos cuando han migrado a los tejidos. La diferenciación terminal es el criterio de valoración normal de la diferenciación celular y normalmente no es reversible.

En una realización particularmente preferida, el término “células mieloides” se refiere a monocitos. El término “monocito”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a glóbulos blancos que circulan en el torrente sanguíneo. Los monocitos se encuentran en la sangre periférica circulante, donde constituyen entre el 10 y el 20 % de la población total de células mononucleares. Los monocitos se caracterizan por su expresión fenotípica de CD14 y, por lo tanto, comúnmente se les llama monocitos CD14+. Desempeñan un papel importante en la defensa del huésped como monocitos circulantes y pueden diferenciarse en macrófagos tisulares y células dendríticas con una potente capacidad presentadora de antígenos. Los monocitos se diferencian en macrófagos al migrar a los tejidos. Por tanto, tal como se utiliza en la presente invención, el término “monocito” también se refiere a macrófagos.

El término “capa leucocitaria” se refiere a la fracción de una muestra de sangre anticoagulada que contiene la mayoría de los glóbulos blancos y plaquetas después de la centrifugación de la sangre en gradiente de densidad.

Las células progenitoras de células mieloides incluyen células hematopoyéticas tales como células madre hematopoyéticas y células progenitoras mieloides. En particular, las células progenitoras de células mieloides incluyen células que expresan CD34+ (células CD34+). Las células que expresan CD34 normalmente se encuentran en el cordón umbilical y la médula ósea como células hematopoyéticas. Las células CD34+ de la médula ósea contienen células madre hematopoyéticas y progenitoras y se sabe que se diferencian en todos los distintos tipos de células sanguíneas. Las células CD34+ se pueden aislar de muestras de sangre mediante métodos inmunomagnéticos o inmunofluorescentes.

Términos tales como “reducir”, “ inhibir” o “disminuir” se relacionan con la capacidad de provocar una disminución global, preferiblemente del 5 % o más, del 10 % o más, del 20 % o más, más preferiblemente del 50 % o más, y lo más preferiblemente del 75 % o más, en el nivel. Estos términos incluyen una inhibición completa o esencialmente completa, es decir, una reducción a cero o esencialmente a cero.

Términos tales como “aumentar”, “mejorar” o “promover” se relacionan con la capacidad de provocar un aumento general, preferiblemente del 5 % o más, del 10 % o más, del 20 % o más, del 50 % o más, del 75 % o más, 100 % o más, 200 % o más, o 500 % o más, en el nivel. Estos términos pueden estar relacionados con un aumento, mejora o promoción desde cero o un nivel no mensurable o no detectable a un nivel superior a cero o un nivel que sea mensurable o detectable. Alternativamente, estos términos también pueden significar que había un cierto nivel antes de un aumento, mejora o promoción y después del aumento, mejora o promoción el nivel es más alto.

De acuerdo con la presente invención, el término “aumentar el nivel celular” con respecto a una sustancia particular tal como CFLAR se refiere a medidas que dan como resultado un mayor grado o cantidad de la sustancia en comparación con la situación normal, en particular la situación normal en un célula, en la que el nivel celular no ha aumentado/no ha sido aumentado por el hombre.

El término “respuesta inmunitaria” se refiere a una respuesta corporal integrada a un antígeno y preferiblemente se refiere a una respuesta inmunitaria celular, una respuesta inmunitaria humoral o ambas. De acuerdo con la invención, el término “respuesta inmunitaria a” o “respuesta inmunitaria contra” con respecto a un agente tal como un antígeno, célula o tejido, se refiere a una respuesta inmunitaria tal como una respuesta celular dirigida contra el agente.

Los términos “respuesta inmunitaria celular”, “respuesta celular”, “ inmunidad mediada por células” o términos similares pretenden incluir una respuesta celular dirigida a células caracterizadas por la expresión de un antígeno y/o la presentación de un antígeno con clase I o clase II MHC. La respuesta celular se relaciona con células llamadas células T o linfocitos T que actúan como “ayudantes” o “asesinas”. Las células T auxiliares (también denominadas CD4+ Las células T) cumplen una función principal al regular la respuesta inmunitaria y las células asesinas (también denominadas células T citotóxicas, células T citolíticas, CD8+ Las células T o CTL) destruyen células como las células enfermas.

El término “respuesta inmunitaria humoral” se refiere a un proceso en organismos vivos en el que se producen anticuerpos en respuesta a agentes y organismos, que en última instancia neutralizan y/o eliminan. La especificidad de la respuesta de anticuerpos está mediada por células T y/o B a través de receptores asociados a membrana que se unen a antígenos de una única especificidad. Después de la unión de un antígeno apropiado y la recepción de varias otras señales de activación, los linfocitos B se dividen, lo que produce células B de memoria, así como clones de células plasmáticas secretoras de anticuerpos, cada uno de los cuales produce anticuerpos que reconocen el epítopo antigénico idéntico al reconocido por su receptor de antígeno. Los linfocitos B de memoria permanecen latentes hasta que posteriormente son activados por su antígeno específico. Estos linfocitos proporcionan la base celular de la memoria y la consiguiente intensificación de la respuesta de anticuerpos cuando se vuelven a exponer a un antígeno específico.

El término “anticuerpo”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula de inmunoglobulina que es capaz de unirse específicamente a un epítopo de un antígeno. En particular, el término “anticuerpo” se refiere a una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. El término “anticuerpo” incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos recombinantes, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y combinaciones de cualquiera de los anteriores. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (VH) y una región constante de cadena pesada (CH). Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (VL) y una región constante de cadena ligera (CL). Las regiones variables y las regiones constantes también se denominan aquí dominios variables y dominios constantes, respectivamente. Las regiones VH y VL se pueden subdividir en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL está compuesto por tres CDR y cuatro FR, dispuestos desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las CDR de un VH se denominan HCDR1, HCDR2 y HCDR3, las CDR de un VL se denominan LCDR1, LCDR2 y LCDR3. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de un anticuerpo comprenden la región constante de cadena pesada (CH) y la región constante de cadena ligera (CL), en el que CH puede subdividirse además en dominio constante CH1, una región bisagra y dominios constantes CH2 y c H3 (dispuestos de amino -terminal a carboxi-terminal en el siguiente orden: CH1, CH2, CH3). Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del huésped, incluidas varias células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas intactas derivadas de fuentes naturales o de fuentes recombinantes y pueden ser porciones inmunoactivas de inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos suelen ser tetrámeros de moléculas de inmunoglobulina. Los anticuerpos pueden existir en una variedad de formas que incluyen, por ejemplo, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, Fv, Fab y F(ab)2, así como anticuerpos monocatenarios y anticuerpos humanizados.

El término “ inmunoglobulina” se refiere a proteínas de la superfamilia de inmunoglobulinas, preferiblemente a receptores de antígenos tales como anticuerpos o el receptor de células B (BCR). Las inmunoglobulinas se caracterizan por un dominio estructural, es decir, el dominio de inmunoglobulina, que tiene un pliegue de inmunoglobulina (Ig) característico. El término abarca inmunoglobulinas unidas a membrana así como inmunoglobulinas solubles. Las inmunoglobulinas unidas a membranas también se denominan inmunoglobulinas de superficie o inmunoglobulinas de membrana, que generalmente forman parte del BCR. Las inmunoglobulinas solubles generalmente se denominan anticuerpos. Las inmunoglobulinas generalmente comprenden varias cadenas, típicamente dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas que están unidas mediante enlaces disulfuro. Estas cadenas están compuestas principalmente de dominios de inmunoglobulina, como el V<l>dominio (cadena ligera variable), C<l>dominio (cadena ligera constante), V<h>dominio (cadena pesada variable), y el C<h>(cadena pesada constante) dominios C<h>1, C<h>2, C<h>3 y C<h>4. Hay cinco tipos de cadenas pesadas de inmunoglobulinas de mamíferos, es decir, a, 5, £, y y M, que representan las diferentes clases de anticuerpos, es decir, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. A diferencia de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas solubles, las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas de membrana o de superficie comprenden un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático corto en su extremo carboxilo. En los mamíferos existen dos tipos de cadenas ligeras, es decir, lambda y kappa. Las cadenas de inmunoglobulinas comprenden una región variable y una región constante. La región constante se conserva esencialmente dentro de los diferentes isotipos de las inmunoglobulinas, mientras que la parte variable es muy diversa y representa el reconocimiento de antígenos.

Un “antígeno” de acuerdo con la invención cubre cualquier sustancia que provoque una respuesta inmunitaria y/o cualquier sustancia contra la cual se dirige una respuesta inmunitaria o un mecanismo inmunitario tal como una respuesta celular. Esto también incluye situaciones en las que el antígeno se procesa en péptidos antigénicos y una respuesta inmunitaria o un mecanismo inmunitario se dirige contra uno o más péptidos antigénicos, en particular si se presentan en el contexto de moléculas MHC. En particular, un “antígeno” se refiere a cualquier sustancia, preferiblemente un péptido o proteína, que reacciona específicamente con los linfocitos T (células T). De acuerdo con la presente invención, el término “antígeno” comprende cualquier molécula que comprende al menos un epítopo tal como un epítopo de célula T Preferiblemente, un antígeno en el contexto de la presente invención es una molécula que, opcionalmente después del procesamiento, induce una reacción inmunitaria, que es preferiblemente específica para el antígeno (incluidas las células que expresan el antígeno). En el contexto de las realizaciones de la presente invención, el antígeno es presentado preferiblemente por una célula en el contexto de moléculas MHC, lo que da como resultado una respuesta inmunitaria contra el antígeno.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término “autoantígeno” se refiere a un antígeno que es nativo de un mamífero y que puede estar implicado en la patogénesis de una enfermedad inmunitaria.

El término “ inmunogenicidad” se refiere a la eficacia relativa de un antígeno para inducir una reacción inmunitaria.

El término “ inmunoestimulador” se utiliza en el presente documento para referirse al aumento de la respuesta inmunitaria general.

El término “ inmunosupresor” se utiliza en el presente documento para referirse a la reducción de la respuesta inmunitaria general.

En algunos casos, es deseable inducir un efecto inmunosupresor específico de antígeno.

“Tolerancia inmunológica”, “tolerancia inmunológica” o simplemente “tolerancia” describe un estado de falta de respuesta del sistema inmunitario a sustancias o tejidos que tienen la capacidad de provocar una respuesta inmunitaria. Contrasta con la eliminación convencional de antígenos extraños mediada por inmunidad. Los mecanismos mediante los cuales se establece la tolerancia son distintos, pero el efecto resultante es similar.

Un “péptido antigénico” De acuerdo con la invención se refiere preferiblemente a una porción o fragmento de un antígeno que es capaz de estimular una respuesta inmunitaria, preferiblemente una respuesta celular contra el antígeno o células caracterizadas por la expresión del antígeno y preferiblemente por la presentación del antígeno. Preferiblemente, un péptido antigénico es capaz de estimular una respuesta celular contra una célula caracterizada por la presentación de un antígeno con MHC de clase I y preferiblemente es capaz de estimular un linfocito T citotóxico (CTL) sensible al antígeno. Preferiblemente, los péptidos antigénicos son péptidos presentados por MHC de clase I y/o clase II. Preferiblemente, los péptidos antigénicos comprenden una secuencia de aminoácidos que corresponde sustancialmente a la secuencia de aminoácidos de un fragmento de un antígeno. Preferiblemente, dicho fragmento de un antígeno es un péptido presentado por MHC de clase I y/o clase II.

Un péptido que es adecuado para unirse a una molécula de MHC, en particular una molécula de MHC de clase I, tiene preferiblemente una longitud de 7-20 aminoácidos, más preferiblemente una longitud de 7-12 aminoácidos, más preferiblemente una longitud de 8-11 aminoácidos en particular 9 ó 10 aminoácidos de longitud.

En una realización, un péptido antigénico cuando se presenta en el contexto de MHC tal como MHC de células presentadoras de antígeno es reconocido por un receptor de células T. El péptido antigénico, si es reconocido por un receptor de células T, puede ser capaz de inducir, en presencia de señales coestimuladoras apropiadas, la expansión clonal de la célula T que porta el receptor de células T que reconoce específicamente el péptido antigénico. Preferiblemente, los péptidos antigénicos, en particular si se presentan en el contexto de moléculas MHC, son capaces de estimular una respuesta inmunitaria, preferiblemente una respuesta celular contra el antígeno del que derivan o células caracterizadas por la expresión del antígeno y preferiblemente caracterizadas por la presentación del antígeno.

El término “epítopo” se refiere a un determinante antigénico en una molécula tal como un antígeno, es decir, a una parte o fragmento de la molécula que es reconocida por el sistema inmunitario, por ejemplo, que es reconocida por una célula T, en particular cuando se presenta en el contexto de moléculas MHC. Un epítopo de una proteína comprende preferiblemente una porción continua o discontinua de dicha proteína y tiene preferiblemente entre 5 y 100, preferiblemente entre 5 y 50, más preferiblemente entre 8 y 30, lo más preferiblemente entre 10 y 25 aminoácidos de longitud, por ejemplo, el epítopo puede tener preferiblemente 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24 o 25 aminoácidos de longitud. Se prefiere particularmente que el epítopo en el contexto de la presente invención sea un epítopo de células T

Términos tales como “epítopo”, “epítopo de células T”, “fragmento de un antígeno”, “péptido inmunogénico” y “péptido antigénico” se usan indistintamente en el presente documento y preferiblemente se relacionan con una representación incompleta de un antígeno que es preferiblemente capaz de provocar una respuesta inmunitaria contra el antígeno o una célula que expresa o comprende y preferiblemente presenta el antígeno. Preferiblemente, los términos se refieren a una porción inmunogénica de un antígeno. Preferiblemente, es una porción de un antígeno que es reconocida (es decir, unida específicamente) por un receptor de células T, en particular si se presenta en el contexto de moléculas de MHC. Ciertas porciones inmunogénicas preferidas se unen a una molécula de MHC de clase I o clase II.

El término “objetivo” significará un agente tal como una célula o tejido que es un objetivo para una respuesta inmunitaria tal como una respuesta inmunitaria celular. Las dianas incluyen células que presentan un antígeno o un epítopo antigénico, es decir, un fragmento peptídico derivado de un antígeno. En una realización, la célula diana es una célula que expresa un antígeno y preferiblemente presenta dicho antígeno con MHC de clase I.

El término “porción” se refiere a una fracción. Con respecto a una estructura particular tal como una secuencia de aminoácidos o una proteína, el término “porción” de la misma puede designar una fracción continua o discontinua de dicha estructura.

