ES2965779A1 - Inhibidores de la ATP-citrato liasa como agentes geroprotectores - Google Patents

Abstract

Inhibidores de la ATP-citrato liasa para su uso como agentes geroprotectores, para tratar trastornos metabólicos relacionados con la obesidad y con el envejecimiento no saludable.

Description

DESCRIPCIÓN

Inhibidores de la ATP-citrato liasa como agentes geroprotectores

CAMPO DE LA TÉCNICA

La invención se enmarca dentro del ámbito de la Medicina, más concretamente en el marco de las terapias de reprogramación celular que tienen como objetivo modular molecularmente los mecanismos del envejecimiento, con el fin de localizar compuestos y/ o tratamientos con potencial terapéutico para el tratamiento de enfermedades ligadas al envejecimiento no saludable como el hígado graso, la diabetes y la sarcopenia entre otras.

ANTECEDENTES

Durante el siglo pasado, los humanos han alcanzado la esperanza de vida más larga de la historia. Sin embargo, el aumento de la esperanza de vida se asocia con una larga lista de patologías relacionadas con la edad y solo un 45% de los humanos que alcanza los 75 años con una buena calidad de vida. Existe una clara necesidad de desarrollar nuevas terapias eficaces para prevenir y tratar las complicaciones relacionadas con la edad con el fin de promover un envejecimiento saludable.

El envejecimiento es la consecuencia de la acumulación de una gran variedad de modificaciones moleculares y celulares a lo largo del tiempo que conduce a una disminución gradual de las capacidades físicas, metabólicas y mentales, así como a un mayor riesgo de enfermedad y muerte. En mamíferos, la mayoría de las patologías relacionadas con la edad, como la aterosclerosis, la diabetes mellitus, la sarcopenia y la esteatosis hepática, pueden derivarse de un inadecuado control metabólico. En este escenario, encontrar una molécula que mejore el control metabólico y promueva un envejecimiento saludable podría tener un gran impacto en los seres humanos en todo el mundo.

El Acetil-coenzima A (Ac-CoA) es un metabolito esencial que puede ser producido a partir de aminoácidos, ácidos grasos y carbohidratos. Esta pequeña molécula juega un papel clave en un gran número de procesos celulares esenciales, incluida la síntesis endógena de lípidos entre los que se encuentran el colesterol, los ácidos grasos y la coenzima Q. Además, la Ac-CoA es el donante universal de grupos acetilo para la acetilación de proteínas, una modificación postraduccional que controla la estabilidad, la localización y la función de las proteínas.

Por su parte, la ATP-citrato liasa (ACLY) es la enzima que cataliza la generación de Ac-CoA nuclear y citosólico, y oxaloacetato a partir de citrato en presencia de ATP y coenzima A.

ACLY se expresa de forma ubicua, aunque presenta una mayor expresión en tejidos lipogénicos (Chypreet al.,2012). ACLY es una enzima esencial, como lo demuestra la falta de viabilidad de los ratones homocigotosknockoutpara ACLY (Beigneuxet al.,2004). Sin embargo, los ratones heterocigóticos ACLYknockoutson sanos y fértiles y exhiben un metabolismo de lípidos normal. Estos resultados han avalado que una pérdida parcial de actividad de ACLY es compatible con una calidad de vida óptima (Beigneuxet al.,2004).

El papel central de la ATP-citrato liasa (ACLY) en la lipogénesis denovoha fomentado la necesidad de generar estrategias terapéuticas basadas en el uso de inhibidores farmacológicos como estrategia hipolipemiante del síndrome metabólico y el tratamiento del cáncer (Granchi, 2018). El uso de inhibidores de ACLY ha mostrado importantes efectos en la reducción de los niveles de colesterol circulante. Los estudios que utilizan administraciones a corto plazo de inhibidores de ACLY han mostrado resultados prometedores para frenar el crecimiento tumoral o mejorar los parámetros metabólicos en mamíferos (Pinkoskyet al.,2013). En este sentido, la investigación con ácido bempedoico desarrollada para el tratamiento de la dislipidemia y la enfermedad cardiometabólica, con un efecto dual: activador de Ampk (proteína quinasa activada por AMP) e inhibidor de ACLY (Pinkoskyet al.,2013), ha proporcionado resultados positivos en la reducción del colesterol de lipoproteínas de baja densidad en ensayos clínicos y actualmente se encuentra en el mercado. Sin embargo, se desconocen las consecuencias fisiológicas, así como los mecanismos moleculares que operan en la respuesta a la inhibición a largo de plazo de ACLY inducida farmacológicamente, y por ende la reducción de los niveles de Ac-CoA. Cabe esperar que una reducción de los niveles de Ac-CoA produzca, en principio, la inhibición de la síntesis endógena de ácidos grasos y colesterol y la promoción del estado desacetilado de las proteínas "acetilables".

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención propone la inhibición de ACLY con el fin de tratar trastornos metabólicos relacionados con la obesidad y con el envejecimiento no saludable.

En la presente invención se han evaluado las consecuencias fisiológicas y los mecanismos moleculares alterados en diferentes especies (levaduras, moscas y ratones) tratadas con el inhibidor ACLY SB-204990 (disponible comercialmente) y se ha demostrado que alarga significativamente la vida en levaduras y en moscas, aumentando marcadores de calidad de vida en moscas, demostrando así su potencial como agente geroprotector.

En la presente memoria el concepto de "agente geroprotector" o “sustancia geroprotectora” se define como agente terapéutico que inhibe el envejecimiento y las enfermedades o trastornos relacionados con la edad, y prolonga la vida de los individuos a los que se les suministra. El efecto geroprotector se caracteriza por la mejora del control metabólico y la promoción de un envejecimiento saludable, así como por la prevención del envejecimiento prematuro. Los compuestos o sustancias geroprotectoras tienen efectos en el origen del envejecimiento, interviniendo en el metabolismo de los individuos. En nuestro caso, la intervención en el metabolismo de levaduras, moscas y ratones, se produce mediante la inhibición de ACLY, que, como más adelante se muestra en la memoria y ejemplos, tiene efectos directos en la prevención de enfermedades relacionadas con la edad y retrasa en el envejecimiento, y finalmente, la muerte de los individuos. Se describen en la memoria los mecanismos de acción involucrados así como las vías celulares interconectadas que contribuyen al mantenimiento de la salud metabólica y el envejecimiento saludable.

Para determinar si la inhibición de ACLY a largo plazo puede proporcionar beneficios en la salud metabólica y la calidad de vida en los mamíferos, se han realizados experimentos a largo plazo (15 semanas) en ratones de tipo salvaje tratados con SB-204990. Los ratones han sido alimentados bien con una dieta estándar saludable (STD) o bien con una dieta alta en grasas (HFD) que promueve el envejecimiento no saludable y la muerte prematura.

Se debe tener en cuenta que la administración de una dieta alta en grasas (HFD) a los ratones objeto de este estudio tiene como propósito provocar de forma súbita las alteraciones para cuyo tratamiento se propone la inhibición de ACLY. Debido a las restricciones propias de los trabajos con ratones, partimos de poblaciones sanas a las que se les provoca en muy corto plazo de tiempo, a través de la dieta suministrada, enfermedades metabólicas, alteraciones en la capacidad funcional y en la salud neurocognitiva. A lo largo de la memoria, y en especial en lo referido a los ejemplos de realización, se debe entender que cuando nos referimos a individuos con dietas altas en grasas nos estamos refiriendo a individuos que presentan alteraciones metabólicas, en su capacidad funcional y en su salud neurocognitiva, provocadas todas ellas por el suministro de una dieta altas en grasas.

Estos tres aspectos, metabólico, funcional y cognitivo, dan cuenta de la salud global del individuo, y sus alteraciones son el objeto de tratamiento de la presente invención.

El efecto geroprotector de los inhibidores de ACLY, que se demuestra ampliamente a lo largo de los ejemplos de la invención, se traduce en su capacidad para restituir valores normales en los parámetros que determinan cada uno de esos aspectos de la salud global del individuo.

Así pues, cuando en los ejemplos de realización de la memoria hablamos de individuos sometidos a dietas altas en grasas se debe entender que nos referimos a individuos en los que se ha provocado, a través de la dieta suministrada, alternaciones:

- metabólicas; que se reflejan en parámetros medibles como los niveles en sangre de glucosa, insulina, piruvato, colesterol, ácidos grados HD, entre otros.

- en su capacidad funcional; que se reflejan en parámetros medibles como la fuerza, resistencia y coordinación motora.

- en su salud neurocognitiva; con especial atención a la memoria.

Por tanto, el ámbito de la invención no debe limitarse a los individuos que presentan dietas altas en grasas, sino que refiere a individuos con niveles patológicos o con valores fuera de los considerados saludables en cada uno de los parámetros que serán objeto de valoración a lo largo de los ejemplos y que aquí se mencionan brevemente.

Asimismo, cabe destacar que muchas de estas alteraciones metabólicas, funcionales y neurocognitivas, en condiciones no experimentales, se pueden deber no solo a una alimentación alta en grasas u otros hábitos de salud no saludables, sino que también aparecen asociados al envejecimiento. Individuos inicialmente sanos pueden desarrollar estas alteraciones debido al proceso de envejecimiento, con independencia de su dieta. Igualmente, existen otros múltiples factores que pueden desencadenar las alteraciones metabólicas, funcionales y neurocognitivas que son objeto de tratamiento con el inhibidor de ACLY, por lo que la invención no se restringe a ningún factor desencadenante concreto.

Así pues, los pacientes que pueden ser potencialmente tratados para contrarrestar las diferentes alteraciones metabólicas, funcionales, y neurocognitivas que se señalan en la presente invención, vendrán definidos por la presencia de niveles considerados patológicos, con valores fuera de los saludables, o de riesgo, para alguno de los siguientes parámetros: nivel de glucosa, nivel de piruvato, nivel de insulina, nivel de lipoproteínas de baja y muy baja densidad, nivel de colesterol y contenido de lípidos en el tejido hepático.

Los niveles que se consideran patológicos, fuera de lo normal o de riesgo para estos parámetros no son valores fijos. Estos valores se revisan a lo largo del tiempo debido al desarrollo propio de la práctica médica, varían en función de los métodos, test y condiciones de medición, y también en función de los diferentes grupos poblacionales, el sexo, la edad, y otras condiciones de los individuos, así como co-morbilidades o factores de riesgo añadidos. Por lo tanto, los conceptos de "valores normales” y "valores patológicos” deben entenderse en sentido amplio, sin constituir limitación alguna del ámbito de aplicación de la invención. Será en cada caso el personal médico quien determine si un individuo en concreto presenta alternaciones metabólicas, funcionales o neurocognitivas en función de los valores obtenidos en los diferentes tests de valoración de estos parámetros y por tanto se considera candidato para ser tratado con los inhibidores de ACLY de la presente invención.

Cuando nos referimos a alternaciones metabólicas hablamos también de enfermedades causadas de forma directa o indirecta por dichas alternaciones metabólicas, como son, a modo de ejemplo y no de forma exhaustiva, la diabetes o la enfermedad de hígado graso, así como otras condiciones que pueden suponer factores de riesgo para la salud, véase, sobrepeso, obesidad, aumento de peso corporal, aumento de la masa de tejido adiposo blanco o aumento del tamaño de los adipocitos.

