ES2967710T3

ES2967710T3 - Péptidos y procedimientos para la detección de anticuerpos contra la enfermedad de Lyme

Info

Publication number: ES2967710T3
Application number: ES19150770T
Authority: ES
Inventors: Rajesh Mehra; Kenneth Aron; Dennis Bleile; Jeremy Walker; Cristina Cuesico
Original assignee: Zoetis Services LLC
Current assignee: Zoetis Services LLC
Priority date: 2011-11-04
Filing date: 2012-11-05
Publication date: 2024-05-03
Anticipated expiration: 2032-11-05
Also published as: CN103998459A; EP3502125A1; EP2773654A1; US20230228747A1; JP6839485B2; DK3502125T3; US8758772B2; KR20190137172A; KR20140091735A; US9201071B2; WO2013067524A1; US20160109446A1; JP2021004251A; EP3502125B1; US10073095B2; EP2773654A4; US20180372743A1; FI3502125T3; JP2019048811A; CA2851540A1

Abstract

Se describen composiciones (por ejemplo, composiciones peptídicas) útiles para la detección de anticuerpos que se unen a antígenos de Borrelia. Las composiciones peptídicas comprenden secuencias polipeptídicas que comprenden variantes en el dominio IR6 de la proteína Borrelia VIsE. También se proporcionan dispositivos, métodos y kits que comprenden dichas composiciones peptídicas y son útiles para la detección de anticuerpos que se unen a antígenos de Borrelia y el diagnóstico de la enfermedad de Lyme. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Péptidos y procedimientos para la detección de anticuerpos contra la enfermedad de Lyme

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de EE. UU. n.° 61/556061, presentada el 4 de noviembre de 2011.

Antecedentes de la invención

La enfermedad de Lyme es una afección debilitante que se ha convertido en un importante problema de salud pública. La enfermedad está causada por la infección con una bacteriaBorreliapatógena (una espiroqueta) y se transmite por la picadura de diversas especies de garrapatasIxodesinfectadas porBorrelia.La detección precisa y precoz de la enfermedad de Lyme es fundamental para un tratamiento eficaz. El único síntoma clínico suficiente para diagnosticar la enfermedad de Lyme es la presencia de eritema migratorio, una erupción con aspecto de ojo de buey. Sin embargo, el eritema migratorio sólo está presente al principio de la infección e, incluso entonces, no aparece en todos los individuos infectados. Otros síntomas clínicos que se han asociado a la enfermedad de Lyme, tal como la parálisis de Bell, no son suficientemente específicos, ni solos ni en combinación, para determinar el diagnóstico clínico en ausencia de eritema migratorio.

En ausencia de eritema migratorio, la base para el diagnóstico de la enfermedad de Lyme es una respuesta de anticuerpos a una especie patógena deBorrelia,tal comoBorrelia burgdorferi, Borrelia afzellioBorrelia garinii.En Norteamérica, el Centro de Control de Enfermedades (Center for Disease Control, CDC) recomienda un enfoque de dos niveles para el serodiagnóstico de la enfermedad de Lyme que consiste en un ensayo sensible de primer nivel, tal como ELISA, seguido de una transferencia Western si el ensayo de primer nivel es positivo o equívoco. Los ensayos de primer nivel han utilizado tradicionalmente un antígeno deBorrelia burgdorferide célula entera o proteínas recombinantes deBorrelia.Sin embargo, estos ensayos pueden ser difíciles de interpretar y se complican por los anticuerpos deBorreliaque surgen de la vacunación y no de la infección. Además, los sonicados de células enteras utilizados en algunos ensayos deBorreliareaccionan con los anticuerpos deTreponema.

Más recientemente, el ensayo del péptido C6, basado en el dominio conservado IR6 del antígeno de superficie variable (VIsE) deBorrelia,ha sido ampliamente aceptado como un ensayo de primer nivel con un alto grado de sensibilidad para la enfermedad de Lyme diseminada y tardía. El ensayo del péptido C6 utiliza una única secuencia de 25 aminoácidos de la proteína VisE deBorrelia burgdorfericomo antígeno de prueba. Aunque se ha sugerido que el ensayo del péptido C6 puede ser adecuado para un enfoque de un solo nivel para el diagnóstico de la enfermedad de Lyme, cada vez es más evidente que el ensayo C6 no es lo suficientemente sensible para tales fines, ya que no detecta determinadas cepas deBorreliainfecciosas.

En consecuencia, sigue existiendo la necesidad en la técnica de ensayos adicionales para la detección de antígenos deBorreliay el serodiagnóstico de la enfermedad de Lyme.

Sumario de la invención

La invención se define por las reivindicaciones anexas y proporciona una mezcla de péptidos aislados que comprende tres o más péptidos aislados diferentes, en los que cada péptido aislado comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 3-146, en los que cada péptido aislado comprende, además, una secuencia peptídica N-terminal adicional, en la que la secuencia es n<1>-n<2>-S-P-n<5>-n<6>-P (SEQ ID NO: 149), en la que n es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A y V, n<2>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E y D, n<5>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K y R, y n<6>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K y R; y una secuencia peptídica C-terminal adicional en la que la secuencia es: (i) V-c<2>-E-G-c<5>-Q-Q-E-G-A-Q-Q-P-S-C (SEQ ID NO: 150), en la que c<2>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q y R, y c<5>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V y A; o (ii) A-V-c<3>-E-G-c<6>-Q-Q-E-G-A-Q-Q-P-S<( S e Q>ID NO: 151), en la que c<3>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q y R, y c<6>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V y A. Cualquier otro aspecto, configuración, caso o realización expuestos en el presente documento que no se incluyan en el alcance de las reivindicaciones son meramente informativos. La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que determinadas variantes de secuencia en el dominio IR6 de la proteína VisE deBorreliaproporcionan una detección robusta de una respuesta de anticuerpos contra una amplia gama de especies deBorrelia.En consecuencia, la invención proporciona una mezcla de péptidos aislados útil para la detección de anticuerpos que se unen a antígenos deBorreliay el diagnóstico de la enfermedad de Lyme.

En un aspecto, los péptidos son capaces de unirse a anticuerpos que reconocen antígenos deBorrelia.En determinados casos, los péptidos comprenden un dominio IR6 de VisE y una secuencia de al menos un antígeno distinto (por ejemplo, dos, tres, etc.) deBorrelia.En determinados casos, dicho al menos antígeno distinto deBorreliaes un antígeno de superficie (por ejemplo, OspC, p41 o una combinación de los mismos).

En determinados casos, los péptidos comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 1, L-K-K-D-D-N-I-A-A-A-X<11>-V-L-R-G-X<16>-X<17>-K-D-G-X<21>-F-A-X<24>-X<25>(SEQ ID NO: 1), en la que X<11>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V y L, Xes un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L e I, X<17>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A y V, X<21>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R, D y N, X<24>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, W e Y, y X<25>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K y R.

En determinados casos, los péptidos comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 1 y comprender además una secuencia peptídica N-terminal adicional. La secuencia peptídica N-terminal adicional puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos y puede ser una secuencia nativa o no nativa. En determinados casos, los péptidos comprenden una secuencia definida por SEQ ID NO: 1 y comprenden además una secuencia C-terminal adicional. La secuencia peptídica C-terminal adicional puede comprender 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos y puede ser una secuencia nativa o no nativa. En determinados casos, la secuencia no nativa comprende un antígeno deBorreliadistinto de VlsE (por ejemplo, un antígeno OspC o p41 deBorrelia).

En otras realizaciones, los péptidos comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 2, n<1>-n<2>-S-P-n<5>-n<6>-P-L-K-K-D-D-N-I-A-A-A-X<18>-V-L-R-G-X<23>-X<24>-K-D-G-X<28>-F-A- X<31>-X<32>-A-V-c<35>-E-G-c<38>-Q-Q-E-G-A-Q-Q-P-S-C (SEQ ID NO: 2), en la que n<1>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A y V, n<2>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E y D, n<5>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K y R, n<6>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K y R, X<18>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V y L, X<23>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L e I, X<24>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A y V, X<28>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R, D y N, X<31>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, W e Y, X<32>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K y R, c<35>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q y R, y c<38>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V y A.

En determinadas realizaciones, los péptidos comprenden al menos 25, 30, 35, 40, 45 o más aminoácidos. Los péptidos son péptidos aislados (por ejemplo, sintéticos y/o purificados). En determinadas realizaciones, los péptidos se conjugan con un ligando. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, los péptidos están biotinilados. En otras realizaciones, los péptidos se conjugan con avidina, estreptavidina o neutravidina. En otras realizaciones, los péptidos se conjugan con una proteína portadora (por ejemplo, seroalbúmina, hemocianina de lapa californiana ("keyhole limpet hemocyanin", KLH) o un dominio Fc de inmunoglobulina). En otras realizaciones, los péptidos se conjugan con un dendrímero y/o forman parte de un sistema de péptidos antigénicos múltiples ("multiple antigenic peptides system", MAPS).

En determinadas realizaciones, los péptidos están unidos o inmovilizados sobre un soporte sólido. En determinadas realizaciones, el soporte sólido es una esfera (por ejemplo, una partícula coloidal, nanopartícula, esfera de látex, etc.), una ruta de flujo en un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral (por ejemplo, una membrana porosa), una ruta de flujo en un rotor analítico, o un tubo o pocillo (por ejemplo, en una placa adecuada para un ensayo ELISA).

En otro aspecto, se describen en el presente documento composiciones que comprenden uno o más péptidos de la invención. Por ejemplo, en determinados casos, la divulgación proporciona una composición que comprende un péptido que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 1, un péptido que comprende una secuencia de<s>E<q>ID NO: 2, o sus mezclas. En determinados casos, la composición comprende una mezcla de dos, tres, cuatro o más péptidos diferentes, en la que cada péptido comprende una secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.

En determinadas realizaciones, los péptidos se conjugan con un ligando o un resto de transducción de señales. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, los péptidos están biotinilados. En otras realizaciones, los péptidos se conjugan con avidina, estreptavidina o neutravidina. En otras realizaciones, los péptidos se conjugan con una proteína portadora (por ejemplo, seroalbúmina, hemocianina de lapa californiana ("keyhole limpet hemocyanin", KLH) o un dominio Fc de inmunoglobulina). En otras realizaciones, los péptidos se conjugan con un dendrímero y/o forman parte de un sistema de péptidos antigénicos múltiples (MAPS).

En el presente documento se describen, pero no forman parte de la invención reivindicada, ácidos nucleicos que comprenden una secuencia que codifica un péptido descrito en el presente documento. Además, se divulgan vectores que comprenden tales ácidos nucleicos y las células hospedadoras que comprenden tales vectores. En determinados casos, el vector es un vector lanzadera. En otros casos, el vector es un vector de expresión (por ejemplo, un vector de expresión bacteriano o eucariota). En determinados casos, la célula hospedadora es una célula bacteriana. En otros casos, la célula hospedadora es una célula eucariota.

En el presente documento se describen dispositivos que no forman parte de la invención reivindicada. En determinados casos, los dispositivos son útiles para realizar un inmunoensayo. Por ejemplo, en determinados casos, el dispositivo es un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral. En otros casos, el dispositivo es un rotor analítico. En otros casos, el dispositivo es un tubo o un pocillo, por ejemplo, en una placa adecuada para un ensayo ELISA. En otros casos, el dispositivo es un sensor electroquímico, óptico u optoelectrónico.

En determinados casos, el dispositivo comprende un péptido. En otros casos, el dispositivo comprende una mezcla de diferentes péptidos de la invención. Por ejemplo, en determinados casos, el dispositivo comprende dos, tres, cuatro o más péptidos diferentes. En determinados casos, el péptido o cada péptido de la mezcla comprende una secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. En determinadas realizaciones, los péptidos están unidos o inmovilizados sobre el dispositivo.

En otro aspecto, la invención proporciona procedimientos para detectar, en una muestra, un anticuerpo contra un epítopo de un antígeno deBorrelia,como se define en el conjunto de reivindicaciones adjunto. En determinadas realizaciones, los procedimientos comprenden poner en contacto una muestra con la mezcla de péptidos de la invención, y detectar la formación de un complejo anticuerpo-péptido que comprende uno o más péptidos aislados en la mezcla, en los que la formación de dicho complejo es indicativa de la presencia de un anticuerpo contra un epítopo de un antígeno deBorreliaen dicha muestra. En determinadas realizaciones, el antígeno deBorreliaes de una especie infecciosa deBorrelia,tal comoBorrelia burgdorferi, Borrelia afzellioBorrelia garinii.En determinadas realizaciones, los procedimientos comprenden poner en contacto la muestra con una mezcla de cuatro o más péptidos diferentes.

El péptido o cada péptido de la mezcla es un péptido aislado (por ejemplo, sintético y/o purificado). En determinadas realizaciones, el péptido o la mezcla de péptidos está unido o inmovilizado sobre un soporte sólido. En determinadas realizaciones, el soporte sólido es una esfera (por ejemplo, una partícula coloidal, nanopartícula, esfera de látex, etc.), una ruta de flujo en un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral (por ejemplo, una membrana porosa), una ruta de flujo en un rotor analítico, o un tubo o un pocillo (por ejemplo, en una placa adecuada para un ensayo ELISA). En determinadas realizaciones, el soporte sólido comprende metal, vidrio, un material a base de celulosa (por ejemplo, nitrocelulosa) o un polímero (por ejemplo, poliestireno, polietileno, polipropileno, poliéster, nailon, polisulfona, etc.). En determinadas realizaciones, el péptido o la mezcla de diferentes péptidos está unido a un dendrímero y/o se incorpora a un sistema MAPS. En otras realizaciones, el péptido o la mezcla de diferentes péptidos está unido a la BSA.

En determinadas realizaciones, la etapa de detección comprende la realización de un ensayo ELISA. En otras realizaciones, la etapa de detección comprende la realización de un inmunoensayo de flujo lateral. En otras realizaciones, la etapa de detección comprende la realización de un ensayo de aglutinación. En otras realizaciones, la etapa de detección comprende hacer girar la muestra en un rotor analítico. En otras realizaciones, la etapa de detección comprende el análisis de la muestra mediante transferencia Western, transferencia por ranuras o transferencia por puntos. En otras realizaciones, la etapa de detección comprende el análisis de la muestra con un sensor electroquímico, un sensor óptico o un sensor optoelectrónico.

En determinadas realizaciones, la muestra es un líquido corporal, tal como sangre, suero, plasma, líquido cefalorraquídeo, orina, moco o saliva. En otras realizaciones, la muestra es un tejido (por ejemplo, un homogeneizado de tejido) o un lisado celular. En determinadas realizaciones, la muestra procede de un animal salvaje (por ejemplo, un ciervo o un roedor, tal como un ratón, una ardilla listada, una ardilla, etc.). En otras realizaciones, la muestra procede de un animal de laboratorio (por ejemplo, un ratón, una rata, una cobaya, un conejo, un mono, un primate, etc.). En otras realizaciones, la muestra procede de un animal domesticado o salvaje (por ejemplo, un perro, un gato, un caballo). En otras realizaciones, la muestra procede de un ser humano.

En otro aspecto, la invención proporciona procedimientos para diagnosticar la enfermedad de Lyme en un sujeto tal como se indica en el conjunto de reivindicaciones adjunto. En determinadas realizaciones, los procedimientos comprenden poner en contacto una muestra del sujeto con la mezcla de péptidos aislados de la invención, y detectar la formación de un complejo anticuerpo-péptido que comprende uno o más péptidos aislados en la mezcla, en los que la formación de dicho complejo es indicativa de que el sujeto tiene la enfermedad de Lyme. En determinadas realizaciones, los procedimientos comprenden poner en contacto la muestra con una mezcla de cuatro, o más péptidos diferentes de la invención.

