ES2954747T3 - Proceso de fermentación - Google Patents

Abstract

La invención proporciona métodos y sistemas para la producción de productos lipídicos a partir de un sustrato gaseoso usando un proceso de fermentación de dos etapas. El método comprende proporcionar un sustrato gaseoso que comprende CO, CO2 o H2 o mezclas de los mismos, a un primer biorreactor que contiene un cultivo o uno o más microorganismos, y fermentar el sustrato para producir acetato. Luego, el acetato del primer biorreactor se proporciona a un segundo biorreactor, donde se utiliza como sustrato para la fermentación a lípidos por una o más levaduras. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proceso de fermentación

Campo de la invención

Esta invención se refiere a un método para la producción de lípidos a partir de materia prima gaseosa. El método comprende un sistema de tres etapas para la producción de uno o más productos lipídicos a partir de una materia prima gaseosa.

Antecedentes de la invención

La crisis energética mundial ha provocado un mayor interés en enfoques alternativos para la producción de combustibles. Los biocombustibles para transporte son sustitutos atractivos de la gasolina y se están introduciendo rápidamente en los mercados de combustibles como mezclas de baja concentración. La producción de biocombustibles derivados de biomasa se ha convertido en un enfoque importante para aumentar la producción de energía alternativa y reducir las emisiones de gases de efecto invernadero. La producción de biocombustibles a partir de biomasa permite que la independencia energética mejore el desarrollo de las zonas rurales y el desarrollo económico sostenible.

Los biocombustibles líquidos de primera generación utilizan materias primas de carbohidratos tales como almidón, caña de azúcar, maíz, colza, soja, palma y aceites vegetales. Las materias primas de primera generación presentan una serie de desafíos importantes. El coste de estas materia primas de carbohidratos está influenciado por su valor como alimento humano o alimento para animales, mientras que el cultivo de almidón o cultivos productores de sacarosa para la producción de etanol no es económicamente sostenible en todas las geografías. El uso sostenido de estas materias primas como fuente de biocombustibles ejercería inevitablemente una gran presión sobre la tierra cultivable y los recursos hídricos. Por tanto, es interesante desarrollar tecnologías para convertir recursos de carbono de bajo coste y/o más abundantes en combustibles.

Los biocombustibles de segunda generación son los producidos a partir de celulosa y algas. Las algas se seleccionaron para producir lípidos debido a sus rápidas tasas de crecimiento y la capacidad de las algas para consumir dióxido de carbono y producir oxígeno.

Un área que ha visto una mayor actividad es la síntesis microbiana de lípidos que comprenden materias primas necesarias para la producción de biocombustibles. Numerosos estudios han demostrado la capacidad de acumular lípidos mediante el uso de levaduras oleaginosas en diferentes sustratos tales como glicerol industrial, ácido acético, lodos de depuración, permeado de suero, melaza de caña de azúcar e hidrolizado de paja de arroz. Nuevamente estas tecnologías de biocombustibles de segunda generación han encontrado problemas debido a altos costes de producción y costes asociados con el transporte y el almacenamiento de la materia prima.

Hace tiempo que se reconoce que pueden usarse procesos catalíticos para convertir gases que consisten en CO, CO₂ o hidrógeno (H₂) en una variedad de combustibles y productos químicos. Sin embargo, los microorganismos también pueden usarse para convertir estos gases en combustibles y productos químicos. Estos procesos biológicos, aunque generalmente más lentos que los procesos termoquímicos, tienen varias ventajas sobre los procesos catalíticos, incluyendo mayor especificidad, mayores rendimientos, menores costes de energía y mayor resistencia al envenenamiento.

Se ha demostrado la producción de ácido acético, acetato y otros productos tales como etanol por fermentación anaerobia de monóxido de carbono y/o hidrógeno y dióxido de carbono. Véase, por ejemplo, Balch et al., (1977) International Journal of Systemic Bacteriology., 27:355-361; Vega et al., (1989) Biotech. Bioeng., 34:785-793; Klasson et al. (1990) Appl. Biochem. Biotech., 24/25: 1; entre otros.

Se ha demostrado que las bacterias acetogénicas, tales como las del género Acetobacterium, Moorella, Clostridium, Ruminococcus, Eubacterium, Butyribacterium, Oxobacter, Methanosarcina y Desulfotomaculum utilizan sustratos que comprenden H₂, CO₂ y/o CO y convierten estos sustratos gaseosos en ácido acético, etanol y otros productos de fermentación por la vía Wood-Ljungdahl con acetil co-A sintasa como enzima clave. Por ejemplo, se describen diversas cepas de Clostridium ljungdahlii que producen acetato y etanol a partir de gases en los documentos WO 00/68407, EP 117309, las patentes de los EE. UU. n.° 5.173.429, 5.593.886 y 6.368.819, WO 98/00558 y WO 02/08438. La bacteria Clostridium autoethanogenum sp también se sabe que produce acetato y etanol a partir de gases (Abrini et al., Archives of Microbiology 161, pág. 345-351 (1994)).

Se ha demostrado que Acetobacterium woodii, un microorganismo estrictamente anaerobio no formador de esporas que crece bien a temperaturas de aproximadamente 30 °C, produce acetato a partir de H₂ y CO₂. Balch et al. divulgaron en primer lugar que la bacteria A. woodii crece por oxidación anaerobia de hidrógeno y reducción de dióxido de carbono. Buschorn et al. mostraron la producción y utilización de etanol por A. woodii en glucosa. La fermentación de A. woodii se realizó a concentraciones de glucosa (fructosa) de hasta 20 mM. Buschorn et al. descubrieron que cuando la concentración de glucosa se incrementó a 40 mM, casi la mitad del sustrato permaneció cuando A. woodii entró en fase de crecimiento estacionaria y apareció etanol como producto de fermentación adicional. Balch et al. descubrieron que el único producto principal detectado por la fermentación de H2 y CO2 por A. woodii fue acetato de acuerdo con la siguiente estequiometría: 4H2 2CO2 -> CH₃COOH H₂O.

El acetato puede ser un producto de fermentación indeseable, ya que es un producto difícil de recuperar de un caldo de fermentación acuoso y tiene un uso comercial limitado.

Un objeto de la presente invención es proporcionar un sistema de proceso y fermentación que sirva al menos de alguna manera para superar las desventajas anteriores, o al menos proporcionar al público una opción útil.

Sumario de la invención

La invención proporciona un método para producir al menos un producto lipídico a partir de un sustrato gaseoso, comprendiendo el método;

i. recibir un sustrato gaseoso que comprende al menos un 25 % de CO en un biorreactor primario que contiene caldo de fermentación que comprende un cultivo de al menos un microorganismo en un medio nutritivo líquido, y fermentar el sustrato gaseoso para producir al menos un ácido o al menos un ácido y al menos un alcohol;

ii. pasar el caldo de fermentación desde el biorreactor primario a un separador para separar las células de microorganismos (el retenido) del resto del caldo de fermentación (el permeado); y

iii. pasar al menos una parte del permeado a un segundo biorreactor que contiene un cultivo de al menos una levadura en un medio nutritivo líquido y fermentar el ácido para producir al menos un producto lipídico,

en donde el ácido es acetato y la concentración de acetato producido en el biorreactor primario es de al menos 10 g/l.

En una realización, el sustrato gaseoso comprende mezclas de CO, CO2 y/o H2. En determinadas realizaciones, el sustrato gaseoso procede de una fuente industrial. En determinadas realizaciones se mezcla al menos un gas de al menos una fuente industrial para proporcionar un sustrato gaseoso con una composición deseada.

En una realización, los uno o más alcoholes se seleccionan del grupo que comprende etanol, butanol, metanol y propanol.

En diversas realizaciones, todo el ácido y/o alcohol producidos en la primera etapa se convierten en lípidos en la tercera etapa. En diversas realizaciones, se recupera al menos una parte de los ácidos y/o alcoholes producidos en la primera etapa.

En una realización del método anterior divulgado, el al menos un ácido es acetato y el al menos un microorganismo se selecciona del grupo que consiste en Acetobacterium, Moorella, Clostridium, Ruminococcus, Eubacterium, Butyribacterium, Oxobacter, Methanosarcina y Desulfotomaculum;

Los expertos en la materia apreciarán las condiciones de fermentación, incluidos los intervalos de pH, necesarias para el éxito de la fermentación de sustratos gaseosos que comprenden CO, CO2 o H2 o mezclas de los mismos. Los inventores reconocen que cualquier microorganismo acetogénico particular que pueda utilizarse de acuerdo con la invención tendrá un intervalo de pH óptimo, que normalmente está entre pH 4 y pH 8. En una realización de la invención, el pH de la fermentación en el biorreactor primario se mantiene entre aproximadamente pH 4,5 y aproximadamente pH 6. En una realización preferente, el pH se mantiene a pH 5,5.