Los términos “parte” y “fragmento” se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a un elemento continuo. Por ejemplo, una parte de una estructura tal como una secuencia de aminoácidos o una proteína se refiere a un elemento continuo de dicha estructura.

“Procesamiento de antígeno” se refiere a la degradación de un antígeno en productos de procesión, que son fragmentos de dicho antígeno (por ejemplo, la degradación de una proteína en péptidos) y la asociación de uno o más de estos fragmentos (por ejemplo, mediante unión) con moléculas MHC para su presentación por células, preferiblemente células presentadoras de antígenos a células T específicas.

Una célula presentadora de antígeno (APC) es una célula que muestra un antígeno en el contexto del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en su superficie. Las células T pueden reconocer este complejo utilizando su receptor de células T (TCR). Las células presentadoras de antígenos procesan los antígenos y los presentan a las células T. Una célula presentadora de antígeno incluye, pero no limitado a, monocitos/macrófagos, células B y células dendríticas (DC).

Las células presentadoras de antígenos no profesionales no expresan constitutivamente las proteínas MHC de clase II necesarias para la interacción con células T vírgenes; estos se expresan únicamente tras la estimulación de las células presentadoras de antígenos no profesionales mediante determinadas citoquinas como el IFNy.

Las células presentadoras de antígenos profesionales son muy eficaces para internalizar el antígeno, ya sea por fagocitosis o por endocitosis mediada por receptores, y luego muestran un fragmento del antígeno, unido a una molécula MHC de clase II, en su membrana. La célula T reconoce e interactúa con el complejo molecular MHC de antígeno de clase II en la membrana de la célula presentadora de antígeno. Luego, la célula presentadora de antígeno produce una señal coestimuladora adicional, lo que conduce a la activación de la célula T La expresión de moléculas coestimuladoras es una característica definitoria de las células presentadoras de antígenos profesionales.

Los principales tipos de células presentadoras de antígenos profesionales son las células dendríticas, que tienen la gama más amplia de presentación de antígenos y son probablemente las células presentadoras de antígenos, macrófagos, células B y ciertas células epiteliales activadas más importantes.

Las células dendríticas (DC) son poblaciones de leucocitos que presentan antígenos capturados en tejidos periféricos a las células T a través de vías de presentación de antígenos del MHC de clase II y I. Es bien sabido que las células dendríticas son potentes inductores de respuestas inmunes y la activación de estas células es un paso crítico para la inducción de inmunidad.

Las células dendríticas se clasifican convenientemente en células “ inmaduras” y “maduras”, lo que puede utilizarse como una forma sencilla de discriminar entre dos fenotipos bien caracterizados. Sin embargo, esta nomenclatura no debe interpretarse en el sentido de que excluye todas las posibles etapas intermedias de diferenciación.

Las células dendríticas inmaduras se caracterizan por ser células presentadoras de antígenos con una alta capacidad de captación y procesamiento de antígenos, lo que se correlaciona con la alta expresión del receptor Fcy y del receptor de manosa. El fenotipo maduro se caracteriza típicamente por una expresión más baja de estos marcadores, pero una expresión alta de moléculas de la superficie celular responsables de la activación de las células T, como el MHC de clase I y clase II, moléculas de adhesión (por ejemplo, CD54 y CD11) y moléculas coestimuladoras (por ejemplo, CD40, CD80, CD86 y 4-1 BB).

La maduración de las células dendríticas se conoce como el estado de activación de las células dendríticas en el que dichas células dendríticas presentadoras de antígenos conducen al cebado de las células T, mientras que la presentación por parte de células dendríticas inmaduras produce tolerancia. La maduración de las células dendríticas está causada principalmente por biomoléculas con características microbianas detectadas por receptores innatos (ADN bacteriano, ARN viral, endotoxinas, etc.), citoquinas proinflamatorias (TNF, IL-1, IFN), ligadura de CD40 en la superficie de las células dendríticas por CD40L y sustancias liberadas por células que sufren muerte celular estresante. Las células dendríticas pueden derivarse cultivando células de la médula ósea in vitro con citocinas, como el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y el factor de necrosis tumoral alfa.

El término “célula inmunorreactiva” o “célula efectora” en el contexto de la presente invención se refiere a una célula que ejerce funciones efectoras durante una reacción inmunitaria. Una “célula inmunorreactiva” preferiblemente es capaz de unirse a un antígeno o una célula caracterizada por la expresión y/o presentación de un antígeno o un péptido antigénico derivado de un antígeno y mediar una respuesta inmunitaria. Por ejemplo, dichas células secretan citocinas y/o quimiocinas, destruyen microbios, secretan anticuerpos, reconocen células infectadas o cancerosas y, opcionalmente, eliminan dichas células. Por ejemplo, las células inmunorreactivas comprenden células T (células T citotóxicas, células T auxiliares, células T infiltrantes de tumores), células B, células asesinas naturales, neutrófilos, macrófagos y células dendríticas. Preferiblemente, en el contexto de la presente invención, “células inmunorreactivas” son células T, preferiblemente Células T CD4+ y/o CD8+.

Preferiblemente, una “célula inmunorreactiva” reconoce un antígeno o un péptido antigénico derivado de un antígeno con cierto grado de especificidad, en particular si se presenta en el contexto de moléculas MHC tales como en la superficie de células presentadoras de antígenos o células enfermas tales como células tumorales. Preferiblemente, dicho reconocimiento permite que la célula que reconoce un antígeno o un péptido antigénico derivado de dicho antígeno responda o sea reactiva. Si la célula es una célula T auxiliar (células T CD4+) que contienen receptores que reconocen un antígeno o un péptido antigénico derivado de un antígeno en el contexto de moléculas del MHC de clase II, tal capacidad de respuesta o reactividad puede implicar la liberación de citocinas y/o la activación de linfocitos CD8+ (CTL) y/o células B. Si la célula es un CTL, dicha capacidad de respuesta o reactividad puede implicar la eliminación de células presentadas en el contexto de moléculas de MHC de clase I, es decir, células caracterizadas por la presentación de un antígeno con MHC de clase I, por ejemplo, mediante apoptosis o lisis celular mediadas por perforina. De acuerdo con la invención, la capacidad de respuesta de los CTL puede incluir flujo sostenido de calcio, división celular, producción de citoquinas tales como IFN-y y TNF-a, regulación positiva de marcadores de activación tales como CD44 y CD69, y muerte citolítica específica de células diana que expresan antígenos. La capacidad de respuesta de CTL también se puede determinar usando un indicador artificial que indique con precisión la capacidad de respuesta de CTL. Dichos CTL que reconocen un antígeno o un péptido antigénico derivado de un antígeno y que responden o son reactivos también se denominan en el presente documento “CTL que responden a antígenos”. Si la célula es una célula B, dicha capacidad de respuesta puede implicar la liberación de inmunoglobulinas.

El término “célula T” o “ linfocito T” se relaciona con células derivadas del timo que participan en una variedad de reacciones inmunitarias mediadas por células e incluye células T auxiliares (células T CD4+) y células T citotóxicas (CTL, células T CD8+) que comprenden células T citolíticas.

Las células T pertenecen a un grupo de glóbulos blancos conocidos como linfocitos y cumplen una función principal en la inmunidad mediada por células. Se pueden distinguir de otros tipos de linfocitos, como las células B y las células asesinas naturales, por la presencia de un receptor especial en su superficie celular llamado receptor de células T (TCR). El timo es el principal órgano responsable de la maduración de las células T. Se han descubierto varios subconjuntos diferentes de células T, cada uno con una función distinta.

Las células T auxiliares ayudan a otros glóbulos blancos en procesos inmunológicos, incluida la maduración de células B en células plasmáticas y la activación de células T citotóxicas y macrófagos, entre otras funciones. Estas células también se conocen como células T CD4+ porque expresan la proteína CD4 en su superficie. Las células T auxiliares se activan cuando se les presentan antígenos peptídicos mediante moléculas MHC de clase II que se expresan en la superficie de las células presentadoras de antígenos (APC). Una vez activadas, se dividen rápidamente y secretan pequeñas proteínas llamadas citocinas que regulan o ayudan en la respuesta inmunitaria activa.

Las células T citotóxicas destruyen las células infectadas por virus y las células tumorales, y también están implicadas en el rechazo de trasplantes. Estas células también se conocen como células T CD8+ porque expresan la glicoproteína CD8 en su superficie. Estas células reconocen sus objetivos uniéndose al antígeno asociado con el MHC de clase I, que está presente en la superficie de casi todas las células del cuerpo.

La mayoría de las células T tienen un receptor de células T (TCR) que existe como un complejo de varias proteínas. El receptor de células T real está compuesto por dos cadenas peptídicas separadas, que se producen a partir de los genes alfa y beta del receptor de células T independientes (TCRa y TCRp) y se denominan cadenas a y p-TCR. Las células T y¿ (células T gamma delta) representan un pequeño subconjunto de células T que poseen un receptor de células T (TCR) distinto en su superficie. Sin embargo, en las células T y§, el TCR está formado por una cadena y y una cadena 8. Este grupo de células T es mucho menos común (2 % del total de células T) que las células T ap.

La estructura del receptor de células T es muy similar a los fragmentos Fab de inmunoglobulina, que son regiones definidas como la cadena ligera y pesada combinada de un brazo de anticuerpo. Cada cadena del TCR es miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas y posee un dominio terminal N de inmunoglobulina (Ig) variable (V), un dominio Ig constante (C), una región transmembrana/membrana celular y una cola citoplasmática corta en el extremo del terminal C. El dominio variable tanto de la cadena a como de la cadena p del TCR tiene tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) hipervariables, mientras que la región variable de la cadena p tiene un área adicional de hipervariabilidad (HV4) que normalmente no contacta con el antígeno y por lo tanto, no se considera una CDR. La CDR3 es la principal CDR responsable del reconocimiento del antígeno procesado, aunque también se ha demostrado que la CDR1 de la cadena a interactúa con la parte terminal N del péptido antigénico, mientras que la CDR1 de la cadena p interactúa con la parte terminal C del péptido antigénico. Se considera que CDR2 reconoce el MHC. No se considera que CDR4 de la cadena p participe en el reconocimiento de antígenos, pero se ha demostrado que interactúa con superantígenos. El dominio constante del dominio TCR consta de secuencias de conexión cortas en las que un residuo de cisteína forma enlaces disulfuro, que forman un enlace entre las dos cadenas.

El término “célula mononuclear de sangre periférica” o “PBMC” se refiere a una célula de sangre periférica que tiene un núcleo redondo. Estas células están formadas por linfocitos (células T, células B, células NK) y monocitos, mientras que los eritrocitos y las plaquetas no tienen núcleo y los granulocitos (neutrófilos, basófilos y eosinófilos) tienen núcleos multilobados. Estas células se pueden extraer de la sangre completa mediante ficoll y centrifugación en gradiente, que separará la sangre en una capa superior de plasma, seguida de una capa de PBMC y una fracción inferior de células polimorfonucleares (como neutrófilos y eosinófilos) y eritrocitos.

El término “complejo mayor de histocompatibilidad” y la abreviatura “MHC” incluyen moléculas MHC de clase I y MHC de clase II y se refieren a un complejo de genes que se encuentra en todos los vertebrados. Las proteínas o moléculas del MHC son importantes para la señalización entre linfocitos y células presentadoras de antígenos o células enfermas en reacciones inmunes, en las que las proteínas o moléculas del MHC se unen a péptidos y los presentan para su reconocimiento por los receptores de células T Las proteínas codificadas por el MHC se expresan en la superficie de las células y muestran tanto antígenos propios (fragmentos de péptidos de la propia célula) como antígenos ajenos (por ejemplo, fragmentos de microorganismos invasores) a una célula T

La región MHC se divide en tres subgrupos, clase I, clase II y clase III. Las proteínas del MHC de clase I contienen una cadena a y una microglobulina p2 (que no forma parte del MHC codificado por el cromosoma 15). Presentan fragmentos de antígeno a las células T citotóxicas. En la mayoría de las células del sistema inmunitario, específicamente en las células presentadoras de antígenos, las proteínas MHC de clase II contienen cadenas a y p y presentan fragmentos de antígenos a las células T auxiliares. La región MHC clase III codifica otros componentes inmunes, como componentes del complemento y algunos que codifican citoquinas.

En los seres humanos, los genes de la región MHC que codifican proteínas presentadoras de antígenos en la superficie celular se denominan genes del antígeno leucocitario humano (HLA). Sin embargo, la abreviatura MHC se utiliza a menudo para referirse a productos del gen HLA. Los genes HLA incluyen los nueve genes MHC denominados clásicos: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA y HLA-DRB1.

En una realización preferida de todos los aspectos de la invención, una molécula de MHC es una molécula de HLA.

El término “funciones efectoras inmunitarias” o “funciones efectoras” en el contexto de la presente invención incluye cualquier función mediada por componentes del sistema inmunitario que resulte, por ejemplo, en la destrucción de células. Preferiblemente, las funciones efectoras inmunes en el contexto de la presente invención son funciones efectoras mediadas por células T. Tales funciones comprenden en el caso de una célula T auxiliar (Célula T CD4+) el reconocimiento de un antígeno o un péptido antigénico derivado de un antígeno en el contexto de las moléculas MHC de clase II por los receptores de células T, la liberación de citoquinas y/o la activación de CD8+ linfocitos (CTL) y/o células B, y en el caso de CTL, el reconocimiento de un antígeno o un péptido antigénico derivado de un antígeno en el contexto de moléculas MHC de clase I por receptores de células T, la eliminación de células presentadas en el contexto de moléculas de MHC de clase I, es decir, células caracterizadas por la presentación de un antígeno con MHC de clase I, por ejemplo, mediante apoptosis o lisis celular mediada por perforina, producción de citocinas como IFN-<y>y TNF-a, y destrucción citolítica específica de células diana que expresan antígenos.

Un “ácido nucleico” es de acuerdo con la invención preferentemente ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), más preferentemente ARN, lo más preferentemente ARN transcrito in vitro (ARN IVT) o ARN sintético. Los ácidos nucleicos incluyen de acuerdo con la invención ADN genómico, ADNc, ARNm, moléculas producidas de forma recombinante y sintetizadas químicamente. De acuerdo con la invención, un ácido nucleico puede presentarse como molécula monocatenaria o bicatenaria y cerrada lineal o covalentemente circularmente. De acuerdo con la invención se puede aislar un ácido nucleico. El término “ácido nucleico aislado” significa, de acuerdo con la invención, que el ácido nucleico (i) fue amplificado in vitro, por ejemplo mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), (ii) se produjo de forma recombinante mediante clonación, (iii) se purificó, por ejemplo, mediante escisión y separación mediante electroforesis en gel, o (iv) se sintetizó, por ejemplo, mediante síntesis química. Se puede emplear un ácido nucleico para la introducción en células, es decir, la transfección de ellas, por ejemplo, en forma de ARN que se puede preparar mediante transcripción in vitro a partir de una plantilla de ADN. Además, el ARN puede modificarse antes de su aplicación mediante secuencias estabilizantes, protección y poliadenilación.