El péptido o cada péptido de la mezcla es un péptido aislado (por ejemplo, sintético y/o purificado). En determinadas realizaciones, el péptido o la mezcla de diferentes péptidos está unido o inmovilizado sobre un soporte sólido. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el soporte sólido es una esfera (por ejemplo, una partícula coloidal, nanopartícula, esfera de látex, etc.), una ruta de flujo en un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral (por ejemplo, una membrana porosa), una ruta de flujo en un rotor analítico, o un tubo o un pocillo (por ejemplo, en una placa adecuada para un ensayo ELISA). En determinadas realizaciones, el soporte sólido comprende metal, vidrio, un material a base de celulosa (por ejemplo, nitrocelulosa) o un polímero (por ejemplo, poliestireno, polietileno, polipropileno, poliéster, nailon, polisulfona, etc.). En determinadas realizaciones, el péptido o la mezcla de diferentes péptidos está unido a un dendrímero y/o se incorpora a un sistema MAPS. En otras realizaciones, el péptido o la mezcla de diferentes péptidos está unido a la BSA.

En determinadas realizaciones, la muestra es un líquido corporal, tal como sangre, suero, plasma, líquido cefalorraquídeo, orina o saliva. En otras realizaciones, la muestra es un tejido (por ejemplo, un homogeneizado de tejido) o un lisado celular. En determinadas realizaciones, el sujeto es un animal salvaje (por ejemplo, un ciervo o un roedor, tal como un ratón, una ardilla listada, una ardilla, etc.). En otras realizaciones, el sujeto es un animal de laboratorio (por ejemplo, un ratón, rata, cobaya, conejo, mono, primate, etc.). En otras realizaciones, el sujeto es un animal domesticado o salvaje (por ejemplo, un perro, un gato, un caballo). En otras realizaciones, el sujeto es un ser humano.

En otro aspecto más, la invención proporciona kits tal como se indica en el conjunto de reivindicaciones adjunto. En determinadas realizaciones, los kits comprenden la mezcla de péptidos aislados de la invención, es decir, tres, cuatro o más péptidos diferentes, y un reactivo de marcaje capaz de unirse a un anticuerpo que reconoce un epítopo de uno o más péptidos aislados de la mezcla. Los péptidos pueden comprender una secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. En determinadas realizaciones, los péptidos están unidos o inmovilizados sobre un soporte sólido. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el soporte sólido es una esfera (por ejemplo, una partícula coloidal, nanopartícula, esfera de látex, etc.), una ruta de flujo en un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral, una ruta de flujo en un rotor analítico, o un tubo o un pocillo (por ejemplo, en una placa). En determinadas realizaciones, el péptido o la mezcla de diferentes péptidos está unido a un dendrímero y/o se incorpora a un sistema MAPS. En otras realizaciones, el péptido o la mezcla de diferentes péptidos está unido a la BSA.

En determinadas realizaciones, los kits comprenden además una población de esferas o una placa (por ejemplo, una placa adecuada para un ensayo ELISA). En otras realizaciones, los kits comprenden además un dispositivo, tal como un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral, un rotor analítico, una transferencia Western, una transferencia por puntos, una transferencia por ranuras, un sensor electroquímico, un sensor óptico o un sensor optoelectrónico. En determinadas realizaciones, la población de esferas, la placa o el dispositivo son útiles para realizar un inmunoensayo. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, la población de esferas, la placa o el dispositivo son útiles para detectar la formación de un complejo anticuerpo-péptido que comprende un anticuerpo de una muestra y un péptido de la invención. En determinadas realizaciones, un péptido o una mezcla de diferentes péptidos de la invención se une o inmoviliza sobre las esferas, la placa o el dispositivo.

En determinadas realizaciones, los kits comprenden además instrucciones. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, los kits comprenden instrucciones que indican cómo utilizar un péptido de la invención para detectar un anticuerpo contra un antígeno deBorreliao para diagnosticar la enfermedad de Lyme. En determinadas realizaciones, los kits comprenden instrucciones que indican cómo utilizar una población de esferas, una placa o un dispositivo (por ejemplo, que comprende un péptido o una mezcla de diferentes péptidos de la invención) para detectar un anticuerpo contra un antígeno deBorreliao para diagnosticar la enfermedad de Lyme.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un diagrama de un ensayo indirecto de tipo "sandwich" que puede utilizarse para detectar anticuerpos contra antígenos deBorrelia.En esta realización, se inmovilizan anticuerpos anti-IgG/IgM humanas o anti-IgG/IgM de perro sobre un sustrato adecuado (por ejemplo, una membrana de nitrocelulosa) en la zona de ensayo. Los anticuerpos inmovilizados se unen a los anticuerpos presentes en una muestra de ensayo. Los anticuerpos de la muestra de ensayo contra los antígenos deBorreliaadecuados se unirán entonces a los péptidos de la invención. Cuando los péptidos de la invención se conjugan con biotina, puede utilizarse estreptavidina marcada con oro coloidal para detectar la presencia de los péptidos en la zona de ensayo. Se puede apreciar que el ensayo indirecto de tipo "sandwich" se puede ejecutar a la inversa, es decir, los péptidos de la invención se pueden inmovilizar sobre un sustrato para capturar anticuerpos anti-Borreliaen una muestra de ensayo y se pueden utilizar anticuerpos anti-IgG/IgM humana o anti-IgG/IgM de perro conjugados con un marcador (por ejemplo, oro coloidal) para detectar la presencia de los anticuerpos unidos a los péptidos inmovilizados en la zona de ensayo.

La figura 2 es un diagrama de un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral basado en el ensayo indirecto de tipo "sandwich" de la figura 1. En esta realización de un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral, la muestra se aplica en un lecho corto de carga de muestra y luego se hace fluir a través del lecho corto de conjugado hasta la membrana de ensayo. Los complejos de péptido-biotina-estreptavidina-oro se solubilizan a medida que la muestra pasa a través del lecho corto de conjugado y se forman entonces complejos entre los péptidos de la invención y los anticuerpos antiantígeno deBorreliaadecuados. La zona de ensayo comprende anticuerpos anti-IgG o anti-IgM adecuados para la muestra, que se unen a todos los anticuerpos de la muestra. La proteína L, por ejemplo, puede utilizarse en lugar de anticuerpos anti-IgG o anti-IgM. Si hay suficientes anticuerpos en la muestra que se hayan unido a los péptidos de la invención, aparecerá una señal positiva en la zona de ensayo. En otra realización de un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral, los péptidos de la invención se inmovilizan en la zona de ensayo (T) y los anticuerpos anti-IgG o anti-IgM adecuados para la muestra (por ejemplo, anti-IgG o anti-IgM humanas o caninas) conjugados con un marcador detectable (por ejemplo, partículas de oro coloidal) están presentes en el lecho corto de conjugado. La muestra que pasa a través del lecho corto de conjugado solubiliza los anticuerpos marcados y cualquier anticuerpo antiantígeno deBorreliapresente en la muestra de ensayo se une a los anticuerpos marcados, y tales complejos de anticuerpos son capturados por los péptidos deBorreliainmovilizados de la invención en la zona de ensayo, produciendo así una señal positiva. En cualquiera de las dos formas de realización, el dispositivo puede comprender además una zona de control (C) en el que se inmovilizan los compañeros de unión que reconocen el péptido marcado o el anticuerpo marcado en el lecho corto de conjugado.

La figura 3 es un diagrama de un ensayo de doble antígeno de tipo "sandwich" que puede utilizarse para detectar anticuerpos contra antígenos deBorrelia.En esta realización, los péptidos de la invención se inmovilizan sobre un sustrato adecuado (por ejemplo, una membrana de nitrocelulosa, un pocillo de una placa ELISA) en una zona de ensayo. Los anticuerpos de una muestra de ensayo se unen a los péptidos inmovilizados de la invención. Los anticuerpos de la muestra de ensayo contra los antígenos deBorreliaadecuados se unirán entonces a un segundo conjunto de péptidos de la invención que están conjugados con una molécula detectora (por ejemplo, oro coloidal, peroxidasa de rábano picante ("horse radish peroxidase", HRP), fosfatasa alcalina (ALP)), que detecta la presencia de los anticuerpos unidos al primer conjunto de péptidos inmovilizados en la zona de ensayo.

La figura 4 es un diagrama de un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral que puede utilizarse para detectar anticuerpos contra antígenos deBorrelia.En esta realización de un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral, los péptidos de la invención se inmovilizan sobre un sustrato adecuado (por ejemplo, una membrana de nitrocelulosa) en una zona de ensayo. Los anticuerposanti-Borreliade una muestra de ensayo se unen a los péptidos inmovilizados de la invención. Se añaden al sistema proteína A conjugada con oro y/o proteína G conjugada con oro y estas se unen a la porción Fc del anticuerpoanti-Borreliacapturado, produciendo así una señal positiva. En esta realización, el dispositivo puede comprender además una zona de control en la que se inmovilizan los compañeros de unión que reconocen la proteína A conjugada con oro y/o la proteína G conjugada con oro. Tales socios de unión pueden incluir, entre otros, antiproteína A, antiproteína G, IgG de ratón y/u otras moléculas de IgG similares.

La figura 5 es un diagrama de un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral que puede utilizarse para detectar anticuerpos contra antígenos deBorrelia.En esta realización de un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral, los péptidos de la invención se inmovilizan sobre un sustrato adecuado (por ejemplo, una membrana de nitrocelulosa) en una zona de ensayo. Los anticuerposanti-Borreliade una muestra de ensayo se unen a los péptidos inmovilizados de la invención. Los anticuerposanti-Borreliapueden ser detectados por péptidos de la invención conjugados con oro, produciendo así una señal positiva. Pueden añadirse al sistema proteína A conjugada con oro y/o proteína G conjugada con oro para mejorar la señal uniéndose a la porción Fc del anticuerpoanti-Borreliacapturado. En esta realización, el dispositivo puede comprender además una zona de control en la que se inmovilizan los compañeros de unión que reconocen la proteína A conjugada con oro y/o la proteína G conjugada con oro. Tales socios de unión pueden incluir, entre otros, antiproteína A, antiproteína G, IgG de ratón y/u otras moléculas de IgG similares.

Descripción detallada

Tal como se utilizan en el presente documento, los siguientes términos y expresiones tendrán el significado que se indica a continuación:

El término "antígeno", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula capaz de ser reconocida por un anticuerpo. Un antígeno puede ser, por ejemplo, un péptido o una forma modificada del mismo. Un antígeno puede comprender uno o más epítopos.

El término "epítopo", tal como se utiliza en el presente documento, es una porción de un antígeno que es reconocida específicamente por un anticuerpo. Un epítopo, por ejemplo, puede comprender o consistir en una porción de un péptido (por ejemplo, un péptido de la invención). Un epítopo puede ser lineal, secuencial o conformacional. En determinadas realizaciones, los epítopos pueden comprender regiones no contiguas.

La expresión "ácido nucleico" y los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" se utilizan indistintamente en el presente documento e incluyen el ADN, el ARN y el ADNc, ya sean monocatenarios o bicatenarios, así como sus modificaciones químicas.

Las abreviaturas de aminoácidos de una sola letra utilizadas en el presente documento tienen su significado convencional en la técnica, y todas las secuencias peptídicas descritas en el presente documento se escriben según la convención, con el extremo N-terminal a la izquierda y el extremo C-terminal a la derecha.

Otros términos y expresiones se definirán, según proceda, en la descripción detallada que sigue.

Composiciones y dispositivos

La invención se define mediante el conjunto de reivindicaciones adjunto. Todos los demás aspectos, configuraciones o realizaciones expuestos en el presente documento que no entren en el alcance de las reivindicaciones son meramente informativos. La presente invención y divulgación se basa, en parte, en el descubrimiento de que determinadas variantes de secuencia en el dominio IR6 de la proteína VisE deBorreliaproporcionan una detección robusta de una respuesta de anticuerpos contra una amplia gama de especies deBorrelia.En consecuencia, en un aspecto, la invención proporciona una mezcla de péptidos aislados capaces de unirse a anticuerpos que reconocen antígenos deBorrelia.

En determinados casos, los péptidos descritos en el presente documento comprenden un dominio IR6 de VisE, o un fragmento del mismo, y una secuencia (por ejemplo, una secuencia que comprende un epítopo) de al menos un antígeno distinto (por ejemplo, dos, tres, etc.) deBorrelia.En determinadas realizaciones, dicho al menos antígeno distinto deBorreliaes un antígeno de superficie o un antígeno seleccionado del grupo que consiste en OspA, OspB, OspC, p41 y combinaciones de los mismos. Así, por ejemplo, en determinadas realizaciones, los péptidos comprenden (i) un dominio IR6 de VisE, o un fragmento del mismo, y (ii) una secuencia que comprende un epítopo de una proteína OspA, una secuencia que comprende un epítopo de una proteína OspB, una secuencia que comprende un epítopo de una proteína OspC, una secuencia que comprende un epítopo de una proteína p41 o una combinación de tales secuencias. En otras realizaciones, los péptidos comprenden (i) un dominio IR6 de VisE, o un fragmento del mismo, (ii) una secuencia que comprende un epítopo de una proteína OspC, y (iii) una secuencia que comprende un epítopo de una proteína p41.

En determinados casos, los péptidos comprenden o consisten en una secuencia de SEQ ID NO: 1, L-K-K-D-D-N-I-A-A-A-X<11>-V-L-R-G-X<16>-X<17>-K-D-G-X<21>-F-A-X<24>-X<25>(SEQ ID NO: 1), en la que X<11>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V y L, X<16>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L e I, X<17>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A y V, X<21>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R, D y N, X<24>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, W e Y, y X<25>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K y R.