En una realización de los métodos anteriores, los lípidos producidos en la segunda o tercera etapa se utilizan para producir al menos un producto terciario. En una realización, el uno o más productos terciarios se seleccionan del grupo que comprende biodiesel, diésel renovable procedente de la hidrogenación (HDRD, del inglés hydrogenation-derived renewable diesel), ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME, del inglés fatty acid methyl esters) y ésteres etílicos de ácidos grasos (FAEE, del inglés fatty acid ethyl esters).

En una realización del método anterior divulgado, al menos una parte del caldo de fermentación pasa del biorreactor primario al biorreactor secundario como purga del caldo.

En otra realización, los productos producidos en el biorreactor primario se eliminan como una purga del permeado.

La purga del caldo y la purga del permeado pueden combinarse antes de suministrarse al biorreactor secundario.

Opcionalmente, el caldo de fermentación combinado se procesa para retirar al menos una parte del acetato antes de que la corriente se suministre al biorreactor secundario.

En una realización, el pH de la corriente de fermentación combinada se ajusta entre pH 6 y pH 8 antes de suministrarse al biorreactor secundario.

En varias realizaciones, la producción de lípidos en el biorreactor secundario puede aumentarse limitando al menos un nutriente en el medio. En una realización, la producción de lípidos en el biorreactor secundario aumenta limitando la cantidad de nitrógeno en el medio.

En una realización, la relación de ácido acético a nitrógeno en el caldo de fermentación en el biorreactor secundario es al menos 10:1. La relación de carbono a ácido acético en el caldo de fermentación del biorreactor secundario puede ser de 49:1. La corriente de ácido que sale del primer biorreactor se trata para proporcionar una corriente de ácido purificada o concentrada para pasarse al segundo biorreactor. La relación carbono:nitrógeno del caldo de fermentación en el segundo biorreactor puede controlarse, y la entrada de carbono y nitrógeno al biorreactor puede ajustarse para asegurar una relación de carbono:nitrógeno mayor que 49:1.

En el método de la invención, el acetato producido en el biorreactor primario tiene una concentración de al menos 10 g/l, por ejemplo, al menos aproximadamente 15 g/l o al menos aproximadamente 20 g/l.

En una realización de la invención, la tasa de producción de acetato en el biorreactor primario es de al menos aproximadamente 10 g/l/día, o al menos 15 g/l/día, o 20 g/l/día o al menos aproximadamente 40 g/l/día o al menos aproximadamente 60 g/l/día.

En una realización de la invención, la al menos una levadura es levadura oleaginosa. La levadura oleaginosa se puede seleccionar del grupo que comprende Cryptococcus, Candida, Lipomyces, Rhodosporidium, Saccharomyces y Yarrowia. En una realización preferente, la una o más levaduras es Cryptococcus curvatii.

La fermentación en el biorreactor secundario puede mantenerse entre aproximadamente pH 6 y aproximadamente pH 8. En una realización preferente, el pH se mantiene a pH 7.

El pH en el biorreactor secundario puede ser sustancialmente el mismo que el pH en el biorreactor primario. En realizaciones alternativas, el pH de la corriente que sale del biorreactor primario se puede ajustar a aproximadamente pH 7 antes de suministrarse al biorreactor secundario.

En una realización de la invención, la concentración de lípidos en el segundo biorreactor es al menos aproximadamente 10 g/l o al menos aproximadamente 20 g/l, o al menos aproximadamente 40 g/l, o al menos aproximadamente 60 g/l, o al menos aproximadamente 80 g/l, o al menos aproximadamente 100 g/l o al menos aproximadamente 150 g/l. La tasa de producción de lípidos en el segundo biorreactor es al menos aproximadamente 5 g/l/día, o al menos aproximadamente 7 g/l/día, o al menos aproximadamente 10 g/l/día, o aproximadamente 15 g/l/día, o al menos aproximadamente 20 g/l/día o al menos aproximadamente 30 g/l/día.

En una realización de la invención, el método es una fermentación continua en tres etapas. En otra realización, el método es una fermentación semicontinua en tres etapas.

En una realización, todo el acetato producido en el biorreactor primario se transfiere al biorreactor secundario para su fermentación a lípidos.

En una realización, al menos una parte del acetato producido en el biorreactor primario se recupera.

En una realización, al menos una parte de la corriente que sale del biorreactor secundario se recicla a un reactor primario. En una realización, la corriente de salida se procesa para retirar sustancialmente toda la biomasa antes de pasar al reactor primario. En determinadas realizaciones, la corriente de salida se trata adicionalmente para eliminar proteínas solubles y otros componentes no deseados. En otras realizaciones, el pH de la corriente de salida se ajusta antes de suministrarse al reactor primario.

En una realización, la corriente de salida pasa a través de un módulo de lavado de oxígeno para eliminar sustancialmente todo el oxígeno antes de pasar al reactor primario.

En una realización, los lípidos producidos en el biorreactor secundario se utilizan para producir al menos un producto terciario. En una realización, el al menos un producto terciario se selecciona del grupo que comprende biodiesel, HDRD, FAME y FAEE.

En una realización, se utiliza una serie de reactores primarios para alimentar al menos un reactor secundario. Por ejemplo, tres reactores primarios para alimentar un reactor secundario, cuatro reactores primarios que alimentan dos reactores secundarios, etc.

En una realización, el sustrato gaseoso es un gas residual o de escape de un proceso industrial. En una realización el gas residual se selecciona del grupo que comprende gas residual de una planta de hidrógeno, gas de horno de coque, gas de petróleo asociado, gas natural, gas de reformado catalítico, gases de escape del pulverizador de nafta, gas combustible de refinería, gases residuales de planta de metanol, gases residuales de planta de amoníaco y gases de horno de cal.

Breve descripción de los dibujos

La invención se describirá ahora con más detalle y por referencia a las figuras adjuntas, en las que:

La figura 1 es un sistema de dos fermentadores para la producción de lípidos a partir de CO y, opcionalmente, H2, o CO2 y H2.

La figura 2 muestra un sistema de dos fermentadores de producción de lípidos a partir de CO y, opcionalmente, H2, o CO2 y H2, en donde el medio sustancialmente libre de acetato se recicla desde el biorreactor secundario al biorreactor primario.

En la figura 3 se muestra la concentración de acetato en una fermentación que utiliza CO de acuerdo con una realización de la presente invención.

En la figura 4a se muestra el crecimiento de C. curvatus utilizando un sustrato de glucosa.

En la figura 4b se muestra el crecimiento de C. curvatus utilizando un sustrato de acetato de un proceso de fermentación de CO2/H₂.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

A menos que se definan de otro modo, los siguientes términos y las expresiones que se usan a lo largo de la presente memoria descriptiva se definen de la siguiente manera:

Permeado - constituyentes sustancialmente solubles del caldo que pasan a través del separador y no se retienen por el separador. El permeado contendrá normalmente productos de fermentación solubles, subproductos y solución de nutrientes.

Tasa de dilución - la tasa de reemplazo del caldo en un biorreactor. La tasa de dilución se mide en el número de volúmenes de biorreactor de caldo que se reemplazan por medio nutriente por día.

Caldo de fermentación o caldo - la mezcla de componentes (incluido el cultivo de caldo y el medio nutriente) que se encuentra en el biorreactor.

Medio nutriente - la solución añadida al caldo de fermentación que contiene nutrientes y otros componentes adecuados para el crecimiento del cultivo de microorganismos.

Por sustrato gaseoso y expresiones similares debe entenderse cualquier sustrato en el monóxido de carbono o el dióxido de carbono están disponibles para una o más cepas de bacterias para su crecimiento y/o fermentación, por ejemplo. Dichos sustratos pueden comprender opcionalmente H2, que puede estar presente en proporciones variables. Purga del caldo - la parte del caldo de fermentación extraída de un biorreactor que no se pasa a un separador. Cultivo de caldo - el cultivo de microorganismos presente en el caldo de fermentación.

Densidad del cultivo de caldo - la densidad de células de microorganismos en el caldo de fermentación.

Separador - un módulo que está adaptado para recibir el caldo de fermentación de un biorreactor y pasar el caldo a través de un filtro para producir un retenido y un permeado. El filtro puede ser una membrana, por ejemplo, una membrana de flujo cruzado o una membrana de fibra hueca.

Ácido - como se utiliza en el presente documento, este término incluye tanto ácidos carboxílicos como el anión carboxilato asociado, tal como la mezcla de ácido acético libre y acetato presente en un caldo de fermentación como se describe en el presente documento. La relación de ácido molecular a carboxilato en el caldo de fermentación depende del pH del sistema. El término "acetato" incluye tanto la sal de acetato sola como una mezcla de ácido acético molecular o libre y sal de acetato, tal como la mezcla de sal de acetato y ácido acético libre presente en un caldo de fermentación como puede describirse en el presente documento. La relación de ácido acético molecular a acetato en el caldo de fermentación depende del pH del sistema.

Los lípidos que se utilizan en el presente documento incluyen ácidos grasos, glucolípidos, esfingolípidos, sacarolípidos, policétidos, lípidos de esteróles y lípidos de preñóles.

