ES2966741T3 - Amplificación de señales en flujo lateral e inmunoensayos relacionados - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona métodos, dispositivos, composiciones (por ejemplo, complejos de captura) y kits útiles para mejorar la detección de anticuerpos en una muestra de prueba. Los métodos, dispositivos y composiciones utilizan moléculas de unión a Fc detectables tales como Proteína A, Proteína G y/o un anticuerpo específico de Fc para amplificar la señal de un anticuerpo detectado en inmunoensayos, tales como ensayos de flujo lateral. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Amplificación de señales en flujo lateral e inmunoensayos relacionados

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional estadounidense n.° 61/562.302, presentada el 21 de noviembre de 2011.

Antecedentes de la invención

Los inmunoensayos se utilizan frecuentemente para identificar agentes infecciosos, entre otros usos. Ciertos inmunoensayos se basan en las respuestas inmunológicas del huésped a un agente infeccioso determinado, por ejemplo, comprobando la presencia de anticuerpos del huésped que se unen específicamente a uno o más antígenos únicos de ese agente infeccioso. Existen numerosos tipos de sistemas de inmunoensayo con fines diagnósticos, incluidos los grandes sistemas automatizados de laboratorio central y las pruebas relativamente sencillas de venta libre. Estos inmunoensayos utilizan una amplia gama de formatos de prueba, como ensayos de aglutinación, ensayos de precipitina, inmunoensayos ligados a enzimas, ensayos de fluorescencia directa, pruebas inmunohistológicas, ensayos de fijación del complemento, pruebas serológicas, ensayos inmunoelectroforéticos y pruebas de flujo lateral y de flujo continuo^ es decir, pruebas rápidas en "tira"). Los inmunoensayos pueden proporcionar diagnósticos rápidos, sencillos y eficaces para una gran variedad de afecciones. Sin embargo, sigue existiendo la necesidad en la técnica de inmunoensayos mejorados que tengan una mayor sensibilidad.

El documento WO2011/063235 divulga péptidos, dispositivos y procedimientos para la detección de anticuerpos contra Ehrlichia.

El documento WO 2011/063003 (miembro de la familia de US2011136155) divulga péptidos y procedimientos para la detección de anticuerpos contra la enfermedad de Lyme.

Hong W. et Al:., J. of Microbiological Methods, Vol. 83, no. 2, Noviembre 2010, p.133-140 trata del desarrollo de un ensayo de flujo lateral de 10 canales basado en tecnología de fósforo de conversión ascendente para el perfilado de anticuerpos contra Yersinia pestis.

Fan Chao-ming et Al., Revista china de tuberculosis y enfermedades respiratorias, Vol. 34, no. 5, mayo de 2011, p.356-358 [en chino, véase el resumen de Medline NLM21729624 en inglés] divulgan un estudio de detección rápida por inmunocromatografía de oro coloidal en sándwich de doble antígeno para el anticuerpo de Mycobacterium tuberculosis.

El documento WO2013/067524 (estado de la técnica de conformidad con el art. 54(3) EPC y miembro de la familia de US2013115634) divulga péptidos y procedimientos para la detección de anticuerpos contra la enfermedad de Lyme.

El documento WO2014/059274 (estado de la técnica de conformidad con el art. 54(3) EPC) divulga péptidos, dispositivos y procedimientos para la detección de anticuerpos de Ehrlichia.

Sumario de la invención

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que la adición de moléculas detectables de unión a Fc (p. ej., conjugados de proteína A, conjugados de proteína G, conjugados de anticuerpos secundarios) puede utilizarse para la detección de anticuerpos en inmunoensayos, p. ej., ensayos de captura basados en antígenos o de tipo sándwich. Estas moléculas detectables de unión a Fc pueden utilizarse solas o en combinación con otras entidades detectables para la detección de anticuerpos en inmunoensayos. Por ejemplo, estas moléculas de unión a Fc pueden utilizarse para detectar anticuerpos una vez que los anticuerpos a detectar son capturados por entidades de unión específicas de anticuerpos, por ejemplo, antígenos. En otro ejemplo, estas moléculas de unión a Fc pueden utilizarse como fuente secundaria de señales detectables, por ejemplo, en combinación con otra entidad de unión a anticuerpos marcada o detectable, como el antígeno.

Este descubrimiento puede aplicarse a una variedad de ensayos de tipo captura, procedimientos relacionados, composiciones y kits, como se describe en el presente documento.

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

La invención proporciona un dispositivo de detección de anticuerpos que comprende:

una región de carga de muestras;

una región conjugada, en la que dicha región conjugada comprende (i) un primer detector móvil que incluye una molécula de unión a Fc capaz de unirse a la región Fc del anticuerpo, en la que la molécula de unión a Fc está conjugada con una primera entidad detectable, y (ii) un segundo detector móvil, en el que el segundo detector comprende un antígeno o péptido antigénico conjugado con una segunda entidad detectable, siendo dicho antígeno o péptido antigénico capaz de unirse específicamente a la región variable del anticuerpo; y

una región de prueba, en la que dicha región de prueba comprende una entidad de captura inmovilizada capaz de unirse específicamente al anticuerpo;

en la que la región de carga muestras, la región conjugada y la región de prueba están configuradas para que, en funcionamiento, una muestra líquida cargada en la región de carga de muestras esté en comunicación fluida con la región conjugada y la región de prueba.

La invención proporciona además un kit que comprende el dispositivo de detección de cualquiera de las reivindicaciones 1-16.

Las realizaciones relacionadas con procedimientos, complejos de captura o composición o relacionadas con dispositivos o kits de detección de anticuerpos que no comprenden un primer detector móvil y un segundo detector móvil como se define en las reivindicaciones anexas no están de acuerdo con la invención y se presentan únicamente con fines ilustrativos.

Por lo tanto, ciertas realizaciones incluyen procedimientos para detectar un anticuerpo en una muestra de ensayo que comprenden: (a) poner en contacto la muestra problema con un primer detector para formar un primer complejo que comprenda el primer detector y el anticuerpo, en el que el primer detector comprenda una molécula de unión a Fc conjugada con una primera entidad detectable; b) poner en contacto el primer complejo con una entidad de captura inmovilizada en una región de prueba de una superficie, en la que la entidad de captura sea capaz de unirse específicamente al anticuerpo; y c) detectar la presencia de una señal de la primera entidad detectable en la región de prueba, en la que la presencia de la señal sea indicativa de la presencia del anticuerpo en la muestra problema. En ciertas realizaciones, el primer detector se inmoviliza en una región conjugada de la superficie, en la que la región conjugada no se solapa con la región de prueba de la superficie. En determinadas realizaciones, la molécula de unión a Fc es la proteína A, la proteína G o ambas. En ciertas realizaciones, el primer detector comprende la proteína A y la proteína G, cada una conjugada con la entidad detectable. En tales realizaciones, la relación entre la proteína A y la proteína G puede ajustarse para optimizar el nivel de amplificación de la señal dependiendo del tipo de inmunoglobulina a detectar. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la proteína A y la proteína G están presentes en una proporción de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 1:10, más preferiblemente de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 1:5.

En ciertas realizaciones, la entidad de captura es un antígeno o péptido antigénico. En realizaciones particulares, dicho antígeno o péptido antigénico es de un organismo seleccionado del grupo que consiste en el gusano del corazón, por ejemplo, gusano del corazón canino,Ehrlichia canis, Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii, Borrelia garinii, Anaplasma phagocytophilum,virus de la leucemia felina, parvovirus, cepa de la gripe A, cepa de la gripe B, virus de la gripe aviar, virus respiratorio sincitial,Legionella,adenovirus, rotavirus, virus de la inmunodeficiencia felina, virus de la inmunodeficiencia humana yStreptococcusdel grupo A .

En ciertas realizaciones, la primera entidad detectable es una nanopartícula metálica, una nanocáscara metálica, un fluoróforo o una partícula de látex coloreada. En algunas realizaciones, la nanopartícula metálica o la nanocáscara metálica se selecciona del grupo que consiste en partículas de oro, partículas de plata, partículas de cobre, partículas de platino, partículas de cadmio, partículas compuestas, esferas huecas de oro, nanocáscaras de sílice recubiertas de oro y cáscaras de oro recubiertas de sílice.

Ciertos procedimientos proporcionados en el presente documento comprenden además poner en contacto la muestra de ensayo con un segundo detector, en el que el segundo detector comprende un antígeno o péptido antigénico conjugado con una segunda entidad detectable, siendo dicho antígeno o péptido antigénico capaz de unirse específicamente al anticuerpo. En algunas realizaciones, el primer y el segundo detector están inmovilizados en una región conjugada, en la que la región conjugada no se solapa con la región de prueba de la superficie. En ciertas realizaciones, la región conjugada comprende además un detector de control. El nivel de amplificación de la señal puede seleccionarse ajustando la relación entre el primer detector y el segundo. En ciertas realizaciones, la relación entre el primer detector y el segundo detector es de aproximadamente 20:1 a aproximadamente 1:20, más preferiblemente de aproximadamente 20:1 a aproximadamente 1:1.

En determinadas realizaciones, la primera y la segunda entidades detectables son la misma. En realizaciones más específicas, la primera y la segunda entidades detectables son nanopartículas de oro. En otras realizaciones, la primera y la segunda entidades detectables son diferentes.

En ciertas realizaciones, la superficie es una vía de flujo en un dispositivo de ensayo de flujo lateral, una superficie de una placa de microtitulación o una vía de flujo en un rotor analítico.

Como se indicó anteriormente, ciertas realizaciones emplean un segundo detector que se conjuga con una entidad detectable, donde ese segundo detector es un antígeno o péptido antigénico. En algunas de estas realizaciones y otras relacionadas, el antígeno o péptido antigénico es de un organismo seleccionado del grupo que consiste en gusano del corazón, por ejemplo, gusano del corazón canino,Ehrlichia canis, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia ewingii,Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii, Borrelia garinii, Anaplasma phagocytophilum, Anaplasma platys,virus de la leucemia felina, parvovirus, por ejemplo, parvovirus canino, cepa de la gripe A, cepa de la gripe B, virus de la gripe aviar, virus respiratorio sincitial,Legionella,adenovirus, rotavirus, virus de la inmunodeficiencia felina, virus de la inmunodeficiencia humana yStreptococcusdel grupo A .

En algunas realizaciones, la superficie es una vía de flujo en un dispositivo de ensayo de flujo lateral o una vía de flujo en un rotor analítico. En determinadas realizaciones, la muestra de ensayo es sangre, suero o plasma.

También se incluyen dispositivos de detección de anticuerpos, que comprenden una región de carga de muestra; una región de conjugado, en la que dicha región de conjugado comprende un primer detector móvil que incluye una molécula de unión a Fc conjugada con una primera entidad detectable; y una región de prueba, en la que dicha región de prueba comprende una entidad de captura inmovilizada capaz de unirse específicamente al anticuerpo; en la que la región de carga de muestra, la región de conjugado y la región de prueba están configuradas de modo que en funcionamiento una muestra líquida cuando se carga en la región de carga de muestra, está en comunicación fluida con la región de conjugado y la región de prueba. En ciertas realizaciones, la molécula de unión a Fc es la proteína A y/o la proteína G.

En algunas realizaciones, la entidad de captura es un antígeno o péptido antigénico. En determinadas realizaciones, el antígeno o péptido antigénico es de un organismo seleccionado del grupo que consiste en gusano del corazón, por ejemplo, gusano del corazón caninoEhrlichia canis, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia ewingii, Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii, Borrelia garinii, Anaplasma phagocytophilum, Anaplasma platys,virus de la leucemia felina, parvovirus, por ejemplo, parvovirus canino, cepa de la gripe A, cepa de la gripe B, virus de la gripe aviar, virus respiratorio sincitial,Legionella,adenovirus, rotavirus, virus de la inmunodeficiencia felina, virus de la inmunodeficiencia humana yStreptococcusdel grupo A .

En determinadas realizaciones, la primera entidad detectable es una nanopartícula metálica, una nanocáscara metálica, un fluoróforo o una partícula de látex coloreada. En determinadas realizaciones, la nanopartícula metálica o la nanocáscara metálica se selecciona del grupo que consiste en partículas de oro, partículas de plata, partículas de cobre, partículas de platino, partículas de cadmio, partículas compuestas, esferas huecas de oro, nanocáscaras de sílice recubiertas de oro y cáscaras de oro recubiertas de sílice.

En algunas realizaciones, el dispositivo comprende además una región de control en comunicación fluida con una muestra líquida cuando se carga en la región de carga de muestras. En ciertas realizaciones, la región de control comprende un compañero de unión inmovilizado capaz de unirse específicamente a un detector de control.

En realizaciones particulares, el primer detector comprende proteína A o proteína G conjugada a una primera entidad detectable y dicho compañero de unión inmovilizado es un anticuerpo antiproteína A o antiproteína G.

Algunos dispositivos comprenden además una almohadilla absorbente situada aguas abajo de la región de prueba. En ciertos dispositivos, la región de conjugado se sitúa aguas arriba de la región de carga de muestras. En algunas realizaciones, la región de conjugado se sitúa aguas abajo de la región de carga de muestras. En algunas realizaciones, la región de carga de muestras comprende un material separador de sangre. En la invención, la región conjugada comprende además un segundo detector móvil, en el que el segundo detector comprende un antígeno o péptido antigénico conjugado con una segunda entidad detectable, siendo dicho antígeno o péptido antigénico capaz de unirse específicamente al anticuerpo. La relación entre el primer detector (por ejemplo, molécula de unión a Fc, como proteína A y/o proteína G, conjugada con una primera entidad detectable) y el segundo detector (antígeno/péptido antigénico conjugado con una segunda entidad detectable) puede ajustarse para seleccionar un nivel deseado de amplificación de la señal. En algunas realizaciones, la relación entre el primer detector y el segundo detector es de aproximadamente 20:1 a aproximadamente 1:20. En otras realizaciones, la relación entre el primer detector y el segundo detector es de aproximadamente 20:1 a aproximadamente 1:1.

