ES2956662T3

ES2956662T3 - Anticuerpos anti-FcRn humanizados con afinidad madurada

Info

Publication number: ES2956662T3
Application number: ES16793546T
Authority: ES
Inventors: Laurence Blumberg; Richard Blumberg; Susan Jones; Derry Roopenian; Robert Holgate; Timothy Jones; Arron Hearn
Original assignee: Syntimmune Inc
Current assignee: Syntimmune Inc
Priority date: 2015-05-12
Filing date: 2016-05-12
Publication date: 2023-12-26
Anticipated expiration: 2036-05-12
Also published as: AU2016262100B2; JP2018522578A; CN108025066B; EP3294335C0; US20200207854A1; JP6936217B2; HK1251483A1; KR20180023900A; CN108025066A; EP3294335A4; AU2016262100A1; CN114716550A; CA3022547A1; AU2022200024A1; EP3294335B1; EP3294335A1; IL255601A; US20200181262A1; JP2022008301A; US20180291101A1

Abstract

En el presente documento se proporcionan anticuerpos recombinantes y porciones de unión a antígeno de los mismos útiles para unirse a FcRn y bloquear la unión de FcRn a IgG Fc. Las proteínas de unión a FcRn se pueden utilizar para tratar una variedad de trastornos, incluidos los trastornos autoinmunes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-FcRn humanizados con afinidad madurada

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a anticuerpos y a porciones de unión al antígeno de los mismos que se unen a FcRn y a su uso para modular o inhibir la interacción de FcRn con regiones Fc del anticuerpo. Los anticuerpos son útiles como terapéuticos para el tratamiento de trastornos autoinmunes y otros trastornos.

LISTADO DE SECUENCIAS

La presente solicitud contiene un Listado de secuencias que se ha presentado en formado ASCII por EFS-Web. El Listado de secuencias, creado el 7 de agosto de 2015, se llama Sequence Listing.txt y ocupa 87.246 bytes de tamaño.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El receptor de Fc neonatal (FcRn) es un receptor de Fc de la membrana integral para el tráfico intracelular para IgG. El FcRn fue originalmente identificado como un receptor que funcionaba en la vida neonatal. Fue aislado por primera vez a partir del intestino de roedores como un heterodímero entre una proteína de 12 kDa y una de 40-50 kDa (Rodewald & Kraehenbuhl 1984, J. Cell. Biol. 99(1 Pt2): 159s-154s; Simister & Rees, 1985, Eur. J. Immunol. 15:733-738) y se clonó en 1989 (Simister & Mostov, 1989, Nature 337:184-187). La clonación y posterior cristalización de FcRn reveló que tenía una cadena pesada del tipo de la clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de aproximadamente 50 kDa en asociación no covalente con una cadena ligera de la p2-microglobulina de 12 kDa (Raghavan et al., 1993, Biochemistry 32:8654-8660; Huber et al., 1993, J. Mol. Biol. 230:1077-1083). Aunque fue reconocido por primera vez a propósito de la vida fetal y neonatal, el FcRn es conocido hoy en día por seguir funcionando durante toda la vida adulta. El FcRn reside principalmente en los primeros endosomas ácidos donde se une a la región Fc de IgG en un modo dependiente del pH, con afinidad de micro- a nanomolar a pH 6,5, mientras que la unión de FcRn a Fc a pH fisiológico es despreciable. La mayor parte del FcRn está presente en endosomas en la mayoría de las células, y la interacción entre FcRn y sus ligandos Fc de IgG ocurre dentro de ese entorno ácido. En algunas células, tales como las células hematopoyéticas, niveles significativos de FcRn se pueden detectar sobre la superficie celular, además de la expresión intracelular (Zhu et al., 2001, J. Immunol. 166:3266-3276). En este caso, cuando el medio extracelular es ácido, como en el caso de condiciones neoplásicas o infecciosas, es posible que el FcRn pueda unirse a IgG sobre la superficie celular de estos tipos de células. El FcRn regula las concentraciones de IgG en suero uniéndose a y protegiendo la IgG monomérica endocitosada de la degradación en el compartimento lisosómico y transportando la IgG a la superficie celular para liberarla a pH extracelular neutro. Durante todo este mecanismo, el FcRn es responsable de la larga semivida en suero de la IgG, puesto que la IgG que no es unida por el FcRn entra en la vía lisosómica y es degradada.

Durante las primeras etapas de la vida, el FcRn confiere inmunidad pasiva a la descendencia antes y después del parto al mediar en la transferencia de IgG a través de la placenta materna o las paredes intestinales neonatales. El FcRn sigue funcionando durante toda la vida adulta y se expresa en diversos tejidos, por ejemplo, el epitelio del pulmón y el hígado, el endotelio vascular, así como en monocitos, macrófagos y células dendríticas.

Los ratones deficientes en FcRn son más resistentes a las enfermedades autoinmunes causadas por autoanticuerpos IgG patógenos, debido a que son incapaces de mantener elevadas concentraciones de IgG patógena en suero (Christianson et al., 1996, J. Immunol. 156:4932-4939; Ghetie et al., 1996, Eur. J. Immunol. 26:690-696; Israel et al., 1996, Immunol. 89:573-578). Se descubrió que la administración de anticuerpos manipulados para tener regiones Fc modificadas que se unen con mayor afinidad a FcRn mejoraba la enfermedad en un modelo de artritis murina (Patel et al., 2011, J. Immunol. 187:1015-1022). La administración de dosis elevadas de IgG en varias enfermedades autoinmunes tiene un efecto paliativo que se puede explicar al menos parcialmente por la saturación de la protección de IgG mediada por FcRn, acortando la semivida de la IgG patógena (Jin & Balthasar, 2005, Hum. Immunol. 66:403-410; Akilesh et al., 2004, J. Clin. Invest. 113:1328-1333; Li et al., 2005, J. Clin. Invest. 115:3440-3450). Por consiguiente, el bloqueo específico de la interacción FcRn-IgG se puede usar para promover la degradación de anticuerpos IgG patógenos, por ejemplo, para tratar enfermedades autoinmunes mediadas por IgG y para depurar anticuerpos terapéuticos del suero después de la administración. Por ejemplo, en un modelo de rata de miastenia grave autoinmune experimentalmente inducida, el tratamiento con un anticuerpo monoclonal específico de cadena pesada de FcRn produjo una reducción de la concentración de IgG en suero y una disminución en la intensidad de la enfermedad (Liu et al., 2007, J. Immunol. 178:5390-5398).

Una ausencia de FcRn en células hematopoyéticas está asociada con depuración más rápida de complejos inmunitarios que contienen IgG de la circulación sanguínea (Qiao et al., 2008, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105: 9337 9342). Esto indica que el bloqueo específico de las interacciones FcRn-IgG también promoverá la depuración de complejos inmunitarios que contienen IgG de la circulación.

El FcRn regula el movimiento de IgG, y cualquier carga unida, entre diferentes compartimentos del cuerpo por transcitosis a través de células polarizadas. Este proceso desempeña una función importante en la protección de la mucosa de la infección, por ejemplo, en el tubo gastrointestinal. El FcRn transporta la IgG a través de la barrera de células epiteliales de los intestinos y dentro de la luz. Después de que la IgG se una al antígeno en la luz, el complejo IgG/antígeno es transportado de nuevo a través de la barrera por FcRn en la lámina propria, lo que permite procesar el complejo IgG/antígeno por células dendríticas y la presentación de antígeno a linfocitos T CD4+ en ganglios linfáticos regionales.

El FcRn también desempeña una función crítica en la presentación de antígenos de clase II del MHC y la presentación cruzada de antígeno complejado con IgG de la clase I del MHC. Cuando el antígeno se presenta como un complejo inmunitario (IC) que contiene IgG, las células dendríticas que son CD8-CD11b+CD11c+ (células dendríticas inflamatorias) muestran una presentación cruzada significativa a bajas dosis de antígeno en una vía que es altamente dependiente de la expresión de FcRn. Esta vía implica la internalización de los IC por receptores de Fcy en un endosoma ácido. La posterior unión de los IC por FcRn dentro de células presentadoras de antígenos (APC) inicia mecanismos específicos que dan como resultado el tráfico de los IC portadores del antígeno en compartimentos donde el antígeno es procesado en epítopes de péptido compatibles con la carga sobre el MHC (Baker et al., 2011, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108:9927-9932; Christianson et al., 2012, mAbs vol. 4, página 208, Introduction). Por lo tanto, el FcRn en DC potencia la presentación de antígenos del MHC II e induce la proliferación de linfocitos T CD4+ específicos de antígeno, así como la presentación de una función fundamental en la presentación de antígenos a linfocitos T CD8+ (linfocitos T citotóxicos). Esta última vía de linfocitos T CD8+ se denomina presentación cruzada e implica la mezcla de antígenos extracelulares en una vía dependiente de la clase I del MHC.

El bloqueo de la interacción del IC FcRn-Ig inhibe la presentación de antígenos del IC y la posterior activación de linfocitos T estimulados por la presentación de antígenos asociada a la inmunidad. Las interacciones con el IC de IgG en APC, tales como DC, también promueven la secreción de citocinas inflamatorias, tales como IL-12, IFNy y TNFa. Por lo tanto, el bloqueo de la interacción del IC FcRn-Ig es útil para inhibir la producción de citocinas inflamatorias por células inmunitarias innatas y los linfocitos T activados por antígeno.

El FcRn contiene un sitio de unión para la albúmina de suero que es distinto de su sitio de unión para el dominio Fc de IgG, debido a interacciones iónicas entre FcRn y IgG o albúmina en caras opuestas de la cadena pesada de FcRn (Chaudhury et al., 2006, Biochemistry 45:4983-4990). Al igual que su unión a IgG, la unión de FcRn a albúmina es fuertemente dependiente del pH, que ocurre a pH ácido (normalmente inferior a pH 6, y óptimamente a pH 5), pero no a pH neutro. Similar a su función en proteger las IgG de la degradación, la unión de FcRn de albúmina protege a la albúmina de la degradación y da como resultado una prolongada semivida en suero para la albúmina.

Un anticuerpo murino que se une a FcRn se desvela en el documento de patente WO 2006/118772 A2. El documento de patente WO 2014/019727 A1 enseña un anticuerpo monoclonal anti-FcRn humano humanizado, que también se conoce como rozanolixizumab.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona anticuerpos y porciones de unión al antígeno de los mismos que se unen a FcRn. Los anticuerpos se unen a un epítope de FcRn que solapa el sitio de unión para el dominio Fc de IgG y reducen o inhiben la unión de FcRn a IgG e IgG como un complejo inmunitario.

La invención proporciona un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a FcRn que comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, en donde la secuencia de la región variable de la cadena pesada es SEQ ID NO:56 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera es SEQ ID NO:22.

En una realización, la invención proporciona un anticuerpo, que tiene el isotipo IgG4 o que es un scFv, Fv, Fab', Fab, F(ab')₂o diacuerpo, opcionalmente en donde el anticuerpo de isotipo IgG4 contiene modificaciones S241P en las cadenas pesadas y/o en donde el anticuerpo carece de lisinas carboxiterminales en las cadenas pesadas.

La presente invención proporciona además un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo contra FcRn o fragmento de unión al antígeno según la invención.

La presente invención proporciona además un vector de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico aislado según la invención.

La presente invención proporciona además una célula hospedadora procariota o eucariota que comprende un ácido nucleico aislado según la invención.

La presente invención proporciona además una composición que comprende un anticuerpo contra FcRn o fragmento de unión al antígeno según la invención, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La presente invención proporciona además el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmune.

En el presente documento se desvela un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a FcRn que comprende una región variable de la cadena pesada, comprendiendo la región variable de la cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3, en donde:

la secuencia de CDR1 es SEQ ID NO:2;

la secuencia de CDR2 es SEQ ID NO:4; y

la secuencia de CDR3 es SEQ ID NO:78.

Según la divulgación, la secuencia de CDR3 puede ser SEQ ID NO:76. Alternativamente, la secuencia de CDR3 puede ser SEQ ID NO:74.

Además, alternativamente, la secuencia de CDR3 se puede seleccionar del grupo que consiste en SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:76 y SEQ ID NO:78. Por ejemplo, la secuencia de CDR3 es SEQ ID NO: 49 o SEQ ID NO:55.

El aminoácido en la posición de Kabat 103 de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno según la invención es arginina.

En el presente documento también se desvela un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a FcRn que comprende una región variable de la cadena ligera, comprendiendo la región variable de la cadena ligera CDR1, CDR2 y C^dR3, en donde:

la secuencia de CDR1 es SEQ ID NO:6;

la secuencia de CDR2 es SEQ ID NO:8; y

la secuencia de CDR3 se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:65 y SEQ ID NO:68.

Como se desvela en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo según la invención es un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a FcRn que comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, en donde cada una de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera comprende CDR1, CDR2 y CDR3, y en donde:

la secuencia de CDR1 de la cadena pesada es SEQ ID NO:2;

la secuencia de CDR2 de la cadena pesada es SEQ ID NO:4; y

la secuencia de CDR3 de la cadena pesada es

SEQ ID NO:55, y la secuencia de CDR1 de la cadena ligera es SEQ ID NO:6;

la secuencia de CDR2 de la cadena ligera es SEQ ID NO:8; y

la secuencia de CDR3 de la cadena ligera es SEQ ID NO: 10

Como se desvela en el presente documento, la secuencia de CDR3 de la cadena pesada puede ser SEQ ID NO:49 o SEQ ID NO:55; y la secuencia de CDR3 de la cadena ligera puede ser SEQ ID NO: 10. La secuencia de CDR de la cadena pesada puede ser SEQ ID NO:55; y la secuencia de CDR3 de la cadena ligera puede ser SEQ ID NO:10. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno proporcionado por la invención es un anticuerpo humanizado o fragmento de unión al antígeno.

En el presente documento también se desvela un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a FcRn que comprende una región variable de la cadena pesada, en donde la secuencia de la región variable de la cadena pesada es SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56 o SEQ ID NO:58 o la secuencia de la región variable de la cadena pesada es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56 o SEQ ID NO:58.

Como se desvela en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno puede comprender además una región variable de la cadena ligera, en donde la secuencia de la región variable de la cadena ligera es SEQ ID NO:20 o SEQ ID NO:22. La secuencia de la región variable de la cadena pesada puede ser SEQ ID NO:50 o SEQ ID NO:56. Según la invención, la secuencia de la región variable de la cadena pesada es SEQ ID NO:56 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera es SEQ ID NO:22.

El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno descrito en el presente documento puede comprender además una región variable de la cadena ligera, en donde la secuencia de la región variable de la cadena ligera es SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:67 o SEQ ID NO:70 o la secuencia de la región variable de la cadena ligera es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:67 o SEQ ID NO:70.

Como se desvela en el presente documento, la secuencia de la región variable de la cadena pesada puede ser SEQ ID NO:50 o SEQ ID NO:56 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera puede ser SEQ ID NO:20 o SEQ ID NO:22. En el anticuerpo según la invención, la secuencia de la región variable de la cadena pesada es SEQ ID NO:56 y la región variable de la cadena ligera comprende la región estructural de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO:22.

También se describe en el presente documento un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a FcRn que comprende una región variable de la cadena ligera, en donde la secuencia de la región variable de la cadena ligera es SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:67 o SEQ ID NO:70 o la secuencia de la región variable de la cadena ligera es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:67 o SEQ ID NO:70. La secuencia de la región variable de la cadena ligera puede ser SEQ ID NO:67. La secuencia de la región variable de la cadena ligera puede ser SEQ ID NO:67 y el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno puede comprender además una región variable de la cadena pesada, en donde la región variable de la cadena pesada comprende la región estructural de SEQ ID NO: 12. Como se desvela en el presente documento, la secuencia de la región variable de la cadena ligera puede ser SEQ ID NO: 67 y el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno puede comprender además una región variable de la cadena pesada, en donde la secuencia de la región variable de la cadena pesada es SEQ ID NO: 12.

También se describe en el presente documento un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a FcRn que comprende una región variable de la cadena pesada, en donde la región variable de la cadena pesada comprende la región estructural de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18 o una región estructural que es al menos 95 % idéntica a la región estructural de SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16 o SEQ ID NO:18. Según la divulgación, la región variable de la cadena pesada puede comprender la región estructural de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO:12 o una región estructural que es al menos 95 % idéntica a la región estructural de SEQ ID NO:12.

También se describe en el presente documento un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a FcRn que comprende una región variable de la cadena ligera, en donde la región variable de la cadena ligera comprende la región estructural de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24 o SEQ ID NO:26 o una región estructural que es al menos 95 % idéntica a la región estructural de SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24 o SEQ ID NO:26. Según la divulgación, la región variable de la cadena ligera puede comprender la región estructural de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO:20 o SEQ ID NO:22 o una región estructural que es al menos 95 % idéntica a la región estructural de SEQ ID NO:20 o SEQ ID NO:22. En el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo según la invención, la región variable de la cadena ligera comprende la región estructural de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO:22.

También se describe en el presente documento un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a FcRn que comprende una región variable de la cadena pesada, en donde la región variable de la cadena pesada comprende la región estructural de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18 o una región estructural que es al menos 95 % idéntica a la región estructural de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 18 y comprende además una región variable de la cadena ligera, en donde la región variable de la cadena ligera comprende la región estructural de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24 o SEQ ID NO:26 o una región estructural que es al menos 95 % idéntica a la región estructural de SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24 o SEQ ID NO:26.

En algunas realizaciones de los anticuerpos descritos en el presente documento, el anticuerpo tiene isotipo IgG4. En algunas realizaciones, el anticuerpo contiene modificaciones S241P en las cadenas pesadas. En algunas realizaciones, el anticuerpo carece de lisinas carboxiterminales en las cadenas pesadas. En algunas realizaciones, el anticuerpo contiene modificaciones S241P en las cadenas pesadas y carece de lisinas carboxiterminales en las cadenas pesadas.

En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno descrito en el presente documento es un scFv, Fv, Fab', Fab, F(ab^{' )2}o diacuerpo.

También se describe en el presente documento un anticuerpo que compite o bloquea de forma cruzada un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une al FcRn descrito en el presente documento.

En el presente documento también se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo contra FcRn o fragmento de unión al antígeno según la invención. En el presente documento también se proporciona un vector de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo contra FcRn o fragmento de unión al antígeno según la invención. En el presente documento también se proporciona una célula hospedadora procariota o eucariota que comprende un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo contra FcRn o fragmento de unión al antígeno descrito en el presente documento. En el presente documento también se proporciona una composición que comprende un anticuerpo contra FcRn o fragmento de unión al antígeno según la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En el presente documento también se desvela un método de modulación de la interacción entre FcRn y IgG Fc que comprende poner en contacto FcRn con un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno descrito en el presente documento.

En el presente documento también se desvela un método de promoción de la degradación de anticuerpos por una célula que comprende poner en contacto FcRn con un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno descrito.

En el presente documento también se desvela un método de promoción de la degradación de anticuerpos en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno descrito en el presente documento. El anticuerpo que es degradado puede ser un autoanticuerpo. El anticuerpo que es degradado puede ser un anticuerpo terapéutico.

En el presente documento también se desvela un método de mejora de una enfermedad mediada por IgG en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno descrito en el presente documento eficaz para mejorar la enfermedad mediada por IgG.

También se describe en el presente documento un método de inhibición de la unión del complejo inmunitario por FcRn o disminución de los complejos inmunitarios en circulación inhibiendo las interacciones de complejos inmunitarios de FcRn, que comprende poner en contacto FcRn con una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno descrito en el presente documento.

En el presente documento también se desvela un método para inhibición de la presentación de un antígeno complejado inmunitario por una célula presentadora de antígenos (APC), que comprende poner en contacto la APC con una cantidad de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno descrito en el presente documento eficaz para inhibir la presentación del antígeno.

En el presente documento también se desvela un método de inhibición de la presentación cruzada de un antígeno complejado inmunitario por una célula presentadora de antígenos (APC), que comprende poner en contacto la APC con una cantidad de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno descrito en el presente documento eficaz para inhibir la presentación cruzada del antígeno.

También se describe en el presente documento un método de inhibición de la secreción de una citocina inflamatoria por una célula presentadora de antígenos (APC), que comprende poner en contacto la APC con una cantidad de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno descrito en el presente documento eficaz para inhibir la secreción de la citocina inflamatoria. Según la divulgación, la citocina inflamatoria puede ser interleucina-6 (IL-6), interleucina-12 (IL-12) o factor de necrosis tumoral-a (TNFa).

En el presente documento también se desvela un método de inhibición de la activación de linfocitos T por una célula presentadora de antígenos que comprende poner en contacto la célula presentadora de antígenos con un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno descrito en el presente documento.

En el presente documento también se proporciona el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo según la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmune en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar una cantidad eficaz del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno Ejemplos de enfermedades autoinmunes que se pueden tratar incluyen pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, pénfigo paraneoplásico, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), trombocitopenia inducida por heparina (HIT), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), anemia hemolítica autoinmune (AIHA), miastenia grave (MG), polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), neuropatía motora multifocal, neuromielitis óptica, trombocitopenia autoinmune, neutropenia inmunitaria, inhibidor de FVIII antihemófilo, síndrome antifosfolípidos, síndrome de Kawasaki, enfermedad asociada a ANCA, polimiositis, dermatomiositis, pénfigo ampolloso, esclerosis múltiple (MS), síndrome de Guillain-Barre, polineuropatía crónica, colitis ulcerosa, diabetes mellitus, tiroiditis autoinmune, oftalmopatía de Graves, urticaria autoinmune, vasculitis y encefalitis de Rasmussen.

En el presente documento también se desvela un método de identificación de anticuerpos que se unen a FcRn a tanto pH ácido como pH fisiológico que comprende dos o más etapas de cribado que se llevan a cabo a pH 5,8-6,4. El método puede comprender:

(a) poner en contacto un conjunto de anticuerpos candidatos con FcRn o una porción de los mismos a pH 5,8-6,4 y aislar los anticuerpos que se unen a FcRn o una porción de los mismos;

(b) poner en contacto los anticuerpos aislados de la etapa (a) con FcRn o una porción de los mismos a pH 6,8 7,6 y aislar los anticuerpos que se unen a FcRn o una porción de los mismos; y

(c) poner en contacto los anticuerpos aislados de la etapa (b) con FcRn o una porción de los mismos a pH 5,8 6,4 y aislar los anticuerpos que se unen a FcRn o una porción de los mismos.