Biorreactor o fermentador - incluye un dispositivo de fermentación que consiste de uno o más recipientes y/o torres o disposiciones de tuberías, que incluye el reactor de tanque agitado de flujo continuo (CSTR, del inglés Continuous Stirred Tank Reactor), un reactor de células inmovilizadas (ICR, del inglés Immobilized Cell Reactor), un reactor de lecho percolador (TBR, del inglés Trickle Bed Reactor), el reactor de película biológica de lecho en movimiento (MBBR, del inglés Moving Bed Biofilm Reactor), una columna de burbujas, un fermentador de elevación de gases, reactor de membrana, tal como el biorreactor de membrana de fibra hueca (HFMBR, del inglés Hollow Fibre Membrane Bioreactor), un mezclador estático, u otro recipiente u otro dispositivo adecuado para el contacto gas-líquido.

Biorreactor primario - como se utiliza en el presente documento, este término pretende abarcar uno o más reactores que pueden conectarse en serie o en paralelo con un biorreactor secundario. Los biorreactores primarios utilizan fermentación anaerobia para producir ácidos a partir de un sustrato gaseoso. Al menos una parte del producto ácido de uno o más biorreactores primarios se usa como sustrato en uno o más biorreactores secundarios.

Biorreactor secundario - como se utiliza en el presente documento, estos términos pretenden abarcar cualquier número de biorreactores adicionales que pueden conectarse en serie o en paralelo con los biorreactores primarios. Cualquiera de estos biorreactores adicionales también puede conectarse a un separador adicional.

Fermentar, proceso de fermentación o reacción de fermentación, y los términos similares utilizados en el presente documento, pretenden abarcar tanto la fase de crecimiento como la fase de biosíntesis del producto del proceso. Como se describe además en el presente documento, en algunas realizaciones, el biorreactor puede comprender un primer reactor de crecimiento y un segundo reactor de fermentación. Como tal, debe entenderse que la adición de metales o composiciones a una reacción de fermentación incluye la adición a uno o ambos de estos reactores.

Los procesos de producción de ácidos mediante fermentación anaerobia de sustratos gaseosos se conocen en la materia.

Como se ha definido anteriormente, la invención proporciona un método para producir al menos un producto lipídico a partir de un sustrato gaseoso, comprendiendo el método;

i. recibir un sustrato gaseoso que comprende al menos un 25 % de CO en un biorreactor primario que contiene caldo de fermentación que comprende un cultivo de al menos un microorganismo en un medio nutritivo líquido, y fermentar el sustrato gaseoso para producir al menos un ácido o al menos un ácido y al menos un alcohol;

ii. pasar el caldo de fermentación desde el biorreactor primario a un separador para separar las células de microorganismos (el retenido) del resto del caldo de fermentación (el permeado); y

iii. pasar al menos una parte del permeado a un segundo biorreactor que contiene un cultivo de al menos una levadura en un medio nutritivo líquido y fermentar el ácido para producir al menos un producto lipídico,

en donde el ácido es acetato y la concentración de acetato producido en el biorreactor primario es de al menos 10 g/l.

En la primera etapa el sustrato gaseoso que comprende al menos un 25 % de CO y opcionalmente H₂, o CO₂ y H₂, se fermenta de manera anaerobia para producir al menos un ácido. En la tercera etapa del proceso, el al menos un ácido se fermenta de manera aerobia para producir uno o más productos lipídicos.

En un aspecto de la invención, el método comprende cultivar en un biorreactor primario que contiene un medio nutriente líquido al menos una cepa de bacterias anaerobias y acetogénicas que son capaces de producir acetato a partir de un sustrato gaseoso que contiene CO, o mezclas de CO, CO₂ y H₂, y suministrar dicho sustrato gaseoso al biorreactor. El proceso de fermentación produce acetato. El acetato producido en el biorreactor primario se suministra a un biorreactor secundario que contiene un cultivo de una levadura oleaginosa capaz de producir lípidos a partir de un sustrato que contiene acetato.

La al menos una cepa de bacterias anaerobias acetogénicas capaces de producir acetato a partir de un sustrato gaseoso que contiene CO, o mezclas de CO, CO₂ y H₂, puede ser del grupo que consiste en Acetobacterium, Moorella, Clostridium, Pyrococcus, Eubacterium, Desulfobacterium, Cabroxydothermus, Acetogenium, Acetoanaerobium, Butyribaceterium, Peptostreptococcus, Ruminococcus, Oxobacter y Methanosarcina.

Fermentación utilizando un sustrato gaseoso.

La invención tiene una aplicabilidad particular para apoyar la producción de acetato y etanol a partir de sustratos gaseosos que comprenden gases de combustión industriales que contienen al menos un 25 % de CO y, opcionalmente H₂. Uno de dichos tipos de corriente de gas son los gases de escape de las plantas de producción de acero, que normalmente contiene del 20 al 70 % de CO. Dichas corrientes de gas pueden comprender además CO₂. Se producen corrientes similares a partir del procesamiento de cualquier materia prima basada en carbono, tal como petróleo, carbón y biomasa.

Se conocen procesos para la producción de acetato y otros alcoholes a partir de sustratos gaseosos. Como ejemplos de procesos se incluyen los descritos, por ejemplo, en los documentos WO2007/117157, WO2008/115080, US 6340581, US 6136577, US 5593886, US 5.807.722 y US 5.821.111. Asimismo, se conocen procesos de fermentación en dos etapas para la producción de lípidos a partir de fuentes de carbono como sustrato gaseoso, por ejemplo los descritos en los documentos US 2011/177564 y WO 2013/036147.

Se sabe que varias bacterias anaerobias son capaces de llevar a cabo la fermentación de CO a etanol y ácido acético, y son adecuadas para su uso en el proceso de la presente invención. Los acetógenos tienen la capacidad de convertir sustratos gaseosos tales como H₂, CO₂ y CO en productos que incluyen ácido acético, etanol y otros productos de fermentación por la vía Wood-Ljungdahl. Como ejemplos de dichas bacterias que son adecuadas para su uso en la invención se incluyen las del género Clostridium, tales como cepas de Ciostrídiumijungdahiii, incluyendo las descritas en los documentos WO 00/68407, EP 117309, las patentes de EE. UU. n.° 5.173.429, 5.593.886 y 6.368.819, WO 98/00558 y WO 02/08438, y Clostridium autoethanogenum (Abrini et al., Archives of Microbiology 161: págs. 345-351). Otras bacterias adecuadas incluyen las del género Moorella, incluyendo Moorella sp HUC22-1, (Sakai et al., Biotechnology Letters 29: págs. 1607-1612), y las del género Carboxydothermus (Svetlichny, V.A., Sokolova, T.G. et al. (1991), Systematic and Applied Microbiology 14: 254-260). También se apreciará que en los procesos de la presente invención puede utilizarse un cultivo mixto de dos o más bacterias.

Un microorganismo preferido adecuado para su uso en la presente invención es Clostridium autoethanogenum que está disponible comercialmente en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) y que tiene las características de identificación del número de depósito de DSMZ DSMZ 10061.

La invención tiene aplicabilidad adicional para apoyar la producción de acetato a partir de sustratos gaseosos que comprenden CO₂ y H₂. Se ha mostrado que Acetobacterium woodii produce acetato mediante la fermentación de sustratos gaseosos que comprenden CO₂ y H₂. Buschhorn et al. demostraron la capacidad de A. woodii para producir etanol en una fermentación de glucosa con limitación de fosfato. Un microorganismo ilustrativo adecuado para su uso en la presente invención es Acetobacterium woodii que tiene las características de identificación de la cepa depositada en el Centro Alemán de Recursos para Material Biológico (DSMZ) con el número de depósito de identificación DSM 1030.

Otras bacterias adecuadas incluyen las del género Moorella, incluyendo Moorella sp HUC22-1, (Sakai et al., Biotechnology Letters 29: págs. 1607-1612), y las del género Carboxydothermus (Svetlichny, V.A., Sokolova, T.G. et al. (1991), Systematic and Applied Microbiology 14: 254-260). Otros ejemplos incluyen Morelia thermoacetica, Moorella thermoautotrophica, Ruminococcus productus, Acetobacterium woodii, Eubacterium limosum, Butyribacterium methylotrophicum, Oxobacter pfennigii, Methanosarcina barkeri, Methanosarcina acetivorans, Desulfotomaculum kuznetsovii (Simpa et al. Critical Reviews in Biotechnology, 2006 Vol. 26. pág. 41-65). También se apreciará que la invención puede aplicarse a un cultivo mixto de dos o más bacterias.

