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ES2955993T3 - Mejora de la polimerización de los ácidos nucleicos mediante compuestos aromáticos - Google Patents

Mejora de la polimerización de los ácidos nucleicos mediante compuestos aromáticos Download PDF

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ES2955993T3
ES2955993T3 ES18897942T ES18897942T ES2955993T3 ES 2955993 T3 ES2955993 T3 ES 2955993T3 ES 18897942 T ES18897942 T ES 18897942T ES 18897942 T ES18897942 T ES 18897942T ES 2955993 T3 ES2955993 T3 ES 2955993T3
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ES
Spain
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diyl
bis
triazol
acid
pyridin
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Active
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ES18897942T
Other languages
English (en)
Inventor
Mark Stamatios Kokoris
John Tabone
Melud Nabavi
Aaron Jacobs
Dylan O'connell
Drew Goodman
Lacey Merrill
Jagadeeswaran Chandrasekar
Kendall Berg
Samantha Vellucci
Jessica Vellucci
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
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Abstract

La invención se refiere a compuestos, métodos y composiciones para mejorar la polimerización de ácidos nucleicos, incluida la replicación del ADN mediante extensión de cebadores in vitro para generar, por ejemplo, polímeros para la secuenciación de una sola molécula basada en nanoporos de una plantilla de ADN. Una composición de reacción de polimerasa de ácido nucleico está provista de restos que mejoran la polimerización, lo que permite una actividad de ADN polimerasa mejorada con análogos de nucleótidos, lo que da como resultado una longitud mejorada de los productos de extensión de cebadores para aplicaciones de secuenciación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Mejora de la polimerización de los ácidos nucleicos mediante compuestos aromáticos
Declaración acerca del listado de secuencias
El listado de secuencias asociado con esta solicitud se proporciona en forma de texto en lugar de una copia impresa. El nombre del archivo de texto que contiene el listado de secuencias es 870225_423WO_SEQUENCE_LISTING.txt. El archivo de texto tiene 14,9 KΒ, se creó el 19 de diciembre de 2018 y se envía electrónicamente a través de EFS-Web.
Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a nuevas entidades químicas, más específicamente a nuevas moléculas orgánicas que opcionalmente tienen componentes inorgánicos, incluyendo sus composiciones y los métodos para su fabricación y utilización, en particular para influenciar el rendimiento enzimático.
Antecedentes
La medición de biomoléculas es una de las bases de la medicina moderna y se utiliza ampliamente en la investigación médica, y más específicamente, en el diagnóstico y la terapia, así como en el desarrollo de fármacos. Los ácidos nucleicos codifican la información necesaria para que los seres vivos funcionen y se reproduzcan, y son esencialmente un modelo de vida. La determinación dichos modelos es útil tanto en la investigación pura como en las ciencias aplicadas. En medicina, la secuenciación puede utilizarse en el diagnóstico y desarrollo de tratamientos de diversas patologías, incluyendo cáncer, cardiopatía, trastornos autoinmunitarios, esclerosis múltiple y obesidad. En la industria, la secuenciación puede utilizarse para diseñar procesos enzimáticos u organismos sintéticos mejorados. En biología, esta herramienta puede utilizarse, por ejemplo, para estudiar la salud de los ecosistemas por lo que su utilidad es muy amplia. De manera similar, la medición de proteínas y otras biomoléculas ha proporcionado marcadores y la comprensión de la propagación de enfermedades y patógenos.
La secuencia de ADN exclusiva de un individuo ofrece una información valiosa sobre su susceptibilidad a ciertas enfermedades. También ofrece a los pacientes la oportunidad de someterse a pruebas de detección precoz y/o recibir tratamiento preventivo. Por otra parte, dado el modelo individual de un paciente, los médicos podrán administrar una terapia personalizada para maximizar la eficacia del fármaco y/o minimizar el riesgo de una respuesta adversa al fármaco. De manera similar, la determinación del modelo de los organismos patógenos puede conducir a nuevos tratamientos para enfermedades infecciosas y a una vigilancia de patógenos más sólida. La secuenciación hologenómica de bajo coste del ADN sentará las bases de la medicina moderna. Para alcanzar este objetivo, las tecnologías de secuenciación deben continuar avanzando con respecto al rendimiento, la precisión y la longitud de lectura.
En la última década, se han comercializado multitud de tecnologías de secuenciación de ADN de nueva generación que han reducido drásticamente el coste de la secuenciación hologenómica. Estas incluyen plataformas de secuenciación por síntesis ("SBS", sequencing by synthesis) (Illumina, Inc., 454 Life Sciences, Ion Torrent, Pacific Biosciences) y plataformas análogas basadas en ligamiento (Complete Genomics, Life Technologies Corporation). Se están desarrollando diversas tecnologías distintas que utilizan una amplia variedad de métodos de procesamiento y detección de muestras. Por ejemplo, GnuBio, Inc. (Cambridge, Mass.) utiliza recipientes de reacción de picolitros para controlar millones de reacciones de secuenciación de sondas distintas, mientras que Halcyon Molecular (Redwood City, Calif.) intentaba desarrollar una tecnología para la medición directa del ADN utilizando un microscopio electrónico de transmisión.
La secuenciación de ácidos nucleicos basada en nanoporos es un enfoque convincente que se ha estudiado ampliamente. Kasianowicz et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 13770-13773, 1996) caracterizaron polinucleótidos monocatenarios al translocarlos eléctricamente a través de un nanoporo de alfa hemolisina incrustado en una bicapa lipídica. Se demostró que durante la translocación de polinucleótidos, el bloqueo parcial de la apertura del nanoporo podía medirse como una disminución de la corriente iónica. Sin embargo, la secuenciación de polinucleótidos en nanoporos, se ve lastrada por tener que resolver bases muy espaciadas (0,34 nm) con pequeñas diferencias de señal inmersas en un ruido de fondo significativo. La dificultad de medir la resolución de una sola base en un nanoporo se hace más exigente debido a las rápidas tasas de translocación observadas en los polinucleótidos, que normalmente son el orden de 1 base por microsegundo. La velocidad de translocación puede reducirse ajustando los parámetros de ejecución, tales como el voltaje, la composición salina, el pH, la temperatura y la viscosidad, por nombrar algunos. Sin embargo, dichos ajustes no han podido reducir la velocidad de translocación a un nivel que permita la resolución de una sola base.
Stratos Genomics ha desarrollado un método denominado Secuenciación por Expansión ("SBX", Sequencing by Expansión) que utiliza un proceso bioquímico para transcribir la secuencia de ADN en un polímero medible denominado "expandómero" (Xpandomer) (Kokoris et al., patente de EE.UU. n.° 7.939.259, "High Throughput Nucleic Acid Sequencing by Expansión"). La secuencia transcrita se codifica a lo largo del esqueleto del expandómero en indicadores de alta relación señal-ruido que están separados por ~10 nm y que están diseñados para dar respuestas bien diferenciadas de alta relación señal-ruido. Estas diferencias proporcionan importantes mejoras de rendimiento en la eficiencia y precisión de la lectura de secuencias de los expandómeros con respecto al ADN nativo. Los expandómeros pueden permitir varias tecnologías de detección de secuenciación de ADN de nueva generación y son muy adecuados para la secuenciación por nanoporos.
Los expandómeros se generan a partir de análogos de nucleótidos no naturales, denominados XNTP, caracterizados por sustituyentes largos que permiten expandir el esqueleto del expandómero después de la síntesis (véase la solicitud PCT publicada. N.° WO2016/081871 de Kokoris et al). Debido a sus estructuras atípicas, los XNTP, así como otros análogos de nucleótidos (p. ej., análogos de nucleótidos modificados con restos de etiquetas detectables) introducen nuevas dificultades como sustratos para las ADN polimerasas actualmente disponibles. En las solicitudes PCT publicadas n.° WO2017/087281 y WO2018/204717 de Kokoris et al., se describen variantes de la polimerasa DP04 modificadas por ingeniería con mayor actividad de extensión de cebadores utilizando, como sustratos, análogos de nucleótidos voluminosos no naturales
Dentro del propio molde de ADN, se sabe que determinados motivos de secuencia de nucleótidos presentan dificultades de replicación adicionales para las ADN polimerasas. De particular importancia son las series de homopolímeros, o secuencias cortas de ADN repetidas, que pueden desencadenar el emparejamiento erróneo de hebra deslizada o "deslizamiento de replicación". Se cree que el deslizamiento de replicación abarca las siguientes etapas: (i) copia de la primera repetición por la maquinaria de replicación, (ii) pausa de la replicación y disociación de la polimerasa del extremo recién sintetizado, (iii) desemparejamiento de la hebra recién sintetizada y su emparejamiento con la segunda repetición, y (iv) reanudación de la síntesis de ADN. La detención de la maquinaria de replicación dentro de una región repetida da como resultado una desalineación del cebador y molde. In vivo, la desalineación de dos hebras de ADN durante la replicación puede dar lugar a reordenamientos del ADN, tales como deleciones o duplicaciones de diferentes longitudes. In vitro, el deslizamiento de replicación da como resultado errores de replicación en el lugar del acontecimiento de deslizamiento. Dicha reducción en la procesividad, o precisión, de la polimerasa, perjudica significativamente la aplicación particular o la manipulación genética deseada. Por tanto, se necesitan nuevos métodos y composiciones para mejorar las reacciones de la polimerasa en condiciones que incluyen uno o más reactivos con estructuras atípicas (p. ej., en la secuenciación por expansión (SBX) y otras aplicaciones en biotecnología y biomedicina, tales como la amplificación de ADN, secuenciación convencional, etiquetado, detección, clonación, etc.), y encontrarían valor en la técnica. La presente invención satisface estas necesidades y proporciona ventajas adicionales relacionadas.
Sumario
En resumen, la presente divulgación proporciona compuestos, composiciones y usos de los mismos que mejoran la actividad de la polimerasa de ácido nucleico. En ciertas realizaciones la actividad de la polimerasa se mejora en las reacciones de polimerización en condiciones que introducen uno o más cambios en la polimerasa, por ejemplo, condiciones que incluyen sustratos de análogos de nucleótidos no naturales o motivos de plantilla que perjudican la procesabilidad de la polimerasa. Dicha potenciación se consigue complementando una reacción de polimerización con uno o más compuestos de la presente divulgación, que opcionalmente en el presente documento se pueden denominar Moléculas potenciadoras de la polimerasa o PEM.
En un aspecto, PEM es un compuesto de fórmula (I)
Figure imgf000003_0001
en donde, independientemente en cada caso: m es 1, 2 o 3; n es 0, 1 o 2; p es 0, 1 o 2; Ar1 es arilo opcionalmente sustituido; Ar2 se selecciona entre anillos aromáticos monocíclicos de 5 a 6 miembros y anillos bicíclicos condensados de 9 a 10 miembros que comprenden dos anillos monocíclicos de 5 y/o 6 miembros condensados entre sí, donde al menos uno de los dos anillos monocíclicos condensados es un anillo aromático, donde Ar2 está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados entre haluro, alquilo C1-C6, haloalquilo C1-C6 , E-CO2R0, E-CONH2, E-CHO, E-C(O)NH(OH), E-N(R0)2 y E-OR0, donde E se selecciona entre un enlace directo y alquileno C1-C6; y R0 se selecciona entre H, alquilo C1-C6 y haloalquilo C1-C6 ; M se selecciona entre hidrógeno, halógeno y alquilo C1-C4 ; y L es un grupo de enlace; incluyendo un solvato, hidrato, tautómero, quelato o sal del mismo.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona un método para mejorar una reacción de polimerasa de ácido nucleico, incluyendo el método, las etapas de formar una composición de reacción de polimerasa de ácido nucleico que incluya un ácido nucleico molde, una polimerasa de ácido nucleico, una mezcla de nucleótidos y/o análogos de nucleótidos, al menos una PEM (por las siglas del inglés Polymerase Enhancing Molecule, molécula potenciadora de polimerasa); e incubar la composición de reacción de polimerasa de ácido nucleico en condiciones que permitan una reacción de polimerización de ácido nucleico. La molécula potenciadora de polimerasa (PEM) aumenta la procesividad, la tasa y/o la fidelidad de la reacción de polimerasa de ácido nucleico. En una realización, la al menos una PEM aumenta la longitud de un producto de ácido nucleico resultante en comparación con una reacción de polimerasa de ácido nucleico que carece de la PEM.
En realizaciones adicionales, la polimerasa de ácido nucleico es una ADN polimerasa. En determinadas realizaciones, la ADN polimerasa es DPO4 o una variante de la misma. En otras realizaciones, la mezcla de nucleótidos o análogos de nucleótidos es una mezcla de análogos de nucleótidos que comprende nucleósido trifosforamidatos, en donde cada uno de los nucleósido trifosforamidatos incluye una nucleobase seleccionada del grupo que consiste en adenina, guanina, timina y citosina y un resto de anclaje polimérico, en donde un primer extremo del resto de anclaje polimérico se fija a la nucleobase y un segundo extremo del resto de anclaje polimérico se fija al fosfato alfa del nucleósido trifosforamidato para permitir la expansión de los análogos de nucleótidos mediante la escisión del enlace fosforamidato. En algunas realizaciones, la reacción de polimerización de ácidos nucleicos produce un polímero expandible de análogos de nucleótidos, en donde el polímero expandible codifica la información de la secuencia de nucleobases del ácido nucleico molde. En otras realizaciones, las condiciones para permitir una reacción de polimerización de ácidos nucleicos incluyen un tampón de polimerización adecuado y un cebador oligonucleotídico. En otras realizaciones, el tampón adecuado incluye uno o más de, p. ej., cada uno de, Tris OAc, NH4OAc, PEG, un disolvente orgánico miscible en agua tal como DMF, NMP y acetona, polifosfato 60 y MnCl2. En otras realizaciones, la mezcla de reacción incluye además un agente intercalante de ácido nucleico. En otras realizaciones, la mezcla de reacción incluye además un resto de reconocimiento de polianiones. En otras realizaciones, la mezcla de nucleótidos o análogos de nucleótidos incluye análogos de nucleótidos que comprenden una etiqueta detectable. En otras realizaciones más, la etiqueta detectable es una etiqueta ópticamente detectable, seleccionada del grupo que consiste en etiquetas luminiscentes, quimioluminiscentes, fluorescentes, fluorógenas, cromóforas o cromógenas.
En otro aspecto, la presente divulgación proporciona una composición que incluye al menos una PEM y una mezcla de análogos de nucleótidos. Esta composición es útil, p. ej., cuando se combina con una polimerasa, en donde la al menos una PEM aumenta el número y la precisión de los análogos de nucleótidos incorporados en una hebra hija durante una reacción de polimerización dependiente de molde en relación con una reacción de polimerización idéntica sin la al menos PEM. En otras realizaciones, la al menos una PEM comprende una pluralidad de PEM.
Opcionalmente, la mezcla de análogos de nucleótidos comprende nucleósido trifosforamidatos, en donde cada uno de los nucleósido trifosforamidatos comprende una nucleobase seleccionada del grupo que consiste en adenina, guanina, timina y citosina y un resto de anclaje polimérico, en donde un primer extremo del resto de anclaje polimérico se fija a la nucleobase y un segundo extremo del resto de anclaje polimérico se fija al fosfato alfa del nucleósido trifosforamidato para permitir la expansión de los análogos de nucleótidos mediante la escisión del enlace fosforamidato. En otras realizaciones, la composición incluye además un tampón que incluye al menos uno de, p. ej., dos de, tres de, cuatro de, etc., o cada uno de, Tris OAc, NH4OAc, PEG, disolvente orgánico miscible en agua tal como DMF y NMP, polifosfato 60, N-metilsuccinimida (NMS) y MnCl2. En otras realizaciones, la composición incluye además una proteína de unión monocatenaria (SSB, single-strand binding protein). En otras realizaciones, la composición incluye además urea. En determinadas realizaciones, la mezcla de análogos de nucleótidos incluye análogos de nucleótidos que incluyen una etiqueta detectable. En algunas realizaciones, la etiqueta detectable es una etiqueta ópticamente detectable, seleccionada del grupo que consiste en etiquetas luminiscentes, quimioluminiscentes, fluorescentes, fluorógenas, cromóforas o cromógenas.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para secuenciar un molde de ADN, incluyendo el método, las etapas de formar una composición de reacción de a Dn polimerasa que incluya el molde de ADN, un cebador de replicación que forma complejos con el molde, una ADN polimerasa, una mezcla de nucleótidos o análogos de nucleótidos, y al menos una PEM, incubar la composición de reacción de ADN polimerasa en condiciones que permitan una reacción de polimerización de ADN, en donde la al menos una PEM aumenta la tasa, la fidelidad o la procesividad de la reacción de ADN polimerasa. El método puede incluir además la determinación de la secuencia de los nucleótidos o análogos de nucleótidos en el polímero resultante de nucleótidos o análogos de nucleótidos. La PEM puede describirse como un compuesto de fórmula (I). En algunas realizaciones, la al menos una PEM se selecciona de compuestos de fórmula (II). En otras realizaciones, la mezcla de análogos de nucleótidos comprende nucleósido trifosforamidatos, en donde cada uno de los nucleósido trifosforamidatos comprende una nucleobase seleccionada del grupo que consiste en adenina, guanina, timina y citosina y un resto de anclaje polimérico, en donde un primer extremo del resto de anclaje polimérico se fija a la nucleobase y un segundo extremo del resto de anclaje polimérico se fija al fosfato alfa del nucleósido trifosforamidato para permitir la expansión de los análogos de nucleótidos mediante la escisión del enlace fosforamidato. En otras realizaciones, la ADN polimerasa es DPO4 o una variante de la misma. En otras realizaciones, el polímero resultante de análogos de nucleótidos es un polímero expandible. En otras realizaciones, el método incluye además la etapa de poner en contacto el polímero expandible con un agente de escisión de fosforamidato para producir un polímero expandido de análogos de nucleótidos. En determinadas realizaciones, el resto de anclaje polimérico de cada uno de los análogos de nucleótidos comprende un resto indicador exclusivo de la nucleobase del análogo. En otras realizaciones, los restos indicadores producen una señal electrónica característica. En otras realizaciones más, la etapa de determinar la secuencia de los análogos de nucleótidos incluye la etapa de translocar el polímero expandido de análogos de nucleótidos a través de un nanoporo.
Por lo tanto, en una realización la presente divulgación se proporciona una composición que comprende una PEM y un polinucleótido. En otra realización la presente divulgación proporciona una composición que comprende una PEM y un polipéptido, por ejemplo, un polipéptido tal como una enzima, donde la enzima puede ser una polimerasa de ácido nucleico.
Los siguientes son compuestos para su uso en los métodos de la presente invención. Las posiciones indicadas con "k" en algunas de las estructuras de Ar1 a modo de ejemplo mostradas a continuación son las posiciones donde los anillos de triazol dentro de los paréntesis, es decir, "( )" están unidas al anillo Ar1 cuando m es 2. Además, a menos que se mencione de manera específica de otro modo, cada átomo identificado en una fórmula puede ser cualquiera de los isótopos de ese átomo. Por ejemplo, la designación C (carbono) incluye 12C, 13C o 14C y sus mezclas, en particular las mezclas isotópicas en su abundancia natural, mientras que H (hidrógeno) incluye 1H, 2H y 34H y sus mezclas, y O (oxígeno) incluye 16O y 18O y sus mezclas, y N (nitrógeno) incluye 14N y 15N y sus mezclas, etc. para otros átomos:
1) Un compuesto de fórmula (I)
Figure imgf000005_0001
en donde, independientemente en cada caso: m es 1, 2 o 3; n es 0, 1 o 2; p es 0, 1 o 2; Ar1 es arilo opcionalmente sustituido; Ar2 se selecciona entre anillos aromáticos monocíclicos de 5 a 6 miembros y anillos bicíclicos condensados de 9 a 10 miembros que comprenden dos anillos monocíclicos de 5 y/o 6 miembros condensados entre sí, donde al menos uno de los dos anillos monocíclicos que están condensados entre sí es un anillo aromático, donde Ar2 está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados entre haluro, alquilo C1-C6 , haloalquilo C1-C6, E-CO2 R0, E-CONH2, E-CHO, E-C(O)NH(OH), E-N(R0)2 y E-OR0, donde E se selecciona entre un enlace directo y alquileno C1-C6; y R0 se selecciona entre H, alquilo C1-C6 y haloalquilo C1-C6 ; M se selecciona entre hidrógeno, halógeno y alquilo C1-C4; y L es un grupo de enlace; o un solvato, hidrato, tautómero, quelato o sal del mismo.
2) El compuesto de 1 en donde n es 0 y m es 2, que tiene la fórmula
Figure imgf000005_0002
3) El compuesto de 1 o 2 en donde Ar1 es arilo carbocíclico monocíclico.
4) El compuesto de 1 o 2 o 3 en donde m es 2 y Ar1 se selecciona entre:
Figure imgf000006_0001
5) El compuesto de 1 o 2 en donde Ar1 es arilo heterocíclico monocíclico.
6) El compuesto de 1 o 2 o 5 en donde m es 2 y Ar1 se selecciona entre:
Figure imgf000006_0002
7) El compuesto de 1 o 2 en donde Ar1 es arilo bicíclico.
8) El compuesto de 1 o 2 en donde m es 2 y Ar1 es un arilo carbocíclico bicíclico seleccionado entre:
Figure imgf000006_0003
9) El compuesto de 1 o 2 en donde Ar1 es un arilo heterocíclico bicíclico seleccionado entre:
Figure imgf000006_0004
10) El compuesto de 1 o 2 en donde Ar1 es un arilo tricíclico.
11) El compuesto de 1 o 2 en donde Ar1 es un arilo carbocíclico tricíclico seleccionado entre:
Figure imgf000007_0001
12) El compuesto de 1 o 2 en donde Ar1 es un heteroarilo tricíclico seleccionado entre:
Figure imgf000007_0002
13) El compuesto de 1 o 2 en donde Ar1 es un heteroarilo tricíclico seleccionado entre:
Figure imgf000007_0003
14) El compuesto de uno cualquiera de 1-13 en donde Ar1 es un arilo sin sustituir.
15) El compuesto de uno cualquiera de 1-13 en donde Ar1 es un arilo sustituido.
16) El compuesto de 15 en donde al menos un sustituyente en Ar1 se selecciona entre el grupo que consiste en halógeno, hidroxilo, mercaptano, nitro y nitrilo.
17) El compuesto de 15 en donde al menos un sustituyente en Ar1 se selecciona entre el grupo que consiste en --SOR1, --S(O)2R1, --S(O)2NR2R3, --OR1, --OC(O)R3, --C(O)OR3, --C(O)R1, --C(O)NR2R3, --NR2R3, --N(R3)C(O)R1 y --NS(O)2 R3; y en donde cada aparición de R1 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en alquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, heterociclilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir y heteroarilo sustituido o sin sustituir; y cada aparición de R2 y R3 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en --H, alquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, heterociclilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir, y heteroarilo sustituido o sin sustituir.
18) El compuesto de 15 en donde al menos un sustituyente en Ar1 se selecciona entre el grupo que consiste en alquilo sustituido o sin sustituir, alquenilo sustituido o sin sustituir, alquinilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, heterociclilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir, heteroarilo sustituido o sin sustituir, arilalquilo sustituido o sin sustituir, heteroarilalquilo sustituido o sin sustituir, haloalquilo sustituido o sin sustituir y haloalcoxi sustituido o sin sustituir.
19) El compuesto de 15 en donde al menos un sustituyente en Ar1 se selecciona entre el grupo que consiste en-R4-H en donde R4 es uno o más alquilenos interrumpidos con heteroátomo en donde el heteroátomo es O, S, NH o una de sus combinaciones.
20) El compuesto de 15 en donde al menos un sustituyente en Ar1 se selecciona entre el grupo que consiste en -O-(alquilo C-i-a), alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, -CO2-alquilo C1-6, -CONH-alquilo C1-6, -CONH2, Cn y -NO2.
21) El compuesto de una cualquiera de 1-20 en donde Ar2 es un anillo aromático monocíclico de 5 miembros seleccionado entre el grupo que consiste en tiofeno, 1,2-tiazol, 1,3-tiazol, furano, 1,2-oxazol, 1,3-oxazol, 1H-pirrol, 1H-pirazol, oxadiazol, tiadiazol, 1,2,4-triazol, 1,2,3-triazol y 1H-imidazol.
22) El compuesto de una cualquiera de 1-20 en donde Ar2 es un anillo aromático monocíclico de 6 miembros seleccionado entre el grupo que consiste en benceno, piridina, piridazina, pirimidina y pirazina.
23) El compuesto de una cualquiera de 1-20 en donde Ar2 es un sistema anular aromático, bicíclico, condensado, de 9 miembros, seleccionado entre el grupo que consiste en benzofurano, 1,3-benzoxazol, furo[3,2-bjpiridina, furo[3,2-c]piridina, furo[2,3-c]piridina, furo[2,3-b]piridina, indol, 1H-benzoimidazol, 1H-pirrolo[3,2-bjpiridina, 1H-pirrolo[3,2-c]piridina, 1 H-pirrolo[2,3-c]piridina, 1H-pirrolo[2,3-b]piridina, benzotiofeno, 1,3-benzotiazol, tienol[3,2-b]piridina, tieno[3,2- c]piridina, tieno[2,3-c]piridina, benzoxadiazol, benzotiadiazol, benzoisoxazol, benzotriazol y tieno[2,3-b]piridina.
24) El compuesto de una cualquiera de 1-20 en donde Ar2 es un sistema anular aromático, bicíclico, condensado, de 10 miembros, seleccionado entre el grupo que consiste en naftaleno, quinolina, quinazolina, quinoxalina, 1,5-naftiridina, 1,6-naftiridina, 1,7-naftiridina, 1,8-naftiridina, isoquinolina, ftalazina, 2,6-naftiridina y 2,7-naftiridina.
25) El compuesto de una cualquiera de 1-20 en donde Ar2 es un anillo piridinilo seleccionado entre
Figure imgf000008_0001
en donde el sustituyente G está presente 0, 1 o 2 veces en el anillo piridinilo.
26) El compuesto de una cualquiera de 1-20 en donde Ar2 es un anillo fenilo de fórmula
Figure imgf000008_0002
en donde el sustituyente G está presente 0, 1 o 2 veces en el anillo fenilo.
27) El compuesto de una cualquiera de 1-20 en donde Ar2 es un anillo fenilo sustituido seleccionado entre
Figure imgf000008_0003
28) El compuesto de una cualquiera de 1-24 en donde la sustitución en Ar2 incluye amino.
29) El compuesto de una cualquiera de 1-24 en donde la sustitución en Ar2 incluye metoxi.
30) El compuesto de cualquiera de 1-24 en donde la sustitución en Ar2 incluye ácido carboxílico.
31) El compuesto de cualquiera de 1-24 en donde la sustitución en Ar2 incluye -CH2-CO2-CH3.
32) El compuesto de cualquiera de 1-24 en donde la sustitución en Ar2 incluye trifluorometilo.
33) El compuesto de una cualquiera de 1-24 en donde la sustitución en Ar2 incluye hidroxilo.
34) El compuesto de una cualquiera de las realizaciones 1-24 en donde la sustitución en Ar2 es un ácido carboxílico y un hidroxilo.
35) El compuesto de una cualquiera de 1-24 en donde la sustitución en Ar2 es un ácido carboxílico y un trifluorometilo.
36) El compuesto de una cualquiera de las realizaciones 1-24 que tiene una sustitución en Ar2 que incluye al menos dos de hidroxilo, ácido carboxílico y trifluorometilo.
37) El compuesto de uno cualquiera de 1-20 de fórmula
Figure imgf000008_0004
38) El compuesto de uno cualquiera de 1-20 de fórmula
Figure imgf000009_0001
39) El compuesto de uno cualquiera de 1-20 de fórmula
Figure imgf000009_0002
40) El compuesto de uno cualquiera de 1-20 de fórmula
Figure imgf000009_0003
41) El compuesto de uno cualquiera de 1-20 de fórmula
Figure imgf000009_0004
42) El compuesto de una cualquiera de 1-41 en forma de un quelato.
43) El compuesto de 42 en donde el quelato es un quelato de cobre.
44) El compuesto de una cualquiera de 1-41 que tiene un logP de al menos 4,9.
45) Una composición que comprende un compuesto de una cualquiera de 1-44 y un agente de acumulación molecular.
46) La composición de 45 en donde el agente de acumulación molecular es un polialquilenglicol.
47) Una composición que comprende un compuesto de una cualquiera de 1-44 y un tampón acuoso.
48) La composición de 47 en donde el tampón acuoso comprende agua y Tris HCl.
49) Una composición que comprende un compuesto de una cualquiera de 1-44 y un polinucleótido.
50) La composición de 49 en donde el polinucleótido es un polinucleótido monocatenario.
51) Una composición que comprende un compuesto de una cualquiera de 1-44 y una proteína.
52) La composición de 51 en donde la proteína es ADN polimerasa.
53) Una composición que comprende un compuesto de una cualquiera de 1-44 y una mezcla de nucleótidos o análogos de nucleótidos. La invención pertenece a un método como se define a continuación y según se limita por las reivindicaciones.
54) Un método para mejorar una reacción de polimerasa de ácido nucleico, comprendiendo el método:
a. formar una composición de reacción de polimerasa de ácido nucleico que comprende:
i. un ácido nucleico molde,
ii. una polimerasa de ácido nucleico,
iii. una mezcla de nucleótidos o análogos de nucleótidos, y
iv. al menos un compuesto de cualquiera de las realizaciones 1-44; y
b. incubar la composición de reacción de polimerasa de ácido nucleico en condiciones que permitan una reacción de polimerización de ácido nucleico, en donde el al menos un compuesto de una cualquiera de las realizaciones 1-44 aumenta la procesividad, la tasa o la fidelidad de la reacción de polimerasa de ácido nucleico.
55) El método de 54, en donde el compuesto de una cualquiera de las realizaciones 1-44 aumenta la longitud de un producto de ácido nucleico resultante en comparación con una reacción de polimerasa de ácido nucleico que carece del compuesto de una cualquiera de las realizaciones 1-44.
56) El método de 54, en donde el al menos un compuesto de una cualquiera de las realizaciones 1-44 comprende una pluralidad de compuestos de una cualquiera de las realizaciones 1-44.
57) El método de 54, en donde la polimerasa de ácido nucleico es una ADN polimerasa.
58) El método de 57, en donde la ADN polimerasa es DPO4 o una variante de la misma.
59) El método de 54, en donde la mezcla de nucleótidos o análogos de nucleótidos es una mezcla de análogos de nucleótidos que comprende nucleósido trifosforamidatos, en donde cada uno de los nucleósido trifosforamidatos comprende una nucleobase seleccionada del grupo que consiste en adenina, guanina, timina y citosina y un resto de anclaje polimérico, en donde un primer extremo del resto de anclaje polimérico se fija a la nucleobase y un segundo extremo del resto de anclaje polimérico se fija al fosfato alfa del nucleósido trifosforamidato para permitir la expansión de los análogos de nucleótidos mediante la escisión del enlace fosforamidato.