Los ácidos nucleicos descritos en el presente documento pueden estar comprendidos en un vector que puede usarse para administrar un ácido nucleico al interior de una célula. El término “vector”, como se usa en el presente documento, incluye cualquier vector conocido por el experto, incluidos vectores plásmidos, vectores cósmidos, vectores fagos tales como fago lambda, vectores virales tales como vectores adenovirales o baculovirales, vectores retro o lentivirales, transposones o vectores cromosómicos artificiales. como los cromosomas artificiales bacterianos (BAC), los cromosomas artificiales de levadura (YAC) o los cromosomas artificiales P1 (PAC). Dichos vectores incluyen vectores de expresión así como de clonación. Los vectores de expresión comprenden plásmidos así como vectores virales y generalmente contienen una secuencia codificante deseada y secuencias de ADN apropiadas necesarias para la expresión de la secuencia codificante unida operativamente en un organismo huésped particular (por ejemplo, bacterias, levaduras, plantas, insectos o mamíferos) o en sistemas de expresión in vitro. Los vectores de clonación se utilizan generalmente para diseñar y amplificar un determinado fragmento de ADN deseado y pueden carecer de secuencias funcionales necesarias para la expresión de los fragmentos de ADN deseados.

Las células tolerogénicas o inmunosupresoras descritas en el presente documento se pueden generar ya sea in vitro o en vivo transfectando o transduciendo las células con un vector que da como resultado una mayor expresión de CFLAR. Puede usarse cualquiera de una variedad de métodos bien conocidos por un experto en la técnica para transfectar o transducir las células.

El ácido nucleico que codifica CFLAR se puede clonar en varios tipos de vectores. Sin embargo, no debe considerarse que la presente invención se limita a ningún vector particular. En lugar de ello, se debe interpretar que la presente invención abarca una amplia variedad de vectores que están fácilmente disponibles y son bien conocidos en la técnica. En realizaciones específicas, el vector se selecciona del grupo que consiste en un vector viral, un vector bacteriano y un vector de células de mamífero. Muchos de estos sistemas están comercialmente y ampliamente disponibles.

El vector puede proporcionarse a una célula en forma de un vector viral. La tecnología de vectores virales es bien conocida en la técnica. Los virus que son útiles como vectores incluyen, pero no limitado a, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes y lentivirus. Preferiblemente, el virus es un adenovirus dependiente auxiliar (HD-Ad). En general, un vector adecuado contiene un origen de replicación funcional en al menos un organismo, una secuencia promotora, sitios de endonucleasa de restricción convenientes y uno o más marcadores seleccionables.

Los expertos en la técnica de la biología molecular generalmente saben cómo utilizar promotores, potenciadores y combinaciones de tipos celulares para la expresión de proteínas. Los promotores empleados pueden ser constitutivos, específicos de tejido, inducibles y/o útiles en las condiciones apropiadas para dirigir la expresión de alto nivel del segmento de ácido nucleico introducido que codifica CFLAR. El promotor puede ser heterólogo o endógeno. Las secuencias promotoras constitutivas que pueden usarse De acuerdo con la invención incluyen, entre otras, la secuencia promotora temprana inmediata del citomegalovirus (CMV), el promotor temprano del virus simio 40 (SV40), el virus del tumor mamario de ratón (MMTV), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) de repetición terminal larga (LTR), promotor del virus de Moloney, promotor del virus de la leucemia aviar, promotor temprano inmediato del virus de Epstein-Barr, promotor del virus del sarcoma de Rous, así como promotores de genes humanos tales como, pero no limitado a, el promotor actina, el promotor de miosina, el promotor de hemoglobina y el promotor de creatina muscular. Además, la invención no debería limitarse al uso de promotores constitutivos. También se contemplan promotores inducibles como parte de la invención. El uso de un promotor inducible en la invención proporciona un interruptor molecular capaz de activar la expresión de la secuencia polinucleotídica a la que está operativamente unida cuando se desea dicha expresión, o desactivar la expresión cuando no se desea la expresión. Los ejemplos de promotores inducibles incluyen, pero no limitado a, un promotor de metalotionina, un promotor de glucocorticoide, un promotor de progesterona y un promotor de tetraciclina. Además, la invención incluye el uso de un promotor específico de tejido, cuyo promotor es activo sólo en un tejido deseado. Los promotores específicos de tejido son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no limitado a, el promotor HER-2 y las secuencias promotoras asociadas a PSA.

Para evaluar la expresión de CFLAR, el vector de expresión que se va a introducir en una célula también puede contener un gen marcador seleccionable o un gen indicador o ambos para facilitar la identificación y selección de células que expresan de la población de células que se busca transfectar o infectados a través de vectores virales. En otras realizaciones, el marcador seleccionable puede transportarse en una pieza separada de ADN y usarse en un procedimiento de cotransfección. Tanto los marcadores seleccionables como los genes indicadores pueden estar flanqueados con secuencias reguladoras apropiadas para permitir la expresión en las células huésped. Se conocen marcadores seleccionables útiles en la técnica e incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a antibióticos, tales como neo y similares. Los genes indicadores se utilizan para identificar células potencialmente transfectadas y para evaluar la funcionalidad de secuencias reguladoras. Los genes indicadores que codifican proteínas fácilmente analizables son bien conocidos en la técnica. En general, un gen indicador es un gen que no está presente ni expresado en el organismo o tejido receptor y que codifica una proteína cuya expresión se manifiesta mediante alguna propiedad fácilmente detectable, por ejemplo, actividad enzimática. La expresión del gen indicador se analiza en un momento adecuado después de que el ácido nucleico se haya introducido en las células receptoras. Los genes indicadores adecuados pueden incluir genes que codifican luciferasa, beta-galactosidasa, cloranfenicol acetil transferasa, fosfatasa alcalina secretada o el gen de la proteína verde fluorescente.

El vector puede introducirse fácilmente en una célula huésped mediante cualquier método de la técnica. Por ejemplo, el vector de expresión puede transferirse a una célula huésped por medios físicos, químicos o biológicos. Los métodos físicos para introducir un ácido nucleico en una célula huésped incluyen precipitación con fosfato cálcico, lipofección, bombardeo de partículas, microinyección, electroporación y similares. Los métodos para producir células que comprenden vectores y/o ácidos nucleicos exógenos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), y en Ausubel et al. (1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York).

Los métodos biológicos para introducir un ácido nucleico de interés en una célula huésped incluyen el uso de vectores de ADN y ARN. Los vectores virales, y especialmente los vectores retrovirales, se han convertido en el método más utilizado para insertar genes en células de mamíferos, por ejemplo, humanas. Otros vectores virales pueden derivarse de lentivirus, poxvirus, virus del herpes simple I, adenovirus y virus adenoasociados, y similares.

Los medios químicos para introducir un ácido nucleico en una célula huésped incluyen sistemas de dispersión coloidal, tales como complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Un sistema coloidal preferido para su uso como vehículo de entrega in vitro y en vivo es un liposoma (es decir, una vesícula de membrana artificial). La preparación y uso de tales sistemas es bien conocido en la técnica.

Independientemente del método utilizado para introducir ácidos nucleicos exógenos en una célula huésped o aumentar de otro modo el nivel celular de CFLAR en una célula, con el fin de confirmar la presencia y/o cantidad de CFLAR o su ácido nucleico codificante en la célula huésped, una variedad de ensayos pueden realizarse. Dichos ensayos incluyen, por ejemplo, transferencias Southern y Northern, RT-PCR y PCR y ensayos para detectar la presencia o ausencia de un péptido particular, por ejemplo, por medios inmunológicos (ELISA y transferencias Western).

En el contexto de la presente invención, el término “ADN” se refiere a una molécula que comprende residuos de desoxirribonucleótidos y preferiblemente está compuesta total o sustancialmente por residuos de desoxirribonucleótidos. “Desoxirribonucleótido” se refiere a un nucleótido que carece de un grupo hidroxilo en la posición 2' de un grupo p-D-ribofuranosilo. El término “ADN” comprende ADN aislado tal como ADN purificado parcial o completamente, ADN esencialmente puro, ADN sintético y ADN generado recombinantemente e incluye ADN modificado que difiere del ADN natural por la adición, eliminación, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Tales alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, tal como en el(los) extremo(s) de un ADN o internamente, por ejemplo en uno o más nucleótidos del ADN. Los nucleótidos en las moléculas de ADN también pueden comprender nucleótidos no estándar, tales como nucleótidos de origen no natural o nucleótidos sintetizados químicamente. Estos ADN alterados pueden denominarse análogos o análogos del ADN natural.

En el contexto de la presente invención, el término “ARN” se refiere a una molécula que comprende residuos de ribonucleótidos y que preferiblemente está compuesta total o sustancialmente por residuos de ribonucleótidos. “Ribonucleótido” se refiere a un nucleótido con un grupo hidroxilo en la posición 2' de un grupo p-D-ribofuranosilo. El término incluye ARN bicatenario, ARN monocatenario, ARN aislado tal como ARN parcial o completamente purificado, ARN esencialmente puro, ARN sintético, ARN producido de forma recombinante, así como ARN modificado que difiere del ARN natural por la adición, deleción, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Tales alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, tal como en el(los) extremo(s) de un ARN o internamente, por ejemplo en uno o más nucleótidos del ARN. Los nucleótidos en moléculas de ARN también pueden comprender nucleótidos no estándar, tales como nucleótidos de origen no natural o nucleótidos o desoxinucleótidos sintetizados químicamente. Estos ARN alterados pueden denominarse análogos o análogos del ARN natural. De acuerdo con la presente invención, el término “ARN” incluye y preferiblemente se refiere a “ARNm”, que significa “ARN mensajero” y se refiere a un transcrito que puede producirse utilizando ADN como plantilla y codifica un péptido o proteína. El ARNm normalmente comprende una región 5' no traducida (5'-UTR), una región codificante de proteína o péptido y una región 3' no traducida (3'-UTR). El ARNm tiene un tiempo medio limitado en las células e in vitro. Preferiblemente, el ARNm es producido por transcripción in vitro utilizando una plantilla de ADN. En una realización de la invención, el ARN se obtiene mediante transcripción in vitro o síntesis química. La metodología de transcripción in vitro es conocida por el experto. Por ejemplo, existe una variedad de in vitro kits de transcripción disponibles comercialmente.

De acuerdo con la invención, la estabilidad y la eficacia de la traducción del ARN pueden modificarse según sea necesario. Por ejemplo, el ARN puede estabilizarse y aumentarse su traducción mediante una o más modificaciones que tengan efectos estabilizadores y/o aumenten la eficiencia de la traducción del ARN. Para aumentar la expresión del ARN utilizado de acuerdo con la presente invención, se puede modificar dentro de la región codificante, es decir, la secuencia que codifica el péptido o proteína expresado, preferiblemente sin alterar la secuencia del péptido o proteína expresado, para aumentar el contenido de GC para aumentar la estabilidad del ARNm y realizar una optimización de codones y, por tanto, mejorar la traducción en las células.

El término “modificación” en el contexto del ARN utilizado en la presente invención incluye cualquier modificación de un ARN que no esté presente de forma natural en dicho ARN.

En una forma de realización de la invención, el ARN utilizado de acuerdo con la invención no presenta 5'-trifosfatos sin rematar. La eliminación de dichos 5'-trifosfatos destapados se puede lograr tratando el ARN con una fosfatasa.

El ARN de acuerdo con la invención puede tener ribonucleótidos modificados para aumentar su estabilidad y/o disminuir su citotoxicidad. Por ejemplo, en una realización, en el ARN utilizado de acuerdo con la invención, la citidina se sustituye parcial o completamente, preferiblemente completamente, por 5-metilcitidina. Alternativa o adicionalmente, en una realización, en el ARN utilizado de acuerdo con la invención, la uridina se sustituye parcial o completamente, preferiblemente completamente, por pseudouridina.

En una realización, el término “modificación” se refiere a proporcionar un ARN con una tapa 5' o un análogo de tapa 5'. El término “tapa 5'“ se refiere a una estructura de tapa que se encuentra en el extremo 5' de una molécula de ARNm y generalmente consiste en un nucleótido de guanosina conectado al ARNm mediante un enlace trifosfato inusual de 5' a 5'. En una realización, esta guanosina está metilada en la posición 7. El término “tapa 5' convencional” se refiere a una tapa 5' de ARN de origen natural, preferiblemente al tapa de 7-metilguanosina (m7G). En el contexto de la presente invención, el término “tapa 5'“ incluye un análogo de tapa 5' que se asemeja a la estructura de la tapa del ARN y está modificado para poseer la capacidad de estabilizar el ARN y/o mejorar la traducción del ARN si está unido al mismo preferiblemente in vivo y/o en una celda.

El ARN puede comprender modificaciones adicionales. Por ejemplo, una modificación adicional del ARN utilizado en la presente invención puede ser una extensión o truncamiento de la cola poli(A) natural o una alteración de las regiones no traducidas (UTR) 5' o 3', tal como la introducción de una UTR que no está relacionada con la región codificante de dicho ARN, por ejemplo, el intercambio de la 3'-UTR existente con o la inserción de una o más, preferiblemente dos copias de una 3'-UTR derivada de un gen de globina, tales como alfa2-globina, alfa1-globina, beta-globina, preferiblemente beta-globina, más preferiblemente beta-globina humana.

El ARN que tiene una secuencia poli-A desenmascarada se traduce más eficazmente que el ARN que tiene una secuencia poli-A enmascarada. El término “cola poli(A)” o “secuencia poli-A” se refiere a una secuencia de residuos de adenilo (A) que normalmente se encuentra en el extremo 3' de una molécula de ARN y “secuencia poli-A desenmascarada” significa que la secuencia poli-A en el extremo 3' de una molécula de ARN termina con una A de la secuencia poli-A y no está seguida por nucleótidos distintos de A ubicados en el extremo 3', es decir, corriente abajo, de la secuencia poli-A. Además, una secuencia poli-A larga de aproximadamente 120 pares de bases da como resultado una estabilidad de la transcripción y una eficiencia de traducción óptimas del ARN.

