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ES2966196T3 - Sonda APN - Google Patents

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ES2966196T3
ES2966196T3 ES17745280T ES17745280T ES2966196T3 ES 2966196 T3 ES2966196 T3 ES 2966196T3 ES 17745280 T ES17745280 T ES 17745280T ES 17745280 T ES17745280 T ES 17745280T ES 2966196 T3 ES2966196 T3 ES 2966196T3
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ES
Spain
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apn
group
oligomer
chemical group
charge
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ES17745280T
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Hugh Alexander Ilyine
Juan J Diaz-Mochon
Salvatore Pernagallo
Mavys Tabraue Chavez
Mario Antonio Fara
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Destina Genomica SL
Original Assignee
Destina Genomica SL
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Abstract

En el presente documento se describen monómeros, nucleobases, oligómeros y sondas mejorados basados en PNA para su uso en una variedad de métodos diferentes de análisis de ácidos nucleicos. Además, la divulgación proporciona métodos para preparar las moléculas de PNA modificadas y mejoradas, así como métodos para usar las mismas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Sonda APN
Campo de la invención
La presente invención se refiere a compuestos de ácido nucleico peptídico. En particular, aunque no exclusivamente, la presente invención se refiere a monómeros, dímeros y/u oligómeros de ácido nucleico peptídico, modificados para incorporar un grupo químico, como por ejemplo un grupo químico cargado, en una ubicación deseada, por ejemplo, en el esqueleto del mismo.
Antecedentes de la invención
La secuenciación del ADN es un procedimiento conocido que ha sido objeto de numerosas investigaciones. Se han descrito varios métodos de secuenciación del ADN, incluido el enfoque químico de Maxam y Gilbert (A.M. Maxam and W. Gilbert, PNAS, 1977, 74, 560-564) y los métodos basados en enzimas de Sanger (F. Sanger et al.., PNAS, 1976, 5463-5467).
Se ha informado de una serie de enfoques más recientes, que se dividen en tres categorías: (i). Secuenciación por adición repetitiva de una sola base, (ii) Pirosecuenciación y (iii) Escisión mediada por enzimas de restricción o ligadura quinasa con deconvolución/decodificación.
Ejemplos de tales métodos se divulgan en publicación de la solicitud PCT No. WO 2009/037473 (Bradley et al.). Los ácidos nucleicos peptídicos (APN) son compuestos sintéticos que se han utilizado en diversas aplicaciones, entre ellas como sondas genéticas (véase la revisión de P. Paulosova y F. Pellestor, Ann. Genetique, 2004, 47, 349-358). El ácido nucleico peptídico (APN) es similar a los ácidos nucleicos naturales: el ácido desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN). Sin embargo, mientras que el ADN y el ARN poseen un esqueleto de azúcar desoxirribosa o ribosa respectivamente, al esqueleto del APN comprende unidades repetidas de N-(2-aminoetil)-glicina que están unidas por enlaces peptídicos. Las diversas bases de pirimidina y/o purina (o nucleobases) del APN se unen a al esqueleto peptídico mediante la formación de enlaces amida. Un experto en la materia entenderá que una única nucleobase unida mediante un enlace amida a una única unidad de N-(2-aminoetil)-glicina puede describirse como un monómero de APN, pero otros APN pueden comprender, por ejemplo, los que contienen esqueletos de aminoetilglicina modificados, como, por ejemplo, los basados en pirrolidina ( R. J. Worthington et al. Org. Biomol. Chem., 2007, 5, 249 259) y los imitadores de ADN basados en indol (Fórmula 9). Los expertos en la materia reconocerán otros oligómeros adecuados.
En Hyunjung Jang et al., Journal of Clinical Microbiology, 2010, Vol. 48, No. 9, 3127-3131 se expone un ejemplo del uso de una matriz de APN para la detección de mutaciones puntuales en el virus de la hepatitis B resistente a los antivíricos.
En Huanhuan Shi et al., Biosensors and Bioelectronics, 2015, 66, 481-489 se analiza la fabricación, la detección y las aplicaciones de las micromatrices de ácidos nucleicos peptídicos (APN).
La publicación de solicitud PCT n° WO 2009/037473 (Bradley et al.) divulga nucleobases modificadas, y monómeros y dímeros y oligómeros de APN modificados, así como su uso en métodos de análisis genético como la secuenciación de ácidos nucleicos y la caracterización de polimorfismos de nucleótido único (SNP). Los SNP representan una forma de variación en un genoma en la que un nucleótido concreto del genoma varía entre los miembros de una población. A modo de ejemplo, un SNP puede presentar dos alelos (es decir, uno de los dos nucleótidos posibles en un locus concreto) y, en tales casos, algunos de los individuos de una población pueden ser portadores de un alelo SNP en un locus concreto, mientras que otros pueden ser portadores del otro alelo en el mismo locus.
El documento WO 2009/037473 (Bradley et al.) divulga un oligómero de ácido APN donde al menos una de las aminas secundarias del esqueleto peptídico no está conjugada con una nucleobasey se mantiene no acoplada. Tal disposición de la unidad de APN "en blanco" o "abásica" facilita la mejoría en la caracterización de una nucleobase dentro de una secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el procedimiento puede comprender la interacción de un ácido nucleico con el oligómero de APN modificado, apto para hibridarse con una parte del ácido nucleico y que omite una nucleobase complementaria a una nucleobase del ácido nucleico, generando un dúplex ácido nucleico/APN; y la interacción de este dúplex con bases modificadas conteniendo una etiqueta detectable. La nucleobase modificada, complementaria a la nucleobase del ácido nucleico, se integra en el dúplex ácido nucleico/APN y puede identificarse a través de la etiqueta detectable.
No obstante, se ha notado que la presencia de una o varias unidades "en blanco" o "abásicas" en una sonda de oligómero de APN puede provocar complicaciones inesperadas. Por ejemplo, al adherirse la sonda a la superficie de un soporte sólido, como un material de soporte de resina, se observó que el vacío generado por la falta de una nucleobase en la posición "en blanco" podría ocasionar que la sonda se flexione, curve o altere de otra forma su configuración lineal "habitual". Esto puede acarrear varios problemas:
Primero, se encontró que tales sondas tienden a asociarse no solo con nucleobases complementarias a la nucleobase del ácido nucleico que se desea caracterizar, sino también con nucleobases no complementarias. Este fenómeno puede describirse como especificidad reducida.
Segundo, se halló que la eficiencia o rendimiento en la detección de sondas asociadas con nucleobases complementarias a la nucleobase del ácido nucleico en análisis, por ejemplo, mediante la detección de una etiqueta detectable asociada a la nucleobase modificada en la posición "en blanco" de la sonda de APN, puede variar y/o verse afectada y/o disminuir. Este fenómeno puede describirse como sensibilidad reducida.
Sugiyama et al., Molecules, 2013, 18, 287-310, "Chiral Peptide Nucleic Acids with a Substituent in the N-(2-Aminoethy)glycine Backbone" (Ácidos nucleicos peptídicos quirales con un sustituyente en el esqueleto de N-(2-aminoeti)glicina) abordan los APN quirales, y describen APN elaborados a partir de monómeros de APN modificados en posición gamma.
La finalidad de la presente invención es superar o atenuar al menos uno de los inconvenientes previamente señalados asociados con el estado de la técnica.
Resumen de la invención
La presente invención se fundamenta en el hallazgo de que los APN modificados para incorporar un grupo con carga o un grupo capaz de adquirir carga a un pH predeterminado pueden emplearse para generar moléculas de APN que se hibridan de manera más eficiente con las cadenas complementarias de ácido nucleico, en comparación con las moléculas de APN sintetizadas usando monómeros de APN no modificados de esta forma.
Las modificaciones propuestas en este documento pueden implementarse en cualquier variedad de molécula basada en APN, incluidos, por ejemplo, monómeros, dímeros, oligómeros y sondas de APN (para facilitar la referencia, estas moléculas de APN se nombrarán en adelante colectivamente como "moléculas de APN").
Un experto reconocerá que las moléculas de APN poseen múltiples aplicaciones y pueden, en ciertos procedimientos, fijarse en sustratos sólidos; bajo estas condiciones, se ha identificado que las moléculas de APN convencionales muestran, en su uso, una propensión a deformarse, flexionarse y/o curvarse de manera no deseada. Estas deformaciones, flexiones y/o curvaturas no deseadas pueden influir negativamente en el desempeño (por ejemplo, en la especificidad y/o sensibilidad) de la molécula de APN en un análisis, obstruyendo la unión óptima con su diana y otros aspectos similares.
Los inventores han determinado que al modificar los monómeros de APN para comprender un grupo con carga o un grupo capaz de adquirir carga a un pH predeterminado, se puede potenciar la estabilidad de las moléculas de APN de tal manera que, por ejemplo, en su uso, la molécula de APN mantenga con mayor facilidad su estructura, exhibiendo menos (o ninguna significativa) deformación, flexión y/o curvatura - especialmente cuando se fija a una superficie o sustrato; Las moléculas de APN sintetizadas a partir de cualquiera de los APN modificados descritos en este documento también pueden demostrar un rendimiento superior en pruebas que incluyen análisis genéticos y ensayos de caracterización de nucleobases. De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un monómero de APN conforme a las reivindicaciones adjuntas.