En el presente documento también se desvela un método de bloqueo de la transmisión de anticuerpos patógenos a través de la placenta que comprende administrar a un mamífero gestante en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo contra FcRn o fragmento de unión al antígeno del mismo.

En el presente documento también se desvela un método de aumento de la depuración de IC de un sujeto que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo un anticuerpo contra FcRn o fragmento de unión al antígeno del mismo. Por ejemplo, el sujeto tiene una vasculitis que está medida por el complejo inmunitario.

En el presente documento también se desvela un método de determinación de si un anticuerpo de prueba o fragmento de unión al antígeno del mismo bloquea o disminuye la interacción entre FcRn y complejos inmunitarios que comprende:

(a) obtener sangre completa de un mamífero;

(b) añadir un complejo inmunitario a una primera porción de la sangre completa;

(c) medir la cantidad de una citocina en la sangre completa después de la adición del complejo inmunitario para obtener una primera cantidad de la citocina;

(d) añadir un anticuerpo de prueba o fragmento de unión al antígeno del mismo a una segunda porción de la sangre completa;

(e) añadir el complejo inmunitario a la segunda porción de la sangre completa después o al mismo tiempo que, la adición del anticuerpo de prueba o fragmento de unión al antígeno del mismo; y

(f) medir la cantidad de la citocina en la segunda porción de la sangre completa después de la adición del complejo inmunitario para obtener una segunda cantidad de la citocina.

El mamífero puede ser un humano. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo se humaniza. En algunas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo es una IgG, Fab, F(ab')², diacuerpo, FV, scFV, péptido bloqueante o fragmento de unión al antígeno del mismo. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una región variable de la cadena pesada que tiene SEQ ID NO:56 y una región variable de la cadena ligera que tiene SEQ ID NO:22.

Como se desvela en el presente documento, la citocina puede ser factor de necrosis tumoral-a (TNF-a), interleucina-6 (IL-6) interleucina-10 (IL-10) o interleucina-12 (IL-12). Como se desvela en el presente documento, el complejo inmunitario puede ser artificial, es decir, no ocurre naturalmente en el mamífero. Como se desvela en el presente documento, el complejo inmunitario puede comprender un complejo multimérico del grupo 4-hidroxi-5-yodo-3-nitrofenilacetilo (NIP) y ovoalbúmina de pollo (OVA) y un anticuerpo anti-NIP.

En el presente documento también se desvela un método de determinación del nivel de sensibilidad esperado de un paciente a una terapia anti-FcRn que comprende:

(a) obtener sangre completa del paciente antes de empezar la terapia anti-FcRn;

(d) añadir un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se sabe que bloquea o disminuye la interacción entre FcRn y complejos inmunitarios a una segunda porción de la sangre completa;

(e) añadir el complejo inmunitario a la segunda porción de la sangre completa después o al mismo tiempo que la adición del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo;

(f) medir la cantidad de la citocina en la segunda porción de la sangre completa después de la adición del complejo inmunitario para obtener una segunda cantidad de la citocina; y

(g) determinar la diferencia entre la primera cantidad de la citocina y la segunda cantidad de la citocina.

Como se desvela en el presente documento, el paciente puede ser un humano.

Como se desvela en el presente documento, la terapia anti-FcRn puede ser la administración de un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO:56 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO:22.

Como se desvela en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo puede ser una IgG, Fab, F(ab')², diacuerpo, FV, scFV, péptido bloqueante o un fragmento del mismo. En realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo es un F(ab')². El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una región variable de la cadena pesada que tiene SEQ ID NO:56 y una región variable de la cadena ligera que tiene SEQ ID NO:22.

La citocina puede ser factor de necrosis tumoral-a (TNF-a), interleucina-6 (IL-6), interleucina-10 (IL-10) o interleucina-12 (IL-12). El complejo inmunitario puede ser artificial, es decir, no ocurre naturalmente en el mamífero. El complejo inmunitario puede comprender un complejo multimérico del grupo 4-hidroxi-5-yodo-3-nitrofenilacetilo (NIP) y ovoalbúmina de pollo (OVA) y un anticuerpo anti-NIP. La diferencia determinada en la etapa (g) se puede comparar con un valor de control. La diferencia determinada en la etapa (g) se puede comparar con una diferencia obtenida cuando el método se lleva a cabo con un complejo inmunitario que comprende un anticuerpo con tres mutaciones puntuales (I253A/H310A/H435A) en el dominio Fc que suprime la unión a FcRn.

También se describe en el presente documento un método de monitorización de la respuesta de un paciente a una terapia anti-FcRn que comprende:

(a) obtener sangre completa del paciente antes de empezar una terapia anti-FcRn;

(b) añadir un complejo inmunitario a la sangre completa;

(d) obtener sangre completa del paciente después de empezar una terapia anti-FcRn;

(e) añadir el complejo inmunitario a la sangre completa de la etapa (d);

(f) medir la cantidad de la citocina en la sangre completa después de la adición del complejo inmunitario en la etapa (e) para obtener una segunda cantidad de la citocina; y

El paciente puede ser un humano.

En algunas realizaciones, la terapia anti-FcRn es la administración de un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de SEQ ID NO:56 y una secuencia de la región variable de la cadena ligera de SEQ ID NO:22. En algunas realizaciones, el anticuerpo es una IgG, Fab, F(ab')², diacuerpo, FV, scFV, péptido bloqueante o un fragmento del mismo. En algunas realizaciones, el anticuerpo es un F(ab')².

La citocina puede ser factor de necrosis tumoral-a (TNF-a), interferón- ^y(IFN-^y) interleucina-6 (IL-6), interleucina-10 (IL-10) o interleucina-12 (IL-12). El complejo inmunitario puede comprender un complejo multimérico del grupo 4-hidroxi-5-yodo-3-nitrofenilacetilo (NIP) y ovoalbúmina de pollo (NIP) y un anticuerpo anti-NIP. La diferencia determinada en la etapa (g) se puede comparar con un valor de control. La diferencia determinada en la etapa (g) se puede comparar con una diferencia obtenida cuando el método se lleva a cabo con un complejo inmunitario que comprende un anticuerpo con tres mutaciones puntuales (I253A/H310A/H435A) en el dominio Fc que suprime la unión a FcRn. La terapia anti-FcRn se puede ajustar basándose en la diferencia entre la primera cantidad de la citocina y la segunda cantidad de la citocina determinada en la etapa (g).

También se describe en el presente documento un método de promoción de la degradación endógena de anticuerpos antes de la administración de un anticuerpo terapéutico que comprende administrar un anticuerpo anti-FcRn o fragmento del mismo que es específico del sitio de unión a IgG de FcRn a un sujeto en necesidad de tratamiento con el anticuerpo terapéutico antes de la administración del anticuerpo terapéutico.

También se describe en el presente documento un método de promoción de la degradación de un anticuerpo terapéutico exógeno que se ha administrado a un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-FcRn o fragmento del mismo.

El método puede comprender además la etapa de administrar el anticuerpo terapéutico al sujeto. Se puede potenciar la farmacocinética o farmacodinámica del anticuerpo terapéutico.

También se describe en el presente documento un método de medición del nivel de anticuerpo anti-FcRn en un sujeto después de la administración de un anticuerpo anti-FcRn, comprendiendo el método obtener sangre completa del sujeto después de que se haya administrado un anticuerpo anti-FcRn, en donde la sangre completa comprende monocitos; y medir el nivel de expresión de FcRn de la superficie celular del monocito. El sujeto puede ser un mamífero. El mamífero puede ser un humano.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS

La Fig. 1 muestra las secuencias de aminoácidos de variantes humanizadas de la cadena pesada (Vh1 -Vh4). Las variantes se basan en las secuencias del dominio variable de la cadena pesada humana y están alineadas para mostrar cambios en aminoácidos incorporados en ciertas posiciones para minimizar la posible inmunogenicidad. Los residuos de aminoácidos que varían entre las regiones estructurales humanizadas están subrayados. Las CDR de Kabat están recuadradas.

La Fig. 2 muestra las secuencias de aminoácidos de variantes humanizadas de la cadena ligera (Vk1-Yk3, Vk5). Las variantes se basan en las secuencias del dominio variable de la cadena ligera humana y están alineadas para mostrar cambios en aminoácidos incorporados en ciertas posiciones para minimizar la posible inmunogenicidad. Los residuos de aminoácidos que varían entre las regiones estructurales humanizadas están subrayados. Las CDR de Kabat están recuadradas.

La Fig. 3 muestra un ELISA competitivo que compara las cadenas pesadas con afinidad madurada H1, H3 y E7 y la cadena ligera con afinidad madurada E8, con el anticuerpo murino parental. Las cadenas pesadas con afinidad madurada se expresaron como scFv con la cadena ligera V^k1 parental humanizada y la cadena ligera con afinidad madurada se expresó como scFv con la cadena pesada V^h1 parental humanizada. El anticuerpo scFv compitió contra el anticuerpo murino parental biotinilado por la unión a FcRn inmovilizado a pH 7,4 (A) y pH 6,0 (B), y el anticuerpo murino parental biotinilado se detectó por estreptavidina-HRP.

La Fig. 4 muestra un ensayo de unión directo que compara anticuerpos IgG4 que comprenden cadenas pesadas y ligeras parentales humanizadas (Vh1Vk1) o con afinidad madurada (H1Vh1_E8Vk1, H1V^h1_E8V^k2, G7V^h1_E8V^k1, G7V^h1_E8V^k2) y el anticuerpo murino parental quimérico. Los anticuerpos reaccionaron con FcRn inmovilizado a pH 7,4 (A) y pH 6,0 (B), y el anticuerpo unido se detectó con antikappa-HRP humano.

La Fig. 5 muestra un ELISA competitivo que compara anticuerpos IgG4 que comprenden cadenas pesadas y ligeras parentales humanizadas (Vh1Vk1) o con afinidad madurada (H1Vh1_E8Vk1, H1Vh1_E8Vk2, F7Vh1_E8Vk1, F7Vh1_E8Vk2) y el anticuerpo murino parental quimérico. Los anticuerpos de prueba compitieron contra el anticuerpo murino parental biotinilado a pH 7,4 (A) y pH 6,0 (B), y el anticuerpo murino parental biotinilado unido se detectó por estreptavidina-HRP.

La Fig. 6 muestra un ELISA competitivo que compara anticuerpos scFv monovalentes e IgG divalentes, que comprenden dominios variables parentales humanizados (V^h1V^k1) o con afinidad madurada (H3V^h1_E8V^k1). Los anticuerpos de prueba compitieron contra el anticuerpo murino parental biotinilado a pH 7,4 (A) y pH 6,0 (B), y el anticuerpo murino parental biotinilado unido se detectó por estreptavidina-HRP.

La Fig. 7 muestra la unión de mAb a FcRn humano a pH 7,4 y 6,0. Los anticuerpos IgG que comprendían cadenas pesadas con afinidad madurada G9 o H3 emparejadas con cadenas ligeras con afinidad madurada E8 o parentales humanizadas Vx2 se acoplaron a un chip sensor BIACORE® CM5. Los sensogramas muestran la unión de cantidades tituladas de FcRn humano monomérico inyectado con respecto a los mAb inmovilizados a pH 7,4 y pH 6,0. (A) G9E8, (B) H3E8, (C) G9Vx2, (D) H3Vx2.

La Fig. 8 muestra los resultados de un ensayo de sangre completa en el que se midió la liberación del factor de necrosis tumoral-a (TNF-a). Las barras negras representan la serie de ensayos con 0,1 μg/ml de complejos NIP-OVA-IgG, pero no H3Vk2; las barras grises representan la serie de ensayos con 0,1 μg/ml de complejos NIP-OVA-IgG en presencia de H3Vx2. Los cuatro gráficos de barras representan, leyendo de izquierda a derecha: animal 1 a las 24 horas; animal 1 a las 48 horas; animal 2 a las 24 horas; animal 2 a las 48 horas. El animal 1 no respondió al tratamiento, es decir, la cantidad de TNF-a producida fue despreciable después de la estimulación con complejos NIP-OVA-IgG. La producción de TNF-a por el animal 2 a las 24 horas fue en realidad inhibida por H3Vx2; esta inhibición se enmascaró debido a que produjo una cantidad tan grande de TNF-a, que tanto las barras negras como grises estuvieron fuera de escala este gráfico.

La Fig. 9 muestra los resultados de un ensayo de sangre completa en el que se midió la liberación de interleucina-6 (IL-6). Las barras negras representan la serie de ensayos con 0,1 μg/ml de complejos NIP-OVA-IgG, pero no H3V^x2; las barras grises representan la serie de ensayos con 0,1 μg/ml de complejos NIP-OVA-IgG en presencia de H3Vx2. Los cuatro gráficos de barras representan, leyendo de izquierda a derecha: animal 1 a las 24 horas; animal 1 a las 48 horas; animal 2 a las 24 horas; animal 2 a las 48 horas.

La Fig. 10 muestra los resultados de un ensayo de sangre completa en el que se midió la liberación de interleucina-10 (IL-10). Las barras negras representan la serie de ensayos con 0,1 μg/ml de complejos NIP-OVA-IgG, pero no H3Vk2; las barras grises representan la serie de ensayos con 0,1 μg/ml de complejos NIP-OVA-IgG en presencia de H3Vx2. Los cuatro gráficos de barras representan, leyendo de izquierda a derecha: animal 1 a las 24 horas; animal 1 a las 48 horas; animal 2 a las 24 horas; animal 2 a las 48 horas.

La Fig. 11 muestra los resultados de otro ensayo de sangre completa. Las barras más a la derecha (mostradas en verde, azul y rojo) demuestran que H3V^k2 tiene un efecto inhibidor dependiente de la dosis de la cantidad de citocinas producidas.

La Fig. 12 muestra la unión de las subclases de IgG humana IgG1 e IgG4, así como el mAb anti-FcRn humano H3Vk2 a FcRn humano a pH 7,4 y pH 6,0. Sensogramas representativos muestran la unión de cantidades tituladas de hFcRn inyectado con respecto a (A) H3Vk2, (B) hIgG1 y (C) hIgG4 inmovilizados a pH 7,4 y pH 6,0.

La Fig. 13 muestra la unión de H3Vk2 a FcRn humano y de macaco cangrejero a pH 7,4 y pH 6,0. Sensogramas representativos muestran la unión de cantidades tituladas de (A) hFcRn inyectado con respecto al Ab inmovilizado a pH 7,4, (B) hFcRn a pH 7,4 y pH 6,0, y (C) cFcRn a pH 7,4 y pH 6,0.

La Fig. 14 muestra los resultados de un ensayo de sangre completa en el que se midió la liberación de interleucina-1 p (IL-1 p). Las barras negras representan la serie de ensayos con 0,1 μg/ml de complejos NIP-OVA-IgG, pero no H3V^k2; las barras grises representan la serie de ensayos con 0,1 μg/ml de complejos NIP-OVA-IgG en presencia de H3V^x2. Los cuatro gráficos de barras representan, leyendo de izquierda a derecha: animal 1 a las 24 horas; animal 1 a las 48 horas; animal 2 a las 24 horas; animal 2 a las 48 horas.

La Fig. 15 muestra los efectos de H3Vk2 sobre el catabolismo de hIgG en ratones transgénicos hFcRn. Los datos se representan como el porcentaje (± error estándar) de HuLys11 (IgG 1 humana) restante basándose en la cantidad de HuLys11 en el plasma de ratones 48 horas antes de la inyección de 20 mg/kg de H3Vk22 horas después de la extracción de sangre de 48 horas. El primer punto de datos recogido después del tratamiento con H3Vk2 fue 6 horas después de la administración durante el día 3.

La Fig. 16 muestra los efectos de H3Vk2 sobre el catabolismo del complejo inmunitario (IC) multimérico en ratones transgénicos hFcRn. El estudio se diseñó según Qiao SW, PNAS 2008. Los resultados se representan como el porcentaje (± error estándar) de IC restante basándose en los niveles basales de 24 horas en los momentos de tiempo indicados.

La Fig. 17 muestra los resultados de un ensayo de sangre completa usando sangre humana en el que se midió la liberación de factor de necrosis tumoral-a (TNF-a), interferón-y (IFN-y) e interleucina-12 (IL-12) en presencia de complejos NIP-OVA-IgG o complejos NiP-OVA-IHH.

La Fig. 18 muestra los resultados de otro ensayo de sangre completa usando sangre humana en el que se probó el efecto de H3E8 y H3Vk2 contra controles irrelevantes de IgG4 y IgG 1.

La Fig. 19 muestra los resultados de otro ensayo de sangre completa usando sangre humana usando anticuerpos de prueba y de control en formato de F(ab')².

DESCRIPCIÓN DETALLADA

En un aspecto, en el presente documento se proporcionan anticuerpos y proteínas de unión que se unen a FcRn. Más particularmente, los anticuerpos se unen a un epítope de FcRn que solapa el sitio de unión para el anticuerpo Fc. Por consiguiente, los anticuerpos modulan funciones mediadas por FcRn, tales como la unión de FcRn a Fc de IgG, protección de IgG y presentación de antígenos de complejos inmunitarios (IC). En otro aspecto, se proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un anticuerpo contra FcRn o porción de unión al antígeno del mismo según la invención. En otro aspecto, se proporciona una composición adecuada para administración a un sujeto que comprende un anticuerpo contra FcRn o porción de unión al antígeno del mismo según la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En algunas realizaciones, los anticuerpos según la invención inhiben la unión de IgG humana a FcRn humano, pero no inhiben la unión de albúmina de suero humano a FcRn humano. En algunas realizaciones, los anticuerpos según la invención disminuyen la semivida en suero de IgG humana, pero no disminuyen la semivida en suero de albúmina de suero humano.

En otro aspecto, se proporcionan los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos según la invención para su uso en métodos de tratamiento. Por ejemplo, reduciendo la unión de IgG Fc a FcRn, los anticuerpos o porciones de unión al antígeno de los mismos expuestos en el presente documento se pueden usar para reducir la semivida de IgG circulantes y tratar o prevenir trastornos autoinmunes mediados por anticuerpo. Similarmente, los anticuerpos o porciones de unión al antígeno de los mismos expuestos en el presente documento se pueden usar para reducir la semivida de IgG terapéuticas y otros agentes terapéuticos que comprenden una región Fc de IgG para estabilidad. Dichos métodos comprenden administrar a un individuo en necesidad de reducción de protección de IgG mediada por FcRn una cantidad de anticuerpo contra FcRn suficiente para inhibir la unión de FcRn a IgG humana.

FcRn, también conocido como el receptor de Fc neonatal, es un receptor de Fc de la membrana integral para IgG. FcRn es un heterodímero de una cadena alfa unida a la membrana (N.° de acceso de GenBank NM004107) y p2-microglobulina soluble (p2m) (N.° de acceso de GenBank NM004048) y está estructuralmente relacionado con moléculas de clase I del MHC. FcRn regula las concentraciones de IgG en suero uniéndose a y protegiendo la IgG endocitosada de la degradación en el compartimento lisosómico, y transportando la IgG a la superficie celular para su liberación a pH extracelular neutro. Mediante este mecanismo, el FcRn es responsable de la larga semivida en suero de IgG. Por consiguiente, el bloqueo específico de la interacción FcRn-IgG se puede usar para promover la degradación de anticuerpos IgG patógenos. El FcRn también se une a complejos inmunitarios (IC) multivalentes de IgG dentro de células presentadoras de antígenos (APC), tales como células dendríticas (DC), dirigiendo el IC unido en las vías de procesamiento de antígeno para la presentación a linfocitos T y la activación de respuestas inmunitarias de linfocitos T. Por consiguiente, el bloqueo específico de la interacción FcRn-IC se puede usar para inhibir las respuestas inmunitarias de linfocitos T, que incluyen la reducción de la producción de citocinas inflamatorias, tales como IL-6, IL-12, IFNy o TNFα

Se proporcionan anticuerpos que derivan de un anticuerpo murino que se une específicamente a FcRn y bloquea la unión de FcRn a Fc de IgG, pero no se une sustancialmente al sitio de unión a albúmina de FcRn. Los anticuerpos tienen mejoras sustanciales en la afinidad de unión por FcRn a pH 7,4 y pH 6,0, y así bloquean la unión de Fc de IgG a FcRn en condiciones fisiológicas y ácidas. Los anticuerpos son útiles en el tratamiento de enfermedades autoinmunes e inflamatorias. Los anticuerpos comprenden una o más CDR con afinidad madurada. El procedimiento de maduración de la afinidad proporciona anticuerpos que se unen con alta afinidad a FcRn por encima del intervalo crítico de pH 6,0 a 7,4. Por lo tanto, los anticuerpos bloquean eficazmente la unión de Fc de IgG una vez internalizados en el entorno ácido del endosoma.

Los anticuerpos mejorados también presentan regiones estructurales humanizadas para reducir la inmunogenicidad. Como se desvela en el presente documento, las CDR de un anticuerpo específico de FcRn se localizan en regiones estructurales obtenidas de un anticuerpo humano. En realizaciones, las CDR de un anticuerpo específico de FcRn según la invención se localizan en regiones estructurales que son un material compuesto de dos o más anticuerpos humanos. Las regiones estructurales se seleccionan para minimizar la presencia de secuencias de aminoácidos que se predice que son epítopes de linfocitos T en un amplio rango de población.