Un péptido de la invención comprende la secuencia L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-L-A-K-D-G-R-F-A-I-K (SEQ ID NO: 3); L-K-K-D-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-L-A-K-D-G-R-F-A-I-K (SEQ ID NO: 4); L-K-K-D-D-N-I-A-A-V-L-R-G-I-A-K-D-G-R-F-A-I-K (SEQ ID NO: 5); L-K-K-D-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-A-K-D-G-R-F-A-I-K (SEQ ID NO: 6); L-K-K-D-D-N-I-A-A-V-L-R-G-L-V-K-D-G-R-F-A-I-K (SEQ ID NO: 7); L-K-K-D-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-L-V-K-D-G-R-F-A-I-K (SEQ ID NO: 8); L-K-K-D-D-N-I-A-A-V-L-R-G-I-V-K-D-G-R-F-A-I-K (SEQ ID NO: 9); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-V-K-D-G-R-F-A-I-K (SEQ ID NO: 10); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-L-A-K-D-G-D-F-A-I-K (SEQ ID NO: 11); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-L-A-K-D-G-D-F-A-I-K (SEQ ID NO: 12); L-K-K-D-D-N-I-A-A-V-L-R-G-I-A-K-D-G-D-F-A-I-K (SEQ ID NO: 13); L-K-K-D-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-A-K-D-G-D-F-A-I-K (SEQ ID NO: 14); L-K-K-D-D-N-I-A-A-V-L-R-G-L-V-K-D-G-D-F-A-I-K (SEQ ID NO: 15); L-K-K-D-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-L-V-K-D-G-D-F-A-I-K (SEQ ID NO: 16); L-K-K-D-D-N-I-A-A-V-L-R-G-I-V-K-D-G-D-F-A-I-K (SEQ ID NO: 17); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-V-K-D-G-D-F-A-I-K (SEQ ID NO: 18); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-L-A-K-D-G-N-F-A-I-K (SEQ ID NO: 19); L-K-K-D-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-L-A-K-D-G-N-F-A-I-K (SEQ ID NO: 20); L-K-K-D-D-N-I-A-A-V-L-R-G-I-A-K-D-G-N-F-A-I-K (SEQ ID NO: 21); L-K-K-D-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-A-K-D-G-N-F-A-I-K (SEQ ID NO: 22); L-K-K-D-D-N-I-A-A-V-L-R-G-L-V-K-D-G-N-F-A-I-K (SEQ ID NO: 23); L-K-K-D-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-L-V-K-D-G-N-F-A-I-K (SEQ ID NO: 24); L-K-K-D-D-N-I-A-A-V-V-L-R-G-I-V-K-D-G-N-F-A-I-K (SEQ ID NO: 25); L-K-K-D-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-V-K-D-G-N-F-A-I-K (SEQ ID NO: 26); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-L-A-K-D-G-R-F-A-W-K (SEQ ID NO: 27); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-L-A-K-D-G-R-F-A-W-K (SEQ ID NO: 28); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-I-A-K-D-G-R-F-A-W-K (SEQ ID NO: 29); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-A-K-D-G-R-F-A-W-K (SEQ ID NO: 30); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-L-V-K-D-G-R-F-A-W-K (SEQ ID NO: 31); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-L-V-K-D-G-R-F-A-W-K (SEQ ID NO: 32); L-K-K-D-D-N-I-A-A-V-L-R-G-1-V-K-D-G-R-F-A-W-K (SEQ ID NO: 33); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-V-K-D-G-R-F-A-W-K (SEQ ID NO: 34); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-L-A-K-D-G-D-F-A-W-K (SEQ ID NO: 35); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-L-A-K-D-G-D-F-A-W-K (SEQ ID NO: 36); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-I-A-K-D-G-D-F-A-W-K (SEQ ID NO: 37); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-A-K-D-G-D-F-A-W-K (SEQ ID NO: 38); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-L-V-K-D-G-D-F-A-W-K (SEQ ID NO: 39); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-L-V-K-D-G-D-F-A-W-K (SEQ ID NO: 40); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-I-V-K-D-G-D-F-A-W-K (SEQ ID NO: 41); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-V-K-D-G-D-F-A-W-K (SEQ ID NO: 42); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-L-A-K-D-G-N-F-A-W-K (SEQ ID NO: 43); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-L-A-K-D-G-N-F-A-W-K (SEQ ID NO: 44); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-I-A-K-D-G-N-F-A-W-K (SEQ ID NO: 45); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-A-K-D-G-N-F-A-W-K (SEQ ID NO: 46); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-L-V-K-D-G-N-F-A-W-K (SEQ ID NO: 47); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-L-V-K-D-G-N-F-A-W-K (SEQ ID NO: 48); L-K-K-D-D-N-I-A-A-V-L-R-G-I-V-K-D-G-N-F-A-W-K (SEQ ID NO: 49); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-V-K-D-G-N-F-A-W-K (SEQ ID NO: 50); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-L-A-K-D-G-R-F-A-Y-K (SEQ ID NO: 51); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-L-A-K-D-G-R-F-A-Y-K (SEQ ID NO: 52); L-K-K-D-D-N-I-A-A-A-V-L-R-G-I-A-K-D-G-R-F-A-Y-K (SEQ ID NO: 53); L-K-K-D-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-A-K-D-G-R-F-A-Y-K (SEQ ID NO: 54); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-L-V-K-D-G-R-F-AY-K (SEQ ID NO: 55); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-L-V-K-D-G-R-F-A-Y-K (SEQ ID NO: 56); L-K-K-D-D-N-I-A-A-V-V-L-R-G-I-V-K-D-G-R-F-A-Y-K (SEQ ID NO: 57); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-V-K-D-G-R-F-A-Y-K (SEQ ID NO: 58); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-L-A-K-D-G-D-F-A-Y-K (SEQ ID NO: 59); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-L-A-K-D-G-D-F-A-Y-K (SEQ ID NO: 60); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-I-A-K-D-G-D-F-A-Y-K (SEQ ID NO: 61); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-A-K-D-G-D-F-A-Y-K (SEQ ID NO: 62); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-L-V-K-D-G-D-F-A-Y-K (SEQ ID NO: 63); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-L-V-K-D-G-D-F-A-Y-K (SEQ ID NO: 64); L-K-K-D-D-N-I-A-A-V-L-R-G-I-V-K-D-G-D-F-A-Y-K (SEQ ID NO: 65); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-V-K-D-G-D-F-A-Y-K (SEQ ID NO: 66); L-K-K-D-D-N-I-A-A-A-V-L-R-G-L-A-K-D-G-N-F-A-Y-K (SEQ ID NO: 67); L-K-K-D-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-L-A-K-D-G-N-F-A-Y-K (SEQ ID NO: 68); L-K-K-D-D-N-I-A-A-A-V-L-R-G-I-A-K-D-G-N-F-A-Y-K (SEQ ID NO: 69); L-K-K-D-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-A-K-D-G-N-F-A-Y-K (SEQ ID NO: 70); L-K-K-D-D-N-I-A-A-V-L-R-G-L-V-K-D-G-N-F-A-Y-K (SEQ ID NO: 71); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-L-V-K-D-G-N-F-A-Y-K (SEQ ID NO: 72); L-K-K-D-D-N-I-A-A-V-V-L-R-G-I-V-K-D-G-N-F-A-Y-K (SEQ ID NO: 73); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-V-K-D-G-N-F-A-Y-K (SEQ ID NO: 74); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-L-A-K-D-G-R-F-A-I-R (SEQ ID NO: 75); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-L-A-K-D-G-R-F-A-I-R (SEQ ID NO: 76); L-K-K-D-N-I-A-A-V-LR-G-I-A-K-D-G-R-F-A-I-R (SEQ ID NO: 77); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-A-K-D-G-R-F-A-I-R (SEQ ID NO: 78); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-L-V-K-D-G-R-F-A-1-R (SEQ ID NO: 79); L-K-K-D-N-1-A-A-L-V-L-R-G-L-V-K-D-G-R-F-A-I-R (SEQ ID NO: 80); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-I-V-K-D-G-R-F-A-I-R (SEQ ID NO: 81); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-V-K-D-G-R-F-A-I-R (SEQ ID NO: 82); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-L-A-K-D-G-D-F-A-I-R (SEQ ID NO: 83); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-L-A-K-D-G-D-F-A-I-R (SEQ ID NO: 84); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-I-A-K-D-G-D-F-A-I-R (SEQ ID NO: 85); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-A-K-D-G-D-F-A-I-R (SEQ ID NO: 86); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-L-V-K-D-G-D-F-A-I-R (SEQ ID NO: 87); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-L-V-K-D-G-D-F-A-I-R (SEQ ID NO: 88); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-I-V-K-D-G-D-F-A-I-R (SEQ ID NO: 89); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-V-K-D-G-D-F-A-I-R (SEQ ID NO: 90); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-L-A-K-D-G-N-F-A-I-R (SEQ ID NO: 91); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-L-A-K-D-G-N-F-A-I-R (SEQ ID NO: 92); L-K-K-D-D-N-I-A-A-V-L-R-G-I-A-K-D-G-N-F-A-I-R (SEQ ID NO: 93); L-K-K-D-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-A-K-D-G-N-F-A-I-R (SEQ ID NO: 94); L-K-K-D-D-N-I-A-A-V-L-R-G-L-V-K-D-G-N-F-A-I-R (SEQ ID NO: 95); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-L-V-K-D-G-N-F-A-I-R (SEQ ID NO: 96); L-K-K-D-D-N-I-A-A-V-V-L-R-G-I-V-K-D-G-N-F-A-I-R (SEQ ID NO: 97); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-V-K-D-G-N-F-A-I-R (SEQ ID NO: 98); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-L-A-K-D-G-R-F-A-W-R (SEQ ID NO: 99); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-L-A-K-D-G-R-F-A-W-R (SEQ ID NO: 100); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-I-A-K-D-G-R-F-A-W-R (SEQ ID NO: 101); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-A-K-D-G-R-F-A-W-R (SEQ ID NO: 102); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-L-V-K-D-G-R-F-A-W-R (SEQ ID NO: 103); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-L-V-K-D-G-R-F-A-W-R (SEQ ID NO: 104); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-I-V-K-D-G-R-F-A-W-R (SEQ ID NO: 105); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-V-K-D-G-R-F-A-W-R (SEQ ID NO: 106); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-L-A-K-D-G-D-F-A-W-R (SEQ ID NO: 107); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-L-A-K-D-G-D-F-A-W-R (SEQ ID NO: 108); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-I-A-K-D-G-D-F-A-W-R (SEQ ID NO: 109); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-A-K-D-G-D-F-A-W-R (SEQ ID NO: 110); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-L-V-K-D-G-D-F-A-W-R (SEQ ID NO: 111); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-L-V-K-D-G-D-F-A-W-R (SEQ ID NO: 112); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-I-V-K-D-G-D-F-A-W-R (SEQ ID NO: 113); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-V-K-D-G-D-F-A-W-R (SEQ ID NO: 114); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-L-A-K-D-G-N-F-A-W-R (SEQ ID NO: 115); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-L-A-K-D-G-N-F-A-W-R (SEQ ID NO: 116); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-I-A-K-D-G-N-F-A-W-R (SEQ ID NO: 117); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-A-K-D-G-N-F-A-W-R (SEQ ID NO: 118); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-L-V-K-D-G-N-F-A-W-R (SEQ ID NO: 119); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-L-V-K-D-G-N-F-A-W-R (SEQ ID NO: 120); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-I-V-K-D-N-F-A-W-R (SEQ ID NO: 121); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-V-K-D-G-N-F-A-W-R (SEQ ID NO: 122); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-L-A-K-D-G-R-F-A-Y-R (SEQ ID NO: 123); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-L-A-K-D-G-R-F-A-Y-R (SEQ ID NO: 124); L-K-K-D-N-I-A-A-V-V-L-R-G-I-A-K-D-G-R-F-AY-R (SEQ ID NO: 125); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-A-K-D-G-R-F-A-Y-R (SEQ ID NO: 126); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-L-V-K-D-G-R-F-A-Y-R (SEQ ID NO: 127); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-L-V-K-D-G-R-F-A-Y-R (SEQ ID NO: 128); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-I-V-K-D-G-R-F-A-Y-R (SEQ ID NO: 129); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-V-K-D-G-R-F-A-Y-R (SEQ ID NO: 130); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-L-A-K-D-G-D-F-A-Y-R (SEQ ID NO: 131); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-L-A-K-D-G-D-F-A-Y-R (SEQ ID NO: 132); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-I-A-K-D-G-D-F-A-Y-R (SEQ ID NO: 133); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-A-K-D-G-D-F-A-Y-R (SEQ ID NO: 134); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-L-V-K-D-G-D-F-A-Y-R (SEQ ID NO: 135); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-L-V-K-D-G-D-F-A-Y-R (SEQ ID NO: 136); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-I-V-K-D-G-D-F-A-Y-R (SEQ ID NO: 137); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-V-K-D-G-D-F-A-Y-R (SEQ ID NO: 138); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-L-A-K-D-G-N-F-A-Y-R (SEQ ID NO: 139); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-L-A-K-D-G-N-F-A-Y-R (SEQ ID NO: 140); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-I-A-K-D-G-N-F-A-Y-R (SEQ ID NO: 141); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-A-K-D-G-N-F-A-Y-R (SEQ ID NO: 142); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-L-V-K-D-G-N-F-A-Y-R (SEQ ID NO: 143); L-K-K-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-L-V-K-D-G-N-F-AY-R (SEQ ID NO: 144); L-K-K-D-N-I-A-A-V-L-R-G-I-V-K-D-N-F-A-Y-R (SEQ ID NO: 145); o L-K-K-D-D-N-I-A-A-L-V-L-R-G-I-V-K-D-G-N-F-A-Y-R (SEQ ID NO: 146).

En determinados casos, los péptidos comprenden una secuencia de SEQ ID NO: 1 y una secuencia peptídica N-terminal adicional (por ejemplo, una extensión N-terminal). La secuencia peptídica N-terminal adicional puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25 o más aminoácidos. En determinados casos, la secuencia peptídica N-terminal tiene una longitud de aproximadamente 5 a aproximadamente 10, de aproximadamente 10 a aproximadamente 15, de aproximadamente 15 a aproximadamente 20, de aproximadamente 20 a aproximadamente 25, de aproximadamente 25 a aproximadamente 30, de aproximadamente 30 a aproximadamente 40, o de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 aminoácidos. La secuencia peptídica N-terminal adicional puede ser una secuencia nativa. Tal como se utiliza en el presente documento, una secuencia "nativa" es una secuencia peptídica procedente de una secuencia natural de VisE deBorrelia,o una variante de la misma. En determinados casos, la secuencia peptídica es un fragmento de una secuencia natural de VisE deBorrelia.La secuencia peptídica puede proceder, por ejemplo, de una región conservada o no conservada de VisE. La secuencia peptídica puede comprender, por ejemplo, un epítopo, tal como un epítopo inmunodominante o cualquier otro epítopo reconocible por el sistema inmunitario de un hospedador (por ejemplo, ser humano, canino, etc.). Las proteínas VisE y sus péptidos se han descrito, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.os6475492, 6660274, 6719983, 6740744 y 7887815 y las patentes europeas n.os 0894143, 1012181, 1171605 y 1589109.

Los polipéptidos variantes son al menos aproximadamente un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 98 % o un 99 % idénticos a un péptido mostrado en las SEQ ID NO: 1-146. El porcentaje de identidad de secuencia tiene un significado reconocido en la técnica y existen varios procedimientos para medir la identidad entre dos secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas. Véase, por ejemplo, Lesk, ed., Computational Molecular Biology, Oxford University Press, Nueva York (1988); Smith, ed., Biocomputing: Informatics And Genome Projects, Academic Press, Nueva York (1993); Griffin y Griffin, eds., Computer Analysis Of Sequence Data, Part I, Humana Press, New Jersey (1994); von Heinje, Sequence Analysis In Molecular Biology, Academic Press (1987); y Gribskov y Devereux, eds., Sequence Analysis Primer, M Stockton Press, Nueva York (1991). Los procedimientos para alinear polinucleótidos o polipéptidos están codificados en programas informáticos, incluido el paquete de programas GCG (Devereuxet al.,Nuc. Acids Res., 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschulet al.,J. Molec. Biol., 215:403 (1990)) y el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711) que utiliza el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (Adv. App. Math., 2:482-489 (1981)). Por ejemplo, puede utilizarse el programa informático ALIGN, que emplea el algoritmo FASTA, con una búsqueda de huecos afines con una penalización por apertura de hueco de -12 y una penalización por extensión de hueco de -2.

Cuando se utiliza cualquiera de los programas de alineación de secuencias para determinar si una secuencia concreta es, por ejemplo, aproximadamente un 95 % idéntica a una secuencia de referencia, los parámetros se establecen de tal manera que el porcentaje de identidad se calcula sobre toda la longitud del polinucleótido de referencia y que se permitan brechas en la identidad de hasta el 5 % del número total de nucleótidos en el polinucleótido de referencia.