El monómero de APN tiene la fórmula general:
donde:
G constituye un grupo químico cargado, o un grupo químico capaz de adquirir una carga a un pH predeterminado; P1 se define como un grupo de protección P;
P3 equivale a hidrógeno, o representa un grupo protector P.
A lo largo de la presente especificación, el término "que comprende" se emplea para denotar que aspectos y realizaciones de esta invención "comprenden" una o más características específicas. El término "que comprende" también incluye aspectos y/o realizaciones que "consisten esencialmente en" o "consisten en" la o las características mencionadas.
De manera ventajosa, la integración de un grupo químico cargado, o un grupo químico capaz de adquirir una carga a un pH predeterminado, en la posición gamma del monómero de APN, facilita la síntesis de una molécula de APN, tal como un oligómero de APN, que presenta una configuración más estable, especialmente cuando dicha sonda se fija a la superficie de un soporte sólido. Este oligómero de APN, por ejemplo, una sonda de APN, demuestra menor tendencia a flexionarse, doblarse o alterarse de su configuración lineal "habitual". En particular, cuando la sonda se emplea en técnicas de análisis genético, como los métodos para secuenciar ácidos nucleicos y caracterizar polimorfismos de nucleótido único (SNP), las modificaciones propuestas en este documento pueden resultar en sondas con especificidad y/o sensibilidad incrementadas hacia una base complementaria de la nucleobase del ácido nucleico objetivo.
Sin estar limitado por la teoría, se postula que la inclusión de un grupo químico cargado, o un grupo químico capaz de adquirir carga en un pH preestablecido, en la posición gamma del monómero de APN, introduce un centro quiral en el monómero.
P3 representa un grupo protector P o puede ser hidrógeno. Un grupo protector ("P") se define como un grupo que puede modificar adicionalmente el grupo al que está unido P.
En ciertas realizaciones, el grupo protector P puede elegirse de un conjunto que consta de acetilo, W-[1-(4,4-dimetil-2,6-dioxociclohex-1-ilideno)etilo] (Dde), fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), grupos nitrilo, disulfuro (Ardec (arilditioetoxicarbonilo)) grupo protector de la luz de escisión (a base de nitroveratilo), butiloxicarbonilo (Boc), benciloxicarbonilo (Cbz), trifluoroacetilo (Tfa), ftalimida, bencilo, aliloxicarbonilo (Alloc), toluensulfonilo (Ts), metoximetiléter (MOM), tetrahidropiraniléter (THP), éter alílico, éter butílico, acetal de bencilideno (Green, Wiley-Interscience, Nueva York, 1999 ).
Un especialista en la materia reconocerá que el término "nucleobases" ("NB": también conocido como "nucleótidos" o "bases") abarca tanto purinas como pirimidinas. La designación "nucleobase" puede comprender, por ejemplo, bases específicas como adenina, guanina, timina, citosina y uracilo, además de variantes tales como xantina, hipoxantina, isoguanina, ácido úrico y el conjunto de nucleobases colectivamente denominadas "bases sintéticas".
Cuando, en el compuesto de Fórmula (I), P3 constituye un grupo protector P o es hidrógeno, la amina secundaria del monómero peptídico no se modifica para incorporar una nucleobase NB. En otras palabras, la amina secundaria de la estructura del APN no se modifica para comprender una nucleobase y permanece "desacoplada". En tales escenarios, el monómero de APN puede considerarse como un monómero de APN "en blanco" o "abásico" (el término "en blanco" alude a la amina secundaria no modificada). La inclusión de tal monómero de APN "en blanco" o "abásico" puede ser especialmente ventajosa en métodos que facilitan la caracterización de una nucleobase en una secuencia de ácido nucleico, como se describe en WO 2009/037473 (Bradley et al.). Comúnmente, en estos casos, P3 podría ser un grupo protector P. Esta disposición puede prevenir y/o evitar reacciones químicas indeseadas de la amina secundaria del monómero pseudopeptídico.
Los monómeros de APN en blanco o abásicos descritos aquí pueden usarse para fabricar sondas de APN. Una sonda de APN puede adoptar la forma de un oligómero de APN que incluya varios monómeros de APN, contando al menos con un monómero de APN que sea un monómero en blanco o abásico. Dicho oligómero de APN (sonda) puede ser capaz de hibridarse con una secuencia específica de ácido nucleico y, a pesar de comprender un monómero de APN en blanco o abásico, no posee una base complementaria a la de un nucleótido a caracterizar.
Como se menciona en WO2009/037473, se describen métodos detallados que podrían utilizar sondas de APN (oligómeros) del tipo descrito aquí, y la presente invención ofrece moléculas de APN modificadas para su aplicación en dichos métodos. Estas moléculas modificadas muestran una estabilidad aumentada o mejorada en, por ejemplo, técnicas de análisis genético que incluyen métodos de caracterización de nucleobase/SNP, como se detalla en WO2009/037473.
Las moléculas de APN mencionadas pueden emplearse en combinación con una o más "bases modificadas". El término "base modificada" puede referirse a bases/nucleobases que incluyen una cadena alquílica con grupos funcionales aptos para reacciones covalentes reversibles. Idealmente, el heterociclo de las bases puede modificarse para incorporar la cadena alquílica y los grupos funcionales. Más específicamente, un heteroátomo o átomo de carbono del heterociclo puede ser modificado para comprender la cadena alquílica y los grupos funcionales. En WO2009/037473 se ejemplifican bases modificadas.
En el marco de las "bases modificadas", se entiende que los grupos funcionales aptos para "reacciones covalentes reversibles" pueden ser, por ejemplo, grupos que contienen aldehídos y/o cetonas y, en una realización, las reacciones covalentes reversibles pueden implicar interacciones entre los grupos aldehído/cetona de la base modificada y aminas, hidrazidas e hidrazidas (A. Dirksen, et al., J. Am. Chem. Soc., 2006, 128, 15602-15603), alcoxiaminas (V.A. Polyakov et al., J. Phys. Org. Chem. 1999, 12, 357-363) o alcoholes, dioles y/o ácidos borónicos (O. Abed et al. Chem. Mater., 2006, 18, 1247-1260). En una realización, el grupo capaz de una reacción covalente reversible no es un alcohol.
El término "etiqueta detectable" puede aludir a etiquetas que son, por ejemplo, distinguibles ópticamente o por otros medios. Aunque muchos de estos marcadores o etiquetas son conocidos por especialistas, a modo de ejemplo, los marcadores adecuados pueden comprender, por ejemplo, compuestos fluorescentes o marcadores de masa. Más concretamente, y en una realización, las bases/nucleobases modificadas de la presente invención pueden contener una o más etiquetas detectables (como un fluoróforo) seleccionadas de un conjunto de etiquetas con tintes ópticamente detectables que abarcan, por ejemplo, desde el espectro azul hasta el rojo lejano. Ejemplos de marcadores adecuados incluyen dansilo, fluoresceína, rodamina, rojo texas, IAEDANS, tintes de cianina (Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7), tintes Bodipy (Invitrogen), tintes SETA como SETA 425 (Seta Biomedicals) y/o tintes Alexa Fluor (Invitrogen).
Entre los "marcadores de masa" adecuados se pueden contar elementos como marcadores que incluyen elementos bromados u otros compuestos, moléculas o elementos que faciliten un patrón isotópico claro en técnicas de espectrometría de masas, como MALDI-TOF. Cuando la base modificada sea una base de uracilo modificada, la etiqueta de masa puede no ser bromo.
Por tanto, un experto en la materia reconocerá que cualquiera de las nucleobases modificadas aquí descritas puede detectarse mediante, porejemplo, microscopía fluorescente o técnicas de espectrometría de masas como MALDI-TOF o similares.
Ventajosamente, el heterociclo de cada una de las bases/nucleobases modificadas aquí descritas puede comprender una etiqueta detectable unida, por ejemplo, en cualquier número de posiciones a través de un heteroátomo o un átomo de carbono. En una realización, el heteroátomo puede modificarse para comprender además elementos espaciadores/espaciadores de carbono adecuados, como, por ejemplo, un alquino, alquenileno o alquinileno que puede ser sustituido independientemente con una o más de las etiquetas detectables mencionadas anteriormente. A modo de ilustración, el heteroátomo y/o heteroátomo modificado del heterociclo puede contener uno o más fluoróforo(s) (T.S. Seo et al., PNAS, 2004, 101, 5488-5493; Z. Li et al., PNAS, 2003, 100, 414-419; L. Thoresen et al., Chem. Eur. J. 2003, 9, 4603-4610) y/o etiquetas de masa, como bromuro, cloruro (C. Portal et al., J. Comb. Chem., 2005, 7, 554-560). En una realización, los heterociclos de purina y/o pirimidina pueden modificarse por medio de reacciones de acoplamiento cruzado usando catalizadores de paladio (L. Thoresen et al., Chem. Eur. J. 2003, 9, 4603 4610; N.K. Garg et al., Chem. Commun., 2005, 4551-4553).