60) El método de 54, en donde la reacción de polimerización de ácidos nucleicos produce un polímero expandible de análogos de nucleótidos, en donde el polímero expandible codifica la información de la secuencia de nucleobases del ácido nucleico molde.
61) El método de 54, en donde las condiciones para permitir una reacción de polimerización de ácidos nucleicos comprenden un tampón de polimerización adecuado y un cebador oligonucleotídico.
62) El método de 54, en donde el tampón adecuado comprende un componente seleccionado del grupo Tris OAc, NH4OAc, PEG, un disolvente orgánico miscible en agua, polifosfato 60, NMS y MnCh.
63) El método de 54, en donde la mezcla de reacción comprende además una proteína de unión monocatenaria.
64) El método de 54, en donde la mezcla de reacción comprende además urea.
65) El método de 54, en donde la mezcla de nucleótidos o análogos de nucleótidos comprende análogos de nucleótidos que comprenden una etiqueta detectable.
66) El método de 65, en donde la etiqueta detectable es una etiqueta ópticamente detectable, seleccionada del grupo que consiste en etiquetas luminiscentes, quimioluminiscentes, fluorescentes, fluorógenas, cromóforas o cromógenas. En los métodos de la invención pueden utilizarse las siguientes composiciones:
67) Una composición para mejorar la procesividad, la fidelidad o la tasa de una reacción de ADN polimerasa, que comprende al menos un compuesto de cualquiera de 1-44 y una mezcla de análogos de nucleótidos.
68) Una composición que comprende al menos un compuesto de una cualquiera de 1-44 y una mezcla de análogos de nucleótidos, en donde el al menos un compuesto de una cualquiera de 1-44 aumenta el número y la precisión de los análogos de nucleótidos incorporados en una hebra hija durante un reacción de polimerización dependiente de molde en relación con una reacción de polimerización idéntica sin el al menos un compuesto de una cualquiera de 1-44.
69) La composición de 68, en donde la mezcla de análogos de nucleótidos comprende nucleósido trifosforamidatos, en donde cada uno de los nucleósido trifosforamidatos comprende una nucleobase seleccionada del grupo que consiste en adenina, guanina, timina y citosina y un resto de anclaje polimérico, en donde un primer extremo del resto de anclaje polimérico se fija a la nucleobase y un segundo extremo del resto de anclaje polimérico se fija al fosfato alfa del nucleósido trifosforamidato para permitir la expansión de los análogos de nucleótidos mediante la escisión del enlace fosforamidato.
70) La composición de 68 o 69, que comprende además un tampón que comprende uno o más componentes seleccionados de Tris OAc, NH4OAc, PEG, un disolvente orgánico miscible en agua, polifosfato 60, NMS y MnCl2.
71) La composición de las realizaciones 68 o 69, que comprende además una proteína de unión monocatenaria.
72) La composición de 68 o 69, que comprende además urea.
73) La composición de 68 o 69, en donde la mezcla de análogos de nucleótidos comprende análogos de nucleótidos que comprenden una etiqueta detectable.
74) La composición de 73, en donde la etiqueta detectable es una etiqueta ópticamente detectable, seleccionada del grupo que consiste en etiquetas luminiscentes, quimioluminiscentes, fluorescentes, fluorógenas, cromóforas o cromógenas. La invención se refiere además a un método como se define a continuación y que está limitado por las reivindicaciones.
76) Un método para secuenciar un molde de ADN, comprendiendo el método las etapas de:
a. formar una composición de reacción de ADN polimerasa que comprende:
i. un molde de ADN,
ii. un cebador de replicación que forma complejos con el molde,
iii. una ADN polimerasa,
iv. una mezcla de nucleótidos o análogos de nucleótidos,
v. al menos un compuesto de cualquiera de las realizaciones 1-44,
b. incubar la composición de reacción de ADN polimerasa en condiciones que permitan una reacción de polimerización de ADN, en donde el al menos un compuesto de cualquiera de 1-44 aumenta la tasa, la fidelidad o la procesividad de la reacción de ADN polimerasa; y
c. determinar la secuencia de los nucleótidos o análogos de nucleótidos en el polímero resultante de nucleótidos o análogos de nucleótidos.
77) El método de 76, en donde la mezcla de análogos de nucleótidos comprende nucleósido trifosforamidatos, en donde cada uno de los nucleósido trifosforamidatos comprende una nucleobase seleccionada del grupo que consiste en adenina, guanina, timina y citosina y un resto de anclaje polimérico, en donde un primer extremo del resto de anclaje polimérico se fija a la nucleobase y un segundo extremo del resto de anclaje polimérico se fija al fosfato alfa del nucleósido trifosforamidato para permitir la expansión de los análogos de nucleótidos mediante la escisión del enlace fosforamidato.
78) El método de 76 o 77, en donde la ADN polimerasa es DPO4 o una variante de la misma.
79) El método de 76 o 77, en donde el polímero resultante de análogos de nucleótidos es un polímero expandible.
80) El método de 79, que incluye además la etapa de poner en contacto el polímero expandible con un agente de escisión de fosforamidato para producir un polímero expandido de análogos de nucleótidos.
81) El método de 76 o 77, en donde el resto de anclaje polimérico de cada uno de los análogos de nucleótidos comprende un resto indicador exclusivo de la nucleobase del análogo.
82) El método de 77, en donde los restos indicadores producen una señal electrónica característica.
83) El método de 77, en donde la etapa de determinar la secuencia de los análogos de nucleótidos comprende la etapa de translocar el polímero expandido de análogos de nucleótidos a través de un nanoporo.
Las características adicionales y mencionadas anteriormente de la presente invención y la manera de obtenerlas, se harán evidentes, y la invención se entenderá mejor con referencia a la siguiente descripción más detallada.
Breve descripción de los dibujos
Las características ilustrativas de la presente divulgación, su naturaleza y diversas ventajas serán evidentes a partir de los dibujos adjuntos y de la siguiente descripción detallada de diversas realizaciones. Se describen realizaciones no limitativas y no exhaustivas con referencia a los dibujos adjuntos, en donde etiquetas o números de referencia similares se refieren a partes similares a lo largo de las diversas vistas, a menos que se especifique lo contrario. Los tamaños y las posiciones relativas de los elementos en los dibujos no están necesariamente a escala. Por ejemplo, para mejorar la legibilidad del dibujo, se seleccionan, amplían y colocan las formas de diversos elementos. Las formas particulares de los elementos tal como están dibujados se han seleccionado para facilitar su reconocimiento en los dibujos.
Las figuras 1A, 1B, 1C y 1D son esquemas condensados que ilustran las características principales de un XNTP generalizado y su uso en la secuenciación por expansión (SBX).
La figura 2 es un esquema que ilustra más detalles de una realización de un XNTP.
La figura 3 es un esquema que ilustra una realización de un expandómero que pasa a través de un nanoporo biológico.
La figura 4 es un gel que muestra productos de extensión de cebador.
La figura 5 es un gel que muestra productos de extensión de cebador.
Las figuras 6A y 6B son visualizaciones de histogramas de poblaciones de lecturas alineadas de secuencias derivadas de nanoporos.
Las figuras 7A y 7b son visualizaciones de histogramas de poblaciones de lecturas alineadas de secuencias derivadas de nanoporos.
La figura 8 es un gel que muestra productos de extensión de cebador.
La figura 9 es un gel que muestra productos de extensión de cebador.
La figura 10 es un gel que muestra productos de extensión de cebador.
La figura 11 es un gel que muestra productos de extensión de cebador.
La figura 12 es un gel que muestra productos de extensión de cebador.
La figura 13 es un gel que muestra productos de extensión de cebador.
La figura 14 es un gel que muestra productos de extensión de cebador.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se puede entender con más facilidad con referencia a la descripción detallada a continuación y los ejemplos incluidos en el presente documento. A menos que se explique de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende normalmente un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente divulgación.
En un aspecto, las PEM de la presente divulgación son compuestos de fórmula (I)
Figure imgf000012_0001
en donde, independientemente en cada caso:
m es 1, 2 o 3;
n es 0, 1 o 2;
p es 0, 1 o 2;
Ar1 es arilo opcionalmente sustituido;
Ar2 se selecciona entre anillos aromáticos monocíclicos de 5 a 6 miembros y anillos bicíclicos condensados de 9 a 10 miembros que comprenden dos anillos monocíclicos de 5 y/o 6 miembros condensados entre sí, donde al menos uno de los dos anillos monocíclicos es un anillo aromático, donde
Ar2 está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados entre haluro, alquilo C1-C6 , haloalquilo Cr Ca, E-CO2R0, E-CONH2 , E-CHO, E-C(O)NH(OH), E-N(R0)2 y E-OR0, donde
E se selecciona entre un enlace directo y alquileno C1-C6 ; y
R0 se selecciona entre H, alquilo C1-C6 y haloalquilo C1-C6,
M se selecciona entre hidrógeno, halógeno y alquilo C1-C4; y
L es un grupo de enlace; y
un solvato, hidrato, tautómero, quelato o sal del mismo.
Como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, salvo que se especifique lo contrario, los siguientes términos tienen el significado indicado.
Ciertos grupos químicos nombrados en el presente documento están precedidos por una notación abreviada que indica el número total de átomos de carbono que se encuentran en el grupo químico indicado. Por ejemplo; alquilo C1-C4 , el cual, como alternativa, se puede escribir alquilo C1-4, describe un grupo alquilo que tiene al menos uno y hasta 4 átomos de carbono, mientras que cicloalquilalquilo C4-C12 (el cual se puede escribir igualmente cicloalquilalquilo C4-12) describe un grupo cicloalquilalquilo que tiene un total de 4 a 12 átomos de carbono. El número total de carbonos en la notación abreviada no incluye los carbonos que pueden existir en los sustituyentes del grupo descrito. Como ejemplos, alquilo C1-C6 se refiere a un radical alquilo que contiene de uno a seis átomos de carbono; haloalquilo C1-C6 se refiere a un radical haloalquilo que contiene de uno a seis átomos de carbono; alquileno C1-C6 se refiere a un dirradical alquileno que contiene de uno a seis átomos de carbono.
Además de lo anterior, como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, salvo que se especifique lo contrario, los siguientes términos tienen los significados indicados:
"Alquilo" se refiere un radical de cadena de hidrocarburo lineal o ramificada que consiste únicamente en átomos de carbono e hidrógeno, que no contiene insaturación y que, opcionalmente, tiene un número indicado de átomos de carbono, por ejemplo, que tiene de uno a doce átomos de carbono, de uno a ocho átomos de carbono o de uno a seis átomos de carbono, o de uno a cuatro átomos de carbono, y que está unida al resto de la molécula por un enlace sencillo. Son ejemplos metilo, etilo, n-propilo, 1 -metiletilo (iso-propilo), n-butilo, n-pentilo, 1,1 -dimetiletilo (tbutilo), 3-metilhexilo, 2-metilhexilo y similares. Cuando se introduce insaturación en un grupo alquilo, el grupo resultante se puede denominar grupo alquilo insaturado, donde los grupos alquilo insaturados se conocen comúnmente como grupos alquenilo (que tienen al menos un doble enlace carbono-carbono) y grupos alquinilo (que tienen al menos un triple enlace carbono-carbono). En una realización, y cuando se especifica, los grupos alquilo en los compuestos de la presente divulgación pueden ser, o incluir, grupos alquilo insaturados.
"Alquenilo” se refiere a un grupo radical de cadena de hidrocarburo lineal o ramificada que consiste únicamente en átomos de carbono e hidrógeno, que contiene al menos un doble enlace, opcionalmente que tiene un número indicado de carbonos, por ejemplo, de dos a doce átomos de carbono, o de dos a ocho átomos de carbono, o de dos a seis átomos de carbono, o de dos a cuatro átomos de carbono, y que está unido al resto de la molécula por un enlace sencillo, por ejemplo, etenilo, prop-1-enilo, but-1-enilo, pent-1-enilo, penta-1,4-dienilo y similares.
"AlquinNo” se refiere a un grupo radical de cadena de hidrocarburo lineal o ramificada que consiste únicamente en átomos de carbono e hidrógeno, que contiene al menos un triple enlace, opcionalmente que tiene un número indicado de carbonos, por ejemplo, que tiene de dos a doce átomos de carbono, o de dos a ocho átomos de carbono, o de dos a seis átomos de carbono, o de dos a cuatro átomos de carbono, y que está unido al resto de la molécula por un enlace sencillo, por ejemplo, etenilo, prop-1-enilo, but-1-enilo, pent-1-enilo, penta-1,4-dienilo y similares.
"Halo" se refiere a bromo, cloro, flúor o yodo.
"Haloalquilo" se refiere a un radical alquilo, como se ha definido anteriormente, que está sustituido con uno o más radicales halo, como se ha definido anteriormente, por ejemplo, trifluorometilo, difluorometilo, triclorometilo, 2,2,2-trifluoroetilo, 1-fluorometil-2-fluoroetilo, 3- bromo-2-fluoropropilo, 1-bromometil-2-bromoetilo y similares. De manera análoga, "haloalquenilo" se refiere a un radical alquenilo, como se define en el presente documento, que está sustituido con uno o más radicales halo, como se define en el presente documento, y "haloalquinilo" se refiere a un radical alquinilo, como se define en el presente documento, que está sustituido con uno o más radicales halo, como se define en el presente documento.
"Alquileno" o "cadena alquileno" se refiere a una cadena de hidrocarburo divalente, lineal o ramificada, que une el resto de la molécula a un grupo radical, que consiste únicamente en carbono e hidrógeno, que no contiene insaturación y que opcionalmente tiene un número indicado de átomos de carbono. Son ejemplos metileno, etileno, propileno, n-butileno y similares. La cadena alquileno está unida al resto de la molécula a través de un enlace simple y al grupo radical a través de un enlace simple. Los puntos de unión de la cadena alquileno al resto de la molécula y al grupo radical pueden ser a través de un carbono o cualquiera de dos carbonos en el interior de la cadena. De manera análoga a los grupos alquilo, se puede introducir insaturación en una cadena alquileno, para proporcionar una cadena alquileno insaturada. Si se introduce insaturación en una cadena alquileno, el grupo resultante se puede denominar grupo o cadena alquileno insaturado, donde las cadenas alquileno insaturadas se conocen comúnmente como grupos alquenileno (que tienen al menos un doble enlace carbono-carbono) y grupos alquinileno (que tienen al menos un triple enlace carbono-carbono). En una realización, y cuando se especifica, las cadenas alquileno en los compuestos de la presente divulgación pueden ser, o incluir, cadenas alquileno insaturadas.
"Alquenileno" o "cadena alquenileno" se refiere a una cadena de hidrocarburo divalente lineal o ramificada que une el resto de la molécula a un grupo radical, que consiste únicamente en carbono e hidrógeno, que contiene al menos un doble enlace y opcionalmente que tiene un número indicado de átomos de carbono, por ejemplo, de dos a doce átomos de carbono. Son ejemplos de grupos alquenileno etenileno, propenileno, n-butenileno y similares. La cadena alquenileno está unida al resto de la molécula a través de un enlace sencillo y al grupo radical a través de un doble enlace o un enlace sencillo. Los puntos de unión de la cadena alquenileno al resto de la molécula y al grupo radical pueden ser a través de un carbono o cualquiera de dos carbonos en la cadena.
"Arilo" se refiere a un radical sistema anular que comprende al menos 5 átomos en el anillo, que opcionalmente comprende 1-6 heteroátomos en el anillo seleccionados entre O, S y N, y al menos un anillo aromático. Un anillo aromático monocíclico de 5 miembros contiene 5 átomos en el anillo seleccionados entre carbonos y heteroátomos, mientras que un anillo aromático monocíclico de 6 miembros contiene 6 átomos en el anillo seleccionados entre carbono y heteroátomos. Ejemplos de los anillos aromáticos monocíclicos que tienen 5 miembros es el pirrol y que tienen seis miembros es la piridina. El radical arilo puede ser, por ejemplo, un sistema anular monocíclico, bicíclico, tricíclico o tetracíclico, que puede incluir sistemas anulares condensados o puenteados. Los radicales arilo carbocíclicos contienen solo carbono en los átomos del anillo, donde los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, radicales arilo derivados de aceantrileno, acenaftileno, acefenantrileno, antraceno, azuleno, benceno, criseno, fluoranteno, fluoreno, as-indaceno, s-indaceno, indano, indeno, naftaleno, fenaleno, fenantreno, pleiadeno, pireno y trifenileno. En una realización, arilo es fenilo o naftilo, and en otra realización es fenilo. Cuando el radical arilo incluye átomos del anillo distintos de carbono, por ejemplo, oxígeno, azufre y nitrógeno, el grupo arilo se puede denominar grupo heteroarilo. El radical heteroarilo puede ser, por ejemplo, un sistema anular monocíclico, bicíclico, tricíclico o tetracíclico, que puede incluir sistemas anulares condensados o puenteados. Los átomos de nitrógeno, carbono o azufre en el radical heteroarilo pueden estar opcionalmente oxidados; el átomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternizado.
"Condensado" se refiere a un sistema anular que contiene fusión entre los anillos, donde fusión se refiere a los anillos que comparten dos átomos adyacentes del anillo. Anillos condensados que contienen dos anillos monocíclicos de 5 o 6 miembros condensados entre sí se refiere a sistemas anulares bicíclicos donde cada anillo es monocíclico y cada uno tiene independientemente 5 o 6 átomos en el anillo, y los dos anillos están condensados dado que comparten dos átomos del anillo. Por ejemplo, naftaleno es un sistema anular condensado de 10 miembros formado por dos anillos monocíclicos de 6 miembros (benceno) condensados entre sí. El naftaleno es bicíclico dado que tiene dos anillos (bi = 2). Como otro ejemplo, 1,3-benzotiazol que es un sistema anular condensado de 9 miembros formado por un anillo de 6 miembros (benceno) y un anillo de 5 miembros (1,3-tiazol) condensados entre sí. 1,3-benzotiazol es bicíclico dado que contiene dos anillos.
"Carbociclilo" se refiere a un radical anular aromático o no aromático, de 3 a 18 miembros, que consiste en 3 a 18 átomos de carbono. A menos que se indique específicamente otra cosa en la memoria descriptiva, el radical carbocíclico puede ser un sistema anular monocíclico, bicíclico, tricíclico o tetracíclico, que puede incluir sistema anulares condensados o puenteados y puede estar parcial o completamente saturado. Los radicales carbocíclicos no aromáticos incluyen cicloalquilo, mientras que los radicales carbocíclicos aromáticos incluyen arilo.
"Cicloalquilo” se refiere a un radical hidrocarburo monocíclico o policíclico estable que consiste únicamente en átomos de carbono e hidrógeno, que puede incluir sistemas anulares condensados o unidos, que tiene de tres a quince átomos de carbono, que tiene preferentemente de tres a diez átomos de carbono, y que está saturado o insaturado y unido al resto de la molécula por un enlace simple. Los radicales monocíclicos incluyen, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y ciclooctilo. Los radicales policíclicos incluyen, por ejemplo, adamantilo, norbornilo, decalinilo, 7,7-dimetil-biciclo-[2.2.1]heptanilo y similares.
"Heterociclilo" se refiere a un radical anulas aromático o no aromático, de 3 a 18 miembros, que consiste en de dos a doce átomos de carbono y de uno a seis heteroátomos seleccionados entre el grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre. A menos que se indique específicamente otra cosa en la memoria descriptiva, el radical heterociclilo puede ser un sistema anular monocíclico, bicíclico, tricíclico o tetracíclico, que puede incluir sistemas anulares condensados o puenteados; y los átomos de nitrógeno, carbono o azufre del radical heterociclilo pueden estar opcionalmente oxidados; el átomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternizado; y el radical heterociclilo puede estar parcial o totalmente saturado. Los ejemplos de radicales heterociclilo no aromáticos incluyen, pero no se limitan a, dioxolanilo, tienil[1,3]ditianilo, decahidroisoquinolilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, isotiazolidinilo, isoxazolidinilo, morfolinilo, octahidroindolilo, octahidroisoindolilo, 2-oxopiperazinilo, 2-oxopiperidinilo, 2-oxopirrolidinilo, oxazolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, 4-piperidonilo, pirrolidinilo, pirazolidinilo, pirazolopirimidinilo, quinuclidinilo, tiazolidinilo, tetrahidrofurilo, trioxanilo, tritianilo, triazinanilo, tetrahidropiranilo, tiomorfolinilo, tiamorfolinilo, 1-oxo-tiomorfolinilo y 1,1-dioxo-tiomorfolinilo.
Opcionalmente, aunque solamente cuando se especifica, cada uno de alquilo, alquenilo, alquileno, alquenileno, carbociclilo, cicloalquilo, arilo, heterociclilo y heteroarilo en los compuestos de PEM de la presente divulgación puede estar sustituido con uno o más sustituyentes sin sustituir (por ejemplo, un sustituyente alquilo en un grupo alquilo no está más sustituido, es decir, el sustituyente alquilo es alquilo sin sustituir) seleccionados entre el grupo que consiste en alquilo, alquenilo, halo, haloalquilo, haloalquenilo, ciano, oxo, tioxo, nitro, arilo, aralquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, heterociclilo, heterociclilalquilo, heteroarilo, heteroarilalquilo, --Rb-ORa, --Rb--OC(O)-Ra, -Rb-N(Ra)2 , -Rb-C(O)Ra, --Rb--C(O)ORa, -Rb-C(O)N(Ra)2, -Rb-N(Ra)C(O)ORc, -Rb-N(Ra)C(O)Rc, --Rb--N(Ra)S(O)tRc (donde t es de 1 a 2), --Rb-N=C(ORa)Ra, —Rb--S(O)tORc (donde t es de 1 a 2), —Rb—S(O)sRc (donde s es de 0 a 2) y -Rb--S(O)tN(Ra)2 (donde t es de 1 a 2) donde cada Ra es independientemente hidrógeno, alquilo, alquenilo, haloalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, arilo, aralquilo, heterociclilo, heterociclilalquilo, heteroarilo o heteroarilalquilo; cada Rb es independientemente un enlace directo o una cadena de alquileno o alquenileno lineal o ramificada; y cada Rc es alquilo, alquenilo, haloalquilo, cicloalquilo, cicloalquilalquilo, arilo, aralquilo, heterociclilo, heterociclilalquilo, heteroarilo o heteroarilalquilo.
"Amino" se refiere al radical --NH2. "Ciano" se refiere al radical --CN. "Hidroxi" se refiere al radical --OH. "Nitro" se refiere al radical --NO2. "Oxo" se refiere al sustituyente =O. "Tioxo" se refiere al sustituyente =S. "Trifluorometilo" se refiere al radical --CF3. "Trifluorometoxi" se refiere al radical --OCF3. Mercaptano, también conocido como tiol, se refiere al radical -SH.
"Acilo" se refiere a un radical --C(O)R, que también se puede escribir -C(=O)R, en donde R es alquilo, aralquilo, carbociclilo, arilo, heteroarilo o heterociclilo. Por ejemplo, cuando R es metilo, el grupo acilo se puede denominar acetilo.
"Alcoxi" se refiere a un radical de fórmula --OR donde R es un radical alquilo o haloalquilo. En una realización, el radical alcoxi contiene hasta seis átomos de carbono. Los grupos alcoxi representativos incluyen metoxi y etoxi. Un alcoxi que está sustituido con halo en el presente documento se puede denominar un haloalcoxi, que incluye, por ejemplo, trifluorometoxi, triclorometoxi y similares.
"Heteroalquenileno" o "cadena heteroalquenileno" se refiere una cadena hidrocarburo divalente, lineal o ramificada, que une el resto de una molécula a un grupo radical, que consiste en carbono e hidrógeno y al menos un heteroátomo seleccionado entre N, O y S.
"Haloalcoxi" se refiere a un radical alcoxi que está sustituido con uno o más radicales halo, como se ha definido anteriormente, por ejemplo, trifluorometoxi, difluorometoxi, triclorometoxi, 2,2,2-trifluoroetoxi, 3-bromo-2-fluoropropiloxi y similares. La parte alcoxi del radical haloalcoxi puede estar opcionalmente sustituida como se ha definido anteriormente con un grupo alcoxi.
"N-heterociclilo" se refiere a un radical heterociclilo que contiene al menos un nitrógeno. Un radical N-heterociclilo puede estar opcionalmente sustituido como se ha descrito anteriormente por radicales heterociclilo.
"Heterociclilalquilo" se refiere a un radical de fórmula --RbRh donde Rb es una cadena alquileno como se ha definido anteriormente y Rh es un radical heterociclilo como se ha definido anteriormente y, si el heterociclilo es un heterociclilo que contiene nitrógeno, el heterociclilo puede estar unido al radical alquilo en el átomo de nitrógeno. La cadena alquileno del radical heterociclilalquilo puede estar opcionalmente sustituida como se ha definido anteriormente con una cadena alquileno. La parte heterociclilo del radical heterociclilalquilo puede estar opcionalmente sustituida como se ha definido anteriormente con un grupo heterociclilo.
"N-heteroarilo" se refiere a un radical heteroarilo como se ha definido anteriormente que contiene al menos un nitrógeno y donde el punto de unión del radical heteroarilo al resto de la molécula es a través de un átomo de nitrógeno en el radical heteroarilo. Un radical N-heteroarilo puede estar opcionalmente sustituido como se ha descrito anteriormente con radicales heteroarilo.
"Heteroarilalquilo" se refiere a un radical de fórmula --RbRi donde Rb es una cadena alquileno como se ha definido anteriormente y Ri es un radical heteroarilo como se ha definido en el presente documento. La parte heteroarilo del radical heteroarilalquilo puede estar opcionalmente sustituida como se ha definido en el presente documento con un grupo heteroarilo. La parte de cadena alquileno del radical heteroaril alquilo puede estar opcionalmente sustituida como se ha definido en el presente documento con una cadena alquileno. De manera análoga, un grupo arilalquilo se refiere a un grupo heteroarilalquilo en donde la porción heteroarilo está reemplazada con el grupo aril carbocíclico correspondiente, es decir, los heteroátomos están reemplazados con carbono, ajustando según sea necesario para la sustitución del hidrógeno.
"Hidroxialquilo" se refiere a un radical de fórmula --RbOH donde Rb es una cadena alquileno como se ha definido en el presente documento. El grupo --OH (hidroxilo también conocido como hidroxi) puede estar unido a cualquier carbono en la cadena alquileno. La parte de cadena alquileno del radical heteroarilalquilo puede estar opcionalmente sustituida como se ha definido anteriormente con una cadena alquileno.
Los compuestos de PEM descritos en el presente documento que tienen grupos ácidos o básicos se pueden usar en general en forma del ácido libre o la base libre. Como alternativa, los compuestos de PEM que tienen grupos ácidos o básicos se pueden usar en forma de sales, por ejemplo, sales de adición de ácido o base. Las sales de adición de ácido de los compuestos amino libres se pueden preparar por métodos bien conocidos en la materia y se pueden formar a partir de ácidos orgánicos e inorgánicos. Los ácidos orgánicos adecuados incluyen los ácidos maleico, fumárico, benzoico, ascórbico, succínico, metanosulfónico, acético, trifluoroacético, oxálico, propiónico, tartárico, salicílico, cítrico, glucónico, láctico, mandélico, cinnámico, aspártico, esteárico, palmítico, glicólico, glutámico y bencenosulfónico. Los ácidos inorgánicos adecuados incluyen los ácidos clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, fosfórico y nítrico. Las sales de adición de base incluyen aquellas sales que se forman con el anión carboxilato e incluyen las sales formadas con cationes orgánicos e inorgánicos tales como aquellos seleccionados entre los metales alcalinos y alcalinotérreos (por ejemplo, litio, sodio, potasio, magnesio, bario y calcio), así como el ion amonio y sus derivados sustituidos (por ejemplo, dibencilamonio, bencilamonio, 2-hidroxietilamonio y similares). Por lo tanto, el término "sal" de los compuestos de PEM descritos en el presente documento pretende incluir cualquiera y todas las formas de sal. Los compuestos de PEM de la presente divulgación pueden estar en la forma de quelato. Un quelato se refiere a un compuesto que contiene un ligando orgánico (tal como un grupo triazol-Ar) unido a un átomo central de metal en dos o más puntos.
Con respecto a los estereoisómeros, los compuestos de PEM descritos en el presente documento pueden tener uno o más centros quirales (o asimétricos) y por lo tanto pueden dar lugar a enantiómeros, diastereómeros y otras formas estereoisoméricas que pueden definirse, en términos de estequiometría absoluta, como (R)- o (S)-. Cuando los compuestos descritos en el presente documento contienen dobles enlaces olefínicos u otros centros de asimetría geométrica y, a menos que se especifique de otro modo, se entiende que los compuestos incluyen los isómeros geométricos E y Z (por ejemplo, cis o trans). De manera análoga, a menos que se indique de otro modo, todos los isómeros posibles, así como sus formas racémicas y ópticamente puras, y todas las formas tautoméricas también se pretende que estén incluidas. Por lo tanto se contempla que los distintos estereoisómeros y sus mezclas incluyan los "enantiómeros", que se refieren a dos estereoisómeros cuyas moléculas son imágenes especulares no superponibles entre sí. Por lo tanto, los compuestos pueden estar presentes en cualquier forma isomérica, que incluye los racematos, mezclas racémicas y en forma de enantiómeros individuales o diastereómeros.
Además, algunas de las formas cristalinas de los compuestos de PEM pueden existir en forma de polimorfos, que están contemplados en el presente documento. Además, algunos de los compuestos de PEM también pueden formar solvatos con agua u otros disolventes orgánicos. Dichos solvatos están incluidos de forma similar dentro del alcance de los compuestos descritos en el presente documento.
Como apreciará un experto en la materia, cualquiera de los compuestos anteriormente mencionados puede incorporar isótopos radiactivos. Por consiguiente, también se contempla el uso de compuestos isotópicamente marcados idénticos a los descritos en el presente documento, en donde uno o más átomos se reemplazan por un átomo que tiene una masa atómica o número másico diferente de la masa atómica o número másico que se encuentra normalmente en la naturaleza. Los ejemplos de isótopos que se pueden incorporar en estos compuestos incluyen isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, fósforo, flúor y cloro. Por lo tanto, la referencia a un elemento, tal como hidrógeno (H) o carbono (C), pretende incluir todos sus isótopos. Por ejemplo, la designación C (carbono) incluye 12C, 13C o 14C y sus mezclas, mientras que H (hidrógeno) incluye 1 H, 2H y 3H y sus mezclas, y O (oxígeno) incluye 16O y 18O y sus mezclas, y N (nitrógeno) incluye 14N y 15N y sus mezclas, etc. para otros átomos. Los compuestos de PEM isotópicamente marcados pueden ser útiles para rastrear los compuestos de PEM o porciones de los mismos durante su uso en ensayos, etc.
