ES2961462T3 - Proteína de fusión multiepítopo de un antígeno del VHC y usos de la misma - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a una proteína de fusión multiepítopo así como a su uso como calibrador y/o control en un inmunoensayo de diagnóstico in vitro para detectar el antígeno central del VHC. La proteína de fusión multiepítopo comprende de dos a seis péptidos lineales no superpuestos diferentes presentes en la secuencia de aminoácidos de la proteína central del virus de la hepatitis C (VHC), en donde cada uno de dichos péptidos está separado del otro por un espaciador que consiste en un secuencia de aminoácidos distinta del VHC y que comprende una secuencia de aminoácidos chaperona. En dicho polipéptido no están presentes más secuencias de aminoácidos específicas del VHC. Un aspecto adicional se refiere a un kit de reactivos para detectar el antígeno central del VHC que comprende dicha proteína de fusión multiepítopo como calibrador o control o ambos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proteína de fusión multiepítopo de un antígeno del VHC y usos de la misma

Los controles fiables y el material calibrador son partes esenciales de ensayos de diagnósticoin vitroserológicos, en particular en el área de las enfermedades infecciosas. Para apoyar el diagnóstico de infecciones víricas, las pruebas de ácido nucleico y la detección de antígenos víricos pertenecen a los procedimientos bien conocidos en la técnica. La hepatitis C es una infección vírica de propagación mundial provocada por el virus de la hepatitis C (VHC), un virus de ARN que afecta al hígado y tiende a volverse crónico. El VHC se transmite por contacto de sangre a sangre (por ejemplo, por el uso de drogas intravenosas, transfusión de sangre, transmisión de madre a hijo durante el embarazo/parto). Además de las pruebas de ARN, la detección serológica de antígenos estructurales del VHC tales como el antígeno central, son procedimientos habituales para una detección en fase temprana de una infección por el virus de la hepatitis C.

Varios kits comerciales para detectar el antígeno central del VHC están disponibles en el mercado, tales como Abbott Architect HCV Ag, Ortho HCV Core Ag EIA, Fujirebio Lumipulse II HCV Core Assay, Murex HCV Ag/Ab Combination, Bio-Rad Monolisa HCV Ag-Ab Ultra. Cada uno de estos ensayos necesita material de calibración para generar un valor de corte fiable para la diferenciación de muestras negativas y positivas. Para ensayos cuantitativos, también se puede usar material de calibración para ajustar la lectura del sistema de prueba para mostrar y probar una correlación entre la medición del instrumento del analito que se está sometiendo a prueba y la concentración real de este analito. Además, también se necesita verificación de calibración o material de control (de calidad). Para ensayos cuantitativos, dicho material de control tiene una concentración conocida del analito y se somete a prueba de la misma forma que las muestras de pacientes. La medición de los controles garantiza que el sistema de prueba mida con exactitud muestras en todo el intervalo de medición analítico. Para ensayos cualitativos que determinan la mera presencia del analito, la medición de los controles garantiza que el sistema de prueba está funcionando apropiadamente y por lo tanto se puede contar con que producirá resultados de calidad.

Para ensayos de diagnósticoin vitrodel centro del VHC se usan sueros naturales de pacientes infectados o bien antígeno central del VHC producido de forma recombinante como material de calibración y a menudo también como material de control. En vista del tratamiento terapéutico eficaz de las infecciones por VHC, la disponibilidad de sueros de pacientes positivos para VHC se vuelve cada vez más difícil. Por lo tanto, es una opción producir antígeno central del VHC recombinante y a continuación enriquecer sueros naturales o matrices artificiales y sistemas tampón con el material recombinante. Sin embargo, hay que evaluar cuidadosamente que la recuperación en dichas matrices producidas artificialmente sea muy próxima a la recuperación en sueros naturales y que la propia matriz artificial no provoque ninguna interferencia.

Poco es conocido sobre la estabilidad del antígeno central del VHC en sueros o plasma humanos. Tanakaet al.(Hepatol Res 2003, 26(4):261-267) describen que el antígeno central del VHC es bastante estable contra la sobrecarga calórica cuando se incuba a 25 °C durante 7 días. Después de este procedimiento de sobrecarga, un ELISA todavía puede detectar el antígeno central del VHC. Sin embargo, se ha descubierto que la reactividad de sueros humanos positivos para el antígeno central así como la reactividad de muestras enriquecidas con antígeno central del VHC recombinante disminuye considerablemente cuando se almacenan a temperatura ambiente durante varios días. El documento WO 00/31127 A2 enseña una proteína que comprende una secuencia dirigida a un glóbulo lipídico unida a una proteína de interés (POI) en la que la secuencia dirigida comprende una proteína central del virus de la hepatitis C (VHC) o fragmento u homólogo de la misma. El documento W o 2016/069762 A2 se refiere a procedimientos, kits y composiciones para detectar anticuerpos anti-VHC objeto en una muestra usando péptidos de captura NS3.

Por lo tanto, un objetivo de la invención es proporcionar material con mayor estabilidad a largo plazo y tiempo de vida útil más largo para calibrar y controlar inmunoanálisis del VHC que superen las limitaciones observadas.

Sumario de la invención

La invención se refiere a una proteína de fusión multiepítopo de acuerdo con la reivindicación 1 así como a su uso como calibrador y/o control en un inmunoanálisis de diagnósticoin vitropara detectar el antígeno central del VHC. La proteína de fusión multiepítopo comprende de dos a seis péptidos lineales no superpuestos diferentes presentes en la secuencia de aminoácidos de la proteína central del virus de la hepatitis C (VHC), en la que cada uno de dichos péptidos diferentes está presente de una a cinco veces en dicha proteína de fusión multiepítopo y cada uno de dichos péptidos diferentes se separa de los otros de dichos péptidos por un espaciador que consiste en una secuencia de aminoácidos distinta del VHC que comprende una secuencia de aminoácidos chaperona. No están presentes otras secuencias de aminoácidos específicas del VHC en dicho polipéptido.

Cada uno de dichos péptidos lineales tiene una longitud de 5 a 50 aminoácidos y en un modo de realización tres péptidos lineales diferentes están presentes en la proteína de fusión multiepítopo. Otros aspectos se refieren a un procedimiento para producir una proteína de fusión multiepítopo soluble de acuerdo con la reivindicación 9, a un procedimiento para detectar el antígeno central del VHC de acuerdo con la reivindicación 11, y a un kit de reactivos para detectar el antígeno central del VHC de acuerdo con la reivindicación 12.

Leyenda para las secuencias de aminoácidos divulgadas

SEQ ID NO: 1, centro del VHC ("HCVcore"), genotipo 1a (aislado 1) de acuerdo con n.° UniProt P26664, 191 aminoácidos

MSTNPKPQKK NKRNTNRRPQ DVKFPGGGQI VGGVYLLPRR GPRLGVRATR KTSERSQPRG RRQPIPKARR PEGRTWAQPG YPWPLYGNEG CGWAGWLLSP RGSRPSWGPT DPRRRSRNLG KVIDTLTCGF ADLMGYIPLV GAPLGGAARA LAHGVRVLED GVNYATGNLP GCSFSIFLLA LLSCLTVPAS A

SEQ ID NO: 2, envoltura E1 del VHC, genotipo 1a (aislado 1) de acuerdo con n.° UniProt P26664, 192 aminoácidos

YQVRNSTGLY HVTNDCPNSS IVYEAADAIL HTPGCVPCVR EGNASRCWVA MTPTVATRDG KLPATQLRRH IDLLVGSATL CSALYVGDLC GSVFLVGQLF TFSPRRHWTT QGCNCSIYPG HITGHRMAWD MMMNWSPTTA LVMAQLLRIP QAILDMIAGA HWGVLAGIAY FSMVGNWAKV LWLLLFAGV DA

