ES2965341T3

ES2965341T3 - Métodos de cromatografía de exclusión por tamaño para la caracterización de composiciones de virus adenoasociados recombinantes

Info

Publication number: ES2965341T3
Application number: ES20722925T
Authority: ES
Inventors: Li Zhi; Zhuchun Wu
Original assignee: Regenxbio Inc
Current assignee: Regenxbio Inc
Priority date: 2019-04-11
Filing date: 2020-04-10
Publication date: 2024-04-12
Anticipated expiration: 2040-04-10
Also published as: WO2020210600A1; EP4310495A2; HUE064411T2; EP3953483A1; IL287104A; FI3953483T3; EP4310495A3; EP3953483B1; DK3953483T3; JP2022526639A; PL3953483T3; SI3953483T1; US20220275358A1; JP2024102283A; JP7488281B2

Abstract

La presente divulgación se refiere al uso de cromatografía de exclusión por tamaño para aislar el genoma de AAV, para determinar la pureza del tamaño del genoma del vector de una composición que comprende partículas de rAAV aisladas, para evaluar el plegamiento o la estructura secundaria de los genomas del vector dentro de las cápsides y para determinar el título del genoma del vector (Vg) de una composición que comprende partículas de rAAV aisladas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de cromatografía de exclusión por tamaño para la caracterización de composiciones de virus adenoasociados recombinantes

CAMPO TÉCNICO

La presente divulgación se refiere al uso de la cromatografía de exclusión por tamaño para aislar el genoma de AAV y caracterizar las composiciones que comprenden partículas de rAAV.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los vectores recombinantes basados en el virus adenoasociado (AAV) son actualmente los productos de terapia génica más utilizados en el desarrollo. El uso preferido de los sistemas vectoriales de rAAV se debe, en parte, a la falta de enfermedades asociadas con el virus de tipo silvestre, la capacidad de los AAV para transducir células no divisorias y divididas, y la expresión transgénica robusta a largo plazo resultante observada en los ensayos clínicos y que indican un gran potencial para la administración en las indicaciones de terapia génica. Además, diferentes serotipos de vectores rAAV de origen natural y recombinantes, se dirigen específicamente a diferentes tejidos, órganos y células, y ayudan a evadir cualquier inmunidad preexistente al vector, ampliando así las aplicaciones terapéuticas de las terapias genéticas basadas en AAV. Antes de la replicación del virus defectuoso, por ejemplo, las terapias genéticas basadas en AAV se pueden adoptar más ampliamente para la etapa clínica tardía y el uso comercial, se necesitan desarrollar nuevos métodos para la producción a gran escala de partículas de virus recombinantes.

La pureza del producto es un atributo de calidad crítico para los productos biológicos terapéuticos con el potencial de afectar la seguridad y eficacia, por lo que la garantía de control, incluyendo las pruebas de liberación, es fundamental. El genoma vectorial de AAV se suministra al núcleo celular y puede ser persistente durante un largo período, mucho más largo que el de las proteínas de las cápsides. Por lo tanto, es deseable evaluar la pureza del genoma vectorial para los productos de AAV. La pureza relativa del AAV intacto que cuantifica la relación de cápside vacía y completa se puede determinar mediante ultracentrifugación analítica (AUC), microscopía crio-electrónica y cromatografía de intercambio iónico. Además, la presencia de vectores con genomas fragmentados y contaminantes del ADN no relacionados con los transgenes, a menudo denominados cápsides parcialmente llenas, puede resolverse mediante AUC. La pureza de la proteína de la cápside se puede determinar mediante SDS-PAGE o s DS-CGE. Si bien se han publicado algunos estudios para analizar el genoma de AAV mediante electroforesis capilar y en gel, no se ha establecido un método de consenso para la pureza del genoma de AAV.

Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de métodos para evaluar la pureza y estructura del genoma del vector de AAV con alta sensibilidad y alta reproducibilidad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

En un aspecto, la divulgación proporciona un método para aislar el genoma del virus adenoasociado recombinante (rAAV) mediante cromatografía de exclusión por tamaño. En algunas realizaciones, el método consiste en someter una composición que comprende partículas rAAV a una condición bajo la cual las partículas de rAAV se desnaturalizan antes de someter la composición que comprende las partículas de rAAV desnaturalizadas a la cromatografía de exclusión por tamaño. En algunas realizaciones, la fase móvil para la cromatografía de exclusión por tamaño comprende una sal, disolvente orgánico o detergente. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende además un agente amortiguador. En algunas realizaciones, el rAAV comprende una proteína de la cápside del serotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV-15 y AAV-16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC 12, AAV.HSC 13, AAV.HSC 14, AAV.HSC15, o AAV.HSC16. En algunas realizaciones, el rAAV comprende una proteína de la cápside del serotipo AAV-8 o AAV-9.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un método para caracterizar partículas del virus adenoasociado recombinante (rAAV) usando cromatografía de exclusión por tamaño. La caracterización de partículas rAAV aisladas incluye, pero no se limita a, determinar la pureza del tamaño del genoma vectorial de una composición que comprende partículas de rAAV aisladas, evaluar el plegamiento o la estructura secundaria de los genomas vectoriales dentro de las cápsides y determinar el título del genoma vectorial (Vg) de una composición que comprende partículas de rAAV aisladas. En algunas realizaciones, la fase móvil para la cromatografía de exclusión por tamaño comprende una sal, disolvente orgánico o detergente. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende además un agente amortiguador. En algunas realizaciones, el rAAV comprende una proteína de la cápside del serotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV-15 y AAV-16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10 , AAV.HSC11, AAV.HSC 12, AAV.HSC 13, AAV.HSC 14, AAV.HSC15, o AAV.HSC16. En algunas realizaciones, el rAAV comprende una proteína de la cápside del serotipo AAV-8 o AAV-9.

En algunas realizaciones, un método descrito en la presente es adecuado para la liberación por lotes, por ejemplo, para las pruebas de liberación de lotes y/o pruebas de liberación por lotes. En algunas realizaciones, un método divulgado en la presente se realiza como parte de las pruebas de liberación por lotes.

En algunas realizaciones, la divulgación proporciona:

[1.] Método de aislamiento del genoma del virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende

a) someter una composición que comprende partículas de rAAV a una condición bajo la cual las partículas de rAAV se desnaturalizan; y

b) someter la composición que comprende las partículas de rAAV desnaturalizadas a la cromatografía de exclusión por tamaño,

en donde la fase móvil para la cromatografía de exclusión por tamaño comprende una sal, disolvente orgánico o detergente;

[2.] el método de [1] que comprende además la recuperación del genoma de AAV;

[3.] el método de [1] que comprende además la medición de la absorbancia UV del eluato en una o ambas de aproximadamente 260 nm y aproximadamente 280 nm;

[4.] un método para determinar la pureza del tamaño del genoma vectorial de una composición que comprende partículas de rAAV aisladas, en donde el método comprende

a) someter la composición a una condición bajo la cual se desnaturalizan las partículas de rAAV;

b) someter la composición que comprende las partículas de rAAV desnaturalizadas a la cromatografía de exclusión por tamaño;

c) medir la absorbancia UV del eluato en uno o ambos de aproximadamente 260 nm y aproximadamente 280 nm; y

d) determinar la pureza del tamaño del genoma vectorial de la composición que comprende las partículas de rAAV,

[5.] un método para evaluar el plegamiento o estructura secundaria de los genomas vectoriales AAV dentro de las cápsides, en donde el método comprende

b) someter la composición que comprende las partículas de rAAV desnaturalizadas a la cromatografía de exclusión por tamaño; y

c) medir la absorbancia UV del eluato en uno o ambos de aproximadamente 260 nm y aproximadamente 280 nm,

[6.] un método para determinar el título del genoma vectorial (Vg) de una composición que comprende partículas aisladas de rAAV, en donde el método comprende

d) determinar el Vg de la composición que comprende las partículas de rAAV,

[7.] el método de cualquiera de [1] a [6], en donde someter la composición a una condición bajo la cual se desnaturalizan las partículas de rAAV comprende exponer la composición a una condición que maximiza sustancialmente la señal de SEC de ADNbc;

[8.] el método de cualquiera de [1] a [6], en donde someter la composición a una condición bajo la cual se desnaturalizan las partículas de rAAV comprende exponer la composición a una temperatura que no sea superior a 10 °C por encima de la temperatura mínima necesaria para desnaturalizar sustancialmente todo el genoma viral de la composición;

[9.] el método de cualquiera de [1] a [6], en donde someter la composición a una condición bajo la cual se desnaturalizan las partículas de rAAV comprende someter la composición a una condición que da como resultado una determinación del % de fragmento de ADN que se correlaciona con el % de la cápside parcialmente llena de la misma composición determinado por AUC;

[10.] el método de cualquiera de [1] a [6], en donde someter la composición a una condición bajo la cual se desnaturalizan las partículas de rAAV comprende exponer la composición a la desnaturalización térmica que maximiza sustancialmente la señal de SEC de ADNbc;

[11.] el método de cualquiera de [1] a [6], en donde someter la composición a una condición bajo la cual se desnaturalizan las partículas de rAAV comprende someter la composición a una desnaturalización térmica que da como resultado una determinación del % de fragmento de ADN que se correlaciona con el % de la cápside parcialmente llena de la misma composición determinado por AUC;

[12.] el método de cualquiera de [1] a [6], en donde someter la composición a una condición bajo la cual se desnaturalizan las partículas de rAAV comprende incubar la composición a una temperatura entre aproximadamente 65 °C y aproximadamente 95 °C, opcionalmente entre aproximadamente 70 °C y aproximadamente 90 °C, entre aproximadamente 75 °C y aproximadamente 85 °C, o entre aproximadamente 80 °C y aproximadamente 85 °C;

[13.] el método de [12], en donde la incubación es a aproximadamente 70 °C, a aproximadamente 75 °C, a aproximadamente 80 °C, a aproximadamente 85 °C o a aproximadamente 90 °C;

[14.] el método de [12], en donde la incubación es a aproximadamente 75 °C;

[15.] el método de [12], en donde la incubación es a aproximadamente 80 °C;

[16.] el método de [12], en donde la incubación es a aproximadamente 85 °C;

[17.] el método de cualquiera de [12] a [16], en donde someter la composición a una condición bajo la cual se desnaturalizan las partículas de rAAV consiste en incubar la composición a una temperatura entre aproximadamente 65 °C y aproximadamente 95 °C durante aproximadamente 5 minutos y 60 minutos;

[18.] el método de [17], en donde la incubación es de aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 25 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 35 minutos, aproximadamente 40 minutos, aproximadamente 45 minutos, o aproximadamente 60 minutos;

[19.] el método de [17], en donde la incubación es de aproximadamente 10 minutos;

[20.] el método de [17], en donde la incubación es de aproximadamente 15 minutos;

[21.] el método de [17], en donde la incubación es de aproximadamente 20 minutos;

[22.] el método de cualquiera de [12] a [21], en donde someter la composición a una condición bajo la cual se desnaturalizan las partículas de rAAV consiste en incubar la composición a una temperatura entre aproximadamente 65 °C y aproximadamente 95 °C durante aproximadamente 5 minutos y 60 minutos en presencia de un detergente;

[23.] el método de [22], en donde el detergente comprende SDS, bromuro de trimetilamonio (ETMAB), polisorbato 80, polisorbato 20, Pluronic F-68 o una combinación de los mismos;

[24.] el método de [22], en donde el detergente tiene una concentración entre aproximadamente el 0.005 % y aproximadamente el 0.5 %;

[25.] el método de [22], en donde el detergente comprende entre aproximadamente 0.005 % y aproximadamente 0.5 % de SDS;

[26.] el método de [22], en donde el detergente comprende aproximadamente 0.05 % de SDS;

[27.] el método de cualquiera de [12] a [26], en donde sustancialmente todas las partículas virales de la muestra se desnaturalizan por el proceso de desnaturalización;

[28.] el método de cualquiera de [12] a [26], en donde al menos aproximadamente el 95 % de las partículas virales de la muestra se desnaturalizan por el proceso de desnaturalización;

[29.] el método de cualquiera de [1] a [28], en donde someter la composición que comprende las partículas de rAAV desnaturalizadas a cromatografía de exclusión por tamaño comprende poner en contacto la composición con una resina de cromatografía de exclusión por tamaño que comprende un tamaño de poro nominal entre aproximadamente 50 nm y aproximadamente 500 nm;

[30.] el método de [29], en donde el tamaño nominal de los poros es de aproximadamente 100 nm, 200 nm, 300 nm o 400 nm;

[31.] el método de [29], en donde el tamaño nominal de los poros es de aproximadamente 200 nm;

[32.] el método de cualquiera de [1] a [31], en donde la cromatografía de exclusión por tamaño comprende el uso de una cromatografía líquida de alto rendimiento o un sistema de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento.

[33.] el método de cualquiera de [1] a [32], en donde la fase móvil para la cromatografía de exclusión por tamaño comprende una sal, disolvente orgánico y detergente.

[34.] el método de cualquiera de [1] a [33], en donde la fase móvil comprende una sal seleccionada del grupo que consiste en cloruro de sodio, acetato de sodio, bicarbonato de sodio, carbonato de sodio, carbonato de amonio, cloruro de amonio, nitrato de amonio y combinaciones de los mismos;

[35.] el método de [34], en donde la fase móvil comprende cloruro de sodio;

[36.] el método de cualquiera de [1] a [35], en donde la fase móvil comprende un detergente seleccionado del grupo que consiste en polisorbato 80, poloxámero 188, poloxámero 407, polisorbato 20, Pluronic F-68, o BRIJ 35, y combinaciones de los mismos;

[37.] el método de [36], en donde la fase móvil comprende polisorbato 80;

[38.] el método de cualquiera de [1] a [37], en donde la fase móvil comprende un disolvente orgánico seleccionado del grupo que consiste en metanol, isopropanol, acetonitrilo, dimetil sulfóxido (DMSO), tetrahidrofurano (THF), trifluoroetanol (TFE), hexafluoroisopropanol (HFIP), y combinaciones de los mismos;

[39.] el método de [38], en donde la fase móvil comprende metanol;

[40.] el método de cualquiera de [1] a [39], en donde la fase móvil para la cromatografía de exclusión por tamaño comprende además un agente amortiguador;

[41.] el método de [40], en donde el agente amortiguador se selecciona del grupo compuesto por fosfato de sodio, histidina, citrato de sodio, HEPES, MES, Tris, Bis-Tris, MOPS, TES, bicina, glicina, tricina, N-glicilglicina, acetato de sodio, carbonato de sodio, glicilglicina, lisina, arginina y combinaciones de los mismo;

[42.] el método de [40], en donde el agente amortiguador es fosfato de sodio;

[43.] el método de cualquiera de [1] a [42], en donde la fase móvil para la cromatografía de exclusión por tamaño comprende fosfato de sodio, cloruro de sodio, polisorbato 80 y metanol;

[44.] el método de [43], en donde la fase móvil comprende entre aproximadamente 5 mm y aproximadamente 50 mm de fosfato de sodio, entre aproximadamente 100 mm y aproximadamente 500 mm de cloruro de sodio, entre aproximadamente 0.01 % y aproximadamente 0.5 % de polisorbato 80, y entre aproximadamente 5 % y aproximadamente 50 % de metanol, y tiene un pH entre aproximadamente 6.0 y 8.5;

[45.] el método de [43], en donde la fase móvil comprende aproximadamente 10 mm de fosfato de sodio, aproximadamente 300 mm de cloruro de sodio, aproximadamente 0.05 % de polisorbato 80 y aproximadamente 20 % de metanol, y tiene un pH de aproximadamente 7.5;

[46.] el método de cualquiera de [1] a [45], en donde la composición que comprende partículas de rAAV comprende entre aproximadamente 2E+10 copias del genoma/ml y aproximadamente 1E+14 copias del genoma/ml.

En algunas realizaciones, un método descrito en la presente comprende la producción de una formulación estable que comprende partículas del virus adenoasociado recombinante (rAAV), en donde las partículas de rAAV se producen aislando partículas de rAAV de un alimento que comprende una impureza (por ejemplo, el cultivo de producción de rAAV), en donde el método para aislar partículas de rAAV comprende uno o más pasos de procesamiento. En algunas realizaciones, el procesamiento es al menos uno de recolección de un cultivo celular, clarificación del cultivo celular recolectado (por ejemplo, por centrifugación o filtración de profundidad), filtración de flujo tangencial, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de interacción hidrofóbica, filtración estéril. En otras realizaciones, el procesamiento incluye al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, o al menos 6 de recolección de un cultivo celular, clarificación del cultivo celular recolectado (por ejemplo, por centrifugación o filtración de profundidad), filtración de flujo tangencial, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de interacción hidrofóbica y filtración estéril. En algunas realizaciones, el procesamiento no incluye la centrifugación del cultivo celular recolectado.