El cultivo de las bacterias que se utilizan en un método de la invención puede realizarse utilizando cualquiera de los diversos procesos conocidos en la materia para cultivar y fermentar sustratos utilizando bacterias anaerobias. En el apartado de "Ejemplos" se proporcionan técnicas ilustrativas. En determinadas realizaciones, se mantiene un cultivo de una bacteria de la invención en un medio de cultivo acuoso. Preferentemente el medio de cultivo acuoso es un medio de crecimiento microbiano anaerobio mínimo. Los medios adecuados son conocidos en la materia y se describen, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.° 5.173.429 y 5.593.886, en el documento WO 02/08438 y en Klasson et al. [(1992). Bioconversion of Synthesis Gas into Liquid or Gaseous Fuels. Enz. Microb. Technol. 14:602-608.], Najafpour y Younesi [(2006). Ethanol and acetate synthesis from waste gas using batch culture of Clostridium ljungdahlii. Enzyme and Microbial Technology, Volumen 38, números 1-2, pág. 223-228] y Lewis et al. [(2002). Making the connection-conversion of biomass-generated producer gas to ethanol. Abst. Bioenergy, pág. 2091-2094]. En realizaciones particulares de la invención, el medio de crecimiento microbiano anaerobio mínimo es como se describe más adelante en la sección de ejemplos. A modo de ejemplo adicional, pueden utilizarse los procesos descritos en general en las siguientes divulgaciones que utilizan sustratos gaseosos para la fermentación: WO98/00558, M. Dernier y D.Weuster-Botz (2010). Reaction Engineering Analysis of Hydrogenotrophic Production of Acetic Acid by Acetobacterium woodii. Biotechnology and Bioengineering 2010; D.R. Martin, A. Misra y H. L. Drake (1985). Dissimilation of Carbon Monoxide to Acetic Acid by Glucose-Limited Cultures of Clostridium thermoaceticum. Applied and Environmental Microbiology, Volumen 49, N.° 6, páginas 1412-1417. Normalmente, la fermentación se realiza en cualquier biorreactor adecuado, tal como un reactor de tanque con agitación continua (CTSR), un reactor de columna de burbujas (BCR, del inglés bubble column reactor) o un reactor de lecho de goteo (TBR, del inglés trickle bedreactor). Además, en algunas realizaciones de la invención, el biorreactor puede comprender un primer reactor de crecimiento, en el que se cultivan los microorganismos, y un segundo reactor de fermentación, al que puede suministrarse caldo de fermentación desde el reactor de crecimiento y en el que se produce la mayor parte del producto de fermentación (por ejemplo, etanol y acetato).

Materia prima

La fuente de carbono para la fermentación es un sustrato gaseoso que comprende al menos un 25 % de monóxido de carbono, opcionalmente en combinación con hidrógeno. El sustrato gaseoso puede ser un gas residual que contiene CO y opcionalmente H2 obtenido como subproducto de un proceso industrial o de alguna otra fuente.

Como se ha descrito anteriormente, la fuente de carbono para la reacción de fermentación es un sustrato gaseoso que contiene al menos 25 % de CO. El sustrato gaseoso puede comprender además CO2 y H2. El sustrato gaseoso puede ser un gas residual que contiene CO o CO y CO2 obtenido como subproducto de un proceso industrial, o de alguna otra fuente, como los gases de escape de los automóviles. En determinadas realizaciones, el proceso industrial se selecciona del grupo que consiste en la fabricación de productos de metales ferrosos, tales como un molino de acero, fabricación de productos no ferrosos, procesos de refinamiento de petróleo, gasificación de carbón, producción de energía eléctrica, producción de negro de carbono, producción de amoniaco, producción de metanol y fabricación de coque. En estas realizaciones, el gas que contiene CO puede ser capturado del proceso industrial antes de ser emitido a la atmósfera, usando cualquier método conveniente. Dependiendo de la composición del sustrato gaseoso que contiene CO, también puede ser deseable tratarlo para retirar cualquier impureza no deseada, tal como partículas de polvo antes de introducirlo a la fermentación. Por ejemplo, el sustrato gaseoso puede filtrarse o lavarse usando métodos conocidos.

Además, a menudo es deseable aumentar la concentración de CO o CO2 de una corriente de sustrato (o presión parcial en un sustrato gaseoso) y así aumentar la eficacia de las reacciones de fermentación donde el CO o el CO2 es un sustrato. El aumento de la presión parcial de CO o CO2 en un sustrato gaseoso aumenta la transferencia de masa a un medio de fermentación. La composición de las corrientes de gas que se utilizan para su suministro a una reacción de fermentación puede tener un impacto significativo sobre la eficacia y/o los costes de esa reacción. Por ejemplo, el O2 puede reducir la eficacia de un proceso de fermentación anaerobia. El procesamiento de gases no deseados o innecesarios en las etapas de un proceso de fermentación antes o después de la fermentación puede aumentar la carga en dichas fases (por ejemplo, cuando la corriente de gas se comprime antes de entrar en un biorreactor, puede utilizarse energía innecesaria para comprimir gases que no son necesarios en la fermentación). En consecuencia, puede ser deseable tratar las corrientes de sustrato, particularmente corrientes de sustrato procedentes de fuentes industriales, para retirar componentes no deseados y aumentar la concentración de componentes deseables.

Las corrientes de gas ricas en hidrógeno se producen mediante una variedad de procesos que incluyen la reformación con vapor de hidrocarburos y, en particular, la reformación con vapor de gas natural. La oxidación parcial de carbón o hidrocarburos también es una fuente de gas rico en hidrógeno. Otras fuentes de gas rico en hidrógeno incluyen la electrólisis del agua, subproductos de células electrolíticas utilizadas para producir cloro y de diversas corrientes químicas y de refinería.

El sustrato gaseoso puede comprender además CO2. Las corrientes de gas con alto contenido de CO2 proceden de una variedad de procesos industriales. Estos procesos incluyen la producción de cemento y cal, y la producción de hierro y acero.

Mezcla de corrientes

Como se ha indicado anteriormente, puede ser deseable combinar una corriente de desechos industriales con una o más corrientes adicionales para mejorar la eficacia, la producción de ácido y/o alcohol y/o la captura general de carbono de la reacción de fermentación.

En consecuencia, cuando las corrientes industriales tienen alto contenido de CO, pero incluyen una cantidad mínima o nada de H2, puede ser deseable mezclar una o más corrientes que comprenden H2 con la corriente residual que comprende CO, antes de proporcionar la corriente de sustrato mezclada al fermentador. La eficacia global, la productividad de alcohol y/o la captura general de carbono de la fermentación dependerán de la estequiometría del CO y el H2 en la corriente mezclada. Sin embargo, en realizaciones particulares, la corriente mezclada puede comprender sustancialmente CO y H2 en las siguientes relaciones molares: al menos 1:2, al menos 1:4, o al menos 1:5, o al menos 1:6, o al menos 1:8 o al menos 1:10.

La mezcla de corrientes también puede tener otras ventajas, en particular en casos donde una corriente residual que comprende CO, y opcionalmente H2, es de naturaleza intermitente. Por ejemplo, una corriente residual intermitente ^{que comprende} C^{o y o H2 puede mezclarse con una corriente sustancialmente continua que comprende CO y/o H2 y} suministrarse al fermentador. En realizaciones particulares de la invención, la composición y caudal de la corriente sustancialmente continua pueden variarse según la corriente intermitente para mantener la provisión de una corriente de sustrato de composición y caudal sustancialmente continuos al fermentador.

La mezcla de dos o más corrientes para lograr una composición deseable puede implicar caudales variables de todas las corrientes, o una o más corrientes pueden mantenerse constantes mientras que otras corrientes se varían para "recortar" u optimizar la corriente del sustrato a la composición deseada. Para corrientes que se procesan continuamente, puede ser necesario poco o ningún tratamiento adicional (tal como tamponamiento) y la corriente se puede proporcionar al fermentador directamente. Sin embargo, puede ser necesario proporcionar almacenamiento intermedio para corrientes en donde una o más están disponibles de manera intermitente, y/o cuando las corrientes están disponibles continuamente, pero se usan y/o producen a tasas variables.

Los expertos en la materia entenderán que será necesario controlar la composición y caudales de las corrientes antes de la mezcla. El control de la composición de la corriente mezclada puede conseguirse variando las proporciones de las corrientes constituyentes para lograr una composición objetivo o deseable. Por ejemplo, una corriente de gas de carga base puede tener principalmente CO y una corriente de gas secundaria que comprende una elevada concentración de H2 pueden mezclarse para conseguir una relación específica H2:CO. La composición y caudal de la corriente mezclada se pueden controlar por cualquier medio conocido en la materia. El caudal de la corriente mezclada puede controlarse independientemente de la operación de mezcla; sin embargo, las velocidades a las que se pueden extraer las corrientes constituyentes individuales deben controlarse dentro de límites. Por ejemplo, una corriente producida intermitentemente, extraída continuamente de almacenamiento intermedio, debe extraerse a una velocidad tal que la capacidad de almacenamiento intermedio no se agote ni se llene hasta su capacidad.

En el punto de mezcla, los gases constituyentes individuales entrarán en una cámara de mezcla, que normalmente será un recipiente pequeño o una sección de tubería. En dichos casos, el recipiente o tubería puede estar provisto de dispositivos de mezcla estática, tales como deflectores, dispuestos para promover turbulencia y rápida homogeneización de los componentes individuales.