En determinadas realizaciones, la primera y la segunda entidades detectables son la misma. En determinadas realizaciones, la primera y la segunda entidades detectables son nanopartículas de oro. En otras realizaciones, la primera y la segunda entidades detectables son diferentes.

En realizaciones particulares, por ejemplo, para la detección de anticuerpos antimicrobianos, el antígeno o péptido antigénico es de un organismo seleccionado del grupo que consiste en gusano del corazón, por ejemploehrlichia canis, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia ewingii, Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii, Borrelia garinii, Anaplasma phagocytophilum, Anaplasma platys, virus de la leucemia felina, parvovirus, por ejemplo, parvovirus canino, cepa de la gripe A, cepa de la gripe B, virus de la gripe aviar, virus respiratorio sincitial,Legionella,adenovirus, rotavirus, virus de la inmunodeficiencia felina, virus de la inmunodeficiencia humana yStreptococcusdel grupo A .

También se incluyen kits que comprenden uno o más de los dispositivos y sistemas de detección aquí descritos, e instrucciones para utilizar el dispositivo o sistema para detectar un anticuerpo en una muestra de ensayo. Ciertos kits comprenden además un segundo detector e instrucciones para combinar el segundo detector con la muestra problema antes de su aplicación a la región de carga de muestras del sistema de detección, en el que dicho segundo detector comprende un antígeno o péptido antigénico conjugado con una segunda entidad detectable, siendo dicho antígeno o péptido antigénico capaz de unirse específicamente al anticuerpo. En algunas realizaciones, las instrucciones proporcionan la combinación del segundo detector con la muestra de ensayo de tal manera que el segundo detector estará presente en una proporción particular con el primer detector para lograr un nivel deseado de amplificación de la señal.

También se incluyen procedimientos de detección de un anticuerpo en una muestra de ensayo que comprenden aplicar la muestra de ensayo a la región de carga de muestra de uno o más de los dispositivos o sistemas de detección descritos en el presente documento, y detectar la presencia o ausencia de una señal de la primera entidad detectable en la región de ensayo. Algunos procedimientos comprenden además la combinación de un segundo detector con la muestra problema antes de su aplicación a la región de carga de muestras del sistema de detección, en el que dicho segundo detector comprende un antígeno o péptido antigénico conjugado con una segunda entidad detectable, siendo dicho antígeno o péptido antigénico capaz de unirse específicamente al anticuerpo.

Ciertas realizaciones se refieren a uno o más complejos de captura que comprenden una entidad de captura, un anticuerpo en una muestra de ensayo y un primer detector, en el que la entidad de captura se une al anticuerpo y en el que el primer detector comprende una molécula de unión a Fc conjugada con una primera entidad detectable y se une a la región Fc del anticuerpo. Algunas de estas realizaciones y otras relacionadas comprenden además un segundo detector, en el que el segundo detector se une específicamente a la región variable del anticuerpo. En algunas realizaciones, el complejo de captura se inmoviliza en una región de prueba de una superficie.

Breve descripción de los dibujos

Lafigura1 ilustra un ejemplo de complejo de captura, con un anticuerpo de interés capturado por una entidad de captura (por ejemplo, antígeno específico de anticuerpo conjugado con BSA) inmovilizado en una superficie de prueba (por ejemplo, nitrocelulosa), un conjugado detectable de molécula de unión a Fc (por ejemplo, conjugado de oro coloidal de proteína A o proteína G) y, opcionalmente, un segundo conjugado detectable (por ejemplo, conjugado de oro coloidal de antígeno), Conjugado de oro coloidal con proteína A o proteína G) unido a la región Fc de un anticuerpo diana, y opcionalmente un segundo conjugado detectable (por ejemplo, conjugado de oro coloidal con antígeno) unido a la región variable del anticuerpo de interés.

Lafigura 2ilustra un ejemplo de dispositivo y procedimiento de flujo lateral según la presente invención. Los péptidos antigénicos específicos de un anticuerpo de interés se unen a la proteína portadora albúmina sérica bovina (BSA) y los conjugados BSA-péptido resultantes se utilizan como captura en nitrocelulosa. Este mismo péptido antigénico se conjuga además con oro coloidal, que sirve como etiqueta en este ensayo ejemplar. A continuación, la señal producida se amplifica aún más mediante la adición de conjugado(s) de proteína A/oro a la mezcla de conjugados.

Lafigura 3ilustra el flujo de la muestra a lo largo del tiempo de un ensayo de flujo lateral específico para la enfermedad de Lyme, utilizando el dispositivo de flujo lateral mostrado en la figura 2. En este ensayo ejemplar, una gota de sangre, suero o plasma (aproximadamente 15-20 pL mediante pipeta de transferencia) se mezcla con cuatro gotas de solución de conjugado de oro coloidal (aproximadamente 30 pL de un frasco cuentagotas) en un tubo de reacción. Se transfiere una gota de la mezcla de reacción resultante al puerto de muestras del casete de prueba que se coloca sobre una superficie plana. La almohadilla de separación de sangre filtra las células sanguíneas de la sangre total (véase la figura 2). El plasma (o suero) y los complejos anticuerpo-conjugadode B. burgdorferimigran a la membrana de nitrocelulosa que contiene las regiones de prueba y de control. La aplicación de tres (3) gotas (aproximadamente 60 pL de un frasco cuentagotas) de tampón de persecución (un minuto después de la aplicación de la muestra) desplaza toda la mezcla a través de la nitrocelulosa hacia la almohadilla absorbente superior que sigue arrastrando el líquido. Los anticuerpos específicos deB. burgdorferipresentes en una muestra positiva ya están formando complejos con el antígeno-conjugado marcado con oro. El complejo antígeno-anticuerpo marcado pasa a la línea de prueba, donde el antígeno inmovilizado captura los complejos antígeno-anticuerpo marcados a través del segundo sitio de unión del anticuerpo. El conjugado proteína A/G-oro presente en la mezcla del conjugado se une a la región Fc del anticuerpo diana y amplifica la señal de la prueba. El antígeno marcado libre y el resto de la mezcla de reacción pasan a la línea de control donde el conjugado de oro de Proteína A es capturado por la captura de control que comprende un anticuerpo anti-Proteína A de pollo. En este caso, el dispositivo se lee en unos 8 minutos. La aparición de una línea roja en la zona de prueba y de una segunda línea roja en la zona de control indica la presencia de anticuerpos contraB. burgdorferi.La aparición de una línea en la zona de control sólo indica la ausencia de anticuerpos contraB. burgdorferi.La prueba se considera inválida si (a) aparece la línea de prueba pero no se forma ninguna línea de control o (b) no se forman ni la línea de control ni la de prueba.

Descripción detallada

Tal y como se utilizan en el presente documento, los siguientes términos tendrán el significado que se indica a continuación:

Los artículos "un" y "una" se utilizan aquí para referirse a uno o a más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

Por "aproximadamente" se entiende una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud que varía hasta un 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1% con respecto a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud de referencia.

A lo largo de esta memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que las palabras "comprender", "comprende" y "que comprende" implican la inclusión de un paso o elemento o grupo de pasos o elementos pero no la exclusión de cualquier otro paso o elemento o grupo de pasos o elementos.

Por "que consiste en" se entiende que incluye, y se limita a, lo que sigue a la frase "que consiste en" Por lo tanto, la frase "que consiste en" indica que los elementos enumerados son necesarios u obligatorios, y que no pueden estar presentes otros elementos. Por "compuesto esencialmente de" se entiende la inclusión de cualquier elemento enumerado después de la frase, y limitado a otros elementos que no interfieran o contribuyan a la actividad o acción especificada en la divulgación para los elementos enumerados. Así, la frase "que consiste esencialmente en" indica que los elementos enumerados son necesarios u obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden o no estar presentes dependiendo de si afectan materialmente o no a la actividad o acción de los elementos enumerados.

Los términos "péptido" y "polipéptido" y "proteína" se utilizan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos y a variantes y análogos sintéticos y naturales del mismo. Por lo tanto, estos términos se aplican a los polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son aminoácidos sintéticos no naturales, como un análogo químico de un aminoácido natural correspondiente, así como a los polímeros de aminoácidos naturales y a sus derivados químicos naturales.

Una cantidad "aumentada" o "mejorada" es opcionalmente una cantidad "estadísticamente significativa", y puede incluir un aumento que es aproximadamente 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 o más veces (incluyendo todos los números enteros, rangos y decimales entre y por encima de 1, p .ej., 2.5, 3.6, 3.7. 3.8, etc.) la cantidad o el valor (por ejemplo, señal o valor como una puntuación de reactividad) en relación, por ejemplo, con una prueba de anticuerpos realizada sin una molécula de unión a Fc detectable. Un valor o cantidad "aumentado" o "mejorado" también puede incluir un 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18% , 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% o más de aumento en la cantidad o valor relativo, por ejemplo, a una prueba de anticuerpos realizada sin una molécula de unión a Fc detectable.

Procedimientos (no forman parte de la invención reivindicada)

En un aspecto, la presente divulgación incluye procedimientos para detectar un anticuerpo en una muestra de ensayo. En ciertas realizaciones, estos procedimientos se relacionan, en parte pertinente, con el contacto de la muestra de ensayo con una molécula de unión a Fc conjugada con una primera entidad detectable (es decir, un conjugadomolécula de unión a Fc detectable) para formar un primer complejo, el contacto del primer complejo con una entidad de captura inmovilizada en una región de prueba de una superficie, en la que la entidad de captura es capaz de unirse específicamente al anticuerpo, y la detección de la presencia de una señal del conjugado-molécula de unión a Fc detectable en la región de prueba. En este caso, la presencia de la señal es indicativa de la presencia del anticuerpo en la muestra problema.

Los reactantes de estos procedimientos pueden ponerse en contacto en cualquier orden o secuencia. Por ejemplo, la muestra de ensayo puede mezclarse con el conjugado-molécula de unión a Fc detectable antes de la aplicación a la superficie, o estos dos reactivos pueden aplicarse por separado a la superficie, secuencialmente o al mismo tiempo, en el mismo lugar o en lugares diferentes de la superficie. Si se añaden por separado, los reactivos entrarán en contacto entre sí al extenderse o fluir por la superficie de ensayo, por ejemplo, por capilaridad u otra acción. En determinadas realizaciones, el conjugado-molécula de unión a Fc detectable se inmoviliza previamente en una región conjugada de la superficie, que no se solapa con la región de prueba de la superficie. En algunas de estas realizaciones, la muestra de ensayo puede aplicarse a la superficie, donde fluye por capilaridad u otra acción a través de la región conjugada y la región de prueba, y de este modo entra en contacto con la molécula de unión a Fc y la entidad de captura. Si un anticuerpo de interés está presente en la muestra, entonces formará un complejo detectable con la molécula detectable de unión a Fc y la entidad de captura. En realizaciones específicas, la molécula de unión a Fc es la proteína A, la proteína G, la proteína A/G, la proteína L o cualquier combinación de las mismas, por ejemplo, como una mezcla o una proteína de fusión de las mismas.

Ciertos procedimientos proporcionados en el presente documento comprenden además poner en contacto la muestra de ensayo con una segunda molécula detectora. En estas realizaciones, el segundo detector puede ser cualquier entidad de unión a anticuerpos adecuada, por ejemplo, un antígeno o péptido antigénico conjugado con una segunda entidad detectable y capaz de unirse específicamente al anticuerpo. La combinación, por ejemplo, el conjugado de segundo detector y segunda entidad detectable se denomina a veces "antígeno-conjugado detectable anticuerpoespecífico" o "antígeno-conjugado detectable", que incluye antígenos peptídicos y antígenos no peptídicos. En algunas realizaciones, la primera y la segunda entidades detectables son las mismas, es decir, el conjugado de molécula de unión a Fc y el conjugado de antígeno detectable se conjugan con el mismo tipo de entidad detectable, como una partícula de oro. En otras realizaciones, la primera y la segunda entidades detectables son diferentes. En determinadas realizaciones, la primera y la segunda entidades detectables son ambas nanopartículas de oro, para crear conjugados de oro coloidal (CGC). En estas realizaciones y otras relacionadas, la molécula de unión a Fc detectable puede denominarse "molécula de unión a Fc-CGC"; entre los ejemplos específicos se incluyen la proteína A-CGC, la proteína G-CGC, la proteína A/G-CGC y la proteína L-CGC. En algunas realizaciones, la molécula de unión a Fc es un anticuerpo secundario o un fragmento del mismo capaz de unirse a la región Fc del anticuerpo de la muestra problema, mientras que el segundo detector puede ser cualquier entidad de unión a anticuerpos adecuada, por ejemplo, antígeno o péptido antigénico, etc.

Similar a lo anterior, los reactantes en estos procedimientos pueden ser contactados en cualquier orden o secuencia. Por ejemplo, la muestra de ensayo puede mezclarse con el conjugado detectable de molécula de unión a Fc, el conjugado detectable de antígeno, o ambos, antes de la aplicación a la superficie, o estos tres reactivos pueden aplicarse por separado a la superficie, secuencialmente o al mismo tiempo, en el mismo lugar o en lugares diferentes de la superficie. Si se añaden por separado, los reactivos entrarán en contacto entre sí al extenderse o fluir por la superficie de ensayo, por ejemplo, por capilaridad u otra acción.

