ES2956013T3 - Formulación de equinomicina, método de producción y método de uso de la misma - Google Patents

Abstract

Una formulación de fármaco liposomal para tratar una enfermedad en un paciente caracterizada por la sobreexpresión de HIF-1α y/o HIF-2α incluye una pluralidad de liposomas en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los liposomas encapsulan la equinomicina y están hechos de un fosfolípido pegliado, un fosfoglicérido neutro y un esterol. Los liposomas PEGilados pueden usarse para tratar enfermedades proliferativas, leucemia, cáncer, enfermedades autoinmunitarias y enfermedad de injerto contra huésped. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Formulación de equinomicina, método de producción y método de uso de la misma

Esta solicitud reivindica prioridad con respecto a la solicitud de patente provisional de EE.UU. nro. 62/253,257, presentada el 10 de noviembre de 2015.

Campo

Esta solicitud se refiere en general a composiciones y métodos para preparar formulaciones de equinomicina liposomal para el tratamiento de enfermedades, particularmente trastornos proliferativos, enfermedades autoinmunes y respuestas aloinmunes.

Antecedentes

Los factores inducibles por hipoxia (HIF) son factores transcripcionales y median la respuesta celular a la hipoxia. Se sabe que los HIF están regulados al alza en muchos tipos de cáncer, enfermedades autoinmunes y respuestas aloinmunes. En particular, los HIF están involucrados en el metabolismo tumoral, la angiogénesis y la metástasis (Semenza, G.L. et al., Nature Rev. Cancer. 2003;3(10):721-32).

La equinomicina (NSC526417) es un miembro de la familia de las quinoxalinas aislado originalmente de Streptomyces echinatus en 1957. La equinomicina es una molécula pequeña que inhibe la actividad de unión a ADN de HIF1a. Se ha demostrado que la equinomicina presenta actividad antitumoral frente a tumores murinos implantados con melanoma B16 y leucemia P388 y frente al crecimiento de células tumorales humanas in vitro e in vivo. Además, se demostró que la equinomicina erradica de manera eficiente la leucemia linfoblástica aguda de ratón y la leucemia mieloide aguda humana en modelos xenogénicos al eliminar preferiblemente las células madre de la leucemia (Wang et al., Cell Stem Cell. 2011;8(4):399-411).

El Instituto Nacional del Cáncer introdujo la equinomicina en ensayos clínicos. Sin embargo, la equinomicina, tal como se empleó en estos estudios, no demostró una actividad antitumoral significativa en pacientes tratados previamente. A lo largo de los años se han realizado múltiples experimentos de fase I (7-11) y fase II (12-19) para tumores sólidos. Sin embargo, debido a que el fármaco no fue sistemáticamente efectivo para pacientes con tumores sólidos que son refractarios a todas las terapias existentes, se detuvo el desarrollo clínico de la equinomicina. Dado que los estudios se realizaron mucho antes de que se supiera que la equinomicina es un inhibidor de HIF (Kong D. et al., Cancer Res. 2005;65(19):9047-55), los estudios de eficacia no se diseñaron para evaluar el posible beneficio de la supresión de HIF. Aunque la equinomicina se usó en varios experimentos de fase II con una dosis de 1200 |jg/m2 en humanos, no surgieron datos de farmacocinética (PK), ya que no había ningún método disponible entre 1985 y 1995 para medir la concentración del fármaco. Sin embargo, recientemente han surgido nuevos métodos que revelan que la equinomicina tiene una semivida corta in vivo, lo que limita su uso clínico.

La equinomicina es muy insoluble en agua, lo que complica los medios por los que se puede formular el fármaco en una forma de dosificación adecuada. Cuando se disuelve en agua, la equinomicina se precipita rápidamente fuera de la solución y, por lo tanto, cualquier formulación que dependa de la mezcla del fármaco libre con un disolvente acuoso no puede producir una biodisponibilidad significativa en el receptor. Además, los disolventes disponibles con los que se puede disolver la equinomicina, tales como el DMSO, son clínicamente inaceptables debido a la naturaleza severa de estos disolventes para el paciente. Los experimentos clínicos para la equinomicina también revelaron efectos secundarios significativos, tales como náuseas y vómitos intensos, lo que limita aún más su utilidad clínica.

En vista de las limitaciones descritas anteriormente, existe la necesidad de formulaciones de equinomicina nuevas y eficaces, que no sean tóxicas y sean eficaces contra trastornos proliferativos, enfermedades autoinmunes, enfermedad de injerto contra huésped o cualquier otra enfermedad que necesite la supresión de HIF-1.

El documento WO00/42989 divulga un proceso para producir un cocleato a base de lípidos de tamaño pequeño. Los cocleatos se obtienen de liposomas que se suspenden en una solución polimérica bifásica acuosa, lo que permite el reparto diferencial de estructuras basadas en moléculas polares mediante la separación de fases. La solución polimérica bifásica que contiene liposomas, tratada con moléculas cargadas positivamente tales como Ca2+ o Zn2+, forma un precipitado de cocleato con un tamaño de partícula inferior a una micra. El proceso puede usarse para producir cocleatos que contienen moléculas biológicamente relevantes. Los cocleatos de tamaño pequeño pueden administrarse por vía oral o a través de la mucosa para obtener un método de tratamiento eficaz.

El documento US2014/0271820 divulga una composición para el tratamiento del cáncer que incluye liposomas zwitteriónicos que consisten esencialmente en: un 50-70 % en moles de un lípido de fosfatidilcolina, un 25-45 % en moles de colesterol y un 2-8 % en moles de un lípido-PEG; y oxaliplatino. El oxaliplatino se encapsula en los liposomas en una cantidad tal que la relación entre el peso total de lípidos y el peso de oxaliplatino sea de aproximadamente 20:1 a aproximadamente 65:1. También se divulgan métodos para la preparación de oxaliplatino liposomal y el tratamiento del cáncer.

El documento US2012/0264697 divulga un método para tratar un cáncer hematológico utilizando un factor inducible por hipoxia (inhibidor de HIF). La invención también se refiere a la inducción de la remisión de la leucemia mieloide aguda usando el inhibidor de HIF. La invención se refiere además a la inhibición de una función de mantenimiento o supervivencia de una célula madre cancerosa (CSC) utilizando el inhibidor de HIF. El documento US2013/0164370 divulga un nuevo método para tratar a un individuo que padece una infección bacteriana, tal como infecciones bacterianas de diversos tejidos u órganos de un individuo. En general, el método de tratamiento implica administrar a un individuo una formulación farmacéutica que comprende un agente antimicrobiano encapsulado en liposomas, en el que se unen de forma covalente moléculas de polietilenglicol (PEG) a la superficie de los liposomas.

Compendio

Un aspecto de la presente solicitud se refiere a una formulación de fármaco liposomal para tratar una enfermedad en un paciente, según la reivindicación 1. La formulación de fármaco liposomal contiene una pluralidad de liposomas en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los liposomas encapsulan la equinomicina y están hechos de un fosfolípido pegilado, un fosfoglicérido neutro y un esterol.

En una realización, el fosfolípido pegilado es un diestearoilfosfatidiletanolamina-polietilenglicol (DSPE-PEG), dimiristoil fosfatidiletanolamina-polietilenglicol (DMPE-PEG), dipalmitoilglicerosuccinato polietilenglicol (DPGS-PEG), colesteril-polietilenglicol, o un lípido pegilado a base de ceramida.

En otra realización, el fosfoglicérido neutro se selecciona del grupo que consiste en fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol y fosfatidilinositol.

En otra realización, la proporción molar de fosfolípido pegilado a lípidos totales en la formulación es de un 3 a un 6 %; la proporción molar de fosfoglicérido neutro a lípidos totales en la formulación está entre un 45 y un 60 %; y la proporción molar de esterol a lípidos totales en la formulación está entre un 30 y un 50 %.

En una realización, el fosfolípido pegilado es diestearoilfosfatidiletanolamina-polietilenglicol (DSPE-PEG), el fosfoglicérido neutro es fosfatidilcolina y el esterol es colesterol.

En una realización concreta, los liposomas comprenden un 5.3 % de DSPE-PEG-2000, un 56.3 % de fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC) y un 38.4 % de colesterol.

En ciertas realizaciones, la proporción en masa de equinomicina a lípidos totales está entre un 2 y un 10 %. En una realización concreta, la proporción en masa de equinomicina a lípidos totales es del 5 %.

En algunas realizaciones, al menos el 90 % de los liposomas en la formulación tienen un diámetro entre 80 y 120 nm.

En algunas realizaciones, el índice de polidispersidad promedio de los liposomas es <0.1 y los liposomas son suficientemente estables para lograr una vida útil de almacenamiento de al menos 12 meses a 4 °C.

En otras realizaciones, los liposomas se formulan como un polvo liofilizado.

En otro aspecto, se proporciona la formulación liposomal pegilada según la reivindicación 1 para uso en el tratamiento de una enfermedad en un paciente caracterizado por sobreexpresión de HIF-1a y/o HIF-2a. En una realización, la enfermedad es un trastorno proliferativo. En una realización concreta, la enfermedad proliferativa es leucemia. En otra realización, el trastorno proliferativo es cáncer de mama.

En otra realización, la enfermedad es una enfermedad autoinmune.

En otra realización, la enfermedad es una enfermedad de injerto contra huésped.

En otro aspecto, un método para producir una formulación liposomal pegilada según la presente solicitud incluye formar una mezcla que comprende equinomicina y los componentes lipídicos, incluidos el fosfolípido pegilado, el fosfolípido neutro y el esterol en un disolvente polar; secar la mezcla para eliminar el disolvente polar, formando así una película lipídica seca; solubilizar y dispersar la película lipídica seca en un tampón para formar una suspensión lipídica; extruir la suspensión lipídica a través de un filtro de policarbonato para lograr un intervalo de tamaños de liposomas deseado; y esterilizar los liposomas por filtración.

Breve descripción de los dibujos

FIG. 1. Características físicas de la equinomicina liposomal. (A) Distribución de tamaños para una preparación típica medida por dispersión de luz dinámica (DLS) en el software Malvern Zetasizer. (B) Resumen del tamaño promedio y potencial zeta de la equinomicina liposomal. Los datos son un resumen de 6 preparaciones independientes /- d.e. Las mediciones se realizaron utilizando el software Malvern Zetasizer.

FIG. 2. Liberación in vitro de equinomicina a partir de equinomicina liposomal. (Serie A) Curva de liberación de fármaco de equinomicina liposomal dializada contra ddH²O a 21 °C. Los puntos de datos representan promedios /- d.e. de mediciones por triplicado mediante HPLC. (Serie B) Cromatogramas de HPLC representativos que indican los niveles máximos de equinomicina en los puntos de tiempo correspondientes representados en la (Serie A).

Figura 3. Estabilidad y almacenamiento de equinomicina liposomal in vitro. (Serie A y Serie B) La equinomicina liposomal se almacenó a 4 °C y se tomaron muestras para los parámetros de estabilidad después de 1 y 3 meses de almacenamiento. Cero meses indica mediciones realizadas directamente después de la preparación. Mediciones de tamaño promedio y potencial zeta (Serie A) e índice de polidispersidad promedio (Pdl) (Serie B) de equinomicina liposomal durante el almacenamiento a 4 °C. Los datos se generaron utilizando el software Malvern Zetasizer y las barras de error representan la d.e. de mediciones por triplicado. (Serie C) Análisis por HPLC de la pérdida de contenido de equinomicina durante el almacenamiento a 4 °C expresada como porcentaje de la medición inicial (0 meses). Las barras de error representan la d.e. de mediciones por triplicado.

Figura 4. Comparación de la toxicidad y la eficacia de la equinomicina liposomal frente a la libre. (Serie A) Cambio de peso corporal en ratones hembra NSG que recibieron un ciclo terapéutico de equinomicina liposomal, equinomicina PBS (DMSO al 20 % en PBS) o una dosis equivalente de vehículo liposomal vacío. Los ratones se trataron con 250 μg/kg de equinomicina liposomal (n=7) o libre (n=7), o vehículo equivalente (n=4), por vía iv una vez cada dos días durante un total de 3 dosis). (Serie B) Supervivencia de ratones NSG a los que se administró una inyección iv única de 1 mg/kg de equinomicina liposomal o libre, o una dosis equivalente de vehículo liposomal vacío.

Figura 5. Comparación de la farmacocinética de la equinomicina liposomal frente a la libre. Niveles plasmáticos séricos de equinomicina detectados por MS después de la administración de una dosis única iv de 0.1 mg/kg de equinomicina liposomal o equinomicina libre.

Figura 6. Acumulación de equinomicina en un tumor. Concentración de equinomicina en un tumor de mama SUM 159 después de una inyección iv de dosis única (0.1 mg/kg) de equinomicina liposomal y formulada convencionalmente. n=3/punto de tiempo.

Figura 7. Acumulación de HIF-1a en ETP-ALL. (Serie A) Los niveles de proteína HIF-1a en los bazos de modelos de xenoinjerto ETP ALL se midieron mediante transferencia Western. (Serie B) Unas células ETP-ALL-1 del bazo de ratones con xenoinjerto se tiñeron con marcadores de superficie anti-hCD45 y CD117 y se tiñeron intracelularmente con anticuerpo HIF-1a conjugado con APC, seguido de análisis FACS.

Figura 8. La equinom icina liposomal elim ina las células ETP-ALL humanas en un modelo de ratón con xenoinjerto. (Serie A) Régimen de dosificación del tratamiento con equinomicina liposomal para ratones humanizados con ETP-ALL para los datos de la serie B. El día 0 indica el día del trasplante con células ETP-ALL-1 humanas. Las flechas verdes representan una inyección individual de equinomicina liposomal (0.35 mg/kg/inyección por vía iv). Las flechas rojas indican análisis de sangre. (Serie B) A ratones NSG con 1.3 Gys irradiados se les administró una inyección iv de 1 x 106 células ETP-ALL-1 humanas. Se detectaron células CD45+ humanas en PBMC de receptores mediante análisis FACS el día 34 después del trasplante. El porcentaje de CD45+ humano en PBMc de ratones receptores antes del tratamiento (día 34) y después del tratamiento (días 42, 48, 56 y 64) de ratones (tratamiento con vehículo y equinomicina liposomal) se analizó mediante análisis FACS. Resumen del porcentaje de CD45+ humano en PBMC de todos los ratones receptores tratados con vehículo o equinomicina liposomal (n=10 para cada grupo). (Serie C) En dosis bien toleradas, la equinomicina liposomal es más eficaz que la equinomicina máximamente libre. Los ratones NSG se irradiaron con 1.3 Gys y se les administró una inyección iv de 1 x 106 células ETP-ALL-1 humanas. El análisis FACS se realizó el día 21 antes del tratamiento. El día 22, los ratones recibieron la primera dosis de tratamiento. Un grupo de ratones receptores (PBS-EM, n=5) recibió 3 ciclos de equinomicina en PBS (15 dosis totales). En cada ciclo, los ratones recibieron equinomicina en PBS, en una dosis de 0.1 mg/kg por inyección iv, una vez al día durante un total de 5 dosis, seguido de 5 días de descanso antes del inicio del siguiente ciclo. En otro grupo de receptores (Lipo-EM, n=5), los ratones recibieron 0.35 mg/kg de equinomicina liposomal por inyección iv.

La equinomicina liposomal se administró una vez cada 4 días durante las 2 primeras dosis a partir del día 22, seguidas de 7 días de descanso. Luego, los ratones recibieron una inyección cada dos días durante 4 dosis, seguidas de 7 días de descanso, y completadas con una inyección cada dos días durante 4 dosis más (10 dosis en total). Un grupo adicional de ratones recibió vehículo liposomal vacío (n=5) según el mismo programa en el que se administró la equinomicina liposomal. El porcentaje de CD45+ humano en PBMC de receptores después del tratamiento con equinomicina (días 34, 50 y 65) de ratones se analizó mediante análisis FACS.

Fig. 9. La equinomicina redujo el número de células vivas de cáncer de mama in vitro. Se trataron células de cáncer de mama con niveles altos (SUM 159) o bajos (MCF7) de HIF-1a con diversas concentraciones de equinomicina in vitro. Se muestra la correlación entre la concentración de equinomicina y las proporciones relativas de células supervivientes después del cocultivo con equinomicina. Las células SUM 159 con alto HIF-1a son más sensibles a la equinomicina que las MCF7, que expresan menos HIF-1a.

Figura 10. Acumulación de equinomicina en células de cáncer de mama xenoinjertadas. La línea celular de cáncer de mama humano SUM-159 se transfectó con luciferasa y se xenoinjertó ortotópicamente en las almohadillas de grasa mamaria de ratones hembra NSG. Se administraron liposomas marcados con DiR o DiR libre en agua a los ratones xenoinjertados de acuerdo con la clave en la parte inferior de la figura. Se utilizó formación de imágenes por bioluminiscencia para evaluar la expresión de luciferasa en células xenoinjertadas (serie superior) y la presencia de equinomicina liposomal mediante formación de imágenes por bioluminiscencia (serie inferior).

Figura 11. Efecto terapéutico de la equinomicina liposomal en el cáncer de mama in vivo. (Serie A) Unos ratones hembra NSG recibieron xenoinjertos de células humanas de cáncer de mama SUM159 y fueron tratados con equinomicina libre o vehículo (n=10 por grupo). Los ratones recibieron 0.1 mg/kg de equinomicina libre o vehículo mediante inyección iv una vez cada 3 días a partir del día 28 durante un total de 6 dosis. Se muestra la cinética de crecimiento de SUM159. (Serie B) Unos ratones hembra NSG recibieron xenoinjertos de células de cáncer de mama SUM159 y fueron tratados con equinomicina liposomal o vehículo (n=5 por grupo). Se muestra la cinética de crecimiento de SUM159 en ratones receptores tratados con vehículo y equinomicina liposomal. Los ratones recibieron 0.35 mg/kg de equinomicina liposomal o vehículo mediante inyección iv los días 9, 11, 13, 25 y 27. Se registró el volumen promedio del tumor durante todo el experimento. Las barras de error representan ± ETM. Las dosificaciones y los tratamientos individuales se indican con asteriscos. (Serie C) Los ratones se sacrificaron y los tumores se diseccionaron y fotografiaron. (Serie D) Resumen del peso tumoral del cáncer de mama de ratones tratados con vehículo y equinomicina liposomal. El peso se expresa como peso promedio ± d.e., el valor P se calculó mediante la prueba de la t.