En los compuestos de PEM de fórmula (I), Ar1 es un grupo arilo, también denominados un resto aromático. El resto aromático puede ser un resto aromático carbocíclico o heterocíclico, donde cada uno de los átomos del anillo aromático es carbono en un resto aromático carbocíclico, mientras que al menos uno de los átomos del anillo aromático es nitrógeno, oxígeno o azufre en un resto aromático heterocíclico.
En una realización, Ar1 puede comprender 1-6 anillos, donde hasta seis de los átomos del anillo se pueden seleccionar entre oxígeno, azufre y nitrógeno, siendo el resto átomos de carbono. Opcionalmente, el resto Ar1 puede comprender 1-5 anillos, donde hasta cinco de los átomos del anillo se puede seleccionar entre oxígeno, azufre y nitrógeno. Como otra opción, el grupo Ar1 puede comprender 1 -4 anillos, donde hasta cuatro de los átomos del anillo se puede seleccionar entre oxígeno, azufre y nitrógeno. Como otra opción más, el resto Ar1 puede comprender 1-3 anillos, donde hasta tres de los átomos del anillo se puede seleccionar entre oxígeno, azufre y nitrógeno. Como un ejemplo más, Ar1 puede comprender 1-2 anillos, donde hasta tres de los átomos del anillo se puede seleccionar entre oxígeno, azufre y nitrógeno. En cualquier caso, cada anillo puede ser independientemente un anillo de cinco miembros, es decir, cinco átomos en el anillo forman el anillo, o un anillo de seis miembros, o un anillo de siete miembros, mientras que en una opción, cada uno de los anillos es un anillo de cinco o de seis miembros.
Un resto aromático a modo de ejemplo es un resto aromático carbocíclico. El resto carbocíclico puede contener uno (por ejemplo, benceno) o dos (por ejemplo, naftaleno, azuleno) o tres (por ejemplo, acenaftileno, fluoreno) o cuatro (por ejemplo, fluoranteno, aceantrileno) o cinco (por ejemplo, pentaceno, piceno) o seis (por ejemplo, hexaceno) anillos aromáticos, donde, por conveniencia, el grupo Ar1 se puede ejemplificar en el presente documento nombrando la versión sin sustituir del mismo (por ejemplo, benceno) aunque en los compuestos de la presente divulgación el grupo Ar1 es el radical correspondiente, por ejemplo, cuando m es 2 y Ar1 está sin sustituir de otro modo, dos hidrógenos del anillo se reemplazan con grupos triazol. Por ejemplo, el resto aromático puede ser un resto carbocíclico monocíclico, es decir, fenilo, también denominado resto aromático C6. Como otro ejemplo, el resto aromático puede ser un resto carbocíclico bicíclico, por ejemplo, naftilo, que es un resto aromático C10.
Un resto aromático Ar1 a modo de ejemplo es un resto aromático heterocíclico, que también se puede denominar grupo heteroarilo. El resto heterocíclico puede contener uno o dos o tres o cuatro o cinco o seis anillos aromáticos, además de contener 1 o 2 o 3 o 4 o 5 o 6 heteroátomos, es decir, átomos distintos de carbono, seleccionados entre átomos de nitrógeno, azufre y oxígeno. Opcionalmente, el heteroátomo, si está presente, es nitrógeno. Por ejemplo, el resto aromático puede ser un resto heterocíclico monocíclico, por ejemplo, piridinilo, que es un resto aromático C5 de seis miembros, o pirazinilo, que es un resto aromático C4 de seis miembros. Como otro ejemplo, el resto aromático puede ser un resto heterocíclico bicíclico, por ejemplo, quinolinilo o isoquinolinilo, que son restos aromáticos C9 de diez miembros, o 1,5-naftilidinilo, 2,6-naftilidinilo o 2,7-naftilidinilo, que son restos aromáticos C8 de diez miembros a modo de ejemplo.
Por lo tanto, los grupos heteroarilo son compuestos anulares aromáticos que contienen 5 o más miembros del anillo, de los cuales, uno o más es un heteroátomo tal como, pero no limitado a, N, O y S. Un grupo heteroarilo designado como un heteroarilo C2 puede ser un anillo de 5 miembros con dos átomos de carbono y tres heteroátomos, un anillo de 6 miembros con dos átomos de carbono y cuatro heteroátomos, etc. Asimismo, un heteroarilo C4-puede ser un anillo de 5 miembros con un heteroátomo, un anillo de 6 miembros con dos heteroátomos, etc. El número de átomos de carbono más el número de heteroátomos se suma para igualar el número total de átomos del anillo. Los grupos heteroarilo incluyen, pero no se limitan a, grupos tales como los grupos pirrolilo, pirazolilo, triazolilo, tetrazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, piridinilo, tiofenilo, benzotiofenilo, benzofuranilo, indolilo, azaindolilo, indazolilo, benzoimidazolilo, azabenzoimidazolilo, benzoxazolilo, benzotiazolilo, benzotiadiazolilo, imidazopiridinilo, isoxazolopiridinilo, tianaftalenilo, purinilo, xantinilo, adeninilo, guaninilo, quinolinilo, isoquinolinilo, tetrahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, quinoxalinilo y quinazolinilo. Por lo tanto, las expresiones "heteroarilo" y "grupos heteroarilo" incluyen compuestos de anillos condensados tales como en donde al menos un anillo, pero no necesariamente todos los anillos, son aromáticos, incluyendo tetrahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, indolilo y 2,3-dihidroindolilo.
Cuando m es 2, de modo que Ar1 está necesariamente sustituido con dos restos triazol-Ar2, cualesquiera dos carbonos del resto aromático Ar1 pueden estar sustituidos con uno de estos dos restos triazol-Ar2. Por ejemplo, cuando Ar1 es benceno sustituido, Ar1 puede estar sustituido en las posiciones orto, meta o para, como se muestra a continuación, donde k designa dónde puede tener lugar la sustitución en el resto aromático:
Figure imgf000017_0001
Como otro ejemplo, cuando Ar1 es naftaleno sustituido y m es 2, Ar1 puede estar sustituido en cualquiera de los dos átomos de carbono del naftilo, donde las estructuras siguientes muestran las opciones de sustitución, con k mostrando dónde puede tener lugar en el resto aromático la sustitución con triazol proporcionada por (triazol-Ar2)
Figure imgf000017_0002
Los ejemplos anteriores ilustraban la sustitución en Ar1 usando grupos aromáticos carbocíclicos Ar1 como resto Ar1 ilustrativo. Sin embargo, el mismo principio se aplica a la sustitución con triazol en los grupos aromáticos heterocíclicos Ar1. Por ejemplo, cuando Ar1 es piridina sustituida y m es 2, los dos grupos triazol de (triazol-Ar2) se pueden ubicar en cualquiera de las siguientes ubicaciones del anillo de piridina, donde k se usa para designar las posiciones donde los grupos triazol se pueden ubicar:
Figure imgf000017_0003
Por lo tanto, en una realización a modo de ejemplo, Ar1 es una estructura heteroaromática monocíclica seleccionada entre
Figure imgf000018_0001
en donde los anillos de triazol están sustituidos en las posiciones k de Ar1. En otra realización a modo de ejemplo, Ar1 es una estructura carbocíclica monocíclica seleccionada entre
Figure imgf000018_0002
en donde los anillos de triazol están sustituidos en las posiciones k de Ar1. En otra realización a modo de ejemplo, Ar1 es una estructura carbocíclica bicíclica seleccionada entre
Figure imgf000018_0003
en donde los anillos de triazol están sustituidos en las posiciones k de Ar1. En otra realización, Ar1 es una estructura heterocíclica policíclica que tiene dos anillos de seis miembros y un anillo de cinco miembros y un átomo del anillo de nitrógeno, y se selecciona entre
Figure imgf000018_0004
en donde los anillos de triazol están sustituidos en las posiciones k de Ar1. En otra realización a modo de ejemplo más, Ar1 es una estructura heterocíclica policíclica que tiene tres anillos de seis miembros y dos átomos del anillo de nitrógeno, y se selecciona entre
Figure imgf000019_0001
en donde los anillos de triazol están sustituidos en las posiciones k de Ar1.
Ar1 incluye restos aromáticos tanto sustituidos como sin sustituir, como se describe en el presente documento. En una realización, Ar1 es un resto aromático sustituido. En una realización, Ar1 es un resto aromático no sustituido, que también se puede denominar resto aromático sin sustituir. En el resto aromático sustituido, uno o más átomos de hidrógeno que podrían haber estado unidos a un átomo del anillo se han sustituido con un sustituyente, por ejemplo, opcionalmente 1 o 2 o 3 o 4 o 5 o 6 de los átomos de hidrógeno se pueden sustituir con un sustituyente. Un sustituyente en Ar1 no se refiere al resto triazol-Ar2 que está necesariamente presente cuando m es igual a 1, o los dos restos triazol-Ar2 que están necesariamente presentes cuando m es igual a 2, o los tres restos triazol Ar2 que están necesariamente presentes cuando m es igual a 3.
En una realización, un sustituyente en Ar1 consistirá en átomos seleccionados entre deuterio, halógeno (F, Cl, Br, I), carbono, nitrógeno, oxígeno y azufre y, opcionalmente, también contendrá hidrógeno y también contendrá átomos adicionales que forman un contraión, si está presente. El deuterio y el haluro se consideran átomos monovalentes, mientras que carbono, nitrógeno, oxígeno y azufre, dado que son capaces de formar de manera simultánea más de un enlace covalente, se consideran átomos multivalentes. Además de átomos monovalentes, un sustituyente en Ar1 puede tener múltiples átomos multivalentes, por ejemplo, 1-25 átomos multivalentes, o 1-20 átomos multivalentes, o 1-15 átomos multivalentes, o 1-10 átomos multivalentes, o 1-5 átomos multivalentes, seleccionándose los átomos opcionalmente entre carbono, nitrógeno, oxígeno y azufre. A continuación se proporcionan ilustraciones de sustituyentes con hasta 10 átomos multivalentes. Otros sustituyentes, que incluyen sustituyentes con hasta 25 átomos multivalentes, son conocidos por analogía para un experto habitual en la materia.
En una realización, un sustituyente en Ar1 contiene 0 átomos multivalentes. En esta realización, un hidrógeno unido a un átomo del anillo está sustituido con otro átomo monovalente, tal como deuterio, flúor, cloro, bromo o yodo. En una realización, un sustituyente en Ar1 contiene 1 átomo multivalente. En esta realización, uno o más átomos de hidrógeno unidos a un átomo del anillo de Ar1 están sustituidos con un único átomo multivalente, donde las valencias abiertas en el átomo multivalente se llenan con uno o más átomos monovalentes, son ejemplos el hidroxilo (OH), tiol (SH), amino (NH2), metilo (CH3) y metileno (=CH2), que incluyen sus versiones total o parcialmente halogenadas y deuteradas, por ejemplo, CF3.
En una realización, un sustituyente en Ar1 contiene 2 átomos multivalentes. En esta realización, uno o más átomos de hidrógeno unidos a un átomo del anillo de Ar1 están sustituidos con un primer átomo multivalente que, a su vez, está unido a un segundo átomo multivalente, proporcionando de este modo un sustituyente formado a partir de dos átomos multivalentes, donde las valencias abiertas de los átomos multivalentes se llenan con uno o más átomos monovalentes. El experto habitual en la materia conoce bien los ejemplos de estos sustituyentes. Los ejemplos específicos incluyen etilo (CH2CH3), etileno (CH=CH2), etinilo (C=c H), etilideno (=CHCH3), aminometilo (CH2NH2), aminometileno (=CHNH2), tiometileno (=CHSH), hidroximetileno (=ChOh ), hidroximetilo (CH2OH), tiometilo (CH2SH), N-metilamina (NHCH3), metilsulfuro (SCH3), metoxi (OCH3), nitrilo (CN), formilo (C(O)H), tioformilo (C(S)H), N-hidroxi (N-OH), hidroxilamina (ONH2), hidrazina (NHNH2), diazina (N=NH), diazonio (N=N), que incluyen sus versiones total o parcialmente halogenadas y deuteradas, por ejemplo, OCF3 y CH2CD3.
En una realización, un sustituyente en Ar1 contiene 3 átomos multivalentes. En esta realización, uno o más átomos de hidrógeno unidos a un átomo del anillo de Ar1 están sustituidos con un primer átomo multivalente que, a su vez, está unido directa o indirectamente a cada uno de un segundo y un tercer átomos multivalentes; por lo tanto, el primer átomo multivalente está unido a un segundo átomo multivalente, y un tercer átomo multivalente está unido a cualquiera o a ambos del primer y el segundo átomos multivalentes, proporcionando de este modo un sustituyente formado a partir de tres átomos multivalentes, donde las valencias abiertas de los átomos multivalentes se llenan con uno o más átomos monovalentes. El experto habitual en la materia conoce bien los ejemplos de estos sustituyentes y se proporcionan en el presente documento, por ejemplo, nitro, metilcetona, carboxilo.
En una realización, un sustituyente en Ar1 contiene 4 átomos multivalentes. En esta realización, uno o más átomos de hidrógeno unidos a un átomo del anillo de Ar1 están sustituidos con un primer átomo multivalente que, a su vez, está unido directa o indirectamente a cada uno de un segundo, tercero y cuarto átomos multivalentes, proporcionando de este modo un sustituyente formado a partir de cuatro átomos multivalentes, donde las valencias abiertas de los átomos multivalentes se llenan con uno o más átomos monovalentes. El experto habitual en la materia conoce bien los ejemplos de estos sustituyentes y se proporcionan en el presente documento, por ejemplo, metiléster (CO2CH3), N-metilcarboxamida (C(O)NHCH3) y acetamida (NHC(O)CH3).
En una realización, un sustituyente en Ar1 contiene 5 átomos multivalentes. En esta realización, uno o más átomos de hidrógeno unidos a un átomo del anillo de Ar1 están sustituidos con un primer átomo multivalente que, a su vez, está unido directa o indirectamente a cada uno de un segundo, tercer, cuarto y quinto átomos multivalentes, proporcionando de este modo un sustituyente formado a partir de cinco átomos multivalentes, donde las valencias abiertas de los átomos multivalentes se llenan con uno o más átomos monovalentes. El experto habitual en la materia conoce bien los ejemplos de estos sustituyentes y se proporcionan en el presente documento, por ejemplo, etiléster (CO2CH2CH3), S-etilcarbotioato (C(O)SCH2CH3), N-etilcarboxamida (C(O)NHCH2CH3) y N,N-dimetilcarboxamida (C(O)N(CH3)2).
En una realización, un sustituyente en Ar1 contiene 6 átomos multivalentes. En esta realización, uno o más átomos de hidrógeno unidos a un átomo del anillo de Ar1 están sustituidos con un primer átomo multivalente que, a su vez, está unido directa o indirectamente a cada uno de un segundo, tercer, cuarto, quinto y sexto átomos multivalentes, proporcionando de este modo un sustituyente formado a partir de seis átomos multivalentes, donde las valencias abiertas de los átomos multivalentes se llenan con uno o más átomos monovalentes. El experto habitual en la materia conoce bien los ejemplos de estos sustituyentes y se proporcionan en el presente documento, por ejemplo, N-ciclopropilcarboxamida (C(O)NH-ciclopropilo), N-propilcarboxamida (C(O)NHCH2CH2CH3), N-(2-hidroxietil)carboxamida (C(O)NHCH2CH2OH) y N-carbamimidocarboxamida (C(O)NHC(=NH)NH2).
En una realización, un sustituyente en Ar1 contiene 7 átomos multivalentes. En esta realización, uno o más átomos de hidrógeno unidos a un átomo del anillo de Ar1 están sustituidos con un primer átomo multivalente que, a su vez, está unido directa o indirectamente a cada uno de un segundo, tercer, cuarto, quinto, sexto y séptimo átomos multivalentes, proporcionando de este modo un sustituyente formado a partir de siete átomos multivalentes, donde las valencias abiertas de los átomos multivalentes se llenan con uno o más átomos monovalentes. El experto habitual en la materia conoce bien los ejemplos de estos sustituyentes y se proporcionan en el presente documento, por ejemplo, N-(n-butil)carboxamida (C(O)NHCH2CH2CH2CH3), N-(t-butil)carboxamida (C(O)NHC(CH3)3), N,N-dietilcarboxamida (C(O)N(CH2CH3 )2) y N-ciclobutilcarboxamida (C(O)NH(ciclobutilo)).
En una realización, un sustituyente en Ar1 contiene 8 átomos multivalentes. En esta realización, uno o más átomos de hidrógeno unidos a un átomo del anillo de Ar1 están sustituidos con un primer átomo multivalente que, a su vez, está unido directa o indirectamente a cada uno de un segundo, tercer, cuarto, quinto, sexto, séptimo y octavo átomos multivalentes, proporcionando de este modo un sustituyente formado a partir de ocho átomos multivalentes, donde las valencias abiertas de los átomos multivalentes se llenan con uno o más átomos monovalentes. El experto habitual en la materia conoce bien los ejemplos de estos sustituyentes y se proporcionan en el presente documento, por ejemplo, N-ciclopentilcarboxamida (C(O)NH(ciclopentilo)), (piperidin-1-il)metanona (C(O)-piperidin-1-ilo) y (morfolin-4-il)metanona (C(O)-morfolin-4-ilo).
En una realización, un sustituyente en Ar1 contiene 9 átomos multivalentes. En esta realización, uno o más átomos de hidrógeno unidos a un átomo del anillo de Ar1 están sustituidos con un primer átomo multivalente que, a su vez, está unido directa o indirectamente a cada uno de un segundo, tercer, cuarto, quinto, sexto, séptimo, octavo y noveno átomos multivalentes, proporcionando de este modo un sustituyente formado a partir de nueve átomos multivalentes, donde las valencias abiertas de los átomos multivalentes se llenan con uno o más átomos monovalentes. El experto habitual en la materia conoce bien los ejemplos de estos sustituyentes y se proporcionan en el presente documento, por ejemplo, di-(/so-propil)éster (C(O)O(CH(CH3)2)2 , di-(n-propil)éster (C(O)O(CH2CH2CH3)2), N-ciclohexilcarboxamida (C(O)NH(ciclohexilo)), (4-metilpiperazin-1-il)metanona (C(O)(4-metilpiperazin-1-ilo), 2-(acetilamino)etilcarboxamida (C(O)NHCH2CH2NHC(O)CH3) y N-fenilcarboxamida (C(O)NH(fenilo)).
En una realización, un sustituyente en Ar1 contiene 10 átomos multivalentes. En esta realización, uno o más átomos de hidrógeno unidos a un átomo del anillo de Ar1 están sustituidos con un primer átomo multivalente que, a su vez, está unido directa o indirectamente a cada uno de un segundo, tercer, cuarto, quinto, sexto, séptimo, octavo, noveno y décimo átomos multivalentes, proporcionando de este modo un sustituyente formado a partir de diez átomos multivalentes, donde las valencias abiertas de los átomos multivalentes se llenan con uno o más átomos monovalentes. El experto habitual en la materia conoce bien los ejemplos de estos sustituyentes y se proporcionan en el presente documento, por ejemplo, N-bencilcarboxamida (C(O)NHCH2(fenilo)).
En una realización, Ar1 es arilo sustituido en donde al menos un sustituyente en Ar1 se selecciona entre el grupo que consiste en halógeno, hidroxilo, mercaptano, nitro y nitrilo.
En una realización, Ar1 es arilo sustituido en donde al menos un sustituyente en Ar1 se selecciona entre el grupo que consiste en --SOR1, --S(O)2R1, --S(O)2NR2R3, --OR1, --OC(O)R3, --C(O)OR3, --C(O)R1, --C(O)NR2R3, --NR2R3, --N(R3)C(O)R1 y --NS(O)2R3; y en donde cada aparición de R1 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en alquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, heterociclilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir y heteroarilo sustituido o sin sustituir; y cada aparición de R2 y R3 se selecciona independientemente entre el grupo que consiste en --H, alquilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, heterociclilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir, y heteroarilo sustituido o sin sustituir.
En una realización, Ar1 es arilo sustituido en donde al menos un sustituyente en Ar1 se selecciona entre el grupo que consiste en alquilo sustituido o sin sustituir, alquenilo sustituido o sin sustituir, alquinilo sustituido o sin sustituir, cicloalquilo sustituido o sin sustituir, heterociclilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir, heteroarilo sustituido o sin sustituir, arilalquilo sustituido o sin sustituir, heteroarilalquilo sustituido o sin sustituir, haloalquilo sustituido o sin sustituir y haloalcoxi sustituido o sin sustituir.
En una realización, Ar1 es arilo sustituido en donde al menos un sustituyente en Ar1 se selecciona entre el grupo que consiste en -R4-H en donde R4 es uno o más alquilenos interrumpidos con heteroátomos en donde el heteroátomo es O, S, NH o una de sus combinaciones.
El grupo Ar1 incluirá un resto aromático como se ha explicado en el presente documento, donde ese resto aromático puede estar opcionalmente sustituido como también se ha descrito en el presente documento, cuya sustitución es además de estar sustituido con grupos (triazol-Ar2)m. En una realización, los sustituyentes a modo de ejemplo de Ar1 son haluros tales como fluoruro, cloruro y bromuro, grupos alquilo que tienen 1-6 átomos de carbono tales como metilo y etilo, grupos haloalquilo que tienen 1-6 átomos de carbono tales como trifluorometilo, ciano, formilo y carboxamida. En otra realización, los sustituyentes a modo de ejemplo de Ar1 son nitro (-NO2), ciano (-CN), ácido carboxílico (-COOH, o sus sales), carboxamida (-C(O)NH2), alcoxi C1-C6 que incluye metoxi, alquilo C1-C6 que incluye metilo, haloalquilo C1-C6 tal como trifluorometilo, heteroalquilo C1-C6 que incluye amidas tales como -NHC(O)(alquilo C1-C6), -NHC(O)(heteroalquilo C1-C6), -C(O)NH(alquilo C1-C6), -C(O)NH(heteroalquilo C1-C6), -C(O)N(alquil C1-C6)(alquilo C1-C6), -C(O)N(alquil C1-C6)(heteroalquilo C1-C6) y -C(O)N(heteroalquil C1-C6)(heteroalquilo C1-C6) que incluye -NHC(O)CH3, C(O)NHCH3 , -C(O)N(CH3)2, -NHC(O)CH2CH3, C(O)NHCH2CH3 , -C(O)N(CH3)CH2CH3 , -C(O)N(CH2CH3)2 , -C(O)NH(cicloalquilo C1-C6) y -NHC(O)(cicloalquilo C1-C6) (por ejemplo, C(O)NH(ciclopropilo), -NHC(O)-ciclopropilo, C(O)NH(ciclohexilo), NHC(O)-ciclohexilo), C(O)NHCH2CH2CH2CH3 , -C(O)NH(C(CH3)3), -C(O)NH(CH2CH2OH), cetonas tales como -C(O)(alquilo C1-C6) que incluye -C(O)CH3, -C(O)(cicloalquilo) que incluye -C(O)-ciclohexilo, y C(O)-(heterocicloalquilo) donde el heterocicloalquilo puede ser, por ejemplo, morfolinilo, piperidinilo, piperazinilo, N-metilpiperazinilo, ésteres tales como -CO2-(alquilo C1-C6) que incluye -CO2CH3, -CO2CH2CH3, -CO2CH2CH2CH3 , -CO2CH2(CH3)2 y tioésteres tales como C(O)-S-(alquilo C1-C6) que incluye -C(O)-S-CH3 y -C(O)-S-CH2CH3.
En una realización, Ar1 es arilo sustituido en donde al menos un sustituyente en Ar1 se selecciona entre el grupo que consiste en -O-(alquilo C1-6), alquilo C1-6, haloalquilo C1-6, -CO2-alquilo C1-6, -CONH-alquilo C1-6, -CONH2 , CN y -NO2.
En una realización, cuando n no es igual a 0, la sustitución en Ar1 incluirá uno o más grupos triazol-Ar2. En una realización, la sustitución opcional en Ar1 incluye exactamente un grupo triazol-Ar2, de modo que el compuesto de la presente divulgación opcionalmente tiene exactamente dos grupos triazol-Ar2 (cuando m es 1), u opcionalmente tiene exactamente tres grupos triazol-Ar2 (cuando m es 2) según se ilustra con, por ejemplo, 4,4'-((4-(but-3-in-1-ilcarbamoil)piridin-2,6-diil)bis(1 H-1,2,3-triazol-4,1 -diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico), que es el compuesto 47 identificado en el presente documento. En otra realización, la sustitución opcional en Ar1 incluye exactamente dos grupos triazol-Ar2, de modo que el compuesto la presente divulgación opcionalmente tiene exactamente tres grupos triazol-Ar2 cuando m es igual a 1, u opcionalmente tiene exactamente cuatro grupos triazol Ar2 cuando m es igual a 2, según se ilustra con 4,4',4",4"'-((((butano-1,4-diilbis(azanediil))bis(carbonil))bis(piridin-4,2,6-triil))tetraquis(1H-1,2,3-triazol-4,1-diil))tetraquis(ácido 2-hidroxibenzoico), que es el compuesto 71 identificado en el presente documento.
En los compuestos de fórmula (I), el designados m indica un número mínimo de grupos triazol-Ar2 que están directamente unidos a Ar1. En la fórmula (I), m se selecciona entre 1, 2 o 3, de modo que Ar1 está directamente unido a al menos 1, 2 o 3 grupos triazol-Ar2, respectivamente. Estas opciones, cada una de las cuales es una realización de las PEM de la presente divulgación, se muestran en las fórmulas (Ia), (Ib) y (Ic) de la tabla 1.
T l 1
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Opcionalmente, en los compuestos de fórmula (I), n es igual a 0, en cuyo caso los compuestos de la presente divulgación se pueden describir con la fórmula
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en donde Ar1 puede o puede no estar sustituido, pero si Ar1 está sustituido, entonces Ar1 no está sustituido con un grupo triazol-Ar2. Opcionalmente, m es 1, 2 o 3, de modo que Ar1 está sustituido con 1, 2 o 3 grupos triazol-Ar2, respectivamente. Estas opciones, cada una de las cuales es una realización de las PEM de la presente divulgación, se muestran como las figuras (Id), (Ie) y (If) en la tabla 2.
T l 2
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Opcionalmente, en los compuestos de fórmula (I), n es igual a 1, en cuyo caso las PEM de la presente divulgación se pueden describir mediante la fórmula
Figure imgf000023_0001
donde p puede ser 0, 1 o 2 para proporcionar compuestos que se pueden describir mediante las fórmulas químicas (Ig), (Ih) y (Ii) como se muestran en la tabla 3, donde cada una de estas fórmulas es una realización de las PEM de la presente divulgación.
T l
Figure imgf000024_0002
En varias realizaciones de las PEM de fórmula (I), n es igual a 1 y m es igual a 2, para proporcionar compuestos de las fórmulas (Ij), (Ik) y (Im) como se muestran en la tabla 4, donde cada una de estas fórmulas es una realización de las PEM de la presente divulgación.
T l 4
Figure imgf000024_0001
continuación
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Opcionalmente, en los compuestos de PEM de fórmula (I), n es igual a 2, en cuyo caso los compuestos de la presente divulgación se pueden describir con la fórmula
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donde p puede ser 0, 1 o 2 para proporcionar compuestos que se pueden describir mediante las fórmulas químicas (In), (Io) y (Ip), respectivamente, como se muestra en la tabla 5. Cada una de las fórmulas de la tabla 5 es una realización de los compuestos de PEM de la presente divulgación.
T l
Figure imgf000025_0003
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En varias realizaciones de PEM, n es igual a 2 en los compuestos de fórmula (I) y m es igual a 2, para proporcionar los compuestos de las fórmulas (Iq), (Ir) y (Is) como se muestran en la tabla 6. Cada una de las fórmulas mostradas en la tabla 6 es una realización de los compuestos de PEM de la presente divulgación.
T l
Figure imgf000026_0002
continuación
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Cuando n es 1 o 2, los compuestos de fórmula (I) incluirán un enlazador, L, donde el grupo enlazador se une covalentemente el grupo Ar1 que está presente necesariamente en los compuestos de PEM de la presente divulgación, al uno o más brazos de triazol-Ar2 (es decir, el uno o más grupos triazol-Ar2 que están dentro de los paréntesis {} en las fórmulas) que están opcionalmente presentes en los compuestos de PEM de la presente divulgación. En una realización, el enlazador L puede ser un enlace directo. En otra realización, el enlazador no un enlace directo, sino uno o más átomos, en particular átomos seleccionados entre carbono, oxígeno, azufre. En otra realización, el enlazador puede ser un grupo alquileno (por ejemplo, alquileno C1-C6) o un alquileno sustituido. El enlazador puede ser un enlazador heteroalquileno, que se refiere a un alquileno sustituido o sin sustituir que además incluye al menos un heteroátomo (por ejemplo, 1,2, 3 o 4 heteroátomos) seleccionado entre oxígeno, nitrógeno o azufre dentro de y/o colocado en una o más posiciones terminales de la cadena precursora. En una realización, L es un grupo heteroalquileno de 2 a 10 átomos de carbono en longitud, en donde uno o más átomos de carbono se sustituye con al menos un heteroátomo seleccionado entre oxígeno, nitrógeno y azufre. En una realización, L puede ser un enlazador heteroalquileno que tiene al menos un heteroátomo N, O o S, en donde el heteroalquileno puede ser una cadena lineal o estar ciclado y opcionalmente sustituido, donde los sustituyentes a modo de ejemplo incluyen oxo, --OH, alquilo C1-4 y alcoxi C1-4. Los ejemplos de grupos enlazadores heteroalquileno incluyen grupos heteroalquileno que contienen amida tales como -C(O)NH-alquileno- y -C(O)NH-alquilen-NHC(O)-, donde alquileno es opcionalmente alquileno C1-C6. Otros ejemplos de grupos heteroalquileno incluyen grupos heteroalquileno que contienen éster tales como -C(O)O-alquileno- y -C(O)O-alquilen-OC(O)-, donde en una realización el alquileno es alquileno C1-C6 sin sustituir y en otra realización el alquileno es alquileno C1-C6 sustituido. En una realización, el enlazador es hidrolíticamente estable, de modo que no se descompone o degrada o se rompe de otro modo cuando la PEM se coloca en agua.
El enlazador L habitualmente no necesita ser demasiado larga; en una realización contiene de 1 a aproximadamente 25 átomos excluyendo el hidrógeno y el halógeno de ese recuento atómico, donde el enlazador puede estar compuesto opcionalmente por átomos seleccionados entre carbono, nitrógeno, oxígeno y azufre, además de hidrógeno y halógeno. En varias otras realizaciones, el enlazador tiene menos de 25 átomos (excluyendo hidrógeno y halógeno), por ejemplo, contiene de 1 a aproximadamente 20 átomos, o de 1 a aproximadamente 15 átomos, o de 1 a aproximadamente 10 átomos, o de 1 a aproximadamente 5 átomos, en cada caso se excluyen el hidrógeno y el halógeno de ese recuento atómico, donde los átomos contados se pueden seleccionar opcionalmente entre carbono, oxígeno, nitrógeno y azufre.