SEQ ID NO: 3, envoltura E2 del VHC, genotipo 1a (aislado 1) de acuerdo con n.° UniProt P26664, 363 aminoácidos

ETHVTGGSAG HTVSGFVSLL APGAKQNVQL INTNGSWHLN STALNCNDSL NTGWLAGLFY HHKFNSSGCP ERLASCRPLT DFDQGWGPIS YANGSGPDQR PYCWHYPPKP CGIVPAKSVC GPVYCFTPSP WVGTTDRSG APTYSWGEND TDVFVLNNTR PPLGNWFGCT WMNSTGFTKV CGAPPCVIGG AGNNTLHCPT DCFRKHPDAT YSRCGSGPWI TPRCLVDYPY RLWHYPCTIN YTIFKIRMYV GGVEHRLEAA CNWTRGERCD LEDRDRSELS PLLLTTTQWQ VLPCSFTTLP ALSTGLIHLH QNIVDVQYLY GVGSSIASWA IKWEYWLLF LLLADARVCS CLWMMLLISQ AEA

SEQ ID NO: 4, calibrador de 3 epítopos centrales del VHC (HCVcore-3Epi-EcS-FP), 432 aminoácidos; tres epítopos centrales del VHC diferentes separados por dos polipéptidos espaciadores SlyD deE. coli.Las partes subrayadas son tres péptidos centrales del VHC diferentes.

MRGSGRRQPI PKARRPEGRT GGGSGGGMKV AKDLWSLAY QVRTEDGVLV DESPVSAPLD YLHGHGSLIS GLETALEGHE VGDKFDVAVG ANDAYGQYDE NLVQRVPKDV FMGVDELQVG MRFLAETDQG PVPVEITAVE DDHWVDGNH MLAGQNLKFN VEVVAIREAT EEELAHGHVH GAHDHHHDHD HDGGGSGGGL LSPRGSRPSW GPTDPRRRSR GGGSGGGMKV AKDLWSLAY QVRTEDGVLV DESPVSAPLD YLHGHGSLIS GLETALEGHE VGDKFDVAVG ANDAYGQYDE NLVQRVPKDV FMGVDELQVG MRFLAETDQG PVPVEITAVE DDHWVDGNH MLAGQNLKFN VEWAIREAT EEELAHGHVH GAHDHHHDHD HDGGGSGGGA HGVRVLEDGV NYATGNLPGG GGSGGGHHHH HH

SEQ ID NO: 5, calibrador de 3 epítopos centrales del VHC (HCVcore-3Epi-EcS-FP, XY(Z, extralargo, C/A)), 473 aminoácidos; tres epítopos centrales del VHC diferentes separados por dos polipéptidos espaciadores SlyD deE. coli. Las partes subrayadas son tres péptidos centrales del VHC diferentes.

MRGSGRRQPI PKARRPEGRT GGGSGGGMKV AKDLWSLAY QVRTEDGVLV DESPVSAPLD YLHGHGSLIS GLETALEGHE VGDKFDVAVG ANDAYGQYDE NLVQRVPKDV FMGVDELQVG MRFLAETDQG PVPVEITAVE DDHWVDGNH MLAGQNLKFN VEVVAIREAT EEELAHGHVH GAHDHHHDHD HDGGGSGGGL LSPRGSRPSW GPTDPRRRSR GGGSGGGMKV AKDLWSLAY QVRTEDGVLV DESPVSAPLD YLHGHGSLIS GLETALEGHE VGDKFDVAVG ANDAYGQYDE NLVQRVPKDV FMGVDELQVG MRFLAETDQG PVPVEITAVE DDHWVDGNH MLAGQNLKFN VEWAIREAT EEELAHGHVH GAHDHHHDHD HDGGGSGGGD PRRRSRNLGK VIDTLTAGFA DLMGYIPLVG APLGGAARAL AHGVRVLEDG VNYATGNLPG GGGSGGGHHH HHH

SEQ ID NO: 6, calibrador de 3 epítopos centrales del VHC (HCVcore-3Epi-EcS-FP, XY(Z)4), 513 aminoácidos; tres epítopos centrales del VHC diferentes separados por dos polipéptidos espaciadores SlyD deE. coli.Las partes subrayadas representan tres péptidos centrales del VHC diferentes. El epítopo C terminal está presente cuatro veces mientras que los otros dos epítopos están presentes como epítopos únicos.

MRGSGRRQPI PKARRPEGRT GGGSGGGMKV AKDLVVSLAY QVRTEDGVLV DESPVSAPLD YLHGHGSLIS GLETALEGHE VGDKFDVAVG ANDAYGQYDE NLVQRVPKDV FMGVDELQVG MRFLAETDQG PVPVEITAVE DDHVVVDGNH MLAGQNLKFN VEVVAIREAT EEELAHGHVH GAHDHHHDHD HDGGGSGGGL LSPRGSRPSW GPTDPRRRSR GGGSGGGMKV AKDLVVSLAY QVRTEDGVLV DESPVSAPLD YLHGHGSLIS GLETALEGHE VGDKFDVAVG ANDAYGQYDE NLVQRVPKDV FMGVDELQVG MRFLAETDQG PVPVEITAVE DDHVVVDGNH MLAGQNLKFN VEVVAIREAT EEELAHGHVH GAHDHHHDHD HDGGGSGGGA HGVRVLEDGV NYATGNLPGG GGSGGGAHGV RVLEDGVNYA TGNLPGGGGS GGGAHGVRVL EDGVNYATGN LPGGGGSGGG AHGVRVLEDG VNYATGNLPG GGGSGGGHHH HHH

Descripción detallada de la invención

Se considera que los antígenos recombinantes que corresponden al antígeno natural imitan eficazmente el analito natural. Se han descrito ampliamente secuencias parciales de antígenos del VHC en la técnica anterior. El documento WO2016/172121 describe polipéptidos del antígeno central del virus de la hepatitis C que comprenden secuencias parciales del antígeno central de longitud completa. Los antígenos divulgados se pueden usar como inmunógenos para producir anticuerpos de camélido y para cribado posterior. Esta publicación no dice nada con respecto a los problemas de estabilidad, ni divulga ninguna información sobre el uso de un antígeno central como calibrador o control. Sin embargo, se observó que independientemente de la matriz usada (suero, plasma o matrices artificiales tales como, por ejemplo, tampones acuosos) un antígeno central de la hepatitis C con un tamaño próximo al antígeno central de longitud completa natural pierde su reactividad en cada una de estas matrices en un grado considerable en varios días. El motivo de esta inestabilidad no es conocido pero se podría deber a una degradación proteolítica o química o al enmascaramiento del antígeno por otras sustancias contenidas en dicha matriz. También la sobrecarga mecánica y térmica puede influir en la estabilidad del antígeno central del VHC.

De forma sorprendente, cuando solo se usaron secciones cortas del antígeno central como antígeno de fusión multiepítopo en un inmunoanálisis de diagnósticoin vitroy se aplicó en lugar de un antígeno central de longitud casi completa (168 aminoácidos), la recuperación de señal resultante fue muy alta en una prueba de sobrecarga calórica a 35 °C durante 14 días. Mientras que la señal de la proteína de fusión multiepítopo recombinante disminuyó menos de un 10 %, el antígeno central de longitud completa mostró una pérdida de señal continua hasta aproximadamente dos tercios de la señal original.

