ES2972698T3 - Dispositivo para la exploración de neuronas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un dispositivo para el examen de neuronas y a un método para examinar neuronas, y más específicamente para examinar neuronas que crecen en una red tridimensional. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Dispositivo para la exploración de neuronas

La presente invención se refiere a un dispositivo para la exploración de neuronas y a un método para explorar neuronas, y más específicamente, para explorar neuronas que crecen en una red tridimensional.

Las disfunciones del sistema nervioso central representan una carga importante para la sociedad y la asistencia médica en todo el mundo, que afecta a cientos de millones de personas cada año, obteniendo muchos pacientes poco o ningún alivio con los tratamientos actuales.

La identificación de nuevos fármacos que se dirijan de forma segura y eficaz a circuitos neuronales específicos representa uno de los principales retos a los que debe enfrentarse la industria farmacéutica para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas destinadas a tratar trastornos cerebrales humanos, en particular enfermedades neurodegenerativas. Para evitar tasas de abandono tardías y elevadas y hacer más rentable el desarrollo de fármacos, la posible neurotoxicidad y el riesgo de convulsiones deben reconocerse lo antes posible durante el proceso de descubrimiento.

La evaluación del posible impacto de los nuevos compuestos sobre el sistema nervioso representa un gran esfuerzo también para la industria agroquímica y de productos de consumo, ya que las autoridades reguladoras exigen estos estudios antes de que las nuevas entidades químicas puedan introducirse en el mercado.

La mayoría de estos estudios se basan en el uso de modelos animales ex vivo e in vivo, que no siempre son predictivos de acontecimientos adversos en seres humanos. Son costosos, requieren mucho tiempo y no se prestan a pruebas de alto rendimiento de sustancias químicas y compuestos. Además, son éticamente cuestionables debido a la gran cantidad de animales necesarios y al impacto en su bienestar durante la exposición a la sustancia.

De acuerdo con una política reciente de la Unión Europea (Reglamento, Evaluación, Autorización y Restricción de productos químicos, REACH (Regulation, Evaluation Authorisation and Restriction o f Chemicals), se calcula que en los próximos doce a quince años, habrá que someter a pruebas de seguridad unos 30.000 productos químicos y, según las directrices actuales, estas pruebas requerirían el uso de unos 7,2 millones de animales de laboratorio. También se ha calculado que de 5.000 a 10.000 nuevas entidades farmacológicas con las que puede comenzar una compañía farmacéutica, sólo una es finalmente aprobada por la Administración de Alimentos y Medicamentos con un coste de más de mil millones de dólares. Una gran parte de este coste se debe a las pruebas con animales.

Por lo tanto, las políticas de la UE e internacionales exigen cada vez más la reducción o sustitución de los estudios in vivo con animales en el proceso de desarrollo de fármacos y ensayos de toxicidad. Por tanto, se necesitan enfoques in vitro alternativos para la identificación de riesgos que tengan mayor capacidad de rendimiento y sean más predictivos de los efectos in vivo.

Debido a su capacidad intrínseca para medir de forma no invasiva el potencial extracelular de cientos o miles de células en paralelo, en los últimos años, los registros con matrices de microelectrodos (MEA, microelectrode array) se han vuelto cada vez más comunes para una variedad de aplicaciones centradas en el estudio de redes neuronales y, más en general, de células excitables tales como las neuronas y los cardiomiocitos. Esto se aplica tanto a la investigación básica como a las industrias que buscan un ensayo de alto rendimiento y alto contenido para el descubrimiento preclínico, la farmacología de seguridad y la toxicología.

Varios grupos internacionales han demostrado que los registros con MEA son muy sensibles para detectar cambios electrofisiológicos en redes neuronales. Por tanto, los registros con MEA proporcionan un ensayo contundente con respecto a la eficacia, al riesgo de convulsiones y a las pruebas de neurotoxicidad en una variedad de modelos in vitro. Un gran consorcio internacional (CiPA Initiative), compuesto por partes interesadas públicas e industriales, está evaluando la tecnología MEA también por su posible aplicación en el campo de la farmacología de seguridad cardíaca. Allí, la tecnología MEA junto con el uso de cardiomiocitos humanos derivados de iPSC (induced Pluripotent Stem, células madre pluripotentes inducidas) ofrecería una alternativa a los costosos y lentos modelos animales in vivo que actualmente exigen las autoridades reguladoras.

Las células cultivadas adherentes en sustratos bidimensionales (2D) no representan completamente entornos celulares in vivo y carecen de componentes extracelulares, interacciones célula-célula y célula-matriz necesarias para la diferenciación, la proliferación y las funciones basadas en células. Más recientemente, las técnicas de cultivo celular tridimensionales (3D) se han explorado como una nueva oportunidad en la comunidad de investigación biomédica. Las técnicas de cultivo celular en 3D han demostrado su potencial para desarrollar estructuras tisulares complejas in vitro. Cada vez hay más pruebas de que los sistemas de cultivo en 3D pueden captar componentes importantes de la compleja fisiología de un tejido u órgano mejor que los métodos clásicos en monocapa.

Con ello se espera reducir las tasas de exclusión de moléculas piloto y mejorar la previsibilidad general de los ensayos in vitro. Sin embargo, estos modelos limitan enormemente la reproducibilidad de los datos, suponen un reto para los sistemas de lectura de ensayos y a menudo requieren complejos procesos de microfabricación. Nuevos avances en esta dirección, especialmente en las capacidades de rendimiento y modelado de enfermedades, tienen un gran valor para la identificación y validación de nuevas dianas implicadas en las funciones y disfunciones neuronales.

En un esfuerzo por acelerar y aumentar la tasa de éxito del proceso de descubrimiento de fármacos, el potencial de combinar e interconectar microtecnologías con poblaciones de células cerebrales, por ejemplo, derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) humanas, se ha convertido recientemente en el foco de muchos programas de investigación preclínica en todo el mundo, por ejemplo, en los NIH (Institutos Nacionales de Salud) y DARPA (Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa) en los EE. UU. Al aprovechar el origen humano de las iPSC, estos nuevos métodos pretenden mejorar la previsibilidad de toda una serie de ensayos fisiológicos, farmacológicos y toxicológicos. Para hacerlo, varios laboratorios están intentando crear órganos y cuerpos en chip, buscando la posibilidad de generar estructuras 3D que, imitando la arquitectura multicelular de los órganos vivos, puede resumir mejor la salud y las enfermedades humanas.

Sin embargo, hasta ahora, no existe ningún sistema o tecnología 3D in vitro integrado y relevante para el ser humano que permita evaluar la eficacia, la neurotoxicidad o el riesgo de convulsiones de nuevos compuestos basándose en las características fisiológicas intrínsecas del cerebro (es decir, actividad eléctrica, arquitectura tisular, estructuras sinápticas) que sea adecuado(a) para su uso en investigación básica o aplicada.

Brewer et al. (2013), Toward a self-wired active reconstruction of the hippocampal trisynaptic loop: DG-CA3, Front. Neural. Circuits., vol. 7, Art. 165, págs. 1-8 y Gladkov et al. (2017), Design of Cultured Neuron Networks in vitro with Predefined Connectivity Using Asymmetric Microfluidic Channels". Sci Rep. 7(1):15625, describen un sistema de cultivo de neuronas de dos compartimentos, donde ambos compartimentos están conectados a través de microtúneles de diferentes diseños que permiten el paso de neuritas adherentes. Dicho sistema está dispuesto en una matriz multielectrodo (MEA) que comprende electrodos de registro. La actividad eléctrica de las neuritas se registró mediante microelectrodos situados dentro de microtúneles, como cabe esperar en neuronas cultivadas adherentes a superficies MEA.