Como se describe adicionalmente en el presente documento, para la maduración de la afinidad, se mutaron las regiones CDR3 del dominio variable de la cadena pesada y ligera y se cribaron en forma de scFv a pH 6,0 y pH 7,4. La variación de la secuencia de aminoácidos se introdujo en la región CDR3H de la cadena pesada en las posiciones de aminoácidos 98-103 (aa 98-102 de CDR3H y aa 103 de FW4) usando un oligonucleótido que comprendía la secuencia KNCNNCNNCNNCSVCNWCYGG (SEQ ID NO:71) que proporcionó aminoácidos seleccionados en cada posición del siguiente modo: aa 98: A, C, D, F, G, S, V, Y; aa 99: A, C, D, F, G, H, I, L, N, P, R, S, T, V, Y; aa 100: A, C, D, F, G, H, I, L, N, P, R, S, T, V, Y; aa 100a: A, C, D, F, G, H, I, L, N, P, R, S, T, V, Y; aa 101: A, D, G, H, P, R; aa 102: D, F, H, I, L, N, V, Y; aa 103: R, W. La variación de secuencias de aminoácidos se introdujo en la región CDR3L de la cadena ligera en las posiciones de aminoácidos 89-97 usando la secuencia de oligonucleótidos TGTMRSVMGTVSKRSRRCWMCYYCBWCRYCTTC (SEQ ID NO:72), que proporcionó aminoácidos seleccionados en cada posición, del siguiente modo: aa 88: C; aa 89: H, K, N, Q, R, S; aa 90: A, E, K, P, Q, T; aa 91: C, S, W, Y; aa 92: C, D, E, G, W, Y; aa 93: D, G, N, S; aa 94: N, S, T, Y; aa 95: F, L, P, S; aa 96: D, F, H, L, V, Y; aa 97: A, I, T, V.

Como se muestra en los ejemplos que siguen, esto condujo a varias variantes de CDR3H que confirieron mejoras sustanciales en la afinidad de unión a FcRn. La inspección de las variantes obtenidas en comparación con la variabilidad introducida en la biblioteca de CDR3H indica ciertas posiciones donde los aminoácidos siguieron relativamente invariables y otras donde la variación se podría introducir y dar como resultado unión mejorada. Por consiguiente, se desvela un anticuerpo o porción de unión del mismo que se une a FcRn, en donde la cadena pesada comprende CDR3H, que comprende ciertos aminoácidos que se pueden variar. Como se desvela en el presente documento, CDR3H puede comprender VX1PPX2X3, en donde X1 es A, R o S; X2 es G o R; y X3 es I, L o V (SEQ ID ⁿO:73). La cadena pesada CDR3H puede ser STTVX1PPX2X3, en donde X1 es A, R o S; X2 es G o R; y X3 es I, L o V (SeQ ID NO:74). La cadena pesada CDR3H puede comprender VX1PPX2X3, en donde X1 es A, R o S; X2 es A, G, H, P o R; y X3 es H, I, L o V (SeQ ID NO:75). La cadena pesada CDR3H puede ser STTVX1PPX2X3, en donde X1 es A, R o S; X2 es A, G, H, P o R; y X3 es H, I, L o V (SEQ ID NO:76). La cadena pesada CDR3H puede comprender VX1X2X3X4X5, en donde X1 es A, H, R o S; X2 es A o P; X3 es A, D o P; X4 es A, D, G, H, P o R; X5 es F, H I, L, N o V; y al menos un de X2 y X3 es P (SeQ ID NO:77). La cadena pesada CDR3H puede ser STTVX1X2X3X4X5, en donde X1 es A, H, R o S; X2 es A o P; X3 es A, D o P; X4 es A, D, G, H, P o R; X5 es F, H, I, L, N o V; y al menos un de X2 y X3 es P (SEQ ID NO:78).

Como se desvela en el presente documento, CDR3H puede ser STTVSPADF (SEQ ID NO:27), STTVSPPPI (SEQ ID NO:29), STTVSPPAH (SEQ ID NO:31) o STTVAPPRL (SEQ ID NO:33). CDR3H puede ser STTVHPDRN (SEQ ID NO:35), STTVSPPAL (SEQ ID NO:37) o STTVHPDHN (SEQ ID NO:39), STTVSPPHL (SEQ ID NO:41). CDR3H pueden adicional be STTVAPPPL (SEQ ID NO:43), STTVSPPHL (SEO ID NO:45), STTVAPPGH (SEQ ID NO:47) o STTVSPPRV (SEQ ID NO:49). En el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo según la invención, CDR3H es STTVRPPGI (SEQ ID NO:55). Como se desvela en el presente documento, el aminoácido en la posición 103 del dominio variable de la cadena pesada puede ser triptófano. Según la invención, el aminoácido en la posición 103 del dominio variable de la cadena pesada es arginina.

Como se describe en el presente documento, CDR3H puede ser como se expone anteriormente, CDR1H se expone por SEQ ID NO:2 y CDR2H se expone por s Eq ID NO:4.

Se desarrollaron varias regiones estructurales de la cadena pesada y ligera, teniendo en cuenta las secuencias de la región estructural del anticuerpo murino en vista de las estructuras de anticuerpo conocidas. Las regiones estructurales humanizadas se ensamblaron a partir de secuencias del dominio variable humano, con vistas a minimizar los epítopes de linfocitos T inmunogénicos. Se ejemplifican cuatro de dichas regiones estructurales humanizadas de la cadena pesada y cuatro de dichas regiones estructurales humanizadas de la cadena ligera: Vh1 (SEQ ID NO: 12); Vh2 (SEQ ID NO:14); Vh3 (SEQ ID NO:16); Vh4 (SEQ ID NO:18); Vk1 (SEQ ID NO:20); Vk2 (SEQ ID NO:22); Vk3 (SEQ ID NO:24); y V ^k5 (SEQ ID NO:26). Secuencias de oligonucleótidos correspondientes para estas regiones estructurales humanizadas ejemplificadas se exponen por: SEQ ID NO: 11 (Vh1); SEQ ID NO: 13 (Vh2); SEQ ID NO: 15 (Vh3); SEQ ID NO: 17 (Vh4); SEQ ID NO: 19 (Vx1); SEQ ID NO:21 (Vx2); SEQ ID NO:23 (Vk3); y SEQ ID NO:25 (Vx5). En las secuencias del dominio variable de la cadena pesada proporcionadas en SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:14, S^eQ ID NO:16 y SEQ ID NO:18, los aminoácidos de CDR¹H, ^cD^r2H y CDR3H se representan como "Xaa". Las secuencias de aminoácidos de CDR1H y CDR2H son como se exponen en SEQ ID NO:2 y SEQ ID NO: 4, respectivamente. Una secuencia de oligonucleótidos correspondiente para CDR1H se expone por SEQ ID NO: 1 y una secuencia de oligonucleótidos correspondiente para CDR2H se expone por SEQ ID NO:3. En las secuencias del dominio variable de la cadena ligera proporcionadas en SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24 y SEQ ID NO:26, se especifica un aminoácido particular en todas las posiciones. Las secuencias de aminoácidos de CDR1L son como se exponen en SEQ ID NO:6, CDR2L como se exponen en SEQ ID NO:8, y CDR3L como se exponen en SEQ ID NO: 10. Las secuencias de oligonucleótidos correspondientes son como se exponen por: SEQ ID NO:5 (CDR1L); SEQ ID NO:7 (CDR2L); y SEQ ID NO:9 (CDR3L). Las localizaciones de FW y CDR en las cadenas pesadas y ligeras también serán evidentes a partir de la Fig. 1 y Fig. 2, respectivamente.

La Tabla 1 proporciona ejemplos no limitantes de dominios variables de la cadena pesada y ligera de anticuerpos de unión a FcRn humanizados con afinidad madurada y CDR. Como se describe en el presente documento, los dominios variables se seleccionaron para su unión mejorada a pH 6,0 y pH 7,4, y demuestran unión sustancialmente mejorada con respecto al anticuerpo murino parental.

Las CDR3 de cadena pesada con afinidad madurada se pueden combinar con una CDR1 de cadena pesada (por ejemplo, una CDR1 que tiene SEQ ID NO:2) y/o una CDR2 de cadena pesada (por ejemplo, una CDR2 que tiene SEQ ID NO:4). Las CDR3 de cadena ligera con afinidad madurada se pueden combinar con una CDR1 de cadena ligera (por ejemplo, una CDR1 que tiene SEQ ID NO:6) y/o una CDR2 de cadena ligera (por ejemplo, una CDR2 que tiene SEQ iD NO:8).

Como se desvela en los ejemplos que siguen, diversos dominios variables de anticuerpo ejemplificados en el presente documento se basan en un anticuerpo murino y contienen CDR con afinidad madurada, y ciertos ejemplos también presentan FW humanizadas. Será evidente que los dominios variables de la cadena pesada y ligera desvelados en la Tabla 1 están diseñados para ser compatibles. Por lo tanto, cualquier dominio variable de la cadena pesada desvelado en la Tabla 1 puede ser coexpresado con cualquier cadena ligera desvelada para crear un anticuerpo anti-FcRn funcional. Además, un dominio variable de la cadena pesada con afinidad madurada puede emparejarse con un dominio variable de la cadena ligera humanizado no de afinidad madurada desvelado en el presente documento, y un dominio variable de la cadena ligera con afinidad madurada puede emparejarse con un dominio variable de la cadena pesada humanizado no de afinidad madurada. Un dominio variable de la cadena pesada con afinidad madurada puede emparejarse con un dominio variable de la cadena ligera humanizado. Por tanto, la Tabla 1 expone CDR de cadena pesada en Vh1 y CDR de cadena ligera en Vk1 y Vk2. Las CDR de cadena pesada también son compatibles con, por ejemplo, las regiones estructurales Vh2, Vh3 y Vh4 desveladas en el presente documento (véase la Fig. 1). Las CDR de cadena ligera también son compatibles con, por ejemplo, las regiones estructurales V^k3 y V^k5 desveladas en el presente documento (véase la Fig. 2). Como se usa en el presente documento, las designaciones Vh1, Vh2, Vh3, Vh4, V^k1, V^k2, Y^k3, V^k5 se refieren a regiones estructurales humanizadas a modo de ejemplo desveladas en el presente documento, y no son referencias a familias de genes de la estirpe germinal humana. Será evidente que cualquier dominio variable de la cadena pesada o cadena ligera desvelado en el presente documento se puede combinar con una biblioteca de dominios variables complementarios y cribar para identificar nuevos anticuerpos que tienen características de unión mejoradas o alteradas.

En el presente documento se desvelan anticuerpos y porciones de unión al antígeno que son similares, pero no idénticos a, los desvelados en la Tabla 1. Los anticuerpos pueden tener una o más sustituciones, deleciones, inserciones y/o adiciones de aminoácidos. Un anticuerpo contra FcRn puede comprender un dominio variable de la cadena pesada que es al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % idéntico a un dominio variable de la cadena pesada expuesto en la Tabla 1. Un anticuerpo contra FcRn puede comprender un dominio variable de la cadena ligera que es al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % idéntico a un dominio variable de la cadena ligera expuesto en la Tabla 1. Un anticuerpo puede comprender un dominio variable de la cadena pesada expuesto en la Tabla 1 o un dominio variable de la cadena pesada que es al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % idéntico a un dominio variable de la cadena pesada expuesto en la Tabla 1 y un dominio variable de la cadena ligera expuesto en la Tabla 1 o un dominio variable de la cadena ligera que es al menos 85 %, al menos 90 % o al menos 95 % idéntico a un dominio variable de la cadena ligera expuesto en la Tabla 1.

Según la divulgación, un anticuerpo contra FcRn puede contener un dominio variable de la cadena pesada que comprende secuencias de CDR, es decir, CDR1H, CDR2H y CDR3H, expuestos en la Tabla 1 y una región estructural (es decir, FW1, FW2, FW3 y FW4) de VH1, VH₂, VH3 o VH4 o una región estructural que es al menos 85 %, 90 % o 95 % idéntica a una región estructural de Vh1, Vh2, Vh3 o Vh4. Un anticuerpo contra FcRn puede contener un dominio variable de la cadena pesada que comprende secuencias de CDR expuestas en la Tabla 1 y regiones estructurales de forma que la secuencia del dominio variable de la cadena pesada sea al menos 85 % o al menos 90 % o al menos 95 % idéntico a un dominio variable expuesto en la Tabla 1.

Como se desvela adicionalmente en el presente documento, un anticuerpo contra FcRn puede contener un dominio variable de la cadena ligera que comprende las secuencias de CDR, es decir, CDR1L, CDR2L y CDR3L, expuestas en la Tabla 1 y una región estructural (es decir, FW1, FW2, FW3 y FW4) de V^k1, V^k2, V^k3 o V^k5 o una región estructural que es al menos 85 %, 90 % o 95 % idéntica a una región estructural de Vk1, Vk2, Vk3 o Vk5. Un anticuerpo contra FcRn puede contener un dominio variable de la cadena ligera que comprende las secuencias de CDR expuestas en la Tabla 1 y regiones estructurales de forma que la secuencia del dominio variable de la cadena ligera sea al menos 85 % o al menos 90 % o al menos 95 % idéntica a un dominio variable de la cadena ligera expuesto en la Tabla 1.

Como se desvela adicionalmente en el presente documento, un anticuerpo contra FcRn puede contener un dominio variable de la cadena pesada que comprende las secuencias de CDR, es decir, CDR1H, CDR2H y CDR3H, expuestas en la Tabla 1 y una región estructural (es decir, FW1, FW2, FW3, y FW4) de Vh1, Vh2, Vh3 o Vh4 o una región estructural que es al menos 85 %, 90 % o 95 % idéntica a una región estructural de Vh1, Vh2, Vh3 o Vh4, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende V^k1, V^k2, V^k3 o V^k5 o una secuencia que es al menos 85 %, 90 % o 95 % idéntica a Vk1, Vk2, Vk3 o Vk5.

"Identidad" se refiere al número o porcentaje de posiciones idénticas compartidas por dos secuencias del aminoácido o de ácidos nucleicos, teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que se necesita introducir para el alineamiento óptimo de las dos secuencias.

Si se describe que una secuencia de aminoácidos es al menos 85 % o al menos 90 % o al menos 95 % idéntica a otra secuencia de aminoácidos, las secuencias de aminoácidos se pueden diferenciar por sustituciones conservativas (incluyendo donde todas las sustituciones son sustituciones conservativas).

Las sustituciones de aminoácidos se pueden hacer, en algunos casos, seleccionando sustituciones que no se diferencian significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto de péptido en el área de la sustitución, (b) la carga o hidrofobia de la molécula en el sitio diana; o (c) la mayor parte de la cadena lateral. Por ejemplo, los residuos naturales se pueden dividir en grupos basándose en las propiedades de las cadenas laterales; (1) aminoácidos hidrófobos (metionina, alanina, valina, leucina e isoleucina); (2) aminoácidos hidrófilos neutros (cisteína, serina y treonina); (3) aminoácidos ácidos (ácido aspártico y ácido glutámico); (4) aminoácidos básicos (asparagina, glutamina, histidina, lisina y arginina); (5) aminoácidos que influyen en la orientación de la cadena (glicina y prolina); y (6) aminoácidos aromáticos (triptófano, tirosina y fenilalanina). Las sustituciones hechas dentro de estos grupos se pueden considerar sustituciones conservativas. Los ejemplos de sustituciones incluyen, sin limitación, sustitución de alanina por valina, arginina por lisina, asparagina por glutamina, ácido aspártico por ácido glutámico, cisteína por serina, glutamina por asparagina, ácido glutámico por ácido aspártico, glicina por prolina, histidina por arginina, isoleucina por leucina, leucina por isoleucina, lisina por arginina, metionina por leucina, fenilalanina por leucina, prolina por glicina, serina por treonina, treonina por serina, triptófano por tirosina, tirosina por fenilalanina y/o valina por leucina.

Están disponibles públicamente métodos y programas informáticos para determinar la similitud de secuencias, que incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programas GCG (Devereux et al., Nucleic Acids Research 12: 387, 1984), BLASTP, BLASTN, FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403 (1990) y el programa ALIGN (versión 2.0). También se puede usar el bien conocido algoritmo de Smith Waterman para determinar la similitud. El programa BLAST está públicamente disponible de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, et al., NCBI N^lM NIH, Bethesda, Md.

20894; BLAST 2.0 en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/). En la comparación de secuencias, estos métodos explican diversas sustituciones, deleciones y otras modificaciones.

Como se usa en el presente documento, el término "regiones determinantes de la complementariedad" (CDR, es decir, CDR1, CDR2 y CDR3) se refiere a los residuos de aminoácidos de un dominio variable de anticuerpo cuya presencia es necesaria para la unión al antígeno. Cada dominio variable tiene normalmente tres regiones CDR identificadas como CDR1, CDR2 y CDR3. Cada región determinante de la complementariedad puede comprender residuos de aminoácidos de una "región determinante de la complementariedad" como se define por Kabat (es decir, aproximadamente los residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 31 -35

(H1), 50-65 (H₂) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada. Asimismo, las "regiones estructurales"

(FW) comprenden los aminoácidos 1-23 (FW1), 35-49 (FW2), 57-88 (FW3) y 98-107 (FW4) en el dominio variable de la cadena ligera y 1-30 (FW1), 36-49 (F^w2), 66-94 (FW3) y 103-113 (FW4) en el dominio variable de la cadena pesada, teniendo en cuenta el sistema de numeración de Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,

5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987, 1991)).

Las designaciones de residuos de Kabat no siempre corresponden directamente con la numeración lineal de los residuos de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales que en la estricta numeración de Kabat correspondiente a un acortamiento de, o inserción en, un componente estructural, ya sea la región estructural o la región determinante de la complementariedad (CDR), de la estructura del dominio variable básico. La correcta numeración de Kabat de residuos se puede determinar para un anticuerpo dado por alineación de residuos de homología en la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat "estándar".

Como se usa en el presente documento, "dominio variable de anticuerpo" se refiere a las porciones de las cadenas ligeras y pesadas de moléculas de anticuerpo que incluyen secuencias de aminoácidos de regiones determinantes de la complementariedad (CDR; es decir, CDR1, CDR2 y CDR3) y regiones estructurales (FR). Vh se refiere al dominio variable de la cadena pesada. V^lse refiere al dominio variable de la cadena ligera.

Los anticuerpos son proteínas que reconocen y se unen a un antígeno específico o sustancia. En realizaciones preferidas, los anticuerpos o porciones de unión al antígeno expuestos en el presente documento se unen a FcRn al menos tan fuertemente como el ligando natural (es decir, Fc de IgG). La afinidad, representada por la constante de equilibrio para la disociación de un antígeno con un anticuerpo (Kd), mide la fuerza de unión entre un determinante antigénico y un sitio de unión al anticuerpo. La afinidad de un anticuerpo por un antígeno se puede determinar por el uso de una medición de resonancia de la energía de plasmones superficiales adecuada. Dicha medición podría ser el ensayo BIACORE® descrito en la publicación de la solicitud de patente internacional WO 2005/012359 y en cualquier parte en el presente documento. Otros métodos de determinación de la afinidad incluyen enzimoinmunoanálisis de adsorción o ensayos de competición, tales como radioinmunoensayos.

La avidez es la medida de la fuerza de unión entre un anticuerpo con su antígeno. La avidez está relacionada con tanto la afinidad entre un determinante antigénico y un sitio de unión al antígeno en el anticuerpo, como el número de sitios de unión (valencia) por anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo monovalente (por ejemplo, Fab o scFv) tiene un sitio de unión para un epítope particular. Un anticuerpo IgG tiene dos sitios de unión al antígeno. Valores de K típicos

(la inversa de la constante de disociación Kd) son 105 a 1011 litros/mol. Se considera que cualquier K inferior a

104 litros/mol indica unión que no es específica.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos o porciones de unión al antígeno de los mismos se unen a la porción de unión a Fc de FcRn humano con una Kd de 105 a 1012 litros/mol, 106 a 1012 litros/mol, 107 a 1012 litros/mol, 108 a

1012 litros/mol, 109 a 1012 litros/mol, 1010 a 1012 litros/mol o 1011 a 1012 litros/mol. En otras realizaciones, los anticuerpos o porciones de unión al antígeno de los mismos se unen a la porción de unión a Fc de FcRn humano con una Kd de 105 a 1011 litros/mol, 106 a 1011 litros/mol, 107 a 1011 litros/mol, 108 a 1011 litros/mol, 109 a 10 1010 a 1011 litros/mol. En otras realizaciones, los anticuerpos o porciones de unión al antígeno de los mismos se unen a la porción de unión a Fc de FcRn humano con una Kd de 105 a 1010 litros/mol, 106 a 1010 litros/mol, 107 a

1010 litros/mol, 108 a 1010 litros/mol o 109 a 1010 litros/mol. En otras realizaciones, los anticuerpos o porciones de unión al antígeno de los mismos se unen a la porción de unión a Fc de FcRn humano con una Kd de 105 a 108 litros/mol,

106 a 108 litros/mol o 107 a 108 litros/mol.

Para minimizar la inmunogenicidad cuando se administran a un humano, los anticuerpos o porciones de unión al antígeno de los mismos expuestos en el presente documento incluyen preferentemente dominios constantes humanos.

Por lo tanto, los anticuerpos pueden ser de cualquier isotipo o subtipo, que incluye, pero no se limitan a, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgG4, IgM, IgA, IgD o IgE. La clase de anticuerpo se puede seleccionar para optimizar funciones efectoras

(por ejemplo, para aumentar o reducir la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC)). En ciertas realizaciones, la región constante (es decir, CH1, CH2, CH3 y/o la región bisagra) se modifica, por ejemplo, para aumentar o disminuir la unión a un receptor de Fc. En ciertas realizaciones, el dominio constante se modifica para promover o estabilizar la unión cadena pesada-cadena pesada. En ciertas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo IgG4 y la región bisagra de las cadenas pesadas se modifica cambiando la serina en la posición 241 a prolina, que conduce una prolongación de la semivida en suero (Angal et al., 1993, Mol.

Immunol. 30:105-108). En ciertas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo IgG⁴y las lisinas carboxiterminales en la posición 478 de las cadenas pesadas están delecionadas. En algunas realizaciones, el anticuerpo IgG⁴tiene tanto las modificaciones S241P como carece de las lisinas carboxiterminales.

En ciertas realizaciones, se proporcionan fragmentos de anticuerpos que se unen a FcRn. Un Fv es el fragmento más pequeño que contiene un dominio variable de la cadena pesada y ligera completo, que incluye los seis bucles hipervariables (CDR). Al carecer de dominios constantes, los dominios variables están no covalentemente asociados. Las cadenas pesadas y ligeras se pueden conectar en una única cadena de polipéptidos (una "Fv de cadena única" o "scFv") usando un conector que permite que los dominios V^hy V^lse asocian para formar un sitio de unión al antígeno. Véase, por ejemplo, Bird et al., 1988, Science 242:423 y Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879. En una realización, el conector es (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)³. Puesto que los fragmentos scFv carecen de los dominios constantes de anticuerpos completos, son considerablemente más pequeños que los anticuerpos completos. Los fragmentos scFv también están libres de interacciones de dominios constantes de las cadenas ligeras con otras moléculas biológicas que pueden desearse en ciertas realizaciones.

