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ES2970251T3 - Profármacos antivirales y nanoformulaciones de los mismos - Google Patents

Profármacos antivirales y nanoformulaciones de los mismos Download PDF

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ES2970251T3
ES2970251T3 ES19877349T ES19877349T ES2970251T3 ES 2970251 T3 ES2970251 T3 ES 2970251T3 ES 19877349 T ES19877349 T ES 19877349T ES 19877349 T ES19877349 T ES 19877349T ES 2970251 T3 ES2970251 T3 ES 2970251T3
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ES
Spain
Prior art keywords
cab
drug
hiv
prodrug
nm2cab
Prior art date
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Active
Application number
ES19877349T
Other languages
English (en)
Inventor
Howard E Gendelman
Benson Edagwa
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Nebraska Lincoln
University of Nebraska System
Original Assignee
University of Nebraska Lincoln
University of Nebraska System
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

La presente invención proporciona profármacos y métodos de uso de los mismos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Profármacos antivirales y nanoformulaciones de los mismos
Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno en virtud de las Subvenciones Nos. R01 MH104147, P01 DA028555, R01 NS036126, P01 NS031492, R01 NS034239, P01 MH064570, P30 MH062261, P30 AI078498, R01 AG043540, y R56 AI138613 otorgado por los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general al suministro de productos terapéuticos. Más específicamente, la presente invención se refiere a composiciones y suministro de agentes terapéuticos a un paciente para uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno.
Antecedentes de la invención
Se han logrado avances notables en el desarrollo de diagnósticos y tratamientos eficaces contra el virus de la inmunodeficiencia humana tipo uno (VIH-1). La terapia antirretroviral (ART) ha reducido notablemente la morbilidad y la mortalidad asociadas a enfermedades, permitiendo una calidad de vida casi normal para las personas infectadas (Vittinghoff, et al. (1999) J. Infect Dis., 179(3):717-720; Lewden, et al. (2007) J. Acquir. Immune Defic. Syndr., 46(1):72-77). Sin embargo, la ART requiere un tratamiento de por vida para suprimir la replicación viral y prevenir la aparición del SIDA. Más aún, la eficacia de la ART se puede ver obstaculizada por la resistencia al VIH-1, toxicidad de los fármacos y mala adherencia del paciente (Wensing, et al. (2014) Top. Antivir. Med., 22(3):642-650; Siliciano, et al. (2013) Curr. Opin. Virol., 3(5):487-494; Prosperi, et al. (2012) BMC Infect. Dis., 12:296-296; Van den Berk, et al. (2016) Abstract number: 948, In Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, 22-25; Siefried, et al. (2017) PLoS One 12(4):e0174613). La fatiga del tratamiento, la falta de apoyo financiero y social, los síntomas mentales coexistentes, y/o el abuso de sustancias pueden provocar el incumplimiento de los regímenes críticos de ART (Tucker, et al. (2017) EBioMedicine, 17:163-171).
Los fármacos antirretrovirales parenterales de acción prolongada (LAP) han aumentado la adherencia al régimen (Spreen, et al. (2013) Curr. Opin. HIV AIDS, 8(6):565-571). Reducir el programa de tratamiento de una administración diaria a mensual o incluso menos frecuente proporciona mayor privacidad y satisfacción al paciente y aumenta la adherencia al régimen (Sangaramoorthy, et al. (2017) J. Assoc. Nurses AIDS Care, 28(4):518-531; Carrasco, et al. (2017) Afr. J. AIDS Res. 16(1): 11-18; Williams, et al. (2013) Nanomed. Lond. 8(11):1807-1813). Sin embargo, sólo unos pocos fármacos antirretrovirales se han reformulado con éxito en LAP.
Cabotegravir (CAB) es un inhibidor de integrasa o inhibidor de la transferencia de cadena de integrasa (INSTI) con baja solubilidad acuosa, alto punto de fusión, alta potencia, vida media larga, y depuración metabólica lenta (Karmon, et al. (2015) J. Acquir. Immune Defic. Syndr., 68(3):39-41; Trezza, et al. (2015) Curr. Opin. HIV AIDS 10(4):239-245). Estas propiedades permiten que CAB se formule en una suspensión de 200 mg/ml (CAB LAP) y se administre por vía intramuscular mensual o incluso con menos frecuencia (Margolis, et al. (2017) Lancet 390(10101): 1499-1510; Spreen, W.W. (2014) J. Acquir. Immune Defic. Syndr., 67(5):481-486). Notablemente, CAB más rilpivirina (RPV) es el primer régimen de ART combinado de acción prolongada en el que las formulaciones de CAB y RPV LAP mensuales o cada dos meses han demostrado una actividad antirretroviral comparable a las combinaciones de tres fármacos orales diarias para la terapia de mantenimiento (Margolis, et al. (2017) Lancet 390(10101):1499-1510).
Ventajosamente, CAB se metaboliza principalmente por la uridina difosfato glucuronosiltransferasa (UGT) 1A1 y tiene un bajo potencial para interactuar con otros fármacos antirretrovirales (Trezza, et al. (2015) Curr. Opin. HIV AIDS 10(4):239-245; Bowers, et al. (2016) Xenobiotica 46(2):147-162). c Ab LAP es altamente protector contra la transmisión del virus de la inmunodeficiencia de simio/humana (SHIV) rectal, vaginal, e intravenosa en primates no humanos y se ha avanzado en ensayos clínicos para la prevención del VIH (NCT02720094) (Andrews, et al. (2014) Science 343(6175):1151-1154; Andrews, et al. (2015) Sci. Transl. Med., 7(270) 270ra4; Radzio, et al. (2015) Sci. Transl. Med., 7(270) 270ra5-270ra5; Andrews, et al. (2016) AIDS 2016:461-467). Sin embargo, el patrón de dosificación de CAB LAP tiene limitaciones. Específicamente, se requieren inyecciones divididas proporcionadas en volúmenes de 2 ml, lo que conduce a la interrupción del tratamiento debido a reacciones intolerables en el sitio de inyección (Margolis, et al. (2017) Lancet 390(10101):1499-510; Markowitz, et al. (2017) Lancet HIV 4(8):331-340). Más aún, el intervalo máximo de dosificación es de sólo 8 semanas. Recientemente, se ha probado la administración de CAB LAP cada 12 semanas con el objetivo de mantener las concentraciones plasmáticas de CAB por encima de 4 veces la concentración inhibidora del 90 % ajustada por la unión a proteína (4 * PA-IC<90>, 660 ng/ml), una concentración que demostró ser protectora contra nuevas infecciones en macacos (Spreen, W.W. (2014) J. Acquir. Immune Defic. Syndr., 67(5):481-486; Andrews, et al. (2014) Science 343(6175):1151-1154; Andrews, et al. (2015) Sci. Transl. Med., 7(270) 270ra4; Radzio, et al. (2015) Sci. Transl. Med., 7(270) 270ra5-270ra5; Andrews, et al. (2016) AIDS 2016:461-467; Markowitz, et al. (2017) Lancet HIV 4(8):331-340; Spreen, et al. (2014) J. Acquir. Immune Defic. Syndr., 67(5):487-492). Sin embargo, dos tercios de los participantes tuvieron una absorción del fármaco más rápida de lo previsto lo que llevó a concentraciones plasmáticas del fármaco por debajo de la concentración efectiva dina de 4 * PA-IC<90>a las 12 semanas. Por lo tanto, son muy necesarias las formas de extender el intervalo de dosis más allá de 8 semanas y reducir los volúmenes de inyección para aumentar la adherencia al régimen (Boyd, et al. (2017) Lancet 390(10101):1468-1470).
El documento WO2017223280 divulga composiciones y métodos para el suministro y retención basada en células de agentes terapéuticos a un paciente para el tratamiento y prevención de una infección viral. En particular, un compuesto profármaco de fórmula I-A y sales farmacéuticamente aceptables del mismo que incluyen un residuo de ácido graso saturado o insaturado.
Resumen de la invención
En un primer aspecto se proporciona un compuesto de fórmula I:
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que R es una cadena alifática lineal saturada de una longitud de 17 carbonos.
En un segundo aspecto, se proporciona una nanopartícula que comprende un compuesto de la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un polímero o tensioactivo.
en ciertas realizaciones el compuesto es
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y el polímero o tensioactivo es P407.
En otro aspecto se proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un portador farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto se proporciona un compuesto o sal de la reivindicación 1, una nanopartícula de la reivindicación 2 o la reivindicación 3, o una composición farmacéutica de la reivindicación 4, para uso en un método de tratamiento de una infección por VIH.
En determinadas realizaciones el compuesto o sal del mismo, nanopartícula, o composición farmacéutica se administra al sujeto a través de inyección.
En ciertas realizaciones el compuesto o sal del mismo, nanopartícula, o composición farmacéutica se administra al sujeto una vez en un período de 3, 6, 9, 12, 18 o 24 meses.
Breve descripción de los dibujos
(cualquiera de las siguientes figuras que no entren dentro del alcance de las reivindicaciones no forman parte de la invención pero se proporcionan solo con fines comparativos)
La Figura 1A proporciona imágenes de nanopartículas de NM2CAB (arriba) y NCAB (abajo) según se determina mediante microscopía electrónica de barrido. La Figura 1B proporciona gráficos de la estabilidad de las nanopartículas de NM2CAB a 25 °C durante los períodos de tiempo indicados. Particularmente, el potencial zeta de las nanopartículas (arriba), el índice de polidispersidad (centro) y el diámetro de las partículas (abajo) se determinaron mediante dispersión dinámica de la luz.
La Figura 2A proporciona un gráfico (arriba) de la absorción de fármaco medida por UPLC-UV/Vis por macrófagos derivados de monocitos humanos (MDM) y un gráfico (abajo) de retención de fármaco por MDM y recolectado en los puntos de tiempo indicados para el análisis de fármaco intracelular. La Figura 2B proporciona un gráfico (arriba) de la actividad de la transcriptasa inversa del VIH-1 a la concentración indicada de fármaco y un gráfico (abajo) de la actividad de la transcriptasa inversa del VIH-1 en MDM tratados con fármaco e inoculados con VIH-1<ada>y medido en los puntos de tiempo indicados después del tratamiento. La Figura 2C proporciona imágenes de células MDM teñidas con p24 después de la inoculación.
La Figura 3A proporciona un gráfico de los niveles plasmáticos de CAB después de una única dosis intramuscular (IM) de NCAB, NMCAB o NM2CAB en ratones NSG hembra (ratón NOD scid gamma). La dosis administrada fue de 45 mg de equivalentes de CAB (eq)/kg. La línea discontinua en negrita superior indica el CAB 4 * PA-IC<90>en plasma de 664 ng/ml y la línea punteada inferior muestra el CAB 1 * PA-IC<90>en plasma de 166 ng/ml. La Figura 3B proporciona un gráfico de los niveles plasmáticos de CAB después de una única dosis intramuscular (IM) de NM3CAB en ratones NSG hembra (ratón NOD scid gamma). La dosis administrada fue de 45 mg de equivalentes de CAB (eq)/kg. La línea discontinua en negrita superior indica el CAB 4 * PA-IC<90>en plasma de 664 ng/ml y la línea punteada inferior muestra el CAB 1 * PA-IC<90>EN plasma de 166 ng/ml.
La Figura 4 proporciona imágenes de la dosis-respuesta antirretroviral de NM2CAB a una concentración de 10, 50 o 100 |<j>M mediante inmunocitoquímica para el antígeno p24 del VIH-1.
La Figura 5 proporciona gráficos de niveles de profármaco. La biodistribución de tejido y sanguínea de los profármacos (MCAB o M2<c>A<b>) se evaluó a los 14, 28, 42 y 364 días después de una única inyección IM de NMCAB o NM2CAB. Los niveles de profármaco se midieron en los tejidos anatómicos asociados a bazo, hígado, intestino, pulmones, cerebro, el tejido rectal, riñones, ganglios linfáticos y la sangre. Los niveles de profármaco se determinaron mediante LC-MS/MS. Los datos se expresan como media ±<e>E<m>. Para los grupos de los días 14, 28 y 42, el número de animales en cada grupo fue N = 5, y para el grupo del día 364, el número de animales fue N = 3 (NMCAB), N = 4 (NM2CAB). Se utilizó un ANOVA unidireccional seguido de una prueba de Tukey post para comparar los niveles del fármaco en los tejidos entre tres tratamientos (*P <0.05, **P <0.01, ***P <0.001).
Las Figuras 6A y 6B proporcionan gráficos de la farmacocinética y biodistribución de NM2CAB en macacos rhesus. A cuatro macacos rhesus se les administró 45 mg/kg de una dosis equivalente a CAB de NM2CAB mediante una única inyección IM. Se recolectaron muestras de plasma y se analizaron los niveles de CAB (líneas superiores) y M2CAB (líneas inferiores) hasta el día 393 (Figura 6A). Se recolectaron biopsias rectales, de ganglios linfáticos y de tejido adiposo el día 204 después de la administración del fármaco y se ensayaron las concentraciones tanto de CAB (arriba) como M2CAB (abajo) (Figura 6B). Las concentraciones del fármaco tanto en plasma como en tejido se determinaron mediante LCMS/<m>S.
Descripción detallada de la invención
Los profármacos de la invención mencionados en los siguientes párrafos se refieren a los compuestos de fórmula (I) tal como se define en las reivindicaciones.
La restricción máxima de la carga viral en los sitios infecciosos de los tejidos puede facilitar las estrategias de erradicación viral. Esto se puede lograr mediante la generación de potentes nanocristales de profármacos antirretrovirales lipófilos e hidrófobos estabilizados por tensioactivos. Las hidrofobicidades, tasas de hidrólisis del fármaco y potencias antirretrovirales se deben equilibrar para lograr un efecto terapéutico óptimo. En el presente documento, se demuestra que la manipulación del tamaño de la longitud de la cadena de carbono hidrófoba y lipófila de un profármaco puede optimizar la eficacia terapéutica, particularmente con respecto a la terapia antirretroviral de liberación lenta y eficaz con acción prolongada (LASER a Rt ). LASER ART se refiere a un fármaco antirretroviral de acción prolongada generado a partir de un profármaco de nanocristales con una cola lipídica. El nanocristal del profármaco CAB miristoilado proporciona concentraciones plasmáticas de CAB sostenidas en el PA-IC<90>durante 4 meses en macacos rhesus después de una única dosis de inyección intramuscular equivalente a CAB de 45 mg/kg. En el presente documento, se muestra que modificaciones químicas adicionales sirven inesperadamente para mejorar la lipofilicidad e hidrofobicidad de CAB, aumentar la potencia del fármaco y retardar la hidrólisis del profármaco, extendiendo de esta manera ampliamente la vida media del fármaco original. Los profármacos de cabotegravir (M2CAB) novedosos mejoran la encapsulación del fármaco con excipientes y estabilizadores apropiados, tales como el poloxámero 407 (P407). Las nanoformulaciones de M2CAB (NM2CAB) proporcionan una liberación sostenida de fármacos y un suministro de fármacos antirretrovirales específicos del sitio. Los profármacos comprenden un fármaco nativo conjugado con fracciones hidrófobas mediante enlaces covalentes hidrolizables. Las nanoformulaciones de NM2CAB se absorbieron fácilmente por los macrófagos derivados de monocitos humanos (MDM) con retención sostenida del fármaco durante 30 díasin vitro;mientras que la nanoformulación del fármaco original (NCAB) o el cabotegravir miristoilado de primera generación (NMCAB) mostraron un avance del VIH-1 en MDM dentro de uno o 20 días de tratamiento, respectivamente. Notablemente, los MDM tratados con NM2CAB exhibieron actividades antirretrovirales sostenidas después de la exposición al VIH-1 durante hasta 30 días después del tratamiento con un único fármaco. No se detectó VIH-1p24 en el grupo tratado con NM2CAB en puntos de tiempo incrementales de 5 días durante hasta 30 días o más. Además, una única inyección intramuscular (IM) de NM2CAB a 45 mg equivalentes/kg de CAB en ratones NSG hembra (ratón NOD scid gamma) demostró una cinética de liberación controlada de orden cero de CAB activo y proporcionó niveles de fármaco iguales o superiores a 4 veces los PA-CI<90>durante más de 5 meses. Las nanoformulaciones de NM2CAB presentadas en el presente documento mejoran los regímenes de ART combinados actuales que requieren múltiples administraciones diarias al reducir la carga de píldoras, disminuir el riesgo de rebote viral, limitar las toxicidades, y/o permitir la penetración del fármaco en los reservorios virales. Es importante destacar que NM2CAB también facilita un intervalo de dosificación de una vez cada seis meses (o incluso con menos frecuencia) para maximizar la eficacia de la profilaxis o los regímenes de tratamiento previos a la exposición.
Las formulaciones de ART de liberación lenta y eficaz de acción prolongada (LASER ART) pueden extender los intervalos de dosificación, reducir la toxicidad sistémica y mejorar los perfiles farmacocinéticos (PK) y farmacodinámicos (PD) (Sillman, et al., Nat. Commun. (2018) 9:443; Zhou, et al., Biomaterials (2018) 151:53-65; McMillan, et al., Antimicrob. Agents Chemother. (2018) 62:e01316-17). En el presente documento, se proporcionan profármacos inhibidores de la integrasa novedosos, formulaciones de liberación efectiva y lenta con acción prolongada de las mismas, y métodos de síntesis y uso de los mismos. Los inhibidores de la integrasa (inhibidores de la transferencia de cadena de integrasa (INSTI)) son una clase de fármaco antirretroviral diseñado para bloquear la acción de la integrasa (por ejemplo, la integrasa del VIH), una enzima viral que inserta el genoma viral en el ADN de la célula huésped. Ejemplos de inhibidores de la integrasa incluyen, sin limitación, cabotegravir (CAB, GSK1265744), raltegravir (RAL), elvitegravir (EVG), dolutegravir (DTG, GSK1349572), bictegravir (BIC, GS-9883), BI 224436 (Boehringer Ingelheim, Ingelheim, Alemania), y MK-2048 (Merck, Kenilworth, NJ). Los profármacos hidrófobos y lipófilos y sus formulaciones de liberación lenta y eficaz exhiben potencia y eficacia mejoradas, mayor penetración celular y de tejido y vidas medias prolongadas en comparación con el inhibidor de integrasa original. Los profármacos y sus formulaciones de la presente invención y sus combinaciones se pueden utilizar en el manejo de infecciones virales (por ejemplo, retrovirales).
Los tratamientos de infecciones virales, particularmente infecciones por VIH, que están actualmente disponibles, incluyen inhibidores de la entrada viral, transcriptasa inversa de nucleósidos, transcriptasa inversa de nucleótidos, integrasa, y proteasa. La resistencia está vinculada con una vida media más corta del fármaco, el ciclo de vida viral, y mutaciones rápidas que resultan en una alta variabilidad genética. Las terapias combinadas, por ejemplo, terapias antirretrovirales (ART), que se consideran terapias de “cóctel”, han ganado considerable atención. Los beneficios incluyen una menor resistencia viral, toxicidades limitadas, adherencia aumentada a los regímenes terapéuticos y una eficacia antirretroviral sostenida. Las terapias combinadas minimizan la posible resistencia a los fármacos al suprimir la replicación viral (por ejemplo, VIH), reduciendo de esta manera los mutantes resistentes espontáneos. El fracaso del tratamiento se atribuye, en parte, a la corta vida media del fármaco. Además, el fracaso también se puede atribuir, en parte, al acceso limitado de los fármacos a los reservorios virales celulares y de tejido, lo que impide los esfuerzos de erradicación viral. Con estos fines, el desarrollo de plataformas de profármacos (nanopartículas) nanoformuladas dirigidas a células y tejidos es de considerable interés en el manejo de infecciones virales (por ejemplo, VIH). La profilaxis previa a la exposición (PrEP) es otra estrategia utilizada en el manejo de la transmisión viral (por ejemplo, VIH). Por ejemplo, TRUVADA® (tenofovir/emtricitabina) se ha aprobado para la profilaxis previa a la exposición contra la infección por VIH. Adicionalmente, la combinación de lamivudina y zidovudina (COMBIVIR®) se ha utilizado como profilaxis previa a la exposición y profilaxis posterior a la exposición.