Las variantes de las secuencias peptídicas pueden seleccionarse con facilidad por un experto en la materia, basándose en parte en las propiedades conocidas de la secuencia. Por ejemplo, un péptido variante puede incluir sustituciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones conservadoras de aminoácidos) y/o deleciones (por ejemplo, deleciones pequeñas de un solo aminoácido, o deleciones que abarquen 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20 o más aminoácidos contiguos). Así, en determinadas realizaciones, una variante de una secuencia peptídica nativa es aquella que difiere de una secuencia natural por (i) una o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6 o más) sustituciones conservadoras de aminoácidos, (ii) deleción de 1 o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6 o más) aminoácidos, o (iii) una combinación de las mismas. Los aminoácidos delecionados pueden ser contiguos o no contiguos. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos son las que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados por lo que se refiere a sus cadenas laterales y propiedades químicas. Entre ellos se incluyen, por ejemplo, (1) aminoácidos ácidos: aspartato, glutamato; (2) aminoácidos básicos: lisina, arginina, histidina; (3) aminoácidos no polares: alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; (4) aminoácidos polares no cargados: glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina; (5) aminoácidos alifáticos: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, con la serina y la treonina opcionalmente agrupadas por separado como alifáticos hidroxilados; (6) aminoácidos aromáticos: fenilalanina, tirosina, triptófano; (7) aminoácidos de amida: asparagina, glutamina; y (9) aminoácidos que contienen azufre: cisteína y metionina. Véase, por ejemplo, Biochemistry, 2a ed., ed. por L. Stryer, W. H. Freeman and Co., 1981. Los procedimientos para confirmar que los péptidos variantes son adecuados son convencionales y habituales.

Las variantes de las secuencias peptídicas incluyen variaciones de secuencias peptídicas previamente definidas. Por ejemplo, una secuencia peptídica previamente descrita que comprenda un epítopo conocido puede alargarse o acortarse, en uno o ambos extremos (por ejemplo, en aproximadamente 1 a 3 aminoácidos) y/o uno, dos, tres, cuatro o más aminoácidos pueden sustituirse por aminoácidos conservadores, etc. Además, si se ha identificado una región de una proteína que contiene un epítopo de interés, un investigador puede "desplazar" la región de interés (por ejemplo, en aproximadamente 5 aminoácidos en cualquier dirección) desde los extremos de la región aproximada original para optimizar la actividad.

En determinados casos, la secuencia peptídica N-terminal adicional puede comprender o consistir en otro péptido de dominio IR6. En otras realizaciones, la secuencia nativa es una secuencia VisE que es adyacente en la naturaleza al extremo N-terminal de un dominio IR6 de VisE.

En determinados casos, la secuencia peptídica N-terminal adicional es una secuencia no nativa. Tal como se utiliza en el presente documento, una secuencia "no nativa" es cualquier secuencia de proteína, ya sea de una proteína deBorreliao de otro tipo, distinta de una secuencia del péptido VisE nativa. En determinados casos, la secuencia peptídica N-terminal adicional comprende un epítopo de un antígeno deBorrelia,tal como OspA, OspB, DbpA, proteínas asociadas a los flagelos FlaA (p37) y FlaB (p41), OspC (25 kd), BBK32, BmpA (p39), p21, p39, p66 o p83. También pueden utilizarse polipéptidos o péptidos derivados de otros microorganismos.

Se puede diseñar un péptido que comprenda una secuencia peptídica N-terminal adicional para diagnosticar infecciones porBorreliapoco después de la infección (por ejemplo, en el plazo de una a dos semanas tras el inicio de la infección). Entre las proteínas patógenas deBorreliacuya expresión se ha reconocido en fases tempranas de la infección (por ejemplo, frente a las que aparecen anticuerpos IgM poco después de la infección) se encuentran OspC, BBK32, la proteína FlaB asociada a los flagelos (p41) y, en menor medida, BmpA (p39), y la proteína FlaA asociada a los flagelos (p37). Los polipéptidos o péptidos que derivan de esos polipéptidos son adecuados para ensayos de infección temprana. Por ejemplo, algunos epítopos lineales adecuados que pueden utilizarse para el diagnóstico de la infección temprana incluyen péptidos en OspC: PVVAESPKKP (SEQ ID NO: 147), ILMTLFLFISCNNS (SEQ ID NO: 148) y uno o más epítopos contenidos entre los aminoácidos 161 y 210, según notifican Jobeet al.(2003), Clin. Diagn. Lab. Immunol., 10, 573-578). Los péptidos OspC descritos en la patente de EE. UU. n.° 6716574 también pueden utilizarse. En FlaB (p41) se han identificado otras regiones adecuadas, que se ha demostrado que no contienen epítopos importantes de reactividad cruzada, tales como los residuos 120 a 235. Véase, por ejemplo, Crotheret al.((2003) Infect. Inmun., 71, 3419-3428; Wanget al.(1999)), Clin. Microbial. Rev., 12, 633-653; y patentes de EE. UU. n.os 5618533, 5643733, 5643751, 5932220 y 6617441. Otros péptidos con epítopos lineales o conformacionales son conocidos en la técnica. Los procedimientos para identificar secuencias de epítopos no nativas adicionales, en especial de regiones variables, por ejemplo, de OspC, BBK32 o DbpA, se analizan, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 7887815.

En la mezcla de péptidos de la invención, la secuencia peptídica N-terminal adicional proviene de OspC. En concreto, la secuencia peptídica N-terminal adicional es una secuencia de SEQ ID NO: 149, n--n<2>-S-P-n<5>-n<6>-P (SEQ ID NO: 149), en la que n es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A y V, n<2>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E y D, n<5>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K y R, y n6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K y R.

En determinadas realizaciones de la divulgación, la secuencia peptídica N-terminal adicional es una combinación de secuencias. Por ejemplo, la secuencia peptídica N-terminal adicional puede comprender una secuencia nativa, una secuencia no nativa o cualquier combinación de tales secuencias (por ejemplo, dos o más secuencias nativas, dos o más secuencias no nativas, una secuencia nativa y no nativa, etc.).

En determinados casos, los péptidos descritos en el presente documento comprenden una secuencia definida por SEQ ID NO: 1 y comprenden además una secuencia C-terminal adicional. La secuencia peptídica C-terminal adicional puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25 o más aminoácidos. La secuencia peptídica C-terminal adicional puede ser una secuencia nativa. Por ejemplo, en determinados casos, la secuencia peptídica C-terminal adicional puede comprender o consistir en otro péptido de dominio IR6. En otros casos, la secuencia nativa es una secuencia VisE que es adyacente en la naturaleza al extremo C-terminal de un dominio IR6 de VisE.

En determinados casos, la secuencia peptídica C-terminal adicional es una secuencia no nativa. En determinados casos, la secuencia peptídica C-terminal adicional comprende un epítopo de un antígeno deBorrelia,tal como OspA, OspB, DbpA, proteínas asociadas a los flagelos FlaA (p37) y FlaB (p41), OspC (25 kd), BBK32, BmpA (p39), p21, p39, p66 o p83, tal como se ha comentado anteriormente. También pueden utilizarse polipéptidos o péptidos derivados de otros microorganismos.

La secuencia peptídica C-terminal adicional de los péptidos de la invención procede de FlaB (p41). Por ejemplo, en determinadas realizaciones, la secuencia peptídica C-terminal adicional es una secuencia de SEQ ID NO: 150, V-c<2>-E-G-c<5>-Q-Q-E-G-A-Q-Q-P-S-C (SEQ ID NO: 150), en la que c<2>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q y R, y c<5>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V y A. En otras realizaciones, la secuencia peptídica C-terminal adicional es una secuencia de s Eq ID NO: 151, A-V-c<3>-E-G-c<6>-Q-Q-E-G-A-Q-Q-P-S-C (SEQ ID NO: 151), en la que c<3>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q y R, y c6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V y A.

En determinados casos de la divulgación, la secuencia peptídica C-terminal adicional es una combinación de secuencias. Por ejemplo, la secuencia peptídica C-terminal adicional puede comprender una secuencia nativa, una secuencia no nativa o cualquier combinación de tales secuencias (por ejemplo, dos o más secuencias nativas, dos o más secuencias no nativas, una secuencia nativa y no nativa, etc.).

En determinadas realizaciones, los péptidos descritos en el presente documento comprenden una secuencia definida por SEQ ID NO: 1 y comprenden además una secuencia peptídica N-terminal adicional y una secuencia peptídica C-terminal adicional. Las secuencias peptídicas N-terminal y C-terminal adicionales pueden ser como las descritas anteriormente. Los péptidos no consisten en una proteína VisE de longitud completa. Sin embargo, en determinadas realizaciones, los péptidos pueden comprender una proteína VisE de longitud completa. En otras realizaciones, los péptidos no comprenden una proteína VisE de longitud completa.

Además de las secuencias descritas anteriormente, las secuencias N-terminal y C-terminal adicionales pueden comprender o consistir en una secuencia flexible, diseñada para presentar mejor los péptidos de la invención para su detección en un inmunoensayo (por ejemplo, ensayo ELISA, inmunoensayo de flujo lateral, ensayo de aglutinación, etc.). Tales secuencias flexibles pueden ser fácilmente identificadas por los expertos en la materia.

En determinadas realizaciones, los péptidos de la invención comprenden o consisten en una secuencia de SEQ ID NO: 2, n--n<2>-S-P-n<5>-n<6>-P-L-K-K-D-D-N-I-A-A-A-X<18>-V-L-R-G-X<23>-X<24>-K-D-G-X<28>-F-A-X<31>-X<32>-A-V-c<35>-E-G-c<38>-Q-Q-E-G-A-Q-Q-P-S-C (SEQ ID NO: 2), en la que n es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A y V, n<2>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E y D, n<5>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K y R, n6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K y R, X<18>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V y L, X<23>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L e I, X<24>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A y V, X<28>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R, D y N, X<31>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, W e Y, X<32>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K y R, c<35>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q y R, y c<38>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V y A.

En determinadas realizaciones, los péptidos de la invención comprenden una secuencia definida por SEQ ID NO: 2 y comprenden además una secuencia peptídica N-terminal adicional, una secuencia peptídica C-terminal adicional o una combinación de las mismas. Las secuencias peptídicas N-terminal y C-terminal adicionales pueden ser como las descritas anteriormente.

En determinados casos, los péptidos comprenden o consisten en 25 o más (por ejemplo, 26, 27, 28, 29 o más) residuos de aminoácidos. En determinados casos, los péptidos comprenden o consisten en 30 o más (por ejemplo, 31, 32, 33, 34 o más) residuos de aminoácidos. En determinados casos, los péptidos comprenden o consisten en 35 o más (por ejemplo, 36, 37, 38, 39 o más) residuos de aminoácidos. En determinados casos, los péptidos comprenden o consisten en 40 o más (por ejemplo, 41, 42, 43, 44 o más) residuos de aminoácidos. En determinados casos, los péptidos comprenden o consisten en 45 o más (por ejemplo, 46, 47, 48, 49 o más) residuos de aminoácidos. En determinados casos, los péptidos comprenden o consisten en 50 o más (por ejemplo, 51, 52, 53, 54 o más) residuos de aminoácidos. En determinados casos, los péptidos comprenden o consisten en 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 o más residuos de aminoácidos.

En determinados casos, los péptidos descritos en el presente documento comprenden un epítopo de una secuencia peptídica descrita en el presente documento. Por ejemplo, en determinados casos, dichos péptidos comprenden un epítopo de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-146.

En determinados casos, los péptidos de la divulgación comprenden un fragmento de una secuencia peptídica descrita en el presente documento. Por ejemplo, en determinados casos, los péptidos comprenden un fragmento de una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1-146. El fragmento puede tener, por ejemplo, al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 o 44 aminoácidos de longitud. El fragmento puede ser contiguo o puede incluir una o más deleciones (por ejemplo, una deleción de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más residuos de aminoácidos). En determinados casos, el fragmento comprende una secuencia indicada en las patentes de EE. UU. n.os 6 475492, 6660274, 6719983, 6740744 o 7887815 o en las patentes europeas n.os 0894143, 1012181, 1171605 o 1589109. En determinados casos, el fragmento no consiste en una secuencia indicada en una o más de las patentes de EE. UU. n.os 6475492,6 660274,6 719983,6 740744 y 7887815 yen las patentes europeas n.os 0894143, 1012181, 1171605 y 1589109. Los péptidos que comprenden un fragmento de una secuencia peptídica descrita en el presente documento pueden comprender además una secuencia peptídica N-terminal adicional, una secuencia peptídica C-terminal adicional o una combinación de las mismas. Las secuencias peptídicas N-terminal y C-terminal adicionales pueden ser como las descritas anteriormente.

Los péptidos que comprenden una secuencia peptídica N-terminal o C-terminal adicional pueden comprender además un conector que conecta el péptido (por ejemplo, un péptido de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o un fragmento del mismo) con la secuencia peptídica N-terminal o C-terminal adicional. El conector puede ser, por ejemplo, un espaciador peptídico. Dicho espaciador puede consistir, por ejemplo, en entre uno y cinco (por ejemplo, aproximadamente tres) residuos de aminoácidos, preferentemente aminoácidos no cargados, por ejemplo, residuos alifáticos, tales como la glicina o la alanina. En una realización, el espaciador es un espaciador de triplete de glicina. En otra realización, el espaciador es un espaciador de triplete de alanina. En otra realización, el espaciador comprende residuos tanto de glicina como de alanina. Como alternativa, el conector puede ser un conector químico (es decir, no peptídico).

En determinadas realizaciones, los péptidos de la invención y la divulgación se producen mediante química sintética (es decir, un "péptido sintético"). En otras realizaciones, los péptidos de la invención se producen de modo biológico (es decir, por la maquinaria celular, tal como un ribosoma). En determinadas realizaciones, se aíslan los péptidos de la invención. Tal como se utiliza en el presente documento, un péptido "aislado" es un péptido que se ha producido de modo sintético o biológico y después se ha purificado, al menos parcialmente, de los productos químicos y/o la maquinaria celular utilizados para producir el péptido. En determinadas realizaciones, un péptido aislado de la invención está sustancialmente purificado. La expresión "sustancialmente purificado", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula, tal como un péptido, que está sustancialmente exenta de material celular (proteínas, lípidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, etc.), medio de cultivo, precursores químicos, productos químicos utilizados en la síntesis del péptido o combinaciones de los mismos. Un péptido que está sustancialmente purificado tiene menos de aproximadamente un 40 %, un 30 %, un 25 %, un 20 %, un 15 %, un 10 %, un 5 %, un 2 %, un 1 % o menos de material celular, medio de cultivo, otros polipéptidos, precursores químicos y/o sustancias químicas utilizados en la síntesis del péptido. En consecuencia, una molécula sustancialmente pura, tal como un péptido, puede ser al menos aproximadamente un 60 %, un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 98 % o un 99 % en peso seco de la molécula de interés. Un péptido aislado de la invención puede estar en agua, un tampón o en una forma seca a la espera de reconstitución, por ejemplo, como parte de un kit. Un péptido aislado de la presente invención puede estar en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Los ácidos y bases adecuados que son capaces de formar sales con los péptidos de la presente invención son bien conocidos por los expertos en la materia, e incluyen ácidos y bases inorgánicos y orgánicos.

En determinadas realizaciones, los péptidos de la invención y la divulgación se purifican por afinidad. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, los péptidos de la invención se purifican por medio de su capacidad para unirse a anticuerposanti-Borrelia(por ejemplo, anticuerpos contra proteínas VisE y, opcionalmente, otros antígenos deBorrelia)poniendo en contacto dichos anticuerpos con los péptidos de la invención de manera que puedan formarse complejos de péptido-anticuerpo, lavando los complejos de péptido-anticuerpo para eliminar impurezas, y eluyendo después los péptidos de los anticuerpos. Los anticuerpos pueden estar, por ejemplo, unidos a un soporte sólido. Los procedimientos de purificación por afinidad son bien conocidos y habituales para los expertos en la materia.