De manera ventajosa, cada base o nucleobase modificada puede incorporar una etiqueta detectable única. Así, dicha etiqueta detectable permite, por ejemplo, diferenciar eficazmente entre una nucleobase de adenina modificada y otras nucleobases que han sido igualmente modificadas. Adicionalmente, se describe en este documento un monómero de APN caracterizado por tener la fórmula general:
donde:
G se define como un grupo químico cargado, o un grupo químico capaz de adquirir una carga a pH predeterminado; Pi es un grupo protector P, o es hidrógeno; y
P2 es un grupo protector P, o es hidrógeno, o un grupo seleccionado de un conjunto que incluye alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo o halógeno.
Por lo tanto, el monómero de APN de fórmula (Ib) puede describirse como un monómero "en blanco" o "abásico", que comprende un grupo protector Boc en lugar de una nucleobase.
En general, cualquiera de las posiciones N-terminal y/o C-terminal pueden derivatizarse para comprender un grupo protector (como se ha descrito anteriormente). Así pues, el monómero de APN puede estar protegido y/o presentar un grupo protector P en la posición N-terminal o C-terminal.
Si P1 es un grupo protector P, entonces P2 es hidrógeno, y viceversa.
Cuando G es un grupo químico cargado, G puede presentar una o más cargas negativas, y/o G puede presentar una o más cargas positivas.
En una realización, G puede presentar una carga negativa o una carga positiva.
G puede presentar uno o más uno o más grupos cargados negativamente seleccionados del grupo que consiste en carboxilato, sulfonato, sulfato, fosfonato, fosfato.
G puede presentar uno o más grupos cargados positivamente seleccionados del grupo que consiste en guanidinio, amonio cuaternario, fosfonio, sulfonio.
G puede presentar uno o más grupos, por ejemplo, grupos neutros que pueden no tener carga a un primer pH, pero que pueden tener carga a un segundo pH o a un pH predeterminado. En tal caso, G puede seleccionarse del grupo formado por amina, hidrazida, hidrazina, guanidina, alcoxiamina, ácidos sulfónicos y/o derivados de los mismos, y/o ácidos fosfónicos y/o derivados de los mismos.
G puede presentar uno o más grupos capaces de llevar una primera carga, por ejemplo, una carga negativa, a un primer pH o rango de pH, y una segunda carga, por ejemplo, una carga positiva, a un segundo pH o rango de pH. Se entenderá que el experto puede seleccionar un grupo "G" adecuado basándose en las condiciones previstas durante el uso del oligómero de APN del que se deriva el monómero de APN. En particular, cuando el oligómero de APN resultante está destinado a usarse en un ensayo, el experto puede seleccionar un grupo "G" adecuado de manera que el grupo "G" lleve un grupo químico cargado en el entorno de pH del ensayo.
Cuando G es un grupo capaz de llevar una carga a un pH predeterminado, el pH al que el grupo G es capaz de llevar una carga puede estar en el rango de 6-8
Cuando G es capaz de llevar una carga negativa, el pH al que el grupo G es capaz de llevar la carga negativa puede estar en el rango de 6-8.
Cuando G es capaz de llevar una carga positiva, el pH al que el grupo G es capaz de llevar la carga positiva puede estar en el rango de 6-8.
En algunas realizaciones, el grupo G capaz de llevar una carga negativa a un pH predeterminado puede presentar un ácido y/o un derivado del mismo, por ejemplo, un éster. El grupo G puede presentar un ácido carboxílico o un derivado del mismo, un ácido sulfónico o un derivado del mismo, un ácido sulfúrico o un derivado del mismo, un ácido fosfónico o un derivado del mismo, un ácido fosfórico o un derivado del mismo.
En algunas realizaciones, el grupo G capaz de llevar una carga positiva a un pH predeterminado puede presentar una base y/o un derivado de la misma. El grupo G puede presentar una amina, una hidrazida, una hidrazina, un guanidinio, una alcoxiamina y/o un derivado de los mismos.
En una realización, G puede tener la fórmula general:
En tal caso, el monómero de APN puede tener la fórmula general:
donde: Fmoc es fluorenilmetoxicarbonilo.
También se divulga en el presente documento un dímero de APN que comprende, al menos en una posición gamma, un grupo químico cargado o un grupo químico capaz de llevar una carga a un pH predeterminado.
El dímero de APN puede derivar de una unidad de glicina.
Típicamente, el dímero de APN puede derivar de una unidad de N-(2-aminoetil)-glicina. Como se ha indicado, el dímero de APN puede presentar en la posición gamma de una o ambas unidades de repetición un grupo químico cargado o un grupo químico capaz de llevar una carga a un pH predeterminado.
El dímero de APN puede tener la fórmula general:
donde:
G1 y G2 son independientemente hidrógeno o G, donde G es un grupo químico cargado, o un grupo químico capaz de llevar una carga a un pH predeterminado;
P1 es un grupo protector P, o es hidrógeno;
P2 es un grupo protector P, o es hidrógeno, o es un grupo seleccionado de la lista que consiste en alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo o halógeno,
P3 es hidrógeno, o es un grupo protector P, o es un grupo representado por la fórmula (II) siguiente;
Fórmula (II)
donde NB es una nucleobase;
con la condición de que:
al menos uno de Gi y G2 es G,
si P3 es hidrógeno o un grupo protector P, entonces G1 = G, y
si P4 es hidrógeno o un grupo protector P, entonces G2 = G.
Cuando G es un grupo químico cargado, G puede presentar una o más cargas negativas, y/o G puede presentar una o más cargas positivas.
En una realización, G puede presentar una carga negativa o una carga positiva.
G puede presentar uno o más grupos cargados negativamente seleccionados del grupo que consiste en carboxilato, sulfonato, sulfato, fosfonato, fosfato. G puede presentar uno o más grupos cargados positivamente seleccionados del grupo que consiste en guanidinio, amonio cuaternario, fosfonio o sulfonio.
G puede presentar uno o más grupos, por ejemplo, grupos neutros que pueden no tener carga a un primer pH, pero que pueden tener carga a un segundo pH o a un pH predeterminado. En tal caso, G puede seleccionarse del grupo formado por amina, hidrazida, hidrazina, guanidina, alcoxiamina, ácidos sulfónicos y/o derivados de los mismos, y/o ácidos fosfónicos y/o derivados de los mismos.
G puede presentar uno o más grupos capaces de llevar una primera carga, por ejemplo, una carga negativa, a un primer pH o rango de pH, y/o una segunda carga, por ejemplo, una carga positiva, a un segundo pH o rango de pH.
Se entenderá que el experto puede seleccionar un grupo "G" adecuado basándose en las condiciones previstas durante el uso del oligómero de APN del que se deriva el monómero de APN. En particular, cuando el oligómero de APN resultante está destinado a usarse en un ensayo, el experto puede seleccionar un grupo "G" adecuado de manera que el grupo "G" lleve un grupo químico cargado en el entorno de pH del ensayo.
Cuando G es un grupo capaz de llevar una carga a un pH predeterminado, el pH al que el grupo G es capaz de llevar una carga puede estar en el rango de 6-8.
Cuando G es capaz de llevar una carga negativa, el pH al que el grupo G es capaz de llevar la carga negativa puede estar en el rango de 6-8.
Cuando G es capaz de llevar una carga positiva, el pH al que el grupo G es capaz de llevar la carga positiva puede estar en el rango de 6-8.
En algunas realizaciones, el grupo G capaz de llevar una carga negativa a un pH predeterminado puede presentar un ácido y/o un derivado del mismo, por ejemplo, un éster. El grupo G puede presentar un ácido carboxílico o un derivado del mismo, un ácido sulfónico o un derivado del mismo, un ácido sulfúrico o un derivado del mismo, un ácido fosfónico o un derivado del mismo, un ácido fosfórico o un derivado del mismo. En algunas realizaciones, el grupo G capaz de llevar una carga positiva a un pH predeterminado puede presentar una base y/o un derivado de la misma. El grupo G puede presentar una amina, una hidrazida, una hidrazina, un guanidinio, una alcoxiamina y/o un derivado de los mismos.
En una realización, G puede tener la fórmula general:
Fórmula (III)
Típicamente, cualquiera de las posiciones N-terminal y/o C-terminal pueden modificarse para presentar un grupo protector (como se ha descrito anteriormente). Así, el monómero de a Pn puede estar protegido y/o puede presentar un grupo protector P en la posición N-terminal y/o C-terminal.
En una realización, si P1 es un grupo protector P, entonces P2 es hidrógeno, y viceversa.
En una realización preferida, P1 es un grupo protector P, y P2 es hidrógeno.
También se divulga un dímero de APN que tiene la fórmula general:
donde:
Gi y G2 son independientemente hidrógeno o G, donde G es un grupo químico cargado, o un grupo químico capaz de llevar una carga a un pH predeterminado;
P1 es un grupo protector P, o es hidrógeno;
P2 es un grupo protector P, o es hidrógeno, o es un grupo seleccionado de la lista que consiste en alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo o halógeno,
P3 es hidrógeno, o es un grupo protector P, o es un grupo representado por la fórmula (II) siguiente;
donde NB es una nucleobase;
con la condición de que:
al menos uno de G1 y G2 es G,
si P3 es hidrógeno o un grupo protector P, entonces G1 = G, y
si P4 es hidrógeno o un grupo protector P, entonces G2 = G.
Según un segundo aspecto de la invención, se proporciona un oligómero de APN según las reivindicaciones adjuntas.
