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ES2971639T3 - Composiciones y métodos novedosos útiles para tratar o prevenir enfermedades o trastornos hepáticos y favorecer la pérdida de peso - Google Patents

Composiciones y métodos novedosos útiles para tratar o prevenir enfermedades o trastornos hepáticos y favorecer la pérdida de peso Download PDF

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ES2971639T3
ES2971639T3 ES15833246T ES15833246T ES2971639T3 ES 2971639 T3 ES2971639 T3 ES 2971639T3 ES 15833246 T ES15833246 T ES 15833246T ES 15833246 T ES15833246 T ES 15833246T ES 2971639 T3 ES2971639 T3 ES 2971639T3
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Spain
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mammal
digoxin
liver
adenosine
lps
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Wajahat Mehal
Xinshou Ouyang
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Yale University
Original Assignee
Yale University
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Abstract

La invención incluye un método para prevenir o tratar una enfermedad o trastorno tóxico del hígado, tal como, entre otros, esteatohepatitis no alcohólica (NASH), lesión hepática asociada o causada por el consumo de alcohol en un mamífero afectado por NASH, hepatitis alcohólica, drogas lesión hepática inducida, colangitis esclerosante primaria, hepatitis viral, fibrosis hepática, cirrosis hepática y otras afecciones hepáticas tóxicas, en un sujeto, tal como un mamífero. La invención también incluye un método para promover la pérdida de peso en un sujeto, tal como un mamífero. La invención comprende administrar al sujeto una dosis terapéuticamente eficaz de al menos un glucósido cardíaco o un solvato, sal, profármaco o derivado del mismo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y métodos novedosos útiles para tratar o prevenir enfermedades o trastornos hepáticos y favorecer la pérdida de peso
Referencia a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica prioridad, en virtud de 35 U.S.C. § 119(e), a la solicitud provisional de EE. UU. n° 62/039.619, presentada el 20 de agosto de 2014.
Declaración con respecto a la investigación o desarrollo patrocinados por el gobierno federal
Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno bajo la subvención número R01DK076674-01A2 otorgada por los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno posee determinados derechos sobre la invención.
Antecedentes de la invención
La esteatohepatitis (también conocida como esteatosis hepática) es un tipo de enfermedad hepática, se caracteriza por inflamación hepática con acumulación simultánea de grasa en el hígado. Observada normalmente en las personas alcohólicas como parte de la enfermedad hepática alcohólica, la esteatohepatitis también se da con frecuencia en personas con diabetes y obesidad, y está relacionada con el síndrome metabólico.
Cuando no se asocia a una ingesta excesiva de alcohol, se denomina esteatosis hepática no alcohólica (también conocida como "EHNA"), y es la forma progresiva de la esteatosis hepática no alcohólica relativamente benigna. La esteatohepatitis de cualquier etiología puede evolucionar a cirrosis, y actualmente se cree que la EHNA es una causa frecuente de cirrosis sin causa aparente. La EHNA también está asociada a la deficiencia de lipasa ácida lisosomal.
A nivel microscópico, la esteatohepatitis se caracteriza por la acumulación de grasa hepática (esteatosis), inflamación lobular mixta, degeneración globular de los hepatocitos (a veces con cuerpos de Mallory identificables), núcleos de hepatocitos glucogenados y fibrosis pericelular. El patrón "de alambre de gallinero" de la fibrosis pericelular, que solo afecta secundariamente a las zonas portales en fases posteriores, es muy característico y se identifica en las tinciones de tricrómico.
La EHNA suele asociarse al síndrome metabólico (obesidad, dislipidemia y resistencia a la insulina). La progresión ulterior de la enfermedad se debe probablemente a la inflamación crónica y a la formación de especies reactivas del oxígeno. La inflamación hepática inducida metabólicamente recluta componentes inflamatorios adicionales (neutrófilos, vía AP-1) y causa EHNA. Un estudio retrospectivo de cohortes concluyó que la insuficiencia hepática es la principal causa de morbilidad y mortalidad en la cirrosis asociada a EHNA. Ningún tratamiento se ha convertido aún en el "tratamiento de referencia" para la EHNA.
La digoxina es un glucósido cardíaco purificado similar a la digitoxina extraído de la planta conocida como dedalera,Digitalis lanata.La digoxina se utiliza ampliamente en el tratamiento de diferentes cardiopatías, a saber, la fibrilación auricular, el aleteo auricular y, a veces, la insuficiencia cardíaca que no puede controlarse con otra medicación. En tales enfermedades, una frecuencia ventricular elevada provoca un tiempo de llenado diastólico insuficiente. Ralentizando la conducción en el nódulo auriculoventricular (AV) y aumentando su periodo refractario, la digoxina puede reducir la frecuencia ventricular. La arritmia en sí no se ve afectada, pero la función de bombeo del corazón mejora debido a un mejor llenado.
La digoxina es un glucósido cardíaco que actúa como agente inotrópico; disminuye la acción del canal de ATPasa Na+/K+uniéndose a un sitio alostérico. Normalmente, 3 moléculas de Na+ salen de la célula cardíaca y 2 de K+ entran en la célula cardíaca. Como resultado, la concentración de Na+ en el miocito aumenta e inactiva la proteína antiportadora NCX, en donde ya no se bombea Na+ al miocito. Por otro lado, la inactivación de NCX provoca un aumento de la concentración de Ca2+ en el interior de la célula, dado que el Ca2+ no puede ser bombeado. El aumento de la concentración de Ca2+ favorece la contracción del corazón. La digoxina también actúa como agonista vagal, con un efecto secundario de disminución de la frecuencia cardíaca. La toxicidad de la digoxina se caracteriza por taquicardia auricular (debido a la ectopia) y bloqueo AV (debido a sus propiedades estimulantes vagales). La digoxina reduce aún más el riesgo de padecer ciertos tipos de cáncer, pero no a las concentraciones terapéuticas utilizadas para tratar las cardiopatías.
Existe una necesidad en la técnica de identificar tratamientos terapéuticos novedosos que puedan utilizarse para tratar o prevenir la esteatohepatitis no alcohólica (también conocida como EHNA) en un mamífero. También es necesario identificar nuevos tratamientos terapéuticos que puedan utilizarse para tratar o prevenir otras enfermedades o trastornos hepáticos, tales como, aunque no de forma limitativa, lesión hepática asociada y/o causada por el consumo de alcohol en un mamífero afectado de EHNA, hepatitis alcohólica, lesión hepática inducida por fármacos, colangitis esclerosante primaria, hepatitis vírica, fibrosis hepática, cirrosis hepática y/u otras afecciones hepáticas tóxicas en un mamífero. También hay una necesidad en la técnica de identificar nuevos tratamientos terapéuticos que se puedan utilizar para tratar o prevenir potenciar la pérdida de peso en un mamífero. La presente invención aborda y satisface estas necesidades.
Breve sumario de la invención
La invención proporciona las siguientes realizaciones definidas en los puntos 1-7
1. Una composición farmacéutica que comprende digoxina para usar en el tratamiento o la prevención de una enfermedad o un trastorno hepático seleccionado del grupo que consiste en esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), lesión hepática asociada o causada por el consumo de alcohol en un mamífero afectado de EHNA y hepatitis alcohólica, en un mamífero que lo necesita,
en donde la composición se administra al mamífero, preferentemente un ser humano, en una cantidad terapéuticamente eficaz; y
en donde la administración de la composición al mamífero proporciona un nivel plasmático de digoxina en el mamífero igual o inferior a aproximadamente 0,8 ng/ml.
2. La composición farmacéutica para usar de acuerdo con el punto 1, en donde la digoxina inhibe al menos una de (i) la síntesis de HIF-1a en el hígado del mamífero; y (ii) la esteatosis hepática en el mamífero.
3. La composición farmacéutica para usar de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 y 2, en donde la digoxina reduce en el mamífero al menos una afección seleccionada del grupo consistente en daño hepático, glucólisis y obesidad inducida por la grasa en el mamífero.
4. La composición farmacéutica para usar de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 3, y al menos un agente adicional, o un solvato, sal, profármaco o derivado del mismo seleccionado entre un medicamento antidiabético y el ácido abeticólico.
5. La composición farmacéutica para usar de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1-4, en donde la cantidad de digoxina administrada al mamífero no causa un efecto cardíaco clínicamente significativo en el mamífero, en donde el efecto cardíaco clínicamente significativo es preferentemente al menos uno seleccionado del grupo que consiste en la aparición de taquicardia auricular, aparición de bloqueo auriculoventricular, reducción de la conducción del nódulo auriculoventricular y aumento del período refractario efectivo dentro del nódulo auriculoventricular.
6. La composición farmacéutica para usar de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1-5, en donde la composición se administra al mamífero aproximadamente una vez al día, aproximadamente cada dos días, aproximadamente cada tres días, aproximadamente cada cuatro días, aproximadamente cada cinco días, aproximadamente cada seis días o aproximadamente una vez a la semana, y/o se administra al mamífero por al menos una vía seleccionada del grupo que consiste en nasal, inhalatoria, tópica, oral, bucal, rectal, pleural, peritoneal, vaginal, intramuscular, subcutánea, transdérmica, epidural, intratraqueal, ótica, intraocular, intratecal e intravenosa.
7. La composición farmacéutica de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1-6, en donde la administración de la composición al sujeto proporciona un nivel plasmático de digoxina seleccionado del grupo que consiste en: de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 0,05 ng/ml; de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,1 ng/ml; de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,15 ng/ml; de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,2 ng/ml; de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,25 ng/ml; de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,3 ng/ml; de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,35 ng/ml; de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,4 ng/ml; de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,45 ng/ml; de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,5 ng/ml; de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,55 ng/ml; de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,6 ng/ml; de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,65 ng/ml; de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,7 ng/ml; de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,75 ng/ml; y de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,8 ng/ml.
En el presente documento se divulga un método para tratar o prevenir en un mamífero que lo necesita una enfermedad o un trastorno hepático seleccionado del grupo que consiste en esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), lesión hepática asociada y/o causada por el consumo de alcohol en un mamífero afectado de EHNA, hepatitis alcohólica, lesión hepática inducida por fármacos, colangitis esclerosante primaria, hepatitis vírica, fibrosis hepática, cirrosis hepática y/u otras afecciones hepáticas tóxicas. Además, el presente documento divulga un método para promover la pérdida de peso en un mamífero que lo necesite. En el presente documento se divulga además un kit que comprende al menos un glucósido cardíaco, un aplicador y un material didáctico para el uso del mismo. Se divulga además en el presente documento una composición farmacéutica que comprende al menos un glucósido cardíaco, o un solvato, sal, profármaco o derivado del mismo, en donde el al menos un glucósido cardíaco comprende digoxina, por lo que la administración de la composición a un mamífero proporciona un nivel plasmático de digoxina igual o inferior a aproximadamente 0,8 ng/ml en el mamífero. Se divulga además en el presente documento una composición farmacéutica que comprende al menos un glucósido cardíaco (o un solvato, sal, profármaco o derivado del mismo) y al menos un agente adicional (o un solvato, sal, profármaco o derivado del mismo) que trata, previene o reduce los síntomas de una enfermedad o trastorno hepático seleccionado del grupo que consiste en EHNA, lesión hepática asociada y/o causada por el consumo de alcohol en un mamífero afectado de EHNA, hepatitis alcohólica, lesión hepática inducida por fármacos, colangitis esclerosante primaria, hepatitis vírica, fibrosis hepática, cirrosis hepática y/u otras afecciones hepáticas tóxicas. Se divulga además en el presente documento una composición farmacéutica que comprende al menos un glucósido cardíaco (o un solvato, sal, profármaco o derivado del mismo) y al menos un agente adicional que favorezca la pérdida de peso (o un solvato, sal, profármaco o derivado del mismo).
En ciertas realizaciones de la divulgación, el método comprende administrar al mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un glucósido cardíaco. En otras realizaciones, la administración del al menos un glucósido cardíaco al mamífero proporciona un nivel plasmático de glucósido cardíaco en el mamífero que es igual o inferior al nivel plasmático de glucósido cardíaco requerido para tratar o prevenir una cardiopatía en mamíferos afectados por la cardiopatía. En otras realizaciones más, la administración de la composición y/o al menos un glucósido cardíaco al mamífero proporciona un nivel plasmático de glucósido cardíaco en el mamífero que es inferior al nivel plasmático de glucósido cardíaco requerido para tratar o prevenir una cardiopatía en mamíferos afectados por la cardiopatía.
En ciertos aspectos de la divulgación, el glucósido cardíaco reduce la obesidad inducida por la grasa en el mamífero. En otros aspectos de la divulgación, el mamífero no experimenta una reducción significativa de la ingesta de alimentos. En otros aspectos más de la divulgación, al mamífero se le administra además al menos un agente adicional que favorece la pérdida de peso. En otros aspectos más de la divulgación, la administración del al menos un glucósido cardíaco al mamífero no causa un efecto cardíaco clínicamente significativo en el mamífero. En otros aspectos de la divulgación, el efecto cardíaco clínicamente significativo comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste en la aparición de taquicardia auricular, aparición de bloqueo auriculoventricular, reducción de la conducción del nódulo auriculoventricular y aumento del período refractario efectivo dentro del nódulo auriculoventricular. En otros aspectos más de la divulgación, el glucósido cardíaco inhibe la síntesis de HIF-1a en el hígado del mamífero. En otros aspectos más de la divulgación, el glucósido cardíaco inhibe la inflamación en el hígado del mamífero. En otros aspectos más de la divulgación, el glucósido cardíaco inhibe la esteatosis hepática en el mamífero. En otros aspectos más de la divulgación, el glucósido cardíaco reduce en el mamífero al menos una afección seleccionada del grupo que consiste en daño hepático y glucólisis. En otros aspectos más de la divulgación, el glucósido cardíaco reduce la obesidad inducida por la grasa en el mamífero. En otros aspectos más de la divulgación, el glucósido cardíaco mejora la tolerancia a la glucosa en el mamífero. En otros aspectos más de la divulgación, el glucósido cardíaco reduce uno o varios síntomas y/o complicaciones diabéticos en el mamífero.
En ciertos aspectos de la divulgación, el al menos un glucósido cardíaco es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en acetildigitoxina, bufalina, cinobufagerina, convalatoxina, cimarina, digitoxigenina, digotoxina, digoxigerina, digoxina, gitoxigenina, gitoxina, marinobufagenina, nerifolina, oleandrina, ouabaína, periplocimarina, peruvosida, proscilaridina A, estrofantina K y UNBS1450.
En ciertos aspectos de la divulgación, el al menos un glucósido cardíaco comprende digoxina. En otros aspectos de la divulgación, el al menos un glucósido cardíaco comprende digoxina, y la administración del al menos un glucósido cardíaco al mamífero proporciona un nivel plasmático de digoxina igual o inferior a aproximadamente 0,8 ng/ml. En otros aspectos más de la divulgación, el al menos un glucósido cardíaco comprende digoxina, y la administración del al menos un glucósido cardíaco al mamífero proporciona un nivel plasmático de digoxina seleccionado del grupo que consiste en: de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 0,05 ng/ml; de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,1 ng/ml; de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,15 ng/ml; de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,2 ng/ml; de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,25 ng/ml; de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,3 ng/ml; de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,35 ng/ml; de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,4 ng/ml; de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,45 ng/ml; de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,5 ng/ml; de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,55 ng/ml; de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,6 ng/ml; de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,65 ng/ml; de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,7 ng/ml; de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,75 ng/ml; y de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,8 ng/ml.
En ciertos aspectos de la divulgación, el al menos un glucósido cardíaco se administra al mamífero aproximadamente una vez al día, aproximadamente cada dos días, aproximadamente cada tres días, aproximadamente cada cuatro días, aproximadamente cada cinco días, aproximadamente cada seis días o aproximadamente una vez a la semana.
En ciertos aspectos de la divulgación, al mamífero se le administra además al menos un agente adicional que reduce los síntomas de, trata o previene una enfermedad o el trastorno hepático seleccionado del grupo que consiste en EHNA, lesión hepática asociada y/o causada por el consumo de alcohol en un mamífero afectado de EHNA, hepatitis alcohólica, lesión hepática inducida por fármacos, colangitis esclerosante primaria, hepatitis vírica, fibrosis hepática, cirrosis hepática y/u otras afecciones hepáticas tóxicas. En otros aspectos de la divulgación, el al menos un agente adicional comprende un medicamento antidiabético o ácido abeticólico. En otros aspectos más de la divulgación, el al menos un glucósido cardíaco se administra al mamífero por al menos una vía seleccionada del grupo consistente en nasal, inhalatoria, tópica, oral, bucal, rectal, pleural, peritoneal, vaginal, intramuscular, subcutánea, transdérmica, epidural, intratraqueal, ótica, intraocular, intratecal e intravenosa. En otros aspectos más de la divulgación, el mamífero es un ser humano.
En ciertos aspectos de la divulgación, el material instructivo comprende instrucciones para prevenir o tratar en un mamífero una enfermedad o un trastorno hepático seleccionado del grupo que consiste en NASH, lesión hepática asociada y/o causada por el consumo de alcohol en un mamífero afectado de EHNA, hepatitis alcohólica, lesión hepática inducida por fármacos, colangitis esclerosante primaria, hepatitis vírica, fibrosis hepática, cirrosis hepática y/u otras afecciones hepáticas tóxicas. En otros aspectos de la divulgación, el kit comprende además al menos un agente adicional que trata, previene o reduce los síntomas de una enfermedad o trastorno hepático seleccionado del grupo que consiste en EHNA, lesión hepática asociada y/o causada por el consumo de alcohol en un mamífero afectado de EHNA, hepatitis alcohólica, lesión hepática inducida por fármacos, colangitis esclerosante primaria, hepatitis vírica, fibrosis hepática, cirrosis hepática y/u otras afecciones hepáticas tóxicas. En otros aspectos más de la divulgación, el al menos un agente adicional comprende un medicamento antidiabético o ácido abeticólico. En otros aspectos más de la divulgación, el material didáctico comprende instrucciones para promover la pérdida de peso en un mamífero. En otros aspectos más de la divulgación, el kit comprende además al menos un agente adicional que favorece la pérdida de peso. En otros aspectos más de la divulgación, la administración al mamífero de la al menos una cantidad de glucósido cardíaco descrita en el material de instrucción proporciona un nivel plasmático de glucósido cardíaco en el mamífero que es igual o inferior al nivel plasmático de glucósido cardíaco requerido para tratar o prevenir una cardiopatía en mamíferos aquejados de la cardiopatía.
Breve descripción de los dibujos
La siguiente descripción detallada de realizaciones específicas de la invención se entenderá mejor cuando se lea junto con los dibujos adjuntos. A fin de ilustrar la invención, en los dibujos se muestran realizaciones específicas. Debe entenderse que, sin embargo, la invención no está limitada a las disposiciones precisas e instrumentos de las realizaciones mostradas en los dibujos.
