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ES2971516T3 - Edición del genoma sin nucleasas - Google Patents

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ES2971516T3
ES2971516T3 ES15764889T ES15764889T ES2971516T3 ES 2971516 T3 ES2971516 T3 ES 2971516T3 ES 15764889 T ES15764889 T ES 15764889T ES 15764889 T ES15764889 T ES 15764889T ES 2971516 T3 ES2971516 T3 ES 2971516T3
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ES
Spain
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nucleic acid
gene
vector
transgene
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ES15764889T
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English (en)
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Adi Barzel
Mark A Kay
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Leland Stanford Junior University
Original Assignee
Leland Stanford Junior University
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Publication date
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Abstract

Se proporcionan métodos y composiciones para editar el genoma de una célula sin el uso de una nucleasa suministrada exógenamente. Aspectos de los métodos incluyen poner en contacto una célula con un vector de direccionamiento que comprende una secuencia de ácido nucleico que se va a integrar en el locus diana, donde la célula no se pone también en contacto con una nucleasa. Además, se proporcionan reactivos, dispositivos y kits de los mismos que encuentran uso en la práctica de los métodos en cuestión. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Edición del genoma sin nucleasas
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Esta invención se refiere a la edición del genoma en ausencia de nucleasas exógenas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La manipulación específica del sitio del genoma es un objetivo deseable para muchas aplicaciones en medicina, biotecnología e investigación biológica. En los últimos años se han hecho grandes esfuerzos por desarrollar nucleasas específicas del sitio para el direccionamiento de genes en células mitóticas y postmitóticas in vitro e in vivo. Sin embargo, estas nucleasas dirigidas a menudo son tóxicas para las células y su actividad fuera de la diana puede ser inmunógena y genotóxica. Lo que se necesita en la técnica son métodos para editar el genoma de una célula sin el uso de nucleasas proporcionadas exógenamente. La presente invención aborda estas cuestiones. Lisowski et al., 2012, describe un vector viral recombinante adecuado para integrar un transgén en un sitio de integración de diana en el genoma de la célula. Anguela et al., 2013 describe la integración del Factor VIII en el locus de albúmina en ratones usando un vector AAV que comprende nucleasas de dedos de zinc (ZFNs).
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Se divulgan métodos y se proporcionan composiciones para editar el genoma de una célula sin el uso de una nucleasa suministrada exógenamente. Aspectos de los métodos divulgados incluyen poner en contacto una célula con un vector de direccionamiento que comprende la secuencia de ácido nucleico que se integrará en el locus diana, donde la célula no se pone en contacto también con una nucleasa. Además, se divulgan reactivos, dispositivos y kits de los mismos que encuentran uso en la puesta en práctica de los métodos divulgados.
La presente invención proporciona un vector viral recombinante para integrar un transgén en un sitio de integración diana en el genoma de la célula, que comprende:
un casete de polinucleótidos que comprende una primera secuencia de ácido nucleico y una segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico comprende el transgén; y la segunda secuencia de ácido nucleico está situada 5' o 3' de la primera secuencia de ácido nucleico y promueve la producción de dos productos génicos independientes al integrarse en el sitio de integración diana en el genoma de la célula; una tercera secuencia de ácido nucleico situada 5' del casete de polinucleótidos y que comprende una secuencia sustancialmente homóloga a la secuencia genómica 5' del sitio de integración diana en el genoma de la célula; y una cuarta secuencia de ácido nucleico situada 3' del casete de polinucleótidos y que comprende una secuencia sustancialmente homóloga a la secuencia genómica 3' del sitio de integración diana en el genoma de la célula, en donde el vector viral es un vector rAAV;
en donde la secuencia de ácido nucleico que promueve la producción de dos productos génicos independientes en el sitio de integración diana se selecciona de: una secuencia que codifica un péptido 2A; un IRES; una inteína; una secuencia de reconocimiento para una proteasa específica del sitio; una secuencia que codifica un conector escindible que se escinde como parte de la cascada de coagulación; una secuencia que codifica un sitio de escisión del factor XI; y una secuencia intrónica donante de corte y empalme/aceptora de corte y empalme; y en donde el transgén codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en receptor de lipoproteína de baja densidad, purina nucleósido fosforilasa, esfingomielinasa, glucocerebrosidasa, CD-18, ornitina transcarbamilasa argininosuccinato sintetasa, fenilalanina hidroxilasa, a-cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada, fumarilacetoacetato hidrolasa, glucosa 6-fosfatasa, a-L-fucosidasa, p-glucuronidasa, a-L-iduronidasa, galactosa 1-fosfato uridiltransferasa; una proteína del complejo BCKDH (subunidades E1a, E1b y E2); metilmalonil-CoA mutasa; propionil-CoA carboxilasa (subunidades alfa y beta); isovaleril CoA deshidrogenasa; HADHA; HADHB; LCHAD; ACADM; ACADVL; G6PC (GSD1a); G6PT1(GSD1b); y SLC17A3; o
en donde el transgén codifica un polipéptido quimérico, que comprende un dominio inmunoglobulina y un dominio efector inmunitario, específico para un patógeno seleccionado entre: el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de la gripe, el virus respiratorio sincitial (VRS), el virus de la hepatitis C (VHC), un plasmodio, plasmodium falciparum, plasmodium malariae, un hongo y una bacteria; y
en donde el sitio de integración diana se encuentra en el gen de la albúmina.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La invención se comprende mejor a partir de la siguiente descripción detallada cuando se lee junto con los dibujos acompañantes. Se enfatiza que, de acuerdo con la práctica común, las varias características de los dibujos no son a escala. Por el contrario, las dimensiones de las varias características se amplían o reducen arbitrariamente por claridad. En los dibujos se incluyen las siguientes figuras.
Figura 1.Diseño del vector y esquema de orientación: Un ADNc de F-IX humano optimizado con codón (verde claro) va precedido de una secuencia que codifica un péptido 2A (P2A, verde oscuro). Está flanqueado por secuencias homólogas a las que abarcan el codón de parada de la albúmina desde el 5' (azul) y el 3' (u Tr , amarillo). Los brazos de homología tienen una longitud de 1,3 y 1,4 Kb, respectivamente. La integración en el locus Alb da como resultado un gen quimérico. Sin embargo, la omisión ribosomal inducida por el péptido 2A permite la producción de dos proteínas separadas. La proteína Albúmina queda con una etiqueta 2A de 21 aminoácidos de longitud, mientras que el factor de coagulación está enlazado a una prolina N terminal que posteriormente se procesa en el ER como parte del péptido señal.
Figura 2.A ratones C57BL/6J (B6) de dos días de edad se les inyectaron por vía intraperitoneal (IP) 50 ul que contenían 2,5e11 partículas de vector, según la titulación por transferencia de puntos. La hF-IX plasmática se evaluó semanalmente mediante ELISA, a partir de la semana 4 de vida, tras la extracción de sangre retroorbital. N=6, las barras de error representan la desviación estándar.
Figura 3.A ratones adultos C57BL/6J (B6) se les inyectaron por vía intravenosa (IV) 100 ul que contenían partículas del vector 1e12, según la titulación por transferencia de puntos. La hF-IX plasmática se evaluó semanalmente mediante ELISA, a partir de la semana 4 de vida, tras la extracción de sangre retroorbital. N=3, las barras de error representan la desviación estándar.
Figura 4.PCR no sesgada con RT que muestra que hF-IX se expresa a partir de la integración en diana. Se realizó la transcripción inversa con el cebador RT (ARRIBA) seguida de la síntesis de ADN de segunda cadena con cebadores aleatorios, la escisión con la enzima de restricción Msel, la ligadura de conector y la PCR con el par de cebadores 1&2. Azul: Alb exones, Naranja: Alb intrones, línea negra continua: extremo de homología entre el vector y el genoma. Se secuenció el producto de la PCR (Abajo) y se comprobó que correspondía a un transcrito fusionado de Albúmina_F-IX, como se esperaba de la integración en la diana. El enfoque no sesgado no dio lugar a productos PCR correspondientes a la expresión episomal o a la integración fuera del objetivo.
Figura 5.Análisis por transferencia Western de plasma que muestra una única banda anti-2A del tamaño de la albúmina, lo que indica únicamente la expresión en la diana.
Figura 6.Análisis por transferencia Western de hígado. El tamaño de la banda hF-IX indica una omisión ribosomal eficiente por el péptido 2A.
Figura 7.Corrección fenotípica en ratones knock-out de F-IX (un cruce de B6 y CD-1). Se inyectó a ratones adultos con 1 x 10A12 genomas vectoriales (Vg) de AAV8_hF-IX. El tiempo de coagulación se midió mediante el ensayo aPTT dos semanas después de la inyección. Los ratones inyectados con el vector de direccionamiento AAV8_hF-IX muestran tiempos de coagulación mucho mejores.
Figura 8.Diseño del vector y esquema experimental.A.El vector rAAV8 codifica un ADNc de hF9 optimizado con codón y una secuencia codificante de péptido 2A precedente flanqueada por brazos de homología que dirigen la integración 5' al codón de paradaAlb.La longitud de los brazos 5' y 3' es de 1,3 y 1,4-kb, respectivamente. Después de la integración por recombinación homóloga,AlbyhF9 sefusionan a nivel de ADN y ARN, pero se producen dos proteínas separadas como resultado de la omisión ribosomal.B.Con respecto a los brazos de homologíaAlb,el control inverso AAV tiene hF9 invertido junto con la secuencia codificante del péptido 2A, el exónAlbadyacente y la unión de corte y empalme precedente. Rectángulos blancos finos: Intrones Alb; rectángulos gruesos gris oscuro: ExonesAlb;rectángulos blancos gruesos: P2A; flechas blancas gruesas:hF9;rectángulos grises claros gruesos: ADN extragénico; líneas discontinuas: codón de parada; elipsoides: repeticiones terminales invertidas; P = prolina.
Figura 9.Expresión y actividad del factor IX humano en ratones inyectados.A.hF9en plasma medido por ELISA tras inyecciones IP de ratones B6 de 2 días de edad con 2,5e11 vg del constructo experimentalhF9(n = 6) o del control inverso (n = 3). A las mediciones por debajo del límite de detección se les asignó un valor umbral de 20 ng/ml. PH = hepatectomía parcial. Las barras de error representan la desviación estándar. Las líneas discontinuas indican el 5% y el 20% de los niveles normales deF9.B.PlasmahF9medido por ELISA tras inyecciones en la vena de la cola de ratones B6 de 9 semanas de edad con 1e12 vg del constructo experimental AAVhF9(n = 7), o control inverso (n = 3), o una inyección hidrodinámica de 30 |jg de plásmido (3,5e12 número de copias) que codifica el constructohF9en la orientación "correcta". El límite de detección fue de 20 ng/ml. Barras de error y líneas discontinuas como en (A).C.hF9en plasma medido por ELISA tras inyecciones en la vena de la cola de ratones B6 de 9 semanas de edad con el MOI designado del constructo experimental AAV hF9 (n = 4 para cada grupo). Las barras de error representan la desviación estándar.D.Medición de la eficacia de la coagulación mediante el tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) 2 semanas después de inyecciones en la cola de 1e12 AAV8-hF9 vg por ratón (n = 5). Las barras de error representan la desviación estándar.E.Análisis de transferencia Western parahF9en muestras de hígado de ratones inyectados con el constructo AAV8-hF9 o control inverso. El tamaño esperado dehF9es de 55-Kd.
Figura 10.Tasa de selección deAlb anivel de ADN y ARN.A. Laevaluación de la tasa de integración en la diana comienza usando amplificación lineal (LAM) con el cebador 1 biotinilado (negro), apareando con el locus genómico pero no el vector. A continuación, los amplicones lineales se unen a perlas estreptavidiniladas y se lavan para excluir los vectores episomales. A la síntesis posterior de ADN de segunda cadena con cebadores aleatorios le sigue la digestión de restricciónCviQI.A continuación se ligó un conector compatible, seguido de dos rondas de PCR anidada (cebadores 2-3 en azul, y luego cebadores 4-5 en rojo).CviQIescinde a la misma distancia del borde de homología tanto en los alelos objetivo como en los de tipo salvaje, lo que permite una amplificación no sesgada. Los amplicones de la 2a PCR anidada que sirven como plantilla para los ensayos de qPCR con los cebadores 6-7 (verde) u 8-9 (naranja).B.Para la cuantificación del ARNm, se usaron los cebadores 10-11 u 11-12 para generar un ADNc para los ensayos de qPCR. Forma y código de relleno como en la Fig. 1.C.Las barras negras representan la tasa de direccionamiento de los alelosAlbdiana como la relación entre la abundancia de la plantilla de ADN amplificada por los cebadores 6-7 y la abundancia de la plantilla de ADN amplificada por los cebadores 8-9, corregida por un factor de 0,7 para tener en cuenta la frecuencia de hepatocitos. Las barras grises representan la tasa de expresión de los alelosAlbdirigidos como la relación entre la abundancia de la plantilla de ADNc amplificada por los cebadores 10-11 y la abundancia de la plantilla de ADNc amplificada por los cebadores 11-12. N = 3 en cada grupo; las barras de error representan la desviación estándar.
Figura 11.Especificidad de la expresión dehF9.A.El ADNc, producido a partir de RT con un cebador poli-dT, sirvió como plantilla para un ensayo de qPCR con los cebadores 13-14 o 14-15.B.Las barras representan la proporción de ARNm de Alb_hF9 respecto al total de ARNm que contienen hF9 como la relación entre la abundancia de la plantilla de ADNc amplificada por los cebadores 13-14 y la abundancia de la plantilla de ADNc amplificada por los cebadores 14-15. N = 3 en cada grupo, las barras de error representan la desviación estándar.
C.Análisis por transferencia Northern de muestras de hígado con una sonda contra P2A. La señal inespecífica inferior corresponde en tamaño al ARNr 18S.D.Análisis por transferencia Western de P2A a partir de muestras de hígado de ratones inyectados con el constructo AAV-P2A-hF9 o control inverso. Se espera que P2A se fusione a la albúmina (66,5-Kd).
Figura 12.Inmunohistoquímica hepática de hF9. De arriba abajo, los paneles muestran la tinción del factor 9 humano (rojo) con contratinción nuclear DAPI (azul) en el hígado humano de control positivo, el hígado de ratón no tratado de control negativo y dos tinciones representativas de ratones tratados como neonatos o adultos con AAV8-P2A-hF9.
Figura 13.Esquema de la evaluación de la tasa de direccionamiento. La evaluación de la tasa de integración en diana comienza usando amplificación lineal (LAM) con el cebador 1 biotinilado (negro), apareando al locus genómico pero no al vector (paso 1). A continuación, los amplicones lineales se unen a perlas estreptavidiniladas y se lavan para excluir los vectores episomales (paso 2). A la síntesis posterior de ADN de segunda cadena con cebadores aleatorios (paso 3) le sigue la digestión de restricciónCviQI(paso 4). A continuación, se ligó un conector compatible (Paso 5) seguido de dos rondas de amplificaciones de PCR anidadas (cebadores 2-3 en azul - Paso 6, y luego cebadores 4-5 en rojo - Paso 7).El CviQIse escinde a la misma distancia del borde de homología tanto en los alelos dirigidos como en los de tipo salvaje, lo que permite una amplificación no sesgada. Los amplicones de la 2a PCR anidada sirven como plantilla para los ensayos de qPCR con los cebadores 6-7 (verde) u 8-9 (naranja) (paso 8).
Figura 14.Curvas estándar para evaluación de la tasa de direccionamiento por qPCR. Las curvas estándar de qPCR para el alelo dirigido (cebadores 8 y 9, Figura 3) y el alelo no dirigido (cebadores 6 y 7, Figura 3). Las unidades de masa usadas son funcionalmente equivalentes a la molaridad porque todos los amplicones usados tenían la misma longitud.
Figura 15.Evaluación de la toxicidad mediante la medición de ALT. Los niveles de alanina transaminasa (ALT) se evaluaron 7 días después de la inyección en ratones inyectados con AAV8 que codifica para nuestro vector experimental (1 e12) o un control negativo que codifica para un casete no tóxico conocido (1e12 de ARNhc impulsado por el promotor H1), o un control positivo que codifica para un casete tóxico conocido (5e11 de ARNhc impulsado por el promotor U6). Los datos representan la media de dos mediciones de cuatro ratones independientes para cada grupo. La significancia estadística se define aquí como tener p<0,05 en una prueba t de una cola entre muestras de diferente varianza.
Figura 16.Número de copias del vector. Número de copias del vector evaluado mediante qPCR usando los cebadores 8 y 9 (Figura 3). N = 7 para ratones inyectados como adultos y N = 6 para ratones inyectados como neonatos y analizados antes o después de la hepatectomía parcial. Las barras de error representan la desviación estándar.
Figura 17.Haplotipos en la población humana en el locusAlbpertinente extraídos del proyecto de 1000 genomas ("http:" seguido de "//www." seguido de "1000genomes" seguido de ".org").
Figura 18.F9 en plasma medido por ELISA tras inyecciones en la vena de la cola de ratones B6 hembra de 9 semanas de edad con 1 x 1012 genomas de vector por ratón del constructo experimental AAV8-F9 o AAVDJ-F9 (n = 4 cada una), Las barras de error representan la desviación estándar.