Por lo tanto, para aumentar la estabilidad y/o expresión del ARN usado según la presente invención, se puede modificar para que esté presente junto con una secuencia poli-A, preferiblemente que tenga una longitud de 10 a 500, más preferiblemente de 30 a 300, aún más preferiblemente de 65 a 200 y especialmente de 100 a 150 residuos de adenosina. En una realización especialmente preferida, la secuencia poli-A tiene una longitud de aproximadamente 120 residuos de adenosina. Para aumentar aún más la estabilidad y/o la expresión del ARN utilizado de acuerdo con la invención, se puede desenmascarar la secuencia poli-A.

El término “estabilidad” del ARN se relaciona con la “vida media” del ARN. La “vida media” se refiere al período de tiempo que se necesita para eliminar la mitad de la actividad, cantidad o número de moléculas. En el contexto de la presente invención, la vida media de un ARN es indicativa de la estabilidad de dicho ARN. La vida media del ARN puede influir en la “duración de la expresión” del ARN. Se puede esperar que el ARN que tiene una vida media larga se exprese durante un período de tiempo prolongado.

Por supuesto, si según la presente invención se desea disminuir la estabilidad y/o la eficiencia de la traducción del ARN, es posible modificar el ARN para interferir con la función de los elementos como se describió anteriormente aumentando la estabilidad y/o la eficiencia de la traducción del ARN.

“Codificación” se refiere a la propiedad inherente de secuencias específicas de nucleótidos en un ácido nucleico para servir como plantillas para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen una secuencia definida de nucleótidos o una secuencia definida de aminoácidos. Por tanto, un ácido nucleico codifica una proteína si la expresión (traducción y opcionalmente transcripción) del ácido nucleico produce la proteína en una célula u otro sistema biológico.

El término “expresión” se utiliza De acuerdo con la invención en su significado más general y comprende la producción de ARN y/o péptidos o polipéptidos, por ejemplo mediante transcripción y/o traducción. Con respecto al ARN, el término “expresión” o “traducción” se refiere en particular a la producción de péptidos o polipéptidos. También comprende la expresión parcial de ácidos nucleicos. Además, la expresión puede ser transitoria o estable.

En el contexto de la presente invención, el término “transcripción” se refiere a un proceso en el que el código genético de una secuencia de ADN se transcribe en ARN. Posteriormente, el ARN puede traducirse en proteína. De acuerdo con la presente invención, el término “transcripción” comprende “transcripción in vitro”, donde el término “transcripción in vitro” se refiere a un proceso en el que el ARN, en particular el ARNm, se in vitro sintetizado en un sistema libre de células, preferiblemente usando extractos celulares apropiados. Preferiblemente, se aplican vectores de clonación para la generación de transcritos. Estos vectores de clonación se denominan generalmente vectores de transcripción y, de acuerdo con la presente invención, están abarcados por el término “vector”. De acuerdo con la presente invención, el ARN utilizado en la presente invención preferiblemente es in vitro ARN transcrito (IVT-RNA) y puede obtenerse mediante transcripción in vitro de una plantilla de ADN apropiada. El promotor para controlar la transcripción puede ser cualquier promotor de cualquier ARN polimerasa. Ejemplos particulares de ARN polimerasas son las ARN polimerasas T7, T3 y SP6. Preferiblemente, el in vitro la transcripción De acuerdo con la invención está controlada por un promotor T7 o SP6. Una plantilla de ADN para in vitro La transcripción se puede obtener clonando un ácido nucleico, en particular ADNc, e introduciéndolo en un vector apropiado para transcripción in vitro. El ADNc puede obtenerse mediante transcripción inversa de ARN.

El término “traducción” de acuerdo con la invención se refiere al proceso en los ribosomas de una célula mediante el cual una hebra de ARN mensajero dirige el ensamblaje de una secuencia de aminoácidos para formar un péptido o polipéptido.

Las secuencias de control de expresión o secuencias reguladoras, que de acuerdo con la invención pueden estar unidas funcionalmente con un ácido nucleico, pueden ser homólogas o heterólogas con respecto al ácido nucleico. Una secuencia codificante y una secuencia reguladora están unidas entre sí “funcionalmente” si están unidas covalentemente, de modo que la transcripción o traducción de la secuencia codificante está bajo el control o bajo la influencia de la secuencia reguladora. Si la secuencia codificante debe traducirse en una proteína funcional, con enlace funcional de una secuencia reguladora con la secuencia codificante, la inducción de la secuencia reguladora conduce a una transcripción de la secuencia codificante, sin provocar un cambio del marco de lectura en la secuencia codificante o incapacidad de la secuencia codificante para traducirse en la proteína o péptido deseado.

El término “secuencia de control de la expresión” o “secuencia reguladora” comprende, de acuerdo con la invención, promotores, secuencias de unión a ribosomas y otros elementos de control que controlan la transcripción de un ácido nucleico o la traducción del ARN derivado. En determinadas realizaciones de la invención, las secuencias reguladoras pueden controlarse. La estructura precisa de las secuencias reguladoras puede variar dependiendo de la especie o del tipo de célula, pero generalmente comprende secuencias 5' no transcritas y 5' y 3' no traducidas, que participan en el inicio de la transcripción o traducción, tales como Caja TATA, secuencia de limitación, secuencia CAAT y similares. En particular, las secuencias reguladoras no transcritas en 5' comprenden una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del gen funcionalmente unido. Las secuencias reguladoras también pueden comprender secuencias potenciadoras o secuencias activadoras aguas arriba.

De acuerdo con la invención, se prefiere que un ácido nucleico tal como ARN que codifica un péptido o proteína una vez absorbido o introducido, es decir transfectado o transducido, en una célula cuya célula puede estar presente in vitro o en un sujeto da como resultado la expresión de dicho péptido o proteína. La célula puede expresar el péptido o proteína codificado intracelularmente (por ejemplo, en el citoplasma y/o en el núcleo), puede secretar el péptido o proteína codificado, o puede expresarlo en la superficie.

De acuerdo con la invención, términos tales como “que expresa ácido nucleico” y “codificador de ácido nucleico” o términos similares se usan indistintamente en el presente documento y con respecto a un péptido o polipéptido particular significan que el ácido nucleico, si está presente en el entorno apropiado, preferiblemente dentro de una célula, puede expresarse para producir dicho péptido o polipéptido.

De acuerdo con la invención, se puede utilizar cualquier medio para diseñar células con el fin de aumentar el nivel celular de CFLAR. En una realización, las células se diseñan para aumentar el nivel celular de CFLAR transfectando las células con ácido nucleico que codifica un polipéptido CFLAR.

Términos tales como “transferir”, “ introducir”, “transfectar” o “transducir” se usan indistintamente en el presente documento y se relacionan con la introducción de ácidos nucleicos, en particular ácidos nucleicos exógenos o heterólogos, tales como ARN en una célula. De acuerdo con la presente invención, la célula puede estar presente in vitro o en vivo, por ejemplo, la célula puede formar parte de un órgano, un tejido y/o un organismo. De acuerdo con la invención, la transfección puede ser transitoria o estable. Para algunas aplicaciones de transfección, es suficiente que el material genético transfectado se exprese sólo de forma transitoria. Dado que el ácido nucleico introducido en el proceso de transfección normalmente no está integrado en el genoma nuclear, el ácido nucleico extraño se diluirá mediante mitosis o se degradará. Las líneas celulares que permiten la amplificación episomal de ácidos nucleicos reducen en gran medida la tasa de dilución. Si se desea que el ácido nucleico transfectado permanezca realmente en el genoma de la célula y sus células hijas, debe producirse una transfección estable. El ARN se puede transfectar en células para expresar transitoriamente su proteína codificada.

El término “proteína inhibidora de FLICE celular [dominio de muerte asociado a Fas (FADD) similar a enzima convertidora IL-1p]”, “proteína inhibidora de FLICE celular”, “CFLAR” o “c-FLIP” es un regulador maestro antiapoptótico y factor de resistencia que suprime la apoptosis inducida por el factor de necrosis tumoral a (TNF-a), Fas-L y el ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (TRAIL), así como la apoptosis desencadenada por agentes de quimioterapia en células malignas. CFLAR se expresa como (CFLAR<l>) largo, (CFLAR) corto y variantes de empalme CFLAR<r>en células humanas. CFLAR se une a FADD y/o caspasa-8 o -10 y al receptor TRAIL 5 (DR5) de forma dependiente e independiente del ligando y forma un complejo inhibidor de la apoptosis (AIC). Esta interacción, a su vez, previene la formación del complejo de señalización inductor de muerte (DISC) y la posterior activación de la cascada de caspasas. También se sabe que los CFLAR<l>y CFLARs tienen funciones multifuncionales en diversas vías de señalización, además de activar y/o regular positivamente varias proteínas de señalización citoprotectoras y de supervivencia, incluidas Akt, ERK y NF-kB. De acuerdo con la invención, el término “CFLAR” incluye cualquier variante, en particular mutantes, variantes de empalme, conformaciones, isoformas, variantes alélicas, variantes de especies y homólogos de especies, en particular aquellos que están presentes de forma natural, y comprende CFLAR<l>, CFLARs, CFLAR<r>y v-CFLAR.

El término “CFLAR<l>” preferentemente se refiere a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 1 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos. En una realización, la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 1 del listado de secuencias está codificada por la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID NO: 2 del listado de secuencias.

El término “CFLARs” se refiere preferiblemente a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 3 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos. En una realización, la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 3 del listado de secuencias está codificada por la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID NO: 4 del listado de secuencias.

El término “CFLAR<r>” preferentemente se refiere a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 5 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos. En una realización, la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 5 del listado de secuencias está codificada por la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID NO: 6 del listado de secuencias.

El término “v-CFLAR” se refiere preferiblemente a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 7 del listado de secuencias o una variante de dicha secuencia de aminoácidos. En una realización, la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 7 del listado de secuencias está codificada por la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID NO: 8 del listado de secuencias.

De acuerdo con la presente invención, el término “péptido” se refiere a sustancias que comprenden dos o más, preferiblemente 3 o más, preferiblemente 4 o más, preferiblemente 6 o más, preferiblemente 8 o más, preferiblemente 10 o más, preferiblemente 13 o más, preferiblemente 16 más, preferentemente 21 o más y hasta preferentemente 8, 10, 20, 30, 40 ó 50, en particular 100 aminoácidos unidos covalentemente mediante enlaces peptídicos.

El término “proteína” se refiere a péptidos grandes, es decir, polipéptidos, preferiblemente a péptidos con más de 100 residuos de aminoácidos, pero en general los términos “péptido”, “polipéptido” y “proteína” son sinónimos y se usan indistintamente en el presente documento.

La presente invención también incluye “variantes” de los péptidos, proteínas o secuencias de aminoácidos descritos en el presente documento.

Para los fines de la presente invención, las “variantes” de una secuencia de aminoácidos comprenden variantes de inserción de aminoácidos, variantes de adición de aminoácidos, variantes de deleción de aminoácidos y/o variantes de sustitución de aminoácidos.

Las variantes de inserción de aminoácidos comprenden inserciones de uno o dos o más aminoácidos en una secuencia de aminoácidos particular. En el caso de variantes de secuencia de aminoácidos que tienen una inserción, se insertan uno o más residuos de aminoácidos en un sitio particular en una secuencia de aminoácidos, aunque también es posible una inserción aleatoria con un cribado apropiado del producto resultante.

Las variantes de adición de aminoácidos comprenden fusiones amino y/o carboxi terminales de uno o más aminoácidos, tales como 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 o más aminoácidos.

Las variantes de deleción de aminoácidos se caracterizan por la eliminación de uno o más aminoácidos de la secuencia, tal como por la eliminación de 1,2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 o más aminoácidos. Las eliminaciones pueden estar en cualquier posición de la proteína. Las variantes de deleción de aminoácidos que comprenden la deleción en el extremo terminal N y/o terminal C de la proteína también se denominan variantes de truncamiento terminal N y/o terminal C.

Las variantes de sustitución de aminoácidos se caracterizan por la eliminación de al menos un residuo de la secuencia y la inserción de otro residuo en su lugar. Se prefieren las modificaciones en posiciones de la secuencia de aminoácidos que no están conservadas entre proteínas o péptidos homólogos y/o la sustitución de aminoácidos por otros que tengan propiedades similares. Preferiblemente, los cambios de aminoácidos en variantes de proteínas son cambios de aminoácidos conservadores, es decir, sustituciones de aminoácidos cargados o no cargados de manera similar. Un cambio de aminoácido conservador implica la sustitución de uno de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos naturales generalmente se dividen en cuatro familias: ácidos (aspartato, glutamato), básicos (lisina, arginina, histidina), no polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) y no cargados. Aminoácidos polares (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina). La fenilalanina, el triptófano y la tirosina a veces se clasifican conjuntamente como aminoácidos aromáticos.

Preferiblemente, el grado de similitud, preferiblemente identidad, entre una secuencia de aminoácidos dada y una secuencia de aminoácidos que es una variante de dicha secuencia de aminoácidos dada será al menos aproximadamente 60 %, 65 %, 70 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %. El grado de similitud o identidad se proporciona preferiblemente para una región de aminoácidos que es al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90% o aproximadamente el 100% de la longitud total de la secuencia de aminoácidos de referencia. Por ejemplo, si la secuencia de aminoácidos de referencia consta de 200 aminoácidos, el grado de similitud o identidad se proporciona preferiblemente para al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 120, al menos aproximadamente 140, al menos aproximadamente 160, al menos aproximadamente 180 o aproximadamente 200 aminoácidos, preferiblemente aminoácidos continuos. El grado de similitud o identidad se indica preferentemente para un segmento de al menos 80, al menos 100, al menos 120, al menos 150, al menos 180, al menos 200 o al menos 250 aminoácidos. En realizaciones preferidas, el grado de similitud o identidad se proporciona para toda la longitud de la secuencia de aminoácidos de referencia. La alineación para determinar la similitud de secuencia, preferiblemente la identidad de secuencia, se puede realizar con herramientas conocidas en la técnica, preferiblemente usando la mejor alineación de secuencia, por ejemplo, usando Align, usando configuraciones estándar, preferiblemente EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5.

“Similitud de secuencia” indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos o que representan sustituciones de aminoácidos conservadoras. La “ identidad de secuencia” entre dos secuencias de aminoácidos indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos entre las secuencias.