Las Figs. 1A-1J ilustran el hallazgo de que la adenosina estimula la producción de IL-1p de forma dependiente del inflamosoma NLRP3. Se obtuvieron macrófagos peritoneales murinos (MPM) de ratones de tipo natural (WT,Wild Type)(Figs. 1A-1D, 1F-1I),Illr-/-(Fig. 1E) o ratonesNlrp3-/-, ASC-/-, P2xr7-/-,oCaspasa-1-/-(Fig. 1J) y se sensibilizaron con LPS durante 16 horas. Fig. 1A: a continuación, se trató durante 1 hora con adenosina (Ad, 100 j M), inhibidor de la adenosina desaminasa (EHNA, 10 j M), adenosina desaminasa (ADA, 10 U ml-1), ATP difosfohidrolasa (Apirasa, 10 U ml-1) o eritro-9-(2-hidroxi-3-nonil)adenina (EHNA, 10 j M) (Figs. 1B, 1F-1J)), agonista de la Pan adenosina (NECA, 1 j M, 10 j M) (Figs. 1C, 1E) o (Figs. 1D, 11) por NECA durante 1 y 6 horas, y luego se aplicó de manera intermitente ATP durante 20 min. Se midió el ensayo inmunoenzimático (ELISA) de la secreción de IL-1p, TNF-a, IL-10 e IFN-y en los sobrenadantes celulares después de aplicar ATP de manera intermitente durante 5 horas (Figs. 1A, 1C-1E, 1J) o el tiempo indicado (Figs. 1B, 1G-1l). El ensayo de LDH se llevó a cabo después de aplicar de manera intermitente ATP de acuerdo con el curso temporal indicado (Fig. 1F). Los datos se expresan como la media ± DT de al menos tres experimentos independientes. *p <0,05 determinado por la prueba de latde Student.
Las Figs.2A-2H ilustran el hallazgo de que la adenosina media el aumento de IL-1p a través del receptor A2A y amplifica las vías de la señal 1 y la señal 2. Fig. 2A: los MPM sensibilizados con LPS se trataron con NECA (10 j M) en presencia o ausencia de tres antagonistas diferentes del receptor de adenosina para A1 (DPCPX, 10 nM), A2A (ZM 241385, 10<j>M), A2B (MRS1706, 10 nM), A3 (MRS1523, 5<j>M) o sus combinaciones durante 1 hora, y se aplicó de manera intermitente ATP durante 20 min. Figs. 2A-2B: el agonista específico del receptor A2A (CGS21680) y el antagonista ZM 241385 aumentan y bloquean la producción de IL-1p respectivamente. Fig. 2C: la liberación de LDH en los MPM no mostró diferencias en presencia o ausencia de ZM 241385 como se muestra en la Fig. 2A. Fig. 2D: los MPM de células deficientes en el receptor A2A tienen una producción baja de IL-1p, que no es aumentada por NECA ni CGS 21680. Fig. 2E: CGS21680 aumenta la inducción de la expresión de ARNm deIl1b,y esta disminuyó en las células deficientes en el receptor A2A. Fig. 2F: la pérdida del receptor A2A en macrófagos da lugar a niveles mucho más bajos de expresión de la proteína A deIl1ben respuesta al LPS. Fig. 2G: CGS21680 y ZM241395 aumentan y disminuyen la producción de caspasa-1 escindida, respectivamente. Fig. 2H: la producción de caspasa-1 escindida disminuye en macrófagos deficientes en receptores A2A. Los datos se expresan como la media ± DT de al menos tres experimentos independientes. Las inmunotransferencias mostradas son resultados representativos de al menos tres experimentos independientes.p<0,05 determinado por la prueba de latde Student.
Las Figs. 3A-3I ilustran el hallazgo de que la adenosina sustituye a la tolerancia inducida por LPS y aumenta la producción de IL-1p mediante la regulación de la transcripción de pro-IL-1p a través de la vía AMPc-PKA. Se utilizaron MPM en todos los experimentos siguientes. Fig. 3A: sensibilizados (sens.) con LPS (100 ng/ml) durante 16 horas seguido de estimulación (estim.) con LPS (100 ng/ml) o NECA (10 j M), o CGS21680 (10 j M) en presencia o ausencia de LPS (100 ng/ml) durante 6 horas. Fig. 3B: tratados con forskolina durante 6 horas en las dosis indicadas con y sin sensibilización de L<p>S. Fig. 3C: tratados con o sin NECA (10<j>M), CGS21680 (10<j>M) o db-cAMP (200<j>M) durante 6 horas. Fig. 3D: sensibilizados con LPS y tratados con NECA o CGS21680 en presencia y ausencia de SQ22536, H89 y PKi. Fig. 3E: sensibilizados con LPS durante 16 horas y tratados con ATP durante 20 min, seguido de CGS 21680 en presencia o ausencia de los inhibidores de la adenilil ciclasa y PKA SQ22536 y H-89. Fig. 3F: sensibilizados con LPS y tratados con o sin NECA (10<j>M) o db-cAMP (200<j>M) durante 6 horas. Fig. 3G: tratados con o sin CGS21680 (10 j M) durante 3 horas, y se detuvo la transcripción añadiendo 5 jg/m l de actinomicina D y se recogieron muestras de ARN en los puntos temporales indicados. Fig. 3H: los MPM sensibilizados con LPS obtenidos de ratones de tipo natural oA2aR-cKOse estimularon con NECA (10 j M) durante 6 horas. Se cosecharon las células y se aisló el<a>R<n>después de cada tratamiento y se cuantificó la expresión génica deIl1by otros genes como se indica mediante PCR en tiempo real utilizando cebadores específicos. Fig. 31: sensibilizados con LPS durante 16 horas y tratados con ATP durante 20 min, seguido de CGS 21680 en presencia o ausencia de SQ22536 o H-89. El análisis de inmunotransferencia de la proIL-1p caspasa-1 en el lisado celular se realizó mediante anticuerpos específicos anti-IL-1p y anti-caspasa-1 p10 (Figs. 3C, 3E-3F, 31). Los datos se expresan como la media ±<d>T de tres experimentos independientes. Las inmunotransferencias mostradas son resultados representativos de al menos tres experimentos independientes. *p <0,05 determinado por la prueba de latde Student.
Las Figs. 4A-4H ilustran el hallazgo de que la adenosina media el aumento de pro-IL-1p a través de una vía dependiente de HIF-1a. Fig. 4A: sitios de consenso de unión NEkB y HRE en el promotor de IL-1p. Fig. 4B: Los MPM sensibilizados con LPS obtenidos deA2aR-cKOy controles fueron estimulados con o sin NECA o CGS21680. Fig. 4C: los MPM sensibilizados con LPS obtenidos deHIF-1a-cKOy controles se estimularon con o sin NECA en los momentos indicados. Se cosecharon las células y se aisló el ARN después de cada tratamiento y se cuantificó la expresión génica deIl1by Hiflamediante PCR en tiempo real. Fig. 4D: las células THP-1 se transfectaron con la construcción de luciferasa promotora de HRE y el plásmido de p-galactosidasa en presencia o ausencia del plásmido CREB dominante negativo (CREBA), y a continuación se sensibilizaron con LPS/<p>M<a>seguido de NECA. Fig. 4E: las células THP-1 se transfectaron con la construcción de luciferasa promotora de IL-1p humana y el plásmido de p-galactosidasa en presencia o ausencia de CREBA, y luego se sensibilizaron con LPS/PMA seguido de CGS21680 o NECA. Se midieron las actividades de luciferasa y se normalizaron con respecto a la actividad de p-galactosidasa y con respecto a los controles. Los datos son la media ± DT de cultivos por triplicado y son representativos de tres experimentos independientes. Fig. 4F: las células CD14-MD2-TLR4-HEK 293 se transfectaron con la construcción de luciferasa promotora de NE<k>B y el vector indicador de control de luciferasa de Renilla (Rluc), y luego se trataron con CGS21680, NECA o ZM241395 en presencia de LPS. Se midieron las actividades de luciferasa y se normalizaron con la actividad de Rluc y el valor normalizado con los controles como se indica. Los datos son la media ± DT de cultivos por triplicado y son representativos de tres experimentos independientes para las Figs. 4B-4F. Fig. 4G: los MPM sensibilizados con LPS obtenidos deHIF-1a-cKOy controles se trataron con o sin NECA en diferentes puntos temporales como se indica, seguido de la aplicación intermitente de ATP. Los sobrenadantes celulares se recogieron 5 horas después de la aplicación intermitente de ATP. La IL-1p se midió en el sobrenadante celular mediante ELISA. Los datos se expresan como la media ± DT de tres experimentos independientes. Fig. 4H: Los MPM sensibilizados con LPS obtenidos de ratonesHIF-1a-cKOy ratones de control se trataron con o sin NECA en diferentes momentos como se indica, seguido de la aplicación intermitente de ATP. Los lisados celulares se recogieron tras la aplicación intermitente de ATP. Se midieron HIF-1a, pro-caspasa-1, Caspasa-1 y pro-IL-1p en el sobrenadante celular mediante transferencia Western. Las inmunotransferencias mostradas son resultados representativos de al menos tres experimentos independientes.
Las Figs. 5A-5H ilustran el hallazgo de que la lesión hepática y la fibrosis dependen de la señalización del receptor A2A en los macrófagos. Fig. 5A: los ratones A2<a>R-<c>KO y los ratones de control recibieron mediante inyección por vía intraperitoneal LPS (1 mg/kg) y D-galactosamina (500 mg kg_1) durante 6 horas, tras lo cual se recogió tejido hepático y suero para la tinción H&E y el ensayo de ALT. Fig. 5B: se recogieron muestras de ARN hepático y se analizó el genIllbmediante PCR en tiempo real utilizando cebadores específicos. Fig. 5C: se analizaron lisados de tejido hepático para detectar el nivel de procaspasa-1, caspasa-1 escindida (p 10) y proteína p-actina mediante análisis de inmunotransferencia utilizando anticuerpos específicos. Los datos se expresan como la media ± DT de 10-11 ratones de cada grupo para las Figs. 5A-5D. Fig. 5d: se recogió suero para medir la IL-1p. Fig. 5E: los ratones A2<a>R-<c>KO y los ratones de control recibieron por inyección por vía intraperitoneal una dosis única de TAA seguida de la recogida de tejido hepático de acuerdo con lo indicado para la tinción H&E. Fig. 5F: se recogieron muestras de ARN hepático y se analizó el genIl1bmediante PCR en tiempo real. Fig. 5G: también se obtuvo tejido hepático el día 7 tras la inyección de TAA y se tiñó para H&E y rojo Sirius para detectar la fibrosis. Fig. 5H: se recogieron sueros y se realizó el ensayo de ALT en suero (los datos se expresan como la media ± DT de 5 ratones en cada grupo). *p <0,05 determinado por la prueba de latde Student. Las barras de escala corresponden a 500 jm .
Las Figs. 6A-6B ilustran el hallazgo de que los macrófagos de la médula ósea y las células de Kupffer del hígado aumentan la IL-1p en respuesta a la señalización de adenosina. Fig. 6A: los macrófagos derivados de médula ósea (MDMO) murinos se sensibilizaron con LPS durante 16 horas, se trataron con NECA (10 j M) durante 1 hora y, a continuación, se aplicó de manera intermitente ATP. Fig. 6b: las células Kupffer primarias de hígado murino se sensibilizaron con LPS durante 16 horas, se trataron con NECA (10 j M) durante 1 hora y, a continuación, se aplicó de manera intermitente ATP. La secreción de IL-1p se midió en sobrenadantes 5 horas después de aplicar de manera intermitente ATP. Los datos se expresan como la media ± DT de al menos tres experimentos independientes. *p <0,05 determinado por la prueba de latde Student.
Las Figs. 7A-7H ilustran el hallazgo de que la señalización de adenosina es importante en la regulación de amplios tipos de estímulos del inflamosoma. Fig. 7A: Los MPM sensibilizados con LPS se trataron con NECA (10 j M) durante 1 hora y, a continuación, se expusieron a MSU durante 6 horas. Fig. 7B: los MPM sensibilizados con CpG-B se trataron con EHNA (10<j>M) durante 1 hora y luego se aplicó de manera intermitente ATP. Fig. 7C: los MPM sensibilizados con P CpG-B se trataron con ZM241385 (10<j>M), y luego se aplicó de manera intermitente ATP. Fig. 7D: los MPM sensibilizados con Pam(3)CysSK(4) se trataron con ZM241385 (10<j>M), y luego se aplicó de manera intermitente ATP. Fig. 7E: los MPM sensibilizados con LPS se trataron con ZM241385 (10 j M) y, a continuación, se estimularon con microesferas de PMMA de 150 micrómetros. Fig. 7F: los MPM sensibilizados con LPS se trataron con ZM241385 (10|jM) y, a continuación, se expusieron a MSU durante 6 horas. Fig. 7G: los MPM se pretrataron con o sin ZM241385 (10 j M) durante 1 hora y, a continuación, se estimularon con lisado hepático durante 2 horas. La secreción de IL-1p se midió en sobrenadantes 5 horas después de aplicar de manera intermitente ATP. Fig. 7H: se inyectaron cristales de MSU por vía intraperitoneal en ratones de tipo natural con o sin ZM241385, y se cuantificó la IL-1p en el lavado peritoneal al cabo de 6 horas. Los datos se expresan como la media ± DT de 6 ratones en cada grupo. *p <0,05 determinado por la prueba de latde Student.
Las Figs. 8A-8B ilustran la reducción en macrófagos peritoneales de la expresión de AzaR y HIF-1a utilizando el sistema Cre/flox. Fig. 8A: las células MPM obtenidas de ratonesAdora2afl/fl-LysM-Cre+ (A2aR-cKo)yAdorafl/fl -LysM-Cre-control(Ctrl)se estimularon con LPS (100 ng ml-1), Pam(3)CysSK(4) (10 ng ml-1) o CpG-B (3 j M) durante 6 horas. Se cosecharon las células y se aisló el ARN después de cada tratamiento, y se cuantificó la expresión génica deAdora2amediante PCR en tiempo real utilizando cebadores génicos específicos. Los datos se expresan como la media ± DT de tres experimentos independientes. Fig. 8B: Las células MPM obtenidas de los ratonesHIF-1afl/fl-LysM-Cre+ (HIF-1a-cKO)yHlF-1afl/fl-LysM-Cre-control (Ctrl)se expusieron a hipoxia durante 12 horas. Los lisados celulares se analizaron mediante inmunotransferencia utilizando un anticuerpo HIF-1a específico. Los datos de inmunotransferencia mostrados son representativos de tres experimentos independientes
Las Figs. 9A-9H ilustran cambios en la expresión de citocinas y genes de reparación tisular en macrófagos peritoneales en respuesta a agonistas de adenosina. Se estimularon con LPS (100 ng ml-1), los MPM no sensibilizados previamente con l Ps o sensibilizados con LPS, CGS21680 (10 j M) o NEc A (10 j M) en diferentes puntos temporales como se indica. Las células fueron cosechadas, y aisló el ARN después de cada tratamiento y se cuantificó la expresión génica de ProIL-1p(Il1b)(Fig. 9A), IL-6(Il6)(Fig. 9B), IL-4 (Il4) (Fig. 9C), TNF-a(tnfa)(Fig. 9D), TIMP-1(Timpl)(Fig. 9E), VEGF(vegf)(Fig. 9F), PGK-1(PgkI)(Fig. 9G), GLUT-1(Slc2a1)(Fig. 9H) mediante PCR en tiempo real utilizando cada conjunto de cebadores de genes específicos como se indica. Los datos se expresan como la media ± DT de tres experimentos independientes. *p <0,05 determinado por la prueba de latde Student.
Las Figs. 10A-10F ilustran la expresión de genes antimicrobianos en macrófagos peritoneales deficientes en A2aR yIl1rpor agonistas de adenosina. Los MPM no sensibilizados previamente con LPS o sensibilizados con LPS fueron estimulados con LPS (100 ng ml-1) o NECA (10<j>M) durante 6 horas. Las células fueron cosechadas y se aisló el ARN después de cada tratamiento, y se cuantificó la expresión génica deMarco(Figs. 10A, 10D),Ptges(Figs. 10B, 10E) yFpr1(Figs. 10C, 10F) por PCR en tiempo real utilizando cada conjunto de cebadores de genes específicos como se indica. Los datos se expresan como la media ± DT de tres experimentos independientes. *p <0,05 determinado por la prueba de latde Student.
Las Figs. 11A-11D ilustran la diferencia de la secreción de IL-1p mediante la señalización de AMPc en condiciones tolerogénicas y no tolerogénicas de LPS en la actividad del inflamosoma. A las 16 horas (Fig. 11A) o 3 horas (Fig. 11B) los MDMO sensibilizados con LPS fueron tratados con db-cAMP (200<j>M) durante 1 hora, y luego recibieron un tratamiento intermitente de ATP. Los sobrenadantes celulares se recogieron de acuerdo con el curso temporal indicado tras la aplicación intermitente de ATP para el ensayo de IL-1p mediante ELISA. Figs. 11C-11D: a las 3 horas, los MDMO sensibilizados con LPS fueron tratados con forskolina a diferentes dosis, como se indica, durante 1 hora, y luego se les aplicó de manera intermitente ATP. Los sobrenadantes celulares se recogieron a las 5 horas después de la aplicación intermitente de ATP para el ensayo de IL-1p por ELISA (Fig. 11C), y los lisados celulares se cosecharon para detectar la caspasa-1 activa mediante transferencia Western (Fig. 11D). Los datos se expresan como la media ± DT de tres experimentos independientes. *p <0,05 determinado por la prueba de latde Student.
Las Figs. 12A-12D ilustran el hallazgo de que se requiere HIF-1a para la regulación al alza inducida por adenosina de Pro-IL-1p y NLRP3. Fig. 12A: Los MPM sensibilizados con LPS fueron estimulados con NECA (10<j>M) en presencia o ausencia del inhibidor de HIF-1a CAY 10585 (30<j>M) durante 6 horas. Se cosecharon las células y se aisló el ARN después de cada tratamiento, y se cuantificó la expresión génica deI llamediante PCR en tiempo real utilizando cebadores génicos específicos. Los datos se expresan como la media ± DT de tres experimentos independientes. Fig. 12B: Los MPM sensibilizados con LPS fueron tratados con o sin CGS21680 (10<j>M) o NECA (10<j>M) durante 1 hora, o CAY10585 y luego tratados intermitentemente con ATP. La secreción de IL-1p en sobrenadantes celulares se midió tras 5 horas de aplicación intermitente de ATP. Los datos se expresan como la media ± DT de tres experimentos independientes. Figs. 12C-12D: Los MPM sensibilizados con LPS obtenidos de ratones de tipo naturaloHlF-1a-cKOfueron estimulados con NECA (10 j M) durante 6 horas. Se cosecharon las células y se aisló el ARN después de cada tratamiento, y se cuantificó la expresión génica deNlrp3yTxnipmediante PCR en tiempo real utilizando cada conjunto de cebadores génicos específicos. Los datos se expresan como la media ± DT de tres experimentos independientes. *p <0,05 determinado por la prueba de latde Student.
La Fig. 13 es un conjunto de imágenes que ilustran la distribución normal de las principales poblaciones celulares hepáticas en ratonesA22R-CKO.Se recogieron tejidos hepáticos de ratonesA2aR-cKOy ratones de control y, a continuación, se aislaron las células mononucleares hepáticas. Las frecuencias de los subconjuntos CD11b+, CD11b+/F4/80+, Gr1+/Ly6-C+ y Ly6-C+ se determinaron mediante FACS.
