ES2953516T3

ES2953516T3 - Proteínas de unión recombinantes y su uso

Info

Publication number: ES2953516T3
Application number: ES17778226T
Authority: ES
Inventors: Clara Metz; Ulrike Fiedler; Ignacio Dolado; Heike Maria Strobel
Original assignee: Molecular Partners AG
Current assignee: Molecular Partners AG
Priority date: 2016-09-22
Filing date: 2017-09-20
Publication date: 2023-11-14
Anticipated expiration: 2037-09-20
Also published as: CA3036301C; CO2019002609A2; NZ751689A; MX377424B; CL2019000729A1; CN109790206A; JP2019531093A; KR102270315B1; SA519401369B1; IL265489A; EP3515933B1; PH12019500596A1; PH12019500596B1; AU2017331329A1; AU2017331329B2; KR20190050802A; US20180155402A1; EP3515933C0; RU2019111628A; MY196882A

Abstract

Se describen nuevas proteínas de unión recombinantes, que comprenden dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para HER2, y que comprenden dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para albúmina sérica, así como ácidos nucleicos que codifican dichas proteínas de unión recombinantes, composiciones farmacéuticas que comprenden dichas proteínas de unión recombinantes. o ácidos nucleicos y el uso de tales proteínas de unión recombinantes, ácidos nucleicos o composiciones farmacéuticas en el tratamiento de enfermedades. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de unión recombinantes y su uso

Referencia cruzada a solicitud relacionada

La presente solicitud reivindica el beneficio y la prioridad de la solicitud de patente europea EP 16190221 presentada el 22 de septiembre de 2016 en la Oficina Europea de Patentes.

Campo de la invención

Se proporcionan nuevas proteínas de unión recombinantes. Las proteínas comprenden dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el h ER2, y dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, unidos por enlazadores polipeptídicos. Las proteínas de unión recombinantes son útiles para el tratamiento de enfermedades. En particular, las proteínas de unión recombinantes que comprenden dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, presentan una alta estabilidad de almacenamiento. Se proporcionan adicionalmente ácidos nucleicos que codifican dichas proteínas de unión recombinantes, composiciones farmacéuticas que comprenden dichas proteínas de unión recombinantes, o ácidos nucleicos, y el uso de dichas proteínas de unión recombinantes, ácidos nucleicos, o composiciones farmacéuticas en el tratamiento de enfermedades.

Antecedentes de la invención

Las bibliotecas de proteínas de repetición de anquirina diseñadas (documento WO2002/020565; Binz, H.K., Amstutz, P., Kohl, A., Stumpp, M.T., Briand, C., Forrer, P., Grütter, M.G., and Plückthun, A., Nat. Biotechnol. 22, 575-582, 2004; Stumpp, M.T., Binz, H.Kand Amstutz, P., Drug Discov. Today 13, 695-701,2008) se pueden utilizar para la selección de dominios de repetición de anquirina diseñados específicos para una diana. Dichos dominios de repetición de anquirina diseñados específicos para una diana, a su vez se pueden utilizar como componentes valiosos de las proteínas de unión recombinantes para el tratamiento de enfermedades. Se ha descrito la selección de diferentes dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER2 o ErbB2; UniProt P04626) (documento WO2014/083208). En la presente descripción se describen proteínas de unión recombinantes que comprenden dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2.

A diferencia de, p. ej., los anticuerpos IgG, que presentan largas semividas sistémicas mediadas al reciclar FcRn, las proteínas que comprenden dominios de repetición de anquirina diseñados, típicamente, presentan un rápido aclaramiento farmacocinético y semividas terminales cortas, a menos de que la proteína comprenda elementos que mejoren las propiedades farmacocinéticas, tales como, p. ej., un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica descrito en el documento WO2012/069654. El uso de la unión a la albúmina sérica para mejorar las propiedades farmacocinéticas de las proteínas es un procedimiento bien conocido en la técnica (véase, p. ej., el documento WO1991/001743; Frejd F.Y., 2012 [en Kontermann, R (Ed.) “ Therapeutic proteins: strategies to modulate their plasma half-lives” , Wiley-VCH Verlag GmbH, 2012, ISBN 978-3-527-32849 9]; y el documento WO2012/069654). Con el fin de utilizar dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica en candidatos a fármacos clínicos, es deseable que se mejore la estabilidad de almacenamiento de los dominios de repetición de anquirina diseñados conocidos con especificidad de unión para la albúmina sérica. En la presente memoria se describen proteínas de unión recombinantes que comprenden dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, en donde dichos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica presentan mejores propiedades de estabilidad de almacenamiento. Al contrario que con los informes anteriores (Hopp, J., Horning, N., Zettlitz, K.A., Schwarz, A., Fuss, N., Müller, D., Kontermann, R.E. Protein Eng. Des. Sei. 23, 827-834, 2010), los inventores observaron, sorprendentemente, que al tener dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, en vez de uno en la proteína de unión recombinante, las propiedades farmacocinéticas de la proteína de unión recombinante podían mejorarse.

El HER2 juega un importante papel en la patogénesis y la progresión de determinados tipos de cáncer. El HER2 es un receptor trans-membrana tirosina cinasa (RTK) que pertenece a la familia más amplia de receptores ErbB (Bublil, E.M. y Yarden, Y. Curr. Opin. Cell Biol. 19[2], 124-34, 2007). La familia de receptores ErbB se conserva en los vertebrados y también incluye el receptor ErbB1 o el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) o el HER1 (UniProt P00533), y los receptores HER3 (ErbB3; UniProt P21860) y HER4 (ErbB4; UniProt Q15303). Todos los receptores ErbB comparten extensas homologías de secuencia y de dominio, y forman homodímeros funcionales (por ejemplo, ErbB1-ErbB1, HER2-HER2, y HER4-HER4) y heterodímeros en todas las combinaciones. La homodimerización y la heterodimerización del receptor se produce tras unirse al ligando o la sobreexpresión del receptor y, a su vez, activa los dominios del receptor cinasa intracelular mediante la autofosforilación. Esto entonces desencadena la señalización intracelular corriente abajo y las respuestas biológicas. Los antagonistas bien conocidos de las vías de señalización de ErbB incluyen los anticuerpos monoclonales Trastuzumab (que se une al dominio IV del dominio extracelular de HER 2, e inhibe la homodimerización del HER2) y Pertuzumab (que se une al dominio II del dominio extracelular de HER2, e inhibe la heterodimerización de HER2/HER3). De manera importante, el Trastuzumab tiene principalmente un efecto antiproliferativo, y los tumores en estadios avanzados de la enfermedad puede que escapen a dicho tratamiento. El Pertuzumab, que tiene una eficacia terapéutica inesperadamente baja como agente único, puede complementar la actividad del Trastuzumab al interferir la heterodimerización HER2/HER3. Por lo tanto, la combinación de Trastuzumab con Pertuzumab resulta atractiva para el tratamiento del cáncer HER2 positivo (Capelan M., y col., Ann. Oncol., 24, 273-82, 2013).

La combinación de Trastuzumab y Pertuzumab ha dado lugar al concepto de que se necesita un direccionamiento doble de dos dominios en HER2, para una eficacia antitumoral superior. Se ha informado de mezclas de anticuerpos que se dirigen a los dominios II y IV del HER2, o del direccionamiento simultáneo al dominio I y a otro dominio de HER2 (documento US-20110033460; p. ej., también al dominio IV), o al dominio I y al dominio IV (documento WO2014/060365; Jost, Ch., y col., Structure 21, 1-13, 2013; Tamaskovic, R., y col., Nat Commun 7, 11672, 2016), o al dominio II y al dominio IV (documento WO2014/083208), o el direccionamiento simultáneo del epítopo de Trastuzumab en el dominio IV del HER2 y del epítopo de Pertuzumab en el dominio II del HER2 (WO2009/068625). Algunos de los enfoques incluían las proteínas de unión biparatópicas. De manera interesante, algunas de las proteínas de unión biparatópicas ensayadas en WO2009/068625, tuvieron un efecto antagonista, otras tuvieron efectos agonistas. Los informes del documento WO2014/083208 y de Jost, Ch., y col. (loc. cit.; WO2014/060365) indican que la generación de proteínas de unión biparatópicas antagonistas no es sencilla. En vez de eso, tiene que haber una selección cuidadosa optimizada de los dominios individuales (epítopo, propiedades del enlazador), así como de la disposición estructural (orientación, distancia, longitud del enlazador, composición del enlazador), para un antagonismo eficaz. Adicionalmente, la elección de la fracción de ingeniería farmacocinética y su disposición estructural, también se tienen que optimizar. En conjunto, esto representa una elección de entre al menos 250.000 variantes diferentes.

En la presente memoria se describe una proteína de unión recombinante que comprende (i) una proteína de unión biparatópica que antagoniza con la señalización de ErbB, que consiste en dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2, y (ii) dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica y con estabilidad de almacenamiento mejorada. Esta proteína de unión recombinante, un candidato a fármaco DARPin®, demostró ser un valioso candidato a fármaco para el tratamiento de distintas enfermedades. DARPin® es una marca registrada de Molecular Partners AG, Suiza.

Resumen

La invención se refiere a proteínas de unión recombinantes que comprenden cuatro dominios de repetición de anquirina diseñados, en donde dos de dichos cuatro dominios de repetición de anquirina diseñados son dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2, y en donde dos de dichos cuatro dominios de repetición de anquirina diseñados son dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica. En particular, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 21. La invención también se refiere a dicha proteína de unión recombinante, en donde cada uno de dichos dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. En particular, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia con la proteína de unión recombinante que consiste en s Eq ID NO: 21. En una realización, dichos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, que comprenden la SEQ ID NO: 14, presenta cada uno una mejorada estabilidad de almacenamiento en PBS, en comparación con un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13. En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21. En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21. En una realización, la proteína de unión recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 , presenta una mayor estabilidad de almacenamiento que la proteína de unión recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22. En una realización, la proteína de unión recombinante de la invención inhibe la proliferación de células BT474 con una constante de inhibición menor de 10'7 M. En una realización, la proteína de unión recombinante de la invención, a una concentración de 100 nM, presenta una mayor regulación a la baja de la fosforilación AKT-S473 en las células BT474 que Trastuzumab a una concentración de 100 nM. La invención se refiere, adicionalmente, a ácidos nucleicos que codifican la proteína de unión recombinante de la invención. La invención se refiere, adicionalmente, a composiciones farmacéuticas que comprenden la proteína de unión recombinante y/o el ácido nucleico de la invención, y un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptables. La invención también se refiere a la composición farmacéutica de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad, una enfermedad neoplásica, cáncer, cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer gástrico, cáncer de estómago, cáncer uterino, cáncer colorrectal, cáncer de vejiga, cáncer sobreexpresante de HER2, cáncer expresante de HER, cáncer adicto a HER2, cáncer parcialmente adicto a HER2, cáncer amplificado de HER2, cáncer resistente a Trastuzumab, cáncer sensible a Trastuzumab, cáncer gastrointestinal o cáncer cerebral. La invención se refiere, adicionalmente, a un kit que comprende la proteína de unión recombinante de la invención, o un ácido nucleico de la invención, o una composición farmacéutica de la invención. La invención se refiere, adicionalmente, a un método para producir la proteína de unión recombinante de la invención, comprendiendo el método las etapas de (i) expresar dicha proteína de unión recombinante en bacterias, y (ii) purificar dicha proteína de unión recombinante utilizando cromatografía.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. ilustración de proteínas de unión recombinantes con especificidad de unión para el HER2, que comprende dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica.

(a) Ilustración de un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica. Ejemplos de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados son los dominios de repetición de anquirina diseñados que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 12 a 15, en particular, el dominio de repetición de anquirina diseñado que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 14. (b) Ilustración de un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para HER2. Ejemplos de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados son los dominios de repetición de anquirina diseñados que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 16 a 20, en particular, los dominios de repetición de anquirina diseñados que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOs: 16 y 17. (c) Ilustración de un enlazador polipeptídico (por ejemplo, un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que se corresponde con cualquiera de las SEQ ID NOs: 2 a 9, en particular, el enlazador polipeptídico que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9). (d) Ilustración de una secuencia de aminoácidos en el extremo N. Ejemplos de dichas secuencias de aminoácidos en el extremo N, son, por ejemplo, las secuencias MGS o GS (como, por ejemplo, las presentes en el extremo N de cualquiera de las SEQ ID NOs: 21 a 30, y 32 y 33, o etiquetas polipeptídicas, como se ejemplifica mediante las secuencia de aminoácidos correspondiente a la SEQ ID NO: 1. (e) Ilustración de una proteína de unión recombinante, como se proporciona en la presente memoria, que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, y dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2, unidos por enlazadores polipeptídicos, y que tienen una secuencia de aminoácidos en el extremo N. Los dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica están flanqueando los otros dos dominios de repetición de anquirina diseñados. La proteína de unión recombinante que comprende los aminoácidos de la SEQ ID NO: 21, se corresponde con esta ilustración.

Figura 2. Estabilidad de almacenamiento mejorada de una proteína que comprende la SEQ ID NO: 14.

Análisis SDS PAGE al 15 %, de la Proteína n° 13-His (n° 13) y la Proteína n° 14-His (n° 14; véase el Ejemplo 1) almacenadas a 10 mg/ml en PBS durante 1 semana a 4 °C (1), 25 °C (2), 40 °C (3), y 60 °C (4). La Proteína n° 14-His presenta mayor estabilidad de almacenamiento que la Proteína n° 13-His. M: Marcador (banda inferior: 6,5 kDa; banda en el nivel de la Proteína n° 14-His: 14,4 kDa; banda superior en el caso de PAGE de la Proteína n° 14-His: 21,5 kDa).

Figura 3. Inhibición de la proliferación de células BT474 por las proteínas de unión recombinantes con especificidad de unión para el HER2.

La inhibición de la proliferación de células de cáncer de mama BT474 se realizó como se describe en el Ejemplo 6. La proteína de unión recombinante que comprende la SEQ ID NO: 21, presenta una CI50 menor que la proteína de unión recombinante que comprende la SEQ ID NO: 23, lo que indica que tener las SEQ ID NOs: 16 y 17 en una proteína de unión recombinante es más favorable que tener las SEQ ID NOs: 18 y 17. Círculos rellenos y línea continua: Proteína n° 21-His; Cuadrados rellenos y línea discontinua: Proteína n° 23-His; Triángulo: Sin inhibidor. DO: DO₄05-DO620; C: concentración en nM.

Figura 4. Experimentos de xenoinjerto tumoral en ratones.

a) Modelo de xenoinjerto tumoral en ratones de cáncer de mama BT474. El modelo se realizó como se describe en el Ejemplo 7. Triángulos: PBS; cuadrados blancos: Trastuzumab; rombos con líneas discontinuas: Trastuzumab y Pertuzumab; Círculos rellenos: proteína de unión recombinante con especificidad de unión para el HER2 (Proteína n° 21-His); V: volumen tumoral [mm3]; t: tiempo [d], b) Modelo de xenoinjerto tumoral en ratones de células de cáncer de mama que compara la Proteína n° 21-His (21), la Proteína n° 23-His (23), la Proteína n° 24-His (24), o la Proteína n° 25-His (25), en el día 18 de tratamiento. El experimento se realizó como se describe en el Ejemplo 7. La Proteína n° 21-His es significativamente más eficaz en la inhibición del crecimiento tumoral que la Proteína n° 24-His (p = 0,0003), la Proteína n° 23-His, o la Proteína n° 25. V: volumen tumoral [mm3]; t: tiempo [d], c) y d) Modelo de xenoinjerto tumoral en ratones derivado de un paciente con cáncer gástrico GXA3039. El experimento se realizó dos veces como se describe en el Ejemplo 7. PBS (triángulos), Pertuzumab (triángulos inversos blancos), Trastuzumab (cuadrados blancos), una mezcla de Trastuzumab y Pertuzumab (rombos con línea discontinua), así como la Proteína n° 21, se utilizaron en estos experimentos, c) la Proteína n° 21 presenta una fuerte inhibición del crecimiento tumoral, similar a la combinación de Trastuzumab y Pertuzumab, mientras que el Trastuzumab por sí solo es menos eficaz, d) La Proteína n° 21 presenta una fuerte inhibición del crecimiento tumoral, similar a la combinación de Trastuzumab y Pertuzumab. El Trastuzumab por sí solo y el Pertuzumab por sí solo son significativamente menos eficaces. RTV: volumen tumoral relativo en referencia al volumen tumoral al inicio del tratamiento [%]; t: tiempo [d], e) Modelo de xenoinjerto tumoral en ratones derivado de un paciente con cáncer gástrico GXF281. El experimento se realizó como se describe en el Ejemplo 7. PBS (triángulos), Lapatinib (cuadrados blancos), así como la Proteína n° 21 (círculos rellenos). La Proteína n° 21 muestra una fuerte inhibición del crecimiento tumoral, en comparación con el Lapatinib en este modelo. RTV: volumen tumoral relativo en referencia al volumen tumoral al inicio del tratamiento [%]; t: tiempo [d].