Figura 19.Medición de la eficacia de la coagulación mediante el tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) 2 semanas después de inyecciones en la vena de la cola de AAV8-F9 a 1 x 1012 genomas de vector por ratón (arriba) o de AAV8-F9 Triple a 3 x 1011 genomas de vector por ratón (abajo) (n = 5 cada uno). KO, desactivación. Las barras de error representan la desviación estándar.
Figura 20.F9 en plasma medido por ELISA tras inyecciones en vena temporal superficial de ratones B6 de 2 días de edad con 2,5 x 1011 genomas vectoriales por ratón del constructo experimental AAV8-F9 (n = 4).
Figura 21.VRC01 en plasma (anticuerpo ampliamente neutralizante contra el VIH) medido por ELISA tras inyecciones en vena de la cola de ratones B6 hembra de 9 semanas de edad con 1 x 1012 genomas de vector por ratón del constructo experimental AAV8-VRC01 (n = 4 cada uno), Las barras de error representan la desviación estándar. El ELISA en sándwich usa placas cubiertas con anticuerpos contra la región constante de la IgG humana, mientras que el ELISA funcional usa placas cubiertas con la glicoproteína gp120 del VIH, que es el antígeno reconocido por el anticuerpo VRC01.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La invención se define en las reivindicaciones.
Se divulgan métodos y se proporcionan composiciones para editar el genoma de una célula sin el uso de una nucleasa suministrada exógenamente. Los aspectos de los métodos divulgados incluyen poner en contacto una célula con un vector de direccionamiento que comprende la secuencia de ácido nucleico que se integrará en el locus diana, donde la célula no se pone en contacto también con una nucleasa. Además, se divulgan reactivos, dispositivos y kits de los mismos que encuentran uso en la puesta en práctica de los métodos divulgados.
La invención proporciona un vector viral recombinante para integrar un transgén en un sitio de integración diana en el genoma de la célula, como se define en las reivindicaciones.
Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que también se divulga específicamente cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario, entre los límites superior e inferior de dicho intervalo. Cada intervalo más pequeño entre cualquier valor indicado o valor intermedio en un intervalo indicado y cualquier otro valor indicado o valor intermedio en ese intervalo indicado está incluido en la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse o excluirse independientemente en el intervalo, y cada intervalo en el que uno, ninguno o ambos límites se incluyen en los intervalos más pequeños también se engloba dentro de la invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, también se incluyen en la invención los intervalos que excluyen uno o ambos de esos límites incluidos.
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque en la puesta en práctica o ensayo de la presente invención pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente , a continuación se describen algunos métodos y materiales potenciales y preferidos.
Cabe señalar que, como se usan en la presente y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno" y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una pluralidad de tales células y la referencia a "el péptido" incluye la referencia a uno o más péptidos y equivalentes de los mismos, por ejemplo, polipéptidos, conocidos por los expertos en la técnica, y demás.
Se divulgan métodos y se proporcionan composiciones para editar el genoma de una célula. Por edición del genoma se entiende la manipulación genética en la que se inserta, sustituye o elimina de un genoma una secuencia de ácido nucleico de interés. En el presente caso, los métodos y composiciones se usan en particular para insertar una secuencia de ácido nucleico que se expresará en una célula, denominada en la presente "transgén", en el genoma de la célula en un locus diana. En algunos casos, el transgén codifica un ARN que codifica un péptido o polipéptido. En otros casos, el transgén codifica un ARN no codificante, es decir, un ARN que no codifica un péptido o proteína, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica una ribozima, un a Rn de horquilla pequeña (ARNhc), un microARN (miARN) o un precursor del mismo, un ARN no codificante largo, etc. En algunos casos, se inserta un transgén en el locus diana. En otros casos, se inserta más de un transgén, por ejemplo, 2, 3, 4 o 5 o más transgenes en el locus diana. En algunos casos, el o los transgenes se enlazan operativamente al promotor del gen endógeno en el locus diana tras la integración en el sitio de integración diana. En otros casos, el transgén está enlazado operativamente a un promotor en el vector viral, y permanece enlazado operativamente a ese promotor tras la integración en el sitio de integración diana.
En la puesta en práctica de los métodos, el genoma de la célula se edita sin el uso de una nucleasa exógena. Por "nucleasa" se entiende una enzima capaz de escindir los enlaces fosfodiéster entre subunidades nucleotídicas de ADN, por ejemplo ADN genómico o ADN mitocondrial, para crear una rotura de cadena doble. Se conocen muchos ejemplos de nucleasas en la técnica, incluyendo las nucleasas de dedos de zinc (ZFN) manipuladas artificialmente, las nucleasas efectoras similares a activadores de la transcripción (TALEN), el sistema CRISPR/Cas, y endonucleasas homing remanipuladas con meganucleasas manipuladas, así como nucleasas de origen natural como las endonucleasas de restricción, RecBCD endonucleasa, T7 endonucleasa, T4 endonucleasa IV, Bal 31 endonucleasa, Endonucleasa I (endo I), Endonucleasa II (endo VI, exo III), Micrococcal nucleasa, Neurospora endonucleasa, S1-nucleasa, P1-nucleasa, Mung bean nucleasa I, Ustilago nucleasa, Dnasa I, AP endonucleasa, y EndoR. Por nucleasa exógena se entiende una nucleasa que procede del exterior de la célula, por ejemplo, una nucleasa o un ácido nucleico que codifica una nucleasa que está presente y activa en una célula viva pero que se originó fuera de esa célula. Como se demuestra en los ejemplos de trabajo de la presente, la edición dirigida del genoma en una célula puede lograrse sin proporcionar nucleasas a la célula, es decir, sin poner en contacto la célula con una nucleasa o un ácido nucleico que codifique una nucleasa.
La edición del genoma sin el uso de una nucleasa exógena proporciona una serie de beneficios sobre los métodos que requieren el uso de una nucleasa exógena. Por ejemplo, las nucleasas pueden ser inmunogénicas, al igual que los vectores que administran un gen codificante de nucleasas. Además, la actividad de la nucleasa puede ser genotóxica debido tanto a la escisión específica de la diana como a la escisión fuera de la diana. Además, la introducción de una secuencia codificante de nucleasas en una célula también conlleva el riesgo de una posible integración de la secuencia codificante de nucleasas en el genoma y la posterior expresión estable de la nucleasa, lo que conlleva un riesgo aún mayor de inmunogenicidad y genotoxicidad, así como la activación de genes cercanos por el promotor que impulsa la expresión de la nucleasa o por otros promotores presentes en el vector que codifica las nucleasas. El uso de un método libre de nucleasas elimina estos riesgos.
En la puesta en práctica de los métodos, el transgén que debe integrarse en el genoma de la célula se proporciona a las células en un vector, denominado en la presente "vector de direccionamiento". En otras palabras, las células se ponen en contacto con un vector de direccionamiento que comprende la secuencia de ácido nucleico que se integrará en el genoma celular mediante integración dirigida. En la descripción detallada que sigue, se describirán composiciones que comprenden vectores de direccionamiento, seguido de métodos ejemplares para su uso.
COMPOSICIONES
En aspectos de la invención, se proporcionan composiciones que encuentran uso en la edición del genoma, por ejemplo, mediante los métodos de la divulgación. En la presente invención, la composición es un vector de direccionamiento como se define en las reivindicaciones. Como se ha analizado anteriormente, un vector de direccionamiento se refiere a un vector que comprende un transgén que se va a integrar en el genoma de la célula. Ejemplos de vectores de direccionamiento divulgados en la presente incluyen vectores virales y vectores no virales, por ejemplo, plásmidos, minicirculos y similares.
En la presente invención, el vector de direccionamiento es un vector viral. Un vector viral se refiere a un virus o material cromosómico viral en el que puede insertarse un fragmento de ADN extraño para transferirlo a una célula. En los métodos y composiciones divulgados en la presente puede usarse como vector viral cualquier virus que incluya una etapa de a Dn en su ciclo vital. Por ejemplo, el virus puede ser un virus de ADN de cadena sencilla (ADNmc) o un virus de ADN de cadena doble (ADNdc). También son adecuados los virus de ARN que tienen una etapa de ADN en su ciclo de vida, por ejemplo, retrovirus, por ejemplo MMLV, lentivirus, que se transcriben inversamente en ADN. El virus puede ser un virus integrador o un virus no integrador.
En la presente invención, el virus de interés es el virus adenoasociado. Por virus adenoasociado, o "AAV", se entiende el propio virus o sus derivados. El término cubre todos los subtipos y formas tanto de origen natural como recombinantes, excepto cuando se requiera lo contrario, por ejemplo, AAV tipo 1 (AAV-1), AAV tipo 2 (AAV-2), AAV tipo 3 (AAV-3), AAV tipo 4 (AAV-4), AAV tipo 5 (AAV-5), AAV tipo 6 (AAV-6), AAV tipo 7 (AAV-7), AAV tipo 8 (AAV-8), AAV tipo 9 (AAV-9), AAV tipo 10 (AAV-10), AAV tipo 11 (AAV-11), AAV aviar, AAV bovino, AAV canino, AAV equino, AAV de primate, AAV no de primate, AAV ovino, un AAV híbrido (es decir, un AAV que comprende una proteína de cápside de un subtipo de AAV y material genómico de otro subtipo), un AAV que comprende una proteína de cápside de AAV mutante o una cápside de AAV quimérica (es decir, una proteína de cápside con regiones o dominios o aminoácidos individuales que se derivan de dos o más serotipos diferentes de AAV, por ejemplo, AAV-DJ, AAV-LK3, AAV-LK19). "AAV de primate" se refiere a AAV que infectan a primates, "AAV no de primate" se refiere a AAV que infectan mamíferos no primates, "AAV bovino" se refiere a AAV que infectan mamíferos bovinos, etc.
La invención proporciona un vector viral recombinante como se define en las reivindicaciones, para integrar un transgén en un sitio de integración diana en el genoma de la célula, y el vector viral recombinante de la invención es un vector rAAV. Por un "vector AAV recombinante", o "vector rAAV" se entiende un virus AAV o material cromosómico viral AAV que comprende una secuencia polinucleotídica que no es de origen AAV (es decir, un polinucleótido heterólogo a AAV), típicamente una secuencia de ácido nucleico de interés que se integrará en la célula siguiendo los métodos de la divulgación. En general, el polinucleótido heterólogo está flanqueado por al menos una, y generalmente por dos secuencias de repetición terminal invertida (ITR) de AAV. En algunos casos, el vector viral recombinante también comprende genes virales importantes para el empaquetamiento del material del vector viral recombinante. Por "empaquetamiento" se entiende una serie de acontecimientos intracelulares que dan como resultado el ensamblaje y encapsidación de una partícula viral, por ejemplo, una partícula viral de AAV. Ejemplos de secuencias de ácidos nucleicos importantes para el empaquetamiento del AAV (es decir, "genes de empaquetamiento") incluyen los genes "rep" y "cap" del AAV, que codifican para las proteínas de replicación y encapsidación del virus adenoasociado, respectivamente. El término vector rAAV engloba tanto las partículas vectoriales de rAAV como los plásmidos vectoriales de rAAV.
Una "partícula viral" se refiere a una unidad única de virus que comprende una cápside que encapsula un polinucleótido basado en el virus, por ejemplo, el genoma viral (como en un virus de tipo salvaje) o, por ejemplo, el vector de direccionamiento (como en un virus recombinante). Una "partícula viral de<a>A<v>" se refiere a una partícula viral compuesta por al menos una proteína de la cápside de AAV (típicamente por todas las proteínas de la cápside de un AAV tipo salvaje) y un vector AAV polinucleótido encapsulado. Si la partícula comprende un polinucleótido heterólogo (es decir, un polinucleótido distinto de un genoma de AAV tipo salvaje, como un transgén que se administrará a una célula de mamífero), se denomina típicamente "partícula vectorial de rAAV" o simplemente "vector de rAAV". Por tanto, la producción de una partícula de rAAV incluye necesariamente la producción de un vector de rAAV, ya que dicho vector está contenido en una partícula de rAAV.
Los vectores de direccionamiento están configurados para guiar la integración del transgén a un locus específico de interés, es decir, un "locus diana", en el genoma celular. En otras palabras, la integración es una integración dirigida. Ejemplos de loci en mamíferos de particular interés para el direccionamiento incluyen el gen de la albúmina; un gen del colágeno, por ejemplo colágeno tipo 1, colágeno tipo 2, colágeno tipo 3, colágeno tipo 4, colágeno tipo 5, colágeno tipo 6, colágeno tipo 7, colágeno tipo 8, colágeno tipo 9, colágeno tipo 10, colágeno tipo 11, colágeno tipo 12, colágeno tipo 13, colágeno tipo 14, colágeno tipo 15, colágeno tipo 16, colágeno tipo 17, colágeno tipo 18, colágeno tipo 19, colágeno tipo 20, colágeno tipo 21, colágeno tipo 22, colágeno tipo 23, colágeno tipo 24, colágeno tipo 25, colágeno tipo 26, colágeno tipo 27, colágeno tipo 28; un gen de actina, por ejemplo, actina alfa, actina beta; etc.
En la invención reivindicada, el sitio de integración diana se encuentra en el gen de la albúmina.
Para promover la integración dirigida, el vector de direccionamiento comprende secuencias de ácidos nucleicos que son permisivas para la recombinación homóloga en el sitio de integración, por ejemplo, secuencias que son permisivas para la recombinación homóloga con el gen de la albúmina. Este proceso requiere homología de secuencia de nucleótidos, usando la molécula "donante", por ejemplo, el vector de direccionamiento, para la reparación de la plantilla de una molécula "diana", es decir, el ácido nucleico en el que se integra el ácido nucleico de la secuencia, por ejemplo, un locus diana en el genoma celular, y lleva a la transferencia de información genética del donante a la diana. Como tal, en los vectores de direccionamiento de las composiciones en cuestión, el transgén que se va a integrar en el genoma celular puede estar flanqueado por secuencias que contienen suficiente homología con una secuencia genómica en el sitio de escisión, por ejemplo, un 70%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de homología con las secuencias de nucleótidos que flanquean el sitio de escisión, por ejemplo, dentro de aproximadamente 50 bases o menos del sitio de escisión, por ejemplo dentro de aproximadamente 30 bases, dentro de aproximadamente 15 bases, dentro de aproximadamente 10 bases, dentro de aproximadamente 5 bases, o inmediatamente flanqueando el sitio de integración diana, para favorecer la recombinación homóloga entre éste y la secuencia genómica con la que guarda homología. Aproximadamente 25, 50, 100, 250 o 500 nucleótidos o más de homología de secuencia entre un donante y una secuencia genómica soportarán la recombinación homóloga entre ellos.
En algunas realizaciones, la presencia de las secuencias flanqueantes que son permisivas para la recombinación homóloga proporciona una mayor tasa de integración en el sitio diana, en comparación con un vector que carece de las secuencias flanqueantes o que tiene secuencias flanqueantes que no son homólogas con el locus diana (por ejemplo, secuencias flanqueantes que son homólogas con un locus genómico diferente, secuencias flanqueantes sin homología con ninguna ubicación en el genoma diana, etc.). En algunas realizaciones, el 0,01% o más (por ejemplo, el 0,05% o más, el 0,1% o más, el 0,2% o más, el 0,3% o más, el 0,4% o más, el 0,5% o más, el 0,6% o más, el 0,7% o más, el 0,8% o más, el 0,9% o más, el 1% o más, el 1,5% o más, el 2% o más, el 5% o más, el 10% o más) de los loci diana entre las células de un tejido o entre las células que reciben el vector diana contienen un transgén integrado después de la administración. La tasa de integración en un locus diana puede medirse mediante cualquier ensayo adecuado (por ejemplo, un ensayo de amplificación lineal como el descrito en la presente).
En algunas realizaciones, la expresión transgénica resulta sustancialmente de la integración en el locus diana. Por ejemplo, en algunos casos, el 75% o más (por ejemplo, el 80% o más, el 85% o más, el 90% o más, el 95% o más, el 99% o más, el 99,5% o más) de la expresión transgénica total procede del transgén que se ha integrado en el locus diana. En otras palabras, en algunos casos, la fracción relativa de expresión del transgén procedente de fuentes distintas de la integración en el locus diana (por ejemplo, expresión episomal o integración en un locus no diana) en comparación con la expresión procedente de la integración en el locus diana es del 25% o menos (por ejemplo, 20% o menos, 15% o menos, 10% o menos, 5% o menos, 1% o menos, 0,5% o menos, etc.). El porcentaje de expresión de la integración basada en el locus diana puede medirse mediante cualquier ensayo adecuado, por ejemplo, un ensayo descrito en la presente.
Las secuencias de recombinación flanqueantes pueden tener cualquier longitud, por ejemplo, 10 nucleótidos o más, 50 nucleótidos o más, 100 nucleótidos o más, 250 nucleótidos o más, 500 nucleótidos o más, 1000 nucleótidos (1 kb) o más, 5000 nucleótidos (5 kb) o más, 10000 nucleótidos (10kb) o más, etc. Generalmente, la región o regiones homólogas de una secuencia donante tendrán por lo menos un 50% de identidad de secuencia con una secuencia genómica con la que se desea la recombinación. En ciertas realizaciones, la identidad de secuencia es del 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o 99,9%, si la hay. Puede haber cualquier valor entre el 1% y el 100% de identidad de secuencia, dependiendo de la longitud del vector de direccionamiento.