El almacenamiento intermedio de la secuencia combinada también se puede proporcionar, si fuera necesario, para mantener la provisión de una corriente de sustrato sustancialmente continua al biorreactor.

Un procesador adaptado para controlar la composición y los caudales de las corrientes constituyentes y controlar la mezcla de las corrientes en proporciones adecuadas para lograr la mezcla requerida o deseable, se puede incorporar opcionalmente en el sistema. Por ejemplo, pueden proporcionarse componentes particulares de la manera requerida o disponible para optimizar la eficacia de productividad del acetato y/o la captura general de carbono.

El sistema está adaptado para controlar continuamente los caudales y las composiciones de al menos dos corrientes y combinarlos para producir una única corriente de sustrato mezclada de composición óptima, y medios para pasar la corriente de sustrato optimizada al fermentador.

A modo de ejemplo no limitante, realizaciones particulares de la invención implican la utilización de gas monóxido de carbono de un proceso de producción de acero. Normalmente, tales corrientes contienen poco o nada de H2, por tanto, puede ser deseable combinar la corriente que comprende CO con una corriente que comprende H2 para lograr una relación CO:H₂ más deseable. El H2 a menudo se produce en grandes cantidades en una acería en el horno de coque. En consecuencia, una corriente residual del horno de coque que comprende H2 puede mezclarse con una corriente residual de horno de acero que comprende CO para lograr una composición deseable.

Las corrientes de sustrato procedentes de una fuente industrial suelen tener una composición variable. Asimismo, las corrientes de sustrato procedentes de fuentes industriales que comprenden elevadas concentraciones de CO (tales como, por ejemplo, al menos un 40 % de CO, al menos un 50 % de CO o al menos un 65 % de CO) suelen tener un bajo componente de H2 (tal como menos del 20 %, o menos del 10 % o sustancialmente el 0 %). Como tal, es particularmente deseable que los microorganismos sean capaces de producir productos mediante fermentación anaerobia de sustratos que comprenden una variedad de concentraciones de CO y H2, en particular concentraciones elevadas de CO y concentraciones bajas de H2. Las bacterias de la presente invención tienen una tasa de crecimiento y una tasa de producción de acetato sorprendentemente elevadas mientras fermentan un sustrato que comprende CO (y no H2).

Se apreciará que el método de la presente invención, como se describe en el presente documento, se puede utilizar para reducir las emisiones totales de carbono atmosférico de los procesos industriales, mediante la captura de los gases que contienen CO producidos como resultado de dichos procesos y utilizándolos como sustratos para los procesos de fermentación descritos en el presente documento.

Como alternativa, en otras realizaciones de la invención, el sustrato gaseoso que contiene CO puede proceder de la gasificación de biomasa. El proceso de gasificación implica la combustión parcial de biomasa en una alimentación restringida de aire u oxígeno. El gas resultante comprende principalmente CO y H2, con volúmenes mínimos de CO2, metano, etileno y etano. Por ejemplo, los subproductos de biomasa obtenidos durante la extracción y el procesamiento de productos alimenticios, tales como azúcar de caña de azúcar o el almidón de maíz o granos, o los residuos de biomasa no alimentaria generados por la industria forestal, pueden gasificarse para producir un gas que contiene CO adecuado para su uso en la presente invención.

Generalmente se prefiere que el sustrato gaseoso que contiene CO contenga una proporción mayoritaria de CO. En el método de la invención, el sustrato gaseoso comprende al menos un 25 %, por ejemplo, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 40 %, al menos aproximadamente un 50 %, al menos aproximadamente un 65 % o al menos de aproximadamente un 70 % a aproximadamente un 95 % de CO por volumen. No es necesario que el sustrato gaseoso contenga hidrógeno. El sustrato gaseoso también contiene opcionalmente CO2, tal como de aproximadamente un 1 % a aproximadamente un 30 % por volumen, tal como de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 10 % de CO2.

Estequiometría de la reacción

Se ha demostrado que las bacterias anaerobias producen etanol y ácido acético a partir de CO, CO2 y H2 a través de la vía bioquímica de la acetil-CoA.

La estequiometría para la formación de acetato a partir de un sustrato que comprende CO mediante microorganismos acetogénicos es la siguiente:

4CO 2 H₂O → CH₃COOH 2CO2

Y en presencia de H2.

4CO 4H² → 2CH₃COOH

También se ha demostrado que las bacterias anaerobias producen ácido acético a partir de CO2 y H2. La estequiometría para la formación de acetato a partir de un sustrato que comprende CO2 y H2 mediante bacterias acetogénicas que incluyen Acetobacterium woodii.

4H² + 2CO2 → CH₃COOH 2 H₂O

Se apreciará que para que se produzca el crecimiento de las bacterias y la fermentación de CO, CO2 y H2 a acetato, además del gas sustrato que contiene CO, CO2 y/o H2, será necesario suministrar al biorreactor un medio nutritivo líquido adecuado. El medio nutritivo contendrá vitaminas y minerales suficientes para permitir el crecimiento del microorganismo utilizado. Se conocen en la materia medios anaerobios adecuados para la fermentación de etanol usando CO como única fuente de carbono. Por ejemplo, los medios adecuados se describen en las patentes de EE. UU. n.° 5.173.429 y 5.593.886, y en el documento WO 02/08438, así como en otras publicaciones mencionadas anteriormente en el presente documento. En una realización de la invención, el medio es como se describe en la sección de ejemplos más adelante.

Es deseable que la fermentación se lleve a cabo en condiciones adecuadas para que se produzca la fermentación de CO, o CO2 y H2, a acetato. Las condiciones de reacción que deben considerarse incluyen presión, temperatura, caudal de gas, caudal de líquido, pH de los medios, potencial redox de los medios, velocidad de agitación (en caso de utilizar un reactor de tanque agitado de flujo continuo), nivel de inóculo, concentraciones máximas de sustrato gaseoso para garantizar que el Co o el CO2 en la fase líquida no se vuelve limitante, y concentraciones máximas del producto para evitar inhibición del producto.

En una realización, la fermentación se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 34 °C a aproximadamente 37 °C. En una realización particular, la fermentación se lleva a cabo a una temperatura de aproximadamente 34 °C. Los inventores señalan que este intervalo de temperatura puede ayudar a respaldar o aumentar la eficiencia de la fermentación, lo que incluye, por ejemplo, mantener o aumentar la tasa de crecimiento de las bacterias, extender el período de crecimiento de las bacterias, mantener o aumentar la producción de metabolitos (incluido el acetato), mantener o aumentar la captación o consumo de CO o CO2.

Las condiciones óptimas de reacción dependerán en parte del microorganismo particular de la invención usado. Sin embargo, en general, se prefiere que la fermentación se realice a una presión superior a la presión ambiente. Operar a presiones aumentadas permite un aumento significativo en la tasa de transferencia de CO y/o CO2 de la fase gaseosa a la fase líquida, donde puede absorberse por el microorganismo como fuente de carbono para la producción de acetato. Esto a su vez significa que el tiempo de retención (definido como el volumen de líquido en el biorreactor dividido entre el caudal de gas de entrada) puede reducirse cuando los biorreactores se mantienen a presión elevada en lugar de a presión atmosférica.

Además, puesto que una tasa de conversión de CO, o CO2 y H2, a acetato determinada es en parte una función del tiempo de retención del sustrato, y que a su vez conseguir un tiempo de retención deseado dictamina el volumen necesario de un biorreactor, el uso de sistemas presurizados puede reducir en gran medida el volumen necesario del biorreactor y, en consecuencia, el coste de capital del equipo de fermentación.

Levadura que utiliza ácidos como sustrato para la producción de lípidos

La invención tiene aplicabilidad particular para ayudar a la producción de lípidos a partir de sustratos que contienen acetato. Uno de dichos tipos de sustrato es el acetato procedente de la conversión de gases de CO y opcionalmente H2, o CO2 y H2, mediante fermentación microbiana anaerobia.

Se conocen procesos para la producción de lípidos a partir de fuentes de carbono, tales como la glucosa, xilosa, lactosa, glicerol y etanol (Chi et al., "Oleaginous yeast Cryptococcus curvatus culture with dark fermentation hydrogen production effluent as feedstock for microbial lipid production" International Journal of Hydrogen Energy, Vol. 36, 2011, pág. 9542-9550.) Los procesos ilustrativos incluyen los descritos, por ejemplo, por Chi et al.

Se sabe que varias levaduras oleaginosas son capaces de realizar la fermentación de azúcares a lípidos, y son adecuadas para su uso en el proceso de la presente invención. Ejemplos de tales levaduras que son adecuadas para usar en la invención incluyen las del género Cryptococcus, tales como cepas de Cryptococcus curvatus (también conocida como Candida curvatus) (Chi et al.)

Se ha mostrado que Cryptococcus curvatus produce lípidos mediante la fermentación de sustratos que comprenden acetato. Chi et al. demostraron la capacidad de C. curvatus para producir lípidos en la fermentación de acetato.