En determinadas realizaciones, los péptidos de la invención y la divulgación están modificados. Los péptidos de la invención pueden modificarse mediante diversas técnicas, tales como la desnaturalización con calor y/o un detergente (por ejemplo, SDS). Como alternativa, los péptidos pueden modificarse mediante la asociación con uno o más restos adicionales. La asociación puede ser covalente o no covalente, y puede ser, por ejemplo, a través de un conector de aminoácido terminal, tal como la lisina o la cisteína, un agente de acoplamiento químico o un enlace peptídico. El resto adicional puede ser, por ejemplo, un ligando, un receptor de ligando, un compañero de fusión, un marcador detectable, una enzima o un sustrato que inmovilice el péptido.

Los péptidos de la invención y la divulgación pueden conjugarse con un ligando, tal como biotina (por ejemplo, a través de un residuo de cisteína o lisina), una molécula lipídica (por ejemplo, a través de un residuo de cisteína) o una proteína portadora (por ejemplo, seroalbúmina, hemocianina de lapa californiana (KLH), dominio Fc de inmunoglobulina a través, por ejemplo, de un residuo de cisteína o lisina). La unión a ligandos, tales como la biotina, puede ser útil para asociar el péptido a receptores de ligandos, tales como la avidina, la estreptavidina, la estreptavidina polimérica (véanse, por ejemplo, los documentos US 2010/0081125 y US 2010/0267166) o neutravidina. A su vez, la avidina, la estreptavidina, la estreptavidina polimérica o la neutravidina pueden unirse a un resto de transducción de señales (por ejemplo, un resto que pueda visualizarse, tal como el oro coloidal, un resto fluorescente o una enzima (peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina) o a un sustrato sólido (por ejemplo, una membrana Immobilon o de nitrocelulosa). Como alternativa, los péptidos pueden fusionarse o unirse a un receptor de ligando, tal como avidina, estreptavidina, estreptavidina polimérica o neutravidina, facilitando así la asociación de los péptidos con el ligando correspondiente, tal como biotina y cualquier resto (por ejemplo, resto de transducción de señales) o sustrato sólido unido a él. Los ejemplos de otros pares de ligando-receptor son bien conocidos en la técnica y pueden utilizarse de forma similar. En algunas realizaciones, los péptidos pueden unirse o conjugarse directamente a un resto de transducción de señales.

Los péptidos de la invención y la divulgación pueden fusionarse o conjugarse con un compañero de fusión (por ejemplo, un péptido u otro resto). En algunas realizaciones, un compañero de fusión puede facilitar la purificación, la expresión del péptido en una célula hospedadora, la detección, la estabilización del péptido, la conexión del péptido a una superficie u otras entidades, etc. Algunos ejemplos de compuestos adecuados para compañeros de fusión incluyen proteínas portadoras (por ejemplo, seroalbúmina, dominio Fc de inmunoglobulina, dendrímero, etc.), betagalactosidasa, glutatión-S-transferasa, un marcador de histidina, etc. La fusión puede lograrse, por ejemplo, mediante una unión peptídica. Por ejemplo, los péptidos de la invención y los compañeros de fusión pueden ser proteínas de fusión y pueden fusionarse directamente dentro del marco o pueden comprender un conector peptídico, como se ha comentado anteriormente en el contexto de las secuencias peptídicas N-terminal y C-terminal adicionales. En determinadas realizaciones, una mezcla de péptidos de la invención puede unirse mediante un dendrímero, por ejemplo, como en una estructura MAPS.

Además, los péptidos de la invención y la divulgación pueden modificarse para incluir cualquiera de una diversidad de grupos químicos o moléculas conocidos. Tales modificaciones incluyen, entre otras, glucosilación, acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, unión covalente a polietilenglicol (por ejemplo, PEGilación), unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o derivado nucleotídico, unión covalente de un lípido o derivado lipídico, unión covalente de fosfatidilinositol, reticulación, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de enlaces cruzados covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, gamma-carboxilación, glucosilación, formación de anclaje GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, ubiquitinación, modificaciones con ácidos grasos, adición de aminoácidos a proteínas mediada por ARN de transferencia, tal como la arginilación, etc. También se incluyen los análogos de un aminoácido (incluidos los aminoácidos no naturales) y los péptidos con enlaces sustituidos. Los péptidos que consisten en cualquiera de las secuencias analizadas en el presente documento pueden ser modificados por cualquiera de las modificaciones analizadas. Dichos péptidos siguen "consistiendo" en aminoácidos.

Las modificaciones expuestas anteriormente son bien conocidas por los expertos en la materia y se han descrito con gran detalle en la bibliografía científica. Varias modificaciones especialmente comunes, como la glucosilación, la unión a lípidos, la sulfatación, la gamma-carboxilación de residuos de ácido glutámico, la hidroxilación y la ADP-ribosilación, por ejemplo, se describen en muchos textos básicos, como, por ejemplo, Proteins-Structure and Molecular Properties, 2a ed., T E. Creighton, W.H. Freeman and Company, Nueva York (1993). Existen muchos análisis detallados sobre este tema, como, por ejemplo, en Wold, F., Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, ed., Academic Press, Nueva York, 1-12 (1983); Seifteret al.(1990), Meth. Enzymol., 182:626-646; y Rattanet al.(1992), Ann. N.Y Acad. Sci., 663:48-62.

En determinadas realizaciones, los péptidos de la invención y la divulgación se unen o inmovilizan sobre un sustrato, tal como un soporte sólido o semisólido. La unión puede ser covalente o no covalente, y puede verse facilitada por un resto asociado al péptido que permita la unión covalente o no covalente, tal como un resto que tenga una alta afinidad por un componente unido al portador, soporte o superficie. Por ejemplo, el péptido puede estar asociado a un ligando, tal como la biotina, y el componente asociado a la superficie puede ser un receptor del ligando correspondiente, tal como la avidina. En algunas realizaciones, el péptido puede asociarse con un compañero de fusión, por ejemplo, seroalbúmina bovina ("bovine serum albumin", BSA), que facilita la unión del péptido a un sustrato. El péptido puede unirse o inmovilizarse en el sustrato antes o después de la adición de una muestra que contenga anticuerpos durante un inmunoensayo.

En determinadas realizaciones, el sustrato es una esfera, tal como una partícula coloidal (por ejemplo, una nanopartícula coloidal fabricada con oro, plata, platino, cobre, compuestos metálicos, otros metales blandos, partículas con estructura de núcleo y envuelta o nanoesferas de oro huecas) u otro tipo de partícula (por ejemplo, una esfera magnética o una partícula o nanopartícula que comprenda sílice, látex, poliestireno, policarbonato, poliacrilato o PVDF). Dichas partículas pueden comprender un marcador (por ejemplo, un marcador colorimétrico, quimioluminiscente o fluorescente) y pueden ser útiles para visualizar la localización de los péptidos durante los inmunoensayos. En determinadas realizaciones, se utiliza una cisteína terminal de un péptido para unir el péptido directamente a las nanopartículas de oro, plata, platino, cobre, compuestos metálicos, otros metales blandos, etc.

En determinadas realizaciones, el sustrato es una transferencia por puntos o una ruta de flujo en un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral. Por ejemplo, los péptidos pueden unirse o inmovilizarse sobre una membrana porosa, tal como una membrana de PVDF (por ejemplo, una membrana Immobilon™), una membrana de nitrocelulosa, una membrana de polietileno, una membrana de nailon o un tipo similar de membrana.

En determinadas realizaciones, el sustrato es una ruta de flujo en un rotor analítico. En otras realizaciones, el sustrato es un tubo o un pocillo, tal como un pocillo en una placa (por ejemplo, una placa de microvaloración) adecuado para su uso en un ensayo ELISA. Dichos sustratos pueden comprender vidrio, materiales a base de celulosa, polímeros termoplásticos, tales como polietileno, polipropileno o poliéster, estructuras sinterizadas compuestas de materiales en partículas (por ejemplo, vidrio o diversos polímeros termoplásticos) o película de membrana moldeada compuesta de nitrocelulosa, nailon, polisulfona o similares. Un sustrato puede ser partículas finas sinterizadas de polietileno, comúnmente conocido como polietileno poroso, por ejemplo, polietileno poroso de 0,2 a 15 micrómetros de Chromex Corporation (Albuquerque, NM). Todos estos materiales de sustrato pueden utilizarse en formas adecuadas, tales como películas, láminas o placas, o pueden recubrirse, adherirse o laminarse sobre soportes inertes adecuados, tales como papel, vidrio, películas de plástico o tejidos. Los procedimientos adecuados para inmovilizar péptidos en fases sólidas incluyen interacciones iónicas, hidrofóbicas, covalentes y similares.

Por consiguiente, en otro aspecto que no forma parte de la invención, la divulgación proporciona dispositivos. En determinados casos, los dispositivos son útiles para realizar un inmunoensayo. Por ejemplo, en determinados casos, el dispositivo es un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral. En otros casos, el dispositivo es un rotor analítico. En otros casos, el dispositivo es una transferencia por puntos, transferencia por ranuras o transferencia Western. En otros casos, el dispositivo es un tubo o un pocillo, por ejemplo, en una placa adecuada para un ensayo ELISA. En otros casos, el dispositivo es un sensor electroquímico, un sensor óptico o un sensor optoelectrónico.

En determinados casos, el dispositivo comprende un péptido de la divulgación. En otros casos, el dispositivo comprende una mezcla de diferentes péptidos de la invención. Por ejemplo, en determinados casos, el dispositivo comprende dos, tres, cuatro o más péptidos diferentes. En determinados casos, el péptido o cada péptido de la mezcla comprende una secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. En algunos casos, los péptidos se fijan o inmovilizan sobre el dispositivo.

En otro aspecto, se describen composiciones que comprenden uno o más péptidos. Por ejemplo, en determinados casos, la composición comprende un péptido que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 1, un péptido que comprende una secuencia de SEQ ID NO: 2, o sus mezclas. En determinados casos, la composición comprende una mezcla de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 o más péptidos (por ejemplo, todos los posibles péptidos definidos por SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2). En determinados casos, los péptidos se modifican (por ejemplo, mediante la asociación con uno o más restos adicionales), como se describe en el presente documento.

En determinados casos, las composiciones comprenden uno o más péptidos de la divulgación y uno o más péptidos adicionales, tales como un péptido o antígeno deBorrelia,un péptido o antígeno de una o más especies infecciosas deBorrelia,o un péptido o antígeno de uno o más agentes causantes de la enfermedad de Lyme. El péptido o antígeno deBorreliapuede ser cualquier péptido o antígeno deBorreliadescrito en el presente documento (por ejemplo, una proteína OspA, OspB, DbpA, FlaA (p37) y FlaB (p41) asociadas a los flagelos, OspC (25 kd), BBK32, BmpA (p39), p21, p39, p66, p83 o VisE), o cualquier fragmento o epítopo de los mismos. Se han descrito algunos péptidos deBorreliaadecuados, por ejemplo, en la patente de EE.n.° 7887815. La combinación puede comprender un cóctel (una mezcla simple) de péptidos o polipéptidos individuales, puede adoptar la forma de un péptido o polipéptido de fusión (por ejemplo, un péptido multimérico) o los péptidos pueden estar unidos por un dendrímero (por ejemplo, como en una estructura MAPS) opcionalmente a través de un residuo de conexión (por ejemplo, un residuo de lisina). Un péptido de la invención puede fusionarse en su N-terminal o C-terminal a otro péptido adecuado. Dos o más copias de un péptido de la invención pueden unirse entre sí, solas o junto con uno o más péptidos adicionales. Pueden utilizarse combinaciones de péptidos o polipéptidos fusionados y no fusionados. En un caso, el péptido o péptidos adicionales contienen epítopos de linfocitos B y/o linfocitos T procedentes de un péptido o antígeno deBorrelia,un péptido o antígeno procedente de una especie infecciosa deBorrelia,o un péptido o antígeno procedente de un agente causante de la enfermedad de Lyme.

En otro aspecto, en el presente documento se describen ácidos nucleicos que comprenden una secuencia que codifica un péptido de la divulgación. Los ácidos nucleicos contienen menos de un genoma microbiano completo y pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Un ácido nucleico puede ser ARN, ADN, ADNc, ADN genómico, ARn o ADN sintetizados químicamente o combinaciones de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden purificarse para eliminar otros componentes, tales como proteínas, lípidos y otros polinucleótidos. Por ejemplo, los ácidos nucleicos pueden estar purificados en un 50 %, un 75 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 %. Los ácidos nucleicos codifican los péptidos descritos en el presente documento. En determinados casos, los ácidos nucleicos codifican un péptido que tiene la secuencia de s Eq ID NO: 1-146 o sus combinaciones. Los ácidos nucleicos pueden comprender otras secuencias de nucleótidos, tales como secuencias que codifican conectores, secuencias señal, secuencias de transferencia de terminación de TMR, dominios transmembrana o ligandos útiles en la purificación de proteínas, tales como la glutatión-S-transferasa, el marcador de histidina y la proteína estafilocócica A.

Los ácidos nucleicos pueden aislarse. Un ácido nucleico "aislado" es aquel que no es inmediatamente contiguo a una o ambas de las secuencias genómicas flanqueantes 5' y 3' con las que está asociado en la naturaleza. Un ácido nucleico aislado puede ser, por ejemplo, una molécula de ADN recombinante de cualquier longitud, siempre que la secuencia de ácido nucleico que se encuentra de forma natural inmediatamente flanqueando a la molécula de ADN recombinante en un genoma de origen natural esté eliminada o ausente. Los ácidos nucleicos aislados también pueden incluir moléculas de ácidos nucleicos no naturales. Los ácidos nucleicos también pueden comprender fragmentos que codifican péptidos inmunogénicos. Los ácidos nucleicos pueden codificar polipéptidos de longitud completa, fragmentos de péptidos y péptidos variantes o de fusión.

Los ácidos nucleicos pueden aislarse, al menos en parte, a partir de secuencias de ácidos nucleicos presentes, por ejemplo, en una muestra biológica, tal como sangre, suero, saliva o tejido de un individuo infectado. Los ácidos nucleicos también pueden sintetizarse en el laboratorio, por ejemplo, utilizando un sintetizador automático. Puede utilizarse un procedimiento de amplificación, tal como la PCR, para amplificar ácidos nucleicos, al menos en parte, a partir de ADN genómico o ADNc que codifica los polipéptidos.

Los ácidos nucleicos pueden comprender secuencias codificantes para polipéptidos de origen natural o pueden codificar secuencias alteradas que no aparecen en la naturaleza. Si se desea, los ácidos nucleicos pueden clonarse en un vector de expresión que comprenda elementos de control de la expresión, incluidos, por ejemplo, orígenes de replicación, promotores, potenciadores u otros elementos reguladores que conduzcan la expresión de los polinucleótidos descritos en el presente documento en las células hospedadoras. Un vector de expresión puede ser, por ejemplo, un plásmido, tal como pBR322, pUC o ColE1, o un vector de adenovirus, tal como un vector de adenovirus de tipo 2 o de tipo 5. Opcionalmente, pueden utilizarse otros vectores, incluidos, entre otros, el virus Sindbis, el virus 40 de simio, vectores de alfavirus, vectores de poxvirus y vectores de citomegalovirus y retrovirales, tales como el virus del sarcoma murino, el virus del tumor mamario de ratón, el virus de la leucemia murina de Moloney y el virus del sarcoma de Rous. También pueden utilizarse minicromosomas, tales como MC y MC1, bacteriófagos, fágmidos, cromosomas artificiales de levadura, cromosomas artificiales bacterianos, partículas de virus, partículas similares a virus, cósmidos (plásmidos en los que se han insertado sitios cos de fago lambda) y replicones (elementos genéticos capaces de replicarse bajo su propio control en una célula).

Los procedimientos para preparar polinucleótidos unidos operativamente a una secuencia de control de expresión y expresarlos en una célula hospedadora son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 4366246. Un ácido nucleico está operativamente unido cuando se sitúa adyacente o cerca de uno o más elementos de control de la expresión, que dirigen la transcripción y/o traducción del polinucleótido.