Descripción detallada

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen los mismos significados que los entendidos comúnmente por un experto en la técnica a la que pertenecen el método y las composiciones divulgados. Se debe observar que, tal como se utilizan en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares «uno», «una», «el» y «la» incluyen referencias plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a «un péptido» incluye una pluralidad de tales péptidos, la referencia a «el péptido» es una referencia a uno o más péptidos y equivalentes de éstos conocidos por los expertos en la técnica, etc.

Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "trastorno proliferativo celular" se refiere a un trastorno caracterizado por una proliferación anormal de células. Un trastorno proliferativo no implica ninguna limitación con respecto a la tasa de crecimiento celular, sino que simplemente indica una pérdida de los controles normales que influyen en el crecimiento y la división celular. Por lo tanto, en algunas realizaciones, las células de un trastorno proliferativo pueden tener las mismas tasas de división celular que las células normales, pero no responden a las señales que limitan dicho crecimiento. Dentro del ámbito del "trastorno proliferativo celular" se encuentra una neoplasia o tumor, que es un crecimiento anormal de tejido. "Cáncer" se refiere a una cualquiera de diversas neoplasias malignas caracterizadas por la proliferación de células que tienen la capacidad de invadir el tejido circundante y/o metastatizar en nuevos sitios de colonización, e incluye leucemia, linfoma, carcinoma, melanoma, sarcoma, tumor de células germinales y blastoma. Los ejemplos de cánceres para el tratamiento con la formulación de la presente divulgación incluyen cáncer de cerebro, vejiga, mama, cuello uterino, colon, cabeza y cuello, riñón, pulmón, pulmón no microcelular, mesotelioma, ovario, próstata, estómago, útero, leucemia y meduloblastoma.

El término "leucemia" se refiere a enfermedades malignas progresivas de los órganos hematopoyéticos y se caracteriza generalmente por un desarrollo y una proliferación distorsionados de leucocitos y sus precursores en la sangre y la médula ósea. Los ejemplos de leucemias incluyen, por ejemplo, leucemia no linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia granulocítica aguda, leucemia granulocítica crónica, leucemia promielocítica aguda, leucemia de células T en adultos, leucemia aleucémica, leucemia leucocitémica, leucemia basófila, leucemia blastocelular, leucemia bovina, leucemia mielocítica crónica, leucemia cutis, leucemia embrionaria, leucemia eosinofílica, leucemia de Gross, tricoleucemia, leucemia hemoblástica, leucemia hemocitoblástica, leucemia histiocítica, leucemia de células madre, leucemia monocítica aguda, leucemia leucopénica, leucemia linfática, leucemia linfoblástica, leucemia linfocítica, leucemia linfógena, leucemia linfoide, leucemia de células del linfosarcoma, leucemia mastocítica, leucemia megacariocítica, leucemia micromieloblástica, leucemia monocítica, leucemia mieloblástica, leucemia mielocítica, leucemia mieloide granulocítica, leucemia mielomonocítica, leucemia de Naegeli, leucemia de células plasmáticas, leucemia plasmocítica, leucemia promielocítica, leucemia de células de Rieder, leucemia de Schilling, leucemia de células madre, leucemia subleucémica y leucemia de células indiferenciadas.

El término "carcinoma" se refiere al crecimiento maligno de células epiteliales que tienden a infiltrarse en los tejidos circundantes y producir metástasis. Los ejemplos de carcinomas incluyen, por ejemplo, carcinoma acinar, carcinoma acinoso, carcinoma adenoquístico, carcinoma adenoide quístico, carcinoma adenomatoso, carcinoma de corteza suprarrenal, carcinoma alveolar, carcinoma de células alveolares, carcinoma de células basales, carcinoma basocelular, carcinoma basaloide, carcinoma basoescamocelular, carcinoma bronquioalveolar, carcinoma bronquiolar, carcinoma broncogénico, carcinoma cerebriforme, carcinoma colangiocelular, carcinoma coriónico, carcinoma coloide, comedo carcinoma, carcinoma de cuerpo uterino, carcinoma cribriforme, carcinoma en coraza, carcinoma cutáneo, carcinoma cilíndrico, carcinoma de células cilíndricas, carcinoma ductal, carcinoma duro, carcinoma embrionario, carcinoma encefaloide, carcinoma epidermoide, carcinoma epitelial adenoide, carcinoma exofítico, carcinoma ex ulcere, carcinoma fibroso, carcinoma gelatiniforme, carcinoma gelatinoso, carcinoma de células gigantes, carcinoma gigantocelular, carcinoma glandular, carcinoma de células de la granulosa, carcinoma de la matriz pilosa, carcinoma hematoide, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células de Hurthle, carcinoma hialino, carcinoma hipernefroide, carcinoma embrionario infantil, carcinoma in situ, carcinoma intraepidérmico, carcinoma intraepitelial, carcinoma de Krompecher, carcinoma de células de Kulchitzky, carcinoma de células grandes, carcinoma lenticular, carcinoma lenticulare, carcinoma lipomatoso, carcinoma linfoepitelial, carcinoma medullare, carcinoma medular, carcinoma melanótico, carcinoma molle, carcinoma mucinoso, carcinoma mucoide, carcinoma mucocelular, carcinoma mucoepidermoide, carcinoma mucosum, carcinoma mucoso, carcinoma mixomatodes, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma de células en grano de avena, carcinoma ossificans, carcinoma osteoide, carcinoma papilar, carcinoma periportal, carcinoma preinvasivo, carcinoma de células espinosas, carcinoma pultáceo, carcinoma de riñón de células renales, carcinoma de células de reserva, carcinoma sarcomatoide, carcinoma schneideriano, carcinoma escirro, carcinoma escrotal, carcinoma de células en forma de anillo de sello, carcinoma simple, carcinoma de células pequeñas, carcinoma solanoide, carcinoma de células esferoidales, carcinoma de células fusiformes, carcinoma esponjoso, carcinoma escamoso, carcinoma de células escamosas, carcinoma en collar, carcinoma telangiectásico, carcinoma telangiectodes, carcinoma de células de transición, carcinoma tuberosum, carcinoma tuberoso, carcinoma verrugoso y carcinoma villosum.

El término "sarcoma" se refiere a un tumor hecho de una sustancia como el tejido conectivo embrionario y se compone generalmente de células densamente empaquetadas incluidas en una sustancia fibrilar u homogénea. Los ejemplos de sarcomas incluyen, por ejemplo, condrosarcoma, fibrosarcoma, linfosarcoma, melanosarcoma, mixosarcoma, osteosarcoma, sarcoma de Abemethy, sarcoma adiposo, liposarcoma, sarcoma alveolar de partes blandas, sarcoma ameloblástico, sarcoma botrioides, sarcoma cloroma, coriocarcinoma, sarcoma embrionario, sarcoma con tumor de Wilms, sarcoma de endometrio, sarcoma del estroma, sarcoma de Ewing, sarcoma fascial, sarcoma fibroblástico, sarcoma de células gigantes, sarcoma granulocítico, sarcoma de Hodgkin, sarcoma hemorrágico pigmentado idiopático múltiple, sarcoma inmunoblástico de células B, linfomas (por ejemplo, linfoma no Hodgkin), sarcoma inmunoblástico de células T, sarcoma de Jensen, sarcoma de Kaposi, sarcoma de células de Kupffer, angiosarcoma, leucosarcoma, sarcoma de mesenquimoma maligno, sarcoma perióstico, sarcoma reticulocítico, sarcoma de Rous, sarcoma serocítico, sarcoma sinovial y sarcoma telangiectásico.

El término "melanoma" se refiere a un tumor que surge del sistema melanocítico de la piel y otros órganos. Los melanomas incluyen, por ejemplo, melanoma acrolentiginoso, melanoma amelanótico, melanoma benigno juvenil, melanoma de Cloudman, melanoma S91, melanoma de Harding-Passey, melanoma juvenil, melanoma lentigo maligno, melanoma maligno, melanoma nodular, melanoma subungueal y melanoma de extensión superficial.

Los cánceres adicionales incluyen, por ejemplo, enfermedad de Hodgkin, mieloma múltiple, neuroblastoma, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, rabdomiosarcoma, trombocitosis primaria, macroglobulinemia primaria, tumores de pulmón de células pequeñas, tumores cerebrales primarios, cáncer de estómago, cáncer de colon, insulinoma pancreático maligno, carcinoide maligno, lesiones cutáneas premalignas, cáncer testicular, cáncer de tiroides, neuroblastoma, cáncer de esófago, cáncer del tracto genitourinario, hipercalcemia maligna, cáncer cervical, cáncer de endometrio y cáncer de la corteza suprarrenal.

Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "enfermedad autoinmune" se refiere a un estado en el que el sistema inmunitario de un individuo (por ejemplo, células T activadas) ataca los propios tejidos y células del individuo. La expresión "respuesta aloinmune" se refiere a un estado en el que el sistema inmunitario de un individuo ataca el tejido o las células implantados (como en un injerto o trasplante).

Los ejemplos de enfermedades autoinmunes para el tratamiento con las formulaciones de la presente divulgación incluyen artritis, alopecia greata, espondilitis anquilosante, anemia hemolítica autoinmune, hepatitis autoinmune, enfermedad de Behcet, enfermedad de Crohn, dermatomiositis, diabetes (Tipo I), glomerulonefritis, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré, trastorno inflamatorio intestinal (TII), nefritis lúpica, esclerosis múltiple, miastenia grave, miocarditis, pénfigo/penfigoide, anemia perniciosa, poliarteritis nodosa, polimiositis, cirrosis biliar primaria, psoriasis, artritis reumatoide, fiebre reumática, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, lupus eritematoso sistémico (LES), tiroiditis (tal como tiroiditis de Hashimoto y tiroiditis de Ord), colitis ulcerosa, uveítis, vitíligo y granulomatosis de Wegener. Los ejemplos de respuestas aloinmunes para el tratamiento con las formulaciones de la presente divulgación incluyen la enfermedad de injerto contra huésped (EICH) y el rechazo de trasplantes.

Tal como se usa en la presente memoria, "tratamiento" significa cualquier mejoramiento del trastorno proliferativo, de la enfermedad autoinmune o de la respuesta aloinmune.

Los términos "tratar" y "tratamiento" se refieren al mejoramiento de uno o más síntomas asociados con un trastorno proliferativo celular, enfermedad autoinmune o respuesta aloinmune; prevención o retraso del comienzo de uno o más síntomas de un trastorno proliferativo celular, enfermedad autoinmune o respuesta aloinmune; y/o disminución de la gravedad o frecuencia de uno o más síntomas de trastorno proliferativo celular, enfermedad autoinmune o respuesta aloinmune.

Los términos "mejorar", "aumentar" o "reducir", tal como se usan en este contexto, indican valores o parámetros relativos a una medición de base, tal como una medición en el mismo individuo antes del inicio del tratamiento descrito en la presente memoria, o medición en un individuo de control (o múltiples individuos de control) en ausencia del tratamiento descrito en la presente memoria.

Un "individuo de control" es un individuo que adolece de la misma enfermedad o trastorno que el individuo que se está tratando, que tiene aproximadamente la misma edad que el individuo que se está tratando (para asegurarse de que las etapas de la enfermedad en el individuo tratado y el o los individuos de control se puedan comparar). El individuo (también denominado "paciente" o "sujeto") que se está tratando puede ser un individuo mamífero, preferiblemente un individuo humano, tal como un feto, un bebé, un niño, un adolescente o un ser humano adulto.

Sistemas de aporte de fármacos de equinomicina en microemulsión

La presente solicitud proporciona un sistema de aporte de fármacos de equinomicina en microemulsión, que puede usarse en el tratamiento de trastornos proliferativos, enfermedades autoinmunes y respuestas aloinmunes en los que HIF-1a o HIF-2a estén elevados. Una emulsión es una mezcla de dos o más líquidos que normalmente son inmiscibles (no mezclables o que no se pueden mezclar). El sistema de aporte de fármacos de equinomicina en microemulsión puede comprender liposomas, micelas o una mezcla de liposomas y micelas. Un liposoma es una vesícula esférica con un núcleo de solución acuosa rodeado por una membrana hidrófoba, en forma de bicapa lipídica. Los liposomas suelen componerse de fosfolípidos, especialmente fosfatidilcolina, pero también pueden incluir otros lípidos, siempre que sean compatibles con la estructura de la bicapa lipídica. Una micela típica es una vesícula esférica formada por una sola capa de moléculas anfifílicas con las regiones hidrófilas de "cabeza" de las moléculas anfifílicas en contacto con el disolvente circundante, secuestrando las regiones hidrófobas de una sola cola en el centro de la micela.

La presente solicitud proporciona composiciones liposomales que encapsulan equinomicina, para uso en el tratamiento de enfermedades, incluidos trastornos proliferativos, enfermedades autoinmunes y respuestas aloinmunes en los que HIF-1a o HIF-2a estén elevados. Las formulaciones de equinomicina se administran a un paciente utilizando un sistema de aporte de fármacos en microemulsión. A menos que se indique lo contrario, debe interpretarse que la expresión "formulación de equinomicina" incluye formulaciones en microemulsión que contengan equinomicina.

El sistema de aporte de fármacos en microemulsión utilizado es un sistema de aporte de fármacos liposomal.

En la presente memoria se describen, pero no como parte de la invención, sistemas de aporte de fármacos en microemulsión que se componen de micropartículas (o microesferas), nanopartículas (o nanoesferas), nanocápsulas, micelas de copolímeros de bloques u otros sistemas poliméricos de aporte de fármacos.

También se describen en la presente memoria, pero no como parte de la invención, sistemas de aporte de fármacos que no son microemulsiones, basados en polímeros, tales como hidrogeles, películas u otros tipos de sistemas poliméricos de aporte de fármacos. También se describe en la presente memoria, pero no como parte de la invención, que la equinomicina o los análogos de equinomicina se administran por vía parenteral en un disolvente basado en lípidos.

Las formulaciones de la presente invención son útiles para el tratamiento de trastornos proliferativos, enfermedades autoinmunes y respuestas aloinmunes en todos los individuos mamíferos, particularmente pacientes humanos. Tal como se usa en la presente memoria, un "paciente" es un paciente humano.

La equinomicina (NSC526417) es un miembro de la familia de las quinoxalinas aislado originalmente de Streptomyces echinatus. La equinomicina es una molécula pequeña que inhibe la actividad de unión a ADN de HIF-1a. La equinomicina es soluble en etanol, álcalis, cetonas, ácido acético y cloroformo. Es insoluble en agua. Por lo tanto, la equinomicina es lipófila y generalmente se asocia fácilmente con lípidos, por ejemplo, muchos de los utilizados en los sistemas de aporte de fármacos en microemulsión de la presente invención. En determinadas realizaciones, la equinomicina también se puede formular como un quelato metálico.

Los análogos de equinomicina descritos en la presente memoria, pero no como parte de la invención, incluyen compuestos que, debido a su similitud estructural y funcional con la equinomicina, presentan efectos sobre la reducción de la actividad de HIF-1a o HIF-2a, similares a los de la equinomicina. Los ejemplos de análogos de equinomicina incluyen YK₂000 y YK₂005 (Kim, J.B. et al., Int. J. Antimicrob. Agents, diciembre de 2004; 24(6):613-615); quinomicina G (Zhen X. et al., Mar. Drugs, 18 de noviembre de 2015; 13(11):6947-61); 2QN (Bailly, C. et al., Anticancer Drug. Des., junio de 1999; 14(3):291-303); y quinazomicina (Khan, A.W. et al., Indian J. Biochem., diciembre de 1969; 6(4):220-1).

Los vehículos de aporte de fármacos en microemulsión, según la presente invención, se pueden usar para aportar equinomicina en células o en pacientes con trastornos proliferativos o enfermedades autoinmunes, o en pacientes que presenten respuestas aloinmunes en, por ejemplo, la EICH. La equinomicina se puede encapsular (o incorporar) en cualquier vehículo de aporte de fármacos en microemulsión adecuado, según la presente invención, que sea capaz de aportar el fármaco a las células diana in vitro o in vivo.

Tal como se usa en la presente memoria, un vehículo de aporte de fármacos en microemulsión es uno que comprende partículas que pueden suspenderse en un medio líquido farmacéuticamente aceptable en el que el intervalo de tamaños de las partículas oscila entre varios nanómetros y varios micrómetros de diámetro. Los sistemas de aporte de fármacos en microemulsión contemplados en la presente solicitud incluyen aquellos que conservan sustancialmente su naturaleza de microemulsión cuando se administran in vivo. Los sistemas de aporte de fármacos en microemulsión incluyen, pero no se limitan a, partículas basadas en lípidos y basadas en polímeros. Los ejemplos de sistemas de aporte de fármacos en microemulsión incluyen liposomas, nanopartículas (o nanoesferas), nanocápsulas, micropartículas (o microesferas), y micelas de copolímeros de bloques.

Los liposomas tienen muchas semejanzas con las membranas celulares y se usan en la presente invención como vehículos para la equinomicina. Son ampliamente adecuados, ya que pueden encapsularse tanto sustancias solubles en agua como sustancias solubles en lípidos, es decir, en los espacios acuosos y dentro de la propia bicapa, respectivamente. Los expertos en la técnica pueden modificar la formulación liposomal del liposoma para maximizar la solubilidad de la equinomicina en función de la hidrofugancia.

Los liposomas adecuados para el aporte de equinomicina incluyen aquellos compuestos principalmente de lípidos formadores de vesículas. Los lípidos formadores de vesículas apropiados para usar en la presente invención incluyen aquellos lípidos que pueden formar espontáneamente vesículas bicapa en agua, incluidos los fosfolípidos.