La divulgación proporciona un método para producir una formulación estable compuesta por partículas aisladas del virus adenoasociado recombinante (rAAV), que comprende: (a) aislar las partículas de rAAV de un producto de alimentación que contenga una impureza mediante una o varias de las siguientes operaciones: centrifugación, filtración de profundidad, filtración de flujo tangencial, ultrafiltración, cromatografía de afinidad, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de interacción hidrofóbica, (b) caracterizar las partículas de rAAV aisladas mediante un método divulgado en la presente, y (c) formular las partículas de rAAV aisladas.

La divulgación proporciona un método para producir una dosis unitaria farmacéutica de una formulación estable compuesta por partículas aisladas del virus adenoasociado recombinante (rAAV), que comprende: (a) aislar las partículas de rAAV de un producto de alimentación que contenga una impureza mediante una o varias de las siguientes operaciones: centrifugación, filtración de profundidad, filtración de flujo tangencial, ultrafiltración, cromatografía de afinidad, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de interacción hidrofóbica, (b) caracterizar las partículas de rAAV aisladas mediante un método divulgado en la presente, y (c) formular las partículas de rAAV aisladas.

Otras características y ventajas de las composiciones y métodos descritos en la presente se harán más evidentes de la siguiente descripción detallada cuando se lea junto con los dibujos que lo acompañan.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1. HPLC de exclusión por tamaño para el análisis del ADN del genoma rAAV - descripción general del método.

Figuras 2A y 2B. Desnaturalización de las cápsides de rAAV. Figura 2A. Se muestra el perfil de SEC de muestras de rAAV expuestas a 65 °C durante 10 min o a 75 °C durante 10 min en presencia de 0.05 % de SDS. Se muestra la absorbancia UV a 260 nm. La flecha indica partículas que no fueron desnaturalizadas por el tratamiento a 65 °C durante 10 min. Figura 2B. Perfil SEC de la muestra de rAAV totalmente desnaturalizada y fragmentos de ADN marcador. El pico principal del ADN del vector corresponde al genoma del vector de longitud completa.

Figura 3. Cromatogramas superpuestos para tres productos de rAAV diferentes. Las muestras fueron desnaturalizadas por incubación a 80 °C durante 20 minutos en presencia de 0.05 % de SDS.

Figura 4. Desnaturalización y caracterización de la estructura del ADNmc. Se muestra el perfil de SEC de una muestra de rAAV expuesta a 75 °C durante 10 min, 85 °C durante 10 min, o 85 °C durante 20 min en presencia de 0.05 % de SDS. La presencia de ADNmc en la muestra expuesta a 75 °C durante 10 min indica que no fue completamente desnaturalizada por el tratamiento térmico. 85 °C durante 20min fue óptimo para desnaturalizar/linearizar el ADNbc. Se pudo observar una baja cantidad de genoma vectorial truncado en todas las muestras.

Figura 5. Curva de absorbancia UV260 de una preparación de AAV después de la desnaturalización térmica a 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C, 95 °C durante 20 min.

Figura 6. Comparación del % de fragmento de ADN por ADN-SEC vs. % parcial por Ultracentrifugación Analítica.

Figura 7. Curva de absorbancia UV260 de una preparación AAV tras una desnaturalización débil, fuerte y extra fuerte.

Figura 8. Optimización de procesos evaluada por DNA-SEC.

Figuras 9A-C. Las medidas de rendimiento del ensayo se realizaron con respecto a la precisión (Figura 9A y Figura 9B), linealidad y LoQ (Figura 9C). Los parámetros probados demuestran una confiabilidad y sensibilidad generales del ensayo DNA-SEC.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

En la presente, se proporciona un método para aislar el genoma del virus adenoasociado recombinante (rAAV) mediante cromatografía de exclusión por tamaño. En algunas realizaciones, el método consiste en someter una composición que comprende partículas rAAV a una condición bajo la cual las partículas de rAAV se desnaturalizan antes de someter la composición que comprende las partículas de rAAV desnaturalizadas a la cromatografía de exclusión por tamaño. En algunas realizaciones, la fase móvil para la cromatografía de exclusión por tamaño comprende una sal, disolvente orgánico o detergente. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende además un agente amortiguador.

También se proporciona un método para caracterizar partículas del virus adenoasociado recombinante (rAAV) usando cromatografía de exclusión por tamaño. La caracterización de partículas rAAV aisladas incluye, pero no se limita a, determinar la pureza del tamaño del genoma vectorial de una composición que comprende partículas de rAAV aisladas, evaluar el plegamiento o la estructura secundaria de los genomas vectoriales dentro de las cápsides y determinar el título del genoma vectorial (Vg) de una composición que comprende partículas de rAAV aisladas. En algunas realizaciones, un método descrito en la presente se utiliza para apoyar el desarrollo de productos y la optimización de procesos mediante la evaluación rápida de la calidad, por ejemplo, la pureza, de las partículas de rAAV producidas por los procesos modificados. En algunas realizaciones, se utiliza un método divulgado en la presente para evaluar la calidad de las partículas de rAAV en diferentes etapas de un proceso de fabricación de rAAV. En algunas realizaciones, el rAAV comprende una proteína de la cápside del serotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV-15 y AAV-16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10 , AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, o AAV.HSC16. En algunas realizaciones, el rAAV comprende una proteína de la cápside del serotipo AAV-8 o AAV-9.

Definiciones

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que comúnmente se entiende por un experto en la técnica con la que esta divulgación está relacionada. Para facilitar la comprensión de los métodos divulgados, a continuación se definen varios términos y frases.

Modificar, por ejemplo, la cantidad de un ingrediente en las composiciones, la concentración de un ingrediente en las composiciones, la tasa de flujo , el rendimiento de partículas de rAAV, el volumen de alimentación, la concentración de sal, y valores similares, y sus rangos, empleados en los métodos proporcionados en la presente, se refiere a la variación en la cantidad numérica que puede ocurrir, por ejemplo, a través de los procedimientos típicos de medición y manipulación utilizados para la fabricación de concentrados o soluciones de uso; a través de errores involuntarios en estos procedimientos; a través de diferencias en la fabricación, fuente o pureza de los ingredientes empleados para preparar las composiciones o llevar a cabo los métodos; y consideraciones similares. El término "aproximadamente" también abarca cantidades que difieren debido al envejecimiento de una composición con una concentración o mezcla inicial particular. El término "aproximadamente" también abarca cantidades que difieren debido a la mezcla o procesamiento de una composición con una concentración o mezcla inicial particular. Independientemente de que las reivindicaciones hayan sido modificadas o no por el término "aproximadamente", incluyen equivalentes a las cantidades. En algunas realizaciones, el término "aproximadamente" se refiere a rangos de aproximadamente 10-20 % más o menos que el número o rango indicado. En otras realizaciones, "aproximadamente" se refiere a más o menos 10 % del número o rango indicado. Por ejemplo, "aproximadamente 10 %" indica un rango de 9 % a 11 %.

"AAV" es una abreviatura de virus adenoasociado, y se puede utilizar para referirse al virus mismo o modificaciones, derivados, o pseudotipos de los mismos. El término abarca subtipos al1 y formas tanto naturales como recombinantes, excepto cuando se requiera lo contrario. La abreviatura "rAAV" se refiere al virus adenoasociado recombinante. El término "AAV" incluye AAV tipo 1 (AAV-1), AAV tipo 2 (AAV-2), AAV tipo 3 (AAV-3), AAV tipo 4 (AAV-4), AAV tipo 5 (AAV-5), AAV tipo 6 (AAV-6), AAV tipo 7 (AAV-7), AAV tipo 8 (AAV-8), AAV tipo 9 (AAV-9), AAV aviar, AAV bovino, AAV canino, AAV equino, AAV de primates, AAV de no primates y AAV ovino, así como modificaciones, derivados o pseudotipos de los mismos. "AAV de primates" se refiere a AAV que infectan a los primates, "AAV de no primates" se refiere a AAV que infectan a los mamíferos no primates, "AAV bovino" se refiere a AAV que infectan a los mamíferos bovinos, etc.

"Recombinante", como se aplica a una partícula AAV, significa que la partícula AAV es el producto de uno o más procedimientos que da como resultado en un constructo de partícula AAV que es diferente de una partícula AAV en la naturaleza.

Una partícula del virus adenoasociado recombinante "partícula de rAAV" se refiere a una partícula viral compuesta por al menos una proteína de la cápside AAV y un genoma vectorial rAAV del polinucleótido encapsidado que comprende un polinucleótido heterólogo (es decir, un polinucleótido distinto de un genoma AAV de tipo silvestre, como un transgén que se suministra a una célula de mamíferos). La partícula de rAAV puede ser de cualquier serotipo de AAV, incluyendo cualquier modificación, derivado o pseudotipo (por ejemplo, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, o AAV-10, o derivados/modificaciones/pseudotipos de los mismos). Tales serotipos y derivados/modificaciones/pseudotipos de AAV, y métodos para producir tales serotipos/derivados/modificaciones/ pseudotipos son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Asokan et al., Mol. Ther. 20(4):699-708 (2012).

Las partículas de rAAV de la divulgación pueden ser de cualquier serotipo, o cualquier combinación de serotipos, (por ejemplo, una población de partículas de rAAV que comprende dos o más serotipos, por ejemplo, que comprende dos o más partículas de rAAV2, rAAV8 y rAAV9). En algunas realizaciones, las partículas de rAAV son rAAV1, rAAV2, rAAV3, rAAV4, rAAV5, rAAV6, rAAV7, rAAV8, rAAV9, rAAV10, u otras partículas de rAAV, o combinaciones de dos o más de las mismas. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV son partículas de rAAV8 o rAAV9.

En algunas realizaciones, las partículas de rAAV tienen una proteína de la cápside AAV de un serotipo seleccionado del grupo que consiste en AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV-15 y AAV-16, o un derivado, modificación o pseudotipo de los mismos. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV tienen una proteína de la cápside AAV de un serotipo de AAV-8, AAV-9, o un derivado, modificación o pseudotipo de los mismos.

Los términos "depuración", "purificación", "separar", "separación", "aislar", "aislando" o "aislamiento", tal como se utilizan en la presente, se refiere al aumento del grado de pureza de un producto objetivo, por ejemplo, partículas de rAAV y genoma de rAAV de una muestra que comprende el producto objetivo y una o más impurezas. Típicamente, el grado de pureza del producto objetivo se incrementa al eliminar (total o parcialmente) al menos una impureza de la muestra. En algunas realizaciones, el grado de pureza del rAAV en una muestra se aumenta al eliminar (total o parcialmente) una o más impurezas de la muestra mediante el uso de un método descrito en la presente.

Como se utiliza en la presente divulgación y en las reclamaciones, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen formas plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.

Se entiende que siempre que se describan en la presente las realizaciones con el lenguaje "que comprende", se proporcionan también realizaciones análogas descritas en términos de "que consisten en" y/o "que consisten esencialmente en". También se entiende que siempre que se describan las realizaciones en la presente con el lenguaje "que consisten esencialmente de", se proporcionan también realizaciones análogas descritas en términos de "que consisten en".

El término "y/o" tal como se utiliza en una frase como "A y/o B" en este documento tiene la intención de incluir tanto A como B; A o B; A (solo); y B (solo). Del mismo modo, el término "y/o" tal como se utiliza en una frase como "A, B, y/o C" tiene la intención de abarcar cada una de las siguientes realizaciones: A, B, y C; A, B, o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).

Cuando las realizaciones de la divulgación se describan en términos de un grupo Markush u otra agrupación de alternativas, el método divulgado abarca no sólo todo el grupo enumerado en su conjunto, sino también cada miembro del grupo individualmente y todos los subgrupos posibles del grupo principal, y también el grupo principal con uno o más de los miembros del grupo ausentes. Los métodos divulgados también prevén la exclusión explícita de uno o más de los miembros del grupo en los métodos divulgados.

Métodos utilizando cromatografía de exclusión por tamaño

En algunas realizaciones, la divulgación proporciona métodos para aislar el genoma del virus adenoasociado recombinante (rAAV) mediante cromatografía de exclusión por tamaño. En algunas realizaciones, un método descrito en la presente comprende someter una composición que comprende partículas rAAV a una condición bajo la cual las partículas de rAAV se desnaturalizan antes de someter la composición que comprende las partículas de rAAV desnaturalizadas a la cromatografía de exclusión por tamaño. En algunas realizaciones, la fase móvil para la cromatografía de exclusión por tamaño comprende una sal, disolvente orgánico o detergente. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende además un agente amortiguador. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende fosfato de sodio, cloruro de sodio, polisorbato 80 y metanol.

En algunas realizaciones, la divulgación proporciona métodos para caracterizar las partículas del virus adenoasociado recombinante (rAAV) usando la cromatografía de exclusión por tamaño. La caracterización de partículas rAAV aisladas incluye, pero no se limita a, determinar la pureza del tamaño del genoma vectorial de una composición que comprende partículas de rAAV aisladas, evaluar el plegamiento o la estructura secundaria de los genomas vectoriales dentro de las cápsides y determinar el título del genoma vectorial (Vg) de una composición que comprende partículas de rAAV aisladas. En algunas realizaciones, un método descrito en la presente comprende someter una composición que comprende partículas rAAV a una condición bajo la cual las partículas de rAAV se desnaturalizan antes de someter la composición que comprende las partículas de rAAV desnaturalizadas a la cromatografía de exclusión por tamaño. En algunas realizaciones, la fase móvil para la cromatografía de exclusión por tamaño comprende una sal, disolvente orgánico o detergente. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende además un agente amortiguador.

En algunas realizaciones, un método para aislar el genoma del virus adenoasociado recombinante (rAAV) que se divulga en la presente comprende: (a) someter una composición que comprende partículas de rAAV a una condición bajo la cual se desnaturalizan las partículas de rAAV; y (b) someter la composición que comprende las partículas de rAAV desnaturalizadas a una cromatografía de exclusión por tamaño. En algunas realizaciones, un método divulgado en la presente comprende además la recuperación del genoma de AAV. En algunas realizaciones, un método divulgado en la presente comprende además la determinación de la concentración del genoma de AAV en el eluato de la cromatografía de exclusión por tamaño. En algunas realizaciones, la concentración del genoma de AAV en el eluato se determina midiendo la absorbancia UV en uno o ambos de aproximadamente 260 nm y a aproximadamente 280 nm. En algunas realizaciones, la concentración del genoma de AAV en el eluato se determina midiendo la absorbancia UV a aproximadamente 260 nm.

En algunas realizaciones, un método para determinar la pureza del tamaño del genoma vectorial de una composición que comprende partículas de rAAV aisladas comprende (a) someter una composición que comprende partículas de rAAV a una condición bajo la cual se desnaturalizan las partículas de rAAV; (b) someter a la cromatografía de exclusión por tamaño la composición que comprende las partículas de rAAV desnaturalizadas, y (c) determinar la concentración del genoma de AAV en el eluato de la cromatografía de exclusión por tamaño. En algunas realizaciones, la concentración del genoma de AAV en el eluato se determina midiendo la absorbancia UV en uno o ambos de aproximadamente 260 nm y a aproximadamente 280 nm. En algunas realizaciones, la concentración del genoma de AAV en el eluato se determina midiendo la absorbancia UV a aproximadamente 260 nm. En algunas realizaciones, un método divulgado en la presente comprende además la determinación de la pureza del tamaño del genoma vectorial de la composición que comprende las partículas de rAAV. En algunas realizaciones, la pureza del tamaño del genoma vectorial se determina mediante el análisis de las áreas pico relativas de la curva de absorbancia UV.

En algunas realizaciones, un método para evaluar el plegamiento o la estructura secundaria de los genomas vectoriales dentro de las cápsides consiste en (a) someter una composición que comprende partículas de rAAV a una condición bajo la cual se desnaturalizan las partículas de rAAV; (b) someter a la cromatografía de exclusión por tamaño la composición que comprende las partículas de rAAV desnaturalizadas, y (c) determinar la concentración del genoma de AAV en el eluato de la cromatografía de exclusión por tamaño.