La producción de lípidos mediante la fermentación de C. curvatus se ha demostrado que se mejora mediante la limitación de nitrógeno. Se ha demostrado que una relación de carbono a nitrógeno de 49:1 tiene un impacto significativo en la producción de lípidos. Se sabe que C. curvatus crece en varias fuentes de carbono, incluyendo glucosa, acetato y etanol, El pH ideal para el crecimiento de C. curvatus es pH 7.

La capacidad de C. curvatus para crecer en acetato y etanol, hace que las corrientes de productos del proceso de fermentación de CO y H2, o CO2 y H2, descrito en el presente documento, sean sustratos de fermentación ideales para las fermentaciones de levadura. La corriente del producto de la fermentación de CO2/H₂ es particularmente ideal, ya que es rico en acetato. En realizaciones particulares de la invención, el pH de la corriente del producto de la fermentación se puede ajustar a aproximadamente pH 7.

Otras levaduras adecuadas incluyen las de los géneros, Candida, Lipomyces, Rhodosporidium, Rhodotorula, Saccharomyces y Yarrowia. Además, debe entenderse que otras levaduras oleaginosas pueden utilizarse en la presente invención como entendería un experto en la materia. También se entenderá que la invención se puede aplicar a un cultivo mixto de dos o más levaduras.

El cultivo de la levadura usada en un método de la invención puede realizarse usando cualquier número de procesos conocidos en la materia para cultivar y fermentar sustratos usando levaduras oleaginosas.

Normalmente, la fermentación se realiza en cualquier biorreactor adecuado, tal como un reactor de tanque con agitación continua (CTSR), un reactor de columna de burbujas (BCR) o un reactor de lecho de goteo (^t B^r ). En determinadas realizaciones, el biorreactor de levadura necesitará una entrada de oxígeno o aire para el crecimiento de la levadura.

La levadura contenida dentro del biorreactor secundario es capaz de convertir el acetato en lípidos, en donde los lípidos se acumulan dentro de la fracción de membrana de la biomasa. Después de la acumulación de lípidos, la biomasa del biorreactor secundario se puede pasar a un sistema de extracción. En determinadas realizaciones, el sistema de extracción se utiliza para la extracción de los lípidos acumulados de la fracción de membrana de la biomasa de levadura. La extracción de lípidos puede llevarse a cabo utilizando cualquier número de procesos conocidos en la materia.

Los lípidos producidos mediante el proceso de la invención pueden procesarse adicionalmente para proporcionar productos químicos, combustibles o componentes de combustible seleccionados del grupo que comprende diésel, hidrocarburos, HDRD, FAME y FAEE mediante medios bien conocidos en la materia. Diversos derivados, tales como productos de limpieza y cuidado personal, utilizan componentes como tensioactivos, alcoholes grasos y ácidos grasos, todos los cuales pueden proporcionar lípidos como sustituto. Adicionalmente, se pueden producir varios oleoquímicos a partir de lípidos.

Reciclaje de medios

La eficacia de los procesos de fermentación de la invención puede mejorarse adicionalmente mediante un proceso adicional de reciclaje de una corriente que sale del biorreactor secundario a al menos un reactor primario. La corriente que sale del biorreactor secundario puede contener metales, sales y otros componentes nutritivos no utilizados. Al reciclar la corriente de salida a un reactor primario, puede reducirse el coste de proporcionar un medio nutriente continuo al reactor primario. Esta etapa de reciclaje tiene el beneficio adicional de reducir los requisitos de agua del proceso de fermentación continua. La corriente que sale del biorreactor puede tratarse antes de volver a pasar a un reactor primario.

Asimismo, la etapa de reciclaje es beneficiosa porque ayuda a reducir los costes de control de pH en el biorreactor primario. La acumulación de producto de acetato da como resultado una disminución del pH en el caldo del biorreactor primario, lo cual es nocivo para el cultivo suspendido en los medios. En dichos casos de acumulación de acetato, una base, tal como NH3 o NaOH, debe añadirse a los medios para aumentar el pH. Pasando el caldo al biorreactor secundario y después reciclándolo de nuevo al biorreactor primario, las levaduras oleaginosas del biorreactor secundario se utilizan para consumir el acetato y, por tanto, aumentar el pH de los medios devueltos al biorreactor primario. Esto reduce la necesidad de añadir costosas bases a los medios del reactor primario a medida que el acetato se elimina del sistema a través del biorreactor secundario.

En realizaciones preferidas, la biomasa se separa y procesa para recuperar uno o más productos lipídicos. La corriente sustancialmente libre de biomasa puede pasar después a un reactor primario. De manera alternativa, la corriente libre de biomasa puede tratarse adicionalmente para eliminar proteínas solubles u otros componentes no deseados antes de pasar al reactor primario. Se pueden añadir metales y sales adicionales a la corriente que retorna al reactor primario para proporcionar una corriente de nutrientes que tenga una composición deseada. El pH de la corriente se puede controlar y ajustar según el proceso de fermentación que ocurre en el reactor primario.

Como las levaduras necesitan oxígeno para crecer en el biorreactor secundario, cualquier medio reciclado de regreso al biorreactor primario necesitará eliminar sustancialmente todo el oxígeno, ya que cualquier oxígeno presente en el biorreactor primario será perjudicial para el cultivo anaerobio. Por tanto, la corriente del caldo que sale del biorreactor secundario puede pasar a través de un depurador de oxígeno para eliminar sustancialmente todo el oxígeno antes de pasar al reactor primario.

El método de la invención se describe en el presente documento por referencia a las figuras. Las figuras que ilustran realizaciones que quedan fuera del alcance de las reivindicaciones se incluyen a modo de referencia. En la figura 1 se muestra un sistema de dos etapas para la producción de lípidos a partir de una corriente gaseosa que comprende CO y H2, o CO2 y H2. El sistema proporciona un biorreactor primario 101 que tiene una entrada de medio 102, un puerto de entrada de gas 103, un medio separador 104, una salida de corriente de permeado 107 y una salida de corriente de purga 108. El biorreactor primario está conectado a un biorreactor secundario 201, que tiene un separador 205, una salida de corriente de permeado 207 y una salida de corriente de purga 208.

Durante el uso, el biorreactor primario 101 contiene caldo de fermentación que comprende un cultivo de una o más bacterias acetogénicas en un medio nutriente líquido. Se añade medio al biorreactor 101 de manera continua o semicontinua a través de la entrada de medios 102. Se suministra un sustrato gaseoso al biorreactor 101 a través del puerto de entrada de gas 103. El medio separador está adaptado para recibir al menos una parte de caldo del biorreactor 101 a través de un primer conducto de salida 104 y pasarlo a través del separador 105 configurado para separar sustancialmente las células del microorganismo (el retenido) del resto del caldo de fermentación (el permeado). Al menos una parte del retenido se devuelve al primer biorreactor a través de un primer conducto de retorno 106 que asegura que la densidad del cultivo del caldo se mantenga a un nivel óptimo. El separador 105 está adaptado para pasar al menos una del permeado fuera del biorreactor 101 a través de un conducto de suministro de permeado 107. El conducto de suministro de permeado conduce el permeado libre de células al biorreactor secundario 201. En determinadas realizaciones de la invención, al menos una parte del permeado libre de células se elimina para la extracción del producto o se recicla antes de que la corriente del permeado se suministre al biorreactor secundario 201. Se proporciona una salida de purga de caldo 108 para suministrar directamente el caldo desde el biorreactor primario 101 al biorreactor secundario 202. En determinadas realizaciones, la purga del caldo y la purga del permeado se combinan antes de suministrarse al biorreactor secundario. Puede ser deseable purificar la corriente antes de pasar al biorreactor secundario para asegurar una relación carbono:nitrógeno de al menos 10:1, o al menos 25:1 o al menos 49:1.

El biorreactor secundario 202 contiene un cultivo de una levadura oleaginosa más en un medio nutriente líquido. El biorreactor secundario recibe caldo y permea desde el biorreactor primario de manera continua o semicontinua a través de la salida de purga del caldo 108 y el conducto de suministro de permeado 107. El medio separador está adaptado para recibir al menos una parte de caldo del biorreactor 201 a través de un primer conducto de salida 204 y pasarlo a través del separador 205 configurado para separar sustancialmente las células del microorganismo (el retenido) del resto del caldo de fermentación (el permeado). Al menos una parte del retenido se devuelve al primer biorreactor a través de un primer conducto de retorno 206 que asegura que la densidad del cultivo del caldo se mantenga a un nivel óptimo. El separador 205 está adaptado para hacer pasar al menos una parte del permeado fuera del biorreactor 201 a través de un conducto de retirada de permeado 207. Se proporciona una salida de purga del caldo 208 para eliminar directamente el caldo del biorreactor secundario 201. La corriente de purga del caldo se trata para eliminar la biomasa para extracción de lípidos utilizando métodos conocidos. La corriente de purga sustancialmente libre de biomasa y las corrientes de permeado se combinan para producir una corriente combinada. En realizaciones de la divulgación, la corriente combinada puede devolverse al reactor primario para complementar el medio nutriente líquido que se añade continuamente. En determinadas realizaciones puede ser deseable procesar adicionalmente la corriente de reciclaje para retirar cualquier subproducto no deseado de la fermentación secundaria. En determinadas realizaciones, puede ajustarse el pH de la corriente de reciclaje y añadir vitaminas y metales adicionales para complementar la corriente.

