ES2965754T3 - 2-Iminobiotina para uso en el tratamiento de lesiones de células cerebrales - Google Patents

Abstract

La presente divulgación se refiere al uso de 2-iminobiotina para tratar lesiones de células cerebrales, en particular en adultos. El tratamiento puede usarse para el tratamiento de hipoxia-isquemia cerebral y/o lesión por reperfusión, incluyendo uno o más síntomas de los mismos. Se proporcionan métodos de tratamiento que comprenden administrar una dosis con efecto terapéutico de 2-iminobiotina a un individuo que lo necesita. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

2-Iminobiotina para uso en el tratamiento de lesiones de células cerebrales

Campo de la invención

La presente divulgación se refiere al uso de 2-iminobiotina para tratar lesiones de células cerebrales, en particular en adultos. El tratamiento puede usarse para el tratamiento de hipoxia-isquemia cerebral y/o lesión por reperfusión, incluyendo uno o más síntomas de los mismos. Se proporcionan usos de 2-iminobiotina en métodos de tratamiento que comprenden administrar una dosis de 2-iminobiotina con efecto terapéutico a un individuo que la necesite.

Antecedentes de la invención

Las enfermedades cardíacas, incluido el paro cardíaco, son la causa de muerte más frecuente en los EE. UU. (Heron NVSR 2015). De los casos que experimentaron un paro cardíaco extrahospitalario (OHCA) presenciado, la supervivencia general fue del 11.7 % (Ewy et al., 2015). Sin embargo, estos resultados dependen de múltiples factores relacionados y no relacionados con el paciente (Shah et al., 2014; Mosier et al., 2010; Hasan et al., 2014; Mauri et al., 2015; Warren et al., 2015; Iqbal et al., 2015).

Es difícil predecir el resultado funcional de los pacientes en las primeras etapas después de una OHCA. A menudo, la categoría de desempeño cerebral (CPC) en el momento del alta se utiliza como instrumento/herramienta de detección rápida. Se informa un buen resultado neurológico general, definido como una puntuación de CPC de 1 o 2 al momento del alta, en el 6.5 % de los pacientes después de presenciar una OHCA (Ewy et al., 2015). Sin embargo, la puntuación de CPC por sí sola no es suficiente para evaluar el funcionamiento de los pacientes (Wallin et al., 2014). En los supervivientes de OHCA, entre el 30 % y el 50 % experimentan déficits cognitivos hasta varios años después del alta (Green et al., 2015). Además, el deterioro cognitivo, principalmente problemas de memoria, está presente en el 29 % de los supervivientes de OHCA con un buen resultado neurológico inicial al alta hospitalaria (Buanes et al., 2015). La memoria espacial se ve especialmente afectada debido al daño neuronal en el hipocampo inducido por la isquemia.

Para mejorar la supervivencia y disminuir el grado de deterioro neurológico, se ha investigado la implementación de hipotermia terapéutica después de OHCA. No se demostró ninguna diferencia en la función cognitiva entre los pacientes que recibieron hipotermia (32-34 °C) y normotermia controlada (36 °C) (Lilja et al., 2015). Por ello se están explorando nuevas estrategias para reducir las consecuencias sobre la cognición tras la hipoxia-isquemia cerebral, como por ejemplo tras la OHCA y otras enfermedades en las que se produce lesión por isquemia y reperfusión.

Sumario de la invención

La presente divulgación proporciona usos de 2-iminobiotina en métodos para el tratamiento de lesiones de células cerebrales en un individuo, que comprende proporcionar a un individuo que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de 2-iminobiotina (2-IB). La divulgación proporciona 2-IB para su uso en el tratamiento de lesiones de células cerebrales. La divulgación proporciona 2-IB para su uso en el tratamiento de lesión de células cerebrales en un individuo que no es un neonato, es decir, que es mayor que un neonato.

Preferiblemente, se administran a dicho individuo de 0.05 a 10 mg/kg/día de 2-IB. Preferiblemente, a dicho individuo se le administran de 0.2 a 10 mg/kg/día de 2-IB, más preferiblemente de 0.2 a 5 mg/kg/día de 2-iminobiotina.

Preferiblemente, dicho tratamiento con 2-IB se combina con hipotermia. Preferiblemente dicho tratamiento se combina con hipotermia y se administran a dicho individuo de 0.01 a 10 mg/kg/día de 2-IB.

Preferiblemente, se administran de 0.1 a 10 mg/kg/día de 2-iminobiotina a dicho individuo, en la que la 2-iminobiotina se administra cada cuatro a seis horas por día, preferiblemente cada cuatro horas. Preferiblemente, el tratamiento se combina con un control de temperatura objetivo de 36 °C.

Preferiblemente, se administran entre 2-20, más preferiblemente entre 3-13 mg de 2-IB por dosis.

En realizaciones preferidas, se administran de 0.01 a 1.5 mg/kg/día de 2-iminobiotina a dicho individuo, en la que la 2-iminobiotina se administra cada cuatro a seis horas, preferiblemente cada seis horas, en la que dicho tratamiento se combina con hipotermia. Preferiblemente, en el que se administran de 0.03 a 1 mg/kg/día de 2-iminobiotina, preferiblemente en el que se administran de 0.03 a 0.4 mg/kg/día de 2-iminobiotina cuando el tratamiento se combina con hipotermia. Preferiblemente, en el que se administran entre 0.7-8 mg, más preferiblemente entre 1-5 mg de 2-IB por dosis.

Preferiblemente, se proporciona 2-iminobiotina para su uso en el tratamiento de lesión de células cerebrales en un individuo, en el que se administran entre 18-78 mg/día de 2-iminobiotina, donde la 2-iminobiotina se proporciona en al menos tres dosis por día, preferiblemente en al menos seis dosis por día, y en el que dicho individuo no es un neonato. Preferiblemente, la 2-IB se proporciona continuamente, cada 2-10 horas, cada 3-8 horas, lo más preferiblemente cada 4-6 horas. Preferiblemente, el tratamiento se combina con un control de temperatura objetivo de 36 °C.

Preferiblemente, la 2-iminobiotina para uso en el tratamiento de lesión de células cerebrales en un individuo, en el que se administran entre 4-20 mg/día de 2-iminobiotina, donde la 2-iminobiotina se proporciona en al menos tres dosis por día, preferiblemente en al menos cuatro dosis por día, en el que dicho tratamiento se combina con hipotermia. Preferiblemente, la 2-IB se proporciona continuamente, cada 2-10 horas, cada 3-8 horas, lo más preferiblemente cada 6-8 horas, en particular cada 6 horas.

En realizaciones preferidas, la dosis de 2-iminobiotina se ajusta en función de la función renal del individuo. Preferiblemente, la dosis de 2-iminobiotina se ajusta basándose en el nivel de creatinina en suero del individuo. Preferiblemente, la dosis de 2-iminobiotina se ajusta en función de la tasa de filtración glomerular estimada (TFGe) del individuo.

Preferiblemente, la 2-iminobiotina se administra de modo que el área bajo la curva de concentración en plasma respecto del tiempo a las 4 h esté entre 100 ng.h/mL y 2000 ng.h/mL, más preferiblemente entre 300 ng.h/mL y 1300 ng.h/mL.

Preferiblemente, dicha lesión de células cerebrales es hipoxia-isquemia cerebral y/o lesión por reperfusión. Preferiblemente, dicha lesión de las células cerebrales es la reperfusión después de una hipoxia-isquemia cerebral. Preferiblemente, la lesión de las células cerebrales está asociada con un paro cardíaco. Preferiblemente, el individuo es un ser humano de al menos un año de edad. Preferiblemente, el ser humano tiene al menos dos años de edad.

Preferiblemente, la 2-iminobiotina se administra por vía parenteral o intravenosa. Preferiblemente, en la que la 2-iminobiotina se administra durante al menos 24 horas. Preferiblemente, se administran al menos cuatro, más preferiblemente al menos seis, dosis de 2-iminobiotina.

Preferiblemente, la 2-iminobiotina se administra profilácticamente, es decir, antes de que se haya producido la lesión de las células cerebrales (tal como hipoxia-isquemia cerebral y/o lesión por reperfusión). En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un método para determinar una dosis de 2-iminobiotina para tratar una lesión de células cerebrales en un individuo, comprendiendo el método determinar la concentración de creatinina en suero o la tasa de filtración glomerular estimada (TFGe) en el individuo y ajustar la dosis de 2-iminobiotina con base en el nivel de creatinina en suero o TFGe.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Configuración experimental.

Figura 2: Efectos de la 2-IB sobre el daño celular y la actividad metabólica inducidos por la hipoxia. La 2-IB atenúa el daño celular inducido por la hipoxia (A y B) y aumenta la actividad metabólica en condiciones hipóxicas (C y D), mostrando una curva de respuesta a la dosis en forma de U. Las columnas muestran la media; las barras denotan DE. A y C: *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001 todos frente al control de normoxia respectivo. B y D: *, P < 0.05 frente a 1; **, P < 0.01 frente a 1; #, P < 0.05; ##, P < 0.01.

Figura 3: Efectos de la 2-IB sobre la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) inducida por hipoxia. La 2-IB atenúa la producción de ROS inducida por hipoxia (A y B) mostrando una curva de respuesta a la dosis en forma de U. Las columnas muestran la media; las barras denotan DE. A: *, P < 0.05; **, P < 0.01; todos frente al respectivo control de normoxia. B: *, P < 0.05 frente a 1; **, P < 0.01 frente a 1; #, P < 0.05.

Figura 4: Regulación de proteínas asociadas al estrés celular por 2-IB. La aplicación de 2-IB después de la agresión hipóxica atenúa la expresión inducida por la hipoxia de las proteínas del estrés celular y conduce a un aumento en el número de proteínas subreguladas y de proteínas que permanecen sin cambios. Matriz de perfiles de proteoma: 1A pp38a, fosfo-p38 alfa (T181/Y185); 1B HIF2a, factor 2 alfa inducible por hipoxia; 1C ADAMTS1, una desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 1; 2App53, fosfo-p53 (S46); 2B pHSP-27, proteína fosforilada de choque térmico 27; 2C Bcl-2, linfoma 2 de células B; 3A PON1, paraoxonasa 1; 3B HSP-60, proteína de choque térmico 60;<3 c>CA IX, anhidrasa carbónica IX; 4A PON2, paraoxonasa 2; 4B HSP-70, proteína de choque térmico 70; 4C Cited2, transactivador que interactúa con Cbp/p300; 4A PON3, paraoxonasa 3; 5B IDO, indolamina 5C 2,3-dioxigenasa; COX-2, ciclooxigenasa-2; 6A Thio-1, tiorredoxina-1; 6B pJNK, quinasa del extremo terminal N fosfoc-Ju (T183/Y185); 6C CytC, citocromo C; 7A SIRT2, sirtuina 2; 7B NFkB1, factor nuclear kappa B1; 7C Dkk-4, dickkopf-4; 8A SOD2, superóxido dismutasa 2; 8B p21/CIP1, inhibidor de quinasa dependiente de ciclina 1A; 8C FABP-1, proteína 1 de unión a ácidos grasos; 9A - Ctr, control negativo; 9B p27, inhibidor de quinasa dependiente de ciclina 1B; 9C HIF1a, factor 1 inducible por hipoxia.

Figura 5: Fosforilación de moléculas clave de señalización. La 2-IB conduce a una tendencia a aumentar la fosforilación de la molécula pro-supervivencia akt en condiciones normóxicas e hipóxicas. Las columnas muestran la media; las barras denotan DE. N, normoxia; H, hipoxia.

Figura 6: Efecto de la duración de la fase de reperfusión en la hipotermia después de la hipoxia sobre el daño celular expresado por LDH/LDH total. A partir de las 25 h de reperfusión se presentó un aumento significativo del daño celular. Figura 7: Efectos de la 2-IB sobre el daño celular inducido por la hipoxia durante la hipotermia. La 2-IB atenúa el daño celular inducido por la hipoxia. Las columnas muestran la media; las barras denotan<D e .>A: **, P < 0.01; ***, P < 0.001 todos frente al control de normoxia respectivo. B: *, P < 0.05 frente a 1; **, P < 0.01 frente a 1; ***, P < 0.001 frente a 1.

Figura 8: Generación de peróxido de hidrógeno, expresada como aumento de la fluorescencia (en %) para el vehículo y todas las dosis de 2-IB durante la hipotermia. Las columnas muestran la media; las barras denotan DE. A: P < 0.01; ***, P < 0.001 todos frente al control de normoxia respectivo. B: *, P < 0.05 frente a 1; **, P < 0.01 frente a 1; ***, P < 0.001 frente a 1.

Figura 9: Escisión de PARP (en %) para el tratamiento con vehículo y 2-IB (30 ng/mL) durante la hipotermia. No hubo un aumento significativo en la escisión de PARP después de la hipoxia.

Figura 10: Fosforilación de Erk (A) y Akt (B) para tratamiento con vehículo y 2-IB (30 ng/mL) durante la hipotermia. Hubo un aumento significativo en la fosforilación de Erk después de la hipoxia, pero no en la fosforilación de Akt. Las columnas muestran la media; las barras denotan DE. *P < 0.05.

Figura 11: Descripción general del procedimiento de estudio en el ejemplo 3; HI = hipoxia-isquemia. ejemplo 3. Figura 12: Prueba de memoria (tiempo transcurrido en el cuadrante derecho para encontrar una plataforma oculta) el día 32 después de 4VO para todos los grupos de tratamiento (media ± DE).

Figura 13: Prueba de aprendizaje desde el día 28 hasta el día 31 después de 4VO: tiempo para encontrar la plataforma oculta por grupo de tratamiento.