En algunas realizaciones, un método para determinar el título del genoma vectorial (Vg) de una composición que comprende partículas de rAAV aisladas comprende (a) someter una composición que comprende partículas de rAAV a una condición bajo la cual se desnaturalizan las partículas de rAAV; (b) someter a la cromatografía de exclusión por tamaño la composición que comprende las partículas de rAAV desnaturalizadas, y (c) determinar la concentración del genoma de AAV en el eluato de la cromatografía de exclusión por tamaño. En algunas realizaciones, la concentración del genoma de AAV en el eluato se determina midiendo la absorbancia UV en uno o ambos de aproximadamente 260 nm y a aproximadamente 280 nm. En algunas realizaciones, la concentración del genoma de AAV en el eluato se determina midiendo la absorbancia UV a aproximadamente 260 nm. En algunas realizaciones, un método divulgado en la presente comprende además la determinación del título del genoma vectorial (Vg) de la composición que comprende las partículas de rAAV.

En algunas realizaciones, un método de caracterización de una composición que comprende partículas de rAAV aisladas comprende (a) someter una composición que comprende partículas de rAAV a una condición bajo la cual se desnaturalizan las partículas de rAAV; (b) someter a la cromatografía de exclusión por tamaño la composición que comprende las partículas de rAAV desnaturalizadas, y (c) determinar la concentración del genoma de AAV en el eluato de la cromatografía de exclusión por tamaño. En algunas realizaciones, la concentración del genoma de AAV en el eluato se determina midiendo la absorbancia UV en uno o ambos de aproximadamente 260 nm y a aproximadamente 280 nm. En algunas realizaciones, la concentración del genoma de AAV en el eluato se determina midiendo la absorbancia UV a aproximadamente 260 nm. En algunas realizaciones, un método divulgado en la presente comprende además la determinación de las características de la composición que comprende las partículas de rAAV.

En algunas realizaciones, un método descrito en la presente comprende someter una composición que comprende partículas de rAAV a una condición bajo la cual las partículas de rAAV son desnaturalizadas. Cualquier método conocido por un experto en la técnica capaz de desnaturalizar los polipéptidos de la cápside de rAAV se puede utilizar para practicar un método divulgado en la presente. En algunas realizaciones, el proceso de desnaturalización de los polipéptidos de la cápside de rAAV también es capaz de desnaturalizar el genoma de rAAV. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende someter una composición que comprende partículas de rAAV a una condición bajo la cual se desnaturaliza el genoma de rAAV. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende someter una composición que comprende partículas de rAAV a una condición bajo la cual se desnaturalizan tanto los polipéptidos de la cápside de rAAV como el genoma de rAAV. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende exponerlas al calor, por ejemplo, incubando la composición que comprende las partículas de rAAV a una temperatura comprendida entre aproximadamente 65 °C y aproximadamente 95 °C. En algunas realizaciones, la temperatura de incubación está entre aproximadamente 70 °C y aproximadamente 90 °C, entre aproximadamente 75 °C y aproximadamente 85 °C, o entre aproximadamente 80 °C y aproximadamente 85 °C. En algunas realizaciones, la temperatura de incubación está entre aproximadamente 70 °C y aproximadamente 90°C. En algunas realizaciones, la temperatura de incubación oscila entre aproximadamente 75 °C y aproximadamente 85 °C. En algunas realizaciones, la temperatura de incubación está entre aproximadamente 80 °C y aproximadamente 85 °C. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende exponerlas a un agente caotrópico. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende exponerlas a un detergente. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende exponerlas a al menos dos de calor, un agente caotrópico y un detergente. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende exponerlas al calor en presencia de un detergente.

En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende la exposición de las partículas a condiciones que maximizan sustancialmente la señal de SEC de ADNbc. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende la exposición de las partículas a condiciones que maximizan sustancialmente la señal de SEC de ADNbc de una composición de referencia que comprende las mismas partículas de rAAV. Las condiciones de desnaturalización que maximizan sustancialmente la señal de SEC de ADNbc para una composición rAAV se pueden determinar utilizando los métodos descritos en la presente, por ejemplo, mediante el análisis del perfil de DNA-SEC de muestras sometidas a diferentes condiciones de desnaturalización.

En algunas realizaciones, el % de contenido de fragmento de ADN de una composición de rAAV determinada usando un método descrito en la presente se correlaciona con el % de la cápside parcialmente llena de la misma composición determinado por AUC. En algunas realizaciones, el % de contenido de fragmento de ADN determinado utilizando un método descrito en la presente se correlaciona con el % de la cápside parcialmente llena determinado por AUC cuando la diferencia entre los dos valores es menor que aproximadamente 1, menor que aproximadamente 2, menor que aproximadamente 3, menor que aproximadamente 4, menor que aproximadamente 5, o menor que aproximadamente 10. En algunas realizaciones, el % de contenido de fragmento de ADN determinado utilizando un método descrito en la presenta se correlaciona con el % de la cápside parcialmente llena determinado por AUC cuando la diferencia entre los dos valores es menor que aproximadamente 1. En algunas realizaciones, el % de contenido de fragmento de ADN determinado utilizando un método descrito en la presenta se correlaciona con el % de la cápside parcialmente llena determinado por AUC cuando la diferencia entre los dos valores es menor que aproximadamente 3. En algunas realizaciones, el % de contenido de fragmento de ADN determinado utilizando un método descrito en la presenta se correlaciona con el % de la cápside parcialmente llena determinado por AUC cuando la diferencia entre los dos valores es menor que aproximadamente 5. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV consiste en someter una composición que comprende las partículas de rAAV a condiciones que dan como resultado un % de contenido de fragmento de ADN determinado utilizando un método divulgado en la presente que se correlaciona con el % de la cápside parcialmente llena de la misma composición determinado por AUC.

En algunas realizaciones de un método divulgado en la presente, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende exponerlas al calor. Como se divulga en la presente, las condiciones de desnaturalización térmica utilizadas para desnaturalizar las partículas AAV influyen en el perfil de DNA-SEC obtenido posteriormente. La desnaturalización térmica subóptima, por ejemplo, mediante el uso de temperatura que no desnaturaliza sustancialmente todos los genomas virales en la muestra puede conducir a una señal SEC de ADNbc reducida y la presencia de señal de SEC de ADNmc. El aumento de la temperatura de desnaturalización térmica para lograr la desnaturalización de sustancialmente todos los genomas virales en la muestra puede aumentar la señal de SEC de ADNbc y reducir o eliminar la señal de SEC de ADNmc. La desnaturalización térmica excesiva, por ejemplo, mediante el uso de temperatura por encima del mínimo necesario para desnaturalizar sustancialmente todos los genomas virales en la muestra, puede conducir a una pérdida de la señal de SEC de ADNbc. Sin desear limitarse a ninguna teoría en particular, la desnaturalización térmica excesiva puede causar pérdida de material y/o crear fragmentos artificiales de ADN. La pérdida de señal de dsDNA SEC debido a la desnaturalización térmica excesiva puede estar relacionada con la secuencia vectorial y diseños de constructos de ADN. En consecuencia, las condiciones óptimas de desnaturalización térmica pueden variar entre diferentes composiciones que comprenden diferentes partículas de rAAV. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende la exposición de las partículas a la desnaturalización térmica en condiciones que maximizan sustancialmente la señal de SEC de ADNbc de una composición de referencia que comprende las mismas partículas de rAAV. Las condiciones de desnaturalización térmica que maximizan sustancialmente la señal de SEC de ADNbc para una composición rAAV se pueden determinar utilizando los métodos descritos en la presente, por ejemplo, mediante el análisis del perfil de DNA-SE<c>de muestras sometidas a diferentes condiciones de desnaturalización térmica. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende la incubación de la composición que comprende partículas de rAAV a una temperatura que está dentro de 5 °C de la temperatura que maximiza sustancialmente la señal de SEC de ADNbc de una composición de referencia que comprende las mismas partículas de rAAV. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende la incubación de la composición que comprende partículas de rAAV a una temperatura que está dentro de 10 °C de la temperatura que maximiza sustancialmente la señal de SEC de ADNbc de una composición de referencia que comprende las mismas partículas de rAAV. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende la incubación de la composición que comprende partículas de rAAV a una temperatura que está dentro de 15 °C de la temperatura que maximiza sustancialmente la señal de SEC de ADNbc de una composición de referencia que comprende las mismas partículas de rAAV.

En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV consiste en incubar la composición que comprende las partículas de rAAV a la temperatura mínima necesaria para desnaturalizar sustancialmente todos los genomas virales en una composición de referencia que comprende las mismas partículas de rAAV. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV consiste en incubar la composición que comprende partículas de rAAV a una temperatura que no es más de 5 °C por encima de la temperatura mínima necesaria para desnaturalizar sustancialmente todos los genomas virales en una composición de referencia que comprende las mismas partículas de rAAV. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV consiste en incubar la composición que comprende partículas de rAAV a una temperatura que no es más de 10 °C por encima de la temperatura mínima necesaria para desnaturalizar sustancialmente todos los genomas virales en una composición de referencia que comprende las mismas partículas de rAAV. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV consiste en incubar la composición que comprende partículas de rAAV a una temperatura que no es más de 15 °C por encima de la temperatura mínima necesaria para desnaturalizar sustancialmente todos los genomas virales en una composición de referencia que comprende las mismas partículas de rAAV.

En algunas realizaciones, el % de contenido de fragmento de ADN de una composición de rAAV determinada usando un método descrito en la presente se correlaciona con el % de la cápside parcialmente llena de la misma composición determinado por AUC. En algunas realizaciones, el % de contenido de fragmento de ADN determinado utilizando un método descrito en la presente se correlaciona con el % de la cápside parcialmente llena determinado por AUC cuando la diferencia entre los dos valores es menor que aproximadamente 1, menor que aproximadamente 2, menor que aproximadamente 3, menor que aproximadamente 4, menor que aproximadamente 5, o menor que aproximadamente 10. En algunas realizaciones, el % de contenido de fragmento de ADN determinado utilizando un método descrito en la presenta se correlaciona con el % de la cápside parcialmente llena determinado por AUC cuando la diferencia entre los dos valores es menor que aproximadamente 1. En algunas realizaciones, el % de contenido de fragmento de ADN determinado utilizando un método descrito en la presenta se correlaciona con el % de la cápside parcialmente llena determinado por AUC cuando la diferencia entre los dos valores es menor que aproximadamente 3. En algunas realizaciones, el % de contenido de fragmento de ADN determinado utilizando un método descrito en la presenta se correlaciona con el % de la cápside parcialmente llena determinado por AUC cuando la diferencia entre los dos valores es menor que aproximadamente 5. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV consiste en someter una composición que comprende las partículas de rAAV a desnaturalización térmica en condiciones que dan como resultado un % de contenido de fragmento de ADN determinado utilizando un método divulgado en la presente que se correlaciona con el % de la cápside parcialmente llena de la misma composición determinado por AUC. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende la incubación de la composición que comprende las partículas de rAAV a una temperatura que está dentro de 5 °C de la temperatura que da como resultado un % de contenido de fragmento de ADN determinado utilizando un método divulgado en la presente que se correlaciona con el % de la cápside parcialmente llena de la misma composición determinado por AUC. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende la incubación de la composición que comprende las partículas de rAAV a una temperatura que está dentro de 10 °C de la temperatura que da como resultado un % de contenido de fragmento de ADN determinado utilizando un método divulgado en la presente que se correlaciona con el % de la cápside parcialmente llena de la misma composición determinado por AUC. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende la incubación de la composición que comprende las partículas de rAAV a una temperatura que está dentro de 15 °C de la temperatura que da como resultado un % de contenido de fragmento de ADN determinado utilizando un método divulgado en la presente que se correlaciona con el % de la cápside parcialmente llena de la misma composición determinado por AUC.

En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende la incubación de la composición que comprende partículas de rAAV a una temperatura entre aproximadamente 65 °C y aproximadamente 95 °C. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV consiste en incubar la composición que comprende partículas de rAAV a una temperatura entre aproximadamente 65 °C y aproximadamente 95 °C durante aproximadamente 5 minutos y 60 minutos. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV consiste en incubar la composición que comprende partículas de rAAV a una temperatura entre aproximadamente 65 °C y aproximadamente 95 °C en presencia de un detergente. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV consiste en incubar la composición que comprende partículas de rAAV a una temperatura entre aproximadamente 65 °C y aproximadamente 95 °C durante aproximadamente 5 minutos y 60 minutos en presencia de un detergente. En algunas realizaciones, el detergente es SDS. En algunas realizaciones, el detergente es SDS en una concentración entre aproximadamente el 0.005 % y aproximadamente el 0.5 %. En algunas realizaciones, el detergente es SDS en una concentración de aproximadamente 0.05 %. En algunas realizaciones, el detergente es polisorbato 20, polisorbato 80 o Pluronic F-68. En algunas realizaciones, la temperatura de incubación está entre aproximadamente 70 °C y aproximadamente 90 °C, entre aproximadamente 75 °C y aproximadamente 85 °C, o entre aproximadamente 80 °C y aproximadamente 85 °C. En algunas realizaciones, la temperatura de incubación está entre aproximadamente 70 °C y aproximadamente 90 °C. En algunas realizaciones, la temperatura de incubación está entre aproximadamente 75 °C y aproximadamente 85 °C. En algunas realizaciones, la temperatura de incubación está entre aproximadamente 80 °C y aproximadamente 85 °C.

En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende la incubación de la composición que comprende las partículas de rAAV a aproximadamente 70 °C, aproximadamente 75 °C, aproximadamente 80 °C, aproximadamente 85 °C o aproximadamente 90 °C durante aproximadamente 5 minutos y 60 minutos. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV consiste en incubar la composición a aproximadamente 65 °C durante aproximadamente 5 minutos y 60 minutos. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV consiste en incubar la composición a aproximadamente 70 °C durante aproximadamente 5 minutos y 60 minutos.

En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV consiste en incubar la composición a aproximadamente 75 °C durante aproximadamente 5 minutos y 60 minutos. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV consiste en incubar la composición a aproximadamente 80 °C durante aproximadamente 5 minutos y 60 minutos. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV consiste en incubar la composición a aproximadamente 85 °C durante aproximadamente 5 minutos y 60 minutos. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV consiste en incubar la composición a aproximadamente 90 °C durante aproximadamente 5 minutos y 60 minutos. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV consiste en incubar la composición a aproximadamente 95 °C durante aproximadamente 5 minutos y 60 minutos. En algunas realizaciones, la composición se incuba durante aproximadamente 5 minutos. En algunas realizaciones, la composición se incuba durante aproximadamente 10 minutos. En algunas realizaciones, la composición se incuba durante aproximadamente 15 minutos. En algunas realizaciones, la composición se incuba durante aproximadamente 20 minutos.

En algunas realizaciones, la composición se incuba durante aproximadamente 25 minutos. En algunas realizaciones, la composición se incuba durante aproximadamente 30 minutos. En algunas realizaciones, la composición se incuba durante aproximadamente 35 minutos. En algunas realizaciones, la composición se incuba durante aproximadamente 40 minutos.

En algunas realizaciones, la composición se incuba durante aproximadamente 45 minutos. En algunas realizaciones, la composición se incuba durante aproximadamente 50 minutos. En algunas realizaciones, la composición se incuba durante aproximadamente 55 minutos. En algunas realizaciones, la composición se incuba durante aproximadamente 60 minutos.

En algunas realizaciones, la composición se incuba en presencia de un detergente. En algunas realizaciones, la composición se incuba en presencia de SDS. En algunas realizaciones, la composición se incuba en presencia de polisorbato 20, polisorbato 80 o Pluronic F-68. En algunas realizaciones, la composición se incuba en presencia de SDS en una concentración entre aproximadamente el 0.005 % y aproximadamente el 0.5 %. En algunas realizaciones, la composición se incuba en presencia de SDS en una concentración de aproximadamente el 0.05 %.

En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende la exposición de las partículas de rAAV a un detergente. En algunas realizaciones, el detergente es un detergente desnaturalizante. En algunas realizaciones, el detergente es un detergente desnaturalizante aniónico. En algunas realizaciones, el detergente es un detergente desnaturalizante catiónico. En algunas realizaciones, el detergente es sulfato de dodecil de sodio (SDS) o bromuro de etil trimetilo amonio (ETMAB). En algunas realizaciones, el detergente es dodecil sulfato de sodio (SDS). En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende la exposición de las partículas de rAAV a entre aproximadamente el 0.005 % y aproximadamente el 0.5 % del detergente. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende la exposición de las partículas de rAAV a aproximadamente el

0.05 % del detergente. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende la exposición de las partículas de rAAV a entre aproximadamente el 0.005 % y aproximadamente el 0.5 % de SDS. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende la exposición de las partículas de rAAV a aproximadamente el 0.05 % de SDS. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende la exposición de las partículas de rAAV a entre aproximadamente el 0.005 % y aproximadamente el 0.5 % de ETMAB. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende la exposición de las partículas de rAAV a aproximadamente el 0.05 % de ETMAB.