Los profármacos y profármacos nanoformulados (nanopartículas) proporcionados en el presente documento extienden inesperadamente la vida media del fármaco, incrementan la hidrofobicidad y la lipofilicidad y mejoran la eficacia antirretroviral. Esto beneficiará a las personas que tienen que recibir dosis altas diarias o incluso varias dosis al día, ya que una dosificación más baja con menos frecuencia de dosificación no sólo disminuiría los efectos secundarios, sino que también sería conveniente para los pacientes. Los profármacos y profármacos nanoformulados (nanopartículas) proporcionados en el presente documento también se pueden utilizar como tratamiento posterior a la exposición y/o profilaxis previa a la exposición (por ejemplo, para personas que tienen un alto riesgo de contraer VIH-1). En otras palabras, los profármacos y nanopartículas de la presente invención y su combinación se pueden utilizar para prevenir una infección viral (por ejemplo, infección por VIH) y/o tratar o inhibir una infección viral aguda o de largo plazo (por ejemplo, infección por VIH). Si bien los profármacos y nanopartículas de la presente invención se describen generalmente como agentes anti-VIH, los profármacos y nanoformulaciones también pueden ser eficaces contra otras infecciones virales que incluyen, sin limitación: retrovirus (por ejemplo, lentivirus), virus de la hepatitis B (HBV), hepatitis virus C (HCV) y virus de la leucemia de células T humanas (HTLV), en particular retrovirus.
La presente invención describe profármacos novedosos, potentes y de amplio espectro con actividad biológica aumentada con respecto a los fármacos originales. También se proporcionan métodos para la encapsulación de los profármacos en formulaciones efectivas lentas de acción prolongada para un suministro intracelular y de tejido eficiente y vidas medias prolongadas de los fármacos. Las composiciones de liberación lenta y eficaz (LÁSER) con acción prolongada descritas en el presente documento exhiben una potencia mejorada y se pueden utilizar como intervenciones terapéuticas o preventivas efectivas contra infecciones virales (por ejemplo, infecciones retrovirales).
Los profármacos de la presente invención permiten el suministro intracelular eficaz de inhibidores de la integrasa. En el presente documento, se proporcionan profármacos que son derivados de inhibidores de la integrasa en los que una fracción química, particularmente una fracción que contiene oxígeno tal como un grupo hidroxilo, se ha reemplazado por una fracción de éster que comprende una fracción escindible hidrófoba y lipófila (por ejemplo, alcoholes grasos terapéuticos). La fracción escindible hidrófoba y lipófila (por ejemplo, alcoholes grasos terapéuticos) puede exhibir actividad antiviral contra virus envueltos (Katz, et al., Ann. NY Acad. Sci. (1994) 724:472-88). Notablemente, las interacciones sinérgicas entre los alcoholes grasos terapéuticos y los análogos de nucleósidos pueden mejorar sustancialmente la potencia antiviral de los nucleósidos (Marcelletti et al., Antiviral Res. (2002) 56: 153-66).
Como se describe en el presente documento, los profármacos pueden comprender alcoholes grasos terapéuticos lábiles para aumentar la potencia del fármaco, acelerar la penetrancia intracelular y de tejido, la unión a proteínas y la biodisponibilidad. La naturaleza hidrófoba de los profármacos sintetizados facilita la encapsulación en nanocristales de fármacos de liberación lenta con acción prolongada con características biofarmacéuticas aumentadas. Las nanoformulaciones de la presente invención pueden estar compuestas de partículas de profármaco dispersadas en suspensiones acuosas estériles y estabilizadas mediante excipientes poliméricos, lípidos, y/o tensioactivos o polímeros. Sin estar limitado a ninguna teoría, el mecanismo de liberación del fármaco implica la disolución del profármaco de la nanopartícula seguida de una escisión eficiente para generar dos agentes bioactivos, es decir, el inhibidor de integrasa y los alcoholes grasos antivirales de amplio espectro.
Los beneficios del sistema descrito en el presente documento incluyen, sin limitación, potencia mejorada del fármaco, biodisponibilidad y vida media prolongada para comodidad del paciente. De hecho, las nanoformulaciones descritas en esta invención exhibieron un incremento significativo en la absorción de fármacos por los macrófagos derivados de monocitos (MDM). También, el fármaco modificado y las nanopartículas mostraron una potencia mejorada a través de una inhibición mayor y extendida de la replicación viral. Por lo tanto, las nanoformulaciones de la presente invención permiten mejorar la potencia antiviral y acelerar el suministro de fármacos a reservorios anatómicos de infección. De acuerdo con la presente invención, se proporcionan profármacos de inhibidores de la integrasa según se reivindica. En un ejemplo no reivindicado, el profármaco comprende un inhibidor de integrasa en el que una fracción química tal como un grupo hidroxilo se reemplaza con un éster que comprende un grupo alifático o alquilo opcionalmente sustituido. En una realización particular, el éster comprende una cadena de hidrocarburos, particularmente una cadena de hidrocarburos de 17 átomos de carbono de longitud (la numeración en el presente documento incluye el carbono en el C=O del éster).
En una realización particular, el inhibidor de integrasa es cabotegravir (CAB).
Ejemplos de las estructuras químicas de estos inhibidores de la integrasa son:
En una realización particular, el profármaco de la presente invención es la fórmula I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
en la que R es un alifático o alquilo opcionalmente sustituido. El grupo alifático o alquilo puede ser insaturado o saturado y se puede sustituir con al menos un heteroátomo (por ejemplo, O, N, o S). En un ejemplo no reivindicado, R puede contener una fracción aromática que se puede sustituir con al menos un heteroátomo (por ejemplo, O, N, o S).
En una realización particular, el grupo alifático es hidrófobo. En un ejemplo no reivindicado R es una cadena hidrocarbonada opcionalmente sustituida, particularmente saturada. En una realización particular, R es una cadena alifática lineal saturada. En un ejemplo no reivindicado, el grupo alquilo o alifático comprende aproximadamente 3 a aproximadamente 30 carbonos (por ejemplo, en la cadena principal del grupo alquilo o alifático), que se puede sustituir con al menos un heteroátomo (por ejemplo, O, N, o S). En un ejemplo no reivindicado, R es un grupo alquilo o alifático C14-C21 insaturado o saturado, que se puede sustituir con al menos un heteroátomo (por ejemplo, O, N, o S). En un ejemplo no reivindicado R es un grupo alquilo o alifático C14-C19 insaturado o saturado, que se puede sustituir con al menos un heteroátomo (por ejemplo, O, N, o S). En un ejemplo no reivindicado, R es un grupo alquilo o alifático C14-C17 insaturado o saturado, que se puede sustituir con al menos un heteroátomo (por ejemplo, O, N, o S). En un ejemplo no reivindicado R es un grupo alquilo o alifático C15-C21 insaturado o saturado, que se puede sustituir con al menos un heteroátomo (por ejemplo, O, N, o S). En un ejemplo no reivindicado, R es un grupo alquilo o alifático C15-C19 insaturado o saturado, que se puede sustituir con al menos un heteroátomo (por ejemplo, O, N, o S). En un ejemplo no reivindicado, R es un grupo alquilo o alifático C15-C17 insaturado o saturado, que se puede sustituir con al menos un heteroátomo (por ejemplo, O, N, o S). En un ejemplo no reivindicado, R es un grupo alquilo o alifático C16-C21 insaturado o saturado, que se puede sustituir con al menos un heteroátomo (por ejemplo, O, N, o S). En un ejemplo no reivindicado, R es un grupo alquilo o alifático C16-C19 insaturado o saturado, que se puede sustituir con al menos un heteroátomo (por ejemplo, O, N, o S). En un ejemplo no reivindicado, R es un grupo alquilo o alifático C17-C21 insaturado o saturado, que se puede sustituir con al menos un heteroátomo (por ejemplo, O, N, o S). En un ejemplo no reivindicado R es un grupo alquilo o alifático C17-C19 insaturado o saturado, que se puede sustituir con al menos un heteroátomo (por ejemplo, O, N, o S). En una realización particular, R es un grupo alifático C17.
En un ejemplo no reivindicado R es la cadena de alquilo de un ácido graso (saturado o insaturado), particularmente un ácido graso C16-C22, un ácido graso C16-C20, un ácido graso C16-C18, un ácido graso C18-C22, un Ácido graso C18-C20, o un ácido graso C18 (la numeración en el presente documento incluye el carbono en el C=O del éster).
En un ejemplo no reivindicado R es una cadena alifática lineal saturada o una cadena hidrocarbonada de al menos 14 carbonos (por ejemplo, 14 a 21 carbonos de longitud en la cadena, 14 a 19 carbonos de longitud en la cadena, 14 a 17 carbonos de longitud en la cadena, 15 a 21 carbonos de longitud en la cadena, 15 a 19 carbonos de longitud en la cadena, 15 a 17 carbonos de longitud en la cadena, o 17 carbonos de longitud en la cadena). En una realización particular, R es una cadena alifática lineal saturada o una cadena hidrocarbonada de 17 carbonos de longitud.
En una realización particular, el profármaco de la presente invención es:
(M2CAB) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
La presente invención también abarca nanopartículas (a veces denominadas en el presente documento nanoformulaciones) que comprenden el profármaco de la presente invención. Las nanopartículas se pueden utilizar para la administración de los compuestos a una célula o huésped (por ejemplo,in vitrooin vivo).En una realización particular, la nanopartícula se utiliza para el suministro de terapia antirretroviral a un sujeto. Las nanopartículas de la presente invención comprenden al menos un profármaco y al menos un tensioactivo o polímero. En una realización particular, las nanopartículas comprenden una relación tensioactivo/polímero: fármaco definida espectroscópicamente que mantiene el direccionamiento óptimo de la nanopartícula del fármaco para mantener un depósito de macrófagos. Estos componentes de la nanopartícula, junto con otros componentes opcionales, se describen a continuación.
Los métodos para sintetizar las nanopartículas de la presente invención se conocen en la técnica. En una realización particular, los métodos generan nanopartículas que comprenden un profármaco (por ejemplo, cristalino o amorfo) recubierto (ya sea parcial o completamente) con un polímero y/o tensioactivo. Los ejemplos de métodos de síntesis incluyen, sin limitación, molienda (por ejemplo, molienda en húmedo), homogeneización (por ejemplo, homogeneización a alta presión), replicación de partículas en tecnología de plantilla no humectante (PRINT), y/o técnicas de sonicación. Por ejemplo, Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. No. 2013/0236553. proporciona métodos adecuados para sintetizar nanopartículas de la presente invención. En una realización particular, los polímeros o tensioactivos primero se modifican químicamente con ligandos dirigidos y luego se utilizan directamente o se mezclan con polímeros o tensioactivos no dirigidos en ciertas relaciones molares para recubrir la superficie de suspensiones de profármacos, por ejemplo, al utilizar un proceso de síntesis de nanopartículas. (por ejemplo, un proceso de síntesis de nanopartículas cristalinas) tal como molienda (por ejemplo, molienda en húmedo), homogeneización (por ejemplo, homogeneización a alta presión), replicación de partículas en tecnología de plantilla no humectante (PRINT) y/o técnicas de sonicación, preparando de esta manera nanoformulaciones dirigidas. Las nanopartículas se pueden utilizar con o sin purificación adicional, aunque es deseable evitar una purificación adicional para una producción más rápida de las nanopartículas. En una realización particular, las nanopartículas se sintetizan utilizando molienda y/u homogeneización. Las nanopartículas dirigidas (por ejemplo, utilizando ligandos (opcionalmente con alto peso molecular)) se pueden desarrollar mediante recubrimiento y/o unión física o química sobre la superficie de polímeros o tensioactivos y/o nanosuspensiones de fármacos.
En una realización particular, las nanopartículas de la presente invención se sintetizan al agregar el profármaco (por ejemplo, cristales) a un polímero o solución tensioactiva y luego generar las nanopartículas (por ejemplo, mediante molienda en húmedo u homogeneización a alta presión). La solución de profármaco y polímero o tensioactivo se puede agitar antes de la molienda en húmedo o la homogeneización a alta presión.
Las nanopartículas de la presente invención se pueden utilizar para suministrar al menos un profármaco de la presente invención a una célula o un sujeto (que incluyen animales no humanos). Las nanopartículas de la presente invención pueden comprender además al menos otro agente o compuesto, particularmente un agente bioactivo, particularmente un agente terapéutico (por ejemplo, compuesto antiviral) o agente de diagnóstico, particularmente al menos un antiviral o antirretroviral. En una realización particular, las nanopartículas de la presente invención comprenden al menos dos agentes terapéuticos, particularmente en los que al menos uno es un profármaco de la presente invención. Por ejemplo, la nanopartícula puede comprender un profármaco inhibidor de integrasa de la presente invención y al menos otro agente terapéutico (por ejemplo, un agente anti-VIH).
En una realización particular, las nanopartículas de la presente invención son una dispersión coloidal submicrónica de cristales de profármaco de tamaño nanométrico estabilizados por polímeros o tensioactivos (por ejemplo, cristales de fármaco recubiertos con tensioactivo; una nanoformulación). En una realización particular, el profármaco puede ser cristalino (sólidos que tienen las características de cristales), amorfo, o son nanopartículas en estado sólido del profármaco que se forma como un cristal que combina el fármaco y el polímero o tensioactivo. En una realización particular, el profármaco es cristalino. Como se utiliza en el presente documento, el término “cristalino” se refiere a un estado ordenado (es decir, no amorfo) y/o una sustancia que exhibe un orden de largo alcance en tres dimensiones. En una realización particular, la mayoría (por ejemplo, al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95, % o más) del profármaco y, opcionalmente, la porción hidrófoba del tensioactivo son cristalinos.
En una realización particular, la nanopartícula de la presente invención tiene hasta aproximadamente 2 o 3 pm de diámetro (por ejemplo, diámetro promedio z) o su dimensión más larga, particularmente hasta aproximadamente 1 pm (por ejemplo, aproximadamente 100 nm a aproximadamente 1 pm). Por ejemplo, el diámetro o la dimensión más larga de la nanopartícula puede ser de aproximadamente 50 a aproximadamente 800 nm. En una realización particular, el diámetro o dimensión más larga de la nanopartícula es de aproximadamente 50 a aproximadamente 750 nm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 nm, de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 500 nm, de aproximadamente 200 nm a aproximadamente 400 nm, o de aproximadamente 250 nm a aproximadamente 350 nm. Las nanopartículas pueden tener, por ejemplo, conformación de varilla, varillas alargadas, conformación irregular o redonda. Las nanopartículas de la presente invención pueden ser neutras o cargadas. Las nanopartículas se pueden cargar positiva o negativamente.
Como se indicó anteriormente, las nanopartículas de la presente invención comprenden al menos un polímero o tensioactivo. Un “tensioactivo” se refiere a un agente de superficie activa, que incluye sustancias comúnmente denominadas como agentes humectantes, detergentes, agentes dispersantes, o agentes emulsionantes. Los tensioactivos son usualmente compuestos orgánicos anfifílicos.
Los ejemplos de polímeros o tensioactivos incluyen, sin limitación, fosfolípidos sintéticos o naturales, lípidos PEGilados (por ejemplo, fosfolípidos PEGilados), derivados lipídicos, polisorbatos, copolímeros anfifílicos, copolímeros de bloque anfifílicos, polietilenglicol)-co-poli(lactida-co-glicolida). (PEG-PLGA), sus derivados, derivados conjugados con ligando y combinaciones de los mismos. En la presente invención se pueden utilizar otros polímeros o tensioactivos y sus combinaciones que pueden formar nanosuspensiones estables y/o se pueden unir química/físicamente a los ligandos dirigidos de células T CD4+, macrófagos y células dendríticas infectadas/infectables por VIH. Ejemplos adicionales de polímeros o tensioactivos incluyen, sin limitación: 1) tensioactivos no iónicos (por ejemplo, poliésteres pegilados y/o conjugados con polisacáridos y otros bloques poliméricos hidrófobos como poli(lactida-co-glicolida) (PLGA), ácido poliláctico (PLA), policaprolactona (PCL), otros poliésteres, óxido de polipropileno), poli(óxido de 1,2-butileno), poli(óxido de n-butileno), poli(tetrahidrofurano) y poli(estireno); ésteres de glicerilo, éteres de alcoholes grasos de polioxietileno, ésteres de ácidos grasos de sorbitán y polioxietileno, ésteres de ácidos grasos de polioxietileno, ésteres de sorbitán, monoestearato de glicerol, polietilenglicoles, polipropilenglicoles, alcohol cetílico, alcohol cetoestearílico, alcohol estearílico, alcoholes de arilalquilpoliéter, copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno, poloxaminas, celulosa, metilcelulosa, hidroxilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, polisacáridos, almidón y sus derivados, hidroxietil almidón, alcohol polivinílico (PVA), polivinilpirrolidona y combinaciones de los mismos); y 2) tensioactivos iónicos (por ejemplo, fosfolípidos, lípidos anfifílicos, 1,2-dialquilglicero-3-alquilfofocolinas, 1,2-diestearoilsn-glecro-3-fosfocolina (DSPC), 1,2-distearoil-sn-glicero- 3-fosfoetanolamina-N-[carboxi(polietilenglicol) (DSPE-PEG), dimetilaminoetanocarbamoil colesterol (DC-Chol), N-[1-(2,3-Dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP), haluros de alquilpiridinio, compuestos de amonio cuaternario, laurildimetilbencilamonio, clorhidratos de acil carnitina, dimetildioctadecilamonio (DDAB), n-octilaminas, oleilaminas, benzalconio, cetiltrimetilamonio, quitosano, sales de quitosano, poli(etilenimina) (PEI), poli(N-isopropilacrilamida) (PNIPAM) y poli(alilamina) (PAH), poli(cloruro de dimetildialilamonio) (PDDA), sulfonatos de alquilo, fosfatos de alquilo, fosfonatos de alquilo, laurato de potasio, estearato de trietanolamina, laurilsulfato de sodio, dodecilsulfato de sodio, sulfatos de alquilpolioxietileno, ácido algínico, sales de ácido algínico, ácido hialurónico, sales de ácido hialurónico, gelatinas, dioctilsulfosuccinato de sodio, carboximetilcelulosa de sodio, sulfato de celulosa, sulfato de dextrano y carboximetilcelulosa, sulfato de condroitina, heparina, poli(ácido acrílico) (PAA) sintético, poli(ácido metacrílico) (PMA), poli(sulfato de vinilo) (PVS), poli(sulfonato de estireno) (PSS), ácidos biliares y sus sales, ácido cólico, ácido desoxicólico, ácido glicocólico, ácido taurocólico, ácido glicodesoxicólico, derivados de los mismos, y combinaciones de los mismos).
El polímero o tensioactivo de la presente invención puede estar cargado o ser neutro. En una realización particular, el polímero o tensioactivo es neutro o está cargado negativamente (por ejemplo, poloxámeros, polisorbatos, fosfolípidos, y sus derivados).
En una realización particular, el polímero o tensioactivo es un copolímero de bloque anfifílico o un derivado lipídico. En una realización particular, al menos un polímero o tensioactivo de la nanopartícula es un copolímero de bloques anfifílico, particularmente un copolímero que comprende al menos un bloque de poli(oxietileno) y al menos un bloque de poli(oxipropileno). En una realización particular, el polímero o tensioactivo es un copolímero de bloques anfifílico tribloque. En una realización particular, el polímero o tensioactivo es un copolímero de bloques anfifílico tribloque que comprende un bloque hidrófobo central de polipropilenglicol flanqueado por dos bloques hidrófilos de polietilenglicol. En una realización particular, el tensioactivo es poloxámero 407.