Las Figs. 14A-14F ilustran el aumento de la ALT sérica y los cambios en la expresión génica hepática en ratones tratados con LPS en presencia o ausencia del agonista adenosina. Se inyectó LPS (1 pg/ratón) por vía intraperitoneal a ratones C57BL/6 de tipo natural. 16 horas después, los ratones recibieron NECA (2,5 mg kg-1 de peso corporal) y D-galactosamina (500 mg kg-1) por vía i.p. durante 2 horas tras la recogida de tejido hepático y suero. Se determinó la ALT sérica (Fig. 14A), y la expresión génica deI l l f i(Fig. 14B),Il6(Fig. 14C),Hifla.(Fig. 14D), se cuantificaronNlrp3(Fig. 14E) y tnfa(Fig. 14<f>) por PCR en tiempo real utilizando cada conjunto de cebadores de genes específicos como se indica. Los datos se expresan como la media ± DT de 6 ratones en cada grupo de tratamiento. *p <0,05 determinado por la prueba de latde Student.
Las Figs. 15A-15C ilustran la producción constante deIL1pmediante la inyección repetida de TAA en ratonesA2aR-cKO.(Fig. 15A) Diagrama de la inyección de TAA (200 mg kg-1 peso corporal). Figs. 15B-15C: el tejido hepático y el suero se recogieron 16 horas después de la última inyección, los lisados de tejido se aplicaron para pro-IL-1p e IL-1p madura mediante transferencia Western (Fig. 15B), y los niveles de IL-1p en suero se determinaron por ELISA (Fig. 15C). Los datos se expresan como la media ± DT de 5 ratones en cada grupo. *p <0,05 determinado por la prueba de latde Student.
Las Figs. 16A-16B ilustran el aumento de la fibrosis hepática en ratones de control de tipo natural pero no en los ratones deficientes en caspasa-1 en respuesta al agonista adenosina. Fig. 16A: Los ratonesCasp-1-/y de tipo natural recibieron por inyección intraperitonealmente con TAA con la inyección simultánea de CGS21680 (2,5 mg kg'1 de peso corporal) o vehículo. Los tejidos hepáticos de cada grupo se recogieron 3 días después de la primera inyección y el colágeno tisular se visualizó mediante tinción con rojo Sirius. La barra de escala corresponde a 500 pm. Fig. 16B: se extrajo el ARN total del hígado y se cuantificaron los niveles de ARNm deTimpl.Los datos se expresan como la media ± DT de tres experimentos independientes. *p <0,05 determinado por la prueba de latde Student.
Las Figs. 17A-17B ilustran las dos señales (señal 1 y señal 2) que participan en la activación del inflamosoma (Fig. 17A) y el papel que desempeña la adenosina en la regulación de la activación del inflamosoma (Fig. B.
La Fig. 18 ilustra la estructura de la digoxina.
La Fig. 19 es un gráfico de barras que ilustra los niveles plasmáticos de digoxina en ratones. Se inyectó diariamente solución salina o digoxina en ratones a una dosis de 1,0 mg/kg. Los niveles plasmáticos de digoxina medidos 24 horas después de la última inyección estaban en el intervalo terapéutico para los seres humanos (0,8-2 ng/ml) o por debajo del mismo.
Las Figs. 20A-20C ilustran el hallazgo de que la digoxina inhibe la inflamación en un modelo de lesión hepática aguda.
Las Figs. 21A-21C ilustran el hallazgo de que la digoxina reduce el daño hepático, la inflamación, la glucólisis y el colesterol total. Fig. 21A: a los ratones C57BL/6 de tipo natural se les suministró comida de dieta rica en grasas (Research diets D12451 con un 45 % de grasas) durante 12 semanas con o sin la inyección simultánea i.p. de digoxina (dos veces por semana, 1,0 mg/kg) o control de PBS. Los tejidos hepáticos se tiñeron con tinción H & E, y los neutrófilos se tiñeron con células que expresaban tanto CD11b como Ly6G mediante FACS. Los datos se expresan como la media ± DT de 5 ratones en cada grupo de tratamiento. *p <0,05 determinado por la prueba de latde Student. Fig. 21B: los sueros se recogieron como se ilustra en la Fig. 21a, y se sometieron a la determinación del nivel sérico de colesterol total mediante el método enzimático. Los datos se expresan como la media ± DT de 5 ratones en cada grupo de tratamiento. *p <0,05 determinado por la prueba de latde Student. Fig. 21C: el ARN total del hígado se aisló siguiendo el procedimiento de la Fig. 21a, y se sometió al análisis del transcriptoma con illumina. Se enumeraron los más de 15 genes más expresados. Los datos se expresan como la media ± DT de 3 ratones en cada grupo de tratamiento
Las Figs. 22A-22D ilustran el hallazgo de que la digoxina reduce la obesidad inducida por una alimentación rica en grasas en ratones. A los ratones C57BL/6 de tipo natural se les suministró comida de dieta rica en grasas (Research diets D12451 con un 45% de grasas) durante 12 semanas con o sin la inyección simultánea i.p. de digoxina (dos veces por semana, 1,0 mg/kg) o control de PBS. El peso corporal se controló cuidadosamente como el cambio del promedio de cada 3 días. Una imagen representativa mostraba los cambios morfológicos de ratones a los que se inyectó i.p. con o sin digoxina (1 mg/kg) durante 12 semanas. La Fig. 22A ilustra ejemplos de ratones con dieta rica en grasas con (DIG) y sin (Ctrl) digoxina. Los ratones sometidos a la DRG registraron un menor aumento de peso (Fig. 22B). Se muestra la proporción entre el tejido adiposo blanco y el peso corporal después de 12 semanas (Fig. 22C). No se observó ningún cambio significativo en la ingesta de alimentos (como el cambio de el promedio de cada 3 días) para los ratones con la DRG (Fig. 22D). Los datos se expresan como la media ± DT de 5 ratones en cada grupo de tratamiento. *p <0,05 determinado por la prueba de latde Student.
Las Figs. 23A-23D ilustran el hallazgo de que la digoxina protege la gravedad de la insuficiencia hepática aguda experimental. Se administró digoxina por vía intraperitoneal a ratones C57BL/6 en dosis de 2, 1, 0,2, 0,05 mg/kg de peso corporal y solución salina de control durante 1 hora y, a continuación, se expuso a los ratones a LPS (1 mg/kg de peso corporal)/D-galactosamina (D-GalN) durante 5 horas. La morfología del tejido hepático se determinó mediante la tinción H & E, y la inflamación se determinó mediante la infiltración de neutrófilos de la tinción de anticuerpos Gr-1. Se ilustran las tinciones H & E representativas (Fig. 23A, superior), y el área positiva de Gr-1 (Fig. 23A, inferior) de secciones hepáticas (aumento original x100) de digoxina y control de solución salina. Los gráficos muestran la cuantificación del área lesionada (Fig. 23B) o Gr-1 (Fig. 23C) positiva mediante morfometría utilizando Image J. *p <0,05 para cada dosis del grupo digoxina frente al control de solución salina. Se midió la actividad del marcador de lesión hepática alanina transaminasa (ALT) en el nivel sérico de digoxina frente al control de solución salina (Fig. 23 D). Todos los datos de la figura se muestran como la media ± DT. La significación estadística se determinó mediante ANOVA unidireccional.
Las Figs. 24A-24G ilustran el hallazgo de que la digoxina limita la esteatosis hepática y la inflamación. Fig. 24A: los ratones C57BL/6 fueron alimentados con la DRG o pienso simultáneamente con inyección intraperitoneal de digoxina (1 mg/kg) y control de solución salina dos veces por semana durante 12 semanas (Figs. 24A, 24<c>, 24F, 24G) o con la DRG durante las primeras 5 semanas y luego comenzaron simultáneamente a recibir la inyección intraperitoneal de digoxina (1 mg/kg) durante otras 3 semanas (Figs. 24B, 24D, 24E, 24H). Los tejidos hepáticos se sometieron a tinción H & E y los gráficos muestran la cuantificación de la puntuación de la actividad histológica de la NAFLD (Figs. 24A-24B). La inflamación del tejido hepático también se determinó mediante la infiltración de neutrófilos y monocitos, que se midió mediante la células que expresaban tanto CD11b como Ly6G y las que expresaban tanto CD11b como Ly6C mediante FACS (Figs. 24F-24H). Se muestran flujos FACS representativos de digoxina frente a control de solución salina (Figs. 24F-24G). Se realizó la cuantificación de neutrófilos y monocitos en digoxina frente al control de solución salina. Se midió el nivel sérico de ALT en digoxina frente al control de solución salina (Figs. 24C-24D). Se determinó el marcador de esteatosis por acumulación de triglicéridos (TG) en el hígado después del tratamiento con digoxina en comparación con el control de solución salina (Fig. 24E). Todos los datos de la figura se muestran como la media ± DT de 5 ratones de cada grupo. La significación estadística se determinó mediante ANOVA unidireccional. *p <0,05, **p<0,01 para cada grupo de digoxina frente al control de solución salina.
Las Figs. 25A-25H ilustran el hallazgo de que la digoxina alivia el estrés oxidativo hepático y la activación del inflamosoma. Se inyectó a ratones C57BL/6 por vía intraperitoneal digoxina (1 mg/kg) y PBS de control durante 1 hora, y luego se les administró LPS (1 mg/kg)/D-GlaN (500 mg/kg) durante 5 horas; los ratones C57BL/6 recibieron una dieta hipercalórica con inyección intraperitoneal simultánea de digoxina (1 mg/kg) durante 12 semanas. El estrés oxidativo celular y la producción intracelular de ROS se monitorizaron mediante la inyección intraperitoneal de DHE en los últimos 30 minutos antes del sacrificio de los ratones. Se ilustran las tinciones representativas de DHE en LPSID-GlaN (Fig. 25A) y DRG (Fig. 25B) de digoxina frente al control de solución salina. Se realizó la cuantificación del área positiva de DHE en digoxina frente al control de solución salina (Fig. 25A, inferior, y Fig. 25B, inferior). Se aisló el ARN total del tejido hepático y se aplicó para la expresión génica de proIL-1p, TNFa, NLRP3 y HIF1a (Figs.
25C-25F). La proteína hepática total se aplicó para la expresión proteica de HIF1a, caspasa-1, prolL-1p mediante transferencia Western (Fig. 25H). La IL-1p sérica se midió mediante ELISA (Fig. 25G). Todos los datos de la figura se muestran como la media ± DT de 5 ratones de cada grupo. La significación estadística se determinó mediante ANOVA unidireccional. *p <0,05, **p<0,01 para cada grupo de digoxina frente al control de solución salina.
La Fig. 26 ilustra el hallazgo de que la digoxina limita la esteatosis hepática y la inflamación de forma dependiente de una dosis baja. Los ratones C57BL/6 fueron alimentados con la DRG o pienso simultáneamente con inyección intraperitoneal de digoxina (0,2 y 0,05 mg/kg) y control de solución salina dos veces por semana durante 12 semanas. Los tejidos hepáticos se sometieron a tinción con H & E, y los gráficos muestran la cuantificación de la puntuación de la actividad histológica de la NAFLD. Se midió el nivel sérico de ALT en digoxina frente al control de solución salina. Todos los datos de la figura se ilustran como la media ± DT de 5 ratones de cada grupo. La significación estadística se determinó mediante ANOVA unidireccional. *p <0,05, para cada grupo de digoxina frente al control de solución salina.
La Fig. 27 comprende un gráfico que ilustra la producción de ROS en neutrófilos humanos. Los neutrófilos humanos se trataron con DIG en la dosis indicada durante 3 horas y, a continuación, con CM-H2DCFDA (diacetato de 5-(y-6)-clorometil-2',7'-diclorodihidrofluoresceína, éster acetilado; un derivado clorometílico de H2DCFDA, útil como indicador fluorescente de las especies reactivas del oxígeno (ROS) en las células) durante 20 min. La densidad de CM-H2DCFDA se midió mediante un lector de placas cinético.
Las Figs. 28A-28D comprenden un conjunto de gráficos que ilustran el hallazgo de que la administración de digoxina cambia el peso corporal de los ratones sometidos a la<d>R<g>. Los ratones C57BL/6 fueron alimentados con la DRG o pienso simultáneamente con digoxina en las dosis indicadas y control de solución salina dos veces a la semana durante 12 semanas (Figs. 28A-28C), o con la DRG durante las primeras 5 semanas y luego comenzaron recibir simultáneamente digoxina (1 mg/kg) durante otras 3 semanas (Fig. 28D). El peso corporal se controló dos veces por semana (Figs. 28A-28D). Todos los datos de la figura se muestran como la media ± D<t>de 5 ratones de cada grupo. Se determinó la significación estadística. *p <0,05.
Las Figs. 29A-29B comprenden un conjunto de gráficos que ilustran el hallazgo de que la digoxina no afecta a la ingesta de alimentos de los ratones que siguen la DRG. Los ratones C57BL/6 fueron alimentados con la DRG o pienso simultáneamente con digoxina en las dosis indicadas y control de solución salina dos veces por semana durante 12 semanas (Figs. 29A-29B). La ingesta de alimentos se midió dos veces por semana (Figs. 29A-29B). Todos los datos de la figura proceden de 5 ratones de cada grupo.
Las Figs. 30A-30C comprenden un conjunto de imágenes y gráficos que ilustran la morfología de los ratones sometidos a la DRG tras el tratamiento con digoxina. Los ratones C57BL/6 fueron alimentados con la DRG o pienso simultáneamente con digoxina y control de solución salina dos veces por semana durante 12 semanas (Figs. 30A-30C). Se ilustran imágenes morfológicas representativas de ratón, hígado y tejido adiposo blanco (TAB) (Figs. 30A-30B). Se midió la cuantificación del hígado, blanco con ración de peso corporal (Fig. 30C). Se determinó la significación estadística. *p <0,05.
Las Figs. 31A-31B comprenden un conjunto de imágenes y gráficos que ilustran el hallazgo de que la digoxina reduce la deposición de grasa. Los ratones C57BL/6 fueron alimentados con la DRG o pienso simultáneamente con digoxina como digoxina (1 mg/kg) y control de solución salina dos veces por semana durante 12 semanas (Figs. 31A-31B). La sección del hígado se tiñó con aceite rojo. Se mostró la tinción representativa de aceite rojo (Fig. 31A, izquierda) y la cuantificación del área positiva de aceite rojo se midió utilizando Image J (Fig. 31A, derecha). El contenido hepático de TG se midió mediante ELISA (Fig. 31B). Todos los datos de la figura proceden de 5 ratones de cada grupo. Se determinó la significación estadística. *p <0,05.
Descripción detallada de la invención
En un aspecto, la divulgación se refiere al descubrimiento inesperado de que dosis bajas de glucósidos cardíacos son eficaces para tratar o prevenir la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) en un mamífero. En otro aspecto, la presente invención se refiere al descubrimiento inesperado de que dosis bajas de glucósidos cardíacos son eficaces para tratar o prevenir enfermedades o trastornos hepáticos, tales como, aunque no de forma limitativa, lesiones hepáticas asociadas y/o causadas por el consumo de alcohol en un mamífero afectado de NASH, hepatitis alcohólica, lesión hepática inducida por fármacos, colangitis esclerosante primaria, hepatitis vírica, fibrosis hepática, cirrosis hepática y/u otras afecciones hepáticas tóxicas en un mamífero. En otro aspecto más, la presente invención se refiere al descubrimiento inesperado de que dosis bajas de glucósidos cardíacos son eficaces para tratar o prevenir la hepatitis autoinmunitaria, cirrosis biliar primaria, y otras afecciones hepáticas tóxicas y/o inflamatorias en un mamífero. En otro aspecto más, la presente divulgación se refiere al descubrimiento inesperado de que dosis bajas de glucósidos cardíacos son eficaces para promover la pérdida de peso en un mamífero.
En ciertos aspectos de la divulgación, la administración del glucósido cardíaco al mamífero inhibe la inflamación en el hígado del mamífero. En otros aspectos de la divulgación, la administración del glucósido cardíaco al mamífero inhibe la esteatosis hepática en el mamífero. En otros aspectos más de la divulgación, la administración del glucósido cardíaco al mamífero reduce el daño hepático y/o la glucólisis en el mamífero. En otros aspectos más de la divulgación, la administración del glucósido cardíaco al mamífero reduce la obesidad inducida por la grasa en el mamífero. En otros aspectos más de la divulgación, la administración del glucósido cardíaco al mamífero produce pérdida de peso sin reducir la ingesta de alimentos. En otros aspectos más de la divulgación, el glucósido cardíaco mejora la tolerancia a la glucosa en el mamífero. En otros aspectos más de la divulgación, el glucósido cardíaco reduce uno o más síntomas y/o complicaciones diabéticos en el mamífero. En otros aspectos más de la divulgación, el mamífero es un ser humano.
La presente invención contempla que los efectos biológicos mencionados en el presente documento pueden estar asociados con el glucósido cardíaco en sí y/o con uno o más metabolitos del mismo formados en el cuerpo del mamífero. En determinados aspectos, la presente divulgación contempla la administración de cantidades terapéuticamente eficaces del metabolito o metabolitos de glucósidos cardíacos biológicamente activos al mamífero para provocar los efectos biológicos descritos en el presente documento.
Definiciones
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la materia a la que pertenece la presente invención. Aunque pueden utilizarse en la práctica o el ensayo de la presente invención cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los que se describen en el presente documento, se describen los métodos y materiales preferidos.
Como se utiliza en el presente documento, cada uno de los siguientes términos tiene el significado asociado con él en esta sección.
Como se utilizan en el presente documento, los artículos "un" y "una" se usan para referirse a uno o más de uno (es decir, al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.
Como se utiliza en el presente documento, "aproximadamente", cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad, una duración temporal y similares, pretende abarcar variaciones de ± el 20% o ± el 10%, más preferentemente ± el 5%, incluso más preferentemente ± el 1 %, y aún más preferentemente ± el 0,1 % del valor especificado, ya que dichas variaciones son apropiadas para realizar los métodos divulgados.
Una enfermedad o trastorno se "alivia" si se reduce la gravedad de un síntoma de la enfermedad o trastorno, la frecuencia con la que dicho síntoma es experimentado por un paciente, o ambas cosas.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "efecto cardíaco clínicamente significativo", en relación con una dosis de medicamento, indica que, una vez administrada a un sujeto, la dosis del fármaco no causa efectos cardíacos significativos, perjudiciales y/o medibles en el sujeto.
En un aspecto, los términos "coadministrado" y "coadministración" en relación con un sujeto se refieren a la administración al sujeto de un compuesto de la invención o un derivado, solvato, sal o sal profármaco del mismo, junto con un compuesto que también puede tratar los trastornos o enfermedades contemplados dentro de la invención. En ciertos aspectos de la divulgación, los compuestos coadministrados se administran por separado, o en cualquier tipo de combinación como parte de un único enfoque terapéutico. El compuesto coadministrado puede formularse en cualquier tipo de combinaciones como mezclas de sólidos y líquidos bajo una variedad de formulaciones sólidas, en gel y líquidas, y en forma de una solución.
Como se utiliza en el presente documento, el término "composición" o la expresión "composición farmacéutica" se refiere a una mezcla de al menos un compuesto útil dentro de la invención con un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica facilita la administración del compuesto a un paciente o sujeto. Existen múltiples técnicas de administración de un compuesto en la técnica que incluyen, aunque no de forma limitativa, intravenosa, oral, aerosol, parenteral, oftálmica, nasal, pulmonar y tópica.