En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende la exposición de las partículas de rAAV a un detergente. En algunas realizaciones, el detergente es un polisorbato 20, polisorbato 80 o Pluronic® F-68. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende la exposición de las partículas de rAAV a entre aproximadamente el 0.005 % y aproximadamente el 0.5 % del detergente.

En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende la exposición de las partículas de rAAV a un detergente e incubación de la composición que comprende partículas de rAAV a una temperatura entre aproximadamente 65 °C y aproximadamente 95 °C. En algunas realizaciones, el detergente es dodecil sulfato de sodio

(SDS) o bromuro de etil trimetilo amonio (ETMAB). En algunas realizaciones, el detergente es dodecil sulfato de sodio (SDS). En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende la exposición de las partículas de rAAV a entre aproximadamente el 0.005 % y aproximadamente el 0.5 % del detergente. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende la exposición de las partículas de rAAV a aproximadamente el

0.05 % del detergente. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende la exposición de las partículas de rAAV a entre aproximadamente el 0.005 % y aproximadamente el 0.5 % de SDS. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende la exposición de las partículas de rAAV a aproximadamente el 0.05 % de SDS. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende la exposición de las partículas de rAAV a entre aproximadamente el 0.005 % y aproximadamente el 0.5 % de ETMAB. En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende la exposición de las partículas de rAAV a aproximadamente el 0.05 % de ETMAB. En algunas realizaciones, la temperatura de incubación está entre aproximadamente 70 °C y aproximadamente 90 °C, entre aproximadamente 75 °C y aproximadamente 85 °C, o e aproximadamente 80 °C y aproximadamente 85 algunas realizaciones, la temperatura de aproximadamente 70 °C y aproximadamente 90 algunas realizaciones, la temperatura de aproximadamente 75 °C y aproximadamente 85 algunas realizaciones, la temperatura de aproximadamente 80 °C y aproximadamente 85 °C.

En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende la exposición de las partículas de rAAV a un agente caotrópico. En algunas realizaciones, el agente caotrópico comprende el clorhidrato de guanidina, perclorato de litio, fenol, tiourea, urea, o una combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, la desnaturalización de las partículas de rAAV comprende la exposición de las partículas de rAAV a un agente caotrópico e incubación de la composición que comprende partículas de rAAV a una temperatura entre aproximadamente 65 °C y aproximadamente 95 °C. En algunas realizaciones, el agente caotrópico comprende el clorhidrato de guanidina, perclorato de litio, fenol, tiourea, urea, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la temperatura de incubación está entre aproximadamente 70 °C y aproximadamente 90 °C, entre aproximadamente 75 °C y aproximadamente 85 °C, o entre aproximadamente 80 °C y aproximadamente 85 °C. En algunas realizaciones, la temperatura de incubación está entre aproximadamente 70 °C y aproximadamente 90 °C. En algunas realizaciones, la temperatura de incubación está entre aproximadamente 75 °C y aproximadamente 85 °C. En algunas realizaciones, la temperatura de incubación está entre aproximadamente 80 °C y aproximadamente 85 °C.

En algunas realizaciones, un método descrito en la presente comprende someter una composición que comprende partículas de rAAV a una condición bajo la cual las partículas de rAAV son desnaturalizadas. En algunas realizaciones, sustancialmente todas las partículas virales en la muestra se desnaturalizan por el proceso de desnaturalización. En algunas realizaciones, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 %, o al menos aproximadamente 99 % de las partículas virales en la muestra se desnaturalizan por el proceso de desnaturalización.

En algunas realizaciones, un método divulgado en la presente comprende someter la composición que comprende las partículas de rAAV desnaturalizadas a la cromatografía de exclusión por tamaño. En algunas realizaciones, la composición comprende polipéptidos de la cápside desnaturalizados. En algunas realizaciones, la composición no comprende sustancialmente partículas de rAAV no desnaturalizadas. En algunas realizaciones, menos de aproximadamente 5 %, menos de aproximadamente 3%, menos de aproximadamente 2 %, o menos de aproximadamente 1 % de los polipéptidos de la cápside en la composición son parte de una partícula de rAAV no desnaturalizada.

En algunas realizaciones, un método divulgado en la presente comprende someter la composición que comprende las partículas de rAAV desnaturalizadas a la cromatografía de exclusión por tamaño. En algunas realizaciones, someter la composición que comprende las partículas de rAAV desnaturalizadas a la cromatografía de exclusión por tamaño comprende poner en contacto la composición con una resina de cromatografía de exclusión por tamaño. Se puede utilizar cualquier resina de cromatografía de exclusión por tamaño adecuada para separar el genoma viral de longitud completa de los fragmentos del genoma viral. En algunas realizaciones, la resina de cromatografía de exclusión por tamaño comprende partículas de sílice (por ejemplo, resinas Yarra SEC y resinas Sepax SRT SEC), un copolímero reticulado de alilo dextrano y N'-metilbisacrilamida (por ejemplo, Sephacryl®), o una forma de agarosa reticulada y con perlas (por ejemplo, Sepharose®, Superose® y Superdex®). En algunas realizaciones, la resina de cromatografía de exclusión por tamaño comprende partículas de sílice. En algunas realizaciones, la resina de cromatografía de exclusión por tamaño comprende películas gruesas de nanómetros uniformes, hidrófilas y neutros unidas químicamente en sílice de alta pureza y estabilidad mecánica mejorada. En algunas realizaciones, la resina de cromatografía de exclusión por tamaño comprende un tamaño de poro nominal entre aproximadamente 50 nm y aproximadamente 500 nm. En algunas realizaciones, la resina de cromatografía de exclusión por tamaño comprende un tamaño de poro nominal de aproximadamente 50 nm. En algunas realizaciones, la resina de cromatografía de exclusión por tamaño comprende un tamaño de poro nominal de aproximadamente 100 nm. En algunas realizaciones, la resina de cromatografía de exclusión por tamaño comprende un tamaño de poro nominal de aproximadamente 200 nm. En algunas realizaciones, la resina de cromatografía de exclusión por tamaño comprende un tamaño de poro nominal de aproximadamente 300 nm. En algunas realizaciones, la resina de cromatografía de exclusión por tamaño comprende un tamaño de poro nominal de aproximadamente 400 nm. En algunas realizaciones, la resina de cromatografía de exclusión por tamaño comprende un tamaño de poro nominal de aproximadamente 500 nm.

En algunas realizaciones, un método divulgado en la presente comprende someter la composición que comprende las partículas de rAAV desnaturalizadas a la cromatografía de exclusión por tamaño. En algunas realizaciones, la cromatografía de exclusión por tamaño comprende el uso de una cromatografía líquida de alto rendimiento o un sistema de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento. En algunas realizaciones, la cromatografía de exclusión por tamaño comprende el uso de un sistema de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento. En algunas realizaciones, la cromatografía de exclusión por tamaño comprende el uso de un sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento.

En algunas realizaciones, un método divulgado en la presente comprende someter la composición que comprende las partículas de rAAV desnaturalizadas a la cromatografía de exclusión por tamaño, en donde la fase móvil para la cromatografía de exclusión por tamaño comprende uno o más de una sal, disolvente orgánico y detergente. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende una sal, disolvente orgánico y detergente.

En algunas realizaciones, un método divulgado en la presente comprende someter la composición que comprende las partículas de rAAV desnaturalizadas a la cromatografía de exclusión por tamaño, en donde la fase móvil para la cromatografía de exclusión por tamaño comprende uno o más de un agente amortiguador, una sal, disolvente orgánico y detergente. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende un agente amortiguador, una sal, disolvente orgánico y detergente.

En algunas realizaciones, la fase móvil comprende una sal de litio, sal de sodio, sal de potasio, sal de rubidio, sal de cesio, sal de magnesio, o una mezcla de las mismas. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende una sal de sodio. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende citrato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio, o una mezcla de los mismos. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende cloruro de sodio. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende cloruro de sodio, acetato de sodio, bicarbonato de sodio, carbonato de sodio, carbonato de amonio, cloruro de amonio, nitrato de amonio o una mezcla de los mismos.

En algunas realizaciones, la fase móvil comprende entre aproximadamente 100 mM y aproximadamente 500 mM de sal. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende entre aproximadamente 100 mM y aproximadamente 400 mM de sal. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende entre aproximadamente 200 mM y aproximadamente 500 mM de sal. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende entre aproximadamente 200 mM y aproximadamente 400 mM de sal. En algunas realizaciones, la sal comprende una sal de sodio. En algunas realizaciones, la sal comprende citrato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio o una mezcla de los mismos. En algunas realizaciones, la sal comprende cloruro de sodio.

En algunas realizaciones, la fase móvil comprende aproximadamente 100 mM, aproximadamente 150 mM, aproximadamente 200 mM, aproximadamente 250 mM, aproximadamente 300 mM, aproximadamente 350 mM, aproximadamente 400 mM, aproximadamente 450 mM, o aproximadamente 500 mM de sal. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende aproximadamente 100 mM de sal. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende aproximadamente 200 mM de sal. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende aproximadamente 250 mM de sal. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende aproximadamente 300 mM de sal. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende aproximadamente 350 mM de sal. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende aproximadamente 400 mM de sal. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende aproximadamente 500 mM de sal. En algunas realizaciones, la sal comprende una sal de sodio. En algunas realizaciones, la sal comprende citrato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio o una mezcla de los mismos. En algunas realizaciones, la sal comprende cloruro de sodio.

En algunas realizaciones, la fase móvil comprende un agente amortiguador. Los agentes amortiguadores son bien conocidos en la técnica, e incluyen, sin limitación, disoluciones amortiguadoras de fosfato, histidina, citrato de sodio, HEPES, MES, Tris, Bis-Tris, MOPS, TES, bicina, glicina, tricina, N-glicilglicina, acetato de sodio, carbonato de sodio, glicilglicina, lisina, arginina, fosfato de sodio, y mezclas de los mismos. En algunas realizaciones, el agente amortiguador comprende una disolución amortiguadora de fosfato. En algunas realizaciones, el agente amortiguador comprende Tris.

En algunas realizaciones, la fase móvil comprende entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 50 mM de un agente amortiguador. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 30 mM, entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 20 mM, entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 30 mM, entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 20 mM, entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 30 mM, entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 20 mM, o entre aproximadamente 20 mM y aproximadamente 50 mM de un agente amortiguador. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende aproximadamente 1 mM, aproximadamente 2 mM, aproximadamente 3 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 15 mM, aproximadamente 20 mM, aproximadamente 25 mM, aproximadamente 30 mM, o aproximadamente 40 mM de un agente amortiguador. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende aproximadamente 10 mM de un agente amortiguador. En algunas realizaciones, el agente amortiguador comprende una disolución amortiguadora de fosfato. En algunas realizaciones, el agente amortiguador comprende Tris.

En algunas realizaciones, la fase móvil comprende entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 50 mM de fosfato de sodio. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 30 mM, entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 20 mM, entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 30 mM, entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 20 mM, entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 30 mM, entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 20 mM, o entre aproximadamente 20 mM y aproximadamente 50 mM de fosfato de sodio. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende aproximadamente 1 mM, aproximadamente 2 mM, aproximadamente 3 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 15 mM, aproximadamente 20 mM, aproximadamente 25 mM, aproximadamente 30 mM, o aproximadamente 40 mM de fosfato de sodio. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende aproximadamente 5 mM de fosfato de sodio.

En algunas realizaciones, la fase móvil tiene un pH de entre 6.0 y 8.5. En algunas realizaciones, la fase móvil tiene un pH de entre 6.0 y 7.0. En algunas realizaciones, la fase móvil tiene un pH de entre 7.0 y 8.0. En algunas realizaciones, la fase móvil tiene un pH de entre 8.0 y 8.5. En algunas realizaciones, la fase móvil tiene un pH de entre 7.2 y 7.8.

En algunas modalidades, la fase móvil tiene un pH de aproximadamente 7.2. En algunas modalidades, la fase móvil tiene un pH de aproximadamente 7.3. En algunas modalidades, la fase móvil tiene un pH de aproximadamente 7.4. En algunas modalidades, la fase móvil tiene un pH de aproximadamente 7.5. En algunas modalidades, la fase móvil tiene un pH de aproximadamente 7.6. En algunas modalidades, la fase móvil tiene un pH de aproximadamente 7.7. En algunas modalidades, la fase móvil tiene un pH de aproximadamente 7.8.

En algunas modalidades, la fase móvil tiene un pH de aproximadamente 7.0. En algunas modalidades, la fase móvil tiene un pH de aproximadamente 7.1. En algunas modalidades, la fase móvil tiene un pH de aproximadamente 7.4. En algunas modalidades, la fase móvil tiene un pH de aproximadamente 7.9. En algunas modalidades, la fase móvil tiene un pH de aproximadamente 8.0.

En algunas modalidades, la fase móvil tiene un pH de aproximadamente 7.5.

En algunas realizaciones, la fase móvil comprende un detergente. En algunas realizaciones, el detergente es un detergente desnaturalizante. En algunas realizaciones, el detergente es un detergente no desnaturalizante. Los detergentes aceptables incluyen, sin limitaciones, poloxámero 188, poloxámero 407, polisorbato 80, polisorbato 20, Pluronic F-68, o BRIJ 35. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende poloxámero 188, poloxámero 407, polisorbato 80, polisorbato 20, Pluronic F-68, BRIJ 35, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende el polisorbato 80.

En algunas realizaciones, un método descrito en la presente comprende la desnaturalización de las partículas de rAAV mediante un proceso que comprende la exposición de las partículas de rAAV a un primer detergente, y someter las partículas de rAAV desnaturalizadas a la cromatografía de exclusión por tamaño, en donde la fase móvil para la cromatografía de exclusión por tamaño comprende un segundo detergente. En algunas realizaciones, un método descrito en la presente comprende: (a) la desnaturalización de las partículas de rAAV mediante un proceso que comprende la exposición de las partículas de rAAV a un primer detergente e incubación de la composición que comprende las partículas de rAAV a una temperatura entre aproximadamente 65 °C y aproximadamente 95 °C; y (b) someter las partículas de rAAV desnaturalizadas a la cromatografía de exclusión por tamaño, en donde la fase móvil para la cromatografía de exclusión por tamaño comprende un segundo detergente. En algunas realizaciones, la temperatura de incubación está entre aproximadamente 70 °C y aproximadamente 90 °C, entre aproximadamente 75 °C y aproximadamente 85 °C, o entre aproximadamente 80 °C y aproximadamente 85 °C. En algunas realizaciones, la temperatura de incubación aproximadamente 70 °C y aproximadamente 90 °C. En algunas realizaciones, la temperatura de incubación aproximadamente 75 °C y aproximadamente 85 °C. En algunas realizaciones, la temperatura de incubación aproximadamente 80 °C y aproximadamente 85 °C. En algunas realizaciones, el primer y segundo detergentes comprenden el mismo detergente. En algunas realizaciones, el primer y segundo detergentes comprenden un detergente diferente. En algunas realizaciones, el primer detergente comprende un detergente desnaturalizante y el segundo detergente comprende un detergente no desnaturalizante. En algunas realizaciones, el primer detergente comprende SDS y el segundo detergente comprende un detergente no desnaturalizante. En algunas realizaciones, el primer detergente comprende SDS y el segundo detergente comprende polisorbato 80.

En algunas realizaciones, la fase móvil comprende entre aproximadamente el 0.001 % y aproximadamente el 5 % de detergente. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende entre aproximadamente el 0.05 % y aproximadamente el 2 % de detergente. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende entre aproximadamente el 0.05 % y aproximadamente el 2 % de detergente. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende entre aproximadamente el 0.01 % y aproximadamente el 1 % de detergente. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende aproximadamente aproximadamente 0.01 %, aproximadamente 0.05 %, aproximadamente 0.1 %, aproximadamente 0.2 %, aproximadamente 0.3 %, aproximadamente 0.4 %, aproximadamente 0.5 %, aproximadamente 0.6 %, aproximadamente 0.6 %, aproximadamente 0.8 %, o aproximadamente 0.9 % de detergente. En algunas realizaciones, el detergente comprende polisorbato 80.

En algunas realizaciones, la fase móvil comprende entre aproximadamente 0.001 % y aproximadamente 5 % de polisorbato 80. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende entre aproximadamente 0.05 % y aproximadamente 2 % de polisorbato 80. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende entre aproximadamente 0.05 % y aproximadamente 2 % de polisorbato 80. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende entre aproximadamente 0.01 % y aproximadamente 1 % de polisorbato 80. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende aproximadamente aproximadamente 0.01 %, aproximadamente 0.05 %, aproximadamente 0.1 %, aproximadamente 0.2 %, aproximadamente 0.3 %, aproximadamente 0.4 %, aproximadamente 0.5 %, aproximadamente 0.6 %, aproximadamente 0.6 %, aproximadamente 0.8 %, o aproximadamente 0.9 % de polisorbato 80.