En una realización particular, el copolímero de bloques anfifílico es un copolímero que comprende al menos un bloque de poli(oxietileno) y al menos un bloque de poli(oxipropileno). En una realización particular, el copolímero de bloques anfifílico es un poloxámero. Ejemplos de poloxámeros incluyen, sin limitación, Pluronic ® L31, L35, F38, L42, L43, L44, L61, L62, L63, L64, P65, F68, L72, P75, F77, L81, P84, P85, F87, F88, L92, F98, L101, P103, P104, P105, F108, L121, L122, L123, F127, 10R5, 10R8, 12R3, 17R1, 17R2, 17R4, 17R8, 22R4, 25R1,25R2, 25R4, 25R5, 25R8, 31R1, 31R2, y 31R4. En una realización particular, el poloxámero es el poloxámero 407 (Pluronic® F127).
En una realización particular de la invención, el polímero o tensioactivo está presente en la nanopartícula y/o solución para sintetizar la nanopartícula (como se describe en el presente documento) en una concentración que varía desde aproximadamente 0.0001 % a aproximadamente 10 % o 15 % en peso. En una realización particular, la concentración del polímero o tensioactivo varía desde aproximadamente 0.01 % a aproximadamente 15 %, aproximadamente 0.01 % a aproximadamente 10%, aproximadamente 0.1% a aproximadamente 10%, o aproximadamente 0.1% a aproximadamente 6 % en peso. En una realización particular, la nanopartícula comprende al menos aproximadamente 50 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o más del agente terapéutico (profármaco) en peso. En una realización particular, las nanopartículas comprenden una relación fármaco:polímero/tensioactivo definida. En una realización particular, la relación fármaco:polímero/tensioactivo definida (por ejemplo, en peso) es desde aproximadamente 10:6 a aproximadamente 1000:6, aproximadamente 20:6 a aproximadamente 500:6, aproximadamente 50:6 a aproximadamente 200:6, o aproximadamente 100:6.
Como se indicó anteriormente, el polímero o tensioactivo de la presente invención se puede ligar a un ligando dirigido. El direccionamiento de las nanopartículas (por ejemplo, a los macrófagos) puede proporcionar un direccionamiento superior, menores tasas de excreción, menor toxicidad y una vida media prolongada en comparación con el fármaco libre o las nanopartículas no dirigidas. Un ligando dirigido es un compuesto que se une específicamente a un tipo específico de tejido o tipo de célula (por ejemplo, en una relación de células diana deseada). Por ejemplo, se puede utilizar un ligando de direccionamiento para la interacción o unión de un receptor o marcador de superficie de una célula diana (por ejemplo, un macrófago), que puede facilitar su absorción en la célula (por ejemplo, dentro de un orgánulo subcelular protegido que está libre de degradación metabólica). En una realización particular, el ligando dirigido es un ligando para un marcador/receptor de superficie celular. El ligando dirigido puede ser un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo inmunológicamente específico para un marcador de superficie celular (por ejemplo, proteína o carbohidrato) expresado preferencial o exclusivamente sobre el tejido o tipo de célula diana. El ligando de direccionamiento se puede ligar directamente al polímero o tensioactivo o mediante un ligador. Generalmente, el ligador es una fracción química que comprende un enlace covalente o una cadena de átomos que adhiere covalentemente el ligando al polímero o tensioactivo. El ligador se puede ligar a cualquier posición sintéticamente factible del ligando y el polímero o tensioactivo. Los ligadores de ejemplo pueden comprender al menos un grupo opcionalmente sustituido; saturado o insaturado; alifático lineal, ramificado o cíclico, un grupo alquilo o un grupo arilo opcionalmente sustituido. El ligador puede ser un alquilo inferior o alifático. El ligador también puede ser un polipéptido (por ejemplo, de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 aminoácidos, particularmente de aproximadamente 1 a aproximadamente 5). En una realización particular, la fracción de direccionamiento está ligada a uno o ambos extremos del polímero o tensioactivo. El ligador puede ser no degradable y puede ser un enlace covalente o cualquier otra estructura química que no pueda escindirse sustancialmente o escindirse en absoluto bajo entornos o condiciones fisiológicas.
Las nanopartículas/nanoformulaciones de la presente invención pueden comprender polímeros o tensioactivos dirigidos y/o no dirigidos. En una realización particular, la relación molar de polímeros o tensioactivos dirigidos y no dirigidos en las nanopartículas/nanoformulaciones de la presente invención es desde aproximadamente 0.001 a 100%, aproximadamente 1% a aproximadamente 99%, aproximadamente 5% a aproximadamente 95%, aproximadamente 10 % a aproximadamente 90 %, aproximadamente 25 % a aproximadamente 75 %, aproximadamente 30 % a aproximadamente 60 %, o aproximadamente 40 %. En una realización particular, la nanopartícula comprende sólo polímeros o tensioactivos dirigidos. En una realización particular, las nanopartículas/nanoformulaciones de la presente invención comprenden un polímero o tensioactivo dirigido a folato y una versión no dirigida del polímero o tensioactivo. En una realización particular, las nanopartículas/nanoformulaciones de la presente invención comprenden folato-poloxámero 407 (FA-P407) y/o poloxámero 407.
Ejemplos de ligandos dirigidos incluyen, pero no se limitan a, ligandos dirigidos a macrófagos, ligandos dirigidos a células T CD4+, ligandos dirigidos a células dendríticas y ligandos dirigidos a tumores. En una realización particular, el ligando dirigido a macrófagos es un ligando dirigido a macrófagos. Las nanoformulaciones dirigidas de la presente invención pueden comprender un ligando dirigido para dirigir las nanopartículas al tejido del VIH y a santuarios/depósitos celulares (por ejemplo, sistema nervioso central, tejidos linfoides asociados al intestino (GALT), células T CD4+, macrófagos, células dendríticas, etc.). Los ligandos dirigidos a macrófagos incluyen, sin limitación, ligandos del receptor de folato (por ejemplo, folato (ácido fólico) y anticuerpos del receptor de folato y fragmentos de los mismos (ver, por ejemplo, Sudimack et al. (2000) Adv. Drug Del. Rev., 41:147-162)), ligandos del receptor de manosa (por ejemplo, manosa), ligandos del receptor de péptido formilo (FPR) (por ejemplo, N-formil-Met-Leu-Phe (fMLF)) y tuftsina (el tetrapéptido Thr-Lys-Pro-Arg). Otros ligandos de direccionamiento incluyen, sin limitación, ácido hialurónico, gp120 y fragmentos de péptido de los mismos, y ligandos o anticuerpos específicos para CD4, CCR5, CXCR4, CD7, CD111, CD204, CD49a, CD29, CD19, CD20, CD22, CD171, CD33, Leis-Y, WT-1, ROR1, MUC16, MUC1, MUC4, receptor de estrógeno, receptores de transferrina, receptores de EGF (por ejemplo, HER2), receptor de folato, receptor de VEGF, receptor de FGF, receptor de andrógenos, NGR, Integrinas y GD2. En una realización particular, el ligando dirigido es ácido fólico.
Como se indicó anteriormente, las nanopartículas de la presente invención pueden comprender un agente terapéutico adicional. Los profármacos y/o nanopartículas para uso según se reivindica se pueden coadministrar con otro agente terapéutico. En una realización particular, el agente terapéutico es hidrófobo, un compuesto insoluble en agua o un compuesto poco soluble en agua, particularmente cuando se incluye en la nanopartícula. Por ejemplo, el agente terapéutico puede tener una solubilidad de menos de aproximadamente 10 mg/ml, menos de 1 mg/ml, más particularmente menos de aproximadamente 100 pg/ml y más particularmente menos de aproximadamente 25 pg/ml en agua o medios acuosos en un rango de pH de 0-14, preferiblemente entre pH 4 y 10, particularmente a 20 °C.
En una realización particular, el agente terapéutico es un antiviral o un antirretroviral. El antirretroviral puede ser eficaz contra o específico a los lentivirus. Los lentivirus incluyen, sin limitación, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) (por ejemplo, VIH-1, VIH-2), virus de la inmunodeficiencia bovina (BIV), virus de la inmunodeficiencia felina (FIV), virus de la inmunodeficiencia simia (SIV) y virus de la anemia infecciosa equina (EIA). En una realización particular, el agente terapéutico es un agente anti-VIH. Un compuesto anti-VIH o un agente anti-VIH es un compuesto que inhibe el VIH (por ejemplo, inhibe la replicación y/o la infección del VIH). Ejemplos de agentes anti-VIH incluyen, sin limitación:
(I) Inhibidores de la transcriptasa inversa análogos de nucleósidos (NRTI). Los NRTI se refieren a nucleósidos y nucleótidos y análogos de los mismos que inhiben la actividad de la transcriptasa inversa, particularmente la transcriptasa inversa del VIH-1. Los NRTi comprenden un azúcar y una base. Ejemplos de inhibidores de la transcriptasa inversa análogos de nucleósidos incluyen, sin limitación, adefovir dipivoxil, adefovir, lamivudina, telbivudina, entecavir, tenofovir, estavudina, abacavir, didanosina, emtricitabina, zalcitabina, y zidovudina.
(II) Inhibidores de la transcriptasa inversa no nucleósidos (NNRTI). Los NNRTI son inhibidores alostéricos que se unen de manera reversible a un sitio que no se une a un sustrato en la transcriptasa inversa, en particular la transcriptasa inversa del VIH, alterando de esta manera la conformación del sitio activo o bloqueando la actividad de la polimerasa. Los ejemplos de NNRTI incluyen, sin limitación, delavirdina (DLV, BHAP, U-90152; Rescriptor®), efavirenz (EFV, DMP-266, Su STIVA®), nevirapina (NVP, Viramune®), PNU-142721, capravirina (S-1153, AG-1549), emivirina (+)-calanolida A (NSC-675451) y B, etravirina (ETR, TMC-125, Intelence®), rilpivirna (RPV, TMC278, Edurant™), DAPY (TMC120), doravirina (Pifeltro™), BILR-355 BS, PHI-236 y PHI-443 (TMC-278).
(III) Inhibidores de proteasa (PI). Los inhibidores de proteasa son inhibidores de una proteasa viral, particularmente la proteasa del VIH-1. Ejemplos de inhibidores de proteasa incluyen, sin limitación, darunavir, amprenavir (141W94, AGENERASE®), tipranivir (PNU-140690, APTIVUS®), indinavir (MK-639; CRIXIVAN®), saquinavir (INVIRASE®, FORTOVASE®), fosamprenavir (LEXIVA®), lopinavir (ABT-378), ritonavir (ABT-538, NORVIR®), atazanavir (REYATAZ®), nelfinavir (AG-1343, VIRACEPT®), lasinavir (BMS-234475/CGP-61755), BMS-2322623, GW-640385X (VX-385), AG-001859, y SM-309515.
(IV) Inhibidores de fusión o entrada. Los inhibidores de fusión o entrada son compuestos, tales como los péptidos, que bloquean la entrada del VIH a una célula (por ejemplo, al unirse a la proteína de la envoltura del VIH y bloquear los cambios estructurales necesarios para que el virus se fusione con la célula huésped). Ejemplos de inhibidores de la fusión incluyen, sin limitación, antagonistas del receptor CCR5 (por ejemplo, maraviroc (Selzentry®, Celsentri)), enfuvirtida (INN, FUZEON®), T-20 (DP-178, FUZEON®) y T-1249.
(V) Inhibidores de la integrasa (además del profármaco de la presente invención). Los inhibidores de la integrasa son una clase de fármaco antirretroviral diseñado para bloquear la acción de la integrasa (por ejemplo, la integrasa del VIH), una enzima viral que inserta el genoma viral en el ADN de la célula huésped. Ejemplos de inhibidores de integrasa incluyen, sin limitación, raltegravir, elvitegravir, GSK1265744 (cabotegravir), GSK1349572 (dolutegravir), GS-9883 (bictegravir) y MK-2048.
Los compuestos anti-VIH también incluyen inhibidores de maduración (por ejemplo, bevirimat). Los inhibidores de maduración normalmente son compuestos que se unen a la mordaza de VIH e interrumpen su procesamiento durante la maduración del virus. Los compuestos anti-VIH también incluyen vacunas contra el VIH tales como, sin limitación, ALVAC® VIH (vCP1521), AIDSVa X®B/E (gp120), y combinaciones de las mismas. Los compuestos anti-VIH también incluyen anticuerpos contra el VIH (por ejemplo, anticuerpos contra gp120 o gp41), particularmente anticuerpos ampliamente neutralizantes.
Se puede utilizar más de un agente anti-VIH, particularmente cuando los agentes tienen diferentes mecanismos de acción (como se describió anteriormente). Por ejemplo, los agentes anti-VIH que no son NNRTI se pueden combinar con los profármacos NNRTI de la presente invención. En una realización particular, la terapia anti-VIH es una terapia antirretroviral altamente activa (HAART).
La presente invención abarca composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) que comprenden al menos un profármaco y/o nanopartícula de la presente invención y al menos un portador farmacéuticamente aceptable. Como se indicó anteriormente, la nanopartícula puede comprender más de un agente terapéutico. En una realización particular, la composición farmacéutica comprende una primera nanopartícula que comprende un primer profármaco y una segunda nanopartícula que comprende un segundo profármaco, en la que el primer y segundo profármaco son diferentes. En una realización particular, el primer profármaco es un profármaco de la presente invención y el segundo profármaco es un profármaco de un inhibidor de transcriptasa inversa no nucleósido (NNRTI), particularmente rilpivirina (RPV). Las composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) de la presente invención pueden comprender además otros agentes terapéuticos (por ejemplo, otros compuestos anti-VIH (por ejemplo, los descritos en el presente documento)).
La presente invención incluye los compuestos, nanopartículas y composiciones de los mismos para uso en métodos para prevenir, inhibir y/o tratar una enfermedad o trastorno. Los métodos comprenden administrar un profármaco y/o nanopartícula de la presente invención (opcionalmente en una composición) a un sujeto que lo necesite. En una realización particular, la enfermedad o trastorno es una infección viral (por ejemplo, retroviral). Ejemplos de infecciones virales incluyen, sin limitación: VIH, hepatitis B, hepatitis C y HTLV. En una realización particular, la infección viral es una infección retroviral o lentiviral, particularmente una infección por VIH (por ejemplo, VIH-1).
Los profármacos y/o nanopartículas de la presente invención (opcionalmente en una composición) se pueden administrar a un animal, en particular un mamífero, más particularmente un humano, para tratar/inhibir/prevenir la enfermedad o trastorno (por ejemplo, un virus retroviral tal como una infección por VIH). Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden comprender al menos un otro agente terapéutico tal como un agente antiviral, particularmente al menos un otro compuesto/agente anti-VIH. El compuesto anti-VIH adicional también se puede administrar en una composición farmacéutica separada de los profármacos o composiciones de la presente invención. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar al mismo tiempo o en diferentes tiempos (por ejemplo, secuencialmente).
Los rangos de dosificación para la administración de los profármacos, nanopartículas y/o composiciones de la invención son aquellos suficientemente grandes para producir el efecto deseado (por ejemplo, curar, aliviar, tratar y/o prevenir la enfermedad o trastorno (por ejemplo, infección por VIH), los síntomas del mismo (por ejemplo, SIDA, ARC) o la predisposición a padecerlo). En una realización particular, la composición farmacéutica de la presente invención se administra al sujeto en una cantidad de aproximadamente 5 pg/kg a aproximadamente 500 mg/kg. En una realización particular, la composición farmacéutica de la presente invención se administra al sujeto en una cantidad mayor de aproximadamente 5 pg/kg, mayor de aproximadamente 50 pg/kg, mayor de aproximadamente 0.1 mg/kg, mayor de aproximadamente 0.5 mg/kg, mayor de aproximadamente 1 mg/kg, o mayor que aproximadamente 5 mg/kg. En una realización particular, la composición farmacéutica de la presente invención se administra al sujeto en una cantidad desde aproximadamente 0.5 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, o aproximadamente 15 mg/kg. kg a aproximadamente 50 mg/kg. La dosificación no debe ser tan grande como para causar efectos secundarios adversos significativos, tales como reacciones cruzadas no deseadas, reacciones anafilácticas y similares. Generalmente, la dosificación variará con la edad, afección, sexo y grado de la enfermedad en el paciente y se puede determinar por un experto en la técnica. La dosificación se puede ajustar por el médico individual en caso de cualquier contraindicación.
Los profármacos y nanopartículas descritos en el presente documento generalmente se administrarán a un paciente como una composición farmacéutica. El término “paciente”, como se utiliza en el presente documento, se refiere a sujetos humanos o animales. Estos profármacos y nanopartículas se pueden emplear terapéuticamente, bajo la dirección de un médico.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden los profármacos y/o nanopartículas de la presente invención se pueden formular convenientemente para administración con cualesquier portador(es) farmacéuticamente aceptable(s). Por ejemplo, los complejos se pueden formular con un medio aceptable tal como agua, solución salina tamponada, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido y similares), sulfóxido de dimetilo (DMSO), aceites, detergentes, agentes de suspensión, o mezclas adecuadas de los mismos, particularmente una solución acuosa. La concentración de los profármacos y/o nanopartículas en el medio elegido se puede variar y el medio se puede elegir en base a la ruta de administración deseada de la composición farmacéutica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con las nanopartículas que se van a administrar, se contempla su uso en la composición farmacéutica.
La dosis y el régimen de dosificación de profármacos y/o nanopartículas de acuerdo con la invención que son adecuados para la administración a un paciente particular se pueden determinar por un médico teniendo en cuenta la edad, sexo, peso, condición médica general y condición específica del paciente al que se le van a administrar las nanopartículas y la gravedad de las mismas. El médico también puede tener en cuenta la ruta de administración, el portador farmacéutico y la actividad biológica de la nanopartícula.
La selección de una composición farmacéutica adecuada dependerá también del modo de administración elegido. Por ejemplo, las nanopartículas de la invención se pueden administrar mediante inyección directa o por vía intravenosa. En este caso, una composición farmacéutica comprende el profármaco y/o la nanopartícula dispersada en un medio que es compatible con el sitio de inyección.
Los profármacos y/o nanopartículas de la presente invención se pueden administrar mediante cualquier método. Por ejemplo, los profármacos y/o nanopartículas de la presente invención se pueden administrar, sin limitación, por vía parenteral, subcutánea, oral, tópica, pulmonar, rectal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intratecal, intracerbral, epidural, intramuscular, intradérmica o intracarótida. En una realización particular, el profármaco y/o nanopartícula se administra por vía parenteral. En una realización particular, el profármaco y/o nanopartícula se administra por vía oral, intramuscular, subcutánea o al torrente sanguíneo (por ejemplo, por vía intravenosa). En una realización particular, el profármaco y/o nanopartícula se administra por vía intramuscular o subcutánea. Las composiciones farmacéuticas para inyección son conocidas en la técnica. Si se selecciona la inyección como método para administrar el profármaco y/o nanopartícula, se deben tomar medidas para garantizar que cantidades suficientes de moléculas o células lleguen a sus células diana para ejercer un efecto biológico. Las formas de dosificación para administración oral incluyen, sin limitación, comprimidos (por ejemplo, recubiertas y no recubiertas, masticables), cápsulas de gelatina (por ejemplo, blandas o duras), pastillas, trociscos, soluciones, emulsiones, suspensiones, jarabes, elixires, polvos/gránulos (por ejemplo, reconstituibles o dispersables) chicles y comprimidos efervescentes. Las formas de dosificación para administración parenteral incluyen, sin limitación, soluciones, emulsiones, suspensiones, dispersiones y polvos/gránulos para reconstitución. Las formas de dosificación para administración tópica incluyen, sin limitación, cremas, geles, pomadas, ungüentos, parches y sistemas de suministro transdérmico.
Las composiciones farmacéuticas que contienen un profármaco y/o nanopartícula de la presente invención como ingrediente activo en mezcla íntima con un portador farmacéuticamente aceptable se pueden preparar de acuerdo con las técnicas de composición farmacéutica convencionales. El portador puede adoptar una amplia variedad de formas dependiendo de la forma de composición farmacéutica deseada para la administración, por ejemplo, intravenosa, oral, inyección directa, intracraneal e intravítrea.