En algunos casos, las secuencias flanqueantes pueden ser sustancialmente iguales en longitud entre sí, por ejemplo, una puede ser un 30% más corta o menos que la otra secuencia flanqueante, un 20% más corta o menos que la otra secuencia flanqueante, un 10% más corta o menos que la otra secuencia flanqueante, un 5% más corta o menos que la otra secuencia flanqueante, un 2% más corta o menos que la otra secuencia flanqueante, o sólo unos pocos nucleótidos menor que la otra. En otros casos, las secuencias flanqueantes pueden ser sustancialmente diferentes en longitud entre sí, por ejemplo, una puede ser un 40% más corta o más, un 50% más corta o más, a veces un 60% más corta o más, un 70% más corta o más, un 80% más corta o más, un 90% más corta o más, o un 95% más corta o más que la otra secuencia flanqueante.
A menudo, por lo menos una secuencia de recombinación flanqueante comprenderá secuencia codificante para el gen en el locus diana. Por ejemplo, si el sitio de integración diana comprende el extremo 3' del gen endógeno, la secuencia de recombinación en el vector de direccionamiento que está 5' del transgén será sustancialmente homóloga a la secuencia de ADN en sentido ascendente de, por ejemplo adyacente a, el codón de parada del gen endógeno, mientras que la secuencia de recombinación en el vector de direccionamiento que está 3' del transgén será sustancialmente homóloga a la secuencia de ADN en sentido descendente de, por ejemplo adyacente a, el codón de parada del gen endógeno. Como otro ejemplo, si el sitio de integración diana comprende el extremo 5' del gen endógeno, la secuencia de recombinación en el vector de direccionamiento que está 5' del transgén será sustancialmente homóloga a la secuencia de ADN en sentido ascendente de, por ejemplo adyacente a, el codón de inicio del gen endógeno, mientras que la secuencia de recombinación en el vector de direccionamiento que está 3' del transgén será sustancialmente homóloga a la secuencia de ADN en sentido descendente de, por ejemplo adyacente a, el codón de inicio del gen endógeno. La integración de la secuencia codificante para el gen en el locus diana tiene muchos usos. Por ejemplo, la integración de la secuencia codificante para el gen en el locus diana que se encuentra en sentido descendente, o 3', del sitio de inserción garantizará que la expresión del gen no se vea sustancialmente alterada por la integración del gen de interés. Como otro ejemplo, puede ser deseable integrar la secuencia codificante para el gen en el locus diana para expresar una secuencia genética que sea una variante de la del locus diana de la célula, por ejemplo, si el gen en el locus diana de la célula es mutante, por ejemplo, para suplementar un locus diana mutante con una secuencia genética de tipo salvaje para tratar un trastorno genético.
Es deseable editar el genoma de la célula sin alterar sustancialmente la expresión del gen en el locus editado. Con este fin, el vector de direccionamiento de la invención reivindicada comprende una o más secuencias de ácidos nucleicos adicionales que permiten la expresión del transgén sin alterar sustancialmente la expresión del gen en el locus diana. Por ejemplo, el vector de direccionamiento comprende una secuencia de ácido nucleico que promueve la producción de dos productos génicos independientes - el gen endógeno en el locus diana y el transgén integrado -tras la integración del transgén en el sitio de integración diana. Ejemplos de tales secuencias de ácidos nucleicos incluyen una secuencia que codifica un péptido 2A; un IRES; una inteína; una secuencia de reconocimiento para una proteasa específica del sitio (por ejemplo Furina), una secuencia que codifica un conector escindible que se escinde como parte de la cascada de coagulación; una secuencia que codifica un sitio de escisión del factor XI; y secuencias intrónicas donantes de corte y empalme/aceptoras de corte y empalme.
Por "péptido 2A" se entiende una secuencia peptídica pequeña (18-22 aminoácidos) que permite la expresión eficiente y concordante de productos proteicos discretos dentro de una única secuencia codificante, independientemente del orden de colocación de los genes dentro de la secuencia codificante, mediante la omisión ribosomal. Los péptidos 2A son fácilmente identificables por su motivo de consenso (DVEXNPGP, SEQ ID NO: 9) y su capacidad para promover la escisión de proteínas. En el vector de direccionamiento puede usarse cualquier péptido 2A conveniente, por ejemplo, el péptido 2A de un virus como el virus de la fiebre aftosa (F2A), el virus de la rinitis equina A, el teschovirus porcino-1 (P2A) o el virus Thosea asigna (T2A), o cualquiera de los péptidos 2A descritos en Szymczak-Workman, A. et al. "Design and Construction of 2A Peptide-Linked Multicistronic Vectors". Adaptado de: Gene Transfer: Delivery and Expression of DNA and RNA (ed. Friedmann y Rossi). CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, USA, 2007.
Típicamente, el transgén y la secuencia codificante del péptido 2A se colocarán en el vector de direccionamiento de modo que se garantice la expresión ininterrumpida, es decir, la transcripción, traducción y actividad del gen endógeno en el locus diana tras la inserción del transgén. Por ejemplo, puede ser deseable insertar el transgén en un sitio de integración cerca del extremo 5' del gen endógeno en el locus diana, por ejemplo, justo en sentido descendente del codón de inicio del gen endógeno en el locus diana. En tales casos, la secuencia codificante del péptido 2A se colocaría dentro del vector de direccionamiento de tal manera que estuviese inmediatamente 3' del transgén, y se seleccionarían secuencias de recombinación flanqueantes que guiaran la recombinación homóloga y la integración del casete de secuencia codificante del péptido transgén-2A en el sitio de integración justo en sentido descendente del codón de inicio del gen endógeno en el locus diana. Como otro ejemplo, puede ser deseable insertar el transgén en un sitio de integración dentro del extremo 3' del gen endógeno en el locus diana, es decir, justo en sentido ascendente del codón de parada del gen endógeno en el locus diana. En tales casos, la secuencia codificante del péptido 2A se colocaría dentro del vector de direccionamiento de tal manera que se encontrase inmediatamente 5' del transgén, y se seleccionarían secuencias de recombinación flanqueantes que guiasen la recombinación homóloga y la integración del casete de transgén 2A en el sitio de integración justo en sentido ascendente del codón de parada del gen endógeno en el locus diana.
Por "sitio interno de entrada al ribosoma" o "IRES" se entiende una secuencia de nucleótidos que permite iniciar la traducción de proteínas en medio de una secuencia de ARN mensajero (ARNm). Por ejemplo, cuando un segmento IRES está situado entre dos marcos de lectura abiertos en una molécula de ARNm eucariota bicistrónica, puede impulsar la traducción de la región codificante de proteínas en sentido descendente independientemente de la estructura de caperuza 5' unida al extremo 5' de la molécula de ARNm, es decir, delante de la región codificante de proteínas en sentido ascendente. En tal configuración caso, se producen ambas proteínas en la célula. La proteína situada en el primer cistrón se sintetiza por el enfoque de inicio dependiente de la caperuza, mientras que el inicio de la traducción de la segunda proteína está dirigida por el segmento IRES localizado en la región espadadora intercistrónica entre las dos regiones codificantes de proteínas. Se han aislado IRES de genomas virales y genomas celulares. En la técnica también se conocen IRES artificiales. En el polinucleótido donante conveniente puede emplearse cualquier IRES.
Típicamente, al igual que con el péptido 2A, el transgén y el IRES se colocarán en el vector de direccionamiento de manera que se proporcione la expresión ininterrumpida del gen en el locus diana tras la inserción del transgén. Por ejemplo, puede ser deseable insertar el transgén en un sitio de integración dentro de la región no traducida (UTR) 5' del gen en el locus diana. En tales casos, el IRES se colocaría dentro del vector de direccionamiento de manera que estuviera inmediatamente 3' del transgén, y se seleccionarían secuencias de recombinación flanqueantes que guiasen la recombinación homóloga y la integración del casete transgén-IRES en el sitio de integración dentro de la UTR 5'. Como otro ejemplo, puede ser deseable insertar el transgén en un sitio de integración dentro de la UTR 3' del gen en el locus diana, es decir, en sentido descendente del codón de parada, pero en sentido ascendente de la secuencia de poliadenilación. En tales casos, el IRES se colocaría dentro del vector de direccionamiento de manera que estuviera inmediatamente 5' del transgén, y se seleccionarían secuencias de recombinación flanqueantes que guiasen la recombinación homóloga y la integración del casete de transgén IRES en el sitio de integración dentro de la UTR 3' del gen en el locus diana.
Por "inteína" se entiende un segmento de un polipéptido que es capaz de extirparse a sí mismo y volver a unir las partes restantes de la secuencia polipeptídica traducida (las "exteínas") con un enlace peptídico. En otras palabras, el vector de direccionamiento comprende secuencias de ácidos nucleicos que, cuando se traducen, promueven la escisión de la proteína codificada por el transgén del polipéptido que se traduce a partir del locus diana modificado. Las inteínas pueden ser de origen natural, es decir, inteínas que catalizan espontáneamente una reacción de corte y empalme proteico para extirpar sus propias secuencias y unirse a las secuencias de exteínas flanqueantes, o artificiales, es decir, inteínas que han sido manipuladas para que experimenten un corte y empalme controlable. Las inteínas comprenden típicamente una región de corte y empalme N-terminal que comprende una Cys (C), Ser (S), Ala (A), Gln (Q) o Pro (P) en la posición más N-terminal y una secuencia TXXH en sentido descendente (SEQ ID NO: 8); y una región de corte y empalme C-terminal que comprende una Asn (N), Gln (Q) o Asp (D) en la posición más C-terminal y una His (H) en la penúltima posición C-terminal. Además, una Cys (C), Ser (S) o Thr (T) se encuentra en la posición 1 de la exteína a partir de la cual se corta y empalma la inteína (-1 y 1 de la exteína se definen como las posiciones inmediatamente N-terminal y C-terminal, respectivamente, al sitio de inserción de la inteína). El mecanismo por el que las inteínas promueven el corte y empalme de proteínas y los requisitos para el corte y empalme de inteínas pueden consultarse en Liu, X-Q, "Protein Splicing Intein: Genetic Mobility, Origin, and Evolution" Annual Review of Genetics 2000, 34: 61-76 y en bases de datos disponibles públicamente como, por ejemplo, la base de datos InBase en el sitio web de New England Biolabs, que se encuentra en la world wide web en "tools(dot)neb(dot)com/inbase/mech(dot)php". Cualquier secuencia, por ejemplo, regiones de corte y empalme N-terminal y regiones de corte y empalme C-terminal, conocida por conferir escisión asociada a la inteína, ya sea escisión espontánea o controlada, en un polinucleótido donante, encuentra uso en las composiciones objeto. Los genes de interés configurados como inteínas pueden insertarse en un sitio de integración en cualquier exón de un locus diana, es decir, entre el codón de inicio y el codón de parada del gen en el locus diana.
Por secuencia de reconocimiento para una proteasa específica de sitio, se entiende generalmente una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que es reconocida por una enzima que realiza la proteólisis. En algunos casos, dicha secuencia de aminoácidos se denomina "conector escindible". Por ejemplo, en algunos casos, el conector escindible se escinde como parte de la cascada de coagulación (por ejemplo, en algunos casos, la secuencia de reconocimiento para una proteasa específica del sitio es un sitio de escisión del factor XI). Ejemplos no limitativos de proteasas que son altamente específicas y las secuencias que escinden incluyen la trombina (escinde después del residuo de arginina en su sitio de escisión Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser, SEQ ID NO: 1), proteasa TEV (escinde después del residuo de glutamina en su sitio de escisión Glu-X-X-Tyr-X-Gln-Ser, SEQ ID NO: 2), Furina (escinde la proteína después de la última arginina de la secuencia Arg-X-(Lys/Arg)-Arg, SEQ ID NO: 3), Enterocinasa (escinde después del residuo de lisina en su sitio de escisión Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, SEQ ID NO: 4); FactorXa (escinde después del residuo de arginina en su sitio de escisión Ile-(Glu o Asp)-Gly-Arg, SEQ ID NO: 5); Genenasa I (escinde en el sitio Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr, SEQ ID NO: 6); Proteasa HRV 3C (escinde después del residuo de glutamina en su sitio de escisión Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro, SEQ ID NO: 7). En algunas realizaciones, el conector escindible es escindido por una proteasa intracelular. En algunas realizaciones, el conector escindible es escindido por una proteasa extracelular.
Por "intrón" se entiende cualquier secuencia de nucleótidos dentro de un gen que se elimina por corte y empalme de ARN para generar el producto final de ARN maduro de un gen. En otras palabras, el vector de direccionamiento comprende secuencias de ácidos nucleicos que, al transcribirse, promueven la escisión del pre-ARN codificado por el gen de interés del pre-ARN que se transcribe del locus diana modificado, permitiendo que el transgén se traduzca por separado (o no, si el transgén codifica un ARNip, miARN, etc.) del ARNm del locus diana. Los intrones comprenden típicamente un sitio de corte y empalme 5' (donante de corte y empalme), un sitio de corte y empalme 3' (aceptor de corte y empalme) y un sitio de bifurcación. El donante de corte y empalme incluye una secuencia GU casi invariable en el extremo 5' del intrón. El aceptor de corte y empalme termina el intrón con una secuencia AG casi invariante. En sentido ascendente (hacia 5') del aceptor de corte y empalme se encuentra una región rica en pirimidinas (C y U) o un tracto de polipirimidina. En sentido ascendente del tracto de polipirimidina se encuentra el punto de bifurcación, que incluye un nucleótido de adenina. Además de comprender estos elementos, el vector de direccionamiento puede comprender una o más secuencias adicionales que promuevan la traducción del ARNm transcrito a partir del gen de interés, por ejemplo, una secuencia consenso de Kozak, un sitio de unión ribosómica, un sitio de entrada ribosómica interna, etc. Los genes de interés configurados como intrones pueden insertarse en un sitio de integración dentro de la secuencia transcrita de un locus diana en cualquier punto 5' de la secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de poliadenilación, por ejemplo, la región no traducida 3', la secuencia codificante o la región no traducida 5' del gen en el locus diana.
Como se ha analizado anteriormente, en algunos casos, puede ser deseable insertar dos o más genes de interés, por ejemplo, tres o más, 4 o más, o 5 o más genes de interés en un locus diana. En tales casos, pueden usarse múltiples péptidos 2A o IRES para crear un vector de direccionamiento bicistrónico o multicistrónico. Por ejemplo, un transgén y un marcador seleccionable pueden integrarse en la región 3' del gen en el locus diana, usándose péptidos 2A para promover su escisión del polipéptido codificado por el locus diana y entre sí. Alternativamente, las secuencias codificantes de interés pueden proporcionarse en el vector de direccionamiento bajo el control de un promotor distinto del del gen en el locus diana.
Típicamente, el gen de interés, el péptido 2A y las secuencias de recombinación se colocarán en el vector de direccionamiento de tal manera que se proporcione una expresión ininterrumpida del gen en el locus diana tras la inserción del gen de interés. Por ejemplo, como se ha analizado anteriormente, puede ser deseable insertar el transgén en un sitio de integración que está 3', o "en sentido descendente" del codón de inicio del gen en el locus diana, por ejemplo, dentro de los primeros 50 nucleótidos 3' del codón de inicio (es decir, el ATG de inicio) para el gen en el locus diana, por ejemplo, dentro de los primeros 25 nucleótidos 3' del codón de inicio, dentro de los primeros 10 nucleótidos 3' del codón de inicio, dentro de los primeros 5 nucleótidos 3' del codón de inicio o, en algunos casos, inmediatamente 3' del codón de inicio, es decir, adyacente al codón de inicio. En tales casos, el péptido 2A se colocaría dentro del vector de direccionamiento de tal manera que estuviera inmediatamente 3' del gen de interés, y se seleccionarían secuencias de recombinación flanqueantes que guiasen la recombinación homóloga y la integración del gen de interés en el sitio de integración que está 3' del codón de inicio en el locus diana. Como otro ejemplo, puede ser deseable insertar el gen de interés en un sitio de integración que esté 5', o "en sentido ascendente" del codón de terminación del gen en el locus diana, por ejemplo, dentro de los primeros 50 nucleótidos 5' del codón de terminación (es decir, el codón de parada, por ejemplo, TAA, TAG o TGA), por ejemplo, dentro de los primeros 25 nucleótidos 5' del codón de terminación, dentro de los primeros 10 nucleótidos 5' del codón de terminación, dentro de los primeros 5 nucleótidos del codón de terminación, o en algunas realizaciones, inmediatamente 5' del codón de terminación, es decir, adyacente al codón de terminación. En tales casos, el péptido 2A se colocaría dentro del vector de direccionamiento de manera que estuviera inmediatamente 5' del gen de interés, y se seleccionarían secuencias de recombinación flanqueantes que guiaran la recombinación homóloga y la integración del gen de interés en el sitio de integración que está 5' del codón de terminación en el locus diana.
El vector de direccionamiento también puede comprender secuencias, por ejemplo, sitios de restricción, polimorfismos de nucleótidos, marcadores seleccionables, etc., que pueden usarse para evaluar la inserción con éxito del gen de interés en el sitio de integración. Típicamente, el vector de direccionamiento también comprenderá una estructura principal vectorial que contiene secuencias, por ejemplo, secuencias virales, por ejemplo, orígenes de replicación, caperuza del gen, gen rep, ITRs, etc., que no son homólogas a la región diana de interés y que no están destinadas a la inserción en la región diana de interés.