Típicamente, el monómero de APN del que se deriva el oligómero de APN, o una o más unidades de repetición del oligómero de APN, es/son derivado/s de una unidad de N-(2-aminoetil)-glicina. El monómero de APN o una o más de las unidades de repetición del oligómero de APN pueden presentar en la posición o posiciones gamma un grupo químico cargado, o un grupo químico capaz de llevar una carga a un pH predeterminado.
El oligómero de APN tiene la fórmula general:
donde:
G es un grupo químico cargado, o un grupo químico capaz de llevar una carga a un pH predeterminado;
NB es una nucleobase; y
l> 1; m > 1; n >0.
Normalmente, m = 1.
Preferiblemente, n > 1.
Se entenderá que las unidades de repetición del oligómero de APN de fórmula (V) pueden no proporcionarse necesariamente de forma secuencial o como un polímero en bloque de los bloques I, my n , sino que las unidades de repetición pueden proporcionarse en cualquier orden.
Típicamente, el número total de unidades de APN (l+m+n) en el oligómero puede estar en el intervalo de 5-50, por ejemplo 7-40, por ejemplo 10-30, típicamente 12-24.
Se apreciará que el número de unidades repetidas que comprenden en sus respectivas posiciones gamma un grupo químico cargado o un grupo químico capaz de llevar una carga a un pH predeterminado, y/o el número de unidades que tienen un grupo químico "G" en la fórmula (V), puede depender de la aplicación particular prevista para la molécula de APN, por ejemplo, oligómero de APN.
Típicamente, el número de unidades repetidas que comprenden en sus respectivas posiciones gamma un grupo químico cargado o un grupo químico capaz de llevar una carga a un pH predeterminado, y/o el número de unidades que tienen un grupo químico "G" en la fórmula (V), puede estar en el intervalo de 1-10, por ejemplo, 2-8, por ejemplo, 3-5. Dicho de otra manera, (n+m) puede estar en el intervalo de 1-10, por ejemplo, 2-8, por ejemplo, 3-5. Dicho de otro modo, (n+m) puede estar en el intervalo de 1-10, por ejemplo, 2-8, por ejemplo, 3-5.
Por ejemplo, se observó que, para moléculas/oligómeros de APN que tienen aproximadamente 12-22 unidades repetidas, un número de unidades repetidas que comprenden en sus respectivas posiciones gamma un grupo químico cargado o un grupo químico capaz de llevar una carga a un pH predeterminado, y/o el número de unidades que tienen un grupo químico "G" en la fórmula (V), en el intervalo de 3-5, proporcionó un rendimiento significativamente mejorado.
La proporción del número de unidades repetidas que comprenden en sus respectivas posiciones gamma un grupo químico cargado o un grupo químico capaz de llevar una carga a un pH predeterminado y/o del número de unidades que tienen un grupo químico "G" en la fórmula (V), con respecto al número total de unidades repetidas, puede estar en el intervalo de 1:20-1:1, típicamente, 1:10-1:2. Por ejemplo, 1:5 -1:2.
La relación (n+m)/(l+m+n) puede estar en el rango de 1:20 -1:1, típicamente, 1:10 -1:2. Por ejemplo, 1:5 -1:2.
Típicamente, cuando la molécula de APN comprende una unidad "en blanco" o "abásica", la unidad "en blanco" o "abásica" comprende en la posición gamma un grupo químico cargado o un grupo químico capaz de transportar una carga a un pH predeterminado. Se observó que la disposición de un grupo químico cargado o un grupo químico capaz de transportar una carga a un pH predeterminado, en la posición gamma de la unidad "en blanco" o "abásica", mejoraba significativamente el rendimiento de la molécula de APN.
Normalmente, m = 1.
Las unidades de repetición que comprenden la posición gamma un grupo químico cargado o un grupo químico capaz de llevar una carga a un pH predeterminado, pueden distribuirse en la molécula de APN para proporcionar una estabilidad y/o rendimiento óptimos.
El oligómero de APN puede presentar al menos una porción en la que cada unidad de repetición que comprende en su posición gamma un grupo químico cargado o un grupo químico capaz de llevar una carga a un pH predeterminado se distribuye en la porción del oligómero de APN cada 1-5, por ejemplo, cada 2-4 unidades.
Cuando la molécula de APN comprende una unidad "en blanco" o "abásica" que comprende en la posición gamma un grupo químico cargado o un grupo químico capaz de transportar una carga a un pH predeterminado, el oligómero de APN comprende al menos una porción adyacente o alrededor de la unidad "en blanco" o "abásica", en la que cada unidad de repetición que comprende en su posición gamma un grupo químico cargado o un grupo químico capaz de transportar una carga a un pH predeterminado, se distribuye en esa porción cada 1-5, por ejemplo, cada 2-4 unidades.
Sin querer estar limitado por la teoría, se sugiere que la presencia y/o distribución de unidades "modificadas" cerca o alrededor de la unidad "en blanco" o "abásica", puede mejorar la estabilidad dimensional y/o el rendimiento de la molécula de APN, por ejemplo, el oligómero de a Pn .
La unidad "en blanco" o "abásica" puede estar situada distalmente de uno o más extremos del oligómero de APN. Típicamente, la unidad "en blanco" o "abásica" puede estar situada al menos a una, p. ej., al menos a dos, p. ej., al menos a tres unidades de repetición de uno o más extremos, preferiblemente de ambos extremos, del oligómero de APN. Mediante dicha disposición, puede mejorarse el rendimiento de la sonda. Se apreciará que la ubicación exacta de la unidad "en blanco" o "abásica" dentro del oligómero de APN, y/o la distancia de la unidad "en blanco" o "abásica" con respecto a uno o más extremos del oligómero de APN, puede depender de la longitud total del oligómero de APN y de la aplicación específica prevista para la sonda.
Cuando G es un grupo químico cargado, G puede presentar una o más cargas negativas, y/o G puede presentar una o más cargas positivas.
En una realización, G puede presentar una carga negativa o una carga positiva.
G puede presentar uno o más uno o más grupos cargados negativamente seleccionados del grupo que consiste en carboxilato, sulfonato, sulfato, fosfonato, fosfato.
G puede presentar uno o más grupos cargados positivamente seleccionados del grupo que consiste en guanidinio, amonio cuaternario, fosfonio o sulfonio,
G puede presentar uno o más grupos, por ejemplo, grupos neutros que pueden no tener carga a un primer pH, pero que pueden tener carga a un segundo pH o a un pH predeterminado. En tal caso, G puede seleccionarse del grupo formado por amina, hidrazida, hidrazina, guanidina, alcoxiamina, ácidos sulfónicos y/o derivados de los mismos, y/o ácidos fosfónicos y/o derivados de los mismos.
G puede presentar uno o más grupos capaces de llevar una primera carga, por ejemplo, una carga negativa, a un primer pH o rango de pH, y/o una segunda carga, por ejemplo, una carga positiva, a un segundo pH o rango de pH. Se entenderá que el experto puede seleccionar un grupo "G" adecuado basándose en las condiciones previstas durante el uso del oligómero de APN del que se deriva el monómero de APN. En particular, cuando el oligómero de APN resultante se destina para su uso en un ensayo, el experto puede seleccionar un grupo "G" adecuado de manera que el grupo "G" lleve un grupo químico cargado en el entorno de pH del ensayo.
Cuando G es un grupo capaz de llevar una carga a un pH predeterminado, el pH al que el grupo G es capaz de llevar una carga puede estar en el rango de 6-8.
Cuando G es capaz de llevar una carga negativa, el pH al que el grupo G es capaz de llevar la carga negativa puede estar en el rango de 6-8.
Cuando G es capaz de llevar una carga positiva, el pH al que el grupo G es capaz de llevar la carga positiva puede estar en el rango de 6-8.
En algunas realizaciones, el grupo G capaz de llevar una carga negativa a un pH predeterminado puede presentar un ácido y/o un derivado del mismo, por ejemplo, un éster. El grupo G puede presentar un ácido carboxílico o un derivado del mismo, un ácido sulfónico o un derivado del mismo, un ácido sulfúrico o un derivado del mismo, un ácido fosfónico o un derivado del mismo, un ácido fosfórico o un derivado del mismo.
En algunas realizaciones, el grupo G capaz de llevar una carga positiva a un pH predeterminado puede presentar una base y/o un derivado de la misma. El grupo G puede presentar una amina, una hidrazida, una hidrazina, un guanidinio, una alcoxiamina y/o un derivado de los mismos.
En una realización, G puede tener la fórmula general:
Fórmula (III)
Una molécula de APN, por ejemplo un oligómero de APN, descrita en el presente documento puede estar unida, ligada y/o asociada a un soporte.
En una realización, la molécula de APN puede estar unida covalentemente al soporte.
El soporte puede consistir en un soporte sólido.
El soporte puede proporcionarse en forma de una superficie bidimensional y/o sustancialmente plana, como una membrana, una película, una lámina o similar.
El soporte puede comprender una membrana. La membrana puede ser polimérica, como el nailon o una membrana funcionalizada con nailon.