"Anticuerpos", como se usa en el presente documento, se refiere a monómeros, así como a multímeros. Se pueden usar anticuerpos intactos, que incluyen multímeros o fragmentos de anticuerpos que llevan regiones de unión al antígeno de anticuerpos. Las regiones de unión al antígeno incluyen, sin limitación, fragmentos Fv, scFv, Fab, Fab' y F(ab')₂. Se conocen bien en la técnica los métodos de preparación de fragmentos de anticuerpos. Por ejemplo, se pueden preparar fragmentos Fab monovalentes, que carecen de la región bisagra de la cadena pesada, a partir de inmunoglobulina completa por digestión proteolítica con papaína. Los fragmentos bivalentes F(ab')₂, que retienen la región bisagra de la cadena pesada, se pueden preparar por digestión proteolítica con pepsina.

También se pueden usar fragmentos de un anticuerpo que contiene Vh, Vl y opcionalmente Cl, Ch1, u otros dominios constantes. Dichos fragmentos también pueden ser producidos recombinantemente. Se conocen en la técnica muchos otros fragmentos de anticuerpos de unión al antígeno útiles, e incluyen, sin limitación, diacuerpos, triacuerpos, anticuerpos de un solo dominio, y otras formas monovalentes y multivalentes.

Se proporcionan además proteínas de unión al antígeno multivalentes, que puede estar en la forma de anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, y proteínas que comprenden todas las porciones de unión al antígeno de anticuerpos. Las proteínas de unión al antígeno multivalentes pueden ser monoespecíficas, biespecíficas o multiespecíficas. El término especificidad se refiere al número de diferentes tipos de determinantes antigénicos a los que se puede unir una molécula particular. Si una molécula de inmunoglobulina se une a solo un tipo de determinante antigénico, la molécula de inmunoglobulina es monoespecífica. Si la molécula de inmunoglobulina se une a diferentes tipos de determinantes antigénicos, entonces la molécula de inmunoglobulina es multiespecífica.

En una realización, un anticuerpo monocatenario multivalente incluye un fragmento de la cadena ligera variable unido a un fragmento de la cadena pesada variable (similar a un scFv), que se une además por otro conector peptídico a al menos otro dominio de unión al antígeno. Normalmente, el conector peptídico está compuesto por aproximadamente quince residuos de aminoácidos. En una realización preferida, el número de dominios Vl y Vh es equivalente. Por ejemplo, un anticuerpo monocatenario bivalente se puede representar del siguiente modo: V^l-L¹-V^h-L²-V^l-L³-V^ho V^l-L1-Vh -L2-VH-L3-VL o Vh-L¹-Vl-L²-Vh-L³-Vl o Vh -L1-VL-L2 -VL-L3-VH. Los anticuerpos monocatenarios multivalentes que son trivalentes o superior tienen uno o más fragmentos de anticuerpos unidos a un anticuerpo monocatenario bivalente mediante conectores peptídicos adicionales. Un ejemplo de un anticuerpo monocatenario trivalente es: V^l-L1-V^h-L2-Vl-L1-Vh -L2-VL-L1-VH.

Dos anticuerpos monocatenarios se pueden combinar para formar un diacuerpo, también conocido como dímero bivalente. Véanse, por ejemplo, la solicitud de patente europea 0404 097 o Hollinger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444. Los diacuerpos tienen dos cadenas. Cada cadena del diacuerpo incluye un dominio V^hconectado a un dominio Vl por un conector corto de aproximadamente 5-10 residuos de aminoácidos, por ejemplo, (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser), (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₂. Dichos conectores son lo suficientemente cortos para prevenir el emparejamiento intracatenario entre dominios en la misma cadena, conduciendo así al emparejamiento intercatenario entre dominios complementarios en diferentes cadenas y recrear dos sitios de unión al antígeno. La estructura de diacuerpo es compacta, con sitios de unión al antígeno en extremos opuestos de la molécula.

Las variantes de la secuencia de la región estructural V^hy V^ly los anticuerpos con afinidad madurada se pueden someter a un ensayo preclínico ex vivo para evaluar la posible inmunogenicidad. Dicho ensayo es EPISCREEN™ , que proporciona una tecnología eficaz para predecir la inmunogenicidad de linfocitos T por cuantificación de respuestas de linfocitos T a terapéuticos de proteína. El ensayo usa una cohorte de donantes de sangre cuidadosamente seleccionados basándose en los haplotipos de la clase II del MHC para presentar mejor el número y la frecuencia de alotipos de HLA-DR expresados en la población mundial. El ensayo proporciona un método por el que la inmunogenicidad de proteínas completas se puede evaluar tanto en términos de magnitud como de frecuencia de respuestas de linfocitos T (Jones et al., J Interferon Cytokine Res. 200424(9):560-72; Jones et al., J Thromb Haemost.

20053(5):991-1000).

Los anticuerpos que compiten con o bloquean de forma cruzada la unión de un anticuerpo desvelado en el presente documento con FcRn o que ellos mismos son bloqueados de forma cruzada de la unión de FcRn por un anticuerpo desvelado en el presente documento, se pueden usar en los métodos de bloqueo de la actividad de FcRn desvelados en el presente documento. En algunos casos, estos anticuerpos de competición, de bloqueo cruzado o bloqueados de forma cruzada se unen a un epítope de FcRn que limita y/o solapa con el epítope unido por un anticuerpo descrito en el presente documento. En algunos casos, estos anticuerpos de competición, de bloqueo cruzado o bloqueados de forma cruzada won anticuerpos quiméricos, completamente humanos o humanizados que se unen a un epítope de FcRn que es el mismo que el epítope unido por un anticuerpo descrito en el presente documento.

Los estos anticuerpos de competición, de bloqueo cruzado y bloqueados de forma cruzada se pueden identificar usando cualquier método adecuado conocido en la técnica, que incluye ELISA de competición o ensayos BIACORE®, donde la unión del anticuerpo de competición o anticuerpo bloqueante cruzado a FcRn humano previene la unión de un anticuerpo desvelado en el presente documento o vice versa.

Como se desvela en el presente documento, el anticuerpo de competición o bloqueante de forma cruzada puede ser un anticuerpo que bloquea la unión de IgG humana a FcRn humano y que compite con o bloquea de forma cruzada la unión de un anticuerpo que tiene una secuencia de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, y SEQ ID NO:58 y una secuencia de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:67 y SEQ ID NO:70. Por ejemplo, la competición o el bloqueo cruzado es superior al 80 %, superior al 85 %, superior al 90 % o superior al 95 %.

Como se desvela en el presente documento, el anticuerpo de competición o bloqueante de forma cruzada puede ser un anticuerpo que bloquea la unión de IgG humana a FcRn humano y que compite con o bloquea de forma cruzada la unión de un anticuerpo que tiene una secuencia de la cadena pesada de SEQ ID NO:56 y una secuencia de la cadena ligera de SEQ ID NO:22. Por ejemplo, la competición o el bloqueo cruzado es superior al 80 %, superior al 85 %, superior al 90 % o superior al 95 %.

Como se desvela en el presente documento, el anticuerpo de competición o bloqueante de forma cruzada puede ser un anticuerpo que bloquea la unión de IgG humana a FcRn humano y cuya unión a FcRn es competida con o bloqueada de forma cruzada por un anticuerpo que tiene una secuencia de la cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56 y SEQ ID NO:58 y una secuencia de la cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:67 y SEQ ID NO:70. Por ejemplo, el anticuerpo de competición o bloqueante de forma cruzada es competido con o bloqueado de forma cruzada más del 80 %, más del 85 %, más del 90 % o más del 95 %.

Como se desvela en el presente documento, el anticuerpo de competición o bloqueante de forma cruzada puede ser un anticuerpo que bloquea la unión de IgG humana a FcRn humano y cuya unión a FcRn es competida con o bloqueada de forma cruzada por un anticuerpo que tiene una secuencia de la cadena pesada de SEQ ID NO:56 y una secuencia de la cadena ligera de SEQ ID NO:22. Por ejemplo, el anticuerpo de competición o bloqueante de forma cruzada es competido con o bloqueado de forma cruzada más del 80 %, más del 85 %, más del 90 % o más del 95 %.

Como se desvela en el presente documento, los anticuerpos de competición, bloqueantes de forma cruzada o bloqueados de forma cruzada pueden ser quiméricos, completamente humanos o están humanizados. Por ejemplo, los anticuerpos de competición, bloqueantes de forma cruzada o bloqueados de forma cruzada se unen al sitio de unión de Fc de FcRn humano con una afinidad de 105 a 1011 litros/mol, 106 a 1011 litros/mol, 107 a 1011 litros/mol, 108 a 1011 litros/mol, 109 a 1011 litros/mol o 1010 a 1011 litros/mol.

En el presente documento también se proporcionan ácidos nucleicos que codifican anticuerpos anti-FcRn y fragmentos funcionales de los mismos, vectores, células hospedadoras y sistemas de expresión según la invención. Los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos anti-FcRn y fragmentos funcionales de los mismos pueden ser, por ejemplo, ADN, ADNc, ARN, ADN o ARN sintéticamente producido o una molécula quimérica recombinantemente producida del ácido nucleico que comprende cualquiera de los polinucleótidos, tanto solos como en combinación. Por ejemplo, se proporcionan vectores de expresión que contienen una secuencia de polinucleótidos que codifica un anticuerpo anti-FcRn según la invención unido operativamente a secuencias de control de la expresión adecuadas para la expresión en una célula hospedadora eucariota y/o procariota. Se ha desarrollado una variedad de vectores de expresión para la eficiente síntesis de anticuerpos y se han desarrollado fragmentos en células procariotas, tales como bacterias y sistemas eucariotas, que incluyen, pero no se limitan a, levadura y sistemas de cultivo celular de mamífero. Los vectores pueden comprender segmentos de secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético.

Se puede usar cualquier vector de expresión adecuado. Por ejemplo, los vectores de clonación procariotas incluyen plásmidos de E. coli, tales como colEI, pCR1, pBR322, pMB9, pUC, pKSM y RP4. Los vectores procariotas también incluyen derivados de ADN de fago, tales como M13 y otros fagos filamentosos de ADN monocatenario. Un ejemplo de un vector útil en levadura es el plásmido 2p. Vectores adecuados para la expresión en células de mamífero incluyen derivados de SV40 bien conocidos, adenovirus, secuencias de ADN derivadas de retrovirus y vectores lanzadera derivados de una combinación de vectores funcionales de mamífero, tales como los descritos anteriormente, y plásmidos funcionales, por ejemplo, pLenti6.3/V5-DEST®, pT-Rex™-DEST31®, pGene/V 5-HispGene/V 5-His® (Life Technologies, Norwalk, CT).

Se conocen en la técnica vectores de expresión eucariotas adicionales (por ejemplo, P.J. Southern y P. Berg, J. Mol. Appl. Genet., 1,327-341 (1982); Subramani et al., Mol. Cell. Biol., 1: 854-864 (1981); Kaufmann y Sharp, "Amplification And Expression of Sequences Cotransfected with a Modular Dihydrofolate Reductase Complementary DNA Gene," J. Mol. Biol. 159, 601 -621 (1982); Kaufmann y Sharp, Mol. Cell. Biol. 159, 601 -664 (1982); Scahill et al., "Expression And Characterization Of The Product Of A Human Immune Interferon DNA Gene In Chinese Hamster Ovary Cells," Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 80, 4654-4659 (1983); Urlaub y Chasin, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 77, 4216-4220, (1980).

Los vectores de expresión pueden contener al menos una secuencia de control de la expresión que está unida operativamente a la secuencia de ADN o fragmento a expresar. La secuencia de control se inserta en el vector para controlar y regular la expresión de la secuencia de ADN clonada. Los ejemplos de secuencias de control útiles de la expresión son el sistema lac , el sistema trp , el sistema tac , el sistema trc , regiones operadoras y promotoras principales de fago lambda, la región de control de la proteína de la envoltura fd, los promotores glicolíticos de levadura, por ejemplo, el promotor para la 3-fosfoglicerato cinasa, los promotores de levadura fosfatasa ácida, por ejemplo, Pho5, los promotores de los factores de apareamiento alfa de levadura y promotores derivados de citomegalovirus, polioma, adenovirus, retrovirus y virus simio, por ejemplo, los promotores temprano y tardío o SV40, y otras secuencias que se sabe que controlan la expresión de genes de células procariotas o eucariotas y sus virus o combinaciones de los mismos. Otras secuencias de control de la expresión que se pueden usar incluyen secuencias reguladoras de ADN del gen del factor-1a de elongación de hámster chino (CHEF1) (Running Deer & Allison, 2004, Biotechnol. Prog.

20:880-889; patente de EE. UU. N.25.888.809).

También se proporcionan células hospedadoras recombinantes que contienen los vectores de expresión previamente descritos. Los anticuerpos o porciones de unión al antígeno de los mismos expuestos en el presente documento se pueden expresar en estirpes celulares distintas de en hibridomas. Se pueden usar ácidos nucleicos, que comprenden una secuencia que codifica un polipéptido como se describe en el presente documento, para la transformación de una célula hospedadora de mamífero adecuada.

Se seleccionan estirpes celulares de preferencia particular basándose en el elevado nivel de expresión, expresión constitutiva de proteína de interés y contaminación mínima de proteínas hospedadoras. Las estirpes celulares de mamífero disponibles como hospedadores para la expresión se conocen bien en la técnica e incluyen muchas estirpes celulares inmortalizadas, tales como, pero no se limitan a, células NS0, células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón de hámster bebé (BHK) y muchas otras. En algunas realizaciones, la célula es una célula de mieloma, por ejemplo, SP2/0, que se pueden transfectar y cultivar en cultivo en la cavidad peritoneal de un ratón donde elevadas concentraciones de IgG se pueden recuperar de líquido ascítico. Células eucariotas adicionales adecuadas incluyen levadura y otros hongos. Hospedadores procariotas útiles incluyen, por ejemplo, E. coli, tal como SG-936 de E. coli, HB 101 de E. coli, W3110 de E. coli, X1776 de E. coli, X2282 de E. coli, DHI de E. coli y MRCI de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, tales como Bacillus subtilis, y Streptomyces.

Estas células hospedadoras recombinantes presentes se pueden usar para producir un anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo, cultivando las células en condiciones que permitan la expresión del anticuerpo o fragmento del mismo y la purificación del anticuerpo o fragmento del mismo de la célula hospedadora o medio que rodea a la célula hospedadora. Por lo tanto, se proporciona un método para la producción de un anticuerpo capaz de unirse a la región de unión a Fc de FcRn, comprendiendo dicho método: (a) cultivar una célula hospedadora como se ha descrito anteriormente; y (b) aislar dicho anticuerpo de la célula hospedadora o el medio de cultivo de la célula hospedadora.

Los hospedadores transformados se pueden cultivar en fermentadores y cultivar según técnicas conocidas en la técnica. Una vez se alcanzar el nivel de expresión deseado de los anticuerpos, los anticuerpos se pueden purificar según procedimientos convencionales de la técnica, que incluyen precipitación con sulfato de amonio, purificación en columnas de afinidad, cromatografía en columna, electroforesis en gel y similares. Para su uso en los métodos terapéuticos descritos en el presente documento, se prefiere que los anticuerpos se purifiquen a una pureza de al menos el 90 %, 95 %, 98 % o 99 %.

El direccionamiento del anticuerpo expresado o fragmento para la secreción en las células hospedadoras recombinantes se puede facilitar insertando una secuencia codificante de péptidos conductores señalizadores o secretores (véase, Shokri et al., Appl Microbiol Biotechnol. 60(6):654-64 (2003), Nielsen et al., Prot. Eng. 10: 1-6 (1997) y von Heinje et al., Nucl. Acids Res. 14:4683-4690 (1986)) en el extremo 5' del gen codificante de anticuerpos de interés. Estos elementos de péptido conductor secretor pueden derivar de secuencias procariotas o eucariotas. Por consiguiente, adecuadamente, se usan péptidos conductores secretores, que son aminoácidos unidos al extremo aminoterminal de un polipéptido para dirigir el movimiento del polipéptido fuera del citosol de la célula hospedadora y secreción en el medio.

Los anticuerpos o porciones de unión al antígeno de los mismos se pueden fusionar con residuos de aminoácidos adicionales. Dichos residuos de aminoácidos pueden ser una marca de péptido, quizás para facilitar el aislamiento. También se contemplan otros residuos de aminoácidos para la migración dirigida de los anticuerpos a órganos o tejidos específicos.

El anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo se puede conjugar con una o más moléculas efectoras, que proporcionan alguna propiedad deseable (por ejemplo, elevada semivida en suero) al anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo. El anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo se puede conjugar con polietilenglicol (PEG). El PEG se puede fijar a cualquier cadena lateral de aminoácido o grupo funcional de aminoácido terminal, por ejemplo, un grupo amino libre, imino, tiol, hidroxilo o carboxilo. Se conocen en la técnica métodos de fijación de PEG a anticuerpos y se pueden emplear. Véanse, por ejemplo, la solicitud de patente europea EP 0948544; la solicitud de patente europea EP1090037; "Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, Nueva York; "Poly( ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris & S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC; "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam & A. Dent, Grove Publishers, New York; o Chapman, A.

2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545.

En otra realización, un anticuerpo o porción de unión al antígeno según la invención es prepara expresando un ácido nucleico que codifica el anticuerpo en un animal transgénico, de forma que el anticuerpo se exprese y pueda ser recuperado. Por ejemplo, el anticuerpo se puede expresar en un modo específico de tejido que facilita la recuperación y purificación. En dicha realización, un anticuerpo se expresa en la glándula mamaria para la secreción durante la lactación. Los animales transgénicos incluyen, pero no se limitan a, ratones, cabra y conejo.

En el presente documento se desvelan métodos de identificación de anticuerpos que se unen a FcRn tanto a pH ácido como a pH fisiológico. Los métodos comprenden dos o más etapas de cribado que se llevan a cabo a pH ácido (por ejemplo, pH 5,0-6,6, pH 5,8-6,4, pH 6,0-6,2 o pH 6,0). Las dos o más etapas de cribado ácido se alternan con etapas de cribado llevada a cabo a pH fisiológico (por ejemplo, pH 6,8-8,2, pH 6,8-7,6, pH 7,2-7,4 o pH 7,4).

Por ejemplo, dichos métodos comprenden:

(b) poner en contacto los anticuerpos aislados de la etapa (a) con FcRn o una porción de los mismos a pH 6,8 7,6 y aislar los anticuerpos que se unen a FcRn o una porción de los mismos;

Otro ejemplo comprende:

(a) proporcionar un conjunto de candidatos a anticuerpos de unión a FcRn;

(b) poner en contacto el conjunto de candidatos a anticuerpos de unión a FcRn con FcRn o una porción de los mismos a pH 6,0 en condiciones tales que se formen complejos entre FcRn o una porción del mismo y al menos algunos de los candidatos a anticuerpos de unión a FcRn;

(c) aislar los complejos;

(d) separar los candidatos a anticuerpos de unión a FcRn de los complejos aislados;

(e) poner en contacto los candidatos a anticuerpos de unión a FcRn separados de la etapa (d) con FcRn o una porción de los mismos a pH 7,4 en condiciones tales que se formen los complejos entre el FcRn o una porción del mismo y al menos algunos de los candidatos a anticuerpos de unión a FcRn;

(f) aislar los complejos formados en la etapa (e);

(g) separar los candidatos a anticuerpos de unión a FcRn de los complejos aislados de la etapa (f);

(h) poner en contacto los candidatos a anticuerpos de unión a FcRn separados de la etapa (g) con FcRn o una porción de los mismos a pH 6,0 en condiciones tales que se formen complejos entre el FcRn o una porción del mismo y al menos algunos de los candidatos a anticuerpos de unión a FcRn;

(i) aislar los complejos formados en la etapa (h);

(j) separar los candidatos a anticuerpos de unión a FcRn de los complejos aislados de la etapa (i) para obtener anticuerpos que se unen FcRn tanto a pH ácido como a pH fisiológico.

El conjunto de candidatos a anticuerpos de unión a FcRn puede ser una biblioteca de anticuerpos o porciones de la misma (por ejemplo, una biblioteca de scFv presentada en fago).

La concentración de FcRn o una porción del mismo se puede disminuir en cada etapa de puesta en contacto. Por ejemplo, la etapa (b) se puede llevar a cabo a una concentración de 25 nM, la etapa (e) se puede llevar a cabo a una concentración de 2,5 nM y la etapa (h) se puede llevar a cabo a una concentración de 0,25 nM.

El FcRn o una porción del mismo se puede fijar a un soporte sólido, por ejemplo, una perla magnética. En dichos ejemplos, las etapas de aislamiento pueden ser simplemente la unión de los anticuerpos al FcRn o una porción de los mismos fijada al soporte sólido, por ejemplo, cuando el soporte sólido es una columna de cromatografía. El FcRn o una porción del mismo se puede fijar a un resto que facilita el aislamiento de los complejos entre FcRn o una porción del mismo y los anticuerpos. Por ejemplo, el FcRn o una porción del mismo se puede fijar a biotina.

Las propiedades físicas y funcionales de los anticuerpos o porciones de unión al antígeno de los mismos como se exponen en el presente documento se pueden determinar por procedimientos rutinarios. Por ejemplo, la capacidad de un anticuerpo para bloquear la actividad de FcRn se puede evaluar por varios métodos. Una forma es mostrando la unión competitiva con un anticuerpo que se sabe que se une a la región de unión a Fc de FcRn. Otra es mostrando la protección de la Ig sérica del catabolismo. Véase, por ejemplo, Akiles et al., 2007, J. Immunol. 179:4580-88. Otra forma es medir la capacidad de FcRn para recircular o transcitosar los anticuerpos en presencia de un agente de prueba. Por ejemplo, Claypool et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:28038-50 usaron las células de riñón canino de Madin-Darby (MDCK) transfectadas para expresar FcRn humano y p²m para demostrar la transcitosis de IgG. Otras estirpes celulares epiteliales polarizadas adecuadas que expresan FcRn endógenamente incluyen las estirpes celulares epiteliales intestinales humanas T84 y Caco-2. En los ejemplos, se proporciona un método de ensayo para determinar la capacidad de anticuerpos o porciones de unión al antígeno de los mismos, como se expone en el presente documento, para unirse a FcRn e inhibir la presentación de antígenos por MHC de clase II y la presentación cruzada por MHC de clase I.