Como se utiliza en el presente documento, el término "digoxina" se refiere a 4-[(3S,5R,8R,9S,10S,12R,13S,14S)-3-[(2S,4S,5R,6R)-5-[(2S,4S,5R,6R)-5-[(2S,4S,5R,6R)-4,5-dihidroxi-6-metil-oxan-2-il]oxi-4-hidroxi-6-metil-oxan-2-il]oxi-4-hidroxi-6-metil-oxan-2-il]oxi-12,14-dihidroxi-10,13-dimetil-1,2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,15,16,17-tetradecahidrociclopenta[a]fenantren-17-il]-5H-furan-2-ona, o una sal o solvato de la misma.
Una "enfermedad" como se utiliza en el presente documento es un estado de salud de un animal en donde el animal no puede mantener la homeostasis, y donde si la enfermedad no mejora, la salud del animal continúa deteriorándose.
Un "trastorno" como se utiliza en el presente documento en un animal es un estado de salud en el que el animal puede mantener la homeostasis, pero en el que el estado de salud del animal es menos favorable de lo que sería en ausencia del trastorno. Si se deja sin tratar, un trastorno no necesariamente causa una disminución adicional en el estado de salud del animal.
Como se utiliza en el presente documento, las expresiones "cantidad eficaz", "cantidad farmacéuticamente eficaz" y "cantidad terapéuticamente eficaz" se refieren a una cantidad no tóxica pero suficiente de un agente para proporcionar el resultado biológico deseado. Ese resultado puede ser la reducción y/o el alivio de los signos, los síntomas o las causas de una enfermedad, o cualquier otra alteración deseada de un sistema biológico. Un experto habitual en la materia puede determinar una cantidad terapéutica apropiada en cualquier caso individual utilizando experimentación de rutina.
Como se utiliza en el presente documento, el término "DRG" se refiere a dieta rica en grasas.
"Material didáctico" como esta expresión se utiliza en el presente documento, incluye una publicación, un registro, un diagrama, o cualquier otro medio de expresión que pueda utilizarse para comunicar la utilidad de la composición y/o compuesto de la invención en un kit. El material de formación del kit puede, por ejemplo, fijarse a un recipiente que contenga el compuesto y/o la composición de la invención o enviarse junto con un recipiente que contenga el compuesto y/o la composición. Como alternativa, el material didáctico puede enviarse separado del recipiente con la intención de que el destinatario utilice el material didáctico y el compuesto de forma cooperativa. La entrega del material didáctico puede ser, por ejemplo, mediante la entrega física de la publicación u otro medio de expresión que comunique la utilidad del kit, o puede realizarse, como alternativa, mediante transmisión electrónica, por ejemplo por medio de un ordenador, por ejemplo, por correo electrónico o descargándolo de un sitio web.
Los términos "paciente", "sujeto" o "individuo" se utilizan indistintamente en el presente documento, y se refieren a cualquier animal, o células del mismo ya seain vitrooin situ,susceptibles de los métodos descritos en el presente documento. En una realización no limitante, el paciente, sujeto o individuo es un ser humano.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a un material, tal como un vehículo o diluyente, que no anula la actividad biológica o las propiedades del compuesto, y es relativamente no tóxico, es decir, el material puede administrarse a un individuo sin causar efectos biológicos indeseables o interactuar de manera perjudicial con cualquiera de los componentes de la composición en la que está contenido.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" significa un material, composición o vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una carga líquida o sólida, estabilizante, agente dispersante, agente de suspensión, diluyente, excipiente, agente espesante, disolvente o material encapsulante, implicados en llevar o transportar n compuesto útil dentro de la invención dentro o al paciente de modo que pueda realizar su función prevista. Normalmente, tales construcciones son llevadas o transportadas desde un órgano, o porción del cuerpo, a otro órgano, o parte del cuerpo. Cada vehículo también debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de la formulación, incluido el compuesto útil dentro de la invención, y no perjudicial para el paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen: azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes, tales como manteca de cacao y ceras de supositorio; aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; glicoles, tales como propilenglicol; polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes tamponantes, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; agentes tensioactivos; ácido algínico; agua exenta de pirógenos; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico; solución de tampón de fosfato; y otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas.
Como se utiliza en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye también cualquiera y todos los recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, y agentes retardadores de la absorción, y similares que son compatibles con la actividad del compuesto útil dentro de la invención, y son fisiológicamente aceptables para el paciente. Los compuestos activos complementarios también se pueden incorporar en las composiciones.
El "portador farmacéuticamente aceptable" puede incluir además una sal, profármaco, solvato o derivado farmacéuticamente aceptable del compuesto útil dentro de la invención. Otros ingredientes adicionales que pueden incluirse en las composiciones farmacéuticas usadas en la práctica de la invención son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo en Remington's Pharmaceutical Sciences (Genaro, Ed., Mack Publishing Co., 1985, Easton, PA).
Como se utiliza en el presente documento, la expresión "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal de los compuestos administrados preparada a partir de ácidos no tóxicos farmacéuticamente aceptables, incluyendo ácidos inorgánicos, ácidos orgánicos, solvatos, hidratos o clatratos de los mismos.
Los términos "prevenir", "previniendo" o "prevención" como se utilizan en el presente documento, se refieren a evitar o retrasar la aparición de síntomas asociados a una enfermedad o afección en un sujeto que no ha desarrollado dichos síntomas en el momento en que comienza la administración de un agente o compuesto.
Un tratamiento "terapéutico" es un tratamiento administrado a un sujeto que presenta signos de patología, con el fin de disminuir o eliminar estos signos.
Como se utiliza en el presente documento, el término "tratamiento" o "tratar" se define como la aplicación o administración de un agente terapéutico, es decir, un compuesto de la invención (solo o junto con otro agente farmacéutico), a un paciente, o aplicación o administración de un agente terapéutico a un tejido o estirpe celular aislada de un paciente (p. ej., para diagnóstico o aplicacionesex vivo),que padezca una de las afecciones contempladas en el presente documento, un síntoma de una afección contemplada en el presente documento o la posibilidad de desarrollar una afección contemplada en el presente documento, con el propósito de curar, cicatrizar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, recuperar, mejorar o afectar a una afección contemplada en el presente documento, los síntomas de una afección contemplada en el presente documento o la posibilidad de desarrollar una afección contemplada en el presente documento. Dichos tratamientos pueden adaptarse o modificarse específicamente, según el conocimiento obtenido en el campo de la farmacogenómica.
Las expresiones "se unen específicamente" o "se une específicamente" como se utilizan en el presente documento, pretenden significar que una primera molécula se une preferentemente a una segunda molécula (p. ej., un determinado receptor o enzima), pero no necesariamente se une solo a esa segunda molécula.
A lo largo de la presente divulgación, se pueden presentar diversos aspectos de la invención en un formato de intervalo. Ha de comprenderse que la descripción en formato de intervalo es meramente por conveniencia y brevedad, y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la invención. Por consiguiente, se debe considerar que la descripción de un intervalo ha divulgado específicamente todos los posibles subintervalos, así como los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, debería considerarse que la descripción de un intervalo tal como de 1 a 6 tiene subintervalos específicamente divulgados tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 2,7, 3, 4, 5, 5,1, 5,3, 5,5 y 6. Esto es aplicable independientemente de la amplitud del intervalo.
Divulgación
La producción de IL-1p es una etapa central en una amplia selección de respuestas inflamatorias y fibróticas agudas y crónicas. Se sabe que son necesarias dos vías distintas para la activación inicial del inflamosoma y la producción de IL-1p (Fig. 17A). Normalmente se considera que la vía de la señal 1 se activa a través de los receptores de tipo Toll, dando lugar a una regulación al alza del gen Pro-ILp mediada por NFkp, así como los genes de los componentes del inflamosoma. Se requiere una segunda vía (señal 2) para la activación del mecanismo del inflamosoma. La señal 2 es emitida por una amplia selección de estímulos, que van desde moléculas derivadas de patógenos, como la flagelina y el ADN citosólico, hasta partículas no derivadas de patógenos, como los cristales de ácido úrico.
Las dos vías anteriores parecen proporcionar los requisitos mínimos para la activación del inflamosoma, sin embargo, su activación se asocia a una producción aguda de lL-1p que se resuelve significativamente en 24 horas. La activación del inflamosoma también desempeña un papel importante en varias enfermedades inflamatorias crónicas y fibróticas. La producción constante de IL-1p podría producirse teóricamente en el marco de las vías mencionadas por un mayor número, concentración o duración de la exposición a los ligandos que inician las vías de las señales 1 y 2. Sin embargo, la exposición persistente a los PAMP provoca el desarrollo de un estado tolerogénico, y las vías de señalización 2, como el ATP, inducen la muerte celular.
Como se demuestra en el presente documento, hay señales reguladoras adicionales, que son independientes de los ligandos que proporcionan las señales 1 y 2. La ventaja adicional de estas señales es que pueden proporcionar información funcional distinta. Los presentes estudios abordan el papel de la adenosina en la regulación de la activación del inflamosoma (Fig. 17B). Las concentraciones extracelulares de adenosina se elevan en respuesta al daño tisular, y la adenosina se elimina rápidamente de los tejidos por captación celular y metabolismo mediado por la adenosina desaminasa. Esto proporciona un mecanismo de respuesta rápida que señala la isquemia tisular local y la lesión. La adenosina, sin embargo, no se ha considerado una molécula DAMP(Damage-Associated Molecular Pattern,molécula de patrón molecular asociado a peligro) porque coordina las respuestas adaptativas a la lesión tisular de muchas maneras, además de la inflamación, y la mayoría de los efectos inmunitarios han consistido en reducir la producción de citocinas.
Como se demuestra en el presente documento, la adenosina que actúa a través del receptor A2A es un regulador clave de la actividad del inflamosoma. Las concentraciones de adenosina encontradas durante la lesión tisular aumentan la amplitud y duración máximas de la respuesta del inflamosoma. La regulación del inflamosoma por la adenosina no sustituye ni a la señal 1 ni a la 2, sino que regula la actividad del inflamosoma iniciada por una amplia selección de moléculas PAMP(Pathogen-Associated Molecular Pattern,moléculas de patrón molecular asociado a patógenos) y DAMP. Se activa una vía de señalización cAMP/PKA/CREB/HIF-1a en dirección 3' del receptor A2A, lo que resulta en una regulación al alza de Pro-IL1p y NLRP3, y una mayor activación de la caspasa-1. Además de la regulación de la actividad del inflamosoma mediante concentraciones patológicas de adenosina, existe la necesidad de tener niveles fisiológicos de adenosina para la producción máxima de IL-1p. Finalmente, después de que los macrófagos hayan recibido las señales 1 y 2, la adenosina puede regular aún más la producción de IL-1p, sin necesidad de ninguna señal de inicio. Esto demuestra que dichas células no son simplemente tolerantes o que no responden a otras señales, sino que se encuentran en un estado posterior a la activación en el que han pasado de un fenotipo inicial impulsado por DAMP a un fenotipo posterior impulsado por adenosina y AMPc.
En el presente documento se divulga además un método para tratar o prevenir la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) en un mamífero. En otro aspecto, la presente divulgación proporciona un método de tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno como la lesión hepática asociada y/o causada por el consumo de alcohol en un mamífero afectado de NASH, hepatitis alcohólica, lesión hepática inducida por fármacos, colangitis esclerosante primaria, hepatitis vírica, fibrosis hepática, cirrosis hepática y/u otras afecciones hepáticas tóxicas en un mamífero. En otro aspecto más, la presente divulgación proporciona un método para tratar o prevenir la hepatitis autoinmunitaria, cirrosis biliar primaria, y otras afecciones hepáticas tóxicas y/o inflamatorias en un mamífero. En otro aspecto más, la presente divulgación proporciona un método para promover la pérdida de peso en un mamífero.
En ciertos aspectos de la divulgación, el método comprende la administración de una dosis baja terapéuticamente eficaz de al menos un glucósido cardíaco, o de al menos un metabolito biológicamente activo del mismo, al mamífero. En ciertos aspectos de la divulgación, el glucósido cardíaco inhibe la síntesis de HIF-1a en el hígado del mamífero. En otros aspectos de la divulgación, el glucósido cardíaco inhibe la inflamación en el hígado del mamífero. En otros aspectos de la divulgación, el glucósido cardíaco inhibe la esteatosis hepática en el mamífero. En otros aspectos más de la divulgación, el glucósido cardíaco reduce el daño hepático y/o la glucólisis en el mamífero. En otros aspectos más de la divulgación, el glucósido cardíaco reduce la obesidad inducida por la grasa en el mamífero. En otros aspectos más de la divulgación, el glucósido cardíaco no tiene una actividad cardíaca significativa, perjudicial ni/o mensurable en el mamífero, medida, por ejemplo, como la aparición de taquicardia auricular, bloqueo auriculoventricular, reducción de la conducción del nódulo auriculoventricular y/o aumento del período refractario efectivo dentro del nódulo auriculoventricular. En ciertos aspectos de la divulgación, el mamífero experimenta una pérdida de peso sin una reducción concomitante de la ingesta de alimentos.
Los glucósidos cardíacos útiles dentro de los métodos divulgados en el presente documento incluyen, pero sin limitación, acetildigitoxina, bufalina, cinobufagerina, convalatoxina, cimarina, digitoxigenina, digotoxina, digoxigerina, digoxina, gitoxigenina, gitoxina, marinobufagenina, nerifolina, oleandrina, ouabaína, periplocimarina, peruvosida, proscilaridina A, estrofantaina K y/o UNBS1450, y derivados, profármacos, sales o solvatos de los mismos.
La dosis del glucósido cardíaco contemplada en la divulgación proporciona un nivel plasmático de glucósido cardíaco igual o inferior al nivel plasmático de glucósido cardíaco necesario para tratar o prevenir cardiopatías, tales como insuficiencia cardíaca y/o arritmia auricular. En ciertos aspectos de la divulgación, el glucósido cardíaco es digoxina y la dosis útil dentro de los métodos proporciona un nivel plasmático de glucósido cardíaco que es igual o inferior al nivel plasmático de digoxina requerido para tratar cardiopatías (aproximadamente 0,8 ng/ml).
En ciertos aspectos de la divulgación, el glucósido cardíaco es digoxina y la dosis útil en los métodos proporciona un nivel plasmático de digoxina que varía de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 0,8 ng/ml. En otros aspectos de la divulgación, la dosis de digoxina útil en los métodos proporciona un nivel plasmático de digoxina que varía de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 0,05 ng/ml. En otros aspectos más de la divulgación, la dosis de digoxina útil dentro de los métodos proporciona un nivel plasmático de digoxina que varía de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,1 ng/ml. En otros aspectos más de la divulgación, la dosis de digoxina útil dentro de los métodos proporciona un nivel plasmático de digoxina que varía de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,15 ng/ml. En otros aspectos más de la divulgación, la dosis de digoxina útil dentro de los métodos proporciona un nivel plasmático de digoxina que varía de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,2 ng/ml. En otros aspectos más de la divulgación, la dosis de digoxina útil dentro de los métodos proporciona un nivel plasmático de digoxina que varía de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,25 ng/ml. En otros aspectos más de la divulgación, la dosis de digoxina útil dentro de los métodos proporciona un nivel plasmático de digoxina que varía de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,3 ng/ml. En otros aspectos más de la divulgación, la dosis de digoxina útil dentro de los métodos proporciona un nivel plasmático de digoxina que varía de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,35 ng/ml. En otros aspectos más de la divulgación, la dosis de digoxina útil dentro de los métodos proporciona un nivel plasmático de digoxina que varía de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,4 ng/ml. En otros aspectos más de la divulgación, la dosis de digoxina útil dentro de los métodos proporciona un nivel plasmático de digoxina que varía de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,45 ng/ml. En otros aspectos más de la divulgación, la dosis de digoxina útil dentro de los métodos proporciona un nivel plasmático de digoxina que varía de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,5 ng/ml. En otros aspectos más de la divulgación, la dosis de digoxina útil dentro de los métodos proporciona un nivel plasmático de digoxina que varía de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,55 ng/ml. En otros aspectos más de la divulgación, la dosis de digoxina útil dentro de los métodos proporciona un nivel plasmático de digoxina que varía de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,6 ng/ml. En otros aspectos más de la divulgación, la dosis de digoxina útil dentro de los métodos proporciona un nivel plasmático de digoxina que varía de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,65 ng/ml. En otros aspectos más de la divulgación, la dosis de digoxina útil dentro de los métodos proporciona un nivel plasmático de digoxina que varía de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,7 ng/ml. En otros aspectos más de la divulgación, la dosis de digoxina útil dentro de los métodos proporciona un nivel plasmático de digoxina que varía de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,75 ng/ml. En otros aspectos más de la divulgación, la dosis de digoxina útil dentro de los métodos proporciona un nivel plasmático de digoxina que varía de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,8 ng/ml. En otros aspectos más de la divulgación, la dosis de digoxina útil dentro de los métodos proporciona un nivel plasmático de digoxina seleccionado del grupo que consiste en aproximadamente 0,02 ng/ml, aproximadamente 0,05 ng/ml, aproximadamente 0,1 ng/ml, aproximadamente 0,15 ng/ml, aproximadamente 0,2 ng/ml, aproximadamente 0,25 ng/ml, aproximadamente 0,3 ng/ml, aproximadamente 0,35 ng/ml, aproximadamente 0,4 ng/ml, aproximadamente 0,45 ng/ml, aproximadamente 0,5 ng/ml, aproximadamente 0,55 ng/ml, aproximadamente 0,6 ng/ml, aproximadamente 0,65 ng/ml, aproximadamente 0,7 ng/ml, aproximadamente 0,75 ng/ml y aproximadamente 0,8 ng/ml.
En ciertos aspectos de la divulgación, la dosis oral de digoxina varía de aproximadamente 0,0025 mg/día a aproximadamente 0,125 mg/día. En otros aspectos de la divulgación, la dosis oral de digoxina varía de aproximadamente 0,0025 mg/día a aproximadamente 0,0075 mg/día. En otros aspectos más de la divulgación, la dosis oral de digoxina varía de aproximadamente 0,0075 mg/día a aproximadamente 0,015 mg/día. En otros aspectos más de la divulgación, la dosis oral de digoxina varía de aproximadamente 0,0075 mg/día a aproximadamente 0,0225 mg/día. En otros aspectos más de la divulgación, la dosis oral de digoxina varía de aproximadamente 0,0075 mg/día a aproximadamente 0,030 mg/día. En otros aspectos más de la divulgación, la dosis oral de digoxina varía de aproximadamente 0,0075 mg/día a aproximadamente 0,0375 mg/día. En otros aspectos más de la divulgación, la dosis oral de digoxina varía de aproximadamente 0,0075 mg/día a aproximadamente 0,045 mg/día. En otros aspectos más de la divulgación, la dosis oral de digoxina varía de aproximadamente 0,0075 mg/día a aproximadamente 0,0525 mg/día. En otros aspectos más de la divulgación, la dosis oral de digoxina varía de aproximadamente 0,0075 mg/día a aproximadamente 0,060 mg/día. En otros aspectos más de la divulgación, la dosis oral de digoxina varía de aproximadamente 0,0075 mg/día a aproximadamente 0,0675 mg/día. En otros aspectos más de la divulgación, la dosis oral de digoxina varía de aproximadamente 0,0075 mg/día a aproximadamente 0,075 mg/día. En otros aspectos más de la divulgación, la dosis oral de digoxina varía de aproximadamente 0,0075 mg/día a aproximadamente 0,0825 mg/día. En otros aspectos más de la divulgación, la dosis oral de digoxina varía de aproximadamente 0,0075 mg/día a aproximadamente 0,090 mg/día. En otros aspectos más de la divulgación, la dosis oral de digoxina varía de aproximadamente 0,0075 mg/día a aproximadamente 0,0975 mg/día. En otros aspectos más de la divulgación, la dosis oral de digoxina varía de aproximadamente 0,0075 mg/día a aproximadamente 0,105 mg/día. En otros aspectos más de la divulgación, la dosis oral de digoxina varía de aproximadamente 0,0075 mg/día a aproximadamente 0,113 mg/día. En otros aspectos más de la divulgación, la dosis oral de digoxina varía de aproximadamente 0,0075 mg/día a aproximadamente 0,120 mg/día.