En una realización, un anillo triazol en un compuesto de fórmula (I) puede estar sustituido además de estar directamente unido a Ar1 y Ar2. En general, los compuestos de la presente divulgación se pueden describir opcionalmente como que incluyen la fórmula química
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donde Ar1 y Ar2 se definen en otro sitio en el presente documento y M puede ser hidrógeno (en cuyo caso el anillo triazol solamente está sustituido con Ar1 y Ar2) o M puede ser un sustituyente de haluro, por ejemplo, fluoruro, cloruro, bromuro o yodo. En una realización, los compuestos de la presente divulgación tienen un anillo triazol sustituido solamente con Ar1 y Ar2, es decir, M es hidrógeno. En otra realización, los compuestos de la presente divulgación tienen un anillo triazol sustituido con Ar1, Ar2 y un haluro. En otra realización, los compuestos de la presente divulgación incluyen un anillo triazol sustituido con yoduro, es decir, M es yoduro. En otra realización, los compuestos de la presente divulgación tienen un sustituyente M en un anillo triazol, donde M se selecciona entre hidrógeno y yoduro.
Por lo tanto, en una realización, la presente divulgación proporciona compuestos de fórmula
Figure imgf000028_0001
donde Ar1 y Ar2 se definen en otra parte del presente documento y M se selecciona entre hidrógeno y haluro. Opcionalmente, como se ha indicado anteriormente, M puede ser hidrógeno o, en otra opción, M puede ser, por ejemplo, un haluro tal como yoduro, como se ilustra con el compuesto 4,4'-((4l3-piridin-2,6-diil)bis(5-yodo-1 H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico). Cuando, como en la estructura anterior, un compuesto de la presente divulgación tiene más de un anillo triazol sustituido con M, M se selecciona independientemente en cada caso. Sin embargo, en una realización, M es el mismo átomo en cada caso en un compuesto de la presente divulgación. Por ejemplo, la presente divulgación proporciona compuestos en donde M es hidrógeno en cada caso de M. En otro ejemplo, la presente divulgación proporciona compuestos en donde M es yoduro en cada caso de M.
Los compuestos de fórmula (I) incluyen al menos un resto triazol-Ar2. En una realización, los compuestos de la presente divulgación incluyen dos o más restos triazol-Ar2, tales como los compuestos de fórmula
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Cuando un compuesto de la presente divulgación incluye dos o más de dos, restos triazol-Ar2, los restos Ar2 pueden tener opcionalmente la misma estructura química en cada caso. Sin embargo, cuando un compuesto de PEM de la presente divulgación contiene múltiples restos triazol-Ar2, en una realización esos restos Ar2 no son necesariamente idénticos entre sí y, de hecho, pueden no ser idénticos. Los restos Ar2 pueden diferir entre sí en cuanto a los átomos del anillo Ar2 y/o en cuanto a la sustitución en los átomos del anillo Ar2. Por ejemplo, si un grupo Ar2 es fenilo y el otro grupo Ar2 es piridinilo, entonces los grupos Ar2 en cuanto a los átomos del anillo que componen el grupo Ar2. Como otro ejemplo, si ambos grupos Ar2 son fenilo, pero un fenilo está sustituido con carboxilo mientras el otro fenilo está sustituido con metoxi, como en, por ejemplo, ácido 4-(4-(3-(1-(4-metoxifenil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)fenil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)benzoico, entonces se considera que el compuesto tiene dos grupos Ar2 diferentes. Otro ejemplo más, los dos grupos Ar2 pueden ser isómeros posicionales entre sí, como cuando ambos grupos Ar2 son fenilo, y ambos anillos fenilo están sustituidos con hidroxilo y carboxilo, pero las ubicaciones de los grupos hidroxilo y/o carboxilo son diferentes en los dos anillos fenilo, por ejemplo, si en un anillo fenilo el triazol se ubica en la posición 3 (meta) con respecto al grupo carboxilo mientras que en el otro anillo fenilo el triazol se ubica en la posición 4 (para) con respecto al grupo carboxilo, entonces se considera que los dos grupos Ar2 son isómeros posicionales y no idénticos. En una realización, los anillos Ar2 son idénticos en todos los aspectos en cada caso en un compuesto de la presente divulgación. En una realización, los átomos del anillo Ar2 son idénticos en cada caso de Ar2, pero la sustitución en los anillos Ar2 no es idéntica en cada caso de Ar2. En otra realización, los átomos del anillo Ar2 no son idénticos en cada caso de Ar2, y la sustitución en los anillos de Ar2 puede o no ser idéntica.
Los compuestos de fórmula (I) incluyen al menos un resto Ar2, donde en una realización Ar2 es un anillo aromático monocíclico, seleccionado entre fenilo y piridinilo, que puede estar opcionalmente sustituido. En una realización, Ar2 es un anillo aromático monocíclico de 6 miembros, donde los ejemplos son fenilo, piridinilo y pirazinilo, donde otra vez el grupo Ar2 opcionalmente incluye sustituyentes en los átomos del anillo. En otra realización, Ar2 es un anillo aromático monocíclico de 5 miembros, que puede estar opcionalmente sustituido. En otra realización, Ar2 es un anillo aromático de 5 o 6 miembros, que puede estar opcionalmente sustituido. En otra realización, Ar2 es un anillo bicíclico condensado de 9 o 10 miembros que comprende dos anillos monocíclicos de 5 y/o 6 miembros condensados juntos, donde al menos uno de los dos anillos monocíclicos es un anillo aromático. En otra realización, Ar2 es un anillo bicíclico condensado de 9 o 10 miembros que comprende dos anillos monocíclicos de 5 y/o 6 miembros condensados juntos, donde ambos de los dos anillos monocíclicos es un anillo aromático. En una realización, Ar2 puede ser cualquiera de estas opciones, es decir, Ar2 se selecciona entre (a) anillos aromáticos monocíclicos de 5 miembros, (b) anillos aromáticos monocíclicos de 6 miembros, (c) anillos bicíclicos condensados de 9 miembros que comprenden un anillo monocíclico de 5 miembros y uno de 6 miembros condensados juntos, donde al menos uno de los dos anillos monocíclicos y, opcionalmente; ambos anillos monocíclicos, es un anillo aromático y (d) anillos bicíclicos condensados de 10 miembros que comprenden dos anillos monocíclicos de 6 miembros condensados juntos, donde al menos uno de los dos anillos monocíclicos y, opcionalmente; ambos anillos monocíclicos, es un anillo aromático,
En los compuestos de fórmula (I), opcionalmente, Ar2 es un anillo aromático monocíclico de 5 miembros seleccionado entre el grupo que consiste en tiofeno, 1,2-tiazol, 1,3-tiazol, furano, 1,2-oxazol, 1,3-oxazol, 1 H-pirrol, 1 H-pirazol, oxadiazol, tiadiazol, 1,2,4-triazol, 1,2,3-triazol y 1H-imidazol.
En los compuestos de fórmula (I), opcionalmente, Ar2 es un anillo aromático monocíclico de 6 miembros seleccionado entre el grupo que consiste en benceno, piridina, piridazina, pirimidina y pirazina.
En los compuestos de fórmula (I), opcionalmente, Ar2 es un sistema anular aromático bicíclico condensado de 9 miembros seleccionado entre el grupo que consiste en benzofurano, 1,3-benzoxazol, furo[3,2-b]piridina, furo[3,2-c]piridina, furo[2,3-c]piridina, furo[2,3-b]piridina, indol, 1H-benzoimidazol, 1H-pirrolo[3,2-b]piridina, 1H-pirrolo[3,2-c]piridina, 1H-pirrolo[2,3-c]piridina, 1H-pirrolo[2,3-b]piridina, benzotiofeno, 1,3-benzotiazol, tienol[3,2-b]piridina, tieno[3,2-c]piridina, tieno[2,3-c]piridina, benzoxadiazol, benzotiadiazol, benzoisoxazol, benzotriazol y tieno[2,3-b]piridina.
En los compuestos de fórmula (I), opcionalmente, Ar2 es un sistema anular aromático bicíclico condensado de 10 miembros seleccionado entre el grupo que consiste en naftaleno, quinolina, quinazolina, quinoxalina, 1,5-naftiridina, 1,6-naftiridina, 1,7-naftiridina, 1,8-naftiridina, isoquinolina, ftalazina, 2,6-naftiridina y 2,7-naftiridina.
Como se ha mencionado anteriormente, un compuesto de la presente divulgación incluye al menos un grupo Ar2, donde el grupo Ar2 incluye al menos un anillo aromático y opcionalmente incluye uno o más sustituyentes en el anillo aromático. En una realización, Ar2 incluye al menos uno, es decir, uno o más, sustituyentes en el anillo aromático, tal como 1-5, o 1-4, o 1-3, o 1-2 sustituyentes. Opcionalmente, Ar2 incluye exactamente un sustituyente en el anillo aromático. En otra opción, Ar2 incluye exactamente dos sustituyentes en el anillo aromático. En otra opción más, Ar2 incluye exactamente tres sustituyentes en el anillo aromático. En otra opción, Ar2 incluye exactamente cuatro sustituyentes en el anillo aromático. En una realización opcional, Ar2 incluye dos o más sustituyentes en el anillo aromático.
En una realización, el uno o más sustituyentes en los átomos del anillo de Ar2 se seleccionan entre sustituyentes opcionalmente denominados "G", donde los sustituyentes se seleccionan entre E-M, E-CO2R, E-CONH2 , E-CHO, E-NR2 y E-OR, en donde (a) E se selecciona entre un enlace directo, metileno, etileno, propileno y butileno; (b) M es un haluro seleccionado entre fluoruro, cloruro, bromuro y yoduro; y (c) R se selecciona independientemente entre H y alquilo C1-C6. En otra realización, el uno o más sustituyentes en los átomos del anillo de Ar2 se seleccionan entre haluro, alquilo C1-C6 , haloalquilo C1-C6 , E-CO2R0, E-CONH2 , E-CHO, E-C(O)NH(OH), E-N(R0)2 y E-OR0, donde E se selecciona entre un enlace directo y un grupo alquileno seleccionado entre alquileno C1-C6, por ejemplo, metileno, etileno, propileno o butileno; y R0 se selecciona entre H, alquilo C1-C6 y haloalquilo C1-C6. Opcionalmente, el grupo alquileno puede ser un grupo alquileno sustituido.
En una realización, la sustitución en Ar2 incluye amino (-NH2 ). En una realización, la sustitución en Ar2 incluye alcoxi, por ejemplo, alcoxi C1-C6. Por ejemplo, en una realización, la sustitución en Ar2 incluye metoxi. En una realización, la sustitución en Ar2 incluye ácido carboxílico o ácido alquilen-carboxílico. Por ejemplo, en una realización, la sustitución en Ar2 de los compuestos de PEM de fórmula (I) incluye ácido carboxílico. En una realización, la sustitución en Ar2 incluye éster del ácido carboxílico o éster del ácido alquilen-carboxílico. Por ejemplo, en una realización la sustitución en Ar2 de los compuestos PEM de la fórmula (I) incluye - CH2-CO2-CH3. En una realización, la sustitución en Ar2 incluye un grupo haloalquilo, por ejemplo, un grupo haloalquilo C1-C6. Por ejemplo, en una realización, la sustitución en Ar2 de un compuesto de PEM de fórmula (I) incluye trifluorometilo. En una realización, la sustitución en Ar2 incluye hidroxilo o alquilo sustituido con hidroxilo, por ejemplo, alquilo C1-C6 sustituido con hidroxilo. Por ejemplo, en una realización, la sustitución en Ar2 de un compuesto de fórmula (I) incluye hidroxilo (-OH).
En una realización, la sustitución en Ar2 incluye un grupo seleccionado entre ácido carboxílico y ácido alquilencarboxílico, por ejemplo, ácido alquilen C1-C6-carboxílico y otro grupo seleccionado entre hidroxilo y alquilo sustituido con hidroxilo, por ejemplo, alquilo C1-C6 sustituido con un hidroxilo. Por ejemplo, en una realización, la sustitución en Ar2 es, o incluye, un ácido carboxílico y un hidroxilo. Opcionalmente, en este caso, el compuesto de fórmula (I) puede ser uno de los compuestos de PEM de fórmula (I), que incluye las fórmulas (Ia), (Ib), (Ic), (Id), (Ie), (If), (Ig), (Ih), (Ii), (Ij), (Ik), (Im), (In), (Io), (Ip), (Iq), (Ir) y (Is) y el anillo Ar2 puede ser un anillo aromático carbocíclico o heterocíclico de seis miembros, por ejemplo, fenilo, piridinilo o pirazinilo.
En una realización, la sustitución en Ar2 incluye un grupo seleccionado entre ácido carboxílico y ácido alquilencarboxílico, por ejemplo, ácido alquilen C1-C6-carboxílico y un grupo seleccionado entre haloalquilo, por ejemplo, haloalquilo C1-C6. Por ejemplo, en una realización, la sustitución en Ar2 es, o incluye, un grupo ácido carboxílico y un grupo trifluorometilo. Opcionalmente, en este caso, el compuesto de fórmula (I) puede ser uno de los compuestos de PEM de fórmula (I), que incluye las fórmulas (la), (Ib), (Ic), (Id), (le), (If), (Ig), (Ih), (Ii), (Ij), (Ik), (Im), (In), (Io), (Ip), (Iq), (Ir) y (Is) y el anillo Ar2 puede ser un anillo aromático carbocíclico o heterocíclico de seis miembros, por ejemplo, fenilo, piridinilo o pirazinilo.
En una realización, la sustitución en Ar2 incluye un grupo seleccionado entre hidroxilo y alquilo sustituido con hidroxilo, por ejemplo, alquilo C1-C6 sustituido con un hidroxilo y otro grupo seleccionado entre haloalquilo, por ejemplo, haloalquilo C1-C6. Por ejemplo, en una realización, la sustitución en Ar2 es, o incluye, un grupo hidroxilo y un grupo trifluorometilo. Opcionalmente, en este caso, el compuesto de fórmula (I) puede ser uno de los compuestos de PEM de fórmula (I), que incluye las fórmulas (Ia), (Ib), (Ic), (Id), (Ie), (If), (Ig), (Ih), (Ii), (Ij), (Ik), (Im), (In), (Io), (Ip), (Iq), (Ir) y (Is) y el anillo Ar2 puede ser un anillo aromático carbocíclico o heterocíclico de seis miembros, por ejemplo, fenilo, piridinilo o pirazinilo.
En una realización, la sustitución en el anillo Ar2 de fórmula (I) incluye al menos uno de a) ácido carboxílico y ácido alquilen-carboxílico, por ejemplo, ácido alquilen C1-C6-carboxílico; b) hidroxilo y alquilo sustituido con hidroxilo, por ejemplo, alquilo C1-C6 sustituido con un hidroxilo; y c) haloalquilo, por ejemplo, haloalquilo C1-C6. Por ejemplo, al menos uno de ácido carboxílico, hidroxilo y trifluorometilo. Opcionalmente, en este caso, el compuesto de fórmula (I) puede ser uno de los compuestos de PEM de fórmula (I), que incluye las fórmulas (Ia), (Ib), (Ic), (Id), (Ie), (If), (Ig), (Ih), (Ii), (Ij), (Ik), (Im), (In), (Io), (Ip), (Iq), (Ir) y (Is) y el anillo Ar2 puede ser un anillo aromático carbocíclico o heterocíclico de seis miembros, por ejemplo, fenilo, piridinilo o pirazinilo.
En una realización, la sustitución en el anillo Ar2 de fórmula (I) incluye al menos dos de a) ácido carboxílico y ácido alquilen-carboxílico, por ejemplo, ácido alquilen C1-C6-carboxílico; b) hidroxilo y alquilo sustituido con hidroxilo, por ejemplo, alquilo C1-C6 sustituido con un hidroxilo; y c) haloalquilo, por ejemplo, haloalquilo C1-C6. Por ejemplo, al menos dos de ácido carboxílico, hidroxilo y trifluorometilo. Opcionalmente, en este caso, el compuesto de fórmula (I) puede ser uno de los compuestos de PEM de fórmula (I), que incluye las fórmulas (Ia), (Ib), (Ic), (Id), (Ie), (If), (Ig), (Ih), (Ii), (Ij), (Ik), (Im), (In), (Io), (Ip), (Iq), (Ir) y (Is) y el anillo Ar2 puede ser un anillo aromático carbocíclico o heterocíclico de seis miembros, por ejemplo, fenilo, piridinilo o pirazinilo.
En una realización, la sustitución en el anillo Ar2 de fórmula (I) incluye los tres de a) ácido carboxílico y ácido alquilen-carboxílico, por ejemplo, ácido alquilen C1-C6-carboxílico; b) hidroxilo y alquilo sustituido con hidroxilo, por ejemplo, alquilo C1-C6 sustituido con un hidroxilo; y c) haloalquilo, por ejemplo, haloalquilo C1-C6. Es decir, Ar2 puede estar sustituido con ácido carboxílico, hidroxilo y trifluorometilo. Opcionalmente, en este caso, el compuesto de fórmula (I) puede ser uno de los compuestos de PEM de fórmula (I), que incluye las fórmulas (Ia), (Ib), (Ic), (Id), (Ie), (If), (Ig), (Ih), (Ii), (Ij), (Ik), (Im), (In), (Io), (Ip), (Iq), (Ir) y (Is) y el anillo Ar2 puede ser un anillo aromático carbocíclico o heterocíclico de seis miembros, por ejemplo, fenilo, piridinilo o pirazinilo.
Por ejemplo, en una realización, el grupo Ar2 es un grupo fenilo sustituido seleccionado entre
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Como se ha mencionado, en una realización, los compuestos de PEM de la presente divulgación pueden tener sustitución de hidroxilo y ácido carboxílico en Ar2. Estos dos grupos se pueden ubicar en diversas posiciones en el anillo Ar2. Por ejemplo, en una realización, la presente divulgación proporciona compuestos de PEM de fórmula (I) descritos por la fórmula:
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En otra realización, los compuestos de PEM de fórmula (I) de la presente divulgación tienen una sustitución de hidroxilo y ácido carboxílico en Ar2 según se proporciona en la fórmula:
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En otra realización más, los compuestos de PEM de fórmula (I) de la presente divulgación tienen una sustitución de hidroxilo y ácido carboxílico en Ar2 como se muestra en la fórmula:
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En una realización, los compuestos de PEM de fórmula (I) de la presente divulgación tiene al menos una sustitución hidroxilo y carboxílico en Ar2 y puede tener otra sustitución en Ar2. Por ejemplo, Ar2 puede estar sustituido con hidroxilo, ácido carboxílico y alquilo, por ejemplo, alquilo C1-C6 , para proporcionar, por ejemplo, un compuesto de fórmula:
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Como se ha mencionado anteriormente, en una realización, los compuestos de PEM de fórmula (I) de la presente divulgación pueden tener una sustitución haloalquilo y ácido carboxílico en Ar2 en lugar de hidroxilo y ácido carboxílico como se ha ilustrado en las estructuras anteriores. Como un ejemplo, los compuestos de PEM de la presente divulgación se pueden describir mediante la fórmula:
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Los compuestos de PEM de fórmula (I) incluyen solvato, que incluye hidrato, quelato y sus formas de sal. En algunos casos, los compuestos de PEM pueden ser amorfos, mientras que en otros casos los compuestos de PEM pueden ser cristalinos. Además, algunas de las formas cristalinas de los compuestos pueden existir en forma de polimorfos, que están contemplados en el presente documento. Además, algunos de los compuestos también pueden formar solvatos con agua u otros disolventes orgánicos. Dichos solvatos están incluidos de forma similar dentro del alcance de los compuestos descritos en el presente documento.
Los compuestos de PEM de fórmula (I) pueden estar en forma de un quelato, tal como quelato de cobre. Un quelato de cobre se puede formar combinando un compuesto de PEM de la presente divulgación con sulfato de cobre. Los compuestos de PEM de fórmula (I) pueden estar en forma de una sal, tanto una sal de adición de ácido como una sal de adición de base, dependiendo de los sustituyentes en los grupos Ar1 y Ar2.
Las estructuras de PEM incluyen todas las formas estereoisoméricas estables. Por lo tanto, los compuestos de PEM descritos en el presente documento pueden tener uno o más centros quirales (o asimétricos) y por lo tanto pueden dar lugar a enantiómeros, diastereómeros y otras formas estereoisoméricas que pueden definirse, en términos de estequiometría absoluta, como (R)- o (S)-. Cuando los compuestos descritos en el presente documento contienen dobles enlaces olefínicos u otros centros de asimetría geométrica y, a menos que se especifique de otro modo, se entiende que los compuestos incluyen los isómeros geométricos E y Z (por ejemplo, cis o trans). De manera análoga, a menos que se indique de otro modo, todos los isómeros posibles, así como sus formas racémicas y ópticamente puras, y todas las formas tautoméricas también se pretende que estén incluidas. Por lo tanto se contempla que los distintos estereoisómeros y sus mezclas incluyan los "enantiómeros", que se refieren a dos estereoisómeros cuyas moléculas son imágenes especulares no superponibles entre sí. Por lo tanto, los compuestos pueden estar presentes en cualquier forma isomérica, que incluye los racematos, mezclas racémicas y en forma de enantiómeros individuales o diastereómeros.
los compuestos de PEM de la presente divulgación en general son solubles en agua. Una medición de la solubilidad en agua es el valor logP de un compuesto. Los valores LogP se pueden calcular usando programas informáticos comerciales, basados en la estructura química del compuesto. Por ejemplo, el programa informático de dibujo químico CHEMDRAW (Cambridgesoft Limited, una subsidiaria de PerkinElmer Holdings) puede calcular un valor logP para una estructura química dibujada. En una realización, un compuesto de PEM de la presente divulgación tiene un logP de al menos 4,9.
Los compuestos de la presente divulgación, por ejemplo, los compuestos de PEM de fórmula (I) como se ha descrito anteriormente, y los compuestos de PEM de fórmula (II) como se describe a continuación, habitualmente se pueden sintetizar mediante la reacción de los compuestos de dietinilo de fórmula Arl(CECH) 2 con compuestos azida de fórmula Ar2-N3 en presencia de catalizador de Cu(I). Véase también Crowley J.D., McMorran D.A. (2012) "Click-Triazole" Coordination Chemistry: Exploiting 1,4-Disubstituted- 1,2,3-Triazoles as Ligands. In: Kosmrlj J. (eds.) Click Triazoles. Topics in Heterociclic Chemistry, vol. 28. Springer, Berlín, Heidelberg doi.org/10.1007/7081_2011_67. Los reactivos específicos y análogos también se pueden identificar mediante los índices de productos químicos conocidos preparados por la Chemical Abstract Service of the American Chemical Society, que están disponibles en la mayoría de las bibliotecas públicas y universitarias, así como a través de las bases de datos on-line (the American Chemical Society, Washington, D.C., se puede contactar para más detalles). Los productos químicos que se conocen pero no están disponibles en el mercado en los catálogos se pueden preparar en empresas de síntesis química habituales, donde muchas de las empresas suministradoras de productos químicos habituales (por ejemplo, las listadas anteriormente) proporcionan servicios de síntesis habituales. Una referencia para la preparación y selección de sales farmacéuticas de la presente divulgación es P. H. Stahl & C. G. Wermuth "Handbook of Pharmaceutical Salts," Verlag Helvetica Chimica Acta, Zúrich, 2002.
Los compuestos de fórmula Arl(CECH) están disponibles en el mercado, por ejemplo, en TCI America (Portland, Oregón, EE.UU.), que vende, por ejemplo, 1,3-dietinilbenceno, 1,4-dietinilbenceno, 2,6-dietinilpiridina y 3,6-dietinilcarbazol.
En general, los compuestos aromáticos de etinilo se pueden preparar mediante una homologación Seyferth-Gilbert a partir de un aril aldehído usando dimetil(diazaometil)fosfonato disponible en MilliporeSigma Corp. (St. Louis, MO, EE.UU.). Como alternativa, el dimetil(diazometil)fosfonato se puede generar in situ a partir de dimetil-1-diazo-2-oxopropilfosfonato (reactivo Ohira-Bestmann). Véase, por ejemplo, Seyforth et al., J. Org. Chem. 36(10): 1379-1386 (1971). doi:10.1021/jo00809a014 y Bestman et al., Synlett. 1996 (06): 521-522 (1996). doi:10.1055/s-1996-5474. Otra vía para los compuestos aromáticos de etinilo implica un acoplamiento de Sonogashira de los compuestos aromáticos halo con (t-butildimetilsilil)acetileno en presencia de un catalizador de paladio. El etinilo aromático se forma después de la posterior protección del grupo sililo. Véase, por ejemplo, Sonogashira, Organomet. Chem., 653: 46-49 (2002). doi:10.1016/s0022-328x(02)01158-0.
Las reacciones (I), (II) y (III) siguientes ilustran preparaciones a modo de ejemplo de los compuestos aromáticos de dietinilo. En la reacción (I), la 2,6-dibromopiridin-4-amina se convierte en el compuesto 2,6-dietinilpiridin-4-amina correspondiente. En la reacción (II), la 2,6-diyodo-4-nitroanilina se convierte en la 2,6-dietinil-4-nitroanilina correspondiente. En la reacción (III), el ácido 2-hidroxi-3,5-diyodobenzoico se convierte en el ácido 3,5-dietinil-2-hidroxibenzoico correspondiente. En cada caso, la conversión tiene lugar a través del compuesto intermedio ditrimetilsililo (TMS) como se muestra.
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Cada uno de estos productos de reacción, concretamente 2,6-dietinilpiridin-4-amina, y 2,6-dietinil-4-nitroanilina, y ácido 3,5-dietinil-2-hidroxibenzoico, puede funcionar como precursor de Ar1 para preparar los PEM de la presente divulgación. Por lo tanto, cada uno de ellos representa un compuesto Ar1(CECH)2 que puede hacerse reaccionar con un compuesto azida de fórmula Ar2-N3 en presencia de un catalizador de Cu(I) para proporcionar un PEM. Las reacciones (I), (II) y (III) ilustran la preparación de un precursor a un resto Ar1 sustituido de la presente divulgación. Los compuestos de fórmula Ar2-N3 están asimismo disponibles en el mercado, por ejemplo, en TCI America (Portland, Oregón, EE.UU.), Synthonix (Wake Forest, Carolina del Norte, EE.UU.), SigmaAldrich (St. Louis, Missouri, EE.UU.), Toronto Research Chemicals (Toronto, Canadá) y AnaSpec (Fremont, California, EE.UU.). En general, las azidas de fórmula Ar2-N3 se pueden preparar mediante desplazamiento nucleófilo con una azida sódica de compuestos electrófilos tales como un alquilo, yoduro o bromuro bencílico o alílico.
En general, los compuestos usados en las reacciones descritas en el presente documento se pueden fabricar según técnicas de síntesis orgánicas conocidas por los expertos en esta materia, partiendo de productos químicos disponibles en el mercado y/o a partir de compuestos descritos en la bibliografía química. Los "productos químicos disponibles en el mercado" se pueden obtener a partir de fuentes comerciales habituales que incluyen Across Organics (Pittsburgh Pa.), Aldrich Chemical (Milwaukee Wis., que incluye Sigma Chemical y Fluka), Apin Chemicals Ltd. (Milton Park R.U.), Avocado Research (Lancashire R.U.), BDH Inc. (Toronto, Canadá), Bionet (Cornwall, R.U.), Chemservice Inc. (West Chester Pa.), Crescent Chemical Co. (Hauppauge N.Y.), Eastman Organic Chemicals, Eastman Kodak Company (Rochester N.Y.), Fisher Scientific Co. (Pittsburgh Pa.), Fisons Chemicals (Leicestershire R.U.), Frontier Scientific (Logan Utah), ICN Biomedicals, Inc. (Costa Mesa Calif.), Key Organics (Cornwall R.U.), Lancaster Synthesis (Windham N.H.), Maybridge Chemical Co. Ltd. (Cornwall R.U.), Parish Chemical Co. (Orem Utah), Pfaltz & Bauer, Inc. (Waterbury Conn.), Polyorganix (Houston Tex.), Pierce Chemical Co. (Rockford Ill.), Riedel de Haen AG (Hanover, Alemania), Spectrum Quality Product, Inc. (New Brunswick, N.J.), TCI America (Portland Oreg.), Trans World Chemicals, Inc. (Rockville Md.) y Wako Chemicals EE.UU., Inc. (Richmond Va.). En una realización, un compuesto de PEM de la presente divulgación, p. ej., un compuesto de PEM de fórmula (I) o un compuesto de PEM de fórmula (II), está presente en una composición. Por ejemplo, los compuestos de PEM de la presente divulgación pueden estar presentes en una composición que también comprenda un tampón acuoso. En una realización, los compuestos de PEM de la presente divulgación están presentes en una composición que comprende una biomolécula tal como un polipéptido y/o un polinucleótido. El polipéptido puede ser una enzima tal como una ADN polimerasa. Las siguientes definiciones pueden ser útiles para comprender estas composiciones y determinados usos de las mismas.
Como se usa en el presente documento, los "ácidos nucleicos", también denominados polinucleótidos, son series de nucleótidos unidos de manera covalente en los que la posición 3' de la pentosa de un nucleótido se une mediante un grupo fosfodiéster a la posición 5' del siguiente. Una molécula de ácido nucleico puede ser ácido desoxirribonucleico (ADN), ácido ribonucleico (ARN) o una combinación de ambos. El ADN (ácido desoxirribonucleico) y el ARN (ácido ribonucleico) son polinucleótidos de origen biológico en los que los residuos de nucleótidos están unidos en una secuencia específica mediante enlaces fosfodiéster. Como se usa en el presente documento, las expresiones "ácido nucleico", "polinucleótido" u "oligonucleótido" abarcan cualquier compuesto polimérico que tenga un esqueleto lineal de nucleótidos. Los oligonucleótidos, también denominados oligómeros, son generalmente polinucleótidos de cadena corta. Los ácidos nucleicos se denominan generalmente "ácidos nucleicos diana" o "secuencia diana" si se dirigen a la secuenciación.
Como se usa en el presente documento, la expresión "manera dependiente del molde" pretende referirse a un proceso que implica la extensión dependiente del molde de una molécula de cebador (p. ej., síntesis de ADN por ADN polimerasa). La expresión "manera dependiente del molde" se refiere a la síntesis de polinucleótidos de ARN o ADN en donde la secuencia de la hebra de polinucleótido recién sintetizada está establecida por las bien conocidas reglas de emparejamiento de bases complementarias (véase, por ejemplo, Watson, J. D. et al., En: Molecular Biology of the Gene, 4.a Ed., W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, Calif. (1987)).