En el presente documento se desvela un ensayo basado en sangre completa para determinar la capacidad de un anticuerpo anti-FcRn para modular el procesamiento de complejos inmunitarios (IC). FcRn funciona uniéndose a IgG monomérica y desviándola del catabolismo, prolongando así su semivida en suero. La IgG multimérica o IC antígenoanticuerpo, por otra parte, interactúa con FcRn activando la producción de citocinas y dirigiendo los IC en las vías de presentación de antígenos. Una función importante de FcRn es la regulación de las funciones inmunitarias mediadas por células, supuestamente por captación, procesamiento y presentación de IC que contienen IgG. La activación de la producción de citocinas asociada a este aspecto de la biología de FcRn permite el desarrollo de un ensayo basado en sangre completa para determinar la capacidad de un anticuerpo anti-FcRn para modular (por ejemplo, bloquear o disminuir) esta interacción FcRn-IC.

El ensayo puede comprender obtener sangre completa de un mamífero (por ejemplo, un humano o un primate no humano) y añadir un complejo inmunitario previamente formado a la sangre completa para estimular la producción de citocinas, en presencia o ausencia de un anticuerpo de prueba o fragmento de unión al antígeno del mismo, y medir la producción de una citocina adecuada. Si el anticuerpo de prueba o fragmento de unión al antígeno del mismo es capaz de bloquear o disminuir la cantidad de citocina medida, en comparación con la cantidad medida en ausencia del anticuerpo de prueba o fragmento de unión al antígeno del mismo, el anticuerpo de prueba o fragmento de unión al antígeno del mismo se considera capaz de interferir con la interacción entre FcRn y IC. Como control para garantizar que las citocinas medidas sean el resultado de la interacción entre FcRn y el IC, el ensayo puede ser realizado con un IC en el que las IgG son incapaces de unirse a FcRn. Dichas IgG son conocidas (véase, por ejemplo, Qiao et al., 2008, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105: 9337-9342). La realización del ensayo con dichas IgG debe dar como resultado ninguna, o muy poca, producción de citocinas.

El ensayo también se puede usar para predecir qué pacientes es probable que se beneficien de la terapia con un anticuerpo anti-FcRn o fragmento de unión al antígeno del mismo. En esta versión del ensayo, el ensayo se realiza con un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se sabe que es eficaz en bloquear o reducir la interacción entre FcRn y el IC. Los pacientes que muestran una reducción significativa de la producción de citocinas tras la realización del ensayo con el anticuerpo anti-FcRn conocido o fragmento de unión al antígeno del mismo, a diferencia de la realización del ensayo en ausencia del anticuerpo anti-FcRn conocido o fragmento de unión al antígeno del mismo, se beneficiarán más probablemente de la terapia con un anticuerpo anti-FcRn o fragmento de unión al antígeno del mismo que los pacientes que muestran menores reducciones en la producción de citocinas, o ninguna.

Otra versión de los ensayos descritos anteriormente implica administrar un anticuerpo de prueba o fragmento de unión al antígeno del mismo o un anticuerpo anti-FcRn conocido o un fragmento de unión al antígeno del mismo a un sujeto o un paciente antes de que la sangre del sujeto o paciente se obtenga para su uso en el ensayo de sangre completa. En esta versión del ensayo, un anticuerpo de prueba o fragmento de unión al antígeno del mismo o un anticuerpo anti-FcRn conocido o fragmento de unión al antígeno del mismo no se añade a la sangre completa, puesto que el anticuerpo de prueba o fragmento de unión al antígeno del mismo o anticuerpo anti-FcRn conocido o fragmento de unión al antígeno del mismo ya está presente en la sangre.

Otro uso del ensayo basado en sangre completa es monitorizar la respuesta de un paciente a terapia anti-FcRn. En este caso, el ensayo se realiza en la sangre de pacientes que han estado recibiendo un anticuerpo anti-FcRn o fragmento de unión al antígeno del mismo durante un periodo de tiempo predeterminado. Los IC preformados se añaden a la sangre y se mide la cantidad de citocinas producida. Esa cantidad se compara con la cantidad que se había producido de la misma sangre del paciente obtenida antes de empezar el tratamiento con el anticuerpo anti-FcRn o fragmento de unión al antígeno del mismo. Si la cantidad de citocina producida es menos en el ensayo cuando se realiza después de empezar el tratamiento, esto indica que el paciente está respondiendo a la terapia. Si no se observa diferencia, o una diferencia insignificativa, en la producción de citocinas para la sangre del paciente extraída antes de empezar el tratamiento, en comparación con la sangre extraída después de que el tratamiento haya estado en curso durante el periodo de tiempo predeterminado, esto indica que el paciente no está respondiendo significativamente a la terapia. En los casos en los que exista una diferencia observada, la magnitud de la diferencia es una indicación de la magnitud de la respuesta - cuanto mayor sea la diferencia, más está respondiendo el paciente a la terapia anti-FcRn. El ensayo en esta versión no implicaría añadir un anticuerpo anti-FcRn o fragmento de unión al antígeno del mismo a la sangre.

En el presente documento se desvela un método de determinación de si un anticuerpo de prueba o fragmento de unión al antígeno del mismo bloquea o disminuye la interacción entre FcRn y complejos inmunitarios que comprende:

(a) obtener sangre completa de un mamífero;

(e) añadir el complejo inmunitario a la segunda porción de la sangre completa después o al mismo tiempo que la adición del anticuerpo de prueba o fragmento de unión al antígeno del mismo;

(g) determinar la diferencia entre la primera cantidad de la citocina y la segunda cantidad de la citocina; donde si la primera cantidad de la citocina es mayor que la segunda cantidad de la citocina, el anticuerpo de prueba o fragmento de unión al antígeno del mismo bloquea o disminuye la interacción entre FcRn y complejos inmunitarios. En el presente documento se desvela un método de determinación del nivel esperado de sensibilidad de un paciente a una terapia anti-FcRn que comprende:

(a) obtener sangre completa del paciente antes de empezar la terapia anti-FcRn;

La magnitud de la diferencia entre la primera cantidad de la citocina y la segunda cantidad de la citocina, donde la primera cantidad es mayor que la segunda cantidad, indica el grado al que se espera que el paciente responda a la terapia anti-FcRn. Dependiendo de este grado de respuesta esperada, el paciente se puede seleccionar para recibir la terapia anti-FcRn.

En el presente documento se desvela un método de monitorización de la respuesta de un paciente a una terapia anti-FcRn que comprende:

(a) obtener sangre completa del paciente antes de que empiece la terapia anti-FcRn;

(b) añadir un complejo inmunitario a la sangre completa;

(d) obtener sangre completa del paciente después de que empiece la terapia anti-FcRn;

(e) añadir el complejo inmunitario a la sangre completa de la etapa (d);

La magnitud de la diferencia entre la primera cantidad de la citocina y la segunda cantidad de la citocina, donde la primera cantidad es mayor que la segunda cantidad, indica el grado al que el paciente está respondiendo a la terapia anti-FcRn. Basándose en el grado de sensibilidad observado, se puede ajustar la terapia anti-FcRn. Por ejemplo, si la primera cantidad es solo ligeramente superior a la segunda cantidad, se puede aumentar la terapia anti-FcRn. Si la terapia anti-FcRn es un anticuerpo descrito en el presente documento, la frecuencia de la administración del anticuerpo se puede aumentar y/o la dosis administrada se pueden aumentar. Tras el ajuste de la terapia, el ensayo puede ser realizado otra vez. De esta forma se puede llevar a cabo un proceso de ensayo iterativo, ajuste de terapia, ensayo, ajuste de terapia, etc., y determinar un nivel de terapia óptimo.

En los métodos anteriormente descritos, la diferencia entre la primera cantidad de la citocina y la segunda cantidad de la citocina se puede comparar con un valor de control.

En algunos de los usos médicos según la invención, el mamífero es un ser humano. En algunas realizaciones, el humano está padeciendo una enfermedad autoinmune. En algunas realizaciones, el humano está padeciendo una enfermedad autoinmune seleccionada del grupo anemia hemolítica autoinmune (AIHA) o miastenia grave (MG). Como se desvela en el presente documento, el complejo inmunitario puede ser un complejo inmunitario de antígeno antígeno-anticuerpo específico. El complejo inmunitario puede ser artificial, es decir, no ocurre naturalmente en el mamífero. Por ejemplo, el complejo inmunitario puede ser un complejo multimérico de ácido 4-hidroxi-5-yodo-3-nitrofenilacético (NIP), ovoalbúmina de pollo (OVA) y un anticuerpo anti-NIP. Una posibilidad para el anticuerpo anti-NIP es un anticuerpo IgG quimérico que contiene una región variable específica murina para ácido 4-hidroxi-5-yodo-3-nitrofenilacético y un dominio Fc de IgG¹humana no mutante (Claypool, 2004, Mol. Biol. Cell 15:1746-1759). El anticuerpo anti-NIP puede ser un anticuerpo IgG con tres mutaciones puntuales (I253A/H310A/H435A) en el dominio Fc que suprime la unión a FcRn. El complejo inmunitario puede ser un complejo NIP-OVA-anticuerpo que comprende 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 restos NIP.

Una función de los complejos inmunitarios en los ensayos descritos en el presente documento es multimerizar FcRn. Por lo tanto, el ensayo puede ser realizado con otras sustancias que son capaces de llevar a cabo esta función. Por ejemplo, se puede usar una sustancia que tiene dominios Fc apropiadamente separados. Dicha sustancia podría ser una perla de estireno recubierta con un anticuerpo que tiene un dominio Fc que es capaz de ser reconocido por FcRn o recubierto con un polipéptido que contiene dominios Fc apropiadamente separados. El anticuerpo puede ser directamente unido a la perla o un antígeno que el anticuerpo reconoce puede ser directamente unido a la perla y el anticuerpo se puede fijar a la perla en virtud del reconocimiento y unión al antígeno.

Por consiguiente, en el presente documento se desvela un método de multimerización de FcRn que comprende:

(a) obtener sangre completa de un mamífero; y

(b) añadir a la sangre completa una sustancia que tiene dominios Fc apropiadamente separados tal que se multimerice FcRn en la sangre completa.

Un anticuerpo anti-FcRn o fragmento de unión al antígeno del mismo se puede añadir a la sangre completa antes o al mismo tiempo que la sustancia.

El método puede comprender (c) medir la cantidad de una citocina en la sangre completa. La cantidad de la citocina se puede medir en ausencia y presencia de un anticuerpo anti-FcRn o fragmento de unión al antígeno y se determina la diferencia en cantidades medidas.

En los métodos anteriormente descritos, la citocina puede ser factor de necrosis tumoral-a (TNF-a), interleucina-6 (IL-6), interleucina-10 (IL-10) o interleucina-12 (IL-12). La cantidad de citocina en sangre completa se puede medir por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede medir la cantidad de proteína citocina con un anticuerpo específico para la citocina o la cantidad de transcrito de ARNm para la citocina en la sangre completa.

En el método descrito anteriormente para determinar el nivel esperado de sensibilidad de un paciente a terapia anti-FcRn, se puede generar un informe que especifica el nivel esperado de sensibilidad y/o que el paciente ha sido seleccionado para recibir terapia anti-FcRn, el informe es comunicado a un profesional sanitario y se administra una terapia anti-FcRn al paciente. Se puede generar un informe que especifica el nivel esperado de sensibilidad y/o que el paciente ha sido seleccionado para recibir terapia anti-FcRn, el informe se comunica a un médico, y el médico administra la terapia anti-FcRn o se refiere a otro profesional sanitario para administrar la terapia anti-FcRn.

En los métodos de ensayo anteriormente descritos, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo puede ser una IgG, Fab, F(ab')², diacuerpo, FV, scFV, péptido bloqueante, o un fragmento del mismo. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo puede ser un F(ab')². El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo puede comprender una región variable de la cadena pesada que tiene SEQ ID NO:56 y una región variable de la cadena ligera que tiene SEQ ID NO:22.

En el método anteriormente descrito para monitorizar la respuesta de un paciente a una terapia anti-FcRn, la terapia anti-FcRn puede ser la administración al paciente de un anticuerpo que se une a la región de unión a Fc de FcRn y bloquea o disminuye la unión de IgG a FcRn. Como se desvela en el presente documento, el anticuerpo puede ser H3Vk2, H3E8, G9Vx2 o G9E8. El anticuerpo puede comprender una CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia SEQ ID NO:49 o SEQ ID NO:55. El anticuerpo puede comprender la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO:50 o SEQ ID NO:56. En algunos casos, por ejemplo, G9Vk2, el anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada expuesta en SEO ID NO:50 y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO:22. El anticuerpo de la invención, es decir, H3V^k2, comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada expuesta en SEQ ID NO:56 y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera expuesta en SEQ ID NO:22. En algunos casos, el anticuerpo es una IgG, Fab, F(ab')², diacuerpo, FV, scFV, péptido bloqueante o un fragmento del mismo. En algunos casos, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo es F(ab')².

La cantidad de anticuerpo añadida a la sangre completa se puede determinar probando diversas cantidades y estableciendo una curva de dosis-respuesta. La cantidad de anticuerpo añadida puede ser suficiente para llevar la concentración de anticuerpo en la sangre completa a entre 1 nM y 1 μM, entre 10 nM y 750 nM o entre 100 nM y 500 nM.

En los métodos de ensayo anteriormente descritos, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo puede estar humanizado, ser quimérico o completamente humano no natural.

La región específica o epítope de FcRn humano a la que se unen los anticuerpos desvelados en el presente documento se puede identificar por cualquier método de cartografía de epítopes adecuado conocido en la técnica. Dichos métodos incluyen cribado de péptidos de longitudes variables de FcRn para su unión al anticuerpo para determinar a qué aminoácidos de FcRn se une el anticuerpo. Los péptidos se pueden producir por métodos bien conocidos, tales como digestión proteolítica de FcRn o síntesis química. Se pueden usar técnicas, tales como espectrometría de masas, para identificar péptidos que se unen al anticuerpo. Alternativamente, se puede usar espectroscopía de RMN o cristalografía de rayos X. Una vez identificados, los péptidos de unión se pueden usar como inmunógenos para obtener anticuerpos adicionales que se unen al mismo epítope de FcRn.

Se entiende que los anticuerpos anti-FcRn o porciones de unión al antígeno de los mismos expuestos en el presente documento, donde se usan en un mamífero con el fin de profilaxis o tratamiento, se administrarán en forma de una composición que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, por ejemplo, uno o más de agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, histidina, glutamato, citrato, manitol, trehalosa, sacarosa, arginina, acetato, polisorbato 80, poloxámero 188 y similares, así como combinaciones de los mismos. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden comprender además cantidades menores de sustancias auxiliares, tales como humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian la estabilidad en almacén o la eficacia de los anticuerpos.

Las composiciones que comprenden anticuerpo y vehículo farmacéuticamente aceptable se pueden liofilizar.

Las composiciones que comprenden anticuerpo y vehículo farmacéuticamente aceptable pueden comprender los anticuerpos anti-FcRn o porciones de unión al antígeno de los mismos expuestos en el presente documento a diversas concentraciones. Por ejemplo, las composiciones pueden comprender anticuerpo a 10 mg/ml a 200 mg/ml, 25 mg/ml a 130 mg/ml, 50 mg/ml a 125 mg/ml, 75 mg/ml a 110 mg/ml o 80 mg/ml a 100 mg/ml. Las composiciones también pueden comprender anticuerpo a aproximadamente 10 mg/ml, 20 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ml, 110 mg/ml, 120 mg/ml, 130 mg/ml, 140 mg/ml o 150 mg/ml.

Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento o diagnóstico in vivo se refieren a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en el método de tratamiento del cuerpo humano o animal por terapia o para diagnóstico in vivo. En los métodos descritos en el presente documento, una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o porciones de unión al antígeno del mismo expuesto en el presente documento se administra a un mamífero en necesidad del mismo. El término "administrar", como se usa en el presente documento, significa administrar los anticuerpos o porciones de unión al antígeno de los mismos expuestos en el presente documento a un mamífero por cualquier método que pueda lograr el resultado buscado. Se pueden administrar, por ejemplo, por vía subcutánea, por vía intravenosa o por vía intramuscular. Aunque los anticuerpos o porciones de unión al antígeno de los mismos expuestos en el presente documento son particularmente útiles para administración a los seres humanos, se pueden administrar a otros mamíferos también. El término "mamífero", como se usa en el presente documento, pretende incluir, pero no se limita a, seres humanos, animales de laboratorio, animales domésticos y animales de granja. "Cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de anticuerpo o porciones de unión al antígeno del mismo expuesto en el presente documento que, cuando se administra a un mamífero, es eficaz en producir el efecto terapéutico deseado. Por ejemplo, dependiendo de la enfermedad, para un anticuerpo, esto puede requerir 0,1, 1,0, 3,0, 6,0 o 10,0 mg/kg. Para una IgG que tiene una masa molecular de 150.000 g/mol (dos sitios de unión), estas dosis corresponden a aproximadamente 18 nM, 180 nM, 540 nM, 1,08 μM y 1,8 μM de sitios de unión para un volumen de sangre de 5 l.

El anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo se puede administrar al mamífero por infusión intravenosa, es decir, introducción del anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo en la vena de un mamífero durante un cierto periodo de tiempo. El periodo de tiempo puede ser aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 4 horas o aproximadamente 8 horas.

El anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo se puede administrar al mamífero por administración subcutánea, es decir, bajo la piel del mamífero, en general, pellizcando y levantando la piel lejos del tejido subyacente e inyectando el anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo en el espacio debajo la piel así formado.

Una dosis de un compuesto o una composición se puede administrar a un sujeto cada día, cada dos días, cada par de días, cada tercer día, una vez a la semana, dos veces a la semana, tres veces a la semana o una vez cada dos semanas. Dos, tres o cuatro dosis de un compuesto o una composición se pueden administrar a un sujeto cada día, cada par de días, cada tercer día, una vez a la semana o una vez cada dos semanas. Una dosis de un compuesto o una composición se puede administrar durante 2 días, 3 días, 5 días, 7 días, 14 días o 21 días. Una dosis de un compuesto o una composición se puede administrar durante 1 mes, 1,5 meses, 2 meses, 2,5 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses o más.

Los métodos de administración incluyen, pero no se limitan a, parenteral, intradérmica, intravítrea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural, oral, sublingual, intranasal, intracerebral, intravaginal, transdérmica, transmucosa, por vía rectal, por inhalación o por vía tópica, particularmente a los αdos, la nariz, los ojos o la piel. El modo de administración se deja a criterio del médico. En la mayoría de los casos, la administración producirá la liberación de un compuesto en la circulación sanguínea.

Puede ser conveniente administrar un compuesto por vía local. Esto se puede lograr, por ejemplo, y no a modo de limitación, por infusión local, administración tópica, por inyección, por medio de un catéter o por medio de un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, que incluye membranas, tales como membranas sialásticas, o fibras. En dichos casos, la administración se puede dirigir selectivamente a un tejido local sin liberación sustancial de un compuesto en la circulación sanguínea.

También se puede emplear administración pulmonar, por ejemplo, por uso de un inhalador o nebulizador, y la formulación con un agente aerosolizante, o por perfusión en un fluorocarburo o tensioactivo pulmonar sintético. Un compuesto se puede formular como un supositorio, con aglutinantes y vehículos tradicionales, tales como triglicéridos.

Un compuesto se puede administrar en una vesícula, en particular un liposoma (véase Langer, 1990, Science 249:1527 - 1533; Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Bacterial infection, Lopez-Berestein y Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353 - 365 (1989); Lopez Berestein, arriba, pp. 317 - 327; véase, en general, arriba).

Un compuesto se puede administrar en un sistema de liberación controlada (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, arriba, vol. 2, pp. 115 - 138 (1984)). Se pueden usar los ejemplos de sistemas de liberación controlada tratados en la revisión por Langer, 1990, Science 249:1527-1533. En una realización, se puede usar una bomba (véase Langer, arriba; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). Se pueden usar materiales poliméricos (véase Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger y Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; véanse también Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105).

Los programas de administración anteriormente descritos se proporcionan únicamente para fines ilustrativos. Un experto habitual en la técnica entenderá fácilmente que todas las dosis están dentro del alcance de la invención.

"Enfermedad autoinmune" se refiere a una clase de enfermedades en las que los propios anticuerpos de un sujeto reaccionan con tejido hospedador o en las que los linfocitos T efectores inmunitarios son autorreactivos con los autopéptidos endógenos y causan la destrucción de tejido. Por lo tanto, se organiza una respuesta inmunitaria contra los propios antígenos de un sujeto, denominados autoantígenos. Un "autoantígeno", como se usa en el presente documento, se refiere a un antígeno de un tejido normal del hospedador. El tejido normal de hospedador no incluye células neoplásicas.

Los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno que se unen a FcRn se pueden administrar a un sujeto para modular una respuesta inmunitaria o para tratar, prevenir o diagnosticar trastornos, tales como trastornos inmunitarios. El término "tratar" se refiere a administrar una terapia eficaz para mejorar o aliviar un trastorno o enfermedad o reducir o prevenir la progresión de un trastorno o enfermedad. Una cantidad eficaz puede variar, dependiendo de, por ejemplo, la afección o trastorno, el sujeto individual, y puede adaptarse al sujeto. Los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno que se unen a FcRn también se pueden usar in vitro.

En el presente documento se desvela un método de modulación de la interacción entre FcRn y Fc de IgG que comprende poner en contacto FcRn en una célula o en un sujeto con un anticuerpo contra FcRn o fragmento de unión al antígeno descrito en el presente documento. La modulación puede inhibir la interacción entre FcRn y Fc de IgG. Por lo tanto, se describe un método de promoción de la degradación de anticuerpos por una célula o en un sujeto. El anticuerpo puede ser un autoanticuerpo. El anticuerpo puede ser un anticuerpo terapéutico.