La selección de los lípidos apropiados para los liposomas se rige por los factores de: (1) estabilidad de los liposomas, (2) temperatura de transición de fase, (3) carga, (4) no toxicidad para los sistemas de mamíferos, (5) eficiencia de encapsulación, (6) características de la mezcla de lípidos. Se espera que un experto en la técnica que se beneficie de esta divulgación pueda formular liposomas según la presente invención que optimicen estos factores. Los lípidos formadores de vesículas de este tipo son preferiblemente los que tienen dos cadenas hidrocarbonadas, típicamente cadenas de acilo, y un grupo de cabeza, ya sea polar o no polar. Las cadenas hidrocarbonadas pueden estar saturadas o tener diversos grados de instauración. Existen diversos lípidos formadores de vesículas sintéticos y lípidos formadores de vesículas de origen natural, incluidos fosfolípidos, fosfoglicéridos, glicolípidos, tales como los cerebrósidos y gangliósidos, esfingolípidos, lípidos de éter, esteroles y fosfolípidos enjaulados.

El liposoma incluye una cubierta liposomal compuesta de una o más monocapas lipídicas o bicapas lipídicas concéntricas. Por lo tanto, la cubierta lipídica se puede formar a partir de una sola bicapa lipídica (es decir, la cubierta puede ser unilaminar) o varias bicapas lipídicas concéntricas (es decir, la cubierta puede ser multilaminar). Los lípidos pueden ser lípidos sintéticos, semisintéticos o de origen natural, incluidos fosfolípidos, tocoferoles, esteroides, ácidos grasos, glicoproteínas tales como albúmina, lípidos aniónicos y lípidos catiónicos. Los lípidos pueden tener un grupo de cabeza hidrófilo aniónico, catiónico o zwitteriónico, y pueden ser lípidos aniónicos, catiónicos o neutros a pH fisiológico.

Las formulaciones liposomales pueden incluir una mezcla de lípidos. La mezcla puede comprender (a) una mezcla de lípidos neutros y/o zwitteriónicos; (b) una mezcla de lípidos aniónicos; (c) una mezcla de lípidos catiónicos; (d) una mezcla de lípidos aniónicos y lípidos catiónicos; (e) una mezcla de lípidos neutros o zwitteriónicos y al menos un lípido aniónico; (f) una mezcla de lípidos neutros o zwitteriónicos y al menos un lípido catiónico; o (g) una mezcla de lípidos neutros o zwitteriónicos, lípidos aniónicos y lípidos catiónicos. Además, la mezcla puede comprender lípidos saturados, lípidos insaturados o una combinación de los mismos. Si un lípido insaturado tiene dos colas, ambas colas pueden ser insaturadas o puede tener una cola saturada y una cola insaturada. En algunas realizaciones, la mezcla de lípidos no contiene lípidos insaturados.

En una realización, la formulación lipídica está sustancialmente libre de lípidos aniónicos, sustancialmente libre de lípidos catiónicos, o ambos. En otra realización, la formulación lipídica está libre de lípidos aniónicos o lípidos catiónicos o ambos. En una realización, la formulación lipídica comprende sólo lípidos neutros. Normalmente, un componente lipídico neutro es un lípido que tiene dos grupos acilo (es decir, diacilfosfatidilcolina y diacilfosfatidiletanolamina). Los lípidos que tienen diversos grupos de cadena acilo de longitud de cadena y grado de saturación variables están disponibles comercialmente o pueden aislarse o sintetizarse mediante técnicas bien conocidas.

Los ejemplos de fosfolípidos neutros o zwitteriónicos incluyen, pero no se limitan a, fosfatidilcolina de huevo (EPC), fosfatidilglicerol de huevo (EPG), fosfatidilinositol de huevo (EPI), fosfatidilserina de huevo (EPS), fosfatidiletanolamina (EPE), fosfatidilcolina de huevo (EPC), fosfatidilglicerol de huevo (EPG), fosfatidilinositol de huevo (EPI), fosfatidilserina de huevo (EPS), fosfatidiletanolamina (EPE), ácido fosfatídico (EPA), fosfatidilcolina de soja (SPC), fosfatidilglicerol de soja (SPG), fosfatidilserina de soja (SPS), fosfatidilinositol de soja (SPI), fosfatidiletanolamina de soja (SPE), ácido fosfatídico de soja (SPA), fosfatidilcolina de huevo hidrogenada (HEPC), fosfatidilglicerol de huevo hidrogenado (HEPG), fosfatidilinositol de huevo hidrogenado (HEPI), fosfatidilserina de huevo hidrogenada (HEPS), fosfatidiletanolamina hidrogenada (HEPE), ácido fosfatídico hidrogenado (HEPA), fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), fosfatidilglicerol de soja hidrogenado (HSPG), fosfatidilserina de soja hidrogenada (HSPS), fosfatidilinositol de soja hidrogenado (HSPI), fosfatidiletanolamina de soja hidrogenada (HSPE), ácido fosfatídico de soja hidrogenado (HSPA), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), 1 -palmitoil-2-miristoil fosfatidilcolina (PMPC), 1 -miristoil-2-palmitoil fosfatidilcolina (MPPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), 1-palmitoil-2-estearoil fosfatidilcolina (PSPC), 1,2-diaraquidoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DBPC), 1-estearoil-2-palmitoil fosfatidilcolina (SPPC), 1,2-dieicosenoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DEPC), palmitoiloleoil fosfatidilcolina (POPC), dilauriloilfosfatidilcolina (DLPC), palmitoilestearoilfosfatidilcolina (PSPC), lisofosfatidilcolina (LPC), dilinoleoilfosfatidilcolina (DLPC), diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE), dimiristoilfosfatidiletanolamina (DMPE), dipalmitoil fosfatidiletanolamina (DPPE), dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE), dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoil fosfatidiletanolamina (POPE) y palmitoilestearoilfosfatidilglicerol (PSPG), esteroles, tales como colesterol y ergosterol; ésteres de colesterol, ceramidas, cerebrósidos, diacilglicerol, esfingosina, esfingomielinas, tales como esfingomielina cerebral, esfingomielina de huevo, dipalmitoil esfingomielina y diestearoil esfingomielina dihidroesfingomielina; y fosfolípidos acilados simples, tales como mono-oleoil-fosfatidiletanolamina (MOPE).

Los lípidos zwitteriónicos incluyen, pero no se limitan a, lípidos zwitteriónicos de acilo y lípidos zwitteriónicos de éter. Ejemplos de lípidos zwitteriónicos útiles son 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DSPE), 1,2-dioleoilsn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina (DOPE), 1,2-difitanoil-snglicero-3-fosfoetanolamina (DPyPE) y dodecilfosfocolina.

Los ejemplos de lípidos aniónicos incluyen dihexadecilfosfato (DhP), fosfatidilinositoles, fosfatidilserinas, incluidas diacilfosfatidilserinas, tales como dimiristoilfosfatidilserina, dipalmitoilfosfatidilserina; fosfatidilgliceroles, tales como dimiristoil fosfatidilglicerol (DMPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), diestearoil fosfatidilglicerol (DSPG), dioleoilfosfatidil glicerol (DO^p G), dilauriloilfosfatidil glicerol (DLPG), diesteariloilfosfatidil glicerol (DSPG) y lisilfosfatidilglicerol (LPG); fosfatidiletanolaminas, tales como N-dodecanoil fosfatidil etanolamina, N-succinil fosfatidiletanolamina, N-glutaril fosfatidiletanolamina; ácidos fosfatídicos, incluyendo difosfatidil glicerol y ácidos diacilfosfatídicos, tales como ácido dimiristoil fosfático y ácido dipalmitoil fosfático; cardiolipina y hemisuccinato de colesterol (CHEMS).

Los lípidos catiónicos normalmente tienen un resto lipófilo, tal como un esterol, una cadena de acilo o diacilo, y donde el lípido tiene una carga positiva neta global. Preferiblemente, el grupo de cabeza del lípido lleva la carga positiva. Los lípidos catiónicos ejemplares incluyen sales de N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetil amonio, a las que también se hace referencia como lípidos TAP, por ejemplo, sal de metilsulfato. Los lípidos TAP adecuados incluyen, pero no se limitan a, DOTAP (dioleoil-), DMTA^p (dimiristoil-), DPTAP (dipalmitoil-) y DSTAP (distearoil-). Otros lípidos catiónicos adecuados incluyen bromuro de dimetildioctadecil amonio (DDAB), 1,2-diaciloxi-3-trimetilamonio propanos, N-[1-(2,3-dioloiloxi)propil]-N,N-dimetil amina (DODAP), 1,2-diaciloxi-3-dimetilamonio propanos, cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA), 1,2-dialquiloxi-3-dimetilamonio propanos, dioctadecilamidoglicilespermina (DOGS), 3-[N'(N',N'-dimetilamino-etano)carbamoil] colesterol (DC-Chol); trifluoroacetato de 2,3-dioleoiloxi-N-(2-(esperminacarboxamido)-etil)-N,N-dimetil-1-propanaminio (DOSPA), .p-alanil colesterol, bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), diC14-amidina, N-tercbutil-N'-tetradecil-3-tetradecilaminopropionamidina, cloruro de N-(alfa-trimetilamonioacetil)didodecil-Dglutamato (TMAG), cloruro de ditetradecanoil-N-(trimetilamonio-acetil)dietanolamina, 1,3-dioleoiloxi-2-(6-carboxi-espermil)-propilamida (DOSPER), y N,N,N',N'-tetrametil-, N'-bis(2-hidroxiletil)-2,3-dioleoiloxi-1,4-butanodiamonio yoduro, derivados de cloruro de 1 -[2-(aciloxi)etil]2-alquil(alquenil)-3-(2-hidroxietil)-imidazolinio, tales como cloruro de 1-[2-(9(Z)-octadecenoiloxi)etil]-2 -(8(Z)-heptadecenil-3-(2-hidroxietil)-imidazolinio (DOTIM) y cloruro de 1-[2-(hexadecanoiloxi)etil]-2-pentadecil-3-(2-hidroxietil)imidazolinio (DPTIM) y derivados de amonio cuaternario de 2,3-dialquiloxipropilo que contienen un resto hidroxialquilo en la amina cuaternaria, por ejemplo, bromuro de 1,2-dioleoil-3-dimetil-hidroxietil amonio (DORI), bromuro de 1,2-dioleiloxipropil-3-dimetil-hidroxietil amonio (DORIE), bromuro de 1,2-dioleiloxipropil-3-dimetil-hidroxipropil amonio (DORIC-HP), bromuro de 1,2-dioleil-oxi-propil-3-dimetil-hidroxibutil amonio (DORIE-HB), bromuro de 1,2-dioleiloxipropil-3-dimetil-hidroxipentil amonio (DORIE-Hpe), bromuro de 1,2-dimiristiloxipropil-3-dimetil-hidroxietil amonio (DMRIE), bromuro de 1,2-dipalmitiloxipropil-3-dimetil-hidroxietil amonio (DPRIE), bromuro de 1,2-diesteriloxipropil-3-dimetil-hidroxietil amonio (DMRIE), 1,2-diesteariloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DSDMA), 1.2- dioleiloxi-N,Ndimetil-3-aminopropano (DODMA), 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DLinDMA), 1.2- dilinoleniloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DLenDMA).

Una formulación liposomal según la presente solicitud incluye al menos un fosfolípido dentro del liposoma que está pegilado, es decir, el fosfolípido incluye un resto de polietilenglicol. Los liposomas que incluyen fosfolípidos pegilados tendrán PEG orientado de modo que esté presente al menos en el exterior del liposoma (pero algo de PEG también puede estar expuesto al interior del liposoma, es decir, al núcleo acuoso). Esta orientación se puede lograr uniendo el PEG a una parte apropiada del lípido. Por ejemplo, en un lípido anfifílico, el PEG estaría unido a la cabeza hidrófila, ya que es esta cabeza la que se orienta por sí misma hacia el exterior de la bicapa lipídica que mira hacia la parte acuosa. La pegilación de esta manera se puede lograr mediante la unión covalente de un PEG a un lípido utilizando técnicas conocidas en la técnica.

Los lípidos pegilados ejemplares incluyen, pero no se limitan a, diestearoilfosfatidiletanolamina-polietilenglicol (DSPE-PEG), incluyendo DSPE PEG (1000 PM), DSPE PEG (2000 PM) y DSPE PEG (5000 PM); dimiristoil fosfatidiletanolamina-polietilenglicol (DMPE-PEG), incluyendo Dm PE Pe G (1000 PM), DMPE PEG (2000 PM) y DMPE PEG (5000 PM); dipalmitoilglicerosuccinato polietilenglicol (Dp Gs -PEG), incluyendo DPGS-PEG (1000 PM), D^p G^s (2000 PM) y DPGS (5000 PM); estearil-polietilenglicol, colesteril-polietilenglicol y lípidos pegilados a base de ceramida tales como N-octanoil-esfingosina-1-{succinil[metoxi(polietilenglicol)PM]}, la denominada ceramida C8 PEG (PM), donde PM es 750, 2000 o 5000, o N-palmitoil-esfingosina-1-{succinil[metoxi(polietilenglicol)PM]} o la denominada ceramida C16 PEG (PM), donde el PM es 750, 2000 o 5000. Se pueden obtener lípidos pegilados adicionales de Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, AL).

Un liposoma de la invención normalmente incluirá un gran número de restos PEG, que pueden ser iguales o diferentes. La masa molecular media del PEG en un liposoma de la invención es superior a 350 Da, pero inferior a 5 kDa, por ejemplo, entre 0.35-5 kDa, entre 1-3 kDa, entre 1-2-6 kDa, entre 2-3 kDa, o 4-5 kDa, o preferiblemente 2 kDa (PEG2000). El PEG normalmente comprenderá cadenas poliméricas lineales, pero, en algunas realizaciones, el PEG puede comprender cadenas poliméricas ramificadas.

En algunas realizaciones, el PEG puede ser un PEG sustituido, por ejemplo, en el que uno o más átomos de carbono en el polímero estén sustituidos por uno o más grupos alquilo, alcoxi, acilo o arilo. En otras realizaciones, el PEG puede incluir grupos de copolímero, por ejemplo, uno o más monómeros de propileno, para formar un polímero de polipropileno de PEG.

El liposoma se forma a partir de una mezcla de uno o más fosfolípidos pegilados y uno o más lípidos neutros adicionales. El porcentaje molar de los lípidos pegilados puede estar entre el 0.1-20 %. En algunas realizaciones, el porcentaje molar de los lípidos pegilados está entre el 1-9 %, entre el 2-8 % y preferiblemente entre el 5-6 % de los lípidos totales en la composición.

Tal como se usa en la presente memoria, el "porcentaje molar" de lípido A en una mezcla que contiene lípidos A, B y C se define como:

En la formulación, según la invención reivindicada, el liposoma se forma a partir de una mezcla de lípidos que comprende un fosfolípido pegilado, un fosfoglicérido neutro, tal como una fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol o fosfatidilinositol; y un esterol, tal como colesterol o ergosterol. En esta realización, el porcentaje molar del fosfolípido pegilado puede oscilar entre el 1 y el 10 % o entre el 3 y el 6 % de los lípidos totales; la cantidad de fosfoglicérido neutro (con respecto a lípidos totales) puede oscilar entre el 20-60 % o el 30-50 % o el 33-43 %; y la proporción molar del esterol neutro puede oscilar entre el 35-75 % o el 45-65 % o el 50-60 %.

En una realización concreta, el liposoma se forma a partir de una mezcla de DSPE-PEG(2000), HSPC y colesterol. En esta realización, el porcentaje molar de DSPE-PEG(2000) es de aproximadamente el 5.3 %, el porcentaje molar de HSPC es de aproximadamente el 56.3 % y el porcentaje molar de colesterol es de aproximadamente el 38.4 %.

Se describe en la presente memoria, pero no como parte de la invención, como una alternativa a la pegilación, que un lípido puede modificarse mediante la unión covalente de un resto diferente de PEG. Por ejemplo, un lípido puede incluir: un polifosfaceno, una poli(vinil pirrolidona), una poli(acril amida), una poli(2-metil-2-oxazolina), una poli(2-etil-2-oxazolina), un fosfatidil poliglicerol, una poli[N-(2-hidroxipropil)metacrilamida] o un polímero de éter de polialquileno, distinto del PEG.

El destino y la disposición de los liposomas inyectados por vía intravenosa dependen de sus propiedades físicas, tales como el tamaño, la fluidez y la carga superficial. Pueden perdurar en los tejidos durante horas o días, según su composición, y las semividas en la sangre oscilan entre minutos y varias horas. Los liposomas generalmente se dividen en tres grupos: vesículas multilaminares (MLV); vesículas unilaminares pequeñas (SUV); y vesículas unilaminares grandes (LUV). Las MLV tienen múltiples bicapas en cada vesícula, formando varios compartimentos acuosos separados. Las SUV y LUV tienen una sola bicapa que encapsula un núcleo acuoso. Las MLV normalmente tienen diámetros de 0.5 a 4 μm. La sonicación de MLV da como resultado la formación de vesículas unilaminares grandes (LUV) con diámetros en el intervalo de 50-500 nm o vesículas unilaminares pequeñas (SUV) con diámetros menores de 50 nm, típicamente en el intervalo de 200 a 500 A, que contienen un solución acuosa en el núcleo.

Los liposomas más grandes, tales como MLV y LUV, pueden ser recogidos rápidamente por células fagocíticas del sistema reticuloendotelial, pero la fisiología del sistema circulatorio impide la salida de especies tan grandes en la mayoría de los sitios. Pueden salir sólo en lugares donde existen grandes aberturas o poros en el endotelio capilar, tales como los sinusoides del hígado o el bazo. Por lo tanto, estos órganos son el sitio predominante de absorción. Por otro lado, las SUV muestran una distribución tisular más amplia, pero aún son altamente secuestradas en el hígado y el bazo. En general, este comportamiento in vivo limita el guiado potencial de los liposomas sólo a aquellos órganos y tejidos accesibles a su gran tamaño. Estos incluyen la sangre, el hígado, el bazo, la médula ósea y los órganos linfoides.