A lo largo de los ejemplos de la invención se prueba la efectividad del tratamiento a largo plazo con inhibidores de ACLY en todos los parámetros que han sido objeto de estudio. El inhibidor de ACLY utilizado para los ejemplos de realización ha sido SB-204990. Otros inhibidores de ACLY, igualmente efectivos para su uso en el marco de la presente invención son: BMS 303141, ácido bempedoico, NDI-091143, ácido hidroxicítrico, ácido 2-furoico, Litarex y MEDICA16. Todos ellos pueden ser utilizados para inhibir ACLY de forma individual o en cualquiera de sus posibles combinaciones.

Los estudios llevados a cabo revelan que la tolerancia a la glucosa y la tolerancia al piruvato mejoraron en ratones alimentados con dieta tipo HFD tratados con el inhibidor ACLY SB-204990. El índice HOMA-IR, modelo homeostático para evaluar la resistencia a la insulina, fue más bajo, y las lipoproteínas de baja y muy baja densidad (LDL/VLDL), ambas aterogénicas, también fueron más bajas, lo que indica una mejora general en la salud metabólica. Por tanto, SB-204990 proporciona un beneficio terapéutico contra los trastornos metabólicos relacionados con la obesidad que predisponen a un envejecimiento no saludable.

Curiosamente, los ratones alimentados con una dieta saludable exhibieron una desregulación metabólica con una resistencia moderada a la insulina, reproduciendo ciertos efectos nocivos observados en ratones tratados con el agente geroprotector rapamicina.

Para realizar este estudio, tras 15 semanas de tratamiento con SB-204990, los ratones fueron sacrificados para analizar su hígado. En estos análisis, se ha determinado que las vías clave que regulan el envejecimiento en ratones se ven alteradas en los ratones tratados con el inhibidor de ACLY. Así pues, SB-204990 juega un papel importante en la regulación de la función mitocondrial, mientras que, sorprendentemente, no se observan alteraciones en la acetilación global de histonas y proteínas totales. Esta falta de diferencias en la acetilación de proteínas se explica por otro de los efectos fisiológicos de SB-204990, una reducción leve y sostenida de la actividad mitocondrial. Prueba de ello es que, tanto en cultivos primarios de hepatocitos tratados con SB-209440 en diferentes condiciones (acetato, citrato, glucosa alta y metformina, entre otros tratamientos), como en hígado de ratones tratados con SB-204990, SB-204990 aumenta la concentración de algunos lípidos y reduce la actividad metabólica mitocondrial. En ambos casos muestran niveles reducidos de Ampk fosforilada. SB-204990 al inhibir la ATP-citrato liasa (ACLY) reduce la actividad mitocondrial a través de la inhibición de Ampk. Se ha probado que los efectos en el aumento del contenido en lípidos y la actividad metabólica restringida se reducen si los hepatocitos se tratan simultáneamente con SB-204990 y metformina o AICAR (ambos activadores de Ampk). Estos resultados respaldan que la inhibición de ACLY actúa sobre la señalización de Ampk para modular el rendimiento mitocondrial.

Un primer aspecto de la invenciónrefiere a un inhibidor de la ATP-citrato liasa (ACLY), de ahora en adelante “inhibidor de ACLY de la invención”, para su uso como agente geroprotector en una población de pacientes que presenta niveles alterados, patológicos, o fuera de los considerados saludables, de uno o varios de los parámetros metabólicos seleccionados de la lista que consiste en: nivel de glucosa, nivel de piruvato, nivel de insulina, nivel de lipoproteínas de baja y muy baja densidad, nivel de colesterol y contenido de lípidos en el tejido hepático.

En una realización preferida de la invención, el inhibidor de ACLY de la invención es SB-204990, BMS 303141, ácido bempedoico, NDI-091143, ácido hidroxicítrico, ácido 2-furoico, Litarex, MEDICA16, o cualquiera de sus combinaciones.

Otro aspecto de la invenciónrefiere al inhibidor de ACLY de la invención, para su uso en el tratamiento de enfermedades metabólicas. En una realización preferida ese inhibidor es SB-204990, BMS 303141, ácido bempedoico, NDI-091143, ácido hidroxicítrico, ácido 2-furoico, Litarex, MEDICA16, o cualquiera de sus combinaciones.

En una realización más preferida, la enfermedad metabólica a tratar con el inhibidor de ACLY de la invención afecta a la tolerancia a la glucosa, al piruvato y/ o a la insulina.

En otra realización más preferida, la enfermedad metabólica a tratar con el inhibidor de ACLY de la invención afecta a los niveles en sangre de lipoproteínas de baja y muy baja densidad y/ o de colesterol.

En otra realización más preferida, la enfermedad metabólica a tratar con el inhibidor de ACLY de la invención afecta al contenido de lípidos en el tejido hepático.

En otra realización más preferida, la enfermedad metabólica a tratar con el inhibidor de ACLY de la invención cursa con aumento de peso corporal, aumento de la masa de tejido adiposo blanco y/o aumento del tamaño de los adipocitos.

En otra realización más preferida, la enfermedad metabólica a tratar con el inhibidor de ACLY de la invención se selecciona de la lista que consiste en diabetes e hígado graso.

Otro aspecto de la invenciónrefiere al inhibidor de la ACLY de la invención, para su uso en la mejora de la capacidad funcional. En una realización preferida, ese inhibidor es SB-204990, BMS 303141, ácido bempedoico, NDI-091143, ácido hidroxicítrico, ácido 2-furoico, Litarex, MEDICA16, o cualquiera de sus combinaciones.

En una realización más preferida, la mejora de la capacidad funcional refiere a la mejora en los resultados de pruebas que miden la fuerza, resistencia y/o coordinación motora de los individuos.

Otro aspecto de la invenciónrefiere al inhibidor de la ACLY de la invención, para su uso en la mejora de salud neurocognitiva. En una realización preferida, ese inhibidor es SB-204990, BMS 303141, ácido bempedoico, NDI-091143, ácido hidroxicítrico, ácido 2-furoico, Litarex, MEDICA16, o cualquiera de sus combinaciones. En una realización aún más preferida, el inhibidor de la invención es SB-204990.

En una realización más preferida, la mejora de salud neurocognitiva refiere a la mejora en los resultados de pruebas que miden la memoria de los individuos.

Una realización aún más preferida de la invención, refiere al inhibidor de ACLY de la invención para su uso en el tratamiento conjunto de dos o más de las enfermedades metabólicas, que afectan a la capacidad funcional o que afectan a la salud neurocognitiva, descritas previamente.

Otro aspecto de la invenciónrefiere a una composición que comprende los inhibidores de la ACLY de la invención, para su uso como agente geroprotector.

En una realización preferida, la composición además comprende un activador de Ampk.

En otra realización más preferida, el activador de Ampk es metformina y/o AICAR.

En otra realización aun más preferida, la composición es una composición farmacéutica.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: La inhibición farmacológica de ACLY usando SB-204990: efectos en ratones, levaduras y moscas.En ratones: (A) Peso corporal. (B) Peso del tejido. (C) OGTT. (D) Área bajo la curva (AUC) de la OGTT. (E) Niveles de insulina durante una OGTT. (F) AUC de los niveles de insulina durante una OGTT. (G) IPPTT. (H) AUC del IPPTT. (I) ITT. (J) AUC de la ITT. (K) Niveles de glucosa circulante a las 16 horas de ayuno. (L) Niveles de insulina circulante a las 16 horas de ayuno. (M) Índice de HOMA-IR. (N) Expresión del gen ACLY. En levaduras. (O) Vida útil cronológica de la levadura BY4741 de tipo salvaje tratada o no con 10 ^M SB-204990. En moscas: (P) Curva de supervivencia de Kaplan-Meier de moscas tratadas o no con SB-204990 10 ^M. (Q) Actividad espontánea durante el ensayo de longevidad en moscas tratadas o no con 10 ^M SB-204990.

SB: SB-204990. Ut: Sin tratar. a.u.: unidades arbitrarias. r.u.: unidades relativas. Los datos que se muestran son las medias ± SEM. En paneles A-N: * p< 0,05 Viejos vs. Jóvenes; # p< 0,05 Adulto vs Anciano; &p< 0,05 Joven vs. Adulto. En paneles O-Q: * p< 0,05 SB vs Ut.

Figura 2: Salud en ratones y vida útil en levaduras y moscas.En ratones: (A) Actividad hepática ACLY. En levaduras: (B) Vida útil cronológica de la levadura BY4741 de tipo salvaje tratada o no con 100 ^M SB-204990. En moscas: (C) Curva de supervivencia de Kaplan-Meier de moscas tratadas o no con 100 ^M SB-204990. (D) Curva de supervivencia de Kaplan-Meier de moscas tratadas o no con 1000 ^M SB-204990. (E) Actividad espontánea durante el ensayo de longevidad en moscas en el ensayo SB-204990 100 ^M.

(F) Actividad espontánea durante el ensayo de longevidad en moscas en ensayo SB-204990 1000 |<j>M.

SB: SB-204990. Ut: sin tratar. De nota: los datos de levadura y moscas sin tratar se comparten con la figura principal. Los datos que se muestran son las medias ± SEM. * p< 0,05 SB vs Ut o Viejo vs Joven.

Figura 3: Tratamiento a largo plazo con SB-204990 en ratones alimentados con HFD y con STD.(A) Evaluación farmacocinética de los niveles circulantes de SB-204990 en ratones expuestos a la administración oral (30 mg/kg de peso corporal) de SB-204990. (B) Peso corporal a lo largo del estudio. (C) OGTT en la semana 13 de tratamiento. (D) AUC de la OGTT. (E) IPPTT en la semana 9 de tratamiento. (F) AUC del IPPTT. (G) ITT en la semana 11 de tratamiento. (H) AUC de la ITT. (I) Niveles de insulina durante una OGTT en la semana 10 de tratamiento. (J) AUC de los niveles de insulina durante una OGTT. (K) Niveles de glucosa en ayunas de 24 horas en la semana 14 de tratamiento. (L) AUC de los niveles de glucosa durante el ayuno de 24 horas.

SB: SB-204990. STD: dieta estándar. HFD: dieta rica en grasas. a.u.: unidades arbitrarias. Los datos que se muestran son las medias ± SEM.* p< 0,05 tiempos diferentes vs tiempo 0 o STD-SB vs STD. # p< 0,05 HFD-SB vs HFD.

Figura 4: Efecto sobre la viabilidad y funcionalidad de SB-204990 en islotes pancreáticos primarios y hepatocitos.(A-C) Se aislaron hepatocitos primarios y se expusieron a diferentes concentraciones de SB-204990 durante 16 horas. (A) Determinación de la incorporación de glucosa en lípidos. (B) Análisis de muerte celular por ELISA. (C) Determinación de la producción de urea. (D-F) Los islotes pancreáticos primarios se aislaron y expusieron a diferentes concentraciones de SB-204990 durante 16 horas. (D) Análisis de muerte celular por ELISA. (E) Determinación de la actividad metabólica por ensayo MTT. (F) Determinación de la secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS). (G) Actividad de ACLY hepática. (H) Promedio de ingesta diaria de energía durante el transcurso del estudio. (I) Contenido de lípidos fecales en la semana 10 de tratamiento. (J) Ingesta de energía inducida por el ayuno en la semana 8 de tratamiento.