Tsantoulas et al. (2013), Probing functional properties of nociceptive axons using a microfluidic culture system, PLoS One, vol. 8, Issue 11, págs.1-17, desvelan un sistema de cultivo de neuronas de dos compartimentos, donde ambos compartimentos están conectados a través de microranuras que permiten el paso de neuritas. De nuevo, las neuronas se cultivaron adheridas a la superficie del dispositivo. Básicamente, en el sistema se realiza una estimulación química. En una variante, se produce una estimulación eléctrica. La llamada estimulación del potencial de campo se lleva a cabo mediante "electrodos" macroscópicos en forma de simples cables colocados en el compartimento de cultivo. La actividad de las neuronas se lee principalmente mediante imágenes de calcio, que únicamente calculan indirectamente la actividad eléctrica y no coinciden con la resolución temporal del registro eléctrico. Además, la actividad de las neuronas se registra mediante el método de pinzamiento zonal (patch-clamp), que es invasivo y tiene efectos negativos sobre la arquitectura y la integridad de las neuronas.

En el documento WO 2004/034016 se desvela un dispositivo microfluídico de dos compartimentos donde los dos compartimentos están acoplados por una barrera que comprende ranuras de tamaño micrométrico. Se menciona que pueden aplicarse selectivamente estímulos positivos o negativos a partes distales de las neuritas, que crecen de manera adherente a una de las superficies del dispositivo, en el punto de la barrera con las ranuras o canales, respectivamente.

En el documento US 2004/230270 se describe una interfaz que establece contacto eléctrico de manera selectiva con una pluralidad de células neurales en una red neuronal biológica, en donde dicha red biológica comprende una corteza cerebral o una red neuronal retiniana. Se menciona que el contacto eléctrico resuelto espacialmente con las células neurales puede realizarse permitiendo la migración del soma celular en los microcanales.

Se conocen dispositivos adicionales para explorar neuronas de Navarro et al. (2005), A critical review of interfaces with the peripheral nervous system for the control of neuroprostheses and hybrid bionic systems. J. Peripher. Nerv. Syst. 10(3):229-58; Zhuang et al. (2017), 3D neural tissue models: From spheroids to bioprinting. Biomaterials 154:113-133; Wang et al. (2012), Biophysics of microchannel-enabled neuron-electrode interfaces. J. Neural. Eng. 9(2):026010; Fitzgerald et al. (2008), Microchannels as axonal amplifiers. IEEE Trans. Biomed. Eng. 55(3): 1136-46; documentos US 3.955.560, EP 2249 915 y US 2017/311.827.

También se describen dispositivos adicionales para explorar neuronas en Bradley J. Dworak et al. (2009): "Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture", LAB ON A CHIP 9(3):404-410.

Hasta ahora, los dispositivos y métodos conocidos no han resultado ser especialmente eficaces respaldando el desarrollo de nuevas intervenciones terapéuticas para trastornos neuronales en pacientes humanos. En particular, a menudo no logran imitar la complejidad fisiológica que caracteriza a las redes neuronales. Hasta ahora, no existe ningún sistema 3D in vitro integrado y relevante para el ser humano que permita evaluar la eficacia, la neurotoxicidad o el riesgo de convulsiones basándose en las características fisiológicas intrínsecas del sistema neurológico, es decir, actividad eléctrica, arquitectura tisular, estructuras sinápticas, que sea adecuado para su uso en el sector comercial.

En este contexto, es un objeto subyacente a la invención proporcionar un nuevo dispositivo que permita la exploración y/o estimulación de neuronas en redes 3D no adherentes in vitro, creando así una plataforma para estudiar funciones neuronales, trastornos neurodegenerativos y probar sustancias potencialmente neuroactivas. En particular, se proporcionará un dispositivo que permita tanto la medición de la propagación del potencial de acción y la transmisión sináptica entre neuronas conectadas como la estimulación eléctrica directa de las neuritas, tanto en presencia como en ausencia de sustancias de ensayo, sin interferir con la arquitectura y la integridad de las neuronas.

Este objeto se cumple proporcionando un dispositivo que registra la actividad eléctrica de las células neurales y/o las estimula, en una red neuronal tridimensional, que comprende:

- un primer compartimento que comprende una matriz de hidrogel o fibrosa tridimensional configurada para contener neuronas y mantener dichas neuronas en dicha matriz tridimensional, y

- al menos un microcanal que se extiende desde dicho primer compartimento y que tiene dimensiones que permiten la extensión de las neuritas desde dicho primer compartimento hacia dicho microcanal y que impiden la entrada del soma de las neuronas en dicho al menos un microcanal,

en donde dicho al menos un microcanal comprende al menos un microelectrodo incorporado en el mismo y dispuesto para registrar señales eléctricas desde y/o administrar pulsos eléctricos a las neuritas que se extienden a lo largo de dicho al menos un microcanal, y en donde dicha matriz tridimensional está configurada para permitir el cultivo de las células sin adherirse o entrar en contacto con las paredes o superficies límite del compartimento.

Los inventores se han percatado inesperadamente de que con un dispositivo diseñado de la manera prescrita, la medición de la excitabilidad neuronal, así como la estimulación eléctrica a lo largo de las neuritas que surgen de las arquitecturas neuronales 3D, será posible sin interferir con la arquitectura y la integridad de las neuronas. Por lo tanto, el dispositivo de acuerdo con la invención permitirá probar el potencial neuroactivo de los compuestos en el contexto de redes neuronales complejas, tales como fármacos, en potencia, neurofarmacológicamente activos, contaminantes ambientales y pesticidas, etc.

De acuerdo con la invención, el al menos un microcanal comprende dimensiones que permiten la extensión de las neuritas desde dicho primer compartimento a dicho al menos un microcanal e impiden la entrada del soma de neuronas. El experto en la técnica es perfectamente consciente de las dimensiones de los microcanales para cumplir tales condiciones previas, ya que las dimensiones de las neuronas o de sus neuritas y soma están bien descritas en la bibliografía. Sin embargo, ejemplo ilustrativo, no vinculante, de un microcanal apropiado de una realización de la invención, comprende las siguientes dimensiones: aprox. 3 gm de altura, aprox. 3 - 4 gm de anchura y aprox. 100 -500 gm y preferiblemente aprox. 300 gm de longitud.

El al menos un microelectrodo integrado en el microcanal permitirá la medición o el inicio de la propagación del potencial de acción y la transmisión sináptica entre neuronas conectadas en 3D. Es importante destacar que, de acuerdo con la invención, el microelectrodo está incorporado en el microcanal de tal manera que se acerca a las neuritas presentes en el microcanal sin penetrar ni dañar la neurita. El microelectrodo puede extenderse y/o sobresalir parcialmente en el microcanal de tal manera que no penetre ni dañe la neurita. Sin embargo, preferiblemente, el microelectrodo no se extiende y/o sobresale en el microcanal. De ese modo, el microelectrodo no penetrará ni dañará la neurita. Esto ofrece la ventaja sobre otras técnicas electrofisiológicas, tal como el pinzamiento zonal utilizado para registrar estructuras neuronales en 3D, de ser no invasivo. Por lo tanto, durante el cultivo, pueden tomarse o efectuarse mediciones y/o estimulaciones repetidamente en cualquier punto temporal.

El "al menos un compartimento" puede estar completamente cerrado o puede estar abierto en uno o más lados.

"Al menos un microcanal" significa que puede haber más de un microcanal o incluso una pluralidad de microcanales.

De acuerdo con la invención, un "microelectrodo" se refiere a cualquier dispositivo capaz de integrarse en un microcanal y que registre la actividad eléctrica de las células neurales y/o las estimule, de manera preferente, eléctricamente. Un microelectrodo tiene propiedades adecuadas para su función, incluyendo baja impedancia y bajo ruido. El microelectrodo puede estar hecho de un material adecuado para realizar su función, incluyendo, pero sin limitación, oro, platino, iridio, óxido de iridio, nitruro de titanio, nanotubos de carbono, grafeno, diamante, un polímero conductor tal como poli(3,4-etilendioxitiofeno) o combinaciones de estos materiales. El microelectrodo puede incluir un recubrimiento que posibilite o mejore su función. El microelectrodo puede colocarse en diferentes posiciones dentro del microcanal. Además, puede haber más de un microelectrodo dentro de un canal. El microelectrodo puede colocarse en un lado del canal, puede encerrar el perímetro del canal, puede ser menor que la longitud del canal, o puede cubrir toda la longitud de un canal.