MÉTODOS
En la puesta en práctica de los métodos de la divulgación, una célula, por ejemplo, una célula mitótica, una célula postmitótica, se pone en contacto in vitro o in vivo con el vector de direccionamiento. En otras palabras, las células se ponen en contacto con el vector de direccionamiento de tal manera que el vector de direccionamiento es captado por las células. El vector de direccionamiento puede introducirse en la célula mediante cualquier método conveniente que haga que de cómo resultado la captación del vector de direccionamiento por la célula, por ejemplo, como ácido nucleico desnudo, como ácido nucleico complejado con un agente como un liposoma o poloxámero, como material genómico en un virus (por ejemplo, adenovirus, Aa V, retrovirus), etc. Los métodos para poner en contacto células con vectores de ácido nucleico que son plásmidos, como la electroporación, la transfección con cloruro cálcico y la lipofección, son bien conocidos en la técnica, y puede usarse cualquiera de ellos. Los métodos y sistemas para empaquetar vectores de ácido nucleico en cápsides virales, recoger las partículas virales que comprenden el vector de ácido nucleico y poner en contacto las células con las partículas virales que comprenden el vector de ácido nucleico también son bien conocidos en la técnica, y puede usarse cualquiera de ellos. Una vez dentro de la célula, el vector de direccionamiento puede mantenerse de manera episomal, por ejemplo, como plásmidos, ADN minicirculares, virus como el virus adenoasociado, adenovirus, citomegalovirus, etc., o pueden integrarse en el genoma de la célula diana, mediante recombinación homóloga o integración aleatoria, por ejemplo, vectores derivados de retrovirus como MMLV, VIH-1, ALV, etc..
En algunas realizaciones, el vector de direccionamiento se proporciona a las células como partículas virales que comprenden el vector de direccionamiento. En tales casos, el vector de direccionamiento comprenderá típicamente la secuencia o secuencias de ácidos nucleicos, por ejemplo, transgén, secuencia de ácido nucleico que promueve la producción de dos productos génicos independientes, secuencias de homología con el sitio de integración diana, etc., como secuencias heterólogas en asociación con la secuencia genómica viral, por ejemplo, repeticiones terminales invertidas (ITR). Cualquier virus que incluya una etapa de ADN en su ciclo de vida puede usarse como vector viral en los métodos y composiciones. Por ejemplo, el virus puede ser un virus de ADN de cadena sencilla (ADNmc) o un virus de ADN de cadena doble (ADNdc). También son adecuados los virus de ARN que tienen una etapa de ADN en su ciclo de vida, por ejemplo, retrovirus, por ejemplo MMLV, lentivirus, que se transcriben inversamente en ADN. El virus puede ser un virus integrador o un virus no integrador.
Los virus adenoasociados, por ejemplo, son especialmente adecuados para los métodos divulgados en la presente. Por virus adenoasociado, o "AAV", se entiende el propio virus o derivados del mismo. El término abarca todos los subtipos y formas tanto de origen natural como recombinantes, excepto cuando se requiera lo contrario, por ejemplo, AAV tipo 1 (AAV-1), AAV tipo 2 (AAV-2), AAV tipo 3 (AAV-3), AAV tipo 4 (AAV-4), AAV tipo 5 (AAV-5), AAV tipo 6 (AAV-6), AAV tipo 7 (AAV-7), AAV tipo 8 (AAV-8), AAV tipo 9 (AAV-9), AAV aviar, AAV bovino, AAV canino, AAV equino, AAV de primate, AAV no de primate, AAV ovino, un AAV híbrido (es decir, un AAV que comprenda una proteína de cápside de un subtipo de AAV y material genómico de otro subtipo), un AAV que comprenda una proteína de cápside de AAV mutante o una cápside de AAV quimérica (es decir, una proteína de cápside con regiones o dominios o aminoácidos individuales derivados de dos o más serotipos diferentes de AAV, por ejemplo, AAV-DJ, AAV-LK3, AAV-LK19), etc.
Un vector de expresión de AAV que comprenda las secuencias de ácidos nucleicos heterólogas de interés, por ejemplo, transgén, secuencia de ácido nucleico que promueva la producción de dos productos génicos independientes, secuencias de homología con el sitio de integración diana, etc., y que se usa para generar un virión rAAV puede construirse usando métodos bien conocidos en la técnica. Consultar, por ejemplo, Koerber et al. (2009) Mol. Ther. 17:2088; Koerber et al. (2008) Mol Ther.16:1703-1709; Patentes de Estados Unidos N° 7.439.065, 6.951.758 y 6.491.907. Por ejemplo, la secuencia o secuencias heterólogas pueden insertarse directamente en un genoma de AAV del que se hayan eliminado los principales marcos de lectura abierta ("ORF"). También pueden suprimirse otras partes del genoma del AAV, siempre que quede una parte suficiente de los ITR para permitir las funciones de replicación y empaquetamiento. Tales constructos pueden diseñarse usando técnicas bien conocidas en la técnica. Consultar, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N° 5.173.414 y 5.139.941; Publicaciones Internacionales N° WO 92/01070 (publicada el 23 de enero de 1992) y WO 93/03769 (publicada el 4 de marzo de 1993); Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539; Muzyczka, N. (1992) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158:97-129; Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Shelling y Smith (1994) Gene Therapy 1:165-169; y Zhou et al. (1994) J. Exp. Med. 179:1867-1875.
Para producir viriones de rAAV, se introduce un vector de expresión de AAV en una célula huésped adecuada mediante técnicas conocidas, como la transfección. Generalmente se conocen varias técnicas de transfección. Consultar, por ejemplo, Graham et al. (1973) Virology, 52:456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Nueva York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, y Chu et al. (1981) Gene 13:197. Entre los métodos de transfección particularmente adecuados se encuentran la coprecipitación de fosfato cálcico (Graham et al. (1973) Virol. 52:456-467), la microinyección directa en células cultivadas (Capecchi, M. R. (1980) Cell 22:479-488), la electroporación (Shigekawa et al. (1988) BioTechnigues 6:742-751), la transferencia de genes mediada por liposomas (Mannino et al. (1988) BioTechniques 6:682-690), la transducción mediada por lípidos (Felgner et al. (1987) Proc. Acad. Sci. USA 84:7413-7417), y la administración de ácidos nucleicos mediante microproyectiles de alta velocidad (Klein et al. (1987) Nature 327:70-73).
Las células huésped adecuadas para producir viriones de rAAV incluyen microorganismos, células de levadura, células de insecto y células de mamífero, que pueden ser, o han sido, usadas como receptores de una molécula de ADN heteróloga. El término incluye la progenie de la célula original que ha sido transfectada. Por tanto, una "célula huésped", como se usa en la presente, se refiere de manera general a una célula que ha sido transfectada con una secuencia de ADN exógena. Pueden usarse células de la línea celular humana estable 293 (fácilmente disponible, por ejemplo, a través de la American Type Culture Collection con el número de registro ATCC CRL1573). Por ejemplo, la línea celular humana 293 es una línea celular de riñón embrionario humano que se ha transformado con fragmentos de ADN de adenovirus de tipo 5 (Graham et al. (1977) J. Gen. Virol. 36:59), y expresa los genes adenovirales E1a y E1b (Aiello et al. (1979) Virology 94:460). La línea celular 293 se transfecta fácilmente y proporciona una plataforma adecuada en la que producir viriones de rAAV. Los métodos de producción de un virión de AAV en células de insecto son conocidos en la técnica, y pueden usarse para producir un virión de rAAV en cuestión. Consultar, por ejemplo, la Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2009/0203071; la Patente de Estados Unidos N° 7.271.002; y Chen (2008) Mol. Ther. 16:924.
El virus AAV que se produce puede ser competente para la replicación o incompetente para la replicación. Un virus "competente en replicación" (por ejemplo, un AAV competente en replicación) se refiere a un virus fenotípicamente de tipo salvaje que es infeccioso y también capaz de replicarse en una célula infectada (por ejemplo, en presencia de un virus ayudante o de funciones del virus ayudante). En el caso del AAV, la competencia de replicación generalmente requiere la presencia de genes de empaquetamiento AAV funcionales. En general, los vectores de rAAV descritos en la presente son incompetentes para la replicación en células de mamífero (especialmente en células humanas) debido a la falta de uno o más genes de empaquetamiento de AAV. Típicamente, tales vectores de rAAV carecen de secuencias de genes de empaquetamiento de AAV para minimizar la posibilidad de que se generen AAV competentes en replicación por recombinación entre genes de empaquetamiento de AAV y un vector de rAAV entrante. En muchas realizaciones, las preparaciones de vectores de rAAV descritas en la presente son aquellas que contienen pocos o ningún AAV competentes para la replicación (rcAAV, también denominados RCA) (por ejemplo, menos de aproximadamente 1 rcAAV por 102 partículas de rAAV, menos de aproximadamente 1 rcAAV por 104 partículas de rAAV, menos de aproximadamente 1 rcAAV por 108 partículas de rAAV, menos de aproximadamente 1 rcAAV por 1012 partículas de rAAV, o ningún rcAAV).
Las células pueden entrar en contacto con los vectores diana del sujeto, por ejemplo, en forma de plásmido, virus, etc., in vitro o in vivo. En caso de contacto in vitro, las células pueden proceder de líneas celulares establecidas o pueden ser células primarias, donde "células primarias", "líneas celulares primarias" y "cultivos primarios" se usan indistintamente en la presente para referirse a células y cultivos celulares que se han derivado de un sujeto y se han modificado sin un cultivo adicional significativo, es decir, se han modificado "ex vivo", por ejemplo, para devolverlas al sujeto, o se han dejado crecerin vitrodurante un número limitado de pases, es decir, divisiones, del cultivo. Por ejemplo, los cultivos primarios son cultivos que pueden haber sido pasados 0 veces, 1 vez, 2 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces o 15 veces, pero que no han pasado suficientes veces por la etapa de crisis. Típicamente, las líneas celulares primarias de la presente invención se mantienen durante menos de 10 pases in vitro. Típicamente, las células a poner en contacto son permisivas a la recombinación homóloga.
Si las células son primarias, pueden recogerse de un individuo por cualquier método adecuado. Por ejemplo, los leucocitos pueden recogerse convenientemente mediante aféresis, leucocitaféresis, separación en gradiente de densidad, etc., mientras que las células de tejidos como la piel, los músculos, la médula ósea, el bazo, el hígado, el páncreas, los pulmones, el intestino, el estómago, etc., se recogen más convenientemente mediante biopsia. Puede usarse una solución apropiada para la dispersión o suspensión de las células recogidas. Dicha solución será generalmente una solución salina equilibrada, por ejemplo, solución salina normal, PBS, solución salina equilibrada de Hank, etc., convenientemente suplementada con suero de ternera fetal u otros factores naturales, junto con un tampón aceptable a baja concentración, generalmente de 5-25 mM. Los tampones convenientes incluyen HEPES, tampones de fosfato, tampones de lactato, etc. Las células pueden usarse inmediatamente, o pueden almacenarse, congeladas, durante largos periodos de tiempo, descongelarse y poder reutilizarse. En tales casos, las células se congelarán habitualmente en DMSO al 10%, suero al 50%, medio tamponado al 40%, o alguna otra solución que se use habitualmente en la técnica para conservar las células a tales temperaturas de congelación, y se descongelarán de la manera que se conoce habitualmente en la técnica para descongelar células cultivadas congeladas.
Para inducir la integración del ADN in vitro, se suministra el vector de direccionamiento, por ejemplo en forma de virus, a las células durante de aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 24 horas, por ejemplo 1 hora, 1,5 horas, 2 horas, 2,5 horas, 3 horas, 3,5 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 12 horas, 16 horas, 18 horas, 20 horas, o cualquier otro período comprendido entre aproximadamente 30 minutos y aproximadamente 24 horas, que puede repetirse con una frecuencia de aproximadamente cada día a aproximadamente cada 4 días, por ejemplo, cada 1,5 días, cada 2 días, cada 3 días, o cualquier otra frecuencia comprendida entre aproximadamente cada día y aproximadamente cada cuatro días. El vector de direccionamiento puede proporcionarse a las células en cuestión una o más veces, por ejemplo, una vez, dos veces, tres veces o más de tres veces, y las células pueden incubarse con el vector de direccionamiento durante cierto tiempo después de cada contacto, por ejemplo, 16-24 horas, tras lo cual el medio se sustituye por medio fresco y las células se siguen cultivando.
El contacto de las células con el vector de direccionamiento puede producirse en cualquier medio de cultivo y en cualquier condición de cultivo que favorezca la supervivencia de las células. Por ejemplo, las células pueden suspenderse en cualquier medio nutritivo apropiado que sea conveniente, como DMEM modificado de Iscove o RPMI 1640, suplementado con suero fetal de ternera o suero de cabra inactivado por calor (aproximadamente 5-10%), L-glutamina, un tiol, en particular 2-mercaptoetanol, y antibióticos, por ejemplo penicilina y estreptomicina. El cultivo puede contener factores de crecimiento a los que respondan las células. Los factores de crecimiento, como se definen en la presente, son moléculas capaces de promover la supervivencia, el crecimiento y/o la diferenciación de las células, ya sea en cultivo o en el tejido intacto, a través de efectos específicos sobre un receptor transmembrana. Los factores de crecimiento incluyen polipéptidos y factores no polipeptídicos.
Típicamente, se proporciona a las células una cantidad eficaz de vector de direccionamiento para promover la recombinación y la integración. Una cantidad eficaz de vector diana es la cantidad necesaria para inducir un aumento de 2 veces o más en el número de células en las que se observa la integración del transgén con respecto a un control negativo, por ejemplo, una célula en contacto con un vector vacío. La cantidad de integración puede medirse por cualquier método conveniente. Por ejemplo, la presencia del gen de interés en el locus puede detectarse mediante, por ejemplo, citometría de flujo. La PCR o la hibridación Southern pueden realizarse usando cebadores que amplifiquen el locus diana para detectar la presencia de la inserción. La expresión o actividad del gen de interés integrado puede determinarse mediante Western, ELISA, pruebas de actividad proteica, etc., por ejemplo, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 24 horas, 36 horas, 48 horas, 72 horas o más después del contacto con el polinucleótido donante. Como otro ejemplo, la integración puede medirse cointegrando un marcador de imagenología o un marcador seleccionable, y detectando la presencia del marcador de imagenología o seleccionable en las células.
Típicamente, la modificación genética de la célula usando las composiciones y métodos no irá acompañada de la alteración de la expresión del gen en el locus modificado, es decir, el locus diana. En otras palabras, la expresión normal del gen en el locus diana se mantiene espacial y temporalmente, y a niveles sustancialmente inalterados con respecto a los niveles normales, por ejemplo, a niveles que difieren 5 veces o menos de los niveles normales, por ejemplo 4 veces o menos, o 3 veces o menos, más habitualmente 2 veces o menos de los niveles normales, tras la integración dirigida del gen de interés en el locus diana.
En algunos casos, la población de células puede enriquecerse con las que comprenden el transgén separando las células modificadas genéticamente de la población restante. La separación de las células modificadas genéticamente se basa típicamente en la expresión de un marcador seleccionable cointegrado en el locus diana. Por "marcador seleccionable" se entiende un agente que puede usarse para seleccionar células, por ejemplo, células que han sido objetivo de las composiciones de la presente solicitud. En algunos casos, la selección puede ser positiva; es decir, las células se aíslan de una población, por ejemplo, para crear una población enriquecida de células que comprenden la modificación genética. En otros casos, la selección puede ser selección negativa, es decir, la población se aísla de las células, por ejemplo, para crear una población enriquecida de células que no contienen la modificación genética. La separación puede realizarse mediante cualquier técnica de separación adecuada para el marcador seleccionable usado. Por ejemplo, si se ha insertado un marcador fluorescente, las células pueden separarse mediante clasificación celular activada por fluorescencia, mientras que si se ha insertado un marcador de superficie celular, las células pueden separarse de la población heterogénea mediante técnicas de separación por afinidad, por ejemplo, separación magnética, cromatografía de afinidad, "adsorción" con un reactivo de afinidad unido a una matriz sólida, u otra técnica conveniente. Las técnicas que proporcionan una separación precisa incluyen clasificadores celulares activados por fluorescencia, que pueden tener varios grados de sofisticación, como canales de colores múltiples, canales de detección de dispersión de luz obtusa y de ángulo bajo, canales de impedancia, etc. Las células pueden seleccionarse contra células muertas empleando colorantes asociados a células muertas (por ejemplo, yoduro de propidio). Puede emplearse cualquier técnica que no sea indebidamente perjudicial para la viabilidad de las células modificadas genéticamente.
De este modo se consiguen composiciones celulares altamente enriquecidas en células que contienen el transgén. Por "altamente enriquecidas" se entiende que las células modificadas genéticamente constituirán el 70% o más, el 75% o más, el 80% o más, el 85% o más, el 90% o más de la composición celular, por ejemplo, aproximadamente el 95% o más, o el 98% o más de la composición celular. En otras palabras, la composición puede ser una composición sustancialmente pura de células modificadas genéticamente.