Figura 5. Análisis farmacocinéticos en ratón.

a.) Análisis de propiedades farmacocinéticas en ratón, comparando la Proteína n° 21-His (círculos rellenos) con la Proteína n° 23-His (cuadrados), según el Ejemplo 8. Este experimento indica una ventaja farmacocinética de tener la SEQ ID NO: 16 presente en la proteína de unión recombinante, en lugar de la SEQ ID NO: 18. b) Análisis de propiedades farmacocinéticas en ratón, comparando la Proteína n° 30-His (círculos rellenos; comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica) con la Proteína n° 29-His (cuadrados rellenos; comprende un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica) según los Ejemplos 8 y 11. Tener dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, mejora el perfil farmacocinético más allá del perfil que se consigue con un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica, c) Comparación farmacocinética de una proteína de unión recombinante que comprende enlazadores polipeptídicos GlySer (Proteína n° 26-His; Cuadrados rellenos) vs. una proteína de unión recombinante que comprende enlazadores polipeptídicos ProThr (Proteína n° 27-His; Círculos rellenos), como se describe en los Ejemplos 8 y 10. Tener enlazadores polipeptídicos ProThr tiene un impacto favorable sobre las propiedades farmacocinéticas en un ratón. % DI: porcentaje de dosis inyectada normalizada al valor de medición a 1 hora [%]; t: tiempo [horas].

Figura 6. Análisis farmacocinético en mono Cynomolgus.

a) Análisis de propiedades farmacocinéticas de la Proteína n° 21-His (círculos rellenos) y la Proteína n° 23-His (cuadrados rellenos) a 1 mg/kg, en un mono Cynomolgus, según el Ejemplo 9. Se observó una semivida terminal más larga para la Proteína n° 21-His, indicando que tener la SEQ ID NO: 16 presente en la proteína de unión recombinante es más favorable que tener presente la SEQ ID NO: 18. b) Análisis de propiedades farmacocinéticas de la Proteína n° 21-His a 1 mg/kg (círculos rellenos), 5 mg/kg (cuadrados rellenos), y 10 mg/kg (triángulos rellenos), en un mono Cynomolgus, según el Ejemplo 9. La Proteína n° 21-His presenta un aumento dependiente de la dosis de la semivida terminal desde las 47 horas a 1 mg/kg, a las 100 horas a 5 mg/kg, a aproximadamente 180 horas a 10 mg/kg. C: Concentración [nM]; t: tiempo [horas].

Figura 7. Inducción de apoptosis en células BT474.

Medición de la apoptosis de células BT474 inducida por varias concentraciones de Proteína n° 21 (círculos rellenos). Trastuzumab (cuadrados blancos), Pertuzumab (triángulos inversos blancos), o una mezcla de 100 nM de Trastuzumab y varias concentraciones de Pertuzumab (rombos blancos; línea discontinua), según el Ejemplo 6. Los resultados se representan incluyendo las curvas de ajuste de regresión no lineal. Las mediciones para PBS (triángulos rellenos) y 100 nM de Trastuzumab (triángulo inverso relleno) se muestran como referencias a 50 μM. C: Concentración en [nM]; RLU: Unidades de luz relativas.

Descripción detallada

La invención se refiere a proteínas de unión recombinantes que comprenden cuatro dominios de repetición de anquirina diseñados, en donde dos de dichos cuatro dominios de repetición de anquirina diseñados son dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2, y en donde dos de dichos cuatro dominios de repetición de anquirina diseñados son dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica. La SEQ ID NO: 21 es un ejemplo de dicha proteína de unión recombinante.

En una realización, cada uno de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 14. En una realización, cada uno de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) la SEQ ID NO: 14, y/o en (ii) secuencias en donde hasta 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 o 0 aminoácidos de la SEQ ID NO: 14 se intercambian por cualquier aminoácido. En una realización, cada uno de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) la SEQ ID NO: 14, y/o en (ii) secuencias en donde hasta 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 o 0 aminoácidos de la ^{S e Q}ID NO: 14 se intercambian por cualquier aminoácido, y cada uno de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, no es idéntico a una secuencia de un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 12, 13, o 15, de la presente solicitud, así como de las SEQ ID NOs: 17 a 25, y 43 a 48, del documento WO2012/069654.

En una realización, el penúltimo aminoácido de cualquiera de las SEQ ID NOs: 10 a 20 es Ala o Leu, preferentemente Ala. En una realización, el aminoácido en el extremo C de cualquiera de las SEQ ID NOs: 10 a 20 es Ala o Asn, preferentemente Ala, o está, opcionalmente, ausente. Por ejemplo, la SEQ ID NO: 29 comprende, p. ej., la SEQ ID NO: 15, en la que el penúltimo aminoácido es Leu y el aminoácido en el extremo C está ausente. Preferentemente, el penúltimo aminoácido y el aminoácido en el extremo C de cualquier dominio de repetición de anquirina diseñado (es decir, de cualquiera de las SEQ ID NOs: 10 a 20) presente en una proteína de unión recombinante de la presente descripción, son ambos Ala.

En una realización, los aminoácidos Gly Ser en el extremo N de cualquiera de las SEQ ID NOs: 10 a 30, y 32 a 33, están, opcionalmente, ausentes.

En una realización, dichos dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, son al menos un 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 %, idénticos en secuencia de aminoácidos. En una realización, dichos dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica de dicha proteína de unión recombinante, son idénticos en secuencia de aminoácidos.

En una realización, cada uno de dichos dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica de la proteína de unión recombinante de la invención, comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. En una realización, cada uno de dichos dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica de la proteína de unión recombinante de la invención, consiste en la SEQ ID NO: 14.

En una realización, cada uno de los dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica de dicha proteína de unión recombinante, es capaz de unirse simultáneamente a una molécula de albúmina sérica.

En una realización, la invención se refiere a proteínas de unión recombinantes que comprenden cuatro dominios de repetición de anquirina diseñados, en donde dos de dichos cuatro dominios de repetición de anquirina diseñados son dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2, y en donde dos de dichos cuatro dominios de repetición de anquirina diseñados son dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, y en donde cada uno de dichos dos dominios de repeticiones de anquirina diseñados con especificidad de unión por la albúmina sérica consiste en la SEQ ID NO: 14.

En una realización, dicho dominio de repetición de anquirina diseñado que comprende la SEQ ID NO: 14, presenta una mejorada estabilidad de almacenamiento en PBS, en comparación con el dominio de repetición de anquirina diseñado que comprende la SEQ ID NO: 13. En una realización, dicho dominio de repetición de anquirina diseñado que comprende la SEQ ID NO: 14, presenta una mejorada estabilidad de almacenamiento en PBS, en comparación con el dominio de repetición de anquirina diseñado que comprende la SEQ ID NO: 15. En una realización dicho dominio de repetición de anquirina diseñado que consiste en la SEQ ID NO: 14, presenta una mejorada estabilidad de almacenamiento en PBS, en comparación con el dominio de repetición de anquirina diseñado que consiste en la SEQ ID NO: 13. En una realización, dicho dominio de repetición de anquirina diseñado que consiste en la SEQ ID NO: 14, presenta una mejorada estabilidad de almacenamiento en PBS, en comparación con el dominio de repetición de anquirina diseñado que consiste en la SEQ ID NO: 15. Los dominios de repetición de anquirina diseñados de las SEQ ID NOs: 12 a 15, son ejemplos de dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión por la albúmina sérica.

En una realización, dicha proteína de unión recombinante comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, en donde cada uno de dichos dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión por la albúmina sérica, comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 14, y en donde cada uno de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, presenta una mejorada estabilidad de almacenamiento en PBS, preferentemente cantidades reducidas de productos de degradación tras el almacenamiento a 40 °C durante 1 mes a 10 mg/ml en PBS, en comparación con un dominio de repetición de anquirina diseñado que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 13.

En una realización, dicha proteína de unión recombinante que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, en donde cada uno de dichos dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, presenta una estabilidad de almacenamiento mejorada, preferentemente cantidades reducidas de productos de degradación tras el almacenamiento a 40 °C durante 1 mes a 10 mg/ml en PBS, en comparación con una proteína de unión recombinante correspondiente, en donde cada uno de dichos dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13. Las SEQ ID NOs: 21 y 22 son ejemplos de dichas proteínas de unión recombinantes que comprenden las SEQ ID NOs: 14 y 13, respectivamente.

En una realización, dicha proteína de unión recombinante que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, presenta propiedades farmacocinéticas mejoradas, en comparación con una proteína de unión recombinante correspondiente que comprenda solo un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica. En una realización, dicha proteína de unión recombinante que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, presenta una semivida terminal más larga en un mono Cynomolgus, en comparación con una proteína de unión recombinante correspondiente que comprenda solo un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica. El Ejemplo 11 (véase la Figura 5b) describe las proteínas de unión recombinantes con propiedades farmacocinéticas mejoradas.

En una realización, dichos dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica están uno en el extremo N y el otro en el extremo C, de dichos dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2.

En una realización, uno de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2, tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 16. En una realización, uno de dichos diseñados de repetición de anquirina dominios con especificidad de unión para el HER2, comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) la SEQ ID NO: 16, y/o en (ii) las secuencias en donde hasta 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 o 0 aminoácidos de la SEQ ID NO: 16 se intercambian por cualquier aminoácido. En una realización, uno de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2, comprende la SEQ ID NO: 16. En una realización, uno de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2, consiste en la SEQ ID NO: 16.

En una realización, uno de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2, tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 17. En una realización, uno de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2, comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) la SEQ ID NO: 17, y/o en (ii) las secuencias en donde hasta 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 o 0 aminoácidos de la SEQ ID NO: 17 se intercambian por cualquier aminoácido. En una realización, uno de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2, comprende la SEQ ID NO: 17. En una realización, uno de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2, consiste en la SEQ ID NO: 17.

En una realización, uno de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2, tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 16, y uno de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2, tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 17. En una realización uno de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2, comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) la SEQ ID NO: 16, y/o en (ii) las secuencias en donde hasta 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 o 0 aminoácidos de la SEQ ID NO: 16 se intercambian con cualquier aminoácido, y uno de dominios diseñados de repetición de anquirina dichos con especificidad de unión para el HER2, comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) la SEQ ID NO: 17, y/o en (ii) las secuencias en las que 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 o 0 aminoácidos de la SEQ ID NO: 17 se intercambian por cualquier aminoácido. En una realización, uno de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2, comprende la SEQ ID NO: 16, y uno de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2, comprende la SEQ ID NO: 17. En una realización, uno de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2, consiste en la SEQ ID NO: 16, y uno de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2, consiste en la SEQ ID NO: 17. En una realización, dicha proteína de unión recombinante comprende la SEQ ID NO: 16 en el extremo N de la SEQ ID NO: 17.

En una realización, dicha proteína de unión recombinante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 32. En una realización, dicha proteína de unión recombinante comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) la SEQ ID NO: 32, y/o en (ii) las secuencias en las que hasta 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 o 0 aminoácidos de la SEQ ID NO: 32 se intercambian con cualquier aminoácido.

En una realización, la descripción se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende cuatro dominios de repetición de anquirina diseñados, en donde dos de dichos cuatro dominios de repetición de anquirina diseñados son dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2, que consisten en las SEQ ID NOs: 16 y 17, y en donde dos de dichos cuatro dominios de repetición de anquirina diseñados son dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica y en donde dichos dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión por albúmina sérica, consiste cada uno en la SEQ ID NO: 14.

En una realización, la descripción se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende la SEQ ID NO: 32 y dos veces la SEQ ID NO: 14. En una realización, la descripción se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende la SEQ ID NO: 32 y dos veces la SEQ ID NO: 14, en donde la SEQ ID NO: 32 está flanqueada por una SEQ ID NO: 14 en el extremo N, y una SEQ ID NO: 14 en el extremo C.

En una realización, los enlazadores polipeptídicos que unen los dominios de repetición de anquirina diseñados presentes en la proteína de unión recombinante de la presente descripción, comprenden secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 a 9, más preferentemente las SEQ ID NOs: 3 a 9, más preferentemente las SEQ ID NOs: 4 a 9, más preferentemente las SEQ ID NOs: 6 o 9, más preferentemente la SEQ ID NO: 9, en las que hasta 4, 3, 2, 1 o 0 aminoácidos de dichas SEQ ID NOs: 2 a 9, más preferentemente las SEQ ID NOs: 3 a 9, más preferentemente las SEQ ID NOs: 4 a 9, más preferentemente las SEQ ID NOs: 6 o 9, más preferentemente la SEQ ID NO: 9, se intercambian por cualquier aminoácido. En una realización, los Gly Ser flanqueantes en el extremo N de cualquiera de las SEQ ID NOs: 7 a 9, y/o los Gly Ser flanqueantes en el extremo C de cualquiera de las SEQ ID Nos: 2 a 6, están, opcionalmente, ausentes. En una realización, cualquiera de las SEQ ID NOs: 2 a 9, opcionalmente, comprenden adicionalmente Arg Ser en el extremo C (como, p. ej., presente en la SEQ ID NO: 29). En una realización dichos enlazadores polipeptídicos comprenden una secuencia de aminoácidos escogida de entre cualquiera de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2 a 9, más preferentemente las SEQ ID NOs: 3 a 9, más preferentemente las SEQ ID NOs: 4 a 9, más preferentemente las SEQ ID NOs: 6 o 9, más preferentemente la SEQ ID NO: 9. En una realización, los enlazadores polipeptídicos que unen los dominios de repetición de anquirina diseñados presentes en una proteína de unión recombinante de la presente descripción, consisten en una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre cualquiera de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOs: 2 a 9, más preferentemente las SEQ ID NOs: 3 a 9, más preferentemente las SEQ ID NOs:

4 a 9, más preferentemente las SEQ ID NOs: 6 o 9, más preferentemente la SEQ ID NO: 9. En una realización, los enlazadores polipeptídicos que unen los dominios de repetición de anquirina diseñados presentes en una proteína de unión recombinante de la presente descripción, consisten cada uno en la s Eq ID NO: 9. En una realización, dichos enlazadores polipeptídicos presentes en una proteína de unión recombinante de la presente descripción son un 70 %, 71 %, 72 %, 73 %,

74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %,

93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 %, idénticos, preferentemente idénticos. En una realización, cada uno de dichos dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, y dichos cuatro dominios de repetición de anquirina diseñados están unidos por enlazadores polipeptídicos que consiste cada uno en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9.

En una realización, la descripción se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende, desde el extremo N hasta el extremo C: SEQ ID NO: 14 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO: 17 - SEQ ID NO: 14, unidos por enlazadores polipeptídicos. En una realización, la descripción se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende desde el extremo N hasta el extremo C: SEQ ID NO: 14 - SEQ ID NO: 9 - SEQ ID NO: 16 - SEQ ID NO:

9 - SEQ ID NO: 17 - SEQ ID NO: 9 - SEQ ID NO: 14.

En una realización, la descripción se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con la proteína de unión recombinante que consiste en la SEQ ID NO: 21. En una realización, la descripción se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) la SEQ ID NO: 21, y/o en (ii) las secuencias de aminoácidos en las que hasta 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45,

44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 1 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, o 0 aminoácidos de la SEQ ID NO: 21 se intercambian por otros aminoácidos. En una realización, la descripción se refiere a una proteína de unión recombinante que consiste una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con la proteína de unión recombinante que consiste en la SEQ ID NO: 21. En una realización, la descripción se refiere a una proteína de unión recombinante que consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) la SEQ ID NO: 21, y en (ii) las secuencias de aminoácidos en las que hasta

72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61,60, 59, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 4 39, 38, 37, 36, 35, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21,20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 9, 8, 3, 2, 1, o 0 aminoácidos de la SEQ ID NO: 21 se intercambian por otros aminoácidos. Preferentemente, dichos intercambios de aminoácidos en la SEQ ID NO: 21 se localizan en las posiciones 127 a 444 de la SEQ ID NO: 21.

En una realización, la descripción se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con la proteína de unión recombinante que consiste en la SEQ

ID NO: 21, en donde dicha proteína de unión recombinante comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, y en donde cada uno de dichos dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 14. En una realización, la descripción se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %,

95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con la proteína de unión recombinante que consiste en la SEQ ID NO: 21, en donde dicha proteína de unión recombinante comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, y en donde cada uno de dichos dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión por albúmina sérica, consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. En una realización, la descripción se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) la SEQ ID NO: 21, y/o en (ii) las secuencias de aminoácidos en las que hasta 72, 71, 70, 69, 68, 67,

65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35,

34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, o

0 aminoácidos de la SEQ ID NO: 21, se intercambian por otros aminoácidos, en donde dicha proteína de unión recombinante comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, y en donde cada uno de dichos dos dominios de repetición diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 14. En una realización, la descripción se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en (i) la SEQ ID NO: 21, y/o en (ii) las secuencias de aminoácidos en las que hasta 72, 71, 70,

69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, o 0 aminoácidos de la SEQ ID NO: 21, se intercambian por otros aminoácidos, en donde dicha proteína de unión recombinante comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, y en donde cada uno de dichos dos dominios de repetición diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 14.