Figura 14: La eliminación y la dosis requerida para alcanzar el objetivo varían en función de SeCre (creatinina en suero).

Figura 15: Predicciones de dosis ajustadas y no ajustadas de SeCre. La línea de puntos indica una exposición objetivo de 356 ng.mL/h, intervalo de CreaO en gris. (CreaO indica creatinina en suero al inicio).

Figura 16: Se ajustaron las concentraciones en sueros de 2-IB con infusión intravenosa cada cuatro horas. Los puntos en el gráfico representan valores medidos que han sido extrapolados.

Figura 17: La eliminación y la dosis requerida para alcanzar el objetivo varían en función de la TFGe.

Figura 18: Predicciones de dosis no ajustadas y ajustadas por TFGe. Las líneas de puntos indican la exposición objetivo superior e inferior de 356 ng.mL/h y 1068 ng.mL/h.

Descripción detallada de las realizaciones divulgadas

La 2-iminobiotina (2-IB), un análogo de la biotina reduce la cantidad de daño neurológico en un modelo de lechones de hipoxia-isquemia global perinatal (HI) (Peeters-Scholte et al., 2002). La 2-IB se encuentra actualmente en ensayos clínicos de fase 2 para esta indicación en recién nacidos. Aunque el cerebro de recién nacidos no es sólo un cerebro adulto pequeño y las vías (pato)fisiológicas subyacentes difieren enormemente, la presente divulgación demuestra sorprendentemente que la 2-IB es un tratamiento eficaz para el daño neuronal inducido por hipoxia-isquemia también en adultos.

Las referencias a métodos de tratamiento en la descripción detallada de la invención en esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia.

Un objeto de la presente divulgación es proporcionar métodos para tratar lesiones de células cerebrales en adultos, adolescentes y jóvenes. Aunque 2-IB se ha utilizado en recién nacidos, existen diferencias importantes entre el recién nacido y un individuo mayor y más desarrollado que un neonato, tal como un adulto y un niño mayor. Algunas de las muchas diferencias se resumen a continuación.

Los recién nacidos se diferencian de los animales mayores en la maduración del desarrollo del cerebro y en la capacidad de los sistemas antioxidantes (Ferriero et al., 2010 y Ben-ari et al., 2012). Tienen distintas formas de inducir y regular la apoptosis y difieren en el metabolismo (Cella et al., 2011). También existe una diferencia entre el cerebro inmaduro y el maduro en la sensibilidad a los procesos implicados en la muerte celular secundaria (Vannucci et al, 2004). Además, existe un cambio en el desarrollo entre las respuestas excitatorias e inhibidoras mediadas por el receptor GABA(A) durante el desarrollo del cerebro (Kilb W., 2012) y el proceso de mielinización del cerebro en desarrollo aún continúa durante los primeros 1.5 años (Haynes RL , et al., 2005)

Finalmente, la barrera hematoencefálica del recién nacido aún no está madura y funciona de manera diferente a la barrera hematoencefálica madura, específicamente en lo que respecta a la permeabilidad a las moléculas pequeñas. Saunders et al., informa que hay una disminución en la permeabilidad a compuestos insolubles en lípidos de bajo peso molecular durante el desarrollo del cerebro. (Saunders et al., 2000). Más recientemente se ha demostrado que la BHE de un neonato reacciona de manera diferente ante una lesión hipóxico-isquémica en comparación con la de un adulto (López DF, et al., 2012). Otras diferencias en la BHE entre recién nacidos y personas mayores se describen en Saunders et al., 2012. En conclusión, está claro que no es posible extrapolar dosis terapéuticas de un fármaco de un neonato a un adulto, como es el caso con la 2-IB.

Además de las muchas diferencias entre el cerebro de recién nacidos y el cerebro adulto, los recién nacidos también tienen diferencias en el metabolismo en comparación con los adultos. En la vida perinatal se producen alteraciones importantes en la eliminación renal y el metabolismo hepático y la farmacología de muchos fármacos difiere sustancialmente en el recién nacido en comparación con el adulto (Mulberg et al., 2009).

El documento US7087633B2 divulga el uso de 2-iminobiotina en el tratamiento de la asfixia perinatal en un neonato humano. Además, menciona el uso de 2-iminobiotina en el tratamiento y prevención de lesiones de células cerebrales en personas de todas las edades. La dosis indicada de 2-iminobiotina para este tratamiento es de 0.1 a 250 mg/kg/día. Sin embargo, no se divulgan datos sobre el tratamiento de la lesión de las células cerebrales.

S. Perrone et al.: "2-Iminobiotin for the treatment of perinatal asphyxia", EXPERT OPINION ON ORPHAN DRUGS, vol. 1, núm. 11,21 de octubre de 2013, páginas 935-945, divulga el uso de 2-iminobiotina en el tratamiento de la asfixia perinatal.

En un aspecto de la divulgación, se proporcionan métodos para el tratamiento de lesión de células cerebrales en un individuo que comprenden administrar a un individuo que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de 2-IB.

Preferiblemente, la 2-IB se administra a un individuo de modo que el área bajo la curva de concentración en plasma en el tiempo después de la primera dosis (de 0 a 4 h, AUC 0-4 h) para 2-IB sea al menos 100 ng.h/mL, más preferiblemente al menos 300 ng.h/mL. Preferiblemente, el AUC 0-4 h es al menos 356 ng.h/mL. En algunas realizaciones, el AUC 0-4 h está entre 100 ng.h/mL y 2000 ng.h/mL, entre 100 ng.h/mL y 1300 ng.h/mL, entre 300 ng.h/mL y 2000 ng.h/mL, o entre 300 ng.h/mL y 1300 ng.h/mL. Preferiblemente, el Au C 0-4 h es inferior a 2000 ng.h/mL, más preferiblemente inferior a 1300 ng.h/mL.

Como se explica en los ejemplos del presente documento, la divulgación proporciona que la exposición mínima objetivo para el tratamiento es de alrededor de 356 ng.h/mL (concentración en plasma) y que niveles de hasta 1068 ng.h/mL (concentración en plasma) también son eficaces. La divulgación proporciona una serie de regímenes de dosificación que proporcionan los niveles de exposición a 2-IB apropiados.

En realizaciones preferidas, los métodos comprenden administrar de 0.01 a 10 mg/kg/día de 2-IB al individuo. Preferiblemente se administran de 0.05 a 10 mg/kg/día de 2-IB, más preferiblemente de 0.2 a 10 mg/kg/día. Otras dosis preferidas de 2-IB incluyen de 0.05 a 5 mg/kg/día, de 0.1 a 5 mg/kg/día y de 0.2 a 5 mg/kg/día. Otras dosis preferidas de 2-IB incluyen de 0.05 a 3 mg/kg/día, de 0.1 a 3 mg/kg/día y de 0.2 a 3 mg/kg/día. Otras dosis preferidas de 2-IB incluyen de 0.05 a 1.5 mg/kg/día, de 0.1 a 1.5 mg/kg/día y de 0.2 a 1.5 mg/kg/día. Otras dosis preferidas de 2-IB incluyen de 0.05 a 1 mg/kg/día, de 0.1 a 1 mg/kg/día y de 0.2 a 1 mg/kg/día. Otras dosis preferidas de 2-IB incluyen de 0.05 a 0.5 mg/kg/día, de 0.1 a 0.5 mg/kg/día y de 0.2 a 0.5 mg/kg/día. Lo más preferido es una dosis de 0.1 a 10 mg/kg/día. Estas cantidades se refieren al componente activo y no incluyen materiales portadores o adyuvantes tales como carbohidratos, lípidos o proteínas o similares. Como se analiza más detalladamente en el presente documento, la 2-IB se administra preferiblemente varias veces al día. En un ejemplo de realización no limitante, se puede proporcionar una dosis de 0.1 a 10 mg/kg/día en seis dosis de 0.016-1.6 mg de 2-IB cada cuatro horas.

El tratamiento con 2-IB descrito en el presente documento puede implicar una única administración, pero habitualmente--y preferiblemente--implica administraciones múltiples durante varias horas o días. La dosis diaria de 2-IB a la que se hace referencia en el presente documento se puede administrar como una dosis única o como dosis múltiples por día, o esencialmente de forma continua durante un cierto período de tiempo, por ejemplo, mediante infusión continua. Preferiblemente, la 2-IB se administra cada 4 o 6 horas, es decir, la 2-IB se administra 4-6 veces por día. En algunas realizaciones, la 2-IB se administra cada 3-8 horas, es decir, 3-8 veces por día. Cuando se combina con hipotermia, la 2-IB se administra preferiblemente cada 6 horas. Para un experto está claro que la dosis administrada puede administrarse durante un período prolongado. Preferiblemente, la 2-IB se administra como una infusión i.v. lenta en bolo. Preferiblemente, la 2-IB se administra como una infusión intravenosa de 15 minutos. Como un ejemplo de realización, se administran 6 mg de 2-IB como una infusión intravenosa de 15 minutos seis veces al día (es decir, aproximadamente cada 4 horas). Aunque no deseamos limitarnos a ninguna teoría, la Figura 16 demuestra que la administración de 2-IB en dosis bajas varias veces al día proporciona el nivel de exposición mínimo objetivo de 2-IB.

Como se describe en el Ejemplo 5B, la divulgación proporciona que el peso corporal tiene un efecto mínimo sobre la exposición a la 2-IB. En realizaciones preferidas, se pueden proporcionar dosis no influenciadas por el peso. Preferiblemente, los individuos tratados con las dosis independientes del peso divulgadas en el presente documento oscilan entre 20 y 200 kg, más preferiblemente entre 30 kg y 180 kg.

Preferiblemente, la dosis diaria total está entre 6-120, más preferiblemente entre 12 a 120 mg, lo más preferiblemente entre 18-78 mg. Preferiblemente, la dosis diaria se administra como al menos tres dosis, es decir, al menos en tres momentos de tiempo separados; preferiblemente entre 3-10 dosis. Está claro para un experto que la administración de tres dosis o al menos tres puntos de tiempo separados abarca la infusión continua. Preferiblemente, la dosis diaria se administra como al menos cuatro dosis, es decir, al menos en cuatro puntos de tiempo separados. Lo más preferible es que la dosis diaria se administre como al menos seis dosis, es decir, en al menos seis puntos de tiempo separados. Para un experto está claro que el tiempo entre cada dosis (o punto de tiempo) debe ser esencialmente el mismo. Preferiblemente, 2-IB se administra en una dosis de entre 2-39 mg, entre 2-20 mg, entre 3-39 mg, más preferiblemente entre 3-13 mg, lo más preferiblemente entre 3-12.75 mg, preferiblemente administrada seis veces al día.

Preferiblemente, la 2-IB se administra como una dosis unitaria de 3 mg, 4 mg, 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg o 13 mg. En un ejemplo de realización no limitante, un individuo que pesa 80 kg puede recibir seis dosis de 2-IB en un día, en la que cada dosis comprende de 3-13 mg. El individuo recibiría así 0.04-0.16 mg/kg/dosis y 0.23 0.94 mg/kg/día.

Como se describe en el Ejemplo 5B, la divulgación proporciona que la eliminación de 2-IB está asociada con la función renal, en particular mediante la tasa de filtración glomerular (TFG). En realizaciones preferidas, la dosis de 2-IB se puede ajustar según la función o la eliminación renal del individuo. Esto puede expresarse como la tasa de filtración glomerular (TFG) y aproximarse mediante la tasa de eliminación de creatinina, que puede calcularse utilizando los niveles de creatinina en suero.

En realizaciones preferidas, la dosis de 2-IB se puede ajustar en función del nivel de creatinina en suero del individuo. La creatinina es un subproducto del metabolismo muscular y normalmente permanece en un estado estable equilibrado por la eliminación renal. Los niveles de creatinina en suero pueden determinarse mediante varios métodos conocidos por un experto en la técnica y también están disponibles varias pruebas en el lugar de atención, véase, por ejemplo, el analizador clínico portátil iSTAT (revisado en Clin Chim Acta. 18 de enero de 2012; 413 (1-2): 88-92) y el analizador CardioChek Silver PA. Por consiguiente, la divulgación proporciona métodos para determinar una dosis de 2-iminobiotina para tratar una lesión de células cerebrales en un individuo, comprendiendo el método determinar la creatinina en suero en el individuo y ajustar la dosis de 2-iminobiotina en función del nivel de creatinina en suero.

Preferiblemente, la dosis de 2-IB se ajusta en función de la creatinina en suero. Las dosis ajustadas de SeCre son particularmente útiles para personas que tienen una TFG alta. Para estas personas, la dosis de 2-IB se puede aumentar para garantizar que se alcance la exposición objetivo. Un ejemplo de esquema de dosificación para hombres basado en creatinina en suero (SeCre) es el siguiente:

- SeCre de menos de 30 pM, 12-20 mg/dosis, preferiblemente 15-18.75 mg/dosis.

- SeCre de entre 30 y 40 pM, 8-17 mg/dosis, preferiblemente 10-15 mg/dosis.

- SeCre de entre 41 y 50 pM, 6-14 mg/dosis, preferiblemente 7.5-12 mg/dosis.

- SeCre de entre 51 y 60 pM, 5-11 mg/dosis, preferiblemente 6-9.75 mg/dosis.

- SeCre de entre 61 y 80 pM, 4-9 mg/dosis, preferiblemente 5-8.25 mg/dosis.

- SeCre de entre 81 y 100 pM, 3-7 mg/dosis, preferiblemente 4-6 mg/dosis.