Una composición farmacéutica de la invención se puede formular en forma de dosificación unitaria para facilitar la administración y uniformidad de dosificación. La forma de dosificación unitaria, como se utiliza en el presente documento, se refiere a una unidad físicamente discreta de la composición farmacéutica apropiada para el paciente sometido a tratamiento. Cada dosificación debe contener una cantidad de ingrediente activo calculada para producir el efecto deseado en asociación con el portador farmacéutico seleccionado. Aquellos expertos en la técnica conocen bien los procedimientos para determinar la unidad de dosificación apropiada. En una realización particular, los profármacos y/o nanopartículas de la presente invención, debido a su efecto terapéutico de acción prolongada, se pueden administrar una vez cada 1 a 12 meses o incluso con menos frecuencia. Por ejemplo, las nanoformulaciones de la presente invención se pueden administrar una vez cada 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 18, 21, 24 o más. meses. En una realización particular, los profármacos y/o nanopartículas de la presente invención se administran menos de una vez cada dos meses. En una realización particular, los profármacos y/o nanoformulaciones de los profármacos se administran una vez cada mes, una vez cada dos meses, particularmente una vez cada tres meses, una vez cada cuatro meses, una vez cada cinco meses, una vez cada seis meses, una vez cada siete meses, una vez cada ocho meses, una vez cada nueve meses, una vez cada diez meses, una vez cada once meses, una vez cada doce meses, o con menor frecuencia.
Las unidades de dosificación se pueden incrementar o reducir proporcionalmente según el peso del paciente. Las concentraciones apropiadas para el alivio de una afección patológica particular se pueden determinar mediante cálculos de la curva de concentración de dosificación, como se conoce en la técnica.
De acuerdo con la presente invención, la unidad de dosificación apropiada para la administración de nanopartículas se puede determinar al evaluar la toxicidad de las moléculas o células en modelos animales. Se pueden administrar a ratones diversas concentraciones de nanopartículas en una composición farmacéutica, y las dosificaciones mínima y máxima se pueden determinar en base a los resultados beneficiosos y los efectos secundarios observados como resultado del tratamiento. La unidad de dosificación adecuada también se puede determinar al evaluar la eficacia del tratamiento con nanopartículas en combinación con otros fármacos estándar. Las unidades de dosificación de nanopartículas se podrán determinar individualmente o en combinación con cada tratamiento de acuerdo con el efecto detectado.
La composición farmacéutica que comprende las nanopartículas se puede administrar a intervalos apropiados hasta que los síntomas patológicos se reduzcan o alivien, después de lo cual la dosificación se puede reducir a un nivel de mantenimiento. El intervalo apropiado en un caso particular normalmente dependería de la afección del paciente.
La presente invención abarca métodos para tratar una enfermedad/trastorno que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una composición farmacéutica que comprende un profármaco y/o nanopartícula de la presente invención y, preferiblemente, al menos un portador farmacéuticamente aceptable. La presente invención también abarca métodos en los que el sujeto se trata mediante terapiaex vivo.En particular, el método comprende eliminar células del sujeto, exponer/poner en contacto las célulasin vitroa las nanopartículas de la presente invención, y devolver las células al sujeto. En una realización particular, las células comprenden macrófagos. Se pueden combinar otros métodos para tratar la enfermedad o trastorno con los métodos de la presente invención y se pueden coadministrar con las composiciones farmacéuticas de la presente invención.
La presente también abarca el suministro de la nanopartícula de la presente invención a una célulain vitro(por ejemplo, en cultivo). La nanopartícula se puede suministrar a la célula en al menos un portador.
Definiciones
Las siguientes definiciones se proporcionan para facilitar la comprensión de la presente invención.
Las formas singulares “un”, “una” y “el” incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
“Farmacéuticamente aceptable” indica la aprobación por parte de una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerada en la Farmacopea de EE.UU. u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales, y más particularmente en humanos.
Un “portador” se refiere, por ejemplo, a un diluyente, adyuvante, conservante (por ejemplo, timersol, alcohol bencílico), antioxidante (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio), solubilizante (por ejemplo, polisorbato 80), emulsionante, tampón (por ejemplo, Tris HCl, acetato, fosfato), antimicrobiano, sustancia formadora de volumen (por ejemplo, lactosa, manitol), excipiente, agente auxiliar o vehículo con el que se administra un agente activo de la presente invención. Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, que incluyen aquellos de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético. Preferiblemente se emplean como portadores agua o soluciones salinas acuosas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol, particularmente para soluciones inyectables. Los portadores farmacéuticos adecuados se describen en “Remington's Pharmaceutical Sciences” by E.W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, PA); Gennaro, A. R., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (Lippincott, Williams and Wilkins); Liberman, et al., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y; and Kibbe, et al., Eds., Handbook of Pharmaceutical Excipients, American Pharmaceutical Association, Washington.
El término “tratar” como se utiliza en el presente documento se refiere a cualquier tipo de tratamiento que imparta un beneficio a un paciente aquejado de una enfermedad, que incluye la mejora en la afección del paciente (por ejemplo, en uno o más síntomas), retraso en la progresión de la afección, etc. En una realización particular, el tratamiento de una infección retroviral da como resultado al menos una inhibición/reducción en el número de células infectadas y/o niveles virales detectables.
Como se utiliza en el presente documento, el término “prevenir” se refiere al tratamiento profiláctico de un sujeto que está en riesgo de desarrollar una afección (por ejemplo, infección por VIH) dando como resultado una disminución en la probabilidad de que el sujeto desarrolle la afección.
Una “cantidad terapéuticamente eficaz” de un compuesto o una composición farmacéutica se refiere a una cantidad eficaz para prevenir, inhibir, tratar o disminuir los síntomas de un trastorno o enfermedad particular. El tratamiento de una infección microbiana (por ejemplo, infección por VIH) en el presente documento se puede referir a curar, aliviar y/o prevenir la infección microbiana, el(los) síntoma(s) de la misma o la predisposición hacia esta.
Como se utiliza en el presente documento, el término “agente terapéutico” se refiere a un compuesto químico o molécula biológica que incluye, sin limitación, ácidos nucleicos, péptidos, proteínas y anticuerpos que se pueden utilizar para tratar una afección, enfermedad o trastorno o reducir los síntomas de la afección, enfermedad o trastorno.
Como se utiliza en el presente documento, el término “molécula pequeña” se refiere a una sustancia o compuesto que tiene un peso molecular relativamente bajo (por ejemplo, menor de 4,000, menor de 2,000, particularmente menos de 1 kDa u 800 Da). Normalmente, las moléculas pequeñas son orgánicas, pero no son proteínas, polipéptidos ni ácidos nucleicos, aunque pueden ser aminoácidos o dipéptidos.
El término “antimicrobianos” como se utiliza en el presente documento indica una sustancia que mata o inhibe el crecimiento de microorganismos tales como bacterias, hongos, virus o protozoos.
Como se utiliza en el presente documento, el término “antiviral” se refiere a una sustancia que destruye un virus y/o suprime la replicación (reproducción) del virus. Por ejemplo, un antiviral puede inhibir o prevenir: producción de partículas virales, maduración de partículas virales, adhesión viral, absorción viral en las células, ensamble viral, liberación/gemación viral, integración viral, etc.
Como se utiliza en el presente documento, el término “terapia antirretroviral altamente activa” (HAART) se refiere a la terapia contra el VIH con diversas combinaciones de agentes terapéuticos tales como inhibidores de la transcriptasa inversa nucleósidos, inhibidores de la transcriptasa inversa no nucleósidos, inhibidores de la proteasa del VIH e inhibidores de fusión.
Como se utiliza en el presente documento, el término “anfifílico” significa la capacidad de disolverse tanto en agua como en lípidos/entornos apolares. Normalmente, un compuesto anfifílico comprende una porción hidrófila y una porción hidrófoba. “Hidrófobo” designa una preferencia por entornos apolares (por ejemplo, una sustancia o fracción hidrófoba se disuelve o se humedece más fácilmente con solventes no polares, tales como hidrocarburos, que con agua). Los compuestos “hidrófobos” son, en su mayor parte, insolubles en agua. Como se utiliza en el presente documento, el término “hidrófilo” significa la capacidad de disolverse en agua.
Como se utiliza en el presente documento, el término “polímero” denota moléculas formadas a partir de la unión química de dos o más unidades o monómeros de repetición. El término “copolímero de bloque” se refiere más simplemente a conjugados de al menos dos segmentos poliméricos diferentes, en los que cada segmento polimérico comprende dos o más unidades adyacentes del mismo tipo.
Un “anticuerpo” o “molécula de anticuerpo” es cualquier inmunoglobulina, que incluye anticuerpos y fragmentos de la misma (por ejemplo, scFv), que se une a un antígeno específico. Como se utiliza en el presente documento, anticuerpo o molécula de anticuerpo contempla moléculas de inmunoglobulina intactas, porciones inmunológicamente activas de una molécula de inmunoglobulina y fusiones de porciones inmunológicamente activas de una molécula de inmunoglobulina.
Como se utiliza en el presente documento, el término “ inmunológicamente específico” se refiere a proteínas/polipéptidos, particularmente anticuerpos, que se unen a uno o más epítopos de una proteína o compuesto de interés, pero que no reconocen ni se unen sustancialmente a otras moléculas en una muestra que contiene una población mezclada de moléculas biológicas antigénicas.
Como se utiliza en el presente documento, el término “ ligando dirigido” se refiere a cualquier compuesto que se une específicamente a un tipo específico de tejido o tipo de célula, particularmente sin unirse sustancialmente a otros tipos de tejidos o tipos de células. Ejemplos de ligandos dirigidos incluyen, sin limitación: proteínas, polipéptidos, péptidos, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, hormonas, ligandos, carbohidratos, esteroides, moléculas de ácido nucleico y polinucleótidos.
El término “alifático” se refiere a una fracción basada en hidrocarburos no aromáticos. Los compuestos alifáticos pueden ser fracciones acíclicas (por ejemplo, lineales o ramificadas) o cíclicas (por ejemplo, cicloalquilo) y pueden ser saturados o insaturados (por ejemplo, alquilo, alquenilo y alquinilo). Los compuestos alifáticos pueden comprender una cadena principal mayoritariamente de carbono (por ejemplo, de 1 a aproximadamente 30 carbonos) y comprender heteroátomos y/o sustituyentes (ver más abajo). El término “alquilo”, como se emplea en el presente documento, incluye hidrocarburos de cadena lineal o ramificada, saturados o insaturados, que contienen de 1 a aproximadamente 30 carbonos en la cadena normal/principal. La cadena de hidrocarburos de los grupos alquilo se puede interrumpir con uno o más heteroátomos (por ejemplo, oxígeno, nitrógeno o azufre). Un alquilo (o alifático) se puede sustituir opcionalmente (por ejemplo, con menos de aproximadamente 8, menos de aproximadamente 6 o de 1 a aproximadamente 4 sustituyentes). El término “alquilo inferior” o “alifático inferior” se refiere a un alquilo o alifático, respectivamente, que contiene de 1 a 3 carbonos en la cadena de hidrocarburos. Los sustituyentes alquilo o alifáticos incluyen, sin limitación, alquilo (por ejemplo, alquilo inferior), alquenilo, halo (tal como F, Cl, Br, 1), haloalquilo (por ejemplo, CCh o CF<3>), alcoxilo, alquiltio, hidroxi, metoxi, carboxilo, oxo, epoxi, alquiloxicarbonilo, alquilcarboniloxi, amino, carbamoilo (por ejemplo, NH<2>C(=O)- o NHRC(=O)-, en el que R es un alquilo), urea (-NHCONH<2>), alquilurea, arilo, éter, éster, tioéster, nitrilo, nitro, amida, carbonilo, carboxilato y tiol. Los grupos alifáticos y alquilo que tienen al menos aproximadamente 5 carbonos en la cadena principal son generalmente hidrófobos y carecen de sustituciones extensas con sustituyentes hidrófilos.
El término “arilo”, como se emplea en el presente documento, se refiere a grupos aromáticos monocíclicos y bicíclicos que contienen de 6 a 10 carbonos en la porción del anillo. Ejemplos de grupos arilo incluyen, sin limitación, fenilo o naftilo, tal como 1-naftilo y 2-naftilo, o indenilo. Los grupos arilo pueden incluir opcionalmente de uno a tres anillos adicionales fusionados a un anillo cicloalquilo o un anillo heterocíclico. Los grupos arilo pueden estar opcionalmente sustituidos a través de átomos de carbono disponibles con, por ejemplo, 1,2 o 3 grupos seleccionados de hidrógeno, halo, alquilo, polihaloalquilo, alcoxi, alquenilo, trifluorometilo, trifluorometoxi, alquinilo, arilo, heterociclo, aralquilo, ariloxi, ariloxialquilo, aralcoxi, ariltio, arilazo, heterociclooxi, hidroxi, nitro, ciano, anión sulfonilo, amino o amino sustituido. El grupo arilo puede ser un heteroarilo. “Heteroarilo” se refiere a un sistema de anillo aromático mono, di, tri u otro multicíclico opcionalmente sustituido que incluye al menos uno, y preferiblemente desde 1 a aproximadamente 4, miembros de anillo de heteroátomo de azufre, oxígeno o nitrógeno. Los grupos heteroarilo pueden tener, por ejemplo, desde aproximadamente 3 a aproximadamente 50 átomos de carbono (y todas las combinaciones y subcombinaciones de rangos y números específicos de átomos de carbono en los mismos), se prefiere desde aproximadamente 4 a aproximadamente 10 carbonos.
Los siguientes ejemplos proporcionan métodos ilustrativos para poner en práctica la presente invención y no pretenden limitar el alcance de la invención de ninguna manera.
Cualquiera de los siguientes ejemplos que no entren dentro del alcance de las reivindicaciones no forman parte de la invención pero se proporcionan solo con fines comparativos.
Ejemplo 1
La reducción máxima del VIH-1 residual de sus sitios santuario de tejidos que incluyen el cerebro, los ganglios linfáticos, la médula ósea, el tejido linfoide asociado al intestino y los tractos genitales se puede lograr mediante el desarrollo de fármacos dirigidos a reservorios de acción prolongada. Además del beneficio de los intervalos de dosificación poco frecuentes, se pueden diseñar formulaciones de fármacos inyectables de acción prolongada para utilizar procesos mediados por receptores para lograr un mejor direccionamiento celular, una vida media prolongada del fármaco y una biodistribución de tejido mejorada. CAB es un potente inhibidor de integrasa viral y se ha formulado como LAP (CAB-LAP) que demuestra niveles sostenidos del fármaco en plasma en humanos después de una dosis intramuscular única. Las nanoformulaciones inyectables de acción prolongada de rilpivirina y CAB-LAP ya han permitido la inyección mensual para la supresión y prevención del VIH (Andrews, et al. (2014) Science 343(6175):1151-1154; Cohen, J. (2014) Science 343(6175):1067; Spreen, et al. (2013) Curr. Opin. HIV AIDS, 8(6):565-571). Las principales limitaciones de las nanoformulaciones existentes incluyen la necesidad de dosis elevadas y volúmenes de inyección elevados. Con este fin, se han desarrollado terapias antirretrovirales de liberación lenta y eficaz con acción prolongada (LASER ART) al sintetizar nanocristales de profármacos lipófilos e hidrófobos que permiten una rápida penetración del fármaco a través de barreras fisiológicas. LASER ART maximiza la carga de fármacos con un uso limitado de excipientes, manteniendo al mismo tiempo la escalabilidad y el almacenamiento a largo plazo. Se han formulado profármacos miristoilados con tensioactivos de poloxámero. Se demostró una potencia aumentada, biodisponibilidad y distribución de tejido de CAB al aumentar la lipofilicidad del fármaco que mantuvo las concentraciones plasmáticas de CAB en el PA-IC<90>durante 4 meses en macacos rhesus después de una única inyección intramuscular equivalente a 45 mg/kg de CAB. En el presente documento se han sintetizado mayores profármacos y nanoformulaciones que reducen la frecuencia de dosificación y al mismo tiempo aumentan el direccionamiento del reservorio viral y la actividad del fármaco.
En el presente documento se proporciona un profármaco de éster potente de CAB que tiene propiedades fisicoquímicas que permiten el uso de una formulación LASER ART para administración poco frecuente, tal como una vez cada seis a doce meses en intervalos de dosificación o incluso con menos frecuencia. Los criterios evaluados para seleccionar un candidato óptimo a profármaco CAB incluyeron la potencia del fármaco, perfil de lipofilicidad y, eficiencia de conversiónin vivoa<c>A<b>con circulación sistémica mínima del profármaco y concentraciones sostenidas de CAB cuatro veces por encima del PA-IC<90>durante períodos de seis meses o más después de una única inyección intramuscular de la formulación del profármaco. Sorprendentemente, la presente invención ha demostrado que la variación en la longitud de la cadena de hidrocarburos del profármaco de éster graso aumenta espectacularmente la liberación y retención del fármaco activo. Esto culminó en la identificación de M2CAB, un profármaco de éster graso de 18 carbonos de CAB, con una cinética de liberación controlada de CAB inesperadamente superior en comparación con MCAB u otras longitudes de cadena de hidrocarburos de ácidos grasos.
Los profármacos de la presente invención son derivados de un inhibidor de integrasa tal como CAB conjugado con fracciones escindibles hidrófobas. Por tanto, el compuesto original hidrófobo se convierte en un derivado éster más hidrófobo. Esto se logra mediante la unión de una fracción de ácido graso que puede aumentar la unión a proteínas y la biodisponibilidad del fármaco. El enlace éster entre el inhibidor de integrasa (por ejemplo, CAB) y las fracciones derivatizantes es propenso a la escisión enzimática o hidrolítica. El mecanismo de liberación del fármaco a partir de la partícula implica la disolución del profármaco del excipiente seguida de una degradación eficaz del éster para generar el compuesto original activo. El NM2CAB desarrollado mejoró significativamente la absorción de fármacos mediante los MDM con una retención sostenida del fármaco durante un período de observación de 30 días; mientras que las formulaciones de NCAB o NMCAB se eliminaron de los macrófagos después de un solo día o 20 días de tratamiento, respectivamente. De manera similar, el MDM tratado con NM2CAB exhibió actividades antirretrovirales mejoradas y sostenidas en comparación con NCAB o NMCAB cuando se inocularon con VIH-1 durante hasta 30 días después del tratamiento con un único fármaco. No se detectó VIH-1 p24 en el grupo tratado con NM2CAB en ninguno de estos puntos de tiempo. Los beneficios del sistema incluyen una biodisponibilidad del fármaco inesperadamente mejorada y una vida media más prolongada. Las concentraciones prolongadas de CAB en plasma y tejido de NM2CAB demuestran que se puede lograr un intervalo de dosificación eficaz una vez cada seis meses.
Síntesis de M2CAB
La síntesis de los profármacos M2CAB se realizó como se muestra:
Brevemente, la preparación del profármaco M2CAB se realizó mediante: 1) desprotonación del grupo funcional fenol con una base adecuada tal como N,N-diisopropiletilamina; y 2) reacción ya sea con cloruro de acilo o ácido carboxílico activado del ácido graso de alquilo.
Ambas etapas 1 y 2 se realizaron en un solo recipiente. Específicamente, el grupo hidroxilo se desprotonó utilizando el reactivo apropiado. Luego, el anión alcohol se acopló con el cloruro de acilo graso o el ácido carboxílico activado para generar los profármacos. Ejemplos de reactivos de acoplamiento que se pueden utilizar para activar el ácido carboxílico incluyen, sin limitación, sales de uranio, reactivos de carbodiimida y sales de fosfonio. Un ejemplo de base que se puede utilizar en la reacción de acoplamiento es, sin limitación, N,N diisopropiletilamina (DI<e>A). Ejemplos de solventes apróticos polares que se pueden utilizar incluyen, sin limitación, N,N-dimetilformamida (DMF), tetrahidrofurano (THF) y acetonitrilo. Los reactivos se mezclaron a 0 °C y se calentaron gradualmente hasta alcanzar la temperatura durante 12-24 horas. Los compuestos finales se purificaron mediante cromatografía en una columna de sílice y se caracterizaron mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear y cromatografía líquida de alta resolución en tándem con espectrometría de masas.