Los liposomas de la presente solicitud son preferiblemente SUV con un diámetro en el intervalo de 60-180 nm, 80-160 nm o 90-120 nm. Un liposoma de la presente solicitud puede ser parte de una formulación liposomal que comprenda una pluralidad de liposomas, en la que los liposomas dentro de la pluralidad pueden tener un intervalo de diámetros. En algunas realizaciones, una formulación liposomal comprende al menos el 80 %, al menos el 90 % o al menos el 95 % de los liposomas con un diámetro promedio en el intervalo de 60-180 nm, 80-160 nm, 90-120 nm. Además, los diámetros dentro de la pluralidad pueden tener un índice de polidispersidad <0.2, <0.1 o <0.05. En algunas realizaciones, el diámetro promedio de los liposomas se determina utilizando el método Malvern Zetasizer.

Una forma de aumentar el tiempo de circulación de los liposomas es mediante el uso de liposomas derivatizados con una cadena polimérica hidrófila o un polialquiléter, tal como polietilenglicol (PEG) (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nros. 5,013,556, 5,213,804, 5,225,212 y 5,395,619). El revestimiento de polímero reduce la velocidad de absorción de los liposomas por parte de los macrófagos y, por lo tanto, prolonga la presencia de los liposomas en el torrente sanguíneo. Esto también se puede utilizar como mecanismo de liberación prolongada de los fármacos transportados por los liposomas. Por consiguiente, las formulaciones de equinomicina liposomal según la presente solicitud incluyen uno o más lípidos pegilados.

Un experto en la técnica puede seleccionar uno o varios lípidos formadores de vesículas que logren un grado específico de fluidez o rigidez. La fluidez o rigidez del liposoma se puede usar para controlar factores tales como la estabilidad del liposoma en el suero o la velocidad de liberación del agente atrapado en el liposoma. Mediante la incorporación de un lípido relativamente rígido se obtienen liposomas que tienen una bicapa lipídica más rígida, o una bicapa cristalina líquida. La rigidez de la bicapa lipídica se correlaciona con la temperatura de transición de fase de los lípidos presentes en la bicapa. La temperatura de transición de fase es la temperatura a la que el lípido cambia de estado físico y pasa de una fase de gel ordenada a una fase cristalina líquida desordenada. Varios factores afectan la temperatura de transición de fase de un lípido, incluyendo la longitud de la cadena hidrocarbonada y el grado de insaturación, la carga y las especies del grupo de cabeza del lípido. Un lípido que tenga una temperatura de transición de fase relativamente alta producirá una bicapa más rígida. También se sabe que otros componentes lipídicos, tales como el colesterol, contribuyen a la rigidez de la membrana en las estructuras de bicapa lipídica. El colesterol se puede utilizar para manipular la fluidez, la elasticidad y la permeabilidad de la bicapa lipídica. Se cree que funciona llenando espacios en la bicapa lipídica. Por el contrario, la fluidez de los lípidos se logra mediante la incorporación de un lípido relativamente fluido, típicamente uno que tenga una temperatura de transición de fase más baja. Las temperaturas de transición de fase de muchos lípidos se tabulan en diversas fuentes, tales como el catálogo Avanti Polar Lipids y Lipidat de Martin Caffrey, CRC Press.

Los fosfolípidos pueden formar diversas estructuras distintas de los liposomas cuando se dispersan en agua, dependiendo de la proporción molar de lípido a agua. En relaciones bajas, el liposoma es la estructura preferida. Las características físicas de los liposomas dependen del pH, la fuerza iónica y la presencia de cationes divalentes. Los liposomas pueden mostrar una baja permeabilidad a sustancias iónicas y polares, pero a temperaturas elevadas experimentan una transición de fase que altera notablemente su permeabilidad. La transición de fase implica un cambio de una estructura ordenada y densamente empaquetada, conocida como estado de gel, a una estructura menos ordenada y poco empaquetada, conocida como estado fluido. Esto ocurre a una temperatura de transición de fase característica y da como resultado un aumento en la permeabilidad a iones, azúcares y fármacos.

Los liposomas de la presente solicitud se pueden preparar para que tengan tamaños sustancialmente homogéneos en un intervalo de tamaños seleccionado. Un método eficaz para dimensionar las REV y MLV implica la extrusión de una suspensión acuosa de los liposomas a través de una serie de membranas de policarbonato con un tamaño de poros uniforme seleccionado en el intervalo de 0.03 a 0.2 micras, típicamente 0.05, 0.08, 0.1 o 0.2 micras. El tamaño de poros de la membrana corresponde aproximadamente a los mayores tamaños de liposomas producidos mediante extrusión a través de esa membrana, en particular cuando la preparación se extruye dos o más veces a través de la misma membrana. Los métodos de homogeneización también son útiles para reducir el tamaño de los liposomas a tamaños de 100 nm o menos (Martin, F. J., en Specialized Drug Delivery Systems-Manufacturing and Production Technology, (P. Tyle, Ed.) Marcel Dekker, Nueva York, páginas 267-316 (1990)). La homogeneización se basa en la energía de cizallado para fragmentar liposomas de gran tamaño en otros más pequeños. Otros métodos apropiados para reducir el tamaño de los liposomas incluyen reducir el tamaño de los liposomas mediante agitación vigorosa de los liposomas en presencia de un detergente solubilizante apropiado, tal como desoxicolato.

Los liposomas que se han dimensionado a un intervalo de aproximadamente 0.2-0.4 micras pueden esterilizarse filtrando los liposomas a través de un filtro de esterilización convencional, que normalmente es un filtro de 0.22 micras, con un alto rendimiento. Otros métodos apropiados de esterilización serán evidentes para los expertos en la técnica.

La no toxicidad de los lípidos también es una consideración importante en la presente solicitud. Los lípidos aprobados para uso en aplicaciones clínicas son bien conocidos por los expertos en la técnica. En ciertas realizaciones, los lípidos sintéticos, por ejemplo, pueden preferirse a los lípidos obtenidos de fuentes biológicas debido a un menor riesgo de contaminación vírica o proteínica procedente del organismo fuente.

El método original para formar liposomas involucraba primero suspender los fosfolípidos en un disolvente orgánico y luego evaporarlos hasta la sequedad hasta que se forma una torta o película lipídica seca. Se añade una cantidad adecuada de medio acuoso y los lípidos forman espontáneamente vesículas bicapa concéntricas multilaminares (también denominadas vesículas multilaminares (MLV)). Estas MLV se pueden entonces dispersar y reducir de tamaño por medios mecánicos.

A pesar de la naturaleza insoluble en agua de la equinomicina, los inventores de la presente solicitud han descubierto que se pueden formar liposomas estables combinando equinomicina y lípidos en un disolvente polar, tal como etanol, secando estos componentes para formar una película y luego dispersando los liposomas en un medio acuoso. Por lo tanto, en una realización, una vez que la equinomicina y los lípidos estén mezclados completamente en el disolvente orgánico, el disolvente se elimina usando, por ejemplo, un rotavapor, dando como resultado una película lipídica seca. La película lipídica seca se hidrata y solubiliza en un tampón adecuado (por ejemplo, PBS, pH 7.4), dando como resultado una suspensión lipídica. A continuación, la suspensión lipídica se extruye de forma repetitiva a través de filtros de policarbonato utilizando un Avanti Mini-Extruder para conseguir el intervalo de tamaños de liposomas deseado. A continuación, los liposomas se esterilizan por filtración (filtros estériles de 0.45 o 0.2 μm). Se describe en la presente memoria, pero no como parte de la invención, que los análogos de equinomicina solubles en agua pueden atraparse pasivamente hidratando una película lipídica con una solución acuosa que contenga el análogo de equinomicina soluble en agua.

La equinomicina puede estar localizada dentro de la bicapa lipídica, entre las dos hojas de la bicapa lipídica, dentro del espacio del núcleo interno, sobre cualquiera de las caras de la bicapa, dentro o sobre el resto PEG del liposoma, o una combinación de los mismos. Un método alternativo para crear vesículas unilaminares grandes (LUV) es el proceso de evaporación en fase inversa, descrito, por ejemplo, en la patente de EE.UU. nro. 4,235,871. Este proceso genera vesículas de evaporación en fase inversa (REV), que en su mayoría son unilaminares, pero también suelen contener algunas vesículas oligolaminares. En este procedimiento, se mezcla una mezcla de lípido polar en un disolvente orgánico con un medio acuoso adecuado. Se forma una emulsión homogénea de tipo agua en aceite y el disolvente orgánico se evapora hasta que se forma un gel. A continuación, el gel se convierte en una suspensión dispersando la mezcla similar a un gel en un medio acuoso.

En una realización alternativa, la equinomicina puede conjugarse con la superficie de la bicapa liposomal. En una realización, la equinomicina se une de forma covalente a un liposoma mediante conjugación de amida. Por ejemplo, los fosfolípidos con grupos funcionales hidroxilo se pueden conjugar con uno de los grupos amina presentes en la equinomicina.

La formulación liposomal según la presente invención tendrá suficiente estabilidad a largo plazo para lograr una vida útil de almacenamiento de al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 12 meses, al menos 24 meses o al menos 48 meses a temperatura ambiente o temperatura de refrigeración (por ejemplo, 4 °C).

Se describe en la presente memoria, pero no como parte de la invención, que la equinomicina o el análogo de equinomicina pueden encapsularse en un material de pared protector que sea de naturaleza polimérica en lugar de basado en lípidos. El polímero utilizado para encapsular el agente bioactivo suele ser un único copolímero u homopolímero. El sistema polimérico de aporte de fármacos puede ser de naturaleza de microemulsión o no microemulsión.

También se describen en la presente memoria, pero no como parte de la invención, estructuras de encapsulación poliméricas en microemulsión que incluyen micropartículas, microcápsulas, microesferas, nanopartículas, nanocápsulas, nanoesferas, micelas de copolímero de bloques y similares. Se pueden usar tanto polímeros sintéticos, que son fabricados por el hombre, como biopolímeros, incluidas proteínas y polisacáridos. El sistema polimérico de aporte de fármacos puede componerse de materiales poliméricos biodegradables o no biodegradables, o cualquier combinación de los mismos.

Tal como se usa en la presente memoria, una "microemulsión" se refiere a una emulsión que comprende microesferas que son de forma regular o semirregular con un diámetro de aproximadamente l0 nm a 500 μm. En algunas realizaciones, la microemulsión de la presente solicitud contiene liposomas con diámetros en el intervalo de 20-400 nm, 30-300 nm, 50-200 nm, 60-150 nm u 80-120 nm.

En algunas realizaciones, la microemulsión de la presente solicitud comprende micelas que tienen una cubierta que se compone de una sola capa de moléculas anfifílicas. El núcleo interno de la micela crea un microambiente hidrófobo para fármacos no polares, mientras que la cubierta hidrófila proporciona una interfaz estabilizadora entre el núcleo de la micela y el medio acuoso. Las propiedades de la cubierta hidrófila se pueden ajustar tanto para maximizar la biocompatibilidad como para evitar la absorción del sistema reticuloendotelial y la filtración renal. El tamaño de las micelas suele estar entre 10 nm y 100 nm.

Se describen en la presente memoria, pero no como parte de la invención, sistemas poliméricos de aporte de fármacos sin microemulsión, que incluyen películas, hidrogeles y sistemas de aporte de fármacos de tipo "depósito". Tales sistemas poliméricos sin microemulsión también se pueden usar junto con la inyección parenteral, particularmente cuando el sistema de aporte de fármacos sin microemulsión se coloca cerca del tejido canceroso objetivo. Tal como se usa en la presente memoria, un "hidrogel" significa una solución de polímeros, a veces denominada sol, convertida en estado de gel por iones pequeños o polímeros de carga opuesta o por reticulación química. Una "película polimérica" se refiere a una película a base de polímero generalmente de aproximadamente 0.5 a 5 mm de espesor que a veces se usa como revestimiento.

En determinadas realizaciones, los vehículos de aporte de fármacos liposomales que comprenden equinomicina se pueden revestir, conjugar o modificar con un ligando de guiado específico a células. Mediante el enlace de un vehículo de aporte a un ligando de guiado a células, el aporte de equinomicina se puede dirigir a una población de células diana que se une al ligando de guiado a células o al ligando de guiado. Tal como se usa en la presente memoria, un "ligando de guiado" incluye cualquier ligando que haga que un liposoma se asocie con el tipo de célula diana en un grado mayor que con los tejidos a los que no está guiado.

Los ligandos de guiado, tales como anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, se pueden usar para unirse a la superficie del liposoma y para dirigir el anticuerpo y su contenido de fármaco a receptores antigénicos específicos ubicados en una superficie de tipo celular concreta (véase, por ejemplo, Mastrobattista et al., 1999). Los determinantes de carbohidratos (componentes de la superficie celular de glicoproteína, lectina y glicolípido que desempeñan un papel en el reconocimiento, la interacción y la adhesión célula-célula) también se pueden usar como ligandos de guiado, ya que tienen potencial para dirigir liposomas a tipos de células concretos. Ciertas proteínas se pueden usar como ligandos de guiado, generalmente las que son reconocidas por los receptores de la superficie propia del tejido diana. Por ejemplo, un ligando que se una a un receptor de la superficie celular que se sobreexprese en células cancerosas concretas podría usarse para aumentar la absorción de liposomas por parte del tejido diana. En ciertas realizaciones se preferirán los receptores de la superficie celular que se someten a endocitosis. Cuando se combina con liposomas pegilados, el ligando de guiado a menudo se une al extremo del polímero hidrófilo que se expone al medio acuoso. Como alternativa, los liposomas pueden comprender proteínas fusogénicas, por ejemplo, proteínas fusogénicas obtenidas de virus, que induzcan la fusión del liposoma con la membrana celular.

En determinadas realizaciones, el ligando de guiado es un receptor de la superficie celular que es sometido a endocitosis por la célula diana. Los ligandos de guiado apropiados para usar en la presente solicitud incluyen cualquier ligando que provoque una mayor unión o asociación de los liposomas con la superficie celular de las células diana que con las células no diana. El ligando de guiado puede ser una molécula pequeña, un péptido, un ligando, un fragmento de anticuerpo, un aptámero o un synbody. Un synbody es un anticuerpo sintético producido a partir de una biblioteca compuesta de secuencias de péptidos aleatorios escrutados para unirse a proteínas diana de interés y se describe en el documento US 2011/0143953. Un aptámero es una versión de ácido nucleico de un anticuerpo que comprende una clase de oligonucleótidos que pueden formar estructuras tridimensionales específicas que presentan una alta afinidad de unión a una amplia variedad de moléculas, proteínas y/o estructuras macromoleculares de la superficie celular. Los ejemplos de ligandos de guiado a células incluyen, pero no se limitan a, moléculas pequeñas (por ejemplo., folato, adenosina, purina) y moléculas grandes (por ejemplo, péptido o anticuerpo) que se unen a (y se guían a), por ejemplo, células dendríticas epidérmicas como se describe posteriormente.

Los anticuerpos o fragmentos obtenidos de anticuerpos ejemplares pueden incluir cualquier miembro del grupo que consiste en: IgG, región variable del anticuerpo; región CDR aislada; molécula Fv de cadena sencilla (scFv) que comprende un dominio VH y un dominio VL enlazados por un enlazador peptídico que permite la asociación entre los dos dominios para formar un sitio de unión a antígeno; dímero scFv biespecífico; minicuerpo que comprende un scFv unido a un dominio CH₃; fragmento de diacuerpo (dAb); fragmento de dAb de cadena sencilla que consiste en un dominio VH o VL; fragmento Fab que consiste en dominios VL, VH, CL y CH1; fragmento Fab', que se diferencia de un fragmento Fab por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxilo del dominio CH1 de la cadena pesada, que incluye una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo; fragmento Fab'-SH, un fragmento Fab' en el que el o los residuos de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre; F(ab')², fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados; fragmento Fd que consiste en dominios VH y CH1; derivados de los mismos; y cualquier o cualesquiera otros fragmentos de anticuerpo que conserven la función de unión a antígeno. Las moléculas Fv, scFv o de diacuerpos se pueden estabilizar mediante la incorporación de puentes disulfuro que enlacen los dominios VH y VL. Cuando se usan fragmentos obtenidos de anticuerpos, cualquiera o la totalidad de los dominios de guiado de los mismos y/o las regiones Fc se pueden "humanizar" usando metodologías bien conocidas por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, el anticuerpo puede modificarse para eliminar la región Fc.

Conjugados de anticuerpo-fármaco de equinomicina

En otro aspecto, la equinomicina se puede conjugar con un agente de unión a células o un anticuerpo, tal como un anticuerpo contra el cáncer descrito anteriormente. Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "anticuerpo conjugado" o "conjugado de anticuerpo y fármaco (ADC)" se refiere a un anticuerpo conjugado con equinomicina a través de un enlazador o un agente de reticulación bifuncional. El uso de un conjugado equinomicina-anticuerpo combina la alta especificidad de un anticuerpo monoclonal para un antígeno asociado a un tumor con la potencia farmacológica de la equinomicina. Los ejemplos de ADC incluyen gemtuzumab ozogamicina (Mylotarg; mAb anti-CD33 conjugado con calicheamicina, Pfizer/Wyeth); brentuximab vedotina (SGN-35, Adcetris, un ADC de guiado a CD30 que consiste en brentuximab, enlazado de manera covalente a MMAE (monometilauristatina), Seattle Genetics); y conjugado trastuzumab-DM1 (T-DM1).

Se ha empleado una amplia gama de tecnologías de enlazador para la preparación de conjugados anticuerpofármaco como se describe en el documento U.S. 9,090,629. Cualquiera de los métodos y reactivos allí descritos puede emplearse en la preparación de los conjugados anticuerpo-equinomicina de la presente solicitud. Tal como se usa en la presente memoria, un "reactivo de reticulación bifuncional" se refiere a un reactivo que posee dos grupos reactivos; uno de los cuales es capaz de reaccionar con un agente de unión a células o anticuerpo, y otro que es capaz de reaccionar con equinomicina para enlazar el agente de unión a células o anticuerpo con equinomicina, formando así un conjugado.