El término “ identidad porcentual” pretende designar un porcentaje de residuos de aminoácidos idénticos entre las dos secuencias a comparar, obtenido después del mejor alineamiento, siendo este porcentaje puramente estadístico y distribuyéndose las diferencias entre las dos secuencias aleatoriamente y en toda su longitud. Las comparaciones de secuencias entre dos secuencias de aminoácidos se llevan a cabo convencionalmente comparando estas secuencias después de haberlas alineado de manera óptima, realizándose dicha comparación por segmento o por “ventana de comparación” para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. El alineamiento óptimo de las secuencias a comparar puede producirse, además de manualmente, mediante el algoritmo de homología local de Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, mediante el algoritmo de homología local de Neddleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, mediante el método de búsqueda por similitud de Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA85, 2444, o mediante programas informáticos que utilizan estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N and TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).

El porcentaje de identidad se calcula determinando el número de posiciones idénticas entre las dos secuencias que se comparan, dividiendo este número por el número de posiciones comparadas y multiplicando el resultado obtenido por 100 para obtener el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias.

Las secuencias de aminoácidos homólogas presentan de acuerdo con la invención al menos el 40 %, en particular al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % y preferentemente al menos el 95 %, al menos el 98 % o al menos 99 % de identidad de los residuos de aminoácidos.

Las variantes de secuencia de aminoácidos descritas en el presente documento pueden ser preparadas fácilmente por un experto, por ejemplo, mediante manipulación de ADN recombinante. La manipulación de secuencias de ADN para preparar péptidos o proteínas que tienen sustituciones, adiciones, inserciones o eliminaciones se describe en detalle en Sambrook et al. (1989), por ejemplo. Además, los péptidos y variantes de aminoácidos descritos en el presente documento pueden prepararse fácilmente con la ayuda de técnicas de síntesis de péptidos conocidas tales como, por ejemplo, mediante síntesis en fase sólida y métodos similares.

La invención incluye derivados de los péptidos o proteínas descritos en el presente documento que están comprendidos por los términos “péptido” y “proteína”. De acuerdo con la invención, los “derivados” de proteínas y péptidos son formas modificadas de proteínas y péptidos. Dichas modificaciones incluyen cualquier modificación química y comprenden sustituciones, eliminaciones y/o adiciones únicas o múltiples de cualquier molécula asociada con la proteína o péptido, tales como carbohidratos, lípidos y/o proteínas o péptidos. En una realización, los “derivados” de proteínas o péptidos incluyen aquellos análogos modificados que resultan de glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, palmitoilación, miristoilación, isoprenilación, lipidación, alquilación, derivatización, introducción de grupos protectores/bloqueantes, escisión proteolítica o unión a un anticuerpo o a otro ligando celular. El término “derivado” también se extiende a todos los equivalentes químicos funcionales de dichas proteínas y péptidos. Preferiblemente, un péptido modificado tiene una mayor estabilidad y/o una mayor inmunogenicidad.

De acuerdo con la invención, una variante o derivado de un péptido o proteína tiene preferiblemente una propiedad funcional del péptido o proteína del que se deriva. Preferiblemente, una variante o derivado de una proteína CFLAR tiene la misma propiedad o similar que la proteína CFLAR de la que se deriva.

El término “derivado” significa De acuerdo con la invención que una entidad particular, en particular una secuencia particular, está presente en el objeto del cual se deriva, en particular un organismo o molécula. En el caso de secuencias de aminoácidos, especialmente regiones de secuencia particulares, “derivado” significa en particular que la secuencia de aminoácidos relevante se deriva de una secuencia de aminoácidos en la que está presente.

El término “célula” o “célula huésped” es preferiblemente una célula intacta, es decir, una célula con una membrana intacta que no ha liberado sus componentes intracelulares normales tales como enzimas, orgánulos o material genético. Una célula intacta es preferentemente una célula viable, es decir, una célula viva capaz de llevar a cabo sus funciones metabólicas normales. Preferiblemente, dicho término se refiere De acuerdo con la invención a cualquier célula que pueda transformarse o transfectarse con un ácido nucleico exógeno. El término “célula” incluye De acuerdo con la invención células procariotas (por ejemplo, E. coli) o células eucariotas (por ejemplo, células dendríticas, células B, células CHO, células COS, células K562, células HEK293, células HELA, células de levadura y células de insectos). El ácido nucleico exógeno puede encontrarse dentro de la célula (i) libremente disperso como tal, (ii) incorporado en un vector recombinante, o (iii) integrado en el genoma de la célula huésped o en el ADN mitocondrial. Se prefieren especialmente células de mamíferos, como células de seres humanos, ratones, hámsteres, cerdos, cabras y primates. Las células pueden derivar de una gran cantidad de tipos de tejidos e incluyen células primarias y líneas celulares.

Una célula que comprende un ácido nucleico, por ejemplo que ha sido transfectada con un ácido nucleico, expresa preferiblemente el péptido o proteína codificado por el ácido nucleico.

El término “expansión” se refiere a un proceso en el que se multiplica una entidad específica. En una realización de la presente invención, el término se usa en el contexto de una respuesta inmunológica en la que los linfocitos son estimulados por un antígeno, proliferan y el linfocito específico que reconoce dicho antígeno se amplifica. Preferiblemente, la expansión clonal conduce a la diferenciación de los linfocitos.

Las células tolerogénicas o inmunosupresoras descritas en el presente documento (ya sea generadas in vitro para administración a un sujeto o generado en el lugar en un sujeto, por ejemplo, mediante la administración de un ácido nucleico que codifica CFLAR) son útiles en métodos de supresión de una respuesta inmunitaria en un mamífero para el tratamiento o prevención de una enfermedad inmunitaria o una enfermedad inflamatoria, o rechazo de trasplantes que incluyen órganos, tejidos, trasplante de células y/o proteínas. Sin desear estar ligado a ninguna teoría particular, las células tolerogénicas o inmunosupresoras que se administran al paciente o se forman en el lugar en el paciente inhibe la activación y proliferación de las células T del paciente.

Las células tolerogénicas o inmunosupresoras son útiles para evitar o suprimir los efectos secundarios resultantes de la respuesta inmunitaria del paciente montada contra la proteína administrada al paciente (opcionalmente mediante la expresión de un ácido nucleico administrado a un paciente), lo que por lo tanto disminuye la eficacia y seguridad de la proteína. Las terapias proteicas incluyen, entre otras, anticuerpos monoclonales, enzimas, citocinas y toxinas.

Además, las células tolerogénicas o inmunosupresoras son útiles para reducir y/o eliminar una respuesta inmunitaria a un trasplante en un receptor administrando o generando en el receptor del trasplante una cantidad de células tolerogénicas o inmunosupresoras eficaces para reducir o inhibir el rechazo del huésped del trasplante. El trasplante puede incluir una red biocompatible o un tejido, órgano, célula o molécula de un donante a trasplantar. Un ejemplo de trasplante puede incluir, pero no limitado a, células o tejido de la piel, médula ósea y órganos sólidos como corazón, páncreas, riñón, pulmón e hígado. En algunos casos, el trasplante es un ácido nucleico o una proteína. Según la divulgación proporcionada en el presente documento, las células mieloides o sus células progenitoras se pueden obtener de cualquier fuente, por ejemplo, del donante del trasplante, del receptor del trasplante o de otra fuente no relacionada (un individuo o especie completamente diferente). Las células tolerogénicas o inmunosupresoras preferiblemente se administran o se generan en el receptor antes o simultáneamente con un trasplante para reducir y/o eliminar el rechazo del trasplante por parte del huésped. En otra realización más, las células tolerogénicas o inmunosupresoras pueden administrarse o generarse en el receptor del trasplante después de la administración del trasplante.

La presente divulgación se refiere al uso de células tolerogénicas o inmunosupresoras como terapia para inhibir la enfermedad de injerto contra huésped después del trasplante. En esta divulgación, la presente invención abarca un método para poner en contacto un trasplante de donante con células tolerogénicas o inmunosupresoras antes del trasplante a un receptor. Las células tolerogénicas o inmunosupresoras sirven para mejorar, inhibir o reducir una respuesta adversa del donante trasplantado contra el receptor. Las células tolerogénicas o inmunosupresoras se pueden obtener de cualquier fuente, por ejemplo, del donante del trasplante, del receptor del trasplante o de otra fuente no relacionada (un individuo o especie completamente diferente) para el uso de eliminar o reducir una respuesta inmunitaria no deseada mediante un trasplante. contra un receptor del trasplante. De acuerdo con lo anterior, las células tolerogénicas o inmunosupresoras pueden ser autólogas, alogénicas o xenogénicas para el donante del trasplante, el receptor del trasplante o una fuente no relacionada de otro modo. Preferiblemente, un receptor de trasplante que padece enfermedad de injerto contra huésped o que corre el riesgo de sufrir enfermedad de injerto contra huésped puede tratarse administrando las células tolerogénicas o inmunosupresoras al receptor o generando las células tolerogénicas o inmunosupresoras en el receptor para reducir, inhibir o eliminar la gravedad de la enfermedad de injerto contra huésped. Preferiblemente, las células tolerogénicas o inmunosupresoras pueden obtenerse del receptor antes del trasplante y pueden almacenarse y/o expandirse en cultivo para proporcionar una reserva de células tolerogénicas o inmunosupresoras en cantidades suficientes para tratar una reacción injerto contra huésped en curso. Sin embargo, como se analiza en otra parte del presente documento, las células tolerogénicas o inmunosupresoras se pueden obtener de cualquier fuente, por ejemplo, del donante del trasplante, del receptor del trasplante o de una fuente no relacionada (un individuo o especie completamente diferente).

Con base en la divulgación en el presente documento, se prevé que las células tolerogénicas o inmunosupresoras descritas en el presente documento se puedan usar junto con los modos de tratamiento actuales, por ejemplo el uso de terapia con fármacos inmunosupresores para el tratamiento del rechazo del huésped al tejido del donante o enfermedad de injerto contra huésped. Una ventaja de usar células tolerogénicas o inmunosupresoras junto con fármacos inmunosupresores en trasplantes es que al usar células tolerogénicas o inmunosupresoras para mejorar la gravedad de la respuesta inmunitaria en un receptor de trasplante, la cantidad de terapia con fármacos inmunosupresores utilizada y/o la frecuencia de Se puede reducir la administración de terapia con medicamentos inmunosupresores. Un beneficio de reducir el uso de la terapia con medicamentos inmunosupresores es el alivio de la supresión inmune general y los efectos secundarios no deseados asociados con la terapia con medicamentos inmunosupresores.

En el presente documento se describe, en particular, un método para prevenir o tratar el rechazo de trasplantes y/o la enfermedad de injerto contra huésped mediante la administración a un paciente o generando en un paciente células tolerogénicas o inmunosupresoras descritas en el presente documento en una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz para la prevención, tratamiento o mejora del rechazo del huésped del trasplante y/o enfermedad de injerto contra huésped. De acuerdo con la presente divulgación, una cantidad terapéuticamente eficaz de células tolerogénicas o inmunosupresoras es una cantidad que inhibe o disminuye el número de células T activadas, en comparación con el número de células T activadas en ausencia de la administración de células tolerogénicas o inmunosupresoras. En la situación de rechazo del trasplante por parte del huésped, una cantidad eficaz de células tolerogénicas o inmunosupresoras es una cantidad que inhibe o disminuye el número de células T activadas en el receptor del trasplante en comparación con el número de células T activadas en el receptor antes de la administración de células tolerogénicas o inmunosupresoras. En el caso de la enfermedad de injerto contra huésped, una cantidad eficaz de células tolerogénicas o inmunosupresoras es una cantidad que inhibe o disminuye el número de células T activadas presentes en el trasplante.

Se puede determinar una cantidad eficaz de células tolerogénicas o inmunosupresoras comparando el número de células T activadas en un receptor o en un trasplante antes de la administración de células tolerogénicas o inmunosupresoras al mismo, con el número de células T activadas presentes en el receptor o trasplante. tras la administración de células tolerogénicas o inmunosupresoras al mismo. Una disminución, o la ausencia de un aumento, en el número de células T activadas en el receptor del trasplante o en el propio trasplante que está asociado con la administración de células tolerogénicas o inmunosupresoras al mismo, indica que el número de células tolerogénicas o se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de células tolerogénicas inmunosupresoras o inmunosupresoras.

En lugar de administrar células tolerogénicas o inmunosupresoras a un paciente, la invención también puede usarse para expresar CFLAR en células de un mamífero para generar células tolerogénicas o inmunosupresoras en el mamífero. Este aspecto de la invención se refiere a un tipo de terapia génica en la que se administran proteínas terapéuticas a un mamífero mediante la introducción de un ácido nucleico que las codifica en células de un mamífero. En todos los casos en los que se transfecta un ácido nucleico en una célula, la secuencia de ácido nucleico que codifica CFLAR está unida operativamente a secuencias reguladoras necesarias para lograr la expresión de la secuencia de ácido nucleico en la célula. La construcción de ácido nucleico se proporciona preferiblemente como un vector de expresión que incluye la secuencia codificante para CFLAR unida operativamente a secuencias reguladoras esenciales de modo que cuando el vector se transfecte en la célula, la célula expresará la secuencia codificante. La secuencia codificante está operativamente unida a los elementos reguladores necesarios para la expresión de esa secuencia en las células. El ácido nucleico que codifica CFLAR puede ser ADNc, ADN genómico, ADN sintetizado o un híbrido del mismo o una molécula de ARN tal como ARNm.

La construcción de ácido nucleico incluye la secuencia de nucleótidos que codifica CFLAR unida operativamente a los elementos reguladores y puede permanecer presente en la célula como una molécula citoplasmática funcional, una molécula episomal funcional o puede integrarse en el ADN cromosómico de la célula. Se puede introducir material genético exógeno en las células donde permanece como material genético separado en forma de plásmido.

Alternativamente, se puede introducir en la célula ADN lineal que pueda integrarse en el cromosoma. Al introducir ADN en la célula, se pueden agregar reactivos que promuevan la integración del ADN en los cromosomas. También pueden incluirse en la molécula de ADN secuencias de ADN que son útiles para promover la integración. Alternativamente, se puede introducir ARN en la célula.

El enfoque básico de usar células tolerogénicas o inmunosupresoras de la invención para inducir tolerancia tiene una aplicación amplia como complemento de terapias que utilizan una molécula potencialmente inmunogénica con fines terapéuticos. Por ejemplo, un número cada vez mayor de enfoques terapéuticos utilizan una molécula proteica, tal como un anticuerpo, una proteína de fusión o similares, para el tratamiento de un trastorno clínico. Una limitación al uso terapéutico de tales moléculas es que pueden provocar una respuesta inmunitaria dirigida contra la molécula terapéutica en el sujeto que está siendo tratado (por ejemplo, la eficacia del Factor VIII en sujetos humanos se ve obstaculizada por la inducción de una respuesta inmunitaria contra el Factor VIII en el sujeto humano). La presente invención es una mejora de la terapia proteica convencional en el contexto de inducir tolerancia contra la molécula administrada.