SB: SB-204990. STD: dieta estándar. HFD: dieta rica en grasas. Ut: sin tratar. Lg: glucosa baja. Hg: Glucosa alta. Glú: glucosa. r.u.: unidades relativas. Los datos que se muestran son las medias ± SEM. * p< 0,05 SB vs no tratado o STD-SB vs STD.

Figura 5: Salud física en ratones(A) Niveles de glucosa circulante en ayunas en la semana 14 de tratamiento. (B) Niveles de insulina circulante en ayunas en la semana 14 de tratamiento. (C) Índice HOMA-IR en la semana 14 de tratamiento. (D) Porcentaje de hemoglobina glucosilada (HbA1c) en sangre a la semana 15 de tratamiento. (E) Niveles de LDL/VLDL en suero en la semana 15 de tratamiento. (F) Niveles de colesterol total en suero en la semana 15 de tratamiento. (G) Tiempo hasta caer en un rotarod acelerado en la semana 8 de tratamiento. (H) Tiempo hasta caer en la prueba de suspensión en cable en la semana 10 de tratamiento. (I) Peso de tejido. (J) Imágenes representativas de tinción con hematoxilina y eosina en varios tejidos. Escala 200 ^m. (K) Área media de adipocitos.

SB: SB-204990. STD: dieta estándar. HFD: dieta rica en grasas. BAT: Tejido adiposo pardo. a.u.: unidades arbitrarias. Los datos mostrados son las medias ± SEM.* p< 0,05 STD-SB vs. STD. # p< 0,05 HFD-SB vs HFD.

Figura 6: Función neurocognitiva.Se evaluó la memoria espacial con el Laberinto de Barnes en la semana 12-13 de tratamiento. (A) Latencia al objetivo en el día 5. (B) Latencia al objetivo en el día 12. (C) Errores al objetivo en el día 5. (D) Errores al objetivo en el día 12. (E) Total de intentos de objetivo en el día 5. (F) Total de intentos de objetivo en el día 12.

SB: SB-204990. STD: dieta estándar. HFD: dieta rica en grasas. SKM: Músculo esquelético. Los datos que se muestran son las medias ± SEM. * p< 0,05 STD-SB vs STD. # p< 0,05 HFD-SB vs HFD.

Figura 7: Niveles hepáticos de acetilación de histonas.(A) Las células AML12 se cultivaron en condiciones estándar y se trataron con las dosis indicadas de acetato, citrato y SB-204990 durante 16 horas. La concentración de glucosa en condiciones basales es de 17 mM y suplementada es de 42 mM. Se realizaron aislamientos de histonas ácidas y los niveles de acetilación de histonas se analizaron mediante transferencia Western. Se muestran imágenes representativas de transferencias Western y tinción de Ponceau. (B) Se realizaron aislamientos de histonas ácidas y se analizaron los niveles de acetilación de histonas mediante transferencia Western en los hígados de ratones tratados o no con SB-204990 durante 15 semanas. Se muestran imágenes representativas de transferencias Western y tinción de Ponceau. (C) Se representa la cuantificación de los niveles de acetilación de histonas de varios residuos. (D) Se muestran imágenes representativas de transferencias Western de acetilación de lisina de proteína. Los marcadores de peso molecular se representan a la izquierda. (E) Cuantificación densitométrica de la acetilación hepática de la proteína lisina por Western blot. (F) Niveles totales de Ac-CoA en tejido hepático.

SB: SB-204990. STD: dieta estándar. HFD: dieta rica en grasas. Ac-Lys: Lisina acetilada. r.u.: unidades relativas. Los datos mostrados son las medias ± SEM* p< 0,05 STD-SB vs. STD. # p< 0,05 HFD-SB vs HFD.

Figura 8: Cuantificación de la acetilación de histonas en células AML12.Las células AML12 se cultivaron en condiciones estándar y se trataron con las dosis indicadas de acetato, citrato y SB-204990 durante 16 horas. La concentración de glucosa en condiciones basales es de 17 mM y suplementada es de 42 mM. (A) Se representa la cuantificación de los niveles de acetilación de histonas por transferencia Western de varios residuos.

SB: SB-204990. r.u.: unidades relativas. Los datos que se muestran son las medias ± SEM. * p< 0,05 frente a células no tratadas en las mismas condiciones de cultivo. SB-209440 no produjo alteraciones significativas en la acetilación de histonas.

Figura 9: SB-204990 modula el metabolismo de ácidos grasos, colesterol y fosfolípidos.(A) Ésteres de colesterol hepático. Chol-P: palmitato de colesterol. (B) Inmunotransferencias para Hmgcs y Gapdh de homogeneizados de hígado. (C) Análisis densitométricos de inmunotransferencias que se muestran en el panel E. (D) Ácidos grasos hepáticos. (E) Especies de triglicéridos hepáticos. P: ácido palmítico. O: ácido oleico. L: ácido linoleico. S: Ácido esteárico. (F) Análisis de metabolitos hidrofóbicos significativamente alterados por LC/MS. (G) Análisis de metabolitos hidrofílicos significativamente alterados por LC/MS.

SB: SB-204990. STD: dieta estándar. HFD: dieta rica en grasas. r.u.: unidades relativas. Los datos que se muestran son las medias ± SEM. * p< 0,05 STD-SB vs STD. # p< 0,05 HFD-SB vs. HFD.

Figura 10: Efectos mediados por SB-204990 en la función mitocondrial y la acumulación de lípidos.(A-F) Los hepatocitos primarios se trataron con SB-204990 en diferentes condiciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, los hepatocitos se trataron durante 16 horas con SB-204990 10 ^M. (A) Imágenes representativas de hepatocitos primarios teñidos con aceite rojo O tratados con SB-204990 10 ^M. Barra de escala 50 ^m. (B) Cuantificación de la tinción aceite rojo O de hepatocitos primarios tratados con 10 ^M SB-204990. (C-D) Cuantificación de la tinción aceite rojo O y determinación de la actividad metabólica mediante la prueba MTT en hepatocitos primarios tratados con 10 ^M SB-204990 en presencia de las dosis indicadas de acetato o citrato. La concentración de glucosa en condiciones basales es de 5 mM y suplementada es de 25 mM. (C) Tinción aceite rojo O. (D) Prueba MTT. (E) Tasa de consumo de oxígeno en hepatocitos primarios. (F) Tasa de acidificación extracelular en hepatocitos primarios. (G) Tasa de consumo de oxígeno de mitocondrias hepáticas recién aisladas de ratones alimentados con SB-204990. Las muestras de hígado se recogieron 3 horas después de la alimentación forzada. (H) Inmunotransferencias para proteínas hepáticas de ratones tratados con SB-204990 durante 15 semanas. La cuantificación densitométrica se muestra en la Figura S7E. (I-K) Los hepatocitos primarios se trataron con SB-204990 o no en presencia de metformina (500 ^M) durante 16 horas. (I) Imágenes representativas de hepatocitos primarios teñidos con aceite rojo O. Barra de escala de 50 ^m. (J) Cuantificación de la tinción Oil red O. (K) Cuantificación de la actividad metabólica por MTT.

STD: dieta estándar. HFD: dieta rica en grasas. SB: SB-204990. NS: no significativo. r.u.: unidades relativas. Los datos que se muestran son las medias ± SEM. Salvo que se indique lo contrario * p< 0,05 SB vs. Ut o LG-SB vs. LG. &p< 0,05 HGacetato vs acetato.

Figura 11: Efectos de SB-204990 en mitocondrias y estrés celular.(A) Imágenes representativas de hepatocitos primarios teñidos con aceite rojo O tratados o no con 10 ^M SB-204990 en presencia de acetato o citrato. Barra de escala 50 ^m. (B) Los hepatocitos primarios se trataron con SB-204990 o no en presencia de metformina (500 ^M) durante 16 horas. Se realizaron inmunotransferencias para Ampk total y fosforilada y cuantificaciones densitométricas. (C) Cuantificación densitométrica de proteínas hepáticas por transferencia Western de transferencias mostradas en la Figura 7H. (D) Los hepatocitos primarios se trataron con SB-204990 o no en presencia de AICAR, rapamicina, MHY1485, tetrahidrofolato o metotrexato durante 16 horas. Cuantificación de la tinción aceite rojo O y la actividad metabólica mediante la prueba MTT de hepatocitos primarios tratados con 10 ^M SB-204990 en presencia o no de los compuestos indicados. (E) Inmunotransferencias para proteínas hepáticas de ratones tratados con SB-204990 durante 15 semanas. (F) Cuantificación densitométrica de proteínas hepáticas por Western blot.

SB: SB-204990. STD: dieta estándar. HFD: dieta rica en grasas. SB: SB-204990. Metf: Metformina. Rapa: rapamicina, THF: ácido tetrahidrofólico, Metho: metotrexato. NS: No significativo. r.u.: unidades relativas. Los datos mostrados son las medias ± SEM.* p< 0,05 SB frente a Ut, SB-control frente a Ut-control o STD-SB frente a STD. # p< 0,05 SB-Ut-Metf frente a Ut-Metf o HFD-SB frente a HFD.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Ejemplo 1: Ensayos de longevidad en levadura y en Drosophila

Se realizaron ensayos de longevidad en levaduras y moscas con el objetivo de determinar si los inhibidores de ACLY podrían promover un envejecimiento más saludable y prolongar la vida de ambos. Los resultados se pueden observar en lasFigura 1O-P y Figura 2B-D.

Por un lado, se estudió la vida cronológica de la cepa BY4741 deSaccharomyces cerevisiae.Fue cultivada en medio completo de dextrosa sintética (SDC) que contiene glucosa al 2% con un exceso de 4 veces de los suplementos de triptófano, leucina, uracilo e histidina se midió como se describe Fabrizio y Longo, 2003; Mirisolaet al.,2014. La vida útil cronológica se controló en medio SDC caducado midiendo las unidades formadoras de colonias (UFC) cada 48-72 horas. Se consideró que el número de UFC en el día 3 era el 100 % de supervivencia inicial. La levadura se trató o no con SB-204990 en el día 0.

Para el estudio de la vida cronológica de Drosophila se usó el stock de moscas w1118 (#5905) del Bloomingtin Drosophila Stock Center. Las moscas se mantuvieron con alimento estándar de azúcar/levadura/ágar que contenía ágar de bajo punto de fusión (OmniPur® Agarose, Low Melting, CAS 9012-36-6, Merck) a 25°C en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas con una humedad constante del 60%. Los cruces de Drosophila pusieron huevos a 25°C y se permitió que las moscas experimentales adultas emergieran y se aparearan durante 1 día. Posteriormente, las moscas adultas se anestesiaron con CO2 y los machos se seleccionaron para los experimentos. Se utilizó una densidad de 8-10 moscas por vial para la evaluación de la vida útil. La actividad espontánea de las moscas en cada vial se registró cada hora usando la plataforma de Tracked.bio y se calculó el promedio de la actividad de 5 días. También se realizaron recuentos manuales de las moscas semanalmente para determinar la supervivencia. Los alimentos frescos se intercambiaban semanalmente.