Como se usa en el presente documento, la "polimerasa de ácido nucleico" es una enzima generalmente para unir nucleótidos 3'-OH 5'-trifosfato, oligómeros y sus análogos. Las polimerasas incluyen, pero sin limitación, ADN polimerasas dependientes de ADN, ARN polimerasas dependientes de ADN, ADN polimerasas dependientes de ARN, ARN polimerasas dependientes de ARN, ADN polimerasa T7, ADN polimerasa T3, ADN polimerasa T4, ARN polimerasa T7, ARN polimerasa T3, ARN polimerasa SP6, ADN polimerasa 1, fragmento de Klenow, ADN polimerasa de Thermophilus aquaticus, ADN polimerasa Tth (de Thermus thermophilus), ADN polimerasa VentR® (New England Biolabs), ADN polimerasa Deep VentR® (New England Biolabs), Fragmento grande de ADN polimerasa Bst (de Bacillus stearothermophilus), fragmento de Stoeffel, ADN Polimerasa 9° N, ADN polimerasa 9° N, ADN polimerasa Pfu (de Pyrococcus furiosus), ADN polimerasa Tfl (de Thermus flavus), ADN polimerasa Tth (de Thermus thermophilus), Polimerasa RepliPHI del fago Phi29, ADN polimerasa Tli (de Thermococcus littoralis), ADN polimerasa beta de eucariotas, telomerasa, polimerasa Therminator™ (New England Biolabs), ADN polimerasa KOD HiFi™ (Novagen), ADN polimerasa KOD1, Q-beta replicasa, transferasa terminal, transcriptasa inversa AMV (del virus de la mieloblastosis aviar), transcriptasa inversa M-MLV (del virus de la leucemia murina de Moloney), transcriptasa inversa phi6 (del fago phi6), transcriptasa inversa HIV-1 (del virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1). Una polimerasa según la invención puede ser una polimerasa variante, mutante o quimérica.
Como se usa en el presente documento, una "ADN polimerasa de tipo DPO4" es una ADN polimerasa expresada de manera natural por la arquea, Sulfolobus solfataricus, o una ADN polimerasa de la familia Y relacionada, que generalmente funciona en la replicación del ADN dañado mediante un proceso conocido como síntesis por translesión (TLS, translesion synthesis). Las ADN polimerasas de la familia Y son homólogas a la polimerasa DPO4; ejemplos de las cuales incluyen las enzimas procariotas, PolII, PollV, PolV, la enzima de arqueas, Dbh, y las enzimas eucariotas, Rev3p, Revlp, Polq, REV3, REVI, ADN polimerasas Pol I y Pol k, así como sus quimeras. Una ADN polimerasa de tipo DPO4 recombinante modificada incluye una o más mutaciones respecto a las ADN polimerasas de tipo DPO4 de tipo silvestre de origen natural, por ejemplo, una o más mutaciones que aumentan la capacidad de utilizar análogos de nucleótidos voluminosos como sustratos u otra propiedad de la polimerasa, y puede incluir alteraciones o modificaciones adicionales respecto a la ADN polimerasa de tipo DPO4 de tipo silvestre, tal como una o más deleciones, inserciones y/o fusiones de secuencias de péptidos o proteínas adicionales (p. ej., para inmovilizar la polimerasa en una superficie o etiquetar de otra manera la enzima polimerasa). Son ejemplos de polimerasa variante según la invención las variantes de Sulfolobus sulfataricus DPO4 descritas en la solicitud de patente PCT publicada WO2017/087281 A1 y las solicitudes de patente PCT n.° PCTUS2018/030972 y PCTUS2018/64794.
Como se usa en el presente documento, "reacción de polimerasa de ácido nucleico" se refiere a un método in vitro para crear una nueva hebra de ácido nucleico o alargar un ácido nucleico existente (p. ej., ADN o ARN) de una manera dependiente del molde. Las reacciones de polimerasa de ácido nucleico, según la invención, incluyen reacciones de extensión de cebadores, que dan como resultado la incorporación de nucleótidos o análogos de nucleótidos en un extremo 3' del cebador de manera que el nucleótido o análogo de nucleótido incorporado es complementario al nucleótido del polinucleótido diana correspondiente. El producto de extensión del cebador de la reacción de la polimerasa de ácido nucleico puede utilizarse además para la secuenciación de una sola molécula o como moldes para sintetizar moléculas de ácido nucleico adicionales.
Los reactivos de la reacción de extensión del cebador normalmente incluyen (i) una enzima polimerasa; (ii) un tampón; y (iii) uno o más nucleótidos o análogos de nucleótidos extensibles. Las reacciones de extensión del cebador pueden utilizarse para medir la longitud de un producto de ácido nucleico resultante en condiciones experimentales particulares y para determinar el efecto de diversos aditivos de reacción de polimerasa (p. ej., las PEM) sobre la actividad de la polimerasa comparando las longitudes de los productos de cebador extendidos, p. ej., mediante electroforesis en gel.
Como se usa en el presente documento, "mejorar una reacción de polimerasa de ácido nucleico" se refiere a la capacidad de un aditivo, p. ej., una PEM, para permitir que una polimerasa de ácido nucleico sintetice un producto de extensión del cebador al menos una subunidad más larga de lo que sería en ausencia de la PEM.
La tasa de una reacción de polimerasa de ácido nucleico, como se usa en el presente documento, se refiere a la velocidad media a la que una polimerasa de ácido nucleico extiende una cadena polimérica. Como se usa en el presente documento, los términos "velocidad" y "tasa de elongación" se utilizan indistintamente. El ensayo de incorporación de nucleótidos de Hogrefe et al. (Methods in Enzymol. Vol. 334, págs 91-116 (2001)) puede utilizarse medir la tasa de polimerización. Resumiendo, la actividad de la polimerasa puede medirse como la tasa de incorporación de 32P-dCTP (trifosfato de desoxicitidina, marcado en el grupo fosfato alfa con 32P) en ADN de esperma de salmón activado (adquirido en Pharmacia; para el protocolo de activación véase C. C. Richardson, Procedures in Nucl. Acid Res. (Cantoni y Davies, eds.), págs. 263-276 (1966) en pág. 264). El tampón de reacción puede ser, por ejemplo, Tris-HCl 50 mM (pH 8,0), MgCl25 mM, ditiotreitol (dTt ) 1 mM, seroalbúmina bovina (BSA) 50 |jg/ml y glicerol al 4 % (v/v). Los sustratos de nucleótidos y el ADN se utilizan en gran exceso, normalmente al menos 10 veces la Km de la polimerasa que se está analizando, p. ej., 200 jM de cada uno de dATP, dTTP y dGTP, 195 jM de dCTP más 5 jIM de dCTP marcado y 250 jg/ml de ADN activado. Las reacciones se inactivan en hielo y las partes alícuotas de la mezcla de reacción se aplican en filtros de intercambio iónico (p. ej., Whatman DE81). El nucleótido no incorporado se lava, y se procede al recuento por centelleo para medir la radiactividad incorporada. Como se usa en el presente documento, "aumento de la tasa" se refiere a un aumento del 5-10 %, 10-50 % o 50­ 100 % o mayor, en comparación con una reacción de polimerización que carece de una PEM que aumente la tasa como se define en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, "procesividad" se refiere al grado de polimerización por una polimerasa de ácido nucleico durante un solo contacto entre la polimerasa y su molde, es decir, su propiedad de continuar actuando sobre un sustrato en lugar de disociarse de él. El grado de polimerización se refiere al número de nucleótidos o análogos de nucleótidos añadidos por la polimerasa durante un solo contacto entre la polimerasa y su molde. La procesividad puede depender de la naturaleza de la polimerasa, de la secuencia de un molde, de la estructura de los sustratos de nucleótidos o análogos de nucleótidos y de las condiciones de reacción, por ejemplo, concentración salina, temperatura o la presencia de aditivos específicos.
Como se usa en el presente documento, "aumento de la procesividad" se refiere a un aumento del 5-10 %, 10-50 % o 50-100 % o mayor, en comparación con una reacción de polimerización que carece de una PEM que aumente la procesividad como se define en este documento. Los métodos para medir la procesividad de una polimerasa de ácido nucleico son generalmente conocidos en la técnica, p. ej., como se describe en Sambrook et al. 1989, en Molecular Cloning, 2a edición, CSH Press, 7.79-7.83 y 13.8, como se describe en la solicitud de patente publicada de EE. UU. n.° 2002/0119467, en la solicitud PCT publicada n.° WO01/92501 y en la patente de EE.UU. n.° 5.972.603 El término "fidelidad", como se usa en el presente documento, se refiere a la precisión de la polimerización de ácidos nucleicos por la polimerasa de ácidos nucleicos dependiente de molde. La fidelidad de una ADN polimerasa se mide por la tasa de error (la frecuencia de incorporación de un nucleótido inexacto, es decir, un nucleótido que no se incorpora de una manera dependiente del molde). La fidelidad o tasa de error de una ADN polimerasa puede medirse utilizando ensayos conocidos en la materia (véase, por ejemplo, Lundburg et al., 1991 Gene, 108: 1-6). Como se usa en el presente documento, "aumentar la fidelidad" se refiere a un aumento del 5-10 %, 10-50 % o 50­ 100 % o mayor, en comparación con una reacción de polimerización que carece de un aditivo que aumente la fidelidad como se define en el presente documento.
El término "pluralidad", como se usa en el presente documento, se refiere a "al menos dos".
"XNTP" es un sustrato de nucleótido expandible, modificado con 5' trifosfato, compatible con la polimerización enzimática dependiente de molde. Un XNTP tiene dos componentes funcionales distintos; concretamente, una nucleobase 5'-trifosforamidato y un anclaje que está fijado dentro de cada nucleósido trifosforamidato en posiciones que permiten la expansión controlada por escisión intranucleotídica del enlace fosforamidato. Como se usa en el presente documento, los XNTP son "sustratos análogos de nucleótidos no naturales, altamente sustituidos", ilustrativos. Se describen XNTP y métodos ilustrativos para fabricarlos, p. ej., en la solicitud PCT publicada de los solicitantes n.° WO2016/081871
El "intermedio expandómero" es un producto intermedio (también denominado en el presente documento "hebra hija") ensamblado a partir de los XNTP y que se forma mediante ensamblaje dirigido por molde mediado por polimerasa de los XNTP utilizando un molde de ácido nucleico diana. El intermedio expandómero recién sintetizado es un expandómero restringido. En una etapa del proceso en el que se escinden los enlaces de fosforamidato proporcionados por los XNTP, el expandómero restringido deja de estar restringido y es el producto expandómero que se extiende a medida que se estiran los anclajes.
Un "expandómero" o "producto expandómero" es una construcción molecular sintética producida por la expansión de un expandómero restringido, que a su vez se sintetiza mediante el ensamblaje de sustratos XNTP dirigido por molde. El expandómero se alarga respecto al molde diana a partir del que se produjo. Se compone de una concatenación de subunidades, cada subunidad un motivo, cada motivo un miembro de una biblioteca, que comprende información de secuencia, un anclaje y, opcionalmente, una porción, o la totalidad del sustrato, todos ellos derivados de la construcción del sustrato formativo. El expandómero está diseñado para expandirse, para ser más largo que el molde diana, lo que reduce la densidad lineal de la información de secuencia del molde diana en toda su longitud. Además, el expandómero proporciona opcionalmente una plataforma para aumentar el tamaño y la abundancia de indicadores, lo que a su vez mejora la señal con respecto al ruido para la detección. La menor densidad de información lineal y las señales más fuertes aumentan la resolución y reducen los requisitos de sensibilidad para detectar y descodificar la secuencia de la hebra molde.
"Anclaje" o "miembro de anclaje" se refiere a un polímero o construcción molecular que tiene una dimensión generalmente lineal y con un resto final en cada uno de los dos extremos opuestos. Un anclaje se fija a un nucleósido trifosforamidato con un enlace en el resto final para formar un XNTP. Los enlaces sirven para restringir el anclaje en una "configuración restringida". Los anclajes tienen una "configuración restringida" y una "configuración expandida". La configuración restringida se encuentra en los XNTP y en la hebra hija, o en el intermedio expandómero. La configuración restringida del anclaje es la precursora de la configuración expandida, como la que se encuentra en los productos expandómeros. La transición de la configuración restringida a la configuración expandida da como resultado la escisión de enlaces de fosforamidato escindibles de manera selectiva. Los anclajes comprenden uno o más indicadores o construcciones indicadoras en toda su longitud que pueden codificar información de secuencia de sustratos. El anclaje proporciona un medio para expandir la longitud del expandómero y de este modo reducir la densidad lineal de la información de la secuencia.
Un "elemento de anclaje" o "segmento de anclaje" es un polímero que tiene una dimensión generalmente lineal con dos extremos terminales, donde los extremos forman enlaces finales para concatenar los elementos de anclaje. Los elementos de anclaje son segmentos de anclaje. Dichos polímeros pueden incluir, pero sin limitación: polietilenglicoles, poliglicoles, polipiridinas, piliisocianuros, poliisocianatos, poli(triarilmetil)metacrilatos, polialdehídos, polipirrolinonas, poliureas, poliglicol fosfodiésteres, poliacrilatos, polimetacrilatos, poliacrilamidas, ésteres de polivinilo, poliestirenos, poliamidas, poliuretanos, policarbonatos, polibutiratos, polibutadienos, polibutirolactonas, polipirrolidinonas, polivinilfosfonatos, poliacetamidas, polisacáridos, polihialuronatos, poliamidas, poliimidas, poliésteres, los polietilenos, polipropilenos, poliestirenos, policarbonatos, politereftalatos, polisilanos, poliuretanos, poliéteres, poliaminoácidos, poliglicinas, poliprolinas, polilisina N-sustituida, polipéptidos, péptidos con cadena lateral N-sustituida, poli-glicina N-sustituida, peptoides, péptidos con cadena lateral sustituida con carboxilo, homopéptidos, oligonucleótidos, oligonucleótidos de ácido ribonucleico, oligonucleótidos de ácido desoxinucleico, oligonucleótidos modificados para impedir el emparejamiento de bases de Watson-Crick, análogos de oligonucleótidos, poli(ácido citidílico), poli(ácido adenílico), poli(ácido uridílico), politimidina, polifosfato, polinucleótidos, polirribonucleótidos, polietilenglicol fosfodiésteres, análogos de polinucleótidos peptídicos, análogos de treosil-polinucleótidos, análogos de glicol-polinucleótidos, análogos de morfolino-polinucleótidos, análogos de oligómeros de nucleótidos bloqueados, análogos de polipéptidos, polímeros ramificados, polímeros de peine, polímeros de estrella, polímeros dendríticos, copolímeros aleatorios, de gradiente y de bloque, polímeros aniónicos, polímeros catiónicos, polímeros formadores de tallo-bucle, segmentos rígidos y segmentos flexibles.
Un "indicador" se compone de uno o más elementos indicadores. Los indicadores sirven para analizar la información genética del ácido nucleico diana.
Una "construcción indicadora" comprende uno o más indicadores que pueden producir una o más señales detectables, en donde la(s) señal(es) detectable(s) generalmente contiene(n) información de secuencia. Esta información de señal se denomina "código indicador" y posteriormente se descodifica en datos de secuencia genética. Una construcción indicadora también puede comprender segmentos de anclaje u otros componentes arquitectónicos, incluidos polímeros, copolímeros de injerto, copolímeros de bloque, ligandos de afinidad, oligómeros, haptenos, aptámeros, dendrímeros, grupos enlazadores o grupo de unión por afinidad (p. ej., biotina).
Un "código indicador" es la información genética de una señal medida de una construcción indicadora. El código indicador se descodifica para proporcionar datos de información genética específicos de secuencia.
Por tanto, en una realización, la presente divulgación proporciona una composición que comprende una PEM como se desvela en el presente documento y un tampón. En otra realización, la presente divulgación proporciona una composición que comprende una PEM como se desvela en el presente documento y una pluralidad de nucleótidos y/o análogos de nucleótidos. En otra realización, la presente divulgación proporciona una composición que comprende una PEM como se desvela en el presente documento y un polinucleótido. En otra realización, la presente divulgación proporciona una composición que comprende una PEM como se desvela en el presente documento y una proteína, donde opcionalmente la proteína es una polimerasa que incluye cualquiera de las polimerasas descritas anteriormente.
En una realización, la presente divulgación proporciona una composición que comprende un compuesto de PEM de la presente divulgación, p. ej., un compuesto de PEM de fórmula (I) o un compuesto de PEM de fórmula (II), y un agente de aglomeración molecular. En términos generales, los agentes de aglomeración molecular incluyen una gama polímeros grandes y neutros. Como ejemplos de reactivos de aglomeración molecular útiles se incluyen, pero sin limitación, polietilenglicol (PEG), ficoll, dextrano o alcohol polivinílico. En la patente de EE.UU. n.° 7.399.590, se exponen ejemplos de reactivos y formulaciones de aglomeración molecular. En una realización, el agente de aglomeración molecular es un polialquilenglicol, opcionalmente con un peso molecular promedio en número de 4.000-10.000. En una realización, el agente de aglomeración molecular es un derivado de un polialquilenglicol, p. ej., uno o ambos de los grupos hidroxilo terminales de un polialquilenglicol está(n) en forma de un grupo éster o éter. En una realización, el agente de aglomeración molecular es un polímero inerte y soluble en agua.
En una realización, la presente divulgación proporciona una composición que comprende un compuesto de PEM de la presente divulgación y un tampón acuoso. En una realización, el compuesto de PEM tiene la fórmula (I). En otra realización, el compuesto de PEM tiene la fórmula (II). En una opción, la composición tiene un pH de aproximadamente 6 a 8,5 y el tampón ayuda a estabilizar el pH de la composición. Un tampón ilustrativo es Tris HCl. Otros tampones adecuados incluyen los conocidos en la técnica, p. ej., tampones de fosfato, tampones de ácido cítrico, tampones de acetato de sodio, tampones de carbonato de sodio y similares.
En una realización, la presente divulgación proporciona una composición que comprende un compuesto de PEM de la presente divulgación, p. ej., un compuesto de PEM de fórmula (I), y un polinucleótido. En una opción, el polinucleótido es monocatenario, p. ej., ADN monocatenario o ARN monocatenario. Cuando se pretende que el polinucleótido funcione como cebador, el polinucleótido es una molécula de ADN monocatenario. Cuando se pretende que funcione como cebador, el polinucleótido puede tener una longitud de aproximadamente 10-60 meros (unidades monoméricas) de oligonucleótidos, p. ej., 20-30 oligonucleótidos. El polinucleótido puede funcionar alternativamente como un molde, en cuyo caso puede ser un ADN monocatenario o un ARN monocatenario, y puede tener una longitud de 30 bases a kilobases y valores superiores, p. ej., 10 k bases y valores superiores.
En una realización, la presente divulgación proporciona una composición que comprende un compuesto de PEM de la presente divulgación, p. ej., un compuesto de PEM de fórmula (I), y una proteína. Por ejemplo, la proteína puede ser una enzima, una polimerasa de ácido nucleico, una ADN polimerasa. Un ejemplo de una ADN polimerasa adecuada es una variante de la polimerasa DPO4, como se describe en el presente documento.
En una realización, la presente divulgación proporciona una composición que comprende al menos un compuesto de PEM de la presente divulgación, p. ej., un compuesto de PEM de fórmula (I) y una mezcla de nucleótidos o análogos de nucleótidos, en donde el al menos un compuesto aumenta el número y la precisión de los análogos de nucleótidos incorporados en una hebra hija durante una reacción de polimerización dependiente de molde en relación con una reacción de polimerización idéntica sin el al menos un compuesto. Opcionalmente, la mezcla de análogos de nucleótidos incluye nucleósido trifosforamidatos, en donde cada uno de los nucleósido trifosforamidatos tiene una nucleobase seleccionada de adenina, guanina, timina y citosina y un resto de anclaje polimérico, en donde un primer extremo del resto de anclaje polimérico se fija a la nucleobase y un segundo extremo del resto de anclaje polimérico se fija al fosfato alfa del nucleósido trifosforamidato para permitir la expansión de los análogos de nucleótidos mediante la escisión del enlace fosforamidato. Opcionalmente, la composición incluye además un tampón que comprende uno o más de Tris OAc, NH4OAc, PEG, un disolvente orgánico miscible en agua tal como dimetilformamida (DMF), N-metilpirrolidona (NMP) o acetona, polifosfato 60, NMS y MnCh. Opcionalmente, la composición también incluye una proteína de unión monocatenaria. Opcionalmente, la composición incluye urea. Opcionalmente, la mezcla de análogos de nucleótidos incluye análogos de nucleótidos que comprenden una etiqueta detectable, en donde la etiqueta detectable es opcionalmente una etiqueta luminiscente, quimioluminiscente, fluorescente, fluorógena, cromófora o cromógena. En una realización, la composición incluye dos o más de estas opciones, p. ej., todas estas opciones.
En un aspecto de la presente divulgación, las PEM y sus composiciones, como se desvela en el presente documento, pueden utilizarse para mejorar una reacción de polimerización de ácidos nucleicos o mejorar las propiedades del ácido nucleico resultante, p. ej., la longitud o la precisión del producto de reacción. Las reacciones de polimerización incluyen, p. ej., reacciones de extensión de cebador, PCR, mutagénesis, amplificación isotérmica, secuenciación de ADN y etiquetado con sonda. Dichos métodos se conocen bien en la técnica. La mejora puede proporcionarse mediante la estimulación de la incorporación de nucleótidos a través de mecanismos tales como el aumento de la procesividad de la polimerasa (es decir, la reducción de la disociación de la polimerasa del molde), aumentando la tasa de unión al sustrato o la catálisis enzimática, y aumentando la precisión o fidelidad de la incorporación de nucleótidos. Además, la mejora puede proporcionarse mediante la reducción de impedimentos en el molde de ácido nucleico, tales como la estructura secundaria y el ADN dúplex. Superar o mejorar dichos impedimentos mediante la adición de las PEM puede permitir que las reacciones de polimerización se produzcan de manera más precisa o eficaz, o permitir el uso de temperaturas de desnaturalización/extensión más bajas o temperaturas isotérmicas.
En algunas realizaciones, para mejorar una reacción de polimerasa, puede utilizarse una PEM junto con otras clases de aditivos. Una clase ilustrativa de aditivos son las proteínas de unión al surco menor (MGB, minor groove binding). En una realización, la proteína MGB se selecciona del grupo que consiste en distamicina A y análogos sintéticos de la misma, netropsina, (+)-CC-1065, duocarmicinas, pirrolobenzodiazepinas, trabectina y análogos de la misma, colorantes de Hoechst y sus derivados, lexitropsina, tiazotropsina A, diamidinas y poliamidas. En determinadas realizaciones, el al menos un resto de unión al surco menor es un colorante de Hoechst. Se puede encontrar más información sobre el uso de las proteínas MGB para mejorar una reacción de polimerasa, en la solicitud presentada conjuntamente por los solicitantes titulada ENHANCEMENT OF NUCLEIC ACID POLYMERIZATION BY MGBS. (MEJORA DE LA POLIMERIZACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS POR PROTEÍNAS MGB).
Una reacción de polimerasa ilustrativa que puede mejorarse con las PEM, es la polimerización de los análogos de nucleótidos no naturales conocidos como "XNTP". que constituye la base del protocolo de "Secuenciación por Expansión" (SBX), desarrollado por Stratos Genomics (véase, p. ej., Kokoris et al., patente de EE.UU. n.° 7.939.259, "High Throughput Nucleic Acid Sequencing by Expansion"). En términos generales, la SBX utiliza esta polimerización bioquímica para transcribir la secuencia de un molde de ADN en un polímero medible denominado "expandómero". La secuencia transcrita se codifica a lo largo del esqueleto del expandómero en indicadores de alta relación señalruido que están separados por ~10 nm y que están diseñados para dar respuestas bien diferenciadas de alta relación señal-ruido. Estas diferencias proporcionan importantes mejoras de rendimiento en la eficiencia y precisión de la lectura de secuencias de los expandómeros con respecto al ADN nativo. En las figuras 1A, 1B, 1C y 1D, se representa una vista generalizada del proceso de SBX.
Los XNTP son sustratos de nucleótido expandibles, modificados con 5' trifosfato, compatibles con la polimerización enzimática dependiente de molde. En la figura 1A se ilustra un XNTP muy simplificado, que resalta las características exclusivas de estos análogos de nucleótidos: XNTP 100 tiene dos regiones funcionales distintas; concretamente, un enlace de fosforamidato 110 escindible de manera selectiva, que une el 5' a-fosfato 115 con la nucleobase 105, y un anclaje 120 que se fija dentro del nucleósido trifosforamidato en posiciones que permiten la expansión controlada por escisión intranucleotídica del enlace fosforamidato. El anclaje del XNTP se compone de restos de brazo enlazador 125A y 125B separados por el enlace de fosforamidato escindible de manera selectiva. Cada enlazador se fija a un extremo de un indicador 130 a través de un grupo enlazador (linking group), como se desvela en la patente de EE.UU. n.° 8.324.360 de Kokoris et al. El XNTP 100 se ilustra en la "configuración restringida", característica de los sustratos XNTP y la hebra hija después de la polimerización. La configuración contraída de los XNTP polimerizados es la precursora de la configuración expandida, como la que se encuentra en los productos expandómeros. La transición de la configuración restringida a la configuración expandida se produce tras la escisión del enlace P--N del fosforamidato dentro del esqueleto primario de la hebra hija.
La síntesis de un expandómero se resume en las figuras 1B y 1C. Durante el ensamblaje, los sustratos XNTP monoméricos 145 (XATP, XCTP, XGTP y XTTP) se polimerizan en el extremo extensible de una hebra hija naciente 150 mediante un proceso de polimerización dirigida por molde utilizando como guía un molde monocatenario 140.
Generalmente, este proceso se inicia a partir de un cebador y procede en la dirección 5' a 3'. Generalmente, se utiliza una ADN polimerasa u otra polimerasa para formar la hebra hija, y se seleccionan las condiciones para que se obtenga una copia complementaria de la hebra molde. Una vez sintetizada la hebra hija, los anclajes acoplados comprenden el expandómero restringido que comprende además la hebra hija. Los anclajes en la hebra hija tienen la "configuración restringida" de los sustratos XNTp . La configuración restringida del anclaje es la precursora de la configuración expandida, como la que se encuentra en el producto expandómero.
Como se muestra en la figura 1C, la transición de la configuración restringida 160 a la configuración expandida 165 es el resultado de la escisión de los enlaces de fosforamidato escindibles de manera selectiva (ilustrados para simplificar mediante óvalos no sombreados) dentro del esqueleto primario de la hebra hija. En esta realización, los anclajes comprenden uno o más indicadores o construcciones indicadoras, 130A, 130C, 130G o 130T, específicos de la nucleobase a la que están unidos, codificando así la información de secuencia del molde. De esta manera, los anclajes proporcionan un medio para expandir la longitud del expandómero y reducir la densidad lineal de la información de secuencia de la hebra progenitora.
La figura 1D ilustra un expandómero 165 translocándose a través de un nanoporo 180, desde el reservorio cis 175 al reservorio trans 185. Al pasar a través del nanoporo, cada uno de los indicadores del expandómero linealizado (en esta ilustración, etiquetados como "G", "C" y "T") genera una señal electrónica distinta y reproducible (ilustrada mediante un trazado superpuesto 190), específica de la nucleobase a la que está unida.
La figura 2 representa la estructura generalizada de un XNTP con más detalle. El XNTP 200 comprende una nucleobase de trifosforamidato 210 con restos de brazo enlazador 220A y 220B separados por un enlace de fosforamidato 230 escindible de manera selectiva. Los anclajes se unen al nucleósido trifosforamidato en los grupos enlazadores 250A y 250B, en donde un primer extremo de anclaje se une al heterociclo 260 (representado en este caso por citosina, aunque el heterociclo puede ser una cualquiera de las cuatro nucleobases estándar, A, C, G o T) y el segundo extremo de anclaje se une al fosfato alfa 270 del esqueleto de la nucleobase. El experto en la materia apreciará que pueden utilizarse muchas químicas de acoplamiento adecuadas conocidas en la materia para formar el producto de sustrato XNTP final, por ejemplo, la conjugación de anclaje se puede lograr a través de un enlace triazol.
En esta realización, el anclaje 275 comprende varios elementos funcionales, incluyendo potenciadores 280A y 280B, códigos indicadores 285A y 285B, y elementos de control de la traducción (TCE, translation control elements) 290A y 290B. Cada una de estas características realiza una función exclusiva durante la translocación del expandómero a través de un nanoporo y la generación de una señal electrónica exclusiva y reproducible. El anclaje 275 está diseñado para el control de la translocación por hibridación (TCH, translocation control by hybridization). Como se muestra, los TCE proporcionan una región de hibridación que puede formar dúplex con un oligómero complementario (CO, complementary oligomer) y se colocan adyacentes a los códigos indicadores. Para bloquear el flujo de iones a través de un nanoporo a diferentes niveles medibles se dimensionan diferentes códigos indicadores. Pueden sintetizarse códigos indicadores específicos de manera eficaz utilizando química de fosforamidita normalmente utilizada para la síntesis de oligonucleótidos. Los indicadores pueden diseñarse seleccionando una secuencia de fosforamiditas específicas de bibliotecas disponibles en el comercio. Dichas bibliotecas incluyen, pero sin limitación, polietilenglicol con longitudes de 1 a 12 o más unidades de etilenglicol, alifáticos con longitudes de 1 a 12 o más unidades de carbono, desoxiadenosina (A), desoxicitosina (C), desoxiguanodina (G), desoxitimina (T), abásico (Q). Los TCE en dúplex, asociados a los códigos indicadores, también contribuyen al bloqueo de la corriente iónica, por tanto, la combinación del código indicador y el TCE puede denominarse "indicador". A continuación de los códigos indicadores se encuentran los potenciadores, que, en una realización, comprenden polímeros de espermina.
La figura 3 muestra una realización de un expandómero escindido en el proceso de translocación de un nanoporo de a-hemolisina. Este nanoporo biológico está incrustado en una membrana de bicapa lipídica que separa y aísla eléctricamente dos reservorios de electrolitos. Un electrolito clásico tiene KCl (cloruro de potasio) 1 molar tamponado a un pH de 7,0. Cuando se aplica un pequeño voltaje, normalmente de 100 mV, a través de la bicapa, el nanoporo restringe el flujo de corriente iónica y es la resistencia principal en el circuito. Los indicadores de expandómero están diseñados para proporcionar niveles específicos de bloqueo de corriente iónica y la información de la secuencia puede leerse midiendo la secuencia de niveles de corriente iónica a medida que la secuencia de indicadores se transloca en el nanoporo.