En ciertos aspectos de la divulgación, el glucósido cardíaco se administra al mamífero aproximadamente una vez al día, aproximadamente cada dos días, aproximadamente cada tres días, aproximadamente cada cuatro días, aproximadamente cada cinco días, aproximadamente cada seis días y/o aproximadamente una vez a la semana.
En ciertos aspectos de la divulgación, al mamífero se le administra además al menos un agente adicional que reduce los síntomas de, trata o previene la EHNA, lesión hepática asociada y/o causada por el consumo de alcohol en un mamífero afectado de EHNA, hepatitis alcohólica, lesión hepática inducida por fármacos, colangitis esclerosante primaria, hepatitis vírica, fibrosis hepática, cirrosis hepática y/u otras afecciones hepáticas tóxicas.
En ciertos aspectos de la divulgación, al mamífero se le administra además al menos un agente adicional que reduce los síntomas de, trata o previene la hepatitis autoinmunitaria, cirrosis biliar primaria y otras afecciones hepáticas tóxicas y/o inflamatorias.
En ciertos aspectos de la divulgación, al mamífero se le administra además al menos un agente adicional que favorece la pérdida de peso.
En ciertos aspectos de la divulgación, el mamífero es un ser humano.
En ciertos aspectos de la divulgación, la composición se administra al mamífero por al menos una vía seleccionada del grupo consistente en nasal, inhalatoria, tópica, oral, bucal, rectal, pleural, peritoneal, vaginal, intramuscular, subcutánea, transdérmica, epidural, intratraqueal, ótica, intraocular, intratecal e intravenosa.
Kits
La divulgación incluye un kit que comprende al menos un glucósido cardíaco, un aplicador y un material didáctico para el uso del mismo.
En ciertos aspectos de la divulgación, el material didáctico incluido en el kit comprende instrucciones para prevenir o tratar una enfermedad o trastorno hepático como la EHNA, lesión hepática asociada y/o causada por el consumo de alcohol en un mamífero afectado de EHNA, hepatitis alcohólica, lesión hepática inducida por fármacos, colangitis esclerosante primaria, hepatitis vírica, fibrosis hepática, cirrosis hepática y/u otras afecciones hepáticas tóxicas en un mamífero. El material de instrucción cita la cantidad de, y la frecuencia con la que, el al menos un glucósido cardíaco debe administrarse al mamífero. En otros aspectos de la divulgación, el kit comprende además al menos un agente adicional que trata, previene o reduce los síntomas de una enfermedad o trastorno hepático tal como la EHNA, lesión hepática asociada y/o causada por el consumo de alcohol en un mamífero afectado de EHNA, hepatitis alcohólica, lesión hepática inducida por fármacos, colangitis esclerosante primaria, hepatitis vírica, fibrosis hepática, cirrosis hepática y/u otras afecciones hepáticas tóxicas.
En ciertos aspectos de la divulgación, el material didáctico incluido en el kit comprende instrucciones para prevenir o tratar la hepatitis autoinmunitaria, cirrosis biliar primaria, y otras afecciones hepáticas tóxicas y/o inflamatorias en un mamífero. El material de instrucción cita la cantidad de, y la frecuencia con la que, el al menos un glucósido cardíaco debe administrarse al mamífero. En otros aspectos de la divulgación, el kit comprende además al menos un agente adicional que trata, previene o reduce los síntomas de la hepatitis autoinmunitaria, cirrosis biliar primaria y otras afecciones hepáticas tóxicas y/o inflamatorias.
En ciertos aspectos de la divulgación, el material didáctico incluido en el kit comprende instrucciones para promover la pérdida de peso. El material de instrucción cita la cantidad de, y la frecuencia con la que, el al menos un glucósido cardíaco debe administrarse al mamífero. En otros aspectos de la divulgación, el kit comprende además al menos un agente adicional que favorece la pérdida de peso.
Terapias de combinación
En ciertos aspectos de la divulgación, los compuestos contemplados dentro de la invención son útiles dentro de los métodos de la invención junto con al menos un agente adicional útil para tratar o prevenir una enfermedad o un trastorno hepático tal como la EHNA, lesión hepática asociada y/o causada por el consumo de alcohol en un mamífero afectado de EHNA, hepatitis alcohólica, lesión hepática inducida por fármacos, colangitis esclerosante primaria, hepatitis vírica, fibrosis hepática, cirrosis hepática y/u otras afecciones hepáticas tóxicas. Este compuesto adicional puede comprender compuestos identificados en el presente documento o compuestos, p. ej., compuestos disponibles comercialmente, conocidos para tratar, prevenir o reducir los síntomas de la EHNA, lesión hepática asociada y/o causada por el consumo de alcohol en un mamífero afectado de EHNA, hepatitis alcohólica, lesión hepática inducida por fármacos, colangitis esclerosante primaria, hepatitis vírica, fibrosis hepática, cirrosis hepática y/u otras afecciones hepáticas tóxicas.
En determinados aspectos, los compuestos contemplados dentro de la divulgación son útiles dentro de los métodos de la divulgación junto con al menos un agente adicional útil para tratar o prevenir la hepatitis autoinmunitaria, cirrosis biliar primaria y otras afecciones hepáticas tóxicas y/o inflamatorias. Este compuesto adicional puede comprender compuestos identificados en el presente documento o compuestos, p. ej., compuestos disponibles comercialmente, conocidos para tratar, prevenir o reducir los síntomas de la hepatitis autoinmunitaria, cirrosis biliar primaria y otras afecciones hepáticas tóxicas y/o inflamatorias.
En determinados aspectos, los compuestos contemplados dentro de la divulgación son útiles dentro de los métodos de la divulgación junto con al menos un agente adicional útil para promover la pérdida de peso. Este compuesto adicional puede comprender compuestos identificados en el presente documento o compuestos, p. ej., compuestos disponibles comercialmente, conocidos por promover la pérdida de peso.
En ciertos aspectos de la divulgación, el agente adicional es un medicamento antidiabético o ácido abeticólico (también conocido como ácido (3a,5p,6a,7a)-6-etil-3,7-dihidroxicolan-24-oico; o ácido (4R)-4-[(3R,5S,6R,7R,8S,9S,10S,13R,14S,17R)-6-etil-3,7-dihidroxi-10,13-dimetil-2,3,4,5,6,7,8,9,11,12,14,15,16,17-tetradecahidro-1H-ciclopenta[a]fenantren-17-il]pentanoico) o derivados, profármacos, sales o solvatos del mismo.
Algunos ejemplos no limitantes de medicamentos para la pérdida de peso contemplados dentro de la invención incluyen orlistat, sibutramina, tartrato de fendimetrazina, metanfetamina, IONAMIN™, fentermina, fenfluramina, dexfenfluramina, quitosano, picolinato de cromo, ácido linoleico conjugado, extracto de té verde, goma guar, hoodia, una combinación de topiramato y fentermina, una combinación de bupropión y zonisamida, una combinación de bupropión y naltrexona, una combinación de fentermina y fluoxetina, una combinación de fentermina y sertralina, una combinación de fentermina y citalopram, una combinación de fentermina y escitalopram, o una combinación de fentermina y trazodona.
Algunos ejemplos no limitantes de medicamentos antidiabéticos contemplados dentro de la invención incluyen: inhibidores de a-glucosidasa: inhiben las enzimas del tubo gastrointestinal superior (a-glucosidasas) responsables de la digestión de los hidratos de carbono, ralentizando la absorción de la glucosa; también provocan un aumento más lento de las concentraciones postprandiales de glucosa en sangre. Son algunos ejemplos no limitativos: acarbosa (Precose, Glucobay); miglitol (Glyset); voglibosa (Vogseal, Volix, Basen);
inhibidores de lipasa: inhiben las lipasas pancreáticas y gástricas, bloqueando la absorción de grasas. Son algunos ejemplos no limitativos: orlistat (Xenical, Alli);
sulfonil ureas: actúan como secretores de la insulina, desencadenando la liberación de insulina al interactuar con el canal de potasio dependiente de ATP de las células p pancreáticas. El resultado neto es que se libera más insulina en todas las concentraciones de glucosa en sangre. Son los fármacos más utilizados para el tratamiento de pacientes con diabetes de tipo 2, pero, dado desencadenan la liberación de la propia insulina, la combinación de insulina y sulfonil ureas no es frecuente. Son algunos ejemplos no limitativos: sulfonilureas de 1.a generación, como acetohexamida, clorpropamida (Diabinese), tolbutamida (Orinase), tolazamida; sulfonilureas de 2.a generación como gliclazida (Diamicron R, Diamicron MR), gliburida o glibenclamida (Diabeta, Micronase, Glynase), glipizida (Glucotrol, Glucotrol XL), glimepirida (Amaryl), gliquidona (Glurenorm);
meglitinidas: fármacos hipoglucemiantes de acción corta, que actúan regulando los canales de potasio dependientes de ATP en las células p pancreáticas como las sulfonilureas; estructuralmente diferentes de las sulfonilureas y actúan también a través de receptores diferentes. Son algunos ejemplos no limitativos: mitiglinida (Glufast); nateglinida (Starlix); repaglinida (Prandix);
biguanidas: reducen la liberación de glucosa por el hígado y aumentan la captación de glucosa por el músculo esquelético. La metformina es el tratamiento inicial preferido de la diabetes de tipo 2, con buena eficacia glucémica, ausencia de aumento de peso e hipoglucemia, tolerabilidad general y bajo coste. La combinación de metformina e insulina suele asociarse a un menor aumento de peso que la insulina sola o la combinación de insulina y sulfonilureas. La triple combinación de una sulfonilurea, metformina e insulina glargina han demostrado tener menos efectos adversos, menos problemas de perfil lipídico y menor coste que la triple combinación de una sulfonilurea, metformina y rosiglitazona. Son algunos ejemplos no limitativos: metformina (Glucophage); fenformina (DBI); buformina (Glybigid, Glybigidum);
tiazolidindionas: aumentan la sensibilidad a la insulina actuando sobre el tejido adiposo, tejido muscular y hepático para aumentar la utilización de la glucosa y disminuir su producción. El mecanismo de acción no se conoce por completo, pero parece que se unen y activan uno o varios receptores activados por el proliferador de peroxisomas (PPAR), regulando la expresión génica. Son algunos ejemplos no limitativos: rosiglitazona (Avandia); pioglitazona (Actos); troglitazona (Rezulin); tesaglitazar (Pargluva);
pramlintida (Symlin): también conocida como polipéptido amiloide de los islotes, es un análogo sintético de la amilina humana que ralentiza el vaciado gástrico e inhibe el glucagón, reduciendo las subidas postprandiales de los niveles de glucosa en sangre; aprobada por la FDA para reducir la glucemia en pacientes con diabetes de tipo 1;
miméticos de la incretina: estos secretagogos de insulina actúan como agonistas de los receptores de membrana del péptido similar al glucagón-1 (GLP-1). Actúan de forma dependiente de la glucosa, estimulando la secreción de insulina solo cuando los niveles de glucosa en sangre son más altos de lo normal. También favorecen la regeneración de las células p en modelos animales. Los miméticos de la incretina disminuyen la motilidad gástrica y provocan náuseas. Son algunos ejemplos no limitativos: exenatida, exedina-4 o AC2993 (Byetta); liraglutida, NN2211 o NNC 90-1170; consiste en un conjugado lipídico de GLP-1, con una elevada unión a proteínas y una semivida de ~10 h en el hombre;
Inhibidores de la DPP-IV: afectan a la regulación de la glucosa, inhibiendo la degradación del GLP-1. Suelen causar menos problemas de hipoglucemia o aumento de peso que los tratamientos convencionales. Son algunos ejemplos no limitativos: sitagliptina (Januvia); sitagliptina y metformina (Janumet); vildagliptina (Galvus); vildagliptina y metformina (Eucreas);
inhibidores de SGLT2: inhiben la proteína SGLT2, haciendo que el exceso de glucosa se excrete del organismo en lugar de reabsorberse. Son algunos ejemplos no limitativos: dapaglifozina.
Un efecto sinérgico se puede calcular, por ejemplo, utilizando métodos adecuados tales como, por ejemplo, la ecuación Sigmoide-Emáx (Holford y Scheiner, 1981, Clin. Pharmacokinet. 6: 429-453), la ecuación de la aditividad de Loewe (Loewe y Muischnek, 1926, Arch. Exp. Pathol Pharmacol. 114: 313-326) y la ecuación de efecto de la mediana (Chou y Talalay, 1984, Adv. Enzyme Regul. 22:27-55). Cada ecuación mencionada anteriormente se puede aplicar a datos experimentales para generar un gráfico correspondiente para ayudar a evaluar los efectos de la combinación de fármacos. Los gráficos correspondientes asociados a las ecuaciones mencionadas anteriormente son la curva de efecto de la concentración, la curva del isobolograma y la curva del índice de combinación, respectivamente.
Composiciones
La divulgación incluye una composición farmacéutica que comprende un glucósido cardíaco, o un solvato, sal, profármaco o derivado del mismo, en donde el glucósido cardíaco comprende digoxina, por lo que la administración de la composición al mamífero proporciona un nivel plasmático de digoxina igual o inferior a aproximadamente 0,8 ng/ml.
La divulgación incluye además una composición farmacéutica que comprende un glucósido cardíaco, o un solvato, sal, profármaco o derivado del mismo, y al menos un agente adicional que trate, prefenga o reduzca los síntomas de la EHNA, lesión hepática asociada y/o causada por el consumo de alcohol en un mamífero afectado de EHNA, hepatitis alcohólica, lesión hepática inducida por fármacos, colangitis esclerosante primaria, hepatitis vírica, fibrosis hepática, cirrosis hepática y/u otras afecciones hepáticas tóxicas, o un disolvente, sal, profármaco o derivado del mismo.
La divulgación incluye además una composición farmacéutica que comprende un glucósido cardíaco, o un solvato, sal, profármaco o derivado del mismo, y al menos un agente adicional que trate, previene o reduce los síntomas de la hepatitis autoinmunitaria, cirrosis biliar primaria y otras afecciones hepáticas tóxicas y/o inflamatorias, o un disolvente, sal, profármaco o derivado del mismo.
La divulgación incluye además una composición farmacéutica que comprende un glucósido cardíaco, o un solvato, sal, profármaco o derivado del mismo, y al menos un agente adicional que favorezca la pérdida de peso, o un solvato, sal, profármaco o derivado del mismo.
En ciertos aspectos de la divulgación, el al menos un glucósido cardíaco se selecciona del grupo formado por la acetildigitoxina, bufalina, cinobufagerina, convalatoxina, cimarina, digitoxigenina, digotoxina, digoxigerina, digoxina, gitoxigenina, gitoxina, marinobufagenina, nerifolina, oleandrina, ouabaína, periplocimarina, peruvosida, proscilaridina A, estrofantina K y UNBS1450. En otros aspectos de la divulgación, el al menos un agente adicional comprende un medicamento antidiabético o ácido abeticólico. En otros aspectos más de la divulgación, el al menos un glucósido cardíaco comprende digoxina, por lo que la administración de la composición al mamífero proporciona un nivel plasmático de digoxina igual o inferior a aproximadamente 0,8 a 2,0 ng/ml.
Administración/Dosificación/Formulaciones
El régimen de administración puede afectar a lo que constituye una cantidad eficaz. Las formulaciones terapéuticas pueden administrarse al sujeto antes o después de la aparición de una enfermedad o trastorno contemplado en la divulgación. Además, varias dosis divididas, así como las dosis escalonadas pueden administrarse diariamente o secuencialmente, o la dosis puede infundirse continuamente, o puede ser una inyección en bolo. Además, las dosis de las formulaciones terapéuticas pueden aumentarse o disminuirse proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica o profiláctica.
La administración de las composiciones de la presente divulgación a un paciente, preferentemente un mamífero, más preferentemente un ser humano, puede llevarse a cabo usando procedimientos conocidos, a dosis y durante períodos de tiempo eficaces para tratar una enfermedad o trastorno contemplado en la divulgación. Una cantidad eficaz del compuesto terapéutico necesaria para lograr un efecto terapéutico puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad o trastorno en el paciente; la edad, el sexo y el peso del paciente; y la capacidad del compuesto terapéutico para tratar una enfermedad o un trastorno contemplado en la divulgación. Pueden ajustarse los regímenes de dosificación para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, se pueden administrar varias dosis divididas diariamente o se puede reducir proporcionalmente la dosis según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. Un ejemplo no limitativo de un intervalo de dosis eficaz para un compuesto terapéutico de la divulgación es de aproximadamente 1 y 5000 mg/kg de peso corporal/día. Un experto en la materia podría estudiar los factores relevantes y determinar la cantidad eficaz del compuesto terapéutico sin una experimentación excesiva.
Los niveles de dosificación reales de los principios activos en las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden variarse para obtener una cantidad del principio activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición, y modo de administración concretos, sin ser tóxicos para el paciente.
La cantidad o dosis terapéuticamente eficaz de un compuesto de la presente divulgación depende de la edad, el sexo y el peso del paciente, el estado médico actual del paciente y la progresión de una enfermedad o trastorno contemplado en la divulgación.
Un doctor, p. ej., médico o veterinario, que sea un experto habitual en la materia puede determinar fácilmente y prescribir la cantidad eficaz de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, el médico o veterinario podría comenzar las dosis de los compuestos de la divulgación empleados en la composición farmacéutica a niveles inferiores a los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta que se logre el efecto deseado.
Una dosis adecuada de un compuesto de la presente divulgación estar en el intervalo de desde aproximadamente 0,01 mg hasta aproximadamente 5000 mg al día, tal como de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 1000 mg, por ejemplo, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 500 mg, por ejemplo, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 250 mg al día. La dosis se puede administrar en una dosificación única o en múltiples dosificaciones, por ejemplo, desde 1 hasta 4 o más veces al día. Cuando se utilizan múltiples dosificaciones, la cantidad de cada dosificación puede ser igual o diferente. Por ejemplo, una dosis de 1 mg al día puede administrarse como dos dosis de 0,5 mg, con aproximadamente un intervalo de 12 horas entre dosis.