Desprotonación del grupo hidroxilo y acoplamiento a ácido graso
Se enfrió una solución de CAB (2 g, 4.93 mmol, 1.0 equiv.) en dimetilformamida anhidra (20 ml) a 0 °C bajo argón. Luego se agregó gota a gota N,N diisopropiletilamina (1.7 ml, 9.86 mmol, 2.0 equiv.) a la solución preenfriada del fármaco. Después se agregó cloruro de estearoilo (3.3 ml, 9.86 mmol, 2.0 equiv.) a la solución de fenol desprotonado. La mezcla se calentó gradualmente hasta temperatura ambiente bajo agitación durante 16 horas, se concentró y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida eluyendo con EtOAc/Hex del 80 al 90 % para dar el profármaco con un rendimiento químico del 90 %. El espectro de 1H-RMN de M2CAB que muestra la presencia de un pico amplio a 1,20 1.50 ppm y los correspondientes a los protones alifáticos en la fracción de ácido graso.
Síntesis de formulación
Los nanocristales de M2CAB se recubrieron con poloxámero 407 (P407), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[carboxi(polietilenglicol)-2000 (DSPE-PEG) y/o alcohol polivinílico (PVA). Los nanocristales también se pueden estabilizar con tensioactivos de polisorbato y polietilenglicol. En base a los datos de espectroscopía de RMN de protones, se utilizó una relación de fármaco a tensioactivo de 100:6 en peso para fabricar M2CAB, MCAB y CAB nanoformulados. Brevemente, se mezclaron 1-5% (p/v) de M2CAB, MCAB o CAB y 0.06-0.3 % (p/v) de P407 en agua libre de endotoxinas. Las suspensiones premezcladas se formularon mediante molienda en húmedo u homogeneización a alta presión a 1.38*108 presión Pa (20000 psi) hasta alcanzar el tamaño y el índice de polidispersidad (PDI) deseables. Las nanoformulaciones se caracterizaron por el tamaño de partícula, índice de polidispersidad (PDI) y potencial zeta mediante dispersión dinámica de luz (Figura 1). Esto se hizo utilizando un Malvern Zetasizer, Nano Series Nano-ZS (Malvern Instruments Inc, Westborough, MA). La morfología de las nanopartículas se determinó mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). Se utilizó UPLC MS/MS para la cuantificación del fármaco.
Absorción y retención de macrófagos.
Los monocitos humanos se obtuvieron mediante leucoféresis de donantes seronegativos para VIH-1/2 y hepatitis B y luego se purificaron mediante elutriación centrífuga a contracorriente (Balkundi et al., Intl. J. Nanomed. (2011) 6:3393-3404; Nowacek et al., Nanomed. (2009) 4(8):903-917). Los monocitos humanos se sembraron en una placa de 12 pocillos a una densidad de 1.0 * 106 células por pocillo utilizando DMEM suplementado con suero humano combinado inactivado por calor al 10 %, glutamina al 1 %, 10 ^g/ml de ciprofloxacina y 50 ^g/ml de gentamicina. Las células se mantuvieron a 37 °C en una incubadora de CO2al 5 %. Después de 7-10 días de diferenciación en presencia de 1000 U/ml de factor estimulante de colonias de macrófagos humanos (MCSF) recombinante, los MDM se trataron con una variedad de nanoformulaciones y fármacos nativos. La absorción del fármaco se evaluó mediante mediciones de las concentraciones intracelulares del fármaco en varios puntos de tiempo después del tratamiento. Para los estudios de retención de fármacos, las células se trataron durante 8 horas, luego se lavaron con PBS y se mantuvieron con cambios de semimedio cada dos días hasta su recolección en los puntos de tiempo indicados. Para ambos estudios, los MDM adherentes se lavaron con PBS (3 x 1 ml), luego se rasparon en 1 ml de PBS fresco y se contaron en los puntos de tiempo indicados utilizando un contador de células automatizado Countess™ (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las células se sedimentaron mediante centrifugación a 950 x g durante 8 minutos a 4 °C. El sedimento celular se reconstituyó en 200 pl de metanol de calidad cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y la sonda se sonicó, seguido de una centrifugación a 20,000 x g durante 20 minutos. Se analizó el contenido de fármaco del sobrenadante utilizando HPLC.
Como se ve en la Figura 2A, el MDM adoptó NM2CAB a niveles estadísticamente más altos que NMCAB. Más aún, MDM retuvo NM2CAB en niveles estadísticamente más altos durante períodos de tiempo más largos que NMCAB (Figura 2A).
Actividades antirretrovirales
La eficacia antirretroviral se determinó mediante mediciones de la actividad de la transcriptasa inversa (RT) del VIH (Figura 2B y 2C). Para evaluar la eficacia antirretroviral, los MDM se trataron con CAB-LAP, NMCAB o NM2CAB 100 pM durante 8 horas. Después del tratamiento, las células se lavaron con PBS para eliminar el exceso de fármaco libre y nanopartículas y las células se cultivaron con medio fresco, con intercambios de semimedio cada dos días. Los MDM se inocularon con VIH-1<ada>a una MOI de 0.01 partículas virales/célula infecciosas durante un máximo de 30 días. La producción de viriones de progenie se midió mediante la actividad RT en medio de cultivo (Kalter, et al. (1992) J. Clin. Microbiol., 30(4):993-995). Se evaluó la expresión del antígeno de la proteína p24 del VIH-1 (Guo, et al. (2014) J. Virol., 88(17):9504-9513). Los MDM se lavaron con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las células se bloquearon utilizando BSA al 10 % que contenía Triton X-100 al 1 % en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después del bloqueo, las células se incubaron con anticuerpos monoclonales de ratón VIH-1 p24 (1:50; Dako, Carpinteria, CA, EE.UU.) durante la noche a 4 °C, seguido de una incubación de 1 hora a temperatura ambiente. Se agregó anticuerpo secundario anti-ratón de polímero marcado con HRP (Dako EnVision® System) (una gota/pocillo). Se agregó hematoxilina para contrateñir los núcleos y las imágenes se capturaron utilizando un microscopio Nikon TE300 con un objetivo de 20X. Como se ve en las Figuras 2B y 2C, se observó una eficacia antirretroviral inesperadamente superior para M2CAB nanoformulado en comparación con CAB o MCAB nanoformulado.
Farmacocinética/estudio de biodistribución
A ratones NSG hembra se les administró una única dosis IM de equivalente de 45 mg/kg de CAB de NM2CAB, NMCAB o NCAB. Los niveles de fármaco en plasma y tejidos se ensayaron mediante UPLC-MS/MS. Los niveles de fármaco en plasma se monitorizaron semanalmente. Una única inyección IM de NM2CAB demuestra una cinética de liberación controlada de orden cero de CAB activo que permanece cuatro veces por encima del PA-IC<90>en comparación con NMCAB o NCAB (Fig. 3). El día 364 después de la inyección, los niveles plasmáticos de CAB eran de 345.2 ng/ml para NM2CAB, 8.5 ng/ml para NMCAB y valores indetectables para NCAB (límite de detección de 0.5 ng/ml).
A los ratones también se les administró una dosis única IM de equivalente de 45 mg/kg de CAB de NM3CAB (C22). Los niveles de fármaco en plasma se monitorizaron semanalmente. El día 28 después de la inyección, los niveles plasmáticos de CAB eran de 233.2 ng/ml (Fig. 3B). De acuerdo con lo anterior, está claro que NM2CAB (C18) fue estadísticamente superior al NMCAB más corto (C14) y al NM3CAB más largo (C22) para mantener la liberación efectiva del fármaco a largo plazo.
La hidrofobicidad de CAB mejoró enormemente tras la derivatización en profármaco M2CAB. La hidrofobicidad mejorada de M2CAB facilitó la producción de formulaciones estables con alta capacidad de carga de fármaco. Más aún, la conversión de CAB en M2CAB, más hidrófobo, y la formación de nanopartículas mejoraron significativamente la acumulación intracelular del fármaco en comparación con CAB o MCAB nanoformulados. También se observaron mejoras significativas en la retención de MDM y la eficacia antirretroviral para el M2CAB nanoformulado en comparación con el CAB o MCAB nanoformulado. Una única inyección IM de NM2CAB a 45 mg equivalentes/kg de CAB en ratones NSG hembra también demostró inesperadamente concentraciones plasmáticas de CAB cuatro veces superiores a la PA-IC<90>durante más de cinco meses, lo que es significativamente mayor que el CAB o MCAB nanoformulado.
Ejemplo 2
Los regímenes terapéuticos actuales con fármacos antirretrovirales (ARV) son potentes y bien tolerados, lo que permite una supresión sostenida y de por vida del virus de la inmunodeficiencia humana tipo uno (VIH-1) (Fauci et al., JAMA (2019) 321:844-845). Sin embargo, dicho control de la replicación viral debe estar ligado a la adherencia al régimen, que a su vez se ve afectada por la comorbilidad concurrente, el estigma social, el comportamiento, el uso concurrente de fármacos ilícitos y el coste (Fauci et al., JAMA (2019) 321:844-845). No obstante, incluso la adherencia estricta de la dosificación diaria comúnmente conduce a toxicidades farmacológicas, interacciones fármaco-fármaco y la aparición de resistencia viral a fármacos. Todos los regímenes farmacológicos impiden la eliminación viral (Dash, et al., Nat. Commun (2019) 10:2753). Esto pone de relieve el hecho de que todas las terapias requieren una adherencia de por vida para mantener la supresión del VIH-1 y mitigar la enfermedad. Esto ha llevado a los científicos a desarrollar enfoques terapéuticos de acción prolongada (LA). Todos se centran en mejorar la adherencia al régimen y la potencia del fármaco (Gendelman et al., Trends Microbiol. (2019) 27:593-606). Los dos más activos y aquellos que se acercan a la aprobación clínica de la Administración de Alimentos y Fármacos de EE. UU. son los inyectables LA ARV, mientras que los dispositivos farmacológicos implantables siguen en desarrollo (Margolis, et al., Lancet (2017) 390:1499-1510; Taylor, et al., Topics Antiviral Med. (2019) 27:50-68).
Los estudios realizados hasta la fecha han resultado muy prometedores para el LA inyectable para un uso humano generalizado (Margolis, et al., Lancet (2017) 390:1499-1510; Taylor, et al., Topics Antiviral Med. (2019) 27:50-68; Kerrigan, et al., PloS One (2018) 13:e0190487). Como resultado, las nanoformulaciones inyectables LA de Cabotegravir (CAB) y rilpivirina (RPV) como una combinación de dos fármacos en recibirán aprobación para administración mensual probablemente a finales de 2019 (Margolis, et al., Lancet (2017) 390:1499-1510; Taylor, et al., Topics Antiviral Med. (2019) 27:50-68; Kerrigan, et al., PloS One (2018) 13:e0190487). La “Terapia antirretroviral como supresión de acción prolongada” (ATLAS) y el “Primer régimen inyectable de acción prolongada” (FLAIR) demostraron seguridad, eficacia y tolerabilidad prometedoras (Taylor, et al., Temas Antiviral Med. (2019) 27:50-68). El tratamiento combinado afirmó la no inferioridad cuando se comparó el tratamiento con regímenes orales estándar de tres fármacos (Taylor, et al., Topics Antiviral Med. (2019) 27:50-68). Asimismo, los implantes de fármacos también se han mostrado prometedores (Kovarova, et al., Nat. Commun. (2018) 9:4156; Gunawardana, et al., Antimicrob. Agents Chemother. (2015) 59:3913-3919; Flexner, C., Curr. Opin. HIV AIDS (2018) 13:374-380; Barrett, et al., Antimicrob. Agents Chemother. (2018) 62(10):e01058-18.). Sin embargo, abundan las limitaciones para ambos enfoques, que incluyen reacciones en el sitio de la inyección, grandes volúmenes de inyección, frecuencia de dosificación y penetrancia limitada en los reservorios virales (Margolis, et al., Lancet (2017) 390:1499-1510; Markowitz, et al., Lancet HIV (2017) 4:e331-e340; Zhou, et al., Biomaterials (2018) 151:53-65). Más aún, estos enfoques terapéuticos más nuevos requieren servicios profesionales de atención médica frecuentes, ya sea al proporcionar las propias inyecciones o realizar inserciones y extracciones de implantes. Las mediciones de los niveles de fármaco en tejido y plasma correlacionan la eficacia de LA ARV, que incluye la penetrancia del fármaco en las mucosas, los tejidos linfoides y el sistema nervioso central, así como la seguridad a largo plazo. En base al alcance de estas incógnitas, subsiste la necesidad inmediata de realizar más mejoras en los regímenes LA ARV. Cualquier LA ARV futuro se deberá administra en volúmenes reducidos sin toxicidad sistémica. Si se logran, los regímenes ARV también podrían comportarse de manera que reflejen un mimético de la vacuna ARV. El éxito evitaría nuevas infecciones y reduciría nuevas transmisiones, y de esa manera se podría lograr una cura funcional para el VIH-1.
Con tales fines, se han creado bibliotecas de LA ARV para un espectro de agentes antirretrovirales (Zhou, et al., Biomaterials (2018) 151:53-65; Hilaire, et al., J. Control Release (2019) 311-312:201-211; Ibrahim, et al., Int. J. Nanomedicine (2019) 14:6231-6247; Lin, et al., Chem. Commun. (Camb) (2018) 54:8371-8374; McMillan, et al., Antimicrob. Agents Chemother. (2017) 62: e01316-17; McMillan, et al., AIDS (2019) 33:585-588; Sillman, et al., Nat. Commun. (2018) 9:443; Smith, et al., Biomaterials (2019) 223:119476; Soni, et al., Biomaterials (2019) 222:119441). En el presente documento, los profármacos CAB se crearon con el objetivo de prolongar la vida media aparente del fármaco y las actividades antirretrovirales mientras se ejerce un estricto control de la hidrólisis. Se informa la síntesis y caracterización fisicoquímica integral de tres profármacos de CAB con brazos ligadores de 14, 18 y 22 carbonos (MCAB, M2CAB y M3CAB, respectivamente) con una evaluación completa de sus respectivas nanoformulaciones (NMCAB, NM2CAB y NM3CAB). Estos análisis ampliaron las pruebas previas del profármaco CAB de primera generación, MCAB (Zhou, et al., Biomaterials (2018) 151:53-65; McMillan, et al., AIDS (2019) 33:585-588). La nanoformulación de C18, NM2CAB, mejoró la absorción y retención de CAB en monocitos-macrófagos y mostró una protección mensual a largo plazo contra la inoculación infecciosa del VIH-1. NM2CAB generó concentraciones plasmáticas de CAB superiores al 90 % de la concentración del inhibidor asociado a proteínas (PA-IC<90>) de 166 ng/ml durante 52 semanas. Esto se correlacionó con niveles significativos de biodistribución linfoide, mucosa e intestinal después de una única inyección parenteral. No se registraron eventos adversos sistémicos. Las concentraciones plasmáticas paralelas del fármaco en ratones normales e inmunodeficientes y en monos rhesus a los que se les había inyectado el fármaco afirmaron la liberación prolongada y sostenida del fármaco para los regímenes de prevención y tratamiento. Los resultados tomados en conjunto indican que los profármacos se pueden utilizar con el mismo propósito que una vacuna preventiva contra el VIH-1.
Materiales y métodos
Reactivos
Se adquirió CAB de BOC Sciences (Shirley, NY). La piridina, dimetilformamida (DMF), N,N-diisopropiletilamina (DIEA), cloruro de miristoilo, cloruro de estearoilo, ácido behénico, poloxámero 407 (P407), ciprofloxacina, bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT), sulfóxido de dimetilo (DMSO), paraformaldehído (PFA) y la 3,3'-diaminobencidina (DAB) se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). El éter de dietilo, acetato de etilo, hexanos, acetonitrilo (ACN), metanol, agua de grado LC-MS, agua de grado de cultivo celular (libre de endotoxinas), gentamicina, fosfato monobásico de potasio (KH<2>PO<4>), albúmina sérica bovina (BSA), Triton™ X-100 y reactivo TRIzol® se adquirieron de Fisher Scientific (Hampton, NH). VIH-1 p24 anti-humano de ratón monoclonal (clon Kal-1) y el EnVision™+ anti-ratón conjugado con HRP a base de polímero secundario se adquirieron en Dako (Carpinteria, CA). El suero humano combinado inactivado por calor se adquirió de Innovative Biologics (Herndon, VA). El medio Eagle de modificación de Dulbecco (DMEM) se adquirió de Corning Life Sciences (Tewksbury, MA).
Síntesis y caracterización de profármacos CAB.
Se sintetizó una serie de tres profármacos mediante esterificación del grupo 10-hidroxilo en CAB, produciendo profármacos lipófilos con ligadores de 14, 18 y 22 carbonos denominados MCAB, M2CAB y M3CAB. Inicialmente, el CAB se secó en piridina anhidra y luego se suspendió en DMF anhidra. La mezcla se enfrió a 0 °C bajo atmósfera de argón. Se utilizó DIEA (2 equivalentes) para desprotonar el grupo 10-hidroxilo de CAB, que luego se hizo reaccionar con 2 equivalentes de cloruro de miristoilo o cloruro de estearoilo durante 24 horas para obtener MCAB o M2CAB respectivamente. La síntesis de M3CAB fue un proceso de dos etapas. En la primera etapa, se sintetizó cloruro de behenilo mediante cloración del grupo ácido carboxílico del ácido behénico en cloroformo anhidro utilizando 4 equivalentes de cloruro de tionilo. Se agregó además CAB secado en piridina anhidra y resuspendido en DMF anhidro en presencia de 4 equivalentes de trietilamina al cloruro de behenilo en DMF a 0 °C en una atmósfera bajo argón, seguido de calentamiento de la reacción a 50 °C durante 24 horas. Todos los profármacos resultantes se purificaron mediante cromatografía en columna de gel de sílice utilizando una fase móvil inicial de acetato de etilo:hexanos 4:1 para las fracciones iniciales, luego acetato de etilo:hexanos 9:1 para las restantes. Finalmente, los profármacos se precipitaron y se lavaron en éter de dietilo, se secaron al vacío para obtener un polvo blanco con un rendimiento promedio del 85-95 %. La síntesis exitosa de profármacos se confirmó mediante resonancia magnética nuclear de protones y carbono (1H y 13C RMN) registrados por Bruker Avance-III HD (Billerica, MA) operando a 500 MHz, una intensidad de campo magnético de 11.7 T El análisis infrarrojo por transformada de Fourier (FT-IR) se realizó en un Espectro Dos de reflectancia total atenuada universal (UATR) (PerkinElmer, Waltham, MA). Se llevaron a cabo análisis cristalográficos comparativos de CAB y profármacos mediante difracción de rayos X en polvo (XRD) en el rango 20 de 2-70° a una tasa de 1°/s utilizando un difractómetro PANalytical Empyrean (PANalytical Inc., Westborough, MA) con radiación Cu-Ka (1.5418 A) a 40 kV, ajuste de 45 mA. La masa molecular se determinó mediante infusión directa en un espectrómetro de masas Waters TQD.
Cuantificación de UPLC-UV/Vis de CAB, MCAB, M2CAB y M3CAB.
Se utilizó el sistema H-Class de cromatografía líquida de ultra rendimiento (UPLC) Waters ACQUITY con detector TUV y el software Empower 3 (Milford, MA) para medir las concentraciones de fármaco. Las muestras CAB, MCAB, M2CAB y M3CAB se separaron en una columna Phenomenex Kinetex C18 de 5 pm (150 * 4.6 mm) (Torrance, CA). CAB se detectó a 254 nm, utilizando una fase móvil que consistía en 65 % de fosfato monobásico de potasio 50 mM (KH<2>PO<4>), pH 3.2 y 35 % de acetonitrilo (ACN) y un caudal de 1.0 ml/minuto. Se detectaron MCAB, M2CAB y M3CAB a 230 nm, utilizando una fase móvil que consistía en ACN al 90 % y agua al 10 %, ACN al 95 % y agua al 5 %, ACN al 98 % y agua al 2 %, respectivamente, y un caudal de 1.0 ml/minuto. El contenido de fármaco se determinó en relación con las áreas de pico de los estándares de fármaco (0.05-50 pg/ml) en metanol.