Por lo tanto, la invención se refiere a una proteína de fusión multiepítopo de acuerdo con la reivindicación 1. Otra divulgación se refiere a una proteína de fusión multiepítopo que comprende de dos a seis péptidos lineales no superpuestos diferentes presentes en la secuencia de aminoácidos de la proteína central del virus de la hepatitis C (VHC), en la que cada uno de dichos péptidos diferentes está presente de una a cinco veces en dicha proteína de fusión multiepítopo y cada uno de dichos péptidos diferentes se separa de los otros de dichos péptidos por un espaciador que consiste en una secuencia de aminoácidos distinta del VHC que comprende una secuencia de aminoácidos chaperona y en la que no están presentes otras secuencias de aminoácidos específicas del VHC en dicho polipéptido.

El término "proteína de fusión multiepítopo" es sinónimo de "antígeno de fusión multiepítopo". Una proteína de fusión multiepítopo comprende más de un epítopo que es un sitio de unión que se reconoce y se une específicamente por anticuerpos, tales como anticuerpos aplicados como reactivos en un inmunoanálisis para detectar dichos epítopos.

La proteína de fusión multiepítopo de acuerdo con la presente invención contiene epítopos solo de la proteína central del VHC. Esto quiere decir que los de dos a seis péptidos lineales no superpuestos diferentes representan distintos epítopos de la proteína central pero no de una mezcla de, por ejemplo, péptidos del centro y la envoltura. Los antígenos de fusión multiepítopo de la hepatitis C como se describe en la técnica anterior tal como en la solicitud de patente internacional WO97/44469 o por Chienet al.(J Clin Microbiol 1999, 37(5): 1393-1397), en la que varias proteínas víricas o epítopos de varias proteínas víricas son parte de una proteína de fusión multiepítopo tal como centro, env, NS3 y NS4 del VHC, no se engloban por la presente invención. Al contrario que la técnica anterior, las proteínas de fusión multiepítopo de la presente invención contienen epítopos presentes en el antígeno central del VHC natural. La secuencia de aminoácidos de una proteína central del VHC representativa (genotipo 1a, aislado 1) se muestra en la SEQ ID NO: 1. Las SEQ ID NO: 2 y 3 muestran las secuencias de aminoácidos de la envoltura 1 (E1) y envoltura 2 (E2), respectivamente.

La proteína de fusión multiepítopo comprende de dos a seis péptidos lineales no superpuestos diferentes, en un modo de realización de tres péptidos lineales diferentes, presentes en la secuencia de aminoácidos de la proteína central del virus de la hepatitis C (VHC) como se describe anteriormente. Los péptidos lineales son aminoácidos enlazados por medio de un enlace peptídico en secuencia directa, uno después de otro, donde los aminoácidos individuales son adyacentes y se enlazan covalentemente entre sí. La proteína de fusión multiepítopo es una cadena continua, no interrumpida y contigua de aminoácidos enlazados covalentemente.

El término "no superpuesto" quiere decir que las regiones de aminoácidos seleccionadas son epítopos separados que no tienen secuencias de aminoácidos superpuestas en común dentro del antígeno central natural. Para ilustración, cuando se selecciona como epítopo el epítopo central de las posiciones aminoacídicas 60-75, un epítopo seleccionado adicionalmente puede comenzar en la posición 76 o puede terminar en la posición 59. Una combinación de epítopos en las posiciones 60-75, 97-117 y 152-171 es un ejemplo que cumple el requisito de no superposición.

Un epítopo dentro de esta proteína de fusión multiepítopo normalmente comprende al menos 5 aminoácidos en una cadena polipeptídica contigua, en un modo de realización entre 5 a 50 aminoácidos, en un modo de realización de 5 a 31 aminoácidos, en un modo de realización de 5 a 25 aminoácidos, en un modo de realización de 7 a 21 aminoácidos, en un modo de realización de 15 a 21 aminoácidos.

El término péptido y polipéptido se entienden como sinónimos en esta memoria descriptiva, en referencia a moléculas de hasta 50 aminoácidos. El término proteína se refiere a polipéptidos de más de 50 aminoácidos. Un antígeno puede ser un polipéptido o bien una proteína. El término antígeno se refiere al hecho de que los anticuerpos se pueden unir específicamente a él. Un antígeno comprende al menos un epítopo (sitio de unión para anticuerpos), pero normalmente alberga más de un epítopo.

Normalmente, los péptidos contenidos en la proteína de fusión multiepítopo se seleccionan de tal forma que las secuencias peptídicas lineales corresponden a los epítopos reconocidos por los anticuerpos que se aplican como reactivos específicos en un inmunoanálisis que detecta una proteína estructural del VHC, en un modo de realización de antígeno central del VHC. Los péptidos individuales imitan determinados epítopos del analito natural. Es importante que la proteína de fusión multiepítopo compuesta artificialmente reaccione de manera muy similar con los especificadores del ensayo, es decir, los agentes de unión específica a analito, como es el caso de la proteína central en muestras naturales. De otro modo un ensayo de diagnósticoin vitrono se puede calibrar apropiadamente. En un modo de realización, tres péptidos lineales no superpuestos diferentes son parte de la proteína de fusión multiepítopo. En otro modo de realización, dichos tres péptidos lineales diferentes comprenden una secuencia de aminoácidos lineal presente dentro de las posiciones aminoacídicas 55 a 80 de SEQ ID NO: 1, las posiciones aminoacídicas 90 a 120 de SEQ ID NO: 1 y las posiciones aminoacídicas 145 a 175 de SEQ ID NO: 1. En otro modo de realización, dichos tres péptidos lineales diferentes consisten en las posiciones aminoacídicas 60 a 75 de SEQ ID NO: 1, las posiciones aminoacídicas 97 a 117 de SEQ ID NO: 1 y las posiciones aminoacídicas 152 a 171 de SEQ ID NO: 1. En otro modo de realización, dichos tres péptidos lineales diferentes consisten en las posiciones aminoacídicas 60 a 75 de SEQ ID NO: 1, las posiciones aminoacídicas 97 a 117 de SEQ ID NO: 1 y las posiciones aminoacídicas 111 a 171 de SEQ ID NO: 1.

También se engloban variantes de SEQ ID NO: 1, tales como los antígenos centrales de diferentes genotipos del VHC. Estas variantes se pueden crear fácilmente por un experto en la técnica por sustituciones conservativas u homólogas de las secuencias de aminoácidos divulgadas (tales como, por ejemplo, sustituciones de una cisteína por alanina o serina). El término "variantes" en este contexto también se refiere a un polipéptido sustancialmente similar a dicho polipéptido. En particular, una variante puede ser una isoforma que muestra intercambios, deleciones o inserciones aminoacídicos en comparación con la secuencia de aminoácidos de la isoforma de proteína más predominante. En un modo de realización, dicha proteína sustancialmente similar tiene una identidad de secuencia de aminoácidos con la isoforma más predominante de la proteína de al menos un 90 %, en otro modo de realización, al menos un 95 %. Una variante de SEQ ID NO: 1 es, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos del centro de los genotipos del VHC 1 a 7. Los genotipos del VHC, su predominio y distribución global se han descrito bien en la técnica y resumido, por ejemplo, por Messinaet al.,Hepatology 201561(1), p. 77-87.

Aparte de los de dos a seis péptidos lineales diferentes no superpuestos, no están presentes otras secuencias de aminoácidos específicas del VHC en dicha proteína de fusión multiepítopo. Las expresiones "no (están presentes) otras secuencias de aminoácidos específicas del VHC" y "secuencia de aminoácidos distinta del VHC" quieren decir que otros tramos de aminoácidos pueden ser parte de la proteína de fusión multiepítopo. Sin embargo, si están presentes secuencias de aminoácidos no específicas del VHC, un anticuerpo generado contra cualquiera de estas secuencias no específicas del VHC no se uniría a un antígeno estructural del VHC tal como el antígeno central con una alta afinidad. La afinidad de dicho anticuerpo por un antígeno estructural del VHC sería menor de 103 l/mol. Solo los de dos a seis péptidos diferentes pueden inmunorreaccionar con anticuerpos en una muestra de paciente o con los anticuerpos que se usan como reactivos de inmunoanálisis específicos para detectar una proteína estructural del VHC. Típicamente, un anticuerpo que se une específicamente a una proteína estructural del VHC en un inmunoanálisis tiene una afinidad por dicha proteína de al menos 107 l/mol, en un modo de realización de al menos 109 l/mol.