En una realización, la descripción se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 21. En una realización, la descripción se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21. Se prefiere una proteína de unión recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21. Se prefiere la SEQ ID NO: 21. Se prefiere una proteína de unión recombinante, en donde la secuencia de aminoácidos es la SEQ ID NO: 21. Se prefiere una proteína, en donde la secuencia de aminoácidos es la SEQ ID NO: 21. Se prefiere una proteína de unión recombinante que consiste en la SEQ ID NO: 21. Se prefiere una proteína de unión recombinante que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.

Múltiples características hacen que la proteína codificada por la SEQ ID NO: 21 sea la proteína de unión recombinante preferida de la descripción. Comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2, y dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, en donde cada uno de dichos dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, consiste en la SEQ ID NO: 14. Los dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2, se unen al HER2 en dos epítopos diferentes. Es la primera proteína de unión recombinante que combina la unión a albúmina sérica y la unión bi-paratópica a HER2. El dominio de repetición de anquirina diseñado de la SEQ ID NO: 14, presenta propiedades de estabilidad de almacenamiento mejoradas (véase el Ejemplo 2 y 3; Figura 2), en comparación con dominios de repetición de anquirina diseñados conocidos con especificidad de unión para la albúmina sérica. Dichos dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica dan lugar, sorprendentemente, a propiedades farmacocinéticas mejoradas de la proteína de unión recombinante, en comparación con una proteína de unión recombinante correspondiente que tenga solo un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica (Ejemplo 11, Figura 5). Cuando los dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica flanquean los otros dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2, se observan las mejores propiedades farmacocinéticas (Ejemplo 11). La elección de los dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2, así como su disposición estructural, dan lugar a la actividad máxima del compuesto (Ejemplos 5, 6 y 7). Los dominios de repetición de anquirina diseñados se conectan utilizando un enlazador rico en ^{p T ,}lo que da lugar, sorprendentemente, a propiedades farmacocinéticas mejoradas (Ejemplos 10 y 11). Las moléculas aúnan la funcionalidad de al menos dos fármacos (p. ej., Trastuzumab y Pertuzumab) en una molécula y, adicionalmente, pueden inducir la apoptosis en células que expresen HER2 (Ejemplo 6, Figura 7).

En una realización, dicha proteína de unión recombinante que consiste en la SEQ ID NO: 21, presenta una estabilidad de almacenamiento mejorada, en comparación con una proteína de unión recombinante correspondiente que consista en la SEQ ID NO: 22. En una realización, dicha proteína de unión recombinante que consiste en la SEQ ID NO: 21 presenta cantidades reducidas de productos de degradación tras el almacenamiento a 40 °C durante 1 mes a 10 mg/ml en PBS, en comparación con una proteína de unión recombinante correspondiente que consista en la SEQ ID NO: 22.

En una realización, dicha proteína de unión recombinante que consiste en la SEQ ID NO: 21, presenta propiedades farmacocinéticas mejoradas, en comparación con la proteína de unión recombinante que consiste en SEQ ID NO: 21, en donde se ha eliminado el dominio de repetición de anquirina diseñado del extremo C con especificidad de unión para la albúmina sérica. En una realización, dicha proteína de unión recombinante que consiste en la SEQ ID NO: 21, presenta propiedades farmacocinéticas mejoradas en comparación con la proteína de unión recombinante que consiste en los aminoácidos 1 a 422 de la SEQ ID NO: 21. En una realización, dicha proteína de unión recombinante que consiste en la SEQ ID NO: 21, presenta propiedades farmacocinéticas mejoradas en comparación con la proteína de unión recombinante que consiste en la SEQ ID NO: 33.

En una realización, cada uno de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, se une a la albúmina sérica de origen de ratón, rata, perro, mono Cynomolgus, o ser humano, más preferentemente a la albúmina sérica de origen de ratón, mono Cynomolgus, o ser humano, más preferentemente a la albúmina sérica de origen de mono Cynomolgus, o ser humano, más preferentemente a la albúmina sérica de origen humano en PBS con una constante de disociación (Kd) menor de 10-5 M; preferentemente menor de 10-6 M; o más preferentemente menor de 10-7 M. En una realización, cada uno de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, consiste en la SEQ ID NO: 14, y se une a la albúmina sérica humana en PBS con una constante de disociación (Kd) menor de 10-5 M; preferentemente menor de 10-6 M; o más preferentemente menor de 10-7 M. Se dan ejemplos de la determinación de la constante de disociación utilizando resonancia de plasmón de superficie, en el Ejemplo 5 y en el documento WO2014/083208.

En una realización, cada uno de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2, se unen al HER2 de origen humano en PBS con una constante de disociación (Kd) menor de 10-6 M; preferentemente menor de 10-7 M; más preferentemente menor de 10-8 M, o más preferentemente menor de 10-9 M. En una realización, dicho dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para el HER2, que consiste en la SEQ ID NO: 16, se une al HER2 humano en PBS con una constante de disociación (Kd) menor de 10-6 M; preferentemente menor de 10-7 M; más preferentemente menor de 10-8 M, más preferentemente menor de 10-9 M, más preferentemente menor de 10-10 M, o más preferentemente menor de 10-11 M. En una realización, dicho dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para el HER2, que consiste en la SEQ ID NO: 17, se une al HER2 humano en PBS con una constante de disociación (Kd) menor de 10-6 M; preferentemente menor de 10-7 M; más preferentemente menor de 10-8 M, o más preferentemente menor de 10-9 M.

En una realización, dicha proteína de unión recombinante se une a HER2 de origen humano en PBS con una constante de disociación (Kd) menor de 10-7 M; preferentemente menor de 10-8 M; más preferentemente menor de 10-9 M, o más preferentemente menor de 10-10 M. En una realización, dicha proteína de unión recombinante con especificidad de unión para el HER2, que comprende la SEQ ID NO: 32, se une a la albúmina sérica humana en PBS con una constante de disociación (Kd) menor de 10-8 M; preferentemente menor de 10-9 M, o más preferentemente menor de 10-10 M. En una realización, dicha proteína de unión recombinante con especificidad de unión para el HER2, que comprende la SEQ ID NO: 21, se une a HER2 de origen humano en PBS con una constante de disociación (Kd) menor de 10-7 M; preferentemente menor de 10-8 M; más preferentemente menor de 10-9 M, o más preferentemente menor de 10-10 M. En una realización, dicha proteína de unión recombinante con especificidad de unión para el HER2, que consiste en la SEQ ID NO: 21, se une al HER2 de origen humano en PBS con una constante de disociación (Kd) menor de 10-7 M; preferentemente menor de 10 8 M; más preferentemente menor de 10-9 M, o más preferentemente menor de 10-10 M. En una realización, dicha proteína de unión recombinante se une a la albúmina sérica humana, con una constante de disociación (Kd) menor de 10-5 M, preferentemente menor de 10-6 M, o más preferentemente menor de 10-7 M. En una realización, dicha proteína de unión recombinante con especificidad de unión para el HER2, que comprende la SEQ ID NO: 21, se une a la albúmina sérica humana en PBS con una constante de disociación (Kd) menor de 10-5 M; preferentemente menor de 10-6 M, o más preferentemente menor de 10-7 M. En una realización, dicha proteína de unión recombinante con especificidad de unión para el HER2, que consiste en la SEQ ID NO: 21, se une a la albúmina sérica humana en PBS con una constante de disociación (Kd) menor de 10-5 M; preferentemente menor de 10-6 M, o más preferentemente menor de 10-7 M.

En una realización, dicha proteína de unión recombinante inhibe la proliferación celular de células que expresan HER2, con una constante de inhibición (CI50) menor de 10-6 M; preferentemente menor de 10-7 M, o más preferentemente menor de 10 8 M. Ejemplos de dichas células incluyen células BT474, SKBR-3, SKOV-3, NCI-N87, ZR-75-30, HCC1419, o MDA-MB175. En una realización, dicha proteína de unión recombinante inhibe la proliferación de células BT474, con una constante de inhibición (CI50) menor de 10'6 M; preferentemente menor de 10'7 M, o más preferentemente menor de 10'8 M. En una realización, la proteína de unión recombinante que comprende la SEQ ID NO: 32, inhibe la proliferación de células BT474, con una constante de inhibición (CI50) menor de 10'6 M; preferentemente menor de 10'7 M, o más preferentemente menor de 10'8 M. En una realización, la proteína de unión recombinante que comprende la SEQ ID NO: 21, inhibe la proliferación de células BT474, con una constante de inhibición (CI50) menor de 10'6 M; preferentemente menor de 10'7 M, o más preferentemente menor de 10'8 M. En una realización, la proteína de unión recombinante que consiste en la SEQ ID NO: 21, inhibe la proliferación de células BT474, con una constante de inhibición (CI50) menor de 10'6 M; preferentemente menor de 10'7 M, o más preferentemente menor de 10'8 M. Los ensayos de inhibición celular son bien conocidos en el campo. En una realización, dicha proteína de unión recombinante que consiste en la SEQ ID NO: 21, inhibe la proliferación de células BT474, más potentemente que la proteína de unión recombinante que solo tiene un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para el HER2. En una realización, dicha proteína de unión recombinante que consiste en la SEQ ID NO: 21, inhibe la proliferación de células BT474 sin la ayuda de la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC; bien conocida por el experto en la técnica). En una realización, dicha proteína de unión recombinante que consiste en la SEQ ID NO: 21, inhibe la proliferación de células BT474 sin la ayuda de un fragmento de IgG1-Fc.

En una realización, dicha proteína de unión recombinante que comprende, preferentemente que consiste en, la SEQ ID NO: 21, induce la apoptosis en las células BT474. En una realización, dicha proteína de unión recombinante que comprende, preferentemente que consiste en, la SEQ ID NO: 21, induce la apoptosis en células BT474, con un valor de la concentración eficaz (CE50) semimáxima menor de 100 nM. Preferentemente, dicha proteína de unión recombinante induce la apoptosis en células BT474, con un valor de la CE50 menor de 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o 10 nM. Preferentemente, dicha proteína de unión recombinante a 100 nM induce la apoptosis en células BT474 en mayor medida que 100 nM de Trastuzumab, 100 nM de Pertuzumab, o una mezcla de 100 nM de Trastuzumab y 100 nM de Pertuzumab. En una realización, dicha proteína de unión recombinante que comprende, preferentemente que consiste en, la SEQ ID NO: 21, induce la apoptosis en las células que expresan HER2.

En una realización, dicha proteína de unión recombinante que comprende la SEQ ID NO: 21, inhibe la vía RAS. En una realización, el HER2 en BT474 se fosforila menos cuando se trata con dicha proteína de unión recombinante que comprende la SEQ ID NO: 21, que cuando se trata con Trastuzumab.

En una realización, dicha proteína de unión recombinante es capaz de unirse simultáneamente al HER2 y a la albúmina sérica humana. En una realización, dicha proteína de unión recombinante es capaz de unirse simultáneamente a dos moléculas de albúmina sérica humana. Dicha unión simultánea se puede demostrar utilizando experimentos de resonancia de plasmón de superficie (Ejemplo 5), o por cromatografía de exclusión por tamaño acoplada a una dispersión de luz estática (Ejemplo 14), técnicas bien conocidas por el experto en la técnica.

En una realización, dicha proteína de unión recombinante se une al HER2 de un modo bi-paratópico. En una realización, dicha proteína recombinante se une al HER2 en dos epítopos diferentes.

En una realización, la presente invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende un primer, un segundo, un tercer, y un cuarto dominio de repetición de anquirina diseñado, en donde dichos primer y segundo dominios de repetición de anquirina diseñados tienen cada uno especificidad de unión para el HER2, y en donde dichos tercer y cuarto dominios de repetición de anquirina diseñados tienen cada uno especificidad de unión para la albúmina sérica. Preferentemente, dicha proteína de unión recombinante consiste en una única cadena peptídica. Más preferentemente, dichos primer, segundo, tercer y cuarto dominio de repetición de anquirina diseñados, están unidos por enlazadores polipeptídicos. La SEQ ID NO: 21 es un ejemplo de dicha proteína de unión recombinante.

En una realización, dicho primer dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para el HER2, es el dominio de unión II del HER2. En una realización, dicho segundo dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para el HER2, es el dominio de unión IV del HER2. En una realización, dicho primer dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para el HER2, es el dominio de unión II del HER2, y dicho segundo dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para el HER2, es el dominio de unión IV del HER2. En una realización, dicho primer dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para el HER2, comprende la SEQ ID NO: 16. En una realización, dicho dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para el HER2, comprende la SEQ ID NO: 17. En una realización, dicho primer dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para el HER2, comprende la SEQ ID NO: 16, y dicho segundo dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para el HER2, comprende la SEQ ID NO: 17.

En una realización, dicho primer dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para el HER2, que comprende la SEQ ID NO: 16, se une al HER2 humano en PBS con una constante de disociación (Kd) menor de 10-6 M; preferentemente menor de 10-7 M; más preferentemente menor de 10-8 M, más preferentemente menor de 10 9 M, más preferentemente menor de 10-10 M, o más preferentemente menor de 10-11 M. En una realización, dicho segundo dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para el HER2, que comprende la SEQ ID NO: 17, se une al HER2 humano en PBS con una constante de disociación (Kd) menor de 10-6 M; preferentemente menor de 10-7 M; más preferentemente menor de 10-8 M, o más preferentemente menor de 10-9 M.

En una realización, cada uno de dichos tercer y cuarto dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, se une a la albúmina sérica humana en PBS con una constante de disociación (Kd) menor de 10-5 M, preferentemente menor de 10-6 M, o más preferentemente menor de 10-7 M. En una realización, dichos tercer y cuarto dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, que comprenden cada uno la SEQ ID NO: 14, se une cada uno a la albúmina sérica humana en PBS con una constante de disociación (Kd) menor de 10-5 M; preferentemente menor de 10-6 M; o más preferentemente menor de 10-7 M.

Los términos “ primer” , “ segundo” , “tercer” y, opcionalmente, “ cuarto” , que se utilizan en “ primer dominio de repetición de anquirina diseñado” , “ segundo dominio de repetición de anquirina diseñado ” , “ tercer dominio de repetición de anquirina diseñado” y “ cuarto dominio de repetición de anquirina diseñado” , no indican ni implican ninguna disposición posicional de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados, en la proteína de unión recombinante. En una realización, dichos cuatro dominios de repetición de anquirina diseñados, están posicionados desde el extremo N hasta el extremo C: Tercero - primero - segundo - cuarto.

En una realización, la proteína de unión recombinante inhibe la proliferación de células BT474 en un modelo de xenoinjerto tumoral en ratones. En una realización, la proteína de unión recombinante inhibe el crecimiento tumoral en ratones en un modelo de cáncer expresante del HER2, de un xenoinjerto derivado de un paciente. En una realización, la proteína de unión recombinante inhibe el crecimiento tumoral en ratones en un modelo de cáncer gástrico expresante del HER2, de un xenoinjerto derivado de un paciente. La expresión “ expresante del HER2, de un xenoinjerto derivado de un paciente” , tiene el significado de un xenoinjerto de tejido canceroso derivado de un paciente, en donde en dicho tejido al menos una célula expresa el HER2 por encima del fondo.

En cualquier realización de la presente descripción que se refiere a un dominio de repetición de anquirina diseñado o a una proteína de unión recombinante, que comprenda una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos determinada, los aminoácidos no idénticos puede que se localicen en cualquier posición del dominio de repetición de anquirina diseñado o de la proteína de unión recombinante.

De manera similar, en cualquier realización de la presente invención que se refiera a un dominio de repetición de anquirina diseñado o a una proteína de unión recombinante, en la que hasta 72, 71, 70, 69, 68, 67, 66, 65, 64, 63, 62, 61, 60, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, o 0 aminoácidos se intercambien por cualquier aminoácido, los aminoácidos intercambiados puede que se localicen en cualquier posición del dominio de repetición de anquirina diseñado. Las técnicas para modificar, p. ej., por mutación puntual, una proteína de unión recombinante de la presente descripción, son bien conocidas por el experto en la técnica. Partiendo de la SEQ ID NO: 21, una persona experta en la técnica conoce cómo y dónde intercambiar aminoácidos (p. ej., usando el conocimiento del documento WO2002/020565) para crear variantes de secuencia de la SEQ ID NO: 21, con una alta probabilidad de actividad funcional no alterada.

En una realización, dicha proteína de unión recombinante presenta un aumento de la semivida terminal, preferentemente un aumento de la semivida terminal de al menos un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, o 45 %, en comparación con una proteína de unión recombinante correspondiente que carezca de dicho cuarto dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica. En una realización, dicha proteína de unión recombinante presenta un aumento de la semivida terminal, preferentemente un aumento de la semivida terminal de al menos un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, o 45 %, en comparación con una proteína de unión recombinante correspondiente que comprenda solo un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica. Ejemplos de dicho aumento de la semivida terminal, se dan en el Ejemplo 11.