En algunas realizaciones, la molécula de unión a Fc-conjugado se inmoviliza en una región conjugada de la superficie, que no se solapa con la región de prueba, y la muestra de ensayo y el antígeno detectable-conjugado se aplican por separado o juntos a la superficie. En otras realizaciones, el antígeno-conjugado detectable se inmoviliza en una región conjugada de la superficie, que no se solapa con la región de prueba, y la muestra de ensayo y la molécula de unión a Fc-conjugado detectable se aplican separada o conjuntamente a la superficie. En ciertas realizaciones, el conjugadomolécula de unión a Fc detectable y el conjugado-antígeno detectable están ambos inmovilizados en una región conjugada de la superficie, que no se solapa con la región de prueba de la superficie, y la muestra de ensayo se aplica a la superficie de prueba. Tras la aplicación a la superficie, la muestra de ensayo (sola o en combinación con los otros reactivos), puede fluir o extenderse por toda la superficie mediante capilaridad u otra acción, a través de la región conjugada (si está presente) y la región de ensayo, y entrar así en contacto con el conjugado-molécula de unión a Fc detectable, el conjugado-antígeno detectable y la entidad de captura. Si un anticuerpo de interés está presente en la muestra, formará uno o más complejos detectables con estos reactivos, indicando así la presencia del anticuerpo en la muestra. Los expertos en la materia comprenderán que estas combinaciones ejemplares no son limitativas y que son posibles otras posibilidades.

En ciertas realizaciones, la región conjugada comprende además un detector de control, por ejemplo, un anticuerpo que se une específicamente a la molécula de unión a Fc. Otros tipos de regiones de control serán evidentes para los expertos en la materia.

Una muestra de ensayo suele ser una muestra biológica obtenida de un sujeto que tiene o se sospecha que tiene un anticuerpo de interés, como un anticuerpo específico de un agente infeccioso. Una muestra biológica es preferiblemente fácil de obtener y puede incluir sangre, suero o plasma derivado de una muestra de sangre venosa o incluso de un pinchazo en el dedo. Se sabe que los tejidos de otras partes del cuerpo u otros fluidos corporales, como el líquido cefalorraquídeo (LCR), la saliva, las secreciones gástricas, las mucosidades, la orina, las heces, etc., contienen anticuerpos y pueden utilizarse como fuente de una muestra de ensayo. En otras realizaciones, la muestra es un tejido (por ejemplo, un homogeneizado de tejido), un extracto de un órgano corporal o un lisado celular. En ciertas realizaciones, el sujeto es un animal salvaje (por ejemplo, un ciervo o un roedor, como un ratón, una ardilla listada, una ardilla, etc.). En otras realizaciones, el sujeto es un animal de laboratorio (por ejemplo, un ratón, una rata, una cobaya, un conejo, un mono, un primate, etc.). En otras realizaciones, el sujeto es un animal doméstico o salvaje (por ejemplo, un perro, un gato, un caballo). En otras realizaciones, el sujeto es un ser humano.

Un anticuerpo, también denominado inmunoglobulina, es una proteína del sistema inmunitario en forma de Y que identifica específicamente objetos extraños o antígenos, como los componentes de bacterias, levaduras, parásitos y virus. Cada punta de la "Y" de un anticuerpo contiene un sitio de unión al antígeno que es específico para un epítopo concreto de un antígeno, lo que permite que estas dos estructuras se unan con precisión. La producción de un anticuerpo determinado aumenta tras la exposición a un antígeno (por ejemplo, un antígeno microbiano) que interactúa específicamente con ese anticuerpo. Por lo tanto, la detección de anticuerpos antígeno-específicos en una muestra de un sujeto puede informar de si ese sujeto está actualmente expuesto, o lo ha estado previamente, a un microbio determinado, como un virus, una bacteria, un hongo o un parásito.

La región cristalizable del fragmento (región Fc) es la región de la cola de un anticuerpo que interactúa con los receptores Fc de la superficie celular y con ciertas proteínas del sistema del complemento. En los isotipos de anticuerpos IgG, IgA e IgD, la región Fc se compone de dos fragmentos proteicos idénticos, derivados del segundo y tercer dominios constantes de las dos cadenas pesadas del anticuerpo. Las regiones Fc de IgM e IgE contienen tres dominios constantes de cadena pesada (dominios C<h>2-4) en cada cadena polipeptídica. Las regiones Fc de los anticuerpos IgG presentan un sitio de N-glicosilación muy conservado. Los N-glicanos unidos a este sitio son predominantemente estructuras diantenarias núcleo-fucosiladas del tipo complejo. Además, pequeñas cantidades de estos N-glicanos también llevan residuos de ácido siálico enlazado a-2,6 y GlcNAc bisecante. La región Fab de un anticuerpo contiene secciones variables que definen la especificidad de la diana del anticuerpo y, en cambio, la región Fc de todos los anticuerpos de una clase son iguales para cada especie; son constantes y no variables.

Un "sitio de unión al antígeno", o "porción de unión" de un anticuerpo, se refiere a la parte de la molécula de inmunoglobulina que participa en la unión al antígeno. El sitio de unión al antígeno está formado por residuos de aminoácidos de las regiones variables ("V") N-terminales de las cadenas pesada ("H") y ligera ("L"). Tres tramos altamente divergentes dentro de las regiones V de las cadenas pesada y ligera se denominan "regiones hipervariables", que se interponen entre tramos flanqueantes más conservados conocidos como "regiones marco" o "FR". Así, el término "FR" se refiere a las secuencias de aminoácidos que se encuentran de forma natural entre las regiones hipervariables de las inmunoglobulinas y adyacentes a ellas. En una molécula de anticuerpo, las tres regiones hipervariables de una cadena ligera y las tres regiones hipervariables de una cadena pesada están dispuestas unas respecto a otras en un espacio tridimensional para formar una superficie de unión al antígeno. La superficie de unión al antígeno es complementaria a la superficie tridimensional de un antígeno unido, y las tres regiones hipervariables de cada una de las cadenas pesada y ligera se denominan "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR"

Un anticuerpo comprende típicamente toda o una porción de una región Fc, para facilitar la detección por una molécula de unión a Fc, y también puede comprender uno o más sitios de unión a antígeno, para facilitar la detección por un agente de unión específico de anticuerpo, tal como un antígeno o péptido antigénico. Los anticuerpos pueden ser, por ejemplo , de tipo IgG, IgE, IgD, IgM o IgA. Generalmente, se detectan anticuerpos IgM y/o IgA, por ejemplo, para la detección en fases tempranas de la infección.

Una molécula de unión a Fc incluye cualquier agente de unión que se una específicamente a la región Fc de un anticuerpo o a cualquier región que esté fuera de la región variable de un anticuerpo. En ciertas realizaciones, una molécula de unión a Fc no es un anticuerpo ni un fragmento de unión a antígeno del mismo. En otras realizaciones, la molécula de unión a Fc es un anticuerpo secundario específico de Fc, por ejemplo, un anticuerpo anti-perro de conejo, un anticuerpo anti-perro de cabra. En ciertas realizaciones, una molécula de unión a Fc es un anticuerpo secundario contra el anticuerpo que debe detectarse en una muestra de ensayo. Ejemplos generales de moléculas de unión a Fc incluyen polipéptidos, receptores solubles, adnectinas, péptidos pequeños, miméticos peptídicos, moléculas pequeñas, aptámeros, etc., que se unen específicamente a la región Fc de una inmunoglobulina. Entre los ejemplos específicos de moléculas de unión a Fc se incluyen la proteína A, la proteína G, las proteínas de fusión de proteína A/G, la proteína L y los fragmentos y variantes de las mismas que conservan la capacidad de unirse específicamente a la región Fc de un anticuerpo.

La proteína A es una proteína de superficie MSCRAMM (componentes de la superficie microbiana que reconocen las moléculas de la matriz adhesiva.) de 40-60 kDa que se encuentra en la pared celular deStaphylococcus aureus, y está codificada por el gensp a. La proteína A de tipo salvaje está compuesta por cinco dominios de unión a Ig homólogos que se pliegan en un haz de tres hélices y que pueden unirse individualmente a las regiones Fc de un anticuerpo. La proteína A se une con gran afinidad a las IgG1 e IgG2 humanas y con afinidad moderada a las IgM, IgA e IgE humanas.

La proteína G es una proteína de unión a inmunoglobulinas que se expresa en las bacterias estreptocócicas de los grupos C y G (véase, por ejemplo, Sjobring et al., J Biol Chem. 266: 399-405, 1991). La estructura en solución de RMN(Véase Lian et al., Journal of Mol. Biol. 228:1219-1234, 1992) y la estructura cristalina (véase Derrick y Wigley, Journal of Mol. Biol. 243:906-918, 1994) de la Proteína G se han resuelto a 1 Angstrom. La proteína A y la proteína G son bien conocidas en la técnica y están disponibles comercialmente en diversas formas conjugadas y no conjugadas.

También se incluyen variantes funcionales y fragmentos de versiones de longitud completa o de tipo silvestre de la Proteína A y la Proteína G. En ciertas realizaciones, un polipéptido variante incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos alrededor del 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o más identidad o similitud de secuencia con la secuencia de tipo silvestre de la Proteína A y/o la Proteína G. Un fragmento funcional de puede ser un fragmento polipeptídico que sea, por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500 o más residuos contiguos o no contiguos de la Proteína A y/o Proteína G de tipo salvaje. Las variantes y fragmentos de la proteína A y la proteína G suelen conservar la unión específica a la región Fc de uno o más isotipos de inmunoglobulina.

El porcentaje de identidad de secuencia tiene un significado reconocido en la técnica y existen varios procedimientos para medir la identidad entre dos secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas. Véase, por ejemplo Lesk, Ed., Computational Molecular Biology, Oxford University Press, Nueva York, (1988); Smith, Ed., Biocomputing: Informatics And Genome Projects , Academic Press, Nueva York, (1993); Griffin & Griffin, Eds., Computer Analysis Of Sequence Data, Part I, Humana Press, New Jersey, (1994); von Heinje, Sequence Analysis In Molecular Biology, Academic Press, (1987); y Gribskov & Devereux, Eds., Sequence Analysis Primer, M Stockton Press, Nueva York, (1991). Los procedimientos para alinear polinucleótidos o polipéptidos están codificados en programas informáticos, incluido el paquete de programas GCG (Devereux et al., Nuc. Acids Res. 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA(Atschul et al., J Molec. Biol. 215:403 (1990)), y el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711) que utiliza el algoritmo de homología local de Smith y Waterman ( Adv. App. Math., 2:482-489 (1981)). Por ejemplo, puede utilizarse el programa informático ALIGN, que emplea el algoritmo FASTA, con una búsqueda afín de huecos con una penalización por apertura de hueco de -12 y una penalización por extensión de hueco de -2.

También se contemplan proteínas de fusión que comprenden polipéptidos de unión a Fc, incluidas fusiones de Proteína A y fusiones de Proteína G. Las moléculas de unión a Fc pueden fusionarse a la totalidad o a una parte de otra molécula de unión a Fc, o a uno o más polipéptidos heterólogos. Un ejemplo específico de proteína de fusión Proteína A/G combina cuatro dominios de unión a Fc de la Proteína A con dos de la Proteína G (véase, p. ej, Sikkema, J.W.D., Amer. Biotecnología. Lab, 7:42, 1989 y Eliasson et al., J. Biol. Química. 263, 4323-4327, 1988); no obstante, pueden utilizarse otras combinaciones. Los socios de fusión (por ejemplo, un péptido u otra fracción) pueden utilizarse para mejorar la purificación, mejorar la solubilidad, mejorar la expresión del polipéptido en una célula huésped, ayudar a la detección y estabilizar el polipéptido, etc. Ejemplos de socios de fusión incluyen proteínas portadoras (por ejemplo, albúmina sérica como la albúmina sérica bovina), beta-galactosidasa, glutatión-S-transferasa, etiqueta(s) de histidina, etc.

Una entidad de captura puede ser cualquier agente de unión que se una específicamente a un anticuerpo de interés, es decir, un anticuerpo diana, como un anticuerpo específico de microbio, que se detectará mediante los procedimientos y dispositivos aquí descritos. Típicamente, la entidad de captura se une específicamente a la región variable de un anticuerpo, y por lo tanto contiene uno o más epítopos que son específicos para el(los) sitio(s) de unión al antígeno de un anticuerpo. En ciertas realizaciones, una entidad de captura no es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. En realizaciones particulares, una entidad de captura es un antígeno o un péptido antigénico que se une específicamente a un anticuerpo de interés. A continuación se describen antígenos y péptidos antigénicos ejemplares. También se incluyen receptores solubles, adnectinas, miméticos peptídicos, moléculas pequeñas, aptámeros, etc., que se unen específicamente a un anticuerpo de interés, es decir, un anticuerpo que se va a detectar según los procedimientos aquí proporcionados.

Como se ha indicado anteriormente, una entidad de captura suele estar adherida o inmovilizada en una superficie o sustrato de prueba, como un soporte sólido o semisólido. La unión puede ser covalente o no covalente, y puede facilitarse mediante una fracción asociada a la entidad de captura que permita la unión covalente o no covalente, como una fracción que tenga una alta afinidad por un componente unido al portador, soporte o superficie. Por ejemplo, una entidad de captura puede estar asociada a un ligando, como la biotina, y el componente asociado a la superficie puede ser un receptor del ligando correspondiente, como la avidina. Alternativamente, una entidad de captura puede estar asociada a un receptor ligando, como la avidina, y el componente asociado a la superficie puede ser un ligando correspondiente, como la biotina. La entidad de captura puede fijarse o inmovilizarse en la superficie o sustrato de prueba antes o después de la adición de una muestra que contenga anticuerpos durante un inmunoensayo.