Así, por ejemplo, un péptido puede producirse de modo recombinante siguiendo técnicas convencionales de ingeniería genética. Para producir un péptido recombinante, se inserta un ácido nucleico que codifica el péptido en un sistema de expresión adecuado. Por lo general, se construye una molécula recombinante o un vector en el que la secuencia polinucleotídica que codifica el péptido seleccionado está operativamente unida a una secuencia de control de expresión que permite la expresión del péptido. En la técnica se conocen muchos tipos de vectores de expresión adecuados, incluidos, por ejemplo, vectores que contienen sistemas de expresión bacterianos, víricos, de levaduras, de hongos, de insectos o de mamíferos. Los procedimientos para obtener y utilizar dichos vectores de expresión son bien conocidos. Para obtener orientación sobre ésta y otras técnicas de biología molecular utilizadas para las composiciones o procedimientos de la invención, véase, por ejemplo, Sambrooket al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, edición actual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York; Milleret al.,Genetic Engineering, 8:277-298 (Plenum Press, edición actual); Wuet al.,Methods in Gene Biotechnology (CRC Press, Nueva York, N.Y, edición actual); Recombinant Gene Expression Protocols, en Methods in Molecular Biology, vol. 62 (Tuan, ed., Humana Press, Totowa, N.J., edición actualo); y Current Protocols in Molecular Biology (Ausabelet al.,eds.), John Wiley & Sons, NY (edición actual), y las referencias citadas en ellos.

En consecuencia, la divulgación también proporciona vectores que comprenden ácidos nucleicos y células hospedadoras que comprenden dichos vectores. En determinados casos, el vector es un vector lanzadera. En otros casos, el vector es un vector de expresión (por ejemplo, un vector de expresión bacteriano o eucariota). En determinados casos, la célula hospedadora es una célula bacteriana. En otros casos, la célula hospedadora es una célula eucariota.

Las células hospedadoras o líneas celulares hospedadoras adecuadas para los ácidos nucleicos recombinantes o vectores descritos en el presente documento transfectados por este procedimiento incluyen células bacterianas. Por ejemplo, diversas cepas deE. coli(por ejemplo, HB101, MC1061) son bien conocidas como células hospedadoras en el campo de la biotecnología. También pueden emplearse en este procedimiento diversas cepas deB. subtilis, Pseudomonas, Streptomycesy otros bacilos y similares. Como alternativa, un péptido puede expresarse en levaduras, insectos, mamíferos u otros tipos de células, utilizando procedimientos convencionales. También pueden utilizarse la síntesisin vitrosin células y/o las maquinarias sintéticas mediadas por enzimas.

La divulgación también proporciona un procedimiento para producir un péptido o polipéptido recombinante, que implica transfectar o transformar, por ejemplo, por medios convencionales tales como la electroporación, una célula hospedadora con al menos un vector de expresión que contiene un polinucleótido bajo el control de una secuencia de control de la expresión (por ejemplo, una secuencia reguladora transcripcional). A continuación, la célula hospedadora transfectada o transformada se cultiva en condiciones que permitan la expresión del péptido o polipéptido. El péptido o polipéptido expresado se recupera, aísla y opcionalmente se purifica de la célula (o del medio de cultivo, si se expresa de modo extracelular) por medios adecuados conocidos por un experto en la materia, incluida la cromatografía líquida, tal como en fase normal o inversa, utilizando HPLC, FPLC y similares, cromatografía de afinidad, tal como con ligandos inorgánicos o anticuerpos monoclonales, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de quelato metálico inmovilizado, electroforesis en gel y similares. Un experto en la materia puede seleccionar las técnicas de aislamiento y purificación más adecuadas sin apartarse del alcance de la presente invención. Un experto en la materia puede determinar la pureza del péptido o polipéptido utilizando procedimientos convencionales que incluyen, por ejemplo, electroforesis en gel de poliacrilamida (por ejemplo, SDS-PAGE), electroforesis capilar, cromatografía en columna (por ejemplo, cromatografía líquida de alta resolución ("high performance liquid chromatography", HPLC)), análisis de aminoácidos aminoterminales y análisis cuantitativo de aminoácidos.

Procedimientos

En otro aspecto, la invención proporciona procedimientos para detectar en una muestra un anticuerpo contra un epítopo de un antígeno deBorreliacomo se define en el conjunto de reivindicaciones adjunto. Los procedimientos comprenden poner en contacto una muestra con una mezcla de péptidos aislados de la invención, y detectar la formación de un complejo de anticuerpo-péptido que comprende uno o más péptidos aislados en la mezcla, en los que la formación de dicho complejo es indicativa de la presencia de un anticuerpo contra un epítopo de un antígeno deBorreliaen dicha muestra. En determinadas realizaciones, el antígeno deBorreliaprocede de una especie infecciosa deBorrelia.En determinadas realizaciones, el antígeno deBorreliaprocede de una especie patógena deBorrelia,tal comoBorrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzellioBorrelia garinii.Otras especies deBorreliaque se han implicado en la enfermedad de Lyme, tal comoB. lusitaniaeyB. valaisianae,también pueden detectarse utilizando los procedimientos de la invención, siempre que induzcan anticuerpos que puedan reaccionar específicamente con un péptido de la invención. Por lo tanto, debe entenderse que la expresión "Borreliapatógena", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquiera de las especies deBorreliaque causan la enfermedad de Lyme.

En determinadas realizaciones, los procedimientos comprenden poner en contacto la muestra con una mezcla de cuatro o más (por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 o más) péptidos diferentes. En determinadas realizaciones, los procedimientos comprenden poner en contacto la muestra con una mezcla de péptidos de la invención y uno o más péptidos distintos (por ejemplo, un péptido deBorreliao un fragmento antigénico o epítopo del mismo, tal como una proteína OspA, OspB, DbpA, FlaA (p37) y FlaB (p41) asociadas a los flagelos, OspC (25 kd), BBK32, BmpA (p39), p21, p39, p66, p83 o VisE).

Cada péptido de la mezcla es un péptido aislado (por ejemplo, sintético y/o purificado). En determinadas realizaciones, el péptido o la mezcla de péptidos está unido o inmovilizado sobre un soporte sólido. En determinadas realizaciones, el soporte sólido es una esfera (por ejemplo, una partícula coloidal, nanopartícula, esfera de látex, etc.), una ruta de flujo en un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral (por ejemplo, una membrana porosa), una ruta de flujo en un rotor analítico, una transferencia (transferencia Western, transferencia por puntos o transferencia de ranura), un tubo o un pocillo (por ejemplo, en una placa adecuada para un ensayo ELISA) o un sensor (por ejemplo, un sensor electroquímico, óptico u optoelectrónico).

En determinadas realizaciones, la etapa de detección comprende la realización de un ensayo ELISA. En otras realizaciones, la etapa de detección comprende la realización de un inmunoensayo de flujo lateral. En otras realizaciones, la etapa de detección comprende la realización de un ensayo de aglutinación. En otras realizaciones, la etapa de detección comprende hacer girar la muestra en un rotor analítico. En otras realizaciones, la etapa de detección comprende el análisis de la muestra con un sensor electroquímico, óptico u optoelectrónico.

Existen diversos ensayos convencionales para detectar la formación de un complejo de anticuerpo-péptido que comprenda un péptido de la invención. Por ejemplo, la etapa de detección puede comprender la realización de un ensayo ELISA, la realización de un inmunoensayo de flujo lateral, la realización de un ensayo de aglutinación, la realización de una transferencia Western, una transferencia por puntos o una transferencia por ranuras, el análisis de la muestra en un rotor analítico o el análisis de la muestra con un sensor electroquímico, óptico u optoelectrónico. Estos diferentes ensayos se han descrito anteriormente y/o son bien conocidos por los expertos en la materia.

En una realización, los procedimientos implican detectar la presencia de anticuerpos naturales contra un antígeno deBorrelia(por ejemplo, el antígeno de unaBorreliapatógena, tal comoB. burgdorferi)que son producidos por el sistema inmunitario del sujeto infectado en sus líquidos o tejidos biológicos, y que son capaces de unirse específicamente a un péptido de la invención o combinaciones de un péptido de la invención y, opcionalmente, uno o más polipéptidos o péptidos antigénicos adicionales adecuados.

Los procedimientos de inmunoensayo adecuados suelen incluir lo siguiente: recibir u obtener (por ejemplo, de un paciente) una muestra de líquido corporal o tejido que pueda contener anticuerpos; poner en contacto (por ejemplo, incubar o hacer reaccionar) una muestra a ensayar con un péptido de la invención, en condiciones eficaces para la formación de un complejo específico de péptido-anticuerpo (por ejemplo, para la unión específica del péptido al anticuerpo); y ensayar la muestra que se ha puesto en contacto (ha reaccionado) para detectar la presencia de una reacción de anticuerpo-péptido (por ejemplo, determinar la cantidad de un complejo de anticuerpo-péptido). La presencia de una cantidad elevada del complejo de anticuerpo-péptido indica que el sujeto estuvo expuesto e infectado por una especie infecciosa deBorrelia.Un péptido, incluida una forma modificada del mismo, que se "une específicamente" (por ejemplo, "es específico para" o se une "preferentemente") a un anticuerpo contra un antígeno deBorreliainteractúa con el anticuerpo, o forma o experimenta una asociación física con él, en una cantidad y durante un tiempo suficientes para permitir la detección del anticuerpo. Por "específicamente" o "preferentemente" se entiende que el péptido tiene una mayor afinidad (por ejemplo, un mayor grado de selectividad) por dicho anticuerpo que por otros anticuerpos de una muestra. Por ejemplo, el péptido puede tener una afinidad por el anticuerpo de al menos aproximadamente 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces o mayor que por otros anticuerpos de la muestra. Dicha afinidad o grado de especificidad puede determinarse mediante diversos procedimientos habituales, incluidos, por ejemplo, los estudios de unión competitiva. En un ensayo ELISA, una respuesta positiva se define como un valor 2 o 3 desviaciones estándar superior al valor medio de un grupo de controles sanos. En algunas realizaciones, se requiere un ensayo de segundo nivel para proporcionar un serodiagnóstico inequívoco de la enfermedad de Lyme.

Expresiones tales como "muestra que contiene un anticuerpo" o "detectar un anticuerpo en una muestra" no pretenden excluir muestras o determinaciones (por ejemplo, intentos de detección) en las que no se detecta ningún anticuerpo o en las que no hay anticuerpos. En un sentido general, esta invención implica ensayos para determinar si un anticuerpo producido en respuesta a la infección con unaBorreliainfecciosa está presente en una muestra, independientemente de si se detecta o no.

Las condiciones para hacer reaccionar péptidos y anticuerpos de manera que reaccionen específicamente son bien conocidas por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Immunology (Coliganet al.,editores, John Wiley & Sons, Inc).

Los procedimientos comprenden la recepción u obtención de una muestra de líquido corporal o tejido susceptible de contener anticuerpos procedente de un sujeto. Los anticuerpos pueden ser, por ejemplo, de tipo IgG, IgE, IgD, IgM o IgA. Por lo general, se detectan anticuerpos IgM y/o IgA, por ejemplo, para la detección en fases tempranas de la infección. Sin embargo, en el caso de una infecciónpor Borrelia,los anticuerpos IgM pueden persistir durante mucho tiempo. Los anticuerpos IgG pueden detectarse cuando se utilizan en el procedimiento algunos de los péptidos adicionales comentados anteriormente (por ejemplo, péptidos para la detección de proteínas del flagelo). La muestra es preferiblemente fácil de obtener y puede ser suero o plasma derivado de una muestra de sangre venosa o incluso de un pinchazo en el dedo. Se sabe que el tejido de otras partes del cuerpo u otros líquidos corporales, tal como el líquido cefalorraquídeo (LCR), la saliva, las secreciones gástricas, el moco, la orina, etc., contienen anticuerpos y pueden utilizarse como fuente de la muestra.

Una vez que se permite que el antígeno peptídico y el anticuerpo de muestra reaccionen en un medio adecuado, se realiza un ensayo para determinar la presencia o ausencia de una reacción de anticuerpo-péptido. Entre los muchos tipos de ensayos adecuados, que serán evidentes para los expertos en la materia, se encuentran los ensayos de inmunoprecipitación y aglutinación.

En determinadas realizaciones de la invención, el ensayo comprende lo siguiente: inmovilizar el anticuerpo o anticuerpos en la muestra, por ejemplo, directa o indirectamente a través de la unión a péptidos de la invención; añadir un péptido de la invención; y detectar el grado de anticuerpo unido al péptido, por ejemplo, marcando el péptido o añadiendo una sustancia marcada, tal como un compañero de unión marcado (por ejemplo, un complejo de estreptavidina-oro coloidal) o un anticuerpo marcado que reconozca específicamente el péptido. Véase, por ejemplo, la figura 1. En otras realizaciones, el ensayo comprende lo siguiente: inmovilizar un péptido de la invención; añadir la muestra que contiene anticuerpos; y detectar la cantidad de anticuerpo unido al péptido, por ejemplo, añadiendo otro péptido de la invención conjugado, directa o indirectamente, con un marcador (por ejemplo, complejo de oro coloidal, un marcador fluorescente, una enzima (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina)) o añadiendo una sustancia marcada, tal como un compañero de unión o un anticuerpo marcado que reconozca específicamente los anticuerpos de la muestra (por ejemplo, anticuerpos anti-IgG humana, anticuerpos anti-IgM humana, anticuerpos anti-IgG de perro, anticuerpos anti-IgM de perro, proteína A, proteína G, proteína L, etc.) o combinaciones de los mismos. Véase,por ejemplo, la figura 3. En otras realizaciones, el ensayo comprende lo siguiente: inmovilizar un péptido de la invención; añadir la muestra que contiene anticuerpos; y detectar la cantidad de anticuerpo unido al péptido, por ejemplo, añadiendo un primer compañero de unión que reconozca específicamente los anticuerpos de la muestra (por ejemplo, anticuerpos anti-IgG humana, anticuerpos anti-IgM humana, anticuerpos anti-IgG de perro, anticuerpos anti-IgM de perro, proteína A, proteína G, proteína L, etc.), y añadiendo además un segundo compañero de unión (por ejemplo, proteína A, proteína G, proteína L, etc.), en el que el segundo compañero de unión está marcado y reconoce dicho primer compañero de unión. En otras realizaciones, el ensayo comprende lo siguiente: hacer reaccionar el péptido y la muestra que contiene anticuerpos sin que ninguno de los reactivos esté inmovilizado, y luego detectar la cantidad de complejos de anticuerpo y péptido, por ejemplo, por el péptido marcado o añadiendo una sustancia marcada, tal como un compañero de unión marcado (por ejemplo, un complejo de estreptavidina-oro coloidal) o un anticuerpo marcado que reconozca específicamente el péptido.