Las células modificadas genéticamente producidas por los métodos descritos en la presente pueden usarse inmediatamente. Alternativamente, las células pueden congelarse a temperaturas de nitrógeno líquido y almacenarse durante largos periodos de tiempo, descongelarse y poder reutilizarse. En tales casos, las células habitualmente se congelarán en DMSO al 10%, suero al 50%, medio tamponado al 40%, o alguna otra solución de este tipo que se use comúnmente en la técnica para conservar las células a tales temperaturas de congelación, y se descongelarán de la manera comúnmente conocida en la técnica para descongelar células cultivadas congeladas.
Las células modificadas genéticamente pueden cultivarse in vitro en varias condiciones de cultivo. Las células pueden expandirse en cultivo, es decir, crecer en condiciones que promuevan su proliferación. El medio de cultivo puede ser líquido o semisólido, por ejemplo, conteniendo agar, metilcelulosa, etc. La población celular puede suspenderse en un medio nutritivo apropiado, como DMEM modificado de Iscove o RPMI 1640, normalmente suplementado con suero fetal de ternera (aproximadamente 5-10%), L-glutamina, un tiol, en particular 2-mercaptoetanol, y antibióticos, por ejemplo penicilina y estreptomicina. El cultivo puede contener factores de crecimiento a los que respondan las células. Los factores de crecimiento, como se definen en la presente, son moléculas capaces de promover la supervivencia, el crecimiento y/o la diferenciación de las células, ya sea en cultivo o en el tejido intacto, a través de efectos específicos sobre un receptor transmembrana. Los factores de crecimiento incluyen polipéptidos y factores no polipeptídicos.
Las células que se han modificado genéticamente de esta manera pueden trasplantarse a un sujeto con propósitos como la terapia génica, por ejemplo para tratar una enfermedad o como agente terapéutico antivírico, antipatógeno o anticancerígeno, para la producción de organismos modificados genéticamente en agricultura o para la investigación biológica. El sujeto puede ser un neonato, un joven o un adulto. De particular interés son los sujetos mamíferos. Las especies de mamíferos que pueden tratarse con los presentes métodos incluyen caninos y felinos; equinos; bovinos; ovinos; etc. y primates, en particular humanos. Para las investigaciones experimentales pueden usarse modelos animales, en particular pequeños mamíferos, por ejemplo murinos, lagomorfos, etc.
Las células pueden proporcionarse al sujeto solas o con un sustrato o matriz adecuados, por ejemplo para favorecer su crecimiento y/o organización en el tejido al que se trasplantan. Habitualmente, se administrarán por lo menos 1x103 células, por ejemplo 5x103 células, 1x104 células, 5x104 células, 1x105 células, 1 x 106 células o más. Las células pueden introducirse en el sujeto por cualquiera de las siguientes vías: parenteral, subcutánea, intravenosa, intracraneal, intraespinal, intraocular o en el líquido cefalorraquídeo. Las células pueden introducirse por inyección, catéter o medios similares. Entre los ejemplos de métodos de administración local, es decir, en el lugar de la lesión, se incluyen, por ejemplo, a través de un reservorio Ommaya, por ejemplo, para la administración intratecal (consultar, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 5.222.982 y 5385582); por inyección en bolo, por ejemplo, mediante una jeringuilla, por ejemplo en una articulación; por infusión continua, por ejemplo por canulación, por ejemplo con convección (consultar, por ejemplo la Solicitud de Estados Unidos N° 20070254842); o por implantación de un dispositivo en el que las células se han fijado reversiblemente (consultar, por ejemplo las Solicitudes de Estados Unidos N° 20080081064 y 20090196903).
El número de administraciones del tratamiento a un sujeto puede variar. La introducción de las células modificadas genéticamente en el sujeto puede realizarse una sola vez; pero en ciertas situaciones, dicho tratamiento puede producir una mejora durante un periodo de tiempo limitado y requerir una serie continua de tratamientos repetidos. En otras situaciones, pueden ser necesarias múltiples administraciones de las células modificadas genéticamente antes de que se observe un efecto. Los protocolos exactos dependen de la enfermedad o afección, de la fase de la enfermedad y de los parámetros del sujeto individual tratado.
El vector de direccionamiento puede emplearse para modificar el ADN celular in vivo. En estos usos in vivo, el vector de direccionamiento se administra directamente, por ejemplo, como un virus al individuo. El vector de direccionamiento puede administrarse mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica para la administración de ácidos nucleicos a un sujeto. El vector de direccionamiento puede incorporarse a una variedad de formulaciones. Más particularmente, los vectores de direccionamiento de la presente invención pueden formularse en composiciones farmacéuticas mediante su combinación con portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables apropiados.
Las preparaciones farmacéuticas son composiciones que incluyen un vector de direccionamiento, por ejemplo un virus, presente en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los "vehículos farmacéuticamente aceptables" pueden ser vehículos aprobados por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o incluidos en la Farmacopea de Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en mamíferos, como los humanos. El término "vehículo" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o portador con el que se formula un compuesto de la invención para su administración a un mamífero. Tales vehículos farmacéuticos pueden ser lípidos, por ejemplo liposomas, por ejemplo dendrímeros liposomados; líquidos, como agua y aceites, incluyendo los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares, solución salina; goma acacia, gelatina, pasta de almidón, talco, queratina, sílice coloidal, urea y similares. Además, pueden usarse agentes auxiliares, estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse en preparados sólidos, semisólidos, líquidos o gaseosos, como comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, pomadas, soluciones, supositorios, inyecciones, inhalantes, geles, microesferas y aerosoles. Como tal, la administración del vector de direccionamiento puede lograrse de varias maneras, incluyendo la administración oral, bucal, rectal, parenteral, intraperitoneal, intraocular, intradérmica, transdérmica, intraqueal, etc. El agente activo puede ser sistémico después de la administración o puede localizarse mediante el uso de administración regional, administración intramural o uso de un implante que actúa para retener la dosis activa en el sitio de implantación. El agente activo puede formularse para una actividad inmediata o para una liberación sostenida.
Para algunas afecciones, en particular las del sistema nervioso central, puede ser necesario formular agentes que atraviesen la barrera hematoencefálica (BHE). Una estrategia para la administración de fármacos a través de la barrera hematoencefálica (BHE) consiste en alterar la BHE, ya sea por medios osmóticos como el manitol o los leucotrienos, o bioquímicamente mediante el uso de sustancias vasoactivas como la bradicinina. También existe la posibilidad de usar la apertura de la BHE para dirigir agentes específicos a los tumores cerebrales. Un agente de alteración de la BHE puede coadministrarse con las composiciones terapéuticas de la invención cuando las composiciones se administran por inyección intravascular. Otras estrategias para atravesar la BHE pueden implicar el uso de sistemas de transporte endógenos, incluyendo la transcitosis mediada por Caveolina-1, transportadores mediados por portadores como los portadores de glucosa y aminoácidos, transcitosis mediada por receptores para insulina o transferrina, y transportadores de eflujo activo como la p-glicoproteína. Las fracciones transportadoras activas también pueden conjugarse con los compuestos terapéuticos para su uso en la invención para facilitar el transporte a través de la pared endotelial del vaso sanguíneo. Alternativamente, la administración de agentes terapéuticos detrás de la BHE puede ser por administración local, por ejemplo por administración intratecal, por ejemplo a través de un reservorio de Ommaya (consultar, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 5.222.982 y 5385582); por inyección en bolo, por ejemplo mediante una jeringuilla, por ejemplo intravítrea o intracranealmente; por infusión continua, por ejemplo mediante canulación, por ejemplo con convección (consultar, por ejemplo la Solicitud de Estados Unidos N° 20070254842); o implantando un dispositivo en el que se ha fijado el agente de forma reversible (consultar, por ejemplo las Solicitudes de Estados Unidos N° 20080081064 y 20090196903).
Típicamente, se proporciona una cantidad eficaz de vector de direccionamiento. Como se ha analizado anteriormente con respecto a los métodos ex vivo, una cantidad o dosis eficaz de un vector de direccionamiento in vivo es la cantidad para inducir un aumento de 2 veces o más en el número de células en las que puede observarse recombinación entre el vector de direccionamiento y el locus diana con respecto a un control negativo, por ejemplo, una célula en contacto con un vector vacío o un polipéptido irrelevante. La cantidad de recombinación puede medirse por cualquier método conveniente, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente y se conoce en la técnica. El cálculo de la cantidad eficaz o de la dosis eficaz de un vector de direccionamiento que se va a administrar está dentro de los conocimientos de un experto en la técnica, y será rutinario para los expertos en la técnica. Huelga decir que la cantidad final a administrar dependerá de la vía de administración y de la naturaleza del trastorno o afección que se vaya a tratar.
La cantidad eficaz administrada a un paciente concreto dependerá de una variedad de factores, varios de los cuales diferirán de un paciente a otro. Un practicante clínico competente podrá determinar la cantidad eficaz de un vector de direccionamiento que se administrará a un paciente para detener o invertir la progresión de la enfermedad, según sea necesario. Utilizando los datos de LD<50>en animales y otra información disponible sobre el agente, un practicante clínico puede determinar la dosis máxima segura para un individuo, dependiendo de la vía de administración. Por ejemplo, una dosis administrada por vía intravenosa puede ser mayor que una dosis administrada por vía intratecal, dado el mayor volumen de líquido en el que se administra la composición terapéutica. De manera similar, las composiciones que se eliminan rápidamente del organismo pueden administrarse a dosis más altas, o en dosis repetidas, para mantener una concentración terapéutica. Utilizando los conocimientos habituales, el practicante clínico competente será capaz de optimizar la dosificación de un agente terapéutico particular en el curso de ensayos clínicos rutinarios.
Para su inclusión en un medicamento, el vector de direccionamiento puede obtenerse de una fuente comercial adecuada. Como proposición general, la cantidad total farmacéuticamente eficaz del vector de direccionamiento administrada parenteralmente por dosis estará en un intervalo que pueda medirse mediante una curva de respuesta a la dosis.
Las terapias basadas en vectores de direccionamiento deben ser estériles. La esterilidad se consigue fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles (por ejemplo, membranas de 0,2 pm). Las composiciones terapéuticas generalmente se colocan en un recipiente que tenga un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial que tenga un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica. Las terapias basadas en vectores de direccionamiento pueden almacenarse en recipientes unitarios o multidosis, por ejemplo, ampollas o viales sellados, como solución acuosa o como formulación liofilizada para reconstitución. Como ejemplo de una formulación liofilizada, se llenan viales de 10 ml con 5 ml de solución acuosa estéril al 1% (p/v) del compuesto, y la mezcla resultante se liofiliza. La solución para infusión se prepara reconstituyendo el compuesto liofilizado usando agua para inyección bacteriostática.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir, dependiendo de la formulación deseada, portadores de diluyentes farmacéuticamente aceptables y no tóxicos, que se definen como vehículos usados comúnmente para formular composiciones farmacéuticas para administración animal o humana. El diluyente se selecciona de manera que no afecte a la actividad biológica de la combinación. Ejemplos de tales diluyentes son agua destilada, agua tamponada, solución salina fisiológica, PBS, solución de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank. Además, la composición o formulación farmacéutica puede incluir otros portadores, adyuvantes o estabilizadores no tóxicos, no terapéuticos, no inmunogénicos, excipientes y similares. Las composiciones también pueden incluir sustancias adicionales para aproximarse a las condiciones fisiológicas, como agentes de ajuste y tamponamiento del pH, agentes de ajuste de la toxicidad, agentes humectantes y detergentes. La composición también puede incluir cualquiera de una variedad de agentes estabilizadores, como un antioxidante, por ejemplo. Cuando la composición farmacéutica incluye un polipéptido, el polipéptido puede formar complejos con varios compuestos bien conocidos que mejoran la estabilidad in vivo del polipéptido, o mejoran de otro modo sus propiedades farmacológicas (por ejemplo, aumentan la semivida del polipéptido, reducen su toxicidad, mejoran la solubilidad o la captación). Ejemplos de tales modificaciones o agentes complejantes incluyen sulfato, gluconato, citrato y fosfato. Los ácidos nucleicos o polipéptidos de una composición también pueden formar complejos con moléculas que mejoran sus atributos in vivo. Tales moléculas incluyen, por ejemplo, carbohidratos, poliaminas, aminoácidos, otros péptidos, iones (por ejemplo, sodio, potasio, calcio, magnesio, manganeso) y lípidos.
En Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Filadelfia, Pa., 17.a ed. (1985), se ofrece más información sobre las fórmulas adecuadas para los distintos tipos de administración. Para una breve revisión de los métodos de administración de fármacos, consultar, Langer, Science 249:1527-1533 (1990).
Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. La toxicidad y la eficacia terapéutica del principio activo pueden determinarse de acuerdo con procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares y/o animales de experimentación, incluyendo, por ejemplo, la determinación de la LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación LD50/ED50. Se prefieren las terapias que presentan grandes índices terapéuticos.
En algunas realizaciones, una composición farmacéutica administrada a un sujeto en una cantidad eficaz presenta poca o ninguna toxicidad hepática (por ejemplo, no presenta toxicidad hepática sustancial, no presenta toxicidad hepática sustancial, es sustancialmente no tóxica para el hígado, etc.). La toxicidad hepática puede medirse de varias maneras, por ejemplo, midiendo los niveles de una, ambas o una proporción de alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (ASP). En algunas realizaciones, la administración de una cantidad eficaz de la composición farmacéutica induce un aumento de la toxicidad hepática (por ejemplo, medida mediante un ensayo conveniente seleccionado) de menos del 50% (por ejemplo, menos del 40%, menos del 30%, menos del 20%, menos del 15%, menos del 10%, menos del 5%, menos del 4%, menos del 3%, menos del 2%, menos del 1%, menos del 0,5%, o el 0%) en comparación con dicha medida de toxicidad hepática antes de dicha administración (o en comparación con un control no tratado o en comparación con un intervalo normal aceptado de valores, es decir, valores de referencia, para la medida). En algunas realizaciones, la administración de una cantidad eficaz de la composición farmacéutica no induce un aumento estadísticamente significativo en la medida de toxicidad hepática (por ejemplo, con un valor p de menos de 0,1, 0,05, 0,01 o menor) en comparación con dicha medida antes de dicha administración (o en comparación con un control no tratado o en comparación con un intervalo normal aceptado de valores, es decir, valores de referencia, para la medida). En algunas realizaciones, la administración de una cantidad eficaz de la composición farmacéutica reduce una medida de toxicidad hepática (por ejemplo, como puede resultar cuando la afección tratada por la administración provocaba toxicidad hepática) en un 5% o más (por ejemplo, 10% o más, 15% o más, 20% o más, 30% o más, 40% o más, 50% o más, etc.) en comparación con dicha medida antes de dicha administración (o en comparación con un control no tratado o en comparación con un intervalo normal aceptado de valores, es decir, valores de referencia, para la medida).
Los datos obtenidos de los cultivos celulares y/o los estudios con animales pueden usarse en la formulación de un intervalo de dosificaciones para humanos. La dosificación del principio activo típicamente se sitúa dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con baja toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la vía de administración utilizada.
Los componentes usados para formular las composiciones farmacéuticas son preferiblemente de alta pureza y están sustancialmente libres de contaminantes potencialmente dañinos (por ejemplo, por lo menos de grado de Alimentación Nacional (NF), generalmente por lo menos de grado analítico, y más típicamente por lo menos de grado farmacéutico). Además, las composiciones destinadas a un uso in vivo habitualmente son estériles. En la medida en que un compuesto dado deba sintetizarse antes de su uso, el producto resultante está típicamente sustancialmente libre de cualquier agente potencialmente tóxico, en particular cualquier endotoxina, que pueda estar presente durante el proceso de síntesis o purificación. Las composiciones para la administración parental también son estériles, sustancialmente isotónicas y se fabrican en condiciones GMP. La cantidad eficaz de una composición terapéutica que debe administrarse a un paciente dado dependerá de una variedad de factores, varios de los cuales diferirán de un paciente a otro. Un practicante clínico competente podrá determinar la cantidad eficaz de un agente terapéutico que debe administrarse a un paciente para detener o invertir la progresión de la enfermedad según sea necesario. Utilizando los datos sobre la LD50 en animales y otra información disponible sobre el agente, el practicante clínico puede determinar la dosis máxima segura para un individuo, dependiendo de la vía de administración. Por ejemplo, una dosis administrada por vía intravenosa puede ser mayor que una dosis administrada por vía intratecal, dado el mayor volumen de líquido en el que se administra la composición terapéutica. De manera similar, las composiciones que se eliminan rápidamente del organismo pueden administrarse a dosis más altas, o en dosis repetidas, para mantener una concentración terapéutica. Utilizando los conocimientos habituales, el practicante clínico competente será capaz de optimizar la dosificación de un agente terapéutico particular en el curso de ensayos clínicos rutinarios.
UTILIDAD
Los métodos y composiciones divulgados en la presente se usan en cualquier aplicación in vitro o in vivo en la que se desee expresar un transgén de un locus particular en una célula, por ejemplo, cuando se desea expresar uno o más transgenes en una célula con el mismo patrón espacial y temporalmente restringido que el de un gen endógeno en un locus diana, manteniendo la expresión de ese gen endógeno en ese locus diana y evitando el riesgo de usar una nucleasa exógena. Usando los métodos y composiciones para editar el genoma de la célula, pueden lograrse una serie de beneficios sobre los métodos que requieren el uso de una nucleasa exógena. Por ejemplo, el uso de los métodos y composiciones evitará la inmunogenicidad y genotoxicidad potenciales asociadas al suministro de una nucleasa exógena a una célula, ya sea como polipéptido o como ácido nucleico codificante. También se evita el riesgo de una posible integración de la secuencia codificante de la nucleasa en el genoma y la posterior expresión estable de la nucleasa, que puede dar como resultado una mayor inmunogenicidad y genotoxicidad, así como a la activación de genes cercanos por el promotor que impulsa la expresión de la nucleasa.