Medidas de solubilidad acuosa de la formulación de fármacos
La solubilidad acuosa de CAB, MCAB, M2CAB y M3CAB en agua óptima se determinó al agregar el exceso de fármaco o profármaco en polvo en 1 ml de agua para preparar la solución acuosa saturada. La mezcla se agitó durante 24 horas a temperatura ambiente. Además, la solución se centrifugó a 14000 rpm durante 10 minutos para sedimentar el polvo no disuelto. El sobrenadante se recolectó, se liofilizó y se disolvió en metanol para el análisis del contenido de fármaco mediante UPLC UV/Vis.
Estabilidad química
Se determinó la estabilidad de MCAB, M2CAB y M3CAB en condiciones ácidas (pH 1), básicas (pH 11) y neutras (pH 7) a temperatura ambiente y temperatura elevada (37 °C). La solución madre de cada profármaco se preparó en DMSO a una concentración de 1 mg/ml. Para ensayos ácidos, básicos y neutros, se agregaron 100 pl de solución madre de cada profármaco a 1900 pl de HCl 0.1 M, NaOH 0.1 M o agua de grado óptimo (pH ajustado a 7), respectivamente. Luego las muestras se incubaron a temperatura ambiente y 40 °C en condiciones de agitación (innova® Incubadora de 42 agitadores, 150 rpm). Las muestras se retiraron a las 0, 2, 4, 8 y 24 horas y se almacenaron a -80 °C. Posteriormente, las muestras se analizaron para determinar el contenido de fármaco mediante UPLC-UV/Vis.
Cinética de hidrólisis de fármacos de escisión de plasma
La cinética de hidrólisis de MCAB, M2CAB y M3CAB y la liberación relativa del fármaco activo se determinaron en plasma de diferentes especies (ratón, rata, conejo, mono, perro y humano). Se incubaron MCAB, M2CAB o M3CAB (1 pM) en 100 pl de plasma a 37 °C. En diferentes puntos de tiempo, se agregó a cada muestra 1 ml de metanol acidificado (ácido fórmico al 0.1 % y formiato de amonio 25 mM para evitar una mayor hidrólisis del profármaco) y se agitó en vórtex durante 3 minutos para detener la reacción. Durante un punto de tiempo de 0 minutos, se enriqueció una solución madre de profármaco a 100 pl de plasma helado y se agregó inmediatamente 1 ml de metanol ácido helado. Después de la adición de metanol, las muestras se centrifugaron a 15,000 g durante 10 minutos, y el sobrenadante recolectado se analizó para determinar el contenido de fármaco mediante UPLC-MS/MS (Waters Xevo TQ-XS).
Síntesis y caracterización de nanopartículas
Se fabricaron nanoformulaciones del CAB original (NCAB) y de sus profármacos (NMCAB, NM2CAB y NM3CAB) mediante homogeneización a alta presión utilizando el tensioactivo poloxámero 407 (P407). El fármaco/profármaco y P407 se mezclaron previamente (10: 1 p/p) en agua libre de endotoxinas durante 24 horas en el rango de concentración de 2 %-20 % p/v de fármaco/profármaco y 0.2-2 % p/v de P407. La premezcla se homogeneizó adicionalmente utilizando un homogeneizador de alta presión Avestin EmulsiFlex-C3 (Ottawa, ON, Canadá) a 1,24*108 Pa (18000 psi) para generar nanocristales homogéneos del tamaño de partícula deseado. Las nanopartículas se caracterizaron por su tamaño de partícula (Deff), índice de polidispersidad (PDI) y potencial zeta mediante dispersión dinámica de luz (DLS) utilizando un Malvern Nano-ZS (Worcestershire, Reino Unido). La estabilidad de las nanoformulaciones se monitorizó a 4, 25 y 37 °C durante 3 meses. El contenido de fármaco/profármaco en la nanoformulación se midió al disolver la nanoformulación en metanol (rango del factor de dilución: 1000-10000), y se analizó por UPLC UV/Vis. Se utilizó la siguiente ecuación para calcular la eficiencia de encapsulación. Eficiencia de encapsulación (%) = (peso del fármaco en la formulación/peso inicial del fármaco agregado) * 100. La morfología de las nanopartículas se evaluó mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). Las nanopartículas se fijaron en una solución de glutaraldehído al 2 % y paraformaldehído al 2 % en un tampón de fosfato de Sorenson 0.1 M (pH 7.2) a 4 °C durante 24 horas y se procesaron para formación de imágenes. Brevemente, las nanosuspensiones se secaron al aire sobre un cubreobjetos de vidrio montado en un trozo de muestra SEM y se recubrieron mediante pulverización catódica con aproximadamente 50 nm de aleación de oro/paladio. Las muestras se ensayaron utilizando un microscopio electrónico de barrido FEI Quanta 200 (Hillsboro, OR) operado a 5.0 kV ((Sillman, et al., Nat. Commun. (2018) 9:443).
Macrófagos derivados de monocitos humanos (MDM)
Los monocitos humanos se obtuvieron mediante leucoféresis de donantes seronegativos para VIH-1/2 y hepatitis B y luego se purificaron mediante elutriación centrífuga a contracorriente (Gendelman, et al., J. Exper. Med. (1988) 167:1428-1441). Los monocitos se cultivaron en medio DMEM que contenía 4.5 g/l de glucosa, L-glutamina y piruvato de sodio suplementados con suero humano inactivado por calor al 10 %, 50 pg/ml de gentamicina y 10 pg/ml de ciprofloxacina. Las células se mantuvieron a 37 °C en una incubadora de CO<2>al 5 %. Se agregó factor estimulante de colonias de macrófagos humanos recombinante (MCSF, 1000 U/ml) a los medios de cultivo durante los primeros 7 días para facilitar la diferenciación de macrófagos derivados de monocitos (MDM). Los medios de semicultivo se reemplazaron con medios frescos cada dos días. Después de la diferenciación, se utilizaron MDM para seguir ensayosin vitro.
Ensayo de citotoxicidad
La viabilidad celular después del tratamiento con nanopartículas se evaluó al realizar un ensayo MTT MDM humano sembrado en placas de 96 pocillos a una densidad de 0.08 * 106 células por pocillo se trataron con NCAB, NMCAB, NM2CAB o<n>M3CAB 10, 25, 50, 100, 200 o 400 pM durante 24 horas. Se utilizaron células no tratadas como controles. Para cada grupo las muestras estaban en cuádruples. Las células se lavaron con PBS y se incubaron con 100 pl/pocillo de solución de MTT (5 mg/ml) durante 45 minutos a 37 °C. Después de la incubación, se eliminó la solución de MTT y las células se lavaron con PBS. Luego, se agregaron 200 pl de DMSO a cada pocillo, y se midió la absorbancia a 490 nm en un lector de placas Molecular Devices SpectraMax® M3 con software SoftMax Pro 6.2 (Sunnyvale, CA).
Estudios de absorción, retención y liberación de MDM de partículas de fármacos
Los estudios de absorción y retención de MDM se realizaron en placas transparentes de 12 pocillos de fondo plano a una densidad de 1.0 * 106 células por pocillo, con cada grupo de tratamiento completado por triplicado. Para los estudios de absorción celular, los MDM se trataron con NCAB, NMCAB, NM2CAB o n M3CAB 100 pM. Se recolectaron MDM a las 2, 4, 8 y 24 horas después del tratamiento para medir los niveles intracelulares de fármaco y profármaco. Para los estudios de retención, los MDM se trataron con NCAB, NMCAB, NM2CAB o NM3CAB 100 pM durante 8 horas y luego se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se agregó medio de cultivo fresco y la mitad del medio se reemplazó cada dos días. Se recolectaron MDM los días 1, 5, 10, 15, 20, 25 y 30 para ensayar las concentraciones intracelulares de fármaco y profármaco. Para ambos estudios, en los puntos de tiempo indicados, los MDM adherentes se lavaron dos veces con PBS. Luego, las células se rasparon en PBS y se contaron utilizando un Contador de Células Automatizado Invitrogen Countess™ (Carlsbad, CA). La suspensión de células en PBS se centrifugó a 3,000 rpm durante 8 minutos a 4 °C. Los sedimentos celulares obtenidos se sometieron a sonicación en 200 pl de metanol utilizando un sonicador de sonda para extraer el fármaco intracelular. Los resultados se centrifugaron a 20,000 g durante 10 minutos a 4 °C para separar los restos celulares del sobrenadante que contenía el fármaco. Las muestras se analizaron adicionalmente para determinar el contenido de fármacos y profármacos mediante UPLC-UV/Vis. Para los estudios de liberación, se recolectó medio de cultivo en los puntos de tiempo similares a los del estudio de retención para cuantificar el fármaco y el profármaco liberado por MDM. El medio de cultivo se mezcló con metanol para precipitar los componentes no solubles en el medio de cultivo y extraer el fármaco y el profármaco. La mezcla se centrifugó a 17,000 g durante 10 minutos a 4 °C para separar el precipitado no soluble. El sobrenadante se transfirió a tubos nuevos para secarlos al vacío rápido. Los contenidos secos se suspendieron en metanol para su posterior análisis mediante UPLC-UV/Vis.
Caracterización de partículas mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM)
Se trataron MDM con NCAB, NMCAB, NM2CAB o NM3CAB a una concentración de 100 pM durante 8 horas y luego se lavaron dos veces con PBS. Se agregaron medios de cultivo frescos y la mitad de los medios se reemplazó cada dos días. Los fluidos sobrenadantes del cultivo de MDM se recolectaron los días 0, 15, y 30 después del tratamiento con partículas de fármaco y se analizaron mediante TEM para obtener imágenes de nanopartículas intracelulares. Para el día 0, las células se recolectaron inmediatamente después de 8 horas de duración del tratamiento. En los puntos de tiempo indicados, las células se lavaron, se rasparon en PBS, se sedimentaron a 3000 rpm durante 8 minutos a temperatura ambiente, y se fijaron en una solución de glutaraldehído al 2 %, paraformaldehído al 2 % en tampón fosfato de Sorenson 0.1 M (pH 6.2). Se colocó una gota de la suspensión de células fijadas sobre una rejilla de cobre de malla 200 de formvar/monóxido de silicio y se dejó reposar durante 2 minutos. El exceso de solución se eliminó y se dejó secar. Se colocó una gota de tinte negativo de vanadio NanoVan sobre la rejilla durante 1 minuto, luego se eliminó y se dejó secar. Las rejillas se examinaron en un microscopio electrónico de transmisión FEI Tecnai G2 Spirit TWIN (Hillsboro, OR) operado a 80 kV. Las imágenes se adquirieron digitalmente con un sistema de formación de imágenes digitales<a>M<t>((Woburn, MA) Sillman, et al., Nat. Commun. (2018) 9:443).
Infección por VIH-1 y mediciones de la actividad de transcriptasa inversa (RT) en fluidos celulares infectados
Los MDM se colocaron en placas transparentes de 24 pocillos de fondo plano a una densidad de 0.8 * 106 células/pozo. Los MDM se trataron con NCAB, NMCAB, NM2CAB o NM3CAB 100 pM durante 8 horas. Después del tratamiento, las células se lavaron con PBS y se cultivaron en medio de cultivo fresco con reemplazo de la mitad del medio cada dos días. 1, 5, 10, 15, 20, 25 y 30 días después del tratamiento, las células se infectaron con VIH-1ADA (una cepa viral trópica de macrófagos) con una multiplicidad de infección (MOI) de 0.1 partículas infecciosas por célula durante 16 horas. Después del período de infección, los MDM se lavaron con PBS y se repusieron con medio fresco. Las células se cultivaron durante los siguientes diez días con un reemplazo de la mitad del medio cada dos días y el reemplazo completo del medio el 8° día. El medio de cultivo se recolectó el décimo día después de la infección para la medición de la actividad de RT del VIH-1 (Kalter, et al., J. Immunol. (1991) 146:3396-3404; Nowacek, et al., J. Neuroimmune Pharm. (2010) 5:592-601). El alcance de la infección se expresó como porcentaje de la actividad de RT por MDM infectados que no fueron tratados. Las células se fijaron en PFA al 2 % y la expresión del antígeno p24 del VIH-1 se determinó mediante inmunocitoquímica (Nowacek, et al., J. Neuroimmune Pharm. (2010) 5:592-601).
Ensayo de concentración efectiva a la mitad máxima (EC<50>)
Los MDM se sembraron en placas transparentes de 96 pocillos de fondo plano (0.08 * 106 células/pozo). Las células se trataron con un rango de concentraciones de fármaco, 0.01-1000 nM de c Ab , MCAB, M2Ca B, M3CAB, NCAB, NMCAB, NM2CAB o NM3CAB durante 1 hora antes de la infección con VIH-1<ada>(MOI de 0.1 partículas infecciosas por célula) durante 4 horas. Después de 4 horas de inoculación viral, las células se lavaron y se les administró medio fresco que contenía fármaco (0.1-1000 nM). Posteriormente, se recolectaron los sobrenadantes de células 10 días después y se ensayó la actividad de la RT del VIH-1 como se describió anteriormente.
Absorción de nanopartículas en células T CD4+ utilizando células CEM-ss como estándares
Se suspendieron células T CD4+ CEM-ss en RPMI suplementado con suero bovino fetal al 10%, 100 U/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina. Se agregó suspensión celular (1 ml/pocillo) en placas transparentes de 12 pocillos de fondo plano recubiertas previamente con solución de poli-L-lisina (500 pg/ml en agua destilada) durante 1 hora. Después de la adhesión a la superficie de los pocillos, las células se trataron con NCAB, NMCAB, NM2CAB o NM3CAB 25 pM. A las 2, 4 y 8 horas, las células se lavaron y se desecharon en PBS. La suspensión celular se centrifugó a 200 g durante 5 minutos y las concentraciones intracelulares de fármaco y profármaco se cuantificaron mediante un espectrómetro de masas Waters TQD. La absorción de nanopartículas en estirpes de células T CD4+ CEM-ss se confirmó mediante formación de imágenes TEM después de 8 horas de tratamiento a una concentración de 25 pM. El procesamiento de muestras para formación de imágenes TEM se describió anteriormente.
Estudios en ratones de farmacocinética (PK) y biodistribución (BD)
A ratones NSG (hembras, 6-8 semanas, Jackson Labs, Bar Harbor, ME) se les administraron 45 mg/kg de equivalentes de CAB de N<c>A<b>, NMCAB, NM2CAB o NM3CAB mediante una única inyección intramuscular (IM, músculo caudal del muslo) a 40 pl/25 g de ratón. Después de la inyección, se recolectaron muestras de sangre en tubos heparinizados el día 1 después de la administración y luego semanalmente hasta el día 364 mediante punción de la mejilla (vena submandibular, MEDIpoint, Inc., Mineola, NY). La sangre recolectada (25 pl) se diluyó inmediatamente en 1 ml de ACN y se almacenó a -80 °C hasta las mediciones del fármaco. Las muestras de sangre restantes se centrifugaron a 2,000 g durante 8 minutos para la recolección de plasma. Se recolectó plasma y se almacenó a -80 °C para el análisis del contenido del fármaco. Los días 14, 28, 42 y 364 después de la administración, los animales se sacrificaron humanamente mediante inhalación de isofluorano, seguido de dislocación cervical. Se recolectaron tejido de bazo, ganglios linfáticos, hígado, pulmón, intestino, riñón, cerebro, vaginal y tejido rectal para cuantificar las concentraciones de CAB y profármaco. CAB, MCAB, M2CAB y M3CAB se cuantificaron en plasma, sangre y tejidos de ratón mediante UPLC-MS/MS utilizando un UPLC Waters ACQUITY H-class (Waters, Milford, MA, EE. UU.) conectado a un microespectrómetro de masas Xevo TQ-S. Todos los solventes para el procesamiento de muestras y el análisis UPLC-MS/MS fueron de grado LCMS (Fisher). Para muestras de plasma y sangre, se agregaron 25 pl de muestra a 1 ml de acetonitrilo (ACN) enriquecido con 10 pl de estándar interno (IS). Se utilizaron d3-dolutegravir (d3-DTG), dolutegravir miristoilado (MDTG) y darunavir estearoilado (SDRV), en una concentración final de 200, 20 y 20 ng/ml, respectivamente, como IS para análisis de CAB, MCAB y M2CAB/M3CAB, respectivamente. Las muestras se agitaron en vórtex y se centrifugaron a 17,000 x g durante 10 minutos a 4 °C. Los sobrenadantes se recolectaron y secaron utilizando un SpeedVac®y se reconstituyeron en 100 pl de metanol al 80 %; se inyectaron 10 pl para el análisis UPLC-MS/MS de MCAB, M2CAB y M3CAB. Se prepararon curvas estándar en plasma/sangre de ratón en blanco en el rango de 0.2-2000 ng/ml para C<a>B, MCAB,<m>2<c>AB y M3CAB. Para la cuantificación del fármaco en tejidos, se homogeneizaron de 3-200 mg de muestra en 4-29 volúmenes de ácido fórmico al 0.1 % v/v y formiato de amonio 2.5 mM que contenía metanol al 90 %. A 100 pl de homogeneizado de tejido se agregaron 280 pl de metanol que contenía ácido fórmico al 0.1 % y formiato de amonio 2.5 mM, metanol al 80 % (10 pl) e IS (10 pl), seguido de agitación en vórtex durante 3 minutos y centrifugación a 17,000 x g durante 15 minutos. Para los análisis de MCAB, M2CAB y M3CAB, se mezclaron 85 pl de sobrenadante con 15 pl de agua. Para el análisis de CAB, se mezclaron 20 pl de sobrenadante con 80 pl de ACN al 50 %. Estas alícuotas se agitaron en vórtex, se centrifugaron a 17,000 x g durante 10 minutos y se utilizaron 10 pl de sobrenadante para el análisis de LC-MS/MS. Los estándares se prepararon de manera similar utilizando homogeneizados de tejido en blanco con 10 pl de solución de enriquecimiento(CAB/MCAB/M2CAB/M3CAB, 5-20,000 ng/ml en ACN al 50 %). Para la cuantificación de CAB, se realizó la separación cromatográfica de 10 pl de muestra de CAB en una columna Waters ACQUITY UPLC BEH Shield RP18 (1.7 pm, 2.1 mm * 100 mm) utilizando un gradiente de 10 minutos de fase móvil A (formiato de amonio 7.5 mM en agua, ajustado a pH 3 utilizando ácido fórmico) y fase móvil B (ACN al 100 %) a un caudal de 0.25 ml/minuto. Durante los primeros 3.5 min, la composición de la fase móvil fue 35 % B y se incrementó a 95 % B en 0.5 min y se mantuvo constante durante 1.5 minutos. Luego se restableció la fase móvil B al 35 % en 0.5 min y la columna se equilibró durante 1 minuto antes de la siguiente inyección. Para la cuantificación de MCAB y M2CAB, la separación cromatográfica se logró en una columna más corta de 30 mm (PN con un método de gradiente de 8 minutos a un caudal de 0.28 ml/minuto. La composición inicial de la fase móvil fue 80 % de B durante los primeros 2 min e incrementó a 95 % de B en 4 minutos, se mantuvo constante durante 0.75 minutos, se restableció al 80 % en 0.25 minutos y la columna se equilibró durante 1 minuto antes de la siguiente inyección. Para la separación cromatográfica por cuantificación de M3CA<b>, también se logró en una columna más corta de 30 mm con un método de gradiente de 8 minutos a un caudal de 0.35 ml/min. La composición de la fase móvil inicial fue de 88 % de B durante los primeros 5 min y se incrementó a 95 % de B en 0.25 min, se mantuvo constante durante 1.5 minutos, se restableció al 88 % en 0.25 minutos y la columna se equilibró durante 1 minuto antes de la siguiente inyección. Se detectaron CAB, MCAB, M2CAB y M3CAB con un voltaje de cono de 10 V, 24 V, 2 V y 20 V respectivamente, y una energía de colisión de 24 V, 18 V, 24 V y 26 V respectivamente, en el modo de ionización positiva. Las transiciones de monitorización de reacciones múltiples (M<r>M) utilizadas para CAB, MCAB, M2CAB, M3CAB, d3-DTG, MDTG y SDRV fueron 406.04 > 126.93, 616.28 > 406.09, 672.34 > 406.07, 728.47 > 406.09, 422.84 > 129.99, 630.20 > 420.07 y 814.52 > 658.44, respectivamente. Los espectros se analizaron y cuantificaron mediante el software MassLynx versión 4.1. Todas las cuantificaciones se determinaron utilizando relaciones entre el área del pico del analito y el área del pico del estándar interno. Después del análisis de PK y BD en ratones NSG, se evaluó nuevamente NM2CAB superior, entre todas las formulaciones, en otra cepa de ratones, BALB/cJ. (Macho, 6-8 semanas, Jackson Labs). NCAB se utilizó como control. Los ratones inyectados con NM2CAB se sacrificaron humanamente el día 280 después de la administración. La cuantificación de fármacos y profármacos en plasma y tejido recolectados fue similar a la anterior. El análisis farmacocinético no compartimental para CAB en plasma se realizó utilizando Phoenix WinNonlin-8.0 (Certara, Princeton, NJ) para estudios en ratones NSG.