Los compuestos de la divulgación para administración pueden estar en el intervalo de aproximadamente 1 |jg a aproximadamente 10.000 mg, de aproximadamente 20 jg a aproximadamente 9500 mg, de aproximadamente 40 jg a aproximadamente 9000 mg, de aproximadamente 75 jg a aproximadamente 8500 mg, de aproximadamente 150 jg a aproximadamente 7500 mg, de aproximadamente 200 jg a aproximadamente 7000 mg, de aproximadamente 3050 jg a aproximadamente 6000 mg, de aproximadamente 500 jg a aproximadamente 5000 mg, de aproximadamente 750 jg a aproximadamente 4000 mg, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 3000 mg, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 2500 mg, de aproximadamente 20 mg a aproximadamente 2000 mg, de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 1500 mg, de aproximadamente 30 mg a aproximadamente 1000 mg, de aproximadamente 40 mg a aproximadamente 900 mg, de aproximadamente 50 mg a aproximadamente 800 mg, de aproximadamente 60 mg a aproximadamente 750 mg, de aproximadamente 70 mg a aproximadamente 600 mg, de aproximadamente 80 mg a aproximadamente 500 mg, y todos y cada uno de los incrementos enteros o parciales entre ellos.
En algunos aspectos, la dosis de un compuesto de la divulgación es de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 2500 mg. En algunos aspectos, una dosis de un compuesto de la invención utilizado en composiciones descritas en el presente documento es inferior a aproximadamente 10.000 mg, o inferior a aproximadamente 8000 mg, o inferior a aproximadamente 6000 mg, o inferior a aproximadamente 5000 mg, o inferior a aproximadamente 3000 mg, o inferior a aproximadamente 2000 mg, o inferior a aproximadamente 1000 mg, o inferior a aproximadamente 500 mg, o inferior a aproximadamente 200 mg, o inferior a aproximadamente 50 mg. De igual manera, en algunos aspectos, una dosis de un segundo compuesto como se describe en el presente documento es inferior a aproximadamente 1000 mg, o inferior a aproximadamente 800 mg, o inferior a aproximadamente 600 mg, o inferior a aproximadamente 500 mg, o inferior a aproximadamente 400 mg, o inferior a aproximadamente 300 mg, o inferior a aproximadamente 200 mg, o inferior a aproximadamente 100 mg, o inferior a aproximadamente 50 mg, o inferior a aproximadamente 40 mg, o inferior a aproximadamente 30 mg, o inferior a aproximadamente 25 mg, o inferior a aproximadamente 20 mg, o inferior a aproximadamente 15 mg, o inferior a aproximadamente 10 mg, o inferior a aproximadamente 5 mg, o inferior a aproximadamente 2 mg, o inferior a aproximadamente 1 mg, o inferior a aproximadamente 0,5 mg, y todos y cada uno de sus incrementos totales o parciales.
En ciertos aspectos de la divulgación, las composiciones de la invención se administran al paciente en dosis que varían entre una y cinco veces al día o más. En otros aspectos, las composiciones de la invención se administran al paciente en intervalos de dosis que incluyen, pero sin limitación, una vez al día, cada dos, días, cada tres días a una vez a la semana, y una vez cada dos semanas. Es muy evidente para un experto en la materia que la frecuencia de administración de las diferentes composiciones combinadas varía de un individuo a otro en función de muchos factores, entre los que se incluyen, aunque no de forma limitativa, la edad, la enfermedad o el trastorno que se vaya a tratar, el sexo, la salud general, y otros factores. Por tanto, la divulgación no debe interpretarse como limitada a ningún régimen de dosificación en particular y la dosis y composición precisas que deben administrarse a cualquier paciente las determina el médico que lo atiende teniendo en cuenta todos los demás factores sobre el paciente.
Se entiende que la cantidad del compuesto administrado al día se puede administrar, en ejemplos no limitativos, cada día, en días alternos, cada 2 días, cada 3 días, cada 4 días o cada 5 días. Por ejemplo, con la administración en días alternos, una dosis de 5 mg al día puede iniciarse el lunes con una primera dosis subsiguiente de 5 mg al día administrada el miércoles, una segunda dosis posterior de 5 mg al día se puede administrar el viernes, etc.
En caso en donde el estado del paciente mejore, a juicio del médico, la administración del inhibidor divulgado en el presente documento se realiza opcionalmente de forma continua; como alternativa, la dosis del fármaco que se administra se reduce temporalmente o se suspende temporalmente durante cierto tiempo (es decir, un "descanso farmacológico"). La duración del descanso farmacológico varía opcionalmente entre 2 días y 1 año, que incluyen, solo a modo de ejemplo, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 10 días, 12 días, 15 días, 20 días, 28 días, 35 días, 50 días, 70 días, 100 días, 120 días, 150 días, 180 días, 200 días, 250 días, 280 días, 300 días, 320 días, 350 días o 365 días. La reducción de la dosis durante el descanso farmacológico varía del 10 % al 100 %, lo que incluye, solo a modo de ejemplo, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 %.
Una vez que se ha producido la mejora del estado del paciente, en caso necesario, se administra una dosis de mantenimiento. Posteriormente, la dosis o la frecuencia de administración, o ambas, se reduce, en función de la enfermedad o el trastorno, a un nivel en el que se conserve la enfermedad mejorada. En ciertos aspectos de la divulgación, los pacientes requieren un tratamiento intermitente a largo plazo en caso de reaparición de los síntomas y/o de la infección.
Los compuestos para usar en el método de la divulgación pueden estar formulados en formas farmacéuticas unitarias. La expresión "forma farmacéutica unitaria" se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los individuos sometidos a tratamiento, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado, opcionalmente en asociación con un vehículo farmacéuticamente adecuado. La forma farmacéutica unitaria puede ser para una sola dosis diaria o para una de varias dosis diarias (p. ej., de 1 a 4 o más veces al día). Cuando se utilizan múltiples dosis diarias, la forma farmacéutica unitaria puede ser la misma o diferente para cada dosis.
La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales regímenes terapéuticos se determinan opcionalmente en cultivos celulares o animales de experimentación, lo que incluye, aunque no de forma limitativa, la determinación de la DL50 (la dosis letal para el 50 % de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, que se expresa como el cociente entre DL50 y DE50. Los datos obtenidos de los ensayos en cultivos celulares y los estudios en animales se utilizan opcionalmente en la formulación de un intervalo de dosis para usar en seres humanos. La dosificación de tales compuestos se encuentra preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con una toxicidad mínima. La dosis varía opcionalmente dentro de este intervalo en función de la forma farmacéutica empleada y de la vía de administración utilizada.
En ciertos aspectos de la divulgación, las composiciones de la invención se formulan utilizando uno o más excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables. En una realización, las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.
El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede lograrse mediante la inclusión de varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, es preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, cloruro sódico, o polialcoholes, tales como manitol y sorbitol, en la composición.
En determinados aspectos, la presente divulgación está dirigida a una composición farmacéutica envasada que comprende un envase que contiene una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto divulgado en el presente documento, solo o junto con un segundo agente farmacéutico; e instrucciones para utilizar el compuesto con fines terapéuticos, prevenir o reducir uno o más síntomas de una enfermedad o trastorno contemplado en la divulgación.
Las formulaciones pueden emplearse en mezclas con excipientes convencionales, es decir, sustancias portadoras orgánicas o inorgánicas farmacéuticamente aceptables adecuadas para cualquier modo de administración adecuado, conocido en la técnica. Las preparaciones farmacéuticas pueden esterilizarse y, si se desea, mezclarse con agentes auxiliares, p. ej., lubricantes, conservantes, estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en los tampones para presión osmótica, coloración, aromatizantes y/o sustancias aromáticas y similares. También se pueden combinar donde se desee con otros agentes activos, p. ej., agentes analgésicos.
Las vías de administración de cualquiera de las composiciones de la invención incluyen la administración por vía nasal, inhalatoria, tópica, oral, bucal, rectal, pleural, peritoneal, vaginal, intramuscular, subcutánea, transdérmica, epidural, intratraqueal, ótica, intraocular, intratecal e intravenosa.
Las composiciones adecuadas y las formas farmacéuticas incluyen, por ejemplo, dispersiones, suspensiones, soluciones, jarabes, gránulos, microesferas, polvos, microgránulos, aerosoles líquidos para administración nasal u oral, polvo seco o formulaciones en aerosol para inhalación, y similares. Debe entenderse que las formulaciones y composiciones que serían útiles en la presente invención no están limitadas a las formulaciones y composiciones particulares que se describen en el presente documento.
Administración oral
Para la aplicación oral, particularmente adecuados son comprimidos, grageas, líquidos, gotas, supositorios o cápsulas, comprimidos ovalados y cápsulas de gelatina. Las composiciones destinadas al uso oral pueden prepararse de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica y dichas composiciones pueden contener uno o más agentes seleccionados del grupo de los excipientes farmacéuticos inertes, no tóxicos y adecuados para la fabricación de comprimidos. Dichos excipientes incluyen, por ejemplo un diluyente inerte, tal como lactosa; agentes de granulación y disgregantes, tal como almidón de maíz; agentes aglutinantes, tales como almidón; y agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio. Los comprimidos pueden no estar recubiertos o pueden recubrirse mediante técnicas conocidas por su idoneidad o para retrasar la liberación de los principios activos. Las formulaciones para uso oral también pueden presentarse como cápsulas de gelatina en donde el principio activo se mezcla con un diluyente inerte.
Para la administración oral, los compuestos de la invención pueden presentarse en forma de comprimidos o cápsulas preparados por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables como agentes aglutinantes (p. ej., polivinilpirrolidona, hidroxipropilcelulosa o hidroxipropilmetilcelulosa); cargas (p. ej., almidón de maíz, lactosa, celulosa microcristalina o fosfato de calcio); lubricantes (p. ej., estearato magnésico, talco o sílice); disgregantes (p. ej., glicolato sódico de almidón); o humectantes (p. ej., lauril sulfato de sodio. Si se desea, los comprimidos pueden recubrirse utilizando métodos y materiales de recubrimiento adecuados, como los sistemas de recubrimiento pelicular OPADRY™ disponibles en Colorcon, West Point, Pa. (p. ej., de tipo OPADRY™ OY, Tipo OYC, Orgánico entérico Tipo OY-P, Entérico acuoso Tipo OY-A, tipo OY-PM y blancos OPADRY™, 32K18400). Las preparaciones líquidas para administración oral pueden estar en forma de soluciones, jarabes o suspensiones. Las preparaciones líquidas pueden prepararse por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables como agentes de suspensión (p. ej., jarabe de sorbitol, metilcelulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agente emulsionante (p. ej, lecitina o goma arábiga); vehículos no acuosos (p. ej., aceite de almendras, ésteres oleosos o alcohol etílico); y conservantes (p. ej., p-hidroxi-benzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico).
Las técnicas de granulación son bien conocidas en la técnica farmacéutica para modificar polvos u otros materiales en partículas de partida de un principio activo. Los polvos se mezclan normalmente con un material aglutinante en aglomerados o gránulos permanentes fluidos más grandes denominada "granulación". Por ejemplo, los procesos de granulación "húmeda" que usan disolventes generalmente se caracterizan por que los polvos se combinan con un material aglutinante y se humedecen con agua o un disolvente orgánico en condiciones que dan como resultado la formación de una masa granulada húmeda a partir de la cual el disolvente debe evaporarse.
La granulación por fusión consiste generalmente en el uso de materiales que son sólidos o semisólidos a temperatura ambiente (es decir, que tienen un intervalo relativamente bajo de ablandamiento o punto de fusión) para promover la granulación de materiales en polvo o de otro tipo, esencialmente en ausencia de agua añadida u otros disolventes líquidos. Los sólidos de bajo punto de fusión, cuando se calientan a una temperatura en el intervalo del punto de fusión, se licuan para actuar como aglutinante o medio de granulación. El sólido licuado se extiende sobre la superficie de los materiales en polvo con los que se pone en contacto y, al enfriarse, forma una masa granulada sólida en la que los materiales iniciales se unen entre sí. La granulación en estado fundido resultante se puede transferir a una prensa de comprimidos o se puede encapsular para preparar la forma farmacéutica oral. La granulación por fusión mejora la velocidad de disolución y la biodisponibilidad de un activo (es decir, un fármaco) al formar una dispersión sólida o una solución sólida.
La patente estadounidense n.° 5.169.645 divulga gránulos que contienen cera para compresión directa que tienen propiedades de flujo mejoradas. Los gránulos se obtienen cuando las ceras se mezclan en la masa fundida con determinados aditivos que mejoran el flujo, seguido de enfriamiento y granulación de la mezcla. En ciertos aspectos de la divulgación, solo la propia cera se funde en la combinación fundida de la(s) cera(s) y aditivos(s) y, en otros casos, tanto la(s) cera(s) como el aditivo(s) se fundirán.
La presente divulgación también incluye un comprimido multicapa que comprende una capa que proporciona la liberación retardada de uno o más compuestos de la divulgación, y otra capa que proporciona la liberación inmediata de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o trastorno relacionado con el cerebro. Usando una mezcla de cera/polímero sensible al pH, se puede obtener una composición insoluble gástrica en la que el principio activo queda atrapado, asegurando su liberación retardada.
Administración parenteral
Para su administración parenteral, los compuestos de la invención pueden formularse para inyección o infusión, por ejemplo, intravenosa, intramuscular o inyección o infusión subcutánea, o para administración en una dosis de bolo y/o infusión continua. Las suspensiones, soluciones o emulsiones en un vehículo oleoso o acuoso, que contienen opcionalmente otros agentes de formulación, tales como agentes suspensores, estabilizantes y/o dispersantes.
Formas de administración adicionales
Las formas farmacéuticas adicionales pueden incluir formas farmacéuticas como las descritas en las patentes de EE.UU. n.° 6.340.475; 6.488.962; 6.451.808; 5.972.389; 5.582.837; y 5.007.790. Las formas farmacéuticas adicionales también incluyen las formas farmacéuticas descritas en las solicitudes de patente de EE.UU. n.° 20030147952; 20030104062; 20030104053; 20030044466; 20030039688; y 20020051820. Las formas farmacéuticas adicionales incluyen también formas farmacéuticas como se describen en las solicitudes PCT n.°WO 03/35041; WO 03/35040; WO 03/35029; WO 03/35177; WO 03/35039; WO 02/96404; WO 02/32416; WO 01/97783; WO 01/56544; WO 01/32217; WO 98/55107; WO 98/11879; WO 97/47285; WO 93/18755; y WO 90/11757.
Formulaciones de liberación controlada y sistemas de administración de fármacos
En determinados aspectos, las formulaciones de la presente divulgación pueden ser, pero sin limitación, formulaciones de liberación a corto plazo, de compensación rápida, así como de liberación controlada, por ejemplo, liberación constante, de liberación retardada y de liberación pulsátil.
La expresión liberación constante se usa en su sentido convencional para referirse a una formulación de fármaco que proporciona la liberación gradual de un fármaco durante un período prolongado de tiempo y que, aunque no necesariamente, puede dar como resultado niveles sanguíneos sustancialmente constantes de un fármaco durante un período prolongado de tiempo. El período de tiempo puede ser de hasta un mes o más y debe ser una liberación que sea más larga que la misma cantidad de agente administrado en forma de bolo.
Para la liberación constante, los compuestos pueden formularse con un polímero o material hidrófobo adecuado que proporcione propiedades de liberación constante a los compuestos. Como tales, los compuestos para usar en el método de la invención se pueden administrar en forma de micropartículas, por ejemplo, por inyección o en forma de obleas o discos por implantación.
Los compuestos de la invención pueden administrarse a un paciente, solos o junto con otro agente farmacéutico, usando una formulación de liberación constante.
La expresión liberación retardada se utiliza en el presente documento en su sentido convencional para referirse a una formulación de fármaco que proporciona una liberación inicial del fármaco después de cierto retraso tras la administración del fármaco y que puede, aunque no necesariamente, incluir un retraso de aproximadamente 10 minutos hasta aproximadamente 12 horas.
La expresión liberación pulsátil se usa en el presente documento en su sentido convencional para referirse a una formulación de fármaco que proporciona la liberación del fármaco de tal manera que produce perfiles plasmáticos pulsátiles del fármaco después de la administración del fármaco.
La expresión liberación inmediata se usa en su sentido convencional para referirse a una formulación de fármaco que proporciona la liberación del fármaco inmediatamente después de la administración del fármaco.
Como se utiliza en el presente documento, a corto plazo se refiere a cualquier período de tiempo de hasta e incluyendo aproximadamente 8 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 40 minutos, aproximadamente 20 minutos o aproximadamente 10 minutos y todos y cada uno de los incrementos completos o parciales de los mismos después de la administración del fármaco.
Como se utiliza en el presente documento, de compensación rápida se refiere a cualquier período de tiempo de hasta e incluyendo aproximadamente 8 horas, aproximadamente 7 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 40 minutos, aproximadamente 20 minutos, o aproximadamente 10 minutos y todos y cada uno de los incrementos completos o parciales de los mismos después de la administración del fármaco.
Sin embargo, de ninguna manera son una limitación de las enseñanzas o la divulgación de la presente invención como se establece en el presente documento.
Ejemplos
La invención se describe ahora en referencia a los siguientes Ejemplos. Estos Ejemplos se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y la invención no debe interpretarse de ninguna manera como limitada a estos Ejemplos, sino que debe interpretarse que abarca todas y cada una de las variaciones que se hagan evidentes como resultado de la enseñanza proporcionada en el presente documento.
Materiales y métodos
Animales y macrófagos:
los ratones C57BL/6 se adquirieron en el Instituto Nacional del Cáncer. Los ratonesASC-/-, Caspasa-1-/-, Nlrp3-/-yP2xr7-/-se han descrito (Rocket al.,2010, Annu Rev Immunol. 28:321-42). Los ratonesA2ora2a flox/floxy los ratones LysMcre se adquirieron en los laboratorios Jackson Laboratories. Los ratonesHIF-1a flox/floxfueron proporcionados amablemente por el Dr. Ruslan M. Medzhitov (Universidad de Yale). En la mayoría de los experimentos se utilizaron machos de 7 a 12 semanas de edad con diversas manipulaciones genéticas. El número de ratones de cada grupo experimental se eligió en función de la experiencia previa con estos modelos experimentales. Se aislaron macrófagos peritoneales de ratón (MPM) mediante lavado peritoneal 3 días después de la inyección intraperitoneal de una solución de tioglicolato al 4% (B2551, Fluka). Las células se sembraron a una densidad de 3 * 106 células en placas de 12 pocillos y las células no adherentes se retiraron al cabo de 3 h. Las células sensibilizadas durante la noche con 100 ng/ml de LPS o 10 ng/ml de Pam3CSK4 se trataron con diversos productos químicos y se siguió la estimulación. Las células se cultivaron en medio DMEM complementado con FBS al 10 %, penicilina/estreptomicina y L-glutamina. Los macrófagos derivados de médula ósea de ratón se aislaron a partir de células de médula ósea y se diferenciaron durante 7 días en medio RPMI-1640 completo suplementado con L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 |jg/ ml de estreptomicina, 2-mercaptoetanol 50 jM (todos de Invitrogen), FBS al 10 % inactivado por calor y 20 ng/ml de M-CSF (PeproTech). Las células de Kupffer (KC) se aislaron mediante la separación en gradiente de densidad de Optiprep (Sigma) y, a continuación, se lavaron suavemente las placas y se repuso el medio tras sembrar las células durante 2 horas para aumentar la pureza de KC.