SB-204990 (10 ^M), un inhibidor de ACLY promovió una esperanza de vida más larga en la levadura, similar al inhibidor de ACLY ácido hidroxicítrico (Baroniet al.,2020), y también en moscas (Figura 1O-P). Además, la actividad espontánea, que refleja la salud de las moscas, fue significativamente mayor al principio de su vida (Figura 1Q). Mayores concentraciones de SB-204990 (100-1000 ^M) no produjeron una extensión de la esperanza de vida en levaduras y moscas, mientras que la actividad espontánea aumentó en los estadios iniciales de los ensayos de supervivencia (Figura 2B-F).

Estos datos indican que el inhibidor de ACLY SB-204990 es eficiente para extender la esperanza de vida más allá de los límites evolutivos.

Ejemplo 2: Ensayos con ratones

Animales, dietas y tratamientos in vivo

Los experimentos con ratones fueron aprobados por el Comité de Animales de CABIMER y se realizaron de acuerdo con la ley española sobre uso de animales RD 53/2013 y la Directiva de la UE (2010/63/UE) para la investigación con animales. Se compraron ratones C57BL/6 macho de tipo salvaje de 8 semanas de edad. Los ratones se distribuyeron en cuatro grupos diferentes a las 26 semanas de edad y se iniciaron los tratamientos:

(1)STD:dieta estándar con alimento para roedores TD2914 (Envigo, Barcelona, España) con los siguientes porcentajes de distribución de calorías: 67% de carbohidratos, 20% de proteínas y 13% de grasas,

(2)STD-SB: STD 250 mg/Kg de SB-204990,

(3)HFD: una dieta alta en grasas sin colesterol con alimento para roedores TD.06414 (Envigo, Barcelona, España) con los siguientes porcentajes de distribución de calorías: 21,4 % de carbohidratos, 18,3 % de proteínas y 60,3 % de grasas (37% saturadas, 47% monoinsaturadas y 16% poliinsaturadas), y

(4)HFD-SB:HFD 250 mg/Kg de SB-204990.

En la semana 41 de vida, los ratones fueron sacrificados a las 16 horas de ayuno para los análisisex vivo.

El SB-204990 se compró a Tocris y Sreeni Labs Private Limited.

Pruebas metabólicas

Para eltest oral de tolerancia a la glucosa (OGTT), los ratones se mantuvieron en ayunas durante 6 horas y recibieron una dosis de glucosa (3 g/kg) por sonda.

Para laprueba de tolerancia al piruvato intraperitoneal (IPPTT),los ratones se mantuvieron en ayunas durante 6 horas y recibieron una inyección intraperitoneal de piruvato de sodio (2 g/kg).

Para laprueba de tolerancia a la insulina (ITT),los ratones se mantuvieron en ayunas durante 3 horas y recibieron una inyección intraperitoneal de insulina (1,5 UI/kg).

Para elíndice de evaluación del modelo homeostático de resistencia a la insulina (HOMA-IR), las determinaciones se realizaron a las 16 horas de ayuno. Para determinar los niveles de glucosa se tomaron muestras de sangre por venopunción utilizando un glucómetro Precision Xceed (Abbott, Madrid, España). La insulina se midió en plasma utilizando kits ELISA (Crystal Chem, Downers Grove, IL, EE. UU.).

Aislamiento de ARN y RT-PCR semicuantitativa

El ARN total se aisló de tejidos congelados utilizando el kit de extracción de ARN total easyblue (número 17061, iNtRON Biotechnology, Inc., Seongnam, Corea). La concentración y la calidad del ARN se determinaron con el espectrofotómetro NanoDrop® ND-100. Se utilizó ARN total (0,5-2 ^g) para sintetizar ADNc con el kit de síntesis de ADNc iScript™ (Bio-Rad Laboratories). La expresión de ARNm se calculó mediante el método 2-AACT y se normalizó a la expresión de Rps29.

Actividad de ACLY

La actividad de ACLY se determinó como se describe en MacDonaldet al.,2013. El tejido hepático se lisó en manitol 220 mM enfriado con hielo, sacarosa 70 mM, tampón HEPES de potasio 5 mM, pH 7,5 que contenía ditiotreitol 1 mM. Los lisados se centrifugaron a 600 xgdurante 10 minutos para precipitar los núcleos y los desechos. Luego, el sobrenadante se centrifugó a 5500 xgdurante 10 minutos para precipitar la fracción mitocondrial y luego el sobrenadante se centrifugó a 20000 xgdurante 20 minutos para generar una fracción citosólica utilizada para medir la actividad enzimática. La actividad enzimática se midió en citrato 5 mM, coenzima A 0,3 mM, ATP 3 mM, NADH 0,15 mM, MgCl210 mM, ditiotreitol 10 mM y malato deshidrogenasa 6 unidades/ml en tampón Tris cloruro 100 mM, pH 8,5 a 37°C. La desaparición de NADH se controló a 340 nm durante 1 minuto para el fondo, después de lo cual se añadió citrato 5 mM para determinar la actividad de ACLY.

Aislamiento primario de hepatocitos

Los hepatocitos primarios se aislaron de los hígados de ratones macho de tipo salvaje como se describe en López-Noriegaet al.,2019, con modificaciones menores. Los hígados se perfundieron con solución salina equilibrada de Hank (KCl 5,33 mM, KH2PO4 0,44 mM, Na2HPO4 0,34 mM, NaCl 138 mM, NaHCO3 4,17 mM y HEPES 25 mM) que contenía glucosa 5 mM complementada con EGTA 0,5 mM y HEPES 25 mM (pH 7,4 a 37°C) utilizando una bomba peristáltica CTP100 (ThermoFisher). Una vez que se perfundió el hígado, la solución de perfusión se cambió a DMEM (Sigma-Aldrich D5546) suplementada con 100 U/mL de penicilina y 0,1 mg/mL de estreptomicina (pen-strep), 10 mM de HEPES y 100 U/mL de colagenasa (tipo IV, Worthington). Las células se liberaron del hígado y la suspensión celular se filtró usando un filtro de células 70 ^M y se centrifugó a 50 g x 2 minutos 3 veces. Los sedimentos celulares se resuspendieron en DMEM (Sigma-Aldrich D5796) complementado con penstrep, HEPES 10 mM, dexametasona 10 nM, l-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM y suero bovino fetal al 10 % (FBS) y se sembraron en placas recubiertas previamente con colágeno. I (Sigma-Aldrich St. Louis, MO, EE. UU.). 60 minutos después de la siembra, el medio se cambió a DMEM (Sigma-Aldrich D5546) complementado con pen-strep, HEPES 10 mM, dexametasona 100 nM y FBS al 10%. El medio se cambió 3 horas más tarde a DMEM sin suero (Sigma-Aldrich D5546) complementado con pen-strep, HEPES 5 mM, dexametasona 10 nM, l-glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM y las células se cultivaron durante un máximo de 16 horas para varios experimentos.

Obtención y cultivo de islotes pancreáticos

Los islotes pancreáticos se aislaron de ratones de tipo salvaje mediante perfusión de colagenasa intraductal como se describe en Jimenez-Morenoet al.,2015. Los islotes se cultivaron durante 16 horas en RPMI 1640 suplementado con FBS al 10 %, pen-strep, glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM, p-mercaptoetanol 50 ^M y HEPES 10 mM.

Incorporación de glucosa en lípidos

La incorporación de glucosa a los lípidos se determinó en hepatocitos primarios, como se describe en Martin-Montalvoet al.,2016, con modificaciones menores. Los hepatocitos primarios se sembraron en placas de cultivo de 12 pocillos a razón de 2,5 x 105 células por pocillo y se incubaron durante 16 horas en las diferentes condiciones experimentales. Después de una preincubación de 60 minutos en HEPES 20 mM, pH 7,4, NaCl 114 mM, KCl 4,7 mM, KH2PO4 1,2 mM, MgSO4 1,16 mM, CaCl22,5 mM, glucosa 3 mM y albúmina de suero bovino libre de ácidos grasos al 1% a 37°C, las células se trataron con 30.000 cpm de [3-3H] glucosa (0,5 Ci/mol, Perkin Elmer NET331C005MC) y las placas se sellaron con una película adhesiva óptica. La incubación se terminó 2 horas después añadiendo 1 ml de solución salina tamponada con metanol:fosfato (PBS) (2:3) a las células. Las células se recogieron con pipeteo suave, se centrifugaron a 700 ×gy se lavaron dos veces con PBS. Se añadieron 200 μl de NaCl 0,2 M al sedimento celular y la mezcla se congeló inmediatamente en N2 líquido. Las muestras se descongelaron y se añadió una mezcla compuesta por 750 μl de CHCl3:metanol (2:1) y 50 μl de KOH 0,1 N por muestra. Luego, se aplicó un vortex vigoroso y las fracciones lipídica y acuosa se separaron por centrifugación a 2000 ×gdurante 20 minutos. La capa acuosa superior se descartó y la capa soluble en lípidos inferior se lavó con 200 μl de metanol:agua:CHCl3 (48:47:3). Se transfirieron alícuotas (200 μl) de la fase soluble en lípidos a viales de centelleo y se cuantificaron los lípidos radiomarcados utilizando un cóctel de centelleo líquido (Perkin Elmer).

Muerte celular

La muerte celular se evaluó por ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Sigma-Aldrich 115446775001). La densidad óptica a 405 nm frente a la referencia de 490 nm se determinó con un espectrofotómetro Varioskan Flash (Thermo Scientific). En el caso de los hepatocitos primarios, las células se sembraron en placas de 12 pocillos. En el caso de los islotes pancreáticos se utilizaron 10 islotes por pocillo.

Prueba MTT

La prueba MTT (análisis colorimétrico para medir la actividad de enzimas celulares) se realizó utilizando el Cell Proliferation Kit I según las recomendaciones del fabricante (Roche, España). La densidad óptica se determinó a 575 nm con una longitud de onda de referencia de 690 nm utilizando un espectrofotómetro Varioskan Flash (Thermo Scientific, España). En el caso de los hepatocitos primarios, las células se sembraron en placas de 12 o 24 pocillos. En el caso de los islotes pancreáticos se utilizaron 35 islotes por pocillo.

Prueba de urea

La producción de urea se determinó en hepatocitos primarios, como se describe en Yeet al.,2017, con modificaciones menores. Los hepatocitos primarios de ratones de tipo salvaje se sembraron en placas de 12 pocillos a una densidad de 3 × 10<5>células por pocillo y se incubaron durante 16 horas en las diferentes condiciones experimentales. Luego, se reemplazó el medio y se midió la producción de urea después de 2 horas usando los kits MAK006 según las instrucciones del fabricante (Sigma-Aldrich St. Louis, MO, EE. UU.) usando un espectrofotómetro Varioskan Flash (Thermo Scientific).