Los métodos y composiciones para integrar uno o más transgenes en el ADN celular en un locus diana encuentran uso en muchos campos, incluyendo, por ejemplo, la terapia génica, la agricultura, la biotecnología y la investigación. Por ejemplo, tales modificaciones son terapéuticamente útiles, por ejemplo para tratar un trastorno genético complementando una mutación genética en un sujeto con una copia de tipo salvaje del gen; para promover procesos de origen natural, promoviendo/aumentando actividades celulares (por ejemplo promover la curación de heridas para el tratamiento de heridas crónicas o la prevención de heridas agudas o fallo de colgajo, aumentando las actividades celulares asociadas con la curación de heridas); modular la respuesta celular (por ejemplo, para tratar la diabetes mellitus, proporcionando insulina); expresarterapias antivirales, antipatógenas o anticancerígenas en sujetos, por ejemplo, en poblaciones celulares específicas o en condiciones específicas, etc. Otros usos de dichas modificaciones genéticas incluyen la inducción de células madre pluripotentes inducidas (iPSC), por ejemplo, para producir iPSC a partir de un individuo con propósitos de diagnóstico, terapéuticos o de investigación; en la producción de organismos modificados genéticamente, por ejemplo, en la fabricación para la producción a gran escala de proteínas por células con propósitos terapéuticos, de diagnóstico o de investigación; en la agricultura, por ejemplo, para la producción de cultivos mejorados; o en la investigación, por ejemplo, para el estudio de modelos animales de enfermedades.
Por ejemplo, los métodos y las composiciones pueden usarse para tratar un trastorno, una enfermedad o una afección médica en un sujeto. Los términos "tratamiento", "tratar" y similares se usan en la presente para referirse en general a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevención total o parcial de una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de curación parcial o completa de una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", como se usa en la presente, abarca cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, e incluye: (a) prevenir la aparición de la enfermedad en un sujeto que puede estar predispuesto a padecerla pero al que aún no se le ha diagnosticado; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; o (c) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad. El agente terapéutico puede administrarse antes, durante o después de la aparición de la enfermedad o lesión. El tratamiento de la enfermedad en curso, cuando el tratamiento estabiliza o reduce los síntomas clínicos indeseables del paciente, es de particular interés. Es deseable que dicho tratamiento se realice antes de la pérdida completa de la función de los tejidos afectados. Es deseable que la terapia se administre durante la fase sintomática de la enfermedad y, en algunos casos, después de la fase sintomática de la enfermedad. Los términos "individuo", "sujeto", "huésped" y "paciente" se usan indistintamente en la presente y se refieren a cualquier sujeto mamífero para el que se desee un diagnóstico, tratamiento o terapia, en particular los seres humanos.
Con este fin, el uno o más transgenes de las composiciones pueden incluir un gen que codifique un agente terapéutico. Por "agente terapéutico" se entiende un agente, por ejemplo, ribozima, ARNip, ARNhc, miARN, péptido, polipéptido, etc. que tiene un efecto terapéutico sobre una célula o un individuo, por ejemplo, que promueve un proceso biológico para tratar una afección médica, por ejemplo, una enfermedad o trastorno.
Los ejemplos de agentes terapéuticos que pueden integrarse en un genoma celular mediante los métodos y composiciones incluyen (es decir, el transgén integrado codifica) agentes como ribozimas, ARNip, ARNhc, miARN, péptidos (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un péptido) o polipéptidos (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un polipéptido) que alteran la actividad celular. En algunos casos, el transgén codifica un péptido o polipéptido. Ejemplos de péptidos o polipéptidos que pueden tener una actividad terapéutica para el organismo multicelular en el que se expresan (por ejemplo, mediante un ácido nucleico que codifica el péptido o polipéptido) incluyen, pero no se limitan a: factor VIII, factor IX, p-globina, receptor de lipoproteínas de baja densidad, adenosina deaminasa, purina nucleósido fosforilasa, esfingomielinasa, glucocerebrosidasa, regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística, a1-antitripsina, CD-18, ornitinatranscarbamilasa, argininosuccinato sintetasa, fenilalanina hidroxilasa, a-cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada, fumarilacetoacetato hidrolasa, glucosa 6-fosfatasa, a-L-fucosidasa, p-glucuronidasa, a-L-iduronidasa, galactosa 1-fosfato uridiltransferasa; un factor neuroprotector, por ejemplo, una neurotrofina (por ejemplo NGF, BDNF, NT-3, NT-4, CNTF), Kifap3, Bcl-xl, proteína mediadora de la respuesta a la colapsina 1, Chkp, calmodulina 2, calcyon, NPT1, E e fla l, Dhps, Cd151, Morf412, CTGF, LDH-A, Atl1, NPT2, Ehd3, Cox5b, Tubala, Y-actina, Rpsa, NPG3, NPG4, NPG5, NPG6, NPG7, NPG8, NPG9, NPG10, dopamina, interleucinas, citoquinas, péptidos pequeños, los genes/proteínas enumerados enla Tabla 1(ver a continuación: Complejo BCKDH (subunidades E1a, E1b y E2); Metilmalonil-CoA Mutasa; Propionil-CoA Carboxilasa (subunidades Alfa y Beta); Isovaleril CoA deshidrogenasa; HADHA; HADHB; LCHAD; ACADM; ACADVL; G6PC (GSD1a); G6PT1(GSD1b); SLC17A3; SLC37A4 (GSD1c); alfa-glucosidasa ácida; OCTN2; CPT1; CACT; CPT2; CPS1; ARG1; ASL; OTC; UGT1A1; FAH; COL7A1; COL17A1; MMP1; KRT5; LAMA3; LAMB3; LAMC2; ITGB4; y/o ATP7B), y similares. La lista anterior de proteínas se refiere a proteínas de mamíferos, y en muchos casos a proteínas humanas, donde las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de las proteínas anteriores son generalmente conocidas por los expertos en la técnica.
Tabla 1. Lista de enes/ roteínas ue son defectuosos en varias enfermedades
En otros casos, el transgén codifica para un ARN que no codifica una proteína, por ejemplo, el ácido nucleico codifica para una ribozima, un ARN de horquilla pequeña (ARNhc), un microARN (miARN) o un precursor del mismo. Como se usa en la presente, el término "microARN" se refiere a cualquier tipo de ARN de interferencia, incluyendo, entre otros, los microARN endógenos y los microARN artificiales (por ejemplo, miARN sintéticos). Los microARN endógenos son ARN pequeños codificados de manera natural en el genoma que son capaces de modular la utilización productiva del ARNm. Un microARN artificial puede ser cualquier tipo de secuencia de ARN, distinta del microARN endógeno, capaz de modular la actividad de un ARNm. Una secuencia de microARN puede ser una molécula de ARN compuesta por una cualquiera o más de estas secuencias. Las secuencias de microARN (o "miARN") se han descrito en publicaciones como Lim, y otros, 2003, Genes & Development, 17, 991-1008, Lim y otros, 2003, Science, 299, 1540, LeeyAmbrose, 2001, Science, 294, 862, Lauyotros, 2001, Science 294, 858-861, Lagos-Quintana et al., 2002, Current Biology, 12, 735-739, Lagos-Quintana et al., 2001, Science, 294, 853-857, y Lagos-Quintana et al., 2003, RNA, 9, 175-179. Los ejemplos de microARN incluyen cualquier ARN que sea un fragmento de un ARN más grande o sea un miARN, ARNsi, ARNst, ARNnc, ARNt, ARNtn, ARNsn, ARNm, ARNsh, ARNsn u otro ARN no codificante pequeño. Consultar, por ejemplo, las Solicitudes de Patente de Estados Unidos 20050272923, 20050266552, 20050142581, y 20050075492. Un "precursor de microARN" (o "pre-miARN") es un ácido nucleico que tiene una estructura de tallogiro con una secuencia de microARN incorporada en el mismo. Un "microARN maduro" (o "miARN maduro") incluye un microARN que se ha escindido de un precursor de microARN (un "pre-miARN"), o que se ha sintetizado (por ejemplo, sintetizado en un laboratorio mediante síntesis libre de células) y tiene una longitud de aproximadamente 19 nucleótidos a aproximadamente 27 nucleótidos, por ejemplo, un microARN maduro puede tener una longitud de 19 nt, 20 nt, 21 nt, 22 nt, 23 nt, 24 nt, 25 nt, 26 nt o 27 nt. Un microARN maduro puede unirse a un ARNm diana e inhibir la traducción del ARNm diana.
Otros ejemplos de agentes terapéuticos que pueden integrarse en un locus diana incluyen (es decir, el transgén integrado codifica) agentes que promueven la inmunoprofilaxis (también denominada inmunoprofilaxis vectorizada, o VIP). Ejemplos de agentes que promueven la inmunoprofilaxis incluyen, pero no se limitan a: anticuerpos o polipéptidos quiméricos que comprenden un dominio de inmunoglobulina y un dominio efector inmunitario. Como ejemplos no limitativos, los agentes que promueven la inmunoprofilaxis pueden incluir anticuerpos neutralizantes, o polipéptidos quiméricos, específicos para un patógeno seleccionado de entre: virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la gripe, virus sincitial respiratorio (VSR), virus de la hepatitis C (VHC), un plasmodio (por ejemplo, Plasmodium falciparum, plasmodium malariae, y similares), patógenos fúngicos o bacterianos, y similares. Por ejemplo, los agentes que promueven la inmunoprofilaxis pueden incluir anticuerpos neutralizantes, o polipéptidos quiméricos, dirigidos a epítopos conservados entre cepas de: virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la gripe, virus sincitial respiratorio (VSR), virus de la hepatitis C (VHC), un plasmodio (por ejemplo, Plasmodium falciparum, plasmodium malariae, y similares), patógenos fúngicos o bacterianos, y similares.
En la invención reivindicada, el transgén codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en receptor de lipoproteína de baja densidad, purina nucleósido fosforilasa, esfingomielinasa, glucocerebrosidasa, CD-18, ornitina transcarbamilasa, argininosuccinato sintetasa, fenilalanina hidroxilasa, a-cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada, fumarilacetoacetato hidrolasa, glucosa 6-fosfatasa, a-L-fucosidasa, p-glucuronidasa, a-L-iduronidasa, galactosa 1-fosfato uridiltransferasa; una proteína del complejo BCKDH (subunidades E1a, E1b y E2); metilmalonil-CoA mutasa; propionil-CoA carboxilasa (subunidades alfa y beta); isovaleril CoA deshidrogenasa; HADHA; HADHB; LCHAD; ACADM; ACADVL; G6PC (GSD1a); G6PT1(GSD1b); y SLC17A3; o el transgén codifica un polipéptido quimérico, que comprende un dominio de inmunoglobulina y un dominio efector inmunitario, específico para un patógeno seleccionado entre: virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de la gripe, virus sincitial respiratorio (VSR), virus de la hepatitis C (VHC), un plasmodio, plasmodium falciparum, plasmodium malariae, un hongo y una bacteria.
En algunos casos, el agente terapéutico altera la actividad de la célula en la que se expresa el agente. En otras palabras, el agente tiene un efecto intrínseco en la célula. Por ejemplo, el agente puede ser una proteína intracelular, una proteína transmembrana o una proteína secretada que, cuando se expresa en una célula, sustituye o "complementa" a una proteína mutante en la célula. En otros casos, el agente terapéutico altera la actividad de células distintas de las células en las que se expresa el agente. En otras palabras, el agente tiene un efecto extrínseco a la célula. Por ejemplo, el gen integrado de interés puede codificar una citoquina, una quimiocina, un factor de crecimiento, una hormona, un anticuerpo o un receptor de superficie celular que modula la actividad de otras células.
Los métodos y composiciones pueden aplicarse a cualquier enfermedad, trastorno o proceso celular natural que se beneficiaría de la modulación de la actividad celular mediante la integración de un transgén de interés. Por ejemplo, los métodos y composiciones pueden encontrar uso en el tratamiento de trastornos genéticos. Cualquier trastorno genético que resulte de un defecto genético definido (por ejemplo, un trastorno con un defecto de un solo gen, un trastorno con 2 genes defectuosos, 3 genes defectuosos, 4 genes defectuosos, 5 genes defectuosos, 2 o más genes defectuosos, 3 o más genes defectuosos, 4 o más genes defectuosos, 5 o más genes defectuosos, etc.) puede tratarse mediante las composiciones y métodos. El defecto puede ser el resultado de una o más mutaciones en un único gen (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o más mutaciones), o puede ser el resultado de una o más mutaciones en 2 o más genes (por ejemplo, 3 o más genes, 4 o más genes, 5 o más genes, 2 genes, 3 genes, 4 genes, 5 genes, etc.). Ejemplos no limitativos de enfermedades resultantes de defectos genéticos incluyen: hemofilia (por ejemplo, hemofilia A, hemofilia B), acidurias orgánicas de cadena ramificada (por ejemplo, enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce (MSUD), acidemia isovalérica (IVA), aciduria propiónica (PA) y aciduria metilmalónica (M<m>A), 3-metilcrotonilglicinuria, aciduria 3-metilglutacónica tipo I, Deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena corta/ramificada, deficiencia de 2-metil-3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa, deficiencia de isobutiril-CoA deshidrogenasa, aciduria 3-hidroxiisobutírica, aciduria malónica, etc.), trastornos de la oxidación de ácidos grasos de cadena larga, enfermedades por almacenamiento de glucógeno (por ejemplo, enfermedad por almacenamiento de glucógeno tipo I (GSD1), enfermedad por almacenamiento de glucógeno tipo II, enfermedad por almacenamiento de glucógeno tipo III, enfermedad por almacenamiento de glucógeno tipo IV, enfermedad por almacenamiento de glucógeno tipo V, enfermedad por almacenamiento de glucógeno tipo VI, enfermedad por almacenamiento de glucógeno tipo VII, enfermedad por almacenamiento de glucógeno tipo VIII, enfermedad por almacenamiento de glucógeno tipo IX, enfermedad por almacenamiento de glucógeno tipo X, enfermedad por almacenamiento de glucógeno tipo XI, enfermedad por almacenamiento de glucógeno tipo XII, enfermedad por almacenamiento de glucógeno tipo 0, etc.), trastornos del ciclo de la carnitina, trastornos del ciclo de la urea, síndrome de Crigler-Najjar, tirosinemia hereditaria, epidermólisis bullosa, enfermedad de Wilson, deficiencia de adenosina deaminasa, enfermedad de células falciformes, inmunodeficiencia combinada grave ligada al cromosoma X (SCID-X1), talasemia, fibrosis quística, deficiencia de alfa-1 antitripsina, anemia de Diamond-Blackfan, enfermedad de Gaucher, deficiencia de la hormona del crecimiento, etc.
Como otro ejemplo, los métodos y composiciones encuentran uso en el tratamiento de afecciones del sistema nervioso y para proteger el SNC contra afecciones del sistema nervioso, por ejemplo enfermedades neurodegenerativas, incluyendo, por ejemplo Enfermedad de Parkinson, Enfermedad de Alzheimer, Enfermedad de Huntington, Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA), enfermedad de Spielmeyer-Vogt-Sjogren-Batten (Enfermedad de Batten), Demencia Frontotemporal con Parkinsonismo, Parálisis Supranuclear Progresiva, Enfermedad de Pick, enfermedades priónicas (por ejemplo, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob), la amiloidosis, el glaucoma, la retinopatía diabética, la degeneración macular asociada a la edad (DMAE) y similares); trastornos neuropsiquiátricos (por ejemplo, trastornos de ansiedad (por ejemplo, trastorno obsesivo compulsivo), trastornos del estado de ánimo (por ejemplo, depresión), trastornos infantiles (por ejemplo, trastorno por déficit de atención, trastornos autistas), trastornos cognitivos (por ejemplo, delirio, demencia), esquizofrenia, trastornos relacionados con sustancias (por ejemplo, adicción), trastornos alimentarios y similares); canalopatías (por ejemplo, epilepsia, migraña y similares); trastornos por almacenamiento lisosómico (por ejemplo, enfermedad de Tay-Sachs, enfermedad de Gaucher, enfermedad de Fabry, enfermedad de Pompe, enfermedad de Niemann-Pick, mucopolisacaridosis (MPS) y enfermedades afines, y similares); enfermedades autoinmunes del SNC (por ejemplo, esclerosis múltiple, encefalomielitis, síndromes paraneoplásicos (por ejemplo, degeneración cerebelosa), enfermedad autoinmune del oído interno, síndrome opsoclono-mioclono y similares); infarto cerebral, ataque cerebral, lesión cerebral traumática y lesión medular.
Como otro ejemplo, los métodos y composiciones pueden usarse en el tratamiento de afecciones médicas y enfermedades en las que es deseable expresar ectópicamente un agente terapéutico para promover la reparación tisular, la regeneración tisular, o proteger contra más lesiones tisulares, por ejemplo, para promover la curación de heridas; promover la supervivencia de la célula y/o células colindantes, por ejemplo, en enfermedades degenerativas, por ejemplo, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades renales, enfermedades hepáticas, etc.; prevenir o tratar infecciones, etc.