En algunas realizaciones, la fase móvil comprende aproximadamente 0.1 % de polisorbato 80. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende aproximadamente 0.2 % de polisorbato 80. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende aproximadamente 0.3 % de polisorbato 80. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende aproximadamente 0.4 % de polisorbato 80. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende aproximadamente 0.5 % de polisorbato 80. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende aproximadamente 0.6 % de polisorbato 80. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende aproximadamente 0.7 % de polisorbato 80. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende aproximadamente 0.8 % de polisorbato 80. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende aproximadamente 0.9 % de polisorbato 80.

En algunas realizaciones, la fase móvil comprende un disolvente orgánico. Los disolventes orgánicos aceptables incluyen, sin limitaciones, metanol, isopropanol, acetonitrilo, dimetil sulfóxido (DMSO), tetrahidrofurano (THF), trifluoroetanol (TFE), hexafluoroisopropanol (HFIP), o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende metanol.

En algunas realizaciones, la fase móvil comprende entre aproximadamente 5 % y aproximadamente 50 % de disolvente orgánico. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende entre aproximadamente 10 % y aproximadamente 40 % de disolvente orgánico. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende entre aproximadamente 10 % y aproximadamente 30 % de disolvente orgánico. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende entre aproximadamente 10 % y aproximadamente 50 % de disolvente orgánico. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende entre aproximadamente 5 % y aproximadamente 20 % de disolvente orgánico. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende entre aproximadamente 20 % y aproximadamente 50 % de disolvente orgánico. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende entre aproximadamente 20 % y aproximadamente 40 % de disolvente orgánico. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, y más o menos un 20 %. aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, o aproximadamente 50 % de disolvente orgánico. En algunas realizaciones, el disolvente orgánico comprende metanol.

En algunas realizaciones, la fase móvil comprende entre aproximadamente 5 % y aproximadamente 50 % de metanol. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende entre aproximadamente 10 % y aproximadamente 40 % de metanol. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende entre aproximadamente 10 % y aproximadamente 30 % de metanol. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende entre aproximadamente 10 % y aproximadamente 50 % de metanol. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende entre aproximadamente 5 % y aproximadamente 20 % de metanol. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende entre aproximadamente 20 % y aproximadamente 50 % de metanol. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende entre aproximadamente 20 % y aproximadamente 40 % de metanol. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, y más o menos un 20 %. aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, o aproximadamente 50 % de metanol.

En algunas realizaciones, la fase móvil comprende aproximadamente 10 % de metanol. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende aproximadamente 15 % de metanol. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende aproximadamente 20 % de metanol. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende aproximadamente 25 % de metanol. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende aproximadamente 30 % de metanol. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende aproximadamente 35 % de metanol. En algunas realizaciones, la fase móvil comprende aproximadamente 40 % de metanol.

En algunas realizaciones, la fase móvil comprende entre aproximadamente 5 mm y aproximadamente 50 mm de fosfato de sodio, entre aproximadamente 100 mm y aproximadamente 500 mm de cloruro de sodio, entre aproximadamente 0.01 % y aproximadamente 0.5 % de polisorbato 80, y entre aproximadamente 5 % y aproximadamente 50 % de metanol, y tiene un pH entre aproximadamente 6.5 y 8.5.

En algunas realizaciones, la fase móvil comprende aproximadamente 10 mm de fosfato de sodio, aproximadamente 300 mm de cloruro de sodio, aproximadamente 0.05 % de polisorbato 80 y aproximadamente 20 % de metanol, y tiene un pH de aproximadamente 7.5.

En algunas realizaciones, un documento descrito en la presente comprende (a) someter una composición que comprende partículas de rAAV a una condición bajo la cual las partículas de rAAV son desnaturalizadas; y (b) someter la composición que comprende las partículas de rAAV desnaturalizadas a cromatografía de exclusión por tamaño. En algunas realizaciones, la composición que comprende las partículas de rAAV comprende entre aproximadamente 2E+10 copias del genoma/ml y aproximadamente 1E+14 copias del genoma/ml de partículas de rAAV. En algunas realizaciones, la composición comprende aproximadamente 2.0E+10 GC/ml, aproximadamente 1.0E+11 GC/ml, aproximadamente 1.0E+12 GC/ml, aproximadamente 1.0E+13 GC/ml, o aproximadamente 1.0E+14 GC/ml de partículas de rAAV. En algunas realizaciones, la composición comprende partículas de rAAV que comprenden una proteína de la cápside del serotipo AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV-15 y AAV-16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10 , AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, o AAV.HSC16, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, la composición comprende partículas de rAAV que comprenden una proteína de la cápside del serotipo AAV-8, serotipo AAV-9 o una combinación de los mismos.

Los métodos descritos en la presente se pueden aplicar a las partículas de rAAV que comprenden una proteína de la cápside de cualquier serotipo de la cápside de AAV. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden una proteína de la cápside de un serotipo de la cápside de AAV seleccionado de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, A<a>V5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV-15 y AAV-16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10 , AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, y AAV.HSC16. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden una proteína de la cápside que es un derivado, modificación o pseudotipo de la proteína de la cápside AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV-15 y AAV-16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10 , AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, o AAV.HSC16.

En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden una proteína de la cápside de un serotipo de la cápside de AAV seleccionado de AAV-8 y AAV-9. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV tienen un serotipo de la cápside AAV de AAV-8. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV tienen un serotipo de la cápside AAV de AAV-9.

En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden una proteína de la cápside que es un derivado, modificación o pseudotipo de la proteína de la cápside AAV-8 o a AV-9. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden una proteína de la cápside que tiene una proteína de la cápside AAV-8 al menos 80 % o más idéntica, por ejemplo, 85 %, 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 %, etc., es decir, hasta 100 % idéntica, a la secuencia VP1, VP2 y/o VP3 de la proteína de la cápside AAV-8.

En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden una proteína de la cápside que es un derivado, modificación o pseudotipo de la proteína de la cápside AAV-9. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona métodos para producir una composición que comprende una proteína de la cápside AAV-9 al menos 80 % o más idéntica, por ejemplo, 85 %, 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 %, etc., es decir, hasta 100 % idéntica, a la secuencia VP1, VP2 y/o VP3 de la proteína de la cápside AAV-9.

En realizaciones adicionales, las partículas de rAAV comprenden una cápside de mosaico. En realizaciones adicionales, las partículas de rAAV comprenden una partícula de rAAV pseudotipada. En realizaciones adicionales, las partículas de rAAV comprenden una cápside que contiene una quimera de proteína de la cápside de dos o más serotipos de la cápside de AAV.

En algunas realizaciones, un método divulgado en la presente comprende determinar la pureza del tamaño del genoma vectorial, evaluar el plegamiento o la estructura secundaria de los genomas vectoriales dentro de las cápsides, y/o el título del genoma vectorial (Vg) de la composición que comprende las partículas de rAAV. Los métodos para determinar estas características de una composición que comprende partículas de rAAV a partir de las lecturas de absorbancia UV obtenidas utilizando un método descrito en la presente son conocidos por un experto en la técnica, por ejemplo, como se indica en WO 2019/212922.

En algunas realizaciones, un método descrito en la presente se utiliza para apoyar el desarrollo de productos y la optimización de procesos mediante la evaluación rápida de la calidad de las partículas de rAAV producidas por los procesos modificados. En algunas realizaciones, un método divulgado en la presente comprende el efecto determinante de una modificación del proceso sobre la calidad de las partículas de rAAV producidas por el proceso modificado. En algunas realizaciones, la calidad de las partículas de rAAV se evalúa mediante la determinación del % de ADN fragmentado en las partículas de rAAV.

En algunas realizaciones, se utiliza un método divulgado en la presente para evaluar la calidad de las partículas de rAAV en diferentes etapas de un proceso de fabricación de rAAV. Por ejemplo, se puede utilizar un método descrito en la presente para evaluar la calidad de las partículas de rAAV después de la recolección de un cultivo celular, clarificación del cultivo celular recolectado (por ejemplo, por centrifugación o filtración de profundidad), filtración de flujo tangencial, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de interacción hidrofóbica y filtración estéril. En algunas realizaciones, la evaluación de la calidad de las partículas de rAAV comprende la determinación del porcentaje de contenido fragmentado de ADN de las partículas. En algunas realizaciones, un método descrito en la presente es adecuado para la liberación por lotes, por ejemplo, para las pruebas de liberación de lotes y/o pruebas de liberación por lotes. En algunas realizaciones, un método divulgado en la presente se realiza como parte de las pruebas de liberación por lotes.

Partículas de rAAV

Los métodos proporcionados son adecuados para caracterizar cualquier partícula de AAV recombinante aislada, incluyendo, pero sin limitarse a, la determinación de la pureza del tamaño del genoma vectorial de una composición que comprende cualquier partícula de rAAV aislada, la evaluación del plegamiento o la estructura secundaria de los genomas vectoriales dentro de las cápsides, y determinación del título del genoma vectorial (Vg) de una composición que comprende cualquier partícula de rAAV aislada. Además, los métodos proporcionados son adecuados para aislar el genoma de AAV de cualquier partícula de AAV recombinante aislada. Como tal, el rAAV puede ser de cualquier serotipo, modificación o derivado, conocido en la técnica, o cualquier combinación de los mismos (por ejemplo, una población de partículas de rAAV que comprende dos o más serotipos, por ejemplo, que comprende dos o más partículas de rAAV2, rAAV8 y rAAV9 conocidas en la técnica. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV son AAV1, AAV2, rAAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7,AAV8, AAV9, AAV10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV-15 y AAV-16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10 , AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, o AAV.HSC16, u otras partículas de rAAV, o combinaciones de dos o más de las mismas.

En algunas realizaciones, las partículas de rAAV tienen una proteína de la cápside de un serotipo AAV seleccionado de AAV1, AAV1, AAV2, rAAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV-15 y AAV-16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10 , AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, o AAV.HSC16, o un derivado, modificación o pseudotipo de los mismos. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden una proteína de la cápside al menos 80 % o más idéntica, por ejemplo, 85 %, 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 %, etc., es decir, hasta 100 % idéntica, por ejemplo, a la secuencia VP1, VP2 y/o VP3 de un serotipo de la cápside AAV seleccionado de AAV1, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV-15 y AAV-16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, rAAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10 , AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, o AAV.HSC16.

En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden una proteína de la cápside de un serotipo de la cápside de AAV seleccionado de AAV1, AAV1, AAV2, rAAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV-15 y AAV-16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10 , AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, o AAV.HSC166, o un derivado, modificación o pseudotipo de los mismos. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden una proteína de la cápside al menos 80 % o más idéntica, por ejemplo, 85 %, 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 %, etc., es decir, hasta 100 % idéntica, por ejemplo, a la secuencia VP1, VP2 y/o VP3 de un serotipo de la cápside AAV seleccionado de AAV1, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV-15 y AAV-16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10 , AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, o AAV.HSC16.

En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden la cápside de Anc80 o Anc80L65, como se describe en Zinn et al., 2015, Cell Rep. 12(6): 1056-1068.

En ciertas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden la cápside con una de las siguientes inserciones de aminoácidos: LGETTRP o LALGETTRP, como se describe en las patentes de EE. UU. No. 9.193.956; 9458517; y 9.587.282 y la publicación de solicitud de patente de EE. UU. No 2016/0376323.

En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden la cápside de AAV.7m8, como se describe en las patentes de EE. UU. No. 9.193.956; 9.458.517; y 9.587.282 y la publicación de solicitud de patente de EE. UU. No 2016/0376323.

En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden cualquier cápside AAV divulgada en la patente de EE. UU. No. 9.585.971, tal como AAV-PHP.B. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden cualquier cápside AAV divulgada en las patentes de EE. UU. No. 9.840.719 y WO 2015/013313, tal como AAV.Rh74 y RHM4-1.

En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden cualquier cápside AAV divulgada en WO 2014/172669, tal como AAV rh.74.

En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden la cápside de AAV2/5, como se describe en Georgiadis et al., 2016, Gene Therapy 23: 857-862 y Georgiadis et al., 2018, Gene Therapy 25: 450. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden cualquier cápside AAV divulgada en WO 2017/070491, tal como AAV2tYF.

En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden los cápsides de AAVLK03 o AAV3B, como se describe en Puzzo et al., 2017, Sci. Transl. Med. 29(9): 418.

En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden cualquier cápside AAV divulgada en las patentes de EE. UU. No. 8.628.966; US 8.927.514; US 9.923.120 y WO 2016/049230, tales como HSC1, HSC2, HSC3, HSC4, HSC5, HSC6, HSC7, HSC8, HSC9, HSC10 , HSC11, HSC12, HSC13, HSC14, HSC15, o HSC16.

En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden una cápside AAV divulgada en cualquiera de las siguientes patentes y solicitudes de patente.

Patentes de los Estados Unidos No. 7.282.199; 7.906.111; 8.524.446; 8.999.678; 8.628.966; 8.927.514; 8.734.809; US 9.284.357; 9.409.953; 9.169.299; 9.193.956; 9458517; y 9.587.282; publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. No.

2015/0374803; 2015/0126588; 2017/0067908; 2013/0224836; 2016/0215024; 2017/0051257; y Solicitud Internacional de Patente No. PCT/US2015/034799; PCT/EP2015/053335. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV tienen una proteína de la cápside al menos 80 % o más idéntica, por ejemplo, 85 %, 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 %, etc., es decir, hasta 100 % idéntica, a la secuencia VP1, VP2 y/o VP3 de una cápside AAV divulgada en cualquiera de las siguientes patentes y solicitudes de patente.

2015/0374803; 2015/0126588; 2017/0067908; 2013/0224836; 2016/0215024; 2017/0051257; y Solicitud Internacional de Patente No. PCT/US2015/034799; PCT/EP2015/053335.

En algunas realizaciones, las partículas de rAAV tienen una proteína de la cápside divulgada en la publicación de solicitud internacional No. WO 2003/052051 (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 2),<w>O 2005/033321 (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 123 y 88), WO 03/042397 (véase, por ejemplo, S<e>Q ID NO: 2, 81, 85 y 97), WO 2006/068888 (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 1 y 3-6), WO 2006/110689, (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 5-38) WO2009/104964 (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 1-5, 7, 9, 20, 22, 24 y 31), WO 2010/127097 (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 5-38), y WO 2015/191508 (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 80-294), y publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. 20150023924 (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 1, 5-10).

En algunas realizaciones, las partículas de rAAV tienen una proteína de la cápside al menos 80 % o más idéntica, por ejemplo, 85 %, 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 %, etc., es decir, hasta 100 % idéntica, a la secuencia VP1, VP2 y/o VP3 de una cápside AAV divulgada en la publicación de solicitud internacional No. WO 2003/052051 (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 2), WO 2005/033321 (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 123 y 88), WO 03/042397 (véase, por ejemplo, Se Q ID NO: 2, 81, 85 y 97), WO 2006/068888 (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 1 y 3-6), WO 2006/110689 (véase,por ejemplo,las SEQ ID NO: 5-38) WO2009/104964 (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 1-5, 7, 9, 20, 22, 24 y 31), WO 2010/127097 (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 5-38), y WO 2015/191508 (véase,por ejemplo,las SEQ ID NO: 80-294), y publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. 20150023924 (véase, por ejemplo, Se Q ID NO: 1, 5-10).

Las secuencias de ácido nucleico de vectores virales basados en AAV y los métodos de fabricación de cápsulas AAV y AAV recombinantes se enseñan, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. No. 7.282.199; 7.906.111; 8.524.446; 8.999.678; 8.628.966; 8.927.514; 8.734.809; US 9.284.357; 9.409.953; 9.169.299; 9.193.956; 9458517; y 9.587.282; publicación de solicitudes de patente de EE. UU. 2015/0374803; 2015/0126588; 2017/0067908; 2013/0224836; 2016/0215024; 2017/0051257; solicitudes internacionales de patente No. PCT/US2015/034799; PCT/EP2015/053335; WO 2003/052051, WO 2005/033321, WO 03/042397, WO 2006/068888, WO 2006/110689, WO2009/104964, WO 2010/127097, y WO 2015/191508, y publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. 20150023924.