La inmovilización de un péptido de la invención puede ser covalente o no covalente, y la inmovilización no covalente puede ser no específica (por ejemplo, unión no específica a una superficie de poliestireno, por ejemplo, en un pocillo de microvaloración). La unión específica o semiespecífica a un portador, soporte o superficie sólidos o semisólidos puede conseguirse si el péptido tiene asociado un resto que permita su unión covalente o no covalente al portador, soporte o superficie sólidos o semisólidos. Por ejemplo, el resto puede tener afinidad por un componente unido al portador, soporte o superficie. En este caso, el resto puede ser, por ejemplo, un grupo biotina o biotinilo o un análogo de los mismos unido a un grupo aminoácido del péptido, tal como el ácido 6-aminohexanoico, y el componente es entonces avidina, estreptavidina, neutravidina o un análogo del mismo. Una alternativa es una situación en la que el resto tiene la secuencia de aminoácidos His-His-His-His-His-His (SEQ ID NO: 152) y el portador comprende un derivado del ácido nitrilotriacético ("Nitrilotriacetic Acid", NTA) cargado con iones Ni++ o Co++. En determinadas realizaciones, el resto es un compañero de fusión, por ejemplo, BSA. En realizaciones ilustrativas, los péptidos de la invención pueden conjugarse con BSA a través de residuos N-terminales y/o C-terminales de los péptidos. En una realización, uno, dos, tres, cuatro, cinco, 10, 15, 20, 25, 30 o más péptidos de la invención pueden ser sustituidos, por ejemplo, conjugados con BSA. Como comprenderá un experto en la materia, los niveles de sustitución pueden afectar a la sensibilidad del ensayo. Se necesitan concentraciones más bajas de BSA altamente sustituida para alcanzar la sensibilidad que ofrecen las concentraciones altas de BSA-péptido que contienen menos moléculas de péptido. En otras realizaciones, el compañero de fusión puede ser MAPS. En determinadas realizaciones ilustrativas, los MAPS pueden consistir en 4, 8 o más ramas asimétricas.

Los portadores, soportes y superficies adecuados incluyen, entre otros, esferas (por ejemplo, esferas magnéticas, partículas coloidales o nanopartículas, tales como oro coloidal, o nanopartículas que comprenden sílice, látex, poliestireno, policarbonato o PDVF), látex de copolímeros, tales como estireno-divinilbenceno, divinilbenceno-estireno hidroxilado, poliestireno, poliestireno carboxilado, esferas de negro de humo, vidrio activado de poli(cloruro de vinilo) o de poliestireno o no activado, vidrio magnético poroso activado con epoxi, partículas de gelatina o polisacáridos u otras partículas proteicas, glóbulos rojos, anticuerpos mono- o policlonales o fragmentos Fab de dichos anticuerpos.

Los protocolos para los inmunoensayos que utilizan antígenos para la detección de anticuerpos específicos son bien conocidos en el arte. Por ejemplo, se puede utilizar un ensayo de tipo "sandwich" convencional o un formato de ensayo competitivo convencional. Para un análisis de algunos tipos de ensayos adecuados, véase Current Protocols in Immunology(supra).En determinadas realizaciones, un péptido de la invención se inmoviliza sobre una superficie o soporte sólido o semisólido mediante unión covalente o no covalente, ya sea antes o después de la adición de la muestra que contiene anticuerpo.

Los dispositivos para realizar ensayos de unión específicos, en especial inmunoensayos, son conocidos y pueden adaptarse con facilidad para su uso en los presentes procedimientos. Los ensayos en fase sólida, en general, son más fáciles de realizar que los procedimientos de ensayo heterogéneos que requieren una etapa de separación, tal como la precipitación, la centrifugación, la filtración, la cromatografía o el magnetismo, porque la separación de los reactivos es más rápida y sencilla. Los dispositivos de ensayo en fase sólida incluyen placas de microvaloración, dispositivos de ensayo de flujo continuo (por ejemplo, dispositivos de inmunoensayo de flujo lateral), tiras reactivas y dispositivos de inmunoensayo inmunocapilar o inmunocromatográfico.

En realizaciones de la invención, la superficie o soporte sólido o semisólido es el suelo o la pared de un pocillo de microvaloración, una superficie o membrana de filtro (por ejemplo, una membrana de nitrocelulosa o una membrana de PVDF (poli(fluoruro de vinilideno)), tal como una membrana Immobilon™), una fibra hueca, un medio cromatográfico de esferas (por ejemplo, un gel de agarosa o poliacrilamida), una esfera magnética, una matriz fibrosa de celulosa, una matriz de HPLC, una matriz de FPLC, una sustancia que tenga moléculas de un tamaño tal que las moléculas con el péptido unido a ellas, cuando se disuelven o dispersan en una fase líquida, puedan retenerse mediante un filtro, una sustancia capaz de formar micelas o de participar en la formación de micelas que permita cambiar o intercambiar una fase líquida sin dispersar las micelas, un polímero soluble en agua, o cualquier otro portador, soporte o superficie adecuados.

En algunas realizaciones de la invención, el péptido está provisto de un marcador adecuado que permite la detección. Pueden utilizarse marcadores convencionales capaces, solos o junto con otras composiciones o compuestos, de proporcionar una señal detectable. Los procedimientos de detección adecuados incluyen, por ejemplo, la detección de un agente marcado, directa o indirectamente, con un marcador fluorescente mediante microscopía de inmunofluorescencia, incluida la microscopía confocal, o mediante citometría de flujo (FACS), la detección de un agente marcado radiactivamente mediante autorradiografía, microscopía electrónica, inmunotinción, fraccionamiento subcelular o similares. En una realización, un elemento radiactivo (por ejemplo, un aminoácido radiactivo) se incorpora directamente a una cadena peptídica; en otra realización, un marcador fluorescente se asocia con un péptido a través de la interacción de biotina/avidina, la asociación con un anticuerpo conjugado con fluoresceína o similares. En una realización, se añade a la mezcla un compañero de unión específico para el anticuerpo que es detectable. Por ejemplo, el compañero de unión puede ser un anticuerpo secundario detectable u otro agente de unión (por ejemplo, proteína A, proteína G, proteína L) que se une al primer anticuerpo. Este anticuerpo secundario u otro agente de unión puede marcarse, por ejemplo, con un marcador radiactivo, enzimático, fluorescente, luminiscente u otro marcador detectable, tal como un sistema de avidina/biotina. En otra realización, el compañero de unión es un péptido de la invención, que puede conjugarse directa o indirectamente (por ejemplo, mediante la interacción de biotina/avidina) con una enzima, tal como la peroxidasa de rábano picante o la fosfatasa alcalina u otro resto de transducción de señales. En el caso de la enzima, la señal detectable se produce añadiendo un sustrato de la enzima que produce una señal detectable, tal como un sustrato cromogénico, fluorogénico o quimioluminiscente.

Un "sistema de detección" para detectar el péptido unido, tal como se utiliza en el presente documento, puede comprender un compañero de unión detectable, tal como un anticuerpo específico para el péptido. En una realización, el compañero de unión se marca directamente. En otra realización, el compañero de unión está unido a un reactivo generador de señales, tal como una enzima, que, en presencia de un sustrato adecuado, puede producir una señal detectable. Una superficie para inmovilizar el péptido puede acompañar opcionalmente al sistema de detección.

En realizaciones de la invención, el procedimiento de detección comprende inspeccionar de modo visual el complejo de anticuerpo-péptido para detectar un cambio de color, o inspeccionar el complejo de anticuerpo-péptido para detectar un cambio fisicoquímico. Pueden producirse cambios fisicoquímicos con reacciones de oxidación u otras reacciones químicas. Pueden detectarse a simple vista, utilizando un espectrofotómetro o medios similares.

Un formato de ensayo especialmente útil es un formato de inmunoensayo de flujo lateral. Los anticuerpos de inmunoglobulinas humanas o animales (por ejemplo, perro, ratón, ciervo, etc.), o los anticuerpos de proteínas A o G de estafilococos, pueden marcarse con un generador de señales o indicador (por ejemplo, oro coloidal) que se seca y se sitúa sobre un lecho corto de fibra de vidrio (lecho corto de aplicación de muestras o lecho corto de conjugado). El péptido de diagnóstico se inmoviliza sobre una membrana, tal como de nitrocelulosa o una membrana de PVDF (poli(fluoruro de vinilideno)) (por ejemplo, una membrana Immobilon™). Cuando se aplica una solución de muestra (sangre, suero, etc.) al lecho corto de aplicación de muestras (o fluye a través del lecho corto de conjugado), aquella disuelve el indicador marcado, que se une entonces a todos los anticuerpos de la muestra. Los complejos resultantes se transportan a la siguiente membrana (PVDF o nitrocelulosa que contiene el péptido de diagnóstico) por capilaridad. Si hay anticuerpos contra el péptido de diagnóstico, aquellos se unen al péptido de diagnóstico que se ha dispuesto en estrías sobre la membrana, generando así una señal (por ejemplo, una banda que puede verse o visualizarse). Puede utilizarse un anticuerpo adicional específico del anticuerpo marcado o un segundo anticuerpo marcado para producir una señal de control.

Un formato alternativo para el inmunoensayo de flujo lateral comprende que los péptidos o composiciones de la invención se conjuguen con un ligando (por ejemplo, biotina) y formen un complejo con un receptor de ligando marcado (por ejemplo, estreptavidina-oro coloidal). Los complejos peptídicos marcados pueden situarse sobre el lecho corto de aplicación de muestras o en el lecho corto de conjugado. Los anticuerpos anti-IgG/IgM humana o de animal (por ejemplo, perro, ratón, ciervo) u otros péptidos de la invención se inmovilizan sobre una membrana, tal como de nitrocelulosa o PVDF, en una zona de ensayo (por ejemplo, una línea de prueba). Cuando se añade la muestra al lecho corto de aplicación de muestras, los anticuerpos de la muestra reaccionan con los complejos peptídicos marcados, de forma que los anticuerpos que se unen a los péptidos de la invención se marcan indirectamente. A continuación, los anticuerpos de la muestra se transportan a la siguiente membrana (PVDF o nitrocelulosa que contiene el péptido de diagnóstico) por acción capilar y se unen a los anticuerpos inmovilizados anti-IgG/IgM humana o anti-IgG/IgM de animal (o proteína A, proteína G, proteína L o combinaciones de las mismas) o a los péptidos inmovilizados de la invención. Si alguno de los anticuerpos de la muestra se une a los péptidos marcados de la invención, el marcador asociado a los péptidos puede verse o visualizarse en la zona de ensayo. En la figura 2 se muestra una realización de este tipo de dispositivo de flujo lateral. En la figura 3 se muestra otra realización de este tipo de dispositivo de flujo lateral en el que los péptidos de la invención se utilizan como agente de captura inmovilizado en una zona de ensayo y como complejo marcado soluble para que reaccione con los anticuerpos en una muestra. Los controles adecuados para este ensayo pueden incluir, por ejemplo, un conjugado de IgY de pollo y oro coloidal situado en el lecho corto de aplicación de la muestra o en el lecho corto del conjugado, y un anticuerpo anti-IgY de pollo inmovilizado en una zona de control situada proximalmente a la zona de ensayo.

En las realizaciones que utilizan el formato de inmunoensayo de flujo lateral descrito anteriormente, el dispositivo de flujo lateral puede comprender dos puertos: un puerto de muestra, que se sitúa entre un lecho corto de conjugado (que contiene un compañero de unión a analito marcado) y una zona o línea de ensayo (que contiene un compañero de unión a analito inmovilizado) y un puerto de persecución, que se sitúa corriente arriba (por ejemplo, hacia el extremo del dispositivo lejos de la zona de ensayo) del lecho corto de conjugado. En tales dispositivos que comprenden dos puertos, la muestra se deposita corriente arriba de la zona de ensayo a través del puerto de muestra, y el flujo de líquido a través del lecho corto de conjugado se inicia depositando una solución (por ejemplo, diluyente, tampón o similar) a través del puerto de persecución. La solución "de persecución" disuelve los reactivos marcados en el lecho corto de conjugada y fluye a través de él para interactuar con los mismos y con los reactivos inmovilizados en la zona de ensayo.

Otro ensayo para el cribado de productos sanguíneos u otros líquidos fisiológicos o biológicos es un ensayo inmunoenzimático, es decir, un ELISA. Normalmente, en un ELISA, los péptidos aislados o las composiciones de la invención se adsorben sobre la superficie de un pocillo de microvaloración directamente o a través de una matriz de captura (por ejemplo, un anticuerpo). A continuación, se bloquean los sitios de unión a proteínas no específicos residuales de la superficie con un agente adecuado, tal como seroalbúmina bovina (BSA), suero normal de cabra ("normal goat serum", NGS) inactivado por calor o BLOTTO (una solución tamponada de leche en polvo desnatada que también contiene un conservante, sales y un agente antiespumante). A continuación, se incuba el pocillo con una muestra biológica sospechosa de contener un anticuerpo específicoanti-Borrelia(por ejemplo,B. burgdorferi).La muestra puede aplicarse pura, o más a menudo puede diluirse, normalmente en una solución tamponada que contenga una pequeña cantidad (un 0,1-5,0% en peso) de proteína, tal como BSA, NGS o BLOTTO. Después de incubar durante un tiempo suficiente para que se produzca la unión específica, se lava el pocillo para eliminar la proteína no unida y se incuba con una concentración óptima de un anticuerpo antiinmunoglobulina adecuado (por ejemplo, para sujetos humanos, una antiinmunoglobulina humana (aHulg) de otro animal, tal como perro, ratón, vaca, etc.) u otro péptido de la invención que se conjuga con una enzima u otro marcador mediante procedimientos convencionales y se disuelve en tampón de bloqueo. El marcador puede elegirse entre una diversidad de enzimas, tales como la peroxidasa de rábano picante (HRP), la beta-galactosidasa, la fosfatasa alcalina, la glucosa oxidasa, etc. Se deja el tiempo suficiente para que vuelva a producirse la unión específica, después se lava de nuevo el pocillo para eliminar el conjugado no unido y se añade un sustrato adecuado para la enzima. Se deja que se revele el color y se determina la densidad óptica del contenido del pocillo de modo visual o a través de instrumentos (medida a una longitud de onda adecuada). El valor de DO de corte puede definirse como la media de DO+3 desviaciones estándar (DE) de al menos 50 muestras de suero recogidas de individuos de una zona donde la enfermedad de Lyme no es endémica, o por otras definiciones convencionales de este tipo. En el caso de un ensayo muy específico, puede utilizarse OD+2 Sd como valor de corte.

En una realización de un ELISA, un péptido o una mezcla de péptidos de la invención se inmoviliza sobre una superficie, tal como una placa ELISA de noventa y seis pocillos o una fase sólida equivalente que se recubre con estreptavidina o un compuesto de unión a biotina equivalente, tal como avidina o neutravidina, en una concentración óptima en un tampón de recubrimiento alcalino y se incuba a 4° C durante la noche. Tras un número adecuado de lavados con tampones de lavado convencionales, se aplica a cada pocillo una concentración óptima de una forma biotinilada de un péptido o composición de la invención, disuelta en un tampón de bloqueo convencional. A continuación, se añade una muestra y el ensayo se desarrolla como en el caso anterior. Las condiciones para realizar ensayos ELISA son bien conocidas en la técnica.

En otra realización de un ELISA, un péptido o una mezcla de péptidos de la invención se inmoviliza sobre una superficie, tal como una placa ELISA de noventa y seis pocillos o una fase sólida equivalente a través de un compañero de fusión, por ejemplo, BSA o MAPS. A continuación, se añade una muestra y el ensayo se desarrolla como en el caso anterior.

En otra realización, los procedimientos comprenden un ensayo de aglutinación. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, se conjugan partículas coloidales (por ejemplo, oro coloidal, etc.) o esferas de látex con péptidos o composiciones de la invención. Posteriormente, el líquido biológico se incuba con el conjugado de esfera/péptido, formándose así una mezcla de reacción. A continuación, se analiza la mezcla de reacción para determinar la presencia de los anticuerpos. En determinadas realizaciones, los ensayos de aglutinación comprenden el uso de una segunda población de partículas, tales como partículas coloidales (por ejemplo, oro coloidal, etc.) o esferas de látex, conjugadas con (1) anticuerpos específicos de los péptidos de las composiciones de la invención, en el caso de un ensayo de competición, o (2) anticuerpos capaces de detectar anticuerpos de la muestra (por ejemplo, anticuerpos anti-IgG o IgM humana, anticuerpos anti-IgG o IgM de perro, etc.), en el caso de un ensayo de tipo "sandwich". Los procedimientos de aglutinación adecuados pueden incluir la centrifugación como medio para evaluar el grado de aglutinación.