En la figura 2 se muestra un sistema simplificado para la producción de lípidos a partir de una corriente gaseosa que comprende CO y H2, o CO2 y H2, en donde el medio sustancialmente libre de acetato se recicla desde el biorreactor secundario al biorreactor primario. El sistema incluye un biorreactor anaerobio primario 301 que tiene una entrada de medio 302, un puerto de entrada de gas 303, una corriente de purga que contiene acetato 304, un biorreactor aerobio secundario 305, una fuente de oxígeno 306, una corriente de producto 307 que contiene lípidos y biomasa y una corriente de medios reciclados empobrecidos en acetato.

Durante el uso, el biorreactor primario 301 contiene caldo de fermentación que comprende un cultivo de una o más bacterias acetogénicas en un medio nutriente líquido. Se añade medio al biorreactor 301 de manera semicontinua a través de la entrada de medios 302. Un sustrato gaseoso que comprende CO y opcionalmente H₂, o CO₂ y H₂, o mezclas de los mismos, se suministra al biorreactor primario 301 a través de un puerto de entrada de gas 303, en donde el gas se convierte a acetato mediante las bacterias. El biorreactor primario 301 se mantiene a un pH en el intervalo de 6,5 a 7, con pH parcialmente controlado mediante la adición de base según sea necesario. El producto de acetato sale del biorreactor primario en una corriente de caldo acuoso 304, que se suministra a un biorreactor aerobio secundario 305. En el biorreactor secundario 305, el acetato en el caldo acuoso se convierte en lípidos y biomasa no lipídica mediante la levadura oleaginosa. El oxígeno se suministra a la fermentación aerobia mediante un puerto de entrada de oxígeno o aire 306. Las células de levadura que contienen lípidos se eliminan del biorreactor secundario 305 por filtración, lo que da como resultado una corriente de producto 307 que contiene lípidos y biomasa, y una corriente de permeado 308. Debido a que la fermentación aerobia consume acetato, el pH del caldo aumenta a medida que se consume acetato y, en consecuencia, el pH de la corriente de permeado 308 es nominalmente más elevado que el pH de la corriente del caldo 304 que contiene acetato. La tasa de dilución del biorreactor secundario 305 se mantiene de manera que el pH de la corriente de permeado 308 permanece en el intervalo de 7,0 a 7,5. La corriente de permeado empobrecido en acetato 308 se devuelve al biorreactor primario 301. Además de reciclar una parte sustancial del agua, sales, metales y otros nutrientes que componen los medios del biorreactor primario 301, la corriente de agua reciclada 308 actúa para reciclar la base utilizada dentro del sistema, lo que reduce significativamente el coste del control del pH de la fermentación en relación con un sistema en el que el pH se controla solo mediante la adición directa de base al medio del biorreactor.

Ejemplos

Materiales y métodos

Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención. Las realizaciones que quedan fuera del alcance de las reivindicaciones se incluyen con fines de referencia.

Medio:

continuación

Los dos tipos de Clostridium autoethanogenum utilizados fueron los depositados en el Centro alemán de recursos para material biológico (DSMZ) y se asignaron los números de acceso DSM 19630 y DSM 23693. DSM 23693 se desarrolló a partir de la cepa de Clostridium autoethanogenum DSM19630 (DSMZ, Alemania) a través de un proceso de selección iterativo.

Bacterias: Se obtuvieron Acetobacterium woodii del Centro alemán de recursos para material biológico (DSMZ). El número de registro dado a la bacteria es DSM 1030.

Preparación de Na2S - Un matraz de 500 ml se cargó con Na2S (93,7 g, 0,39 mol) y 200 ml de H₂O. La solución se agitó hasta que la sal se disolvió y se añadió azufre (25 g, 0,1 mol) bajo flujo constante de N2. Después de 2 horas de agitación a temperatura ambiente, la solución de "Na₂Sx" (aprox. 4 M con respecto a [Na] y aprox. 5 M con respecto al azufre), ahora un líquido transparente de color marrón rojizo, se transfirió a frascos de suero purgados con N2 envueltos en papel de aluminio.

Preparación de la solución de Cr (II) - Se equipó un matraz de tres bocas de 1 l con una entrada y salida estancas al gas para permitir el trabajo bajo gas inerte y la posterior transferencia del producto deseado a un matraz de almacenamiento adecuado. El matraz se cargó con CrCb 6H₂O (40 g, 0,15 mol), gránulos de zinc [malla 20] (18,3 g, 0,28 mol), mercurio (13,55 g, 1 ml, 0,0676 mol) y 500 ml de agua destilada. Después de enjuagar con N2 durante una hora, la mezcla se calentó a aproximadamente 80 °C para iniciar la reacción. Después de dos horas de agitación bajo un flujo constante de N2, la mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se agitó continuamente durante otras 48 horas, momento en el que la mezcla de reacción se había convertido en una solución de color azul intenso. La solución se transfirió a frascos de suero purgados con N2 y se almacenaron en el refrigerador para uso futuro.

Procedimientos de muestreo y analíticos:

Se tomaron muestras de medios a intervalos durante un período de 30 días

Todas las muestras se usaron para establecer la absorbancia a 600 nm (espectrofotómetro) y el nivel de sustratos y productos (GC o HPLC). Se usó HPLC rutinariamente para cuantificar el nivel de acetato.

HPLC: Sistema HPLC Agilent Serie 1100. Fase móvil: Ácido sulfúrico 0,0025 N. Flujo y presión: 0,800 ml/min. Columna: Alltech IOA; N.° de Catálogo 9648, 150 x 6,5 mm, tamaño de partícula 5 μm. Temperatura de la columna: 60 °C. Detector: Índice de refracción. Temperatura del detector: 45 °C.

Método para la preparación de la muestra: Se cargan 400 μl de muestra y 50 μl de ZnSO⁴0,15 M y 50 μl de Ba(OH)₂ 0,15 M en un tubo de Eppendorf. Los tubos se centrifugan durante 10 min. a 12.000 rpm, 4 °C. Se transfieren 200 μl del sobrenadante a un frasco de HPLC y se inyectan 5 μl en el instrumento de HPLC.

Análisis del espacio libre superior: Las mediciones se realizaron en un micro GC Varian CP-4900 con dos canales instalados. El canal 1 era un columna de tamiz molecular de 10 m que funcionaba a 70 °C, 200 kPa de argón y un tiempo de retroenjuagado de 4,2 s, mientras que el canal 2 era un columna PPQ de 10 m que funcionaba a 90 °C, 150 kPa de helio y sin retroenjuagado. La temperatura del inyector para ambos canales fue de 70 °C. Los tiempos de análisis se establecieron en 120 s, pero todos los picos de interés normalmente eluían antes de los 100 s. El espacio libre superior del fermentador se analizó automáticamente mediante Gas-GC (Varian 4900 Micro-GC) cada hora.

Densidad celular: La densidad celular se determinó contando las células bacterianas en una alícuota definida de caldo de fermentación. Como alternativa, se midió la absorbancia de las muestras a 600 nm (espectrofotómetro) y se determinó la masa seca mediante el cálculo de acuerdo con los procedimientos publicados.

Ejemplo 1: Fermentación de CO en biorreactor para producir acetato:

Una reserva de glicerol de un Clostridium autoethanogenum fue revivido en botellas de suero. La reserva de glicerol almacenado a 80 °C se descongeló lentamente y se transfirió a la botella de suero con una jeringa. Este proceso se llevó a cabo dentro de una cámara anaerobia. La botella de suero inoculado se retiró posteriormente de la cámara anaerobia y se presurizó a un total de 310,24 kPa (45 psi) utilizando una mezcla de gases que contenía CO (CO al 40 %, H2 al 3 %, CO2 al 21 % y N2 al 36 %). A continuación, la botella se colocó horizontalmente en un agitador dentro de una incubadora a una temperatura de 37 °C. T ras dos días de incubación y tras comprobar que el cultivo crecía, la botella se utilizó para inocular otro conjunto de ocho botellas de suero que contenían gas con 5 ml de este cultivo. Estas botellas de suero se incubaron durante otro día como se describe anteriormente y después se utilizaron para inocular 5 l de medio líquido que se preparó en un CSTR de 10 l. El flujo inicial de gas que contenía CO se fijó en 100 ml/min y la velocidad de agitación se fijó en un mínimo de 200 rpm. Cuando los microbios comenzaron a consumir gas, la agitación y los flujos de gas aumentaron a 400 rpm y 550 ml/min. Después de dos días de crecimiento en modo discontinuo, el fermentador se volvió continuo con una tasa de dilución de 0,25 l/día. La tasa de dilución se aumentó en 0,25 l/día hasta un valor de 1 l/día cada 24 h.