En determinadas realizaciones, la superficie de prueba es una microesfera, una mancha de puntos, una vía de flujo en un dispositivo de ensayo de flujo lateral o una vía de flujo en un rotor analítico. Por ejemplo, la entidad de captura puede adherirse o inmovilizarse en una membrana porosa, como una membrana de PVDF (por ejemplo, una membrana Immobilon™), una membrana de nitrocelulosa, una membrana de polietileno, una membrana de nailon o un tipo similar de membrana. En otras realizaciones, la superficie o sustrato de prueba es un tubo o un pocillo, como un pocillo en una placa (por ejemplo, una placa de microtitulación) adecuado para su uso en un ELISA u otro ensayo de tipo sándwich. En algunas realizaciones, la superficie o sustrato de prueba es un sensor, como un sensor electroquímico, óptico u optoelectrónico.

Tales superficies o sustratos de prueba pueden comprender vidrio, materiales a base de celulosa, polímeros termoplásticos, como polietileno, polipropileno o poliéster, estructuras sinterizadas compuestas de materiales particulados (por ejemplo, vidrio o diversos polímeros termoplásticos), o película de membrana moldeada compuesta de nitrocelulosa, nailon, polisulfona o similares. Una superficie o sustrato de prueba puede ser sinterizado, partículas finas de polietileno, comúnmente conocido como polietileno poroso, por ejemplo, 0,2-15 micras. polietileno poroso de Chromex Corporation (Albuquerque, NM), Porex™, etc.. Todos estos materiales de superficie de prueba o sustrato pueden utilizarse en formas adecuadas, como películas, láminas o placas, o pueden recubrirse o adherirse o laminarse a soportes inertes adecuados, como papel, vidrio, películas de plástico o tejidos.

Los procedimientos adecuados para inmovilizar entidades de captura como péptidos en fases sólidas incluyen interacciones iónicas, hidrofóbicas, covalentes y similares. La unión específica o semiespecífica a un portador, soporte o superficie sólidos o semisólidos puede lograrse si la entidad de captura tiene asociada una fracción que permita su unión covalente o no covalente al portador, soporte o superficie sólidos o semisólidos. Por ejemplo, la fracción puede tener afinidad por un componente unido al portador, soporte o superficie. En este caso, la fracción puede ser, por ejemplo , un grupo biotina o biotinilo o un análogo del mismo unido a un grupo aminoácido del péptido, como el ácido 6-aminohexanoico, y el componente es entonces avidina, estreptavidina, neutravidina o un análogo del mismo. Una alternativa es una situación en la que la fracción tiene una secuencia de aminoácidos de seis residuos de histidina consecutivos (por ejemplo, etiqueta 6x-His) y el portador comprende un derivado del ácido nitrilotriacético (NTA) cargado con iones Ni++ o Co++. Además de lo anterior, los portadores, soportes y superficies adecuados incluyen, pero no se limitan a, perlas (por ejemplo, perlas magnéticas, partículas coloidales o nanopartículas, como oro coloidal, o nanopartículas que comprenden sílice, látex, poliestireno, policarbonato o PDVF), látex de copolímeros como estirenodivinilbenceno, estireno-divinilbenceno hidroxilado poliestireno, poliestireno carboxilado, perlas de negro de humo, vidrio no activado o activado con poliestireno o cloruro de polivinilo, vidrio magnético poroso activado con epoxi, partículas de gelatina o polisacáridos u otras partículas proteicas.

Como se ha indicado anteriormente, los antígenos y los péptidos antigénicos pueden utilizarse como entidades de captura y/o como detectores específicos de anticuerpos. Un antígeno o péptido antigénico seleccionado es capaz de unirse específicamente a un anticuerpo diana, la mayoría de las veces a través de uno o ambos sitios de unión al antígeno del anticuerpo. Por lo tanto, el término "antígeno", tal como se utiliza aquí, se refiere a una molécula capaz de unirse específicamente a un anticuerpo a través de al menos un sitio de unión a antígeno del anticuerpo. Un antígeno puede comprender uno o más epítopos, la(s) región(es) particular(es) contigua(s) o no contigua(s) del antígeno que se une(n) específicamente al sitio de unión al antígeno del anticuerpo. Un epítopo puede ser lineal, secuencial o conformacional.

Un antígeno puede ser, por ejemplo, un péptido o una forma modificada del mismo, o un antígeno no peptídico como una molécula pequeña. Como se ha indicado anteriormente, los antígenos también pueden incluir receptores solubles, adnectinas, péptidos miméticos, moléculas pequeñas, aptámeros, etc., que se unen específicamente a un anticuerpo de interés.

Cuando se utilizan como entidades de captura, o "antígenos de captura", los antígenos o péptidos antigénicos no suelen estar etiquetados y se inmovilizan o fijan de otro modo a una superficie de prueba. En ciertas realizaciones, los antígenos de captura pueden fusionarse o conjugarse con una o más proteínas heterólogas, como la albúmina sérica bovina o los péptidos de antígenos múltiples (MAPS), o formar complejos con ellas, para facilitar la unión a la superficie de la prueba o para otro fin.

Para su uso como detectores específicos de anticuerpos, los antígenos o péptidos antigénicos suelen conjugarse con una entidad detectable y forman así un "antígeno-conjugado detectable" En ciertas realizaciones, estos antígenoconjugados detectables también están fusionados o conjugados o formando complejos con una o más proteínas heterólogas como la albúmina sérica bovina o MAPS. Los conjugados de antígenos detectables pueden diseñarse para la detección directa o indirecta, como se describe a continuación.

También se contemplan las proteínas de fusión que comprenden péptidos antigénicos. Los péptidos antigénicos pueden fusionarse con la totalidad o una parte de uno o más péptidos antigénicos que tengan la misma o diferente especificidad de unión (por ejemplo, que tengan uno o más epítopos iguales o diferentes), o con uno o más polipéptidos heterólogos. Los socios de fusión (por ejemplo, un péptido u otra fracción) pueden utilizarse para mejorar la purificación, mejorar la solubilidad, mejorar la expresión del péptido en una célula huésped, ayudar a la detección, estabilizar el péptido antigénico, facilitar la inmovilización en una superficie de prueba, etc. Ejemplos de socios de fusión incluyen proteínas portadoras (por ejemplo, albúmina sérica como la albúmina sérica bovina), betagalactosidasa, glutatión-S-transferasa, etiqueta(s) de histidina, etc.

Los antígenos y péptidos antigénicos y otros agentes de unión específicos de anticuerpos pueden derivarse de una variedad de fuentes. Entre las realizaciones particulares se incluyen las derivadas de fuentes microbianas, incluidos virus, bacterias, hongos y parásitos. Ejemplos específicos incluyen antígenos que son de uno o más de los siguientes: gusano del corazón, por ejemplo, gusano del corazón canino,Ehrlichia cams, Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii, Borrelia garinii, Anaplasma phagocytophilum,virus de la leucemia felina, parvovirus, por ejemplo, parvovirus canino, cepa de la gripe A, cepa de la gripe B, virus de la gripe aviar, virus respiratorio sincitial, virus de la inmunodeficiencia humana (VIH),Legionella,adenovirus,Streptococcusdel grupo A, virus de la inmunodeficiencia felina (VIF), rotavirus, etc. Pueden encontrarse ejemplos de antígenosde Borreliapara la detección de anticuerpos de la enfermedad de Lyme en Solicitud estadounidense n° 13/667.909, la publicación de patente estadounidense n.° US 2011/0136155 y WO 2011/063003 . Pueden encontrarse ejemplos de antígenos deEhrlichiapara la detección de anticuerpos de Ehrlichia en la Solicitud estadounidense n° 61/712.578, la publicación de patente estadounidense n.° 2011/0124125 y WO2011/063235

Los péptidos antigénicos para su uso según los procedimientos aquí descritos pueden prepararse mediante química sintética (es decir, un "péptido sintético"). En otras realizaciones, los péptidos antigénicos pueden producirse biológicamente (es decir, por maquinaria celular, como un ribosoma). En ciertas realizaciones, se aíslan péptidos antigénicos. Tal y como se utiliza en el presente documento, un péptido "aislado" es un péptido que se ha producido sintética o biológicamente y después se ha purificado, al menos parcialmente, de los productos químicos y/o la maquinaria celular utilizados para producir el péptido. En ciertas realizaciones, un péptido aislado está sustancialmente purificado. El término "sustancialmente purificado", tal y como se utiliza aquí, se refiere a una molécula, como un péptido, que está sustancialmente libre de material celular (proteínas, lípidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, etc.), medio de cultivo, precursores químicos, productos químicos utilizados en la síntesis del péptido, o combinaciones de los mismos. Un péptido que está sustancialmente purificado tiene menos de aproximadamente 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2%, 1% o menos del material celular, medio de cultivo, otros polipéptidos, precursores químicos y/o sustancias químicas utilizadas en la síntesis del péptido. En consecuencia, una molécula sustancialmente pura, como un péptido, puede ser al menos aproximadamente el 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99%, en peso seco, de la molécula de interés. Un péptido aislado puede estar en agua, en un tampón o en una forma seca a la espera de reconstitución, por ejemplo, como parte de un kit. Un péptido aislado puede estar en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Los ácidos y bases adecuados que son capaces de formar sales con los péptidos de la presente invención son bien conocidos por los expertos en la materia, e incluyen ácidos y bases inorgánicos y orgánicos.

Se dice que un anticuerpo de interés, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se "une específicamente", "se une inmunológicamente" y/o es "inmunológicamente reactivo" a una entidad de captura o detector específico de anticuerpo (por ejemplo, antígeno o péptido antigénico) si reacciona a un nivel detectable (dentro de, por ejemplo, un ensayo de flujo lateral, western blot, o ensayo ELISA) con la entidad o detector, y no reacciona detectablemente de manera estadísticamente significativa con polipéptidos o agentes no relacionados en condiciones similares. El término "unirse específicamente" también puede significar que una entidad de captura o un detector específico de anticuerpo tiene una mayor afinidad (por ejemplo, un mayor grado de selectividad) por un anticuerpo de interés que por otros anticuerpos de una muestra.

La unión inmunológica, tal como se utiliza en este contexto, se refiere generalmente a las interacciones no covalentes del tipo que se producen entre una molécula de inmunoglobulina y un antígeno para el que la inmunoglobulina es específica. La fuerza o afinidad de la unión, como en el caso de las interacciones de unión inmunológica, puede expresarse en términos de la constante de disociación (Kd) de la interacción, en la que una Kd menor representa una mayor afinidad. Las propiedades de unión inmunológica de los polipéptidos seleccionados pueden cuantificarse mediante procedimientos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Davies et al., Annual Rev. Biochem.

59:439-473, 1990). En ciertas realizaciones ilustrativas, un anticuerpo tiene una afinidad por una entidad de captura o un detector específico de anticuerpo (por ejemplo, antígeno o péptido antigénico) de al menos aproximadamente 0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40 o 50 nM. Como otro ejemplo, una entidad de captura o un detector específico de anticuerpo puede tener una afinidad por el anticuerpo de al menos aproximadamente 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces o mayor que por otros anticuerpos de la muestra.

De forma similar, se dice que una molécula de unión a Fc se "une específicamente" a una región Fc de una inmunoglobulina si reacciona a un nivel detectable con la región Fc, y no reacciona de forma detectable de manera estadísticamente significativa con polipéptidos o agentes no relacionados en condiciones similares. En algunas realizaciones ilustrativas, una molécula de unión a Fc tiene una afinidad por la región Fc de un isotipo de inmunoglobulina seleccionado de al menos aproximadamente 0,01, 0,05, 0,1, 0 .2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, o 50 nM. Ciertas moléculas de unión a Fc tienen una afinidad mayor o menor por uno o más isotipos de inmunoglobulina en relación con otros.

Dicha afinidad o grado de especificidad puede determinarse mediante una variedad de procedimientos rutinarios, incluyendo, por ejemplo, estudios de unión competitiva. En un ensayo ELISA, una respuesta positiva se define como un valor 2 o 3 desviaciones estándar superior al valor medio de un control o grupo de controles.

Como se ha indicado anteriormente, ciertas moléculas detectoras tales como moléculas de unión a Fc, antígenos y/o péptidos antigénicos se conjugan con una entidad detectable. La conjugación se consigue normalmente por unión covalente. Las entidades detectables incluyen "entidades directamente detectables", como nanopartículas metálicas, nanocáscaras metálicas, partículas de látex coloreadas, radioisótopos y fluoróforos, y "entidades indirectamente detectables", que a menudo se basan en interacciones ligando-receptor para lograr la señalización. En el primer caso, la molécula detectora (por ejemplo, péptido antigénico, molécula de unión a Fc como la proteína A/G) se conjuga con la entidad directamente detectable. En este último caso, la molécula detectora se conjuga con un ligando, que a su vez interactúa con su ligando-receptor, estando este último conjugado con una entidad directamente detectable, o viceversa. Algunos ejemplos de ligandos son la biotina (por ejemplo, a través de un residuo de cisteína o lisina), las moléculas lipídicas (por ejemplo, a través de un residuo de cisteína) y las proteínas portadoras (por ejemplo, la albúmina sérica). La unión a ligandos, como la biotina, puede ser útil para asociar el detector a receptores de ligandos, como la avidina, la estreptavidina o la neutravidina. A su vez, la avidina, la estreptavidina y la neutravidina pueden unirse a una entidad directamente detectable (por ejemplo, una fracción de señalización que pueda visualizarse, como el oro coloidal, una fracción fluorescente o una enzima como la peroxidasa de rábano picante o la fosfatasa alcalina). Alternativamente, las moléculas detectoras pueden fusionarse o unirse a un receptor de ligando, como avidina, estreptavidina o neutravidina, facilitando así una asociación con el ligando correspondiente, que, a su vez, está unido a una entidad directamente detectable. Los ejemplos de otros pares ligando-receptor son bien conocidos en la técnica y pueden utilizarse de forma similar

Entre los ejemplos de entidades directamente detectables (o elementos de señalización) se incluyen radioisótopos, fluoróforos, tintes, enzimas, nanopartículas, partículas de látex coloreadas, marcadores quimioluminiscentes, tintes emisores de luz y otros descritos en el presente documento y conocidos en la técnica.