En un modo de realización, los de dos a seis péptidos lineales se seleccionan de tal forma que las secuencias elegidas no se superponen.

Aún en otro modo de realización, la invención se refiere a una proteína de fusión multiepítopo que tiene la fórmula X - espaciador - Y - espaciador - Z, en la que X, Y y Z designan diferentes secuencias de aminoácidos lineales no superpuestas presentes en la proteína central del VHC; en la que espaciador designa una secuencia de aminoácidos distintos del VHC y comprende una secuencia de aminoácidos chaperona. En un modo de realización, cada uno de X, Y y Z está presente de una a cinco veces. En otro modo de realización, Z está presente de una a cinco veces. Todas las explicaciones y definiciones proporcionadas además anteriormente se aplican también a este modo de realización. En un modo de realización, X comprende una secuencia de aminoácidos lineal presente dentro de las posiciones aminoacídicas 55 a 80 de SEQ ID NO: 1, Y comprende una secuencia de aminoácidos lineal presente dentro de las posiciones aminoacídicas 90 a 120 de SEQ ID NO: 1 y Z comprende secuencias de aminoácidos lineales presentes dentro de las posiciones aminoacídicas 145 a 175 de SEQ ID NO: 1. En un modo de realización, X consiste en las posiciones aminoacídicas 60 a 75 de SEQ ID NO: 1, Y consiste en las posiciones aminoacídicas 97 a 117 de SEQ ID NO: 1 y Z consiste en las posiciones aminoacídicas 152 a 171 de SEQ ID NO: 1, en un modo de realización Z consiste en las posiciones aminoacídicas 111 a 171 de SEQ ID NO: 1.

Los de dos a seis péptidos lineales no superpuestos diferentes se separan por un espaciador que consiste en una secuencia de aminoácidos que no está presente en la poliproteína del virus de la hepatitis C, en particular que no está presente en ninguno de los antígenos estructurales del VHC, centro o env. Cualquier polipéptido distinto del VHC con una longitud de al menos 25 aminoácidos distintos del VHC, en un modo de realización al menos 100, en un modo de realización al menos 150, en un modo de realización al menos 200, en un modo de realización de 25 a 200 aminoácidos distintos del VHC puede servir como espaciador. En un modo de realización, el espaciador comprende una secuencia de aminoácidos de una chaperona o cualquier otra proteína que no reacciona inmunológicamente de forma cruzada con los anticuerpos que se supone que se unen a los péptidos específicos del VHC. La chaperona se selecciona del grupo que consiste en SlyD, SlpA y FkpA.

Cada uno de los diferentes péptidos puede estar presente de una a cinco veces en la proteína de fusión multiepítopo. Esto quiere decir que existen repeticiones idénticas de un epítopo individual. Estos epítopos repetitivos no necesitan separarse por una secuencia de aminoácidos chaperona, pero se pueden separar por un espaciador que contiene secuencias no chaperonas tales como péptidos cortos distintos del VHC. Como ejemplo, un espaciador que comprende de 2 a 15 aminoácidos como residuos de glicina repetidos, puede separar los epítopos centrales del VHC idénticos. Otro ejemplo de un espaciador que separa los epítopos idénticos es la secuencia de aminoácidos GGGSGGG

En otro aspecto, la proteína de fusión multiepítopo se puede flanquear por otros aminoácidos distintos del VHC que, por ejemplo, podrían estar presentes debido a procedimientos de clonación o se pueden requerir para propósitos de purificación. Estos aminoácidos adicionales se pueden unir al extremo N terminal o C terminal o a ambos extremos.

En otro modo de realización, la proteína de fusión multiepítopo consiste en SEQ ID NO: 4. En otro modo de realización, consiste en SEQ ID NO: 5 o 6.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a un procedimiento para producir una proteína de fusión multiepítopo soluble como se describe en las secciones anteriores, que comprende las etapas de a) cultivo de células huésped transformadas con un vector de expresión que comprende enlazada de forma funcional una molécula de ADN recombinante que codifica una proteína de fusión multiepítopo como se detalla anteriormente, b) expresión de dicho polipéptido y c) purificación de dicho polipéptido. La tecnología de ADN recombinante es conocida para un experto en la técnica y se ha descrito ampliamente en la técnica anterior, por ejemplo, por Sambrooket al.,(1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual). Aún otro aspecto de la invención es un vector de expresión que comprende enlazada de forma funcional una molécula de<a>D<n>recombinante de acuerdo con la presente invención, es decir, una molécula de ADN recombinante que codifica una proteína de fusión multiepítopo que comprende de dos a seis péptidos lineales diferentes presentes en la secuencia de aminoácidos de una proteína estructural del virus de la hepatitis C (VHC), en la que cada uno de dichos péptidos se separa de los otros de dichos péptidos por un espaciador que consiste en una secuencia de aminoácidos distinta del VHC y en la que no están presentes otras secuencias de aminoácidos específicas del VHC en dicho polipéptido.

Un aspecto adicional es un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9; también se divulga para producir una proteína de fusión multiepítopo soluble, estable e inmunorreactiva que comprende de dos a seis péptidos lineales no superpuestos diferentes del antígeno central del VHC. Este procedimiento comprende las etapas de

a) cultivo de células huésped transformadas con el vector de expresión descrito anteriormente que contiene un gen que codifica dicha proteína de fusión multiepítopo

b) expresión del gen que codifica dicha proteína de fusión multiepítopo

c) purificación de dicha proteína de fusión multiepítopo.

En otro modo de realización, la invención se refiere al uso de una proteína de fusión multiepítopo de acuerdo con la reivindicación 10; se divulga además un uso de una proteína de fusión multiepítopo que comprende secuencias de aminoácidos de una proteína central del VHC como se divulga en esta memoria descriptiva como calibrador y/o material de control en una prueba de diagnósticoin vitropara detectar el antígeno central del VHC.

La calibración de un instrumento de diagnósticoin vitro(DIV) que ejecuta un inmunoanálisis para detectar el antígeno del VHC funciona como sigue: un procedimiento de calibración de un instrumento DIV para un ensayo específico se realiza normalmente de acuerdo con el manual de operario apropiado para las instrucciones de ensayo específicas del analizador. En general, cada paquete de reactivos se calibra usando el material calibrador proporcionado. Como ejemplo: para el antígeno central del VHC, se usan diferentes anticuerpos específicos del centro en un formato marcado y/o en un formato que permite que los anticuerpos se unan en una fase sólida. El material calibrador, en un modo de realización una proteína de fusión multiepítopo como se describe en el presente documento, se incuba con los anticuerpos centrales específicos y se procesa de la misma forma que una muestra. Después de la detección de una señal, este resultado se compara con los valores predefinidos y se configura el intervalo de medición apropiado. Dependiendo de las instrucciones del fabricante, la calibración se repite a intervalos predefinidos o como se requiera, por ejemplo, si los resultados del control de calidad están fuera de los límites especificados.

En un modo de realización, la proteína de fusión multiepítopo como se define en el presente documento se usa como material para el control de calidad. Esto quiere decir que la proteína de fusión multiepítopo se usa en una concentración predefinida en lugar de una muestra para verificar que el sistema DIV esté funcionando apropiadamente y, en particular para ensayos cuantitativos, esté midiendo con exactitud.