En una realización, dicha proteína de unión recombinante que comprende, preferentemente que consiste en, la SEQ ID NO: 21, presenta una semivida terminal de aproximadamente 47 horas a 1 mg/kg en monos Cynomolgus. En una realización, dicha proteína de unión recombinante que comprende, preferentemente que consiste en, la SEQ ID NO: 21, presenta una semivida terminal de aproximadamente 100 horas a 5 mg/kg en monos Cynomolgus. En una realización, dicha proteína de unión recombinante que comprende, preferentemente que consiste en, la SEQ ID NO: 21, presenta una semivida terminal de 100 horas a 10 mg/kg en monos Cynomolgus. En una realización, la proteína de unión recombinante que comprende, preferentemente que consiste en, la SEQ ID NO: 21, presenta una semivida terminal de más de 100 horas a 100 mg/kg en monos Cynomolgus.

En una realización, la descripción se refiere a un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de un dominio de repetición de anquirina diseñado o de una proteína de unión recombinante de la presente descripción, preferentemente una proteína de unión recombinante de la presente descripción. En una realización, la descripción se refiere a un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de una proteína de unión recombinante de la presente descripción. En una realización, la descripción se refiere a un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 21. En una realización, la descripción se refiere a un ácido nucleico que codifica dicha proteína de unión recombinante. En una realización, la descripción se refiere a un ácido nucleico que codifica la proteína de unión recombinante que consiste en la SEQ ID NO: 21. Además, la descripción se refiere a vectores que comprenden cualquier ácido nucleico de la descripción. Los ácidos nucleicos son bien conocidos por el experto en la técnica. En los ejemplos, se utilizaron ácidos nucleicos para producir dominios de repetición de anquirina diseñados o proteínas de unión recombinantes de la descripción, en E. coli.

En una realización, la descripción se refiere a una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión recombinante y/o un dominio de repetición de anquirina diseñado de la presente descripción, y/o un ácido nucleico que codifica una proteína de unión recombinante y/o un dominio de repetición de anquirina diseñado de la presente descripción y, opcionalmente, un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptables.

En una realización, la descripción se refiere a una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión recombinante o un ácido nucleico que codifica una proteína de unión recombinante y, opcionalmente, un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptables.

Los vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables son conocidos por el experto en la técnica, y se explican con más detalle a continuación. Incluso adicionalmente, se considera una composición diagnóstica que comprende una o más de las proteínas de unión recombinantes y/o de los dominios de repetición de anquirina diseñados y/o de los ácidos nucleicos, mencionados anteriormente, en particular, de las proteínas de unión recombinantes y/o de los ácidos nucleicos.

Una composición farmacéutica comprende una proteína de unión recombinante y/o un dominio de repetición de anquirina diseñado y/o un ácido nucleico, preferentemente una proteína de unión recombinante y/o un ácido nucleico, como se describe en la presente memoria, y un vehículo, excipiente o estabilizante farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, como se describe en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A. Ed., 1980. Los vehículos, excipientes o estabilizantes adecuados conocidos por el experto son la solución salina, la solución de Ringer, la solución de dextrosa, la solución de Hank, los aceites no volátiles, el etil oleato, la dextrosa al 5 % en solución salina, las sustancias que aumentan la isotonicidad y la estabilidad química, tampones y conservantes. Otros vehículos adecuados incluyen cualquier vehículo que no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que reciba la composición, tal como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, y copolímeros de aminoácidos. Una composición farmacéutica también puede ser una formulación de combinación que comprenda un principio activo adicional, tal como un agente anticáncer, o un agente antiangiogénico, o un compuesto bioactivo adicional.

Una realización de la presente descripción, se refiere al uso de una proteína de unión recombinante de la presente descripción que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, para elaborar una composición farmacéutica, en donde dicha proteína de unión recombinante presente un aumento de la semivida terminal, preferentemente un aumento de la semivida terminal de al menos un 5 %, preferentemente un 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 %, o 250 %, en comparación con una proteína de unión recombinante correspondiente que comprenda solo un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica.

En una realización, una composición farmacéutica comprende al menos una proteína de unión recombinante, como se describe en la presente memoria, y un detergente, tal como un detergente no iónico, un tampón, tal como fosfato, y un azúcar, tal como la sacarosa. En una realización, dicha composición comprende proteínas de unión recombinantes, como se ha descrito anteriormente, y PBS.

En una realización, la descripción se refiere al uso de una composición farmacéutica, o una proteína de unión recombinante según la presente descripción, para el tratamiento de una enfermedad. Con ese objetivo, la composición farmacéutica, o la proteína de unión recombinante según la presente descripción, se administra, a un paciente que tenga necesidad de la misma, en una cantidad terapéuticamente eficaz. La administración puede incluir la administración tópica, administración oral, y administración parenteral. La vía típica de administración es la administración parenteral. En la administración parenteral, la composición farmacéutica de la presente descripción, se formulará en una forma inyectable de dosificación unitaria, tal como una solución, una suspensión o una emulsión, en asociación con los excipientes farmacéuticamente aceptables, como se definió anteriormente. La dosificación y modo de administración dependerá del individuo que se vaya a tratar y de la enfermedad en particular.

Además, cualquiera de las composiciones farmacéuticas o de las proteínas de unión recombinantes mencionadas anteriormente, se consideran para el tratamiento de un trastorno.

En una realización, dicha proteína de unión recombinante o dicha otra composición farmacéutica descrita en la presente memoria, se aplica por vía intravenosa. Para la aplicación parenteral, la proteína de unión recombinante o dicha composición farmacéutica, se puede inyectar por inyección en bolo o mediante una infusión lenta en una cantidad terapéuticamente eficaz.

En una realización, la descripción se refiere a un método de tratamiento de una afección médica, comprendiendo el método la etapa de administración, a un paciente que necesite dicho tratamiento, de una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión recombinante de la descripción. En una realización, la descripción se refiere a un método de tratamiento de una afección médica, comprendiendo el método la etapa de administrar, a un paciente que necesite dicho tratamiento, de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica de la descripción. El Ejemplo 7 (Figura 4) ilustra la utilidad del uso de una proteína de unión recombinante que comprende la SEQ ID NO: 21 para el tratamiento del cáncer. En una realización, la descripción se refiere al uso de una composición farmacéutica de la presente descripción, para el tratamiento de una enfermedad. En una realización, la descripción se refiere a una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una enfermedad. En una realización, la descripción se refiere a una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una afección médica.

En una realización, la descripción se refiere a la proteína de unión recombinante que consiste en la SEQ ID NO: 21, para su uso como medicamento. En una realización, la descripción se refiere a una proteína de unión recombinante que consiste en la SEQ ID NO: 21, para su uso en el tratamiento de una enfermedad. En una realización, dicha composición farmacéutica, proteína de unión recombinante, o molécula de ácido nucleico, se considera para su uso en el tratamiento de una enfermedad. En una realización, la descripción se refiere a un medicamento que comprende dicha composición farmacéutica, proteína de unión recombinante, o molécula de ácido nucleico. En una realización, la descripción se refiere al uso de la proteína de unión recombinante que consiste en la SEQ ID NO: 21, en una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad. En una realización, la descripción se refiere a dicha composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una enfermedad. En una realización, la descripción se refiere a dicha proteína de unión recombinante para su uso en el tratamiento de una enfermedad. En una realización, la descripción se refiere a dicho ácido nucleico para el tratamiento de una enfermedad. En una realización, la descripción se refiere al uso de dicha composición farmacéutica, proteína de unión recombinante, o molécula de ácido nucleico, como medicamento para el tratamiento de una enfermedad. En una realización, la descripción se refiere al uso de dicha composición farmacéutica, proteína de unión recombinante, o moléculas de ácido nucleico, para el tratamiento de una enfermedad. En una realización, la descripción se refiere al uso de dicha composición farmacéutica, proteína de unión recombinante, o molécula de ácido nucleico, para la elaboración de un medicamento. En una realización, la descripción se refiere al uso de dicha composición farmacéutica, proteína de unión recombinante, o molécula de ácido nucleico, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad. En una realización, la descripción se refiere a un procedimiento para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad, en donde dicha composición farmacéutica, proteína de unión recombinante, o molécula de ácido nucleico, sea el principio activo del medicamento. En una realización, la descripción se refiere a un procedimiento de tratamiento de una enfermedad, utilizando dicha composición farmacéutica, proteína de unión recombinante, o molécula de ácido nucleico.

El término “ afección médica” (o trastorno o enfermedad) incluye trastornos autoinmunitarios, trastornos inflamatorios, retinopatías (particularmente, retinopatías proliferativas), trastornos neurodegenerativos, infecciones, enfermedades metabólicas, y enfermedades neoplásicas. Cualquiera de las proteínas de unión recombinantes descritas en la presente memoria, se pueden utilizar para la preparación de un medicamento para el tratamiento de dicho trastorno, particularmente, un trastorno seleccionado del grupo que comprende: un trastorno autoinmunitario, un trastorno inflamatorio, una retinopatía, una enfermedad neoplásica. Una “ afección médica” puede ser la que se caracterice por una proliferación celular inapropiada. Una afección médica puede ser una afección hiperproliferativa. La descripción se refiere particularmente a un método de tratamiento de una afección médica, comprendiendo el método la etapa de administrar, a un paciente que necesite dicho tratamiento, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión recombinante o de dicha composición farmacéutica de la descripción. En una realización preferida, dicha afección médica es una enfermedad neoplásica. El término “enfermedad neoplásica” , como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un estado o condición anormal de las células o tejidos, que se caracteriza por el crecimiento proliferativo celular rápido o neoplasia. En una realización dicha afección médica es una enfermedad neoplásica maligna. En una realización dicha afección médica se refiere al cáncer. En una realización, dicha afección médica se refiere a cáncer expresante del HER2, cáncer adicto al HER2, cáncer parcialmente adicto al HER2, cáncer sobreexpresante del HER2, cáncer amplificado del HER2, cáncer resistente al Trastuzumab, y/o cáncer sensible al Trastuzumab. En una realización, dicha afección médica se refiere a cáncer de mama y/o a cáncer gastrointestinal y/o a cáncer cerebral. En una realización, dicha afección médica se refiere a cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer gástrico, cáncer de estómago, cáncer uterino, cáncer colorrectal, cáncer de vejiga, y/o cáncer sobreexpresante del HER2. El término “cáncer cerebral” , puede referirse a metástasis cerebral de un cáncer sobreexpresante del HER2, metástasis cerebral de cáncer amplificado del HER2, cáncer cerebral que sobreexpresante del HER2, o cáncer cerebral amplificado del HER2. El término cáncer “ gastrointestinal” , puede referirse a cáncer gástrico, cáncer esofágico, cáncer colorrectal, cáncer biliar glandular, cáncer de vesícula biliar, o adenocarcinoma pancreático. La expresión “ cantidad terapéuticamente eficaz” , significa una cantidad que sea suficiente para producir un efecto deseado en un paciente. En una realización, dicha afección médica se refiere al cáncer, en donde las células de dicho cáncer presentan niveles de expresión del HER2 por encima del fondo, según se determina por IHC. En una realización, dicha afección médica se refiere al cáncer, en donde las células de dicho cáncer presentan niveles de expresión del HER2 por encima de los de las células sanas en su proximidad, según se determina por IHC. Dichos niveles de expresión del HER2 por encima del fondo, son bien conocidos por el experto en la técnica, p. ej., a partir de ensayos tales como los HercepTest® (Dako). Preferentemente, los niveles de expresión del HER2 por encima del fondo, se refiere a una puntuación del HercepTest® de 1+, 2+, o 3+, más preferentemente 2+, o 3+. La sobreexpresión del Her2 es bien conocida para el experto en la técnica (Rüschoff y col., 2012. Modern Pathology 25, 637- 650; Wolff y col., 2013. J. Clin. Oncol. 31 [31], 3997-4014).

En particular, la descripción se refiere al tratamiento de una afección médica, utilizando una composición farmacéutica de la presente descripción, en donde dicha afección médica es un cáncer.

El uso de una proteína de unión recombinante de la presente descripción o dichas composiciones farmacéuticas, para el tratamiento de enfermedades cancerosas, también puede ser en combinación con una o más de otras terapias conocidas en la técnica. La expresión “ uso en combinación con” , como se utiliza en la presente memoria, se referirá a una coadministración, que se lleve a cabo bajo un régimen determinado. Esto incluye la administración sincronizada de los diferentes compuestos, así como la administración de los diferentes compuestos diferida en el tiempo (p. ej., el compuesto A se administra una vez y el compuesto B se administra varias veces a continuación, o viceversa, o ambos compuestos se administran de manera sincronizada, y uno de los dos también se administra en fases posteriores). Ejemplos de compuestos que se pueden coadministrar, comprenden, por ejemplo, taxanos, antraciclinas, quimioterapéuticos basados en platino, ^{5 - F u ,}inhibidores de PI3K (tales como, por ejemplo, Apitolisib, Taselisib o Alpelisib), inhibidores de MEK (tales como, por ejemplo, Trametinib o Cobimetinib), inhibidores de RAS (tal como, por ejemplo, Salirasib), inhibidores de RAF, inhibidores de mTOR (incluyendo, por ejemplo, Apitolisib y Everolimo), inhibidores Pan-EGFR, inhibidores de microtúbulos (incluyendo eribulina), terapias dirigidas que incluyen inhibidores del ciclo cinasa celular (tales como, por ejemplo, Palbociclib), inhibidores del HER2, Trastuzumab, Trastuzumab-DM1, Pertuzumab, Cetuximab, Panitumumab, Nimotuzumab, Bevacizumab, Ranibizumab, MP0250, Ipilimumab, Penbrolizumab, Nivolumab, Urelumab, Utolimumab, o Atezolizumab. Preferentemente, estos compuestos se utilizan a las dosis recomendadas. En una realización, dicha proteína de unión recombinante que comprende la SEQ ID NO: 21, potencia el efecto de los inhibidores PI3K, inhibidores mTOR, Eribulina, Trastuzumab, o Lapatinib. En una realización, dicha proteína de unión recombinante que comprende la SEQ ID NO: 21, hace posible el uso de dosis menores de inhibidores PI3K, inhibidores mTOR, Eribulina, Trastuzumab, o Lapatinib, para el tratamiento de una enfermedad. Ejemplos de dichas combinaciones se dan en el Ejemplo 17.

En una realización adicional, la descripción se refiere al uso de una proteína de unión recombinante de la descripción, para la elaboración de un medicamento que se utilice para el tratamiento de una afección médica, preferentemente una enfermedad neoplásica, más preferentemente un cáncer.

En una realización, la descripción se refiere al uso de una composición farmacéutica de la descripción, para la elaboración de un medicamento que se utilice para el tratamiento de una afección médica, que puede ser una enfermedad neoplásica, en particular, cáncer.

Las formulaciones que se vayan a utilizar para la administración in vivo, deben ser asépticas o estériles. Esto se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

En una realización, la descripción se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende cualquiera de los dominios de repetición mencionados anteriormente.

En una realización, la descripción se refiere a un kit que comprende dicha proteína de unión recombinante. En una realización, la descripción se refiere a un kit que comprende un ácido nucleico que codifica dicha proteína de unión recombinante. En una realización, la descripción se refiere a un kit que comprende dicha composición farmacéutica. En una realización, la descripción se refiere a un kit que comprende dicha proteína de unión recombinante, y/o un ácido nucleico que codifica dicha proteína de unión recombinante, y/o dicha composición farmacéutica. En una realización, la descripción se refiere a un kit que comprende la proteína de unión recombinante que comprende, preferentemente que consiste en, la SEQ ID NO: 21, y/o un ácido nucleico que codifica la proteína de unión recombinante que comprende, preferentemente que consiste en, la SEQ ID NO: 21, y/o la composición farmacéutica que comprende la proteína de unión recombinante que comprende, preferentemente que consiste en, la SEQ ID NO: 21, y/o un ácido nucleico que codifica la proteína de unión recombinante que comprende, preferentemente que consiste en, la SEQ ID NO: 21.

En una realización, la descripción se refiere a un método para producir una proteína de unión recombinante de la presente descripción. En una realización, la descripción se refiere a un método para producir la proteína de unión recombinante que comprende, preferentemente que consiste en, la SEQ ID NO: 21, comprendiendo el método las etapas de (i) expresar dicha proteína de unión recombinante en bacterias, y (ii) purificar dicha proteína de unión recombinante utilizando cromatografía. Dicho método puede contener etapas adicionales. En el Ejemplo 1 se da dicho método de producción de una proteína de unión recombinante de la presente descripción.

La descripción no se restringe a las realizaciones particulares descritas en los Ejemplos. Se pueden utilizar y procesar otras fuentes siguiendo las líneas generales descritas a continuación.

La presente memoria descriptiva hace referencia a varias secuencias de aminoácidos del listado de secuencias de aminoácidos de la presente memoria descriptiva, denominado “ P015_Sequence_Listing.txt” . Este listado de secuencias forma parte integrante de la presente solicitud de patente.

Definiciones

En el contexto de la presente descripción, el término “ proteína” se refiere a un polipéptido, en donde al menos parte del polipéptido tenga, o sea capaz de adquirir, una disposición tridimensional definida, al formar estructuras secundarias, terciarias o cuaternarias en una única cadena polipeptídica y/o entre múltiples cadenas polipeptídicas. Si una proteína comprende dos o más cadenas polipeptídicas, las cadenas polipeptídicas individuales se pueden unir no covalentemente o covalentemente, p. ej., mediante un enlace disulfuro entre dos polipéptidos. Una parte de una proteína, que individualmente tenga, o sea capaz de adquirir, una disposición tridimensional definida al formar una estructura secundaria o terciaria, se denomina “dominio proteico” . Dichos dominios proteicos son bien conocidos por el experto en la técnica.