Los métodos proporcionados son adecuados para su uso en la producción de AAV recombinante que codifica un transgén. En algunas realizaciones, en la presente se proporcionan vectores virales rAAV que codifican un Fab anti-VEGF. En realizaciones específicas, en la presente se proporcionan vectores virales basados en rAAV8 que codifican un Fab anti-VEGF. En realizaciones más específicas, en la presente se proporcionan vectores virales basados en rAAV8 que codifican ranibizumab. En algunas realizaciones, en la presente se proporcionan vectores virales rAAV que codifican iduronidasa (IDUA). En realizaciones específicas, en la presente se proporcionan vectores virales basados en rAAV9 que codifican IDUA. En algunas realizaciones, en la presente se proporcionan vectores virales de rAAV que codifican 2-sulfatasa de iduronato (IDS). En realizaciones específicas, en la presente se proporcionan vectores virales basados en rAAV9 que codifican IDS. En algunas realizaciones, en la presente se proporcionan vectores virales de rAAV que codifican un receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR). En realizaciones específicas, en la presente se proporcionan vectores virales basados en rAAV8 que codifican LDLR. En algunas realizaciones, en la presente se proporcionan vectores virales de rAAV que codifican la proteína tripeptidil peptidasa 1 (TPP1). En realizaciones específicas, en la presente se proporcionan vectores virales basados en rAAV9 que codifican TPP.

En realizaciones adicionales, las partículas de rAAV comprenden una cápside de AAV pseudotipada. En algunas realizaciones, las cápsides de AAV pseudotipadas son cápsides de AAV pseudotipadas rAAV2/8 o rAAV2/9. Los métodos para producir y utilizar partículas de rAAV pseudotipadas se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Duan et al., J. Virol., 75:7662-7671 (2001); Halbert et al., J. Virol., 74:1524-1532 (2000); Zolotukhin et al., Methods 28:158-167 (2002); and Auricchio et al., Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081, (2001)).

En realizaciones adicionales, las partículas de rAAV comprenden una cápside que contiene una proteína quimérica de la cápside de dos o más serotipos de la cápside de AAV. En algunas realizaciones, la proteína de la cápside es una proteína quimérica de 2 o más proteínas de la cápside AAV de serotipos AAV seleccionados de AAV1, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV-15 y AAV-16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10 , AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, o AAV.HSC16.

En ciertas realizaciones, se puede usar un AAV monocatenario (ssAAV). En ciertas realizaciones, se puede utilizar un vector autocomplementario, por ejemplo, scAAV (véase, por ejemplo, Wu, 2007, Human Gene Therapy, 18(2):171-82, McCarty et al, 2001, Gene Therapy, Vol. 8, número 16, páginas 1248-1254; y patentes de EE. UU. No. 6.596.535; 7.125.717; y 7.456.683).

En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden una proteína de la cápside de un serotipo de la cápside AAV seleccionado de AAV-8 o AAV-9. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV tienen un serotipo de la cápside AAV de AAV-8. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV tienen un serotipo de la cápside AAV de AAV-9.

En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden una proteína de la cápside que es un derivado, modificación o pseudotipo de la proteína de la cápside AAV-9. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden una proteína de la cápside que tiene una proteína de la cápside AAV-9 al menos 80 % o más idéntica, por ejemplo, 85 %, 85 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 %, etc., es decir, hasta 100 % idéntica, a la secuencia VP1, VP2 y/o VP3 de la proteína de la cápside AAV-9.

En realizaciones adicionales, las partículas de rAAV comprenden una cápside de mosaico. Las partículas de AAV de mosaico están compuestas por una mezcla de proteínas de la cápside virales de diferentes serotipos de AAV. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden una cápside de mosaico que contiene proteínas de la cápside de un serotipo seleccionado de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV-15 y AAV-16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10, AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, y AAV.HSC16. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden una cápside de mosaico que contiene proteínas de la cápside de un serotipo seleccionado de AAV-1, AAV-2, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAVrh.8, AAVrh.10, AAVhu.37, AAVrh.20, y AAVrh.74.

En realizaciones adicionales, las partículas de rAAV comprenden una partícula de rAAV pseudotipada. En algunas realizaciones, la partícula de rAAV pseudotipada comprende (a) un vector de ácido nucleico que comprende ITR de AAV y (b) una cápside compuesta de proteínas de las cápsides derivadas de AAVx (por ejemplo, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV-15 y AAV-16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10 , AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, y AAV.HSC16). En realizaciones adicionales, las partículas de rAAV comprenden una partícula de rAAV pseudotipada compuesta de una proteína de la cápside de un serotipo de AAV seleccionado de AAV-1, AAV-2, AAV-5,<a>AV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAVrh.8, y AAVrh.10, AAVhu.37, AAVrh.20, y AAVrh.74. En realizaciones adicionales, las partículas de rAAV comprenden una partícula de rAAV pseudotipada que contiene proteína de la cápside AAV-8. En realizaciones adicionales, las partículas de rAAV comprenden una partícula de rAAV pseudotipada que se compone de la proteína de la cápside AAV-9. En algunas realizaciones, las partículas pseudotipadas rAAV8 o rAAV9 son partículas pseudotipadas rAAV2/8 o rAAV2/9. Los métodos para producir y utilizar partículas de rAAV pseudotipadas se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Duan et al., J. Virol., 75:7662-7671 (2001); Halbert et al., J. Virol., 74:1524-1532 (2000); Zolotukhin et al., Methods 28:158-167 (2002); and Auricchio et al., Hum. Molec. Genet. 10:3075-3081, (2001).

En realizaciones adicionales, las partículas de rAAV comprenden una cápside que contiene una proteína quimérica de la cápside de dos o más serotipos de la cápside de AAV. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden una proteína de la cápside AAV quimérica de la proteína de la cápside AAV-8 y una o más proteínas de la cápside AAV de un serotipo AAV seleccionado de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV-15 y AAV-16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10 , AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, y AAV.HSC16. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden una proteína de la cápside de AAV quimérica de la proteína de la cápside AAV-8 y una o más proteínas de la cápside de AAV de un serotipo de AAV seleccionado de<a>A<v>-1, AAV-2, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-9, AAV-10, rAAVrh10, AAVrh.8, AAVrh.10, AAVhu.37, AAVrh.20, y AAVrh.74. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden una proteína de la cápside de AAV quimérica de la proteína de la cápside de AAV-9, la proteína de la cápside de uno o más serotipos de la cápside de AAV seleccionados de AAV1, AAV2, Aa V3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, Aa V8, AAV9, AAV10, AAV-11, AAV-12, AAV-13, AAV-14, AAV-15 y AAV-16, AAV.rh8, AAV.rh10, AAV.rh20, AAV.rh39, AAV.Rh74, AAV.RHM4-1, AAV.hu37, AAV.Anc80, AAV.Anc80L65, AAV.7m8, AAV.PHP.B, AAV2.5, AAV2tYF, AAV3B, AAV.LK03, AAV.HSC1, AAV.HSC2, AAV.HSC3, AAV.HSC4, AAV.HSC5, AAV.HSC6, AAV.HSC7, AAV.HSC8, AAV.HSC9, AAV.HSC10 , AAV.HSC11, AAV.HSC12, AAV.HSC13, AAV.HSC14, AAV.HSC15, y AAV.HSC16. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden una proteína de la cápside AAV quimérica de la proteína de la cápside AAV-9, la proteína de la cápside de uno o más serotipos de la cápside de AAV seleccionados de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AA6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh.8, AAVrh.10, AAVhu.37, AAVrh.20, y AAVrh.74.

Métodos para aislar partículas de rAAV

En algunas realizaciones, la divulgación proporciona métodos para producir una composición que comprende partículas aisladas del virus adenoasociado recombinante (rAAV), que comprenden: (a) aislar partículas de rAAV de un producto de alimentación que contenga una impureza (por ejemplo, cultivo de producción de rAAV), y (b) caracterizar las partículas de rAAV aisladas mediante un método descrito en la presente. En algunas realizaciones, un método para producir una formulación que comprende partículas aisladas del virus adenoasociado recombinante (rAAV) que se divulgan en la presente comprende: (a) aislar partículas de rAAV de un producto de alimentación que contenga una impureza (por ejemplo, cultivo de producción de rAAV), (b) caracterizar las partículas de rAAV aisladas mediante un método divulgado en la presente, y (c) formular las partículas de rAAV aisladas para producir la formulación.

En algunas realizaciones, la divulgación proporciona además métodos para producir una dosis unitaria farmacéutica de una formulación que comprende partículas aisladas del virus adenoasociado recombinante (rAAV), que comprende el aislamiento de partículas de rAAV de un producto de alimentación que comprende una impureza (por ejemplo, el cultivo de producción rAAV), caracterizando las partículas de rAAV aisladas utilizando un método descrito en la presente, y la formulación de las partículas de rAAV aisladas.

Las partículas de rAAV aisladas se pueden aislar utilizando métodos conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, los métodos de aislamiento de partículas de rAAV comprenden el procesamiento aguas abajo, tal como, por ejemplo, recolección de un cultivo celular, clarificación del cultivo celular recolectado (por ejemplo, mediante centrifugación o filtración de profundidad), filtración de flujo tangencial, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de hidroxilapatita, filtración estéril o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el procesamiento aguas abajo incluye al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5 o al menos 6 de: recolección de un cultivo celular, clarificación del cultivo celular recolectado (por ejemplo, por centrifugación o filtración de profundidad), filtración de flujo tangencial, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de hidroxilapatita y filtración estéril. En algunas realizaciones, el procesamiento aguas abajo comprende la recolección de un cultivo celular, clarificación del cultivo celular recolectado (por ejemplo, mediante filtración de profundidad), filtración estéril, filtración de flujo tangencial, cromatografía de afinidad, y cromatografía de intercambio aniónico. En algunas realizaciones, el procesamiento aguas abajo comprende la clarificación de un cultivo celular recolectado, filtración estéril, filtración de flujo tangencial, cromatografía de afinidad y cromatografía de intercambio aniónico. En algunas realizaciones, el procesamiento aguas abajo comprende la clarificación de un cultivo celular recolectado por filtración de profundidad, filtración estéril, filtración de flujo tangencial, cromatografía de afinidad y cromatografía de intercambio aniónico. En algunas realizaciones, la clarificación del cultivo celular recolectado comprende la filtración estéril. En algunas realizaciones, el procesamiento aguas abajo no incluye la centrifugación. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden una proteína de la cápside del serotipo AAV-8. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden una proteína de la cápside del serotipo AAV-9.

En algunas realizaciones, un método de aislamiento de partículas de rAAV comprende la recolección de un cultivo celular, clarificación del cultivo celular recolectado (por ejemplo, por filtración de profundidad), una primera filtración estéril, una primera filtración de flujo tangencial, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio aniónico monolítico, una segunda filtración de flujo tangencial y una segunda filtración estéril. En algunas realizaciones, un método de aislamiento de partículas de rAAV comprende la clarificación de un cultivo celular recolectado, una primera filtración estéril, una primera filtración de flujo tangencial, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio aniónico monolítico, una segunda filtración de flujo tangencial y una segunda filtración estéril. En algunas realizaciones, un método de aislamiento de partículas de rAAV comprende la clarificación de un cultivo celular recolectado por filtración de profundidad, una primera filtración estéril, una primera filtración de flujo tangencial, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio aniónico monolítico, una segunda filtración de flujo tangencial y una segunda filtración estéril. En algunas realizaciones, el método no incluye la centrifugación. En algunas realizaciones, la clarificación del cultivo celular recolectado comprende la filtración estéril. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden una proteína de la cápside del serotipo AAV-8. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV comprenden una proteína de la cápside del serotipo AAV-9.

En la técnica se conocen numerosos métodos para la producción de partículas de rAAV, incluyendo la transfección, la producción de líneas celulares estables, y los sistemas de producción de virus híbridos infecciosos que incluyen híbridos de adenovirus-AAV, híbridos de herpesvirus-AAV e híbridos de baculovirus-AAV. Todos los cultivos de producción de RAAV para la producción de partículas de virus rAAV requieren; (1) células huésped adecuadas, incluidas, por ejemplo, las líneas celulares de origen humano, tales como las células HeLa, A549 o HEK293 y sus derivados (células HEK293T, células HEK293F), las líneas celulares de mamíferos, tales como Vero, o las líneas celulares derivadas de insectos como SF-9 en el caso de los sistemas de producción de baculovirus; (2) función adecuada del virus auxiliar, proporcionada por adenovirus de tipo silvestre o mutante (tal como adenovirus sensible a la temperatura), virus del herpes, baculovirus o un constructo plásmido que proporcione funciones auxiliares; (3) genes y productos genéticos de rep y cap de AAV; (4) un transgán (tal como un transgen terapéutico) flanqueado por secuencias de ITR de AAV; y (5) medios adecuados y componentes de medios para apoyar la producción de rAAV. Los medios adecuados conocidos en la técnica se pueden utilizar para la producción de vectores de rAAV. Estos medios incluyen, sin limitación, los medios producidos por HyClone Laboratories y JRH incluyendo el medio modificado de Eagle (MEM), el medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), y los medios SFM SF-900 II como se describe en la patente de de Ee . UU. No. 6723551.

Los cultivos de producción de rAAV se pueden cultivar rutinariamente bajo una variedad de condiciones (en un amplio rango de temperatura, para diferentes longitudes de tiempo, y similares) adecuadas para la célula huésped particular que se utiliza. Como se sabe en la técnica, los cultivos de producción de rAAV incluyen cultivos dependientes de la fijación que se pueden cultivar en recipientes adecuados dependientes de la fijación, talescomo, por ejemplo, botellas de rodillos, filtros de fibra hueca, microtransportadores, y biorreactores de lecho empacado o de lecho fluidizado. Los cultivos de producción de vectores de rAAV también pueden incluir células huésped adaptadas a la suspensión, tales como HeLa, HEK293, Vero y derivados de las mismas, y células SF-9 que pueden cultivarse de diversas maneras, incluyendo, por ejemplo, frascos giratorios, biorreactores de tanque agitado y sistemas desechables, tal como el sistema de bolsas Wave. En la técnica se conocen numerosos cultivos en suspensión para la producción de partículas de rAAV, incluyendo por ejemplo, los cultivos divulgados en las patentes de EE. UU. No. 6.995.006, 9.783.826, y en la ublicación de solicitud de patente de EE. UU. No. 20120122155.

En algunas realizaciones, los métodos para la producción de partículas de rAAV abarcan proporcionar un cultivo celular que comprende una célula capaz de producir rAAV; añadiendo al cultivo celular un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC) a una concentración final entre aproximadamente 0.1 mm y aproximadamente 20 mm; y mantener el cultivo celular en condiciones que permitan la producción de las partículas de rAAV. En algunas realizaciones, el inhibidor de HDAC comprende un ácido graso de cadena corta o una sal del mismo. En algunas realizaciones, el inhibidor de HDAC comprende butirato (por ejemplo, butirato de sodio), valproato (por ejemplo, valproato de sodio), propionato (por ejemplo, propionato de sodio), o una combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, las partículas de rAAV se producen según se indica en WO 2020/033842.

Las partículas recombinantes de AAV pueden recolectarse de cultivos de producción de rAAV mediante la recolección del cultivo de producción que comprende células huésped o mediante la recolección de los medios usados del cultivo de producción, siempre que las células se cultiven en condiciones conocidas en la técnica para causar la liberación de partículas de rAAV en el medio de las células huésped intactas. Las partículas de AAV recombinantes también se pueden recolectar de cultivos de producción de rAAV mediante lisis de las células huésped del cultivo de producción. Los métodos adecuados de células lisantes también se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, múltiples ciclos de congelación/descongelación, sonicación, microfluidización y tratamiento con productos químicos, tales como detergentes y/o proteasas.

En el momento de la recolección, los cultivos de producción de rAAV pueden contener uno o más de los siguientes: (1) proteínas de las células huésped; (2) ADN de las células huésped; (3) ADN del plásmido; (4) virus auxiliar; (5) proteínas del virus auxiliar; (6) ADN del virus auxiliar; y (7) componentes de medios incluyendo, por ejemplo, proteínas séricas, aminoácidos, transferrinas y otras proteínas de bajo peso molecular. Los cultivos de producción de Ra a V pueden contener además impurezas relacionadas con el producto, por ejemplo, formas vectoriales inactivas, cápsides virales vacías, partículas o cápsides virales agregadas, cápsides virales con plegamiento incorrecto, partículas virales degradadas.