La administración de células tolerogénicas o inmunosupresoras de la invención para inhibir las respuestas de las células T se puede aplicar a estas situaciones terapéuticas para permitir el uso a largo plazo de la molécula terapéutica en el sujeto sin provocar una respuesta inmunitaria.

De acuerdo con la invención, el término “enfermedad” o “trastorno” se refiere a cualquier estado patológico.

El término “enfermedad inflamatoria” se refiere a cualquier enfermedad que se caracteriza o está asociada con altos niveles de inflamación en los tejidos, en particular tejidos conectivos, o degeneración de estos tejidos. Una enfermedad inflamatoria crónica es una afección médica que se caracteriza por una inflamación persistente. Ejemplos de enfermedades inflamatorias (crónicas) incluyen enfermedad celíaca, vasculitis, lupus, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedad del intestino irritable, aterosclerosis, artritis, espondilitis anquilosante, enfermedad de Crohn, colitis, hepatitis crónica activa, dermatitis y psoriasis.

El término “enfermedad inmunitaria” o “trastorno autoinmune” se refiere a cualquier enfermedad/trastorno en el que el cuerpo produce una respuesta inmunogénica (es decir, sistema inmunitario) a algún constituyente de su propio tejido. En otras palabras, el sistema inmunitario pierde su capacidad de reconocer algún tejido o sistema dentro del cuerpo como propio y lo ataca como si fuera extraño. Las enfermedades autoinmunitarias se pueden clasificar en aquellas en las que predominantemente un órgano está afectado (por ejemplo, anemia hemolítica y tiroiditis autoinmune) y aquellas en las que el proceso de la enfermedad inmunitaria se difunde a través de muchos tejidos (por ejemplo, lupus eritematoso sistémico). Por ejemplo, se considera que la esclerosis múltiple es causada por células T que atacan las vainas que rodean las fibras nerviosas del cerebro y la médula espinal. Esto resulta en pérdida de coordinación, debilidad y visión borrosa. Ejemplos de enfermedades autoinmunitarias incluyen, entre otras, enfermedad de Addision, alopecia areata, espondilitis anquilosante, hepatitis autoinmune, parotiditis autoinmune, enfermedad de Crohn, diabetes (Tipo I), epidermólisis ampollosa distrófica, epididimitis, glomerulonefritis, enfermedad de Graves, enfermedad de Síndrome de Guillain-Barr, enfermedad de Hashimoto, anemia hemolítica, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, miastenia gravis, pénfigo vulgar, psoriasis, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, espondiloartropatías, tiroiditis, vasculitis, vitíligo, mixedema, anemia perniciosa, colitis ulcerosa y diabetes mellitus tipo I, entre otras.

“Trasplante” se refiere a una red biocompatible o un tejido, órgano o célula de un donante, a trasplantar. Un ejemplo de trasplante puede incluir, pero no limitado a, células o tejido de la piel, médula ósea y órganos sólidos como corazón, páncreas, riñón, pulmón e hígado. Un trasplante también puede referirse a cualquier material que se vaya a administrar a un huésped. Por ejemplo, un trasplante puede referirse a un ácido nucleico o una proteína.

El término “rechazo de trasplante” se refiere al rechazo de un trasplante, tal como un tejido u órgano trasplantado, por parte del sistema inmunitario del receptor, que, en última instancia, puede destruir el trasplante.

El término “enfermedad de injerto contra huésped” o “GvHD”, tal como se utiliza en el presente documento, se define como una afección en un mamífero, incluidos los seres humanos, que se produce cuando se introducen, trasplantan o injertan células alogénicas inmunológicamente activas, tales como las de la médula ósea o el bazo, en un huésped que produce una reacción grave, incluso fatal, debido a inmunoincompatibilidad entre el huésped y el injerto en el que las células inmunocompetentes del injerto atacan inmunológicamente al huésped.

Por “tratar” se entiende administrar un agente o composición como se describe en el presente documento a un sujeto con el fin de prevenir o eliminar una enfermedad, incluyendo detener o retardar una enfermedad en un sujeto; inhibir o retardar el desarrollo de una nueva enfermedad en un sujeto; disminuir la frecuencia o gravedad de los síntomas y/o recurrencias en un sujeto que actualmente tiene o que ha tenido previamente una enfermedad; y/o prolongar, es decir, aumentar la vida útil del sujeto. En particular, el término “tratamiento de una enfermedad” incluye curar, acortar la duración, mejorar, prevenir, ralentizar o inhibir la progresión o el empeoramiento, o prevenir o retrasar la aparición de una enfermedad o los síntomas de la misma.

Por “estar en riesgo” se entiende un sujeto, es decir, un paciente, que se identifica con una probabilidad mayor de lo normal de desarrollar una enfermedad en comparación con la población general. Además, un sujeto que ha tenido, o que actualmente tiene, una enfermedad es un sujeto que tiene un mayor riesgo de desarrollar una enfermedad, ya que dicho sujeto puede continuar desarrollando una enfermedad. Además, un sujeto que ha recibido o recibirá un trasplante es un sujeto que tiene un mayor riesgo de desarrollar GvHD.

En el contexto de la presente invención, términos tales como “proteger”, “prevenir”, “profiláctico”, “preventivo” o “protector” se relacionan con la prevención o el tratamiento o ambos de la aparición y/o propagación de una enfermedad en un sujeto y, en particular, a minimizar la posibilidad de que un sujeto desarrolle una enfermedad o a retrasar el desarrollo de una enfermedad. Por ejemplo, una persona en riesgo de padecer una enfermedad sería candidata a recibir una terapia para prevenir una enfermedad.

Una administración profiláctica de un agente o composición descrita en el presente documento, preferiblemente protege al receptor del desarrollo de una enfermedad. Una administración terapéutica de un agente o composición descrito en el presente documento puede conducir a la inhibición del progreso/crecimiento de la enfermedad. Esto comprende la desaceleración del progreso/crecimiento de la enfermedad, en particular una interrupción del progreso de la enfermedad, que conduce preferiblemente a la eliminación de la enfermedad.

Los agentes y composiciones proporcionados en el presente documento se pueden usar solos o en combinación con regímenes terapéuticos convencionales tales como cirugía, irradiación, quimioterapia y/o trasplante de médula ósea (autólogo, singénico, alogénico o no relacionado).

El término “en vivo” Se relaciona con la situación de un sujeto.

Los términos “sujeto”, “ individuo”, “organismo” o “paciente” se usan indistintamente y se relacionan con vertebrados, preferiblemente mamíferos. Por ejemplo, los mamíferos en el contexto de la presente invención son humanos, primates no humanos, animales domésticos tales como perros, gatos, ovejas, vacas, cabras, cerdos, caballos, etc., animales de laboratorio tales como ratones, ratas, conejos, conejillos de indias, cerdos, etc. así como animales en cautiverio como animales de zoológicos. El término “animal”, tal como se utiliza en el presente documento, también incluye a los humanos. El término “sujeto” también puede incluir un paciente, es decir, un animal, preferiblemente un ser humano que tiene una enfermedad, preferiblemente una enfermedad como se describe en el presente documento.

El término “autólogo” se utiliza para describir cualquier cosa que se derive del mismo tema. Por ejemplo, “trasplante autólogo” se refiere a un trasplante de tejido u órganos derivados del mismo sujeto. Tales procedimientos son ventajosos porque superan la barrera inmunológica que, de otro modo, daría lugar al rechazo.

El término “alogénico” se utiliza para describir cualquier cosa que se derive de diferentes individuos de la misma especie. Se dice que dos o más individuos son alogénicos entre sí cuando los genes en uno o más loci no son idénticos.

El término “singénico” se utiliza para describir cualquier cosa que se derive de individuos o tejidos que tienen genotipos idénticos, es decir, gemelos idénticos o animales de la misma cepa endogámica, o sus tejidos.

El término “heterólogo” se utiliza para describir algo que consta de múltiples elementos diferentes. Por ejemplo, la transferencia de la médula ósea de un individuo a otro individuo constituye un trasplante heterólogo. Un gen heterólogo es un gen derivado de una fuente distinta del sujeto.

Los agentes y composiciones descritos en el presente documento pueden administrarse mediante cualquier vía convencional, incluso mediante inyección o infusión. La administración puede realizarse, por ejemplo, por vía oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea o transdérmica. En particular, las células descritas en el presente documento pueden administrarse sistémicamente, es decir, parenteralmente, mediante inyección intravenosa o pueden dirigirse a un tejido u órgano particular, tal como la médula ósea. Además, las células se pueden administrar mediante implantación subcutánea de células o mediante inyección de células en tejido conectivo, por ejemplo, músculo.

Los agentes y composiciones descritos en el presente documento se administran en cantidades eficaces. Una “cantidad eficaz” se refiere a la cantidad que logra una reacción deseada o un efecto deseado, por ejemplo, un nivel detectable de inmunosupresión o tolerancia, solo o junto con dosis adicionales. En el caso del tratamiento de una enfermedad particular o de una condición particular, la reacción deseada se refiere preferiblemente a la inhibición del curso de la enfermedad. Esto comprende frenar el progreso de la enfermedad y, en particular, interrumpir o invertir el progreso de la enfermedad. La reacción deseada en un tratamiento de una enfermedad o de una afección también puede ser un retraso de la aparición o una prevención de la aparición de dicha enfermedad o dicha afección.

Una cantidad eficaz de un agente o composición descrita en el presente documento dependerá de la afección a tratar, la gravedad de la enfermedad, los parámetros individuales del paciente, incluyendo la edad, la condición fisiológica, el tamaño y el peso, la duración del tratamiento, el tipo de una terapia de acompañamiento (si está presente), la vía de administración específica y factores similares. Por consiguiente, las dosis administradas de los agentes y composiciones descritos en el presente documento pueden depender de varios de dichos parámetros. En el caso de que una reacción en un paciente sea insuficiente con una dosis inicial, se pueden usar dosis más altas (o dosis efectivamente más altas logradas mediante una vía de administración diferente y más localizada).

Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento son preferentemente estériles y contienen una cantidad eficaz de la sustancia terapéuticamente activa para generar la reacción deseada o el efecto deseado.

Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento generalmente se administran en cantidades farmacéuticamente compatibles y en preparaciones farmacéuticamente compatibles. El término “farmacéuticamente compatible” se refiere a un material no tóxico que no interactúa con la acción del componente activo de la composición farmacéutica. Los preparados de este tipo pueden contener normalmente sales, sustancias tampón, conservantes, vehículos y, dado el caso, otros compuestos terapéuticamente activos. Cuando se utilizan en medicina, las sales deben ser farmacéuticamente compatibles. Sin embargo, se pueden usar sales que no son farmacéuticamente compatibles para preparar sales farmacéuticamente compatibles y están incluidas en la invención. Las sales farmacológica y farmacéuticamente compatibles de este tipo comprenden de forma no limitativa aquellas preparadas a partir de los siguientes ácidos: ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, cítrico, fórmico, malónico, succínico y similares. También se pueden preparar sales farmacéuticamente compatibles como sales de metales alcalinos o sales de metales alcalinotérreos, tales como sales de sodio, sales de potasio o sales de calcio.

Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden comprender un vehículo farmacéuticamente compatible. El término “portador” se refiere a un componente orgánico o inorgánico, de naturaleza natural o sintética, en el que el componente activo se combina para facilitar la aplicación. De acuerdo con la invención, el término “vehículo farmacéuticamente compatible” incluye uno o más rellenos, diluyentes o sustancias encapsulantes sólidos o líquidos compatibles, que son adecuados para la administración a un paciente. Los componentes de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento suelen ser tales que no se produce ninguna interacción que perjudique sustancialmente la eficacia farmacéutica deseada.

Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden contener sustancias tampón adecuadas tales como ácido acético en una sal, ácido cítrico en una sal, ácido bórico en una sal y ácido fosfórico en una sal.

Las composiciones farmacéuticas pueden contener también, dado el caso, conservantes adecuados tales como cloruro de benzalconio, clorobutanol, parabeno y timerosal.

Las composiciones farmacéuticas normalmente se proporcionan en una forma de dosificación uniforme y pueden prepararse de una manera conocida per se. Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden estar en forma de cápsulas, comprimidos, pastillas, soluciones, suspensiones, jarabes, elixires o en forma de una emulsión, por ejemplo.

Las composiciones adecuadas para administración parenteral normalmente comprenden una preparación acuosa o no acuosa estéril del compuesto activo, que es preferiblemente isotónica para la sangre del receptor. Ejemplos de vehículos y disolventes compatibles son la solución de Ringer y la solución isotónica de cloruro de sodio. Además, como medio de solución o suspensión se utilizan aceites fijos, normalmente estériles.

La presente invención se ilustra mejor mediante los siguientes ejemplos que no deben considerarse limitativos del alcance de la invención.

Ejemplos

Las técnicas y métodos utilizados en el presente documento se describen en el presente documento o se llevan a cabo de una manera conocida per se y como se describe, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. Todos los métodos, incluido el uso de kits y reactivos, se llevan a cabo según la información del fabricante, a menos que se indique específicamente.

Ejemplo 1: La transducción de células madre humanas (células CD34+) y monocitos (células CD14+) con lentivirus específicos que codifican CFLAR<l>y CFLARs promueven un fenotipo inmunosupresor.