El soporte puede tener una superficie de silicato. La superficie de silicato puede ser una superficie de vidrio funcionalizado o una superficie de silicio. El soporte puede proporcionarse en forma de partícula, microesfera o similar. En tal caso, el soporte puede presentar un soporte de resina, como microesferas de poliestireno reticulado, microesferas paramagnéticas de poliestireno reticulado, microesferas de poliestireno reticulado etiquetadas con color (por ejemplo, de Luminex Inc.), microesferas de látex de poliestireno o similares. El soporte, por ejemplo, el soporte bidimensional y/o el soporte de partículas, puede presentar y/o estar hecho de un material modificado en superficie, por ejemplo, una resina modificada en superficie. El material puede presentar una superficie modificada para incorporar grupos químicos capaces de unirse, por ejemplo, covalentemente a la molécula de APN en las posiciones N-terminal o C-terminal o a un componente de la misma (por ejemplo un monómero de APN del que se deriva el oligómero de APN).
Las características descritas con respecto a cualquier otro aspecto de la invención pueden aplicarse igualmente con respecto al oligómero de APN según el segundo aspecto de la invención, y no se repiten aquí por razones de brevedad.
Según un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona un uso para una molécula de APN modificada (por ejemplo oligómero de APN) como se describe en el presente documento, en un método de análisis genético o de ácido nucleico.
Debe entenderse que los términos métodos de análisis "genético" o "nucleico" pueden abarcar, por ejemplo, métodos dirigidos a la caracterización, identificación y/o secuenciación de nucleobases de ácidos nucleicos. En una realización, dichos métodos pueden utilizarse para caracterizar nucleótidos individuales, polimorfismos de nucleótido único (SNP) y/o para secuenciar ácidos nucleicos.
En consecuencia, la frase "caracterizar una nucleobase" puede entenderse como el acto de identificar o determinar una nucleobase concreta de una secuencia de ácido nucleico concreta, es decir, identificar qué nucleobase comprende un nucleótido concreto. En los casos en que los métodos se utilizan para caracterizar un SNP, el término "caracterizar" puede entenderse como el acto de determinar qué alelo (o nucleobase) del SNP está presente en una secuencia de ácido nucleico concreta.
En una realización preferida, una molécula de APN modificada (por ejemplo, un oligómero de APN) para su uso en un método de análisis genético (por ejemplo, un método de caracterización de uno o más nucleótidos en una secuencia de ácido nucleico) puede carecer de una base complementaria a la del nucleótido que se va a caracterizar. En tal caso, el oligómero de APN puede describirse como que comprende una unidad de APN "en blanco" o "abásica".
Las características descritas con respecto a cualquier otro aspecto de la invención pueden aplicarse igualmente con respecto al uso según el tercer aspecto de la invención, y no se repiten aquí por razones de brevedad.
Según un cuarto aspecto de la invención, se proporciona un método para preparar un monómero de APN según un primer aspecto de la invención, el método comprende:
proporcionar un compuesto según la fórmula (A3);
hacer reaccionar el compuesto de fórmula (A3) con un grupo protector P; e
hidrólisis.
donde G es un grupo químico cargado, o un grupo químico capaz de llevar una carga a un pH predeterminado, y en el que P1 es un grupo protector.
En una realización, el grupo protector P introducido en el compuesto de fórmula (A3) puede ser un grupo protector Boc.
En una realización, el grupo protector P1 puede ser Fmoc.
El método puede comprender una reacción según el esquema 2:
Así, el compuesto de fórmula (A5) puede denominarse un monómero de APN abásico o "en blanco".
El método puede presentar la preparación del compuesto de fórmula (A3).
El método puede presentar la aminación de un compuesto glicinal alfa-modificado N-protegido, tal como un compuesto según la fórmula (A1).
La aminación puede presentar la reacción del compuesto glicinal alfa-modificado N-protegido, por ejemplo, el compuesto según la fórmula (A1), con éster metílico de glicina.
La aminación puede presentar una reacción según el esquema 3:
Esquema 3
El método puede presentar la preparación del compuesto de fórmula (A1).
El método puede presentar la oxidación de un compuesto según la fórmula (A0).
La oxidación puede comprender una reacción según el esquema 4.
Esquema 4
Típicamente, cualquiera de las posiciones N-terminal y/o C-terminal pueden modificarse para presentar un grupo protector (como se ha descrito anteriormente). Así, el monómero de a Pn puede estar protegido y/o puede presentar un grupo protector P en la posición N-terminal y/o C-terminal.
En una realización, si P1 es un grupo protector P, entonces P2 es hidrógeno, y viceversa.
P1 es un grupo protector P, y P2 es hidrógeno. Así, el monómero de APN puede tener la fórmula general:
Las características descritas con respecto a cualquier otro aspecto de la invención pueden aplicarse igualmente con respecto al método según el cuarto aspecto de la invención, y no se repiten aquí por razones de brevedad.
Según un quinto aspecto de la invención, se proporciona un método para preparar un oligómero de APN según un segundo aspecto de la invención, comprendiendo el método hacer reaccionar uno o más monómeros de APN según un primer aspecto de la invención para formar el oligómero de APN.
El método puede comprender hacer reaccionar uno o más monómeros de APN según un primer o segundo aspecto de la invención (concretamente monómeros de APN que tienen un grupo "G" en la posición gamma) con monómeros de APN diferentes, tales como uno o más monómeros de APN que no comprenden un grupo "G" en la posición gamma. El método puede comprender sintetizar el oligómero de APN usando uno o más monómeros de APN que comprenden un grupo protector P en el N-terminal. En una realización, el método puede comprender sintetizar el oligómero de APN usando monómeros de APN protegidos con Dde como se enseña en el método divulgado en Bradley et al., Tetrahedron, 2005, 61, 8295-8305, en fase sólida ( J.J. Diaz-Mochon et al., Org. Lett. 2004, 6, 1127-1129).
El método puede comprender el paso preliminar de inmovilizar un monómero de APN sobre un soporte, por ejemplo un soporte sólido, por ejemplo a través de su C-terminal.
El método puede comprender la inmovilización de un monómero de APN mediante unión covalente entre un soporte modificado y el extremo C del monómero de APN.
Se apreciará que el monómero de APN inmovilizado o unido al soporte puede ser un monómero de APN según el primer aspecto de la invención, o un monómero de APN diferente que no comprenda un grupo "G" en la posición gamma, dependiendo de la posición o posiciones en el oligómero de APN en las que se pretenda localizar un grupo químico cargado.
Las características descritas con respecto a cualquier otro aspecto de la invención pueden aplicarse igualmente con respecto al método según el noveno aspecto de la invención, y no se repiten aquí por razones de brevedad.
Según un sexto aspecto de la invención, se proporciona un método de caracterización de un nucleótido en una secuencia de ácido nucleico, dicho método comprende las etapas de:
(a) poner en contacto un ácido nucleico con un oligómero de ácido nucleico peptídico (APN) según el segundo aspecto, siendo el oligómero de APN capaz de hibridarse con una porción del ácido nucleico, para formar un dúplex de ácido nucleico/ APN; y
(b) poner en contacto el dúplex de ácido nucleico/APN con una o más bases modificadas seleccionadas del grupo que consiste en:
(i)
(ii)
(iii)
y
(iv)
donde Y es un grupo funcional capaz de reacciones covalentes reversibles;
X -X14 es una etiqueta detectable, una combinación espaciador-etiqueta o un hidrógeno; y
Z es carbono o nitrógeno;
en el que el oligómero de APN comprende un grupo químico capaz de reaccionar reversiblemente con el grupo funcional Y y en el que la base modificada que se integra con el dúplex de ácido nucleico/APN es complementaria a la del nucleótido que se va a caracterizar, caracterizándose el nucleótido por espectrometría de masas o mediante la etiqueta detectable de la base modificada.
El oligómero de APN carece de una base complementaria a la del nucleótido que se desea caracterizar. Por lo tanto, el oligómero de APN puede describirse como una estructura que posee una unidad de APN “en blanco” o “abásica”.
Normalmente, m = 1.
Preferentemente, n > 1.
En una realización, la molécula de APN puede estar unida a un soporte. Típicamente, la molécula de APN puede estar unida covalentemente al soporte.
El soporte puede comprender un soporte sólido, por ejemplo, un soporte como el descrito con respecto al oligómero de a Pn según un quinto aspecto de la invención.
Las características descritas con respecto a cualquier otro aspecto de la invención pueden aplicarse igualmente con respecto al método según el sexto aspecto de la invención, y no se repiten aquí por razones de brevedad.
Breve descripción de los dibujos
La presente invención se describirá ahora en detalle y con referencia a las siguientes Figuras que muestran:
Figura 1: Esquemas de reacción utilizados para preparar un monómero de APN según una realización de la invención;
Figura 2: Esquema que representa un enfoque colorimétrico para probar las sondas de APN;
Figura 3: Ejemplos de moléculas de APN ensayadas;
Figura 4: Resultados de la intensidad medida para las moléculas de APN de la Figura 3;
Figura 5: Ejemplos alternativos de moléculas de APN ensayadas;
Figura 6: Resultados de la intensidad medida para las moléculas de APN de la Figura 5;
Figura 7: Ejemplos alternativos de moléculas de APN ensayadas;
Figura 8: Resultados de la intensidad medida para las moléculas de APN de la Figura 8;
Figura 9: Resultados de la intensidad medida para realizaciones alternativas de las moléculas de APN;
Figura 10: Ejemplos de moléculas de APN ensayadas utilizando un soporte diferente;
Figura 11: Resultados de la intensidad medida para las moléculas de APN de la Figura 10.