Otros ejemplos de cómo pueden usarse los métodos para tratar afecciones médicas se divulgan en otra parte de la presente, o serían fácilmente evidentes para el experto en la técnica.
Los métodos y composiciones también encuentran uso en la imagenología de células de interés, por ejemplo, células que comprenden un gen de interés integrado. Como tal, el transgén (o uno de los transgenes) a integrar puede codificar para un marcador de imagenología. Por "marcador de imagenología" se entiende un agente no citotóxico que puede usarse para localizar y, opcionalmente, visualizar células, por ejemplo, células que han sido objeto de composiciones de la solicitud en cuestión. Una fracción de imagenología puede requerir la adición de un sustrato para la detección, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante (HRP), p-galactosidasa, luciferasa y similares. Alternativamente, una fracción de imagenología puede proporcionar una señal detectable que no requiere la adición de un sustrato para la detección, por ejemplo, un colorante fluoróforo o cromóforo, por ejemplo, Alexa Fluor 488® o Alexa Fluor 647®, o una proteína que comprende un fluoróforo o cromóforo, por ejemplo, una proteína fluorescente. Como se usa en la presente, una proteína fluorescente (PF) se refiere a una proteína que posee la capacidad de fluorescencia (es decir, de absorber energía a una longitud de onda y emitirla a otra longitud de onda). Por ejemplo, una proteína verde fluorescente (GFP) se refiere a un polipéptido que tiene un pico en el espectro de emisión a 510 nm o alrededor de 510 nm. En la técnica se conoce una variedad de FP que emiten a varias longitudes de onda. Las FP de interés incluyen, entre otras, la proteína verde fluorescente (GFP), la proteína amarilla fluorescente (YFP), la proteína naranja fluorescente (OFP), la proteína cian fluorescente (CFP), la proteína azul fluorescente (BFP), la proteína roja fluorescente (RFP), la proteína fluorescente roja lejana o la proteína fluorescente infrarroja cercana y variantes de las mismas.
Como otro ejemplo, los métodos y composiciones encuentran uso en el aislamiento de células de interés, por ejemplo, células que comprenden un transgén integrado. Con este fin, el transgén (o uno de los transgenes) a integrar puede codificar para un marcador seleccionable. Por "marcador seleccionable" se entiende un agente que puede usarse para seleccionar células, por ejemplo, células a las que se han dirigido las composiciones de la solicitud en cuestión. En algunos casos, la selección puede ser selección positiva; es decir, las células se aíslan de una población, por ejemplo, para crear una población enriquecida de células que comprenden la modificación genética. En otros casos, la selección puede ser negativa, es decir, la población se aísla de las células, por ejemplo, para crear una población enriquecida de células que no contienen la modificación genética. Puede emplearse cualquier marcador seleccionable conveniente, por ejemplo, un marcador seleccionable por fármacos, por ejemplo, un marcador que evite la muerte celular en presencia de fármacos, un marcador que promueva la muerte celular en presencia de fármacos, un marcador de imagenología, etc.; un marcador de imagenología que pueda seleccionarse usando tecnología de imagenología, por ejemplo, clasificación celular activada por fluorescencia; un polipéptido o péptido que puede seleccionarse para usar técnicas de separación por afinidad, por ejemplo, clasificación celular activada por fluorescencia, separación magnética, cromatografía de afinidad, "adsorción" con un reactivo de afinidad unido a una matriz sólida, etc.; y similares.
En algunos casos, el transgén puede conjugarse con un dominio codificante que modula la estabilidad de la proteína codificada, por ejemplo, en ausencia/presencia de un agente, por ejemplo, un cofactor o fármaco. Ejemplos no limitativos de dominios desestabilizadores que pueden usarse incluyen un dominio FRB mutante que es inestable en ausencia del derivado de rapamicina C20-MaRap (Stankunas K, et al. (2003) Conditional protein alleles using knockin mice and a chemical inducer of dimerization. Mol Cell. 12(6):1615-24); un polipéptido mutante FKBP12 que es metabólicamente inestable en ausencia de su ligando Shield-1 (Banaszynski LA, et al. (2006) A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules. Cell.126(5):995-1004); un polipéptido mutante de la dihidrofolato reductasa (DHFR) de E. coli que es metabólicamente inestable en ausencia de trimetoprima (TMP) (Mari Iwamoto, et al. (2010) A general chemical method to regulate protein stability in the mammalian central nervous system. Chem Biol. 24 de septiembre de 2010; 17(9): 981-988); y similares.
Como se ha analizado anteriormente, puede integrarse en un locus diana cualquier secuencia de ácido nucleico que desee expresar en una célula el experto en la técnica; por ejemplo, puede integrarse cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique un ARN no codificante como, por ejemplo, una ribozima, un ARNip, un ARNhc, un miARN o un ARN no codificante largo; o cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique un<a>R<n>que codifique un péptido o polipéptido. En algunos casos, puede integrarse más de una secuencia a expresar, por ejemplo, pueden integrarse dos o más polinucleótidos de interés, pueden integrarse tres o más polinucleótidos, pueden integrarse cuatro o más polinucleótidos, por ejemplo, pueden integrarse cinco o más polinucleótidos. Por tanto, por ejemplo, pueden integrarse un gen terapéutico y un marcador de imagenología; un gen terapéutico y un ARN no codificante; un gen terapéutico y un marcador seleccionable; un marcador de imagenología y un marcador seleccionable; un gen terapéutico, un marcador de imagenología y un marcador seleccionable, y demás.
REACTIVOS, DISPOSITIVOS Y KITS
También se divulgan reactivos, dispositivos y kits de los mismos para poner en práctica uno o más de los métodos descritos anteriormente. Los reactivos, dispositivos y kits de los mismos pueden variar enormemente.
Además de los componentes anteriores, los kits incluirán instrucciones para poner en práctica los métodos. Estas instrucciones pueden estar presentes en los kits en una variedad de formas, una o más de las cuales pueden estar presentes en el kit. Una forma en la que pueden estar presentes estas instrucciones es como información impresa en un medio o sustrato adecuado, por ejemplo, una o varias hojas de papel en las que esté impresa la información, en el envase del kit, en un prospecto, etc. Otro medio más sería un soporte legible por ordenador, por ejemplo, un disquete, un CD, etc., en el que se haya grabado la información. Otro medio más que puede estar presente es una dirección de página web que puede usarse a través de Internet para acceder a la información en un sitio retirado. En los kits puede estar presente cualquier medio conveniente.
EJEMPLOS
Se ha hecho esfuerzos para garantizar la precisión de las cifras usadas (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular medio en peso, la temperatura es en grados centígrados y la presión es atmosférica o cercana a la atmosférica.
Pueden encontrarse métodos generales de bioquímica molecular y celular en libros de texto estándar como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a Ed. (Sambrook et al., HaRBor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4a Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); y Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998). Los reactivos, vectores de clonación y kits para la manipulación genética a los que se hace referencia en esta divulgación están disponibles de proveedores comerciales como BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich y ClonTech.
Ejemplo 1
El direccionamiento de genes in vivo sin nucleasas facilita niveles terapéuticos de hF-IXtras inyecciones del vector AAV8 en ratones neonatos o adultos.
A menudo se supone que para alcanzar niveles terapéuticos de selección de genes en sitios específicos se requiere el uso de endonucleasas (por ejemplo, CRISPR, TALEN, ZFN), que se asocian con efectos fuera del objetivo. En particular, la administración de vectores codificados por endonucleasas para aplicacionesin vivopuede tener consecuencias inmunitarias adversas, así como genotoxicidad derivada de la expresión sostenida. Evitando el uso de nucleasas, hemos llevado a cabo la orientaciónin vivo,mediada por vectores<a>AV8, de un gen hF-IX sin promotor al locus de la albúmina para el tratamiento de la hemofilia B. El gen hF-IX sin promotor, precedido por una secuencia que codifica un péptido 2A, está flanqueado por brazos de homología que dirigen su integración como una fusión de ADN al ORF de la albúmina. La expresión de hF-IX está, por tanto, ligada a la expresión robusta de la Albúmina en los niveles de transcripción, procesamiento del ARN, localización y estabilidad, inicio de la traducción y localización en el ER. El péptido 2A induce la omisión ribosomal, por lo que la albúmina se marca pero no se altera. La integración fuera del objetivo se reduce al mínimo al no usar nucleasas, y la ausencia de un promotor vectorial disminuye el riesgo de activación de oncogenes vecinos por una rara integración fuera del objetivo.
En primer lugar, realizamos inyecciones IP de ratones B6 de 2 días de edad con 2,5e11 Vg por ratón de un vector AAV8 que codifica el casete de direccionamiento hF-IX. A continuación, se realizó un seguimiento semanal de los niveles plasmáticos de hF-IX, a partir de la semana 4 de vida. Los niveles de hF-IX en plasma se estabilizaron en -10% de lo normal, lo que corresponde a una mejora significativa de la enfermedad si se traslada a la clínica. Es importante destacar que los niveles plasmáticos de hF-IX recuperaron su nivel original poco después de una hepatectomía parcial 2/3, estableciendo por tanto una integración transgénica estable. Validamos que la expresión de hF-IX se origina esencialmente de la integración en la diana mediante RT seguida de ligación del conector, PCR no sesgada y secuenciación. En panticular, este método no detectó ninguna expresión de hF-IX procedente del episoma ni de ninguna integración fuera del objetivo. Otra corroboración proviene de la superposición de las señales de transferencia Western cuando se usa un anticuerpo anti-péptido-2A o un anticuerpo anti-albúmina. La transferencia Northern usando una sonda anti-hF-IX revela una única banda del tamaño esperado de un ARNm fusionado con albúmina-hF-IX. A continuación, comprobamos si la división de las células hepáticas, asociada a los neonatos, es esencial para los niveles terapéuticos de direccionamiento génico. Para ello, inyectamos en la vena de la cola de ratones adultos 1e12 Vg por ratón de nuestro vector AAV8. La monitorización semanal de los niveles de hF-IX reveló una expresión estable al 15% de lo normal. Actualmente estamos repitiendo estos estudios en ratones con hemofilia B y estamos usando qPCR, IHC y NGS para cuantificar la tasa de integración en el objetivo y la distribución de la integración fuera del objetivo.
En conclusión, el método de orientación génicain vivono disruptivo y sin promotor mediado por AAV es aplicable tanto a neonatos como a adultos. La integración del transgén de direccionamiento como una fusión 2A a un gen endógeno altamente expresado puede obviar el requisito de nucleasas, disminuyendo así el efecto fuera del objetivo, a la vez que permite niveles terapéuticos de expresión del transgén.
Ejemplo 2
Métodos
Para la construcción del vector, se insertó primero un fragmento de ADN genómicode Albque abarcaba el codón de parada entre los ITR de AAV2 en una estructura principal de plásmido pTRUF (Lisowski et al. Molecular therapy: thejournal ofthe American Society of Gene Therapy 20, 1912-1923, 2012). A continuación, se insertaron de forma anidada la secuencia codificante P2A y el ADNc de hF9. Para el control inverso, se escindió un segmento central y se volvió a integrar en la orientación opuesta. El rAAV8 se produjo en células HEK293 y se tituló mediante transferencia de puntos. Se inyecto intraperitonealmente a ratones B6 de 2 días de edad con 2,5e11 vg de rAAV8(hF9o inverso) y se sangro semanalmente a partir de la semana 4 de vida mediante sangrado retroorbital para ELISA. Los ratones B6 adultos recibieron inyecciones en la vena de la cola de 1e12 vg de rAAV8(hF9o inverso) o inyecciones hidrodinámicas de 3,5e12 vg de plásmido, y se sangraron igualmente semanalmente para ELISA. Se realizaron 2/3 hepatectomías parciales (PH) de acuerdo con los protocolos establecidos. Se recogieron tejidos hepáticos para análisis de ADN, ARN y proteínas, así como para IHC, en el momento de la PH y tras sacrificar a los ratones. Los tejidos hepáticos congelados para la IHC de hF9 se seccionaron y tiñeron de acuerdo con los protocolos establecidos. Los ensayos TaqMan qPCR, transferencia Northern y Western usaron los protocolos establecidos. Los ensayos aPTT se realizaron en ratones desactivados para hemofilia B como se ha descrito anteriormente (Shi et al.,).
Resultados
Se realizó direccionamiento génico sin promotor mediada por virus adenoasociado recombinante (rAAV) sin nucleasas para mejorar la diátesis hemorrágica en ratones con hemofilia B. En particular, se dirigió un gen del factor IX de coagulación humano (hF9) sin promotor al locus de la albúmina (Alb) expresada en el hígado. El hF9 se dirigió, junto con una secuencia codificante de péptido 2A precedente, para integrarse justo en sentido ascendente del codón de parada de Alb. Aunque la hF9 se fusionó con la Alb a nivel de ADN y ARN, se sintetizaron dos proteínas separadas mediante omisión ribosomal. Por tanto, la expresión de hF9 se vinculó a una expresión robusta de albúmina hepática sin alterarla. Se inyectó un vector AAV8-hF9 en ratones neonatos y adultos para lograr la integración en el -0,5% de los alelos de albúmina en los hepatocitos. Se comprobó que la hF9 se producía únicamente a partir de la integración en la diana y que la omisión ribosomal era muy eficaz. Se obtuvieron niveles plasmáticos estables de hF9 del 7-20% de lo normal, y los ratones deficientes en factor IX tratados presentaron tiempos de coagulación normales. La integración del transgén como una fusión 2A a un gen endógeno altamente expresado obvió el requisito de nucleasas y/o promotores vectoriales. Este método de ejemplo permite un direccionamiento génico seguro y eficaz tanto en lactantes como en adultos, ya que disminuye en gran medida los efectos fuera de diana, a la vez que proporciona niveles terapéuticos de expresión a partir de la integración.
Se apunto al gen hF9, que es deficiente en la hemofilia B, enfermedad recesiva ligada al cromosoma X que afecta a 1/30.000 varones. Los individuos afectados padecen hemorragias espontáneas graves debido a una deficiencia del factor IX de coagulación plasmático producido en el hígado. La reconstitución con tan sólo un 1-2% de factor de coagulación puede mejorar significativamente la calidad de vida, mientras que un 5-20% mejorará notablemente la diátesis hemorrágica. Se usó el serotipo rAAV8 con tropismo hepático para dirigir la expresión del hF9 tras la integración del promotorAlbespecífico del hígado. Postulamos que (1) el promotorAlbdebería permitir altos niveles de producción de factor de coagulación incluso si la integración tiene lugar sólo en una pequeña fracción de hepatocitos; y (2) la alta actividad transcripcional en el locus Alb podría hacerlo más susceptible a la integración de transgenes por recombinación homóloga.
El direccionamiento génico sin nucleasas debería afectar sólo a una pequeña fracción de alelosAlben el hígado. No obstante, optamos por minimizar la alteración y la desregulación del gen Alb dirigiendo hF9 como una fusión 2A al final del marco de lectura deAlb(Figura 8A). Los péptidos 2A, derivados de virus ARN de cadena positiva, permiten la producción de múltiples proteínas a partir de un único marco de lectura mediante la omisión ribosomal (Kim, J. H. et al. High cleavage efficiency of a 2<a>peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.). Este proceso deja la primera proteína traducida marcada con ~20 aminoácidos C-terminales, y la segunda proteína con sólo una prolina N-terminal adicional. Típicamente se conserva la funcionalidad de ambas proteínas, y los ensayos clínicos con péptidos 2A no informaron de inmunogenicidad. Se usaron AAV de cadena sencilla para dirigir un ADNc de hF9 con codón optimizado, precedido por una secuencia que codifica un péptido 2A de teschovirus-1 porcino (P2A), que se integró justo 5' del codón de parada deAlb.Después de la integración,Alby hF9 se transcriben conjuntamente a partir del potente promotor deAlby, por tanto, deberían estar coregulados a nivel de corte y empalme, salida nuclear, estabilidad del ARNm, inicio de la traducción y localización en el ER. Se tradujeron dos proteínas separadas, ambas conteniendo un péptido señal, de tal manera que la traducción deAlbasociada a ER fuera seguida inmediatamente por la traducción y el procesamiento del factor de coagulación para su secreción. Por último, para reducir aún más la posibilidad de expresión de hF9 fuera del objetivo, el vector no tiene un codón de inicio ATG antes del péptido señal de hF9, ni un codón de inicio en la secuencia codificante del péptido 2A o en el exónAlbanterior.
En primer lugar, se realizaron inyecciones intraperitoneales (IP) de ratones C57BU6 (B6) de 2 días de edad con 2,5e11 vectores genómicos (vg) por ratón de un rAAV8 que codificaba el casete de direccionamiento de hF9 o un control invertido (Figura 8B). El fragmento invertido en el control con respecto a los brazos de homologíaAlbincluía no sólo el gen hF9, sino también la secuencia codificante P2A, el exónAlbadyacente y la unión de corte y empalme precedente. El control inverso no debería permitir una expresión significativa de hF9 tras la integración en la diana, pero permitiría niveles de expresión fuera de la diana similares a los de la construcción experimental (la expresión episomal se controla por otros medios, más adelante). Los niveles plasmáticos de proteínahF9se midieron semanalmente mediante ensayo inmunoenzimático (ELISA), a partir de la semana 4 de vida (Figura 9A). Para el grupo experimental, los niveles dehF9plasmática se estabilizaron en 350-1000 ng/ml, lo que corresponde al 7-20% de lo normal. En el grupo de control inverso, los niveles plasmáticos de hF9 estaban en o por debajo del nivel de detección (20 ng/ml), lo que implica que en el grupo experimental, la expresión dehF9se originó realmente a partir de la integración en el objetivo.hF9mantuvo los niveles originales de proteína en plasma después de una hepatectomía parcial 2/3, un procedimiento quirúrgico conocido por reducir la expresión episomal del transgén AAV en >90%, estableciendo adicionalmente la integración estable del transgén.