Aún otro aspecto de la invención es un procedimiento para detectar el antígeno central del VHC de acuerdo con la reivindicación 11. Dicho procedimiento aplica una proteína de fusión multiepítopo como se describe en detalle además anteriormente como calibrador o material de control o ambos. En un modo de realización, dicho procedimiento comprende las etapas a) formar una mezcla de inmunorreacción mezclando una muestra de líquido corporal con al menos un agente de unión específica a antígeno central del VHC; b) mantener dicha mezcla de inmunorreacción durante un período de tiempo suficiente para permitir que el antígeno central del VHC presente en la muestra de líquido corporal inmunorreaccione con dicho al menos un agente de unión específica a antígeno central del VHC para formar un producto de inmunorreacción; y c) detectar la presencia y/o la concentración de cualquiera de dicho producto de inmunorreacción, en el que una proteína de fusión multiepítopo como se divulga en esta memoria descriptiva se usa como calibrador y/o material de control.

Los inmunoanálisis para la detección de proteínas son bien conocidos en la técnica, al igual que los procedimientos para llevar a cabo dichos ensayos y las aplicaciones y procedimientos prácticos. En un modo de realización, la proteína de fusión multiepítopo se usa en el formato de tipo sándwich, en el que dicha proteína de fusión multiepítopo se une por al menos dos anticuerpos, un anticuerpo marcado y un anticuerpo que permite la unión a una fase sólida. Sin embargo, como la proteína de fusión multiepítopo sirve como calibrador y/o material de control, imita el analito de modo que se puede elegir cualquier principio de detección (por ejemplo, inmunoanálisis enzimático, ensayo de electroquimioluminiscencia, ensayo de radioisótopos, etc.) o el formato del ensayo (por ejemplo, ensayo con tira reactiva, ensayo de tipo sándwich, concepto de prueba indirecta o ensayo homogéneo, etc.).

En un modo de realización de la invención, el inmunoanálisis es un inmunoanálisis basado en partículas que aplica micropartículas como fase sólida. Una "partícula", como se usa en el presente documento, quiere decir un objeto localizado pequeño al que se le puede atribuir una propiedad física tal como volumen, masa o tamaño promedio. En consecuencia, las micropartículas pueden ser de conformación simétrica, globular, esencialmente globular o esférica, o pueden ser de una conformación o forma irregular, asimétrica. El tamaño de una partícula prevista por la presente invención puede variar. En un modo de realización, las micropartículas usadas son de conformación globular, por ejemplo, micropartículas con un diámetro en el intervalo de nanómetros y micrómetros. En un modo de realización, las micropartículas usadas en un procedimiento de acuerdo con la presente divulgación tienen un diámetro de 50 nanómetros a 20 micrómetros. En otro modo de realización, las micropartículas tienen un diámetro de entre 100 nm y 10 |jm. En un modo de realización, las micropartículas usadas en un procedimiento de acuerdo con la presente divulgación tienen un diámetro de 200 nm a 5 jm o de 750 nm a 5 jm .

Las micropartículas como se define en el presente documento anteriormente pueden comprender o consistir en cualquier material adecuado conocido para el experto en la técnica, por ejemplo, pueden comprender o consistir en o consistir esencialmente en material orgánico o inorgánico. Típicamente, pueden comprender o consistir en o consistir esencialmente en metal o una aleación de metales, o un material orgánico, o comprender o consistir en o consistir esencialmente en elementos de carbohidratos. Los ejemplos de material previsto para micropartículas incluyen agarosa, poliestireno, látex, poli(alcohol vinílico), sílice y metales ferromagnéticos, aleaciones o materiales de composición. En un modo de realización, las micropartículas son composiciones, aleaciones o metales magnéticos o ferromagnéticos. En otros modos de realización, el material puede tener propiedades específicas y, por ejemplo, ser hidrófobo o hidrófilo. Dichas micropartículas típicamente se dispersan en soluciones acuosas y retienen una carga superficial negativa pequeña que mantiene las micropartículas separadas y evita la agrupación inespecífica.

En un modo de realización de la presente invención, las micropartículas son micropartículas paramagnéticas y la separación de dichas partículas en el procedimiento de medición de acuerdo con la presente divulgación se facilita por fuerzas magnéticas. Se aplican fuerzas magnéticas para extraer las partículas paramagnéticas o magnéticas de la solución/suspensión y para retenerlas según se desee mientras que el líquido de la solución/suspensión se puede retirar y las partículas, por ejemplo, se pueden lavar y resuspender.

Todos los líquidos biológicos conocidos para el experto se pueden usar como muestras aisladas. Las muestras usadas normalmente son líquidos corporales como sangre completa, suero sanguíneo, plasma sanguíneo, orina, líquido cefalorraquídeo (líquido) o saliva, en un modo de realización suero o plasma sanguíneo.

Otra parte de la invención se refiere a un kit de reactivos de acuerdo con la reivindicación 12; también se divulga un kit de reactivos para la detección del antígeno central del VHC, que comprende en recipientes separados o en compartimentos separados de un recipiente único al menos un agente de unión específica a antígeno central del VHC y al menos una proteína de fusión multiepítopo como se define en esta memoria descriptiva como material calibrador.

El término recipiente único se refiere al hecho de que para muchos analizadores automáticos, como la serie de analizadores Elecsys® de Roche Diagnostics, los reactivos requeridos para medir un determinado analito se proporcionan en forma de un paquete de reactivos, es decir, como una unidad de recipiente que se coloca en el analizador y que contiene en diferentes compartimentos todos los reactivos clave requeridos para la medición del analito de interés.

En un modo de realización, el kit comprende al menos dos agentes de unión específica a antígeno central del VHC, en el que uno de dichos al menos dos agentes de unión específica a antígeno central del VHC se marca de forma detectable. Además, las micropartículas como se define anteriormente pueden ser parte del kit de reactivos. En un modo de realización, el kit de reactivos contiene micropartículas que se recubren con una primera pareja de un par de unión y el segundo de dichos al menos dos agentes de unión específica a antígeno central del VHC se une a una segunda pareja de dicho par de unión.

En otro aspecto, el kit comprende un recipiente separado adicional que comprende una proteína de fusión multiepítopo como se describe en el presente documento como material de control.

Además, los kits de reactivos definidos anteriormente contienen controles y soluciones estándar, así como reactivos en una o más soluciones con los aditivos, tampones, sales, detergentes y similares comunes como se usa por el experto promedio en la técnica junto con instrucciones para su uso.

La invención se ilustra además por los ejemplos.

Ejemplos

Ejemplo 1: procedimientos

Anticuerpos monoclonales

El antígeno central del VHC recombinante necesario para la inmunización de animales apropiados se obtuvo usando técnicas estándar conocidas en la técnica insertando un fragmento de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de antígeno deseada en un plásmido de expresión deE. co liseguido de sobreexpresión y purificación de la proteína. Estos procedimientos de biología molecular estándar se describen, por ejemplo, en Sambrook, J.et al.,Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989.

Se prepararon anticuerpos monoclonales murinos o de conejo contra el centro del VHC por tecnología de hibridoma estándar o por técnicas de ácido nucleico recombinante como es conocido para el experto en la técnica y de manera análoga a como se describe, por ejemplo, en el documento WO2016/091755, respectivamente.

Los anticuerpos monoclonales contra la proteína central del VHC usados como compuestos de captura en los ejemplos a continuación se unen a los epítopos aa 157-169 y aa 65-71 de la proteína central del VHC (SEQ ID NO: 1). Epítopos muy similares y su determinación ya se han divulgado en el documento EP1308507. Como compuesto de detección, se eligió un anticuerpo monoclonal que se puede unir al epítopo central aa 102-112, un epítopo relacionado con los epítopos también descritos en los documentos EP0967484 y EP1308507. Para la inmunización de ratones y conejos, se usaron secuencias antigénicas centrales del VHC de genotipo 1a de acuerdo con el n.° acc. Genbank: P26664.3 GI: 130455 (SEQ ID NO: 1), que divulga la poliproteína completa codificada por el genotipo 1 del VHC.