- SeCre de entre 101 y 125 pM, 2-6 mg/dosis, preferiblemente 3-5.25 mg/dosis.

- SeCre de entre 126 y 150 pM, 2-5 mg/dosis, preferiblemente 2.5-4.5 mg/dosis.

- SeCre de entre 150 y 200 pM, 2-4 mg/dosis, preferiblemente 2-3.75 mg/dosis.

Preferiblemente, la dosis de 2-IB se ajusta en función de la TFGe. La TFGe se basa en los niveles de creatinina en suero y tiene en cuenta tanto la edad como el sexo del individuo. Un ejemplo de fórmula para determinar la TFGe es la siguiente:

TFGe = 186 * SeCr1154 * Edad'0203 * 0.724SEXO

Sexo: masculino = 0; femenino = 1.

Las dosis ajustadas de TFGe son particularmente útiles para personas que tienen una TFG alta. Por consiguiente, la divulgación proporciona métodos para determinar una dosis de 2-iminobiotina para tratar una lesión de células cerebrales en un individuo, comprendiendo el método determinar la TFGe en el individuo y ajustar la dosis de 2-iminobiotina en función de la TFGe. Un ejemplo de esquema de dosificación basado en TFGe es el siguiente; sin embargo, un experto reconocerá que las dosis pueden variar hasta un 10 o un 20 % (+/-) como se enumera a continuación. =

TFGe (mL/min) Dosis preferida (mg)

baja alta

20 <30 3.00

30 <40 3.75

40 <50 4.50

50 <60 6.00

80 <100 7.50

100 <125 8.25

125 <150 9.75

150 <175 11.25

175 <200 12.00

200 <220 12.75

Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "tratamiento", "tratar" y "que trata" se refieren a aliviar, retrasar o prevenir la aparición, o inhibir o reducir el progreso de la lesión de las células cerebrales, o uno o más síntomas asociados con la lesión de las células cerebrales. En particular, dicha lesión de las células cerebrales está asociada con hipoxia, isquemia, anoxia, neurodegeneración, infecciones del SNC o lesión cerebral traumática.

En realizaciones preferidas, dicha lesión de las células cerebrales es hipoxia-isquemia cerebral. La isquemia es una deficiencia del flujo sanguíneo que produce la pérdida de la homeostasis fisiológica y puede provocar un infarto isquémico y, finalmente, la muerte celular por apoptosis. La hipoxia es la reducción de la disponibilidad de oxígeno en los tejidos. La hipoxia puede deberse a eventos isquémicos. Como se usa en el presente documento, "hipoxia" significa una reducción en el suministro de oxígeno a los tejidos por debajo de niveles fisiológicos. Como se usa en el presente documento, "normoxia" significa un nivel normal o fisiológico de suministro de oxígeno a los tejidos corporales. Por lo tanto, la hipoxia también comprende la anoxia, que es una privación total del suministro de oxígeno al tejido.

La hipoxia-isquemia cerebral es la hipoxia-isquemia de los tejidos cerebrales que resulta en la pérdida de células cerebrales. A diferencia de otros tejidos que pueden sobrevivir períodos prolongados de hipoxia-isquemia, el tejido cerebral es particularmente sensible a la privación de oxígeno o energía. El daño permanente a las neuronas puede ocurrir incluso durante períodos muy breves de hipoxia-isquemia. La isquemia cerebral incluye isquemia cerebral focal, que ocurre, por ejemplo, cuando un coágulo de sangre ha ocluido un vaso cerebral y está confinado a una región específica del cerebro, a menudo causada por trombosis o embolia, e isquemia cerebral global, que ocurre, por ejemplo, cuando el flujo de sangre a todo el cerebro se detiene o reduce drásticamente, y es comúnmente causada por enfermedad cardiovascular, pero también durante, por ejemplo, casi ahogamiento y estrangulamiento.

Pueden producirse isquemia cerebral y lesión hipóxica cerebral, por ejemplo, en condiciones de accidente cerebrovascular, accidente cerebrovascular isquémico agudo, ataque isquémico transitorio, accidente cerebrovascular hemorrágico agudo, traumatismo craneoencefálico, hemorragias cerebrales, paro cardíaco, edema cerebral, hidrocefalia, asfixia, condiciones vasooclusivas, embolismo (arterial y venoso), trombosis, tromboembolismo, aterosclerosis, hipotensión severa prolongada, ahogamiento, estrangulación, complicaciones de cirugía cardíaca o complicaciones de neurocirugía. La hipoxia-isquemia cerebral también puede deberse a neurodegeneración, lesión cerebral traumática e infecciones del SNC. Preferiblemente, los métodos descritos en el presente documento son para tratar el paro cardíaco.

En realizaciones preferidas, el tratamiento con 2-IB previene, reduce la gravedad o retarda la aparición de uno o más síntomas de isquemia cerebral y/o lesión hipóxica cerebral. Estos síntomas incluyen problemas cognitivos, sensoriales o motores, según el alcance y las regiones del cerebro dañadas. Estos síntomas incluyen parálisis o pérdida del movimiento muscular, dificultad para caminar, hablar o tragar (incluidas disartria, disfagia y afasia) y defectos en la memoria de trabajo, la atención, el aprendizaje, el cálculo, la percepción visual o la función ejecutiva (es decir, la toma de decisiones, organización y resolución de problemas).

En realizaciones preferidas, la lesión cerebral es una lesión por reperfusión. La lesión por reperfusión es el daño causado cuando el suministro de sangre regresa al tejido después de un período de isquemia o falta de oxígeno (anoxia, hipoxia). Preferiblemente, dicha lesión por reperfusión es el resultado de una isquemia-hipoxia cerebral. La ausencia de oxígeno y nutrientes en la sangre crea una condición en la que la restauración de la circulación produce inflamación y daño oxidativo a través de la inducción de estrés oxidativo en lugar de la restauración de la función normal. La reperfusión puede ocurrir, por ejemplo, después de la reanimación de un paro cardíaco, ahogamiento, estrangulación o revascularización después de un infarto de miocardio o un accidente cerebrovascular isquémico cerebral.

En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para tratar la lesión por reperfusión en un individuo después del inicio de la hipoxia-isquemia cerebral en dicho individuo. Los métodos también se pueden usar para tratar la lesión por reperfusión en un individuo con riesgo de hipoxia-isquemia cerebral, por ejemplo, en un individuo sometido a cirugía cardíaca o de aorta torácica.

Es preferible administrar 2-IB lo antes posible después de una lesión o después de un evento que haya causado una lesión. Por ejemplo, es preferible tratar a un individuo lo antes posible después de sufrir un paro cardíaco. Preferiblemente, el evento que causa la lesión es la reperfusión. En realizaciones preferidas, 2-IB se administra a un individuo que ha sufrido hipoxia-isquemia cerebral. En realizaciones preferidas, la 2-IB se administra a un individuo después de que haya tenido lugar la reperfusión, por ejemplo, después de una hipoxia-isquemia cerebral.

Preferiblemente, el paciente es tratado dentro de las 24 horas posteriores a la lesión o al evento que causó la lesión. El tratamiento puede continuarse hasta 24, 48 o 72 horas después de la hipoxia-isquemia cerebral o del evento causante de la lesión. El tratamiento también puede continuar hasta que se considere que el individuo ya no está en riesgo; por ejemplo, en el caso de infecciones, el tratamiento puede continuar durante 24 horas después de que el individuo esté libre de infección. En realizaciones preferidas, el individuo se trata dentro de las 6 horas posteriores a la reperfusión, por ejemplo, 6 horas después de la reanimación, más preferiblemente dentro de las 4 horas posteriores a la reperfusión, e incluso más preferiblemente dentro de las 2 horas posteriores a la reperfusión. En algunas realizaciones, el individuo se trata inicialmente con hipotermia y se trata dentro de las 12, preferiblemente dentro de las 8 horas posteriores a la reperfusión.

Como se usa en el presente documento, el tratamiento también incluye tratamiento profiláctico para prevenir o minimizar la lesión de las células cerebrales. Por ejemplo, 2-IB puede administrarse de forma profiláctica durante o antes de una cirugía cardíaca o de aorta torácica en el caso de que dichos procedimientos puedan provocar isquemia cerebral. En estas realizaciones, la 2-IB se puede administrar, por ejemplo, 6 horas antes de la cirugía y el tratamiento continúa durante 24 horas después de la cirugía. En algunas realizaciones, se puede administrar 2-IB de 1-5 horas antes de la cirugía. En otras realizaciones, la 2-IB, en particular la 2-IB administrada por vía parenteral, puede administrarse inmediatamente (por ejemplo, dentro de los 10 minutos) antes de la cirugía. Para personas con riesgo de hipoxia-isquemia cerebral, puede estar indicado un tratamiento a largo plazo, por ejemplo, un tratamiento durante varias semanas. Preferiblemente, la 2-IB se administra por vía oral para un tratamiento a largo plazo.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "individuos" se refiere a cualquier mamífero, tal como humanos, primates no humanos, roedores, cobayas, conejos, ovejas, cerdos, cabras, vacas, caballos, perros y gatos. Preferiblemente el individuo es un ser humano. Los protocolos de administración descritos en el presente documento son para el tratamiento de mamíferos adultos (completamente desarrollados) y juveniles (en desarrollo). Los individuos descritos en este documento no incluyen a los recién nacidos. La duración del estado de recién nacido varía según la especie animal y es conocida por un experto. En los mamíferos, el estado de recién nacido dura hasta aproximadamente 4 semanas después del nacimiento. Preferiblemente, los individuos a los que se hace referencia en el presente documento tienen al menos 6 semanas de edad, más preferiblemente al menos 6 meses de edad. En realizaciones preferidas, el individuo es un ser humano que tiene al menos un año, más preferiblemente al menos dos años. En algunas realizaciones, el individuo es un ser humano que tiene al menos tres años.

En una realización preferida, el tratamiento con 2-IB se combina con un control de temperatura objetivo de 36 °C, también denominado en la técnica normotermia controlada. Como sabe un experto, el control de temperatura objetivo de 36 °C es el tratamiento activo de un individuo para mantener una temperatura corporal de alrededor de 36 °C. Los pacientes con una temperatura inicialmente baja, por ejemplo, alrededor de 30 °C, se calientan nuevamente activamente, preferiblemente a una velocidad máxima de 0.5 °C por hora. Los pacientes con una temperatura más alta (por ejemplo, 38 °C) pueden enfriarse, por ejemplo, usando hielo/agua fría, cubitos de hielo o dispositivos de enfriamiento mecánicos. El control de temperatura objetivo de 36 °C difiere del tratamiento con hipotermia en que un individuo puede requerir calentamiento. Preferiblemente, se utiliza un control de temperatura objetivo de 36 °C durante todo el curso del tratamiento con 2-IB. Por ejemplo, se puede utilizar un control de temperatura objetivo de 36 °C durante al menos 20 horas, preferiblemente al menos 24 horas durante el tratamiento con 2-IB.

En un aspecto de la divulgación, se proporcionan métodos para el tratamiento de lesión de células cerebrales en un individuo que comprenden administrar a un individuo que lo necesita 2-IB en combinación con hipotermia.

Como se usa en el presente documento, el término "hipotermia" se refiere a someter a un individuo particular a condiciones hipotérmicas, por ejemplo, reduciendo la temperatura del cuerpo o de la cabeza mediante técnicas pasivas o activas. Normalmente, someterse a condiciones de hipotermia puede conducir a una neuroprotección al disminuir el metabolismo celular de los tejidos corporales.

En algunas realizaciones, la temperatura corporal central en un mamífero se reduce al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 grados Celsius por debajo de la temperatura corporal central normal para el mamífero. En algunas realizaciones, la temperatura corporal central en un mamífero se reduce entre 1-10, 2-6, o preferiblemente 2-4 grados Celsius por debajo de la temperatura corporal central normal para el mamífero.

En una realización preferida, la temperatura del mamífero se mantiene a una temperatura de aproximadamente 31 grados Celsius a aproximadamente 37 grados Celsius. Más preferiblemente, la temperatura del mamífero se mantiene a una temperatura de aproximadamente 32 grados Celsius a aproximadamente 36 grados Celsius, más preferiblemente de aproximadamente 32 grados Celsius a aproximadamente 35 grados Celsius, más preferiblemente aún de aproximadamente 33 grados Celsius a aproximadamente 34 grados Celsius. Tal como se utiliza en el presente documento, hipotermia se refiere a una temperatura corporal central de 35 grados Celsius o menos. Normalmente, las condiciones "hipotérmicas" en un ser humano adulto se refieren a mantener la temperatura corporal en alrededor de 33 grados Celsius.

La inducción de hipotermia mediante la reducción de la temperatura central del cuerpo se puede realizar mediante cualquier método conocido en la técnica. Los medios típicos de inducción de hipotermia en recién nacidos utilizan enfriamiento de todo el cuerpo o de la cabeza, utilizando el sistema Olympic CoolCap™. En adultos, se prefiere inducir la hipotermia utilizando hielo/agua fría, cubitos de hielo o dispositivos de enfriamiento mecánicos como el enfriamiento de superficie, usando el Tekotherm™; mantas de enfriamiento y otros sistemas de enfriamiento disponibles comercialmente, incluido el enfriamiento mediante catéteres colocados en un vaso sanguíneo grande. Alternativamente, se puede inducir hipotermia usando agentes farmacéuticos tales como, por ejemplo, agonistas del receptor vaniloide, capsaicinoides o agonistas similares a capsaicinoides (descritos en la Publicación de patente de EE. UU. 20090197966, cuyo contenido se incorpora en el presente documento como referencia) y análogos de neurotensina capaces de cruzar la barrera hematoencefálica, tales como NT69L y NT77 (descritos en la Patente de EE.UU. No. 7,319,090, cuyo contenido se incorpora en el presente documento como referencia).