El término “ recombinante” , como se utiliza en la proteína recombinante, el dominio proteico recombinante, la proteína de unión recombinante, y similares, significa que dichos polipéptidos se producen mediante el uso de tecnologías de ADN recombinante bien conocidas por el experto en la técnica relevante. Por ejemplo, una molécula de ADN recombinante (p. ej., producida mediante síntesis genética) que codifique un polipéptido, se puede clonar en un plásmido de expresión bacteriana (p. ej., pQE30, QIAgen), plásmido de expresión en levaduras, plásmido de expresión en mamíferos, o plásmido de expresión en plantas, o un ADN que haga posible la expresión in vitro. Si, por ejemplo, dicho plásmido de expresión bacteriana recombinante se inserta en una bacteria apropiada (p. ej., Escherichia coli), esta bacteria puede producir el polipéptido codificado por este ADN recombinante. El polipéptido producido en correspondencia, se denomina polipéptido recombinante o proteína recombinante.

En el contexto de la presente descripción, el término “ proteína de unión” , se refiere a una proteína que comprende dos o más, preferentemente tres o más, más preferentemente cuatro o más, dominios de unión. Preferentemente, dicha proteína de unión es una proteína de unión recombinante. Preferentemente, dicha proteína de unión comprende cuatro dominios de repetición. Más preferentemente, dicha proteína de unión comprende cuatro dominios de repetición de anquirina diseñados. Preferentemente, dos de dichos dominios de unión de dicha proteína de unión, cada uno tiene una especificidad de diana para la albúmina sérica. También preferentemente, dos de dichos dominios de unión de dicha proteína de unión, cada uno tiene una especificidad de diana para el HER2.

Además, cualquiera de dichas proteínas de unión, puede comprender polipéptidos adicionales (tales como, p. ej., etiquetas polipeptídicas, enlazadores polipeptídicos, fusiones con otros dominios de unión proteináceos, citocinas, hormonas, o antagonistas), o modificaciones químicas (tales como acoplamiento con polietilenglicol, toxinas [p. ej., DM1 de Immunogen], moléculas pequeñas, antibióticos, y similares), bien conocidos por el experto en la técnica.

El término “ dominio de unión” , significa un dominio proteico que presenta el mismo “ plegamiento” (es decir, estructura secundaria, terciaria, y/o cuaternaria) que un armazón proteico, y que tiene una propiedad predeterminada, como se define a continuación. Dicho dominio de unión puede obtenerse por técnicas de modificación proteica racionales o, más comúnmente, combinatorias, capacidades conocidas en la técnica (Binz, H.K., Amstutz, P., Plückthun, A., 2005. Nat. Biotech. 23, 1257-1268). Por ejemplo, un dominio de unión que tenga una propiedad predeterminada, puede obtenerse por un método que comprenda las etapas de (a) proporcionar una colección diversa de dominios proteicos que presenten el mismo plegamiento que un armazón proteico, como se define adicionalmente a continuación; y (b) cribar dicha colección diversa y/o seleccionar de dicha colección diversa, para obtener al menos un dominio proteico que tenga dicha propiedad predeterminada. La colección diversa de dominios proteicos se puede proporcionar mediante varios métodos según el sistema de cribado y/o de selección que se vaya a utilizar, y puede comprender el uso de métodos bien conocidos por el experto en la técnica, tal como despliegue de fagos o Ribosome Display. Preferentemente, dicho dominio de unión es un dominio de unión recombinante.

El término “ armazón proteico” , significa una proteína con áreas de superficie expuestas, en las que las inserciones, sustituciones o eliminaciones de aminoácidos, son altamente tolerables. Ejemplos de armazones proteicos que se pueden utilizar para generar los dominios de unión de la presente descripción, son anticuerpos o fragmentos de los mismos, tales como fragmentos Fv o Fab de cadena simple, proteína A de Staphylococcus aureus, la proteína de unión bilin de Pieris brassicae u otras lipocalinas, proteínas de repetición de anquirina u otras proteínas de repetición, y la fibronectina humana. Los armazones proteicos son conocidos por el experto en la técnica (Binz y col., 2005, loc. cit.; Binz y col., 2004, loc. cit.).

El término “ diana” , se refiere a una molécula individual, tal como una molécula de ácido nucleico, un polipéptido o proteína, un carbohidrato, u otra molécula de origen natural, incluyendo cualquier parte de dicha molécula individual, o complejos de dos o más de dichas moléculas. Una diana puede ser una célula completa o una muestra de tejido, o puede ser cualquier compuesto no natural. Preferentemente, una diana es un polipéptido de origen natural o no natural, o un polipéptido que contenga modificaciones químicas, por ejemplo, modificados por fosforilación, acetilación o metilación, natural o no natural. En la aplicación particular de la presente descripción, las dianas son albúmina sérica y HER2.

El término “ propiedad predeterminada” se refiere a una propiedad tal como la unión a una diana, el bloqueo de una diana, la activación de una reacción mediada por la diana, la actividad enzimática, y las propiedades relacionadas adicionales. Dependiendo del tipo de propiedad deseada, un experto en la técnica será capaz de identificar el formato y las etapas necesarias para realizar el cribado y/o la selección de un dominio de unión con la propiedad deseada. Preferentemente, dicha propiedad predeterminada es se une específicamente a una diana.

En el contexto de la presente descripción, el término “ polipéptido” se refiere a una molécula que consiste en una cadena de múltiples, es decir, dos o más, aminoácidos unidos a través enlaces peptídicos. Preferentemente, un polipéptido consiste en más de ocho aminoácidos unidos a través de enlaces peptídicos. El término “ polipéptido” incluye también múltiples cadenas de aminoácidos, unidos entre sí por puentes S-S de cisteínas. Los polipéptidos son bien conocidos por el experto en la técnica.

El término “ etiqueta polipeptídica” se refiere a una secuencia de aminoácidos unida a un polipéptido/proteína, en donde dicha secuencia de aminoácidos sea útil para la purificación, detección, o “ direccionamiento” (es decir, la localización del sitio de una diana) de dicho polipéptido/proteína, o en donde dicha secuencia de aminoácidos mejore el comportamiento fisicoquímico del polipéptido/proteína, o en donde dicha secuencia de aminoácidos posea una función efectora. Las etiquetas polipeptídicas individuales de una proteína de unión, se pueden conectar a otras partes de la proteína de unión directamente o a través de enlazadores polipeptídicos. Estas etiquetas polipeptídicas se conocen bien en la técnica, y están completamente disponibles para el experto en la técnica. Ejemplos de etiquetas polipeptídicas son secuencias polipeptídicas pequeñas, por ejemplo, las etiquetas His (p. ej., la etiqueta His de s Eq ID NO: 1), myc, FLAG, o Strep, o polipéptidos, tales como las enzimas (por ejemplo, la fosfatasa alcalina), que permiten la detección de dicho polipéptido/proteína, o polipéptidos que se puedan utilizar para el direccionamiento (tales como las inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas) y/o como moléculas efectoras.

El término “ enlazador polipeptídico” se refiere a una secuencia de aminoácidos que sea capaz de unir, por ejemplo, dos dominios proteicos, una etiqueta polipeptídica y un dominio proteico, un dominio proteico y un compuesto no proteináceo o un polímero, tal como el polietilenglicol, o dos etiquetas de secuencia. Dichos dominios adicionales, etiquetas, compuestos no proteináceos o polímeros, y enlazadores, son conocidos por el experto en la técnica relevante. Una lista de ejemplos se proporciona en la descripción de la solicitud de patente WO2002/020565. Ejemplos particulares de dichos enlazadores son los enlazadores glicina-serina y los enlazadores prolina-treonina de longitudes variables. Ejemplos de enlazadores glicina-serina son GS y las secuencias de aminoácidos que se proporcionan en las SEQ ID NOs: 2 a 6, y se proporcionan ejemplos de enlazadores prolina-treonina en las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 7 a 9.

La solicitud de patente WO2002/020565 y Forrer y col., 2003 (Forrer, P., Stumpp, M.T., Binz, H.K., Plückthun, A., 2003. FEBS Letters 539, 2-6), contienen una descripción general de características de proteínas de repetición y características de dominios de repetición, técnicas y aplicaciones. La expresión “ proteína de repetición” , se refiere a una proteína que comprenda uno o más dominios de repetición. Preferentemente, una proteína de repetición comprende hasta seis dominios de repetición. Más preferentemente, una proteína de repetición comprende hasta cinco dominios de repetición. Más preferentemente, una proteína de repetición comprende hasta cuatro dominios de repetición. Además, dicha proteína de repetición puede comprender dominios proteicos no de repetición adicionales, etiquetas polipeptídicas, y/o enlazadores polipeptídicos. Los dominios de repetición pueden ser dominios de unión, como se ha descrito anteriormente en la presente memoria.

El término “ dominio de repetición” se refiere a un dominio proteico que comprenda dos o más módulos de repetición consecutivos como unidades estructurales, en donde dichas unidades estructurales tengan el mismo plegamiento, y se apilen firmemente para crear una estructura superhelicoidal que tenga un núcleo hidrófobo conjunto. Junto a una homología estructural, dichos módulos de repetición tienen, adicionalmente, una homología de secuencia.

Preferentemente, un dominio de repetición comprende, además, una repetición de recubrimiento del extremo N y/o del extremo C. Para mayor claridad, una repetición de recubrimiento puede ser un módulo de repetición. Dichos dominios de repetición, módulos de repetición, y repeticiones de recubrimientos, motivos de secuencias, así como la homología estructural y la homología de secuencia, son bien conocidos por el experto en la técnica, a partir de los ejemplos de dominios de repetición de anquirina (documento WO2002/020565), dominios de repetición ricas en leucina (documento WO2002/020565), dominios de repetición de tetratricopéptidos (Main, E.R., Xiong, Y., Cocco, M.J., D'Andrea, L., Regan, L., Structure 11 [5], 497-508, 2003), y dominios de repetición de armadillo (documento WO2009/040338). También es bien conocido por el experto en la técnica, que dichos dominios de repetición son diferentes de las proteínas que comprenden secuencias de aminoácidos repetidas, donde cada secuencia de aminoácidos repetida es capaz de formar un dominio individual (por ejemplo, dominios FN3 de Fibronectina), o donde las secuencias de aminoácidos repetidas no sean unidades estructurales, es decir, dichas secuencias de aminoácidos repetidas no se apilen firmemente para crear una estructura superhelicoidal que tenga un núcleo hidrófobo conjunto. Los métodos para identificar y determinar los módulos de repetición o los motivos de secuencia de repetición, o para identificar las familias de proteínas relacionadas que comprendan dichas unidades o motivos de repetición, tal como las búsquedas de homología (BLAST®, etc.), están bien establecidas en el campo de la bioinformática, y son bien conocidas por el experto en la técnica.

Los términos “ proteína de repetición diseñada” y “ dominio de repetición diseñado” , se refieren a una proteína de repetición o un dominio de repetición, respectivamente, obtenidos como resultado de un procedimiento inventivo, p. ej., como se explica en la solicitud de patente WO2002/020565. El término “diseñado” , se refiere a la propiedad de que dichas proteínas de repetición y dichos dominios de repetición son, respectivamente, artificiales, sintéticos y no naturales. Las proteínas de repetición diseñadas o los dominios de repetición diseñados del documento WO2002/020565, incluyen proteínas de repetición de anquirina diseñadas o dominios de repetición de anquirina diseñados, respectivamente. En consecuencia, una proteína de repetición de anquirina diseñada, en la presente memoria, corresponde a la proteína de la descripción que comprende al menos un dominio de repetición de anquirina diseñado. Además, el término “ no natural” , significa que la secuencia de dicha proteína de unión o de dicho dominio de unión, no está presente como entrada de secuencia no artificial en una base de datos de secuencias, por ejemplo, en GenBank, EMBL-Bank o Swiss-Prot. Estas bases de datos y otras bases de datos de secuencias similares, son bien conocidas por el experto en la técnica. Las proteínas de unión recombinantes o los dominios de repetición de anquirina diseñados de la descripción no son de origen natural.

Los términos “ módulo de repetición” , “ unidad de repetición” , “ repetición de recubrimiento” , “ módulo de recubrimiento ” , y expresiones adicionales que se refieren a proteínas de repetición y módulos de repetición, se definen en el documento WO2002/020565.

Los términos “tiene especificidad de unión para una diana” , “ se une específicamente a una diana” , “ unión a una diana con alta especificidad” , “ específico para una diana” o “ especificidad de diana” y similares, significa que una proteína de unión o un dominio de unión, se une en PBS a una diana con una constante de disociación menor (es decir, se une con mayor afinidad) que con la que se une a una proteína no relacionada, tal como la proteína de unión a maltosa (MBP, por su siglas en inglés) de E. coli. Preferentemente, la constante de disociación (Kd) en PBS para la diana es al menos de 102; más preferentemente, al menos de 103; más preferentemente, al menos de 104; o más preferentemente, al menos de 105 veces menor que la constante de disociación correspondiente para MBP. Los métodos para determinar las constantes de disociación de las interacciones proteína-proteína, tal como las tecnologías basadas en resonancia de plasmón de superficie (SPR, por sus siglas en inglés) (p. ej., análisis de equilibrio en SPR) 0 la calorimetría de titulación isotérmica (iTc , por sus siglas en inglés), son bien conocidos por el experto en la técnica. Los valores de la Kd medidos de una interacción proteína-proteína particular pueden variar si se miden en diferentes condiciones (p. ej., concentración salina, pH). Por lo tanto, las mediciones de los valores de Kd se hacen, preferentemente, con soluciones estandarizadas de proteínas y un tampón estandarizado, tal como el PBS.

El término “ PBS” significa una solución tamponada de agua con fosfato que contenga 137 mM de NaCl, 10 mM de fosfato y 2,7 mM de KCl, y que tenga un pH de 7,4.

El término “ inhibe la proliferación celular” y similares, en el contexto de la presente descripción, se refiere a la capacidad de dicha proteína de unión recombinante para inhibir la proliferación celular. La fuerza de inhibición se mide normalmente evaluando la concentración de inhibición semimáxima (CI50). El término inhibición y la evaluación de los valores de la CI50 están bien establecidos en el campo.

El término “ albúmina sérica de ratón” , se refiere al número de acceso P07724 de UniProt, el término “ albúmina sérica de un mono Cynomolgus” (es decir, Macaca fascicularis), se refiere al número de acceso A2V9Z4 de UniProt, y el término “ albúmina sérica humana” , se refiere al número de acceso P02768 de UniProt.

HER2, como se utiliza en la presente memoria, se refiere al Receptor del factor de crecimiento epidérmico humano 2, también conocido como Neu, ErbB-2, CD340 (cluster de diferenciación 340) o p185. El HER2 es un miembro de la familia de los receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR/ErbB). El HER2, en los seres humanos, se codifica por el ERBB2, un proto-oncogén conocido que se localiza en el brazo largo del cromosoma 17 humano (17q12). El HER2 tiene el número P04626 de UniProtKB/Swiss-Prot. El HER2 humano consiste en 1255 aminoácidos con una secuencia de señal de 21 aminoácidos, una región extracelular de 631 aminoácidos (p. ej., el ectodominio que comprende los dominios 1 a IV), una región transmembrana de 23 aminoácidos, y un dominio citoplasmático de 580 aminoácidos.

“ Estabilidad de almacenamiento mejorada” en el contexto de la presente descripción, significa la reducción de las cantidades de una banda de degradación, preferentemente la reducción de la cantidad de productos de degradación, según se detecta por una SDS-PAGE teñida con Coomasie que se produce tras el almacenamiento a 40 °C durante 1 mes a 10 mg/ml en PBS, en al menos un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, o 50 %. Los métodos para evaluar la estabilidad de almacenamiento mediante SDS-PAGE, son bien conocidos por el experto en la técnica. En los Ejemplos 2 y 3 se dan ejemplos de dominios de repetición de anquirina diseñados y de proteínas de unión recombinantes con propiedades de estabilidad de almacenamiento mejoradas.

La expresión “ la proteína de unión recombinante que comprende solo un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica ” , significa una proteína de unión recombinante que tiene la composición de una proteína de unión de la presente descripción, en la que el número de dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica se reduce a uno, al retirar todos los dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica excepto uno, y los enlazadores polipeptídicos correspondientes.

El término “ proteína de unión bi-paratópica” , significa una proteína de unión dirigida contra dos epítopos diferentes localizados en la misma proteína diana. Por ejemplo, una proteína de unión bi-paratópica que se dirija al HER2, comprende al menos un primer dominio de unión que se dirige a un primer epítopo en el HER2, y un segundo dominio de unión que se dirige a un segundo epítopo diferente en el HER2. La proteína que consiste en la SEQ ID NO: 32, es una proteína de unión bi-paratópica que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2, que se dirige a epítopos diferentes en HER2. La proteína de unión recombinante que consiste en la SEQ ID NO: 21, comprende la ^sE^qID NO: 32.