En algunas realizaciones, la recolección de cultivo de producción de rAAV se aclara para eliminar los desechos de las células huésped. En algunas realizaciones, la recolección de cultivo de producción se clarifica mediante filtración a través de una serie de filtros de profundidad. La clarificación también se puede lograr mediante una variedad de otras técnicas estándar conocidas en la técnica, tales como centrifugación o filtración a través de cualquier filtro de acetato de celulosa de 0,2 mm o mayor tamaño de poro conocido en la técnica En algunas realizaciones, la clarificación del cultivo celular recolectado comprende la filtración estéril. En algunas realizaciones, la recolección de cultivo de producción se clarifica mediante centrifugación. En algunas realizaciones, la clarificación de la recolección de cultivo de producción no incluye la centrifugación.

En algunas realizaciones, el cultivo celular recolectado se clarifica mediante filtración. En algunas realizaciones, la clarificación del cultivo celular recolectado comprende la filtración de profundidad. En algunas realizaciones, la clarificación del cultivo de células recolectadas comprende además la filtración de profundidad y la filtración estéril. En algunas realizaciones, el cultivo de células recolectadas se clarifica utilizando un tren de filtros que comprende uno o más medios de filtración diferentes. En algunas realizaciones, el tren del filtro comprende un medio de filtración de profundidad. En algunas realizaciones, el tren del filtro comprende uno o más medios de filtración de profundidad. En algunas realizaciones, el tren del filtro comprende dos medios de filtración de profundidad. En algunas realizaciones, el tren del filtro comprende un medio de filtración estéril. En algunas realizaciones, el tren del filtro comprende 2 medios de filtración de profundidad y un medio de filtración estéril. En algunas realizaciones, el medio filtrante de profundidad es un filtro de profundidad poroso. En algunas realizaciones, el tren de filtro comprende Clarisolve® 20MS, Millistak+® C0HC, y un medio filtrante de grado esterilizante. En algunas realizaciones, el tren de filtro comprende Clarisolve® 20MS, Millistak+® C0HC, y Sartopore® 2 XLG 0.2 pm. En algunas realizaciones, el cultivo celular recolectado se pretrata antes de ponerlo en contacto con el filtro de profundidad. En algunas realizaciones, el pretratamiento comprende añadir una sal al cultivo celular recolectado. En algunas realizaciones, el pretratamiento comprende añadir un floculante químico al cultivo celular recolectado. En algunas realizaciones, el cultivo celular recolectado no se pretrata antes de ponerlo en contacto con el filtro de profundidad.

En algunas realizaciones, la recolección de cultivo de producción se clarifica por filtración que se divulga en WO 2019/212921.

En algunas realizaciones, la recolección de cultivo de producción de rAAV se trata con una nucleasa (por ejemplo, Benzonase®) o endonucleasa (por ejemplo, endonucleasa de Serratia marcescens) para digerir el ADN de alto peso molecular presente en el cultivo de producción. La digestión de la nucleasa o endonucleasa se puede realizar rutinariamente bajo condiciones estándar conocidas en la técnica. Por ejemplo, la digestión de la nucleasa se realiza a una concentración final de 1-2.5 unidades/ml de Benzonase® a una temperatura que varía de ambiente a 37 °C durante un período de 30 minutos a varias horas.

La filtración estéril abarca la filtración utilizando un medio filtrante de grado esterilizante. En algunas realizaciones, el medio filtrante de grado esterilizante es un filtro de poros de 0.2 o 0.22 pm. En algunas realizaciones, el medio filtrante de grado esterilizante comprende polietersulfona (PES). En algunas realizaciones, el medio filtrante de grado esterilizante comprende fluoruro de polivinilideno (PVDF). En algunas realizaciones, el medio filtrante de grado esterilizante tiene un diseño de doble capa heterogéneo hidrofílico. En algunas realizaciones, el medio filtrante de grado esterilizante tiene un diseño de doble capa heterogéneo hidrofílico de un prefiltro de 0.8 pm y una membrana de filtro final de 0.2 pm. En algunas realizaciones, el medio filtrante de grado esterilizante tiene un diseño de doble capa heterogéneo hidrofílico de un prefiltro de 1.2 pm y una membrana de filtro final de 0.2 pm. En algunas realizaciones, el medio filtrante de grado esterilizante es un filtro de poros de 0.2 o 0.22 pm. En otras realizaciones, el medio filtrante de grado esterilizante es un filtro de poros de 0.2 pm. En algunas realizaciones, el medio filtrante de grado esterilizante es una combinación del tamaño nominal de los poros Sartopore® 2 XLG 0.2 pm, membranas Durapore™ PVDF 0.45 pm, o Sartoguard® PES 1.2 pm 0.2 pm. En algunas realizaciones, el medio filtrante de grado esterilizante es un Sartopore® 2 XLG de 0.2 pm.

En algunas realizaciones, el producto de alimentación clarificado se concentra a través de filtración de flujo tangencial ("TFF") antes de ser aplicado a un medio cromatográfico, por ejemplo, medio de cromatografía de afinidad. La concentración a gran escala de virus usando la ultrafiltración de TFF ha sido descrita por Paul et al., Human Gene Therapy 4:609-615 (1993). La concentración de TFF del producto de alimentación clarificado permite que un volumen técnicamente manejable de producto de alimentación clarificado sea sometido a cromatografía y permite un tamaño más razonable de las columnas sin la necesidad de largos tiempos de recirculación. En algunas realizaciones, el producto de alimentación clarificado se concentra entre al menos dos veces y al menos diez veces. En algunas realizaciones, el producto de alimentación clarificado se concentra entre al menos diez veces y al menos veinte veces. En algunas realizaciones, el producto de alimentación clarificado se concentra entre al menos veinte veces y al menos cincuenta veces. En algunas realizaciones, el producto de alimentación clarificado se concentra aproximadamente veinte veces. Un experto en la técnica también reconocerá que el TFF también se puede utilizar para eliminar las impurezas de moléculas pequeñas (por ejemplo, contaminantes de cultivo celular que comprenden componentes de medios, albúmina sérica u otras proteínas séricas) que forman el producto de alimentación clarificado a través de la diafiltración. En algunas realizaciones, el producto de alimentación clarificado se somete a diafiltración para eliminar impurezas de moléculas pequeñas. En algunas realizaciones, la diafiltración comprende el uso de entre aproximadamente 3 y aproximadamente 10 volúmenes de diafiltración de disolución amortiguadora. En algunas realizaciones, la diafiltración comprende el uso de aproximadamente 5 volúmenes de diafiltración de disolución amortiguadora. Una de las habilidades ordinarias en la técnica también reconocerá que TFF también se puede utilizar en cualquier paso en el proceso de purificación donde es deseable intercambiar amortiguadores antes de realizar el siguiente paso en el proceso de purificación. En algunas realizaciones, los métodos para aislar rAAV del producto de alimentación clarificado que se divulgan en la presente comprenden el uso de TFF para intercambiar disoluciones amortiguadoras.

La cromatografía de afinidad se puede utilizar para aislar partículas de rAAV de una composición. En algunas realizaciones, la cromatografía de afinidad se utiliza para aislar las partículas de rAAV del producto de alimentación clarificado. En algunas realizaciones, la cromatografía de afinidad se utiliza para aislar partículas de rAAV del producto de alimentación clarificado que ha sido sometido a filtración de flujo tangencial. Los medios de cromatografía de afinidad adecuados son conocidos en la técnica e incluyen, sin limitación, AVB Sepharose™, resina de afinidad POROS™ CaptureSelect™ AAVX, resina de afinidad POROS™ CaptureSelect™ AAV9, y resina de afinidad POROS™ CaptureSelect™ AAV8. En algunas realizaciones, el medio de cromatografía de afinidad es la resina de afinidad POROS™ CaptureSelect™ AAV9. En algunas realizaciones, el medio de cromatografía de afinidad es la resina de afinidad POROS™ CaptureSelect™ AAV8. En algunas realizaciones, el medio de cromatografía de afinidad es la resina de afinidad POROS™ CaptureSelect™ AAVX.

La cromatografía de intercambio aniónico se puede utilizar para aislar partículas de rAAV de una composición. En algunas realizaciones, la cromatografía de intercambio aniónico se utiliza después de la cromatografía de afinidad como un paso final de concentración y pulido. Los medios adecuados de cromatografía de intercambio aniónico son conocidos en la técnica e incluyen, sin limitación, Unosphere Q(Biorad, Hercules, California), y las resinas amino o imino cargadas con N, tales como, por ejemplo, POROS 50 PI, o cualquier DEAE, TMAE, amina terciaria o cuaternaria, o las resinas basadas en PEI conocidas en la técnica (patente de EE. UU. No. 6,989,264; Brument et al., Mol. Therapy 6(5):678-686 (2002); Gao et al., Hum. Gene Therapy 11:2079-2091 (2000)). En algunas realizaciones, el medio de cromatografía de intercambio aniónico comprende una amina cuaternaria. En algunas realizaciones, el medio de intercambio aniónico es una resina de cromatografía de intercambio aniónico monolítico. En algunas realizaciones, el medio de cromatografía de intercambio aniónico monolítico comprende polímeros de glicidilmetacrilato-etilendimetacrilato o estireno-divinilbenceno. En algunas realizaciones, el medio de cromatografía de intercambio aniónico monolítico se selecciona del grupo que consiste en Columna compuesta avanzada CIMmultus™ QA-1 (Amina cuaternaria), Columna compuesta avanzada CIMmultus™ DEAE-1 (Dietilamino), CIM® QA Disk (Amina cuaternaria), CIM® DEAE, y Disco CIM® e Da (Etilendiamino). En algunas realizaciones, el medio de cromatografía de intercambio aniónico monolítico es la Columna compuesta avanzada CIMmultus™ QA-1 (Amina cuaternaria). En algunas realizaciones, el medio de cromatografía de intercambio aniónico monolítico es Disco CIM® QA (Amina cuaternaria). En algunas realizaciones, el medio de cromatografía de intercambio aniónico es CIM QA (BIA Separations, Eslovenia). En algunas realizaciones, el medio de cromatografía de intercambio aniónico es BIA CIM® QA-80 (EL volumen de columna es de 80 ml). Un experto en la técnica entenderá que los amortiguadores de lavado de la resistencia iónica adecuada se pueden identificar de tal manera que el rAAV permanece unido a la resina mientras que las impurezas, incluyendo, sin limitación, las impurezas que pueden ser introducidas por los pasos de purificación aguas arriba se eliminan.

En algunas realizaciones, la cromatografía de intercambio aniónico se realiza de acuerdo con un método divulgado en WO 2019/241535.

En algunas realizaciones, un método de aislamiento de partículas de rAAV comprende la determinación del título del genoma vectorial, el título de la cápside y/o la relación de la cápside llena a vacía en una composición que comprende las partículas de rAAV aisladas. En algunas realizaciones, el título del genoma vectorial se determina por PCR cuantitativa (qPCR), PCR digital (dPCR) o PCR digital de gotas (ddPCR). En algunas realizaciones, el título de la cápside se determina por el ensayo ELISA específico de serotipo. En algunas realizaciones, la relación de cápsides llenas a vacías se determina por ultracentrifugación analítica (AUC) o microscopía electrónica de transmisión (TEM).

En algunas realizaciones, el título del genoma vectorial, el título de la cápside, y/o la relación de las cápsides llenas a vacías se determina por espectrofotometría, por ejemplo, midiendo la absorbancia de la composición a 260 nm; y midiendo la absorbancia de la composición a 280 nm. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV no se desnaturalizan antes de medir la absorbancia de la composición. En algunas realizaciones, las partículas de rAAV se desnaturalizan antes de medir la absorbancia de la composición. En algunas realizaciones, la absorbancia de la composición a 260 nm y 280 nm se determina utilizando un espectrofotómetro. En algunas realizaciones, la absorbancia de la composición a 260 nm y 280 nm se determina mediante un HPLC. En algunas realizaciones, la absorbancia es la absorbancia máxima. En la técnica se conocen varios métodos para medir la absorbancia de una composición a 260 nm y 280 nm. Los métodos para determinar el título del genoma vectorial y el título de la cápside de una composición que comprende las partículas de rAAV recombinantes aisladas se divulgan en WO 2019/212922.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Evaluación de la pureza y las estructuras de los genomas vectoriales de AAV mediante cromatografía de exclusión por tamaño de alto rendimiento.

La pureza del producto es un atributo de calidad crítico para las biologías terapéuticas con el potencial de afectar la seguridad y eficacia, por lo que la garantía de control, incluyendo las pruebas de liberación, es fundamental. El genoma vectorial de AAV se suministra al núcleo celular y puede ser persistente durante un largo período, mucho más largo que las proteínas de las cápsides. Por lo tanto, es deseable evaluar la pureza del genoma vectorial para los productos de AAV. La pureza relativa del AAV intacto que cuantifica la relación de cápside vacía y completa se puede determinar mediante ultracentrifugación analítica (AUC), microscopía crio-electrónica y cromatografía de intercambio iónico. Además, la presencia de vectores con genomas fragmentados y contaminantes del ADN no relacionados con los transgenes, a menudo denominados cápsides parcialmente llenas, puede resolverse mediante AUC. La pureza de la proteína de la cápside se puede determinar mediante SDS-PAGE o SDS-CGE. Si bien se han publicado algunos estudios para analizar el genoma de AAV mediante electroforesis capilar y en gel, no se ha establecido un método de consenso para determinar la pureza del genoma de AAV. En la presente se divulgan métodos de alto rendimiento para evaluar la pureza y estructura del genoma del vector AAV con alta sensibilidad y alta reproducibilidad por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC).

El genoma vectorial de AAV es un ADN monocatenario (ADNmc) con partículas de AAV individuales que comprenden los genomas de ADN de cadena más o menos con la misma frecuencia. Una vez liberados de los vectores de AAV, los genomas de ADN monocatenario más y menos pueden aparearse espontáneamente para formar ADN bicatenario (ADNbc). La formación de ADNbcdepende de las condiciones de desnaturalización utilizadas para liberar los genomas monocatenarios. A baja temperatura, donde la desnaturalización es incompleta, ADNmc con diferentes estructuras secundarias puede ser detectado por SEC además de ADNbc. Bajo una condición de desnaturalización completa a una temperatura más alta, todo el ADNnc fue convertido a ADNbc. Sorprendentemente, el aumento adicional de la temperatura de desnaturalización por encima de un óptimo específico de la muestra da como resultado una pérdida de señal durante SEC. Sin desear limitarse a ninguna teoría en particular, la incubación a estas temperaturas por encima de las óptimas, es decir, a 90 °C y 95 °C puede causar pérdida de material o puede crear fragmentos de ADN artificiales. La pérdida y fragmentación observadas indican un termo-inestabilidad del genoma vectorial de AAV, que puede variar de producto a producto, y está probablemente relacionado con secuencias vectoriales y diseños de constructos de ADN.

Además de la variación del producto de AAV a la del producto de AAV, la respuesta a la desnaturalización térmica también puede variar entre subpoblaciones de AAV dentro del mismo producto. Por ejemplo, ciertas subpoblaciones de AAV aisladas de la cromatografía de intercambio aniónico mostraron una mayor resistencia a la desnaturalización, lo que sugiere que estos vectores de AAV pueden contener ADNmc con una estructura compacta. El contenido genómico de estos vectores de AAV determinado por ddPCR fue menor que el determinado por espectrofotometría o cuantificación SEC, lo que indica la presencia de estructuras de ADN compactas y la necesidad de una mayor desnaturalización para mejorar la eficiencia de la PCR.

Después de la desnaturalización completa a la temperatura óptima específica de la muestra, todos los vectores liberados del genoma forman ADNbc, que puede ser separado por SEC de las impurezas incluyendo el ADN residual de la célula huésped, el ADN del plásmido, y los fragmentos del genoma. El análisis del ADN liberado del AAV por SEC proporciona una evaluación cuantitativa de la pureza del tamaño del genoma vectorial de AAV. El porcentaje de fragmentos de ADN determinados por este método se correlaciona bien con el porcentaje de cápsides parcialmente llenas determinado por AUC. El análisis AUC consume mucho tiempo, requiere técnicas y conocimientos avanzados para el funcionamiento del sistema y el análisis de datos, y a menudo consume un gran tamaño de muestras. Por el contrario, el análisis de pureza realizado por SEC como se divulga en la presente es rápido, reproducible, altamente sensible con un límite de cuantificación (LoQ) mejorado, y puede automatizarse para un análisis de alto rendimiento. Figura 1 (véase también la Figura 9). El método SEC que se describe en la presente se utilizó para la evaluación rápida de las cápsides parcialmente llenas para apoyar el desarrollo del producto y la optimización del proceso, y como un método ortogonal para la caracterización del producto AAV. Además, los títulos del genoma vectorial podrían determinarse utilizando el área pico detectada por este método SEC con absorbancia UV a 260 nm.