Reactivos:
El ATP, LPS deSalmonella minnesotaRe-595, Forskolina (análogo del AMPc), SQ22536 (inhibidor de AC), H-89 (inhibidor de PKA), MRS1523 (antagonista A3), adenosina, EHNA (inhibidor de la adenosina desaminasa), 5'-(N-etilcarboxamido)adenosina (NECA) (agonista no selectivo del receptor de adenosina), la sal sódica de monofosfato de N6,2'-O-dibutiriladenosina 3',5'-cíclico (dbcAMP) y la apirasa se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO). La adenosina desaminasa se obtuvo de Worthington Biochemical corporation (Lakewood, NJ). El CGS21680 (agonista A2<a>), DPCPX (antagonista A1), ZM241385 (antagonista A2a) y MRS 1706 (antagonista A2B) se obtuvieron en TOCRIS (Ellisville, MI). La nigericina se adquirió en Calbiochem, Pam3CSK4 y el oligonucleótido CpG de tipo B (ODN 1668, CpG-B) se adquirieron en Invivogen (San Diego, CA). CAY10585 (inhibidor de HIF-1a) se adquirió en Cayman Chemical (Ann Arbor, MI). El TRIZOL y el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) se adquirieron en GIBCO/Invitrogen (Carlsbad, CA). Todos los reactivos eran de la máxima calidad disponible en el mercado. Los cristales de MSU se produjeron como se ha descrito anteriormente (Martinonet al.,2009, Annu Rev Immunol. 27:229-65). En resumen, se disolvieorn 4 mg/ml de ácido úrico (Sigma-Aldrich, Louis, MO) en tampón borato 0,1 M ajustando continuamente el pH a 8,0. La solución se filtró, y los cristales precipitados al cabo de 7 días se lavaron dos veces con alcohol absoluto y una vez con acetona, y se secaron al aire en una campana de cultivo de tejidos antes de su utilización.
RT-PCR cuantitativa en tiempo real:
el ARN total se extrajo utilizando el reactivo TRIZOL (Invitrogen), y el ADNc se generó con un cebador oligo (dT) y el sistema Superscript II (Invitrogen, EE. UU.), seguido de un análisis utilizando el sistema LightCycler 480 (Roche). Se realizó la q-PCR paraIllbutilizando conjuntos comerciales de cebador-sonda (Applied Biosystems Inc.) con la mezcla maestra de ADN (Roche). La expresión de GAPDH se utilizó para estandarizar las muestras, y los resultados se expresaron como UNA proporción relativa al control; se realizó LA q-PCR paratnfa, Il6, Txnip, Nlrp3, Hif1a, Timp1,utilizando la mezcla maestra LightCycler 480 SYBR Green I (Roche). Los resultados se normalizaron en función de la expresión de la p-actina. Las secuencias de cebadores figuran en la Tabla 1.
T l 1. n i r r l x rim n RT-P R
cgctggtataaggtggtctc (SEQ ID NO:12)
Transfección y ensayo de indicador de luciferasa:
las células THP-1 (Sigma-Aldrich) se transfectaron transitoriamente con la luciferasa del promotor de la IL-1p humana (de -1 a -4000) o la construcción de HRE-luciferasa en presencia del plásmido CREBA o vector vacío. Para cada transfección, se mezcló un total de 2,0 |jg de plásmido con 200 j l de medio Opti-MEM® I (sin suero ni antibióticos) y 8,0 j l de reactivo de transfección de ADN X-tremeGENE HP (Roche, Indianapolis, IN) siguiendo las instrucciones del fabricante. La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos y se añadió gota a gota a placas de 6 pocillos que contenían células y medio completo. Las células se incubaron durante 48 horas y se cosecharon utilizando tampón de lisis indicador (Promega) para determinar la actividad de la luciferasa. Las células se transfectaron conjuntamente con un plásmido indicador de p-galactosidasa para normalizar los experimentos en cuanto a la eficacia de la transfección. Las células 293T (InvivoGen) se transfectaron transitoriamente con la construcción indicadora de luciferasa del promotor NFkB junto con el vector indicador de luciferasa de Renilla (Rluc) de control mediante el reactivo Lipofectamine™ 2000. Se midieron todas las actividades de la luciferasa y se normalizaron con la actividad de Rluc o p-galactosidasa, y se indicó el valor normalizado con el porcentaje del grupo de control.
Citometría de flujo:
Se aislaron las células no parenquimatosas del hígado y se utilizaron anticuerpos conjugados con FITC, PE, aloficocianina (APC) específicos para CD11b (1:200, M1/70), GR-1 (1:200, RB6-8C5) (BD Biosciences - Pharmingen), Ly6-C (1:200, HK1.4) y F4/80 (1:200, BM8, eBioscience). Las células teñidas se analizaron utilizando FACScalibur (BD Biosciences).
Mediciones de atocinas mediante ELISA:
los MPM sensibilizados se trataron de manera intermitente durante 20 min con ATP 5 mM o nigericina 10 jM , y se dejaron sin tratar hasta que se recogieron los sobrenadantes de cultivo. La secreción de IL-1p se determinó mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA; R&D Systems).
Análisis de transferencia Western:
los lisados de tejido hepático o MPM se lisaron en tampón RIPA (tampón fosfato 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, NP-40 al 1 %, desoxicolato de sodio al 0,5%, SDS al 0,1 %) complementado con un cóctel completo de inhibidores de proteasas (Roche) y ditiotreitol 2 mM. Los lisados se resolvieron en geles de gradiente de Tris-glicina al 4-12% (Invitrogen) y se transfirieron a nitrocelulosa (Invitrogen) mediante electrotransferencia. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: p10 anti-caspasa-1 de conejo (SC-514, Santa Cruz), iL-1p anti-ratón de cabra (BAF401, R&D Systems), HIF-1a anti-ratón de conejo (NB100-449, Novus Biologicals, Littleton, C<o>).
Análisis estadístico:
todos los datos se expresaron como la media ± DT. Para la evaluación estadística de los resultados se utilizó la prueba de latde Student. La significación se fijó enp<0,05.
Ejemplo 1: La adenosina estimula la IL-ip de forma dependiente del inflamosoma.
Se comprobó si la adenosina puede aumentar la producción de IL-1p por encima de la producida por LPS y ATP, activando ambos las señales 1 y 2 respectivamente. La combinación de LPS y ATP dio lugar a un alto nivel de producción de IL-1p analizada 5 horas después del ATP, que aumentó significativamente con la adenosina (Fig. 1A). Para confirmar que metabolitos como la inosina producida a través de la degradación de la adenosina no eran responsables de la elevación de la IL-1p, se inhibió el metabolismo de la adenosina de fuentes celulares utilizando el inhibidor de la adenosina desaminasa EHNA (eritro-9-(2-hidroxi-3-nonil)adenina, y esto también dio lugar a un aumento significativo de la producción de IL-1p (Fig. 1A). La adenosina y el EHNA en ausencia de LPS o ATP no dieron lugar a IL-1p detectable. Para determinar el efecto de reducir experimentalmente la concentración de adenosina, se añadió adenosina desaminasa y se produjo una reducción significativa de la liberación de IL-1p (Fig. 1A).
Un curso temporal demostró un aumento constante de la producción de IL-1p por la inhibición de la adenosina desaminasa (Fig. 1B). Para confirmar aún más que los metabolitos de adenosina no eran responsables del aumento de IL-1p a través de alguna otra vía, se utilizó el agonista no degradable del receptor de pan-adenosina NECA (5'-N-etilcarboxamidoadenosina), que también estimuló un aumento de la producción de IL-1p en LPS y ATP, y de forma dependiente del tiempo (Figs. 1C-1D). El receptor de IL-1 utiliza la misma proteína adaptadora Myd88 que la mayoría de los TLR y puede aumentar la producción de IL-1p a través de un bucle autocrino. Para descartar que la NECA estuviera potenciando esta vía autocrina, se demostró que la NECA puede aumentar la producción de IL-1p en macrófagos de ratones de tipo natural y deficientes en el receptor de IL-1 en un grado similar (Fig. 1E). A continuación, se comprobó si este fenómeno era aplicable a otros tipos de macrófagos. El LPS y el ATP indujeron la estimulación de los macrófagos derivados de la médula ósea y de las células de Kupffer, dando lugar a la producción de IL-1p, que aumentó significativamente con la NECA (Figs. 6A-6B). Se examinó la muerte celular mediante el ensayo de liberación de LDH (lactato deshidrogenasa), y no mostró correlación con la secreción de IL-1p en presencia o ausencia de EHNA, lo que indica que las diferencias en la supervivencia de los macrófagos no son la razón del aumento de la producción de IL-ip (Fig. 1F).
Se comprobó el efecto de la vía de la adenosina en la producción de otras citocinas y la inhibición de la adenosina desaminasa dio lugar a una reducción de la producción de TNF-a, ningún efecto sobre la IL-10 y un aumento del IFN-Y (Figs. 1G-1I). A continuación, se comprobó si el aumento observado en la producción de IL-1p dependía de la caspasa-1, NLRP3, ASC y receptor P2x7. En ausencia de cualquiera de estas moléculas, la estimulación de la señal de adenosina mediante la adición del agonista del receptor de pan-adenosina (NECA) o la inhibición de la adenosina desaminasa (EHNA) no dio lugar a una producción significativa de IL-1p por LPS ni por ATP (Fig. 1J). NECA también aumentó la producción de IL-1p mediante la combinación de LPS y cristales de urato monosódico (MSU) (Fig. 7A). Esto fue apoyado por los datos de diferentes manipulaciones con la inhibición del metabolismo de la adenosina que da lugar a un aumento de CpG-B y el aumento inducido por ATP en IL-1p (Fig. 7B). La cuestión inversa de la contribución de la señalización del receptor A2A a la producción de IL-1p se comprobó utilizando el antagonista del receptor A2A ZM241385 en la activación del inflamosoma por diversos estímulos (CpG-B y ATP, Pam3 y ATP, LPS y microesferas, LPS y MSU y lisado de células hepáticas) (Figs. 7C-7G).
La contribución de la señalización del receptor A2Ain vivose comprobó en el modelo dependiente del inflamosoma de la inflamación estéril intraperitoneal inducida por MSU, que demostró una reducción significativa en presencia de antagonismo del receptor A2A (Fig. 7H). Estos datos muestran que la activación de una vía de adenosina aumenta la cantidad y duración de la producción de IL-1p inducida por LPS y ATP de una manera dependiente del inflamosoma NLRP3, y esto no se debe a un bucle autocrino de IL-1p.
Ejemplo 2: La activación de los receptores A+ amplifica las vías de señalización 1 y 2.
Existen cuatro receptores de adenosina identificados (A1, A2A, A2B y A3). Estos receptores están ampliamente distribuidos y están acoplados a adenilato ciclasas estimuladoras (A2A, A2B) o inhibidoras (A1 y A3). La NECA aumentó la producción de IL-1p, que fue inhibida por el antagonista A2<a>R (ZM241395), pero no por los antagonistas específicos de los receptores A1R (D<p>CPX), A2<b>R (M<r>S 1706) y A3R (MRS 1523) (Fig. 2A). Este resultado se repitió examinando la capacidad de un agonista del receptor A2A (CGS21680) para aumentar la producción de IL-1p en un grado comparable al de NECA y EHNA. Todos estos estímulos fueron inhibidos por ZM241395 (Fig. 2B). El ensayo de LDH indica que la función inhibidora de ZM241395 sobre la secreción de IL-1p inducida por LPS y ATP no se debió a su toxicidad celular (Fig. 2C). Para confirmar el papel del receptor A2A, se comprobó la capacidad de la estimulación de la vía de la adenosina para aumentar la producción de IL-1p en macrófagos de ratones deficientes en el receptor A2A(Adora2a-/-).En ausencia del receptor A2A no hubo prácticamente producción de IL-1p por parte de LPS y ATP, y esta no aumentó por la estimulación de varios componentes relacionados con la activación amplia de las vías de la adenosina (Fig. 2D). Para identificar si el aumento de la producción de IL-1p se debía a la estimulación de la señal 1 y la señal 2 inducida por la adenosina, se examinó la regulación al alza del genIl1ben macrófagos peritoneales de ratones de tipo natural y deficientes en A2A en respuesta a CGS21680 (Figs. 2E-2F). La necesidad del receptor A2A fue confirmada por una cepa convencional de ratones con desactivación deAdora2ay ratones Adora2aflox/flox/Lisozima M-(LysM)-Cre(A2aRcKO)que presentaban una reducción significativa de la expresión del receptor A2A en los macrófagos (Figs. 8A-8B), los macrófagos de ambas cepas presentaban una regulación al alza significativamente menor del ARNm deIl1ben respuesta al LPS (Figs. 2E-2F). Para examinar el papel de la activación del receptor A2A en la vía del inflamosoma activado por la señal 2, se examinó el efecto de la activación del receptor A2A sobre la formación de caspasa-1 activa. El agonista del receptor A2A CGS21680 por sí solo no produjo caspasa-1 activa detectable (Fig. 2G). En respuesta a LPS/ATP, se detectó caspasa-1 activa, que disminuyó al bloquear el receptor A2A con ZM241385 y aumentó al activar el receptor A2A con CGS21680. El aumento de la caspasa-1 activa por CGS21680 también fue inhibido por ZM241385. Adicionalmente, también se detectó una clara reducción de la caspasa-1 activa en los macrófagosA2aR-cKOen respuesta a LPS/ATP (Fig. 2H). En su conjunto, estos datos demuestran que el aumento inducido por la adenosina en la producción de IL-1p estimulada por LPS y ATP es a través del receptor A2A, y se debe a un aumento tanto de la vía de la señal 1 como de la vía de la señal 2.
Ejemplo 3: La adenosina suprime la tolerancia al LPS a través de una vía CAMP-PKA.
La demostración de que la señalización por adenosina puede aumentar no solo la amplitud, sino también la duración de la producción de IL-1p incide directamente en el fenómeno bien caracterizado de la tolerancia a LPS. En este fenómeno, la exposición a LPS provoca una hipersensibilidad a la posterior estimulación por LPS y otros agonistas TLR, y se produce en parte por una falta de regulación al alza de pro-IL-1p5. Se comprobó la capacidad de la activación de la vía de la adenosina para regular la inducción de Pro-IL-1p a partir de los MPM con la exposición previa a LPS. Como era de esperar, 3 horas después de la estimulación inicial de los MPM con LPS (Estim.) se produjo una regulación al alza de la expresión de ARNm deIl1b(Fig. 3A). Los MPM pretratados con LPS (Sens.) durante 16 horas presentaron niveles bajos de pro-IL-1p, y no respondieron a una estimulación repetida con LPS (Fig. 3A). En claro contraste con la falta de respuesta de los MPM pretratados con LPS a la estimulación repetida con LPS, se produjo un aumento drástico de la expresión de ARNm deIl1ben respuesta a NECA o CGS21680 (Fig. 3A). Estos resultados demuestran que, tras una señal inicial 1, cuando los MPM no responden a otros ligandos de la señal 1, se vuelven altamente sensibles a la adenosina mediante la regulación al alza deIl1b.A continuación, se comprobó si esta capacidad de la adenosina para suplantar la tolerancia al LPS era válida para otras citocinas. Durante 6 y 24 horas, CGS21680 y NECA fueron capaces de aumentar los niveles de expresión deIl1b, Il6, Il4,pero notnfa(Figs. 9A-9D). El análisis de la expresión de genes relevantes mostró una capacidad uniforme del CGS21680 y la NECA para superar la tolerancia al<l>P<s>para el inhibidor tisular de metaloproteinasas-1 (TIMP-1), el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y el transportador de glucosa 1 (GLUT-1) (Figs. 9E-9H). A diferencia de ello, otro gen antimicrobiano como el receptor de macrófagos Marco fue regulado al alza por la activación de la señal de adenosina, y se descubrió que esto dependía de la señalización de los receptores A2A e IL-1 (Figs. 10A-10F).
El receptor A2A se acopla a una adenilato ciclasa estimuladora, lo que provoca un aumento del AMPc y la activación de la proteína cinasa A (PKA). Para probar esta vía, se utilizó el activador de la adenilato ciclasa forskolina, que indujo la inducción del genIl1bde forma dependiente de la dosis, (Fig. 3B). Esto se confirmó utilizando directamente un análogo estable del AMPc (db-cAMP), que junto con NECA y C<g>S indujo la regulación al alza de Pro-IL-1p (Fig. 3C). Para comprobar la necesidad de la vía adenlato ciclasa/cAMP/PKA en la producción de IL-1p inducida por la señal del receptor A2A, se probó un inhibidor de la adenilato ciclasa (SQ22536) que fue capaz de bloquear el aumento de IL-1p inducido por CGS21680 y EHNA (Fig. 3D). La necesidad de PKA en dirección 3' de la activación de AMPc se probó utilizando los inhibidores específicos de H-89 y PKI 14-22 amida (PKi). La inhibición de PKA redujo significativamente la producción de IL-1p en respuesta a NECA y CGS21680 (Fig. 3D). Esto se confirmó para el nivel de proteína pro- IL-1p mediante transferencia Western (Fig. 3E). La falta de respuesta en células de ratones deficientes en receptores A2A (Fig. 2e) no se debió a efectos del desarrollo, como se demostró al comprobar la capacidad del db-cAMP para aumentar los niveles de proteína pro-IL1p en ratonesA2aR-cKO(Fig. 3F).
Para determinar si las mayores cantidades de transcripciones de Pro-IL-1p tras la activación del receptor A2A se debían a una mayor estabilidad de la transcripción, se utilizó actinomicina D para inhibir la transcripción, y examinó el efecto de CGS21680 en la pérdida de la transcripción de Pro-IL-1p. La velocidad de pérdida de expresión del ARNm deIl1bfue idéntica, lo que demuestra que la CGS no afectó a la estabilidad de la transcripción (Fig. 3G). Para confirmar el papel del receptor A2A en el aumento de la regulación de Pro-IL-1p inducida por TLR, se comprobó la respuesta de los macrófagos de ratones deficientes en receptores A2A. En ausencia del receptor A2A se produjo un aumento mínimo de la regulación al alza de la expresión de ARNm deIl1binducida por LPS (Fig. 3H). Se comprobó el papel de la señalización de adenosina y del receptor A2A en los cambios asociados a una serie de transcripciones relacionadas con citocinas e inflamosomas (Fig. 3<h>). En contraste con la disminución del ARNm deIl1beIl6en las células deficientes en el receptor A2A, había un mayor nivel detnfa.Es interesante señalar que también se observaron niveles más bajos de los transcripciones deNlrp3yTxnipen las células deficientes en el receptor A2A. Además, se comprobó si la vía adenilato ciclasa/cAMP/PKA también era necesaria para el aumento de la caspasa-1 activa inducido por el receptor A2A. Este era el caso, con la regulación al alza inducida por CGS21680 en la caspasa-1 activa inducida por LPS/ATP siendo reducida por SQ22536 y H-89 (Fig. 3I). En contraste con estos resultados, en condiciones no tolerogénicas de LPS, la señalización de adenosina-cAMP no mostró aumento de la secreción de IE1p mediante la activación del inflamosoma, lo que indica un papel distinto de la adenosina en la derivación de la producción de IL-1p (Figs. 11A-11D). En su conjunto, estos datos demuestran que la señalización de adenosina puede suplantar la tolerancia a LPS de la señal 1 a través del receptor A2A, y lo hace a través de una vía mediada por la adenilato ciclasa/cAMP/PKA.
Ejemplo 4: La adenosina induce pro-IL-ip a través de CREB y HIF-1a.