En el presente documento se desvela además un método de tratamiento o mejoría de una enfermedad mediada por IgG en un sujeto, que comprende administrar al sujeto un anticuerpo contra FcRn o fragmento de unión al antígeno desvelado en el presente documento en una cantidad eficaz para tratar o mejorar la enfermedad mediada por IgG. Dichas enfermedades mediadas por IgG pueden ser las que implican a anticuerpos IgG patógenos en forma monomérica o como complejos inmunitarios (IC) que contienen IgG e incluyen coagulopatías, vasculitis, trastornos del colágeno, enfermedades dermatológicas, enfermedades neurológicas, enfermedades inflamatorias del intestino y trastornos específicos de órganos.

Se desvela un método de bloqueo de la transmisión de anticuerpos patógenos a través de la placenta que comprende administrar a un mamífero gestante en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo contra FcRn o fragmento de unión al antígeno desvelado en el presente documento.

En el presente documento se desvela además un método de inhibición de la unión del complejo inmunitario (IC) por FcRn, que comprende poner en contacto FcRn en una célula o en un sujeto con un anticuerpo contra FcRn o fragmento de unión al antígeno descrito en el presente documento. Por consiguiente, también se describe un método de inhibición de la presentación de un antígeno complejado inmunitario por una célula presentadora de antígenos (APC), que comprende poner en contacto la APC con una cantidad de un anticuerpo contra FcRn o fragmento de unión al antígeno del mismo. Similarmente, se describe un método de inhibición de la presentación cruzada de un antígeno complejado inmunitario por una célula presentadora de antígenos (APC), que comprende poner en contacto la APC con una cantidad de un anticuerpo contra FcRn o fragmento de unión al antígeno del mismo.

También se describe en el presente documento un método de aumento de la depuración de IC de un sujeto que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo un anticuerpo contra FcRn o fragmento de unión al antígeno descrito en el presente documento. Dichos métodos se pueden usar para tratar vasculitis que están mediadas por IC.

En el presente documento se desvela además un método de inhibición de la secreción de una citocina inflamatoria por una célula presentadora de antígenos (APC), que comprende poner en contacto la APC con un anticuerpo contra FcRn o fragmento de unión al antígeno del mismo. Los ejemplos no limitantes de citocinas inflamatorias incluyen, por ejemplo, interleucina-12 (IL-12), interleucina-6 (IL-6) e interferón y (IFN y).

También se describe en el presente documento un método de inhibición de la activación de linfocitos T por una célula presentadora de antígenos que comprende poner en contacto la célula presentadora de antígenos con un anticuerpo contra FcRn o fragmento de unión al antígeno descrito en el presente documento.

En el presente documento se proporciona el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo según la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmune, que comprende administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo contra FcRn o porción de unión al antígeno del mismo a un paciente en necesidad del mismo. Los ejemplos no limitantes de enfermedades que se pueden tratar incluyen pénfigo (pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo o pénfigo paraneoplásico), enfermedad de Crohn, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), trombocitopenia inducida por heparina (HIT), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), miastenia grave (MG) y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP). Enfermedades autoinmunes no limitantes adicionales incluyen trombocitopenia autoinmune, neutropenia inmunitaria, inhibidor de FVIII antihemófilo, síndrome antifosfolípidos, síndrome de Kawasaki, enfermedad asociada a ANCA, polimiositis, pénfigo ampolloso, esclerosis múltiple (MS), síndrome de Guillain-Barré, polineuropatía crónica, colitis ulcerosa, diabetes mellitus, tiroiditis autoinmune, oftalmopatía de Graves, artritis reumatoide, colitis ulcerosa, colangitis esclerosante primaria, lupus eritematoso sistémico (SLE), encefalomielitis autoinmune, tiroiditis de Hashimoto, síndrome de Goodpasture, anemia hemolítica autoinmune, esclerodermia con anticuerpos anticolágeno, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, anemia perniciosa, enfermedad idiopática de Addison, infertilidad de asociación autoinmune, glomerulonefritis (por ejemplo, glomerulonefritis crescéntica, glomerulonefritis proliferativa), resistencia a la insulina y diabetes mellitus autoinmune (diabetes mellitus de tipo 1; diabetes mellitus dependiente de insulina). Se ha reconocido también que la enfermedad autoinmune engloba aterosclerosis y enfermedad de Alzheimer. Los ejemplos adicionales de enfermedades autoinmunes incluyen hepatitis, hemofilia autoinmune, síndrome linfoproliferativo autoinmune (ALPS), uveorretinitis autoinmune, glomerulonefritis, agammaglobulinemia, alopecia areata, amiloidosis, espondilitis anquilosante, angioedema autoinmune, anemia aplásica autoinmune, disautonomia autoinmune, hiperlipidemia autoinmune, inmunodeficiencia autoinmune, enfermedad autoinmune del αdo interno (AIED), miocarditis autoinmune, pancreatitis autoinmune, retinopatía autoinmune, urticaria autoinmune, neuropatía urticarial autoinmune, neuropatía axonal autoinmune, enfermedad de Balo, enfermedad de Behcet, enfermedad de Castleman, celiaquía, enfermedad de Chagas, osteomielitis multifocal recurrente crónica (CRMO), síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, penfigoide mucoso benigno, síndrome de Cogan, enfermedad de las aglutininas frías, miocarditis de Coxsackie, enfermedad de CREST, crioglobulinemia esencial mixta, dermatitis herpetiforme, dermatomiositis, enfermedad de Devic (neuromielitis óptica), cardiomiopatía dilatada, lupus discoide, síndrome de Dressler, endometriosis, fibrosis angiocéntrica eosinofílica, fascitis eosinofílica, eritema nodoso, síndrome de Evans, alveolitis fibrosante, arteritis de células gigantes (arteritis temporal), encefalitis de Hashimoto, púrpura de Henoch-Schonlein, herpes gestacional, nefritis tubulointersticial hipocomplementémica idiopática, mieloma múltiple, neuropatía motora multifocal, encefalitis por anticuerpos contra el receptor de NMDA, enfermedad relacionada con IgG4, enfermedad esclerosante relacionada con IgG4, aneurisma aórtica inflamatoria, seudotumor inflamatorio, miositis con cuerpos de inclusión, cistitis intersticial, artritis juvenil, tumor de Kuttner, síndrome de Lambert-Eaton, vasculitis leucocitoclástica, liquen plano, liquen escleroso, conjuntivitis leñosa, enfermedad por IgA lineal (LAD), enfermedad de Lyme, fibrosis mediastinal crónica, enfermedad de Meniere, poliangitis microscópica, síndrome de Mikulicz, úlcera de Mooren, enfermedad de Mucha-Habermann, fibroesclerosis multifocal, narcolepsia, neuritis óptica, enfermedad de Ormond (fibrosis retroperitoneal), reumatismo palindrómico, PANDAS (trastornos neuropsiquiátricos autoinmunes pediátricos asociados a Streptococcus), degeneración cerebelosa paraneoplásica, polineuropatías paraproteinémicas, hemoglobinuria paroxística nocturnal (PNH), síndrome de Parry Romberg, síndrome de Parsonnage-Turner, periaortitis, periarteritis, neuropatía periférica, encefalomielitis perivenosa, síndrome de POEMS, poliarteritis nodosa, síndromes poliglandulares autoinmune de tipo I, II y III, polimialgia reumática, síndrome pospericardiotomía, dermatitis por progesterona, cirrosis biliar primaria, psoriasis, artritis psoriásica, fibrosis pulmonar idiopática, pioderma gangrenoso, aplasia pura de la serie roja, fenómeno de Raynaud, distrofia simpático refleja, síndrome de Reiter, policondritis recidivante, síndrome de las piernas inquietas, fiebre reumática, tiroiditis de Riedel, sarcoidosis, síndrome de Schmidt, escleritis, síndrome de Sjogren, autoinmunidad del esperma y testicular, síndrome de la persona rígida, endocarditis bacteriana subaguda (SBE), síndrome de Susac, oftalmia simpática, arteritis de Takayasu, síndrome de Tolosa-Hunt, mielitis transversa, enfermedad indiferenciada del tejido conjuntivo (UCTD), dermatosis vesiculobullosa, vitíligo, encefalitis de Rasmussen y macroglobulinemia de Waldenstrom.

Se describen además métodos de tratamiento de una enfermedad infecciosa, que comprenden administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo contra FcRn o porción de unión al antígeno del mismo a un paciente en necesidad de los mismos.

En el presente documento también se describen métodos de reducción de la semivida en suero de proteínas terapéuticas que contienen dominios Fc, por ejemplo, anticuerpos terapéuticos o anticuerpo no de proteínas que comprenden dominios Fc. Dichos métodos pueden potenciar la retirada de dichas proteínas terapéuticas de la circulación sanguínea si causan efectos fisiológicos no deseados. Los ejemplos de proteínas terapéuticas que puede ser adecuadas para este método incluyen TYSABRI® (natalizumab) y AVASTIN® (bevacizumab). Por ejemplo, el método hace que la semivida de la proteína terapéutica disminuya en aproximadamente 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 %.

En el presente documento se desvelan además métodos de retirada de trazadores radiactivos ligados a IgG u otros conjugados anticuerpo-fármaco en donde existe un deseo de retirar éstos de la circulación. Por ejemplo, el bloqueo de FcRn con un agente reductor de IgG sería beneficioso en disminuir los niveles de IgG endógena para permitir farmacocinética y farmacodinámica potenciadas de un agente terapéutico que contiene IgG. En este caso, el pretratamiento con un anticuerpo anti-FcRn que es específico del sitio de unión a IgG antes de la administración de dicho agente terapéutico reducirá la competición derivada de los anticuerpos IgG endógenos en forma monomérica o como complejos inmunitarios (IC) que contienen IgG y permiten la elevada protección del agente terapéutico basado en IgG administrado.

En el presente documento se proporcionan métodos de uso de anticuerpos contra FcRn o porciones de unión al antígeno de los mismos según la invención. Por consiguiente, se proporcionan los anticuerpos contra FcRn o porciones de unión al antígeno de los mismos para su uso en una enfermedad autoinmune como se define en las reivindicaciones. Se describen los anticuerpos contra FcRn o porciones de unión al antígeno de los mismos como se expone en el presente documento para su uso en modular la interacción entre FcRn y Fc de IgG para promover la degradación de anticuerpos por una célula o en un sujeto. El anticuerpo puede ser un autoanticuerpo o un anticuerpo terapéutico. También se desvelan anticuerpos contra FcRn o porciones de unión al antígeno de los mismos como se expone en el presente documento para su uso en el tratamiento o la mejoría de una enfermedad mediada por IgG en un sujeto, donde la enfermedad mediada por IgG puede ser aquella que implica a anticuerpos IgG patógenos e incluyen coagulopatías, vasculitis, trastornos del colágeno, enfermedades dermatológicas, enfermedades neurológicas, enfermedades inflamatorias del intestino y trastornos específicos de órgano.

En el presente documento se desvelan además anticuerpos contra FcRn o porciones de unión al antígeno de los mismos como se expone en el presente documento para su uso en la inhibición de la unión del complejo inmunitario (IC) por FcRn, la inhibición de la presentación de un antígeno complejado inmunitario por una célula presentadora de antígenos (APC) o la inhibición de la presentación cruzada de un antígeno complejado inmunitario por una célula presentadora de antígenos (APC). También se proporcionan los anticuerpos contra FcRn o porciones de unión al antígeno de los mismos como se expone en el presente documento para su uso en la inhibición de la secreción de una citocina inflamatoria por una célula presentadora de antígenos (APC), donde las citocinas inflamatorias incluyen, por ejemplo, interleucina-12 (IL-12), interleucina-6 (IL-6) e interferón ^y(IFN ^y). También se describen anticuerpos contra FcRn o porciones de unión al antígeno de los mismos como se expone en el presente documento para su uso en la inhibición de la activación de linfocitos T.

En el presente documento se proporcionan anticuerpos contra FcRn o porciones de unión al antígeno de los mismos según la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmune. Los ejemplos de enfermedades autoinmunes que se pueden tratar incluyen pénfigo (pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo o pénfigo paraneoplásico), enfermedad de Crohn, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), trombocitopenia inducida por heparina (HIT), púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), miastenia grave (MG) y polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP). Enfermedades autoinmunes no limitantes adicionales incluyen trombocitopenia autoinmune, neutropenia inmunitaria, inhibidor de FVIII antihemófilo, síndrome antifosfolípidos, síndrome de Kawasaki, enfermedad asociada a ANCA, polimiositis, pénfigo ampolloso, esclerosis múltiple (MS), síndrome de Guillain-Barré, polineuropatía crónica, colitis ulcerosa, diabetes mellitus, tiroiditis autoinmune, oftalmopatía de Graves, artritis reumatoide, colitis ulcerosa, colangitis esclerosante primaria, lupus eritematoso sistémico (SLE), encefalomielitis autoinmune, tiroiditis de Hashimoto, síndrome de Goodpasture, anemia hemolítica autoinmune, esclerodermia con anticuerpos anticolágeno, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, anemia perniciosa, enfermedad idiopática de Addison, infertilidad de asociación autoinmune, glomerulonefritis (por ejemplo, glomerulonefritis crescéntica, glomerulonefritis proliferativa), resistencia a la insulina y diabetes mellitus autoinmune (diabetes mellitus de tipo 1; diabetes mellitus dependiente de insulina). Se ha reconocido también que la enfermedad autoinmune engloba aterosclerosis y enfermedad de Alzheimer. Los ejemplos adicionales de enfermedades autoinmunes incluyen hepatitis, hemofilia autoinmune, síndrome linfoproliferativo autoinmune (ALPS), uveorretinitis autoinmune, glomerulonefritis, agammaglobulinemia, alopecia areata, amiloidosis, espondilitis anquilosante, angioedema autoinmune, anemia aplásica autoinmune, disautonomia autoinmune, hiperlipidemia autoinmune, inmunodeficiencia autoinmune, enfermedad autoinmune del αdo interno (AIED), miocarditis autoinmune, pancreatitis autoinmune, retinopatía autoinmune, urticaria autoinmune, neuropatía urticarial autoinmune, neuropatía axonal autoinmune, enfermedad de Balo, enfermedad de Behcet, enfermedad de Castleman, celiaquía, enfermedad de Chagas, osteomielitis multifocal recurrente crónica (CRMO), síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, penfigoide mucoso benigno, síndrome de Cogan, enfermedad de las aglutininas frías, miocarditis de Coxsackie, enfermedad de CREST, crioglobulinemia esencial mixta, dermatitis herpetiforme, dermatomiositis, enfermedad de Devic (neuromielitis óptica), cardiomiopatía dilatada, lupus discoide, síndrome de Dressler, endometriosis, fibrosis angiocéntrica eosinofílica, fascitis eosinofílica, eritema nodoso, síndrome de Evans, alveolitis fibrosante, arteritis de células gigantes (arteritis temporal), encefalitis de Hashimoto, púrpura de Henoch-Schonlein, herpes gestacional, nefritis tubulointersticial hipocomplementémica idiopática, mieloma múltiple, neuropatía motora multifocal, encefalitis por anticuerpos contra el receptor de NMDA, enfermedad relacionada con IgG4, enfermedad esclerosante relacionada con IgG4, aneurisma aórtica inflamatoria, seudotumor inflamatorio, miositis con cuerpos de inclusión, cistitis intersticial, artritis juvenil, tumor de Kuttner, síndrome de Lambert-Eaton, vasculitis leucocitoclástica, liquen plano, liquen escleroso, conjuntivitis leñosa, enfermedad por IgA lineal (LAD), enfermedad de Lyme, fibrosis mediastinal crónica, enfermedad de Meniere, poliangitis microscópica, síndrome de Mikulicz, úlcera de Mooren, enfermedad de Mucha-Habermann, fibroesclerosis multifocal, narcolepsia, neuritis óptica, enfermedad de Ormond (fibrosis retroperitoneal), reumatismo palindrómico, PANDAS (trastornos neuropsiquiátricos autoinmunes pediátricos asociados a Streptococcus), degeneración cerebelosa paraneoplásica, polineuropatías paraproteinémicas, hemoglobinuria paroxística nocturnal (PNH), síndrome de Parry Romberg, síndrome de Parsonnage-Turner, periaortitis, periarteritis, neuropatía periférica, encefalomielitis perivenosa, síndrome de POEMS, poliarteritis nodosa, síndromes poliglandulares autoinmune de tipo I, II y III, polimialgia reumática, síndrome pospericardiotomía, dermatitis por progesterona, cirrosis biliar primaria, psoriasis, artritis psoriásica, fibrosis pulmonar idiopática, pioderma gangrenoso, aplasia pura de la serie roja, fenómeno de Raynaud, distrofia simpático refleja, síndrome de Reiter, policondritis recidivante, síndrome de las piernas inquietas, fiebre reumática, tiroiditis de Riedel, sarcoidosis, síndrome de Schmidt, escleritis, síndrome de Sjogren, autoinmunidad del esperma y testicular, síndrome de la persona rígida, endocarditis bacteriana subaguda (SBE), síndrome de Susac, oftalmia simpática, arteritis de Takayasu, síndrome de Tolosa-Hunt, mielitis transversa, enfermedad indiferenciada del tejido conjuntivo (UCTD), dermatosis vesiculobullosa, vitíligo, encefalitis de Rasmussen o macroglobulinemia de Waldenstrom.

En los métodos descritos en el presente documento, una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo expuesto en el presente documento se puede administrar en combinación (por ejemplo, simultáneamente, uno detrás de otro o por separado) con otros agentes, fármacos u hormonas. En algunas realizaciones, los otros agentes, fármacos u hormonas puede ser moléculas pequeñas, péptidos o proteínas, que incluye anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno. Los otros agentes, fármacos o hormonas se pueden administrar en la misma composición o en composiciones separadas. Otros agentes, fármacos u hormonas son agentes, compuestos u hormonas conocidos para tratar los trastornos, enfermedades o afecciones descritas en el presente documento. Por ejemplo, el otro agente puede ser una terapia con anticuerpos monoclonales para el tratamiento de una enfermedad inmunorrelacionada. El otro agente pueden ser un inhibidor del sistema del complemento. Por ejemplo, las combinaciones dirigidas al receptor de Fc gamma y FcRn se describen en documento de patente WO 2015/164605. totalidad.

Los otros agentes, fármacos u hormonas son inmunosupresores, inmunoestimulantes, inmunomoduladores o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, los otros agentes, fármacos u hormonas son terapia con Ig intravenosas; fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE); corticosteroides; ciclosporinas, rapamicinas, ascomicinas o sus análogos inmunosupresores, por ejemplo, ciclosporina A, ciclosporina G, FK-506, rapamicina, 40-0-(2-60-hidroxi)etil-rapamicina; ciclofosfamida; azatiopreno; metotrexato; micofenolato; brequinar; FTY 720; leflunomida; mizoribina; ácido micofenólico; micofenolato mofetilo; 15-desoxiespergualina; anticuerpos monoclonales inmunosupresores, por ejemplo, anticuerpos monoclonales contra receptores de leucocitos, por ejemplo, MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD25, CD28, B7, CD45 o CD 58 o sus ligandos; otros compuestos inmunomoduladores, por ejemplo CTLA4Ig; otros inhibidores de moléculas de adhesión, por ejemplo, mAb o inhibidores de bajo peso molecular que incluyen antagonistas de selectina y antagonistas de VLA-4; citocinas inmunomoduladoras, por ejemplo, alfa-interferón, gamma-interferón o factor de necrosis tumoral-alfa; o citocinas inmunoestimulantes, por ejemplo, interleucina-2.

En el presente documento se describen métodos de medición del nivel de anticuerpo anti-FcRn en un sujeto después de la administración de un anticuerpo anti-FcRn, comprendiendo el método obtener sangre completa del sujeto después de la administración de un anticuerpo anti-FcRn, en donde la sangre completa comprende monocitos, y medir el nivel de expresión de FcRn de la superficie celular del monocito. Sin estar limitado a teoría específica alguna, se ha mostrado que existe una correlación entre los niveles de FcRn de la superficie celular del monocito y la presencia de anticuerpos anti-FcRn. El nivel de expresión de FcRn de la superficie celular del monocito se pueden medir por cualquier método conocido en la técnica, y puede incluir, por ejemplo, media geométrica de la intensidad media de fluorescencia.

Se debe entender y esperar que un experto en la técnica pueda hacer variaciones en los principios de invención desvelados en el presente documento.

Los siguientes ejemplos ilustran aún más la invención, pero no se deben interpretar para limitar el alcance de la invención en modo alguno.

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Humanización de dominios variables

Se diseñaron regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras adecuadas para administración humana basándose en un anticuerpo monoclonal de ratón seleccionado por su capacidad para unirse a FcRn y bloquear la unión de FcRn y Fc de IgG. El anticuerpo de ratón no se une sustancialmente a albúmina de suero humano. Usando un modelo del anticuerpo monoclonal basado en estructuras de anticuerpo existentes, regiones estructurales de la región variable para el anticuerpo humano se diseñaron a partir de segmentos de regiones V humanas. Para minimizar la posible inmunogenicidad, se diseñaron varias variantes con aminoácidos seleccionados en ciertas localizaciones de la región estructural diseñadas para retirar epítopes de linfocitos T humanos.

Se construyeron genes de la región V de la cadena pesada y ligera a partir de oligonucleótidos solapados ensamblados en genes de longitud completa usando la reacción en cadena de la ligasa (LCR), seguido por amplificación y adición de sitios de restricción adecuados para la clonación.

Se construyeron cuatro variantes de las cadenas pesadas con una región constante de IgG4 humana. Las variantes se designan Vh1, Vh2, Vh3 y Vh4. Las secuencias de aminoácidos de los dominios variables de las variantes de las cadenas pesadas se representan por SEQ ID NOS: 12, 14, 16 y 18 respectivamente. Las secuencias de oligonucleótidos de los dominios variables de las variantes de las cadenas pesadas se representan por SEQ ID NOS:11, 13, 15 y 17, respectivamente. La Fig. 1 muestra una alineación de las cuatro variantes. Se construyeron cuatro variantes de las cadenas ligeras y se expresaron como cadenas kappa humanas. Las variantes se designan Vk1, Vk2, Vk3 y Vk5. Las secuencias de aminoácidos de las variantes de las cadenas ligeras se representan por SEQ ID NOS:20, 22, 24 y 26 respectivamente. Las secuencias de oligonucleótidos de los dominios variables de las variantes de las cadenas ligeras se representan por SEQ ID NOS:19, 21, 23 y 25 respectivamente. La Fig. 2 muestra una alineación de las cuatro variantes.