Puede usarse cualquier reactivo de reticulación bifuncional adecuado en conexión con la presente solicitud, mientras el reactivo enlazador mantenga una retención de la actividad terapéutica, por ejemplo, inhibición de HIF-1a, y características de guiado del anticuerpo, respectivamente, sin una toxicidad indebida. Preferiblemente, la molécula enlazadora une la equinomicina al agente de unión a células o al anticuerpo a través de enlaces químicos (como se ha descrito anteriormente), de modo que la equinomicina y el agente de unión a células se acoplen químicamente (por ejemplo., se unan de manera covalente) entre sí. Los agentes de reticulación bifuncionales que se pueden utilizar para producir los compuestos fármaco-enlazador de la presente invención incluyen los descritos en Thermo Scientific Pierce Crosslinking Technical Handbook.

Un enlazador puede ser un enlazador "escindible" o un enlazador "no escindible". Los enlazadores escindibles se diseñan para que liberen el fármaco cuando se someten a determinados factores ambientales, por ejemplo, cuando se internalizan en la célula diana. Los enlazadores escindibles incluyen enlazadores lábiles al ácido, enlazadores sensibles a la proteasa, enlazadores fotolábiles, enlazadores de dimetilo o enlazadores que contienen disulfuro. Los enlazadores no escindibles tienden a permanecer asociados de manera covalente con al menos un aminoácido del anticuerpo y el fármaco tras la internalización por y la degradación dentro de la célula diana.

En una realización, el reactivo de reticulación bifuncional incluye un enlazador no escindible. Un enlazador no escindible es cualquier resto químico que sea capaz de enlazar la equinomicina a un agente de unión a células o anticuerpo de manera estable y covalente. Por lo tanto, los enlazadores no escindibles son sustancialmente resistentes a la escisión inducida por ácido, la escisión inducida por luz, la escisión inducida por peptidasa, la escisión inducida por esterasa y la escisión de enlace de disulfuro, en condiciones en las que el agente citotóxico o el agente de unión a células permanecen activos.

Los reactivos de reticulación adecuados que forman enlazadores no escindibles entre la equinomicina y el agente de unión a células o el anticuerpo son bien conocidos en la técnica. En una realización, la equinomicina se enlaza al agente de unión a células o al anticuerpo a través de un enlace tioéter. Los ejemplos de enlazadores no escindibles incluyen enlazadores que tienen un resto basado en maleimido o haloacetilo para reaccionar con el agente citotóxico. Tales reactivos de reticulación bifuncionales son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de EE.UU nro. 2010/0129314), y los disponibles en Pierce Biotechnology Inc. (Rockland, Ill), incluyen, pero no se limitan a, N-succinimidil 4-(maleimidometil)ciclohexanocarboxilato (SMCC), N-succinimidil-4-(N-maleimidometil)-cyclohexano-1-carboxi-(6-amidocaproato), que es un análogo de "cadena larga" de SMCC (LC-SMCC), éster N- succinimidílico de ácido K-maleimidoundecanoico (KMUA), éster N-succinimidílico de ácido Y-maleimidobutírico (GMBS), éster de N-hidroxisuccinimida de ácido 8-maleimidocaproico (EMCS), éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), éster de N-(a-maleimidoacetoxi)-succinimida (AMAS), succinimidil-6-(pmaleimidopropionamido)hexanoato (SMPH), N-succinimidil 4-(p-maleimidofenil)-butirato (SMPB), y N-(pmaleimidofenil)isocianato (PMPI). Los reactivos de reticulación que comprenden un resto basado en haloacetilo incluyen N-succinimidil-4-(yodoacetil)-aminobenzoato (SIAB), N-succinimidil yodoacetato (SIA), N-succinimidil bromoacetato (SBA), y N-succinimidil 3-(bromoacetamido)propionato (SBAP), bis-maleimidopolietileneglicol (BMPEO), BM(PEO)₂, BM(PEO)₃, éster de N-(p-maleimidopropiloxi)succinimida (BMPS), ⁿ H^s de ácido 5-maleimidovalérico, HBVS, hidrazida.HCl de ácido 4-(4-N-maleimidofenil)-butírico (MPBH), succinimidil-(4-vinilsulfonil)benzoato (SVSB), ditiobis-maleimidoetano (DTME), 1,4-bis-maleimidobutano (BMB), 1,4-bismaleimidil-2,3-dihidroxibutano (BMDB), bis-maleimidohexano (BMH), bis-maleimidoetano (BMOE), sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil)cyclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC), sulfosuccinimidil(4-yodoacetil)aminobenzoato (sulfo-SlAB), éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-MBS), éster de N-(8-maleimidobutriloxi)sulfosuccinimda (sulfo-GMBS), éster de N-(8-maleimidocaproiloxi)sulfosuccimido (sulfo-EMCS), éster de N-(K-maleimidoundecanoiloxi)sulfosuccinimida (sulfo-KMUS), sulfosuccinimidil 4-(p-maleimidofenil)butirato (sulfo-SMPB), CX1-1, sulfo-Mal y PEGn-Mal. Preferiblemente, el reactivo de reticulación bifuncional es SMCC.

Una solución de un anticuerpo en tampón acuoso se puede incubar con un exceso molar de un agente de modificación de anticuerpo tal como N-succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) para introducir grupos maleimido, o con N-succinimidil-4-(yodoacetil)-aminobenzoato (SIAB) para introducir grupos yodoacetilo. El anticuerpo modificado se hace reaccionar luego con un derivado de equinomicina que contiene tiol para producir un conjugado anticuerpo-equinomicina enlazado con tioéter. A continuación, el conjugado anticuerpo-citotóxico se purifica mediante filtración en gel u otros métodos mencionados anteriormente o mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Otros reticulantes que introducen grupos maleimido o grupos haloacetilo en un agente de unión a células son bien conocidos en la técnica e incluyen los enlazadores descritos anteriormente.

Los conjugados de anticuerpo pueden incluir un promedio de aproximadamente 1, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 16, aproximadamente 17, aproximadamente 18, aproximadamente 19 o aproximadamente 20 moléculas de equinomicina por anticuerpo.

Terapias de combinación En determinadas realizaciones, la inhibición de HIF-1a con las formulaciones de equinomicina de la presente solicitud puede combinarse con tratamientos estándar contra el cáncer (por ejemplo, cirugía, radiación y quimioterapia). Tal enfoque se basa en el hecho de que se sabe que los HIF median la resistencia a la radioterapia y la quimioterapia (Semenza, Trends Pharmacol Sci. abril de 2012; 33(4): 207-214). Por ejemplo, la evidencia indica que la actividad de HIF-1 puede contribuir al desarrollo de resistencia a nuevas terapias dirigidas, tales como el tratamiento con imatinib de la leucemia mieloide crónica. Específicamente, HIF-1 parece mediar la resistencia a imatinib a través de la reprogramación metabólica, activando la expresión de transcetolasa y, por lo tanto, aumentando el flujo de glucosa a través del brazo no oxidativo de la ruta de la pentosa fosfato. El cambio del metabolismo oxidativo al reductor mediado por HIF-1 tiene el efecto de reducir los niveles celulares de ROS, lo que puede aumentar la resistencia a la quimioterapia citotóxica (Semenza, 2012).

En ciertas realizaciones, la equinomicina se puede administrar en combinaciones sinérgicas con otro u otros agentes quimioterapéuticos o anticancerosos. En estos casos, puede ser posible reducir la dosis de los agentes quimioterapéuticos o anticancerosos administrados. Un ejemplo de tal combinación es la equinomicina en combinación con imatinib para el tratamiento de la leucemia o la combinación de equinomicina en combinación con Herceptin para el tratamiento del cáncer de mama. Se cree que el uso combinado de la inhibición de HIF-1a y la quimioterapia puede revertir los efectos negativos de la resistencia a la radioterapia, la quimioterapia y/o la apoptosis, así como la angiogénesis, el mantenimiento de células madre, la reprogramación metabólica, la señalización del factor de crecimiento autocrino, la transición epitelial-mesenquimal, la invasión y la metástasis.

Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "agente anticanceroso" se refiere a un "fármaco de molécula pequeña" o una proteína o anticuerpo que puede reducir la tasa de crecimiento de células cancerosas o inducir o mediar la muerte (por ejemplo, necrosis o apoptosis) de células cancerosas en un individuo (por ejemplo, un ser humano). La expresión "fármaco de molécula pequeña" se refiere a una entidad molecular, a menudo orgánica u organometálica, que no es un polímero, que tiene actividad medicinal y que tiene un peso molecular inferior a aproximadamente 2 kDa, inferior a aproximadamente 1 kDa, inferior a aproximadamente 900 Da, inferior a aproximadamente 800 Da o inferior a aproximadamente 700 Da. La expresión abarca la mayoría de los compuestos medicinales denominados "fármacos" que no sean proteínas o ácidos nucleicos, aunque un péptido pequeño o un análogo de ácido nucleico pueden considerarse un fármaco de molécula pequeña. Los ejemplos incluyen fármacos anticancerosos quimioterapéuticos e inhibidores enzimáticos. Los fármacos de moléculas pequeñas se pueden obtener de forma sintética, semisintética (es decir, a partir de precursores de origen natural) o biológicamente.

El agente anticanceroso puede ser un agente alquilante; un antibiótico de antraciclina; un antimetabolito; un agente desintoxicante; un interferón; un anticuerpo policlonal o monoclonal; un inhibidor de EGFR; un inhibidor de HER2; un inhibidor de la histona-desacetilasa; una hormona o agente antihormonal; un inhibidor mitótico; un inhibidor de fosfatidilinositol-3-cinasa (PI3K); un inhibidor de Akt; un inhibidor de la diana de rapamicina en mamíferos (mTOR); un inhibidor proteasomal; un inhibidor de la poli(ADP-ribosa) polimerasa (PARP); un inhibidor de la ruta Ras/MAPK; un agente de desagrupamiento del centrosoma; un inhibidor de multicinasa; un inhibidor de serina/treonina cinasa; un inhibidor de tirosina cinasa; un inhibidor de VEGF/VEGFR; un taxano o derivado de taxano, un inhibidor de aromatasa, una antraciclina, un fármaco guiado a microtúbulos, un fármaco tóxico de topoisomerasa, un inhibidor de una enzima o diana molecular (por ejemplo, una cinasa o una proteína metiltransferasa), un análogo de citidina o una combinación de los mismos.

Los ejemplos de agentes alquilantes incluyen, pero no se limitan a, ciclofosfamida (Cytoxan; Neosar); clorambucilo (Leukeran); melfalán (Alkeran); carmustina (BiCNU); busulfano (Busulfex); lomustina (CeeNU); dacarbazina (DTIC-Dome); oxaliplatino (Eloxatin); carmustina (Gliadel); ifosfamida (Ifex); mecloretamina (Mustargen); busulfano (Myleran); carboplatino (Paraplatino); cisplatino (CDDP; Platinol); temozolomida (Temodar); tiotepa (Thioplex); bendamustina (Treanda); o estreptozocina (Zanosar).

Los ejemplos de antibióticos de antraciclina incluyen, pero no se limitan a, doxorrubicina (Adriamycin); doxorrubicina liposomal (Doxil); mitoxantrona (Novantrone); bleomicina (Blenoxane); daunorrubicina (Cerubidine); daunorrubicina liposomal (DaunoXome); dactinomicina (Cosmegen); epirrubicina (Ellence); idarrubicina (Idamycin); plicamicina (Mithracin); mitomicina (Mutamycin); pentostatina (Nipent); o valrubicina (Valstar).

Los ejemplos de antimetabolitos incluyen, pero no se limitan a, fluorouracilo (Adrucil); capecitabina (Xeloda); hidroxiurea (Hydrea); mercaptopurina (Purinethol); pemetrexed (Alimta); fludarabina (Fludara); nelarabina (Arranon); cladribina (Cladribine Novaplus); clofarabina (Clolar); citarabina (Cytosar-U); decitabina (Dacogen); citarabina liposomal (DepoCyt); hidroxiurea (Droxia); pralatrexato (Folotyn); floxuridina (FUDR); gemcitabina (Gemzar); cladribina (Leustatin); fludarabina (Oforta); metotrexato (MTX; Rheumatrex); metotrexato (Trexall); tioguanina (Tabloid); TS-1 o citarabina (Tarabine PFS).

Los ejemplos de agentes desintoxicantes incluyen, pero no se limitan a, amifostina (Ethyol) o mesna (Mesnex).

Los ejemplos de interferones incluyen, pero no se limitan a, interferón alfa-2b (Intron A) o interferón alfa-2a (Roferon-A).

Los ejemplos de anticuerpos policlonales o monoclonales incluyen, pero no se limitan a, trastuzumab (Herceptin); ofatumumab (Arzerra); bevacizumab (Avastin); rituximab (Rituxan); cetuximab (Erbitux); panitumumab (Vectibix); tositumomab/yodo131 tositumomab (Bexxar); alemtuzumab (Campath); ibritumomab (Zevalin; In-111; Y-90 Zevalin); gemtuzumab (Mylotarg); eculizumab (Soliris) y ordenosumab.

Los ejemplos de inhibidores de EGFR incluyen, pero no se limitan a, gefitinib (Iressa); lapatinib (Tykerb); cetuximab (Erbitux); erlotinib (Tarceva); panitumumab (Vectibix); PKI-166; canertinib (CI-1033); matuzumab (Emd7200) o EκΒ-569.

Los ejemplos de inhibidores de HER2 incluyen, pero no se limitan a, trastuzumab (Herceptin); lapatinib (Tykerb) o AC-480.

Los ejemplos de inhibidores de la histona-desacetilasa incluyen, pero no se limitan a, vorinostat (Zolinza), ácido valproico, romidepsina, entinostat abexinostat, givinostat y mocetinostat.

Los ejemplos de agentes hormonales o antihormonales incluyen, pero no se limitan a, tamoxifeno (Soltamox; Nolvadex); raloxifeno (Evista); megestrol (Megace); leuprolida (Lupron; Lupron Depot; Eligard; Viadur); fulvestrant (Faslodex); letrozol (Femara); triptorelina (Trelstar LA; Trelstar Depot); exemestano (Aromasin); goserelina (Zoladex); bicalutamida (Casodex); anastrozol (Arimidex); fluoximesterona (Androxy; Halotestin); medroxiprogesterona (Provera; Depo-Provera); acetato de abiraterona (Zytiga); leuprorelina (Lupron); estramustina (Emcyt); flutamida (Eulexin); toremifeno (Fareston); degarelix (Firmagon); nilutamida (Nilandron); abarelix (Plenaxis); o testolactona (Teslac).

Los ejemplos de inhibidores mitóticos incluyen, pero no se limitan a, paclitaxel (Taxol; Onxol; Abraxane); docetaxel (Taxotere); vincristina (Oncovin; Vincasar PFS); vinblastina (Velban); etopósido (Toposar; Etopophos; VePesid); tenipósido (Vumon); ixabepilona (Ixempra); nocodazol; epotilona; vinorelbina (Navelbina); camptotecina (CPT); irinotecán (Camptosar); topotecán (Hycamtin); amsacrina o lamellarina D (LAM-D).

Los ejemplos de inhibidores de fosfatidil-inositol-3 cinasa (PI3K) incluyen wortmanina, un inhibidor irreversible de PI3K, demetoxiviridina, un derivado de wortmanina, LY294002, un inhibidor reversible de PI3K; BKM120 (Buparlisib); idelalisib (un inhibidor de PI3K Delta); duvelisib (IPI-145, un inhibidor de PI3K delta y gamma); alpelisib (BYL719), un inhibidor de PI3K alfa-específico; TGR 1202 (anteriormente conocido como RP5264), un inhibidor oral de PI3K delta; y copanlisib (BAY 80-6946), un inhibidor de las isoformas PI3Ka,8 predominantemente.

Los ejemplos de inhibidores de Akt incluyen, pero no se limitan a, miltefosina, AZD5363, GDC-0068, MK₂206, perifosina, RX-0201, PBI-05204, GSK₂141795 y SR13668.

Los ejemplos de inhibidores de MTOR incluyen, pero no se limitan a, everólimus (Afinitor) o temsirólimus (Torisel); rapamune, ridaforólimus; deforólimus (AP23573), AZD8055 (AstraZeneca), O^s I-027 (OSI), INK-128, BEZ235, PI-103, Torinl, PP242, PP30, Ku-0063794, WAY-600, WYE-687, WYE-354 y CC-223.

Los ejemplos de inhibidores proteasomales incluyen, pero no se limitan a, bortezomib (PS-341), ixazomib (MI,N 2238), MLN 9708, delanzomib (CEP-18770), carfilzomib (PR-171), YU101, oprozomib (ONX-0912), marizomib (NPI-0052) y disufiram.

Los ejemplos de inhibidores de PARP incluyen, pero no se limitan a, olaparib, iniparib, velaparib, BMN-673, BSI-201, AG014699, ABT-888, GPI21016, MK4827, INO-1001, CEP-9722, PJ- 34, Tiq-A, Phen, PF-01367338 y combinaciones de los mismos.

Los ejemplos de inhibidores de la ruta Ras/MAPK incluyen, pero no se limitan a, trametinib, selumetinib, cobimetinib, CI-1040, PD0325901, AS703026, RO₄987655, RO5068760, AZD6244, GSK1120212, TAK-733, U0126, MEK 162 y GDC-0973.

Los ejemplos de agentes de desagrupamiento del centrosoma incluyen, pero no se limitan a, griseofulvina; noscapina, derivados de noscapina, tales como noscapina bromada (por ejemplo, 9-bromonoscapina), bromonoscapina reducida (RBN), N-(3-brormobencil) noscapina, aminonoscapina y derivados solubles en agua de los mismos; CW069; el inhibidor de poli(ADP-ribosa) polimerasa derivado de fenantrideno, PJ-34; N₂-(3-piridilmetil)-5-nitro-2-furamida, N₂-(2-tienilmetil)-5-nitro-2-furamida y N₂-bencil-5-nitro-2-furamida.