La hipotermia y la 2-IB se pueden administrar de forma simultánea, secuencial o por separado. Como se usa en el presente documento, "simultáneamente" se usa para significar que la 2-IB se administra simultáneamente con hipotermia, mientras que el término "en combinación" se usa para significar que la 2-IB se administra, si no simultáneamente, entonces "secuencialmente" dentro de un período de tiempo en el que la 2-IB y la hipotermia exhiben un efecto terapéutico, es decir, ambos están disponibles para actuar terapéuticamente dentro del mismo período de tiempo. Por lo tanto, la administración "secuencial" puede permitir que la 2-IB se administre dentro de los 5 minutos, 10 minutos o unas horas antes o después de la hipotermia, siempre que la vida media en circulación de la 2-IB sea tal que esté presente en una cantidad terapéuticamente eficaz cuando el sujeto está expuesto a condiciones hipotérmicas. En realizaciones preferidas, la 2-IB se administra de manera que su efecto aún esté presente después de que la temperatura corporal del individuo haya vuelto a la normalidad.

A diferencia de "en combinación" o "secuencialmente", "por separado" se usa en el presente documento para significar que la brecha entre la administración de la 2-IB y la exposición del sujeto a hipotermia es significativa, es decir, la 2-IB puede no estar todavía presente o ya no estar presente en el torrente sanguíneo en una cantidad terapéuticamente eficaz cuando el sujeto está expuesto a condiciones hipotérmicas.

La presente divulgación demuestra que una combinación de 2-IB e hipotermia tiene un efecto mejorado en la reducción del daño celular inducido por hipoxia en comparación con el tratamiento con hipotermia sola. Por lo tanto, la dosis terapéuticamente eficaz de 2-IB es menor cuando se combina con hipotermia. Como se describe en el ejemplo 5C, la dosis de 2-IB se puede reducir en un 37 % en comparación con las condiciones normotérmicas. En consecuencia, todas las dosis proporcionadas anteriormente en el presente documento son adecuadas para su uso en combinación con hipotermia, cuando la dosis se reduce en un 37 % de la dosis original. Considerando que la dosis mínima de 2-IB es de 0.05 mg/kg/día, preferiblemente al menos 0.2 mg/kg/día; cuando se combina con hipotermia, la dosis mínima puede reducirse a 0.01 mg/kg/día. Las dosis más preferidas de 2-IB cuando se combina con hipotermia incluyen de 0.05 a 10 mg/kg/día, de 0.1 a 10 mg/kg/día y de 0.2 a 10 mg/kg/día. Otras dosis preferidas de 2-IB cuando se combina con hipotermia incluyen de 0.05 a 5 mg/kg/día, de 0.1 a 5 mg/kg/día y de 0.2 a 5 mg/kg/día. Otras dosis preferidas de 2-IB cuando se combina con hipotermia incluyen de 0.05 a 1.5 mg/kg/día, de 0.1 a 1.5 mg/kg/día y de 0.2 a 1.5 mg/kg/día. Otras dosis preferidas de 2-IB cuando se combina con hipotermia incluyen de 0.05 a 1 mg/kg/día, de 0.1 a 1 mg/kg/día y de 0.2 a 1 mg/kg/día. Otras dosis preferidas de 2-IB cuando se combina con hipotermia incluyen de 0.05 a 0.5 mg/kg/día, de 0.1 a 0.5 mg/kg/día y de 0.2 a 0.5 mg/kg/día. Las dosis especialmente preferidas incluyen de 0.03 a 3.7 mg/kg/día, 0.04 a 3.7 mg/kg/día, 0.04 a 4 mg/kg/día, 0.03 a 1.9 mg/kg/día, 0.4 a 1.9 mg/kg/día, 0.03 a 2 mg/kg/día, 0.04 a 2 mg/kg/día, 0.03 a 1.9 mg/kg/día, 0.04 a 1.9 mg/kg/día, 0.03 a 1 mg/kg/día, 0.04 a 1 mg/kg /día, 0.03 a 0.4 mg/kg/día y 0.04 a 0.4 mg/kg/día. En las realizaciones más preferidas, se administran de 0.04 a 3.7 mg/kg/día de 2-Iminobiotina, preferiblemente entre 0.04 y 1.9 mg.

Como se describe en el Ejemplo 5B, la divulgación proporciona que el peso corporal tiene un efecto mínimo sobre la exposición a la 2-IB. En realizaciones preferidas, se pueden proporcionar dosis no influenciadas por el peso. Preferiblemente, los individuos tratados con las dosis independientes del peso divulgadas en el presente documento oscilan entre 20 y 200 kg, más preferiblemente entre 30 kg y 180 kg.

Preferiblemente, la dosis diaria total está entre 2-40, más preferiblemente entre 3 y 30 mg, preferiblemente entre 6-29 mg, lo más preferiblemente entre 4-20 mg. Preferiblemente, la dosis diaria se administra como al menos tres dosis, es decir, al menos en tres momentos de tiempo separados; preferiblemente entre 3-10 dosis. Está claro para un experto que la administración de tres dosis o al menos tres puntos de tiempo separados abarca la infusión continua. Preferiblemente, la dosis diaria se administra como al menos cuatro dosis, es decir, al menos en cuatro puntos de tiempo separados. Lo más preferible es que la dosis diaria se administre como al menos seis dosis, es decir, en al menos seis puntos de tiempo separados. Para un experto está claro que el tiempo entre cada dosis (o punto de tiempo) debe ser esencialmente el mismo. Preferiblemente, la 2-IB se administra en una dosis de 1 mg, 1.5 mg, 2 mg, 2.5 mg, 3 mg, 3.5 mg, 4 mg, 4.5 mg o 5 mg, cuando se combina con hipotermia. En un ejemplo de realización no limitante, un individuo que pesa 80 kg puede recibir cuatro dosis de 2-IB en un día en combinación con hipotermia, en la que cada dosis comprende entre 1-5 mg. El individuo recibiría por lo tanto 0.01-0.06 mg/kg/dosis y 0.06-0.23 mg/kg/día. Preferiblemente, la 2-IB se administra en una dosis de entre 0.5-8 mg, preferiblemente de 0.7-7 mg, más preferiblemente de entre 1-5 mg, preferiblemente 4 veces al día.

La 2-IB puede proporcionarse en cualquier formulación farmacéuticamente aceptable adecuada. La divulgación proporciona soluciones y formas de dosificación de 2-IB para, preferiblemente, administración parenteral. La administración parenteral como se usa en el presente documento se refiere a modos de administración que incluyen, entre otros, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, subdural, subaracnoidea, intracapsular, intraorbitaria, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal e inyección e infusión intraesternal. La 2-IB también se puede administrar por vía oral, en particular en pacientes que padecen una lesión cerebral por neurodegeneración, que pueden requerir un tratamiento a largo plazo.

La 2-IB puede estar en cualquier forma adecuada para dicha administración, incluidos, entre otros, comprimidos, cápsulas, polvos, sobres, soluciones, suspensiones, emulsiones, elixires, gotitas, atomizadores, etc. Estos pueden formularse de una manera ya conocida, usando opcionalmente uno o más adyuvantes, excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados; y también puede envasarse adecuadamente, por ejemplo, en un recipiente adecuado tal como un vial o una botella.

Preferiblemente, las preparaciones farmacéuticas se administran por vía intravenosa, tal como mediante inyección y en particular mediante infusión (goteo), bolo lento o mediante un sistema de bomba. Las preparaciones adecuadas para dicha administración intravenosa se pueden preparar, por ejemplo, mezclando 2-IB o una sal de la misma con agua o un tampón o solución farmacéuticamente aceptable tal como solución salina normal. En realizaciones preferidas, las dosis fijas descritas en el presente documento se proporcionan como formas de dosificación unitaria única. Por ejemplo, la divulgación proporciona una dosificación unitaria única que comprende 1 mg, 1.5 mg, 2 mg, 2.5 mg, 3 mg, 3.5 mg, 4 mg, 4.5 mg o 5 mg, 6 mg, 7 mg, 8 mg, 9 mg, 10 mg, 11 mg, 12 mg o 13 mg de 2-IB.

Las formulaciones preferidas incluyen las descritas en el documento WO 2011/149349, que se incorpora a la presente como referencia. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las formulaciones de 2-IB adecuadas están en forma de una solución acuosa y comprenden beta-ciclodextrinas sustituidas, tales como, por ejemplo, hidroxipropil-betaciclodextrina y sulfobutiléter-beta-ciclodextrina. En algunas realizaciones, las formulaciones de 2-IB adecuadas están en forma de una solución acuosa e incluyen un tampón ácido para ajustar el pH dentro del intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 7. Preferiblemente, la formulación comprende suficiente ácido cítrico y/o citrato de sodio u otra sal de citrato para alcanzar el pH deseado. En algunas realizaciones, las formulaciones comprenden ácido cítrico entre 1 y 25 mM. En algunas realizaciones, las formulaciones comprenden citrato de sodio entre 0.1 y 5 mM. En algunas realizaciones, las formulaciones comprenden ácido cítrico/citrato al menos 20 mM.

Definiciones

Como se usa en el presente documento, "comprende" y sus conjugaciones se usa en su sentido no limitante para significar que los elementos que siguen a la palabra están incluidos, pero los elementos que no se mencionan específicamente no se excluyen. Además, el verbo "consiste" puede sustituirse por "consiste esencialmente en", lo que significa que un compuesto o compuesto adjunto tal como se define en el presente documento puede comprender componente(s) adicionales a los específicamente identificados, sin que dichos componente(s) adicionales alteren la característica única de la invención.

Los artículos "un" y "uno, una" se utilizan en el presente documento para referirse a uno o más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

La palabra "aproximadamente" o "alrededor de" cuando se usa en asociación con un valor numérico (aproximadamente 10, alrededor de 10) significa preferiblemente que el valor puede ser el valor dado de 10 más o menos el 1 % del valor.

Todas las referencias a patentes y bibliografía citadas en la presente memoria descriptiva se incorporan por la presente como referencia en su totalidad.

La invención se explica con más detalle en los siguientes ejemplos. Estos ejemplos no limitan el alcance de la invención, sino que simplemente sirven para aclarar la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: 2-IB reduce el daño de las células neuronales inducido por hipoxiain vitro

Existe una falta de conocimiento sobre los efectos mediados por 2-IB a nivel celular y molecular y las concentraciones óptimas de 2-IB. El objetivo de este estudio fue validar los posibles efectos neuroprotectores de diferentes concentraciones de 2-IBin vitroy explorar los mecanismos celulares subyacentes.

Entorno experimental

Se indujo hipoxiain vitroen los cultivos celulares utilizando nuestro sistema recientemente descrito con modificaciones menores (Huang et al., 2013b; Weber et al., 2015; Zitta et al., 2010). Se prepararon soluciones patrón de enzimas (100x) de catalasa y glucosa oxidasa (ambas de Sigma-Aldrich) en medio de cultivo celular (DMEM/F12, FCS al 1 %; concentración final: 120 U/mLy 2 U/mL respectivamente; Sigma-Aldrich) que conduce a una disminución de la presión parcial de oxígeno (pO2) por debajo de 10 mm de Hg en 5 minutos. Las condiciones hipóxicas se confirmaron mediante el uso de un monitor de presión de oxígeno tisular (Catéter de oxígeno LICOX® CMP; Integra, Plainsboro, Estados Unidos). Después de 7 h de hipoxia, las células se lavaron dos veces con PBS (PAA) y se añadió a las células medio normóxico fresco suplementado con disolvente (tampón de citrato al 1 %) o 2-IB (10, 30, 50, 100 y 300 ng/mL). Las investigaciones de daño celular, actividad metabólica, ROS, peróxido de hidrógeno, producción de nitrito/nitrato, fosforilación de erk1/2, akt y stat5, así como la expresión de proteínas de estrés celular, se realizaron con medios de cultivo celular o proteínas celulares (Fig. 1).

Ensayos de citotoxicidad de lactato deshidrogenasa (LDH)

La liberación de LDH de las células cultivadas al medio se cuantificó utilizando un kit colorimétrico de detección de citotoxicidad (Roche, Mannheim, Alemania). Las muestras se prepararon según el protocolo del fabricante. Brevemente, los medios de cultivo se recogieron 24 h después de la hipoxia y se almacenaron a -20 °C. Para la evaluación de la LDH total, las células se lisaron con Triton X-100 al 2 % (Carl Roth, Karlsruhe, Alemania) durante 15 minutos a 37 °C. La actividad de LDH de las muestras se midió en placas de 96 pocillos a 490 nm utilizando un lector de ELISA (Tecan, Crailsheim, Austria) en combinación con el software Magellan v1.1.

Ensayos de actividad metabólica

Las células metabólicamente activas se evaluaron utilizando un kit colorimétrico (CellTiter96® AQueous One Solution Reagent G3580, Promega Madison, WI, EE. UU.). Las muestras se prepararon respetando el protocolo del fabricante. Brevemente, se sembraron 4x104 células por pocillo en una placa de 96 pocillos con 100 pL de DMEM/F12 suplementado con FCS al 10 % por pocillo. Después de 2 días en cultivo, se aplicó normoxia o hipoxia durante 7 h seguido de la adición de 2-IB o el control de disolvente respectivo (citrato al 1 %) durante 17 h. Después de eso, se añadieron 20 pL de reactivo MTT a cada pocillo durante 2.5 h a 37 °C. Las células metabólicas activas generan un producto coloreado, cuya absorbancia se midió a 490 nm utilizando un lector de ELISA (Tecan, Crailsheim, Austria) en combinación con el software Magellan v1.1.