Los anticuerpos se expresaron como IgG completas clonando los genes de la región V en un vector de expresión de mamífero con un promotor/potenciador inmediato/temprano del citomegalovirus aguas arriba, una secuencia señalizadora de inmunoglobulina y región constante de inmunoglobulina. Los vectores se transfectaron en células HEK EBNA, se cuantificó la expresión y los anticuerpos se purificaron en columnas de proteína A.

Las 16 combinaciones de cadenas pesadas-ligeras en las cuatro variantes de las cadenas pesadas y cuatro de las cadenas ligeras se expresaron por transfección transitorio en células HEK EBNA. Los anticuerpos se purificaron en columnas de proteína A Sepharose y se cuantificaron. Como se indica anteriormente, el FcRn reside principalmente en los endosomas ácidos tempranos donde captura IgG endocitosada uniéndose a la región Fc a un bajo pH. Para bloquear la unión de FcRn a Fc de IgG endocitosada, también se desea que los anticuerpos contra FcRn se unan a FcRn expuesto al medio intercelular a pH fisiológico (por ejemplo, pH 7,4). Por lo tanto, la unión de los anticuerpos purificados a FcRn se evaluó en un ensayo de ELISA de competición a pH 6,0 y pH 7,4.

Para el ELISA, se recubrió previamente durante la noche a pH 7,4 una placa de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos Nunc Immuno MaxiSorp con un anticuerpo contra FcRn específico de un epítope de unión a albúmina distinto de la región de unión a Fc. Al día siguiente, 1 μg/ml de FcRn humano recombinante (Sino Biological Inc., Cat. N.° CT009-H08H) diluido en PBS pH 7,4 se añadió a los pocillos y se incubó durante 1 hora a 37 °C. Se premezcló una serie de diluciones cuádruples de anticuerpos IgG4 de control o de prueba desde 25 μg/ml hasta 0,0015 μg/ml con una concentración constante de anticuerpo murino parental biotinilado, se añadió a las placas y se incubó durante 1 hora a 37 °C. La unión del mAb biotinilado se detectó con estreptavidina-HRP y sustrato TMB. La absorbancia se leyó a 450 nm y se representaron las curvas de unión. La unión de las 16 combinaciones se probó a tanto pH 7,4 como pH 6,0 y se cuantificó por comparación con el anticuerpo murino parental, como se muestra en la Tabla 2.

Ejemplo 2

Maduración de la afinidad

Para mejorar la afinidad de unión a pH ácido y fisiológico, se mutaron las regiones CDR3 del dominio variable de la cadena pesada y ligera y se cribaron en forma de scFv a pH 6,0 y pH 7,4. Para preparar las scFv, genes que codificaban Vh y Vk se ensamblaron con un conector de 15 aminoácidos (G4S)₃usando PCR de solapamiento. La secuencia de scFv se clonó en un vector de fagémido como una proteína de fusión del gen 3, y el vector se transformó en E. coli (TG1). El proceso de maduración de la afinidad se realizó usando las variantes Vh1 y Vk1. Para el cribado, una biblioteca de CDR3 de la cadena pesada en Vh1 se combinó con la cadena ligera de Vk1 parental humanizada y una biblioteca de CDR3 de la cadena ligera en V^k1 se combinó con la cadena pesada de V^h1 parental humanizada.

La variación en la secuencia de aminoácidos se introdujo en la región CDR3H de la cadena pesada en las posiciones de aminoácidos 98-103 (aa 98-102 de CDR3H y aa 103 de FW4) usando la secuencia de oligonucleótidos KNCNNCNNCNNCSVCNWCYGG (SEQ ID NO:71) que proporcionó aminoácidos seleccionados en cada posición, del siguiente modo: a.a. 98: A, C, D, F, G, S, V, Y; a.a. 99: A, C, D, F, G, H, I, L, N, P, R, S, T, V, Y; a.a. 100: A, C, D, F, G, H, I, L, N, P, R, S, T, V, Y; a.a. 100a: A, C, D, F, G, H, I, L, N, P, R, S, T, V, Y; a.a. 101: A, D, G, H, P, R; a.a. 102: D, F, H, I, L, N, V, Y; a.a. 103: R, W. R, W. La variación en la secuencia de aminoácidos se introdujo en la región CDR3L de la cadena ligera en las posiciones de aminoácidos 89-97 usando la secuencia de oligonucleótidos TGTMRSVMGTVSKRSRRCWMCYYCBWCRYCTTC (SEQ ID NO:72), que proporcionó aminoácidos seleccionados en cada posición, del siguiente modo: a.a. 88: C; a.a. 89: H, K, N, C, R, S; a.a. 90: A, E, K, P, C, T; a.a. 91: C, S, W, Y; a.a. 92: C, D, E, G, W, Y; a.a. 93: D, G, N, S; a.a. 94: N, S, T, Y; a.a. 95: F, L, P, S; a.a. 96: D, F, H, L, V, Y; a.a. 97: A, I, T, V.

Para cada CDR, se cribó una biblioteca de aproximadamente 5-10x107 fagos que contenía del orden de 3-6x106 secuencias de ADN (es decir, se representaron aproximadamente 10-20 copias de cada secuencia de ADN) para la unión a antígeno soluble. Específicamente, las bibliotecas de fagos se mezclaron con FcRn biotinilado soluble, seguido por captura de complejos de FcRn-fago de anticuerpo sobre perlas recubiertas de estreptavidina. Para obtener anticuerpos que se unen a FcRn en endosomas ácidos, así como a pH fisiológico, se realizaron rondas sucesivas de cribado de la biblioteca a pH alterno. Por tanto, para aumentar la rigurosidad de cada ronda de cribado sucesiva, se redujo la concentración de antígeno de FcRn. La ronda de selección inicial se realizó con una concentración objetivo de antígeno 25 nM a pH 6,0. La segunda ronda se realizó a concentración de antígeno 2,5 nM a pH 7,4. La tercera ronda se realizó a concentración de antígeno 0,25 nM a pH 6,0.

Se seleccionó un total de aproximadamente 60 anticuerpos scFv de las bibliotecas de V^hCDR3 y V^lCDR3 para estudio posterior. Los anticuerpos scFv se prepararon a partir de extractos periplásmicos bacterianos, y se probaron por ELISA de competición a pH 6,0 y pH 7,4. En el ELISA de competición, los fragmentos scFv de anticuerpos compitieron contra anticuerpo murino parental biotinilado por la unión a FcRn inmovilizad. Como en el ELISA usado para probar variantes humanizadas, se recubrió previamente una placa de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos con 1 |ug/ml de un anticuerpo contra FcRn específico de un epítope de unión a albúmina distinto de la región de unión a Fc. La unión se determinó a pH 7,4 y pH 6,0. La Fig. 3 muestra la elevada afinidad de unión por tres de las cadenas pesadas con afinidad madurada (H1, H3, E7) expresadas como scFv con la cadena ligera de V^k1 parental humanizada, y una de las cadenas ligeras con afinidad madurada (E8) expresadas como scFv con la cadena pesada de V^h1 parental, a tanto pH 6,0 como pH 7,4. La Tabla 3 muestra la unión mejorada observada para 15 cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, cuantificada comparando con el anticuerpo murino parental.

Se midieron mejoras sustanciales en la unión para scFv que contenían CDR3 de la cadena pesada con afinidad madurada en la región estructural V^h1. Por lo tanto, se llevaron a cabo pruebas en estas cadenas pesadas en combinación con cadenas ligeras mejoradas. Como se muestra en el Ejemplo 1 anteriormente, las cadenas ligeras de Vk1 y Vk2 demostraron unión similar cuando se emparejaron con Vh1 (y otras variantes de Vh), y se predijo que la región estructural de Vk2 era menos inmunogénica que Vk1. Por lo tanto, se llevaron a cabo pruebas en las cadenas ligeras basadas en Vk1 y Vk2 que contenían CDR3 con afinidad madurada en combinación con cadenas pesadas mejoradas.

Ejemplo 3

Desarrollo de anticuerpos IgG

Se seleccionaron ocho cadenas pesadas con afinidad madurada (A8, C4, F7, G4, G7, G9, H1, y H3) y se expresaron con una CDR3 que contenía cadena ligera humanizada (Vk1 o Vk2) de E8. Las dieciséis combinaciones se expresaron como anticuerpos IgG4 bivalentes por transfección transitoria de células HEK, seguido por purificación de los anticuerpos IgG4. Las cadenas pesadas con afinidad madurada también se expresaron en combinación con cadenas ligeras humanizadas, pero no con afinidad madurada y ciertas cadenas ligeras con afinidad madurada se expresaron con cadenas pesadas humanizadas, pero no con afinidad madurada.

Ejemplo 4

Características de unión al antígeno y bloqueo de anticuerpos IgG4 como se determina por ELISA

Se comparó la IgG de afinidad madurada con IgG V^h1/V ^k1 parental humanizada por ELISA de unión dicto. Se recubrió previamente durante la noche a pH 7,4 una placa de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos Nunc Immuno MaxiSorp con un anticuerpo contra FcRn específico de un epítope de unión a albúmina distinto de la región de unión a Fc. Al día siguiente, 1 μg/ml de FcRn humano recombinante (Sino Biological Inc., Cat. N.° CT009-H08H) diluido en PBS pH 7,4 se añadió a los pocillos y se incubó durante 1 hora a 37 °C, seguido de bloqueo de la unión no específica con 4 % de leche/PBS. Se añadieron IgG parentales o con afinidad madurada humanizadas tituladas a los pocillos, seguido de detección de anticuerpo unido usando anti-kappa-HRP humano. La Fig. 4 muestra la elevada unión de IgG H1Vh1_E8Vk1, H1Vh1_E8Vk2, G7Vh1_E8Vk1 y G7Vh1_E8Vk2 a FcRn movilizado en comparación con la IgG Vh1Vk1 parental humanizada o anticuerpo murino parental quimérico.

Los anticuerpos IgG4 también se probaron para la unión al antígeno en un ELISA de competición a pH 6,0 y pH 7,4. Se recubrió previamente durante la noche a pH 7,4 una placa de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos Nunc Immuno MaxiSorp (Fisher, cat. N.° DIS-971-030J) con 1 μg/ml de un anticuerpo contra FcRn específico de un epítope de unión a albúmina distinto de la región de unión a Fc. Al día siguiente, 1 μg/ml de FcRn humano recombinante (Sino Biological Inc., Cat. N.° CT009-H08H) diluido en PBS pH 7,4 se añadió a los pocillos y se incubó durante 1 hora a 37 °C. Después de lavar las placas 3x con PBST pH 7,4, las placas se bloquearon con PBSM pH 7,4 durante 1 hora a 37 °C. Desde este momento en adelante, todas las etapas de lavado e incubación se realizaron al pH de ensayo elegido (pH 6,0 o 7,4). Después de lavar 3x con PBST, se premezcló una serie de diluciones cuádruples de anticuerpos probados desde 25 μg/ml hasta 0,006 μg/ml de concentración final con una concentración constante de anticuerpo murino parental biotinilado (0,4 μg/ml, concentración final), se añadió a las placas recubiertas de FcRn y se incubó durante 1 hora a 37 °C. Después de 3x lavados con PBST, la unión del mAb biotinilado se detectó con estreptavidina-HRP (Sigma, cat. N.° S5512) y sustrato TMB (Invitrogen, cat. N.° 00-2023). La reacción se detuvo con HCl 3 M, la absorbancia se leyó a 450 nm en un lector de placas Dynex Technologies MRX TC II y se representaron las curvas de unión.

Como se muestra en la Fig. 5 para cuatro de los anticuerpos (H1Vh1_E8Vk1, H1Vh1_E8Vk2, F7Vh1_E8Vk1, Vh1_E8Vk2), las IgG con afinidad madurada se comportaron similarmente al anticuerpo murino parental quimérico y el anticuerpo Vh1Vk1 parental humanizado en el ELISA de competición.

También se usó el ELISA de competición para comparar ciertas combinaciones de cadenas pesadas y ligeras con afinidad madurada expresadas en forma monovalente (scFv) o bivalente (IgG) con el Vh1Vk1 parental humanizado. La Fig. 6 compara la unión de H3Vh1_E8Vk1 IgG, H3Vh1_Vk1 scFv, Vh1Vk1 IgG y Vh1Vk1 scFv a tanto pH 7,4 como pH 6,0. En forma de scFv, la scFv H3Vh1_Vk1 con afinidad madurada demostró unión significativamente mejorada en comparación con el scFv Vh1Vk1 parental. Por tanto, en comparación con la forma scFv, cuando se expresó como IgG bivalente, tanto IgG H3V^h1_E8V^k1 como V^h1V^k1 demostraron unión mejorada.

Se probaron combinaciones adicionales de cadenas pesadas humanizadas con afinidad madurada y cadenas ligeras humanizadas con afinidad madurada en el ELISA de competición. También se probaron las combinaciones de cadenas pesadas humanizadas con afinidad madurada y cadenas ligeras humanizadas no con afinidad madurada. Los resultados obtenidos se resumen en las Tablas 4 y 5, que muestran los valores relativos promedio de CI50 para los experimentos realizados a pH 7,4 y pH 6,0 y el número (n) de experimentos. Los valores de CI50 de las combinaciones se normalizaron al anticuerpo murino parental quimérico probado en la misma placa.

Tabla 4

T a b la 5

La unión de anticuerpos humanizados con afinidad madurada a FcRn se evaluó adicionalmente en un ensayo de ELISA de competición con IgG humana completa a pH 6,0. se recubrió previamente durante la noche a pH 7,4 una placa de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos Nunc Immuno MaxiSorp (Fisher, cat. N.° DIS-971-030J) con 1 μg/ml de un anticuerpo contra FcRn específico de un epítope de unión a albúmina distinto de la región de unión a Fc de FcRn. Al día siguiente, 0,5 μg/ml de FcRn humano recombinante (Sino Biological Inc., cat. N.° CT009-H08H) diluido en PBS pH 7,4 se añadió a los pocillos y se incubó durante una hora a 37 °C. Después de lavar las placas 3x con PBST pH 7,4, las placas se bloquearon con PBSM pH 7,4 durante una hora a 37 °C. Desde este momento en adelante, todas las etapas de lavado e incubación se realizaron al pH de ensayo 6,0. Después de lavar 3x con PBST, se premezcló una serie de diluciones triples de anticuerpos probados desde 25 μg/ml hasta 0,034 μg/ml de concentración final con una concentración constante de IgG sérica humana biotinilada (Sigma, cat. N.° I4506, 25 μg/ml de concentración final), se añadió a las placas y se incubó durante una hora a 37 °C. Después de 3x lavados con PBST, se detectó la unión de la IgG biotinilada con estreptavidina-HRP (Sigma, cat. N.° S5512) y sustrato TMB (Invitrogen, cat. N.° 00-2023). La reacción se detuvo con HCl 3 M, la absorbancia se leyó a 450 nm en un lector de placas Dynex Technologies MRX TC II y se representaron las curvas de unión.

La unión de combinaciones de cadenas pesadas humanizadas con afinidad madurada con cadenas ligeras humanizadas con afinidad madurada a FcRn a pH 6,0 en presencia de IgG sérica humana se comparó con la del anticuerpo murino parental quimérico. Los resultados se resumen en la Tabla 6. Los valores de CI50 relativa promedio se normalizaron al anticuerpo quimérico probado en la misma placa.

T a b la 6

Se comparó la unión de combinaciones de cadenas pesadas humanizadas con afinidad madurada con cadenas ligeras humanizadas no con afinidad madurada a FcRn a pH 6,0 en presencia de IgG sérica humana con la del anticuerpo contra FcRn murino parental. Los resultados se resumen en la Tabla 7. Los valores de CI50 relativa promedio se normalizaron al anticuerpo murino parental probado en la misma placa.

Tabla 7

Datos adicionales referentes a algunas combinaciones de cadenas pesadas y ligeras humanizadas con afinidad madurada, así como algunas combinaciones de cadenas pesadas humanizadas con afinidad madurada emparejadas con cadenas ligeras humanizdas no con afinidad madurada se muestra en la Tabla 8 que sigue.

Tabla 8

Ejemplo 5

Determinación de la cinética de unión de mAb usando resonancia de plasmones superficiales

Se diluyeron anticuerpos en NaAc 10 mM, pH 4,5, y se inmovilizaron sobre chips CM5 de BIACORE® hasta niveles de UR de aproximadamente 500-1000. El análisis se realizó por inyección de FcRn a concentraciones de 12-800 nM en 1xPBS-P a pH 7,4 o pH 6,0. La Tabla 9 muestra los datos cinéticos ajustados a un modelo de Langmuir 1:1.

En un estudio adicional, se compararon las afinidades de IgG que comprenden cadenas pesadas y ligeras con afinidad madurada con el anticuerpo V^h1/V ^k1 parental humanizado por BIACORE®. Los anticuerpos se capturaron en un chip CM5 recubierto con proteína A y el analito (FcRn) circuló sobre la superficie. Como se indica en la siguiente la Tabla 10, los anticuerpos que comprendían cadenas pesadas y ligeras con afinidad madurada presentaron afinidades similares a las del anticuerpo Vh1/V k1 parental humanizado.

Se hicieron comparaciones por parejas entre anticuerpos que tenían V^k1 frente a V^k2, manteniendo constante una cadena pesada con afinidad madurada (es decir, G9Vh1, H3Vh1 o H1Vh1) y entre H3Vh1 y G9Vh1, manteniendo constante Vk2. Se recubrió la proteína A (Sigma, cat. N.° P6031) sobre celdas de flujo (Fc) 1,2, 3 y 4 de una superficie de chip sensor CM5 de serie S (GE Healthcare, cat. N.° BR100530) usando química de acoplamiento de amina estándar. La inmovilización se llevó a cabo a una concentración de proteína de 20 μg/ml en tampón acetato 10 mM a pH 5,0 a un nivel de respuesta objetivo de 500 unidades de resonancia (UR). Se capturó anticuerpo 10 nM sobre Fc 2, 3 y 4 a 10 μl/min dando UR de ~ 172 (nivel de unión del analito (Rmáx.) de 50-150 UR) y se dejó que se estabilizara la superficie.

Para el análisis cinético, se seleccionó un intervalo de diluciones dobles desde FcRn 50-0,02 nM. La fase de asociación del analito FcRn se monitorizó durante 450 segundos, y se midió la disociación durante 1500 segundos, a 40 μl/min. Fc1 fue un canal de referencia y se restó de otras celdas de flujo para corregir la unión no específica. Los valores cinéticos se basan en un modelo de unión 1:1 (Tabla 11).

En un estudio adicional, se realizó resonancia de plasmones superficiales (SPR) usando un instrumento Biacore 3000 (GE Healthcare) con chips sensores CM5 acoplados con mAb (~500-700 unidades de resonancia) usando química de acoplamiento de amina como se describe por el fabricante. El acoplamiento se realizó inyectando 3 μg/ml de cada proteína en acetato sódico 10 mM, pH 4,5 (GE Healthcare), usando el kit de acoplamiento de amina (GE Healthcare). Se usaron tampón HBS-P pH 7,4 (HEPES 0,01 M, NaCl 0,15 M, 0,005 % de tensioactivo P20) o tampón fosfato pH 6,0 (tampón fosfato 67 mM, NaCl 0,15 M, 0,005 % de Tween 20) como tampón de electroforesis y tampón de dilución. Las cinéticas de unión se determinaron inyectando cantidades tituladas de hFcRn monomérico marcado con His (400,0-12,5 nM) sobre Ab inmovilizados a pH 7,4 o pH 6,0. Todos los experimentos de SPR se realizaron a 25 °C con un caudal de 40 μl/min. Los datos de unión se ajustaron a cero, y se restó el valor de la celda de referencia. Se usó el modelo de unión de ligando de Langmuir 1:1 proporcionado por el software BIAevaluation (versión 4.1) para determinar la cinética de unión. La precisión del ajuste se describe mediante el valor estadístico x2.

La Fig.7 muestra gráficos de asociación y disociación de la unión para la cadena pesada con afinidad madurada G9 o H3, emparejada con la cadena ligera de variante V ^k2 o cadena ligera con afinidad madurada E8, determinados por resonancia de plasmones superficiales. Las contantes de velocidad cinética se proporcionan en 12, que sigue. Las constantes de velocidad cinética se obtuvieron usando un modelo de interacción bimolecular de Langmuir simple de primer orden (1:1). Los valores cinéticos representan el promedio de duplicados. Los valores de x2 (chi-cuadrado) representan el ajuste al modelo de unión usado.

En un estudio adicional, se realizó resonancia de plasmones superficiales (SPR) usando un instrumento Biacore 3000 (GE Healthcare) con chips sensores CM5 acoplados con anticuerpos (~550 unidades de resonancia (UR)) usando química de acoplamiento de amina como se describe por el fabricante. El acoplamiento se realizó inyectando 2,5 μg/ml de cada proteína en acetato sódico 10 mM, pH 4,5 (GE Healthcare), usando el kit de acoplamiento de amina (GE Healthcare). Se usaron tampón HBS-P pH 7,4 (HEPES 0,01 M, NaCl 0,15 M, 0,005 % de tensioactivo P20) o tampón fosfato pH 6,0 (tampón fosfato 67 mM, NaCl 0,15 M, 0,005 % de Tween 20) como tampón de electroforesis y tampón de dilución. Las cinéticas de unión se determinaron inyectando cantidades tituladas (400,0-12,5 nM) de FcRn humano monomérico marcado con His (hFcRn) (JTA) sobre el mAb inmovilizado H3Vk2 a pH 7,4 o pH 6,0. Para IgG1 humana (hIgG1) e IgG4 humana (hIgG4), se inyectó 10.000-325,0 nM. Todos los experimentos de SPR se realizaron a 25 °C con un caudal de 40 μl/min. Los datos de unión se ajustaron a cero, y se restó el valor de la celda de referencia. Se usó el modelo de unión de ligando de Langmuir 1: 1 proporcionado por el software BIAevaluation (versión 4.1) para determinar la cinética de unión. La precisión del ajuste se describe mediante el valor estadístico x2.