Ejemplos de radioisótopos que pueden utilizarse como entidades directamente detectables incluyen 32P, 33P, 35S, 3H, y 125I. Estos radioisótopos tienen diferentes semividas, tipos de desintegración y niveles de energía que pueden adaptarse a las necesidades de un protocolo concreto. Por ejemplo, el 3H es un emisor de baja energía que da lugar a bajos niveles de fondo; sin embargo, esta baja energía también da lugar a largos periodos de tiempo para la autorradiografía y otras mediciones.

Entre los ejemplos de fluoróforos o fluorocromos que pueden utilizarse como entidades directamente detectables se incluyen la fluoresceína, la tetrametilrhodamina, el rojo Texas y varios otros (por ejemplo, Haugland, Handbook of Fluorescent Probes - 9th Ed., 2002, Molec. Probes, Inc., Eugene OR; Haugland, El Manual: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies-10th Ed., 2005, Invitrogen, Carlsbad, CA). También se incluyen tintes emisores de luz o detectables de otro modo. La luz emitida por los colorantes puede ser luz visible o luz invisible, como luz ultravioleta o infrarroja. En realizaciones ejemplares, el colorante puede ser un colorante de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET); un colorante de xanteno, como la fluoresceína y la rodamina; un colorante que tenga un grupo amino en la posición alfa o beta (como un colorante de naftilamina, 1-dimetilaminonaftil-5-sulfonato, 1-anilino-8-naftalende sulfonato y 2-p-touidinil-6-naftaleno sulfonato); un colorante que tenga 3-fenil-7-isocianatocotimarina; una acridina, como la 9-isotiocianatoacridina y el naranja de acridina; un pireno, un bensoxadiazol y un estilbeno; un colorante que contenga 3-(£-carboxipentil)-3'-etil-5,5-dimetiloxacarbocianina (CYA); 6-carboxi-fluoresceína (FAM); 5&6-carboxirodamina-110 (R110); 6-carboxirodamina-6G (R6G); N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA); 6-carboxi-X-rodamina (ROX); 6-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxi-fluoresceína (JOE); ALEXA FLUOR™; Cy2; Texas Red y Rhodamine Red, 6-carboxi-2',4,7,7'-tetraclorofluoresceína (TET); 6-carboxi-2',4,4',5',7,7'-hexaclorofluoresceína (H<e>X); 5-carboxi-2',4,5,7'-tetraclorofluoresceína (ZOE); NAN; NED; Cy3; Cy3.5; Cy5; Cy5.5; Cy7; y Cy7.5; IR800CW, ICG, Alexa Fluor 350; Alexa Fluor 488; Alexa Fluor 532; Alexa Fluor 546; Alexa Fluor 568; Alexa Fluor 594; Alexa Fluor 647; Alexa Fluor 680, o Alexa Fluor 750.

Las partículas muy pequeñas, denominadas nanopartículas, también pueden utilizarse como entidades directamente detectables. Estas partículas suelen tener un tamaño de 1-1000 nm e incluyen diversas estructuras químicas, como partículas de oro y plata y puntos cuánticos. Cuando se irradian con luz blanca incidente en ángulo, las nanopartículas de plata u oro de unos 40-120 nm dispersan la luz monocromática con gran intensidad. La longitud de onda de la luz dispersada depende del tamaño de la partícula. Cuatro o cinco partículas diferentes próximas entre sí dispersarán una luz monocromática que, al superponerse, dará lugar a un color específico y único. Las nanopartículas derivatizadas, como las de plata u oro, pueden unirse a una amplia gama de moléculas, como proteínas, anticuerpos, moléculas pequeñas, ligandos receptores y ácidos nucleicos. Algunos ejemplos específicos de nanopartículas son las nanopartículas metálicas y las nanocáscaras metálicas, como las partículas de oro, las partículas de plata, las partículas de cobre, las partículas de platino, las partículas de cadmio, las partículas compuestas, las esferas huecas de oro, las nanocáscaras de sílice recubiertas de oro y las cáscaras de oro recubiertas de sílice. También se incluyen nanopartículas de sílice, látex, poliestireno, policarbonato, poliacrilato, PVDF y partículas coloreadas de cualquiera de estos materiales.

Los puntos cuánticos también pueden utilizarse como entidades directamente detectables. Los puntos cuánticos son cristales fluorescentes de 1-5 nm de diámetro excitables por la luz en una amplia gama de longitudes de onda. Al ser excitados por una luz de longitud de onda adecuada, estos cristales emiten una luz, por ejemplo monocromática, cuya longitud de onda depende de su composición química y de su tamaño. Los puntos cuánticos como CdSe, ZnSe, InP o InAs poseen propiedades ópticas únicas; estos y otros puntos cuánticos similares están disponibles en varias fuentes comerciales (por ejemplo, NN-Labs, Fayetteville, AR; Ocean Nanotech, Fayetteville,<a>R; Nanoco Technologies, Manchester, U<k>; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

La detección de la presencia de una señal puede lograrse por cualquier medio apropiado para la etiqueta o entidad detectable empleada en el ensayo. Por ejemplo, el paso de detección puede incluir la inspección visible del complejo de captura para detectar un cambio de color, o la inspección del complejo de captura para detectar un cambio físicoquímico. Pueden producirse cambios físico-químicos con reacciones de oxidación u otras reacciones químicas. Pueden detectarse a simple vista, utilizando un espectrofotómetro o medios similares.

Una señal es típicamente indicativa de la presencia de un anticuerpo de interés cuando es más fuerte que la señal del control negativo; sin embargo, no todas las pruebas requieren un control negativo. En algunos casos, pero no necesariamente, la intensidad de una señal positiva puede cuantificarse numéricamente y es indicativa de la presencia del anticuerpo cuando dicha intensidad es estadísticamente significativa en relación con un control. En algunos casos, el conocimiento rutinario y la experiencia con un tipo de prueba concreto establecen cuándo una señal es positiva o negativa, y por tanto indica la presencia o ausencia de un anticuerpo de interés.

Como ejemplo, la señal de ciertos dispositivos de ensayo de flujo lateral puede medirse según la puntuación de Reactividad, una puntuación de 0-5 (incluidos los puntos decimales intermedios) en la que una señal más fuerte y positiva recibe una puntuación numérica más alta. Un control negativo tendrá normalmente una puntuación más cercana a cero, por ejemplo, alrededor de 0,25 o menos.

La señal de detección puede optimizarse, por ejemplo, ajustando la proporción de los reactantes individuales. Un ejemplo incluye ajustar la proporción de (i) conjugado(s) detectable(s) de molécula de unión a Fc y (ii) conjugado(s) detectable(s) de antígeno/péptido antigénico como sigue: una proporción (p. ej., relación molar) de (i):(ii) de aproximadamente 1:200, 1:100, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:19, 118, 1:17, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1,2:1, 3:1,4:1, 5:1,6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1, 60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1 o 200:1, incluidas todas las proporciones y rangos de proporciones intermedios. En algunas realizaciones, la relación entre el conjugado detectable de molécula de unión a Fc y un conjugado detectable de antígeno/péptido antigénico es de aproximadamente 20:1 a aproximadamente 1:20, preferentemente de aproximadamente 20:1 a aproximadamente 1:1, y más preferentemente de aproximadamente 16:1 a aproximadamente 2:1. En ciertas realizaciones, la molécula de unión a Fc en el conjugado detectable es proteína A, proteína G, proteínas de fusión de proteína A/G, proteína L, o fragmentos y variantes de las mismas que conservan la capacidad de unirse específicamente a la región Fc de un anticuerpo.

En algunas realizaciones, se utiliza una mezcla de proteína A y proteína G como los conjugados de molécula de unión a Fc, en los que cada molécula de proteína A y proteína G se conjuga con una entidad detectable. En tales realizaciones en las que se utilizan tanto la proteína A como la proteína G como conjugado detectable de la molécula de unión a Fc, la señal de detección puede optimizarse alterando la proporción de proteína A y proteína G en función del tipo de clase de inmunoglobulina que deba detectarse. Como se explica más arriba, la proteína A y la proteína G tienen diferentes afinidades de unión a las regiones Fc de diferentes clases de inmunoglobulinas (por ejemplo, de IgG, IgE, IgD, IgM o IgA). Por consiguiente, la proporción entre la proteína A y la proteína G puede ajustarse en función de la clase de inmunoglobulina que se desee detectar. A modo de ejemplo, si se desea detectar predominantemente inmunoglobulinas IgM, puede utilizarse una proporción menor de proteína A y proteína G (es decir, una cantidad mayor de conjugado de proteína G en relación con el conjugado de proteína A). Por otra parte, si se desea detectar predominantemente inmunoglobulinas IgG, puede utilizarse una proporción mayor de proteína A que de proteína G (es decir, una cantidad mayor de conjugado de proteína A en relación con el conjugado de proteína G). Las proporciones ejemplares (p. ej., relaciones molares) de conjugados de proteína A a proteína G incluyen, pero no se limitan a, 1:20, 1:19, 1:18, 1:17, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1,2:1, 3:1,4:1,5:1,6:1,7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1 y 20:1. En algunas realizaciones, la relación entre el conjugado de proteína A y el conjugado de proteína G es de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 1:10, preferiblemente de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 1:5, y más preferiblemente de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 1:2. En una realización, la proporción entre el conjugado de proteína A y el conjugado de proteína G es de aproximadamente 1:1.

En ciertas realizaciones, la señal de detección puede optimizarse aún más ajustando las proporciones de proteína A a proteína G en relación con la cantidad de conjugado(s) detectable(s) de antígeno/péptido antigénico. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la relación (por ejemplo, relación molar) del conjugado de proteína A con el conjugado de proteína G con el conjugado de antígeno/péptido antigénico detectable puede ser de aproximadamente 20:20:1 a aproximadamente 1:1:20, de aproximadamente 10:10:1 a aproximadamente 2:2:1, o de aproximadamente 4:2:1 a aproximadamente 1:2:1.

Los protocolos para inmunoensayos que utilizan antígenos para la detección de anticuerpos específicos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede utilizar un ensayo sándwich convencional o un formato de ensayo competitivo convencional. Para un análisis de algunos tipos de ensayos adecuados, véase Current Protocols in Immunology (Coligan et al., editores, John Wiley & Sons, Inc). En algunas realizaciones, la etapa de detección comprende la realización de un inmunoensayo de flujo lateral. En ciertas realizaciones, la etapa de detección comprende la realización de un ensayo ELISA. En otras realizaciones, la etapa de detección comprende hacer girar la muestra en un rotor analítico. En otras realizaciones, la etapa de detección comprende el análisis de la muestra con un sensor electroquímico, óptico u optoelectrónico.

Un formato de ensayo particularmente útil es un formato de inmunoensayo de flujo lateral. Como ejemplo no limitativo, las moléculas informadoras o detectoras que incluyen una molécula de unión a Fc (p. ej., proteína A y/o G) y opcionalmente un antígeno específico de anticuerpo se marcan con una entidad detectable (p. ej., oro coloidal) y después se secan y se colocan en una almohadilla de fibra de vidrio (la almohadilla de aplicación de la muestra o la almohadilla del conjugado). El antígeno o péptido antigénico no marcado (es decir, la entidad de captura) se inmoviliza en una membrana, como la nitrocelulosa o una membrana de PVDF (fluoruro de polivinilideno) (por ejemplo, una membrana Immobilon™). Cuando se aplica una solución de muestra (sangre, suero, etc.) a la almohadilla de aplicación de muestras (o fluye a través de la almohadilla de conjugado), disuelve el detector o detectores marcados, que se unen a los anticuerpos de la muestra, si están presentes. Los complejos resultantes se transportan a la siguiente membrana (PVDF o nitrocelulosa que contiene la entidad de captura) por capilaridad. Si hay anticuerpos contra la entidad de captura, forman un complejo con el detector o detectores y la entidad de captura de diagnóstico en la membrana, generando así una señal (por ejemplo, una banda que puede verse o visualizarse).

Como otro ejemplo no limitante, la almohadilla de muestra no está rayada con las moléculas detectoras (es decir, moléculas detectables de unión a Fc, conjugados detectables de antígeno), es decir, la almohadilla de muestra no contiene ninguna región conjugada de moléculas detectoras preinmovilizadas. Todos los demás componentes son esencialmente los mismos que los descritos anteriormente, en los que el antígeno o péptido antigénico no marcado (es decir, la entidad de captura) se inmoviliza en una membrana, como la nitrocelulosa o una membrana de PVDF (fluoruro de polivinilideno) (por ejemplo, una membrana Immobilon™). La muestra de análisis (sangre, suero, etc.) se mezcla previamente con una o ambas moléculas detectoras y, a continuación, se aplica a la almohadilla de muestras. Alternativamente, la muestra de ensayo y las moléculas detectoras se aplican a la almohadilla de muestra por separado, al mismo tiempo o secuencialmente. Otras combinaciones serán evidentes para los expertos en la materia. Independientemente del orden en que se mezclen o apliquen, los complejos resultantes de los anticuerpos de la muestra y las moléculas detectoras se transportan a la siguiente membrana (PVDF o nitrocelulosa que contiene la entidad de captura) por acción capilar. Si los anticuerpos contra la entidad de captura están presentes, forman un complejo con los detectores y la entidad de captura de diagnóstico en la membrana, generando así una señal (por ejemplo, una banda que puede verse o visualizarse).