Figura 12: Esquema que representa dos métodos alternativos para probar las sondas de APN: A) Enfoque quimioluminiscente (utilizando un lector de microplacas); B) Enfoque fluorométrico (aprovechando la citometría de flujo).
Figura 13: Funcionamiento de los oligómeros de APN descritos en la Tabla 1 (véase más abajo). (+) señal positiva - oligo 122 (15 nM). (-) señal negativa - agua como control.
Figura 14: Análisis por citometría de flujo de los oligómeros de APN descritos en la Tabla 2 (véase más abajo). A) El etiquetado de microesferas se realizó utilizando microesferas que contenían el oligómero de APN DGL 21_6.0, SMART-A-Nucleobase-Biotina y Oligo DNA21 (15 nM); B) Como control negativo agua (sin etiquetado).
Figura 15: Análisis por citometría de flujo de los oligómeros de APN indicados en la Tabla 2 (véase más abajo). El etiquetado de microesferas se realizó utilizando microesferas que contenían el oligómero de APN DGL 21_2.0 (A) y DGL 21_3.0 (B), SMART-A-Nucleobase-Biotina y oligo DNA 21 (15 nM).
Ejemplos
Preparación
Preparación de monómeros
Se prepararon monómeros de APN con nucleobases modificados en gamma que contenían nucleobase y monómeros de APN "en blanco" de la presente invención.
En esta realización, los monómeros de APN se basaban en un (L) amino derivado glutámico.
En esta realización, se prepararon un monómero de APN modificado gamma que contiene nucleobase (A8) y un monómero de APN modificado gamma "en blanco" (A9) como se indica a continuación.
En un primer paso, se preparó un compuesto gamma-modificado de fórmula (A7) mediante 1) oxidación y 2) aminación reductora de (L) Fmoc-Glutamol de fórmula (A6). El alcohol se oxidó a aldehído (IBX o DMP), que luego se hizo reaccionar con éster metílico de glicina (A2) en condiciones de aminación reductora para producir el compuesto gamma-modificado (A7).
En un segundo paso, el compuesto modificado en gamma (A7) se hizo reaccionar para producir un monómero de APN que contiene nucleobase (A8) o un monómero de APN "en blanco" (A9).
Para preparar un monómero de APN que contiene nucleobase (A8), al compuesto gamma glutámico (A7) se le acopló una nucleobase (A, C, G, T) y luego se trató en condiciones de hidrólisis para producir el monómero de APN que contiene nucleobase modificado en gamma (A8).
Para preparar el monómero quiral de APN "en blanco" (A9), la amina secundaria del compuesto (A7) se protegió con un grupo protector, en esta realización Boc, y el producto resultante se trató en condiciones de hidrólisis para obtener el monómero de "APN en blanco" (A9).
Esto se ilustra en los esquemas de reacción de la Figura 1.
Moléculas de APN
Se prepararon y evaluaron varias moléculas de APN, incluidos los oligómeros de APN que contienen y/o derivan de los monómeros A8 y A9 anteriores.
Para evaluar la especificidad y sensibilidad de las moléculas de APN, se utilizó una nucleobase SMART C modificada con una biotina. Se realizó un enfoque colorimétrico (como se muestra en el esquema de la Figura 2) utilizando sondas de APN inmovilizadas en membranas de nylon mediante un grupo amino-pegilado en su extremo N-terminal.
En este método, las sondas DestiNA (soluciones de 10 a 100 j M) modificadas en su N-terminal con un grupo aminopegilado se inmovilizaron en Immunodyne ABC (membranas de nylon 6.6 activado de Pall). La mezcla de reacción DestiNA se preparó con 30 j l de SMART-C-PEG-Biotina (SMA<r>T "Reader Base") (100<j>M), 45 j l de cadenas de ácido nucleico (ADN KWT y ADN K12S) a 100 nM o 45uL de PCR KWT y K12S y 20 j l de agente reductor, cianoborohidruro sódico (15 mM) y 205 j l de tampón citrato 0,1M con 0,1 %SDS (pH 6). A continuación, se añadió la mezcla de reacción de DestiNA a la membrana impresa y se incubó a 41 °C durante 20-30 minutos. A continuación, las membranas se lavaron dos veces con citrato sódico salino 0,5x (SSC) y dodecil sulfato sódico al 0,5 % (SDS) utilizando un colector de vacío. La membrana se bloqueó con una solución de bloqueo con BSA y caseína durante 5 minutos y, a continuación, se añadió a la membrana una solución de estreptavidina-fosfatasa alcalina y se incubó a 29 °C durante 5 minutos. A continuación, las membranas se lavaron cuatro veces con tris-HCl 0,1M/tween 20 0,5 % utilizando un colector de vacío. Por último, se añadió solución cromogénica NBT/BCIP y se incubó a 36 °C durante 8 min. Tras los pasos de lavado, se tomaron fotografías de las membranas y se midió la intensidad de la respuesta. Las imágenes se tomaron con una LifeCam asistida con iluminación LED. Las intensidades de las señales se midieron mediante un programa informático de densitometría de imágenes. Los valores de la señal son unidades arbitrarias relacionadas con las intensidades del marcador de biotina dentro de la misma membrana.
a) Moléculas de APN que contienen 6 unidades gamma-modificadas, y posición abásica "no modificada".
Cuatro sondas de APN diferentes (mostradas en la Figura 3) que contenían 6 unidades modificadas gamma (representadas en negro) con una posición abásica "no modificada" se inmovilizaron en membranas de nailon y se sometieron a ensayo.
En particular, las unidades de repetición mostradas en blanco estaban desprovistas de cualquier sustituyente en la posición gamma, y las unidades de repetición mostradas en negro tenían en su posición gamma un grupo químico que contenía un grupo ácido carboxílico.
La especificidad y la sensibilidad de las sondas se evaluaron del siguiente modo:
(i) ESPECIFICIDAD: las mayores diferencias de señal entre dos sondas de APN, cuando reaccionan con:
(a) ADN KWT (control positivo - porción de la cadena de ácido nucleico que contiene como nucleótido a caracterizar una "G"; este nucleótido se caracteriza así por medio de la etiqueta detectable que lleva la nucleobase modificada, en este caso, siguiendo la regla del par de Watson y Crick, la base modificada es "C") o bien
(b) ADN K12S (control negativo - porción de la cadena de ácido nucleico que contiene como nucleótido a caracterizar una "A"; por tanto, este nucleótido no debe caracterizarse mediante la etiqueta detectable que lleva la nucleobase modificada, ya que su base modificada complementaria "T" no lleva una etiqueta detectable).
(ii) SENSIBILIDAD: las señales dadas por las cuatro sondas ensayadas 12SRC -12DAV - 13SRC - 13DAV deberían ser similares cuando se utiliza ADN KWT.
La estructura específica del ADN de control positivo KWT y del ADN de control negativo K12S; y los resultados de las señales medidas para cada sonda, se muestran en la Figura 4.
En la Figura 4, se alinean el ADN de la amplificación PCR y las secuencias APN (DGL). Los nucleótidos no coincidentes están subrayados. Las sondas se imprimieron a 100<j>M.
Se observó que, la especificidad (señal diferente entre las membranas KWT y K12S) era muy buena para las cuatro sondas excepto para K13SRC. También se observó que la sensibilidad (diferencia en la intensidad de la señal proporcionada por las sondas K12SRC y K13SRC si se compara con K12DAV y K13DAV dentro de la misma membrana) no era satisfactoria (76 - 90 vs 44 - 44) y era difícil de predecir y entender basándose en las secuencias mostradas en la Figura 3.
b) Moléculas de APN que contienen variantes alternativas en la posición abásica o "en blanco".
En la Figura 5 se muestran las estructuras específicas de las sondas inmovilizadas en membranas de nailon y ensayadas según la Figura 2. En este caso, las sondas se imprimieron a 50<j>M (la mitad de la concentración de las sondas 6-neg ensayadas en la Figura 4).
En la Figura 5, las sondas Glu tienen unidades estándar de ácido glutámico en los extremos terminales C y N. U y Glu corresponden a una unidad abásica desprovista de cualquier sustituyente en la posición gamma. CBU corresponde a una unidad abásica que comprende un grupo neutro (metilo) en su posición gamma. CBC corresponde a una unidad abásica que tiene en su posición gamma un grupo químico que contiene un grupo ácido carboxílico.
Los resultados de las señales medidas para cada sonda se muestran en la figura 6.
Se observó que las sondas CBC (en las que la unidad en posición abásica contiene un grupo carboxílico) presentaban intensidades muy similares entre las cuatro sondas diferentes (K12SRC, K12DAV, K13SRC y K13DAV), manteniendo un nivel aceptable de especificidad. Sin embargo, las intensidades de señal eran relativamente bajas.
También se observó que las otras sondas sufrían altos niveles de variación en términos de intensidad entre los 4 tipos de sondas.
c) moléculas de APN que contienen variantes alternativas en la posición abásica o "en blanco", así como variantes en otras unidades que contienen una nucleobase
Las estructuras específicas de las sondas inmovilizadas en membranas de nailon y ensayadas según la Figura 2, se muestran en la Figura 7 a continuación. Las sondas se imprimieron a 10, 20 y 50 pM.
Los resultados de las señales medidas para cada sonda se muestran en la figura 8.