Creamos dos construcciones de plásmidos que contienen las secuencias de CFLAR<l>(Figura 1A) o CFLARs (Figura 1B). Las dos construcciones contenían un gen informador: una proteína verde fluorescente (GFP) con función de seguimiento y marcador. Para la producción de proteínas lentivirales recombinantes se utilizó el método de precipitación con cloruro de calcio. Brevemente, la empresa Takara (Takara Clontech, CA, EE. UU.) adquirió los vectores plásmidos que codifican proteínas clave para el ensamblaje del virus. Cloruro de calcio CaCh (2 mM) a la solución que contiene el vector pGp, el vector pE-eco y el vector que codifica CFLAR<l>.<o>CFLARs o luciferasa (como control) (25 |jg). Posteriormente, el tampón HBS 2X (NaCh 274 mM, KCl 10 mM, Na2HPO4 1.5 mM, dextrosa l2 mM, Hepes 42 mM, pH 7.1) se añadió con agitación. Luego se añadió gota a gota la mezcla de transfección a la placa de cultivo de células 293T y el medio que contenía las partículas virales se recogió después de 48 horas, se centrifugó y se filtró en filtros con poros de 0.45 |jm para eliminar las células y los restos y se concentró mediante ultracentrifugación a 50,000 g durante 140 minutos a temperatura ambiente. La infección se llevó a cabo mediante inoculación por rotación: las células (células madre humanas o monocitos) se colocaron en un rotor de cubeta oscilante de placas de múltiples pocillos y se colocaron en una centrífuga; la placa se hizo girar a 2500 rpm durante 4 horas a 30 °C. Después de este paso, configuramos ensayos inmunosupresores. En el caso de las células madre humanas (Bone Marrow CD34 células, 1 millón, cat. 2M-101C, Lonza, Suiza), las células CD34+ infectadas se diferenciaron in vitro en presencia de G-CSF (40 ng/ml; Miltenyi Biotec Srl, Italia) y<g>M-CSF (40 ng/ml, Miltenyi Biotec Srl, Italia) durante cuatro días para promover la adquisición de actividad inmunosupresora relacionada con m Ds C. Después de cuatro días, las células se recuperaron y se cultivaron conjuntamente en presencia de PBMC marcadas con trazas de células activadas (Figura 2A, panel izquierdo). Brevemente, las PBMC se recuperaron y se lavaron en medio IMDM (Lonza, Suiza), suplementado con 10% de FBS (EuroClone, Italia), 100 U/ml de penicilina/estreptomicina (Lonza, Suiza), pmercaptoetanol (Sigma-Aldrich, Italia) y HEPES 10 mM (Lonza, Suiza). Las PBMC se resuspendieron a una concentración final de 107 células/ml en PBS y se tiñeron con 2.5 jM como concentración de trabajo final de solución madre Cell Trace Violet (Invitrogen Molecular Probe, Reino Unido), seguido de 5 minutos de incubación a 37 °C, protegido de la luz. El tinte se difunde fácilmente en las células, donde las esterasas intracelulares lo escinden para producir un compuesto altamente fluorescente. Este compuesto se une covalentemente a aminas intracelulares, lo que da como resultado una tinción fluorescente estable y bien retenida. Después de cada división, el colorante se distribuye uniformemente en las células hijas, por lo que la fluorescencia celular disminuye a la mitad. En un histograma de citometría de flujo, aparecen picos discretos hacia el lado izquierdo y representan cada división o generación celular. Luego las células se lavaron y resuspendieron en medio de cultivo. Las PBMC “objetivo” marcadas se estimularon con anti-CD3 recubierto de 1 jg/m l (clon, OKT-3; eBioscience, CA, EE. UU.) y anti-CD28 soluble de 5 jg/m l (clon, CD28.2, eBioscience, CA, EE. UU.) durante cuatro días y cocultivado con células “efectoras” CD34+ diferenciadas in vitro en diferentes efectores a proporciones objetivo en placas de 384 pocillos de fondo plano (BD Biosciences, Nueva Jersey, EE. UU.). Los cultivos celulares se incubaron a 37 °C y 5 % de CO2 en RPMI libre de arginina y glutamina (Biochrom AG, Alemania), suplementado con L-glutamina 2 mM, arginina 150 jM , FBS al 10 % (Sigma-Aldrich, MO, EE. UU.), penicilina 10 U/ml y estreptomicina (Lonza, Suiza) y HEPES 0.1 mM (Lonza, Suiza). Al final del cultivo, las células se tiñeron con anti-CD3 conjugado con PE-Cy7 (UCHT1, eBioscience, CA, EE. UU.) y todas las muestras se adquirieron con un FACS-CantoII (BD Biosciences, NJ, EE. UU.) y una señal de rastreo celular de los linfocitos seleccionados se analizaron con el software FlowJo (Treestar Inc.). El grado de proliferación celular se cuantificó analizando el número de células en proliferación, que se supone que es del 100 % sin células CD34+ diferenciadas in vitro. Demostramos que la sobreexpresión de CFLAR aumentó la capacidad inmunosupresora para diferenciar MDSC in vitro, lo que sugiere un nuevo papel biológico para esta proteína. De hecho, las células CD34+ que expresa CFLAR mostraron una actividad supresora significativamente aumentada en comparación con células CD34+ que expresan luciferasa. (Figura 2A, panel derecho). Para validar aún más estos datos, infectamos inmunomagnéticamente (cat. 130-050-201; Miltenyi Biotec Srl, Italia) monocitos CD14+ purificados de capas leucocitarias que generalmente no muestran ninguna función inmunosupresora, con lentivirus que expresan CFLAR o luciferasa y los cocultivaron en presencia de PBMC marcadas con trazas celulares activadas por CD3/CD28 antihumano (Figura 2B, panel izquierdo). También en este entorno experimental, las células CD14+ infectadas con CFLAR adquirieron una capacidad supresora más fuerte en comparación con los monocitos infectados con luciferasa (Figura 2B, panel derecho). Esta poderosa función inmunosupresora no se correlacionó con una mejor supervivencia de células CD14+ que expresan CFLAR en comparación con los controles, ya que el porcentaje de células CD14+7-AAD'ANNEXIN-V' después del cocultivo in vitro fue comparable (datos no mostrados) utilizando citometría de flujo mediante el kit de detección de apoptosis APC-AnnexinV con 7-AAD (cat. 640930, Biolegend, CA, EE.UU.). Todas las muestras se adquirieron con un FACS-CantoII (BD Biosciences, Nueva Jersey, EE. UU.) y se analizaron con el software FlowJo (Treestar Inc.).

Ejemplo 2: La expresión forzada de CFLAR en los monocitos impulsa un programa molecular similar a MDSC que controla la función inmunosupresora.

Para identificar mejor la vía molecular activada por CFLAR que subyace al programa funcional inmunosupresor en células mieloides, realizamos un análisis del transcriptoma de células CD14+ infectado con CFLAR- y luciferasa. aisladas de cuatro donantes sanos. Brevemente, el ARN total se aisló utilizando el reactivo TRIzol (Life technology, CA, EE. UU.) y la integridad del ARN se evaluó utilizando Agilent-2100-Bioanalyzer (Agilent Technologies, CA,<e>E. UU.). El ARN se purificó aún más con el kit RNeasy MinElute Cleanup (Qiagen, Venlo, Países Bajos) y el ADNc se sintetizó y amplificó a partir del ARN purificado total con Ovation Pico WTA System V2 (NuGEN, CA, EE. UU.). Todas las muestras se hibridaron con matrices Affymetrix U133 PLUS 2.0 y se escanearon con un escáner Affymetrix GCS 30007G. La muestra y los genes se agrupan utilizando el coeficiente de correlación de Pearson y el promedio como métrica de distancia y vinculación, respectivamente. Como se muestra en la Figura 3, la agrupación supervisada (q.val<0.05, cambio de plegamiento >2) generó una lista de 750 genes regulados positivamente (Figura 4) y 1130 regulados negativamente (datos no mostrados) en monocitos infectados con CFLAR en comparación a los controles. En particular, estos genes expresados diferencialmente resultaron enriquecidos significativamente en categorías involucradas en las vías de inflamación, las vías relacionadas con Notch y la vía relacionada con IL-10. Además, la expresión forzada de CFLAR activa la regulación positiva de genes inmunosupresores relacionados con MDSC, como SOCS2, FAS, CCR7, CCL5, NF-kB, STAT3, CD38, CD274, CD273, IL4R, IL6, IL10, CFS3, PTGS2 y IDOl. Algunos de los supuestos objetivos relacionados con CFLAR fueron probados y validados (Figura 5). En particular, verificamos mediante PCR en tiempo real que los monocitos transducidos con CFLAR mostraron una regulación positiva de ambos CFLAR<l>y CFLARs, así como la regulación positiva de IDOl. Para este objetivo, aislamos el ARN total de monocitos infectados con CFLAR o luciferasa mediante el reactivo TRIzol (Life technology, CA, EE. UU.) y se evaluó la integridad del ARN utilizando Agilent-2100-Bioanalyzer (Agilent Technologies, CA, EE. U<u>.). El ARN se purificó aún más con el kit RNeasy MinElute Cleanup (Qiagen, Venlo, Países Bajos) y el ADNc se sintetizó y amplificó a partir del ARN purificado total con Ovation Pico WTA System V2 (NuGEN, CA, EE. UU.). Todas las muestras se utilizaron para configurar una PCR en tiempo real con cebadores personalizados diseñados por ABI Biosystems por Primer Express. El análisis posterior a qRT-PCR para cuantificar la expresión génica relativa se realizó mediante el método Ct comparativo (2-ññCt). Como se muestra en la Figura 5A, los monocitos transducidos con CFLAR expresaron niveles significativamente altos de supuestos genes diana. Además, validamos que células CD14+ transducidas con CFLAR secretaron niveles significativamente más altos de IL-10 que células CD14+ transducidas con luciferasa mediante ensayo ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) (R&D System, MN, EE. UU.). En definitiva, este ensayo consiste en transferir el medio de cultivo en una placa específica de 96 pocillos previamente incubada con anticuerpo purificado específico para IL-10. En algunos pocillos, en lugar de la muestra, se sembró la curva de calibración utilizando una dilución escalar 1:2 de la citoquina en cuestión. Después de 2 horas de incubación a 37 °C, la placa se marcó con el anticuerpo anti-IL-10 biotinilado durante 1 hora, seguido de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente con estreptavidina unida a peroxidasa. La reacción de peroxidasa con su sustrato (TMB-3,3',5,5'-tetrametilbencidina) permite la cuantificación de la citocina de interés mediante lectura a 450 nm. Finalmente, verificamos que la expresión CFLAR impuesta en monocitos promovió la regulación positiva de marcadores de superficie específicos mediante citometría de flujo. Brevemente, las células CD14+ después de 24 horas de infección, como se describió anteriormente, se resuspendieron en 100 pl de tampón FACS (solución de NaCl al 0.9% que contenía BSA al 2 % y NaN3 al 0.02 %; ambos de Sigma-Aldrich) con<c>D273-PE antihumano de ratón (cat. 557926, BD Biosciences, Nueva Jersey, EE. UU.), CD274-APC antihumano de ratón (cat. 228489, BD Biosciences, Nueva Jersey, EE. UU.), CD80-APC antihumano de ratón (cat. 305220, Biolegend CA, EE. UU.), CD163-PE antihumano (cat.

556018, BD Biosciences, Nueva Jersey, EE. UU.), CD44-PE antihumano (cat. 103024, Biolegend, Nueva Jersey, EE. UU.), CD38-APC antihumano (cat. 554262, BD Biosciences, Nueva Jersey, EE. UU.) y CD124-APC antihumano (cat. FAB23OP, R&D System, MN, EE.UU.). Todas las muestras se adquirieron con un FACS-CantoII (BD Biosciences, Nueva Jersey, EE. UU.) y se analizaron con el software FlowJo (Treestar Inc.).

Ejemplo 3: La transferencia adoptiva de monocitos que expresan CFLAR controla la progresión de GvHD en ratones inmunodeficientes trasplantados con PBMC humanas.

A partir de estas observaciones decidimos evaluar in vivo las funciones inmunosupresoras de células CD14+ infectado con CFLAR (como se describió anteriormente) para controlar el desarrollo de la enfermedad de injerto contra huésped (GvHD) utilizando un modelo de ratón xenogénico. Para este propósito, inyectamos por vía intravenosa (iv) irradiados subletales (usando Irradiador de fuente 137Cs), NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicTac (N<o>G) (adquirido por Taconic, NY, EE. UU.) con 106 PBMC humanas aisladas de capas leucocitarias. Cuando la frecuencia de linfocitos CD3+ humanos circulantes alcanzaron un porcentaje ~5 % del total de células, comenzamos a tratar a los ratones mediante transferencia intravenosa de 106 Monocitos que expresan CFLAR o luciferasa. Brevemente mediante sangrado retroorbital aislamos 100 pl de sangre; Los glóbulos rojos se eliminaron mediante tampón de lisis ACK (cloruro de amonio-potasio) y las células se tiñeron con CD45-APC anti-ratón de rata (clon A20, Biolegend, NJ, EE. UU.), CD45-PerPC-Cy5.5 anti-humano (clon 2D1, Biolegend, NJ, EE. UU.) y CD3-PE-Cy7 antihumano (clon UHCT1, Biolegend, NJ, EE. U<u>.). Todas las muestras se adquirieron con un FACSCanto II (BD Biosciences, Nueva Jersey, EE. UU.) y se analizaron con el software FlowJo (Treestar Inc.). El tratamiento se repitió cuatro veces, los días 21, 28, 42 y 49 después de la exposición inicial y se monitoreó la puntuación de GvHD inmunológica, clínica e histopatológica de los ratones (Figura 6A). La inyección de células CD14+ infectado con CFLAR, redujo eficientemente el desarrollo de GvHD, lo que resultó en una mejor supervivencia a largo plazo de los ratones trasplantados en comparación con los ratones sometidos a GvHD tratados con monocitos que expresan luciferasa o no tratados (Figura 6B). Además, el análisis histológico y la cuantificación de células T CD3+ humano infiltrante de tejido revelaron una patología GvHD menos agresiva en todos los órganos analizados de ratones tratados con monocitos que expresan CFLAR (Figura 6C). Brevemente, los tejidos se extrajeron mediante necroscopia y se fijaron en formalina tamponada al 10% y se incluyeron en parafina. La evaluación histopatológica se realizó en secciones estándar de hematoxilina y eosina. La puntuación patológica fue evaluada por dos patólogos cegados utilizando la guía de línea estándar publicada previamente (Cooke KR, Kobzik L, Martin TR, Brewer J, Delmonte J, Crawford JM, Ferrara JLM: An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood 8:3230, 199). Finalmente, para la inmunohistoquímica se han utilizado secciones de parafina de bazo, hígado, pulmón, piel, colon, riñón y estómago: las secciones se tiñeron con anticuerpo anti-CD3 humano (clon ab5690, Abcam, Reino Unido) para cuantificar los linfocitos infiltrantes en tejidos humanos.