La expresión “ presenta propiedades farmacocinéticas mejoradas” , “ propiedades farmacocinéticas mejoradas” , o “ mejora de las propiedades farmacocinéticas” , en la presente descripción, tiene el significado de que un parámetro farmacocinético de una proteína de unión recombinante, está mejorado en comparación con el parámetro farmacocinético correspondiente de una proteína con la que se compare. Los ejemplos correspondientes se muestran en los Ejemplos 8, 9, 10, y 11 (véase las Figuras 5 y 6). Preferentemente, una propiedad farmacocinética mejorada es un aclaramiento reducido, y/o un aumento de la exposición, y/o un aumento de la semivida terminal. Más preferentemente, una propiedad farmacocinética mejorada es un aumento de la semivida terminal. En una realización, una proteína de unión recombinante de la presente descripción, que comprende al menos dos, más preferentemente que comprende dos, dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, presenta un aumento de la semivida terminal, y/o un aclaramiento reducido, y/o un aumento de exposición, en al menos un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 %, 250 %, o 250 %, en comparación con una proteína de unión recombinante correspondiente que comprenda solo un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica. En una realización una proteína de unión recombinante de la presente descripción, que comprende al menos dos, más preferentemente que comprende dos, dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, presenta un aumento de la semivida terminal, preferentemente un aumento de la semivida terminal en al menos un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 %, 250 %, o 250 %, en comparación con una proteína de unión recombinante correspondiente que comprenda solo un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica.

Preferentemente, el aclaramiento y/o la exposición, y/o la semivida terminal, se evalúan en un mamífero, más preferentemente en un ratón y/o en un mono Cynomolgus, más preferentemente en un mono Cynomolgus. Preferentemente, cuando se mide el aclaramiento, y/o la exposición, y/o la semivida terminal en un ratón, la evaluación se realiza considerando los datos de hasta 48 horas post-inyección. Más preferentemente, la evaluación de la semivida terminal en un ratón se calcula desde las 24 h a las 48 h. Preferentemente, cuando se mide el aclaramiento, y/o la exposición, y/o la semivida terminal, en monos Cynomolgus, la evaluación se hace considerando los datos hasta el día 7 post-inyección. Más preferentemente, la evaluación de la semivida terminal en monos Cynomolgus se calcula desde el día 1 hasta el día 5. El experto en la técnica es, además, capaz de identificar efectos tales como el aclaramiento mediado por la diana, y tenerlos en consideración cuando calcule la semivida terminal. El término “ semivida terminal” de un fármaco tal como una proteína de unión recombinante de la descripción, se refiere al tiempo necesario para alcanzar la mitad de la concentración plasmática del fármaco aplicado a un mamífero después de alcanzar el pseudo-equilibrio (por ejemplo, calculado desde las 24 horas hasta las 48 horas en un ratón, o calculado desde el día 1 hasta el día 5 en monos Cynomolgus). La semivida terminal no se define como el tiempo necesario para eliminar la mitad de la dosis del fármaco administrado a un mamífero. El término semivida terminal es bien conocido por el experto en la técnica. Preferentemente, la comparación farmacocinética se hace a cualquier dosis, más preferentemente a una dosis equivalente (es decir, la misma dosis en mg/kg), o a una dosis equimolar (es decir, la misma dosis en mol/kg), más preferentemente a una dosis equimolar (es decir, la misma dosis en mol/kg). El experto en la técnica entiende que la dosificación equivalente y/o la equimolar, en animales, está sometida a variaciones de la dosis experimental en al menos un 20 %, más preferentemente un 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o 100 %. Preferentemente, una dosis que se utilice para la medición farmacocinética, se selecciona de entre 0,001 a 1000 mg/kg, más preferentemente de 0,01 a 100 mg/kg, más preferentemente de 0,1 a 50 mg/kg, más preferentemente de 0,5 a 10 mg/kg.

Ejemplos

Materiales y métodos generales: Todos los materiales y reactivos convencionales descritos en el presente documento, son conocidos por el experto en la técnica, y están disponibles en el mercado, o se pueden preparar utilizando técnicas bien conocidas. Las líneas celulares se adquirieron en LGC/ATCC (Francia/EE. Uu .). Los medios de cultivo celular procedieron de Invitrogen/Lubio (Suiza). A menos que se especifique lo contrario, los métodos se realizan según lo descrito en protocolos establecidos (p. ej., Sambrook J., Fritsch E.F. y Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1989, Nueva York), bien conocidos por el experto en la técnica. Algunos métodos utilizados se habían descrito anteriormente en los documentos WO2012/069654 y WO2014/083208.

Dominios de repetición de anquirina diseñados: Los métodos para generar dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, se habían descrito en el documento WO2012/069654. Los métodos para generar dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2, y ejemplos de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados y métodos para generar proteínas de unión biparatópica, se habían descrito en el documento WO2014/083208. Los dominios de repetición de anquirina diseñados, en general, se describen con detalle en el documento WO2002/020565.

Ejemplo 1: ADN recombinante, expresión proteica y purificación proteica

El ADN que codifica dominios de repetición de anquirina diseñados o proteínas de unión recombinantes, se generó por medios genéticos bien conocidos por el experto en la técnica. Las proteínas de unión recombinantes seleccionadas del grupo de secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 21 a 33, que, opcionalmente, tenían adicionalmente la SEQ ID NO: 1 en el extremo N, o los dominios de repetición de anquirina diseñados seleccionados del grupo de secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 10 a 20, que, opcionalmente, tenían adicionalmente la SEQ ID NO: 1 en el extremo N, se expresaron en el citoplasma de Escherichia coli, utilizando técnicas convencionales, utilizando, por ejemplo, el sistema de expresión pQE de QIAgen (Alemania). En el caso de que los aminoácidos GS estuvieran en el extremo N, el resto Met codificado adicionalmente por el vector de expresión, se escindía eficazmente en el citoplasma de E. coli desde el polipéptido expresado, ya que al Met de inicio le sigue un pequeño resto de Gly (es decir, el aminoácido en la posición 1 de, por ejemplo, la SEQ ID NO: 21). Las células se lisaron utilizando una prensa francesa, y se purificaron las proteínas hasta casi la homogeneidad, a partir del extracto celular en bruto, utilizando técnicas cromatográficas convencionales bien conocidas por el experto en la técnica.

La siguiente lista define las proteínas según se utilizan en la presente descripción:

Proteína n° 10-His: SEQ ID NO: 10 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 1) fusionada a su extremo N

Proteína n° 11 -His: SEQ ID NO: 11 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 1) fusionada a su extremo N

Proteína n° 12-His: SEQ ID NO: 12 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 1) fusionada a su extremo N

Proteína n° 13-His: SEQ ID NO: 13 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 1) fusionada a su extremo N

Proteína n° 14-His: SEQ ID NO: 14 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 1) fusionada a su extremo N

Proteína n° 15-His: SEQ ID NO: 15 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 1) fusionada a su extremo N

Proteína n° 16-His: SEQ ID NO: 16 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 1) fusionada a su extremo N

Proteína n° 17-His: SEQ ID NO: 17 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 1) fusionada a su extremo N

Proteína n° 18-His: SEQ ID NO: 18 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 1) fusionada a su extremo N

Proteína n° 19-His: SEQ ID NO: 19 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 1) fusionada a su extremo N

Proteína n° 20-His: SEQ ID NO: 20 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 1) fusionada a su extremo N

Proteína n° 21: SEQ ID NO: 21

Proteína n° 21-His: SEQ ID NO: 21 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 1) fusionada a su extremo N

Proteína n° 22: SEQ ID NO: 22

Proteína n° 22-His: SEQ ID NO: 22 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 1) fusionada a su extremo N

Proteína n° 23: SEQ ID NO: 23

Proteína n° 23-His: SEQ ID NO: 23 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 1) fusionada a su extremo N Proteína n° 24: SEQ ID NO: 24

Proteína n° 24-His: SEQ ID NO: 24 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 1) fusionada a su extremo N

Proteína n° 25: SEQ ID NO: 25

Proteína n° 25-His: SEQ ID NO: 25 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 1) fusionada a su extremo N

Proteína n° 26: SEQ ID NO: 26

Proteína n° 26-His: SEQ ID NO: 26 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 1) fusionada a su extremo N

Proteína n° 27: SEQ ID NO: 27

Proteína n° 27-His: SEQ ID NO: 27 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 1) fusionada a su extremo N

Proteína n° 28: SEQ ID NO: 28

Proteína n° 28-His: SEQ ID NO: 28 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 1) fusionada a su extremo N

Proteína n° 29: SEQ ID NO: 29

Proteína n° 29-His: SEQ ID NO: 29 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 1) fusionada a su extremo N

Proteína n° 30: SEQ ID NO: 30

Proteína n° 30-His: SEQ ID NO: 30 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 1) fusionada a su extremo N

Proteína n° 31-His: SEQ ID NO: 31 (incluye una etiqueta His en su extremo N)

Proteína n° 32: SEQ ID NO: 32

Proteína n° 32-His: SEQ ID NO: 32 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 1) fusionada a su extremo N

Proteína n° 33: SEQ ID NO: 33

Proteína n° 33-His: SEQ ID NO: 33 con una etiqueta His (SEQ ID NO: 1) fusionada a su extremo N

Ejemplo 2: Generación de un dominio de repetición de anquirina de estabilidad mejorada diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica (SEQ ID NO: 14).

Contrariamente al conocimiento general diseñado de repetición de anquirina, los inventores descubrieron que la Proteína n° 12-His, la Proteína n° 13-His, y la Proteína n° 15-His (documento WO2012/069654; véase el Ejemplo 1) se degradan con la incubación prolongada en PBS a 10 mg/kg a 40 °C y, por lo tanto, no son ideales para su uso como componentes de candidatos a fármacos. El análisis de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, revela un alto número de sitios potenciales de degradación. La degradación se puede producir, por ejemplo, en la proximidad de cualquiera de las 5 asparaginas (incluyendo los dipéptidos asparagina-glicina), los 13 aspartatos, o las 10 glicinas de la SEQ ID NO: 13, entre los sitios adicionales potenciales de degradación. La SEQ ID NO: 13 comprende, además, varios sitios potenciales de oxidación. Se tiene que analizar, por lo tanto, un alto número de mutantes, y combinaciones de mutantes, para aislar una variante que presente propiedades de estabilidad de almacenamiento mejoradas. Sorprendentemente, los inventores pudieron generar una variante funcional que presenta un gran efecto en la estabilidad de almacenamiento, mutando solo la posición 80 de la SEQ ID NO: 13. Cuando se mutó el aspartato de la posición 80 de la SEQ ID NO: 13 a glutamato, se generó un dominio de repetición de anquirina funcional diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica, correspondiente a la SEQ ID NO: 14, lo que demuestra una destacada mejoría en la estabilidad de almacenamiento (Ejemplo 3; Figura 2). La Proteína n° 14-His, como la Proteína n° 13-His, mostraron una afinidad nanomolar baja (constante de disociación [Kd] menor de 100 nM) para la albúmina sérica humana, de ratón, y de mono Cynomolgus, a un pH 7,4 en PBS (medición con resonancia de plasmón de superficie ProteOn, según el fabricante [BioRad]). Sorprendentemente, la Proteína n° 14-His mostró, adicionalmente, un punto medio de desnaturalización térmica mejorado, en comparación con la Proteína n° 13-His, como se determina mediante despliegue térmico, utilizando técnicas bien conocidas (Niesen, F.H., Berglund, H., Vedadi, M., Nature Protocols 2, 2212-2221, 2007; Proteína n° 13-His: Tm = 86 °C; Proteína n° 14-His, Tm = 89,5 °C; pH 6,0).

Ejemplo 3: Mejora de la estabilidad de almacenamiento cuando se utiliza la SEQ ID NO: 14.

Se prepararon la Proteína n° 13-His, la Proteína n° 14-His, y la Proteína n° 15-His, como se describe en el Ejemplo 1, y se concentraron las muestras a 10 mg/ml en PBS. La Proteína n° 14-His y la Proteína n° 15-His, a continuación, se almacenaron durante 1 mes a -80 °C o a 40 °C, en viales de cristal, seguido por un análisis en SDS PAGE al 15 %. Mientras que la Proteína n° 14-His y la Proteína n° 15-His mostraron una estabilidad equivalente tras el almacenamiento a -80 °C, la Proteína n° 14-His mostró cantidades significativamente reducidas de productos de degradación en >50 % de reducción, en comparación con la Proteína n° 15-His en SDS PAGE al 15 %, tras 1 mes de almacenamiento a 40 °C. De manera similar, cuando se almacenaron a 4 °C, 25 °C, 40 °C y 60 °C, durante una semana a 10 mg/ml en PBS, la Proteína n° 14-His mostró cantidades significativamente reducidas de productos de degradación, en comparación con la Proteína n° 13-His. En particular, la Proteína n° 14-His mostró >50 % de reducción de productos de degradación, en comparación con la Proteína n° 13-His, en una SDS PAGE al 15 %, cuando ambas se almacenaron a 40 °C o 60 °C, respectivamente, (Figura 2). Estos hallazgos ilustran que la Proteína n° 14-His tiene una estabilidad de almacenamiento mejorada, en comparación con la Proteína n° 13-His y la Proteína n° 15-His. De manera similar, cuando se compara la estabilidad de almacenamiento de la Proteína n° 12-His, la Proteína n° 13-His, la Proteína n° 14-His, y la Proteína n° 15-His (véase el Ejemplo 1), al incubar las proteínas a 10 mg/ml en PBS, en viales de cristal durante 1 mes a 40 °C, la Proteína n° 12-His, la Proteína n° 13-His, y la Proteína n° 14-His, muestran >30 % de reducción de productos de degradación, en comparación con la Proteína n° 15-His.

También se observa una mejora de la estabilidad de almacenamiento, cuando se ensaya la estabilidad de almacenamiento de la Proteína n° 21 y la Proteína n° 22 (proteínas de unión recombinantes que consisten en las secuencias de aminoácidos correspondientes a las SEQ ID NOs: 21 y 22, respectivamente). La Proteína n° 21 y la Proteína n° 22 se prepararon como se describe en el Ejemplo 1, se concentraron las muestras a 10 mg/ml en PBS, y se almacenaron durante 1 mes a -80 °C o a 40 °C, en viales de cristal, seguido por un análisis en una cromatografía de exclusión por tamaño convencional. Mientras que la Proteína n° 21 y la Proteína n° 22 muestran perfiles de elución equivalentes tras el almacenamiento a -80 °C, la Proteína n° 21 muestra significativamente más especies monoméricas, en comparación con la Proteína n° 22 tras el almacenamiento a 40 °C. Esto indica que tener la SEQ ID NO: 21 presente en la proteína de unión recombinante, es más favorable con respecto a la estabilidad de almacenamiento que tener la SEQ ID NO: 22 presente. De manera similar, la Proteína n° 21 presenta menores cantidades de productos de degradación que la Proteína n° 22, cuando se analiza por SDS-PAGE tras 1 mes de almacenamiento a 40 °C, en viales de cristal en PBS a 10 mg/ml, confirmando la mayor estabilidad de almacenamiento de una proteína de unión recombinante que comprenda la SEQ ID NO: 21, en comparación con la proteína de unión recombinante que comprenda la SEQ ID NO: 22. A su vez, esto indica que tener dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica que consistan en la SEQ ID NO: 14 presentes en la proteína de unión recombinante, es más favorable con respecto a la estabilidad de almacenamiento que tener dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica presentes que consistan en la SEQ ID NO: 13.

Ejemplo 4: Generación de un candidato a fármaco

También se habían descrito anteriormente ejemplos de dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2 (documento WO2014/083208; documento WO2014/060365; Steiner, D., Forrer, P. y Plückthun, A., J. Mol. Biol. 382, 1211-1227, 2008; Zahnd, C., Pecorari, F., Straumann, N., Wyler, E. and Plückthun, A., J. Biol. Chern.

281[46], 35167-35175, 2006). En los documentos WO2014/083208 y WO2014/060365, se combinaron dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2, con diferentes dominios, dando como resultado proteínas de unión bi-paratópicas que muestran una mayor inhibición del crecimiento de células tumorales.