Secreción de insulina estimulada por glucosa

Se lavaron grupos de 10 islotes pancreáticos en 500 ^L de tampón Krebs-Ringer bicarbonato-HEPES (KRBH) (NaCl 140 mM, KCl 3,6 mM, NaH<2>PO<4>0,5 mM, MgSO<4>0,5 mM, CaCl21,5 mM, NaHCO32 mM, HEPES 10 mM, BSA al 0,1 %) y preincubado a 37°C durante 45 minutos en 300 μl de KRBH. Luego se centrifugaron los islotes y se descartó el tampón KRBH. Posteriormente, se añadió KRBH fresco suplementado con glucosa 2,2 mM y los islotes se incubaron durante 30 minutos. A continuación, se recogió el tampón (secreción de insulina basal) y se añadieron 500 ^L de KRBH complementado con glucosa 22 mM. Los islotes se incubaron durante 30 minutos a 37°C y luego se recogió el tampón (secreción de insulina estimulada). Los niveles de insulina se midieron utilizando un kit ELISA de insulina de ratón de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Crystal Chem).

Estudios farmacocinéticos

Los ratones de tipo salvaje recibieron una sonda oral SB-204990 (30 mg/kg de peso corporal) y se recogieron muestras de suero en diferentes momentos. El SB-204990 en las muestras de suero se cuantificó mediante un método de cromatografía y espectrometría de masas. Se agregaron 150 μl de acetonitrilo que contenía ácido 2,4,diclorohidrocinámico (estándar interno) a 50 μl de muestras de suero, que se mezclaron en vórtex y se centrifugaron a 20000 xga 4°C durante 15 minutos. Se transfirió 110 μl de sobrenadante al vial del muestreador automático para su análisis.

Los experimentos cromatográficos se llevaron a cabo en un sistema HPLC Agilent 1290 (Agilent, CA). La separación de SB-204990 se realizó utilizando una columna C18 Supelco de 50 x 2,1 mm y 3 ^m configurada a 4°C. La fase móvil consistió en agua/acetonitrilo 90/10 con 0,1% de ácido fórmico como componente A y acetonitrilo/agua 90/10 con 0,1% de ácido fórmico como componente B utilizando un gradiente lineal. El análisis de espectrometría de masas se realizó usando el sistema de espectrómetro de masas modelo API 4000 de Applied Biosystems/AB Sciex. Los datos fueron adquiridos y analizados usando Multiquant 2.1.1. (Sciex). Los datos negativos de ionización por electropulverización se adquirieron usando monitoreo de reacciones múltiples (MRM). Los estándares se caracterizaron usando las transiciones MRM (389/329) para SB-204990 y (218,9/174.8) 2,4, diclorohidrocinámico. Los ajustes instrumentales fueron 500°C y 4500 V y los ajustes de parámetros compuestos para la energía de colisión fueron -24eV para SB-204990 y -16eV para 2,4,didorohidrocinámico.

Laberinto de Barnes

El método se realizó de acuerdo con lo indicado en Patilet al.,2009. En la prueba previa, los ratones fueron entrenados para ingresar a la caja de escape, guiándolos. Los ratones permanecieron en la caja durante 2 minutos. Luego, se iniciaron las pruebas de entrenamiento (4 días). Los ratones se entrenaron cuatro ensayos por día y los ensayos se separaron por 15 minutos. Se permitió a los ratones explorar el laberinto durante un máximo de 3 minutos y se los guió hasta la caja de escape. Una vez que los ratones entraron en la caja, se apagó el timbre y los ratones permanecieron en la caja durante 1 minuto. Al día siguiente, los sujetos recibieron una prueba de prueba durante 90 segundos para determinar la memoria de retención corta. Durante los intentos de prueba se retiró la caja de escape. Se registraron la latencia primaria y los intentos totales. Sin más entrenamiento, 7 días después, los ratones fueron probados en otra prueba durante 90 segundos para determinar la memoria de retención a largo plazo.

Contenido de lípidos fecales

La extracción de lípidos de 1g de heces secas se realizó mediante cloroformo-metanol como se describe en Hara y Radin, 1978.

Hemoglobina glicosilada

Los niveles de HbA1c se determinaron en muestras de sangre según el protocolo del fabricante (Crystal Chem).

Determinaciones de colesterol y LDL/VLDL

El colesterol y las lipoproteínas de baja densidad/muy baja densidad (LDL/VLDL) en suero se determinaron con el kit de ensayo EnzyChrom (BioAssay Systems, E2HL-100), según las instrucciones del fabricante.

Rotarod

Los resultados de las pruebas de rotarod se presentan como el tiempo que tardan los ratones en caer de un rotarod en aceleración (4 a 40 rpm durante 5 minutos). A los ratones se les dio una prueba de habituación de 1 minuto a 4 rpm el día anterior al experimento. Los resultados que se muestran son los promedios de tres ensayos por ratón (Soriaet al.,2019).

Prueba de suspensión en cable

Para la prueba de suspensión en cable, se permitió a los ratones agarrar un cable horizontal de 1 mm con cuatro patas hasta 60 segundos y se determinó la latencia para caer del cable. Se realizaron tres ensayos diferentes con cada ratón y los resultados que se muestran son los promedios de los tres ensayos (Soriaet al.,2019).

Histoquímica y citoquímica

Los tejidos disecados y los cultivos celulares se fijaron en paraformaldehído al 4%. Las secciones de tejido (5 ^m de espesor) se desparafinizaron y rehidrataron como se describe en López-Noriegaet al.,2019. Para la tinción con hematoxilina y eosina, las secciones se sumergieron en hematoxilina (Merck) y eosina (Merck) durante 4 y 2 minutos, respectivamente. La evaluación del contenido de lípidos se realizó mediante tinción con aceite rojo O. La cuantificación del contenido de lípidos se realizó después de la solubilización de isopropanol a 510 nm. El estudio histológico de los cortes teñidos se realizó con un microscopio Leica DM6000B equipado con cámara DFC390 (Leica, Barcelona, España) y un Olimpus IX71 con cámara Olimpus DP70 (Olimpus). El tamaño de los adipocitos se cuantificó con el software ImageJ (NIH).

Cultivo de células AML12

Las células de hígado de ratón alfa 12 (AML12) se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) y se mantuvieron y propagaron en DMEM/mezcla de nutrientes F-12 Ham con suero bovino fetal al 10%, suplemento de medios líquidos ITS (Sigma-Aldrich) y dexametasona 0,1 ^M. Para los experimentos, las células se expusieron a FBS dializado al 10% en DMEM/mezcla de nutrientes F-12 Ham que contenía glucosa 17 mM y se trataron con glucosa adicional (hasta 42 mM), citrato, acetato y SB-204990 durante 16 horas. Las muestras se congelaron instantáneamente y se mantuvieron a -80°C hasta su procesamiento.

Extracción de histonas ácidas

Se cortaron sedimentos de células AML12 (2 x 106 células) y muestras de hígado en trozos pequeños (60-70 mg) y se transfirieron a un tubo Eppendorf. Posteriormente, 1 ml de Triton Extraction Buffer (TEB; PBS que contiene 0,5 % Tritón X 100 (v/v), 0,02 % (p/v) NaN3) inhibidores (Tricostatina 10 ^M, nicotinamida 10 mM, butirato de sodio 50 mM, con inhibidores de proteasa y fosfatasa P0044, P5725, P8340) por 200 mg de tejido/1 x 107 células, y las muestras se homogeneizaron. Luego, los lisados se incubaron en rotación durante 10 minutos a 4°C y la mezcla se centrifugó a 2000 rpm durante 10 minutos a 4°C. Se eliminó el sobrenadante y el sedimento se resuspendió en 100 μl de HCl 0,2 N y se incubó en rotación durante la noche a 4°C. Posteriormente, las muestras se centrifugaron a 2000 rpm durante 10 minutos a 4°C y el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo. A continuación, el HCl se neutralizó con NaOH 0,2 N y las muestras se almacenaron a -80°C hasta su uso.

Western blot

Para el aislamiento de proteínas totales, las muestras se lisaron en tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, Na2EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, NP-40 al 1 %, desoxicolato de sodio al 1 %, pH 7,5) con proteasa, fosfatasa e inhibidores de desacetilasa P0044, P5725, P8340 y SC-362323. Las transferencias Western se realizaron de acuerdo con métodos estándar, que implicaron en ciertos casos la separación de la membrana y la incubación con un anticuerpo primario de interés, seguido de la incubación con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante y quimioluminiscencia mejorada. Los blots se cuantificaron con ImageJ, y las bandas de interés se normalizaron a la tinción de Ponceau S, p-actina y/o Gapdh, como se validó previamente en Jimenez-Gomezet al.,2013.

Determinación de Ac-CoA

Ac-CoA se determinó utilizando el kit MAK039 siguiendo las instrucciones del fabricante (Sigma-Aldrich).

Metabolómica no dirigida

La extracción de metabolitos se realizó en tejidos congelados usando 400 ^L de MeOH:agua (8/1, v:v). Después del vortex, las muestras se sometieron a cinco ciclos repetidos de congelación y descongelación y se mantuvieron en hielo durante 1 hora. Luego, las muestras se centrifugaron (10 min, 15.200 rpm a 4°C) y se transfirieron 100 ^L y 250 ^L de sobrenadante a viales de automuestreador para la respectiva cromatografía líquida/espectrometría de masas (LC/MS) y cromatografía de gases/espectrometría de masas (GC/MS).

Para la LC/MS y MS/MS, las muestras se inyectaron en un sistema UHPLC (1290 Agilent) acoplado a un espectrómetro de masas cuadrupolo de tiempo de vuelo (QTOF) (6550 Agilent Technologies) operado en modo de ionización electrospray positivo (ESI+) y electrospray negativo (ESI-). Los extractos de tejido se separaron utilizando un Waters Acquity UPLC BEH HILIC (1,7 ^m, 2,1 x 150 mm). El sistema disolvente fue A = acetato de amonio 50 mM en agua y B = acetonitrilo/agua con acetato de amonio 50 mM. La elución de gradiente lineal utilizada comenzó con 95% de A (tiempo 0-2 min) y finalizó con 95% de B (9,5 min). El volumen de inyección fue de 2 ^L. Las condiciones de ESI fueron temperatura del gas de 150°C, gas de secado de 11 L/min, nebulizador de 35 psig, fragmentador de 120 V y skimmer de 65 V.El instrumento se configuró para adquirir en el rango m/z 50-1200 con una tasa de adquisición de 3 espectro/s. MS/MS se realizó en modo dirigido, con un ancho iso predeterminado (el ancho medio máximo del paso de banda de masa cuadripolar utilizado durante el aislamiento del precursor MS/MS) de 1,3 m/z (estrecho). La energía de colisión se fijó en 10, 20, 30 y 40 V.