Para comprobar la capacidad de los monocitos que expresan CFLAR para controlar la expansión in vivo de células T en ratones sometidos a GvHD, verificamos la presencia y frecuencia de células CD3+ humanas en ratones tratados cuatro veces los días 21, 28, 42 y 49 a partir del injerto de PBMC (Figura 7A). Después de solo dos tratamientos, los ratones sometidos a GvHD tratados con monocitos que expresan CFLAR mostraron una frecuencia de células T humanas más baja en comparación con los tratados con luciferasa (Figura 7B). En particular, los ratones sometidos a GvHD se sacrificaron el día 35 después del injerto de PBMC y evaluamos la frecuencia de células T humanas mediante citometría de flujo en la sangre (Figura 7B i), el bazo (Figura 7B ii) y la médula ósea (Figura 7B iii). Para el análisis de sangre, mediante sangrado retroorbital, se aislaron 100 pl de sangre; Los glóbulos rojos se eliminaron mediante tampón de lisado ACK (amonio-cloruro-potasio) y las células se tiñeron con anticuerpo anti-CD3 conjugado con PECy7 (UCHT1, eBioscience, CA, EE. UU.). Para el análisis del bazo, esplenocitos frescos (106/muestra) se resuspendieron en 100 j l de tampón FACS con solución bloqueadora de FcyR antihumano (cat. 130-046-702, Miltenyi Biotec S.r.l., Italia) durante 10 minutos a temperatura ambiente para reducir la tinción inespecífica. Después del lavado, las células se resuspendieron en tampón FACS y se marcaron con anticuerpo anti-CD3 conjugado con PE-Cy7 humano (UCHT1, eBioscience, CA, EE. UU.). Finalmente, para el análisis de células de la médula ósea, se extrajeron tibias y fémures de ratones sometidos a GvHD mediante técnicas estériles y se lavó la MO. Los glóbulos rojos se eliminaron mediante tampón de lisis ACK (cloruro de amonio-potasio) y las células se tiñeron con anticuerpo anti-CD3 conjugado con PE-Cy7 humano (UCHT1, eBioscience, CA, EE. UU.). Todas las muestras se adquirieron con un FACSCanto II (BD Biosciences, Nueva Jersey, EE. UU.) y se analizaron con el software FlowJo (Treestar Inc.). Además, también evaluamos el estado de activación de las células T humanas. Brevemente, los esplenocitos de ratones sometidos a GvHD tratados fueron estimulados o no (condiciones de reposo) in vitro durante 24 horas con 12-miristato 13-acetato de forbol (PMA, 50 ng/ml) y ionomicina (1 jg/ml). Los esplenocitos se lavaron y se tiñeron con anticuerpos de superficie (anticuerpo anti-CD8 antihumano conjugado con azul Pacífico (cat. 34417, Biolegend, CA, EE. UU.)), fijado y permeabilizado usando el kit Perm/Wash (cat. 554723, BD Biosciences, NJ, EE. UU.) y se incubaron con anticuerpo hlFN-Y marcado con PE (cat. 506506, Biolegend, CA, EE. UU.) (Figura 7Biii). Todas las muestras se adquirieron con un FACSCanto II (BD Biosciences, Nueva Jersey, EE. UU.) y se analizaron con el software FlowJo (Treestar Inc.). Demostramos que las células T aisladas de ratones tratados con CFLAR mostraron una frecuencia estadísticamente más baja de células CD8+ IFNy+ humano en comparación con las tratadas con luciferasa, lo que revela un posible agotamiento o un estado no activado mediado por monocitos CFLAR. Finalmente, evaluamos que la inyección de monocitos que expresan CFLAR en ratones sometidos a GvHD indujo la expansión de las células T reguladoras (Treg) circulantes en comparación con los monocitos que expresan luciferasa (Figura 7C).

Ejemplo 4: Modelo de ratón Rosa26.vFLIP;LysMcre

Para comprender mejor la vía molecular inducida por CFLAR, aprovechamos un modelo de ratón transgénico que expresa la forma viral de CFLAR: los ratones knock-in Rosa26.vFLIP. El herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi codifica una enzima convertidora de interferón similar a FADD o una proteína inhibidora de caspasa 8 (FLICE) (<v>FLIP) en su genoma. Los ratones knock-in Rosa26.vFLIP se cruzaron con ratones que expresaban la recombinasa Cre bajo el control de la proteína endógena liz2 (LysM-Cre), lo que da como resultado ratones con expresión de vFLIP restringida al linaje de células mieloides. Se obtuvieron células de médula ósea y esplenocitos de ratones Rosa26.vFLIP; LysMcre y Rosa26.vFLIP y aislamos mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) los subconjuntos CD11B.+ Ly6G' Ly6Calto y el CD11B+ Ly6G Ly6Cbajo. Luego se evaluó la actividad inmunosupresora de estas células colocando las células mieloides recién aisladas en placas de 96 pocillos a una concentración final del 24 % del total de células en cultivo en presencia de esplenocitos de ratones transgénicos 37B7 (un modelo de ratón que presenta todas células T CD8+ con un receptor de células T (TCR) diseñado específicamente para el antígeno TRP2 asociado al melanoma, marcado con CFSE 1 jM y diluido 1:10 con CD45.1+ esplenocitos, en presencia del péptido TRP-2-180-188 (1 jg/ml). Después de 3 días de cocultivo, realizamos un análisis FACS con un FACS-Canto (Bd Biosciences, Nueva Jersey, EE. UU.) y, para evaluar la supresión de la proliferación, las parcelas se bloquearon en CD8+. Las células T y el porcentaje de células que tenían CFSE diluido se evaluaron utilizando el software FlowJo (Treestar Inc.). Luego se usó el porcentaje de células en proliferación para calcular el porcentaje de supresión de la proliferación usando la siguiente fórmula: 1 - (% proliferación con células mieloides / % proliferación sin células mieloides) * 100 (Figura 8).

Ejemplo 5: c-FLAR induce un programa inmunosupresor independientemente de sus funciones antiapoptóticas.

A partir de capas leucocitarias de donantes sanos (HD), purificamos e infectamos monocitos CD14+ con lentivirus que codifican c-FLAR o luciferasa y demostraron que la propiedad reguladora inmune de c-FLAR no se correlacionaba con una mejor supervivencia de los monocitos que expresaban c-FLAR en comparación con los controles, tanto cuando los monocitos se cultivaban solos como cuando se cultivaron con PBMC activadas por CD3/CD28. De hecho, el porcentaje de células vivas (7-AAD'ANNEXIN-V') CD14+ en diferentes puntos de tiempo no son significativamente diferentes entre los monocitos c-FLAR o luciferasa (Figura 9a), lo que indica que la actividad reguladora inmune se puede separar de las propiedades antiapoptóticas de c-FLAR, al menos en el caso monocitos maduros. Además, para discriminar entre la pro-supervivencia y la inducción de la función inmunosupresora, generamos vectores de expresión lentivirales de otros genes antiapoptóticos (es decir, Bcl-2 y Bcl-xL) y probamos las propiedades inmunosupresoras después de su expresión forzada en monocitos humanos. Como se muestra en la Figura 9b, solo la expresión forzada de c-FLAR es capaz de suprimir significativamente in vitro Activación y proliferación de células T.

Ejemplo 6: La expresión forzada de c-FLAR en monocitos impulsa programas moleculares asociados a MDSC.

Mediante el uso del análisis de enriquecimiento de ontología genética (GO), los genes expresados diferencialmente se enriquecieron significativamente en categorías involucradas en la inflamación, la red de citocinas y los genes regulados positivamente en respuesta a las proteínas del interferón, así como también se asociaron a la vía de la IL-10 y, en general, a la vía relacionada con NF-xB (Figura 10a, b).

Ejemplo 7: c-FLAR activa la vía canónica NF-kB en células mieloides.

La expresión forzada de c-FLAR desencadena la vía canónica NF-kB. Los datos de expresión génica sugirieron una actividad transcripcional y de señalización imprevista de c-FLAR, posiblemente relacionada con la vía NF-<k>B. Para dilucidar los programas moleculares bajo el control de c-FLAR, transfectamos transitoriamente células monocíticas THP1 con in vitro ARN codificante de c-FLAR transcrito (IVT). Lo racional era inducir una producción sostenida e independiente de los virus de la proteína diana; Además, el IVT-RNA no activa los receptores de inmunidad innata ni la producción de interferón tipo I. La introducción forzada de un ARN c-FLAR sintético en células THP1 desencadenó un programa inmunosupresor consistente con los datos mostrados hasta ahora con vectores de expresión de lentivirus (Figura 11a). La transfección de ARN c-FLAR promovió significativamente la translocación nuclear de las subunidades p65 y p50 de NF-kB, mediadores de la vía de activación canónica de NF-kB, mientras que no se detectó diferencia en la translocación de la subunidad p52 (Figura 11b). Para probar si la señalización de NF-kB era necesaria para el programa de regulación inmune posterior a FLAR, silenciamos las quinasas IKKa (codificada por Chuk) e IKKp (codificada por Ikbkb), ambas indispensables para la activación canónica de NF-<k>B. Demostramos que la actividad inmunosupresora de Ly6C que expresa v-FLAR Las células aisladas de ratones Tg se redujeron significativamente después de silenciar iKKa o IKKp (Figura 11c). En conjunto, nuestros datos indican que c-FLAR activa una vía de señalización que controla un programa inmunosupresor en monocitos a través de la activación de NF-kB.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una población de células para uso en terapia, dicha población comprende células mieloides o células progenitoras de las mismas que están diseñadas para aumentar el nivel celular de FLICE celular [enzima convertidora de IL-1p similar al dominio de muerte asociado a Fas (FADD)]- proteína inhibidora (CFLAR), en la que dicha población comprende células mieloides o células progenitoras de las mismas que comprenden un ácido nucleico recombinante que codifica CFLAR, en la que la terapia comprende tratar a un paciente que necesita inmunosupresión o en la que la terapia comprende el tratamiento de un receptor de trasplante o enfermedad de injerto contra huésped o de una enfermedad inflamatoria o de una enfermedad autoinmune, en la que la enfermedad inflamatoria es preferiblemente enfermedad celíaca, vasculitis, lupus, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedad del intestino irritable, aterosclerosis, artritis, espondilitis anquilosante, enfermedad de Crohn, colitis, hepatitis crónica activa, dermatitis o psoriasis y en la que la enfermedad inmunitaria es preferiblemente enfermedad de Addision, alopecia areata, espondilitis anquilosante, hepatitis autoinmune, parotiditis autoinmune, enfermedad de Crohn, diabetes (Tipo I), epidermólisis ampollosa distrófica, epididimitis, glomerulonefritis, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barr, enfermedad de Hashimoto, anemia hemolítica, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, miastenia gravis, pénfigo vulgar, psoriasis, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, espondiloartropatías, tiroiditis, vasculitis, vitíligo, mixedema, anemia perniciosa, colitis ulcerosa o diabetes mellitus tipo

2. La población de células para el uso de la reivindicación 1, en la que las células mieloides o sus células progenitoras se han transfectado usando un vector viral que comprende dicho ácido nucleico que codifica CFLAR.

3. La población de células para uso de la reivindicación 1, en la que dicho ácido nucleico es ARN.

4. La población de células para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que CFLAR es CFLAR<l>y/o CFLARs.

5. La población de células para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que las células mieloides o células progenitoras de las mismas son células aisladas y/o purificadas, en particular aisladas y/o purificadas mediante clasificación celular magnética, en la que las células mieloides o células progenitoras de las mismas son preferentemente monocitos, más preferentemente monocitos CD14+, o células madre, o células CD34+ de médula ósea.

6. La población de células para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dichas células CD34+ de médula ósea se han aislado de células mononucleares (MNC) de médula ósea.

7. Una composición farmacéutica para uso en terapia, dicha composición farmacéutica comprende una población de células que comprenden células mieloides o células progenitoras de las mismas que están diseñadas para aumentar el nivel celular de proteína inhibidora de FLICE celular [dominio de muerte asociado a Fas (FADD) similar a enzima convertidora IL-1p] (CFLAR), en la que dicha población comprende células mieloides o células progenitoras de las mismas que comprenden un ácido nucleico recombinante que codifica CFLAR en la que la terapia comprende tratar a un paciente que necesita inmunosupresión o en la que la terapia comprende el tratamiento de un receptor de trasplante o de enfermedad de injerto contra huésped o de una enfermedad inflamatoria o de una enfermedad autoinmune, en la que la enfermedad inflamatoria es preferentemente enfermedad celíaca, vasculitis, lupus, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedad del intestino irritable, aterosclerosis, artritis, espondilitis anquilosante, enfermedad de Crohn, colitis, hepatitis crónica activa, dermatitis o psoriasis y en la que la enfermedad autoinmune es preferentemente enfermedad de Addision, alopecia areata, espondilitis anquilosante, hepatitis autoinmune, parotiditis autoinmune, enfermedad de Crohn, diabetes (Tipo I), epidermólisis ampollosa distrófica, epididimitis, glomerulonefritis, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barr, enfermedad de Hashimoto, anemia hemolítica, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, miastenia gravis, pénfigo vulgar, psoriasis, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, espondiloartropatías, tiroiditis, vasculitis, vitíligo, mixedema, anemia perniciosa, colitis ulcerosa o diabetes mellitus tipo I.

8. La composición farmacéutica para uso de la reivindicación 7 o la población de células para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la población de células es autóloga al paciente.

9. La composición farmacéutica para uso de la reivindicación 7 u 8, o la población de células para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende administrar la composición farmacéutica o la población de células.

10. Un ácido nucleico que codifica CFLAR, o una composición farmacéutica que comprende dicho ácido nucleico, para uso en terapia, en la que la terapia comprende tratar a un paciente que necesita inmunosupresión o en la que la terapia comprende el tratamiento de un receptor de trasplante o de enfermedad de injerto contra huésped o de una enfermedad inflamatoria o de una enfermedad inmunitaria, en la que la enfermedad inflamatoria es preferentemente enfermedad celíaca, vasculitis, lupus, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedad del intestino irritable, aterosclerosis, artritis, espondilitis anquilosante, enfermedad de Crohn, colitis, enfermedad activa crónica, hepatitis, dermatitis o psoriasis y en la que la enfermedad inmunitaria es preferiblemente enfermedad de Addision, alopecia areata, espondilitis anquilosante, hepatitis autoinmune, parotiditis autoinmune, enfermedad de Crohn, diabetes (Tipo I), epidermólisis ampollosa distrófica, epididimitis, glomerulonefritis, enfermedad de Graves, Síndrome de Guillain-Barr, enfermedad de Hashimoto, anemia hemolítica, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, miastenia gravis, pénfigo vulgar, psoriasis, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, espondiloartropatías, tiroiditis, vasculitis, vitíligo, mixedema, anemia perniciosa, colitis ulcerosa o diabetes mellitus tipo I.

11. El ácido nucleico que codifica CFLAR para uso de la reivindicación 10, o la composición farmacéutica para uso de la reivindicación 10, en la que la terapia comprende administrar el ácido nucleico que codifica CFLAR o la composición farmacéutica a un paciente y en el que el ácido nucleico transfecta células mieloides o células progenitoras de las mismas en el paciente.

12. El ácido nucleico que codifica CFLAR para uso de la reivindicación 11, o la composición farmacéutica para uso de la reivindicación 11, en el que el ácido nucleico es ARN o un vector viral, preferiblemente un vector lentiviral.