La proteína de unión recombinante que consiste en la SEQ ID NO: 21, es un candidato a fármaco que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2 (SEQ ID NOs: 16 y 17, respectivamente), así como dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica flanqueantes (cada uno con la SEQ ID NO: 14), unidos por enlazadores polipeptídicos (cada uno con la SEQ ID NO: 9) (véase la Figura 1). Se ha identificado esta proteína de unión recombinante, mediante un procedimiento complejo que incluye, entre otros, etapas de ingeniería y optimización proteica. En una primera etapa, se generaron cientos de combinaciones de dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2, como proteínas de unión bi-paratópicas mediante clonación, expresión y purificación (véase el Ejemplo 1). Las proteínas de unión bi-paratópicas se cribaron, a continuación, en cuanto a la afinidad para el HER2, así como en cuanto a la inhibición de la potencia celular y la proliferación celular, como se describe en el documento WO2014/083208, y como se describe a continuación. Los resultados representativos de las proteínas de unión bi-paratópicas que resultan de este esfuerzo, se proporcionan en los Ejemplos 5 y 6. De manera importante, la molécula tiene que ser bi-paratópica, ya que si tiene solo un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para el ^hER2, daría lugar a moléculas sin potencia de inhibición celular. Las proteínas de unión recombinantes se sometieron adicionalmente a ingeniería. Esta etapa incluía (entre otras) la ingeniería farmacocinética, añadiendo dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, en distintos formatos (es decir, añadiendo diferentes números de dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, en diferentes posiciones de la molécula) a las proteínas de unión bi-paratópicas, y mediante el ensayo con distintos enlazadores polipeptídicos. Estas proteínas se ensayaron en cuanto a la eficacia in vivo (Ejemplo 7 representativo), la farmacocinética en un ratón (Ejemplo 8 representativo), y la farmacocinética en un mono Cynomolgus (Ejemplo 9 representativo), así como en cuanto a la potencia celular. La optimización del enlazador polipeptídico, incluyó una etapa de ensayo del efecto del enlazador sobre el perfil farmacocinético (Ejemplo 10 representativo). La optimización del esfuerzo de modificación farmacocinética, se evaluó mediante mediciones farmacocinéticas (Ejemplo 11 representativo) y mediciones de potencia (Ejemplo 12 representativo). Además, se ensayaron distintos candidatos a fármacos, en cuanto a sus niveles de expresión recombinante en E. coli (Ejemplo 13). La proteína de unión recombinante que consiste en la SEQ ID NO: 21. es una proteína que resulta de este esfuerzo. Es un candidato a fármaco para su uso en el hombre.

La Proteína n° 31, la proteína de unión recombinante que consiste en la SEQ ID NO: 31, se corresponde con la proteína que consiste en la Proteína n° 21 y los aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 en el extremo N.

Ejemplo 5: Unión de alta afinidad de HER2 por la proteína de unión recombinante que comprende la SEQ ID NO: 21.

La Proteína n° 21-His se expresó y purificó como se describe en el Ejemplo 1. Su afinidad para el HER2 se evaluó mediante resonancia de plasmón de superficie, como se describe en el documento WO2014/083208. Se determinó una constante de disociación de 27 pM por ajuste global de los valores en unidades de resonancia obtenidos para diferentes concentraciones, un método bien conocido por el experto en la técnica. En comparación, la Proteína n° 23-His (véase el Ejemplo 1), que comprende otra combinación de dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2, presentó una constante de disociación de 64 pM. De similar manera, la combinación de los dominios de repetición de anquirina diseñados que se corresponden con las SEQ ID NOs: 16 y 17, presentaron una mejor constante de disociación que la mayoría de las combinaciones que se generaron basándose en los dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2 conocidos del documento WO2014/083208.

Las mediciones mediante resonancia de plasmón de superficie demostraron, adicionalmente, que la proteína de unión recombinante que consiste en la SEQ ID NO: 21, no interactúa con los dominios extracelulares del HER3 o del EGFR.

Las mediciones mediante resonancia de plasmón de superficie demostraron, adicionalmente, que los dominios de repetición de anquirina diseñados que consisten en las SEQ ID NOs: 16 o 17 (que comprenden cada una, adicionalmente, la SEQ ID NO: 1 en el extremo N), presentan una constante de disociación de 9 pM y 152 pM, respectivamente, para la unión al HER2.

Los experimentos de resonancia de plasmón de superficie demostraron, adicionalmente, que la Proteína n° 21 se puede unir simultáneamente al HER2 humano y a la albúmina sérica humana.

Los experimentos de resonancia de plasmón de superficie demostraron, adicionalmente, que la Proteína n° 21 a 100 nM se une a la albúmina sérica humana con una constante de disociación (Kd) de 21 nM.

Ejemplo 6: Alta potencia celular e inducción de apoptosis de la proteína de unión recombinante que comprende la SEQ ID NO: 21.

La Proteína n° 21-His y la Proteína n° 23-His se expresaron y purificaron como se describe en el Ejemplo 1. Se determinaron los efectos de las proteínas de unión recombinantes sobre la proliferación de las células BT474, midiendo la síntesis de ADN, utilizando un etiquetado con BrdU (BrdU, ELISA de proliferación celular, Roche). En resumen, se sembraron 10.000 células BT474 por pocillo, en una placa de 96 pocillos en 100 ul de medio completo, y se incubaron durante 24 horas. Las proteínas de unión recombinantes o controles, se añadieron durante 72 horas adicionales. El BrdU para el etiquetado celular se añadió durante las últimas 24 horas. Las células etiquetadas (proliferantes) se detectaron según el protocolo del fabricante. Los datos se analizaron utilizando el software GraphPad prism, representando el log[c] en el eje x frente a la DO450-602 nm en el eje y. Los datos se ajustaron utilizando un ajuste de regresión no lineal (log[antagonista] vs. respuesta - pendiente variable [cuatro parámetros]), derivando los valores de CI50. Los resultados se muestran en la Figura 3. La Proteína n° 21-His inhibe la proliferación de células BT474 con un valor de la CI50 aparente de 1,5 nM. Una CI50 de 2,4, un 60 % mayor (es decir, peor), se observó para la Proteína n° 23-His, indicando que tener las SEQ ID NOs: 16 y 17 en una proteína de unión recombinante, es más favorable que tener las SEQ ID NOs: 18 y 17. De similar manera, la combinación de los dominios de repetición de anquirina diseñados que se corresponden a las SEQ ID NOs: 16 y 17, inhibieron las células BT474 con un valor aparente de la CI50 menor que el observado en la mayoría de las combinaciones generadas que se basan en los dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2 conocidos del documento WO2014/083208.

La proteína de unión recombinante que consiste en la SEQ ID NO: 21 (Proteína n° 21), presentó, adicionalmente, una fuerte inhibición de la proliferación en varias líneas celulares cancerosas, incluyendo las líneas celulares SKBR-3, SKOV-3, NCI-N87, ZR-75-30, HCC1419, o MDA-MB175.

La inducción de apoptosis por la Proteína n° 21, se determinó midiendo la activación de Caspasa 3/7, utilizando los sistemas Caspasa 3/7-Glo (Promega, Suiza). En resumen, se sembraron 10000 células BT474 por pocillo, en una placa de 96 pocillos en 100 μl de medio completo, y se incubaron durante 24 horas. La Proteína n° 21 y los puntos de referencia se añadieron durante 24 horas adicionales. Se añadió durante 1 hora el reactivo Caspasa Glo según el protocolo del fabricante. Se controló la activación de la Caspasa 3/7, midiendo la actividad de la luciferasa. De manera alternativa, se determinó la inducción de la apoptosis, utilizando el sistema de Detección de muerte celular ELISAPLUS (Roche, Suiza). El ensayo se realizó según el protocolo del fabricante. El número de células y tiempos de incubación fue similar a los del resultado de lectura de Caspasa Glo. Los datos se analizaron utilizando el software GraphPad prism, representando la concentración en el eje x frente a la DO405/490 nm o las unidades de luz relativas (RLU; medidas en un lector Tecan M-1000) en el eje y. Los datos se ajustaron utilizando un ajuste de regresión no lineal (log[agonista] vs. respuesta - Pendiente variable [cuatro parámetros]). Los resultados se muestran en la Figura 7. Para la Proteína n° 21 se observó una CE50 de 2,4 nM. La apoptosis presenta, de manera similar, una alta potencia en la inducción de apoptosis para las líneas celulares SKBR-3, SKOV-3, NCI-N87, ZR-75-30, HCC1419, o MDA-MB175. Por el contrario, los anticuerpos Trastuzumab, Pertuzumab, o la mezcla de Trastuzumab y Pertuzumab, no indujeron apoptosis en las células BT474 (Figura 7).

De manera importante, estos ensayos demuestran que la Proteína n° 21, en donde la SEQ ID NO: 32 está flanqueada por la SEQ ID NO: 14, presenta una alta potencia celular, similar a cuando se utiliza la SEQ ID NO: 32 por sí sola.

Ejemplo 7: Alta eficacia de la proteína de unión recombinante que comprende la SEQ ID NO: 21, en modelos de xenoinjerto tumoral en ratón.

La Proteína n° 21-His, la Proteína n° 23-His, la Proteína n° 24-His, la Proteína n° 25-His, se expresaron y purificaron como se describe en el Ejemplo 1. En un estudio, se comparó la Proteína n° 21-His con Trastuzumab y PBS. Los resultados se muestran en la Figura 4a. Esencialmente, se llevaron a cabo los modelos de xenoinjerto tumoral de cáncer de mama BT474 en ratón de la siguiente manera, utilizando procedimientos bien conocidos por el experto en la técnica: Se cultivaron y se resuspendieron células de carcinoma de mama humano BT474, y se inyectaron 2*107 células en 200 μl de medio RPMI 1640 que contenía un 50:50 de matrigel (BD Biosciences) por ratón, en el flanco derecho de ratones Balb/c desnudos hembra. Con volúmenes tumorales de aproximadamente 200-300 mm3, los ratones se distribuyeron aleatoriamente en grupos de 8 animales, y se comenzó el tratamiento del tumor mediante la administración i.v. de PBS, Trastuzumab (10 mg/kg), Trastuzumab (10 mg/kg) y Pertuzumab (10 mg/kg), o la Proteína n° 21-His (35 mg/kg) en 7 dosis con un intervalo de 3 días (Q3Dx7). Se midieron los volúmenes tumorales durante 32 días. La Proteína n° 21-His es más eficaz en la inhibición del crecimiento tumoral que el Trastuzumab.

En un estudio similar, utilizando las células BT474 (con preparación y procedimiento idénticos; todos a dosis de 35 mg/kg), la Proteína n° 21-His se comparó con la Proteína n° 23-His, la Proteína n° 24-His, y la Proteína n° 25-His. Los resultados del día 18 tras el tratamiento se muestran en la Figura 4b. De manera importante, la Proteína n° 21-His es más eficaz en la supresión de los tumores que la Proteína n° 23-His, la Proteína n° 24-His, o la Proteína n° 25-His.

Además, la Proteína n° 21 se expresó y purificó como se describe en el Ejemplo 1. Se utilizaron PBS, la Proteína n° 21 (60 mg/kg), Trastuzumab (10 mg/kg), Pertuzumab (10 mg/kg), así como la combinación de Trastuzumab y Pertuzumab (10 mg/kg cada uno), en un modelo, bien conocido por el experto en la técnica, de xenoinjerto tumoral de un cáncer gástrico derivado de un paciente, en un ratón. Todos los grupos se dosificaron cada tres días durante 6 veces. En resumen, se obtuvieron fragmentos tumorales de xenoinjertos en pasajes en serie en ratones desnudos. Tras extraerlos de los ratones donantes, se cortaron los tumores en fragmentos (4-5 mm de diámetro), para la implantación subcutánea. Los ratones se distribuyeron aleatoriamente en grupos cuando los tumores alcanzaron un volumen de aproximadamente 100-120 mm3. El día de la distribución aleatoria e inicio del tratamiento se designó como día 0 de cada experimento. Se monitorizó el crecimiento tumoral mediante medición bidimensional con un calibre en el día de la distribución aleatoria y, posteriormente, dos veces a la semana. Se calcularon los volúmenes relativos de los tumores individuales (RTVs individuales) para el Día x, dividiendo el volumen tumoral individual en el Día x (Tx) por el volumen tumoral individual del mismo tumor en el Día 0 (T0), multiplicado por 100 %. Se calculó la inhibición tumoral para un día en particular (T/C en %), a partir de la relación de la mediana de valores de RTV del ensayo frente a los grupos de control, multiplicado por 100 %. La Figura 4c muestra la eficacia de la Proteína n° 21 en el modelo PDX de cáncer gástrico GXA3039, en comparación con el Trastuzumab y una combinación de T rastuzumab y Pertuzumab. La Proteína n° 21 presenta una fuerte inhibición del crecimiento tumoral, similar a la combinación de Trastuzumab y Pertuzumab, mientras que el Trastuzumab por sí solo es menos eficaz. La Figura 4d muestra un segundo experimento en el mismo modelo, comparando la Proteína n° 21 con Trastuzumab, Pertuzumab, y una combinación de T rastuzumab y Pertuzumab. La Proteína n° 21 presenta una fuerte inhibición del crecimiento tumoral, similar a la combinación de Trastuzumab y Pertuzumab. El Trastuzumab por sí solo y el Pertuzumab por sí solo son significativamente menos eficaces. Esto indica que el modelo tumoral podría haber adquirido resistencia al Trastuzumab con el tiempo. Esto sugiere, a su vez, que la Proteína n° 21 es eficaz, incluso en un cáncer resistente al Trastuzumab.

En un experimento similar, la Proteína n° 21 se ensayó adicionalmente en el modelo PDX de cáncer gástrico GXA281 en ratón, bien conocido por el experto en la técnica, en comparación con el estándar de tratamiento Lapatinib (Figura 4e). En resumen, el implante del tumor y la monitorización del crecimiento tumoral, se realizaron como se describió anteriormente. El Lapatinib se dosificó a 100 mg/kg/día durante 21 días, diariamente i.v., y la Proteína n° 21 a 40 mg/kg cada tres días 6 veces i.v.

Estos experimentos de este ejemplo ilustran la utilidad de las proteínas que comprenden la SEQ ID NO: 21, para su uso como medicamento en el tratamiento de una enfermedad.

Ejemplo 8: Propiedades farmacocinéticas favorables de la proteína de unión recombinante que comprende la SEQ ID NO: 21 en el ratón.

Las mediciones que se muestran en el presente ejemplo son el resultado de un esfuerzo de ingeniería de la semivida, como se describe en el Ejemplo 11. La Proteína n° 21-His y la Proteína n° 23-His se expresaron y purificaron como se describe en el Ejemplo 1. Las propiedades farmacocinéticas de las proteínas etiquetadas con His, se evaluaron en el ratón como se describe en otros sitios (Zahnd, C., Kawe, M., Stumpp, M.T., de Pasquale, C., Tamaskovic, R., Nagy-Davidescu, G., Dreier, B., Schibli, R., Binz, H.K., Waibel, R., Plückthun, A., Cancer Res.70, 1595-1605, 2010). Los resultados se muestran en la Figura 5. La Proteína n° 21-His presenta una semivida terminal de 30,4 horas con un 19,5 % de DI remanente tras 48 horas. En comparación, la Proteína n° 23-His presenta una semivida terminal de 24,7 horas con un 6,5 % de DI remanente tras 48 horas. Tener la SEQ ID NO: 16 presente en la proteína de unión recombinante, por lo tanto, parece ser más favorable que tener la SEQ ID NO: 18 presente.

Ejemplo 9: Propiedades farmacocinéticas favorables de la proteína de unión recombinante que comprende la SEQ ID n O: 21 en monos Cynomolgus.

Las mediciones que se muestran en el presente ejemplo son el resultado de un esfuerzo de ingeniería de la semivida, como se describe en el Ejemplo 11. La Proteína n° 21-His, la Proteína n° 23-His, y la Proteína n° 24-His, se expresaron y purificaron como se describe en el Ejemplo 1. Las propiedades farmacocinéticas de las proteínas se evaluaron en monos Cynomolgus. Las proteínas se administraron a los monos Cynomolgus por infusión intravenosa durante 30 min a un nivel de dosis diana de entre 1 mg/kg y 10 mg/kg. Las muestras de sangre se recogieron predosis, y de nuevo en puntos de tiempo seleccionados, por ejemplo, a los 5 min, 10 min, 0,5 horas, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 120 horas, 144 horas, 168 horas, 192 horas, 216 horas, y 240 horas, tras el final de la infusión (es decir, post-inyección). Se dejaron en reposo las muestras de sangre a temperatura ambiente, y se centrifugaron para generar el suero, seguido por el almacenamiento a -80 °C, pendiente de los análisis. Se determinaron los parámetros farmacocinéticos, utilizando procedimientos bien conocidos por el experto en la técnica. Las concentraciones de proteínas en el suero se determinaron mediante ELISA en sándwich, utilizando un anticuerpo monoclonal de conejo anti dominio de repetición de anquirina diseñado como reactivo de captura, y un anticuerpo monoclonal murino anti dominio de repetición de anquirina diseñado como reactivo de detección, y utilizando una curva estándar. Los parámetros farmacocinéticos se determinaron utilizando un software convencional, tal como Phoenix WinNonLin (Certara, Princeton, EE. UU.) o GraphPadPrism (GraphPad Software, La Jolla, EE. UU.), y análisis convencionales, tales como los análisis no compartimentales. Los resultados para la Proteína n° 21-His y la Proteína n° 23-His se muestran en la Figura 6. La Proteína n° 21-His presenta una semivida terminal de 47 horas, mientras que la Proteína n° 23-His presentó una semivida terminal de 35 horas, y la Proteína n° 24-His presentó una semivida terminal de 45 horas. Las proteínas también presentan un aclaramiento mediado por la diana, una vez que la concentración cae por debajo de 100 nM. El aclaramiento mediado por la diana es bien conocido por el experto en la técnica, y se conoce a partir de, p. ej., los anticuerpos que se dirigen al HER2.