El nanoporo de a-hemolisina suele estar orientado de manera que la translocación se produce entrando por el lado del vestíbulo y saliendo por el lado del tallo. Como se muestra en la figura 3, el nanoporo está orientado para capturar primero el expandómero del lado del tallo. Esta orientación es ventajosa utilizando el método de TCH (control de la translocación por hibridación) porque causa menos artefactos de bloqueo que se producen al entrar primero en el vestíbulo. A menos que se indique de otro modo, el lado del tallo primero será la dirección de translocación supuesta. A medida que el expandómero se transloca, un indicador entra en el tallo hasta que su TCE en dúplex se detiene en la entrada del tallo. El dúplex tiene un diámetro de ~2,4 nm, mientras que la entrada del tallo es de ~2,2 nm, por lo que el indicador se mantiene en el tallo hasta que la hebra complementaria 395 del dúplex se disocia (se libera), tras lo cual la translocación prosigue al siguiente indicador. La hebra complementaria libre está muy desfavorecida para entrar en el nanoporo porque el expandómero sigue translocándose y se difunde fuera del poro.
En una realización, cada miembro de un código indicador (después del dúplex) está formado por una elección ordenada de fosforamiditas que pueden seleccionarse de muchas bibliotecas comerciales. Cada fosforamidita constituyente contribuye a la resistencia iónica neta según su posición en el nanoporo (que se sitúa después de la parada del dúplex), su desplazamiento, su carga, su interacción con el nanoporo, su entorno químico y térmico y otros factores. La carga de cada fosforamidita se debe, en parte, al ion fosfato que tiene una carga nominal de -1 pero se reduce de manera eficaz por el blindaje de contraiones. La fuerza que tira del dúplex se debe a estas cargas eficaces a lo largo del indicador sobre las que actúan los campos eléctricos locales. Dado que cada indicador puede tener una distribución de carga diferente, puede ejercer una fuerza diferente sobre el dúplex para un voltaje aplicado dado. La fuerza transmitida a lo largo del esqueleto indicador también sirve para estirarlo y dar una respuesta de bloqueo repetible.
La metodología de secuenciación por expansión (SBX) desarrollada por los inventores proporciona mejoras de rendimiento significativas en la eficiencia de lectura de secuencias y la precisión de los expandómeros en relación con el ADN nativo. Sin embargo, la transcripción inicial de la secuencia del molde de ADN natural en el expandómero medible se basa en la capacidad de la ADN polimerasa para utilizar los XNTP como sustratos (la estructura generalizada de un XNTP se analiza en el presente documento con referencia a las figuras 1A y 2). Los inventores han descubierto que la mayoría de las ADN polimerasas no polimerizan de manera eficaz los XNTP. Sin embargo, la inclusión de un aditivo adecuado, tal como una PEM de la presente divulgación, mejora la eficacia y precisión de la polimerización de los XNTP en expandómeros. Por tanto, las PEM desveladas en el presente documento pueden utilizarse en el contexto de la metodología SBX para mejorar las reacciones de extensión de cebador de ADN polimerasa utilizando los XNTP como sustratos.
Una reacción de extensión de cebador representativa puede incluir los siguientes reactivos: cebador 2 pmol, molde oligonucleotídico de 2,2 pmol de 45 meros, 50 pmol de cada XNTP (XATP, XCTP, XGTP y XTTP), Tris-HCl 50 mM, pH 6,79, NaCl 200 mM, PEG al 20 %, NMS al 5 %, polifosfato 60.190,5 nmol, MnCl2 0,3 mM y 0,6 μg de proteína ADN polimerasa recombinante purificada. Las PEM se añaden a esta mezcla a una concentración normalmente en el intervalo de micro a milimolar. Las reacciones también pueden incluir aditivos adicionales, tales como proteína de unión monocatenaria (SSB), urea y NMS. Las reacciones se llevan a cabo durante 1 hora a 23 °C. Los productos de reacción (es decir, expandómeros restringidos) se tratan para escindir los enlaces de fosforamidato, para generar expandómeros linealizados. Los productos de reacción se analizan mediante electroforesis en gel en geles de acrilamida al 4-12 % para resolver y visualizar los productos de expandómero de diferentes longitudes.
Por tanto, en una realización, la presente divulgación proporciona una composición acuosa (que contiene agua) que comprende una PEM y un tampón, particularmente un tampón adecuado para llevar a cabo una reacción de polimerización de ADN, donde Tris HCl es un tampón ilustrativo de este tipo. En una realización, la presente divulgación proporciona una composición que comprende una PEM y una proteína de ADN polimerasa. En una realización, la presente divulgación proporciona una composición que comprende una PEM y un polinucleótido, p. ej., un oligonucleótido de 20-90, 20-60, 30-90 o 30-60 unidades monoméricas (meros). En una realización, la presente divulgación proporciona una composición que comprende cada uno de estos componentes, es decir, una composición acuosa que comprende una PEM, un tampón, una proteína ADN polimerasa y un polinucleótido.
Para investigar la precisión de la mejora de la polimerización XNTP, los productos de extensión de cebador pueden secuenciarse utilizando el protocolo SBX. Resumiendo, los productos de expandómero restringidos de la polimerización XNTP se escinden para generar expandómeros linealizados. Esto se logra inactivando primero la reacción de extensión con una solución que contenga EDTA 100 mM, THPTA 2 mM y Tween-20 al 2 %. Después, la muestra se somete a modificación de amina con una solución de NaHCO31 M y anhídrido succínico 1 M en DMF. La escisión de los enlaces fosforamidato se lleva a cabo con HCl al 37 % y los expandómeros linealizados se purifican con columnas QIAquick (QIAGEN, Inc.).
Para la secuenciación, se preparan nanoporos de proteína insertando a-hemolisina en un miembro de bicapa de DPhPE/hexadecano en tampón B 1, que contiene NH4Cl 2 M y HEPES 100 mM, pH 7,4. El pocillo cis se perfunde con tampón B2, que contiene NH4Cl 0,4 M, GuCl 0,6 M y HEPES 100 mM, pH 7,4. La muestra de expandómero se calienta a 70 °C durante 2 minutos, se enfría completamente, y después se añade una muestra de 2 μl al pocillo cis. A continuación, se aplica un pulso de voltaje de 90 mV/390 mV/10 ps y los datos se adquieren a través del programa informático de adquisición Labview.
Los datos de secuencia se analizan mediante la visualización del histograma de la población de lecturas de secuencia de una sola reacción SBX. El programa informático de análisis alinea cada lectura de secuencia con la secuencia del molde y recorta la extensión de la secuencia al final de las lecturas que no se alinean con la secuencia del molde correcta.
En una realización, la presente divulgación proporciona un método para aumentar la precisión de la mejora de la polimerización de XNTP, en donde el método comprende añadir una PEM, como se desvela en el presente documento, a la reacción de polimerización de ADN, como se ha descrito anteriormente.
En una realización, la presente divulgación proporciona un kit, donde el kit puede utilizarse en un método como se describe en el presente documento. El kit incluirá al menos un compuesto de la presente divulgación y uno o más de a) un agente de aglomeración molecular, b) un tampón acuoso, c) una proteína tal como una polimerasa, d) un polinucleótido que puede funcionar, por ejemplo, como cebador y/o un polinucleótido que puede funcionar, por ejemplo, como molde.
Por ejemplo, en una realización, la presente divulgación proporciona un kit para secuenciar un molde de ácido nucleico. El kit incluye al menos un compuesto de la presente divulgación y una mezcla de análogos de nucleótidos. El compuesto de la presente divulgación puede utilizarse para aumentar el número y la precisión de los análogos de nucleótidos incorporados en una hebra hija durante una reacción de polimerización dependiente de molde en relación con una reacción de polimerización idéntica sin el al menos un compuesto de la presente divulgación. Opcionalmente, la mezcla de análogos de nucleótidos comprende nucleósido trifosforamidatos, en donde cada uno de los nucleósido trifosforamidatos comprende una nucleobase seleccionada del grupo que consiste en adenina, guanina, timina y citosina y un resto de anclaje polimérico, en donde un primer extremo del resto de anclaje polimérico se fija a la nucleobase y un segundo extremo del resto de anclaje polimérico se fija al fosfato alfa del nucleósido trifosforamidato para permitir la expansión de los análogos de nucleótidos mediante la escisión del enlace fosforamidato. Opcionalmente, la mezcla de análogos de nucleótidos comprende análogos de nucleótidos que comprenden una etiqueta detectable, en donde la etiqueta detectable es una etiqueta ópticamente detectable seleccionada del grupo que consiste en etiquetas luminiscentes, quimioluminiscentes, fluorescentes, fluorógenas, cromóforas o cromógenas. Opcionalmente, el kit incluye un tampón acuoso que comprende Tris OAc, NH4OAc, PEG, un disolvente orgánico miscible en agua tal como dimetilformamida (DMF), N-metil-2-pirrolidinona (NMP), acetona, etc., polifosfato 60, NMS y MnCh. Opcionalmente, el kit incluye una proteína de unión monocatenaria. Opcionalmente, el kit incluye urea. Opcionalmente, el kit incluye dos o más de estos componentes, p. ej., 3 o 4 o todos los componentes mencionados.
Como se ha mencionado anteriormente, la presente divulgación proporciona compuestos de PEM de fórmula (I), que incluyen compuestos PEM de las fórmulas (la), (Ib), (Ic), (Id), (le), (If), (Ig), (Ih), (li), (Ij), (Ik), (Im), (In), (lo), (Ip), (Iq), (Ir) y (Is). En otra realización, la presente divulgación proporciona compuestos PEM de fórmula (II)
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que pueden asimismo estar presentes en las composiciones de la presente divulgación y se usan en los métodos de la presente divulgación. Los PEM de fórmula (II) pueden, como alternativa, representarse como Ar3(triazol-Ar4)2. En la fórmula (II), Ar3 representa un resto aromático que está sustituido con los dos anillos triazol que se muestran dentro de los paréntesis. Cada anillo de triazol está sustituido con un anillo aromático monocíclico representado por Ar4, donde Ar4 se puede seleccionar entre fenilo y análogos del mismo que contienen N, por ejemplo, piridinilo. Además del grupo triazol, el resto Ar4 de los compuestos de fórmula (II) puede o no estar sustituido con cualquier átomo distinto de hidrógeno. Si Ar4 está más sustituido, el uno o más sustituyentes se pueden indicar como grupos G. En una realización, los grupos G se seleccionan entre uno o cualesquiera dos o más, de los grupos siguientes: EX, E-CO2R, E-CONH2 , E-CHO, E-NR2 y E-OR. En estos grupos G, E se selecciona entre un enlace directo y una cadena alquileno corta, es decir, cadenas alquileno C1-C6, por ejemplo, metileno (es decir, -CH2-), etileno (es decir, -CH2CH2-), propileno (es decir, -CH2CH2CH2-) y butileno (es decir, -CH2CH2CH2CH2-); X es un haluro seleccionado entre fluoruro, cloruro, bromuro y yoduro; y R se selecciona independientemente entre H y grupos alquilo cortos, es decir, grupos alquilo C1-C6. Los compuestos dentro del alcance de la fórmula (II) incluyen quelatos y sales de la estructura mostrada, por ejemplo, los quelatos de cobre de la estructura mostrada están incluidos dentro del alcance de los compuestos divulgados. El análisis siguiente pertenece a compuestos de fórmula (II).
Para los compuestos de fórmula (II), el resto Ar3 es un resto aromático. El resto aromático puede ser un resto aromático carbocíclico o heterocíclico, donde cada uno de los átomos del anillo aromático es carbono en un resto aromático carbocíclico, mientras que al menos uno de los átomos del anillo aromático es nitrógeno, oxígeno o azufre en un resto aromático heterocíclico. Un resto aromático a modo de ejemplo es un resto aromático carbocíclico. El resto carbocíclico puede contener uno (por ejemplo, benceno) o dos (por ejemplo, naftaleno, azuleno) o tres (por ejemplo, acenaftileno, fluoreno) o cuatro (por ejemplo, fluoranteno, aceantrileno) o cinco (por ejemplo, pentaceno, piceno) o seis (por ejemplo, hexaceno) anillos aromáticos, donde, por conveniencia, el grupo Ar3 se puede ejemplificar en el presente documento nombrando la versión sin sustituir del mismo (por ejemplo, benceno) aunque en los compuestos de fórmula (II) el grupo Ar3 es el dirradical correspondiente, es decir, la versión sin sustituir que tiene dos hidrógenos del anillo reemplazados con grupos triazol. Por ejemplo, el resto aromático puede ser un resto carbocíclico monocíclico, es decir, fenilo, también denominado resto aromático C6. Como otro ejemplo, el resto aromático puede ser un resto carbocíclico bicíclico, por ejemplo, naftilo, que es un resto aromático C10.
Para los compuestos de fórmula (II), Ar3 incluye restos aromáticos tanto sustituidos como sin sustituir. En una realización, Ar3 es un resto aromático sustituido. En una realización, Ar3 es un resto aromático no sustituido, que también se puede denominar resto aromático sin sustituir. En el resto aromático sustituido, uno o más átomos de hidrógeno se reemplazan con un sustituyente, por ejemplo, opcionalmente 1 o 2 o 3 o 4 o 5 o 6 de los átomos de hidrógeno se pueden sustituir con un sustituyente. El sustituyente puede ser un grupo alquilo, por ejemplo, un grupo alquilo C1-C6, donde el grupo alquilo puede estar opcionalmente sustituido con uno o más haluros tales como fluoruro para proporcionar un sustituyente haloalquilo. Además, o como alternativa, los sustituyentes a modo de ejemplo se pueden seleccionar entre grupos amino, hidroxi, ciano, carboxi, nitro, tio, alcoxi y halógeno.
Para los compuestos de fórmula (II), un resto aromático a modo de ejemplo es un resto aromático heterocíclico, que también se puede denominar grupo heteroarilo. El resto heterocíclico puede contener uno o dos o tres o cuatro o cinco o seis anillos aromáticos, además de contener 1 o 2 o 3 o 4 o 5 o 6 heteroátomos, es decir, átomos distintos de carbono, seleccionados entre átomos de nitrógeno, azufre y oxígeno. Opcionalmente, el heteroátomo, si está presente, es nitrógeno. Por ejemplo, el resto aromático puede ser un resto heterocíclico monocíclico, por ejemplo, piridinilo, que es un resto aromático C5 de seis miembros, o pirazinilo, que es un resto aromático C4 de seis miembros. Como otro ejemplo, el resto aromático puede ser un resto heterocíclico bicíclico, por ejemplo, quinolinilo o isoquinolinilo, que son restos aromáticos C9 de diez miembros, o 1,5-naftilidinilo, 2,6-naftilidinilo o 2,7-naftilidinilo, que son restos aromáticos C8 de diez miembros a modo de ejemplo.
Por lo tanto, los grupos heteroarilo de los compuestos de fórmula (II) son compuestos de anillo aromático que contienen 5 o más miembros del anillo, de los cuales, uno o más es un heteroátomo tal como, pero no limitado a, N, O y S. Un grupo heteroarilo designado como un heteroarilo C2 puede ser un anillo de 5 miembros con dos átomos de carbono y tres heteroátomos, un anillo de 6 miembros con dos átomos de carbono y cuatro heteroátomos, etc. Asimismo, un heteroarilo C4-puede ser un anillo de 5 miembros con un heteroátomo, un anillo de 6 miembros con dos heteroátomos, etc. El número de átomos de carbono más el número de heteroátomos se suma para igualar el número total de átomos del anillo. Los grupos heteroarilo en la fórmula (II) incluyen, pero no se limitan a, grupos tales como los grupos pirrolilo, pirazolilo, triazolilo, tetrazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, piridinilo, tiofenilo, benzotiofenilo, benzofuranilo, indolilo, azaindolilo, indazolilo, benzoimidazolilo, azabenzoimidazolilo, benzoxazolilo, benzotiazolilo, benzotiadiazolilo, imidazopiridinilo, isoxazolopiridinilo, tianaftalenilo, purinilo, xantinilo, adeninilo, guaninilo, quinolinilo, isoquinolinilo, tetrahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, quinoxalinilo y quinazolinilo. Por lo tanto, las expresiones "heteroarilo" y "grupos heteroarilo" incluyen compuestos de anillos condensados tales como en donde al menos un anillo, pero no necesariamente todos los anillos, son aromáticos, incluyendo tetrahidroquinolinilo, tetrahidroisoquinolinilo, indolilo y 2,3-dihidroindolilo.
El grupo Ar3 en los compuestos de fórmula (II) incluirán un resto aromático como se ha explicado en el presente documento, donde ese resto aromático puede estar opcionalmente sustituido como también se ha descrito en el presente documento, cuya sustitución es además de estar sustituido con dos grupos triazol (triazol-Ar4). Los sustituyentes a modo de ejemplo de Ar3 para los compuestos de fórmula (II) son haluros tales como fluoruro, cloruro y bromuro, grupos alquilo que tienen 1-6 átomos de carbono tales como metilo y etilo, grupos haloalquilo que tienen 1-6 átomos de carbono tales como trifluorometilo, ciano, formilo y carboxamida. Cualesquiera dos carbonos del resto aromático Ar3 puede estar sustituido con el resto triazol-Ar4. Por ejemplo, cuando Ar3 es benceno sustituido, Ar3 puede estar sustituido en las posiciones orto, meta o para, como se muestra a continuación, donde k designa dónde puede tener lugar la sustitución en el resto aromático:
Figure imgf000042_0001
Como otro ejemplo, cuando Ar3 es naftaleno sustituido en un compuesto de fórmula (II), Ar3 puede estar sustituido en cualquiera de los dos átomos de carbono del naftilo, donde las estructuras siguientes muestran las opciones de sustitución, con k mostrando dónde puede tener lugar en el resto aromático la sustitución con triazol
Figure imgf000042_0002
Los ejemplos anteriores ilustraban la sustitución con triazol en el resto Ar3 de los compuestos de fórmula (II) usando grupos carbocíclicos aromáticos Ar3 como un resto Ar3 a modo de ejemplo. Sin embargo, el mismo principio se aplica a la sustitución con triazol en los grupos heterocíclicos aromáticos Ar3 de los compuestos de fórmula (II). Por ejemplo, cuando Ar3 es piridina sustituida, los dos grupos triazol se pueden ubicar en cualquiera de las ubicaciones siguientes en el anillo piridina, donde k se usa para designar las posiciones donde los grupos triazol se pueden ubicar:
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En una realización, el resto aromático Ar3 en los compuestos de fórmula (II) puede comprender 1-6 anillos, donde hasta seis de los átomos del anillo se pueden seleccionar entre oxígeno, azufre y nitrógeno, siendo el resto átomos de carbono. Opcionalmente, el resto aromático Ar3 puede comprender 1-5 anillos, donde hasta cinco de los átomos del anillo se puede seleccionar entre oxígeno, azufre y nitrógeno. Como otra opción, el resto Ar3 puede comprender 1-4 anillos, donde hasta cuatro de los átomos del anillo se puede seleccionar entre oxígeno, azufre y nitrógeno. Como otra opción más, el resto Ar3 puede comprender 1-3 anillos, donde hasta tres de los átomos del anillo se puede seleccionar entre oxígeno, azufre y nitrógeno. Como un ejemplo más, el resto Ar3 puede comprender 1-2 anillos, donde hasta tres de los átomos del anillo se puede seleccionar entre oxígeno, azufre y nitrógeno. En cualquier caso, en los compuestos de fórmula (II), cada anillo puede ser independientemente un anillo de cinco miembros, es decir, cinco átomos en el anillo forman el anillo, o un anillo de seis miembros, o un anillo de siete miembros, mientras que en una opción, cada uno de los anillos es un anillo de cinco o de seis miembros.
Por lo tanto, en una realización a modo de ejemplo, Ar3 en un compuesto de fórmula (II) es una estructura heteroaromática monocíclica seleccionada entre
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en donde los anillos de triazol están sustituidos en las posiciones k de Ar3. En otra realización a modo de ejemplo, Ar3 en un compuesto de fórmula (II) es una estructura carbocíclica monocíclica seleccionada entre
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en donde los anillos de triazol están sustituidos en las posiciones k de Ar3. En otra realización a modo de ejemplo, Ar3 en un compuesto de fórmula (II) es una estructura carbocíclica bicíclica seleccionada entre
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en donde los anillos de triazol están sustituidos en las posiciones k de Ar3. En otra realización, Ar3 en los compuestos de fórmula (II) es una estructura heterocíclica policíclica que tiene dos anillos de seis miembros y un anillo de cinco miembros, y un átomo del anillo nitrógeno, y se selecciona entre
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en donde los anillos de triazol están sustituidos en las posiciones k de Ar3. En otra realización a modo de ejemplo más, Ar3 en los compuestos de fórmula (II) es una estructura heterocíclica policíclica que tiene tres anillos de seis miembros y dos átomos del anillo nitrógeno, y se selecciona entre
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en donde los anillos de triazol están sustituidos en las posiciones k de Ar3.
Cada anillo triazol en los compuestos de fórmula (II) está sustituido con un anillo aromático monocíclico representado por Ar4, donde Ar4 puede ser, por ejemplo, fenilo o piridinilo. Además del grupo triazol, el resto Ar4 puede o no estar sustituido con átomos distintos de hidrógeno. Si Ar4 está más sustituido, el uno o más sustituyentes en los compuestos de fórmula (II) se pueden denominar grupos G. En una realización, los grupos G se seleccionan entre uno o cualesquiera dos o más, de los grupos siguientes: E-X, E-CO2R, E-CONH2 , E-CHO, E-NR2 y E-OR. En estos grupos G, E se selecciona entre un enlace directo y una cadena alquileno corta, es decir, cadenas alquileno C1-C6, por ejemplo, metileno (es decir, -CH2-), etileno (es decir, -CH2CH2-), propileno (es decir, -CH2CH2CH2-) y butileno (es decir, -CH2CH2CH2CH2-); X es un haluro seleccionado entre fluoruro, cloruro, bromuro y yoduro; y R se selecciona independientemente entre H y grupos alquilo cortos, es decir, grupos alquilo C1-C6.
Los compuestos se pueden preparar por métodos conocidos por un experto habitual en la materia, donde dichos métodos se pueden identificar mediante diversas bases de datos y libros de referencia. Los libros de referencia y tratados adecuados que detallan la síntesis de los reactivos útiles en la preparación de los compuestos de la presente divulgación, o proporcionan referencias a artículos que describen la preparación, incluyen, por ejemplo, "Synthetic Organic Chemistry," John Wiley & Sons, Inc., Nueva York; S. R. Sandler et al., "Organic Functional Group Preparations," 2a ed., Academic Press, Nueva York, 1983; H. O. House, "Modem Synthetic Reactions", 2a ed., W. A. Benjamin, Inc. Menlo Park, Calif 1972; T. L. Gilchrist, "Heterociclic Chemistry", 2a ed., John Wiley & Sons, Nueva York, 1992; J. March, "Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms and Structure," 4 a ed., Wiley-Interscience, Nueva York, 1992. Otros libros de referencia y tratados adecuados que detallan la síntesis de los reactivos útiles para la preparación de los compuestos de la presente divulgación, o proporcionan referencias a artículos que describen la preparación, incluyen, por ejemplo, Fuhrhop, J. y Penzlin G. "Organic Synthesis: Concepts, Methods, Starting Materials", segunda edición, revisada y ampliada (1994) John Wiley & Sons ISBN: 3­ 527-29074-5; Hoffman, R. V. "Organic Chemistry, An Intermediate Text" (1996) Oxford University Press, ISBN 0-19­ 509618-5; Larock, R. C. "Comprehensive Organic Transformations: A Guide to Functional Group Preparations" 2a edición (1999) Wiley-VCH, ISBN: 0-471-19031-4; March, J. "Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure" 4 a edición (1992) John Wiley & Sons, ISBN: 0-471-60180-2; Otera, J. (editor) "Modern Carbonil Chemistry" (2000) Wiley-vCH, iSb N: 3-527-29871-1; Patai, S. "Patai's 1992 Guide to the Chemistry of Functional Groups" (1992) Interscience ISBN: 0-471-93022-9; Quin, L. D. et al. "A Guide to Organofosforus Chemistry" (2000) Wiley-Interscience, ISBN: 0-471-31824-8; Solomons, T. W. G. "Organic Chemistry" 7 a edición (2000) John Wiley & Sons, ISBN: 0-471-19095-0; Stowell, J. C., "Intermediate Organic Chemistry" 2a edición (1993) Wiley-Interscience, ISBN: 0-471-57456-2; "Industrial Organic Chemicals: Starting Materials and Intermediates: An Ullmann's Enciclopedia" (1999) John Wiley & Sons, ISBN: 3-527-29645-X, en 8 volúmenes; "Organic Reactions" (1942-2000) John Wiley & Sons, en más de 55 volúmenes; y "Chemistry of Functional Groups" John Wiley & Sons, en 73 volúmenes.
Ejemplos
Los compuestos que se muestran en la tabla 7 se prepararon según los ejemplos generales divulgados en el presente documento.
Materiales y métodos. El ácido 4-azido salicílico y el ácido 2,6-dibromo-4-piridin carboxílico eran de Toronto Research Chemicals, Inc. (Toronto, ON, Canadá). El ácido 7-amino-2-hidroxi-1,8-naftiridin-4-carboxílico de Enamina LLC (Monmouth, NJ). La tris[(1 -bencil-1 H-1,2,3-triazol-4-il)metil]amina (TBTA), hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio (HATU), 1,3-dietinilbenceno, 2,6-dietinilpiridina, 3,5-dietinilpiridina, 3,6-dietinilcarbazol, ácido 4-azidobenzoico eran de TCI America (Portland, OR, EE.UU.). La 4-metoxi-2,6-dibromopiridina, 4-nitro-2,6-dibromopiridina y ácido 2,6-dibromo-4-piridincarboxílico eran de Chem-Impex International, Inc. (Wood Dale, IL). La 4-ciano-2,6-dibromopiridina era de Ark Pharm, Inc. (Arlington Heights, IL). Tetrakis(trifenilfosfina)paladio (0), etiniltrimetilsilano, DMSO, ascorbato de sodio, sulfato de cobre, 2,6-dicloropiridin-4-carboxilato de metilo, 2,6-dibromopiridin-4-carboxilato de etilo, 4-metil-2,6-dicloropiridina, 2-cloro-4-cianopiridina, ácido 4-amino-2-(trifluorometil)benzoico, 2-bromo-4-cianopiridina, acetato de metilazido, clorhidrato de 4-azidoanilina, 4-metoxifenil azida y EDTA eran de Sigma-Aldrich Corp. (St. Louis, MO, EE.UU.). Los disolventes de la TLC y la cromatografía ultrarrápida eran de Sigma-Aldrich o Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, MA, EE. UU.). La cromatografía ultrarrápida se realizó en un sistema de purificación Reveleris Prep de Buchi Corp. (New Castle, DE). El sistema se equipó con una columna empaquetada a mano (2,3 cm de diámetro x 8 m de altura) llena con gel de sílice C18 Spherical (n.° de cat. 76646-01) de Sorbent Technologies, Inc (Norcross, GA) y se selló con fritas de polipropileno. Las muestras de 1 a 1,5 ml se cargaron directamente en la parte superior de la columna. Las fases móviles fueron agua (A) y acetonitrilo (B). Un gradiente del 0 al 2 % de B en 2 minutos seguido del 2 al 100 % de B en 20 minutos a un caudal de 28 ml/min. La UV se controló a 220 nm, 260 nm y 280 nm. Las fracciones se recogieron a un umbral UV de 0,1 AU. La cromatografía en capa fina se realizó con TLC Silica Gel 60 F254 con respaldo de aluminio. (n.° de cat. 1.05534.0001) de EMD Millipore Corp. (Billireca, MA, EE. UU.).
T l 7
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(continuación)
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EJEMPLO 1
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El compuesto 1 mostrado anteriormente se preparó mezclando el ácido 4-azidosalicílico B (1,79 mg, 10 μmol) y la 2,6-dietinilpiridina A (0,67 mg, 5 μmol) en DMSO (150 μl). Esta solución se mezcló con una solución de t BtA (5,1 mg, 0,96 μmol) y ascorbato sódico 6,4 mg, 32 μmol) en DMSO (95 μl). La reacción click se inició mediante la adición de sulfato de cobre 20 mM (5 μl) con agitación. La extensión de la reacción se analizó mediante TLC (94:5:1 de acetato de etilo:metanol:ácido acético) y la reacción se completó en 5 minutos basándose en el consumo de la azida y el alquino. Se llevó el volumen de la mezcla de reacción a 1 ml con DMSO y EDTA 0,5 M (100 μl). Los sólidos se aislaron y se disolvieron en más DMSO. Las soluciones en DMSO se combinaron y se purificó por cromatografía ultrarrápida como se ha descrito anteriormente en Materiales y métodos. El producto formó un sólido vidrioso después de evaporación rotatoria con un rendimiento del 50 al 75 %. RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6) ó ppm 3,29 (2H, s a, (O(18)H y O(33)H)), 7,17-7,29 (4H, m, (C(7)H, C(11)H, C(28)H, C(32)H)) 7,85 (2H, d, J = 8,11 (C(10)H y C(31)H)), 8,06 (3H, s, (C(15)H, C(16)H, C(17)H)) 9,36 (2H, s, (C(5)H y C(25)H)).
EJEMPLO 2
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El compuesto 2 mostrado anteriormente se preparó usando el ácido 4-azidosalicílico B y la 3,5-dietinilpiridina C según el método del ejemplo 1. RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6) • ppm 3,29 (2H, s a, (O(18)H y O(33)H)) 7,17-7,29 (4H, m, (C(7)H, C(11)H, C(28)H, C(31)H)) 7,85 (2H, d, J = 8,11 Hz, (C(10)H y C(31)H)) 8,06 (3H, s, , (C(13)H, C(15)H, C(17)H)) 9,36 (2H, s, (C(5)H y C(25)H)).
EJEMPLO 3
Figure imgf000060_0001
El compuesto 3 mostrado anteriormente se preparó usando el ácido 4-azidosalicílico B y el 1,3-dietinilbenceno D según el método del ejemplo 1. RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6) • ppm 3,29 (2H, s a, (O(18)H y O(33)H)) 7,16-7,27 (4H, m, (C(7)H, C(11)H, C(28)H, C(32)H)) 7,57-7,67 (1H, m, (C(16)H)) 7,80-7,88 (2H, m, (C(10)H y C(31)H)) 7,94 (2H, d, J = 7,63 Hz, (C(15)H y C(17)H) 8,57(1H, s, (C(13)H)) 9,35 (2H, s, (C(5)H y C(25)H).