Mediciones de especies reactivas de oxígeno y peróxido de hidrógeno.

Para las mediciones de especies reactivas de oxígeno (ROS), se sembraron 4x104 células por pocillo y se cultivaron durante 3 días en placas de 96 pocillos de paredes negras (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania). Después de la hipoxia, las células se lavaron con PBS precalentado y se cultivaron en un medio DMEM/F12 sin rojo fenol (Gibco®-Invitrogen, NY, EE. UU.) con suero fetal de ternera (PAA) al 1 % durante 17 h, suplementado con disolvente (citrato al 1 %) o 2-IB (10, 30, 50, 100, 300 ng/mL). Las ROS intracelulares se midieron añadiendo diacetato de 2'7'-diclorodihidrofluoresceína (H2DCFDA, Sigma-Aldrich) a una concentración final de 10 pM que se oxida a diclorofluoresceína fluorescente (DCF) por las ROS intracelulares. Las células cargadas con DCF se mantuvieron en la oscuridad a 37 °C y la fluorescencia se evaluó a una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 535 nm utilizando un lector de ELISA (Genios FL; Tecan, Crailsheim, Austria). Los datos de fluorescencia se adquirieron en los puntos de tiempo 0 (T0) y 30 min (T30) y los resultados se calcularon como el incremento de fluorescencia (%) a lo largo del tiempo [(T30-T0)/T0*100]. El peróxido de hidrógeno se midió en el medio de cultivo con un Kit de ensayo de peróxido Quanti-Chrom™ (Bio-Assay Systems, Hayward, EE. UU.), que utiliza la reacción cromogénica Fe3+-naranja de xilenol, en la que se forma un complejo púrpura cuando el Fe2+ proporcionado en el reactivo se oxida a Fe3+ por el peróxido de hidrógeno presente en la muestra. Brevemente, se añadieron 100 pL de reactivo de detección a 20 pL de medio de cultivo y se realizaron mediciones según el protocolo del fabricante. La absorbancia de las muestras colorimétricas y los estándares se midió a 620 nm utilizando un lector de ELISA (Tecan, Crailsheim, Alemania).

Ensayos con nitrato/nitrito

Las concentraciones de nitrato y nitrito se evaluaron en medios de cultivo utilizando un kit de ensayo colorimétrico Griess (Sigma-Aldrich) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se midió la absorbancia a 540 nm en muestras y estándares utilizando un lector de ELISA (Tecan, Crailsheim, Alemania).

Aislamiento y transferencia Western de proteínas

La extracción de proteínas se realizó utilizando tampón RIPA que contenía cloruro de sodio 150 mM, NP-40 al 1 %, desoxicolato de sodio al 1 %, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 0.1 % y tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7.6; todos de Sigma-Aldrich) o, alternativamente, tampón M-PER (reactivo de extracción de proteínas de mamíferos; Pierce, IL, EE. UU.). Las concentraciones de proteínas se determinaron con los ensayos Roti® (Carl Roth) y las muestras se almacenaron a -20 °C hasta su uso. Para la transferencia Western, se mezclaron 30 pg de proteína total con tampón LaemmLi 4X (8 % de SDS, 40 % de glicerol, 20 % de 2-mercaptoetanol, 0.008 % de azul de bromofenol, Tris-HCl 0.25 M, todos de Sigma-Aldrich) y se incubó durante 3 minutos a 95°C. Las muestras se separaron mediante electroforesis en geles de SDS-PAGE al 10 % y se transfirieron a una membrana de PVDF (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, EE. UU.). Después de bloquear 1 hora en TBST con BSA al 3 % a temperatura ambiente, las membranas se incubaron a 4 °C durante la noche con anticuerpos primarios específicos para erk1/2 fosforilado (Cell Signaling Technology; 1:8,000), erk1/2 (Cell Signaling Technology; 1:8,000), akt fosforilado (Cell Signaling Technology; 1:1,000), akt (Cell Signaling Technology; 1:2,000), stat5 fosforilado (R&D Systems, Minneapolis, EE. UU.; 1:200) y stat5 (R&D Systems, Minneapolis, EE. UU. ; 1:200). Después de lavar en tampón TBST, las membranas se incubaron durante 1 h con anti-inmunoglobulina G de conejo porcina conjugada con peroxidasa (Dako, Hamburgo, Alemania; 1:20,000) siguiendo las instrucciones del fabricante. La reacción final se visualizó utilizando quimioluminiscencia mejorada (reactivos de detección de transferencia Western ECL-Plus; Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, Reino Unido), y las membranas se expusieron a películas de rayos X. Las imágenes se tomaron y analizaron densitométricamente con el software Imaged (v1.41o, NIH).

Matrices de perfiles de proteoma de estrés celular

El perfil de proteoma se realizó utilizando matrices de perfilador de proteoma de estrés celular disponibles comercialmente (R&D Systems, Minneapolis, EE. UU.) y el protocolo del fabricante proporcionado con el kit de ensayo. Se combinaron cantidades iguales (50 pg) de proteína de cada experimento (N=4) y se aplicaron a la membrana de matriz respectiva. Los niveles de expresión de 26 proteínas asociadas al estrés celular se evaluaron mediante análisis densitométricos de las matrices utilizando el software Imaged 1.41o (Imaged, NIH, EE. UU.).

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, EE. UU.). Todos los experimentos se realizaron de forma independiente 5 veces utilizando al menos muestras duplicadas en cada experimento. Las excepciones fueron: (i) matrices de perfiles de proteoma de estrés en las que se combinaron muestras de 4 experimentos y (ii) estudios de transferencia Western que se realizaron de forma independiente 3 veces. Los datos se presentan como valores medios con desviaciones estándar (DE). Las comparaciones estadísticas se realizaron utilizando pruebas t de Student, ANOVA unidireccional (para comparaciones intragrupo) y ANOVA bidireccional (para comparaciones entre grupos) con pruebas posteriores de Bonferroni. Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas si p era inferior a 0.05. Los datos no paramétricos fueron analizados mediante la prueba de Kruskal-Wallis y la prueba posterior de Dunn. Para los análisis de pruebas paramétricas, los datos se transformaron (arcoseno de raíz cuadrada de x) para obtener normalidad.

Resultados

La 2-IB reduce el daño celular inducido por la hipoxia y aumenta la actividad metabólica. En comparación con la normoxia, el daño celular aumentó significativamente 17 h después de la hipoxia (LDH/LDH total: normoxia: 0.08 ± 0.02; hipoxia: 0.19 ± 0.05; P < 0.001; Figura 2A). La adición de 2-IB en el intervalo entre 10 y 100 ng/mL redujo la liberación de LDH inducida por hipoxia a niveles encontrados en condiciones normóxicas (10 ng/mL de 2-IB, normoxia: 0.09 ± 0.02; hipoxia: 0.15 ± 0.03; P>0.05. 30ng/mL de 2-IB, normoxia: 0.11 ± 0.03; hipoxia: 0.13 ± 0.02; P>0.05. 50 ng/mL 2-IB, normoxia: 0.14 ± 0.04; hipoxia: 0.14 ± 0.04; P>0.05. 100 ng/mL de 2-IB, normoxia: 0.10 ± 0.02; hipoxia: 0.15 ± 0.03; P>0.05 Figura 2A). Este efecto no se observó con concentraciones más altas de 2-IB (300 ng/mL de 2-IB, normoxia: 0.10 ± 0.02; hipoxia: 0.20 ± 0.06; P < 0.05; Figura 2A). Con respecto a la reducción del daño celular inducido por la hipoxia, 30 y 50 ng/mL de 2-IB fueron las concentraciones más efectivas (P < 0.05 frente al control; Figura 2B).

Los ensayos MTS revelaron una actividad metabólica significativamente reducida de las células IMR-32 17 h después de la hipoxia en comparación con las células cultivadas en condiciones normóxicas (actividad metabólica (a.u.): normoxia: 0.61 ± 0.09; hipoxia: 0.33 ± 0.07; P < 0.01; Figura 2C). La adición de 2-IB en el intervalo entre 10 y 50 ng/mL atenuó la reducción de la actividad metabólica mediada por la hipoxia a niveles encontrados en condiciones normóxicas (actividad metabólica (a.u.): 10 ng/mL 2-IB, normoxia: 0.44 ± 0.08; hipoxia: 0.44 ± 0.10; P>0.05; 30 ng/mL de 2-IB, normoxia: 0.49 ± 0.08, hipoxia: 0.45 ± 0.09; P>0.05; 50 ng/mL de 2-IB, normoxia: 0.50 ± 0.08; hipoxia: 0.41 ± 0.06; P>0.05; Figura 2C), mientras que concentraciones más altas de 2-IB (100 y 300 ng/mL) no fueron efectivas (actividad metabólica (a.u.): 100 ng/mL de 2-IB, normoxia: 0.58 ± 0.09; hipoxia: 0.33 ± 0.06; P < 0.05. 300 ng/mL de 2-IB, normoxia: 0.63 ± 0.09; hipoxia: 0.33 ± 0.07; P < 0.01; Figura 2C). La reducción de la actividad metabólica inducida por la hipoxia se contrarrestó de manera más eficiente con 10, 30 y 50 ng/mL de 2-IB (P < 0.01 frente al control; Figura 2D).

La 2-iminobiotina reduce la producción de especies reactivas de oxígeno inducida por la hipoxia. La producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) aumentó significativamente en condiciones hipóxicas (aumento de ROS (T30-T0)/T0*100: normoxia: 129.18 ± 26.92; hipoxia: 248.02 ± 59.24; P < 0.05; Figura 3A). Dosis bajas de 2-IB (30 y 50 ng/mL) atenuaron la producción de ROS inducida por la hipoxia a niveles no significativamente diferentes de los encontrados en condiciones normóxicas (aumento de ROS (T30-T0)/T0*100: 30 ng/mL de 2-IB, normoxia: 118.93 ± 20.09; hipoxia: 222.00 ± 52.57; P>0.05. 50 ng/mL 2-IB, normoxia: 154.85 ± 30.83; hipoxia: 233.38 ± 53.94; P>0.05; Figura 3A), mientras que concentraciones más altas de 2-IB no fueron efectivas (aumento de ROS (T30-T0)/T0*100: 100 ng/mL 2-IB, normoxia: 128.84 ± 21.94; hipoxia: 246.71 ± 58.94; P < 0.05. 300 ng/mL de 2-IB, normoxia: 141.20 ± 25.35; hipoxia: 311.57 ± 79.02; P < 0.01; Figura 3A). La generación de ROS inducida por hipoxia se atenuó de manera más eficiente con 50 ng/mL de 2-IB (Figura 3B). La hipoxia también resultó en un aumento dramático de la producción de peróxido de hidrógeno (hipoxia: 19.01 ± 2.61 pM; normoxia: 0.10 ± 0.07 pM; P < 0.001). Sin embargo, la adición de 30 ng/mL de 2-IB no atenuó la liberación de peróxido de hidrógeno inducida por la hipoxia (datos no mostrados), aunque esta concentración de 2-IB fue protectora celular y atenuó la producción de ROS inducida por la hipoxia (Figura 2A, B y 3A, B). En cuanto al nitrato y nitrito, que pueden formar NO y otros óxidos de nitrógeno bioactivos (Kaandorp et al., 2010), las mediciones colorimétricas revelaron que los medios de cultivo de células IMR-32 contenían solo concentraciones muy bajas de ambas moléculas (<5 pM) y que nitrato ni las concentraciones de nitrito estuvieron influenciadas por la hipoxia o por la 2-IB (datos no mostrados).

La expresión inducida por hipoxia de proteínas asociadas al estrés celular se atenúa con 2-IB. Las matrices de perfiles de proteoma de estrés celular revelaron una sobrerregulación de 23/26 (88 %) de las proteínas asociadas al estrés celular después de la hipoxia, mientras que solo 1/26 (4 %) fue subregulada y 2/26 (8 %) se mantuvieron sin cambios. La aplicación de 30 ng/mL de 2-IB después de la agresión hipóxica atenuó la expresión inducida por la hipoxia de las proteínas del estrés celular a 19/26 (73 %) proteínas sobrerreguladas y dio como resultado un aumento en el número de proteínas subreguladas 3/26 (12 %) y proteínas que permanecieron sin cambios 4/26 (15 %; Figura 4). En la Tabla 1 se muestra un análisis detallado de las proteínas investigadas.