El al menos un microelectrodo que está dispuesto para registrar las señales eléctricas de las neuritas se denomina "electrodo de registro". El al menos un microelectrodo que está dispuesto para administrar las señales eléctricas a las neuritas se denomina "electrodo de estimulación". Debe entenderse que el mismo microelectrodo puede tener ambas funciones, es decir, un microelectrodo cumple la actividad tanto del electrodo de registro como del electrodo de estimulación. Sin embargo, el electrodo de registro y el electrodo de estimulación pueden proporcionarse como dos microelectrodos distintos.

En una realización de la invención, el dispositivo o partes del mismo pueden estar hechos de polímeros, vidrio o cerámica, o de una combinación de los mismos. Dicho vidrio incluye, a modo de ejemplo, vidrio de borosilicato o sílice fundida. Dicha cerámica incluye, a modo de ejemplo, cuarzo, óxido de silicio o nitruro de silicio. El vidrio y la cerámica pueden diseñarse mediante grabado con plasma, grabado en húmedo y grabado con láser. El vidrio y la cerámica tienen ventajas de resistencia térmica y química. Por otro lado, el vidrio y la cerámica presentan dificultades de fabricación. Los polímeros adecuados incluyen, a modo de ejemplo, polidimetilsiloxano (PDMS). El PDMS ofrece varias ventajas, tales como facilidad de fabricación, claridad óptica y permeabilidad a los gases. Por otro lado, el PDMS puede absorber de manera variable pequeños compuestos hidrófobos, lo que puede provocar cambios en la biodisponibilidad de algunos compuestos. Por esta razón, para fabricar el dispositivo o partes del mismo, pueden utilizarse polímeros alternativos tales como SU-8 u otros fotorresistentes negativos basados en epoxi. SU-8 ofrece ventajas tales como la capacidad de fabricar estructuras multicapa de alta resolución que no son posibles con otros métodos. Sin embargo, SU-8 presenta dificultades de fabricación, transparencia óptica limitada y autofluorescencia. Por esta razón, para fabricar el dispositivo o partes del mismo, pueden utilizarse polímeros alternativos tales como copolímeros de olefina cíclica (COC) o polímeros de olefina cíclica (POC), preferiblemente mediante moldeo por inyección.

De acuerdo con la invención, "red tridimensional" se refiere a la conexión espacial de neuronas en una matriz biocompatible que permite el cultivo de las células sin adherirse o entrar en contacto con las paredes o superficies límite del compartimento.

El objeto que subyace a la invención se consigue por completo.

En una realización de la invención, dicho dispositivo comprende además un segundo compartimento configurado para el cultivo de neuronas, en donde una primera región de conexión comprende el al menos un microcanal que conduce a dicho segundo compartimento conectando de este modo dicho primer compartimento con dicho segundo compartimento.

En esta realización, las neuronas se colocaron y cultivaron en el primer compartimento, y las neuritas alcanzan el segundo compartimento a través del al menos un microcanal. Dichos primer y segundo compartimentos pueden tener las mismas particularidades y características. En particular, pueden comprender dimensiones espaciales que permiten el cultivo tridimensional (3D) de las neuronas, es decir, la formación de redes o circuitos neuronales, respectivamente. En una realización ilustrativa no vinculante de la invención, debido a esto, el primer y segundo compartimentos tienen las siguientes dimensiones: aprox. > 100 pm de altura, aprox. > 300 pm de anchura y aprox. > 2 mm de longitud.

En un desarrollo adicional de la invención, el dispositivo comprende además:

- un tercer compartimento configurado para el cultivo de neuronas,

- una segunda región de conexión que conecta dichos segundo y tercer compartimentos, comprendiendo dicha segunda región de conexión el al menos un microcanal que tiene dimensiones que permiten la extensión de las neuritas desde dicho segundo a dicho tercer compartimento y que impiden la entrada del soma de las neuronas,

en donde dicho al menos un microcanal adicional comprende al menos un microelectrodo adicional incorporado en el mismo y dispuesto para registrar señales eléctricas desde y/o administrar pulsos eléctricos a las neuritas que se extienden a lo largo de dicho al menos un microcanal adicional.

Las particularidades, características y ventajas mencionadas anteriormente para el primer y segundo compartimentos, la primera región de conexión, el al menos un microcanal y el microelectrodo se aplican, según corresponda, al tercer compartimento y a la segunda región de conexión, al menos uno de los microelectrodos adicionales.

Esta realización de la invención da como resultado la ventaja de que la medición de la excitabilidad neuronal, así como la estimulación eléctrica, se hará posible a lo largo de más de una, sino dos o más neuronas o neuritas conectadas en serie a lo largo de diferentes compartimentos. Asimismo, en una realización de la invención, esta configuración permitirá la provisión de un microelectrodo de estimulación incorporado en el microcanal o microcanales de la primera región de conexión y de un microelectrodo de registro incorporado en la segunda región de conexión o viceversa. Dicha configuración puede ayudar a establecer una configuración experimental compleja donde podría examinarse la influencia del compuesto de prueba en la progresión de los impulsos eléctricos inducidos.

Huelga decir que el dispositivo de acuerdo con la invención puede comprender más de tres compartimentos, sino múltiples compartimentos, es decir, cuatro, tres, cinco, seis, ..., diez, veinte, treinta, ... etc., conectados por regiones de conexión, comprendiendo cada una de ellas, al menos un microcanal.

En otra realización de la invención, el microelectrodo se realiza y/o comprende un transductor.

Esta medida tiene la ventaja de que se utiliza un tipo de microelectrodo particularmente adecuado. Un transductor incluye los sitios de registro y estimulación de los dispositivos Semiconductores de Óxido Metálico Complementarios (CMOS, Complementary Metal-Oxide-Semiconductor) tales como CMOS-MEA.

En otra realización de la invención dicho al menos un microcanal y/o dicho al menos un microcanal adicional comprenden múltiples microelectrodos.

Esta medida tiene la ventaja de que se pueden registrar señales eléctricas y/o se pueden administrar pulsos eléctricos en diferentes secciones de las neuritas. Los múltiples microelectrodos pueden ser del mismo tipo, permitiendo así un registro más preciso y/o una estimulación más eficaz. Los múltiples electrodos también pueden ser de diferentes tipos, lo que permiten diversos registros y/o estimulaciones de señales.

En otra realización preferida de la invención, dicha primera región de conexión comprende una pluralidad de dicho microcanal y/o dicha segunda región de conexión comprende una pluralidad de dicho microcanal adicional.

Esta realización permite el registro y la estimulación en numerosas neuritas en paralelo, obteniendo así datos que reflejan mejor las condiciones fisiológicas del cerebro.

Una "pluralidad" se refiere a hasta aproximadamente 50 a aproximadamente 500 o más microcanales por región de conexión,

En otra realización, dichas dimensiones de dicho microcanal y/o de dicho microcanal adicional comprenden, en su(s) dimensión(es) más pequeña(s), un diámetro de < 5 gm, preferiblemente de aproximadamente < 4 gm, más preferiblemente de aproximadamente < 3 gm, más preferiblemente de aproximadamente < 2 gm, más preferiblemente de aproximadamente < 1 gm, más preferiblemente de aproximadamente < 0,5 gm, más preferiblemente de aproximadamente < 0,4 gm, más preferiblemente de aproximadamente 0,3 gm, más preferiblemente de aproximadamente 0,2 gm, y más preferiblemente de aproximadamente 0,1 gm.