En particular, se usaron péptidos de los aminoácidos 110-171 como proteína de fusión recombinante con SlyD deEscherichia colisiguiendo el procedimiento divulgado en los documentos WO 03/000878 A2, US 2009/0291892 A1, WO 2013/107633 A1 o bien péptidos de los aminoácidos 2-169 como proteína recombinante siguiendo el procedimiento descrito por Boulant, S.et al.,2005, J. Virol. 79:11353-11365 para la inmunización. En un enfoque adicional, se usaron péptidos de los aminoácidos 82-117 acoplados a KLH (hemocianina de lapa californiana) para la inmunización de acuerdo con procedimientos conocidos.

Antígenos centrales del VHC recombinantes usados como calibrador/reactivo de control

Se preparó el antígeno central del VHC recombinante de los aminoácidos 2-169 (HCVcore (2-169) rec.) siguiendo el procedimiento descrito por Boulant, S.et al.,2005, J. Virol. 79:11353-11365.

Los genes sintéticos que codifican la proteína de fusión del antígeno central del VHC recombinante que contiene los epítopos de los tres anticuerpos anti-centro del VHC monoclonales descritos anteriormente y dos unidades SlyD deE. coli(HCVcore-3Epi-EcS-FP rec., SEQ ID NO: 4) se adquirieron de Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Alemania). En base al plásmido de expresión pET24a de Novagen (Madison, WI, EE. UU.) se realizaron las siguientes etapas de clonación. El vector se digirió con NdeI y XhoI y se insertó un casete que comprendía la proteína de fusión descrita. Se secuenció el inserto del plásmido resultante y se descubrió que codificaba la proteína de fusión deseada. Las secuencias de aminoácidos de la proteína resultante (SEQ ID NO. 4) se muestran en el protocolo de secuencia de la presente invención. Contenía una marca hexahistidina C terminal para facilitar la purificación asistida por Ni-NTA. La HCVcore-3Epi-EcS-FP rec. se purificó de acuerdo con el siguiente protocolo. Se cultivaron células BL21 (DE3) deE. colique albergan el plásmido de expresión en medio LB más kanamicina (30 g/ml) hasta una DO<600>de 1, y se indujo la sobreexpresión citosólica añadiendo isopropil-p-D-tiogalactósido (IPTG) hasta una concentración final de 1 mM a una temperatura de cultivo de 37 °C. 4 horas después de la inducción, se recogieron las células por centrifugación (20 min a 5000 x g), se congelaron y se almacenaron a -20 °C. Para la lisis celular, se resuspendió el sedimento congelado en tampón Tris 20 mM, pH 8,0, Mgh 10 mM, 10 U/ml de Benzonase<®>, 1 comprimido de Complete<®>y 1 comprimido de Complete<®>sin EDTA por 50 ml de tampón (cóctel inhibidor de proteasa) y se lisó la suspensión resultante por homogeneización a alta presión. Se complementó el lisado bruto con imidazol hasta 20 mM. Después de la centrifugación, se aplicó el sobrenadante en una columna de Ni-NTA (nitrilotriacetato de níquel) preequilibrada en tampón A (fosfato de sodio 100 mM, pH 8,0, cloruro de sodio 300 mM, imidazol 20 mM, 1 comprimido de Complete<®>sin EDTA por 50 ml de tampón). Antes de la elución, se elevó la concentración de imidazol hasta 40 mM para retirar proteínas contaminantes. A continuación se eluyeron las proteínas aplicando una concentración de imidazol de 250 mM. Después de la diálisis, la proteína se purificó además por cromatografía de intercambio iónico (Q-Sepharose). Finalmente, se sometió la proteína a cromatografía de exclusión por tamaño y se agruparon las fracciones que contenían proteína.

Determinación de proteínas

Se determinó la concentración de proteína de los polipéptidos purificados determinando la densidad óptica (DO) a 280 nm, usando el coeficiente de extinción molar calculado en base a la secuencia de aminoácidos del polipéptido o usando el procedimiento de BCA colorimétrico.

Ejemplo 2: síntesis de reactivos de biotinilación activados

Se obtuvieron los reactivos de biotinilación Biotin-PEGn-NHS (n.° CAS 365441-71-0; n = número de unidades de óxido de etileno) de IRIS Biotech GmbH o bien se sintetizaron internamente.

En la síntesisde novose garantizó el control del número discreto de unidades de óxido de etileno por el alargamiento gradual de PEG más cortos, tales como tetraetilenglicol, siguiendo el procedimiento descrito por Chen y Baker, J. Org. Chem. 1999, 64, 6840-6873.

En una primera etapa se ha obtenido bis-tritil-PEG<n>1(como es obvio, n representa el número de unidades de etilenglicol).

Se llevó a cabo la desprotección de1agitando en HCl 1 M en dioxano durante 1 h a temperatura ambiente. Después de la evaporación, se sometió a reflujo el residuo en metanol hasta que se obtuvo una solución transparente y se mantuvo el matraz a 4 °C durante la noche. Después de la filtración, se extrajo la solución con hexano, se evaporó la capa metanólica y se secó para dar el correspondiente PEG<n>-diol2como aceite o cera (dependiendo la consistencia de la longitud/número de unidades (n) del PEG).

A continuación, se llevó a cabo la introducción de la función ácida por la adición catalizada por sodio de PEG<n>-diol a acrilato de terc-butilo de acuerdo con Seitz y Kunz, J. Org. Chem.1997,62,813-826. De esta forma, se obtiene el compuesto3.

A una solución de HO-PEG<n>-COOtBu3(1 equivalente) y trietilamina (2,5 equivalentes) en cloruro de metileno se le añadió cloruro de metilsulfonilo (2 equivalentes) gota a gota a 0 °C. Después de agitar durante 1 h, siguió un tratamiento acuoso y evaporación.

Se hizo reaccionar directamente el mesilato4(1 equivalente) con NaN3 (2 equivalentes) agitando en dimetilformamida a temperatura ambiente durante dos días. Después de la retirada de los sólidos y la dimetilformamida, siguió un tratamiento acuoso con éter dietílico y Na2CO3.

Se purificó el producto bruto5por cromatografía en columna sobre gel de sílice en acetato de etilo/metanol 15/1. Se realizó la reducción de la acida5(1 equivalente) agitando durante 24 h con trifenilfosfina (1,1 equivalentes) en tetrahidrofurano/agua 4/1 a temperatura ambiente. Después de la evaporación se suspendió el residuo en agua y se lavó con acetato de etilo varias veces. Se evaporó la capa acuosa y se secó para dar la amina6como un aceite incoloro.

Se llevó a cabo la escisión del éster ferc-butílico con ácido trifluoroacético al 5 % en agua. Se obtuvo amino-PEG<n>-ácido7por evaporación con agua varias veces.

Se introdujo biotina por acoplamiento con el correspondiente éster de W-hidroxisuccinimida8(1,05 equivalentes) con trietilamina (4 equivalentes) en dimetilformamida a temperatura ambiente durante la noche. Después de la evaporación, se purificó el producto bruto9por RP-HPLC en acetonitrilo/agua.

Finalmente, se formó el éster de W-hidroxisuccinimida10por reacción con W-hidroxisuccinimida (1,1 equivalentes) y etildimetilaminopropilcarbodiimida (1,1 equivalentes) en cloruro de metileno. Después de completarse la reacción, se diluyó la mezcla de reacción con cloruro de metileno y se lavó con agua. La evaporación y el secado dieron lugar a biotina-PEG<n>-NHS puro10como aceite, cera o sólido, respectivamente, dependiendo del número de unidades de óxido de etileno.