En realizaciones específicas, los procedimientos incluyen el contacto de la muestra de ensayo con un conjugado de Proteína A y/o Proteína G-oro coloidal (CGC) para formar un primer complejo, el contacto del primer complejo con un antígeno peptídico inmovilizado en una región de ensayo de una membrana de nitrocelulosa o PVDF, donde el antígeno peptídico se deriva de una fuente microbiana y se une específicamente a un anticuerpo de interés (por ejemplo, un anticuerpo antibacteriano, antivírico, antiparasitario, antifúngico). El antígeno peptídico puede conjugarse con BSA o sintetizarse como MAPS. La presencia de una señal de la proteína A-CGC y/o de la proteína G-CGC en la región de prueba es indicativa de la presencia del anticuerpo en la muestra de ensayo.

Ciertos procedimientos incluyen además el contacto de la muestra de ensayo con un conjugado de antígeno peptídico-CGC, que comprende el mismo antígeno peptídico descrito anteriormente. En ciertas realizaciones, la proteína A/G-CGC o el anticuerpo secundario-CGC o una combinación de los mismos y el antígeno peptídico-CGC se inmovilizan en una región conjugada de la membrana (o en una membrana separada pero conectada) de forma que no se solapen con la región de prueba. En otras realizaciones, la proteína A/G-CGC o el anticuerpo secundario-CGC o una combinación de los mismos y el antígeno peptídico-CGC no se inmovilizan en la membrana, sino que se aplican a la superficie junto con la muestra problema, al mismo tiempo o secuencialmente. La señal combinada de la proteína A/G-CGC y/o el anticuerpo secundario-CGC y el antígeno peptídico-CGC indica la presencia del anticuerpo en la muestra de ensayo, y es típicamente más fuerte que la señal de un ensayo realizado con el antígeno peptídico-CGC solo, es decir, sin la proteína A-CGC, la proteína G-CGC, o el anticuerpo secundario-CGC. En determinadas realizaciones, el antígeno peptídico es un antígenode Borrelia(existente de forma natural o sintetizado, por ejemplo, idéntico o imitador del antígeno existente de forma natural), y la muestra de ensayo procede de un sujeto sospechoso de padecer la enfermedad de Lyme. Una señal positiva identifica la presencia de anticuerpos específicos de la enfermedad de Lyme en la muestra. En otras realizaciones, el antígeno peptídico es un antígeno deEhrlichia(existente de forma natural o sintetizado, por ejemplo, idéntico o que imita al antígeno existente de forma natural), y se sospecha que el sujeto padece Ehrlichiosis, una infección bacteriana transmitida por garrapatas causada por bacterias de la familia Anaplasmataceae, génerosEhrlichiayAnaplasma.

Otro ensayo para el cribado de productos sanguíneos u otros fluidos fisiológicos o biológicos es un ensayo inmunoenzimático, es decir, un ELISA. Normalmente, en un ELISA, las entidades de captura (por ejemplo, antígenos específicos de anticuerpos) se adsorben a la superficie de un pocillo de microtitulación directamente o a través de una matriz de captura (por ejemplo, un anticuerpo). A continuación, se bloquean los sitios de unión a proteínas no específicos residuales de la superficie con un agente adecuado, como albúmina de suero bovino (BSA), suero normal de cabra inactivado por calor (NGS) o BLOTTO (una solución tamponada de leche en polvo descremada que también contiene un conservante, sales y un agente antiespumante). A continuación, se incuba el pocillo con una muestra biológica sospechosa de contener un anticuerpo de interés. La muestra puede aplicarse pura, o más a menudo puede diluirse, normalmente en una solución tamponada que contenga una pequeña cantidad (0,1-5,0% en peso) de proteína, como BSA, NGS o BLOTTO. Tras incubar durante un tiempo suficiente para permitir que se produzca la unión específica, se lava el pocillo para eliminar la proteína no unida y, a continuación, se incuba con una o más moléculas detectoras, incluida una molécula de unión a Fc (por ejemplo, proteína A. y/o proteína G) y, opcionalmente, otro antígeno específico de anticuerpo (normalmente el mismo que la entidad de captura) que se conjuga con una enzima u otra etiqueta mediante procedimientos estándar y se disuelve en tampón de bloqueo. La etiqueta puede elegirse entre una variedad de enzimas, como la peroxidasa de rábano picante (HRP), la beta-galactosidasa, la fosfatasa alcalina, la glucosa oxidasa, etc. Se deja el tiempo suficiente para que vuelva a producirse la unión específica, después se lava de nuevo el pocillo para eliminar el conjugado no unido y se añade un sustrato adecuado para la enzima. Se deja que se desarrolle el color y se determina la densidad óptica del contenido del pocillo visual o instrumentalmente (medida a una longitud de onda adecuada). El valor DO de corte puede definirse como la media de DO+3 desviaciones estándar (DE) de al menos 50 muestras de suero recogidas de individuos de una zona donde la enfermedad de Lyme no es endémica, o por otras definiciones convencionales de este tipo. En el caso de un ensayo muy específico, puede utilizarse DO+2<s>D como valor de corte. Las condiciones para realizar ensayos ELISA son bien conocidas en la técnica.

Debe entenderse por un experto en la materia que cualquier número de formatos de ensayo de proteínas convencionales, en particular los formatos de inmunoensayo, pueden ser diseñados para utilizar las diversas realizaciones descritas en el presente documento. Por lo tanto, esta invención no está limitada por la selección del formato de ensayo particular, y se cree que abarca formatos de ensayo que son conocidos por los expertos en la materia.

Frases como "muestra que contiene un anticuerpo" o "detectar un anticuerpo en una muestra" no pretenden excluir muestras o determinaciones (por ejemplo, intentos de detección) en las que no se contiene o detecta ningún anticuerpo. En un sentido general, esta invención implica ensayos para determinar si un anticuerpo producido en respuesta a la infección por un microbio infeccioso está presente en una muestra, independientemente de si se detecta o no.

Las condiciones para hacer reaccionar antígenos/péptidos y anticuerpos de manera que reaccionen específicamente son bien conocidas por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo Current Protocols in Immunology (Coligan et al., editores, John Wiley & Sons, Inc).

Dispositivos y composiciones

En otro aspecto, la presente invención incluye dispositivos para detectar un anticuerpo en una muestra como se define en las reivindicaciones anexas. Ciertos aspectos incluyen dispositivos de detección de anticuerpos o sistemas de detección de anticuerpos, que comprenden una región de carga de muestra, una región de conjugado y una región de prueba. La región conjugada normalmente no se solapa con la región de prueba; sin embargo, la región de muestra y estas dos regiones están configuradas de manera que en funcionamiento una muestra líquida cuando se carga en la región de carga de muestra, está en comunicación fluida con la región conjugada y la región de prueba. Por lo general, la muestra de ensayo fluye a través de las regiones de conjugado y ensayo o se comunica con ellas por capilaridad. La región de conjugado comprende una molécula de unión a Fc móvil conjugada con una primera entidad detectable (es decir, un conjugado de molécula de unión a Fc detectable, como un conjugado de proteína A y/o proteína G, o un conjugado de anticuerpo secundario específico de Fe), y la región de prueba comprende una entidad de captura inmovilizada capaz de unirse específicamente al anticuerpo. Cada una de estas características se describe en el presente documento.

En algunas realizaciones, el dispositivo comprende además una región de control en comunicación fluida con una muestra líquida cuando se carga en la región de carga de muestras. Una vez más, la muestra líquida puede fluir o comunicarse con la región de control a través de la acción capilar. En ciertas realizaciones, la región de control comprende un compañero de unión inmovilizado capaz de unirse específicamente a un detector de control. A modo de ejemplo, la región de control comprende un anticuerpo antiproteína A, un anticuerpo antiproteína G, o cualquiera de las IgG de mamífero reactivas con la proteína A o la proteína G.

Algunos dispositivos comprenden además una almohadilla absorbente situada aguas abajo de la región de prueba. En ciertos dispositivos, la región de conjugado se sitúa aguas arriba de la región de carga de muestras. En algunas realizaciones, la región de conjugado se sitúa aguas abajo de la región de carga de muestras. En algunas realizaciones, la región de carga de muestras comprende un material separador de sangre.

En la invención, la región conjugada comprende además un segundo detector móvil, en el que el segundo detector comprende un antígeno o péptido antigénico conjugado con una segunda entidad detectable, siendo dicho antígeno o péptido antigénico capaz de unirse específicamente al anticuerpo. En ciertas realizaciones, los detectores primero (molécula de unión a Fc detectable) y segundo (por ejemplo, antígeno-conjugado detectable) tienen el mismo tipo de entidad detectable. En otras realizaciones, los detectores primero y segundo tienen diferentes tipos de entidades detectables. En determinadas realizaciones, la relación (por ejemplo, relación molar) entre el primer detector y el segundo detector se ajusta para alcanzar un nivel deseado de amplificación de la señal. Por ejemplo, la relación entre el primer detector (por ejemplo, molécula de unión a Fc detectable, como la proteína A/proteína G) y el segundo detector (por ejemplo, antígeno-conjugado detectable) puede ser de aproximadamente 1:200, 1:100, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:19, 1:18, 1:17, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 21, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1, 20:1, 30:1, 40:1, 50:1,60:1, 70:1, 80:1, 90:1, 100:1 o 200:1, incluidas todas las proporciones y rangos de proporciones intermedios. En algunas realizaciones, la proporción entre el conjugado detectable de molécula de unión a Fc y un conjugado detectable de antígeno/péptido antigénico es de aproximadamente 20:1 a aproximadamente 1:20, preferiblemente de aproximadamente 20:1 a aproximadamente 1:1, y más preferiblemente de aproximadamente 16:1 a aproximadamente 2:1. En las realizaciones en las que se utilizan conjugados tanto de proteína A como de proteína G como moléculas detectables de unión a Fc, la proporción de conjugado de proteína A y conjugado de proteína G puede ajustarse para optimizar la señal de detección basándose en la clase de inmunoglobulina a detectar, tal como se ha descrito anteriormente. Las proporciones adecuadas (p. ej. relaciones molares) de conjugado de proteína A a conjugado de proteína G incluyen, pero no se limitan a, 1:20, 1:19, 1:18, 1:17, 1:16, 1:15, 1:14, 1:13, 1:12, 1:11, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, t:S, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 12:1, 13:1, 14:1, 15:1, 16:1, 17:1, 18:1, 19:1 y 20:1. En algunas realizaciones, la relación entre el conjugado de proteína A y el conjugado de proteína G es de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 1:10, preferiblemente de aproximadamente 5:1 a aproximadamente 1:5, y más preferiblemente de aproximadamente 2:1 a aproximadamente 1:2. En una realización, la proporción entre el conjugado de proteína A y el conjugado de proteína G es de aproximadamente 1:1.

Los dispositivos para realizar ensayos de unión específicos, especialmente inmunoensayos, son conocidos y pueden adaptarse fácilmente para su uso en los presentes procedimientos. Los ensayos en fase sólida, en general, son más fáciles de realizar que los procedimientos de ensayo heterogéneos que requieren un paso de separación, como la precipitación, la centrifugación, la filtración, la cromatografía o el magnetismo, porque la separación de los reactivos es más rápida y sencilla. Los dispositivos de ensayo en fase sólida incluyen placas de microtitulación, dispositivos de ensayo de flujo (por ejemplo, dispositivos de inmunoensayo de flujo lateral), varillas y dispositivos de inmunoensayo inmunocapilar o inmunocromatográfico.

En la invención, el dispositivo es un inmunoensayo de flujo lateral. En ciertos aspectos, el dispositivo es una placa de microtitulación adecuada para un ensayo ELISA. En otros aspectos, el dispositivo es adecuado para su uso en un rotor analítico. En otros aspectos, el dispositivo comprende un sensor electroquímico, óptico u optoelectrónico.

En ciertos aspectos, se construye un dispositivo de flujo lateral utilizando una almohadilla de separación muestra/sangre, una membrana de nitrocelulosa y una mecha superior colocada en una carcasa (véase, por ejemplo, la Figura 2). La membrana de nitrocelulosa está rayada con una línea o región de prueba que comprende una entidad de captura, como un antígeno específico de anticuerpo no marcado (por ejemplo, un antígeno peptídico o un antígeno no peptídico), y opcionalmente una línea o región de control que contiene un anticuerpo reactivo a una molécula de unión a Fc (indicada más adelante). Una muestra sospechosa de contener un anticuerpo de interés puede mezclarse previamente con un conjugado detectable de molécula de unión a Fc y aplicarse después al dispositivo de ensayo de flujo lateral. O bien, en lugar de la mezcla previa, la muestra y la molécula de unión a Fc pueden aplicarse al mismo tiempo o secuencialmente al dispositivo de ensayo, en cualquier orden.