Con esta medida se proporcionan las condiciones previas constructivas que garantizan unas dimensiones que permiten la extensión de las neuritas desde los compartimentos hasta los microcanales, pero impiden la entrada del soma de las neuronas.

En una realización de la invención múltiples dispositivos, p. ej., tal como aproximadamente 2 a 12 dispositivos, como se caracteriza en el presente documento, se ensamblan, formando así un conjunto de dispositivo que comprende múltiples unidades funcionales. Esto permitirá la ejecución de múltiples ensayos distintos en paralelo, lo que hace que la invención sea una valiosa herramienta para aplicaciones de alto rendimiento.

En otro desarrollo adicional de la invención, al menos uno de dichos primer y segundo y tercer compartimentos comprende una abertura en su parte superior, preferiblemente al menos uno de dichos primer y segundo y tercer compartimentos está abierto en la parte superior.

"Abertura o abierto en la parte superior" significa que los compartimentos son accesibles desde el exterior. Esta medida tiene la ventaja de que, p. ej., se pueden añadir a las células medios de cultivo celular o sustancias de ensayo.

En un desarrollo adicional preferido del dispositivo de acuerdo con la invención, dichos primer y segundo y tercer compartimentos comprenden depósitos terminales en dichos canales, más preferiblemente dichos depósitos están configurados para la siembra de neuronas y/o suministro de aditivos, tales como medios de cultivo y/o compuestos de ensayo.

El "depósito" comprende un volumen que es mayor que el volumen de la parte de canal de los compartimentos. También puede comprender una abertura en la parte superior que es más grande que la abertura de los compartimentos. Por lo tanto, el depósito facilita la siembra en placa de las neuronas en el dispositivo y la adición de medios, compuestos de ensayo, etc.

En otro desarrollo adicional del dispositivo de acuerdo con la invención, dichos depósitos comprenden una zona de siembra celular.

La zona de siembra celular puede comprender una barrera física que permita la siembra definida de las neuronas separadas de la zona restante del depósito. Como ejemplo, la zona de siembra celular puede realizarse mediante un hundimiento o depresión en la base de los depósitos, p. ej., en una posición central de los mismos. Debido a su separación física, la zona de siembra celular también permite depositar una estructura de soporte para el crecimiento de las neuronas en 3D, tal como un hidrogel, que puede llenar la zona de siembra celular y puede conectarse con al menos partes de los canales.

En otro desarrollo adicional de la invención, al menos uno de dichos primer y segundo y tercer compartimentos comprende un subcompartimento inferior y un subcompartimento superior superpuesto adyacente al mismo, preferiblemente dichos microcanales conducen a dicho subcompartimento inferior.

Los subcompartimentos inferior y superior superpuesto son físicamente distintos entre sí, mientras que, al mismo tiempo, están conectados entre sí. La medida permite, p. ej., el llenado del compartimento inferior con una estructura de soporte para el crecimiento de las neuronas en 3D, tal como un hidrogel, y del compartimento superior superpuesto, con medio de cultivo celular o tampón, etc., donde se pueden añadir sustancias de prueba. Después, las sustancias de ensayo pueden difundirse a través del medio o tampón y la estructura de soporte hasta las neuronas.

En una configuración preferida, el (los) microcanal(es) conduce(n) o se abre(n) en el subcompartimento inferior. Esto tiene la ventaja de que las neuritas que crecen desde las neuronas no adherentes encuentran y se extienden hacia los microcanales cerca de la parte inferior de la parte microfluídica del dispositivo que, a su vez, crea la condición para un ajuste sencillo de los microelectrodos desde la parte inferior o el fondo, respectivamente.

En otro desarrollo adicional de la invención, dicho subcompartimento inferior comprende una anchura o un diámetro que es más ancha(o) que la anchura o diámetro de dicho subcompartimento superior.

Con esta medida se realizan las condiciones constructivas para una delimitación física de los subcompartimentos inferior y superpuesto. El ensanchamiento del subcompartimento inferior sobre el compartimento superior facilita la separación de la estructura de soporte o hidrogel del medio superpuesto. Un ejemplo paradigmático y no limitativo de las dimensiones es el siguiente. Subcompartimento inferior: aprox. 400 gm de anchura; compartimento superior: aprox.

300 gm de anchura. En una realización de la invención, el subcompartimento inferior puede tener una altura de aprox.

150 gm e, independientemente, el compartimento superior puede tener una altura de aprox. 2 mm.

En un desarrollo adicional del dispositivo microfluídico de la invención, al menos uno de dicho primer y segundo y, opcionalmente, tercer compartimentos, comprenden al menos un material transparente, tal como vidrio.

"Transparente", en este contexto, significa ópticamente claro, de manera que las neuronas cultivadas puedan visualizarse con un microscopio adecuado a través del dispositivo de acuerdo con la invención. La trayectoria óptica discurre a través de la parte superior de los dispositivos, las neuronas y la parte inferior. Esta medida tiene la ventaja de que, debido a la claridad óptica de partes de los compartimentos y/o del dispositivo, la adquisición de datos estructurales de dichas arquitecturas multicelulares 3D puede captarse con resolución subcelular, p. ej., por microscopía confocal. La transparencia puede realizarse mediante una placa de vidrio, p. ej., una MEA de vidrio configurada de manera que los microelectrodos se encuentren debajo del microcanal o microcanales. Pueden utilizarse otros materiales transparentes, tales como polímeros ópticamente claros. Huelga decir que todo el dispositivo microfluídico puede estar hecho de materiales ópticamente claros.

Otra materia objeto de la invención se refiere a un método para explorar neuronas, que comprende las siguientes etapas:

- cultivar neuronas en un primer compartimento en una matriz de hidrogel o fibrosa tridimensional de manera que las neuronas no se adhieran o entren en contacto con las paredes o superficies límite de dicho primer compartimento, en donde al menos un microcanal se extiende desde dicho primer compartimento, dicho al menos un microcanal tiene dimensiones que permiten la extensión de las neuritas desde dicho primer compartimento a dicho al menos un microcanal y que impiden la entrada del soma de las neuronas en dicho al menos un microcanal;

- dejar que las neuritas de dichas neuronas crezcan a lo largo de dicho al menos un microcanal,

- registrar señales eléctricas desde y/o administrar pulsos eléctricos a dichas neuritas que crecen a lo largo de dicho al menos un microcanal, mediante al menos un microelectrodo de registro y/o al menos un microelectrodo de estimulación incorporado en dicho al menos un microcanal.

Las particularidades, características, desarrollos y ventajas adicionales mencionados para el dispositivo de acuerdo con la invención, se aplican igualmente al método de acuerdo con la invención.

En un desarrollo adicional del método de acuerdo con la invención, dicho primer compartimento está conectado a través de una primera región de conexión con un segundo compartimento, comprendiendo dicha primera región de conexión dicho al menos un microcanal que conduce a dicho segundo compartimento conectando de este modo dicho primer compartimento con dicho segundo compartimento, y se permite que las neuritas de dichas neuronas crezcan a través de dicho al menos un microcanal hacia dicho segundo compartimento.

En una realización alternativa del método de acuerdo con la invención, las neuronas pueden cultivarse en el segundo y/o tercer compartimento. Las neuronas pasarán después a través de la primera región de conexión u, opcionalmente, de la segunda región de conexión, a dicho primer y/o segundo y/o tercer compartimento y/o viceversa. Debe entenderse que, en otra realización de la invención, las neuronas pueden cultivarse en todos los compartimentos en paralelo.

En el método de acuerdo con la invención, dicho cultivo se lleva a cabo en una estructura de soporte que permite un cultivo tridimensional de dichas neuronas, concretamente, una matriz de hidrogel o fibrosa.

Esta medida tiene la ventaja de que se proporcionan estructuras preferidas que favorecen el cultivo tridimensional de las neuronas.

En otra realización del método de acuerdo con la invención, además de o en lugar de dichas neuronas, se cultivan células no neuronales.