Esquema 1Síntesis de biotina-PEG(n)-NHS

Ejemplo 3: mareaje de anticuerpos

Acoplamiento de restos de biotina y rutenio, respectivamente, a anticuerpos:

Se obtuvieron anticuerpos y se purificaron de acuerdo con procedimientos del estado de la técnica que son totalmente familiares para un experto en la técnica.

Antes del marcaje, se escindió el anticuerpo de detección por pepsina para obtener un fragmento F(ab')<2>y para eliminar el fragmento Fc propenso a interferencias (el procedimiento se describe por A. Johnstone y R. Thorpe en Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific 1987). Se polimerizó además el fragmento F(ab')<2>purificado con el reticulante homobifuncional suberato de disuccinimidilo (DSS) y se aplicó a una cromatografía de filtración en gel en S400 para recoger el intervalo de tamaño óptimo del polímero F(ab')<2>(el principio se describe en el documento DE3640412).

Para la unión del respectivo marcador, en general se seleccionaron los grupos £-amino de lisina de los anticuerpos por compuestos activados con N-hidroxisuccinimida. A una concentración de proteína de 10 mg/ml, se hicieron reaccionar los anticuerpos con reactivos de biotinilación activados por N-hidroxisuccinimida (Biotin-PEG24-NHS) y reactivos de marcaje de rutenio activados por N-hidroxisuccinimida, respectivamente. La proporción de marcador/proteína del reactivo de biotinilación o de marcaje de rutenio fue 5-6:1 o 15:1, respectivamente. El tampón de reacción fue fosfato de potasio 50 mM (pH 8,5), KCl 150 mM. Se llevó a cabo la reacción a temperatura ambiente durante 15 minutos y se detuvo añadiendo L-lisina hasta una concentración final de 10 mM. Para evitar la inactivación hidrolítica de los marcadores, se prepararon las respectivas soluciones madre en DMSO seco (Sigma-Aldrich, Alemania). Después de la reacción de acoplamiento, se retiró la biotina o marcador de rutenio libre sin reaccionar haciendo pasar el conjugado de anticuerpo bruto a través de una columna de filtración en gel (Superdex 200 HI Load) o por diálisis.

Ejemplo 4: ensayo de antígeno central del VHC de prototipo de Elecsys

Se llevaron a cabo mediciones de un ensayo de prototipo de antígeno central del VHC de Elecsys en un formato de ensayo de tipo sándwich en analizadores automatizados cobas® e601 o e801 (Roche Diagnostics GmbH). La detección de señales en este analizador se basa en la electroquimioluminiscencia. En este ensayo de tipo sándwich, el uno o más conjugados anticuerpo de captura-biotina (es decir, agentes de unión específica a analito) se inmovilizan sobre la superficie de una microesfera magnética recubierta con estreptavidina. El anticuerpo de detección (otro agente de unión específica a analito) porta un catión de rutenio en complejo como resto de señalización. En presencia de analito, el complejo de rutenio se une por puentes a la fase sólida y emite luz a 620 nm después de la excitación en el electrodo de platino comprendido en la cubeta de medición del analizador. La salida de señal está en unidades de luz arbitrarias. Se realizaron mediciones con muestras de suero y plasma humanos positivas y negativas para el antígeno central del VHC adquiridas de varias fuentes (tablas 1 y 2), así como con los antígenos recombinantes HCVcore (2-169, correspondientes a las posiciones aminoacídicas 2 a 169 de SEQ ID NO: 1) y HCVcore-3Epi-EcS-FP (SEQ ID NO: 4, tabla 1 y figura 1 y 2), HCVcore-3Epi-EcS-FP, XY(Z, extralargo, C/A) (SEQ ID NO: 5, tabla 2 y figura 2) y HCVcore-3Epi-EcS-FP, XY(Z)4 (SEQ ID NO: 6, tabla 2 y figura 2).

El ensayo de antígeno central del VHC experimental se realizó como sigue. Se incubaron juntos 50 |jl de suero humano normal, de muestra positiva para antígeno del VHC o los antígenos recombinantes HCVcore (2-169) o HCVcore-3Epi-EcS-FP o HCVcore-3Epi-EcS-FP, XY(Z, extralargo, C/A) o HCVcore-3Epi-EcS-FP, XY(Z)4 en un tampón HEPES 36 mM que contiene manitol al 5,4 % y D(+)-sacarosa al 5,9 %, clorhidrato de N-metilisotiazolona al 0,01 %, oxipiriona al 0,1 % y albúmina bovina al 0,4 % y 25 j l de un reactivo de pretratamiento que contiene detergente (PT: KOH 0,25 M, KCl 1,125 M, cloruro de hexadeciltrimetilamonio (HT<a>C) al 1,5 %, octilglucósido al 0,85 %) durante 9 minutos para liberar el antígeno seguido de la adición de 35 j l de una mezcla de dos conjugados anticuerpo-biotina diferentes (1,5 jg/m l y 0,9 jg/m l) y 40 j l de 1,2 jg/m l de conjugado de marcador de rutenio de anticuerpo de detección en el mismo tampón de ensayo R1 y R2 (Tris 200 mM, pH 7,0, KCl 225 mM, taurodesoxicolato de sodio al 0,5 %, Zwittergent 3-14 al 0,3 %, oxipiriona al 0,1 %, metilisotiazolinona al 0,01 %, seroalbúmina bovina al 0,2 %, IgG bovina al 0,2 %, 50 jg/m l de MAK33-IgG1, 50 jg/m l de MAK33-F(ab')<2>-Poli, 50 jg/m l de MAK-IgG2b/Fab2a-Poli). Después de 9 minutos adicionales de tiempo de incubación, se añadieron 50 j l de micropartículas paramagnéticas recubiertas con estreptavidina y se incubó durante otros 9 minutos. Posteriormente, se detectó el antígeno central del VHC (por medio de la señal electroquimioluminiscente generada en estos experimentos).

La figura 1 muestra la recuperación de señal de ambos antígenos centrales del VHC recombinantes (central del VHC recombinante de longitud casi completa HCVcore (2-169) rec. y HCVcore-3Epi-EcS-FP rec.) después de una sobrecarga a 35 °C durante 14 días. El día 0 (aún sin sobrecarga calórica), para comparar ambos calibradores, las señales de ambos calibradores se configuran como un 100 %. Sin embargo, durante el período de sobrecarga calórica (incubación a 35 °C del calibrador), el calibrador que comprende una proteína de fusión multiepítopo es superior al calibrador del centro (2-169): La señal de HCVcore-3Epi-EcS-FP rec. disminuyó menos de un 10 % después de 4 días y se mantuvo estable durante los siguientes días de sobrecarga calórica. La pérdida de señal continua de HCVcore (2-169) hasta aproximadamente dos tercios de la señal original fue mucho más significativa durante el período de tiempo observado. Esta situación refleja condiciones realistas cuando los kits de reactivos que contienen calibradores y/o controles se almacenan en condiciones inapropiadas tales como durante el transporte en condiciones climáticas cálidas. También se incrementa el tiempo de vida útil del calibrador que puede ser parte de un kit. Por motivos de estabilidad, las proteínas de fusión multiepítopo tales como la HCVcore-3Epi-EcS-FP rec. son mucho más adecuadas como calibrador y/o reactivo de control que el calibrador recombinante de longitud completa o de longitud casi completa HCVcore (2-169).