La Fig. 12 muestra gráficos de asociación y disociación de la unión para hIgG 1, hIgG4 y H3Vk2. La Tabla 13 que sigue muestra los resultados en forma tabulada.

Como era de esperar, se mostró que hIgG1 y hIgG4 se unían en un modo estrictamente dependiente del pH con KD de aproximadamente 1 μM a pH 6,0, y solo se obtuvieron respuestas de unión muy débiles a pH neutro (a la mayor concentración inyectada, 10.000 nM).

En un estudio adicional, se probó la unión de H3Vk2 a FcRn de macaco cangrejero y a FcRn humano obtenidos de dos proveedores diferentes.

Se realizó resonancia de plasmones superficiales (SPR) usando un instrumento Biacore 3000 (GE Healthcare) con chips sensores CM5 acoplados con mAb H3Vk2 (~550 unidades de resonancia (UR)) usando química de acoplamiento de amina como se describe por el fabricante. El acoplamiento se realizó inyectando 2,5 μg/ml de H3Vk2 en acetato sódico 10 mM, pH 4,5 (GE Healthcare), usando el kit de acoplamiento de amina (GE Healthcare). Se usaron tampón HBS-P pH 7,4 (HEPES 0,01 M, NaCl 0,15 M, 0,005 % de tensioactivo P20) o tampón fosfato pH 6,0 (tampón fosfato 67 mM, NaCl 0,15 M, 0,005 % de Tween 20) como tampón de electroforesis y tampón de dilución. Las cinéticas de unión se determinaron inyectando cantidades tituladas (400,0-12,5 nM) de receptores sobre Ab inmovilizado a pH 7,4 o pH 6,0 (FcRn humano monomérico marcado con His (hFcRn) (JTA) o FcRn humano y de macaco cangrejero (cFcRn) obtenidos de SINO Biological Inc). Todos los experimentos de SPR se realizaron a 25 °C con un caudal de 40 μl/min. Los datos de unión se ajustaron a cero, y se restó el valor de la celda de referencia. Se usó el modelo de unión de ligando de Langmuir 1: 1 proporcionado por el software BIAevaluation (versión 4.1) para determinar la cinética de unión. La precisión del ajuste se describe mediante el valor estadístico x2.

La Fig. 13 muestra gráficos de asociación y disociación de la unión. La Tabla 14 que sigue muestra los resultados en forma tabulada.

En esta configuración experimental, se determinó la cinética de unión de H3Vk2 hacia FcRn humano y de macaco cangrejero obtenido de SINO Biological Inc. Como una comparación, se incluyó FcRn humano monomérico producido internamente y usado en ciertos estudios previos (JTA) a pH7,4. La forma humana comercial de SINO Biological Inc. dio constantes cinéticas muy similares que las de la versión humana producida internamente. Se mostró que FcRn de macaco cangrejero se unía al Ab en ambas condiciones de pH, pero con afinidad algo más débil (aproximadamente 2 veces) a pH 7,4 que el receptor humano.

Ejemplo 6

Ensayo de presentación de antígenos

Preparación de células dendríticas de médula ósea (BMDC) - Se recogen células de la médula ósea (BM) de ocho ratones hembra B6.Cg-Fcgrttm1Dcr Tg(FCGRT)₃2Dcr/DcrJ (reservas de Jackson Laboratory Stock N.° 014565). Estos ratones alojan un alelo inactivado de la cadena a de FcRn (Fcgrttm1Dcr) y expresan un transgén de la cadena a de FcRn humano (FCGRT) bajo el control del promotor de FcRn humano. Se siembran células BM a 2x106/10 cm2 en aproximadamente 70 placas de Petri no tratadas con TC en RPMI completo (C-RPMI). Las células BM se complementan con GM-CSF (20 ng/ml) en el día 3 y 6, y se recogieron (o congelaron) para su uso en los días 8 - 12 de cultivo de BMDC.

En el ensayo de presentación de antígenos, la presentación mediada por FcRn de antígeno por BMDC se evalúa por activación de linfocitos T. Específicamente, las BMDC se incuban con un complejo inmunitario de antígeno anticuerpo específico de antígeno (NIP-OVA anti-NIP-IgG), seguido por determinación de la activación de linfocitos T específicos de antígeno. La capacidad de los anticuerpos anti-FcRn (en comparación con un anticuerpo de control no específico de isotipo equivalente) para inhibir la presentación de antígenos (bloqueando la unión de FcRn a IC, bloqueando así el procesamiento de NIP-OVA y la presentación a linfocitos T) se evalúa determinando la activación de linfocitos T. La activación de linfocitos T se evalúa usando ELISA para cuantificar la producción de IL2 y IFN-y. Los controles para presentación no específica de antígeno (es decir, niveles de fondo de presentación de antígenos no mediados por FcRn) se proporcionan incubando BMDC con anticuerpo de prueba y antígeno sin complejar (es decir, NIP-OVA sin anti-NI P-IgG).

Las BMDC se incuban primero con anticuerpo de prueba o control de isotipo. Específicamente, las BMDC se siembran en placas de 96 pocillos a 5x104/100 μl/pocillo y se incuban a 37 °C durante 30 - 60 minutos. A cada pocillo se añaden 100 μl de cada anticuerpo de prueba (o control de isotipo) para lograr una concentración de anticuerpo de 50, 25, 12,5, 6,25 o 3,125 nM. Las mezclas BMDC - anticuerpo se incuban durante 30 - 60 minutos antes de la adición del complejo inmunitario (IC). Se preparan pocillos suficientes para probar cada serie de diluciones de anticuerpo para la inhibición de la activación de linfocitos T CD4+ y CD8+, y mediciones por triplicado.

Formación del complejo inmunitario (IC)

Se mezclan 2,5 ml de cada uno de anti-NI P-IgG (2X concentración = 200 μg/ml) y NIP-ovoalbúmina ("NIP-OVA")(2X concentración = 200 μg/ml) y se incuban a 37 °C durante 60 minutos para formar 200 μg/ml de complejos inmunitarios (IC). Se prepara una muestra de 5 ml sin tratar (es decir, sin complejar) de 100 μg/ml de NIP-OVA.

Se prepara una mezcla de cada anticuerpo de prueba (o control de isotipo) y IC para la adición a las BMDC. Cada anticuerpo de prueba también se mezcla con NIP-OVA para proporcionar controles de fondo. Específicamente, se preparan diluciones sucesivas de los anticuerpos de prueba (100, 50, 25, 12,5, 6,25 nM) y se añaden 250 μl de cada dilución 250 μl de IC, así como a 250 μl de 100 μg/ml de NIP-OVA), produciendo disoluciones de anticuerpo de prueba IC o anticuerpo de prueba NIP-OVA que contienen concentraciones 50, 25, 12,5, 6,25 y 3,125 nM de los anticuerpos de prueba.

Se centrifugan las placas de 96 pocillos que contenían las BDMC tratadas con el anticuerpo de prueba, todo el medio se extrae excepto 25 μl/pocillo, y se añaden 100 μl de disoluciones de anticuerpo de prueba IC o anticuerpo de prueba NIP-OVA a los pocillos, seguido por incubación a 37 °C durante 2-3 h.

Preparaciones de linfocitos T

Para obtener linfocitos T CD8+, se recogen suspensiones de células individuales del bazo y los ganglios linfáticos de ratones hembra OTI, C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J (reserva de Jackson Laboratory N.° 003831). Estos ratones transgénicos expresan un receptor transgénico de linfocitos T diseñado para reconocer los residuos de ovoalbúmina 257-264 en el contexto de H₂Kb y se usan para estudiar la función de péptidos en selección positiva y la respuesta de linfocitos T CD8+ al antígeno. Se usa un kit de Miltenyi para reducir linfocitos T no CD8+.

Para obtener linfocitos T CD4+, se recogen suspensiones de células individuales del bazo y los ganglios linfáticos de ratones hembra OTII, B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J (reserva de Jackson Laboratory N.° 004194). Estos ratones transgénicos expresan el receptor de cadena alfa y cadena beta de ratón de linfocitos T que se empareja con el correceptor de CD4 y es específico de ovoalbúmina de pollo 323-339 en el contexto de I-Ab. Se usa un kit de Miltenyi para reducir linfocitos T no CD4+.

Se centrifugan las placas de 96 pocillos que contienen BDMC, anticuerpos de prueba y IC (o NIP-OVA sin complejar), todo se retira excepto 25 μl/pocillo, y los pocillos se lavan dos veces con C-RPMI precalentado.

Se incuban linfocitos T (ya sea CD4+ o CD8+) en cantidades de 1,5 x 105/200 μl/pocillo, durante 24 horas a 37 °C. Se recogen 150 μl de cada pocillo para la cuantificación de IL2 por ELISA. Se añaden de nuevo 150 μl/pocillo de C-RPMI a cada pocillo, seguido por incubación durante 48 horas adicionales (total de 72 horas) a 37 °C. En ese momento, se recogen 150 μl de cada pocillo para la cuantificación de IFN-gamma por ELISA.

Se evalúan las respuestas de linfocitos T de OTI (CD8-) y OTII (CD4+) a cada condición de cultivo midiendo la secreción de IL2 y IFN-gamma en el sobrenadante de cultivo por ELISA. Se mide IL2 de ambos cultivos a las 24 horas diluidos 1 a 3 para OTI, y diluidos 1 a 20 para OTII. IFN-^yse mide de cultivos OTI a las 24 horas diluidos 1 a 3, y cultivos OTII a las 72 horas diluidos 1 a 20.

Ejemplo 7

Prueba de inmunogenicidad

Se someten anticuerpos a un ensayo de linfocitos T preclínico ex vivo (EPISCREEN®, Antitope Ltd.). Usando una cohorte seleccionada para representar el número y la frecuencia de alotipos HLA-DR expresados en la población mundial, el ensayo EPISCREEN® (Antitope Ltd.) predice eficazmente la inmunogenicidad de linfocitos T cuantificando las respuestas de linfocitos T a terapéuticos de proteína.

Ejemplo 8

Ensayo de sangre completa

Se desarrolló un ensayo usando sangre completa de macacos cangrejeros para probar la capacidad de anticuerpos anti-FcRn para bloquear la producción de citocinas en un entorno fisiológicamente relevante. A la sangre completa se añadió o 0,1 μg/ml de NIP-OVA o 0,1 μg/ml de NIP-OVA al que se había unido una IgG humana anti-NIP. NIP-OVA-IgG sirvió de complejo inmunitario sustituto en el ensayo, uniéndose a FcRn e iniciando funciones efectoras de FcRn, tales como producción de citocinas. La adición de NIP-OVA-IgG produjo una abundante producción de las citocinas factor de necrosis tumoral-a (TNF-a), interleucina-6 (IL-6), interleucina-10 (IL-10) e interleucina-1 p (IL-1 p) (véanse las barras negras en las Fig. 8, 9, 10 y 14, respectivamente). A diferencia, la adición de NIP-OVA solo no dio como resultado la liberación de citocinas. Cuando la IgG en NIP-OVA-IgG se sustituyó con IHH, una IgG 1 humana anti-NIP con tres mutaciones puntuales (I253A/H310A/H435A) en el dominio Fc que suprime la unión a FcRn (Qiao et al., 2008, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105: 9337-9342), no se observó liberación de citocinas, lo que demuestra que el efecto medido en el ensayo era dependiente de FcRn.

La adición de NIP-OVA-IgG en presencia del anticuerpo anti-FcRn H3Vk2 produjo una marcada diminución de la cantidad de citocinas producidas (véanse las barras grises en las Fig. 8, 9, 10 y 14, respectivamente). Esto demuestra la eficacia de los anticuerpos anti-FcRn descritos en el presente documento para bloquear uno de los efectos de la interacción entre FcRn y IC. Es notable que no todos los monos produjeran cantidades significativas de citocinas en este ensayo. Por lo tanto, no todos los monos presentaron inhibición medible de la producción de citocinas por H3V^k2.

Los monos que no produjeron cantidades significativas de citocinas no serían buenos candidatos para recibir terapia con un anticuerpo anti-FcRn. En cambio, los monos que presentaron producción de cantidades significativas de citocinas y mostraron una buena inhibición de la producción de citocinas en presencia de H3Vk2 serían buenos candidatos para recibir terapia con un anticuerpo anti-FcRn.

La Figura 11 muestra los resultados de otra serie de ensayo basado en sangre completa en el que se añadieron cantidades crecientes de H3Vk2. Como indican las tres barras más a la derecha de los gráficos, se observó un efecto inhibidor dependiente de la dosis de H3Vk2 sobre la cantidad de citocinas producidas.

El ensayo de sangre completa descrito anteriormente se adaptó para su uso con sangre completa de seres humanos. A sangre heparinizada completa de sujetos humanos se añadió complejos inmunitarios previamente formados de NIP-OVA a diversas concentraciones desde 1,0 μg/ml hasta 100 μg/ml con una concentración estable de o IgG humana anti-NIP o anti-NIP-IHH mutado para no unirse a FcRn. Las muestras de sangre completa se incubaron a 37 °C y los niveles de citocinas se midieron por ELISA o matriz de perlas después de 24 o 36 horas. Como se muestra en la Figura 17, los complejos inmunitarios NIP-OVA-IgG estimularon la liberación de múltiples citocinas diferentes, mientras que la ausencia de respuesta de complejos inmunitarios NIP-OVA-IHH demuestra que el efecto medido en el ensayo era dependiente de FcRn.

La Figura 18 muestra que la adición de NIP-OVA-IgG en presencia de los anticuerpos anti-FcRn H3E8 y H3Vk2 en formato IgG4 produjo la diminución de la cantidad de citocinas producidas. El ensayo se volvió a realizar con H3Vk2 y anticuerpos de control en formato F(ab')². Los resultados se muestran en la Figura 19, que demuestra la eficacia de los anticuerpos anti-FcRn descritos en el presente documento para bloquear uno de los efectos de la interacción entre FcRn y IC en sangre humana completa.

Ejemplo 9

Estudio de depuración de IgG

Se realizó un estudio in vivo usando ratones transgénicos para examinar los efectos de los anticuerpos anti-FcRn sobre la depuración de IgG humana. Se dividieron veinte (20) ratones hFcRn TG de 14,9 semanas ± 3 días de edad hemicigóticos para el transgén FCGRT humano en los grupos 1 y 2 que contenía cada uno cinco hembras y cinco machos. En el día 0, todos los ratones se administraron previamente por inyección IV con IVIG humana a 245 mg/kg mezclado con 5 mg/kg del mAb IgG 1 humanizado específico de lisozima de huevo de gallina, HuLys11, para un total de 250 mg/kg de IgG. Se recogieron muestras de sangre de cada ratón 48, 56, 72, 80, 96, 120 y 144 horas después de la inyección IV con IgG humana//HuLys11. Una hora después de la extracción de sangre a las 48 horas, se administró IV 20 mg/kg de H3V^k2 o PBS. Las concentraciones plasmáticas de HuLys 11 se cuantificaron por ELISA. El tratamiento con 20 mg/kg de H3Vk2 dio una reducción triple altamente significativa (p=0,0001) en las concentraciones plasmáticas de HuLys11 en comparación con el grupo de control de PBS. Este resultado demuestra que el bloqueo de hFcRn por H3Vk2 promueve la depuración de hIgG de la circulación.

La Fig. 15 muestra los resultados del estudio representados como el porcentaje (± error estándar) de HuLys11 (IgG1 humana) restante basándose en la cantidad de HuLys11 en el plasma de ratones 48 horas antes de la inyección de 20 mg/kg de SYNT001 a las 2 horas después de la extracción de sangre de 48 horas.

Ejemplo 10

Estudio de depuración de complejos inmunitarios

Se realizó un estudio in vivo usando ratones transgénicos para examinar los efectos de anticuerpos anti-FcRn sobre complejos inmunitarios multiméricos formados in vitro e infundidos por vía intravenosa en ratones hFcRn TG según Qiao SW, PNAS 2008. Se aleatorizaron dieciséis (16) ratones hFcRn Tg de 8,1 semanas /- 3 días de edad hemicigóticos para el transgén FCGRT humano en 2 grupos de 8 ratones (4 machos/4 hembras). Se formaron IC multiméricos incubando 750 μg/ml de anti-NIP NIPhIgG con 75 μg/ml de ovoalbúmina conjugada con NIP (con 11 moléculas de NIP por OVA) durante 20 minutos a temperatura ambiente en PBS. En el día 0, ocho ratones de cada grupo se administraron previamente por inyección IV con el IC NIPhIgG /NIP-OVA a 7,5 mg/kg y 0,75 mg/kg, respectivamente. Esto es equivalente a 150 μg de NIPhIgG 15 μg de NIP-OVA para una dosis de 20 g de peso corporal. Se recogieron muestras de sangre 24, 32, 48, 56, 72, 96 y 120 horas después de la inyección IV con los complejos inmunitarios. Una hora después de la extracción de sangre a las 24 horas, se administró IV 20 mg/kg de H3Vk2 o PBS. Las concentraciones plasmáticas de NIPhIgG se cuantificaron por ELISA. Los resultados de este experimento in vivo confirman que H3V^k2 inhibe la protección proporcionada por FcRn sobre el catabolismo de complejos inmunitarios formados entre IgG y antígeno similarmente a lo observado en el Ejemplo 9 para IgG monomérica.

La Fig. 16 muestra los resultados del estudio representado como el % medio de IC que queda basándose en los niveles basales de 24 h (± error estándar) en los momentos de tiempo indicados.

Ejemplo 11

Expresión de FcRn de monocito

Expresión de FcRn de monocito de muestras de sangre completa de macacos cangrejeros para caracterizar las propiedades farmacocinéticas y la respuesta de marcadores farmacodinámicos adicionales tras la inyección de anticuerpo anti-FcRn. Se administró a macacos cangrejeros una vez a la semana por inyección intravenosa con o vehículo (grupo 1), H3Vk2 a 10 mg/kg/dosis (grupo 2), H3Vk2 a 40 mg/kg/dosis (grupo 3) o H3E8 a 40 mg/kg/dosis (grupo 4) durante cuatro semanas, seguido por un periodo de recuperación de cuatro semanas. Se recogieron muestras de sangre completa por venopunción en tubos que contenían anticoagulante K²EDTA y se mantuvieron a temperatura ambiente hasta que se analizaron. Se tomaron dos muestras antes de la inyección inicial de anticuerpos anti-FcRn, a las dos horas después de la primera inyección, luego inmediatamente antes y dos horas después de cada inyección posterior. Se usó una alícuota de sangre para medir el número de leucocitos (total, absoluto y porcentaje diferencial) por ADVIA. Los números de leucocitos y las cifras totales de linfocitos (TLC) se informaron como los linfocitos por gl de sangre completa (células/gl). Las cifras de células de monocitos se informaron como un porcentaje relativo (%), así como linfocitos por gl de sangre completa (células/gl).

Se analizaron niveles de expresión de FcRn de monocitos extracelulares e intracelulares usando citometría de flujo usando un citómetro de flujo FACSCantoTM II con el software FACSDivaTM. Para la expresión del receptor FcRn extracelular e intracelular en monocitos, se informó de la intensidad media de fluorescencia geométrica (GeoMFI) de la expresión de FcRn en células CD45+CD14+FcRn+ y el valor del porcentaje de monocitos CD14+ que expresan FcRn a partir de la población de monocitos CD14+. Además, se informó de cifras absolutas de monocitos (CD45+/CD14+) y porcentajes relativos.

En la mayoría de los animales administrados, cuando se comparó con los momentos de tiempo previos al estudio, se obtuvo una tendencia hacia una disminución para la media geométrica de la intensidad media de fluorescencia (GeoMFI) para la expresión de FcRn extracelular en las células CD45+/CD14+FcRn+ 2 horas después de la dosis en cada punto, como se muestra en la Tabla 15. Se consideró que estos cambios eran un resultado de la elevada unión de los anticuerpos anti-FcRn al receptor FcRn. En general, los valores de geoMFI volvieron a los niveles previos al estudio antes de cada dosis programada. Este patrón se observó a través de los grupos tratados y la magnitud de disminución fue similar entre los grupos que recibieron H3V^k2 a 10 mg/kg/dosis, H3V^k2 a 40 mg/kg/dosis y H3E8 a 40 mg/kg/dosis. No se observaron cambios en el porcentaje relativo de CD45+/CD14+/FcRn+ para la expresión de FcRn extracelular en monocitos CD14+.

Cuando se tuvo en cuenta la variabilidad global y la ausencia de tendencias en cada punto, no hubo cambios relacionados con SYNT001-H3 Vk2 o SYNT001-H3E8 en el número de leucocitos, en los porcentajes relativos y la media geométrica de CD45+/CD14+/FcRn+ para la expresión de FcRn intracelular en monocitos CD14+ en todos los grupos tratados durante los periodos principal y de recuperación periodos.

Estos datos sugieren que la expresión de FcRn de la superficie celular de monocitos se pueden usar como un marcador sustituto para los niveles de fármaco de anticuerpo anti-FcRn.

Claims

REIVINDICACIONES

1.Un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a FcRn que comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, en donde la secuencia de la región variable de la cadena pesada es SEQ ID NO:56 y la secuencia de la región variable de la cadena ligera es SEQ ID NO:22.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, que tiene isotipo IgG4 o que es un scFv, Fv, Fab', Fab, F(ab^')2o diacuerpo, opcionalmente en donde el anticuerpo de isotipo IgG4 contiene modificaciones S241P en las cadenas pesadas y/o en donde el anticuerpo carece de lisinas carboxiterminales en las cadenas pesadas.

3. Un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo contra FcRn o fragmento de unión al antígeno de la reivindicación 1 o 2.

4. Un vector de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico aislado según la reivindicación 3.

5. Una célula hospedadora procariota o eucariota que comprende un ácido nucleico aislado según la reivindicación 3.

6. Una composición que comprende un anticuerpo contra FcRn o fragmento de unión al antígeno de la reivindicación 1 o 2, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

7. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la reivindicación 1 o 2 para su uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmune.

8. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno para el uso de la reivindicación 7, en donde la enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que consiste en pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, anemia hemolítica autoinmune (AIHA) y miastenia grave (MG)