EJEMPLO 4
Figure imgf000060_0002
El compuesto 4 mostrado anteriormente se preparó usando el ácido 4-azidosalicílico B y el 3,6-dietinilcarbazol E según el método del ejemplo 1. RMN 1H (300 MHz, DMSO-d6) ó ppm 3,29 (2H, s a, (O(25)H y O(40)H)) 7,16-7,27 (4H, m, (C(7)H, C(11)H, C(35)H, C(39)H)) 7,61 (2H, d, J = 8,34 Hz, (C(10)H y C(38)H)) 7,84 (2H, d, J = 7,87 Hz, (C(22)H y C(24)H)) 8,02 (2H, d, J = 8,34 Hz, (C(21)H y C(23)H)) 8,79 (2H, s, (C(13)H y C(19)H)) 9,28 (2H, s, (C(5)H y C(32)H)) 11,53 (1H, s, (N(16)H).
EJEMPLO 5
Figure imgf000061_0001
El compuesto 5 mostrado anteriormente se preparó usando el clorhidrato de 4-azidoanilina F y el 3,6-dietinilcarbazol E según el método del ejemplo 1.
EJEMPLO 6
Figure imgf000061_0002
El compuesto 6 mostrado anteriormente se preparó usando el ácido 4-azidobenzoico G y el 3,6-dietinilcarbazol E según el método del ejemplo 1.
EJEMPLO 7
Figure imgf000061_0003
El compuesto 7 mostrado anteriormente se preparó usando el 4-azidoanisol H y el 3,6-dietinilcarbazol E según el método del ejemplo 1.
EJEMPLO 8
Figure imgf000062_0001
El compuesto 8 mostrado anteriormente se preparó usando el azidoacetato de metilo I y el 3,6-dietinilcarbazol E según el método del ejemplo 1.
EJEMPLO 9
Figure imgf000062_0002
La preparación del compuesto 9 mostrado anteriormente comenzó con la síntesis de la 4-metoxi-2,6-dietinilpiridina J a partir de 4-metoxi-2,6-dibromopiridina y etiniltrimetilsilano usando las condiciones de Sonogashira descritas en Organomet. Chem., 653: 46-49(2002). doi:10.1016/s0022-328x(02)01158-0.) La síntesis del compuesto 9 se completó por reacción click del ácido 4-azidosalicílico B y el compuesto J según el método del ejemplo 1.
EJEMPLO 10
Figure imgf000063_0001
La preparación del compuesto 10 mostrado anteriormente comenzó con la síntesis de la 4-ciano-2,6-dietinilpiridina K a partir de 4-ciano-2,6-dibromopiridina y etiniltrimetilsilano usando las condiciones de Sonogashira descritas en Organomet. Chem., 653: 46-49 (2002). doi:10.1016/s0022-328x(02)01158-0.) La síntesis del compuesto 10 se completó por reacción click del ácido 4-azidosalicílico B y el compuesto K según el método del ejemplo 1.
EJEMPLO 11
Figure imgf000063_0002
La preparación del compuesto 11 mostrado anteriormente comenzó con la síntesis de la 4-nitro-2,6-dietinilpiridina L a partir de 4-nitro-2,6-dibromopiridina y etiniltrimetilsilano usando las condiciones de Sonogashira descritas en Organomet. Chem., 653: 46-49 (2002). doi:10.1016/s0022-328x(02)01158-0.) La síntesis del compuesto 11 se completó por reacción click del ácido 4-azidosalicílico B y el compuesto L según el método del ejemplo 1.
Figure imgf000064_0001
El compuesto 12 mostrado anteriormente se preparó usando el ácido 5-azidosalicílico M y la 4-ciano-2,6-dietinilpiridina K según el método del ejemplo 10.
EJEMPLO 13
Figure imgf000064_0002
El compuesto 13 mostrado anteriormente comenzó con la síntesis de la 4-metil-2,6-dietinil piridina N a partir de 4-metil-2,6-dicloropiridina y etiniltrimetilsilano usando Sonogashira descrita en Organomet. Chem., 653: 46-49 (2002). doi:10.1016/s0022-328x(02)01158-0.) La síntesis del compuesto 11 se completó por reacción click del ácido 4­ azidosalicílico B y la 4-metil-2,6-dietinilpiridina N según el método del ejemplo 1.
EJEMPLO 14
Figure imgf000065_0001
El compuesto 14 mostrado anteriormente comenzó con la síntesis del 2,6-dietinilpiridin-4-carboxilato de etilo O a partir del 2,6-dibromopiridin-4-carboxilato de etilo y etiniltrimetilsilano usando Sonogashira descrita en Organomet. Chem., 653: 46-49 (2002). doi:10.1016/s0022-328x(02)01158-0.) La síntesis del compuesto 14 se completó por reacción click del ácido 4-azidosalicílico B y el 2,6-dietinilpiridin-4-carboxilato de etilo O según el método del ejemplo 1.
EJEMPLO 15
Figure imgf000065_0002
El compuesto 15 mostrado anteriormente se preparó usando el ácido 5-azidosalicílico M y 2,6-dietinilepiridin-4-carboxilato de etilo O por reacción click según el método del ejemplo 14.
EJEMPLO 16
Figure imgf000066_0001
El compuesto 16 mostrado anteriormente comenzó con la síntesis del 2,6-d¡et¡n¡lpir¡d¡n-4-carbox¡lato de metilo P a partir de 2,6-dicloropiridin-4-carboxilato de metilo y etiniltrimetilsilano usando Sonogashira descrita en Organomet. Chem., 653: 46-49(2002). doi:10.1016/s0022-328x(02)01158-0.) La síntesis del compuesto 16 se completó por reacción click del ácido 4-azidosalicílico B y el 2,6-dietinilpiridin-4-carboxilato de metilo P según el método del ejemplo 1.
EJEMPLO 17
Figure imgf000066_0002
La síntesis del compuesto 17 (mostrado anteriormente) comenzó mezclando ácido 2,6-dibromo-4-piridin carboxílico (0,2 g, 0,71 mmol), DIPEA (0,18 g, 1,42 mmol) y HATU (0,27 g, 0,71 mmol) en DMF (900 ul). Se añadió etil amina (0,154 ml, 1,78 mmol) inmediatamente y se mezcló durante 1 hora. La reacción se completó mediante TLC y se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice usando un gradiente de acetato de etilo/hexano. Se aisló N-etil-2,6-dibromo-4-carboxamida en forma de un sólido de color amarillo con un rendimiento del 69 %. La N-etil-2,6-dietinil-4-carboxamida Q se fabricó con etiltrimetilsilano usando el método de Sonogashira descrito en el ejemplo 16. La síntesis del compuesto 17 se completó por reacción click del ácido 4-azidosalicílico B y la N-etil-2,6-dietinil-4-carboxamida Q según el método del ejemplo 1.
EJEMPLO 18
Figure imgf000067_0001
El compuesto 18 mostrado anteriormente se preparó con metil amina para formar la amida según el método del ejemplo 17.
EJEMPLO 19
Figure imgf000067_0002
El compuesto 19 mostrado anteriormente se preparó con amoniaco para formar la amida según el método del ejemplo 17.
EJEMPLO 20
Figure imgf000067_0003
El compuesto 20 mostrado anteriormente se inició con la síntesis de la 2,6-dietinilpirazina T a partir de 2,6-dicloropirazina y etiniltrimetilsilano usando el método Sonogashira descrito en App. Organomet. Chem. 31(12):e3824 (2017) DOI:10.1002/aoc.3824. La síntesis del compuesto 20 se completó por reacción click del ácido 4-azidosalicílico B y la 2,6-dietinilpirazina T según el método del ejemplo 1.
EJEMPLO 21
Figure imgf000068_0001
La síntesis del compuesto 73 mostrado anteriormente comenzó con la diazotización del ácido 4-amino-2-(trifluorometil)benzoico con nitrito sódico y ácido sulfúrico seguido de desplazamiento nucleófilo con azida (Org. Synth. 1942, 22, 96 DOI:10.15227/orgsyn.022.0096) parar formar el ácido 4-azido-2-(trifluorometil)benzoico (U) que se purificó por cromatografía ultrarrápida. La síntesis del compuesto 73 se completó por reacción click del ácido 4-azido-2-(trifluorometil)benzoico U y la N-etil-2,6- dietinil-4-carboxamida Q según el ejemplo 1.
EJEMPLO 22
Figure imgf000068_0002
La síntesis del compuesto 74 mostrado anteriormente comenzó con la diazotización del ácido 7-amino-2-hidroxi-1,8-naftiridin-4-carboxílico con nitrito sódico y ácido sulfúrico seguido de desplazamiento nucleófilo con azida (Org. Synth. 1942, 22, 96 DOI:10.15227/orgsyn.022.0096) para formar el ácido 7-azido-2-hidroxi-1,8-naftiridin-4-carboxílico (V) que se purificó por cromatografía ultrarrápida. La síntesis del compuesto 74 se completó por reacción click del ácido 7-azido-2-hidroxi-1,8-naftiridin-4-carboxílico V y la N-etil-2,6-dietinil-4-carboxamida Q según el ejemplo 1.
EJEMPLO 23
Figure imgf000069_0001
La síntesis del compuesto 28 se completó en dos etapas. Primero, el 2,6-dietinilbenceno D se sometió a reacción click con la mitad de la cantidad estequiométrica del ácido 4-azidosalicílico B según el método del ejemplo 3 para fabricar ácido 4-(4-(3-etinilfenil)-1 H-1,2,3-triazol-1 -il)-2-hidroxibenzoico. La segunda etapa se sometió a reacción click del ácido 4-azidobenzoico G según el método del ejemplo 1 para dar el ácido 4-(4-(3-(1-(4-carboxifenil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)fenil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)-2-hidroxibenzoico 28.
EJEMPLO 24
Figure imgf000069_0002
La preparación del compuesto 43 mostrado anteriormente comenzó con la síntesis de la 4-ciano-2-etinilpiridina W a partir de 4-ciano-2-cloropiridina y etiniltrimetilsilano usando condiciones de Sonogashira descritas en Organomet. Chem., 653: 46-49 (2002). doi:10.1016/s0022-328x(02)01158-0.) La síntesis del compuesto 43 se completó por reacción del ácido 4-azidosalicílico B y el compuesto W según el método del ejemplo 1.
EJEMPLO 25
Figure imgf000070_0001
La preparación del compuesto 31 mostrado anteriormente comenzó con la síntesis de la 2,6-bis(yodoetinil)piridina X a partir de la 2,6-dietinilpiridina A siguiendo el método de Tepper et. al, Org. Lett., 2015, 17 (23), pp 5740-574 DOI:10.1021/acs.orglett.5b02760 que implicó tratamiento con n-yodosuccinimida y nitrato de plata y se asiló por cromatografía ultrarrápida. La síntesis del compuesto 31 se completó por reacción click del ácido 4-azidosalicílico B y el compuesto X según el método del ejemplo 1.
EJEMPLO 26
Figure imgf000070_0002
El compuesto 30 mostrado anteriormente se inició con la síntesis de la 2,6-dietinil-3,5-dimetilpiridina Y a partir de 2,6-dibromo-3,5-dimetilpiridina y etiniltrimetilsilano usando el método Sonogashira descrito en App. Organomet. Chem. 31(12):e3824 (2017) DOI:10.1002/aoc.3824. La síntesis del compuesto 30 se completó por reacción click del ácido 4-azidosalicílico B y la 2,6-dietinil-3,5-dimetilpiridina Y según el método del ejemplo 1.
EJEMPLO 27
Figure imgf000071_0001
El compuesto 33 mostrado anteriormente se inició con la síntesis del 9-acetil-3,6-dietinilcarbazol Z a partir de 9-acetil-3,6- diyodocarbazol y etiniltrimetilsilano usando el método de Sonogashira descrito en App. Organomet. Chem.
31(12):e3824 (2017) DOI:10.1002/aoc.3824. La síntesis del compuesto 33 se completó por reacción click del ácido 4-azidosalicílico B y el 9-acetil-3,6-dietinilcarbazol Z según el método del ejemplo 1.
EJEMPLO 28
Figure imgf000071_0002
La síntesis del compuesto 34 (mostrado anteriormente) comenzó mezclando 4-azidosalicilato de N-hidroxisuccinimida (40 mg, 0,145 mmol) en DMF (72 ul), a esto se le añadió clorhidrato de hidroxil amina (30 mg, 0,43 mmol) en agua (72 ul) y se mezcló durante una noche. Se detectó el producto por TLC y la reacción se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice usando un gradiente de cloruro de metileno y cloruro de metileno-MeOH. Se aisló la 4-azido-N,2-dihidroxibenzamida AA con un rendimiento del 57 %. La síntesis del compuesto 34 se completó por reacción click de la 4-azido-N,2-dihidroxibenzamida AA y la 2,6-dietinilpiridina A según el método del ejemplo 1.
EJEMPLO 29
Figure imgf000072_0001
La síntesis del compuesto 44 mostrado anteriormente comenzó con la diazotización del ácido 5-amino-2-hidroxi-3-metilbenzoico con nitrito sódico y ácido sulfúrico seguido de desplazamiento nucleófilo con azida (Org. Synth. 1942, 22, 96 DOI:10.15227/orgsyn.022.0096) para formar el ácido 5-azido-2-hidroxi-3-metilbenzoico (BB) que se purificó por cromatografía ultrarrápida. La síntesis del compuesto 44 se completó por reacción del ácido 5-azido-2-hidroxi-3-metilbenzoico BB con el 2,6-dietinilpiridin-4-carboxilato P según el ejemplo 1.
EJEMPLO 30
Figure imgf000072_0002
La síntesis del compuesto 47 (mostrado anteriormente) comenzó mezclando ácido 2,6-dibromo-4-piridin carboxílico (0,2 g, 0,71 mmol), DIPEA (0,18 g, 1,42 mmol) y HATU (0,27 g, 0,71 mmol) en DMF (900 ul). Se añadió butinil amina (0,154 ml, 1,78 mmol) inmediatamente y se mezcló durante 1 hora. La reacción se completó mediante TLC y se purificó por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice usando un gradiente de acetato de etilo/hexano. Se aisló N-(but-3-in-1-il)-2,6-dibromoisonicotinamida en forma de un sólido. Se fabricó la N-(but-3-in-1-il)-2,6-dietinilisonicotinamida CC con etiltrimetilsilano usando el método de Sonogashira descrito en el ejemplo 16. La síntesis del compuesto 47 se completó por reacción click del ácido 4-azidosalicílico B y la N-(but-3-in-1-il)-2,6-dietinilisonicotinamida CC según el método del ejemplo 1.
EJEMPLO 31
Figure imgf000073_0001
El compuesto 63 mostrado anteriormente se inició con la síntesis del 2,7-dietinilnaftaleno DD a partir de 2,7­ dibromonaftaleno y etiniltrimetilsilano usando el método Sonogashira descrito en App. Organomet. Chem.
31(12):e3824 (2017) DOI:10.1002/aoc.3824. La síntesis del compuesto 63 se completó por reacción click del ácido 4-azidosalicílico B y el 2,7-dietinilnaftaleno DD según el método del ejemplo 1.
EJEMPLO 32
Figure imgf000073_0002
El compuesto 64 mostrado anteriormente se inició con la síntesis del 2,3-dietinilnaftaleno EE a partir de 2,3-dibromonaftaleno y etiniltrimetilsilano usando el método Sonogashira descrito en App. Organomet. Chem.
31(12):e3824 (2017) DOI:10.1002/aoc.3824. La síntesis del compuesto 64 se completó por reacción click del ácido 4-azidosalicílico B y el 2,3-dietinilnaftaleno EE según el método del ejemplo 1.
EJEMPLO 33
Figure imgf000074_0001
El compuesto 71 mostrado anteriormente se inició con la síntesis de ácido 2,6-dietinil-4-piridin carboxílico a partir de ácido 2,6-dibromo-4-piridin carboxílico y etiniltrimetilsilano usando el método Sonogashira descrito en App. Organomet. Chem. 31(12):e3824 (2017) DOI:10.1002/aoc.3824. Se trató ácido 2,6-dietinil-4-piridin carboxílico con HATU, DIPEA y 1,4-diaminobutano para dar la N,N'-(butan-1,4-diil)bis(2,6-dietinilisonicotinamida) (FF) después de aislamiento por cromatografía ultrarrápida. La síntesis del compuesto 71 se completó por reacción click del ácido 4-azidosalicílico B y la N,N'-(butan-1,4-diil)bis(2,6-dietinilisonicotinamida) (FF) según el método del ejemplo 1.
EJEMPLO 34
Figure imgf000075_0001
La síntesis del compuesto 72 mostrado anteriormente comenzó con la diazotización de ácido 4-amino-3,5,6-tricloropiridin-2-carboxílico con nitrito sódico y ácido sulfúrico seguido de desplazamiento nucleófilo con azida (Org. Synth. 1942, 22, 96 DOI:10.15227/orgsyn.022.0096) para formar el ácido 4-azido-3,5,6-tricloropiridin-2-carboxílico (GG) que se purificó por cromatografía ultrarrápida. La síntesis del compuesto 72 se completó por reacción click del ácido 4-azido-3,5,6-tricloropiridin-2-carboxílico GG con la N-etil-2,6-dietinil-4-carboxamida Q según el ejemplo 1. EJEMPLO 35
EXPLORACIÓN DE LAS PEM PARA MEJORAR LA POLIMERIZACIÓN DE XNTP
La metodología de secuenciación por expansión (SBX) desarrollada por los inventores proporciona mejoras de rendimiento significativas en la eficiencia de lectura de secuencias y la precisión de los expandómeros en relación con el ADN nativo. Sin embargo, la transcripción inicial de la secuencia del molde de ADN natural en el expandómero medible se basa en la capacidad de la ADN polimerasa para utilizar los XNTP como sustratos (la estructura generalizada de un XNTP se analiza en el presente documento con referencia a las figuras 1A y 2). Los inventores han descubierto que la mayoría de las ADN polimerasas no polimerizan de manera eficaz los XNTP. En un intento por mejorar la eficacia y precisión de la polimerización de XNTP en expandómeros, se exploraron varias PEM en cuanto a su capacidad para mejorar las reacciones de extensión de cebador de la a Dn polimerasa utilizando, como sustrato, los XNTP.
Una reacción de extensión de cebador representativa puede incluir los siguientes reactivos: cebador 2 pmol, molde oligonucleotídico de 2,2 pmol de 45 meros, 50 pmol de cada XNTP (XATP, XCTP, XGTP y XTTP), Tris-HCl 50 mM, pH 6,79, NaCl 200 mM, PEG al 20 %, NMS al 5 %, polifosfato 60.19 0,5 nmol, MnCl20,3 mM y 0,6 μg de proteína ADN polimerasa recombinante purificada. Las reacciones pueden realizarse durante 1 hora a 23 °C. Los productos de reacción (es decir, expandómeros restringidos) se tratan para escindir los enlaces de fosforamidato, generando así expandómeros linealizados. Los productos de reacción pueden analizarse mediante electroforesis en gel en geles de acrilamida al 4-12 % para resolver y visualizar productos de expandómero de diferentes longitudes. Para la exploración de las PEM descrita anteriormente, las PEM se analizaron normalmente en el intervalo de micro a milimolar.
Sorprendentemente, se observó que varias PEM mejoraban significativa y reproduciblemente la extensión de cebador mediada por la ADN polimerasa con los XNTP. Los geles representativos que demuestran esta mejora se presentan en las figuras 4 y 5. Con referencia a la figura 4, como puede observarse en el carril 1 (sin aditivo PEM), la ADN polimerasa extiende el cebador unido al molde con hasta solo aproximadamente 14 XNTP en estas condiciones. Sin embargo, la adición de determinadas PEM a la reacción de extensión de cebador permite que la polimerasa sintetice productos de extensión considerablemente más largos, como puede observarse, p. ej., en los carriles 3 (compuesto 4), 7 (compuesto 3) y 9 (compuesto 1). En cambio, varios compuestos aromáticos diferentes tuvieron poco o ningún efecto sobre la polimerización de XNTP (véanse, p. ej., los carriles 2, 4 - 6 y 8), lo que indica que la actividad PEM es específica para los compuestos 1,3 y 4.
De manera similar, con referencia a la figura 5, en ausencia de aditivo PEM, la ADN polimerasa muestra una moderada actividad de extensión de cebador con los XNTP (carril 1, sin aditivo PEM), mientras que la adición del compuesto 2 a varias concentraciones (carriles 8-10) mejora significativamente la actividad de extensión de cebador.
De nuevo, esta actividad PEM es específica para el compuesto 2, ya que otros compuestos aromáticos no relacionados no tuvieron efecto (carriles 2 - 7).
EJEMPLO 36
LAS PEM MEJORAN LA SECUENCIACIÓN POR EXPANSIÓN (SBX)
Para investigar la precisión de la mejora dependiente de PEM de la polimerización XNTP, se secuenciaron productos de extensión de cebador utilizando el protocolo SBX. Resumiendo, los productos de expandómero restringidos de la polimerización XNTP se escinden para generar expandómeros linealizados. Esto se logra inactivando primero la reacción de extensión con una solución que contenga EDTA 100 mM, THPTA 2 mM y Tween-20 al 2 %. Después, la muestra se somete a modificación de amina con una solución de NaHCO31 M y anhídrido succínico 1 M en DMF. La escisión de los enlaces fosforamidato se lleva a cabo con HCl al 37 % y los expandómeros linealizados se purifican con columnas QIAquick (QIAGEN, Inc.).
Para la secuenciación, se preparan nanoporos de proteína insertando a-hemolisina en un miembro de bicapa de DPhPE/hexadecano en tampón B 1, que contiene NH4Cl 2 M y HEPES 100 mM, pH 7,4. El pocillo cis se perfunde con tampón B2, que contiene NH4Cl 0,4 M, GuCl 0,6 M y HEPES 100 mM, pH 7,4. La muestra de expandómero se calienta a 70 °C durante 2 minutos, se enfría completamente, y después se añade una muestra de 2 μl al pocillo cis. A continuación, se aplica un pulso de voltaje de 90 mV/390 mV/10 ps y los datos se adquieren a través del programa informático de adquisición Labview.
Los datos de secuencia se analizan mediante la visualización del histograma de la población de lecturas de secuencia de una sola reacción SBX. El programa informático de análisis alinea cada lectura de secuencia con la secuencia del molde y recorta la extensión de la secuencia al final de las lecturas que no se alinean con la secuencia del molde correcta. En la figura 6A (control sin aditivos) y en la figura 6B (SBX en presencia del compuesto PEM 1) se presentan histogramas representativos de la secuenciación SBX de un molde de 45 meros. Como puede observarse, en ausencia de compuesto 1, las lecturas de secuencia no son precisas más allá de la base 18 del molde. Particularmente, la adición del compuesto 1 a la reacción SBX aumentó la precisión de las lecturas de secuencia en toda la longitud del molde de 45 meros.
Estos resultados inspiraron experimentos adicionales para probar la capacidad del compuesto de PEM 1 para mejorar la SBX de moldes incluso más largos. Las figuras 7A y 7B muestran histogramas de secuenciación SBX de moldes 60 y 80 meros, respectivamente. Sorprendentemente, el compuesto 1 permitió una lectura precisa de la secuencia hasta el final de cada uno de estos moldes más largos. Estos resultados demuestran una mejora sólida y precisa de la actividad de polimerización de XNTP mediante una nueva PEM que aumenta considerablemente la capacidad de SBX para proporcionar información de secuencias de ácidos nucleicos basada en nanoporos.
EJEMPLO 37
LAS PEM PERMITEN LA SÍNTESIS DE PRODUCTOS DE EXPANDÓMERO LARGOS
Tras el éxito de replicar con precisión moldes de hasta 80 nucleótidos de longitud en expandómeros, se llevaron a cabo reacciones de polimerización de XNTP utilizando cuatro moldes más largos, que consistían en 88, 127, 227 y 277 nucleótidos de longitud. Una variante de la ADN polimerasa DPO4, denominada C4552 (SEQ ID NO: 1), se utilizó en estas reacciones de polimerización y las condiciones de reacción se optimizaron con respecto a la actividad de C4552 en presencia del compuesto de PEM 1. Otras variantes adecuadas de la polimerasa DPO4 incluyen, pero sin limitación, las de las SEQ ID NO: 2-5. Además del compuesto 11 mM, los aditivos de reacción incluían urea 1 mM y proteína de unión monocatenaria (Eco SSB) 2,75 μg. Las reacciones de extensión se llevaron a cabo con un molde 0,85 pmol, con un cebador oligonucleotídico 0,5 pmol y con cada uno de los XNTP 1 nmol en un volumen final de 10 μl. Las reacciones se realizaron en un tampón compuesto por TrisCl 50 mM, pH 8,84, NH4OAc 200 mM y PEG8K al 20 % complementado con NMS al 5 %, polifosfato PP-60.20 en cantidades de 3 o 4 nmol y MnCh 2 mM. Se utilizaron 1,2 μg de proteína ADN polimerasa recombinante purificada en cada reacción de extensión y las reacciones se llevaron a cabo durante 1-2 horas a 23 °C. En la figura 8 se muestran los resultados de las reacciones de extensión representativas que utilizan los moldes más largos. Particularmente, en presencia del compuesto 1, la polimerasa pudo polimerizar los XNTP para generar copias completas de expandómero de cada molde más largo, que variaba de 88 (carriles 1 y 6) a 277 (carriles 5 y 10) nucleótidos de longitud. Los carriles 1-5 y 6-10 representan las mismas reacciones de extensión con la excepción de la cantidad de aditivo PP-60.20, que fue de 3 nmol en los carriles 1-5 y de 4 nmol en los carriles 6-10. Estos resultados subrayan las sorprendentes ventajas conferidas por el compuesto 1 en reacciones que requieren la polimerización de análogos de nucleótidos no naturales, sumamente sustituidos, por la ADN polimerasa y sugieren que este compuesto, así como otras PEM, podrían ampliar enormemente el potencial del protocolo de secuenciación SBX.
EJEMPLO 38
LAS PEM DE NUEVA GENERACIÓN MEJORAN LA POLIMERIZACIÓN DE LOS XNTP PARA GENERAR PRODUCTOS DE EXPANDÓMERO LARGOS
Basándose en las propiedades ventajosas observadas con el compuesto PEM 1, se diseñó una nueva generación de compuestos de PEM con el objetivo de mejorar determinadas propiedades, incluyendo, pero sin limitación, la solubilidad en agua de las moléculas. En los ejemplos 9-34 y en la tabla 7 se describen estructuras de PEM de nueva generación representativas.
La actividad PEM de los compuestos 9-11 se probó en ensayos de extensión de cebador utilizando tres moldes de 100 meros, derivados de los genomas del HIV1, 2 y 3. Las reacciones de extensión de cebador incluyeron los siguientes reactivos: TrisCl 75 mM, pH 8,44, NH4OAc 175 mM, PEG8K al 20 %, NMS al 5 %, PP-60.20 0,8 nmol, MnCl2 0,6 mM, proteína de unión monocatenaria (SSB) Tth 2,3 |jg, urea 0,5 M o 1 M, 200 pmol de cada XNTP, molde 1,1 pmol, cebador oligonucleotídico 1 pmol, ADN polimerasa C4552 recombinante purificada 1,2 jg y PEM 0,5 mM. Durante 30 minutos, se llevaron a cabo reacciones de extensión de cebador 10 j l a 23 °C y los productos de reacción se analizaron mediante electroforesis en gel. En la figura 9 se presenta un gel representativo que muestra los productos de extensión de cebador. Como se muestra en los carriles 1 (molde del HlV1), 2 (molde del HIV2) y 4 (molde del HIV3, sin SSB y urea 1 M), el compuesto 1 permite la polimerización de los XNTP en copias de expandómero de longitud completa de los tres moldes diferentes de 100 meros (la flecha indica la posición de la migración del gel del molde de 100 meros). Del mismo modo, cada uno de los compuestos 9 (carriles 13-16), 10 (carriles 9-12) y 11 (carriles 5-8), permiten la polimerización de XNTP al menos de una manera tan eficaz como la del compuesto 1 en cada uno de los tres moldes diferentes de 100 meros. Estos resultados sugieren que la actividad PEM puede optimizarse aumentando varias propiedades fisicoquímicas de los compuestos, tal como la solubilidad en agua.
La actividad PEM del compuesto 12 se probó en ensayos de extensión de cebador utilizando el molde del HIV2 de 100 meros. Las reacciones de extensión de cebador incluyeron los siguientes reactivos: TrisCl 50 mM, NH4OAc 200 mM, PEG8K al 20 %, NMS al 5 %, PP-60.20 0,6 nmol, MnCl2 0,6 mM, proteína de unión monocatenaria (SSB) Eco 2,75 jg /jl, urea 1 M, 50 pmol de cada XNTP, molde 1,1 pmol, cebador oligonucleotídico 1 pmol, ADN polimerasa c4760 recombinante purificada (SEQ ID NO:2) 1,2 jg / j l y PEM 0,5, 1 o 1,5 mM. Durante 30 minutos, se llevaron a cabo reacciones de extensión de cebador 10 j l a 23 °C y los productos de reacción se analizaron mediante electroforesis en gel. En la figura 10 se presenta un gel representativo que muestra los productos de extensión de cebador. Como se muestra en los carriles 5 (PEM 0,5 mM ), 6 (PEM 1 mM) y 7 (Pe M 1,5 mM), el compuesto 12 permite la polimerización de los XNTP en copias de expandómero de longitud completa del molde de 100 meros (la flecha indica la posición de la migración del gel del molde de 100 meros) de una manera comparable a la del compuesto 10 (carril 1). Los carriles 2-4 muestran productos de extensión de cebador de reacciones con un aditivo relacionado estructuralmente que carece de actividad PEM sólida. Estos resultados sugieren que la actividad PEM puede estar determinada por estructuras químicas muy específicas.
La actividad PEM de los compuestos 13 y 14 se probó en ensayos de extensión de cebador utilizando el molde HIV2 de 100 meros. Las reacciones de extensión de cebador incluyeron los siguientes reactivos: TrisCl 50 mM, NH4OAc 200 mM, PEG8K al 20 %, NMS al 5 %, PP-60.20 0,6 nmol, MnCl2 0,6 mM, proteína de unión monocatenaria (SSB) Eco 2,75 jg /jl, urea 1 M, 50 pmol de cada XNTP, molde 1,1 pmol, cebador oligonucleotídico 1 pmol, ADN polimerasa c4760 (una variante de DPO4, véase la SEQ ID NO:2) recombinante purificada 1,2 jg / j l y PEM 0,5, 1, 1,52 o 2,5 mM. Durante 30 minutos, se llevaron a cabo reacciones de extensión de cebador 10 j l a 23 °C y los productos de reacción se analizaron mediante electroforesis en gel. En la figura 11 se presenta un gel representativo que muestra los productos de extensión de cebador (la flecha indica la posición del producto de 100 meros del HIV2 de longitud completa). Como se muestra en los carriles 5-7 (compuesto 14 a varias concentraciones) y 8-10 (compuesto 13 a varias concentraciones), cada una de estas PEM de nueva generación permite la polimerización de los XNTP en copias de expandómero de longitud completa del molde de 100 meros de una manera comparable a la del compuesto 10 (carriles 1-4).