La tabla 1 muestra los resultados de un inmunoanálisis descrito en el ejemplo 4 donde se aplicó una proteína de fusión multiepítopo de acuerdo con la invención como "Cal2" (calibrador positivo que contiene 350 pg/ml de HCVcore-3Epi-EcS-FP rec. como análogo de analito). "Cal1" es el calibrador negativo (muestras normales agrupadas) que no contiene ningún antígeno del VHC. La señal proporcionada con el calibrador Cal2 es aproximadamente 12 veces mayor que la señal obtenida para un grupo de muestras normales (negativo), lo que proporciona un intervalo de medición excelente de modo que el ensayo puede discriminar entre resultados positivos y negativos. "COI" quiere decir índice de corte y es una proporción obtenida dividiendo la señal medida entre el valor de corte predeterminado. El valor de corte es el umbral para discriminar muestras negativas de positivas. En este caso, el valor de corte se determina multiplicando el valor medio del calibrador positivo Cal2 por 0,2 (véase la tabla 1), lo que da como resultado 2041 recuentos como valor de corte. Las muestras con recuentos inferiores a este número se clasifican como negativas y las muestras con más de 2041 recuentos se clasifican como muestras positivas (reactivas o infectadas).

En cuanto a los resultados de medición, el valor obtenido para una muestra normal (negativa) está muy próximo al calibrador negativo (Cal1). Lo mismo ocurre para las muestras de donantes de sangre, que se detectan todas como negativas. Por otra parte, también las muestras positivas (infectadas por el VHC) se detectan correctamente como positivas. En otras palabras, la proteína de fusión multiepítopo como se describe en esta memoria descriptiva sirve como material fiable para calibrar inmunoanálisis para detectar antígenos estructurales del VHC y en particular para detectar el antígeno central del VHC.

La figura 2 representa los resultados de un experimento independiente llevado a cabo como se describe para la figura 1 ampliado por las proteínas de fusión multiepítopo adicionales HCVcore-3Epi-EcS-FP, XY(Z, extralargo, C/A) rec. y HCVcore-3Epi-EcS-FP,XY(Z)4 rec. De forma consecuente, por motivos de estabilidad, las proteínas de fusión multiepítopo tales como la HCVcore-3Epi-EcS-FP rec., HCVcore-3Epi-EcS-FP, XY(Z, extralargo, C/A) rec. y HCVcore-3Epi-EcS-FP,XY(Z)4 rec. son mucho más adecuadas como calibrador y/o reactivo de control que el calibrador recombinante de longitud completa o de longitud casi completa HCVcore (2-169).

La tabla 2 informa de los resultados de un experimento independiente llevado a cabo como se describe para la tabla 1 y como se describe en el ejemplo 4, donde se aplicaron proteínas de fusión multiepítopo adicionales de acuerdo con la invención como "Cal2" (calibrador positivo que contiene 400 pg/ml de HCVcore-3Epi-EcS-FP, XY(Z, extralargo, C/A) rec. o 520 pg/ml de HCVcore-3Epi-EcS-FP,XY(Z)4 rec. como análogo de analito). Además de HCVcore-3Epi-EcS-FP rec., las proteínas de fusión multiepítopo HCVcore-3Epi-EcS-FP, XY(Z, extralargo, C/A) rec. y HCVcore-3Epi-EcS-FP,XY(Z)4 rec. también sirven como material fiable para calibrar inmunoanálisis para detectar antígenos estructurales del VHC y en particular para detectar el antígeno central del VHC.

Tabla 1: datos para muestras normales, de donantes de sangre y positivas para VHC, calibración con proteína de fusión multiepítopo

Tabla 2: datos para muestras normales, de donantes de sangre y positivas para VHC, calibración con otras proteínas de fusión multiepítopo

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de fusión multiepítopo que comprende de dos a seis péptidos lineales no superpuestos diferentes presentes en la secuencia de aminoácidos de la proteína central del virus de la hepatitis C (Vh C), en la que cada uno de dichos péptidos está presente de una a cinco veces en dicha proteína de fusión multiepítopo y cada uno de dichos péptidos diferentes se separa de los otros de dichos péptidos por un espaciador que consiste en una secuencia de aminoácidos distinta del VHC que comprende una secuencia de aminoácidos chaperona y en la que no están presentes otras secuencias de aminoácidos específicas del VHC en dicha proteína de fusión multiepítopo, en la que cada uno de dichos de dos a seis péptidos lineales tiene una longitud de 5 a 50 aminoácidos, y en la que dicha chaperona se selecciona del grupo que consiste en SlyD, SlpA y FkpA.

2. Una proteína de fusión multiepítopo de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha proteína central del VHC corresponde a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

3. Una proteína de fusión multiepítopo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en la que tres péptidos lineales diferentes presentes en la secuencia de aminoácidos de dicha proteína central del VHC son parte de dicha proteína de fusión multiepítopo.

4. Una proteína de fusión multiepítopo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que dichos tres péptidos lineales diferentes comprenden una secuencia de aminoácidos lineal presente dentro de las posiciones aminoacídicas 55 a 80 de SEQ ID NO: 1, las posiciones aminoacídicas 90 a 120 de SEQ ID NO: 1 y las posiciones aminoacídicas 145 a 175 de SEQ ID NO: 1.

5. Una proteína de fusión multiepítopo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que tiene la fórmula X - espaciador - Y - espaciador - Z

en la que X, Y y Z designan diferentes secuencias de aminoácidos lineales no superpuestas presentes en la proteína central del VHC; en la que Z está presente de una a cinco veces y en la que espaciador designa una secuencia de aminoácidos distintos del VHC que comprende una secuencia de aminoácidos chaperona.

6. Una proteína de fusión multiepítopo de acuerdo con la reivindicación 5, en la que X comprende una secuencia de aminoácidos lineal presente en las posiciones aminoacídicas 55 a 80 de SEQ ID NO: 1, Y comprende una secuencia de aminoácidos lineal presente en las posiciones aminoacídicas 90 a 120 de SEQ ID NO: 1, Z comprende secuencias de aminoácidos lineales presentes dentro de las posiciones aminoacídicas 145 a 175 de SEQ ID NO: 1.

7. Una proteína de fusión multiepítopo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que dicho espaciador comprende una secuencia de al menos 25 aminoácidos distintos del VHC, en un modo de realización al menos 100, en un modo de realización al menos 150, en un modo de realización al menos 200, en un modo de realización de 25 a 200 aminoácidos distintos del VHC.

8. Una proteína de fusión multiepítopo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que consiste en cualquiera de SEQ ID NO: 4 a 6.

9. Un procedimiento para producir una proteína de fusión multiepítopo soluble, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de

a) cultivo de células huésped transformadas con un vector de expresión que comprende enlazada de forma funcional una molécula de ADN recombinante que codifica una proteína de fusión multiepítopo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8,

b) expresión de dicho polipéptido y

c) purificación de dicho polipéptido.

10. Uso de una proteína de fusión multiepítopo que comprende secuencias de aminoácidos de un antígeno central del VHC de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 como calibrador y/o material de control en una prueba de diagnósticoin vitropara detectar el antígeno central del VHC.

11. Un procedimiento para detectar el antígeno central del VHC en un inmunoanálisis en el que una proteína de fusión multiepítopo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 se usa como calibrador y/o material de control.

12. Un kit de reactivos para la detección del antígeno central del VHC, que comprende en recipientes separados o en compartimentos separados de un recipiente único al menos un agente de unión específica a antígeno central del VHC y al menos una proteína de fusión multiepítopo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, como material calibrador.

13. Un kit de reactivos de acuerdo con la reivindicación 12, que comprende al menos dos agentes de unión específica a antígeno central del VHC, en el que uno de dichos al menos dos agentes de unión específica a antígeno central del VHC se marca de forma detectable.

14. Un kit de reactivos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 y 13, que comprende adicionalmente micropartículas.