Dicha medida tiene la ventaja de que se establece una situación que se asemeja aún más a la situación fisiológica en la que las células no neuronales asumen otras funciones tales como funciones de soporte.

En otra realización, la matriz tridimensional incluye neuroesferas y/o minicerebros y/u organoides cerebrales.

Esta medida aprovecha el uso de estructuras más heterogéneas compuestas por las arquitecturas neuronales 3D. En otro desarrollo del método de acuerdo con la invención, a dicho primer y/o segundo u, opcionalmente, tercer compartimento, se añaden aditivos, preferiblemente compuestos de ensayo.

Debe entenderse que las particularidades mencionadas anteriormente y las que se mencionarán a continuación, no solo pueden usarse en la combinación indicada en el caso respectivo, sino también en otras combinaciones o de manera aislada sin alejarse del alcance de la invención.

Las particularidades mencionadas en las realizaciones específicas también son particularidades de la invención en general, que no solo son aplicables en la realización respectiva sino también de manera aislada en el contexto de cualquier realización de la invención.

La invención también se describe y explica con más detalle haciendo referencia a los siguientes dibujos:

Fig. 1 muestra una vista en planta superior de una realización de un conjunto de dispositivo microfluídico de acuerdo con la invención;

Fig. 2 muestra una sección transversal a lo largo de la línea ll-ll de la realización representada en la Fig. 1;

Fig. 3 muestra una sección transversal a lo largo de la línea MI-MI de la realización representada en la Fig. 1; Fig. 4 muestra una ampliación de la zona de microcanales de la realización representada en la Fig. 3;

Fig. 5 muestra una vista en planta sobre la parte inferior de una de las unidades funcionales del dispositivo microfluídico de la realización mostrado en la Fig. 3;

Fig. 6 muestra una vista detallada del lado inferior de la región de conexión y los microcanales con microelectrodos integrados de la realización mostrada en la Fig. 5;

Fig. 7 muestra una vista panorámica de una realización de un conjunto de dispositivo microfluídico;

Fig. 8 ilustra un prototipo del dispositivo de acuerdo con la invención, en el que las neuronas se cultivan dentro de una matriz tridimensional en un subcompartimento inferior con un subcompartimento superior separado para perfusión líquida. Los microcanales y microelectrodos (no mostrados aquí) de acuerdo con la invención, permiten el registro y/o la estimulación de las neuronas en una matriz tridimensional.

Fig. 9 muestra una imagen de microscopio electrónico de barrido del prototipo representado en la Fig. 8.

Fig. 10 ilustra una realización del dispositivo de acuerdo con la invención desde una vista panorámica.

Fig. 11 muestra una vista en sección lateral de la realización de la Fig. 10.

Fig. 12 muestra otra realización del dispositivo de acuerdo con la invención.

Fig. 13 ilustra una realización adicional del dispositivo de acuerdo con la invención.

Fig. 14 ilustra una realización de la región de conexión.

Fig. 15 ilustra diversas realizaciones de microcanales.

Fig. 16 muestra una imagen 3D confocal de neuronas primarias marcadas con GFP cultivadas en una realización del conjunto de dispositivo de acuerdo con la invención;

Fig. 17 muestra una imagen 3D confocal de una sola neurona derivada de iPSC humana marcada con GFP que crece en el segundo compartimento de una realización del conjunto de dispositivo de acuerdo con la invención; Fig. 18 muestra un detalle de alta resolución de una sola neurita de la neurona representada en la Fig. 17;

Fig. 19 muestra (izquierda y centro) una imagen microscópica de contraste de interferencia diferencial (DIC, differential interference contrast) de neuronas derivadas de iPSC humanas cultivadas en 3D en una realización de un dispositivo microfluídico de acuerdo con la invención. El cuadro de la derecha muestra potenciales de acción registrados por microelectrodos integrados en microcanales.

Realizaciones

1. El dispositivo microfluídico

En la Fig. 1, se muestra una vista en planta superior de una realización de un conjunto de dispositivo con la referencia 10. El conjunto de dispositivo 10 puede fabricarse por medio de fotolitografía usando un polímero tal como SU-8 o por medio de moldeo por inyección usando polímeros tales como copolímero de olefina cíclica (COC) o polímero de olefina de ciclina (POC) o por medio de grabado láser selectivo usando vidrio. En la realización mostrada, el conjunto de dispositivo 10 tiene las siguientes dimensiones 32 mm (anchura) x 32 mm (longitud) x 3 mm (altura). El conjunto de dispositivo 10 comprende cuatro dispositivos o unidades funcionales correspondientes o 12a, 12b, 12c, 12c, separadas entre sí, que permiten el cultivo de cuatro cultivos de células neuronales independientes. Cada una de las unidades 12a, 12b, 12c, 12d comprende un primer 14, un segundo 16 y un tercer 18 compartimento, cada uno de ellos configurado para el cultivo de neuronas. Cada uno del primer, segundo y tercer compartimento 14, 16, 18, comprende una sección de canal 14a, 16a, 18a y un depósito terminal 14b, 16b, 18b que están conectados entre sí. Cada uno de dichos depósitos terminales 14b, 16b, 18b comprende una zona de siembra celular 14c, 16c, 18c.

En la Fig. 2 se representa una sección transversal a lo largo de la línea ll-ll del segundo compartimento 16 de la unidad funcional 12c. Esta ilustra que el depósito terminal 16b se coloca sobre una placa base 20 que puede formar una parte integrada del conjunto de dispositivo 10 pero también puede ser una MEA de vidrio fijada a la unidad superior que forma una parte microfluídica del dispositivo de manera estanca a líquidos. La zona de siembra celular 16c está incorporada en la placa base 20. El depósito terminal 16b y la zona de siembra celular 16c conducen a la sección de canal 16a.

Como se puede deducir de la Fig. 2, la sección de canal 16a y el depósito terminal 16b están abiertos en la parte superior, lo que permite la adición de medios de cultivo y compuestos de ensayo en el conjunto de dispositivo 10. También se muestra que la sección de canal 16a comprende un subcompartimento inferior 16a' y un subcompartimento superior superpuesto 16a" adyacente al mismo. El subcompartimento inferior 16a' comprende un diámetro o una anchura de canal, respectivamente, que es más ancho(a) que el diámetro o la anchura de canal, respectivamente, de dicho subcompartimento superior 16a". Tanto el subcompartimento superior superpuesto 16a" como el subcompartimento inferior 16a' se abren en el depósito terminal 16b. El subcompartimento inferior 16a' se extiende hasta la zona de siembra celular 16c como resultado de un hundimiento en la placa base 20.

En la Fig. 3 se representa una sección transversal a lo largo de la línea MI-MI de la unidad funcional 12d como se muestra en la Fig. 1. Esta ilustra la disposición de la sección de canal 16a, el subcompartimento inferior 16a' y el subcompartimento superior superpuesto 16a", los depósitos terminales 16b y las zonas de siembra celular 16c que -en esta representación- están situados en los extremos izquierdo 16b', 16c' y derecho 16b", 16c" de la sección de canal 16a. También se muestra de nuevo que tanto el subcompartimento superior superpuesto 16a" como el subcompartimento inferior 16a' se abren hacia los depósitos terminales 16b' y 16b". El subcompartimento inferior 16a' se extiende hasta las zonas de siembra celular 16c', 16c" como resultado de un rebaje en la placa base 20. Los microcanales 22 se abren en el subcompartimento inferior 16a', en particular en la parte que está fuera de los depósitos terminales 16b' y 16b". Los microcanales 22 se proporcionan en una región de conexión 24 (no mostrada aquí) que conectan el segundo compartimento 16 y el primer compartimento 14 contiguo y se extienden hasta el subcompartimento inferior 14a' de la sección de canal 14a del primer compartimento 14 (no mostrado aquí). La Fig. 4 muestra una ampliación de los microcanales 22 que se proporcionan en la región de conexión 24 que conecta el subcompartimento inferior 16a' con el subcompartimento inferior 14a'.