Para el análisis de GC/MS, las muestras se secaron bajo una corriente de gas N2 y se liofilizaron antes de la derivatización química con 40 ^L de metoxiamina en piridina (30 ^g/mL) durante 45 minutos a 60°C. Posteriormente, las muestras se sililaron utilizando 25 ^L de N-metil-Ntrimetilsililtrifluoroacetamida con trimetilcorosilano al 1% (Thermo Fisher Scientific) durante 30 minutos a 60°C para aumentar la volatilidad de los metabolitos. Se utilizó un sistema GC 7890B acoplado a un espectrómetro de masas 7250 QTOF (Agilent Technologies) para el análisis GC-MS. Las muestras derivatizadas (1 ^L) se inyectaron en el sistema de cromatografía de gases equipado con una columna de fase estacionaria Agilent 19091S-433UI HP5-ms Ultra Inert 86 (30 m x 0,25 mm x 0,25 ^m). Se utilizó helio como gas portador a un caudal de 1,5 ml/minuto en modo de flujo constante. El gradiente de temperatura utilizado fue: de 70 a 190°C a una velocidad de calentamiento de 11°C/m, y de 190°C a 325°C a 21°C/min, manteniendo finalmente durante 4 minutos. La ionización por impacto de electrones se realizó a 70 eV y la temperatura de la fuente se fijó en 230°C. Los espectros de masas se registraron después de un retraso del disolvente de 3 minutos, con el analizador adquiriendo en modo MS de barrido completo a una velocidad de 5 barridos/s dentro de un rango de masas de 35-700 m/z. Al momento de la adquisición, los archivos sin procesar de proveedores propietarios de LC/MS se convirtieron al formato estándar abierto mzML utilizando Proteowizard MS-convert y posteriormente se procesaron con el software XCMS (versión 3.10.2). El análisis XCMS de estos datos proporcionó una matriz que contenía el tiempo de retención, el valor m/z y el área de pico integrado para características alineadas entre muestras (una característica que se define como una entidad molecular con una m/z única y un tiempo de retención específico). Se usaron muestras de control de calidad para tener en cuenta la variación analítica.

En los experimentos de LC/MS, las características significativamente modificadas por SB-204990 en STD y HFD se priorizaron para la identificación de MS/MS en modo específico. Los metabolitos se identificaron de acuerdo con el Nivel 2, según lo especificado por Schymanskiet al.,2014 ya que sus espectros MS/MS experimentales y de masa exactos coinciden con el patrón de fragmentación de los estándares químicos de las bases de datos METLIN, MassBank y/o NIST17. Para los análisis de GC/MS, los datos de GC/MS sin procesar se convirtieron al formato mzXML utilizando Proteowizard MS-convert. La deconvolución de datos posterior y la alineación se realizaron utilizando eRah y la identificación de metabolitos se llevó a cabo comparando los espectros de fragmentos con los espectros compuestos presentes en la base de datos Golm y las bibliotecas NIST17 .El procesamiento de datos se realizó en las versiones R 3.6.1 y 4.0.3 (R-Foundation for Statistical Computing, www.Rproject.org).

Análisis de lípidos hepáticos

Los lípidos hepáticos se extrajeron de ~20 mg de tejido usando hexano-isopropanol como se describe en Hara y Radin, 1978. Las muestras fueron analizadas por GLC como se describe en Martinez-Forceet al.,2004. Se obtuvieron ésteres metílicos de ácidos grasos (FAMES) a partir de lípidos aislados calentando las muestras a 80°C durante 1 hora en 3 ml de metanol/tolueno/H2SO4 (88:10:2 v/v). Se añadió ácido heptadecanoico (1/10 p/p) a cada muestra como estándar interno para permitir la cuantificación. Después de enfriar, se añadió 1 ml de heptano y se mezclaron las muestras. Los FAMES se recuperaron de la fase superior y luego se separaron y cuantificaron utilizando un cromatógrafo de gases Hewlett-Packard 5890A (Palo Alto, CA, EE. UU.) con una columna capilar Supelco SP-2380 de sílice fundida (30 m de longitud, 0,25 mm de espesor de la película) (Bellefonte, PA, EE. UU.).Se utilizó hidrógeno como gas portador, con una tasa de gas lineal de 28 cm/s. Las temperaturas del detector e inyector se fijaron a 220°C y el horno a 170°C, con una relación de división de 1:50. Los ácidos grasos se identificaron utilizando estándares (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.). Los triacilglicéridos y los ésteres de colesterol se separaron y cuantificaron por GLC como se describe en Fernandez-Moyaet al.,2000 con un cromatógrafo de gases Agilent 6890 (Palo Alto, CA, EE. UU.). Se añadió ácido triheptadecanoico a las muestras como estándar interno para la cuantificación. Las temperaturas tanto del inyector como del detector fueron de 380°C, la temperatura del horno de 345°C y se aplicó un gradiente de presión de cabeza de 70 a 120 kPa, cambiando este último parámetro dependiendo de la columna. La columna capilar de cromatografía de gases era una J & W Scientific DB-17HT (15 m de longitud, 0,25 mm de d.i., 0,15 ^m de espesor de película) (Folsom, CA, EE. UU.), con una tasa de gas lineal de 50 cm/s, la relación de división era 1:80, y el detector era un detector de ionización de llama (FID). Se identificaron los diferentes triacilglicéridos y ésteres de colesterol respecto a muestras conocidas, y se corrigió la respuesta FID. Los lípidos polares se analizaron y cuantificaron por HPLC. La separación por HPLC se llevó a cabo en un Módulo Waters 2695 (Milford, MA) equipado con un Waters 2420 ELSD. La columna utilizada fue una Lichrospher 100 Diol 254-4 (5 ^m; Merck) aplicando un método basado en un gradiente lineal binario de mezclas de disolventes que contenían diferentes proporciones de hexano, 2-propanol, ácido acético, agua y trimetilamina. El flujo fue de 1 ml/min, los datos se procesaron con el software Empower y el ELSD se calibró regularmente con estándares comerciales de alta pureza para cada lípido.

Consumo de oxígeno y ECAR

Para estudiar la bioenergética mitocondrial en hepatocitos primarios, las células se midieron utilizando un analizador de flujo extracelular XF24 (Agilent). Después de 16 horas de tratamiento, las células se lavaron con medio de ensayo Seahorse (Seahorse Bioscience), que se complementó con glucosa a 10 mM, piruvato a 1 mM y glutamina a 2 mM, pH 7,2.Las células se incubaron en una incubadora sin CO2 a 37°C durante 1 hora. Luego, se midieron la tasa de consumo de oxigeno (OCR) y la tasa de acidificación extracelular (ECAR). Se determinaron OCR y ECAR en condiciones basales y mediante inyecciones consecutivas de oligomicina (4 ^M) en el minuto 27, cianuro de carbonilo 4- (trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP; 2 ^M) en el minuto 52, rotenona (1 ^M) en el minuto 78 y antimicina A (5 ^M) en el minuto 104. Se determinaron las tasas de OCR en mitocondrias de hígado fresco en muestras de ratones expuestos a una sonda oral de SB-204990 (30 mg/kg de peso corporal) siguiendo el protocolo de mitocondrias aisladas de Agilent. En resumen, 3 horas después de la sonda, se extrajo el hígado y el lóbulo cuadrado se transfirió a un tubo de disociación GentleMACS™ con 5 ml de tampón MSHE enfriado con hielo (sacarosa 70 mM, manitol 210 mM, HEPES 5,0 mM, EGTA 1,0 mM, 0,5 % (p/v) libre de ácidos grasos-BSA, pH 7,2). Posteriormente, el tejido se homogeneizó en un disociador de tejido GentleMACS bajo el protocolo de ciclo de aislamiento de tejido de ratón-mito. Las muestras frescas se filtraron dos veces a través de un filtro de malla de 40 ^m y finalmente a través de un filtro de malla de 10 ^m. El filtrado se centrifugó a 9000gdurante 10 minutos a 4°C y el sedimento se resuspendió en 200 μl de MSHE sin BSA enfriado con hielo para cuantificar el contenido de proteína. Luego, se añadió BSA libre de ácidos grasos al 0,5% (p/v) y las muestras se diluyeron en tampón MAS tibio (37°C) (sacarosa 70 mM, manitol 220 mM, KH2PO410 mM, MgCl2 5 mM, HEPES 2 mM, EGTA 1 mM, succinato 10 mM, rotenona 2 ^M, BSA libre de ácidos grasos al 0,5% (p/v), pH 7,2). Se sembraron 5 ^g de mitocondrias por pocillo en placas Seahorse y las placas se centrifugaron a 2000gdurante 20 minutos a 4°C utilizando un adaptador de microplacas de cubeta oscilante. La OCR se determinó mediante inyecciones consecutivas de ADP (4 mM) en el minuto 13, oligomicina (3,16 ^M) en el minuto 20, FCCP (4 ^M) en el minuto 26 y antimicina A (4 ^M) en el minuto 31.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó utilizando SigmaPlot 12.0 (SigmaPlot, Barcelona, España) y GraphPad prism 7 (GraphPad Software Inc, San Diego, CA). Se utilizaron diferentes pruebas estadísticas basadas en el número de grupos y recomendaciones de los estadísticos SigmaPlot 12.0 y GraphPad prism 7. Las pruebas estadísticas incluyen ANOVA de una vía, ANOVA de dos vías y prueba de student's t-test. En todos los casos se incluyeron al mentos 3 replicas biológicas en la experimentación. Los datos se muestran como medios ± SEM. La significación se reporta en p < 0.05.

Resultados

SB-204990 extiende la esperanza de vida y la salud

Para definir los cambios metabólicos dependientes de la edad que contribuyen a promover los procesos de envejecimiento, así como a causar una muerte prematura, evaluamos diferentes parámetros de la homeostasis de la glucosa en ratones sanos de diferentes edades alimentados con una dieta estándar (STD). El peso corporal y el peso de varios tejidos fue mayor en ratones adultos y viejos (Figura 1A-B). La evaluación de la tolerancia a la glucosa oral indicó la ausencia de alteraciones importantes dependientes de la edad en los niveles de glucosa o insulina durante las pruebas llevadas a cabo en ratones jóvenes y viejos. Sin embargo, se observaron diferencias significativas específicamente en ratones adultos frente a viejos en los niveles de insulina circulante (Figura 1C- F).El análisis de la tolerancia al piruvato y la sensibilidad a la insulina indicó una capacidad reducida para promover la gluconeogénesis hepática, así como una resistencia severa a la insulina en ratones de edad avanzada (Figura 1G-J). En condiciones de ayuno, los ratones viejos exhibieron hiperinsulinemia, mientras mantuvieron la normoglucemia, produciendo un mayor índice de evaluación del modelo homeostático de resistencia a la insulina (Homa-IR) (Figura 1K-M). Estos datos indicaron que los efectos más destacados del envejecimiento implican un deterioro de la funcionalidad en los tejidos diana de la insulina en el control del metabolismo de la glucosa.

A continuación, nos enfocamos en determinar si los niveles de expresión de ACLY podrían contribuir a los cambios mencionados en el metabolismo de la glucosa en los tejidos metabólicos de formadependiente de la edad.

Los ratones viejos exhibieron mayores niveles de expresión de ACLY y de actividad enzimática en el hígado (Figura 1N y Figura 2A). Estos datos respaldan el importante papel del ACLY hepático en el envejecimiento y corroboran que restringir la expresión y/o la actividad de ACLY podría refrenar los procesos de envejecimiento intrínsecos.

SB-204990 mejora la función metabólica y física en ratones alimentados con una dieta alta en grasas (HFD)

En condiciones fisiológicas, ACLY ha sido propuesto como el principal productor de Ac-CoA citosólico (Pietrocolaet al.,2015). El Ac-CoA citosólico se usa para la producción de lípidos endógenos y para la producción de malonil-coenzima A, un inhibidor de la carnitina palmitoiltransferasa I necesaria para la absorción de ácidos grasos en la mitocondria (Schlaepfer y Joshi, 2020).