PK y BD en monos rhesus (RM)
Cuatro RM machos (4.4-6.7 kg; PrimeGen) se anestesiaron con ketamina (10mg/kg) y posteriormente se les administró 45 mg/kg de CAB-eq. de NM2CAB y un profármaco RPV generado en laboratorio mediante inyección IM (músculo cuádriceps femoral, 0.5 ml/kg). Se recolectaron muestras de sangre en tubos recubiertos con EDTA de potasio para hemogramas completos (CBC) y perfiles metabólicos. El plasma se separó para las mediciones de fármacos. Se recolectaron biopsias de tejido de ganglios linfáticos, tejidos adiposos y rectales el día 204 después de la inyección para la cuantificación del fármaco. Los métodos de cuantificación de fármacos y profármacos en plasma y tejidos fueron similares a los descritos anteriormente en estudios con ratones.
Análisis estadístico
Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism 7.0 (La Jolla, CA). Los datos de estudiosin vitrose expresaron como media ± EEM con un mínimo de 3 réplicas biológicas, mientras que los resultados del estudioin vivose expresaron como media ± EEM con un mínimo de 3 réplicas biológicas. Para las comparaciones entre dos grupos se utilizó la prueba t de Student (de dos colas). Se utilizó un ANOVA unidireccional seguido de una prueba de Tukey para comparar tres o más grupos. Los significados estadísticos se denotaron de la siguiente manera: *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001.
Aprobaciones de estudios
Todos los estudios con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Médico de la Universidad de Nebraska (IACUC) de acuerdo con los estándares incorporados en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (Consejo Nacional de Investigación de las Academias Nacionales, 2011). Los monocitos humanos se aislaron mediante leucoféresis de donantes seronegativos para VIH-1/2 y hepatitis B de acuerdo con un protocolo exento aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la UNMC.
Resultados
Síntesis y caracterización de profármacos
CAB se modificó químicamente al adherir las cadenas de ácidos grasos de longitudes de carbono variables 14, 18 y 22 para producir ésteres de MCAB, M2CAB y M3CAB respectivamente. Los profármacos se caracterizaron además mediante resonancia magnética nuclear (r Mn ) para confirmar la síntesis. Los espectros de 1H RMN de los tres profármacos mostraron tripletes en el rango de 0.86-0.89, 1.77-1.78 y 2.66-2.70 ppm y un singlete amplio en el rango de 1.24-1.25 ppm que corresponde a los protones de metilo terminal y metileno repetidos de cadena de alquilo de ácido graso. La desaparición del pico de protones de fenol a 11.5 ppm confirmó la sustitución del protón hidroxilo de CAB por fracciones de acilo graso. El espectro de 13C RMN de cada profármaco confirmó los átomos de carbono de la cadena alifática conjugada. La espectrometría de masas por ionización por electropulverización (ESI-MS) confirmó los pesos moleculares de todos los profármacos. La infusión de ESI-MS para MCAB generó una señal fuerte a 616.28 m/z, la infusión de ESI-MS para M2CAB generó una señal fuerte a 672.34 m/z y la infusión de ESI-MS para M3CAB generó una señal fuerte a 728.47 m/z. La caracterización del profármaco por espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FTIR) produjo bandas no observadas para CAB en los rangos de 2908-2935 y 1748-1775 cm'1. Estos corresponden a tramos C-H en grupos metileno alifáticos y tramos C=O correspondientes a grupos carboxilo en enlaces éster, respectivamente. Los espectros XRD sobre 20 = 2-70° mostraron el carácter cristalino de los profármacos MCAB, M2CAb y M3CAB. Las nanopartículas de M2CAB mantuvieron la propiedad cristalina del profármaco. Se observó una reducción seriada significativa en la solubilidad acuosa de MCAB (2.83 ± 1.37 pg/ml), M2CAB (1.91 ± 0.23 pg/ml) y M3CAB (1.51 ± 0.7 pg/ml) en comparación con CAB (12.12 ± 0.41 pg/ml). Más aún, en comparación con CAB (0.09 ± 0.002 mg/ml), se observó un incremento significativo paralelo en la solubilidad en 1-octanol de MCAB (2.31 ± 28.15 mg/ml), M2CAB (2.64 ± 0.02 mg/ml) y M3CAB. Estos resultados confirmaron el incremento en la hidrofobicidad y lipofilicidad de los profármacos en comparación con CAB como resultado de modificaciones químicas con los conjugados de ácidos grasos.
Los profármacos son compuestos farmacológicamente inactivos que requieren activación enzimática o hidrolítica para su bioconversión en fármacos activos en condiciones fisiológicas. Por lo tanto, se evaluó la cinética de hidrólisis de MCAB, M2CAB y M3CAB y la posterior formación de CAB en plasma de diferentes especies (ratón, rata, conejo, mono, perro y humano). Tras la incubación en plasma de todas las especies probadas, MCAB mostró más del 85 % de escisión en 30 minutos, M2CAB mostró un promedio de 75 % de escisión en 2 horas y 80 % de escisión en 6 horas. M3CAB mostró la tasa de escisión más lenta, quedando alrededor del 50 % del profármaco después de 24 horas de incubación en plasma. Estos estudios mostraron que MCAB se convertía rápidamente en CAB, mientras que M3CAB mostraba la menor conversión en CAB. La formación de CAB a partir de la hidrólisis de M2CAB fue un promedio del 71.1 % en 6 horas, lo que significa que M2CAB es el profármaco óptimo en términos de estabilidad y formación de fármaco activo en condiciones fisiológicas. Hubo algunas diferencias en las tasas de hidrólisis de profármacos entre el plasma de varias especies animales. La variabilidad en las concentraciones plasmáticas de CAB entre las especies analizadas puede ser el resultado de diferencias en la distribución de la grasa corporal, la masa muscular, la actividad física y en las enzimas carboxilesterasas plasmáticas operativas para la hidrólisis de profármacos (Trezza, et al., Curr. Opin. HIV AIDS (2015) 10:239-245; Bahar, et al. (2012) J. Pharm. Sci. (2012) 101:3979-3988; Wang, et al., Acta Pharmaceutica Sinica. B (2018) 8:699-712). Más aún, la estabilidad química de M2CAB se determinó a temperatura ambiente y temperatura elevada (37 °C) en condiciones ácidas (pH 1), neutras (pH 7) y básicas (pH 11) durante 24 horas para determinar la estabilidad a largo plazo de nanoformulaciones de profármacos en diversas condiciones de almacenamiento. A temperatura ambiente, a las 24 horas, se determinó un 19 % de hidrólisis en condiciones ácidas y un 24 % de hidrólisis en condiciones neutras. Sin embargo, en condiciones básicas, M2CAB se hidrolizó completamente y no se detectó. A 37 °C, a las 24 horas, se hidrolizó alrededor de >95 % del profármaco en condiciones ácidas y se hidrolizó el 28 % del profármaco en condiciones neutras. Mientras que, en condiciones básicas, M2CAB se hidrolizó completamente en 2 horas. La mitad de los valores de concentración efectiva máxima (EC<50>) de los profármacos, MCAB, M2CAB y M3CAB, se compararon con CAB para determinar los cambios, si los hubiera, en la actividad antirretroviral debido a la modificación química. Las mediciones de la actividad de RT del VIH-1 del medio de cultivo de MDM infectado con VIH-1<ada>demostró que los valores de EC<50>de CAB (28.39 nM), MCAB (34.19 nM), M2CAB (44.71 nM) y M3CAB (51.15 nM) fueron comparativos, lo que indica que no hay efectos significativos sobre la actividad del fármaco.
Fabricación y caracterización de nanoformulaciones
Las nanoformulaciones de CAB (NCAB), MCAB (NMCAB), M2CAB (NM2CAB) y M3CAB (NM3CAB) se fabricaron mediante síntesis de arriba hacia abajo utilizando homogeneización de alta presión. La eficacia de encapsulación del fármaco o cualquiera de los profármacos fue >85 %. El tensioactivo poloxámero 407 (P407) proporcionó estabilización de la superficie de las partículas. El tamaño de las nanopartículas, el índice de polidispersidad (PDI) y el potencial zeta se determinaron mediante DLS a temperatura ambiente (RT), 4 °C y 37 °C. Todas las formulaciones permanecieron estables hasta 98 días, lo que significa que estas formulaciones pueden mantener su integridad física en un rango de condiciones de almacenamiento. Más aún, la variación de temperatura no afectó las propiedades fisicoquímicas de ninguna formulación durante el período de estudio. En el día de fabricación, el tamaño medio de partícula, el PDI y el potencial zeta para NCAB eran 294.5 ± 1.8 nm, 0.23 ± 0.01, -28.3 ± 0.21 mV; para NMCAB fueron 302.1 ± 10.8 nm, 0.23 ±0.01, -31.1 ±1.1 mV; para NM2CAB fueron 359.7 ± 3.63 nm, 0.23 ±0.02, -31.3 ±0.1 mV; y para NM3CAB fueron 268.47 ± 6.9 nm, 0.23 ±0.03, -31.1 ±0.06 mV. El día 98 después de la fabricación, los parámetros fisicoquímicos para NCAB fueron 327.5 ± 4.9 nm, 0.21 ± 0.04, -18.2 ± 0.25 mV; para NMCAB fueron 388.7 ± 6.4 nm, 0.22 ± 0.03, -24.8 ± 2.87 mV; para NM2CAB fueron 369.5 ± 2.5 nm, 0.19 ± 0.03, -19.6 ± 0.53 mV; y para NM3CAB fueron 245.6 ± 2.6 nm, 0.27 ± 0.06, -25.7 ± 0.56 mV. Las imágenes SEM mostraron que las nanopartículas NCAB, NMCAB, NM2CAB y NM3CAB tenían una morfología uniforme en conformación de varilla. Para conformación de la reproducibilidad, la formulación de NM2CAB se fabricó en 11 lotes separados (Tabla 1). Los tamaños de las nanopartículas variaron desde 243.00 ± 2.48 a 378.00 ± 1.90 nm con un p Di estrecho (0.18 ± 0.03 a 0.33 ± 0.03).
Tabla 1: Re roducibilidad de la síntesis de NM2CAB.
Se determinó el efecto de las nanoformulaciones sobre la actividad antirretroviral de los profármacos (EC<50>). La actividad antiviral de NCAB, NMCAB, NM2CAB o NM3CAB en MDM en un rango de concentraciones (0.01-1000 nM) y se midió mediante la actividad de la transcriptasa inversa del VIH-1 después de la inoculación viral con VIH-1<ada>a una MOI de 0.1. Los valores de EC<50>se incrementaron en comparación con los fármacos o profármacos no nanoformulados, probablemente debido a la disolución requerida de las nanopartículas antes de la escisión de los profármacos. Los valores EC<50>fueron comparables entre NCAB (39.83 nM), NMCAB (89.67 nM), NM2CAB (37.02 nM). Sin embargo, el valor EC<50>para NM3CAB se incrementó significativamente (~1.78E±06 nM). Esto podría ser un efecto de una escisión más lenta del profármaco y la posterior generación de CAB activo, así como de la estabilidad intracelular de las nanoformulaciones. Para la caracterización adicional de nanoformulaciones de profármacos y la determinación de las concentraciones de tratamiento para estudiosin vitro,la vitalidad celular se evaluó en células T CD4+ MDM y CEM-ss mediante el ensayo MTT. En MDM, no se observó citotoxicidad en el rango de concentraciones probado (10-400<j>M) para todas las nanoformulaciones. En las células T CD4+ CEM-ss, la citotoxicidad se determinó a concentraciones de 50<j>M y superiores. Por lo tanto, las concentraciones de tratamiento para todas las nanoformulaciones fueron 100<j>M para ensayos en MDM y 25<j>M para estudios en células T CD4+ CEM-ss.
Cribadoin vitroen células T CD4+ MDM y CEM-ss
Los macrófagos se pueden utilizar con éxito como depósitos y transportadores de fármacos celulares. Debido a su naturaleza fagocítica y a la capacidad para migrar por todo el cuerpo (Zhou, et al., Biomaterials (2018) 151:53-65; Darville, et al., J. Pharm. Sci. (2014) 103:2072-2087; Aderem, et al., Ann. Rev. Immunol. (1999) 17:593-623; Dou, et al., Blood (2006) 108:2827-2835), el MDM puede servir como sistema de suministro de fármacos a reservorios virales. Por lo tanto, se utilizaron los MDM como sistemain vitropara evaluar las nanoformulaciones (Zhou, et al., Biomaterials (2018) 151:53-65; Hilaire, et al., J. Control Release (2019) 311-312:201-211; Ibrahim, et al., Int. J. Nanomedicine (2019) 14:6231-6247; Lin, et al., Chem. Commun. (2018) 54:8371-8374; Sillman, et al., Nat. Commun. (2018) 9:443; Smith, et al., Biomaterials (2019) 223:119476; Soni, et al., Biomaterials (2019) 222:119441).
El ensayo de absorción se realizó en MDM al medir los niveles de fármaco y profármaco después del tratamiento con NCAB, NMCAB, NM2CAB o NM3CAB 100 j M durante hasta 24 horas. Los niveles de profármaco intracelular medidos para NMCAB, NM2CAB y NM3CAB fueron 61.69 ± 0.78, 84.07 ±5.82 y 73.34 ± 13.59 nmoles/106 células, respectivamente, por 24 horas; y los niveles de CAB intracelulares fueron 0.58 ±0.11, 12.31 ± 0.46, 17.79 ± 2.92 y 7.97 ± 1.76 nmoles/106 células para NCAB, NMCAB, NM2CAB o NM3CAB, respectivamente. Posteriormente, se evaluó la capacidad de los macrófagos para retener fármacos y profármacos intracelulares durante un período de 30 días después de un único tratamiento. Los MDM se trataron con NCAB, NMCAB, NM2CAB o NM3CAB 100 pM durante 8 horas. Los niveles intracelulares de profármaco se mantuvieron hasta 30 días después del tratamiento único. Específicamente, la cantidad de profármaco intracelular medida el día 30 para NMCa B, NM2CAB y NM3CAB fue 0.41 ± 0.09, 14.21 ± 2.28 y 26.70 ± 3.29 nmoles/106 células. De manera similar, se midieron los niveles intracelulares de CAB formados a partir de la escisión del profármaco hasta los 30 días. La cantidad de niveles de CAB intracelular medidos el día 30 para NM2CAB y NM3CAB fueron 1.71 ± 0.35 y 2.05 ± 0.10 nmoles/106 células. Considerando que los niveles intracelulares de CAB cayeron por debajo del límite de cuantificación dentro de las 24 horas posteriores al tratamiento con NCAB; y la concentración intracelular de CAB después del tratamiento con NMCAB se midió hasta el día 25 (0.09 ± 0.04 nmoles/106 células) y fue indetectable el día 30. En paralelo al ensayo de retención, se midieron los CAB liberados en los fluidos de cultivo durante 30 días. NM2CAB mostró la liberación de CAB más sostenida con niveles de fármaco de 1.0 ± 0.10 nmoles/106 células el día 30. No se detectó CAB con el tratamiento NCAB y NM3CAB. No se detectaron profármacos en el medio de cultivo para ninguno de los tratamientos, lo que indica bioconversión de profármacos.
A continuación, se tomaron imágenes TEM de MDM los días 0, 15 y 30 después del tratamiento con nanoformulaciones durante 8 horas para evaluar la presencia de nanopartículas en las vesículas citoplasmáticas. Las imágenes TEM confirmaron la presencia de nanoformulaciones de profármacos (NM2CAB y NM3CAB) hasta el día 30 en MDM, lo que significa la propiedad de depósito de fármacos de MDM; y validó los resultados de absorción, retención y liberación. La absorción de NCa B, NMCAB, NM2CAB o NM3c A b se determinó en células T CD4+ después del tratamiento a una concentración de 25 pM y reflejó lo observado en MDM. La formación de imágenes TEM realizadas en células T CD4+ CEM-ss después de un tratamiento único con NCAB, NMCAB, NM2CAB o NM3CAB durante 8 horas confirmaron la presencia de nanopartículas en los compartimentos citoplasmáticos.
Para examinar si la retención sostenida de fármacos en MDM protegería contra la infección por VIH-1, se inocularon células con VIH-1<ada>hasta 30 días después de un tratamiento de 8 horas con NCAB, NMc A b o NM2CAB 100 pM y se ensaya cuantitativamente para la actividad de RT del VIH-1, así como cualitativamente la expresión del antígeno p24 del VIH-1. NM3CAB no se seleccionó para este estudio porque no mostró una protección significativa en el valor EC<50>deseado. El tratamiento con NM2CAB suprimió la actividad de la RT del VIH-1 hasta el día 30 y se confirmó por la ausencia de expresión de p24 del VIH-1. Por el contrario, la ruptura viral completa se produjo el día 1 después del tratamiento con NCAB y el día 20 después del tratamiento con NMCAB. Por lo tanto, la retención de fármacos MDM mejorada exhibida por NM2CAB proporcionó una protección superior contra la inoculación con VIH-1 en comparación con NACB y NMc Ab . Además, se determinó la actividad antirretroviral dosis-respuesta de NM2CAB (Figura 4). Los MDM se trataron con NM2CAB 10, 50 o 100 pM durante 8 horas y se inocularon con VIH-1<ada>. De manera similar a lo anterior, la actividad antirretroviral se determinó hasta 30 días. Se observó una supresión viral completa en los tratamientos con NM2CAB 50 y 100 pM, mientras que se observó una protección del 57 % en el tratamiento con 10 pM después de 30 días y se validó mediante la expresión de p24 del VIH-1 (Figura 4).
Farmacocinética (PK) y biodistribución
Para evaluar los perfiles de PK y biodistribución, a ratones NSG hembra se les inyectó IM una dosis única de 45 mg/kg de equivalentes de CAB de NCAB o NMCAB o NM2CAB. Se utilizaron ratones NSG hembra inmunodeficientes para la evaluación con el fin de imitar la patología de la enfermedad de la compensación inmunitaria y evaluar la biodistribución en las vías genitourinarias. NCAB es una formulación equivalente eficaz a CAB-LA, ya que ambas formulaciones produjeron niveles plasmáticos de CAB similares hasta el día 49 después de la administración a ratones BALB/cJ.