.

intensidades densitométricas medias de los puntos de muestra por duplicado

La 2-iminobiotina aumenta la fosforilación de la molécula pro-supervivencia akt. La 2-IB (30 ng/mL) no influyó en la fosforilación de erk1/2 y stat5. Sin embargo, se detectó una tendencia de aumento de la fosforilación de la molécula pro-supervivencia akt en condiciones normóxicas e hipóxicas (akt fosforilado/akt, normoxia: 0.23 ± 0.09; akt fosforilado/akt, hipoxia: 0.29 ± 0.14; akt fosforilado/akt, normoxia más 30 ng/mL de 2-IB: 0.78 ± 0.54; akt fosforilado/akt, hipoxia más 30 ng/mL de 2-IB: 0.60 ± 0.33; P>0.05; Figura 5)

Discusión

La 2-IB es un inhibidor reversible de la biosíntesis de NO, bloqueando principalmente la actividad de iNOS y nNOS (Tataranno et al., 2015). Sin embargo, los efectos celulares de la 2-IB pueden no limitarse solo a la regulación de NOS y varios autores han sugerido la participación de vías de acción de la 2-IB independientes de NOS (Nijboer et al., 2008; Tataranno et al., 2015; van Tweel et al., 2005; van Kesteren et al., 2006). En el presente documento empleamos un modelo de cultivo de células neuronales humanas de células IMR-32 para evaluar posibles efectos neuroprotectores de 2-IBin vitro,para explorar los mecanismos celulares subyacentes y determinar las concentraciones neuroprotectoras óptimas de 2-IB. Las células IMR-32 expresan sólo cantidades marginales de NOS (ARNm, proteína y actividad de NOS) (Fujisawa et al., 1994). Estos hallazgos se ven confirmados por nuestros datos, que muestran bajas concentraciones de nitrato y nitrito en medios de cultivo de células IMR-32. Como la suma de nitrato y nitrito se correlaciona bien con la cantidad de NO total (Kaandorp et al., 2010), nuestros datos sugieren concentraciones bajas de NO y actividades de NOS en cultivos de IMR-32, clasificando a IMR-32 como un modelo adecuado para la investigación de mecanismos mediados por 2-IB independientes de NOS.

La lesión hipóxica/isquémicain vivoproduce una rápida pérdida de compuestos de fosfato de alta energía y una despolarización generalizada, que induce la liberación de glutamato y la apertura de los canales de calcio regulados por glutamato y dependientes del voltaje, lo que resulta en un gran aumento en las concentraciones del Ca2+ citosólico (White et al., 2000). Este aumento de Ca2+ desencadena una cascada de eventos que finalmente conducen a la degeneración de las células neuronales (Perrone et al., 2013). En un primer enfoque, empleando nuestro sistema de hipoxia enzimáticain vitrorecientemente descrito (Huang et al., 2013a; Huang et al., 2013b; Hummitzsch et al., 2014; Weber et al., 2015; Zitta et al., 2012), las células IMR-32 se sometieron a 7 h de hipoxia, lo que resultó en un daño celular significativamente mayor, una reducción de la actividad metabólica y una acumulación de ROS en el medio de cultivo. La incubación de los cultivos con diferentes concentraciones de 2-IB durante 24 h después de la agresión hipóxica atenuó el daño celular inducido por la hipoxia, aumentó la actividad metabólica de las células y redujo la producción de ROS, mientras que el aumento de peróxido de hidrógeno mediado por la hipoxia no se vio afectado por 2-IB. Curiosamente, nuestros resultados revelaron que las concentraciones de 2-IB en los medios de cultivo en el intervalo entre 30 ng/mL y 50 ng/mL fueron más efectivas para reducir el daño celularin vitroinducido por la hipoxia. Concentraciones más altas o bajas de 2-IB no fueron efectivas o mostraron efectos adversos.

En cuanto al daño celular, la actividad metabólica y la producción de ROS, los resultados de nuestro estudio mostraron una relación de respuesta a la dosis en forma de U que ha sido documentada en numerosas investigaciones biológicas, toxicológicas y farmacológicas (Calabrese y Baldwin, 2001).

Con base en los hallazgos mencionados anteriormente de que las bajas concentraciones de 2-IB protegían del daño celular inducido por la hipoxia, decidimos investigar más a fondo posibles modos de acción adicionales de la 2-IB. Se realizó un perfil del proteoma del estrés celular y reveló que la hipoxia sobrerregulada el 88 % de las proteínas de estrés investigadas, mientras que solo el 73 % estaba sobrerregulada después de incubar las células con 30 ng/mL de 2-IB durante 4 horas después de la hipoxia. Uno de los principales indicadores del estrés celular son las ROS (Moretti et al., 2015) y varios estudios han demostrado un efecto protector de los fármacos antioxidantes contra el estrés celular y la apoptosis después de la isquemia cerebral y la reperfusión (Perrone et al., 2013). La 2-IB posee funciones antioxidantes (Fan y Van Bel, 2010; Peeters-Scholte et al., 2002) y también mostramos una reducción moderada de la producción de ROS inducida por hipoxia por la 2-IB. La hipoxia y los cambios mediados por 2-IB en la expresión de la proteína de estrés celular fueron detectables tan pronto como 4 horas después del final de la hipoxia, mientras que se produjeron cambios significativos en ROS 17 horas después de la hipoxia. Por lo tanto, creemos que la producción de ROS representa una consecuencia del estrés celular inducido por la hipoxia y que la reducción de r Os mediada por 2-IB posiblemente se logre indirectamente mediante una reducción temprana de la expresión de la proteína del estrés celular. La hipótesis de que la 2-IB atenúa la producción de ROS indirectamente mediante la regulación de las proteínas del estrés celular también está respaldada por el hecho de que hasta ahora no se han descrito funciones antioxidantes directas de la 2-IB.

Finalmente, el estrés celular y la apoptosis están estrechamente asociados (Mendez-Armenta et al., 2014; Rodrigo et al., 2013) y se ha descrito que la fosforilación de las moléculas de señalización celular akt y erk induce vías antiapoptóticas (Jalsrai et al., 2014; Zhang et al., 2014). Observamos una tendencia hacia una mayor fosforilación de akt después de la adición de 30 ng/mL de 2-IB, que se encontró tanto en condiciones hipóxicas como normóxicas. La activación de Akt también se puede lograr mediante diferentes isoformas de sirtuina (SIRT) (Pillai et al., 2014) y los resultados de nuestra matriz de estrés celular mostraron una mayor expresión de SIRT2 después de la adición de 2-IB en condiciones normóxicas e hipóxicas, lo que sugiere que las vías mediadas por 2-IB pueden implicar la fosforilación de akt y/o la expresión de sirtuinas.

En conjunto, mostramos que el daño de las células neuronales inducido por la hipoxia es inhibido por bajas concentraciones de 2-IB y que los mecanismos asociados pueden involucrar ROS y una subregulación de la expresión de proteínas asociada al estrés.

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Ejemplo 2: Tratamiento combinado de 2-IB e hipotermiain vitro

Hemos demostrado que el análogo de biotina 2-iminobiotina (2-IB) es capaz de reducir el daño de las células neuronales. En el presente documento evaluamos si la 2-IB tiene el potencial de atenuar el daño de las células neuronales inducido por la hipoxia también en condiciones de hipotermia leve.

Métodos: Se indujo hipoxiain vitrodurante 7 h utilizando cultivos celulares IMR-32. Después de la agresión hipóxica, los cultivos se sometieron a 25 h de hipotermia leve (33.5 °C) y se incubaron con o sin 2-IB (10, 30, 50, 100 y 300 ng/mL). La morfología celular se evaluó mediante microscopía de campo claro y el daño celular se analizó mediante ensayos de LDH. La producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) se midió mediante ensayos fluorométricos. Se realizó una transferencia Western para PARP y akt y erk1/2 fosforilados y no fosforilados.

Resultados: La hipoxia provocó signos morfológicos de daño celular incluso en condiciones de hipotermia. Las mediciones de LDH como marcador de daño celular revelaron un aumento significativo de LDH tan pronto como a las 25 h después de la agresión hipóxica, si las células crecieron en condiciones de hipotermia leve (p < 0.01), mientras que en condiciones normotérmicas un daño celular comparable ya era detectable tan pronto como a las 17 h después de la agresión hipóxica (Figura 6). La aplicación post-hipóxica de 30 ng/mLde 2-IB redujo la liberación de LDH inducida por la hipoxia incluso bajo hipotermia, lo que resultó en niveles de LDH que no fueron estadísticamente significativos con respecto a los valores observados bajo normoxia (hipoxia: p < 0.01 frente a normoxia; hipoxia 2-IB: p>0.05 frente a normoxia). (Figura 7) La aplicación post-hipóxica de 2-IB (30 ng/mL) atenuó la producción de ROS inducida por la hipoxia en condiciones hipotérmicas (hipoxia: p < 0.01 frente a normoxia; hipoxia 2-IB: p < 0.05 frente a normoxia). Las concentraciones más altas de 2-IB fueron menos efectivas para reducir la generación de ROS inducida por la hipoxia. Aunque las concentraciones de peróxido de hidrógeno en el medio de cultivo aumentaron 9 veces por la hipoxia bajo hipotermia leve (p < 0.001 frente a normoxia), la aplicación post-hipóxica de 2-IB no influyó en la generación de peróxido de hidrógeno. (Figura 8) La escisión de PARP y la fosforilación de akt aumentaron por tendencia después de la agresión hipóxica (Figuras 9 y 10B), mientras que la hipoxia aumentó significativamente la fosforilación de erk1/2 pro-supervivencia (p < 0.05 frente a normoxia; Figura 10A). La adición post-hipóxica de 2-IB bajo hipotermia leve no influyó en la escisión o fosforilación de las moléculas mencionadas (Figura 9 y 10 A y B).

Conclusión: La 2-IB reduce el daño de las células neuronales inducido por la hipoxia en condiciones de hipotermia leve. La combinación de 2-iminobiotina e hipotermia leve es una estrategia prometedora para reducir el daño celular inducido por la hipoxia.

Ejemplo 3: Eficacia de 2-IB después de isquemia del prosencéfalo en ratas adultas

El modelo de oclusión modificado de cuatro vasos (4VO) en ratas adultas es un modelo muy eficaz para estudiar las consecuencias de la isquemia cerebral transitoria pero grave (Pulsinelli y Buchan, 1988). Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue investigar si la 2-IB, administrada mediante reperfusión, puede mejorar la función cognitiva en un modelo de rata 4VO, imitando el paro cardíaco en adultos.

Métodos:

Modelo de oclusión de cuatro vasos:

Las ratas fueron anestesiadas con ketamina (90 mg/kg) y xilazina sódica (10 %), como se describió anteriormente (Meilin et al., 2014). Se expusieron las primeros vértebras cervicales y las arterias vertebrales se ocluyeron permanentemente mediante electrocauterización. Las arterias carótidas comunes se aislaron a través de una incisión en la línea media ventral del cuello y se levantaron utilizando una ligadura de sutura de seda 4.0, colocada alrededor de ellas.

Veinticuatro horas después de la oclusión arterial vertebral, los animales fueron anestesiados nuevamente con isoflurano. Las arterias carótidas comunes se expusieron y se ocluyeron utilizando clips de microaneurisma durante 15 minutos. Después de retirar los clips se produjo la reperfusión. La piel de la incisión en el cuello se suturó con sutura de seda 4-0. Durante la operación, la temperatura central del animal se controló utilizando una sonda rectal (Modelo 400; YSI Inc., Yellow Springs, OH, EE. UU.) conectada a un termómetro (Modelo 8402-00; Cole-Parmer Instrument Co. Ltd, Londres, Reino Unido). La agresión isquémica se inició cuando se alcanzó una temperatura rectal de 37-38 °C, y esta temperatura se mantuvo durante todo el procedimiento utilizando un colchón calefactor.

Los animales operados de forma simulada se sometieron a los mismos procedimientos sin la oclusión de las arterias vertebrales y carótidas. Los animales fueron anestesiados. Las arterias vertebrales quedaron expuestas sin oclusión. Luego se suturó la piel y los animales regresaron a sus jaulas. El día 1 del estudio, se volvió a anestesiar a los animales y se expusieron las arterias carótidas comunes sin oclusión. Luego se suturó la piel y los animales se devolvieron a sus jaulas.

La presencia de isquemia global se verificó retirando la anestesia durante algunos segundos durante la isquemia. Los animales que no mostraron un reflejo de enderezamiento fueron considerados isquémicos y fueron incluidos en el estudio. Se excluyeron del estudio los animales que mostraron un comportamiento inusual no característico del comportamiento histórico en este modelo a las 24 horas después de la isquemia.

Tratamiento

Se dio tratamientos.c.directamente tras la reperfusión, a las 12 h y 24 h después de la oclusión, un régimen de tratamiento que ya demostró ser neuroprotector en un modelo de rata de HI de recién nacidos en (Van der Tweel, 2005). Durante el período de aclimatación, las ratas fueron asignadas aleatoriamente a grupos experimentales. Los animales fueron sometidos a 4VO por jaula o una rata por jaula fue sometida a HI. Las ratas recibieron vehículo (solución salina normal a pH 3.8-4.0) o 2-IB (1.1 mg/kg, 3.3 mg/kg, 10 mg/kg y 30 mg/kg disueltos en 5 mL/kg de solución salina normal a pH 3.8-4.0). Cada grupo de dosificación se mantuvo en jaulas separadas para evitar la contaminación cruzada por el consumo de heces durante el período de estudio. Los grupos experimentales fueron los siguientes.

Tabla: 2

Prueba del laberinto acuático de Morris

Las pruebas se realizaron durante el día. Las ratas fueron introducidas en una piscina estandarizada de 1.2 m de diámetro llena de agua durante 120 segundos o hasta localizar una plataforma escondida a 1 cm bajo la superficie del agua. Se proporcionaron varias señales visuales dentro de la habitación en la que se encontraba la piscina para permitir a las ratas navegar espacialmente por el laberinto de agua. A las ratas que localizaron la plataforma oculta se les permitió permanecer en ella durante 10 segundos, y a las ratas que no lograron encontrar la plataforma en 120 segundos se colocaron en la plataforma durante 10 segundos. A las ratas se les permitió dos intentos de encontrar la plataforma oculta, y esta prueba de aprendizaje se realizó durante un período de 4 días (días 28-31). La prueba de memoria se realizó el quinto día (día 32), momento en el que se retiró la plataforma oculta y se colocaron las ratas en la piscina durante un único ensayo de 60 segundos. Un observador que no conocía los grupos experimentales registró la cantidad de tiempo que cada rata pasó en el cuadrante donde anteriormente se había ubicado la plataforma oculta.