Alternativamente, la membrana de nitrocelulosa se prepara como se ha indicado anteriormente y se raya además con una línea o región de conjugado que comprende un conjugado-molécula de unión a Fc detectable, donde las regiones de conjugado y de prueba no se solapan. En algunos aspectos, una muestra sospechosa de contener un anticuerpo de interés puede aplicarse entonces al dispositivo de ensayo de flujo lateral. En otros aspectos, una muestra sospechosa de contener un anticuerpo de interés puede premezclarse con un antígeno-conjugado detectable, que se une específicamente al anticuerpo (normalmente con la misma especificidad de unión que la entidad de captura), y aplicarse después al dispositivo de ensayo de flujo lateral. Al igual que en el caso anterior, en lugar de mezclar previamente, la muestra y el antígeno detectable-conjugado pueden aplicarse al mismo tiempo o secuencialmente al dispositivo de ensayo, en cualquier orden

En algunos aspectos, se construye un dispositivo de flujo lateral utilizando una almohadilla de separación muestra/sangre, una membrana de nitrocelulosa y una mecha superior colocada en un alojamiento (véase, por ejemplo , la Figura 2). La membrana de nitrocelulosa está rayada con una línea o región de prueba que comprende una entidad de captura, como un antígeno específico de anticuerpo no marcado (por ejemplo, un antígeno peptídico o un antígeno no peptídico), opcionalmente una línea o región de control que contiene un anticuerpo que es reactivo a una molécula de unión a Fc (indicada más adelante), y una línea o región de conjugado que comprende un conjugado de antígeno detectable, que se une específicamente al anticuerpo (normalmente con la misma especificidad de unión que la entidad de captura). Las regiones conjugada y de prueba no suelen solaparse. Una muestra sospechosa de contener un anticuerpo de interés puede mezclarse previamente con un conjugado detectable de molécula de unión a Fc y aplicarse después al dispositivo de ensayo de flujo lateral. Además, en lugar de la mezcla previa, la muestra y la molécula de unión a Fc pueden aplicarse al mismo tiempo o secuencialmente al dispositivo de ensayo, en cualquier orden. En una realización ejemplar, los dispositivos de dos puertos también pueden utilizarse para la aplicación secuencial de una muestra de ensayo, un conjugado y un tampón de persecución.

En ciertos dispositivos de flujo lateral, la membrana de nitrocelulosa está rayada con una línea o región de prueba que comprende una entidad de captura, tal como un antígeno específico de anticuerpo no marcado (por ejemplo, un antígeno peptídico o un antígeno no peptídico), opcionalmente una línea o región de control que contiene un anticuerpo que es reactivo a una molécula de unión a Fc (indicada a continuación), y una línea o región de conjugado que comprende una molécula de unión a Fc detectable y un conjugado de antígeno detectable, que se une específicamente al anticuerpo (que típicamente tiene la misma especificidad de unión que la entidad de captura). Una muestra sospechosa de contener un anticuerpo de interés puede entonces aplicarse al dispositivo de ensayo de flujo lateral.

En un dispositivo ejemplar para la detección de anticuerpos específicos de Lyme, se construye un dispositivo de flujo lateral utilizando una almohadilla de separación muestra/sangre, una membrana de nitrocelulosa y una mecha superior colocada en un alojamiento (véase, por ejemplo, la Figura 2). La membrana de nitrocelulosa está rayada con una línea o región de prueba que comprende una mezcla de péptidos que imitan o simulan antígenosde Borrelia(véase, por ejemplo, Solicitud estadounidense n° 12/948.209) y una línea o región de control que comprende cualquier inmunoglobulina reactiva a la proteína A o a la proteína G (por ejemplo, IgG antiproteína A, IgG de ratón, humana u otra IgG reactiva a la proteína A, etc.). Una muestra sospechosa de contener anticuerpos deBorrelia burgdorferipuede mezclarse con conjugados de oro coloidal de la proteína A y/o G (proteína A/G-CGC), o ii) una mezcla de proteína A/G-CGC y conjugados de oro coloidal de los antígenosde Borrelia(antígeno deBorrelia-CGC). A continuación, esta mezcla de conjugado de muestra puede aplicarse al dispositivo de ensayo de flujo lateral.

Alternativamente, se construye un dispositivo de flujo lateral como el anterior, pero donde la almohadilla de nitrocelulosa está rayada con una o más regiones conjugadas, separadas de la región de prueba. Las regiones conjugadas pueden incluir, por ejemplo, (i) proteína A/G-CGC sola, (ii) antígeno deBorrelia-CGCsolo, o (iii) una combinación de proteína A/G-CGC y antígeno deBorrelia-CGC. Tal como se utiliza aquí o en cualquier otro lugar de esta solicitud, el antígeno deBorrelia, el antígeno deEhrlichiao cualquier antígeno o péptido antigénico incluye una mezcla de péptidos sintéticos que imitan o simulan el antígeno natural deBorrelia, el antígeno natural deEhrlichiao cualquier antígeno natural, respectivamente, En ciertos aspectos, por ejemplo en (i) o (iii), la muestra de ensayo se aplica por sí misma al dispositivo de flujo lateral sin ninguna mezcla previa. En otros aspectos, por ejemplo en (i), la muestra puede mezclarse previamente con el antígeno-CGC deBorreliay aplicarse después al dispositivo de flujo lateral. En algunos aspectos, por ejemplo en (ii), la muestra puede premezclarse con Proteína A/G-CGC y luego aplicarse al dispositivo de flujo lateral. Sin embargo, estas combinaciones ejemplares no son limitativas, y otras posibilidades serán evidentes para los expertos en la materia.

Los complejos de captura que comprenden la proteína A/G-CGC, el anticuerpo de la muestra y el antígeno opcional deBorrelia-CGCse forman durante el transporte a través de la almohadilla de separación muestra/sangre y la migración a través de la(s) línea(s) de conjugado opcional y la(s) línea(s) de prueba. Dependiendo de las circunstancias (por ejemplo, el uso opcional de antígeno deBorrelia-CGC), se forma un complejo o sándwich de antígeno deBorreliainmovilizado y no marcado, el anticuerpo y la Proteína A/G-CGC marcada. En presencia de antígeno deBorrelia-CGC, se forma un complejo o sándwich de antígeno deBorreliano marcado, el anticuerpo, antígeno deBorreliamarcado-CGC y proteína A/G-CGC marcada. La adición de proteína A/G-CGC a este último complejo amplifica aún más la señal del antígeno deBorrelia-CGCmarcado. En ciertas realizaciones, puede lograrse una mayor amplificación ajustando las proporciones de todos los reactantes, como se describe en el presente documento y se conoce en la técnica.

En un dispositivo ejemplar para la detección de anticuerpos específicos contra la Ehrlichiosis, se construye un dispositivo de flujo lateral utilizando una almohadilla de separación muestra/sangre, una membrana de nitrocelulosa y una mecha superior colocada en una carcasa. La membrana de nitrocelulosa está rayada con una línea o región de prueba que comprende un antígenode Ehrlichiay una línea o región de control que comprende cualquier inmunoglobulina reactiva a la proteína A o a la proteína G (por ejemplo, IgG antiproteína A). Una muestra sospechosa de contener anticuerpos deEhrlichia(por ejemplo,E. cams, E. chaffeensis, E. ewingii,)puede mezclarse con conjugados de oro coloidal de proteína A y/o G (proteína A/G-CGC), o (ii) una mezcla de proteína A/G-CGC y conjugados de oro coloidal del antígenode Ehrlichia(antígeno deEhrlichia-CGC).A continuación, esta mezcla de conjugado de muestra puede aplicarse al dispositivo de ensayo de flujo lateral.

Alternativamente, se construye un dispositivo de flujo lateral como el anterior, pero donde la almohadilla de nitrocelulosa está rayada con una o más regiones conjugadas, separadas de la región de prueba. Las regiones conjugadas pueden incluir, por ejemplo, (i) proteína A/G-CGC sola, (ii) antígeno deEhrlichia-CGCsolo, o (iii) una combinación de proteína A/G-CGC y antígeno deEhrlichia-CGC.En ciertas realizaciones, por ejemplo en (i) o (iii), la muestra de ensayo se aplica por sí misma al dispositivo de flujo lateral sin ninguna mezcla previa. En otros aspectos, por ejemplo en (i), la muestra puede mezclarse previamente con el antígenode Ehrlichia-CGCy aplicarse después al dispositivo de flujo lateral. En algunos aspectos, por ejemplo en (ii), la muestra puede premezclarse con Proteína A/G-CGC y luego aplicarse al dispositivo de flujo lateral. Sin embargo, estas combinaciones ejemplares no son limitativas, y otras posibilidades serán evidentes para los expertos en la materia.

Los complejos de captura que comprenden la proteína AIG-CGC, el anticuerpo de la muestra y el antígeno opcional deEhrlichia-CGCse forman durante el transporte a través de la almohadilla de separación muestra/sangre y la migración a través de la(s) línea(s) de conjugado opcional y la(s) línea(s) de prueba. Dependiendo de las circunstancias (por ejemplo, el uso opcional de antígeno deEhrlichia-CGC), se forma un complejo o sándwich de antígeno deEhrlichiainmovilizado y no marcado, el anticuerpo y la Proteína A/G-CGC marcada. En presencia del antígeno deEhrlichia-CGC, se forma un complejo o sándwich de antígeno deEhrlichiano marcado, el anticuerpo, antígeno deEhrlichiamarcado-CGC y proteína A/G-CGC marcada. La adición de proteína A/G-CGC a este último complejo amplifica aún más la señal del antígeno deEhrlichia-CGCmarcado. En ciertas realizaciones, puede lograrse una mayor amplificación ajustando las proporciones de todos los reactantes, como se describe en el presente documento y se conoce en la técnica.

En un ejemplo de una placa de microtitulación adecuada para un ELISA, una entidad de captura se inmoviliza en una superficie, tal como una placa ELISA de noventa y seis pocillos o una fase sólida equivalente que se recubre con estreptavidina o un compuesto de unión a biotina equivalente, tal como avidina o neutravidina, a una concentración óptima en un tampón de recubrimiento alcalino y se incuba a 4° C durante la noche. Tras un número adecuado de lavados con tampones de lavado estándar, se aplica a cada pocillo una concentración óptima de formas biotiniladas de una molécula de unión a Fc y, opcionalmente, el mismo antígeno utilizado como entidad de captura disuelto en un tampón de bloqueo convencional. A continuación, se añade una muestra y se procede al ensayo tal y como se describe en el presente documento y se conoce en la técnica.

En otro aspecto, la presente divulgación proporciona composiciones relacionadas con la detección de un anticuerpo en una muestra (no reivindicada). Ciertos aspectos se refieren a uno o más complejos de captura que comprenden una entidad de captura, un anticuerpo en una muestra de ensayo y un primer detector, en el que la entidad de captura se une al anticuerpo y en el que el primer detector comprende una molécula de unión a Fc conjugada con una primera entidad detectable y se une a la región Fc del anticuerpo. Ciertos aspectos comprenden además un segundo detector, en el que el segundo detector se une específicamente a la región variable del anticuerpo. En algunos aspectos, el complejo de captura se inmoviliza en una región de prueba de una superficie, como un soporte sólido o semisólido. Por ejemplo, en ciertos aspectos, el soporte sólido es una perla (por ejemplo, una partícula coloidal o una nanopartícula), una vía de flujo en un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral, una vía de flujo en un rotor analítico, o un tubo o un pocillo (por ejemplo, en una placa). Véase la Figura 1 para una ilustración de estas y otras realizaciones relacionadas, incluyendo el conjugado opcional del segundo detector y la superficie de prueba opcional.

En realizaciones particulares, el complejo comprende un anticuerpo de interés (por ejemplo, un anticuerpo antimicrobiano, como un anticuerpo antivírico, antibacteriano, antifúngico o antiparasitario), un conjugado de proteína A y/o proteína G, un antígeno inmovilizado específico de anticuerpo y, opcionalmente, un conjugado de antígeno. En ciertas realizaciones, el conjugado de Proteína A y/o Proteína G comprende una nanopartícula de oro (por ejemplo, una Proteína A-CGC o Proteína G-CGC - "conjugado de oro coloidal"), y el conjugado de antígeno comprende una nanopartícula de oro (por ejemplo, un antígeno-CGC). En algunas realizaciones, el antígeno-conjugado o antígeno-CGC comprende un antígeno microbiano, como un antígeno viral, bacteriano, fúngico o parasitario, como se describe en el presente documento y se conoce en la técnica. En realizaciones específicas, el antígeno-conjugado o antígeno-CGC incluye un antígeno específico de la enfermedad de Lyme, como un antígenode Borrelia(véasesupra).En otras realizaciones, el antígeno-conjugado o antígeno-CGC incluye un antígeno específico de la enfermedad de Ehrlichiosis, como un antígeno deEhrlichia.

Kits

En otro aspecto, la invención proporciona kits tal como se definen en las reivindicaciones adjuntas. En ciertas realizaciones, los kits comprenden un dispositivo de la invención, tal como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, los kits comprenden dos, tres, cuatro o más dispositivos de la invención.

Los reactivos para determinados tipos de ensayos también pueden suministrarse en kits. Así, los kits pueden incluir una población de nanopartículas, microesferas (por ejemplo, adecuadas para un ensayo de aglutinación o un ensayo de flujo lateral), o una placa (por ejemplo, una placa adecuada para un ensayo ELISA). En otros aspectos, los kits comprenden un dispositivo, como un dispositivo de inmunoensayo de flujo lateral, un rotor analítico o un sensor electroquímico, óptico u optoelectrónico. La población de nanopartículas, las microesferas, la placa y los dispositivos son útiles para realizar un inmunoensayo. Por ejemplo, pueden ser útiles para detectar la formación de un complejo anticuerpo-péptido que comprenda un anticuerpo de una muestra, un péptido antigénico (marcado y/o no marcado) y una molécula de unión a Fc.