La Fig. 5 muestra una vista en planta en la parte inferior de la realización de una unidad funcional 12 del conjunto de dispositivo 10. Se muestran en negro las regiones de conexión 24 que comprenden los microcanales 22 que conectan el segundo compartimento 16 con el primer compartimento 14 contiguo y con el tercer compartimento 18 contiguo, y se extienden hacia los respectivos subcompartimentos inferiores 14a', 18a' (no mostrados aquí) de las secciones de canal 14a, 18a del primer y tercer compartimentos 14, 18.

La Fig. 6 muestra una vista detallada del lado inferior de la región de conexión 24 que conecta el segundo compartimento 16 con el primer compartimento 14 contiguo. En la realización representada, cada uno de los microcanales 22 comprende un microelectrodo 26 incorporado en el mismo. Los microelectrodos 26 pueden integrarse en un sustrato de MEA de vidrio debajo de cada uno de los microcanales 22 y disponerse para registrar señales eléctricas desde o administrar pulsos eléctricos a neuritas que se extienden a lo largo de dichos microcanales 22. Por lo tanto, los microelectrodos 26 incluyen microelectrodos de registro y estimulación.

En una realización preferida, pero no limitativa del conjunto de dispositivo 10, cada región de conexión 24 comprende 32 microelectrodos 26, por lo tanto, cada unidad funcional 12, comprende 64 microelectrodos 26 y todo el conjunto de dispositivo 10 comprende 256 microelectrodos 26.

La Fig. 7 muestra una vista panorámica de una realización de un conjunto de dispositivo 10 y una ampliación del depósito terminal 16b y de la zona de siembra celular 16c del segundo compartimento 16. En esta realización, la parte inferior del conjunto de dispositivo 10 microfluídico consiste en una MEA 28 de vidrio que comprende los microelectrodos 26 (no mostrados aquí) fijados a la parte microfluídica superior 30 de manera estanca a líquidos.

Para el cultivo, las células se siembran en las zonas de siembra celular 16c del segundo compartimento 16 en una estructura de soporte de hidrogel que llena los subcompartimentos inferiores 14a', 16a', 18a' hasta el borde de los subcompartimentos superiores 14a", 16a", 18a". Las neuritas pueden extenderse hacia el primer compartimento 14 contiguo y el tercer compartimento 18 creciendo a través de los microcanales 22. Los microelectrodos 26 integrados debajo de cada uno de los microcanales 22 registran potenciales de acción a lo largo de neuritas individuales o pueden aplicar pulsos eléctricos sobre las mismas.

La Fig. 8 ilustra un prototipo del dispositivo de acuerdo con la invención, donde las microestructuras se fabricaron directamente sobre sustratos de vidrio empleando resistentes negativos basados en epoxi tales como SU-8 y un proceso litográfico UV. A continuación, se laminan capas más gruesas adicionales en la parte superior usando resistentes de película seca (DFR, dry film resists). Se compone principalmente de dos compartimentos microfluídicos, uno encima del otro, separados por un delgado DFR perforado. La Fig. 9 muestra una imagen SEM de dicha membrana perforada fabricada por los inventores usando laminación de un resistente de película seca. El grosor de la membrana es de 20 gm. Las perforaciones tienen un diámetro de 30 gm. El compartimento inferior se usó para sembrar neuronas dispersas en una matriz 3D tal como hidrogel, mientras que el compartimento superior se llenó más tarde con medios líquidos. La difusión a través de la membrana perforada garantiza que los nutrientes, los gases y los catabolitos se intercambian continuamente entre los compartimentos de líquido y de gel, proporcionando las condiciones necesarias para el cultivo prolongado de neuronas en 3D y la aplicación de compuestos de ensayo. Los microcanales 22 (no mostrados aquí) se proporcionan en una región de conexión 24 (no mostrada aquí) y comprenden microelectrodos 26 (no mostrados aquí). Los microcanales permiten la extensión de neuritas desde neuronas dispersas en 3D y, de este modo, permiten el registro y/o la estimulación de su actividad eléctrica por los microelectrodos.

En la Fig. 10 se representa una realización del dispositivo de acuerdo con la invención desde una vista panorámica. En la Fig. 11 se representa una vista lateral de esta realización del dispositivo de acuerdo con la invención.

En la Fig. 12 se representa otra realización del dispositivo de acuerdo con la invención. En esta realización, se proporciona un compartimento abierto con su región de conexión inferior conteniendo siete microcanales cerrados con microelectrodos individuales. Las neuronas extienden neuritas en los microcanales.

En la Fig. 13 se ilustra una realización adicional del dispositivo de acuerdo con la invención. En esta realización de tres compartimentos separados por dos regiones de conexión, conteniendo cada una de ellas siete microcanales con microelectrodos individuales. En los compartimentos superior e inferior se cultivan diferentes tipos de células neurales. Sus cuerpos celulares están restringidos a sus respectivos compartimentos. Las células se comunican mediante conexiones sinápticas después de extender las neuritas a través de los canales hacia el compartimento central.

La Fig. 14 ilustra el diseño de la región de conexión. En una vista panorámica, se representan múltiples microcanales en una región de conexión, teniendo cada microcanal un solo microelectrodo.

En la Fig. 15 se ilustran diversas realizaciones de microcanales, tales como un canal recto con un solo microelectrodo (A), un canal recto con múltiples microelectrodos (B), un canal con un microelectrodo largo (C), un canal con anchura variable (D), un canal curvo (E), canales divididos con múltiples microelectrodos (F, G).

2. Fabricación y evaluación

General: Se ha diseñado y fabricado una MEA que tiene una huella de 49 mm x 49 mm y que contiene 256 microelectrodos de registro integrados, dispuestos en una matriz de 4 x 64. El diseño de microcanales alineados con microelectrodos (3 gm de altura, 7,5 gm de anchura, 300 gm de longitud) en la superficie superior de la MEA se consigue mediante fotolitografía de SU-8.

Al mismo tiempo, se evalúa una gama de diferentes diseños, materiales y procesos de fabricación para determinar su capacidad de producir de forma consistente la parte microfluídica del conjunto del dispositivo (32 mm de anchura, 32 mm de longitud, 3 mm de altura) compatible con el objetivo de cultivar células en 3D. En particular, materiales como COC y POC, considerados como productos de referencia industriales para aplicaciones biofarmacéuticas, se prueban para moldeo por inyección. Los materiales como el vidrio se prueban para el grabado láser selectivo. El material se prueba para el proceso de unión sucesiva de MEA (mediante unión por disolvente o unión térmica o unión química), así como para el cultivo de redes neuronales 3D viables.

Después de la unión, el nuevo dispositivo híbrido MEA/microfluídico se somete a pruebas biológicas y caracterización funcional.

Diseño y Masterización: El diseño del conjunto de dispositivo microfluídico puede transferirse a un diseño para fabricación en masa. Tras tener en cuenta las reglas de diseño típicas del moldeo por inyección y adaptar el diseño en consecuencia, los insertos metálicos se pueden fabricar mediante microfresado. Dependiendo de la complejidad, puede requerirse un nuevo molde base durante el desarrollo.

Moldeo por inyección: Después de realizar el inserto para el molde, las pruebas de inyección se pueden realizar con diferentes materiales, p. ej., diferentes grados de COC o POC. Esto permitirá probar y comparar diferentes propiedades del material moldeado para el proceso de unión posterior, así como en la aplicación final.

Grabado láser selectivo: El diseño del conjunto de dispositivo microfluídico puede transferirse a un diseño para fabricación en masa. Después de tener cuidado con las reglas de diseño típicas para el grabado láser selectivo y adaptar el diseño en consecuencia, las piezas microfluídicas de vidrio se pueden producir mediante grabado láser selectivo.