Los ejemplos de inhibidores de multicinasa incluyen, pero no se limitan a, regorafenib; sorafenib (Nexavar); sunitinib (Sutent); BIBW 2992; E7080; Zd6474; PKC-412; motesanib; o AP24534.

Los ejemplos de inhibidores de serina/treonina cinasa incluyen, pero no se limitan a, ruboxistaurin; clorhidrato de eril/easudil; flavopiridol; seliciclib (CYC202; Roscovitrine); Sⁿ S-032 (BMS-387032); Pkc412; briostatina; KAI-9803; SF1126; VX-680; Azd1152; Arry-142886 (AZD-6244); SCIO-469; GW681323; CC-401; CEP-1347 o PD 332991.

Los ejemplos de inhibidores de tirosina cinasa incluyen, pero no se limitan a, erlotinib (Tarceva); gefitinib (Iressa); imatinib (Gleevec); sorafenib (Nexavar); sunitinib (Sutent); trastuzumab (Herceptin); bevacizumab (Avastin); rituximab (Rituxan); lapatinib (Tykerb); cetuximab (Erbitux); panitumumab (Vectibix); everólimus (Afinitor); alemtuzumab (Campath); gemtuzumab (Mylotarg); temsirólimus (Torisel); pazopanib (Votrient); dasatinib (Sprycel); nilotinib (Tasigna); vatalanib (Ptk787; ZK₂22584); CEP-701; SU5614; MLN518; XL999; VX-322; Azd0530; BMS-354825; SKI-606 CP-690; AG-490; WHI-P154; WHI-P131; AC-220; o AMG888.

Los ejemplos de inhibidores de VEGF/VEGFR incluyen, pero no se limitan a, bevacizumab (Avastin); sorafenib (Nexavar); sunitinib (Sutent); ranibizumab; pegaptanib; o vandetinib.

Los ejemplos de fármacos de guiado a microtúbulos incluyen, pero no se limitan a, paclitaxel, docetaxel, vincristina, vinblastina, nocodazol, epotilonas y navelbina.

Los ejemplos de fármacos tóxicos de topoisomerasa incluyen, pero no se limitan a, tenipósido, etopósido, adriamicina, camptotecina, daunorrubicina, dactinomicina, mitoxantrona, amsacrina, epirrubicina e idarrubicina.

Los ejemplos de taxanos o derivados de taxanos incluyen, pero no se limitan a, paclitaxel y docetaxel.

Los ejemplos de agentes antiproliferativos, antineoplásicos y quimioterapéuticos generales incluyen, pero no se limitan a, altretamina (Hexalen); isotretinαna (Accutane; Amnesteem; Claravis; Sotret); tretinoína (Vesanoid); azacitidina (Vidaza); bortezomib (Velcade) asparaginasa (Elspar); levamisol (Ergamisol); mitotano (Lysodren); procarbazina (Matulane); pegaspargasa (Oncaspar); denileucina diftitox (Ontak); porfímero (Photofrin); aldesleukina (Proleukin); lenalidomida (Revlimid); bexaroteno (Targretin); talidomida (Thalomid); temsirólimus (Torisel); trióxido de arsénico (Trisenox); verteporfina (Visudyne); y mimosina (Leucenol).

En algunas realizaciones, la equinomicina se administra en combinaciones sinérgicas con uno o más inhibidores de calcineurina/SOC MTX para el tratamiento de la EICH.

Estos agentes quimioterapéuticos adicionales pueden cargarse en liposomas con equinomicina, en formulaciones liposomales separadas coadministradas con las formulaciones liposomales de la presente solicitud, o por otros modos de administración empleados de otra manera (por ejemplo, administración oral, inyección iv, etc.).

Formulaciones farmacéuticas Las composiciones farmacéuticas de la presente invención que comprenden equinomicina y un vehículo de aporte de fármacos en microemulsión liposomal se preparan de acuerdo con técnicas estándar. Pueden comprender además un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tal como se usa en la presente memoria, la expresión “farmacéuticamente aceptable” se refiere a una composición o entidad molecular que no produce una reacción adversa, alérgica u otra reacción inapropiada cuando se administra a un animal o ser humano, según corresponda. La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable", tal como se usa en la presente memoria, incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y/o antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, tampones, excipientes, ligantes, lubricantes, geles, tensioactivos y similares, que puedan usarse como medio para una sustancia farmacéuticamente aceptable.

Los ejemplos de vehículos o excipientes incluyen, pero no se limitan a, carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y polímeros tales como polietilenglicoles. Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de los siguientes: agua, solución salina, soluciones acuosas isotónicas, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicina acuosa al 0.3 %, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composición, o glicoproteínas para una mayor estabilidad, tales como albúmina, lipoproteína y globulina. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden comprender además cantidades secundarias de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes de conservación o tampones, que aumenten la vida útil de almacenamiento o la efectividad de los agentes terapéuticos.

Estas composiciones se pueden esterilizar mediante técnicas de esterilización convencionales que son bien conocidas por los expertos en la técnica. Los liposomas suficientemente pequeños, por ejemplo, pueden esterilizarse utilizando técnicas de filtración esterilizante.

Las características de la formulación que se pueden modificar incluyen, por ejemplo, el pH y la osmolalidad. Por ejemplo, puede desearse lograr una formulación que tenga un pH y una osmolalidad similares a los de la sangre o los tejidos humanos para facilitar la eficacia de la formulación cuando se administra por vía parenteral. Como alternativa, para promover la eficacia de las composiciones divulgadas cuando se administran a través de otras vías de administración, se pueden modificar características alternativas.

Los tampones son útiles en la presente invención para, entre otros fines, la manipulación del pH total de la formulación farmacéutica (especialmente deseable para la administración parenteral). En las presentes formulaciones se pueden utilizar diversos tampones conocidos en la técnica, tales como diversas sales de ácidos orgánicos o inorgánicos, bases o aminoácidos, e incluyendo diversas formas de iones citrato, fosfato, tartrato, succinato, adipato, maleato, lactato, acetato, bicarbonato o carbonato. Los tampones particularmente ventajosos para el uso en formas administradas por vía parenteral de las composiciones actualmente divulgadas en la presente invención incluyen tampones de sodio o potasio, que incluyen fosfato de sodio, fosfato de potasio, succinato de sodio y citrato de sodio.

Puede usarse cloruro de sodio para modificar la toxicidad de la solución a una concentración de 0-300 mM (óptimamente 150 mM para una forma de dosificación líquida). Se pueden incluir crioprotectores para una forma de dosificación liofilizada, principalmente un 0-10 % de sacarosa (óptimamente un 0.5-1.0 %). Otros crioprotectores adecuados incluyen trehalosa y lactosa. Se pueden incluir agentes de carga para una forma de dosificación liofilizada, principalmente un 1-10 % de manitol (óptimamente un 2-4 %). Se pueden usar estabilizadores en formas de dosificación tanto líquidas como liofilizadas, principalmente L-metionina 1-50 mM (óptimamente 5-10 mM). Otros agentes de carga adecuados incluyen glicina, arginina, se pueden incluir como un 0-0.05 % de polisorbato-80 (óptimamente 0.005-0.01 %).

En una realización, se emplea fosfato de sodio en una concentración de aproximadamente 20 mM para lograr un pH de aproximadamente 7.0. Un sistema de tamponamiento de fosfato de sodio particularmente eficaz comprende monohidrato de fosfato de sodio monobásico y heptahidrato de fosfato de sodio dibásico. Cuando se usa esta combinación de fosfato de sodio monobásico y dibásico, las concentraciones ventajosas de cada uno son de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 1.5 mg/mL de monobásico y de aproximadamente 2.0 a aproximadamente 4.0 mg/mL de dibásico, con concentraciones preferidas de aproximadamente 0.9 mg/mL de monobásico y aproximadamente 3.4 mg/mL de fosfato dibásico. El pH de la formulación cambia según la cantidad de tampón utilizada.

Dependiendo de la forma de dosificación y la vía de administración prevista, como alternativa puede ser ventajoso usar tampones en diferentes concentraciones o usar otros aditivos para ajustar el pH de la composición para abarcar otros intervalos. Los intervalos de pH útiles para las composiciones de la presente invención incluyen un pH de aproximadamente 2.0 a un pH de aproximadamente 12.0.

En algunas realizaciones, también será ventajoso emplear tensioactivos en las formulaciones actualmente divulgadas, no entorpeciendo esos tensioactivos el sistema de aporte de fármacos utilizado. Los tensioactivos o antiadsorbentes que resultan útiles incluyen polioxietilensorbitanos, monolaurato de polioxietilensorbitán, polisorbato-20, tal como Tween-20™, polisorbato-80, polisorbato-20, hidroxicelulosa, genapol y tensioactivos BRIJ. A modo de ejemplo, cuando se emplea cualquier tensioactivo en la presente invención para producir una composición administrable por vía parenteral, es ventajoso usarlo en una concentración de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 0.5 mg/mL.

Los aditivos útiles adicionales los determinan fácilmente los expertos en la técnica, de acuerdo con las necesidades concretas o los usos previstos de las composiciones y el formulador. Una sustancia adicional particularmente útil es el cloruro de sodio, que es útil para ajustar la osmolalidad de las formulaciones para lograr la osmolalidad resultante deseada. Las osmolalidades particularmente preferidas para la administración parenteral de las composiciones divulgadas están en el intervalo de aproximadamente 270 a aproximadamente 330 mOsm/kg. La osmolalidad óptima para las composiciones administradas por vía parenteral, particularmente las inyectables, es de aproximadamente 300 mOsm/kg y se puede lograr mediante el uso de cloruro de sodio en concentraciones de aproximadamente 6.5 a aproximadamente 7.5 mg/mL, siendo particularmente eficaz una concentración de cloruro de sodio de aproximadamente 7.0 mg/mL.

Los liposomas que contienen equinomicina pueden almacenarse como un polvo liofilizado en condiciones asépticas y combinarse con una solución acuosa estéril antes de la administración. La solución acuosa usada para resuspender los liposomas puede contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones físicas, tales como agentes tamponadores y de ajuste del pH, agentes de ajuste de la tonicidad y similares, como se trató anteriormente.

En otras realizaciones, los liposomas que contienen equinomicina se pueden almacenar como una suspensión, preferiblemente una suspensión acuosa, antes de la administración. En ciertas realizaciones, la solución utilizada para el almacenamiento de liposomas o suspensiones de vehículo de fármaco en microemulsión incluirá agentes protectores de lípidos que protejan los lípidos contra daños por radicales libres y peroxidativos de lípidos durante el almacenamiento.

Los compuestos protectores adecuados incluyen inhibidores de radicales libres tales como alfa-tocoferol y quelatos específicos de hierro solubles en agua, tales como ferrioxamina.

Las dosis de equinomicina se pueden ensayar en un modelo animal adecuado como se describe posteriormente. Como propuesta general, se administrará una cantidad terapéuticamente eficaz de equinomicina u otro agente anticanceroso en un intervalo de aproximadamente 10 ng/kg de peso corporal/día a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal/día ya sea mediante una o más administraciones. En una realización concreta, cada proteína de fusión o vector de expresión se administra en el intervalo de aproximadamente 10 ng/kg de peso corporal/día a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal/día, aproximadamente 10 ng/kg de peso corporal/día a aproximadamente 1 mg/kg peso corporal/día, aproximadamente 10 ng/kg peso corporal/día a aproximadamente 100 μg/kg peso corporal/día, aproximadamente 10 ng/kg peso corporal/día a aproximadamente 10 μg/kg peso corporal/día, aproximadamente 10 ng/kg peso corporal/día a aproximadamente 1 μg/kg peso corporal/día, aproximadamente 10 ng/kg peso corporal/día a aproximadamente 100 ng/kg peso corporal/día, aproximadamente 100 ng/kg peso corporal/día a aproximadamente 100 mg/kg peso corporal/día, aproximadamente 100 ng/kg peso corporal/día a aproximadamente 10 mg/kg peso corporal/día, aproximadamente 100 ng/kg peso corporal/día a aproximadamente 1 mg/kg peso corporal/día, aproximadamente 100 ng/kg peso corporal/día a aproximadamente 100 μg/kg peso corporal/día, aproximadamente 100 ng/kg peso corporal/día a aproximadamente 10 μg/kg peso corporal/día, aproximadamente 100 ng/kg peso corporal/día a aproximadamente 1 μg/kg de peso corporal/día, aproximadamente 1 μg/kg de peso corporal/día a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal/día, aproximadamente 1 μg/kg de peso corporal/día a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal/día, aproximadamente 1 μg/kg de peso corporal/día a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal/día, aproximadamente 1 μg/kg de peso corporal/día a aproximadamente 100 μg/kg de peso corporal/día, aproximadamente 1 μg/kg de peso corporal/día a aproximadamente 10 μg/kg de peso corporal/día, aproximadamente 10 μg/kg de peso corporal/día a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal/día, aproximadamente 10 μg/kg de peso corporal/día a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal/día, aproximadamente 10 μg/kg de peso corporal/día a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal/día, aproximadamente 10 μg/kg de peso corporal/día a aproximadamente 100 μg/kg de peso corporal/día, aproximadamente 100 μg/kg de peso corporal/día a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal/día, aproximadamente 100 μg/kg de peso corporal/día a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal/día, aproximadamente 100 μg/kg de peso corporal/día a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal/día, aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal/día a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal/día, aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal/día a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal/día, aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal/día a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal/día.

En algunas realizaciones, la equinomicina se administra en una dosis basada en el área de superficie corporal (BSA) de 10-30 000 μg/m2, 100-30 000 μg/m2, 500-30 000 μg/m2, 1000-30 000 μg/m2, 1500-30 000 μg/m2, 2000-30 000 μg/m2, 2500-30 000 μg/m2, 3000-30 000 μg/m2, 3500-30 000 μg/m2, 4000-30 000 μg/m2, 100-20 000 μg/m2, 500-20000 μg/m2, 1000-20000 μg/m2, 1500-20000 μg/m2, 2000-20000 μg/m2, 2500-20000 μg/m2, 3000-20 000 μg/m2, 3500-20 000 μg/m2, 100-10000 μg/m2, 500-10 000 μg/m2, 1000-10 000 μg/m2, 1500-10 000 μg/m2, 2000-10000 μg/m2, o 2500-10000 μg/m2.

En otras realizaciones, la equinomicina se administra en el intervalo de aproximadamente 10 ng a aproximadamente 100 ng por administración individual, aproximadamente 10 ng a aproximadamente 1 μg por administración individual, aproximadamente 10 ng a aproximadamente 10 μg por administración individual, aproximadamente 10 ng a aproximadamente 100 μg por administración individual, aproximadamente 10 ng a aproximadamente 1 mg por administración individual, aproximadamente 10 ng a aproximadamente 10 mg por administración individual, aproximadamente 10 ng a aproximadamente 100 mg por administración individual, aproximadamente 10 ng a aproximadamente 1000 mg por administración individual, aproximadamente 10 ng a aproximadamente 10000 mg por administración individual, aproximadamente 100 ng a aproximadamente 1 μg por administración individual, aproximadamente 100 ng a aproximadamente 10 μg por administración individual, aproximadamente 100 ng a aproximadamente 100 μg por administración individual, aproximadamente 100 ng a aproximadamente 1 mg por administración individual, aproximadamente 100 ng a aproximadamente 10 mg por administración individual, aproximadamente 100 ng a aproximadamente 100 mg por administración individual, aproximadamente 100 ng a aproximadamente 1000 mg por administración individual, aproximadamente 100 ng a aproximadamente 10 000 mg por administración individual, aproximadamente 1 μg a aproximadamente 10 μg por administración individual, aproximadamente 1 μg a aproximadamente 100 μg por administración individual, aproximadamente 1 μg a aproximadamente 1 mg por administración individual, aproximadamente 1 μg a aproximadamente 10 mg por administración individual, aproximadamente 1 μg a aproximadamente 100 mg por administración individual, aproximadamente 1 μg a aproximadamente 1000 mg por administración individual, aproximadamente 1 μg a aproximadamente 10000 mg por administración individual, aproximadamente 10 μg a aproximadamente 100 μg por administración individual, aproximadamente 10 μg a aproximadamente 1 mg por administración individual, aproximadamente 10 μg a aproximadamente 10 mg por administración individual, aproximadamente 10 μg a aproximadamente 100 mg por administración individual, aproximadamente 10 μg a aproximadamente 1000 mg por administración individual, aproximadamente 10 μg a aproximadamente 10 000 mg por administración individual, aproximadamente 100 μg a aproximadamente 1 mg por administración individual, aproximadamente 100 μg a aproximadamente 10 mg por administración individual, aproximadamente 100 μg a aproximadamente 100 mg por administración individual, aproximadamente 100 μg a aproximadamente 1000 mg por administración individual, aproximadamente 100 μg a aproximadamente 10 000 mg por administración individual, aproximadamente 1 mg a aproximadamente 10 mg por administración individual, aproximadamente 1 mg a aproximadamente 100 mg por administración individual, aproximadamente 1 mg a aproximadamente 1000 mg por administración individual, aproximadamente 1 mg a aproximadamente 10 000 mg por administración individual, aproximadamente 10 mg a aproximadamente 100 mg por administración individual, aproximadamente 10 mg a aproximadamente 1000 mg por administración individual, aproximadamente 10 mg a aproximadamente 10000 mg por administración individual, aproximadamente 100 mg a aproximadamente 1000 mg por administración individual, aproximadamente 100 mg a aproximadamente 10000 mg por persona administración y aproximadamente 1000 mg a aproximadamente 10000 mg por administración individual. La proteína de fusión o el vector de expresión pueden administrarse diariamente, cada 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días, o cada 1, 2, 3 o 4 semanas.

En otras realizaciones concretas, la cantidad de equinomicina puede administrarse en una dosis de aproximadamente 0.0006 mg/día, 0.001 mg/día, 0.003 mg/día, 0.006 mg/día, 0.01 mg/día, 0.03 mg/día, 0.06 mg/día, 0.1 mg/día, 0.3 mg/día, 0.6 mg/día, 1 mg/día, 3 mg/día, 6 mg/día, 10 mg/día, 30 mg/día, 60 mg/día, 100 mg/día, 300 mg/día, 600 mg/día, 1000 mg/día, 2000 mg/día, 5000 mg/día o 10000 mg/día. Como es de esperar, la dosificación dependerá del estado, el tamaño, la edad y el estado del paciente.