El crecimiento de metabolitos y microbios se puede ver en la figura 3. La concentración de acetato en el reactor va desde alrededor de 10 g/l a más de 20 g/l. La tasa de dilución fue 1,0. Las tasas de productividad de acetato variaron entre 10 g/l/día y más de 20 g/l/día. La relación de acetato a etanol varió entre alrededor de 5:1 y alrededor de 18:1.

Ejemplo 2: Fermentación de CO2 y H2 en biorreactor para producir acetato:

El medio a pH 6,5 se preparó utilizando el protocolo definido por Balch et al. (Véase, por ejemplo, Balch et al., (1977) International Journal of Systemic Bacteriology., 27:355-361). Un reactor de tres litros se llenó con 1500 ml del medio. Se retiró el oxígeno del medio mediante rociado continuo con N₂. El gas se cambió de N₂ a una mezcla de H₂ al 60 %, CO₂ al 20 %, y N₂ al 20 % 30 minutos antes de la inoculación. El inóculo (150 ml) provino de un cultivo continuo de Acetobacterium woodii suministrado con la misma mezcla de gases. El biorreactor se mantuvo a 30 °C y se agitó a 200 rpm en el momento de la inoculación. Durante la siguiente fase de crecimiento del lote, la agitación se aumentó gradualmente a 600 rpm. El flujo de gas se incrementó en 50 ml/min de acuerdo en función del descenso de H₂/CO₂ en el espacio libre superior como resultado del aumento de la biomasa. Para compensar el ácido acético producido, el pH se controló automáticamente a 7 usando NaOH 5 M. Durante la fermentación, se bombeó una solución 0,5 M de Na₂S al fermentador a una velocidad de 0,2 ml/hora. El cultivo se hizo continuo después de 1 día. Para alcanzar una alta biomasa junto con un alto consumo de gas, es necesario mantener la concentración de acetato en el fermentador a niveles inferiores a 20 g/l. Esto se realizó haciendo funcionar el fermentador a una velocidad de dilución relativamente alta (D~1,7/día) mientras se mantenían los microbios en el fermentador con un sistema de filtración de membrana de polisulfona con un tamaño de poro de 0,1 μm (membrana de fibra hueca de GE Healthcare). El medio para el cultivo continuo fue la solución A excluyendo la solución compuesta de metal traza, que se suministró por separado a una velocidad de 1,5 ml/hora utilizando una bomba de jeringa automatizada. El medio se desgasificó al menos 1 día antes y se desgasificó continuamente durante todo el proceso de fermentación.

Resultados

Durante un período de treinta días se produce acetato a una concentración de 12,5 g/l. La tasa de productividad de acetato promedió fue 21,8 g/l por día.

La concentración máxima de ácido acético en un cultivo continuo fue de 17,76 g/l (296 mM)

Ejemplo 3 Métodos y materiales

Bacterias: La levadura oleaginosa Cryptococcus curvatus se revivió en medios que contenían glucosa 10 g/l, extracto de levadura 1 g/l y peptona 1 g/l.

1. Los cultivos se inocularon en permeado de un proceso de Acetobacterium woodii. Los cultivos se fermentaron en un matraz cónico (50 ml de medio en un matraz de 250 ml) y a 25 °C y pH 7. C. curvatus creció en el permeado del proceso de A. woodii y convirtió todo el ácido acético presente en el permeado en biomasa. El pH del cultivo aumentó de 7 a 9,3 en el cultivo.

2. Un cultivo de C. curvatus se inoculó en el permeado de la fermentación de CO₂ (ejemplo 2) en CSTR de 2 l. Se añadieron vitamina B y metales. La agitación se ajustó a 300 rpm y el pH se ajustó a pH 6. Durante el análisis, el pH se ajustó a pH 7 y el cultivo mostró el mejor crecimiento a este pH, así como consumo de acetato.

3. Extracción de lípidos: La levadura Cryptococcus curvatus se cultivó en tres medios diferentes, como sigue; (i) medio que comprende 10 g/l de glucosa; (ii) medios que comprenden 15 g/l de acetato de sodio y (iii) permeado de un proceso de fermentación de A. woodii que contenía 15 g/l de acetato. Cada tipo de medio se realizó por duplicado en matraces que contenían 250 ml de medio. Todos los matraces se incubaron a 25 °C inicialmente y después la temperatura se aumentó a 30 °C.

4.

Los lípidos se extrajeron de la biomasa utilizando métodos de extracción conocidos. Dado el tamaño de los matraces, estaba disponible biomasa limitada para su procesamiento. Los resultados son los siguientes: La concentración de lípidos en la biomasa del medio (i) contenía 0,325 %; la concentración de lípidos en la biomasa del medio (ii) fue 2,66 %; y la concentración de lípidos en el medio (iii) fue 4,88 %. En la figura 4a se muestra el crecimiento de C. curvatus que utiliza un sustrato de glucosa (i). En la figura 4b se muestra el crecimiento de C. curvatus que utiliza un sustrato de acetato de un proceso de fermentación de CO₂/H₂ (iii).

La referencia a cualquier técnica anterior en esta memoria descriptiva no es, y no debería tomarse como, un reconocimiento o cualquier forma de indicación de que esa técnica anterior forma parte del conocimiento general común en el campo de la empresa en cualquier país.

A lo largo de esta memoria descriptiva y de cualquiera de las siguientes reivindicaciones, a menos que el contexto requiera otra cosa, las palabras "comprender", "que comprende" y similares, deben interpretarse en un sentido inclusivo en lugar de exclusivo, es decir, en el sentido de "que incluye, pero sin limitación".

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir al menos un producto lipídico a partir de un sustrato gaseoso, comprendiendo el método: i. recibir un sustrato gaseoso que comprende al menos un 25 % de CO por volumen en un biorreactor primario que contiene caldo de fermentación que comprende un cultivo de al menos un microorganismo en un medio nutritivo líquido, y fermentar el sustrato gaseoso para producir al menos un ácido o al menos un ácido y al menos un alcohol; ii. pasar el caldo de fermentación desde el biorreactor primario a un separador para separar las células de microorganismos (el retenido) del resto del caldo de fermentación (el permeado); y

iii. pasar al menos una parte del permeado a un segundo biorreactor que contiene un cultivo de al menos una levadura en un medio nutritivo líquido y fermentar el ácido para producir al menos un producto lipídico, en donde el ácido es acetato y la concentración de acetato producido en el biorreactor primario es de al menos 10 g/l.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el al menos un alcohol se selecciona del grupo que consiste en etanol, butanol, metanol y propanol.

3. El método de la reivindicación 1, en donde la tasa de producción de acetato en el biorreactor primario es de al menos 10 g/l/día.

4. El método de la reivindicación 1, en donde el al menos un microorganismo en el biorreactor primario se selecciona del grupo que consiste en Acetobacterium, Moorella, Clostridium, Ruminococcus, Eubacterium, Butyribacterium, Oxobacter, Methanosarcina y Desulfotomaculum; o la al menos una levadura en el segundo biorreactor se selecciona del grupo que consiste en Cryptococcus, Candida, Lipomyces, Rhodosporidium, Saccharomyces y Yarrowia.

5. El método de la reivindicación 1, en donde el al menos un producto lipídico producido en la etapa (iii) se utiliza para producir al menos un producto terciario seleccionado del grupo que comprende FAME, FAEE, HDRD y biodiésel.

6. El método de la reivindicación 1, en donde la producción de lípidos aumenta en el segundo biorreactor mediante la limitación sustancial de al menos un nutriente en el medio nutritivo líquido.

7. El método de la reivindicación 6, en donde el nutriente limitado es nitrógeno.

8. El método de la reivindicación 1, en donde al menos una parte de una corriente que sale del segundo biorreactor se recicla al biorreactor primario, en donde la concentración de ácido en el caldo reciclado se reduce sustancialmente y en donde el pH en el biorreactor primario se mantiene entre pH 4,5 y 6.

9. El método de la reivindicación 8, en donde la corriente de salida se trata para eliminar sustancialmente toda la biomasa antes de ser reciclada al biorreactor primario.

10. El método de la reivindicación 8, en donde la corriente de salida pasa a través de un módulo de lavado de oxígeno antes de reciclarse al biorreactor primario.

11. El método de la reivindicación 8, en donde el pH de la corriente de salida se ajusta antes de suministrarlo al biorreactor primario.

12. El método de la reivindicación 8, en donde la corriente de salida se trata para eliminar las proteínas solubles y otros componentes no deseados.

13. El método de la reivindicación 1, en donde se recupera al menos una parte del alcohol.

14. El método de la reivindicación 1, en donde se utiliza una serie de reactores primarios para suministrar al menos un reactor secundario.

15. El método de la reivindicación 1, en donde el sustrato gaseoso comprende menos del 20 % en volumen de hidrógeno.