Unión: La MEA se puede fabricar de tal manera que la superficie superior se microdiseñe mediante un proceso fotolitográfico basado en SU8. Durante la tarea de unión, la pieza moldeada puede unirse permanentemente a esta capa de SU8. La unión de piezas moldeadas por inyección se puede realizar mediante unión con disolvente o unión térmica o unión química. Se usa un proceso de unión de COC/POC o vidrio a SU8 que no destruirá las microparticularidades en SU8 y que tendrá una fuerza de unión suficiente para la aplicación.

Pruebas de caracterización y aplicación: Las pruebas de caracterización y aplicación se realizan en paralelo. La caracterización incluye: mediciones geométricas mediante microscopía electrónica de barrido (SEM, siglas del inglés scanning electrón microscopy), comprobaciones de perfilometría y transparencia. Las pruebas de aplicación pueden comenzar en paralelo a las pruebas de unión. Esto dará las primeras pistas sobre la fuerza de unión y cómo se ve afectada por las diferentes estrategias utilizadas para la unión.

Combinación de lecturas estructurales y funcionales: Debido a la claridad óptica del dispositivo, la captura de datos estructurales mediante microscopía en vivo permitirá reconstruir morfologías neuronales en 3D en detalle. Un estudio reciente realizado por los inventores ha demostrado cómo mediante el uso de microscopía confocal de alta resolución fue posible identificar ultraestructuras neuronales delicadas, tales como espinas dendríticas, en neuronas 3D vivas cultivadas en estructuras de soporte de matrigel. El registro de la actividad neuronal mediante microelectrodos ofrece la ventaja, sobre otras técnicas electrofisiológicas, de ser no invasivo. Por lo tanto, durante el cultivo, pueden tomarse mediciones repetidamente en cualquier punto temporal. En combinación con experimentos de formación de imágenes, esto ofrece la posibilidad única de combinar la adquisición continua de parámetros estructurales y funcionales de neuronas cultivadas en 3D en un único ensayo en vivo.

Validación de la plataforma: Esto se llevará a cabo para verificar la capacidad del dispositivo de acuerdo con la invención para identificar y predecir un intervalo de interacciones entre clases específicas de compuestos y rutas neuronales. Las lecturas electrofisiológicas y estructurales pueden emplearse para monitorizar las respuestas a un grupo pequeño y seleccionado de compuestos de referencia. Esto garantizará que se seleccionarán las moléculas más relevantes, de acuerdo con una lista de criterios tales como: i) estructura química, ii) vías de aplicación (fármacos del sistema nervioso, fármacos para otros órganos, pesticidas) y iii) intervalo de rutas celulares acopladas. Para fines de prueba, los compuestos se pueden dividir en 3 conjuntos de calibración, que contiene 5 compuestos cada uno (3 controles positivos y 2 negativos), con el fin de identificar subtipos de diseños de respuesta:

1. Conjunto de eficacia: fármacos neurofarmacológicamente activos.

2. Conjunto de seguridad: moléculas con actividad convulsiva demostrada.

3. Conjunto de toxicidad: contaminantes ambientales y pesticidas con un mecanismo de acción definido.

Rendimiento: Cada conjunto de dispositivo microfluídico, con una huella de solo 49 mm x 49 mm, puede contener un total de 256 microelectrodos, dispuestos en una matriz de hasta 12 x 21 microelectrodos. Esto garantizará múltiples experimentos independientes en cada unidad funcional, teniendo cada una de ellas suficientes microelectrodos para muestrear un gran número de neuronas. En cada chip, se podría ejecutar un intervalo de concentraciones de compuesto y soluciones de control, lo que permitiría realizar campañas de cribado rápidas.

Rentabilidad: Debido al tamaño compacto del conjunto de dispositivo microfluídico, ejecutar cada ensayo individual solo requerirá unos pocos miles de células y menos de 100 gl de compuestos de ensayo. Esto significa, por ejemplo, que un vial de células iPS humanas, que contiene 1-2 millones de células en promedio, será suficiente para hasta 60 mediciones independientes. Esto, teniendo en cuenta los elevados precios de las células iPS, contribuirá a mantener los costes a un nivel aceptable para este tipo de ensayo.

Biocompatibilidad: La mayoría de los dispositivos microfluídicos utilizados actualmente para crear órganos en chip se fabrican en PDMS. Aunque este material ofrece varias ventajas, tales como facilidad de fabricación, claridad óptica y permeabilidad a los gases, por otro lado, el PDMS puede absorber de manera variable pequeños compuestos hidrófobos, lo que puede provocar cambios en la biodisponibilidad de algunos compuestos. Por esta razón, materiales alternativos tales como COC o POC o vidrio, productos de referencia en pruebas biofarmacéuticas, se pueden utilizar para fabricar el chip microfluídico. Aunque esto requerirá un proceso más complejo para la producción del dispositivo y la unión térmica o con disolvente o adhesivo para fijarlo al sustrato MEA, el uso de dichos materiales se considera ventajoso teniendo en cuenta sus fines de cribado previstos.

Cultivo 3D prolongado: Lograr la supervivencia celular prolongada en estructuras de soporte de hidrogel requiere un flujo controlado de medios de cultivo a través del chip microfluídico. De hecho, los medios se utilizan para intercambiar gases entre el aire y el gel, para proporcionar nutrientes y eliminar metabolitos, para aplicar compuestos durante las pruebas de los fármacos. Estas particularidades se implementarán en el diseño del conjunto de dispositivo microfluídico, basado en un canal que contiene un carril de hidrogel (400 gm de anchura, 150 gm de altura) en la parte inferior del dispositivo (subcompartimento inferior) y un carril de líquido (300 gm de anchura, hasta 2 mm de altura) en la parte superior del carril de gel (subcompartimento superior). De esta manera, los medios/soluciones/fármacos se pueden aplicar/reemplazar fácilmente en el carril de líquido superior a través de depósitos y desde aquí pueden difundirse rápidamente a las células contenidas en el carril de gel inferior.

Manipulación: La manipulación de líquidos y las aplicaciones farmacológicas se realizarán como se ha descrito anteriormente, usando un sistema abierto que no requiere ningún equipo específico, ya que todos los líquidos del carril superior se moverán entre los depósitos que pasan a través de canales abiertos de baja resistencia. Esto ofrece la opción de añadir control robótico de todas las etapas de manipulación de líquidos, según se requiera finalmente con fines de cribado.

Funcionalidades interplataforma: Con una huella de solo 49 mm x 49 mm y un fondo de vidrio ópticamente claro, el dispositivo microfluídico de acuerdo con la invención estará disponible para capturar simultáneamente datos electrofisiológicos y de formación de imágenes usando un aparato de registro MEA estándar y microscopía de disco confocal/de barrido. Las matrices de microelectrodos pueden diseñarse compatibles con el formato de hardwareZsoftware de registro producido por proveedores comerciales.

3. Cultivo y exploración de células nerviosas

Los inventores han probado con éxito la capacidad del conjunto de dispositivo microfluídico para cultivar y explorar neuronas en el contexto de redes neuronales 3D.

La Fig. 16 muestra una formación de imágenes en 3D confocal en vivo de neuronas primarias marcadas con GFP en un dispositivo microfluídico de acuerdo con la invención. Desde un compartimento central que contiene el soma, varias neuritas se extienden a través de los canales microfluídicos en la parte inferior del dispositivo, hasta que alcanzan los compartimentos laterales y continúan creciendo en 3D.