La actividad PEM del compuesto 15 se probó en ensayos de extensión de cebador utilizando un molde de amplicón de 411 meros. Las reacciones de extensión de cebador incluyeron los siguientes reactivos: TrisCl 50 mM, NH4OAc 200 mM, PEG8K al 20 %, NMS al 5 %, PP-60.20 3 nmol, MnCl22 mM, proteína de unión monocatenaria (SSB) de Kod 2 jg, urea 1 M, 250 pmol de cada XNTP, molde 1 pmol, cebador oligonucleotídico 1 pmol, ADN polimerasa C4760 (una variante de d Po 4, véase la SEQ ID NO:2) recombinante purificada 1,2 jg y PEM 2 mM (carril 2) o 3 mM (carril 3). Durante 20 minutos, se llevaron a cabo reacciones de extensión de cebador 10 j l a 37 °C y los productos de reacción se analizaron mediante electroforesis en gel. En la figura 12 se presenta un gel representativo que muestra los productos de extensión de cebador (la flecha indica la posición de un producto de 277 meros). Como se muestra en los carriles 2 y 3 (compuesto 15 a dos concentraciones diferentes), esta PEM de nueva generación permite la polimerización de los XNTP en copias de expandómero largas del molde de 411 meros de una manera comparable a la del compuesto 14 (carril 1). Notablemente, la polimerasa depende por completo de la adición de PEM a la reacción para poder sintetizar estos productos de expandómero largos. Incluso pueden obtenerse productos de extensión más largos optimizando varios parámetros de reacción, p. ej., tiempo de extensión y/o concentraciones de varios aditivos.
La actividad PEM de los compuestos 16, 17 y 18 y combinaciones de los mismos, se probaron en ensayos de extensión de cebador utilizando el molde de 100 meros derivado del HIV2. Las reacciones de extensión de cebador incluyeron los siguientes reactivos: TrisCl 50 mM, NH4OAc 200 mM, PEG8K al 20 % o 25 %, NMS al 5 %, PP-60.20 0,6 nmol, MnCh 0,6 mM, proteína de unión monocatenaria (SSB) de Kod 2 μg, urea 1 M, 50 pmol de cada XNTP, molde 1 pmol, cebador oligonucleotídico 1 pmol, ADN polimerasa C4760 (una variante de DPO4, véase la SEQ ID NO:2) recombinante purificada 1,2 μg y PEM 0,5-2 mM. Durante 30 minutos, se llevaron a cabo reacciones de extensión de cebador 10 μl a 37 °C y los productos de reacción se analizaron mediante electroforesis en gel. En la figura 13 se presenta un gel representativo que muestra los productos de extensión de cebador (la flecha indica la posición de un producto de 100 meros). Como se muestra en los carriles 2 (compuesto 162 mM) y 3-6 (compuesto 17 0,5, 1, 2 y 3 mM) estas PEM de nueva generación permiten la polimerización de los XNTp en copias de expandómero largas del molde de 100 meros de una manera comparable a la del compuesto 14 (carril 1). Además, las combinaciones del compuesto 142 mM y del compuesto 170,1 mM (carril 7) o 0,3 mM (carriles 8 y 9), también permitieron la polimerización de los XNTP en copias de expandómero largas del molde de 100 meros, lo que indica que las combinaciones de las PEM pueden permitir el uso de dosis más bajas de cada PEM individual. De manera similar, las combinaciones del compuesto 162 mM y del compuesto 180,1 mM (carril 10) o 0,3 mM (carriles 11 y 12), también parecieron permitir el uso de dosis más bajas de cada PEM individual para permitir la polimerización de los XNTPS en copias del molde de 100 meros de longitud completa.
La actividad PEM del compuesto 19, se probó en ensayos de extensión de cebador utilizando el molde de amplicón de 411 meros. Las reacciones de extensión de cebador incluyeron los siguientes reactivos: TrisCl 50 mM, NH4OAc 200 mM, PEG8K al 20 %, NMS al 5 %, PP-60.20 3 nmol, MnCl22 mM, proteína de unión monocatenaria (SSB) de Kod 2 μg, urea 1 M, 250 pmol de cada XNTP, molde 0,5 pmol, cebador oligonucleotídico 0,5 pmol, ADN polimerasa C4760 (una variante de DPO4, véase la SEQ ID NO:2) recombinante purificada 1,2 μg y Pe M 0,5 mM (carril 2), 1 mM (carril 3) o 1,5 mM (carril 4). Durante 30 minutos, se llevaron a cabo reacciones de extensión de cebador 10 μl a 37 °C y los productos de reacción se analizaron mediante electroforesis en gel. En la figura 14 se presenta un gel representativo que muestra los productos de extensión de cebador (la flecha indica la posición de un producto de 277 meros). Como se muestra en los carriles 2-4, esta PEM de nueva generación permite la polimerización de los XNTP en copias de expandómero largas del molde de 411 meros, aunque de una manera menos eficaz que la del compuesto 14 (carril 1). Estos resultados sugieren que la actividad PEM puede ser específica de la estructura de la PEM y/o de la longitud del molde.
Debe apreciarse que la terminología usada en el presente documento es para el fin de describir realizaciones específicas solamente y no pretende ser limitante. También debe apreciarse que, a menos que se defina específicamente de otro modo en el presente documento, a la terminología usada en el presente documento se le debe dar su significado tradicional según se conoce en la materia pertinente.
La referencia a lo largo de esta memoria descriptiva a "una realización" y sus variaciones significa que una característica particular, estructura o característica descrita en relación con la realización está incluida en al menos una realización. Por lo tanto, las apariciones de la expresión "en una realización" en diversos lugares a lo largo de esta memoria descriptiva no se refieren necesariamente a la misma realización. Además, los rasgos, estructuras o características particulares se pueden combinar de cualquier manera adecuada en una o más realizaciones.
Como se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares de "un", "una", y "el/la" incluyen las referencias plurales, es decir, uno o más, a menos que el contenido y el contexto indique claramente lo contrario. También se debe señalar que los términos conjuntivos, "y" y "o" en general se emplean en el sentido más amplio para incluir y/o a menos que el contenido y el contexto indiquen claramente la inclusividad o la exclusividad según pueda ser el caso. Por lo tanto, el uso de la alternativa (por ejemplo, "o") se debe entender que significa uno, ambos o cualquier combinación de los mismos de las alternativas. Además, la composición de "y" y "o", cuando se incluyen en el presente documento como "y/o" pretende incluir una realización que incluye todos los artículos o ideas asociados y una o más de otras realizaciones alternativas que incluyen menos de todos los artículos o ideas asociados.
A menos que el contexto requiera otra cosa, a lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, la palabra "comprende" y sus sinónimos y variantes tales como "tiene" e "incluye", así como sus variaciones tales como "comprende" y "que comprende" se deben interpretar en un sentido abierto, inclusivo, por ejemplo, "que incluye, pero no se limita a". La expresión "que consiste esencialmente en" limita el alcance de una reivindicación a los materiales o etapas especificados o a aquellos que no afectan materialmente a las características básicas y nuevas de la invención reivindicada.
La abreviatura "p. ej." se usa aquí para indicar un ejemplo no limitante. Por lo tanto, la abreviatura "p. ej." es sinónima de la expresión "por ejemplo". También cabe destacar que, como se usan en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares de "un", "una", y "el/la" incluyen las referencias plurales salvo que el contexto dicte claramente otra cosa, el término "X y/o Y" significa "X" o "Y" o tanto "X" como "Y", y la letra "s" después de un nombre designa tanto las formas plurales como las singulares de ese nombre. Además, cuando las características o aspectos de la invención se describen en términos de grupos de Markush, se pretende, y el experto en la materia lo reconocerá, que la invención incluya y también se describa en términos de cualquier miembro individual y cualquier subgrupo de miembros del grupo Markush, y los solicitantes se reservan el derecho de revisar la solicitud o las reivindicaciones para referirse específicamente a cualquier miembro individual o cualquier subgrupo de miembros del grupo Markush.
Todos los encabezados utilizados en este documento solo se utilizan para acelerar su revisión por parte del lector, y no deben interpretarse como una limitación de la invención o las reivindicaciones de ninguna manera. Por lo tanto, los encabezados y el Resumen de la divulgación proporcionados en el presente documento son únicamente por conveniencia y no interpretan el alcance o el significado de las realizaciones.
Cuando se proporciona un intervalo de valores en el presente documento, se entiende que cada valor intermedio, al décimo de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor declarado o intermedio en el intervalo indicado está comprendido dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden estar incluidos independientemente en los intervalos más pequeños que también están incluidos dentro de esta invención, sujetos a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, también se incluyen en la invención los intervalos que excluyan uno cualquiera o ambos de los límites incluidos.
Por ejemplo, cualquier intervalo de concentración, intervalo de porcentaje, intervalo de proporción o intervalo de números proporcionado en el presente documento se debe entender que incluye el valor de cualquier número dentro del intervalo citado y, cuando sea apropiado, sus fracciones (tal como un décimo y un centésimo de un número entero), a menos que se indique de otro modo. Además, cualquier intervalo numérico indicado en el presente documento en relación con una característica física, tal como subunidades de polímero, tamaño o espesor, se debe entender que incluye cualquier número entero dentro del intervalo indicado, a menos que se indique de otro modo. Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" significa ± 20 % del intervalo indicado, el valor o la estructura, a menos que se indique de otro modo.
Todas las patentes de EE. UU., publicaciones de solicitud de patente de EE. UU., solicitudes de patentes de EE. UU., patentes extranjeras, solicitudes de patentes extranjeras y publicaciones que no son de patente mencionadas en esta memoria descriptiva y/o enumeradas en la hoja de datos de solicitud, que incluyen, pero no limitado a, las solicitudes de patente provisionales de EE. UU. n.° 62/614.120, 62/656.696 y 62/717.549. Dichos documentos se pueden indicar con el fin de describir y divulgar, por ejemplo, materiales y metodologías descritos en las publicaciones, que podrían usarse en conexión con la invención actualmente descrita. Las publicaciones tratadas anteriormente y a lo largo del texto se proporcionan únicamente para su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada de lo expuesto en el presente documento debe interpretarse como una admisión de que los inventores no tengan derecho a antedatar cualquier publicación referenciada en virtud de una invención anterior.

Claims (23)

REIVINDICACIONES
1. Un método para mejorar una reacción de polimerasa de ácido nucleico, comprendiendo el método:
a. formar una composición de reacción de polimerasa de ácido nucleico que comprende:
i. un ácido nucleico molde,
ii. una polimerasa de ácido nucleico,
iii. una mezcla de nucleótidos o análogos de nucleótidos, y
iv. al menos un compuesto de fórmula (I); y
b. incubar la composición de reacción de polimerasa de ácido nucleico en condiciones que permitan una reacción de polimerización de ácido nucleico, en donde el al menos un compuesto de fórmula (I) aumenta la procesividad, la tasa o la fidelidad de la reacción de polimerasa de ácido nucleico;
en donde el compuesto de fórmula (I) se representa por:
Figure imgf000080_0001
en donde, independientemente en cada caso:
m es 1, 2 o 3;
n es 0, 1 o 2;
p es 0, 1 o 2;
Ar1 es arilo opcionalmente sustituido;
Ar2 se selecciona entre anillos aromáticos monocíclicos de 5 a 6 miembros y anillos bicíclicos condensados de 9 a 10 miembros que comprenden dos anillos monocíclicos de 5 y/o 6 miembros condensados entre sí, donde al menos uno de los dos anillos monocíclicos es un anillo aromático, donde
Ar2 está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados entre haluro, alquilo C1-C6 , haloalquilo C1-C6 , E-CO2R0, E-CONH2 , E-CHO, E-C(O)NH(OH), E-N(R0 )2 y E-OR0, donde
E se selecciona entre un enlace directo y alquileno C1-C6 ; y
R0 se selecciona entre H, alquilo C1-C6 y haloalquilo C1-C6,
M se selecciona entre hidrógeno, halógeno y alquilo C1-C4; y
L es un grupo de enlace;
o un solvato, hidrato, tautómero, quelato o sal del mismo.
2. El método de la reivindicación 1, en donde Ar1 es
(a) arilo carbocíclico monocíclico,
(b) arilo heterocíclico monocíclico,
(c) arilo bicíclico,
(d) arilo tricíclico,
(e) arilo sin sustituir o
(f) arilo sustituido.
3. El método de la reivindicación 1, en donde Ar2 es
(a) un anillo aromático monocíclico de 5 miembros seleccionado entre el grupo que consiste en tiofeno, 1,2-tiazol, 1,3-tiazol, furano, 1,2-oxazol, 1,3-oxazol, 1 H-pirrol, 1H-pirazol, oxadiazol, tiadiazol, 1,2,4-triazol, 1,2,3-triazol y 1H-imidazol,
(b) un anillo aromático monocíclico de 6 miembros seleccionado entre el grupo que consiste en benceno, piridina, piridazina, pirimidina y pirazina,
(c) un sistema anular aromático bicíclico condensado de 9 miembros seleccionado entre el grupo que consiste en benzofurano, 1,3-benzoxazol, furo[3,2-b]piridina, furo[3,2-c]piridina, furo[2,3-c]piridina, furo[2,3-b]piridina, indol, 1H-benzoimidazol, 1H-pirrolo[3,2-b]piridina, 1H-pirrolo[3,2-c]piridina, 1H-pirrolo[2,3-c]piridina, 1H-pirrolo[2,3-b]piridina, benzotiofeno, 1,3-benzotiazol, tienol[3,2-b]piridina, tieno[3,2-c]piridina, tieno[2,3-c]piridina, benzoxadiazol, benzotiadiazol, benzoisoxazol, benzotriazol y tieno[2,3-b]piridina o
(d) un sistema anular aromático bicíclico condensado de 10 miembros seleccionado entre el grupo que consiste en naftileno, quinolina, quinazolina, quinoxalina, 1,5-naftiridina, 1,6-naftiridina, 1,7-naftiridina, 1,8-naftiridina, isoquinolina, ftalazina, 2,6-naftiridina y 2,7-naftiridina.
4. El método de la reivindicación 1, en donde la sustitución en Ar2 incluye (a) ácido carboxílico, (b) trifluorometilo, (c) hidroxilo o (d) incluye al menos dos de hidroxilo, ácido carboxílico y trifluorometilo.
5. El método de la reivindicación 4 (d), en donde el al menos un compuesto de fórmula (I) se describe por una fórmula seleccionada entre:
Figure imgf000081_0001
6. El método de la reivindicación 1, en donde el compuesto de fórmula (I) está en forma de un quelato, preferentemente el quelato es un quelato de cobre.
7. El método de la reivindicación 1, en donde el compuesto de fórmula (I) tiene un logP de al menos 4,9.
8. El método de la reivindicación 1, en donde el compuesto de fórmula (I) se selecciona entre:
4,4'-(piridin-2,6-diilbis(1 H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-(piridin-3,5-diilbis(1 H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-(1,3-fenilenobis(1 H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((9H-carbazol-3,6-diil)bis(1H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((9H-carbazol-3,6-diil)bis(1H-1,2,3-triazol-4,1-diil))dianilina;
4,4'-ácido ((9H-carbazol-3,6-diil)bis( 1 H-1,2,3-triazol-4,1 -diil))dibenzoico;
3,6-bis(1-(4-metoxifenil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)-9H-carbazol;
4,4'-((4-metoxipiridin-2,6-diil)bis(1H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico); 4,4'-((4-carboxipiridin-2,6-diil)bis(1H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((4-nitropiridin-2,6-diil)bis(1H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
5,5'-((4-cianopiridin-2,6-diil)bis(1H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((4-metilpiridin-2,6-diil)bis( 1H-1,2,3-triazol-4,1 -diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((4-(etoxicarbonil)piridin-2,6-diil)bis( 1H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
5,5'-((4-(etoxicarbonil)piridin-2,6-diil)bis(1 H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((4-(metoxicarbonil)piridin-2,6-diil)bis( 1H-1,2,3-triazol-4,1 -diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((4-(etilcarbamoil)piridin-2,6-diil)bis( 1H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((4-(metilcarbamoil)piridin-2,6-diil)bis(1H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((4-carbamoilpiridin-2,6-diil)bis(1 H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-(pirazin-2,6-diilbis(1 H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-(1,4-fenilenobis(1 H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-( 1,3-fenilenobis(1 H-1,2,3-triazol-4,1 -diil))dianilina;
ácido 4,4'-(1,3-fenilenobis(1H-1,2,3-triazol-4,1-diil))dibenzoico;
ácido 4-(4-(3-(1-(4-metoxifenil)-1 H-1,2,3-triazol-4-il)fenil)-1 H-1,2,3-triazol-1-il)benzoico;
4,4'-(piridin-2,6-diilbis(1H-1,2,3-triazol-4,1-diil))dianilina;
ácido 4,4'-(piridin-2,6-diilbis( 1 H-1,2,3-triazol-4,1-diil))dibenzoico;
2,6-bis(1-(4-metoxifenil)-1 H-1,2,3-triazol-4-il)piridina;
ácido 4-(4-(3-(1-(4-carboxifenil)-1 H-1,2,3-triazol-4-il)fenil)-1 H-1,2,3-triazol-1-il)-2-hidroxibenzoico;
ácido 4-(4-(3-(1-(4-metoxifenil)-1 H-1,2,3-triazol-4-il)fenil)-1 H-1,2,3-triazol-1-il)benzoico;
4,4'-((3,5-dimetilpiridin-2,6-diil)bis(1 H-1,2,3-triazol-4,1 -diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((413-piridin-2,6-diil)bis(5-yodo-1 H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((4-acetamidopiridin-2,6-diil)bis( 1 H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((9-acetil-9H-carbazol-3,6-diil)bis(1 H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-(piridin-2,6-diilbis(1 H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(N,2-dihidroxibenzamida);
4,4'-(piridin-2,6-diilbis(1 H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(2-h idroxibenzamida);
4,4'-((4-carboxipiridin-2,6-diil)bis( 1 H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((1,10-fenantrolin-2,9-diil)bis( 1H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((4-(trifluorometil)piridin-2,6-diil)bis( 1H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((3-cianopiridin-2,6-diil)bis(1 H-1,2,3-triazol-4,1 -diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((3-nitropiridin-2,6-diil)bis( 1 H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
3,3'-((4-cianopiridin-2,6-diil)bis(1 H-1,2,3-triazol-4,1 -diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((4-(ferc-butoxicarbonil)piridin-2,6-diil)bis( 1H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
ácido 4-(4-(4-ci anopiridi n-2-il)-1 H-1,2,3-triazol-1-il)-2-hidroxibenzoico;
ácido 5-(4-(6-(4-(3-carboxi-4-hidroxi-5-metilfenil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)-4-(metoxicarbonil)piridin-2-il)-1H-1,2,3-triazol-1-il)-2-hidroxi-3-metilbenzoico;
4,4'-((4-(dimetilcarbamoil)piridin-2,6-diil)bis(1H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((4-(ciclopropilcarbamoil)piridin-2,6-diil)bis(1H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((4-(but-3-in-1 -ilcarbamoil)piridin-2,6-diil)bis( 1H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((4-(butilcarbamoil)piridin-2,6-diil)bis(1 H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((4-(dietilcarbamoil)piridin-2,6-diil)bis(1 H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((4-(ferc-butilcarbamoil)piridin-2,6-diil)bis( 1H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((4-(morfolin-4-carbonil)piridin-2,6-diil)bis( 1 H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((4-(propilcarbamoil)piridin-2,6-diil)bis(1 H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((4-(fenilcarbamoil)piridin-2,6-diil)bis(1 H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((4-((2-acetamidoetil)carbamoil)piridin-2,6-diil)bis( 1 H-1,2,3-triazol-4,1 -diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico); 4,4'-((4-(4-ciclopropilpiperazin-1-carbonil)piridin-2,6-diil)bis(1H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico); 4,4'-((4-(carbamimidoilcarbamoil)piridin-2,6-diil)bis(1H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((4-(piperidin-1-carbonil)piridin-2,6-diil)bis(1H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((4-(ciclobutilcarbamoil)piridin-2,6-diil)bis( 1 H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((1,10-fenantrolin-3,8-diil)bis(1 H-1,2,3-triazol-4,1 -diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((4-(ciclopentilcarbamoil)piridin-2,6-diil)bis(1 H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((4-(dipropilcarbamoil)piridin-2,6-diil)bis(1 H-1,2,3-triazol-4,1 -diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((4-(di-sec-butilcarbamoil)piridin-2,6-diil)bis( 1 H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-(naftalen-2,7-diilbis(1H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-(naftalen-2,3-diilbis(1 H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((4-(dibutilcarbamoil)piridin-2,6-diil)bis( 1H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((4-((2-hidroxietil)carbamoil)piridin-2,6-diil)bis(1 H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((4-(ciclohexilcarbamoil)piridin-2,6-diil)bis(1H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((4-(bencilcarbamoil)piridin-2,6-diil)bis( 1H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((4-(4-metilpiperazin-1 -carbonil)piridin-2,6-diil)bis( 1 H-1,2,3-triazol-4,1 -diil))bis(ácido 2-hidroxibenzoico); ácido 4-(4-(3-(1-(4-metoxifenil)-1H-1,2,3-triazol-4-il)fenil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)benzoico;
4,4',4",4"'-((((butan-1,4-diilbis(azanediil))bis(carbonil))bis(piridin-4,2,6-triil))tetraquis(1H-1,2,3-triazol-4,1-diil))tetraquis(ácido 2-hidroxibenzoico);
4,4'-((4-(etilcarbamoil)piridin-2,6-diil)bis(1H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 3,5,6-tricloropicolínico);
4,4'-((4-(etilcarbamoil)piridin-2,6-diil)bis(1H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-(trifluorometil)benzoico);
7,7'-((4-(etilcarbamoil)piridin-2,6-diil)bis(1H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-hidroxi-1,8-naftiridin-4-carboxílico); 5,5'-((4-(etilcarbamoil)piridin-2,6-diil)bis(1H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-(trifluorometil)benzoico);
4,4'-((4-(etilcarbamoil)piridin-2,6-diil)bis(1H-1,2,3-triazol-4,1-diil))bis(ácido 2-fluorobenzoico);
5,5'-((4-(etilcarbamoil)piridin-2,6-diil)bis(1 H-1,2,3-triazol-4,1 -diil))bis(ácido 3-fluorobenzoico); y
2-(1-(1H-benzo[d]imidazol-4-il)-1 H-1,2,3-triazol-4-il)-6-(1-(1H-benzo[d]imidazol-7-il)-1 H-1,2,3-triazol-4-il)-N-etilisonicotinamida.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el compuesto de fórmula (I) aumenta la longitud de un producto de ácido nucleico resultante en comparación con una reacción de polimerasa de ácido nucleico que carece del compuesto de fórmula (I).
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el al menos un compuesto de fórmula (I) comprende una pluralidad de compuestos de fórmula (I).
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la polimerasa de ácido nucleico es una ADN polimerasa, preferentemente la ADN polimerasa es DPO4 o una variante de la misma.
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la mezcla de nucleótidos o análogos de nucleótidos es una mezcla de análogos de nucleótidos que comprende nucleósido trifosforamidatos, en donde cada uno de los nucleósido trifosforamidatos comprende una nucleobase seleccionada del grupo que consiste en adenina, guanina, timina y citosina y un resto de anclaje polimérico, en donde un primer extremo del resto de anclaje polimérico se fija a la nucleobase y un segundo extremo del resto de anclaje polimérico se fija al fosfato alfa del nucleósido trifosforamidato para permitir la expansión de los análogos de nucleótidos mediante la escisión del enlace fosforamidato.
13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la reacción de polimerización de ácidos nucleicos produce un polímero expandible de análogos de nucleótidos, en donde el polímero expandible codifica la información de la secuencia de nucleobases del ácido nucleico molde.
14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde las condiciones para permitir una reacción de polimerización de ácidos nucleicos comprenden un tampón de polimerización adecuado y un cebador oligonucleotídico, preferentemente, el tampón adecuado comprende al menos uno de Tris OAc, NH4OAc, PEG, un disolvente orgánico miscible en agua, polifosfato 60, NMS y MnCh.
15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la mezcla de reacción comprende además una proteína de unión monocatenaria y/o urea.
16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la mezcla de nucleótidos o análogos de nucleótidos comprende análogos de nucleótidos que comprenden una etiqueta detectable, preferentemente la etiqueta detectable es una etiqueta ópticamente detectable seleccionada del grupo que consiste en etiquetas luminiscentes, quimioluminiscentes, fluorescentes, fluorógenas, cromóforas o cromógenas.
17. Un método para secuenciar un molde de ADN, comprendiendo el método las etapas de:
a. formar una composición de reacción de ADN polimerasa que comprende:
i. un molde de ADN,
ii. un cebador de replicación que forma complejos con el molde,
iii. una ADN polimerasa,
iv. una mezcla de nucleótidos o análogos de nucleótidos,
v. al menos un compuesto de fórmula (I),
b. incubar la composición de reacción de ADN polimerasa en condiciones que permitan una reacción de polimerización de ADN, en donde el al menos un compuesto de fórmula (I) aumenta la tasa, la fidelidad o la procesividad de la reacción de ADN polimerasa; y
c. determinar la secuencia de los nucleótidos o análogos de nucleótidos en el polímero resultante de nucleótidos o análogos de nucleótidos;
en donde el compuesto de fórmula (I) es:
Figure imgf000084_0001
en donde, independientemente en cada caso:
m es 1, 2 o 3;
n es 0, 1 o 2;
p es 0, 1 o 2;
Ar1 es arilo opcionalmente sustituido;
Ar2 se selecciona entre anillos aromáticos monocíclicos de 5 a 6 miembros y anillos bicíclicos condensados de 9 a 10 miembros que comprenden dos anillos monocíclicos de 5 y/o 6 miembros condensados entre sí, donde al menos uno de los dos anillos monocíclicos es un anillo aromático, donde
Ar2 está opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes seleccionados entre haluro, alquilo C1-C6 , haloalquilo C-i-Ca, E-CO2R0, E-CONH2 , E-CHO, E-C(O)NH(OH), E-N(R0)2 y E-OR0, donde
E se selecciona entre un enlace directo y alquileno C1-C6 ; y
R0 se selecciona entre H, alquilo C1-C6 y haloalquilo C1-C6,
M se selecciona entre hidrógeno, halógeno y alquilo C1-C4; y
L es un grupo de enlace;
o un solvato, hidrato, tautómero, quelato o sal del mismo.
18. El método de la reivindicación 17, en donde la mezcla de análogos de nucleótidos comprende nucleósido trifosforamidatos, en donde cada uno de los nucleósido trifosforamidatos comprende una nucleobase seleccionada del grupo que consiste en adenina, guanina, timina y citosina y un resto de anclaje polimérico, en donde un primer extremo del resto de anclaje polimérico se fija a la nucleobase y un segundo extremo del resto de anclaje polimérico se fija al fosfato alfa del nucleósido trifosforamidato para permitir la expansión de los análogos de nucleótidos mediante la escisión del enlace fosforamidato.
19. El método de la reivindicación 18, en donde la ADN polimerasa es DPO4 o una variante de la misma.
20. El método de la reivindicación 19, en donde el polímero resultante de análogos de nucleótidos es un polímero expandible.
21. El método de la reivindicación 20, que incluye además la etapa de poner en contacto el polímero expandible con un agente de escisión de fosforamidato para producir un polímero expandido de análogos de nucleótidos.
22. El método de la reivindicación 18, en donde el resto de anclaje polimérico de cada uno de los análogos de nucleótidos comprende un resto indicador exclusivo de la nucleobase del análogo, preferentemente, los restos indicadores producen una señal electrónica característica.
23. El método de la reivindicación 18, en donde la etapa de determinar la secuencia de los análogos de nucleótidos comprende la etapa de translocar el polímero expandido de análogos de nucleótidos a través de un nanoporo.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020236526A1 (en) 2019-05-23 2020-11-26 Stratos Genomics, Inc. Translocation control elements, reporter codes, and further means for translocation control for use in nanopore sequencing
CN119823106A (zh) * 2019-06-26 2025-04-15 豪夫迈·罗氏有限公司 通过芳香族化合物增强核酸聚合
EP4605545A1 (en) 2022-10-21 2025-08-27 F. Hoffmann-La Roche AG Detection of modified nucleobases in nucleic acid samples
WO2025082960A1 (en) 2023-10-18 2025-04-24 F. Hoffmann-La Roche Ag Dpo4 polymerase variants with improved properties
WO2025137293A2 (en) * 2023-12-22 2025-06-26 Roche Sequencing Solutions, Inc. Enhancement of nucleic acid polymerization by aromatic compounds
WO2025132780A2 (en) 2023-12-22 2025-06-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods and compositions for nucleic acid library and template preparation for duplexed sequencing by expansion
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WO2025202488A1 (en) * 2024-03-28 2025-10-02 Roche Diagnostics Gmbh Enhancer of nucleic acid amplification

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4245084B2 (ja) 1997-03-21 2009-03-25 ストラタジーン ポリメラーゼ増強因子（ｐｅｆ）抽出物、ｐｅｆタンパク質複合体、単離されたｐｅｆタンパク質、並びに精製及び単離方法
US6183997B1 (en) * 1997-03-21 2001-02-06 Stratagene Polymerase enhancing factor (PEF) extracts PEF protein complexes isolated PEF proteins and methods for purifying and identifying same
US6787305B1 (en) 1998-03-13 2004-09-07 Invitrogen Corporation Compositions and methods for enhanced synthesis of nucleic acid molecules
CA2377780A1 (en) 1999-07-02 2001-01-11 Invitrogen Corporation Compositions and methods for enhanced sensitivity and specificity of nucleic acid synthesis
US7939259B2 (en) 2007-06-19 2011-05-10 Stratos Genomics, Inc. High throughput nucleic acid sequencing by expansion
US20120088235A1 (en) 2009-01-29 2012-04-12 Stratos Genomics, Inc. High throughput nucleic acid sequencing by expansion and related methods
US8900352B2 (en) * 2011-07-06 2014-12-02 Northwestern University System and method for generating and/or screening potential metal-organic frameworks
CA2968424A1 (en) * 2014-11-20 2016-05-26 Stratos Genomics, Inc. Nucleoside phosphoroamidate esters and derivatives thereof, use and synthesis thereof
US20180213779A1 (en) * 2015-09-25 2018-08-02 Syngenta Participations Ag Pesticidally active heterocyclic derivatives with sulphur containing substituents
WO2017087281A1 (en) 2015-11-16 2017-05-26 Stratos Genomics, Inc. Dp04 polymerase variants
WO2017148860A1 (en) * 2016-02-29 2017-09-08 Genia Technologies, Inc. Polymerase-template complexes for nanopore sequencing
US20200115461A1 (en) 2017-05-03 2020-04-16 Harpoon Therapeutics, Inc. Compositions and methods for adoptive cell therapies

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