Preparación de la muestra. 20 a 40 pL de muestras vectoriales de AAV se calentaron a las temperaturas deseadas en presencia de un SDS del 0.05 % en un bloque de calor. Mediante el uso de bloques de calentamiento adecuados, se pueden preparar múltiples muestras, por ejemplo, hasta 50-100 muestras. La temperatura óptima y la duración de la desnaturalización térmica se evaluaron mediante estudios de curso de tiempo y se determinaron individualmente para cada producto de vector AAV, según lo verificado por la interrupción completa del pico AAV intacto y la aparición de ADN del genoma vectorial puro y picos de ADN de fragmentos en SEC. Figuras 2 y 3.

HPLC de exclusión por tamaño. La HPLC de exclusión por tamaño (SEC) se realizó en un sistema UHPLC Agilent 1290 (Agilent). El volumen de inyección se basó en la concentración genómica estimada de la muestra. Para muestras >5E+12 GC/ml, se inyectaron10 pl y para muestras inferiores a <5E+12 GC/ml, se inyectaron 15-20 pl para el análisis. La absorbancia UV a 280 nm y 260 nm se monitoreó usando un detector de matriz de diodos con una celda de flujo de longitud de trayectoria de 6 cm. Se utilizó un detector de fluorescencia para confirmar la pureza del ADN. Se cargó una muestra vectorial de AAV desnaturalizada por calor de 5 x 1010 GC en una columna SEC (SEPAX) SRT SEC2000 (300 x 4.6 mm, I.D., tamaño de poro 2000 nm) a temperatura ambiente. Para medir cada muestra se utilizó un gradiente isocrático utilizando una fase móvil de 10 mM de fosfato de sodio, 300 mM de cloruro de sodio, 0.05 % de polisorbato 80, 20 % de metanol, pH 7.5 a una tasa de flujo de 0.2 ml/min para un tiempo total de ejecución de 45 minutos. El análisis de los datos se realizó utilizando el software OpenLAB (Agilent). La Figura 3 muestra los perfiles SEC de 3 productos separados ejecutados en la misma secuencia.

Ejemplo 2. Desnaturalización y caracterización de la estructura del ADNmc.

El perfil de SEC de una muestra de rAAV se analizó después de la desnaturalización a 75 °C durante 10 min, 85 °C durante 10 min, o 85 °C durante 20 min. Figura 4. La presencia de ADNmc con alguna estructura secundaria en la muestra expuesta a 75 °C durante 10 min indica que no fue completamente desnaturalizada por el tratamiento térmico. 85 °C durante 20min fue óptimo para desnaturalizar/linearizar completamente el ADNmc. Se pudo observar una baja cantidad de genoma vectorial truncado en las tres muestras. El análisis SEC de diferentes preparaciones del mismo rAAV después de la desnaturalización a 75 °C durante 10 min mostró que el nivel de ADNmc con alguna estructura secundaria varió entre las diferentes preparaciones.

Ejemplo 3. La desnaturalización térmica excesiva conduce a la pérdida de señal.

El perfil SEC de una muestra de rAAV se analizó después de la desnaturalización térmica a 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C o 95 °C durante 20 min. Figura 5. La intensidad de la señal para ADNbc fue mayor después de la desnaturalización térmica a 80 °C y 85 °C que a 75 °C, como se esperaba con base, por ejemplo, en los datos mostrados en el ejemplo 2. Sorprendentemente, un aumento adicional en la temperatura de desnaturalización térmica a 90 °C y 95 °C dio como resultado una pérdida de la señal de ADNbc. Estos resultados indicaron que había una temperatura óptima de desnaturalización térmica que conducía a una señal máxima, y que la temperatura óptima de desnaturalización térmica para la muestra en particular probada estaba en el rango de aproximadamente 80 °C a aproximadamente 85 °C. Esta observación fue sorprendente debido a que no se esperaba que una incubación de 20 minutos a 90 °C y 95 °C degradara significativamente el genoma de AAV. Sin desear limitarse a ninguna teoría en particular, la incubación a temperaturas más altas, es decir, a 90 °C y 95 °C puede haber causado pérdida de material y/o puede haber creado fragmentos de ADN artificiales. La pérdida y fragmentación observadas indicaron un termo-inestabilidad del genoma vectorial de AAV, que puede variar de producto a producto, y está probablemente relacionado con secuencias vectoriales y diseños de constructos de ADN.

La determinación de las condiciones óptimas de desnaturalización térmica específicas del producto es importante para desarrollar un ensayo de cribado de alto rendimiento utilizando los métodos descritos en la presente. Como se demuestra en los ejemplos a continuación, el ensayo descrito en la presente es útil, por ejemplo, como un método ortogonal para AUC para cuantificar la relación de partículas de rAAV parcialmente llenas que comprenden el genoma vectorial truncado. Se puede lograr una correlación confiable entre el % de fragmento de ADN determinado por DNA-SEC y el % de la cápside parcialmente llena determinado por AUC mediante el uso de las condiciones óptimas de desnaturalización térmica específicas del producto para el ensayo DNA-SEC que se divulga en la presente.

Ejemplo 4. Análisis de puente del genoma vectorial truncado entre AUC y DNA-SEC.

Se observó un bajo nivel de ADN fragmentado en composiciones que comprenden tres partículas diferentes de rAAV después de la desnaturalización completa por tratamiento a 85 °C durante 20 min. Figura 3. El nivel de partículas de rAAV parcialmente llenas según lo determinado por el AUC y el nivel de ADN fragmentado detectado por DNA-SEC mostraron resultados consistentes. Figura 6. Por lo tanto, el método DNA-SEC divulgado en la presente se puede utilizar como un método ortogonal de alto rendimiento para AUC para cuantificar la relación de partículas de rAAV parcialmente llenas que comprenden el genoma vectorial truncado.

La buena correlación entre el % de fragmento de ADN determinado por el ADN-SEC y el % de la cápside parcialmente llena determinado por AUC demuestra que ADN-SEC se puede utilizar para evaluar rápidamente el nivel de cápsides parcialmente llenas en un gran número de muestras para apoyar el desarrollo del producto y la optimización del proceso.

Ejemplo 5. Título de VGC por ddPCR y DNA-SEC.

Se determinó el título de copia del genoma viral (VGC) para múltiples preparaciones de rAAV utilizando ADN-SEC divulgado en la presente y ddPCR. DNA-SEC y ddPCR mostraron resultados consistentes generales de títulos de VGC para productos de AAV.

Una ventaja de los métodos divulgados en la presente es que para las composiciones rAAV con alta cantidad de genoma truncado, el título de VGC por ADN-SEC es capaz de reportar VGC para el genoma vectorial de longitud completa.

Ejemplo 6. Caracterización del plegamiento de genomas vectoriales de AAV.

Ciertas poblaciones de AAV, por ejemplo, poblaciones de AAV aisladas de cromatografía de intercambio aniónico (AAV_2 en la Figura 7) mostraron una mayor resistencia a la desnaturalización. El contenido genómico de estos vectores de AAV determinado por ddPCR fue menor que los determinados por espectrofotometría o cuantificación SEC, lo que indica la presencia de estructuras de ADN compactas y la necesidad de una mayor desnaturalización para mejorar la eficiencia de la PCR. Como se demuestra en la presente, mediante el uso de varias condiciones de desnaturalización, el método DNA-SEC divulgado en la presente se puede utilizar para proporcionar información sobre la estructura secundaria/plegamiento del genoma vectorial AAV dentro de las cápsides, lo que puede afectar potencialmente la eficiencia de los ensayos basados en PCR y la potencia.

Ejemplo 7. Optimización de procesos evaluada por DNA-SEC.

DNA-SEC se puede utilizar como un ensayo de cribado de alto rendimiento para apoyar la optimización del proceso y la caracterización del producto. La Figura 8 muestra el perfil DNA-SEC de 5 preparaciones de rAAV producidas por 5 procesos optimizados diferentes. Los perfiles de DNA-SEC se determinaron después de una desnaturalización débil y fuerte. El porcentaje de fragmentos genómicos varió entre 3.9 % y 7.7 % entre las 5 preparaciones de rAAV.

Ejemplo 8. Evaluación del rendimiento del ensayo DNA-SEC.

El ensayo DNA-SEC descrito en la presente proporciona un método confiable y fue probado para el rendimiento con respecto a la precisión, linealidad y límite de cuantificación (LoQ). La reproducibilidad estuvo dentro del 5 % de repetibilidad durante la misma ejecución de SEC, dentro del 10 % de precisión intermedia. El ensayo demostró linealidad, con detección en el rango de 2.9<e>+10 a 29E+10 GC de AAV, y LoQ ~ 2E+10 GC de AAV. Figura 9.

Si bien los métodos divulgados se han descrito en relación con lo que actualmente se considera que son las realizaciones más prácticas y preferidas, debe entenderse que los métodos comprendidos en la divulgación no deben limitarse a las realizaciones divulgadas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método de aislamiento del genoma del virus adenoasociado recombinante (rAAV) que comprende

en donde la fase móvil para la cromatografía de exclusión por tamaño comprende una sal, disolvente orgánico o detergente.

2. El método de la reivindicación 1, que comprende además la recuperación del genoma AAV; o la medición de la absorbancia UV del eluato en uno o ambos de aproximadamente 260 nm y aproximadamente 280 nm.

3. Un método para determinar la pureza del tamaño del genoma vectorial de una composición que comprende partículas de rAAV aisladas, en donde el método comprende

c) medir la absorbancia UV del eluato en uno o ambos de aproximadamente 260 nm y aproximadamente 280 nm; y d) determinar la pureza del tamaño del genoma vectorial de la composición que comprende las partículas de rAAV, en donde la fase móvil para la cromatografía de exclusión por tamaño comprende una sal, disolvente orgánico o detergente.

4. Un método para evaluar el plegamiento o estructura secundaria de los genomas vectoriales AAV dentro de las cápsides, en donde el método comprende

c) medir la absorbancia UV del eluato en uno o ambos de aproximadamente 260 nm y aproximadamente 280 nm, en donde la fase móvil para la cromatografía de exclusión por tamaño comprende una sal, disolvente orgánico o detergente.

5. Un método para determinar el título del genoma vectorial (Vg) de una composición que comprende partículas aisladas de rAAV, en donde el método comprende

c) medir la absorbancia UV del eluato en uno o ambos de aproximadamente 260 nm y aproximadamente 280 nm; y d) determinar el Vg de la composición que comprende las partículas de rAAV,

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde someter la composición a una condición bajo la cual se desnaturalizan las partículas de rAAV comprende:

(i) exponer la composición a una condición que maximice sustancialmente la señal de SEC de ADNbc; o

(ii) exponer la composición a una temperatura que no supere los 10 °C de la temperatura mínima necesaria para desnaturalizar sustancialmente todo el genoma viral de la composición; o

(iii) someter la composición a una condición que dé lugar a una determinación de % de fragmento de ADN que se correlacione con el % de la cápside parcialmente llena de la misma composición determinado por AUC; o

(iv) exponer la composición a una desnaturalización térmica que maximice sustancialmente la señal del SEC de ADNbc; o

(v) someter la composición a una desnaturalización térmica que dé lugar a una determinación de % de fragmento de ADN que se correlacione con el % de la cápside parcialmente llena de la misma composición determinado por AUC.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde someter la composición a una condición bajo la cual se desnaturalizan las partículas de rAAV comprende incubar la composición a una temperatura entre aproximadamente 65 °C y aproximadamente 95 °C, opcionalmente entre aproximadamente 70 °C y aproximadamente 90 °C, entre aproximadamente 75 °C y aproximadamente 85 °C, o entre aproximadamente 80 °C y 85 °C, preferiblemente en donde la incubación se realiza a aproximadamente 70 °C, aproximadamente 75 °C, aproximadamente 80 °C, aproximadamente 85 °C, o aproximadamente 90 °C, más preferiblemente en donde la incubación es aproximadamente a 75 °C, aproximadamente a 80 °C, o aproximadamente a 85 °C; opcionalmente, en donde someter la composición a una condición bajo la cual se desnaturalicen las partículas de rAAV comprende incubar la composición a una temperatura entre aproximadamente 65 °C y aproximadamente 95 °C durante entre aproximadamente 5 minutos y 60 minutos, preferiblemente en donde la incubación dura aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 25 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 35 minutos, aproximadamente 40 minutos, aproximadamente 45 minutos, o aproximadamente 60 minutos, más preferiblemente en donde la incubación dura aproximadamente 10 minutos, durante aproximadamente 15 minutos, o durante aproximadamente 20 minutos.

8. El método de la reivindicación 7, en donde someter la composición a una condición bajo la cual se desnaturalizan las partículas de rAAV comprende incubar la composición a una temperatura entre aproximadamente 65 °C y aproximadamente 95 °C durante aproximadamente 5 minutos y 60 minutos en presencia de un detergente, preferiblemente en donde el detergente comprende SDS, bromuro de trimetilamonio (ETMAb ), polisorbato 80, polisorbato 20, Pluronic F-68, o una combinación de los mismos, o el detergente tiene una concentración entre aproximadamente 0.005 % y aproximadamente 0.5 %, o el detergente comprende entre aproximadamente 0.005 % y aproximadamente 0.5 % de SDS, o el detergente comprende aproximadamente 0.05 % de SDS; opcionalmente, en donde sustancialmente todas las partículas virales de la muestra se desnaturalizan por el proceso de desnaturalización, o al menos aproximadamente el 95 % de las partículas virales en la muestra se desnaturalizan por el proceso de desnaturalización.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde someter la composición que comprende las partículas de rAAV desnaturalizadas a la cromatografía de exclusión por tamaño comprende poner en contacto la composición con una resina de cromatografía de exclusión por tamaño que comprende un tamaño de poro nominal entre aproximadamente 50 nm y aproximadamente 500 nm, preferiblemente en donde el tamaño nominal del poro es de aproximadamente 100 nm, 200 nm, 300 nm, o 400 nm, más preferiblemente en donde el tamaño nominal del poro es de aproximadamente 200 nm.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la cromatografía de exclusión por tamaño comprende el uso de una cromatografía líquida de alto rendimiento o un sistema de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la fase móvil para la cromatografía de exclusión por tamaño comprende una sal, disolvente orgánico y detergente.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde:

(i) la fase móvil comprende una sal seleccionada del grupo que consiste en cloruro de sodio, acetato de sodio, bicarbonato de sodio, carbonato sódico, carbonato amónico, cloruro amónico, nitrato amónico, y combinaciones de los mismos, preferiblemente en donde la fase móvil comprende cloruro de sodio; y/o

(ii) la fase móvil comprende un detergente seleccionado del grupo que consiste en polisorbato 80, poloxámero 188, poloxámero 407, polisorbato 20, Pluronic F-68, o BRIJ 35, y combinaciones de los mismos, preferiblemente en donde la fase móvil comprende polisorbato 80; y/o

(iii) la fase móvil comprende un disolvente orgánico seleccionado del grupo que consiste en metanol, isopropanol, acetonitrilo, dimetil sulfóxido (DMSO), tetrahidrofurano (THF), trifluoroetanol (TFE), hexafluoroisopropanol (HFIP), y combinaciones de los mismos, preferiblemente en donde la fase móvil comprende metanol.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde la fase móvil para la cromatografía de exclusión por tamaño comprende además un agente amortiguador, opcionalmente en donde el agente amortiguador se selecciona del grupo que consiste en fosfato de sodio, histidina, citrato de sodio, HEPES, MES, Tris, Bis-Tris, MOPS, TES, bicina, glicina, tricina, N-glicilglicina, acetato de sodio, carbonato de sodio, glicilglicina, lisina, arginina y combinaciones de los mismos, preferiblemente en donde el agente amortiguador es fosfato de sodio.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde la fase móvil para la cromatografía de exclusión por tamaño comprende fosfato de sodio, cloruro de sodio, polisorbato 80, y metanol, opcionalmente en donde la fase móvil comprende entre aproximadamente 5 mm y aproximadamente 50 mm de fosfato de sodio, entre aproximadamente 100 mm y aproximadamente 500 mm de cloruro de sodio, entre aproximadamente 0.01 % y aproximadamente 0.5 % de polisorbato 80, y entre aproximadamente 5 % y aproximadamente aproximadamente 50 % de metanol, y tiene un pH entre aproximadamente 6.0 y 8.5; o la fase móvil comprende aproximadamente 10 mM de fosfato de sodio, aproximadamente 300 mM de cloruro de sodio, aproximadamente 0.05 % de polisorbato 80 y aproximadamente 20 % de metanol, y tiene un pH de aproximadamente 7.5.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde la composición que comprende partículas de rAAV comprende entre aproximadamente 2E+10 copias del genoma/ml y aproximadamente 1E+14 copias del genoma/ml.