Se midió la incorporación de [H3]-glucosa radiomarcada en lípidos para evaluar indirectamente la liponeogénesis en hepatocitos primarios aislados de ratones macho de tipo salvaje. Los resultados indicaron que SB-204990 provoca una inhibición, dependiente de la dosis, de la lipogénesisde novodependiente de la glucosa (Figura 4A). La muerte celular medida a través de ELISA y la secreción de urea indicaron que la toxicidad ocurre en concentraciones superiores a 10 ^M, con una marcada toxicidad a 100 ^M (Figura 4B-C). Los experimentos en islotes pancreáticos primarios aislados de ratones de tipo salvaje indicaron una menor susceptibilidad a las alteraciones promovidas por SB-204990 en las pruebas funcionales y de viabilidad en comparación con los hepatocitos (Figura 4D-F).

En conjunto, estos resultados muestran que la inhibiciónin vitrode la biosíntesis de ácidos grasos mediada por la inhibición de SB-204990 de ACLY se puede lograr en concentraciones no tóxicas (es decir, ~10 ^M).

Se realizaron estudios farmacocinéticos para determinar los niveles circulantes de SB-204990 tras la administración oral en ratones. Los resultados indicaron que una dosis única de 30 mg/kg de peso corporal de SB-204990 generó una concentración plasmática de ~ 4 ^M 2 horas después de la ingestión, en el rango de concentraciones no tóxicas utilizadas en estudiosin vitroy en dosis que prolongaron la esperanza de vida en levaduras y moscas (Figura 3A).

Estos datos sirvieron para estimar la dosis óptima de SB-204990 para estudiosin vivoa largo plazo en 0,25 mg de compuesto/g de alimento (~ 4 g de ingesta de alimento/día) en ratones.

Los ratones de tipo salvaje se alimentaron con una dieta sana (STD) o una dieta rica en grasas (HFD) diabetogénica libre de colesterol y se trataron o no con SB-204990 durante 15 semanas. Como era de esperar, el tratamientoin vivocon el inhibidor de ACLY SB-204990 no alteró la actividad enzimática de ACLY en el tejido hepático (Figura 4G) (Pearceet al.,1998) y el peso corporal de los ratones alimentados con STD fue menor que el de los ratones alimentados con HFD (Figura 3B).

Los ratones alimentados con HFD y tratados con SB-204990 exhibieron un peso corporal más bajo a partir de la semana 9 de tratamiento en comparación con los ratones alimentados con HFD. La ingesta diaria de energía y el contenido de lípidos en las heces no se vieron alterados por la suplementación con SB-204990 (Figura 4H-I). Sin embargo, la ingesta de energía inducida por el ayuno fue mayor en ratones con dieta STD y tratados con SB-204990 en comparación con sus pares no tratados (Figura 4J).

Posteriormente se investigaron los efectos de SB-204990 en la homeostasis de la glucosa. La prueba de tolerancia a la glucosa oral (OGTT) indicó que, aunque los animales alimentados con las mismas dietas comenzaron con valores similares, SB-204990 produjo un deterioro leve en la tolerancia a la glucosa en ratones STD-SB, mientras que en los ratones alimentados con HFD-SB tuvo el efecto opuesto, es decir, una mejora, en comparación con HFD no tratados (Figura 3C-D). Se obtuvieron resultados similares en una prueba de tolerancia al piruvato intraperitoneal (IPPTT), lo que indica un papel fundamental de ACLY en el tejido hepático (Figura 3E-F).

Para evaluar si los cambios en la tolerancia a la glucosa se deben a un funcionamiento ineficiente de las células p pancreáticas o a una resistencia a la acción de la insulina en sus tejidos diana, se realizó una prueba de tolerancia a la insulina (ITT) (Figura 3G-H).Cuando se les administró una inyección de insulina intraperitoneal, todos los grupos mostraron un déficit en sus respuestas en comparación con el grupo de STD. La determinación de los niveles de insulina durante un test oral de tolerancia a la glucosa (OGTT) indicó que STD-SB responde con una potente secreción de insulina, lo que sugiere que la resistencia a la insulina es la principal causa subyacente de la homeostasis de glucosa desregulada en ratones STD-SB (Figura 3I-J). Los ratones HFD-SB exhibieron niveles de insulina similares durante la OGTT. La evaluación de los niveles de glucosa durante un período de ayuno de 24 horas indicó que los ratones STD-SB exhibieron niveles de glucosa más altos en comparación con los ratones STD, mientras que los ratones alimentados con HFD exhibieron niveles similares independientemente de la suplementación con SB-204990 (Figura 3K-L). Los niveles de glucosa y los niveles de insulina en condiciones de ayuno fueron mayores en los ratones STD-SB en comparación con los ratones alimentados con STD, lo que produjo un mayor índice HOMA-IR (Figura 5A-C). Por el contrario, los ratones alimentados con HFD tratados con SB-204990 exhibieron niveles más bajos de glucosa en ayunas, insulina en ayunas y valores más bajos de HOMA-IR en comparación con sus homólogos alimentados con HFD (Figura 5A-C). El porcentaje de hemoglobina glicosilada indicó una tendencia hacia niveles reducidos en ratones alimentados con HFD-SB en comparación con ratones alimentados con HFD (p = 0,07 en ANOVA de dos vías), sin diferencias en ratones alimentados con una dieta saludable (Figura 5D).

Para dilucidar si la inhibición de ACLY mediada por SB-204990 influye en la homeostasis del colesterol, se midieron los niveles circulantes de lipoproteínas de baja densidad/muy baja densidad (LDL/VLDL) y los niveles de colesterol total (Figura 5E-F). La administración de SB-204990 en HFD redujo los niveles circulantes de LDL/VLDL y colesterol total, mientras que no se detectaron cambios en los ratones tratados con SB-204990 bajo STD en comparación con sus homólogos no tratados. Sorprendentemente, en ambos casos, los valores en el grupo HFD-SB fueron comparables a los de los ratones STD alimentados sanos, lo que demuestra que SB-204990 previene los efectos nocivos de HFD en la homeostasis del colesterol.

A continuación, nos centramos en determinar los efectos en los resultados de la función motora. El SB-204990 en HFD mejoró el rendimiento físico en las pruebas de rendimiento de Rotarod (que mide la coordinación, equilibrio y fatiga en roedores) y Wire Hang o suspensión en cable (que evalúa la función motora y del sistema nervioso central -SNC- en roedores), lo que indica el estado general más saludable de estos animales en comparación con los ratones alimentados con HFD (Figura 5G-H). La memoria espacial no se vio alterada por la suplementación con SB-204990 independientemente de la dieta (Figura 6A-F).

En el momento del sacrificio (es decir, 15 semanas de tratamiento), los ratones alimentados con STD tratados con SB-204990 exhibieron una mayor masa de tejido adiposo blanco (WAT por sus siglas en inglés ”White adipocite tissue”), mientras que los ratones alimentados con HFD suplementado con SB-204990 mostraron una masa de WAT reducida en comparación con su respectiva dieta no tratada (Figura 5I). El examen histológico de los tejidos indicó una reducción masiva en el contenido de lípidos en el tejido hepático y un menor tamaño de adipocitos en ratones tratados con HFD-SB, mientras que no se observaron efectos importantes en las secciones de músculo esquelético y pancreático (Figura 5J-K). Al igual que los ratones que carecían de ACLY en el tejido adiposo blanco (Zhaoet al.,2016), los ratones sanos alimentados tratados con SB-204990 exhibieron un mayor tamaño medio de adipocitos en el tejido adiposo blanco.

En conjunto, estos resultados muestran que SB-204990 tiene efectos opuestos según la dieta proporcionada. En ratones sanos alimentados con STD, SB-204990 produce un deterioro en la homeostasis de la glucosa debido a la resistencia a la insulina, lo que sugiere que se requiere un nivel de actividad de ACLY para mantener la salud metabólica. Sin embargo, en condiciones metabólicamente desafiantes, como una alimentación HFD, la inhibición de ACLY promovida por SB-204990 mejora la salud metabólica y física.

La reprogramación metabólica inducida por SB-204990 es independiente de los cambios globales en la acetilación de histonas

Se evaluó la contribución de ACLY en la reprogramación celular en diferentes condiciones metabólicas, en concreto si la actividad restringida de ACLY promovida por SB-204990 podría alterar la acetilación de histonas, un mecanismo global que controla la transcripción (Wellenet al.,2009). La incubación de células de hepatocitos AML12 con acetato, un sustrato de la sintetasa Ac-CoA citoplasmática (Acs, también conocida como AceCS1) para producir Ac-CoA citosólica, en el orden de las concentraciones en la vena porta (Balmeret al.,2016; Zhaoet al.,2020), produjo niveles máximos de acetilación de histonas en todas las histonas centrales evaluadas (Figura 7A y Figura 8A). Sorprendentemente, la abundancia equimolar de citrato, sustrato de ACLY, no mejoró la acetilación de histonas, lo que sugiere que la disponibilidad de citrato no limita los eventos de acetilación.

Los niveles suprafisiológicos de glucosa, que podrían promover la generación de Ac-CoA a través del metabolismo mitocondrial de la glucólisis, no dieron como resultado aumentos constantes en la acetilación de histonas, lo que demuestra que los aumentos netos de la acetilación de histonas podrían depender más de la actividad citoplasmática de Acs que de la actividad de ACLY. En estas condiciones celulares, el tratamiento con SB-204990 no disminuyó los niveles de acetilación de histonas (Figura 7A y Figura 8A). Las diferencias entre los efectos del acetato, el citrato y la glucosa, y la falta de efectos de SB-204990 respaldan la idea de que el Acs citoplasmático es una fuente importante de Ac-CoA en la promoción de los eventos de acetilación de histonas que regulan la estructura de la cromatina en los hepatocitos AML12. En el hígado de ratón, el análisis de la acetilación de histonas, los niveles globales de acetilación de proteínas y los niveles totales de Ac-CoA confirmaron la falta de diferencias en los ratones tratados con SB-204990 alimentados con una dieta saludable o HFD (Figura 7B-F).Estos datos sugieren que los mecanismos compensatorios potencian la generación de Ac-CoA tras la inhibición de ACLY mediada por SB-204990. Por lo tanto, la modulación de la acetilación de proteínas globales (incluidas las histonas) no es la causa principal de los efectos metabólicos de SB-204990.