En otra realización, el péptido o las composiciones de la invención se electrotransfieren o se transfieren por puntos sobre papel de nitrocelulosa. Posteriormente, una muestra, tal como un líquido biológico (por ejemplo, suero o plasma) se incuba con el antígeno seccionado, y se permite que el anticuerpo presente en el líquido biológico se una al antígeno o antígenos. A continuación, el anticuerpo unido puede detectarse, por ejemplo, mediante procedimientos inmunoenzimáticos convencionales o mediante visualización utilizando nanopartículas coloidales acopladas a anticuerpos secundarios u otros agentes de unión de anticuerpos, tales como la proteína A, la proteína G, la proteína L o combinaciones de las mismas.

Los expertos en la materia deben entender que puede diseñarse cualquier formato de ensayo de proteínas convencionales, en concreto, formatos de inmunoensayo, para utilizar los péptidos aislados de esta invención para la detección de anticuerpos deBorreliae infección porBorreliapatógena (por ejemplo,B. burgdorferi)en un sujeto. Por lo tanto, esta invención no está limitada por la selección del formato de ensayo concreto, y se cree que abarca formatos de ensayo que son conocidos por los expertos en la materia.

En determinadas realizaciones, la muestra utilizada en los procedimientos es un líquido corporal, tal como sangre, suero, líquido cefalorraquídeo, orina o saliva. En otras realizaciones, la muestra es un tejido (por ejemplo, un homogeneizado de tejido) o un lisado celular. En determinadas realizaciones, la muestra procede de un animal salvaje (por ejemplo, un ciervo o un roedor, tal como un ratón, una ardilla listada, una ardilla, etc.). En otras realizaciones, la muestra procede de un animal de laboratorio (por ejemplo, un ratón, una rata, una cobaya, un conejo, un mono, un primate, etc.). En otras realizaciones, la muestra procede de un animal domesticado o salvaje (por ejemplo, un perro, un gato, un caballo). En otras realizaciones, la muestra procede de un ser humano.

Gran parte del análisis precedente está dirigido a la detección de anticuerpos contraBorreliapatógena . Sin embargo, debe entenderse que el análisis también se aplica a la detección de linfocitos T cebadosin vitro.

Se prevé que se genere una respuesta inmunitaria mediada por células (por ejemplo, una respuesta de linfocitos T cooperadores), ya que se produce IgG. Por lo tanto, se espera que sea posible determinar la reactividad inmunológica entre los linfocitos T cebados y un péptido de la invención. Esto puede realizarsein vitroincubando linfocitos T aislados del sujeto con un péptido de la invención y midiendo la inmunorreactividad, por ejemplo, midiendo la proliferación posterior de linfocitos T o midiendo la liberación de citocinas desde los linfocitos T, tales como IFN-y. Estos procedimientos son bien conocidos en la técnica.

En otro aspecto, la divulgación proporciona procedimientos para diagnosticar la enfermedad de Lyme en un sujeto. El sujeto puede ser un sujeto sospechoso de tener anticuerpos contra un agente causal de la enfermedad de Lyme. El procedimiento de diagnóstico es útil para diagnosticar a los sujetos que presentan los síntomas clínicos de la enfermedad de Lyme.

En determinados casos, los procedimientos comprenden poner en contacto una muestra procedente del sujeto con un péptido descrito en el presente documento, y detectar la formación de un complejo de anticuerpo-péptido que comprende dicho péptido, en el que la formación de dicho complejo es indicativa de que el sujeto tiene la enfermedad de Lyme. En determinados casos, los procedimientos comprenden poner en contacto la muestra con una mezcla de dos, tres, cuatro o más (por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 o más) péptidos diferentes de la invención. En determinados casos, los procedimientos comprenden poner en contacto la muestra con una mezcla de uno o más péptidos o de la invención y uno o más péptidos distintos (por ejemplo, un péptido deBorrelia,o un fragmento antigénico o epítopo del mismo, tal como una proteína OspA, OspB, DbpA, FlaA (p37) y FlaB (p41) asociadas a los flagelos, OspC (25 kd), BBK32, BmpA (p39), p21, p39, p66, p83 o proteína VIsE).

En determinados casos, el péptido o cada péptido de la mezcla es un péptido aislado (por ejemplo, sintético y/o purificado). En determinados casos, el péptido o la mezcla de diferentes péptidos se une o se inmoviliza sobre un sustrato (por ejemplo, un soporte sólido o semisólido). Por ejemplo, en determinados casos, el sustrato es una esfera (por ejemplo, una partícula coloidal o de otro tipo o una nanopartícula), una ruta de flujo en un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral (por ejemplo, una membrana porosa), una transferencia (por ejemplo, una transferencia Western, una transferencia por puntos o una transferencia por ranuras), una ruta de flujo en un rotor analítico, o un tubo o un pocillo (por ejemplo, en una placa adecuada para un ensayo ELISA).

Existen diversos ensayos convencionales para detectar la formación de un complejo de anticuerpo-péptido que comprenda un péptido de la invención. Por ejemplo, la etapa de detección puede comprender la realización de un ensayo ELISA, la realización de un inmunoensayo de flujo lateral, la realización de un ensayo de aglutinación, el análisis de la muestra mediante una transferencia Western, una transferencia Western por ranuras o una transferencia por puntos, el análisis de la muestra en un rotor analítico o el análisis de la muestra con un sensor electroquímico, óptico u optoelectrónico. Estos diferentes ensayos se han descrito anteriormente y/o son bien conocidos por los expertos en la materia.

En determinados casos, la muestra es un líquido corporal, tal como sangre, suero, líquido cefalorraquídeo, orina o saliva. En otros casos, la muestra es un tejido (por ejemplo, un homogeneizado de tejido) o un lisado celular. En determinados casos, el sujeto es un animal salvaje (por ejemplo, un ciervo o un roedor, tal como un ratón, una ardilla listada, una ardilla, etc.). En otros casos, el sujeto es un animal de laboratorio (por ejemplo, un ratón, una rata, una cobaya, un conejo, un mono, un primate, etc.). En otros casos, el sujeto es un animal domesticado o salvaje (por ejemplo, un perro, un gato, un caballo). En otros casos, el sujeto es un ser humano.

Kits

En otro aspecto más, la invención proporciona kits según se indica en el conjunto de reivindicaciones adjunto. En determinadas realizaciones, los kits comprenden una mezcla de péptidos aislados de la invención. En determinadas realizaciones, los kits comprenden cuatro o más péptidos diferentes de la invención. Los péptidos pueden comprender una secuencia de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. En determinadas realizaciones, los péptidos están unidos o inmovilizados sobre un soporte sólido. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el soporte sólido es una esfera (por ejemplo, una partícula coloidal o una nanopartícula), una ruta de flujo en un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral, una ruta de flujo en un rotor analítico, o un tubo o un pocillo (por ejemplo, en una placa).

Los kits de la invención también pueden proporcionar reactivos para tipos concretos de ensayos. Así, los kits pueden incluir una población de esferas (por ejemplo, adecuadas para un ensayo de aglutinación o un ensayo de flujo lateral) o una placa (por ejemplo, una placa adecuada para un ensayo ELISA). En otras realizaciones, los kits comprenden un dispositivo, tal como un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral, un rotor analítico, una transferencia Western, una transferencia por puntos, una transferencia por ranuras o un sensor electroquímico, óptico u optoelectrónico. La población de esferas, la placa y los dispositivos son útiles para realizar un inmunoensayo. Por ejemplo, pueden ser útiles para detectar la formación de un complejo de anticuerpo-péptido que comprenda un anticuerpo de una muestra y un péptido de la invención. En determinadas realizaciones, un péptido, una mezcla de diferentes péptidos de la invención o una composición de péptidos de la invención se une o inmoviliza sobre las esferas, la placa o el dispositivo.

Además, los kits pueden incluir diversos diluyentes y tampones, conjugados marcados u otros agentes para la detección de antígenos o anticuerpos específicamente unidos, y otros reactivos generadores de señales, tales como sustratos enzimáticos, cofactores y cromógenos. Un experto en la materia puede determinar fácilmente otros componentes del kit. Tales componentes pueden incluir reactivos de recubrimiento, anticuerpos de captura policlonales o monoclonales específicos para un péptido de la invención, o un cóctel de dos o más de los anticuerpos, extractos purificados o semipurificados de estos antígenos como patrones, anticuerpos detectores monoclonales, un anticuerpo antirratón, antiperro, antipollo o antihumano con una molécula indicadora conjugada al mismo, tablas indicadoras para comparaciones colorimétricas, guantes desechables, instrucciones de descontaminación, bastoncillos o recipientes aplicadores, un vaso preparador de muestras, etc. En una realización, un kit comprende tampones u otros reactivos adecuados para constituir un medio de reacción que permita la formación de un complejo de péptido-anticuerpo.

Tales kits proporcionan una manera conveniente y eficiente para que un laboratorio clínico diagnostique la infección por unaBorreliapatógena, tal como unaB. burgdorferi.Así, en determinadas realizaciones, los kits comprenden además instrucciones. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, los kits comprenden instrucciones que indican cómo utilizar un péptido de la invención para detectar un anticuerpo contra un antígeno deBorreliao para diagnosticar la enfermedad de Lyme. En determinadas realizaciones, los kits comprenden instrucciones que indican cómo utilizar una población de esferas, una placa o un dispositivo (por ejemplo, que comprende un péptido o una mezcla de diferentes péptidos de la invención) para detectar un anticuerpo contra un antígeno deBorreliao para diagnosticar la enfermedad de Lyme.

Los péptidos, las composiciones y los dispositivos que comprenden los péptidos, los kits y los procedimientos de la invención y la divulgación ofrecen una serie de ventajas. Por ejemplo, permiten una detección sencilla, barata, rápida, sensible y precisa de la enfermedad de Lyme, y evitan la reactividad cruzada serológica con otras afecciones con síntomas "similares a los de la enfermedad de Lyme", tales como mialgias, artralgias, malestar o fiebre, incluidas afecciones tales como la sífilis, la artritis crónica y la esclerosis múltiple. Esto permite un diagnóstico preciso. Además, un ensayo de diagnóstico (por ejemplo, un ensayo ELISA, un inmunoensayo de flujo lateral o un ensayo de aglutinación) es útil en muestras de suero que contienen anticuerpos anti-OspA u otros anticuerpos producidos en respuesta a una vacuna basada en las proteínas de la superficie externa deBorrelia.Un péptido de IR6 de VisE de la invención no reacciona de forma cruzada con dichos anticuerpos, lo que permite diferenciar a los individuos vacunados de los individuos infectados de forma natural conB. burgdorferi.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una mezcla de péptidos aislados que comprende tres o más péptidos aislados diferentes, en la que cada péptido aislado comprende una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 3-146, en la que cada péptido aislado comprende además:

una secuencia peptídica N-terminal adicional, en la que la secuencia es n--n<2>-S-P-n<5>-n<6>-P (SEQ ID NO: 149), en la que n es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A y V, n<2>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E y D, n<5>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K y R, y n<6>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K y R; y

una secuencia peptídica C-terminal adicional, en la que la secuencia es:

(i) V-c<2>-E-G-c<5>-Q-Q-E-G-A-Q-Q-P-S-C (SEQ ID NO: 150), en la que c<2>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q y R, y c<5>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V y A; o (ii) A-V-c<3>-E-G-c<6>-Q-Q-E-G-A-Q-Q-P-S (SEQ ID NO: 151), en la que c<3>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q y R, y c<6>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V y A.

2. La mezcla de péptidos aislados de la reivindicación 1, en la que cada péptido aislado comprende, o consiste en una secuencia de n-<,>-n<2>-S-P-n<5>-n<6>-P-L-K-K-D-D-N-1-A-A-A-X<18>-V-L-R-G-X<23>-X<24>-K-D-G-X<28>-F-AX<31>-X<32>-A-V-C<35>-E-G-C<38>-Q-Q-E-G-A-Q-Q-P-S-C (SEQ ID NO: 2), en la que n es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A y V, n<2>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en E y D, n<5>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K y R, y n<6>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K y R, X<18>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V y L, X<23>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en L e I, X<24>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en A y V, X<28>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en R, D y N, X<31>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en I, W y V, X<32>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en K y R, c<35>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Q y R, y c<38>es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en V y A.

3. La mezcla de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en la que la mezcla comprende 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500 o más péptidos.

4. La mezcla de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la mezcla comprende 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 o más péptidos diferentes seleccionados de SEQ ID NO: 3-146.

5. La mezcla de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que cada péptido aislado está conjugado con un ligando, o uno o más de los péptidos aislados está biotinilado.

6. La mezcla de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que uno o más de los péptidos aislados se conjuga con:

(i) estreptavidina, estreptavidina polimérica, avidina o neutravidina;

(ii) una proteína portadora seleccionada entre seroalbúmina, opcionalmente seroalbúmina bovina (BSA), hemocianina de lapa californiana (KLH) y un dominio Fc de inmunoglobulina;

(iii) un dendrímero;

(iv) parte de un sistema de péptidos antigénicos múltiples (MAPS); o

(v) una partícula coloidal, nanopartícula, nanopartícula coloidal, partícula con estructura de núcleo y envuelta 0 nanoesfera hueca;

opcionalmente a través de un residuo de conexión de aminoácido terminal.

7. La mezcla de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que cada péptido aislado se inmoviliza sobre un soporte sólido, opcionalmente a través de un residuo de conexión de aminoácido terminal, opcionalmente en la que el soporte sólido es una esfera, una ruta de flujo en un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral, un pocillo en una placa de microvaloración o una ruta de flujo en un rotor.

8. Un procedimiento para detectar en una muestra un anticuerpo contra un epítopo de un antígeno deBorrelia,comprendiendo el procedimiento:

poner en contacto una muestra con la mezcla de péptidos aislados de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; y

detectar la formación de un complejo de anticuerpo-péptido que comprende uno o más péptidos aislados en la mezcla,

en el que la formación de dicho complejo es indicativa de la presencia en dicha muestra de un anticuerpo contra un epítopo de un antígeno deBorrelia,

opcionalmente, en el que dicho antígeno deBorreliapertenece a las especies Borreliaburgdorferi, Borrelia afzellioBorrelia garinii.

9. Un procedimiento para diagnosticar la enfermedad de Lyme en un sujeto, comprendiendo el procedimiento:

poner en contacto una muestra que se ha tomado del sujeto con la mezcla de péptidos aislados de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7; y

en el que la formación del complejo es indicativa de que el sujeto padece la enfermedad de Lyme.

10. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, en el que dicha etapa de detección comprende (i) realizar un ensayo ELISA, (ii) realizar un ensayo de flujo lateral, (iii) realizar un ensayo de aglutinación, (iv) realizar una transferencia Western, una transferencia por ranuras o una transferencia por puntos, o (v) hacer pasar la muestra por un rotor analítico.

11. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que dicha muestra (i) procede de un sujeto humano, canino o equino, o (ii) es un líquido corporal.

12. Un kit que comprende la mezcla de péptidos aislados de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un reactivo de marcaje capaz de unirse a un anticuerpo que reconoce un epítopo de uno o más péptidos aislados de la mezcla.

13. El kit de la reivindicación 12, en el que el reactivo de marcaje es:

(vi) un anticuerpo anti-IgG/IgM humana, canina o equina conjugado con un marcador detectable; o (vii) proteína Ay/o proteína G conjugadas con un marcador detectable, opcionalmente en el que el marcador detectable son partículas de oro coloidal.