Para determinar si el crecimiento del hígado, como se observa con los neonatos, es esencial para los niveles terapéuticos del direccionamiento génico,hF9se dirigió al locusAlbusando el mismo vector en ratones adultos. Se inyectaron ratones B6 adultos con 1 x1012 vg por ratón (aproximadamente 5e13 por Kg) por la vena de la cola con el vector rAAV8, o el control inverso. Un tercer grupo de ratones recibió inyecciones hidrodinámicas por la vena de la cola de un plásmido que codificaba el constructohF9sin promotor en la orientación "correcta". Para el grupo de ratones rAAVhF9,los niveles plasmáticos de hF9 se mantuvieron estables en un 7-20% de lo normal (Figura 9B). Las inyecciones de vectores en MOI más bajos llevaron a niveles más bajos de plasmahF9sin meseta para implicar un efecto de umbral superior (Figura 9C). Tanto en adultos como en neonatos, los niveles plasmáticos dehF9del grupo de control inverso estaban en el límite de detección o por debajo del mismo. Los niveles plasmáticos dehF9disminuidos también se asociaron a los ratones inyectados hidrodinámicamente con plásmido. Por tanto, el direccionamiento significativo depende de la vectorización con rAAV. Por último, se realizaron inyecciones de rAAV en ratones adultos con hemofilia B con desactivación (KO) deF9.La coagulación funcional, determinada por el tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) en los ratones KO tratados, se restableció a niveles similares a los de los ratones de tipo salvaje (Figura 9D). La actividad biológica de lahF9secorrelacionó con niveles de proteína plasmática de 709±91 ng/ml, similares a los niveles de los ratones de tipo salvaje (Figura 9B-D).
La expresión de hF9 en el hígado se confirmó mediante inmunohistoquímica (IHC) (Figura 12). El análisis de transferencia Western de las muestras de hígado detectóhF9con el peso molecular esperado, lo que demuestra que la omisión ribosomal fue eficiente e implica que tanto las señales ELISA como IHC corresponden a unahF9procesada con precisión (Figura 9E).
hF9es una proteína secretada. Por lo tanto, la señal IHC era escasa y no podía usarse para cuantificar las tasas de direccionamiento. En su lugar, se usó la qPCR para evaluar cuantitativamente la tasa de direccionamiento deAlbporhF9.Para evitar falsas señales del rAAV episomal, se amplificó primero un segmento 3' del locus genómicoAlbde forma que no se viera afectado por la presencia o ausencia de una secuenciahF9integrada (Figura 10a, Figura 13). La amplificación no sesgada fue posible gracias a la presencia de un sitio de restricción común a una distancia aproximadamente igual a 3' del codón de parada en los alelos objetivo y de tipo salvaje. El amplicón PCR se usó entonces como plantilla para dos ensayos qPCR diferentes: uno para cuantificar la abundancia de alelosAlbdirigidos, y el otro para cuantificar la abundancia de alelos de tipo salvaje no dirigidos. En el hígado, sólo los hepatocitos son diana de rAAV8 (Nakai, H. et al. Unrestricted hepatocyte transduction with adeno-associated virus serotype 8 vectors in mice. J Virol 79, 214-224, doi:10.1128/JVI.79.1.214-224.2005 (2005). Por lo tanto, corregimos de manera conservadora para una frecuencia de hepatocitos del 70% y encontramos que la tasa de alelosAlbdirigidos porhF9era del 0,5% de media para ratones inyectados como neonatos o adultos (Figura 10c y curvas estándar asociadas en la Figura 14). A continuación, se examinó la proporción de ARNm deAlb_hF9fusionados con respecto a los ARNm deAlbde tipo salvaje comparando dos ensayos qPCR respectivos realizados con una plantilla de ADNc no sesgada (Figura 10B). Se descubrió que la proporción era del 0,1% de media para los ratones inyectados como neonatos o adultos (Figura 10C). Este valor tendía a ser inferior a la tasa de integración a nivel del<a>D<n>, aunque la diferencia no era estadísticamente significativa. Es posible que la producción, el procesamiento y/o la estabilidad de los transcritos de ARNm quiméricohF9-Albse vieran reducidos en comparación con el ARNm deAlbde tipo salvaje. También es posible que se produjera cierta integración en células no parenquimáticas que no expresan Albúmina. La tasa de direccionamiento observada es superior a la comunicada anteriormente (Miller, D. G. et al. Gene targeting in vivo by adeno-associated virus vectors. Nature biotechnology24, 1022-1026, doi:10.1038/nbt1231 (2006); Paulk, N. K., Loza, L. M., Finegold, M. J. & Grompe, M. El direccionamiento de genes mediado por AAV se mejora significativamente mediante la inhibición transitoria de la unión de extremos no homólogos o del proteosoma in vivo. Human genetherapy 23, 658-665, doi:10.1089/hum.2012.038 (2012)), y es particularmente notable en ratones adultos donde se esperaba que las células no proliferativas permitieran una baja tasa de recombinación homóloga. Nuestra hipótesis es que la alta tasa de expresión del locusAlby el estado de la cromatina asociada pueden contribuir a las altas tasas de direccionamiento. La proliferación inducida por el daño no puede descartarse estrictamente, pero no se observó ninguna elevación de los niveles de ALT tras la inyección (Figura 15).
El vector AAV puede estar presente en las células en forma de episomas o como integrante en diana o fuera de diana. El número total de copias del vector se evaluó mediante qPCR (Figura 16). El cambio relativamente menor en el número de copias del vector tras la hepatectomía parcial en ratones inyectados cuando eran neonatos puede implicar que el vector episomal ya se ha diluido en gran medida. En tal caso, el número de copias del vector podría considerarse como un límite inferior aproximado de la tasa de integración de fuera de diana a dentro de diana. Sin embargo, en ausencia de un promotor vectorial, lahF9sólo debería expresarse a partir de la integración en la diana. Los altos niveles reconstituidos dehF9tras una hepatectomía parcial (Figura 9A) apoyan esta suposición, ya que sólo los transgenes integrados de manera estable podrían recuperarse tras dicho procedimiento, a diferencia de lo observado con la expresión episomal transitoria. La ausencia de niveles plasmáticos significativos dehF9tras el tratamiento con el vector de control inverso demostró además la reducción de la expresión fuera del objetivo. Se usó la RT-qPCR para evaluar directamente la proporción de ARNmde Alb_hF9fusionado con respecto al conjunto total de ARNm dehF9(Figura 11A). Se descubrió que la proporción era de 1:1 para los ratones inyectados como neonatos, así como para los ratones inyectados como adultos (Figura 11B). Esto implica que hF9 se expresa casi exclusivamente a partir de la integración en diana. De hecho, la única señal específica de una transferencia Northern con una sonda P2A correspondía al ARNm deAlb-P2A-hF9fusionado esperado (Figura 11C). Por último, una transferencia Western con un anticuerpo antipéptido 2A indicó que el péptido 2A está asociado a una única especie con el peso molecular esperado deAlb(Figura 11D), como sólo cabría esperar si la expresión estuviera restringida a la integración en la diana y fuera seguida de una omisión ribosomal eficiente.
El rAAV se ha convertido en un vector popular para la terapia clínica. Aunque el periodo de expresión del transgén en adultos puede durar por lo menos un par de años, aún no se sabe si la expresión de por vida, necesaria para muchos trastornos genéticos, puede obtenerse con vectores rutinarios que contengan promotores. La expresión episomal de los vectores AAV se pierde rápidamente, incluso después de una ronda de división celular. Esto hace probable que las enfermedades que inducen la regeneración celular y/o se tratan en la infancia mientras los tejidos siguen creciendo, tengan una expresión limitada. Es poco probable que la infusión secundaria de un vector AAV dé como resultado una transducción secundaria, debido a la fuerte inmunidad humoral resultante de la administración del vector primario. Por el contrario, el enfoque descrito en la presente da como resultado una integración del vector que eliminaría la pérdida de expresión con el tiempo, incluso en tejidos en crecimiento. Sin embargo, esto depende de la elección de los serotipos de AAV apropiados para evitar la neutralización por la inmunidad preexistente.
Los trabajos anteriores que demostraron el direccionamiento dehF9a un locus quimérico en un ratón transgénico (Li, H. et al. In vivo genome editing restorores haemostasis in a mouse model of haemophilia. Nature 475, 217-221, doi:10.1038/nature10177 (2011)) se han basado en la coexpresión de nucleasas que pueden estar asociadas a efectos secundarios inmunológicos y genotóxicos. La misma dependencia de las endonucleasas se mantuvo incluso cuando elhF8se dirigió al locusAlben ratones y primates no humanos (Anguela, X. e. a. ZFN Mediated Targeting Of Albumin "Safe Harbor" Results In Therapeutic Levels Of Human Factor VIII In a Mouse Model Of Hemophilia A. Blood 122, 720 (2013)), probablemente porque no se proporcionaron brazos de homología y la integración se basó en cambio en la unión de extremos no homólogos. El rAAV ya se ha usado en ensayos clínicos de terapia génica para tratar la hemofilia B (Nathwani, A. C. et al. Adenovirus-associated virus vector-mediated gene transfer in hemophilia B. The New England journal of medicine 365, 2357-2365, doi:10.1056/NEJMoa1108046 (2011)). Sin embargo, el transgén en estos ensayos clínicos se expresó a partir de un promotor vectorial que podría inducir la activación de oncogenes, como se ha informado en ratones (Donsante, A. et al. AAV vector integration sites in mouse hepatocellular carcinoma. Science 317, 477, doi:10.1126/science.1142658 (2007)). Según se evaluó midiendo los niveles de transaminasas de alanina, no se observó toxicidad hepática con la inyección del vector de direccionamientohF9descrito en la presente (Figura 15).
El trabajo descrito aquí demuestra un efecto terapéutico para la orientación génicain vivosin nucleasas y sin un promotor vectorial. Los polimorfismos genéticos en el locus diana en la población de pacientes humanos podrían llevar potencialmente a una eficacia terapéutica variable debido a una homología reducida. Sin embargo, descubrimos que el -95% de una muestra de 1000 genomas de la población humana no tiene más de dos haplotipos en la secuenciaAlbrelevante, demostrando por tanto que este enfoque tiene una amplia aplicabilidad (Figura 17).
El perfil de seguridad favorable de esta estrategia de selección de genes sin promotor y sin nucleasas para el rAAV lo convierte en un candidato ideal para el tratamiento de la hemofilia y otras deficiencias genéticas (Yew, N. S. & Cheng, S. H. Gene therapy for lysosomal storage disorders. Pediatric endocrinology reviews;)). En términos más generales, esta estrategia podría aplicarse siempre que el efecto terapéutico sea transmitido por una proteína secretada (por ejemplo, anticuerpos ampliamente neutralizantes) o cuando la orientación confiera una ventaja selectiva (Paulk, N. K., Loza, L. M., Finegold, M. J. & Grompe, M. AAV-mediated gene targeting is significantly enhanced by transient inhibition of nonhomologous end joining or the proteasome in vivo. Human gene therapy 23, 658-665, doi:10.1089/hum.2012.038 (2012)).
Ejemplo 3
La Figura 18 proporciona datos obtenidos midiendo el F9 plasmático (medido por ELISA) tras inyecciones en vena de la cola de ratones B6 hembra de 9 semanas de edad con 1 x 1012 genomas vectoriales por ratón del constructo experimental AAV8-F9 o AAVDJ-F9 (n = 4 cada una).
La Figura 19 proporciona datos obtenidos midiendo la eficacia de la coagulación (mediante el tiempo de tromboplastina parcial activada [aPTT]) 2 semanas después de inyecciones en la vena de la cola de AAV8-F9 a 1 x 1012 genomas de vector por ratón (arriba) o de AAV8-F9 Triple a 3 x 1011 genomas de vector por ratón (abajo) (n = 5 cada uno).
La Figura 20 proporciona datos obtenidos midiendo el F9 plasmático (medido por ELISA) tras inyecciones en vena temporal superficial de ratones B6 de 2 días de edad con 2,5 x 1011 genomas vectoriales por ratón del constructo experimental AAV8-F9 (n = 4).
La Figura 21 proporciona datos obtenidos midiendo el VRC01 plasmático (anticuerpo ampliamente neutralizante contra el VIH) (medido por ELISA) tras inyecciones en vena de la cola de ratones B6 hembra de 9 semanas de edad con 1 x 1012 genomas vectoriales por ratón del constructo experimental AAV8-VRC01 (n = 4 cada uno). En el ELISA de sándwich se usaron placas cubiertas con anticuerpos contra la región constante de la IgG humana, mientras que en el ELISA funcional se usaron placas cubiertas con la glicoproteína gp120 del VIH, que es el antígeno reconocido por el anticuerpo VRC01.

Claims (4)

REIVINDICACIONES
1. Un vector viral recombinante para integrar un transgén en un sitio de integración diana en el genoma de la célula, que comprende:
un casete de polinucleótidos que comprende una primera secuencia de ácido nucleico y una segunda secuencia de ácido nucleico, en donde la primera secuencia de ácido nucleico comprende el transgén; y la segunda secuencia de ácido nucleico está situada a 5' o 3' de la primera secuencia de ácido nucleico y promueve la producción de dos productos génicos independientes al integrarse en el sitio de integración diana en el genoma de la célula; una tercera secuencia de ácido nucleico situada 5' del casete de polinucleótidos y que comprende una secuencia sustancialmente homóloga a la secuencia genómica 5' del sitio de integración diana en el genoma de la célula; y una cuarta secuencia de ácido nucleico situada 3' del casete de polinucleótidos y que comprende una secuencia sustancialmente homóloga a la secuencia genómica 3' del sitio de integración diana en el genoma de la célula, en donde el vector viral es un vector rAAV;
en donde la secuencia de ácido nucleico que promueve la producción de dos productos génicos independientes en el sitio de integración diana se selecciona de: una secuencia que codifica un péptido 2A; un IRES; una inteína; una secuencia de reconocimiento para una proteasa específica del sitio; una secuencia que codifica un conector escindible que se escinde como parte de la cascada de coagulación; una secuencia que codifica un sitio de escisión del factor XI; y una secuencia intrónica donante de corte y empalme/aceptora de corte y empalme; y en donde el transgén codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en receptor de lipoproteína de baja densidad, purina nucleósido fosforilasa, esfingomielinasa, glucocerebrosidasa, CD-18, ornitina transcarbamilasa argininosuccinato sintetasa, fenilalanina hidroxilasa, a-cetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada, fumarilacetoacetato hidrolasa, glucosa 6-fosfatasa, a-L-fucosidasa, p-glucuronidasa, a-L-iduronidasa, galactosa 1-fosfato uridiltransferasa; una proteína del complejo BCKDH (subunidades E1a, E1b y E2); metilmalonil-CoA mutasa; propionil-CoA carboxilasa (subunidades alfa y beta); isovaleril CoA deshidrogenasa; HADHA; HADHB; LCHAD; ACADM; ACADVL; G6PC (GSD1a); G6PT1(GSD1b); y SLC17A3; o
en donde el transgén codifica un polipéptido quimérico, que comprende un dominio de inmunoglobulina y un dominio efector inmunitario, específico para un patógeno seleccionado entre: el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el virus de la gripe, el virus respiratorio sincitial (VRS), el virus de la hepatitis C (VHC), un plasmodio, plasmodium falciparum, plasmodium malariae, un hongo y una bacteria; y
en donde el sitio de integración diana se encuentra en el gen de la albúmina.
2. El vector viral recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el transgén no está enlazado operativamente a un promotor en el vector.
3. El vector viral recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la expresión y la actividad del gen de la albúmina que comprende el sitio de integración diana no se alterado por la integración del transgén, y en donde:
a) el extremo 3' del gen de la albúmina comprende el sitio de integración diana,
la secuencia de la tercera secuencia de ácido nucleico es sustancialmente homóloga a la secuencia de ADN en sentido ascendente del codón de parada del gen de la albúmina, y
la secuencia de las cuartas secuencias de ácidos nucleicos es sustancialmente homóloga a la secuencia de ADN en sentido descendente del codón de parada del gen de la albúmina; o
b) el extremo 5' del gen de la albúmina comprende el sitio de integración diana,
la secuencia de la tercera secuencia de ácido nucleico es sustancialmente homóloga a la secuencia de ADN en sentido ascendente al codón de inicio del gen de la albúmina, y
la secuencia de las cuartas secuencias de ácidos nucleicos es sustancialmente homóloga a la secuencia de ADN en sentido descendente del codón de inicio del gen de la albúmina.
4. El vector viral recombinante de la reivindicación 3, en donde los dos productos génicos independientes son el gen de la albúmina y el transgén.
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