El día 1 después de la inyección, el tratamiento con NCAB generó concentraciones plasmáticas de CAB más altas en comparación con NMCAB y NM2CAB y mostró una cinética de descomposición más rápida durante el período de estudio en comparación con NM2CAB. Con el tratamiento con NCAB, las concentraciones plasmáticas de CAB se mantuvieron por encima de la concentración inhibidora del 90 % ajustada por proteínas cuatro veces (4 * PA-IC<90>; 664 ng/ml) hasta el día 35 (792.7 ng/ml), luego disminuyó rápidamente por debajo de la PA-IC<90>(166 ng/ml) el día 49 (75 ng/ml) antes de caer por debajo del límite de cuantificación (0.5 ng/ml) en el día 126. El tratamiento con NMCAB mostró una descomposición más lenta y mantuvo los niveles plasmáticos de CAB por encima del 4 * PA-IC<90>hasta el día 91 (673.8 ng/ml) y superior PA-IC<90>hasta el día 168 (186.7 ng/ml). El día 364 después del tratamiento con NMCAB, los niveles de CAB se cuantificaron en 8.5 ng/ml. En marcado contraste, el tratamiento con NM2CAB proporcionó una cinética de desintegración del plasma más lenta en comparación con NCAB y NMCAB hasta el día<3 6 4>, manteniendo una concentración sostenida de CAB en plasma por encima de 4 * PA-IC<90>hasta el día 231 (702 ng/ml) y por encima del PA-IC<90>hasta el día 364 (354.2 ng/ml). Los parámetros farmacocinéticos plasmáticos para CAB se determinaron utilizando análisis no compartimental para todos los grupos de tratamiento. La cuantificación de los parámetros farmacocinéticos demostró que la vida media aparente de CAB después del tratamiento con NM2CAB (131.56 días) fue 17 y 3 veces mayor que la de NCAB (7.80 días) y NMCAB (44.40 días), respectivamente. De manera similar, el tiempo de residencia medio (MRT) de CAB de NM2CAB fue 21 veces más largo que el de NCAB (201.94 frente a 9.79 días, respectivamente) y 7 veces más largo que el de NMCAB (201.94 días frente a 30.76 días, respectivamente).
NM2CAB también provocó niveles de CAB en tejido significativamente más altos durante hasta un año. La biodistribución de tejido de CAB se evaluó los días 14, 28, 42 y 364 después de una única inyección IM en tejido vaginal, tejido rectal, tejidos anatómicos asociados a bazo, hígado, intestino, cerebro, riñón, pulmón y ganglios linfáticos. Los niveles de fármaco en los ganglios linfáticos se determinaron en regiones anatómicas asociadas con los ganglios linfáticos solo en los días 28 y 364, debido a su estado inmaduro en ratones NSG inmunodeficientes. Notablemente, los niveles de MCAB fueron inferiores a los de M2CAB los días 14, 28 y 42 y fueron indetectables el día 364. Para NM2CAB, el día 364, los niveles de profármaco fueron 3414.8 ng/g (bazo), 909.8 ng/g (hígado), 52.7 ng/g (pulmón), 50.3 ng/g (cerebro), 3.9 ng/g (riñón) y 18710.1 ng/g (ganglios linfáticos). El día 28, los niveles de CAB en todos los tejidos eran comparables entre NCAB y NM2CAB. Sin embargo, para el día 42, los niveles de CAB en todos los tejidos probados después del tratamiento con NCAB fueron significativamente más bajos en comparación con los del tratamiento con NM2CAB (tejido vaginal, bazo, intestino, cerebro, riñones y pulmones, tejido rectal y cerebro). Mientras que los niveles de CAB en los tejidos, hasta el día 42, después del tratamiento con NMCAB fueron significativamente más altos en comparación con los tratamientos con NCAb y NM2CAB. El día 364 después del tratamiento con NM2CAB, las concentraciones de CAB fueron significativamente mayores en todos los tejidos probados en comparación con otras formulaciones, y los niveles de CAB se midieron en 27 ng/g (tejido vaginal), 19.7 ng/g (recto), 41.1 ng/g (bazo), 67.62 ng/g (ganglios linfáticos-tejidos anatómicos asociados), 123.9 ng/g (hígado), 10.3 ng/g (intestino), 7.5 ng/g (cerebro), 33.2 ng/g (riñón) y 35.5 ng /g (pulmón). Por el contrario, los niveles de CAB eran significativamente bajos o estaban por debajo del límite de cuantificación (0.5 ng/g) en todos los tejidos el día 364 después del tratamiento con NCAB o NMCAB.
También se probaron las concentraciones de profármaco (MCAB o M2CAB) en sangre y en todos los tejidos (Figura 5). Las concentraciones de ambos profármacos en sangre fueron más bajas el día 1 después de la inyección, 22 ng/ml para MCAB y 31.3 ng/ml para M2CAB, y rápidamente superaron el límite de cuantificación, lo que significa bioconversión de profármacos en fármaco original activo. Todos los tejidos cribados eran depósitos sustanciales de M2CAB y tenían niveles sostenidos de M2CAB durante todo el período del estudio. La inyección IM única de NM3CAB (equivalentes de CAB de 45 mg/kg) en ratones NSG hembra generó niveles bajos de CAB en plasma (2248 ng/ml) el día 1 después de la administración en comparación con NCAB (41237.6 ng/ml), NMCAB (30148.9 ng /ml) y NM2CAB (7076.1 ng/ml). Los niveles plasmáticos de CAB se alcanzaron alrededor de PA-IC<90>(233.2 ng/ml) dentro de los 28 días después del tratamiento. Los niveles plasmáticos y de tejidos de CAB y M3CAB se midieron el día 28. Para la validación de una hidrólisis más lenta de M3CAB, se repitió la evaluación P<k>en ratones BALB/cJ después de una única inyección IM de NM3CAB en la misma dosificación. De manera similar a los resultados de PK en ratones NSG, NM3CAB generó niveles bajos de CAB en plasma el día 1 después de la administración (777.8 ng/ml); y los niveles plasmáticos de CAB cayeron por debajo del PA-IC<90>una vez dentro de los 28 días (98.9 ng/ml). Estos datos confirmaron la hidrólisis más lenta del profármaco M3CAB y la posterior bioconversión en CAB.
Se confirmaron perfiles superiores de PK y BD de NM2CAB entre todas las formulaciones en otra cepa de ratones, BALB/cJ (macho). En el presente documento, se utilizaron ratones de tipo silvestre para validar los resultados de ratones NSG inmunodeficientes. Las mediciones de PK y BD en plasma y tejidos para NM2CAB fueron paralelas a las de ratones NSG. Particularmente, las concentraciones plasmáticas de CAB estuvieron por encima de PA-IC<90>el día 231 (170.8 ng/ml) para NM2CAB, lo que confirma la mejora en la vida media aparente del fármaco. Se utilizó NCAB como un control, en el que los niveles de CAB estuvieron por debajo de PA-IC<90>el día 28 (12.28 ng/ml).
Para validar los resultados observados en roedores, a los macacos rhesus se les inyectó IM una dosis única de 45 mg/kg equivalentes de CAB de NM2CAB. Los niveles plasmáticos de CAB y profármaco (M2CAB) se midieron hasta el día 393. De manera similar a los resultados en ratones, el tratamiento con NM2CAB proporcionó una cinética de descomposición del plasma más lenta, manteniendo la concentración plasmática sostenida de CAB hasta el día 393. En el día 393, los niveles de CAB se midieron en un promedio de 56.1 ng/ml. Como se esperaba, las concentraciones plasmáticas de M2CAB fueron más bajas durante todo el estudio en comparación con los niveles de CAB, lo que significa la bioconversión del profármaco a su fármaco original activo (Figura 6A). Se recolectaron biopsias rectales, de ganglios linfáticos y de tejido adiposo el día 204 después de la administración de NM2CAB y se analizaron los niveles de CAB y M2CAB. Las concentraciones de CAB en el recto, los ganglios linfáticos y los tejidos adiposos fueron 10.12 ng/g, 22.7 ng/g y 29.5 ng/g, respectivamente (Figura 6B). M2CAB estuvo presente en niveles altos en los tejidos de ganglios linfáticos y adiposos (33.3 ng/g y 233.2 ng/g, respectivamente), con niveles más bajos (1.7 ng/g) en el tejido rectal (Figura 6C).
Evaluación de toxicidad
Después de la administración de NM2CAB, se realizaron ensayos toxicológicos tanto en ratones como en macacos rhesus. Para la evaluación de la toxicidad en ratones NSG, se registraron los pesos de los animales semanalmente durante un año; y al finalizar el estudio (día 364), se recolectaron plasma y tejidos para perfiles metabólicos e histopatología, respectivamente. Se utilizaron como controles ratones no tratados de la misma edad. No se observaron diferencias de peso entre los animales de todos los grupos. Se cuantificaron parámetros completos de química sérica utilizando un disco de perfil de diagnóstico completo VetScan y un instrumento VetScan VS-2. Los parámetros examinados fueron (alanina aminotransferasa (ALT), albúmina (ALB), fosfatasa alcalina (ALP), amilasa (AMY), calcio total (CA++), creatinina (CRE), globulina (GLOB), glucosa (GLU), fósforo (PHOS), potasio (K+), sodio (NA+), bilirrubina total (TBIL), proteína total (TP) y nitrógeno ureico (BUN). No se observaron diferencias significativas entre los controles y los grupos tratados con NM2CAB, lo que indica que NM2CAB no afectó negativamente las funciones de los órganos sistémicos. El examen histológico de secciones de tejido (hígado, pulmón, intestino, bazo, riñón y cerebro) teñidas con H&E por un patólogo certificado no reveló ninguna patología anormal en los animales tratados con NM2CAB. Más aún, la formulación fue bien tolerada por ambas cepas de ratones (NSG y BALB/cJ), y no se observaron reacciones en el sitio de la inyección ni cambios en el comportamiento o el movimiento.
Para la evaluación en macacos rhesus, se registraron los pesos a partir de la administración previa de la formulación, y se recolectaron plasma y células mononucleares de sangre periférica (PBMC) para recuentos sanguíneos completos y perfiles metabólicos hasta el día 393 después de la administración de NM2CAB. La toxicidad sistémica se evaluó al medir los perfiles hematológicos (neutrófilos, linfocitos, monocitos) y metabólicos (ALT, fosfatasa alcalina, BUN/creatinina). No se registraron cambios de peso en ninguno de los animales después de la inyección. Un leve enrojecimiento inicial observado en el sitio de la inyección se resolvió el día 3 en todos los animales. No se observó inflamación ni bolo 3 días después de la inyección. Se contaron los neutrófilos, linfocitos y monocitos antes y después de la administración de NM2CAB; y el recuento de células sanguíneas fue consistente. El día 1 después de la inyección se registró un incremento en el recuento de neutrófilos, que se normalizó en 2 semanas en todos los animales. Dicho cambio podría estar relacionado con la inyección y puede no estar asociado con el fármaco. Los perfiles metabólicos del hígado y los riñones se mantuvieron sin cambios en todos los animales después del tratamiento. En general, no se observaron eventos adversos después de la administración de NM2CAB.
Interacciones fármaco-fármaco
Se evaluaron las interacciones fármaco-fármaco entre dos nanoformulaciones de profármacos (NM2CAB y NM3PRV) de diferentes clases: CAB (INSTI) y rilpivirina (RPV; NNRTI). RPV fue una opción de fármaco junto con<c>A<b>debido al desarrollo clínico actual de una combinación de nanoformulaciones de CAB y RPV de acción prolongada. NM3RPV es una formulación de acción prolongada de RPV (Hilaire, et al., J. Control Release (2019) 311-312:201-211). Se trataron ratones BALB/cJ IM con una dosis única de NM2CAB solo (45 mg/kg de equivalentes de CAB), NM3RPV solo (45 mg/kg de equivalentes de RPV) o la coadministración de ambas nanoformulaciones de profármacos (NM2CAB y NM3RPV, 45 mg/kg de equivalentes de fármaco). Se midieron los niveles plasmáticos de CAB y RPV y no se observaron diferencias en los niveles de fármaco activo entre los animales tratados con formulaciones solas o en combinación, lo que significa el uso de una combinación de múltiples nanoformulaciones de profármacos para el tratamiento o la prevención.
Ante la incapacidad de erradicar las vacunas protectoras contra la infección por VIH y la profilaxis previa a la exposición (PrEP) para personas en riesgo, la ART a largo plazo es el único enfoque disponible para prevenir enfermedades y detener nuevas infecciones y la transmisión viral. Esto se destaca con el “tratamiento como prevención” para aquellas personas en riesgo de infección. El enfoque en el desarrollo de inyectables LA ARV se centra en la creación de fármacos con vidas medias largas. Para la PrEP, los LA ARV requieren “cobertura” para evitar infecciones después de la exposición al VIH. Es necesario detener la infección viral durante los períodos en los que se detectan niveles protectores de ARV en el plasma. Los fármacos también se deben administrar sin efectos secundarios adversos que incluyan toxicidad gastrointestinal y cualquier interacción fármaco-fármaco notable. Actualmente, los agentes LA han despertado entusiasmo entre los usuarios potenciales con las ventajas potenciales de eliminar el estigma de las infecciones virales y al requerir intervalos de dosificación inferiores a los diarios, algunos de los cuales se administran con tan poca frecuencia como cada 2 a 3 meses. Los LA ARV administrados por ruta subcutánea o intramuscular son altamente efectivos y ya han demostrado una calidad de vida y longevidad mejorada (May, et al., AIDS (2014) 28:1193-1202; Antiretroviral Therapy Cohort, Lancet (2017) HIV 4:e349-e356). Ayudan a evitar la falta de adherencia de la medicación, que sigue siendo un desafío clave para el tratamiento (Shubber, et al., PLoS Med. (2016) 13:e1002183; Osterberg, et al., New Eng. J. Med. (2005) 353:487-497). De hecho, cualquier cumplimiento deficiente de los regímenes ARV que resulte en fracaso del tratamiento, mutaciones resistentes a los fármacos y nuevas transmisiones virales se puede eliminar con una adherencia mejorada. En un intento por mejorar las plataformas existentes para los LA ARV, se han desarrollado profármacos de terapia antirretroviral de liberación lenta y eficaz (LASER ART). Estas nuevas formulaciones sirven para reducir la frecuencia de las inyecciones y al mismo tiempo mantener los niveles terapéuticos sostenidos de los ARV durante más tiempo (Edagwa, et al., Exp. Opinion Drug Del. (2017) 14:1281-1291). LASER ART comprende la síntesis de profármacos a través de modificaciones químicas de ARV existentes para proporcionar una disolución lenta del fármaco nativo, mala solubilidad en agua, penetrancia mejorada a través de las membranas biológicas de las células y los reservorios de tejido, y toxicidades sistémicas limitadas fuera de diana. La síntesis de profármacos permite la formación de nanocristales de ARV estabilizados por excipientes poliméricos. Se ha establecido la PK y eficacia (PD) de las formulaciones de LASER ART para un rango de ARV que incluyen, pero no se limita a, dolutegravir (DTG), CAB, abacavir (ABC), lamivudina (3TC) y emtricitabina (fTc ) (Zhou, et al., Biomaterials (2018) 151:53-65; Hilaire, et al., J. Control Release (2019) 311-312:201-211; Ibrahim, et al., Int. J. Nanomed. (2019) 14:6231-6247; Lin, et al., Chem. Commun. (2018) 54:8371-8374; McMillan, et al., Antimicrob. Agents Chemother. (2018) 62: e01316-17; McMillan, et al., AIDS (2019) 33:585-588; Sillman, et al., Nat. Commun. (2018) 9:443; Smith, et al., Biomaterials (2019) 223:119476; Soni, et al., Biomaterials (2019) 222:119441).
CAB es un inhibidor de la transferencia de cadena de integrasa del VIH-1 (INSTI) y actualmente se está desarrollando como inyectable oral y LA (McPherson, et al., Expert Opin. Investig. Drugs (2018) 27:413-420). Sus propiedades intrínsecas únicas, tales como naturaleza hidrófoba, vida media sistémica prolongada (aproximadamente 40 horas después de la administración oral), alta potencia, perfil resistente, requerimiento de dosificación oral diaria baja (< 30 mg/día) e interacciones fármaco-fármaco limitadas, convertirlo en un candidato atractivo para convertirse en un inyectable de LA (Trezza, et al., Curr. Opin. HIV AIDS (2015) 10:239-245). En el presente documento, se demuestra que una única inyección de NM2CAB generó mejoras inesperadamente superiores en la durabilidad del fármaco, reflejadas por las concentraciones plasmáticas sostenidas del fármaco y la biodistribución de tejido en comparación con NCAB, NMCAB o NM3CAB. NM2CAB proporcionó una descomposición sostenida del plasma mientras mantenía los niveles del fármaco por encima de PA-IC<90>de 166 ng/ml durante 364 días después de una única inyección.
CAB LA, que actualmente se acerca a la aprobación clínica, se estudió ampliamente en macacos rhesus, lo que afirma sus capacidades para uso como ARV inyectable para estudios de profilaxis previa a la exposición (PrEP) (Edagwa, et al., Exp. Opin. Drug Del. (2017) 14:1281-1291; Stellbrink, et al., Curr. Opin. HIV AIDS (2018) 13:334-340). Estos estudios demostraron que CAB LA proporcionó un alto grado de protección contra inoculaciones vaginales, rectales, intravenosos y del pene con cepas de SHIV que respaldan su uso futuro como PrEP para aquellas personas con alto riesgo de exposición al VIH y para usuarios de fármacos intravenosos. Los niveles plasmáticos superiores a 3 * PA-IC<90>proporcionaron 100% de protección y concentraciones superiores a PA-IC<90>proporcionaron un 97% de protección contra inoculación viral (Edagwa, et al., Exp. Opin. Drug Del. (2017) 14: 1281-1291; Stellbrink, et al., Curr. Opin. HIV AIDS (2018) 13:334-340). En el presente documento, la administración de NM2CAB generó concentraciones de CAB en plasma superiores a PA-IC<90>durante más de seis meses, lo que significa su superioridad y su eficacia clínica como PrEP.
En total, el desarrollo de medidas efectivas de tratamiento y prevención con fármacos antirretrovirales (ARV) para pacientes infectados por VIH-1 ha pasado de lo que era una muerte segura a una enfermedad crónica manejable de por vida. Sigue siendo necesario controlar la pandemia del VIH-1, ya que se estima que en todo el mundo hay 37.9 personas infectadas. La llegada de los LA ARV ciertamente ampliará las opciones para superar el desafío de la adherencia deficiente a los fármacos y reducir la carga de la infección por VIH. Hasta la fecha, la quimioprofilaxis con agentes antirretrovirales contra el VIH se ha demostrado en mayor medida con compuestos que contienen fumarato de tenofovir disoproxilo (TDF). Sin embargo, los niveles requeridos de adherencia de los comprimidos orales diarios o casi diarios han resultado ser un desafío. Las preparaciones de LA ofrecen mayores opciones para lograr la prevención con el entendimiento de que la seguridad, la tolerabilidad y la eficacia seguirán siendo parte de las evaluaciones de los resultados terapéuticos. Los LA ARV capaces de administrarse mensualmente o con menor frecuencia mejorarán la adherencia terapéutica y ampliarán las oportunidades para PrEP

Claims (7)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un compuesto de fórmula I:
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que R es una cadena alifática lineal saturada de una longitud de 17 carbonos.
  2. 2. Una nanopartícula que comprende un compuesto de la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un polímero o tensioactivo.
  3. 3. La nanopartícula de la reivindicación 2, en la que el compuesto es
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y el polímero o tensioactivo es P407.
  4. 4. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un portador farmacéuticamente aceptable.
  5. 5. Un compuesto o sal de la reivindicación 1, una nanopartícula de la reivindicación 2 o la reivindicación 3, o una composición farmacéutica de la reivindicación 4, para uso en un método de tratamiento de una infección por VIH.
  6. 6. El compuesto o sal del mismo, nanopartícula o composición farmacéutica para el uso según se reivindica en la reivindicación 5, en el que el compuesto o sal del mismo, nanopartícula, o composición farmacéutica se administra al sujeto mediante inyección.
  7. 7. El compuesto o sal del mismo, nanopartícula, o composición farmacéutica para el uso según se reivindica en la reivindicación 5, en el que el compuesto o sal del mismo, nanopartícula, o composición farmacéutica se administra al sujeto una vez en un período de 3, 6, 9, 12, 18, o 24 meses.
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