Se observó que la configuración 3RCC era la mejor para los APN K12SRC y K12DAV en términos de especificidad (55 frente a 3 y 55 frente a 5, respectivamente). En esta configuración, la posición en blanco está separada a cada lado de una unidad de nucleobase que tiene en su posición gamma un grupo químico que contiene un grupo ácido carboxílico por una unidad de nucleobase desprovista de cualquier sustituyente en la posición gamma. Esta configuración también permitió que las señales fueran de intensidad similar, a diferencia de los resultados obtenidos con estructuras de APN 6Neg. También se observó que las sondas funcionaban mejor cuando las unidades de nucleobase que tenían en su posición gamma un grupo químico que contenía un grupo ácido carboxílico no estaba inmediatamente adyacente a la unidad quiral abásica (sondas 3CC).
También se observó que las sondas estándar (sondas U y Glu que sólo tienen cargas negativas a través de sus grupos aminoácidos glutámicos naturales en los extremos C y N) daban una especificidad menor, ya que disparaban una señal más alta cuando se utilizaba el ADN de control negativo K12S.
A continuación se probaron las sondas K13SRC y K13DAV con la configuración 3RCC. Las sondas se imprimieron a 20 pM. Los resultados se muestran en la Figura 9.
En la figura 9 se observa que las modificaciones 3RCC ofrecen un rendimiento superior tanto en lo que respecta a la sensibilidad como a la especificidad.
d) Utilización del soporte de microesferas como alternativa a la membrana
Las sondas DGL-13SRC-CBC y DGL-13SRC-3RCC (véase la Figura 10 a continuación) se unieron covalentemente a microesferas magnéticas en lugar de a membranas de nailon y la incorporación de nucleobases SMART se detectó mediante detección electroquímica en lugar de colorimetría.
Las sondas se acoplaron a microesferas de ácido carboxílico Dynabeads (ThermoFisher Scientific, EE.UU.) utilizando la química estándar de acoplamiento con carbodiimida en dos pasos. Las microesferas se lavaron (x2, 0,02 % Tween-20, 200 pl y x2, 0,1 % SDS, 200 pl), se resuspendieron en agua (-1 millón de microesferas por 100 pl) y se diluyeron en 2x citrato sódico salino (SSC) y 0,1 % dodecil sulfato sódico (SDS) con el pH ajustado a 6,0 (tampón A) (100 microesferas por pl). 23,5 pl de tampón A, 12,5 pl de las microesferas funcionalizadas (dispersadas en el tampón A, con 100 microesferas por pl), 4 pl de SMART-C-PEG-Biotina (500 pM), 7,5 pl de s-miARN122 o controles s-miARN21 o s-miARN122-A (a 1 pM, 100 nM, 10 nM o 1 nM) y 2,5 pl de agente reductor, cianoborohidruro de sodio (20 mM) en un eppendorf de 200 pl, se agitaron en vórtex y se incubaron (41 °C durante 30 min, termociclador). A continuación, las microesferas se lavaron dos veces con tampón A, se volvieron a suspender (en 50 pl de tampón A) y se añadieron 10 pl de Estreptavidina-HRP durante 10 min. Tras los pasos de lavado (3 min de separación magnética) se utilizó hidroquinona (HQ) como mediador de transferencia de electrones y peróxido de oxígeno (H2O2) como sustrato de HRP. En esta fase, se realizó una medición amperométrica utilizando electrodos de carbono serigrafiados (SPCE) (Dropsens, España).
Los resultados se muestran en la figura 11.
Se observó que una sonda DGL-13SRC-3RCC (unidad modificada gamma en la posición en blanco separada a cada lado de una unidad de nucleobase modificada gamma que tiene un grupo químico que contiene un grupo de ácido carboxílico por una unidad de nucleobase desprovista de cualquier sustituyente en la posición gamma) mejoraba 3 veces la señal específica generada, en comparación con una sonda DGL-13SRC-3CBC (unidad modificada gamma en la posición en blanco sin unidades de nucleobase modificadas gamma).
Los experimentos anteriores demuestran las ventajas del poder de combinar modificaciones quirales tanto en la unidad abásica como en diferentes posiciones de la sonda APN.
Si bien las pruebas anteriores muestran un rendimiento superior para las sondas que tienen una unidad modificada gamma en la posición en blanco separada a cada lado de una unidad de nucleobase modificada gamma que tiene un grupo químico que contiene un grupo de ácido carboxílico por una unidad de nucleobase desprovista de cualquier sustituyente en la posición gamma, se apreciará que la posición específica de las unidades de nucleobase modificadas gamma en la sonda puede alterarse sin comprometer el rendimiento mejorado de la sonda. Por ejemplo, las unidades de nucleobase modificadas con gamma pueden situarse a dos, tres o cuatro unidades de la posición en blanco. La ubicación óptima de una o más unidades de nucleobase modificadas con rayos gamma puede depender de varios factores, como la longitud de la sonda y su aplicación específica.
e) Utilización de sondas de ADNP m odificado quiral para la detección de microARN (miARN) circulante con una plataforma quim iolum iniscente (lector de microplacas).
Se diseñaron/prepararon oligómeros de APN que contenían y/o derivaban de los monómeros A8 y A9 anteriores, para permitir la hibridación antiparalela con cadenas maduras de miARN122 (Tabla 1). Como se muestra en la Tabla 1 (véase más adelante), se sintetizaron oligómeros de APN que contenían monómeros de APN no modificados, como las sondas DGL122_3.0-5.0 y algunas otras sondas que llevaban tres o más unidades modificadas gamma (DGL122_1.2, 4.1, 4.2).
Para probar las moléculas de APN, se utilizaron nucleobases modificadas marcadas con Biotina (SMART-C-Nucleobase-Biotina) junto con un método quimioluminiscente (como se muestra en el esquema de la Figura 12A).
Las moléculas de APN se probaron para evaluar la especificidad y sensibilidad de las moléculas de APN en relación con: i) la presencia de unidades modificadas gamma; ii) la presencia de modificaciones gamma dentro de la unidad abásica; iii) la posición de la unidad abásica y la longitud de los oligómeros de APN (véase la Tabla 1 a continuación).
En este método, las sondas modificadas en su N-terminal con un grupo amino-pegilado se unieron covalentemente a Dynabeads carboxiladas® (M-270 Carboxylic Acid) utilizando un protocolo de dos pasos (sin NHS) de química de acoplamiento carbodiimida según el protocolo del fabricante (Thermo Fisher Scientific).
Se preparó una mezcla de reacción con 50 pl de microesferas (4 ^ 104 microesferas/uL), SMART-C-Nucleobase-Biotina (Reader Base) (2 pM), hebras de ácido nucleico (Oligo DNA 122) a 15 nM o agua en su lugar como control y agente reductor, cianoborohidruro sódico (1 mM) y tampón SCD (2* SSC y 0,1 % SDS - pH 6,0) hasta un volumen final de 50 pl. A continuación, se agitó en vórtex la mezcla de reacción de DestiNA y se incubó a 41 °C durante 1 h en un termociclador. Una vez finalizada la reacción, las microesferas se lavaron tres veces con 200 uL de tampón de lavado A (PBS-Tween 0,1 %). A continuación, se pelletearon las microesferas, se eliminó el sobrenadante y se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente con 100 uL de solución Pierce High Sensitivity Estreptavidina-HRP (1:8000) (Thermo Fisher Scientific). Tras los pasos de lavado (4 veces en tampón A), las microesferas se pelletearon y se volvieron a sobrenadar en 100 uL de sustrato - Sustrato SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent (Thermo Fisher Scientific). Las microesferas se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente. Una vez finalizada la incubación, se transfirieron las microesferas/sustrato (100 uL) al sustrato (una placa blanca de 96 pocillos) para la lectura final utilizando un lector de placas con capacidad de detección de quimioluminiscencia (FLUOstar Omega) (Figura 12A). Los resultados se muestran en la Figura 13. ;;Los mejores resultados de rendimiento se obtuvieron con las sondas de captura 122_1.2, 122_4.1 y 122_4.2. Específicamente, se observó que las sondas 122_1.2, 122_4.1 y 122_4.2 con una unidad modificada gamma en la posición en blanco (una posición abásica modificada gamma) o distribuida a través del esqueleto del APN tienen una señal específica generada mejorada, en comparación con las sondas DGL122_3.0-5.0 (sin una unidad modificada gamma en la posición en blanco o una unidad de nucleobase modificada gamma a través del esqueleto del APN). ;Los oligómeros de APN 122_4.1 (que no tienen una unidad modificada gamma en la posición en blanco y dos nucleobases modificadas gamma en el lado izquierdo y una sola nucleobase modificada gamma en el lado derecho (véase la Tabla 1)) mostraron un buen rendimiento. Esto demuestra que el rendimiento de un oligómero de APN (es decir, una mejora en la relación señal/fondo; donde el fondo se compara con el obtenido cuando la reacción se lleva a cabo utilizando agua como control (sondas DestiNA seguidas de "-" en la Figura 13)) depende en parte de la posición de las unidades de nucleobase modificadas gamma dentro de la sonda Estos resultados confirman que la ubicación y el número óptimos de unidades de nucleobase modificadas gamma pueden depender de varios factores y de la aplicación específica de la sonda. ;;f) Utilización de sondas de APN modificadas quiralmente para la detección de microARN (miARN) circulantes con citometría de flujo. ;;Se utilizó la citometría de flujo para estudiar más a fondo el efecto de las unidades modificadas con gamma en "posiciones en