Se utilizó el laberinto acuático de Morris para evaluar qué tan bien las ratas recordaban la ubicación de la plataforma oculta y si habían aprendido a navegar hacia el cuadrante apropiado. Se midió el tiempo que la rata pasó en el cuadrante derecho. Este se consideró el resultado primario.

Durante la prueba de aprendizaje se calculó el tiempo necesario para encontrar una plataforma oculta en el agua. También se calculó el área bajo la curva (AUC) de las pruebas de aprendizaje posteriores. Estos parámetros se consideraron resultados secundarios.

Histología

Las ratas fueron sacrificadas 33 días después de la agresión con una sobredosis de pentobarbital sódico (100 mg/kg i.p.). Se realizó análisis histológico en al menos 9 ratas para cada grupo. Los cerebros de las otras 3 ratas por grupo se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron para análisis futuros. El cerebro se perfundió a través del ventrículo izquierdo con solución salina normal heparinizada para eliminar el exceso de sangre del cerebro. Posteriormente, el cerebro se perfundió con solución salina tamponada con fosfato de paraformaldehído al 4 %. Se extrajo todo el cerebro y se sumergió en formaldehído durante al menos otras 72 h. Los cerebros se incluyeron en parafina. Se cortaron secciones coronales (6 mm) a aproximadamente 3.3 mm del bregma y se tiñeron con hematoxilina-eosina. Se puntuaron secciones de forma ciega para las neuronas vivas en la parte derecha e izquierda de la región CA1 del hipocampo, el área más dañada en este modelo de isquemia global. Esto también se consideró un parámetro de resultado secundario.

Análisis estadístico

Utilizando una potencia del 80 % y un alfa de 0.05 con una diferencia estimada de medias ± DE de 8 ± 4, se necesitaron al menos 13 ratas por grupo experimental. Sin embargo, un mayor número de ratas comenzaron el procedimiento quirúrgico, pero se perdieron debido al procedimiento quirúrgico. Las ratas operadas de forma simulada (n = 6) solo se sometieron al procedimiento quirúrgico, pero no a la oclusión del vaso (permanente y temporal).

Todos los datos se expresan como la media ± DE. La evaluación estadística de los datos se realizó mediante ANOVA unidireccional cuando fue apropiado. Para los cambios de variables a lo largo del tiempo, se utilizó el análisis del modelo lineal general con el valor inicial como covariable. El análisis post hoc se realizó mediante la prueba bilateral de Dunnett frente al tratamiento con vehículo. Se determinó que un valor de p < 0.05 era estadísticamente significativo. El análisis estadístico se realizó mediante SPSS (IBM, versión 22).

Véase la Figura 11 para ver un esquema del procedimiento del estudio.

Resultados:

Animales

El peso corporal aumentó con el tiempo en todos los grupos. No hubo diferencias significativas entre los grupos de tratamiento. Tampoco se encontraron diferencias significativas entre los valores de glucosa en sangre.

Memoria

La prueba de memoria, definida como el tiempo pasado en el cuadrante derecho el día 32, fue de 10.1 ± 3.0 segundos en las ratas operadas de forma simulada, 3.9 ± 4.4 segundos en las ratas tratadas con vehículo y 10.7 ± 4.4, 12.7 ± 6.7, 12.0 ± 7.3 y 12.5 ± 6.0 segundos en las ratas tratadas con 1.1, 3.3, 10 y 30 mg/kg/dosis de 2-IB, respectivamente (Figura 12). El ANOVA unidireccional mostró una diferencia significativa entre los grupos de tratamiento con vehículo y 2-IB (p < 0.0005). El análisis post hoc de Dunnett reveló una diferencia significativa entre vehículo y 1.1 mg/kg/dosis (p = 0.003), vehículo y 3.3 mg/kg/dosis (p = 0.000), vehículo y 10 mg/kg/dosis (p = 0.001) y grupo con vehículo y 30 mg/kg/dosis (p = 0.000).

Prueba de aprendizaje

Los resultados de la prueba de aprendizaje del día 28 al día 31 se muestran en la Figura 13. El modelado lineal general mostró una diferencia significativa entre los grupos de tratamiento (p = 0.004). El análisis post hoc de Dunnett mostró una diferencia significativa entre el tratamiento simulado (p < 0.01), el de 1.1 mg/kg/dosis (p < 0.05), el de 3.3 mg/kg/dosis (p < 0.01) y el de 30 mg/kg/dosis (p < 0.05) y las ratas tratadas con vehículo.

El AUC de la prueba de aprendizaje desde el día 28 hasta el 31 fue 231 ± 84 en ratas simuladas, 349 ± 76 en ratas tratadas con vehículo, 276 ± 85, 266 ± 64, 297 ± 79, 287 ± 89 en las ratas tratadas con 1.1, 3.3, 10 y 30 mg/kg/dosis de 2-IB, respectivamente. El ANOVA unidireccional mostró una diferencia significativa entre los grupos (p < 0.012). El análisis post hoc de Dunnett reveló una diferencia significativa entre el grupo de vehículo y 1.1 mg/kg/dosis, y el grupo de vehículo y 3.3 mg/kg/dosis (p < 0.05).

Histología

Hubo una disminución significativa en las células supervivientes en la región CA1 causada por el 4VO (ANOVA unidireccional p < 0.005, análisis post hoc simulado frente a todos los demás tratamientos p < 0.005). Los resultados histológicos mostraron 175 ± 53 células supervivientes en la región CA1 de las ratas operadas de forma simulada, 39 ± 51 en las ratas tratadas con vehículo y 29 ± 34, 71 ± 61,63 ± 54 y 50 ± 51 en las ratas tratadas con 1.1, 3.3, 10 y 30 mg/kg/dosis de 2-IB, respectivamente. En el presente estudio estudiamos los posibles efectos neuroprotectores de la 2-IB, un análogo de la biotina, sobre la memoria en un modelo 4VO utilizando la prueba del laberinto acuático de Morris. La 2-IB, administrada en un intervalo de dosis de 1.1 a 30 mg/kg/dosis tras la reperfusión, mostró una memoria significativamente mejorada a los 32 días después de la isquemia global. Además, la curva de aprendizaje para encontrar una plataforma visible fue significativamente mejor en las ratas tratadas con 2-IB en un intervalo de dosis de 1.1 a 30 mg/kg/dosis en comparación con las ratas tratadas con vehículo, aunque no se observó una cantidad significativa de células neuronales preservadas en el área CA1 del hipocampo a los 33 días después de 4VO.

En los supervivientes de OHCA, entre el 30 % y el 50 % experimentan déficits cognitivos durante hasta varios años después del alta (Green et al., 2015). Las pruebas neuropsicológicas mostraron alteraciones frecuentes, con mayor frecuencia en el dominio de la memoria (Orbo et al., 2015). Incluso en pacientes que salieron del hospital con una puntuación de CPC de 1, se observó una reducción de la precisión de la memoria de trabajo y la velocidad de la memoria espacial cuando se realizó una batería de pruebas neurocognitivas (Iannacone et al., 2014). La prueba del laberinto acuático de Morris es un procedimiento relativamente simple en el que se prueban las condiciones de la memoria tanto espacial (plataforma oculta) como no espacial (plataforma visible) (BromLey-Brits et al., 2011). La administración de 2-IB tras la reperfusión después del 4VO aumentó significativamente la función de memoria de las ratas en un grado comparable a la situación simulada.

Los déficits de memoria se corresponden fisiopatológicamente con daño neuronal principalmente en el hipocampo (Bjorklundt et al., 2014). El modelo 4VO conduce predominantemente a una disfunción de la memoria basada en una lesión neuronal en la región CA1 del hipocampo (Pulsinelli y Buchan, 1988). Después de tiempos de supervivencia clínicamente relevantes, se produjo una repoblación espontánea en la región CA1, pero esto no fue suficiente para compensar las alteraciones del comportamiento derivadas de la agresión isquémica (Langdon et al., 2008). En el presente estudio hubo una disminución significativa en las células supervivientes en la región CA1 del hipocampo después de la HI. Sin embargo, el tratamiento con 2-IB no mostró una diferencia significativa frente al vehículo, aunque hubo una tendencia a una mayor supervivencia en un intervalo de dosis de 3.3-30 mg/kg. Todas las ratas fueron sacrificadas 33 días después de la agresión con HI. No se sacrificaron ratas en momentos anteriores, por lo que no sabemos si ya se produjo la repoblación en el hipocampo. Sin embargo, sí sabemos que con menos células supervivientes la función de la memoria en las ratas tratadas con 2-IB fue mejor que en las ratas tratadas con vehículo.

Conclusión:

Ratas adultas tratadass.c.con 3 obsequios de 2-IB en un intervalo de dosis de 1.1-30 mg/kg/dosis directamente tras la reperfusión cada 12 h mostraron una memoria significativamente mejorada después de 4VO en comparación con las ratas tratadas con vehículo. En estos momentos se ha iniciado un ensayo clínico de Fase 2 para evaluar la seguridad y farmacocinética en adultos tras OHCA.

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Ejemplo 4: Cálculo de dosis en humanos.

La toxicocinética de la 2-IB se estudió durante un período de 96 h mediante infusiones intravenosas en pulsos a ratas adultas. El propósito de este estudio fue generar parámetros toxicocinéticos (Cmáx, tmáx, AUC, 11/2) a partir de concentraciones en plasma de 2-IB en ratas macho y hembra después de repetidas infusiones i.v..

Los animales recibieron seis pulsos de 15 minutos de 6.6, 13.3 o 27.5 mg/kg de 2-IB, en un período de 24 h (dosis diaria total de 40, 80 y 165 mg/kg, respectivamente) en los Grupos 2, 3 y 4 respectivamente, durante cuatro días consecutivos, para un total de 23 infusiones. El grupo 1 recibió únicamente el vehículo. La exposición sistémica se controló el día 0 y el día 4. La toma de muestras de sangre se realizó a los 15 min y 0.5, 1 y 4 h después de la primera infusión, y a los 15 min y 0.5, 1,4, 8 y 24 h después de la última dosis.

Para ratas macho y hembra y para el primer y último pulso, los valores medios de AUC0-4h fueron respectivamente 2310, 2530, 1750 y 1950 ng.h/mL después de 6.6 mg/kg por pulso. Entre los sexos y el primer y último pulsos, la media general fue de aproximadamente 2135 ng.h/mL.

En el Ejemplo 3, los efectos farmacológicos más beneficiosos se observaron después de niveles de dosis tan bajos como 1.1 mg/kg y hasta 3.3 mg/kg inclusive. Sin embargo, también se observaron efectos a dosis más altas. Suponiendo una PK lineal, se puede esperar un AUC media de aproximadamente 356 ng.h/mL con el nivel de dosis de 1.1 mg/kg y un AUC de aproximadamente 1068 ng.h/mL con el nivel de dosis de 3.3 mg/kg. Desde una perspectiva traslacional, una exposición de aproximadamente 356 ng.h/mL puede considerarse como el nivel objetivo mínimamente eficaz para los seres humanos adultos. Las exposiciones de hasta 1068 ng.h/mL inclusive también se consideran efectivas, así como exposiciones más altas.

La farmacocinética de 2-IB se investigó en un estudio clínico de Fase I en el que se investigó la seguridad y tolerabilidad de dosis únicas y múltiples de infusión i.v. en pulsos de 2-IB en sujetos varones sanos. El estudio fue un estudio aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo y de aumento de dosis con 3 grupos de 6 sujetos varones sanos que recibieron una única infusión i.v. o infusiones i.v. pulsadas de 2-IB o placebo en 3 periodos. Los tratamientos se aleatorizaron de modo que cada sujeto recibió 2 de 3 niveles de dosis previstos de 2-IB y una vez placebo.

Para los sujetos que recibieron 6 pulsos de 0.6 mg/kg en un período de 24 h, el AUC4h medio fue de 1170 ng.h/mL después de la primera infusión y de 1441 ng.h/mL después de la última infusión. Entonces, en promedio, el AUC0-4h medio fue de aproximadamente 1305 ng.h/mL durante el período de dosificación de 24 h.

Suponiendo una PK lineal, se espera que una dosis pulsada de 0.16 mg/kg proporcione una exposición (AUC4h) que corresponde a aproximadamente 356 ng.h/mL.

Ejemplo 5A: Tratamiento con 2-IB en adultos tras OHCA (paro cardíaco extrahospitalario)

Intervención:

La primera cohorte de ocho pacientes recibirá 2-IB en una dosis de 0.055 mg/kg/dosis cada 4 horas por vía intravenosa, 6 veces en total (parte A; es decir, 0.33 mg/kg/día). La segunda cohorte de ocho pacientes (cohorte B, es decir, 0.99 mg/kg/día) recibirá una dosis prevista de 0.165 mg/kg/dosis y la tercera cohorte de ocho pacientes recibirá una dosis prevista de 0.500 mg/kg/dosis (cohorte C, es decir, 3 mg/kg/día). La primera dosis se administrará lo antes posible y dentro de las 6 horas posteriores a la OHCA. El aumento al siguiente nivel de dosis se realizará después de que se hayan realizado análisis farmacocinéticos y no se hayan encontrado problemas de seguridad relevantes. Todos los pacientes serán tratados con un control de temperatura objetivo de 36 °C.

Producto/tratamiento en investigación

Todos los pacientes recibirán 2-IB de etiqueta abierta, que se proporcionará en viales de 50 mL con un volumen extraíble de 40 mL. No se utilizará ningún placebo.