La colesterogénesis se encuentra entre los principales efectores de la acción de SB-204990

El análisis de los ésteres de colesterol hepático indicó una reducción sólida tanto en los ratones alimentados con STD tratados con SB como con HFD tratados con SB (Figura 9A). El análisis global de los ácidos grasos hepáticos indicó diferencias menores en las especies de ácidos grasos, revelando una ligera reducción en el ácido palmítico en ratones STD-SB y un modesto aumento en el ácido vaccénico en ratones HFD-SB (Figura 9D). En consecuencia, el análisis de las especies de triglicéridos reveló una disminución específica en los triglicéridos que contenían dos ácidos palmíticos (POP y PLP) en ratones STD-SB (Figura 9E). En ratones HFD-SB encontramos mayores niveles hepáticos de varias especies de triglicéridos que contienen dos ácidos grasos saturados (POP, PLS) y niveles más bajos de triglicéridos que contienen ácidos grasos poliinsaturados (POL, PLL OOL), un efecto que se ha observado en células LNCaP con ACLY depletado (Figura 9E)(Migitaet al.,2014). El análisis de las especies de lípidos polares indicó niveles reducidos de fosfatidilserina global en ratones STD-SB. El análisis de especies hidrofóbicas moduladas en nuestra metabolómica LC/MS no dirigida indicó niveles aumentados de varias especies de fosfatidilcolinas de cadena larga, mientras que las fosfatidilcolinas de cadena corta se redujeron (Figura 9F). Además, también se detectaron alteraciones en las especies de diglicéridos y fosfatidilinositol, lo que indica una profunda modulación en el lipidoma (Figura 9F). Sorprendentemente, también se encontró un acuerdo general con estas tendencias en ratones tratados con SB-204990 alimentados con HFD (Figura 9F).Además, observamos una reducción sólida de los precursores de pteridina y betaína relacionados con el ciclo del folato y el metabolismo de un carbono y un aumento concomitante de la carnitina transmetilada en ratones alimentados con STD tratados con SB-204990 (Figura 9G). Es de destacar que el glicerol 3-fosfato, un precursor en la síntesis de glicerolípidos, aumentó en el hígado de ratones STD-SB (Figura 9G). Curiosamente, SB-204990 no logró afectar estos niveles de metabolitos en ratones alimentados con un HFD. Estos datos sugieren que las modulaciones inducidas por SB-204990 en el ciclo del folato son más prominentes en condiciones saludables de alimentación, lo que revela diferencias en cómo se activa esta vía bajo diferentes regímenes de alimentación.

En general, los resultados mostrados revelaron que SB-204990 produce modulaciones en vías relacionadas con una mejor supervivencia y salud, que incluyen el metabolismo de varios aminoácidos y lípidos (Annibalet al.,2021; Aonet al.,2020).

SB-204990 se dirige a la función mitocondrial hepática

Contrariamente al papel putativo de ACLY en la producción de Ac-CoA para la síntesis de ácidos grasosde novoy a pesar del hecho de que la incorporación de glucosa en los lípidos se redujo con SB-204990, encontramos que los hepatocitos primarios exhibieron un rápido aumento en el contenido de lípidos tras el tratamiento con SB-204990 (Figura 10A-B y Figura 4A). Curiosamente, se han observado efectos similares (p. ej., gotas de lípidos más grandes/tamaño de adipocitos) en ratones sanos alimentados y cultivos celulares sin actividad ACLY(Figura 5J-K) (Martinez Calejmanet al.,2020). La incubación de hepatocitos primarios con acetato o citrato no aumentó el contenido de lípidos (Figura 10C y Figura 11A).Las condiciones de cultivo que imitaban la hiperglucemia mostraron una tendencia hacia una mayor acumulación de lípidos que fue estadísticamente significativa solo cuando se complementó con acetato. En condiciones de glucosa basal, SB-204990 produjo aumentos netos en el contenido de lípidos incluso cuando los medios de cultivo se complementaron con citrato y acetato. La acumulación de lípidos en condiciones de inhibición de ACLY mediada por SB-204990 podría explicarse por la actividad metabólica restringida. La prueba de MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-bromuro de 2,5-difeniltetrazolio) indicó que, en condiciones basales, SB-204990 reduce el metabolismo celular (Figura 10D). Sorprendentemente, la suplementación con acetato no restauró la actividad metabólica de los hepatocitos primarios tratados con SB-204990, lo que respalda las observaciones anteriores que indican que la actividad restringida de ACLY no puede compensarse por completo con la suplementación con acetato (Zhaoet al.,2016).

Se estudió el efecto de SB-204990 en el rendimiento mitocondrial, que podría potenciar la acumulación de lípidos. Para ello se evaluó la dinámica funcional mitocondrial en hepatocitos primarios tratados con SB-204990. SB-204990 redujo las tasas de consumo de oxígeno basal y máxima (OCR), mientras que específicamente la las tasas de consumo máxima disminuyó en células cultivadas con glucosa alta (25 mM) tratadas con SB-204990 (Figura 10E). En medios con contenido de glucosa estándar y alto, SB-204990 promovió la reducción de la tasa de acidificación extracelular (ECAR) en células desafiadas con oligomicina y FCCP, lo que indica una glucólisis reducida(Figura 10F). Este resultado sugiere la inhibición alostérica de la glucólisis por acumulación intracelular de citrato (Garlandet al.,1963). A continuación, determinamos si SB-204990 podría provocar efectos en las mitocondriasin vivo.Las mitocondrias de hígado recién aisladas de ratones tratados con SB-204900 (30 mg/kg de peso corporal; sonda oral; 3 horas de tratamiento) exhibieron un bloqueo y un aumento restringido de OCR inducido por ADP y FCCP, respectivamente (Figura 10G). Estos datos indican un efecto rápido de SB-240990 en el desacoplamiento mitocondrial y sugieren que los factores involucrados en el almacenamiento y la utilización de energía podrían modularse en condiciones de inhibición de ACLY mediada por SB-204990. Curiosamente, encontramos que la fosforilación de pThr 172 Ampk se redujo en el hígado de ratones tratados durante 15 semanas con SB-204990 independientemente de la dieta, así como en los hepatocitos primarios tratados con SB-204990, lo que sugiere un rico estado energético (Figura 10H y Figura 11B-C). Los hepatocitos primarios se trataron simultáneamente con SB-204990 y el activador Ampk metformina (Figura 10I-K). La metformina normalizó la actividad metabólica y los niveles de lípidos, lo que indica que estos efectos requieren el bloqueo de la actividad de la Ampk. Se obtuvieron resultados similares utilizando el activador de la Ampk AICAR (Figura 11D). Es importante destacar que la inhibición farmacológica y la activación de otras vías alteradas por SB-204990, como mTOR y el ciclo del folato, no revirtieron las alteraciones en la actividad de MTT y el contenido de lípidos promovidas por SB-204990, lo que indica un papel importante de la inhibición de Ampk en estos efectos (Figura 11D).En el tejido hepático, pThr 172 Ampk restringido se asoció con marcadores de señalización mTOR restringidos y un aumento de la expresión de Sirtl en ratones STD-SB-204990, mientras que se encontró que la señalización de mTOR estaba inalterada y se produjo un aumento de la expresión de Nmnat en ratones HFD-SB-204990 (Figura 10H y Figura 11C). Estos resultados sugieren que la expresión o actividad mejorada de Sirt1, a través de una mayor disponibilidad de NAD+ y/o actividad mTOR restringida, podría compensar la actividad reducida de Ampk (Aonet al.,2020; Gomeset al.,2013). Es importante destacar que los marcadores de contenido mitocondrial y biogénesis se redujeron en el hígado de ratones tratados con SB-204990 alimentados con una dieta saludable, mientras que los niveles de expresión de Acaa2, involucrado en la p-oxidación mitocondrial, aumentaron tanto en ratones alimentados tanto con STD como con HFD tratados con SB-204990(Figura 10H y Figura 11C).

Las modulaciones en la dinámica funcional mitocondrial podrían alterar la resistencia al estrés y la acumulación de daño oxidativo (Martin-Montalvoet al.,2013). Los lisados de hígado de ratones tratados con SB-204990 exhibieron niveles reducidos de marcadores de respuesta al daño del ADN (STD-SB) o peroxidación lipídica (HFD-SB), así como una mayor expresión de la proteína antioxidante Sod1, mientras que los marcadores de autofagia exhibieron efectos divergentes (Figura 11E-F). Bajo condiciones de alimentación saludables, los niveles de Fas se redujeron, lo que respalda la idea de que el metabolismo mitocondrial reducido podría tener un mayor peso específico que promueve la acumulación de lípidosin vivoque las alteraciones en la lipogénesisde novo(Figura 10H y Figura 11C). Todos estos resultados indican que ACLY se encuentra en la encrucijada de la regulación de los mecanismos moleculares del envejecimiento, como la liponeogénesis y los centros metabólicos mitocondriales, y desempeña un papel importante en el control del metabolismo energético a través de la señalización de Ampk.

A la vista de los resultados aquí expuestos se demuestra que el tratamiento con el inhibidor ACLY SB-204990 alarga la vida en varios modelos experimentales y mejora la salud metabólica y física en ratones obesos inducidos por dieta, que sufren por lo general una muerte prematura.

Referencias

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Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Inhibidor de la ATP-citrato liasa para su uso como agente geroprotector en una población de pacientes que presenta niveles alterados, patológicos, o fuera de los considerados saludables, de uno o varios de los parámetros metabólicos seleccionados de la lista que consiste en: nivel de glucosa, nivel de piruvato, nivel de insulina, nivel de lipoproteínas de baja y muy baja densidad, nivel de colesterol y contenido de lípidos en el tejido hepático.

2. El Inhibidor de la ATP-citrato liasa según la reivindicación anterior donde el inhibidor es SB-204990, BMS 303141, ácido bempedoico, NDI-091143, ácido hidroxicítrico, ácido 2 furoico, Litarex, MEDICA16, o cualquiera de sus combinaciones.

3. El inhibidor de la ATP-citrato liasa según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en el tratamiento de enfermedades metabólicas.

4. El inhibidor de la ATP-citrato liasa según la reivindicación anterior donde la enfermedad metabólica afecta a la tolerancia a la glucosa, al piruvato y/ o a la insulina.

5. El inhibidor de la ATP-citrato liasa según cualquiera de las reivindicaciones 3 - 4 donde la enfermedad metabólica afecta a los niveles en sangre de lipoproteínas de baja y muy baja densidad y/ o de colesterol.

6. El inhibidor de la ATP-citrato liasa según cualquiera de las reivindicaciones 3 - 5 donde la enfermedad metabólica afecta al contenido de lípidos en el tejido hepático.

7. El inhibidor de la ATP-citrato liasa según cualquiera de las reivindicaciones 3 - 6 donde la enfermedad metabólica cursa con aumento de peso corporal, aumento de la masa de tejido adiposo blanco y/o aumento del tamaño de los adipocitos.

8. El inhibidor de la ATP-citrato liasa según cualquiera de las reivindicaciones 3 - 7 donde la enfermedad metabólica se selecciona de la lista que consiste en diabetes e hígado graso.

9. El inhibidor de la ATP-citrato liasa según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en la mejora de la capacidad funcional.

10. El inhibidor de la ATP-citrato liasa según la reivindicación anterior donde la mejora de la capacidad funcional refiere a la mejora en los resultados de pruebas que miden la fuerza, resistencia y/o coordinación motora de los individuos.

11. El inhibidor de la ATP-citrato liasa según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso en la mejora de salud neurocognitiva.

12. El inhibidor de la ATP-citrato liasa según la reivindicación anterior donde la mejora de salud neurocognitiva refiere a la mejora en los resultados de pruebas que miden la memoria de los individuos.

13. Una composición que comprende los inhibidores de la ATP citrato liasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 -12 para su uso como agente geroprotector.

14. La composición según la reivindicación anterior que además comprende un activador de Ampk.

15. La composición según la reivindicación anterior donde el activador de Ampk es metformina y/o AICAR.

16. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 13 - 15, que es una composición farmacéutica.