blanco", así como las distribuidas por el esqueleto del oligómero de APN (Figura 12B). ;Se diseñaron/prepararon tres oligómeros de APN que contenían y/o derivaban de los monómeros A8 y A9 anteriores, para permitir la hibridación antiparalela con hebras de miARN21 maduro (Tabla 2). Los oligómeros de APN DGL21_2.0 y DGL21_6.0 se diseñaron para hibridar con la misma región del miARN21 maduro. Ambos oligómeros llevan dos unidades modificadas con gamma respectivamente en las dos nucleobases de timina al lado (o adyacentes) de la posición en blanco. Además, DGL21_6.0 contiene una unidad modificada gamma en la posición en blanco y la secuencia es ligeramente más larga (19-mer en lugar de 17). El otro oligómero de 17-mer APN (DGL21_3.0) fue diseñado para permitir la hibridación anti-paralela a una región diferente de la cadena madura de miARN21 y lleva dos unidades modificadas gamma en las nucleobases de timina a cada lado de la posición en blanco (Tabla 2). Para los tres oligómeros de APN, la posición en blanco se colocó de forma que, tras la hibridación, la cadena madura de miARN21 presenta un uracilo (Tabla 2, nucleobases en verde) delante de la posición en blanco, lo que permite la incorporación de una nucleobase modificada con adenina y marcada con biotina (SMART-A-Nucleobase-Biotina). ;Los oligómeros de APN DGL21_2.0, DGL21_6.0 y DGL21_3.0 se unieron covalentemente a las microesferas Dynabeads Carboxylic Acid (ThermoFisher Scientific) utilizando la química estándar de acoplamiento de carbodiimida en dos pasos (el acoplamiento se realizó como se informó anteriormente). Para evaluar la especificidad y sensibilidad de las moléculas de APN, se evaluó el rendimiento de las microesferas mediante la incorporación selectiva de SMART-A-Nucleobase-Biotina (Reader Base). ;;Las microesferas se procesaron mediante un método de citometría de flujo. Se preparó una mezcla de reacción con 50 |jl de microesferas ( 8 * 107 microesferas/uL), SMART-A-Nucleobase-Biotina (30 jM ), hebras de ácido nucleico (Oligo DNA21) a 15 nM o agua en su lugar como control y agente reductor, cianoborohidruro sódico (150 jM ) y tampón fosfato pH 6 (150 mM) hasta un volumen final de 50 jl. A continuación, la mezcla de reacción se agitó en vórtex y se incubó a 41 °C durante 1 h en un termociclador. Una vez finalizada la reacción, las microesferas se lavaron tres veces con 200 uL de tampón de lavado A (PBS-Tween 0,1 %). A continuación, las microesferas se precipitaron, se eliminó el sobrenadante y se incubaron durante 1 h RT con 100 uL de conjugado de estreptavidina-R-ficoeritrina - SAPE (20 jg / ml), adquirido a Thermo Fisher Scientific. Tras la incubación con SAPE, las microesferas se analizaron mediante Bd FACSCanto (PE-Channel, filtro 585/42) y se obtuvieron gráficos de puntos mediante Flowjo.
Los resultados se muestran en la figura 14.
Se observaron claramente desplazamientos de población en el canal PE con microesferas que contenían el oligómero de APN DGL 21_6.0. Se observó que la sonda DGL 21_6.0 (que contenía la unidad modificada gamma en la posición en blanco y otras distribuidas por el esqueleto del APN) permitía la incorporación dinámica eficiente de la 'Reader Base' con una señal específica generada (desplazamiento de población en el canal PE) (Figura 14), en comparación con las sondas DGL21_2.0 y DGL21_3.0 (sin unidad modificada gamma en la posición en blanco) (Figura 15). Estos resultados muestran cómo la adición de gamma-modificación en la posición en blanco (DGL 21_6.0) aporta una incorporación superior de SMART-A-Nucleobase-Biotina en comparación con una secuencia bastante similar pero sin gamma-modificación en la posición en blanco, como la DGL21_2.0 (véase la Tabla 2).
Tablas
Tabla 1: Moléculas de APN para el microARN 122 circulante. Seis oligómeros de APN con secuencia de nucleobases complementarias a la cadena madura del miARN 122. Los oligómeros contenían monómeros de APN no modificados (círculos blancos) y monómeros que contenían modificaciones quirales en posiciones gamma y un resto que contenía un grupo ácido carboxílico (círculos negros). Las elipses negras y vacías muestran la unidad abásica respectivamente con o sin modificaciones en las posiciones gamma..
Tabla 2: Tres moléculas de APN para el microARN 21 circulante. Consulte la Tabla 1 para ver la leyenda.

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un oligómero de APN, en el que el oligómero de APN tiene la fórmula general:
    donde: G es un grupo químico cargado, o un grupo químico capaz de llevar una carga a un pH predeterminado; NB es una nucleobase; y
  2. 2. El oligómero de APN de la reivindicación 1, en el que n > 1.
  3. 3. El oligómero de APN de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el número total de unidades de APN (l+m+n) en el oligómero está en el intervalo de 12-24, o en el que el número de unidades repetidas que comprenden en sus respectivas posiciones gamma un grupo químico cargado o un grupo químico capaz de llevar una carga a un pH predeterminado, y/o el número de unidades que tienen un grupo químico "G" en la fórmula (V), está en el intervalo de 3-5, o en la que la relación entre el número de unidades repetidas que comprenden en sus respectivas posiciones gamma un grupo químico cargado o un grupo químico capaz de llevar una carga a un pH predeterminado y/o el número de unidades que tienen un grupo químico "G" en la fórmula (V), y el número total de unidades repetidas, está comprendida entre 1:10 y 1:2.
  4. 4. El oligómero de APN de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que m = 1.
  5. 5. El oligómero de APN de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la molécula de APN está unida covalentemente a un soporte sólido.
  6. 6. Un monómero de APN que tenga la fórmula general:
    donde: G es un grupo químico cargado, o un grupo químico capaz de llevar una carga a un pH predeterminado; P1 es un grupo de protección P; P3 es hidrógeno o es un grupo protector P.
  7. 7. El monómero de APN de la reivindicación 6, en el que el monómero de APN tiene la fórmula general:
    donde: Fmoc es fluorenilmetoxicarbonilo.
  8. 8. El oligómero de APN de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o el monómero de APN de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, en el que G es un grupo químico cargado, opcionalmente, donde G comprende uno o más grupos cargados negativamente seleccionados del grupo que consiste en carboxilato, sulfonato, sulfato, fosfonato, fosfato, o en el que G comprende uno o más grupos cargados positivamente seleccionados del grupo que consiste en guanidinio, amonio cuaternario, fosfonio, sulfonio, o en el que G comprende uno o más grupos neutros que no llevan carga a un primer pH, pero que son capaces de llevar carga a un segundo pH o a un pH predeterminado, opcionalmente en el que G se selecciona del grupo que consiste en amina, hidrazida, hidrazina, guanidina, alcoxiamina, ácidos sulfónicos y/o derivados de los mismos, y/o ácidos fosfónicos y/o derivados de los mismos, o en el que G es un grupo capaz de transportar una carga a un pH comprendido entre 6 y 8.
  9. 9. Uso de un oligómero de APN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 u 8, en un método de análisis genético.
  10. 10. Un método para preparar un monómero de APN según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, comprendiendo el método: proporcionar un compuesto según la fórmula (A3); hacer reaccionar el compuesto de fórmula (A3) con un grupo protector P; e hidrólisis.
    donde G es un grupo químico cargado, o un grupo químico capaz de llevar una carga a un pH predeterminado, y en el que P1 es un grupo protector.
  11. 11. Método para preparar un oligómero de APN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende hacer reaccionar uno o más monómeros de APN según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7 para formar el oligómero de APN.
  12. 12. El método de la reivindicación 11, en el que el método comprende el paso preliminar de unir covalentemente un/el monómero de APN sobre un soporte sólido a través de su C-terminal.
  13. 13. Un método de caracterización de un nucleótido en una secuencia de ácido nucleico, dicho método comprende los pasos de: (a) poner en contacto un ácido nucleico con un oligómero de ácido nucleico peptídico (APN) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, siendo el oligómero de APN capaz de hibridarse con una porción del ácido nucleico, para formar un dúplex de ácido nucleico/ APN; y (b) poner en contacto el dúplex de ácido nucleico/APN con una o más bases modificadas seleccionadas del grupo que consiste en: (i)
    (ii)
    (iii)
    y (iv)
    donde Y es un grupo funcional capaz de reacciones covalentes reversibles; X -X14 es una etiqueta detectable, una combinación espaciador-etiqueta o un hidrógeno; y Z es carbono o nitrógeno; en el que el oligómero de APN comprende un grupo químico capaz de reaccionar reversiblemente con el grupo funcional Y y en el que la base modificada que se integra con el dúplex de ácido nucleico/APN es complementaria a la del nucleótido que se va a caracterizar, caracterizándose el nucleótido por espectrometría de masas o mediante la etiqueta detectable de la base modificada.
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