En ciertas realizaciones, un antígeno (o una mezcla de diferentes antígenos) se conjuga con una entidad detectable tal como una nanopartícula de oro, ese mismo antígeno (o mezcla de antígenos) también se une o inmoviliza en una placa, una superficie de prueba de nitrocelulosa u otra superficie o dispositivo de prueba, y una molécula de unión a Fc se conjuga con una entidad detectable tal como una nanopartícula de oro. En kits específicos, un péptido antigénico se conjuga con una nanopartícula de oro y opcionalmente se conjuga con BSA, ese mismo antígeno (sin la partícula de oro pero opcionalmente conjugado con BSA) se inmoviliza en una región o tira de ensayo definida de una superficie de nitrocelulosa, y la proteína A y/o la proteína G se conjugan con una nanopartícula de oro, opcionalmente como parte de un kit que contiene un dispositivo de ensayo de flujo lateral. En algunas realizaciones, el conjugado Proteína A y/o Proteína G-partícula de oro se inmoviliza en una región separada de la superficie de nitrocelulosa, esdecir,una región de conjugado, que no se solapa con la región de prueba.

Además, los kits pueden incluir varios diluyentes y tampones, conjugados marcados u otros agentes para la detección de antígenos o anticuerpos específicamente unidos, y otros reactivos generadores de señales, como sustratos enzimáticos, cofactores y cromógenos. Un experto en la materia puede determinar fácilmente otros componentes del kit. Dichos componentes pueden incluir reactivos de recubrimiento, anticuerpos de captura policlonales o monoclonales específicos para una molécula de unión a Fc como la proteína A y/o la proteína G, o un cóctel de dos o más de los anticuerpos, extractos purificados o semipurificados de antígenos o anticuerpos como patrones, anticuerpos detectores de anticuerpos monoclonales, un anticuerpo anti-ratón, antiperro, antipollo o antihumano con molécula indicadora conjugada al mismo, tablas indicadoras para comparaciones colorimétricas, guantes desechables, instrucciones de descontaminación, bastoncillos o recipientes aplicadores, un vaso preparador de muestras, etc. En una realización, un kit comprende tampones u otros reactivos apropiados para constituir un medio de reacción que permita la formación de un complejo péptido-anticuerpo.

Dichos kits proporcionan una forma conveniente y eficiente para que un laboratorio clínico diagnostique una infección por un agente microbiano, especialmente agentes microbianos patógenos, como se describe en otra parte del presente documento y se conoce en la técnica. Dichos kits también pueden proporcionar una forma cómoda y eficaz para que un laboratorio clínico diagnostique otras afecciones relacionadas con la presencia de cualquier anticuerpo de interés. Por ejemplo, algunos trastornos autoinmunitarios pueden asociarse a determinados tipos de anticuerpos. Así, en la medida en que se conozcan las combinaciones anticuerpo/antígeno relacionadas con la enfermedad, la presente invención puede proporcionar diagnósticos sensibles y precisos de dichas enfermedades. Los kits específicos permiten detectarBorrelia,comoB. burgdorferi,y ayudan así a diagnosticar la enfermedad de Lyme.

En ciertas realizaciones, los kits comprenden además una instrucción. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, los kits comprenden una instrucción que indica cómo utilizar el kit para detectar un anticuerpo, como un anticuerpo frente a un antígeno microbiano (por ejemplo, antígeno deBorrelia, antígeno deEhrlichia), o para diagnosticar una enfermedad, como una enfermedad relacionada con un microbio (por ejemplo, enfermedad de Lyme, Ehrlichiosis). En ciertas realizaciones, los kits comprenden una instrucción que indica cómo utilizar una población de microesferas, una placa o un dispositivo (por ejemplo, un dispositivo de flujo lateral) para detectar un anticuerpo frente a un antígeno microbiano como un antígeno deBorreliaoEhrlichia,o para diagnosticar una enfermedad relacionada con microbios como la enfermedad de Lyme (Borreliosis) o la Ehrlichiosis. En ciertas realizaciones, los kits proporcionan instrucciones para combinar la molécula de unión a Fc detectable, el anticuerpo específico, el conjugado de antígeno detectable o el conjugado de péptido antigénico, y la muestra problema en cualquier orden antes de la aplicación a la región de carga de muestras del sistema de detección (por ejemplo, un dispositivo de ensayo de flujo lateral, una placa de microtitulación, un rotor analítico). En algunas realizaciones, los kits incluyen instrucciones para combinar el conjugado de antígeno detectable o el conjugado de péptido antigénico con la muestra de ensayo, de manera que el conjugado de antígeno detectable o el conjugado de péptido antigénico estén presentes en una proporción particular con la molécula de unión a Fc detectable para lograr un nivel deseado de amplificación de la señal. Los kits también pueden proporcionar instrucciones para la optimización de los tampones, la optimización de las proporciones de los diversos componentes (por ejemplo, molécula de unión a Fc, antígeno o péptido antigénico, muestra de ensayo), y la optimización del orden de la mezcla y los pasos de aplicación (por ejemplo, mezclar todos los componentes antes de la aplicación, mezclar sólo ciertos componentes y aplicar otros por separado).

Los péptidos, composiciones y dispositivos que comprenden los péptidos, kits y procedimientos de la divulgación ofrecen una serie de ventajas. Por ejemplo, permiten la detección sencilla, barata, rápida, sensible y precisa de anticuerpos de interés, y el diagnóstico de afecciones relacionadas, sin señales falsas positivas o de fondo significativas. Esto permite un diagnóstico preciso y sensible, incluso de muestras que contienen niveles muy bajos, e incluso indetectables de otro modo, de anticuerpos.

Ejemplos

Ejemplo 1: La proteína A mejora la detección específica de anticuerpos en un ensayo de flujo lateral específico para la enfermedad de Lyme

Se realizaron pruebas para determinar el impacto de añadir Proteína A-CGC (conjugado de oro coloidal) a un ensayo de flujo lateral específico para la enfermedad de Lyme, mientras se analizaba una muestra negativa, una muestra Lyme-positiva y una muestra Lyme-positiva de bajo nivel. El propósito era observar y clasificar el efecto de la proteína A-CGC sobre las posibles señales falsas, manteniendo al mismo tiempo una sensibilidad adecuada del ensayo. Se probaron varias concentraciones de proteína A-CGC en relación con un control negativo de proteína A-CGC. El ensayo de flujo lateral realizado en esta prueba es similar al ilustrado en las figuras 2 y 3. Los resultados se muestran en la tabla 1, indicados por la puntuación de reactividad (escala de 0 a 5, en la que un número más alto indica un resultado positivo).

Tabla 1: Resumen de los resultados de las pruebas (puntuación de reactividad)

Como se muestra en la Tabla 1, la adición de Proteína A-CGC amplificó la señal de todas las muestras Lyme-positivas probadas, y especialmente permitió la detección de las muestras "poco" positivas. Sin Proteína A-CGC, las muestras poco positivas fueron indetectables, mostrando una puntuación de Reactividad comparable a la de las muestras negativas (-0,25 o menos). Por el contrario, la adición de Proteína A-CGC a concentración 1X y dilución 1:2 amplificó significativamente la señal, mostrando una puntuación de Reactividad de aproximadamente 3,5. De este modo, la proteína A-CGC mejora significativamente la detección de anticuerpos diana en este ensayo de flujo lateral específico para la enfermedad de Lyme.

Ejemplo 2: La proteína A mejora la detección específica de anticuerpos en un ensayo de flujo lateral realizado con una muestra biológica sometida a estrés

Se realizaron pruebas para determinar el impacto de añadir Proteína A-CGC (conjugado de oro coloidal) a una mezcla de conjugado 48BSA (albúmina de suero bovino)/DAG IgG previamente estresada. La mezcla conjugada se sometió a estrés previo durante 15 días en una incubadora a 35°C. En este experimento se analizaron muestras estresadas y no estresadas en presencia o ausencia de proteína A-CGC. El ensayo de flujo lateral realizado en esta prueba es similar al ilustrado en las figuras 2 y 3. Los resultados se muestran en la tabla 1, indicados por la puntuación de reactividad (escala de 0 a 5, en la que un número más alto indica un resultado positivo). Los resultados figuran en la tabla 2.

Tabla 2: Resumen de los resultados de las pruebas con muestras sometidas a tensión y no sometidas a tensión

Como se muestra en la Tabla 2 anterior, la adición de Proteína A-CGC a la mezcla de ensayo de flujo lateral amplificó la señal de la muestra biológica estresada del día 15 (35°C) en relación con la ausencia de Proteína A-CGC, como se muestra por un aumento en la puntuación de Reactividad de 0,75 a 1,75. La muestra no estresada del día 15 (2-8°C) también se vio ligeramente afectada por la adición de Proteína A-CGC, como muestra el aumento de la puntuación de Reactividad de 2,25 a 2,75. Además, las muestras negativas no se alteraron por la adición de Proteína A-CGC.

Claims (19)

REIVINDICACIONES

1. Un dispositivo de detección de anticuerpos que comprende:

una región de carga de muestras;

una región conjugada, en el que dicha región conjugada comprende (i) un primer detector móvil que incluye una molécula de unión a Fc capaz de unirse a la región Fc del anticuerpo, en el que la molécula de unión a Fc está conjugada con una primera entidad detectable, y (ii) un segundo detector móvil, en el que el segundo detector comprende un antígeno o péptido antigénico conjugado con una segunda entidad detectable, siendo dicho antígeno o péptido antigénico capaz de unirse específicamente a la región variable del anticuerpo; y una región de prueba, en el que dicha región de prueba comprende una entidad de captura inmovilizada capaz de unirse específicamente al anticuerpo;

en el que la región de carga de muestras, la región conjugada y la región de prueba están configuradas para que, en funcionamiento, una muestra líquida cargada en la región de carga de muestras esté en comunicación fluida con la región conjugada y la región de prueba.

2. El dispositivo de detección de la reivindicación 1, en el que dicho dispositivo comprende además una región de control en comunicación fluida con una muestra líquida cuando se carga en la región de carga de muestras, en el que dicha región de control comprende un compañero de unión inmovilizado capaz de unirse específicamente a un detector de control.

3. El dispositivo de detección de la reivindicación 2, en el que dicho primer detector comprende proteína A o proteína G conjugada con una primera entidad detectable y dicho compañero de unión inmovilizado es un anticuerpo antiproteína A o antiproteína G.

4. El dispositivo de detección de la reivindicación 1, que comprende además una almohadilla absorbente situada aguas abajo de la región de prueba.

5. El dispositivo de detección de la reivindicación 1, en el que dicha región conjugada se coloca aguas arriba o aguas abajo de dicha región de carga de muestras.

6. El dispositivo de detección de la reivindicación 1, en el que dicha región de carga de muestras comprende un material separador de sangre.

7. El dispositivo de detección de la reivindicación 1, en el que la primera y la segunda entidades detectables son iguales o diferentes.

8. El dispositivo de detección de la reivindicación 1, en el que la primera y la segunda entidades detectables son nanopartículas de oro.

9. El dispositivo de detección de la reivindicación 1, en el que el primer detector y el segundo detector están presentes en una proporción de 20:1 a 1:1.

10. El dispositivo de detección de la reivindicación 1, en el que la molécula de unión a Fc es la proteína A y/o la proteína G.

11. El dispositivo de detección de la reivindicación 1, en el que la entidad de captura es un antígeno o péptido antigénico.

12. El dispositivo de detección de la reivindicación 1, en el que el antígeno o péptido antigénico es un antígeno deBorreliao un antígeno deEhrlichia.

13. El dispositivo de detección de la reivindicación 1, en el que el antígeno o péptido antigénico del segundo detector es de un organismo seleccionado del grupo que consiste en gusano del corazón,Ehrlichia canis, Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii, Borrelia garinii, Anaplasma phagocytophilum,virus de la leucemia felina, parvovirus, cepa de la gripe A, cepa de la gripe B, virus de la gripe aviar, virus respiratorio sincitial,Legionella,adenovirus, rotavirus, virus de la inmunodeficiencia felina, virus de la inmunodeficiencia humana yStreptococcusdel grupo A .

14. El dispositivo de detección de la reivindicación 1, en el que el primer detector móvil comprende proteína A y proteína G cada una conjugada con la primera entidad detectable.

15. El dispositivo de detección de la reivindicación 1, en el que la primera entidad detectable es una nanopartícula metálica, una nanocáscara metálica, un fluoróforo o una partícula de látex coloreada

16. El dispositivo de detección de la reivindicación 15, en el que la nanopartícula metálica o la nanocáscara metálica se selecciona del grupo que consiste en partículas de oro, partículas de plata, partículas de cobre, partículas de platino, partículas de cadmio, partículas compuestas, esferas huecas de oro, nanocáscaras de sílice recubiertas de oro y cáscaras de oro recubiertas de sílice.

17. Un kit que comprende el dispositivo de detección de una cualquiera de las reivindicaciones 1-16.

18. El dispositivo de detección de la reivindicación 11, en el que el antígeno o péptido antigénico es un antígeno deBorreliao un antígeno deEhrlichia.

19.El dispositivo de detección de la reivindicación 11, en el que el antígeno o péptido antigénico de la entidad de captura es de un organismo seleccionado del grupo que consiste en gusano del corazón,Ehrlichia canis, Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii, Borrelia garinii, Anaplasma phagocytophilum,virus de la leucemia felina, parvovirus, cepa de la gripe A, cepa de la gripe B, virus de la gripe aviar, virus respiratorio sincitial,Legionella,adenovirus, rotavirus, virus de la inmunodeficiencia felina, virus de la inmunodeficiencia humana yStreptococcusdel grupo A .