Las dosis pueden ensayarse en varios modelos animales aceptados en la técnica adecuados para un trastorno proliferativo, una enfermedad autoinmune o una respuesta aloinmune concretos.

Los agentes terapéuticos en las composiciones farmacéuticas se pueden formular en una "cantidad terapéuticamente eficaz". Una “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, en las dosis y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz de la formulación liposomal puede variar según el estado que se haya de tratar, la gravedad y el curso del estado, el modo de administración, la biodisponibilidad del o de los agentes concretos, la capacidad del vehículo de aporte para provocar un respuesta deseada en el individuo, la terapia previa, la edad, el peso y el sexo del paciente, el historial clínico del paciente y la respuesta al anticuerpo, el tipo de proteína de fusión o vector de expresión utilizados, el criterio del médico tratante, etc. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es aquella en la que cualesquiera efectos tóxicos o perjudiciales del vehículo de aporte son superados por los efectos terapéuticamente beneficiosos.

Métodos de administración de equinomicina

En un aspecto, el sistema de aporte de fármacos en microemulsión liposomal de la presente invención es para utilizarlo en un método para tratar a un individuo mamífero con un trastorno proliferativo, una enfermedad autoinmune o que presenta una respuesta aloinmune.

En una realización, la formulación de la presente invención es para utilizarla en un método para tratar y/o reducir la gravedad de un trastorno proliferativo en un individuo mamífero, comprendiendo el método: administrar al individuo una composición farmacéutica que comprende un vehículo de aporte de fármacos en microemulsión liposomal que comprende equinomicina en una cantidad eficaz para tratar y/o reducir la gravedad del trastorno proliferativo en el individuo.

En otra realización, la formulación de la presente invención es para utilizarla en un método para tratar y/o reducir la gravedad de una enfermedad autoinmune en un individuo mamífero, comprendiendo el método: administrar al individuo una composición farmacéutica que comprende un vehículo de aporte de fármacos en microemulsión liposomal que comprende equinomicina en una cantidad eficaz para tratar y/o reducir la gravedad de la enfermedad autoinmune en el individuo.

En una realización adicional, la formulación de la presente invención es para utilizarla en un método para prevenir el desarrollo de la EICH o reducir la gravedad de la EICH en un individuo mamífero que recibe un trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas (HSC), comprendiendo el método: administrar al individuo, a las HSC trasplantadas, o a ambos, en combinación con una composición farmacéutica que comprende un vehículo de aporte de fármacos en microemulsión liposomal que comprende equinomicina en una cantidad eficaz para prevenir o reducir la gravedad de la EICH en el individuo.

Cuando la equinomicina se encapsula en un liposoma u otro vehículo de aporte de fármacos en microemulsión liposomal, se puede administrar cualquier cantidad eficaz de la equinomicina. Preferiblemente, las formulaciones liposomales que contienen equinomicina se administran por inyección parenteral, incluyendo intravenosa, intraarterial, intramuscular, subcutánea, intratejido, intranasal, intradérmica, instilación, intracerebral, intrarrectal, intravaginal, intraperitoneal, intratumoral.

La administración intravenosa de equinomicina liposomal ha sido tolerada por ratones en dosis de aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal y no se ha alcanzado ningún valor de DL⁵⁰. Por el contrario, la equinomicina libre tiene un valor de DL⁵⁰ de 0.629 mg/kg.

Otras vías de administración incluyen oral, tópica (nasal, transdérmica, intradérmica o intraocular), mucosa (por ejemplo, nasal, sublingual, bucal, rectal, vaginal), inhalación, intralinfática, intraespinal, intracraneal, intraperitoneal, intratraqueal, intravesical, intratecal, enteral, intrapulmonar, intralinfática, intracavital, intraorbitario, intracapsular y transuretral, así como el aporte local por catéter o stent.

En ciertas realizaciones, la composición se puede formular como una preparación de depósito. Tales formulaciones de acción prolongada pueden administrarse por implantación en un sitio apropiado o por inyección parenteral, particularmente inyección intratumoral o inyección en un sitio adyacente al tejido canceroso.

Las preparaciones liposomales se pueden liofilizar y almacenar como polvos estériles, preferiblemente al vacío, y luego reconstituir en agua bacteriostática (que contenga, por ejemplo, agente de conservación de alcohol bencílico) o en agua estéril antes de la inyección. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse para administración parenteral por inyección, por ejemplo, mediante inyección de bolo o infusión continua.

El vehículo de aporte se puede administrar al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos y se puede administrar al paciente en cualquier momento desde el diagnóstico en adelante. El vehículo de aporte se puede administrar como el único tratamiento o en conjunto con otros fármacos o terapias útiles para tratar el estado en cuestión.

Los siguientes ejemplos ilustran de forma adicional la presente invención, pero no se deberían interpretar como limitativos.

Ejemplos

Ejemplo 1. Preparación de formulaciones de equinomicina liposomal. Los componentes lipídicos y la equinomicina se pesaron en una balanza analítica y se disolvieron en un disolvente adecuado, tal como cloroformo/metanol 2:1 (v/v), en las proporciones apropiadas en un frasco de centelleo de vidrio y se mezclaron mediante un aparato para formar vórtice. Se utilizó una corriente lenta de nitrógeno gaseoso para evaporar el disolvente orgánico y producir una película lipídica homogénea sobre las paredes del frasco de vidrio. Para evitar la gelación, el proceso de secado se llevó a cabo a 65 °C. La película lipídica se hidrató añadiendo sacarosa al 10 % (p/v) en agua bidestilada (ddH²O) precalentada a 65 °C, de forma que la concentración final de lípidos totales fue de 7.1 mg/mL. La mezcla hidratada se mantuvo por encima de 65 °C y se mezcló vigorosamente mediante un aparato para formar vórtice hasta que se disolvió toda la película. La solución hidratada de vesículas multilaminares grandes (LMV) se extruyó exhaustivamente a través de filtros de policarbonato (PC) apilados de 200 nm, 100 nm y 50 nm utilizando un Avanti Mini-Extruder en incrementos de 1 mL hasta que se determinó por dispersión de luz dinámica (DLS) que el tamaño promedio de los liposomas en la mezcla reunida posterior a la extrusión estaba dentro del intervalo de 94-99 nm, con un índice de polidispersidad (PdI) de menos de 0.05. Para evitar el ensuciamiento de la membrana, el proceso de extrusión se llevó a cabo a 65 °C y las membranas de PC se cambiaron entre cada incremento de 1 mL. El número mínimo de pases de extrusión por incremento de 1 mL fue 21x, pero se emplearon pases adicionales contra una membrana de PC de 50 nm si no se cumplían las medidas de los criterios de calidad de DLS después del análisis de la mezcla posterior a la extrusión. La suspensión resultante de vesículas unilaminares pequeñas (SUV) se dejó estabilizar durante la noche a temperatura ambiente (21 °C). A continuación, el producto se sometió a una filtración esterilizante una vez a través de una membrana de PES de 0.22 μm de 33 mm de diámetro (Millipore) para eliminar la equinomicina no atrapada, y se tomaron muestras del filtrado para análisis por HPLC y DLS y se almacenó el mismo en frascos de vidrio estériles a 2-8 °C hasta su uso.

1.1. Preparación de formulación de DSPC-equinomicina. A 1.25 mL 0.2 mg/mL de equinomicina disuelta en cloroformo, se añaden 1.25 mL 13.75 mg/mL de diestearoilfosfatidilcolina (DSPC) en cloroformo en un matraz de fondo redondo. A continuación, se añaden 1.25 mL de 9.8 mg/mL de colesterol disuelto en cloroformo y se mezcla suavemente durante 5-10 segundos mediante agitación manual. A continuación, el cloroformo se evapora al vacío en un rotavapor durante 45 minutos a máxima velocidad de rotación hasta que se forma una película lipídica que contiene equinomicina sobre las paredes del matraz y todo el disolvente se evapora por completo. La película se rehidrata con 5 mL de tampón lipídico y se somete a una agitación vigorosa durante 45 minutos para producir una mezcla heterogénea de liposomas. A continuación, la mezcla se extruye a través de un filtro de 0.2 micras y la mezcla resultante se analiza mediante HPLC para comprobar la eficacia de la encapsulación.

1.2. Preparación de formulación de mPEG-DSPE-DOPC-equinomicina. La DSPC se puede sustituir por DOPC para aumentar la eficacia de la encapsulación, mientras que se puede añadir mPEG-DSPE para reducir el aclaramiento por el sistema reticuloendotelial (SRE) y aumentar el tiempo de circulación in vivo. En un ejemplo, se disolvieron 1.25 mL 0.2 mg/mL de equinomicina en cloroformo, se añaden 1.25 mL 13.75 mg/mL de 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) en cloroformo a un matraz de fondo redondo. A continuación, se añaden 1.25 mL de 9.8 mg/mL de colesterol disuelto en cloroformo y 1.25 mL 1.25 mg/mL de poli(etilenglicol)-a-diestearoil fosfatidiletanolamina (mPEG-DSPE)-2000 en cloroformo y se mezclan suavemente durante 5-10 segundos mediante agitación manual. A continuación, el cloroformo se evapora al vacío en un rotavapor durante 45 minutos a máxima velocidad de rotación hasta que se forma una película lipídica que contiene equinomicina sobre las paredes del matraz y todo el disolvente se evapora por completo. La película se rehidrata con 5 mL de tampón lipídico y se somete a agitación vigorosa durante 45 minutos para producir una mezcla heterogénea de liposomas. A continuación, la mezcla se extruye a través de un filtro de 0.2 micras y la mezcla resultante se analiza mediante HPLC para comprobar la eficacia de la encapsulación.

1.3. Preparación de formulación de mPEG-DSPE-EPC-HEPC-equinomicina. Se disolvieron 0.25 mg de equinomicina en 1.25 mL de cloroformo en un matraz de fondo redondo y se añade a la solución de equinomicina en el matraz de fondo redondo una mezcla de 12.2 mg/mL de fosfatidilcolina de huevo (EPC), 2.28 mg/mL de fosfatidilcolina de huevo hidrogenada (HEPC), 2.28 mg/mL de colesterol y 5.4 mg/ml de metoxi polietilenglicol-diestearoil fosfatidiletanolamina (mPEG-DSPE) en 1.25 mL de cloroformo/metanol. Una vez que los lípidos están mezclados completamente en el disolvente, el disolvente se evapora al vacío para eliminar el disolvente y formar una película lipídica en la pared del matraz de fondo redondo. La película se rehidrata con 5 mL de tampón lipídico y se somete a una agitación vigorosa durante 45 minutos para producir una mezcla heterogénea de liposomas. A continuación, la mezcla se extruye a través de un filtro de 0.2 micras y la mezcla resultante se analiza mediante HPLC para comprobar la eficacia de la encapsulación.

1.4. Preparación de formulación de mPEG-DSPE-HSPC-equinomicina. En otro ejemplo, se produjo un lote de 14 mL de equinomicina liposomal de la siguiente manera: se disolvieron 60 mg de HSPC, 20 mg de DSPE-PEG(2000) y 20 mg de colesterol de lana de ovino en un frasco de centelleo de vidrio de 5 mL con 4 mL de cloroformo/metanol 2:1 (v/v). Se añadieron a la mezcla 0.5 mL de equinomicina 10 mg/mL en cloroformo/metanol 2:1 (v/v) y la mezcla se mezcló durante 30 segundos mediante un aparato para formar vórtice. A continuación, la mezcla se calentó a 65 °C en un baño de agua y el disolvente orgánico se evaporó usando una corriente lenta de nitrógeno gaseoso y agitando el frasco a mano hasta que se formó una película homogénea que contenía equinomicina y lípido sobre las paredes del frasco. Durante el proceso de evaporación del disolvente orgánico, fue crítico mantener la mezcla a 65 °C para evitar la gelación. Como alternativa, se puede usar un matraz de fondo redondo en un sistema de evaporador automático que descanse en un baño de agua calentado con rotación; sin embargo, para el pequeño lote de producción a escala de laboratorio, fue suficiente agitar el vial a mano para producir una capa de película uniforme. En un horno pequeño, se precalentó un volumen suficiente de solución de hidratación a 65 °C. En este ejemplo, la solución de hidratación era sacarosa al 10 % (p/v) en agua destilada desionizada (sucDDW), pero se observa que otras soluciones de hidratación son aceptables, tales como DDW normal, solución salina al 0.9 % en DDW o 1xPBS. A continuación, la película de lípido-equinomicina se hidrató en 14 mL de sucDDW a 65 °C con mezcla vigorosa mediante un aparato para formar vórtice hasta que toda la película se disolvió por completo (aproximadamente 1 h) para producir una suspensión blanca de vesículas multilaminares grandes (LMV). La solución hidratada de vesículas multilaminares grandes (LMV) se extruyó entonces exhaustivamente a través de filtros de policarbonato (PC) apilados de 200 nm, 100 nm y 50 nm utilizando un Avanti Mini-Extruder en incrementos de 1 mL hasta que se determinó por dispersión de luz dinámica (DLS) que el diámetro hidrodinámico promedio de los liposomas en la mezcla reunida posterior a la extrusión estaba dentro del intervalo de 94-99 nm, con un índice de polidispersidad (PdI) de menos de 0.05. Para evitar el ensuciamiento de la membrana, el proceso de extrusión se llevó a cabo a 65 °C y las membranas de PC se cambiaron entre cada incremento de 1 mL. El número mínimo de pases de extrusión por incremento de 1mL fue 21x, pero se emplearon pases adicionales contra una membrana de PC de 50 nm si no se cumplían las medidas de los criterios de calidad de DLS después del análisis de la mezcla posterior a la extrusión. La suspensión resultante de vesículas unilaminares pequeñas (SUV) se dejó estabilizar durante 12-15 horas a temperatura ambiente (21 °C). A continuación, el producto se sometió a una filtración esterilizante una vez a través de una membrana de PES de 33 mm y 0.22 |jm (Millipore) para eliminar la equinomicina no atrapada y otros posibles contaminantes. Se tomaron muestras del filtrado para análisis por HPLC y DLS y se almacenó el mismo en frascos de vidrio estériles a 2-8 °C hasta su uso.

Ejemplo 2. Distribución de tamaños y caracterización física de equinomicina liposomal. Las formulaciones de equinomicina liposomal se caracterizaron utilizando el software Malvern Zetasizer para determinar el tamaño promedio y el potencial zeta. Se encontró que la distribución de tamaños estaba de manera constante dentro de un intervalo muy estrecho con un índice de polidispersidad de menos de 0.1, como se muestra en el perfil representativo de dispersión de luz dinámica (DLS) en la FIG. 1, serie A. Se ha informado de la acumulación de liposomas en tejidos tumorales por permeabilidad y retención aumentadas (EPR) y propiedades inmunoevasivas máximas de liposomas sigilosos pegilados de la absorción rápida por el sistema reticuloendotelial (SRE) para liposomas <100 nm de tamaño. Se encontró que el diámetro hidrodinámico promedio de la equinomicina liposomal era de aproximadamente 98 d.nm; esto se reprodujo fácilmente entre lotes (FIG. 1, serie B).

La medición del potencial zeta de las formulaciones liposomales puede proporcionar un método fiable para predecir la estabilidad de las partículas y la tendencia a la agregación. Se encontró que el potencial zeta promedio de la equinomicina liposomal era de aproximadamente -30 mV, lo que sugería que el producto era estable y era improbable que se agregara (FIG. 1, serie B). En la Tabla 1 se muestra un resumen de las características físicas adicionales de 6 preparaciones independientes de equinomicina liposomal, incluidos PdI, promedios y desviación estándar. Todos los datos se generaron con el software Malvern Zetasizer.

Tabla 1

Potencial Zeta Movilidad Conductividad Nro. LOT Pdl (mV) (μmcm/Vs) (mS/cm)

Ejemplo 3. Liberación in vitro de equinomicina a partir de equinomicina liposomal. Se realizó una evaluación de la liberación de fármaco in vitro a partir de equinomicina liposomal mediante diálisis midiendo la tasa de liberación de equinomicina durante un período de 240 horas mediante HPLC en cada punto de tiempo a temperatura ambiente en agua. Las concentraciones de equinomicina se calcularon para cada punto de tiempo de acuerdo con una curva estándar de equinomicina. Los cálculos del porcentaje de liberación se realizaron en función de la concentración inicial de equinomicina detectada en la muestra de equinomicina liposomal antes de comenzar la diálisis. Las características de liberación in vitro de los liposomas se resumen en el porcentaje acumulado de liberación que se muestra en la FIG. 2, serie A. Los cromatogramas de HPLC representativos que muestran los niveles máximos de equinomicina en los puntos de tiempo correspondientes están representados gráficamente en la FIG. 2, serie B.

Ejemplo 4. Almacenamiento in vitro y estabilidad de equinomicina liposomal. Para ensayar la estabilidad de la equinomicina liposomal en condiciones de almacenamiento, se realizó un seguimiento de las características físicas de la equinomicina liposomal en el transcurso de 3 meses a 4 °C. El tamaño, el PdI y el potencial zeta de la equinomicina liposomal se evaluaron usando el software Malvern Zetasizer a 1 y 3 meses de almacenamiento. No se encontraron cambios considerables en ninguno de estos parámetros con respecto a las mediciones iniciales (FIG. 3, serie A y serie B). La pérdida de contenido de fármaco de equinomicina liposomal se ensayó mediante la eliminación del precipitado de fármaco acumulado mediante filtración a través de una membrana de PES de 0.22 μm en los puntos de tiempo de 1 y 3 meses. Tras el análisis por HPLC del filtrado, no se encontró evidencia de ninguna fuga de fármaco o precipitación de los liposomas en condiciones de almacenamiento.