2-IB está formulado como una solución salina isotónica, isoosmótica de 0.75 mg/mL para inyección con una pequeña cantidad de tampón cítrico (aproximadamente 15 mmol/L) a pH 4.0. La 2-IB se administrará por vía intravenosa a través de un catéter central insertado percutáneamente para disminuir el riesgo de extravasación de la solución ácida utilizando un catéter de lumen doble o múltiple. La medicación del estudio se utilizará sin diluir y se transferirá a una jeringa; el volumen depende del peso del paciente.

Los tiempos de infusión (15 minutos por dosis) serán idénticos dentro y entre los grupos A, B y C, y las velocidades de infusión se ajustarán (triplicarán) en el Grupo B en comparación con el Grupo A aumentando la velocidad de infusión. En el Grupo C, las dosis y velocidades de infusión se triplicarán nuevamente en comparación con el Grupo B.

A modo de ejemplo, un paciente de 80 kg del Grupo A recibirá 0.055 mg/kg = 0.055 * 80 = 4.4 mg de 2-IB por dosis, lo que equivale a 5.9 mL de líquido inyectable por dosis.

Resultados

Los pacientes de las tres cohortes serán monitoreados de la siguiente manera.

Se determinarán los niveles de enolasa neuronal específica (NSE) y S100b a las 24 y 48 h después de la primera dosis de 2-IB. (Véase Rundgren Resuscitation. Julio de 2009; 80(7): 784-9 y Shinozaki Crit Care. 2009; 13(4): R121 para obtener una descripción de cómo determinar los niveles de estos marcadores y su uso para predecir el resultado del paciente).

Las puntuaciones de CPC (categorías de desempeño cerebral), CAMCI (evaluación computarizada para lesiones cognitivas leves) y IQCODE breve (cuestionario del informante sobre deterioro cognitivo) se registrarán 30 días después de O<h>C<a>. (Véase Lilja BMC Cardiovascular Disorders 2013, 13: 85 y Sabedra Resuscitation 201590: 67-72 para la descripción de las pruebas de función cognitiva).

Los pacientes de las tres cohortes pueden exhibir puntuaciones cognitivas promedio más altas en comparación con los controles históricos de OHCA.

Ejemplo 5B: Tratamiento con 2-IB en adultos después de OHCA

Intervención:

Se realizó un estudio como se describe en el ejemplo 5A. Es decir, una primera cohorte de ocho pacientes recibió 2-IB en una dosis de 0.055 mg/kg/dosis cada 4 h iv, 6 veces en total (parte A; es decir, 0.33 mg/kg/día).

Los ocho adultos que sufrieron un paro cardíaco fuera del hospital fueron tratados con 2-IB en infusión intravenosa de 15 minutos cada 4 h durante 6 administraciones. Se utilizó el control de la temperatura objetivo para mantener la temperatura corporal de 36.0 (mediana). Con base en los resultados de la primera cohorte, se determinó que la segunda y tercera cohortes descritas en el ejemplo 5A no eran necesarias.

Análisis:

En todos los pacientes se determinó la creatinina en suero al inicio del estudio (durante el ingreso al hospital). La TFGe (tasa de filtración glomerular estimada) se determinó mediante la siguiente ecuación:

TFGe = 186 * SeCr1154 * Edad'0203 * 0.724SEXO

Sexo: masculino = 0; femenino = 1.

(Véase para determinar TFGe Rule AD, Larson TS, Bergstralh EJ, Slezak JM, Jacobsen SJ, Cosio FG. Using serum creatinine to estimate glomerular filtration rate: accuracy in good health and in chronic kidney disease. Ann Intern Med.

21 de diciembre de 2004; 141 (12): 929-37).

Se generaron modelos para determinar el impacto de los ajustes de dosis y la variabilidad del AUC.

Resultados:

Las características de los pacientes se informan en la Tabla 3.

Tabla 3.

La eliminación pareció aumentar al aumentar la TFGe o SeCre, no se observaron cambios para otras covariables. El volumen pareció aumentar con el peso corporal, sin diferencias para otras covariables.

Las métricas de exposición se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4

Las estimaciones de los parámetros varían ligeramente para el modelo de covariables con CreaO en comparación con el modelo básico. Véase la Tabla 5.

Tabla 5

Se realizó un análisis de covariables exploratorio analizando el peso corporal, la edad, la TFGe, la SeCre y la temperatura central. El modelo utilizado fue el siguiente:

/Coví\

Pa?j —Q±(covrnedicmc

9son parámetros que describen la relación entre el parámetro PK y las covariables;

ndescribe la variabilidad entre individuos.

El análisis de covariables indica que SeCre y la temperatura pueden tener influencia sobre CL y el peso sobre el volumen.

La variabilidad en la eliminación se reduce considerablemente si se tienen en cuenta los niveles de SeCre. La Figura 14 demuestra que la eliminación y la dosis requerida para alcanzar el objetivo varían en función de SeCre.

En un modelo de predicción, ajustar las dosis para CreaO mejora la capacidad de alcanzar el AUC objetivo (véase la Figura 15).

La Tabla 6 muestra las dosis para lograr una exposición de 356 ng.h/mL en el 50 % de los pacientes (independientemente del peso).

Tabla 6

sis (mg)

La Tabla 7 muestra las dosis para lograr una exposición de 356 ng.h/mL en el 95 % de los pacientes (independientemente del peso).

Tabla 7

Creatinina en suero (<j>M) Volumen de dosis (mL) Dosis (mg) baja alta

20 <30 25 18.75

Creatinina en suero (<|j>M) Volumen de dosis (mL) Dosis (mg)

baja alta

30 <40 20 15.00

40 <50 16 12.00

50 <60 13 9.75

60 <80 11 8.25

80 <100 8 6.00

100 <125 7 5.25

125 <150 6 4.50

150 <200 5 3.75

La Tabla 8 muestra una comparación de los valores de AUC obtenidos con el modelo de covariables con CreaO y las predicciones de dosis, así como una dosificación plana.

Tabla 8

ID Creatinina WT AUCinf obs. AUCinf sim. cuando la dosificación AUCinf sim. cuando la dosificación se en suero (kg) (basada en se basa en CreaO de la Tabla 6 basa en 4.8 mg para todos

(j M) el peso)

1 75 65 349 722 427

2 82 114 352 327 266

3 39 85 291 676 220

4 64 79 271 494 292

5 177 125 1235 588 765

6 136 90 884 781 847

7 105 85 464 692 642

8 122 110 1063 1070 993

La variabilidad en la eliminación también se reduce considerablemente cuando se tienen en cuenta los niveles de TFGe.

La Tabla 9 muestra una comparación de los valores de AUC obtenidos con el modelo de covariables y el modelo TFGe0 (TFGe tomado al inicio).

Tabla 9

La Tabla 10 muestra una comparación de los valores de AUC obtenidos con el modelo de covariables con TFGe y las predicciones de dosis, así como una dosificación plana.

Tabla 10

ID TFGe WT AUCinf obs. AUCinf sim. cuando se AUCinf sim. cuando la dosificación (MM) (kg) (basada en el peso) dosifica en TFGe se basa en 4.8 mg para todos 1 103 65 349 800 472

2 87 114 348 415 269

3 208 85 292 802 306

4 87 79 274 465 302

5 35 125 1227 626 814

6 48 90 886 806 873

7 66 85 462 596 484

8 56 110 1067 922 856

Media 86 94 613 679 547

Desv. est. 54 20 385 181 261

CV 63 21 63 27 48

Mín. 35 65 274 415 269

Mediana 77 88 405 713 478

Máx. 208 125 1227 922 873

La Tabla 10 demuestra que hay una disminución sustancial en la variabilidad de la exposición cuando la dosis se ajusta en función de la TFGe.

Con base en el análisis exploratorio de covariables, concluimos que:

• La eliminación parece estar influenciada por la función renal, expresada en este documento como creatinina en suero o TFGe basada en la creatinina en suero antes del tratamiento, así como por la temperatura corporal. • El volumen está influenciado por el peso corporal, lo que no tiene ningún efecto sobre la exposición en este estudio.

• La eliminación no está influenciada por el peso corporal.

En consecuencia, se puede administrar a los pacientes una dosificación basada en la creatinina en suero o la TFGe en lugar de una dosis ajustada por peso para lograr de manera consistente el nivel de exposición deseado.

Ejemplo 5C: Tratamiento con 2-IB en adultos tras OHCA bajo hipotermia

Se realizará un estudio en cuatro a seis adultos después de un paro cardíaco extrahospitalario tratado con 2-IB como una infusión intravenosa de 15 minutos cada 6 h durante 4 administraciones bajo hipotermia de 33 grados Celsius.

Según los resultados del Ejemplo 5B, la dosis de 2-IB necesaria para alcanzar la exposición objetivo se puede determinar de la siguiente manera.

La corrección de dosis para uso a temperaturas más bajas se puede determinar mediante la siguiente ecuación:

11,5fCreaO\~0947

* ( 93.5 )

Esto significa que dada la misma Crea0, esto sugeriría que CL podría disminuir al 37%del CL a 36° cuando la temperatura es de 33°. Para lograr la misma AUC, la dosis debe reducirse al 37 % de la dosis original. Además, el intervalo de tiempo hasta la siguiente dosis debe aumentarse a unas 6 horas.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. 2-iminobiotina para uso en el tratamiento de lesión de células cerebrales en un individuo, en el que se administran de 0.1 a 10 mg/kg/día de 2-iminobiotina a dicho individuo, en el que la 2-iminobiotina se administra cada cuatro a seis horas por día, preferentemente cada cuatro horas, y en el que dicho individuo no es un neonato.

2. La 2-iminobiotina para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se administra a dicho individuo de 0.2 a 10 mg/kg/día de 2-iminobiotina, preferiblemente de 0.2 a 5 mg/kg/día de 2-iminobiotina, más preferiblemente de 0.2 a 1 mg/kg/día.

3. La 2-iminobiotina para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se administran entre 2 y 39 mg de 2-IB por dosis, preferiblemente en el que se administran entre 3 y 12.75 mg de 2-IB por dosis.

4. 2-iminobiotina para su uso en el tratamiento de lesión de células cerebrales en un individuo, en el que se administran entre 6-120 mg/día de 2-iminobiotina, preferiblemente entre 18-78 mg/día de 2-iminobiotina;

y donde la 2-iminobiotina se proporciona en al menos tres dosis por día, preferiblemente en al menos seis dosis por día;

y en el que dicho individuo no es un neonato, preferiblemente

en el que dicho individuo recibe seis dosis de 3 a 12.75 mg de 2-iminobiotina.

5. La 2-iminobiotina para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho tratamiento se combina con un control de temperatura objetivo de 36 °C.

6. 2-iminobiotina para su uso en el tratamiento de lesión de células cerebrales en un individuo, en el que se administran de 0.01 a 5 mg/kg/día de 2-iminobiotina a dicho individuo, preferiblemente se administran de 0.04 a 3.7 mg/kg/día de 2-iminobiotina , preferiblemente en el que se administra entre 0.04 a 1.9 mg/kg/día de 2-iminobiotina, en el que la 2-iminobiotina se administra cada cuatro a seis horas, preferiblemente cada seis horas, en el que dicho tratamiento se combina con hipotermia y en el que dicho individuo no es un neonato.

7. La 2-iminobiotina para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se administran entre 0.5 y 8 mg de 2-IB por dosis, preferiblemente se administran entre 1 y 5 mg de 2-IB por dosis.

8. 2-iminobiotina para su uso en el tratamiento de lesión de células cerebrales en un individuo, en el que se administran entre 2-40 mg/día, preferiblemente 4-20 mg/día, de 2-iminobiotina, donde la 2-iminobiotina se proporciona en al menos tres dosis por día, preferiblemente en al menos cuatro dosis por día, en el que dicho tratamiento se combina con hipotermia y en el que dicho individuo no es un neonato.

9. La 2-iminobiotina para su uso en el tratamiento de lesión de células cerebrales en un individuo, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la 2-iminobiotina se administra de manera que el área bajo la curva de tiempo frente a la concentración en plasma de 0 a 4 h está entre 100ng.h/mL a 2000ng.h/mL, preferiblemente entre 300ng.h/mL a 1300ng.h/mL.

10. La 2-iminobiotina para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la dosis de 2-iminobiotina se ajusta en función de la función renal del individuo en función del nivel de creatinina en suero del individuo, preferiblemente en función de la tasa de filtración glomerular estimada (TFGe) del individuo.

11. La 2-iminobiotina para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha lesión de las células cerebrales es una hipoxia-isquemia cerebral y/o una lesión por reperfusión, o está asociada con un paro cardíaco.

12. La 2-iminobiotina para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho individuo es un ser humano de al menos un año de edad, preferiblemente al menos dos años de edad.

13. La 2-iminobiotina para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la 2-iminobiotina se administra por vía intravenosa o profiláctica, preferiblemente en el que la 2-iminobiotina se proporciona durante o antes de la cirugía cardíaca o de la aorta torácica.

14. La 2-iminobiotina para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se administran al menos cuatro, preferiblemente al menos seis, dosis de 2-iminobiotina.

15. Un método para determinar una dosis de 2-iminobiotina para tratar una lesión de células cerebrales en un individuo, en el que dicho individuo no es un neonato, comprendiendo el método determinar la concentración de creatinina en suero o la tasa de filtración glomerular estimada (TFGe) en el individuo y ajustar la dosis de 2-iminobiotina en función del nivel de creatinina en suero o TFGe, en el que la TFGe se determina de la siguiente manera:

TFGe = 186 * SeCr1154 * Edad'0203 * 0.724SEXO

Sexo: machos = 0; hembras = 1.