Para comprender la relación entre la activación de PKA y la regulación al alza de Pro-IL1p, se identificaron elementos de respuesta a HIF-1a en el promotor de Il1b humano y de ratón (Fig. 4A). Esto indica que la activación de HIF-1a puede ser una etapa fundamental en la regulación al alza de Pro-IL-1p. Los estudios mostraron que la activación del receptor A2A producía una regulación al alza del ARNm deH ifla(Fig. 4B). El inhibidor de HIF-1a CAY10585 fue capaz de disminuir significativamente la expresión deIllbinducida por agonistas de adenosina y la producción de IL-1p (Figs.
12A-12B). Para comprobar específicamente el papel de HlF-1a en la regulación al alza del ARNm deIllbinducida por la activación del receptor A2A, se generaron ratonesHIF-1aflox/flox/LisozimaM (LysM)-Cre(HIF-1a-cKO),y se demostró una alta eficiencia de deleción en macrófagos derivados de médula ósea (Fig. 8B). Los macrófagosHIF-1a-cKOsensibilizados con LPS presentaron una regulación al alza deI llbinducida por la estimulación del receptor A2A significativamente menor que los macrófagos de tipo natural (Fig. 4C). Los macrófagosHIF-1a-cKOsensibilizados con LPS presentaron una regulación al alza del ARNm deNlrp3yTxnipinducida por la estimulación del receptor A2A significativamente menor que los macrófagos de tipo natural (Figs. 12C-12D).
Un vínculo directo entre la activación de PKA y la regulación al alza de HIF-1a lo proporciona la proteína de unión a elementos de respuesta a AMPc (CREB), que potencia dos dominios transactivadores del extremo C de HIF-1a. Se comprobó la necesidad de CREB en la regulación al alza de HIF-1a inducida por adenosina mediante la transfección de la estirpe celular de monocitos humanos THP-1 con la construcción de luciferasa del promotor de HRE y el plásmido de p-galactosidasa en presencia o ausencia del plásmido negativo dominante de CREB (CREBA) durante 24 horas, y después se sensibilizó con LPS/PMA durante 16 horas seguido del tratamiento con NECA durante 8 horas. Un estímulo de adenosina dio lugar a la actividad luciferasa del indicador HRE, y esto fue inhibido por la presencia del plásmido CREB dominante negativo (Fig. 4D). De forma análoga, la transfección de la construcción de luciferasa del promotor de IL-1p y del plásmido de p-galactosidasa en presencia o ausencia de la forma dominante negativa de CREB demostró la necesidad de la señalización de CREB para la producción de IL-1p (Fig. 4E). La regulación transcripcional al alza de Pro-IL-1p tras la estimulación inicial con LPS se produce a través de la activación de la vía NF-kB. Al comprobar si la posterior regulación transcripcional al alza de Pro-IL-1p también utiliza esta vía, los agonistas de adenosina resultaron no aumentar la actividad de la vía NF-kB por encima de la ya inducida por LPS (Fig. 4F). En ausencia de HIF-1a, se produjo una reducción significativa a nivel proteico de la pro-caspasa-1, caspasa-1 activada, pro-IL-1p y finalmente IL-1p activa (Figs. 4G-4H). Estos datos muestran que la regulación al alza de IL-1p inducida por adenosina depende de una vía CREB/HIF-1a, que es distinta de la vía NF-kB utilizada para la producción inicial de IL-1p en respuesta al LPS.
Ejemplo 5: La lesión hepática depende del receptor A+ de los macrófagos.
Los resultados expuestos en el presente documento demuestran la necesidad de la señalización de adenosina a través del receptor A2A para la producción máxima de IL-1p por macrófagosin vitro.Se sabe que los niveles extracelulares de adenosina aumentan por diferentes medios con la inflamación y las lesiones tisulares, desde los niveles basales inferiores a 1 |jM hasta niveles de hasta 100 mM. Se comprobó si la actividad del inflamosoma impulsada por el receptor A2A era relevantein vivo;se utilizaron dos modelos de lesión hepática: un modelo agudo impulsado por LPS en donde la lesión hepática se evaluó en 6 horas después del LPS, y un segundo modelo de lesión estéril por un ataque metabólico tóxico para el hígado mediante tioacetamida (TAA) en donde la lesión se examinó en los días 1, 2 y 7. Se utilizaron ratonesA2aR-cKOque suprimen específicamente el genAdora2aen los macrófagos. Las poblaciones inmunitarias hepáticas estaban intactas en estos ratones (Fig. 13). Seis horas después de la lesión hepática inducida por LPS y D-galactosamina, hubo significativamente menos hemorragia y necrosis en los hígados de los ratonesA2aR-cKOy esto fue confirmado por los valores séricos más bajos de ALT (Fig. 5A). La reducción de la activación del inflamosoma se confirmó demostrando que el hígado entero presentaba niveles más bajos de ARNm deIl1b,caspasa-1 menos activa, y que había niveles más bajos de IL-1p sérica (Figs. 5B, 5C-5D). Para comprobar el efecto de aumentar la señalización de adenosinain vivo, los ratones de tipo natural fueron tratados con LPS en presencia o ausencia del agonista de adenosina NECA. La presencia de<n>E<c>A provocó una elevación significativa de la ALT sérica, transcripciones deIl1b, Il6, H iflayNlrp3en todo el hígado y una reducción de la transcripción paratnfa(Figs.
14A-14F).
La lesión tóxica por TAA demostró una hemorragia y necrosis máximas en el día 1. Hubo menos hemorragia y necrosis hepática, y niveles más bajos de ARNm deIl1bhepático y ALT sérica en los ratonesA2aR-cKO(Figs. 5E-5H). Además de la inflamación, la actividad del inflamosoma es necesaria para el desarrollo de la respuesta fibrótica en muchos órganos. Para evaluar si la fibrosis también se veía afectada en ausencia del receptor A2A en los macrófagos tisulares, los tejidos hepáticos de 7 días después del TAA se tiñeron para detectar el colágeno mediante Sirius Red. Hubo significativamente menos fibrosis en los hígados de los ratonesA2aR-cKOen comparación con los de tipo natural (Fig. 5G). También se observó una producción constante de IL-1p en el tejido hepático y el suero tras un ciclo de inyecciones repetidas de TAA en el control de tipo natural, pero no en los ratonesA2aR-cKO(Figs. 15A-15C).
Para comprobar el efecto del aumento de la señalización de la adenosina en la fibrosis, se inyectó TAA en ratones de tipo natural y deficientes en caspasa-1, con y sin inyección simultánea del agonista de la adenosina CGS21680. Después de una semana, los tejidos hepáticos se tiñeron para detectar el colágeno con Sirus Red. El CGS21680 aumentó la fibrosis hepática inducida por TAA y la expresión deTimplen ratones de tipo natural, pero no en ratones deficientes en caspasa-1 (Figs. 16A-16B). En conjunto, estos datos confirman que la señalización inducida por adenosina a través del receptor A2A es importante para la activaciónin vivodel inflamosoma en lesiones agudas y crónicas.
Ejemplo 6:
el modelo actual de activación del inflamosoma en los macrófagos es inadecuado para explicar cómo se mantiene la actividad en la inflamación crónica, reparación y fibrosis. La cuestión no es solo la respuesta inflamatoria autolimitada inducida por las señales 1 y 2, sino también la falta de respuesta de los macrófagos a señales posteriores similares. Como los macrófagos no responden a la exposición repetida a las señales iniciadoras, se investigó si otras señales son cualitativamente diferentes, y las señales de lesiones tisulares son candidatas dignas de estudio. La adenosina regula las respuestas tisulares al estrés y las lesiones mediante la activación de cuatro receptores ampliamente distribuidos. Los niveles de adenosina aumentan rápidamente en el entorno extracelular en respuesta al estrés y la muerte celular por liberación de los depósitos citosólicos y la desfosporilación secuencial del ATP, y se reducen rápidamente por captación y metabolismo. Las manipulaciones que aumentan la señalización de adenosina producen un aumento de la liberación de IL-1p a partir de MPM activados convencionalmente, y esto no se debe a la potenciación de un bucle de retroalimentación positiva mediado por IL-1 (Figs. 1A-1E). La adenosina tiene un papel concurrente o posterior a la activación convencional del inflamosoma. Las implicacionesin vivoson que durante y después de la activación del inflamosoma, la concentración ambiental de adenosina regula la duración de la activación del inflamosoma y puede volver a estimularla. Los datos presentados en el presente documento concuerdan con los datos originalesin vivode ratones deficientes en receptores A2A, mostrando la ausencia del aumento de la IL-1p sérica en respuesta al LPS10.
La contribución de la activación del receptorA¿aconsiste en aumentar los niveles de transcripción de Pro-IL-1p, NLRP3 y otros. Esto significa que un estímulo de adenosina puede regular al alza ambos grupos de las vías de señales 1 y 2, como demuestran los mayores niveles de proteína pro-IL-1p y caspasa-1 activa (Figs. 3E, 3I). Además, se trata de una respuesta amplia en donde la adenosina aumenta la activación del inflamosoma en respuesta a una serie de estímulos TLR para la señal 1, así como ATP, urato monosódico y la activación inducida por microesferas artificiales de la señal 2 (Figs. 7A-7H).
La activación inicial de MPM por LPS da lugar a niveles elevados de Pro-IL1p, y la exposición posterior a LPS no puede estimular una elevación repetida (tolerancia a LPS). Como se demuestra en el presente documento, tras la activación inicial, el MPM regula al alza la Pro-IL-1p y produce IL-1p en respuesta a las señales de adenosina sin exposición adicional a las señales convencionales 1 y 2. Está claro que estos MPM no son insensibles de forma global, más bien tras la activación inicial por LPS y ATP han cambiado su fenotipo a un estado en donde la producción de Pro-IL1p está regulada por señales de adenosina (Fig. 3A). Sin pretender quedar ligado a teoría alguna, esto se caracteriza mejor como una activación posterior, en lugar de un estado de falta de respuesta. Sin embargo, el efecto de la adenosina no es uniforme para todas las citocinas. En particular, la adenosina produce una regulación a la baja de la producción de TNF-a, y no altera los genes de la mayoría de las proteínas antimicrobianas (Figs. 10A-10F).
Las etapas iniciales secencia abajo del receptor A2A que se requieren para el aumento de la producción de IL-1p son las moléculas de señalización AMPc y PKA (Figs. 3B-3F). La investigación detallada utilizando inhibidores de HIF-1a, construcciones indicadoras y desactivaciones específicas de macrófagos demuestra que la capacidad de las señales de adenosina para regular al alza la pro-IL-1p depende de HIF-1a y CREB, con CREB próximas a HIF-1a (Figs. 4B-4C). Esto se diferencia de la vía NF-kB utilizada para la regulación al alza de las procitocinas tras la activación inicial de TLR, que no se reduce por la señalización de adenosina.
Sin pretender quedar ligado a teoría alguna, en ausencia de señalización del receptor A2A en los macrófagos, se reduce la activación del inflamosoma, con menos lesiones tisulares y fibrosis. Este fue el caso en un modelo agudo y constante de lesión hepática inducida por LPS y TAA (Fig. 5). Esto proporciona una valiosa confirmación de la escala de la señal de adenosinain vivo.En varios modelos experimentales, los animales con deficiencia total del receptor A2A presentan mayores lesiones orgánicas. Sin pretender quedar ligado a teoría alguna, la adenosina puede estar funcionando simultáneamente para potenciar las respuestas inflamatorias basadas en los macrófagos y proporcionar protección a las células parenquimatosas, formando ambas parte de una respuesta integrada a la lesión tisular por patógenos y ataques estériles.
Los datos divulgados en el presente documento demuestran que los macrófagos, tras recibir las señales convencionales 1 y 2, dependen de la adenosina a través del receptor A2A para la actividad inicial y constante del inflamosoma y la producción de IL-1p.
Ejemplo 7: Las dosis bajas de glucósidos cardíacos protegen de la EHNA y la hepatitis alcohólica en ratones
El inflamosoma desempeña un papel crucial en la patogénesis de la EHNA y la hepatitis alcohólica, y HIF-1a es necesario para la actividad constante del inflamosoma. La digoxina se identificó con un potente antagonista de HIF1a, pero su papel en la enfermedad hepática no se ha examinado. El presente estudio se realizó para evaluar si una dosis baja de digoxina tiene efectos terapéuticos en la EHNA y la hepatitis alcohólica en ratones, e investigar los mecanismos moleculares de la actividad de la digoxina.
Se administró a ratones machos C57BL/6J una dieta rica en grasas (DRG) del 45 % durante 11 semanas con y sin digoxina (i.p. 1 mg/kg dos veces por semana). La digoxina, 1 mg/kg ip al día, en ratones da lugar a los niveles séricos terapéuticos alcanzados en seres humanos (0,5-2 ng/ml). Se analizaron la ALT plasmática, la histología hepática, la tinción de neutrófilos, el perfil de leucocitos, la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) mitocondriales y los micromatrices del transcriptoma génico. Se comprobó la capacidad de la digoxina para inhibir el inflamosoma en macrófagos de ratón y humanos. También se realizaron los modelos de hepatitis alcohólica crónica más atracón y de hepatitis LPS/D-GalN.
En los tres modelos, la digoxina redujo las lesiones histológicas, la infiltración de neutrófilos y las ALT séricas más bajas (417 ± 398 U/l en la DRG frente a 91 ± 73 U/l en DRG+DIG, P <0,001). El inicio de la digoxina tras 4 semanas de DRG siguió mostrando una reducción significativa de la inflamación hepática (24,6 % de neutrófilos en la DRG frente al 14,3 % en DRG+DIG; 31,6 % de monocitos en la DRG frente al 19,1 % en DRG+DIG) sin una reducción de la ingesta de alimentos. En la hepatitis LPS/DGaIN, un ajuste de dosis de dos veces, un cuarto y una vigésima parte de la dosis equivalente humana dieron lugar a una mejora de la hemorragia y la necrosis hepáticas, la reducción de las transcripciones hepáticas de HIF-1a y Pro-IL-1p, así como de las proteínas de IL-1p, HIF-1a, pro-IL-1p y caspasa-1 escindida (P10). El análisis de micromatrices en el hígado de los animales con DRG reveló cambios significativos de los genes señal de que la digoxina regulaba a la baja el metabolismo ROS, la vía antioxidante y la glucólisis.
Los datosin vitromostraron que la digoxina inhibía de forma dependiente de la dosis la producción mitocondrial de ROS bajo estimulación con TLR y peróxido de hidrógeno en macrófagos de ratón y humanos. La digoxina también inhibió la secreción de IL-1 p y la activación de la caspasa-1 en macrófagos de ratón.
Como se demuestra en el presente documento, las dosis bajas de digoxina reducen la esteatosis hepática y la inflamación en modelos experimentales de EHNA y hepatitis alcohólica a través de una vía ROS-HIF1a-inflamosoma. Así pues, la digoxina a dosis bajas tiene una utilidad significativa en el tratamiento de la EHNA y la hepatitis alcohólica.
Ejemplo 8: Estudios clínicos
Estudio
Se realiza un ensayo clínico aleatorizado con doble enmascaramiento comparativo con placebo para evaluar el uso de glucósidos cardíacos (como la digoxina) en el tratamiento de la EHNA.
El estudio consistía en 25 pacientes en cada grupo, en donde cada paciente recibe durante 48 semanas digoxina (75 |jg/día) o placebo. Se realizan biopsias hepáticas al inicio y al final del estudio. Los criterios de entrada para los sujetos del estudio comprenden un IMC de 30-45 y EHNA demostrada por las características histológicas.
El criterio de valoración principal del estudio es la mejora histológica de la EHNA. Los criterios de valoración secundarios comprenden la mejora radiológica de la EHNA, pérdida de peso y/o reducción del colesterol sérico.Estudio
Se realiza un ensayo clínico aleatorizado con doble enmascaramiento comparativo con placebo para evaluar el uso de glucósidos cardíacos (como la digoxina) en el tratamiento de la hepatitis alcohólica.
El estudio consistía en 25 pacientes en cada grupo, en donde cada paciente recibe durante 48 semanas digoxina (75 jg/día) o placebo. Se realizan biopsias hepáticas al inicio y al final del estudio. Los criterios de inclusión de los participantes en el estudio comprenden un iMc de 25-30 y hepatitis alcohólica de acuerdo con criterios clínicos convencionales.
El criterio de valoración primario del estudio comprende la mejora histológica de la función discriminante.

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéutica que comprende digoxina para usar en el tratamiento o la prevención de una enfermedad o un trastorno hepático seleccionado del grupo que consiste en esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), lesión hepática asociada o causada por el consumo de alcohol en un mamífero afectado de EHNA y hepatitis alcohólica, en un mamífero que lo necesita,
en donde la composición se administra al mamífero, preferentemente un ser humano, en una cantidad terapéuticamente eficaz; y
en donde la administración de la composición al mamífero proporciona un nivel plasmático de digoxina en el mamífero igual o inferior a aproximadamente 0,8 ng/ml.
2. La composición farmacéutica para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la digoxina inhibe al menos una de (i) la síntesis de HIF-1a en el hígado del mamífero; y (ii) la esteatosis hepática en el mamífero.
3. La composición farmacéutica para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en donde la digoxina reduce en el mamífero al menos una afección seleccionada del grupo consistente en daño hepático, glucólisis y obesidad inducida por la grasa.
4. La composición farmacéutica para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y al menos un agente adicional, seleccionado entre un medicamento antidiabético y ácido abeticólico.
5. La composición farmacéutica para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la cantidad de digoxina administrada al mamífero no causa un efecto cardíaco clínicamente significativo en el mamífero,
en donde el efecto cardíaco clínicamente significativo es preferentemente al menos uno seleccionado del grupo que consiste en la aparición de taquicardia auricular, aparición de bloqueo auriculoventricular, reducción de la conducción del nódulo auriculoventricular y aumento del período refractario efectivo dentro del nódulo auriculoventricular.
6. La composición farmacéutica para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la composición se administra al mamífero aproximadamente una vez al día, aproximadamente cada dos días, aproximadamente cada tres días, aproximadamente cada cuatro días, aproximadamente cada cinco días, aproximadamente cada seis días o aproximadamente una vez a la semana, y/o se administra al mamífero por al menos una vía seleccionada del grupo que consiste en nasal, inhalatoria, tópica, oral, bucal, rectal, pleural, peritoneal, vaginal, intramuscular, subcutánea, transdérmica, epidural, intratraqueal, ótica, intraocular, intratecal e intravenosa.
7. La composición farmacéutica para el uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la administración de la composición al sujeto proporciona un nivel plasmático de digoxina seleccionado del grupo que consiste en: de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 0,05 ng/ml; de aproximadamente 0,05 a aproximadamente
0,1 ng/ml; de aproximadamente 0,05 aproximadamente 0,15 aproximadamente 0,05 a aproxim 0,2 ng/ml; de aproximadamente 0,05 aproximadamente 0,25 aproximadamente 0,05 a aproxim 0,3 ng/ml; de aproximadamente 0,05 aproximadamente 0,35 aproximadamente 0,05 a aproxim 0,4 ng/ml; de aproximadamente 0,05 aproximadamente 0,45 aproximadamente 0,05 a aproxim 0,5 ng/ml; de aproximadamente 0,05 aproximadamente 0,55 aproximadamente 0,05 a aproxim 0,6 ng/ml; de aproximadamente 0,05
aproximadamente 0,65
aproximadamente 0,05 a aproxim 0,7 ng/ml; de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,75 ng/ml; y de aproximadamente 0,05 a aproximadamente
0,8 ng/ml.
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