Ejemplo 5. Toxicidad de equinomicina liposomal en ratones. Para ensayar la toxicidad de la equinomicina liposomal en ratones, se administró un ciclo terapéutico de equinomicina en una dosis de 250 μg/kg (formulada con liposomas, formulada sin liposomas o dosificación equivalente de vehículo liposomal vacío) mediante inyección iv, cada dos días durante un total de 3 dosis. Se hizo un seguimiento de los pesos corporales de los ratones a lo largo de este período. Los resultados de este análisis mostraron que los ratones que recibieron equinomicina liposomal perdieron menos peso y recuperaron el peso perdido más rápido que los ratones que recibieron la dosificación y el programa equivalentes de equinomicina libre (FIG. 4, serie A). A dosis más altas de fármaco (1 mg/kg), todos los ratones tratados con equinomicina libre murieron en una semana, mientras que el 70 % de los ratones que recibieron liposomas cargados con equinomicina sobrevivieron durante todo el período de observación de más de 3 meses (FIG. 4, serie B).

Ejemplo 6. Farmacocinética de equinomicina liposomal frente a equinomicina libre en ratones. Se sabe que los liposomas "sigilosos" presentan un tiempo de circulación prolongado en el torrente sanguíneo en comparación con sus duplicados de fármaco libre, debido a la presencia de restos de PEG en la superficie del liposoma. El PEG protege a los liposomas de una absorción rápida por parte del SRE y proporciona estabilización estérica a las partículas de liposoma. Para medir la circulación prolongada de la equinomicina liposomal en el torrente sanguíneo en comparación con la equinomicina libre, se evaluó la farmacocinética de ambas formulaciones detectando los niveles de equinomicina en el plasma mediante espectrometría de masas después de inyecciones iv únicas de 0.1 mg/kg de equinomicina liposomal o equinomicina libre en ratones (FIG. 5). Los resultados de este análisis indicaron que las concentraciones y los tiempos de circulación de equinomicina en la sangre aumentaron significativamente en ratones que recibieron equinomicina liposomal en comparación con dosis equivalentes de equinomicina libre. En particular, los datos muestran que se alcanza una concentración plasmática >1 ng/mL sólo 15 minutos después de la administración de 0.1 mg/kg de equinomicina libre, pero la misma dosis de equinomicina liposomal mantuvo esta concentración durante más de 8 horas después de la administración (FIG. 5).

Adicionalmente, se evaluó la farmacocinética de la equinomicina convencional y formulada con liposomas en tejidos de cáncer de mama de ratones NSG y se encontró que aumentaba significativamente. Como se muestra en la FIG. 6, se puede lograr una concentración en el tumor >5 ng/g sólo 2 horas después de la dosificación de equinomicina convencional. Por el contrario, la administración de equinomicina liposomal (Lipo-EM) a la misma dosis de 0.1 mg/kg logró una concentración tisular >5 ng/g, que se prolongó durante más de 10 horas tras la administración (FIG. 6). Más importante aun, los niveles máximos de fármaco en el grupo tratado con equinomicina liposomal fueron aproximadamente 6 veces mayores que los tratados con equinomicina libre.

Ejemplo 7. Base para el tratamiento de la ALL con equinomicina La leucemia linfoblástica aguda de precursores de células T tempranos (ETP ALL) se ha reconocido recientemente como una forma de ALL de células T (T-ALL) con mal pronóstico (Coustan-Smith et al., Lancet Oncol., febrero de 2009; 10(2): 147-156). La ETP ALL se caracteriza por una detención de la diferenciación muy temprana y características genéticas y transcripcionales únicas que están más relacionadas con las células madre hematopoyéticas y los progenitores mieloides. Aunque se ha caracterizado el inmunofenotipo, el perfil de expresión génica y el espectro mutacional del gen para la ETP ALL, el mecanismo molecular de la patobiología de la ETP ALL es poco conocido y quedan por identificar dianas terapéuticas eficaces.

Previamente, un modelo de ratón espontáneo de T-ALL utilizado para identificar células madre de leucemia reveló que, incluso bajo normoxia, la señalización de HIF1a se activaba selectivamente en las células madre de T-a Ll de ratón y AML humana (Wang Y. et al. al., Cell Stem Cell. 2011;8(4):399-411). Estudios recientes han confirmado que la ruta también es crítica para el mantenimiento de las células madre de la leucemia mieloide crónica. Es importante destacar que el inhibidor de HIF1a equinomicina erradicó de manera eficiente la leucemia en ratones y fue altamente efectivo y selectivo en la eliminación de células madre de AML tanto in vitro como in vivo (Wang et al. 2011). Estos estudios indicaron que HIF1a activó un subconjunto de células presentes en las células ETP ALL bajo normoxia, y que el tratamiento con equinomicina redujo significativamente las células ETP ALL en ratones NSG xenoinjertados (véanse las Figs. 1, 2 y 3 en Wang et al. 2011). Estas observaciones demuestran que la activación aberrante de HIF1a en un entorno normóxico representa una característica única de ETP ALL. En la medida en que la ETP ALL tiene características transcripcionales que están más relacionadas con las células madre y los progenitores mieloides y tiene una expresión elevada de HIF-1a y sus genes diana, estas características respaldan el guiado a HIF-1a de equinomicina liposomal para el tratamiento de la ETP ALL.

Ejemplo 8. Efectos terapéuticos de la administración de equinomicina liposomal en ratones ETP-ALL NSG xenoinjertados. Como se esperaba a partir de los resultados del Ejemplo 7, se encontró que las proteínas HIF1a estaban sobreproducidas en células ETP ALL en comparación con muestras de control de PBMC de pacientes con ETP-a Ll (FIG. 7, serie A y serie B). Se detectó una alta acumulación de HIF-1a en 3 muestras de ETP-ALL mediante análisis por transferencia Western (FIG. 7, serie A ) o mediante tinción intracelular de HIF1a seguida de análisis FACS (FIG. 7, serie B). Estos resultados confirman que la activación aberrante de HIF1a está presente en las células ETP ALL primarias humanas bajo normoxia.

Para ensayar si la administración de equinomicina liposomal (Lipo-EM) podría eliminar las células ETP-ALL humanas in vivo, se administró Lipo-EM a ratones ETP-ALL NSG xenoinjertados de acuerdo con el programa de dosificación resumido en la FIG. 8, serie A. Brevemente, se trasplantaron 1 x 106 células ^eT^p ALL-1 mediante inyección iv en ratones NSG irradiados con 1.3 Gys. Se realizó un seguimiento de la reconstitución de las células ETP-ALL humanas mediante la detección de hCD45 en la sangre periférica de los ratones receptores. Los resultados de este análisis mostraron que aproximadamente un 10 a un 20 % de las células CD45+ humanas se detectaron en la sangre de los ratones receptores el día 34 después del trasplante. El día 35 comenzó un régimen de tratamiento con Lipo-EM de 20 días que consistió en dos ciclos con 4 tratamientos consecutivos cada dos días como un ciclo, separados por 8 días de descanso entre ciclos. Después del tratamiento se hizo un seguimiento del porcentaje de células ETP ALL-1 humanas. Los resultados de este análisis mostraron que la Lipo-EM redujo significativamente las células ETP-ALL en la sangre de los ratones xenoinjertados (FIG. 8, serie B). En particular, los gráficos FACS que representan el porcentaje de células ETP ALL humanas antes de la administración y en tres puntos de tiempo después del tratamiento con Lipo-EM revelaron que el porcentaje promedio de CD45 humano en ratones vehículo fue del 10.73 % el día 34, aumentando al 22.35 % el día 42, 45.61 % el día 48, 57.44 % el día 56 y finalmente llegando al 80.18 % el día 64 en la sangre. Sin embargo, en los ratones tratados con Lipo-EM, las células ETP-ALL-1 se eliminaron casi por completo con este régimen de tratamiento, de modo que el porcentaje de células CD45 humanas disminuyó del 17.47 % antes del tratamiento al 1.19 % después del tratamiento en el día 64 en la sangre de ratones receptores. Estos resultados demuestran la capacidad de la equinomicina liposomal para eliminar eficazmente las células ETP-ALL en ratones xenoinjertados.

Para comparar la eficacia de la equinomicina liposomal con la equinomicina libre en este modelo de xenoinjerto de ratón para ETP-ALL, se trasplantaron 1 x 106 células ETP ALL-1 mediante inyección iv en ratones NSG irradiados con 1.3 Gys. El tratamiento con Lipo-EM se inició el día 22, cuando el % de células hCD45+ en la sangre periférica alcanzó aproximadamente el 1 % según el análisis FACS el día 21. Los ratones se dividieron en 3 grupos de 5 ratones por grupo. Todos los tratamientos se realizaron mediante inyección iv. El primer grupo recibió 15 dosis totales de equinomicina en PBS divididas en 3 ciclos idénticos. En cada ciclo, los ratones recibieron 0.1 mg/kg de equinomicina en PBS una vez al día durante un total de 5 dosis, seguido de 5 días de descanso antes del inicio del siguiente ciclo. El segundo grupo recibió 10 dosis totales de Lipo-EM en las que las primeras 2 dosis se administraron una vez cada 4 días, seguidas de 7 días de descanso, luego seguidas de 4 dosis cada dos días, seguidas de 7 días más de descanso, y luego 4 dosis más administradas una vez cada dos días. Un grupo adicional de ratones recibió vehículo liposomal vacío (n=5) según el mismo programa en el que se administró la Lipo-EM. La sangre periférica se examinó los días 34, 50 y 65 mediante análisis FACS para comparar el crecimiento de células ETP-ALL-1 en los receptores durante el transcurso del tratamiento (FIG. 8, serie C). Los resultados de este análisis mostraron que aunque el tratamiento con equinomicina en PBS inhibió la tasa de crecimiento de las células ETP-ALL-1, el tratamiento con Lipo-EM proporcionó una eficacia superior en comparación con el primero (FIG. 8, serie C).

Ejemplo 9. Efectos de la equinom icina en células de cáncer de mama in vitro. Para comprender mejor la importancia de la alta expresión de HIF-1a en las células de cáncer de mama, se ensayó la capacidad de la equinomicina para reducir la supervivencia de las células de cáncer de mama en dos líneas celulares de cáncer de mama, MCF7 y SUM l59. Más específicamente, MCF7 y SUM 159 se trataron con diferentes concentraciones de equinomicina durante 48 horas, seguidas de ensayos MTT para medir la viabilidad celular a partir de entonces. Los resultados de este análisis mostraron que la equinomicina redujo el número de células SUM159 vivas (CÍ50=1 nM). Por el contrario, las células MCF7 son menos sensibles a la equinomicina (FIG. 9). Estos datos sugieren que los cánceres que sobreexpresan la proteína HÍF son más sensibles a la equinomicina.

Ejemplo 10. Efectos terapéuticos de la equinom icina liposomal en células de cáncer de mama in vivo. Para determinar si la Lipo-EM permite el aporte eficaz de equinomicina a los sitios de tumores de cáncer de mama, se administró D-luciferina a ratones portadores de xenoinjertos tumorales SUM 159 que expresaban luciferasa para visualizar las masas tumorales por bioluminiscencia. Además, la Lipo-EM se marcó con el colorante fluorescente, yoduro de 1,1'-dioctadeciltetrametil indotricarbocianina (DiR), lo que permitió el seguimiento y la acumulación de liposomas in vivo. El crecimiento tumoral se siguió mediante la actividad de luciferasa expresada de manera endógena. Los resultados de este análisis muestran la acumulación selectiva de Lipo-EM en los tumores SUM159 de cáncer de mama humano cuando se obtienen imágenes 24 horas después de la administración de la equinomicina liposomal marcada con fluorescencia. Por el contrario, la administración de una dosis equivalente de colorante DiR libre en agua no produjo una acumulación apreciable ni señal fluorescente en el canal de fluorescencia. Es importante destacar que el ratón sin ningún tumor no tenía acumulación apreciable de liposomas en otros órganos (FIG. 10). Estos datos demuestran que la Lipo-EM puede acumularse selectivamente en los tumores de xenoinjerto de cáncer de mama humano en ratones.

Para ensayar la eficacia terapéutica de la equinomicina libre (en PBS), la Lipo-EM, y el vehículo en células de cáncer de mama in vivo, se xenoinjertaron células SUM159 en la almohadilla de grasa mamaria de ratones NOD-SCÍD. Cuando se administraron 0.1 mg/kg de equinomicina libre, no se observaron diferencias significativas en el tamaño del tumor entre los grupos tratados con equinomicina y de control con vehículo (FIG.

11, serie A). Para ensayar la eficacia de la Lipo-EM en tumores de mama humanos in vivo, se trasplantaron células de cáncer de mama SUM159 en 10 ratones NSG, en los que a 5 ratones se les administró Lipo-EM por inyección iv en una dosis de 0.35 mg/kg los días 9, 11, 13, 25 y 27, y a 5 ratones se les administró un control de vehículo (sólo liposoma) en estos mismos puntos de tiempo. Además, se midió la cinética de crecimiento de los tumores trasplantados por volumen (FIG. 11, serie B) y por peso (FIG. 11, serie C y serie D). Después de que el tamaño del tumor en los ratones vehículo alcanzara los criterios de eliminación temprana, se sacrificaron los 10 ratones y se pesaron los tumores (FIG. 11, serie C y serie D). Los resultados de este análisis muestran que el crecimiento de tumores en ratones tratados con Lipo-EM que recibieron sólo 5 inyecciones en total se redujo significativamente en comparación con los ratones tratados con vehículo.

Los resultados de estos análisis demuestran que la equinomicina liposomal es una formulación estable que muestra una toxicidad reducida, un mayor tiempo de circulación en el torrente sanguíneo y una mayor capacidad de acumulación en xenoinjertos de tumores sólidos humanos en ratones, en comparación con la equinomicina libre o controles de vehículo. La equinomicina liposomal presenta grandes efectos antitumorales cuando se administra a ratones portadores de xenoinjertos humanos de tumores malignos hematopoyéticos y sólidos que expresan altos niveles de HIF-1a.

La descripción anterior tiene el propósito de enseñar a la persona con conocimientos normales de la técnica cómo poner en práctica la presente invención, y no pretende detallar todas las modificaciones y variaciones obvias de la misma que resultarán evidentes para el trabajador experto al leer la descripción. Las reivindicaciones están destinadas a cubrir los componentes y las etapas reivindicados en cualquier secuencia que sea eficaz para cumplir los objetivos allí previstos, a menos que el contexto indique específicamente lo contrario.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una formulación de fármaco liposomal pegilado para tratar una enfermedad en un paciente, que comprende: equinomicina,

un fosfolípido pegilado,

un fosfoglicérido neutro,

y un esterol,

comprendiendo la formulación una pluralidad de liposomas pegilados que encapsulan la equinomicina, y estando los liposomas suspendidos en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

2. La formulación de la reivindicación 1, en donde el fosfolípido pegilado es un diestearoilfosfatidiletanolaminapolietilenglicol (DSPE-PEG), un dimiristoil fosfatidiletanolamina-polietilenglicol (DMPE-PEG), un dipalmitoilglicerosuccinato polietilenglicol (DPGS-PEG), un colesteril-polietilenglicol, o un lípido pegilado a base de ceramida.

3. La formulación de la reivindicación 1 o 2, en donde el fosfoglicérido neutro se selecciona del grupo que consiste en fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilglicerol y fosfatidilinositol.

4. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la proporción molar de fosfolípido pegilado a lípidos totales en la formulación es del 3 al 6 %,

en donde la proporción molar de fosfoglicérido neutro a lípidos totales en la formulación está entre el 45 y el 65 %, y

en donde la proporción molar de esterol a lípidos totales en la formulación es del 30 al 50 %.

5. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el fosfolípido pegilado es un diestearoilfosfatidiletanolamina-polietilenglicol (DSPE-PEG), el fosfoglicérido neutro es una fosfatidilcolina y el esterol es colesterol.

6. La formulación de la reivindicación 5, que comprende DSPE-PEG-2000, fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC) y colesterol, opcionalmente

en donde la proporción molar de DSPE-PEG-2000, HSPC y colesterol a lípidos totales es del 5.3 %, 56.3 % y 38.4 %, respectivamente.

7. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la proporción en masa de equinomicina a lípidos totales está entre el 2 y el 10 %, opcionalmente

en donde la proporción en masa de equinomicina a lípidos totales es del 5 %.

8. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el índice de polidispersidad promedio de los liposomas es <0.1 y los liposomas son suficientemente estables para alcanzar una vida útil de almacenamiento de al menos 12 meses a 4 °C.

9. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde los liposomas se formulan como un polvo liofilizado.

10. La formulación de la reivindicación 1 para uso en el tratamiento de una enfermedad caracterizada por sobreexpresión de HIF-1a o HIF-2a.

11. La formulación para uso de la reivindicación 10, en donde la enfermedad es un trastorno proliferativo.

12. La formulación para uso de la reivindicación 11, en donde el trastorno proliferativo es leucemia, o en donde el trastorno proliferativo es cáncer de mama.

13. La formulación para uso de la reivindicación 10, en donde la enfermedad es una enfermedad autoinmune, o

en donde la enfermedad es una enfermedad de injerto contra huésped.

14. El método para producir la formulación de la reivindicación 1, que comprende:

formar una mezcla que comprenda la equinomicina y los componentes lipídicos, incluidos el fosfolípido pegilado, el fosfolípido neutro y el esterol en un disolvente polar;

secar la mezcla para eliminar el disolvente polar, formando así una película lipídica seca;

solubilizar y dispersar la película lipídica seca en un tampón para formar una suspensión lipídica; extruir la suspensión lipídica a través de un filtro de policarbonato para lograr un intervalo de tamaños de liposomas deseado; y

esterilizar los liposomas por filtración.

15. La formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 o el método de la reivindicación 14, en donde al menos el 90 % de los liposomas en la formulación tienen un diámetro entre 80 y 120 nm, determinado por dispersión de luz dinámica (DLS) utilizando un Malvern Zetasizer (y software), o

en donde la equinomicina se localiza dentro de una bicapa lipídica de los liposomas.