Emulación de redes cerebrales en 3D: Para reconstruir parcialmente la estructura multicelular compleja del cerebro humano, células neuronales (excitatorias e inhibidoras) y gliales (astrocitos) disponibles en el comercio derivadas de iPSC humanas, se cultivan en 3D dentro del conjunto de dispositivo microfluídico, utilizando una serie de estructuras de soporte de hidrogel biomiméticas (bioderivadas o sintéticas). Para evaluar la viabilidad celular, el crecimiento neuronal y las arquitecturas 3D obtenidas utilizando diferentes diseños microfluídicos, los materiales y tipos de células, los experimentos de formación de imágenes en vivo se llevan a cabo marcando las células con una serie de proteínas fluorescentes codificadas genéticamente. Usando este enfoque, los inventores obtuvieron datos con diversos dispositivos prototipo que mostraban neuronas marcadas con GFP que crecían extensamente en 3D a los pocos días de la siembra. La Fig. 17 muestra una formación de imágenes en 3D confocal en vivo de neuronas derivadas de iPSC humanas marcadas con GFP que crecen en el compartimento central de un conjunto de dispositivo microfluídico de acuerdo con la invención. Las neuritas pueden verse creciendo extensamente en todas las direcciones.

La Fig. 18 muestra una reconstrucción digital de mayor resolución de la imagen anterior mostrada en la Fig. 17. Se observa una sola neurita (de menos de 1 gm de grosor) en 3D desde diferentes ángulos, siendo claramente visibles varias espinas dendríticas.

Registro de actividad neuronal de redes 3D: A medida que las neuritas se alargan a través de los microcanales dedicados en la parte inferior del conjunto de dispositivo microfluídico de acuerdo con la invención, los microelectrodos integrados debajo de cada microcanal permitirán medir la propagación del potencial de acción y la transmisión sináptica entre neuronas conectadas en 3D. Se evalúan diferentes tamaños y posiciones de los microelectrodos dentro de los microcanales para identificar las dimensiones ideales para obtener la mejor relación entre la señal y el fondo. Los inventores obtuvieron resultados de prueba de concepto que muestran que las neuronas derivadas de iPSC cultivadas en 3D (Fig. 19, a la izquierda) son capaces de hacer crecer neuritas a través de los microcanales (Fig. 19, en el centro), donde los microelectrodos integrados podrían medir claramente, a partir de neuritas individuales, potenciales de acción individuales que se originan a partir de neuronas espontáneamente activas (Fig. 19, a la derecha).

Como puede observarse en la Fig. 19, que muestra imágenes en vivo de contraste de interferencia diferencial (DIC) de neuronas derivadas de iPSC humanas cultivadas en 3D en un dispositivo microfluídico de acuerdo con la invención, las células se pueden observar en diferentes posiciones a lo largo del eje z. En el cuadro de la izquierda se ven principalmente los cuerpos celulares, mientras que en el del centro puede observarse las neuritas entrando en los microcanales de la parte inferior del dispositivo. El trazo de la derecha muestra los potenciales de acción registrados a partir de microelectrodos (no visibles aquí) integrados en la parte inferior de los microcanales.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un dispositivo (10), que registra la actividad eléctrica de las células neurales y/o las estimula, en una red neuronal tridimensional, que comprende:

- un primer compartimento (14) que comprende una matriz de hidrogel o fibrosa tridimensional configurada para contener neuronas y mantener dichas neuronas en dicha matriz tridimensional, y

- al menos un microcanal (22) que se extiende desde dicho primer compartimento (14) y que tiene dimensiones que permiten la extensión de las neuritas desde dicho primer compartimento (14) a dicho microcanal (22) y que impiden la entrada del soma de las neuronas en dicho al menos un microcanal (22),

caracterizado por que dicho al menos un microcanal (22) comprende al menos un microelectrodo (26) incorporado en el mismo y dispuesto para registrar señales eléctricas desde y/o administrar pulsos eléctricos a las neuritas que se extienden a lo largo de dicho al menos un microcanal (22), y

por que dicha matriz tridimensional está configurada para permitir el cultivo de las células sin adherirse o entrar en contacto con las paredes o superficies límite del compartimento (14).

2. El dispositivo (10) de la reivindicación 1, que comprende además un segundo compartimento (16), en donde una primera región de conexión (24) comprende el al menos un microcanal (22) que conduce a dicho segundo compartimento conectando de este modo dicho primer compartimento (14) con dicho segundo compartimento (16).

3. El dispositivo (10) de la reivindicación 1 o 2, que comprende además:

- un tercer compartimento (18),

- una segunda región de conexión (24) que conecta dichos segundo compartimento (16) y tercer compartimento (18), comprendiendo dicha segunda región de conexión (24) al menos un microcanal adicional (22) que tiene dimensiones que permiten el paso de las neuritas desde dicho segundo compartimento (16) a dicho tercer compartimento (18) y que impiden la entrada del soma de las neuronas en dicho(s) microcanal(s) (22),

en donde dicho al menos un microcanal (22) adicional comprende al menos un microelectrodo (26) adicional incorporado en el mismo y dispuesto para registrar señales eléctricas desde y/o administrar pulsos eléctricos a las neuritas que se extienden a lo largo de dicho al menos un microcanal (22) adicional,

preferiblemente en donde dicha segunda región de conexión (24) comprende una pluralidad de dicho microcanal adicional (22).

4. El dispositivo (10) de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el (los) microelectrodo(s) (26) comprende(n) un transductor.

5. El dispositivo (10) de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dicho al menos un microcanal (22) y/o dicho al menos un microcanal adicional (22) comprenden múltiples microelectrodos (26).

6. El dispositivo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dicha primera región de conexión (24) comprende una pluralidad de dichos microcanales (22).

7. El dispositivo (10) de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dichas dimensiones de dicho microcanal (22) y/o de dicho microcanal adicional (22), en su(s) dimensión(es) más pequeña(s), son < 5 gm, preferiblemente de aproximadamente < 4 gm, más preferiblemente de aproximadamente < 3 gm, más preferiblemente de aproximadamente < 2 gm, más preferiblemente de aproximadamente < 1 gm, más preferiblemente de aproximadamente < 0,5 gm, más preferiblemente de aproximadamente < 0,4 gm, más preferiblemente de aproximadamente 0,3 gm, más preferiblemente de aproximadamente 0,2 gm, y más preferiblemente de aproximadamente 0,1 gm.

8. El dispositivo (10) de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que al menos uno de dicho primer compartimento (14) y, si corresponde, segundo compartimento (16) y tercer compartimento (18), comprende material transparente, preferiblemente vidrio.

9. Un método para explorar neuronas, que comprende las siguientes etapas:

- cultivar neuronas en un primer compartimento (14) en una matriz de hidrogel o fibrosa tridimensional de manera que las neuronas no se adhieran o entren en contacto con las paredes o superficies límite de dicho primer compartimento (14), en donde al menos un microcanal (22) se extiende desde dicho primer compartimento (14), dicho al menos un microcanal (22) tiene dimensiones que permiten la extensión de las neuritas desde dicho primer compartimento (14) a dicho al menos un microcanal (22) y que impiden la entrada del soma de las neuronas en dicho al menos un microcanal (22);

- dejar que las neuritas de dichas neuronas crezcan a lo largo de dicho al menos un microcanal (22), - registrar señales eléctricas desde y/o administrar pulsos eléctricos a dichas neuritas que crecen a lo largo de dicho al menos un microcanal mediante al menos un microelectrodo de registro (26) y/o al menos un microelectrodo de estimulación (26) incorporado en dicho al menos un microcanal (22).

10. El método de la reivindicación 9, caracterizado por que dicho primer compartimento (14) está conectado a través de una primera región de conexión (24) con un segundo compartimento (16), comprendiendo dicha primera región de conexión (24) dicho al menos un microcanal (22) que conduce a dicho segundo compartimento (16) conectando de ese modo dicho primer compartimento (14) con dicho segundo compartimento (16), y se permite que las neuritas de dichas neuronas crezcan a través de dicho al menos un microcanal (22) hacia dicho segundo compartimento (16).

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9 y 10, caracterizado por que, además de dichas neuronas, se cultivan células no neuronales.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado por que la matriz tridimensional incluye neuroesferas y/u organoides cerebrales.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, caracterizado por que, a dicho primer y/o segundo compartimento se añaden aditivos, preferiblemente compuestos de ensayo.