De manera similar, la Proteína n° 21-His se expresó y purificó como se describe en el Ejemplo 1. Se evaluaron las propiedades farmacocinéticas de las proteínas en monos Cynomolgus, como se describió anteriormente, a 1 mg/kg, 5 mg/kg, y 10 mg/kg. Los parámetros farmacocinéticos se evaluaron como se describió anteriormente, y los resultados se muestran en la Figura 6. Se observó un aumento dependiente de la dosis de la semivida terminal desde las 47 horas a 1 mg/kg, hasta las 100 horas a 5 mg/kg, hasta más de 100 horas a 10 mg/kg. El aclaramiento mediado por la diana se observa una vez que la concentración cae por debajo de 100 nM.

Se observaron resultados similares cuando se ensayó la Proteína n° 21 (expresada y purificada como se describe en el Ejemplo 1). Las propiedades farmacocinéticas de las proteínas se evaluaron en monos Cynomolgus, como se describió anteriormente, a 1 mg/kg, 10 mg/kg y 100 mg/kg. Los parámetros farmacocinéticos se evaluaron como se describió anteriormente. Se observa un aumento dependiente de la dosis de la semivida terminal. Para la Proteína n° 21 se observó una semivida terminal de 109,5 horas o de 130,6 horas, a una dosis de 100 mg/kg en monos Cynomolgus.

Ejemplo 10: Mejorar las propiedades farmacológicas mediante la elección de enlazadores polipeptídicos.

Los enlazadores polipeptídicos que unen los dominios proteicos son bien conocidos por el experto en la técnica. Los enlazadores ricos en Gly-Ser son bien conocidos a partir de los fragmentos de anticuerpo Fv de cadena sencilla, donde han demostrado ser los más apropiados para unir las dos cadenas polipeptídicas de Fv. Sorprendentemente, los inventores descubrieron que los enlazadores ricos en Pro-Thr tienen un impacto positivo en las propiedades farmacocinéticas de una proteína de unión recombinante que comprenda dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2 y dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, en comparación con un enlazador rico en Gly-Ser. La Proteína n° 26-His y la Proteína n° 27-His se expresaron y purificaron como se describe en el Ejemplo 1. Los análisis farmacocinéticos en ratón se llevaron a cabo como se describe en el Ejemplo 8. La Proteína n° 27-His tuvo un 7 % de la dosis inyectada remanente a las 48 horas tras la inyección intravenosa, mientras que la Proteína n° 26-His solo tuvo un 5,3 % de dosis inyectada remanente. De manera similar, la Proteína n° 27-His presentó una semivida terminal más larga que la de la Proteína n° 26-His.

Ejemplo 11: Ingeniería de las propiedades farmacocinéticas

Se conocen muchas opciones en la técnica de la ingeniería farmacocinética, incluyendo la PEGilación, la extensión polipeptídica, la fusión Fc, la fusión con albúmina sérica, y la unión a albúmina sérica, entre otras (Kontermann, R [Ed.] “Therapeutic proteins: strategies to modulate their plasma half-lives” , Wiley-VCH Verlag GmbH, 2012, ISBN 978-3-527 32849-9). Comenzando, p. ej., a partir de la combinación de dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2 que comprendan las SEQ ID NOs: 16 y 17, hay cientos de variantes de potenciales candidatos a fármacos (elección de la ingeniería de modificación farmacocinética, elección del enlazador polipeptídico [p. ej., las SEQ ID NOs: 2 a 9, entre muchos otros], entre otros aspectos). Los inventores descubrieron que utilizando dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica que consistan en la SEQ ID NO: 14 (véase los Ejemplos 2 y 3), y utilizando enlazadores polipeptídicos ricos en Pro-Thr (SEQ ID NO: 9), dando como resultado la SEQ ID NO: 21, se conseguían propiedades farmacocinéticas beneficiosas, y tiene claras ventajas sobre los otros formatos ensayados. Los resultados del efecto de la elección del enlazador polipeptídico se muestran, p. ej., en el Ejemplo 10. La comparación de los perfiles farmacocinéticos en el ratón, de la Proteína n° 29-His y la Proteína n° 30-His, revela, sorprendentemente, el beneficio de tener dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, en comparación con tener solo un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica (véase la Figura 5), al indicar la bibliografía sobre el dominio de unión de la albúmina que tener presentes dos dominios de unión a la albúmina en una molécula no se traduce en ningún beneficio sobre las propiedades farmacocinéticas, en comparación con tener presente solo un dominio de unión a la albúmina (Hopp y col., loc. cit.). De manera similar, cuando se compara la Proteína n° 21 (proteína de unión recombinante que consiste en la SEQ ID NO: 21) con una variante de la Proteína n° 21, en donde el dominio de repetición de anquirina diseñado en el extremo C con especificidad de unión para la albúmina sérica está ausente (aminoácidos 1 a 422 de la SEQ ID NO: 21, dando como resultado la Proteína n° 33), la Proteína n° 21 presenta propiedades farmacocinéticas notablemente mejoradas, en particular, una semivida terminal más larga. Comparando el perfil farmacocinético en el mono Cynomolgus, de la Proteína n° 21 con la Proteína n° 28 PEGilada (que comprende los mismos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2 [SEQ ID NOs: 16 y 17], pero la Proteína n° 28 comprende una fracción de PEG de 40 kDa, en vez de dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica) a una dosis de 5 mg/kg, indica que la proteína que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, presenta propiedades farmacocinéticas notablemente mejoradas. Como se describe en el Ejemplo 9, la comparación de los perfiles farmacocinéticos de la Proteína n° 21-His y la Proteína n° 24-His, revela que es más favorable tener los dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica flanqueando las SEQ ID NOs: 16 y 17, en lugar de tenerlos a ambos en el extremo N (véase la Figura 6).

Para los estudios de este ejemplo, la Proteína n° 21-His, la Proteína n° 24-His, la Proteína n° 28-His, la Proteína n° 29-His, y la Proteína n° 30-His, se prepararon según el Ejemplo 1. La Proteína n° 28-His se PEGiló adicionalmente utilizando una fracción de PEG de 40 kDa (NOF Sunbright GL2-400MA) mediante acoplamiento por maleimida de la fracción de PEG sobre la cisteína libre del extremo C de la Proteína n° 28-His, seguido por purificación hasta la homogeneidad, utilizando métodos de purificación convencionales, procedimientos bien conocidos por el experto en la técnica. Los análisis farmacocinéticos en ratón o mono Cynomolgus, se realizaron como se describió en los Ejemplos 8 y 9.

Ejemplo 12: Una proteína de unión recombinante que comprende la SEQ ID NO: 21, presenta una potencia in vivo mejor, en comparación con una proteína de unión recombinante que comprenda la SEQ ID NO: 24

La Proteína n° 21-His y la Proteína n° 24-His se expresaron y purificaron como se describe en el Ejemplo 1. Se realizaron experimentos de xenoinjerto en ratón como se describió en el Ejemplo 7. Los resultados se muestran en la Figura 4b. Después de 32 días de tratamiento, la Proteína n° 21-His presenta una supresión del tumor significativamente mejor que la Proteína n° 24-His. Esto indica que tener los dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica flanqueando los dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2 (como se encuentra en la SEQ ID NO: 21), es más favorable que tener ambos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica en el extremo N de los dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2 (como se encuentra en la SEQ ID NO: 24).

Ejemplo 13: Alto rendimiento de expresión recombinante en E. coli.

Las secuencias que codifican la Proteína n° 21, la Proteína n° 23, y la Proteína n° 25, se clonaron en un vector con el promotor T7 estándar, y se expresaron las proteínas en E. coli HMS 174 (DE3). Para la Proteína n° 21, se alcanzaron títulos de 4,4 g/l, mientras que la Proteína n° 23 mostró un título de 1,9 g/l, y la Proteína n° 25 mostró un título de 2,1 g/l, indicando la mejor expresión de la Proteína n° 21. Sorprendentemente, la disposición de los dominios de repetición de anquirina diseñados utilizados en la Proteína n° 21, da lugar, por lo tanto, a una mayor expresión recombinante que, por ejemplo, la que se observa para otra disposición utilizada en la Proteína n° 25, a pesar de que se utilizan los mismos componentes (dominios de repetición de anquirina diseñados y enlazadores polipeptídicos). De manera interesante, la combinación de los dominios de repetición de anquirina diseñados que se corresponden con las SEQ ID NOs: 16 y 17, presentaron una mejor expresión proteica recombinante que la mayoría de las combinaciones generadas en base a los dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2, que se conocían del documento WO2014/083208.

Ejemplo 14: Unión simultánea de dos moléculas de albúmina sérica por la Proteína n° 21.

La Proteína n° 21 se expresó y purificó como se describe en el Ejemplo 1. Se realizó una cromatografía de exclusión por tamaño acoplada a una dispersión de luz estática (Superdex 200 10/300GL [GE Healthcare], Agilent 1200 [Life Technologies], Wyatt Optilab Trex [RI] y MiniDawnTreos [MALS]), utilizando 30 μM de Proteína n° 21, 60 μM de albúmina sérica humana (se utilizó una solución Behring CSL al 20 % para purificar la fracción monomérica de la albúmina sérica humana por cromatografía de exclusión por tamaño, en una columna Superdex 200 26/60 [GE Healthcare]), o una mezcla 1:2 de las dos, en PBS.

La Proteína n° 21 eluyó como un pico monomérico, y se determinó mediante MALS un peso molecular de 65,2 kDa, lo que está dentro de 1,2 kDa de su peso molecular teórico (66437 Da). La albúmina sérica eluyó como un pico monomérico de 55,1 kDa (peso molecular teórico: 58917 Da). La mezcla 1:2 (relación molar) de las dos moléculas dió lugar a un pico principal con un peso molecular medio de 169,8 kDa (intervalo: 186,2 kDa a 136,6 kDa), comprendiendo especies de peso molecular que se corresponden con un complejo 1:2 (peso molecular teórico: 191,8 kDa), así como un complejo 1:1 (132,8 kDa). De manera adicional, se detectó un pequeño pico de albúmina sérica libre, que se correspondía con un 6,5 % de la albúmina sérica utilizada en el experimento. No se detectó ningún pico que comprendiera un peso molecular correspondiente a la Proteína n° 21. Estos resultados indican que la Proteína n° 21 puede unirse simultáneamente a dos moléculas de albúmina sérica.

Ejemplo 15: Alta estabilidad térmica de la Proteína n° 21.

La Proteína n° 21 se expresó y purificó como se describe en el Ejemplo 1. La estabilidad térmica se evaluó utilizando el dicrosmo circular utilizando un espectrómetro Jasco J-815 CD en una atmósfera de nitrógeno (3 l/min). Se midió la Proteína n° 21 a 0,4 μM en PBS, en cubetas 117.100F-QS (Hellma, d = 1 cm) con sensores de control de temperatura en la solución, calentándola desde 20 °C a 95 °C (por debajo de 45 °C: 3 °C/min; por encima de 45 °C: 1 °C/min, registrando la señal a 222 nm, un retraso de 1 min a 95 °C, y una fase de enfriamiento posterior (con un programa inverso, en comparación con la fase de calentamiento). La señal CD se normalizó a la elipticidad media residual (MRE, por sus siglas en inglés) con la unidad deg cm2 dmol-1. Adicionalmente, se registró el espectro CD de UV lejano.

La Proteína n° 21 presenta un espectro CD típico de las proteínas alfa-helicoidales con mínimos característicos de 208 nm y 222 nm. La Proteína n° 21 presenta una estabilidad térmica alta tras una línea base estable (sin cambio de pendiente), se detecta pérdida de señal a 222 nm por encima de los 78 °C.

Ejemplo 16: Impacto de la Proteína n° 21 sobre el fosfo-proteoma.

La Proteína n° 21 se expresó y purificó como se describe en el Ejemplo 1. Se trataron las células BT474 o las NCI-N87 durante 18 horas, o con la Proteína n° 21 (100 nM), Trastuzumab (100 nM), Pertuzumab (100 nM), la mezcla de Trastuzumab (100 nM) y Pertuzumab (100 nM), o con PBS. A continuación, se sometieron las células a un análisis de espectrometría de masas fosfo-proteoma, como se describe por Britton, D., y col. (Britton, D., Zen, Y., Quaglia, A., Selzer, S., Mitra, VI., Lossner, C., Jung, S., Bohm, G., Schmid, P., Prefot, P., Hoehle, C., Koncarevic, S., Gee, J., Nicholson, R., Ward, M., Castellano, L., Stebbing, J., Zucht, H.D., Sarker, D., Heaton, N., and Pike, I., 2014. PLOS One 9[3], e90948). El análisis revela que el tratamiento celular con la Proteína n° 21, regula diferencialmente múltiples péptidos fosforilados, en comparación con Trastuzumab, Pertuzumab, y la combinación de ambos. Los resultados se muestran en la Tabla 1. De manera importante, la Proteína n° 21 presenta algunas notables diferencias con Trastuzumab, Pertuzumab, y la mezcla de Trastuzumab y Pertuzumab, ya que inhibe más fuertemente la fosforilación del HER2 en los sitios 1073/1078/1083, 1139/1151, 1172/1174, 1174, y 1240. En otros sitios de fosforilación, se aumenta la fosforilación (772). Se descubrió que, aguas abajo del HER2, miembros específicos de la cascada de señalización mTOR estaban regulados diferencialmente tras el tratamiento con la Proteína n° 21; p. ej., un fosfopéptido de la S6 cinasa (S441/T444/S447) estaba regulado negativamente 0,63 veces respecto al PBS, en comparación con otros grupos en los que la regulación negativa estaba en el intervalo de solo 0,88 veces. Además, los péptidos fosforilados que mapean MAPK1 y MAPK3, estaban considerablemente regulados negativamente.

El análisis de las mismas muestras mediante ELISA específica del sitio fosfo para AKT-S473 (BioConcept: Kit PathScan® Phospho-Akt1 [Ser473] ELISA Sándwich n° 7160) mostró una regulación negativa por la Proteína n° 21 de 0,16 veces con respecto al PBS, en comparación con otros grupos donde la regulación negativa estaba en el intervalo de solo 0,3 a 0,7 veces. Los resultados del ELISA se muestran en la Tabla 2.

Estos resultados indican que la Proteína n° 21 está regulando diferencialmente la señalización del HER2 aguas abajo, en comparación con Trastuzumab, Pertuzumab, y la combinación de ambos. Las mayores diferencias se vieron en la vía AKT-mTOR, la vía crítica para la supervivencia celular, la cual, a su vez, explica el por qué la Proteína n° 21 es inductora de apoptosis. La vía de la fosfoinositida 3-cinasa (PI3K/Akt) se considera que es una de las vías críticas que mantienen la supervivencia celular, al bloquear la apoptosis. La activación patológica de la misma, p. ej., mediante heterodimerización HER2/HER3, puede llevar a, por lo tanto, una proliferación maligna.

En este experimento, se observó, además, que la exposición de células BT474 y NCI-N87 a la Proteína n° 21, aumentó los niveles celulares de la proteína Foxo3a en 1,88 y 2,8 veces, respectivamente, en comparación con una exposición a PBS por sí sola. El aumento correspondiente de los niveles de proteína Foxo3a en células BT474 y NCI-N87 por exposición a Trastuzumab, fue de 1,14 y 1,32 veces, respectivamente; y por exposición a Pertuzumab, de 1,21 y 1,25 veces, respectivamente; y por exposición a Trastuzumab y Pertuzumab, de 1,28 y 1,19 veces, respectivamente. Por lo tanto, la Proteína n° 21 da lugar a un aumento mucho más alto de los niveles de proteína Foxo3a celular, en comparación con Trastuzumab o Pertuzumab, o con la combinación de ambos. Se sabe por el experto en la técnica, que Akt1 fosforila Foxo3a, dando como resultado la degradación de Foxo3a y la promoción de supervivencia celular. La inhibición de la fosforilación de Akt da lugar a la estabilización de Foxo3a y, por lo tanto, al aumento en los niveles de Foxo3a. A niveles aumentados Foxo3a puede translocarse al núcleo, e inducir apoptosis.

Tabla 1. Efecto de diferentes proteínas sobre el fosfo-proteoma de las proteínas de células BT474 (HER2, AKT, mTOR, RPS6 κΒ1/S6 Cinasa, RAF), evaluado mediante espectrometría de masas (cambio de pliegues respecto a PBS).

Tabla 2. Efecto de diferentes proteínas sobre el estado de fosforilación de diferentes proteínas de células BT474 (AKT, HER2, HER3, HER1/EGFR) evaluada por ELISA (cambio de pliegues respecto a PBS).

Ejemplo 17: C0-medicación utilizando proteínas de unión recombinante que comprenden la SEQ ID NO: 21 para la mejora de la terapia.

La Proteína n° 21 y la Proteína n° 21-His se expresaron y purificaron como se describe en el Ejemplo 1. Se realizaron ensayos convencionales de proliferación celular con BrdU, bien conocidos por el experto en la técnica. En resumen, se determinaron los efectos sobre la proliferación celular, de la Proteína n° 21-His, de otros compuestos, o de la Proteína n° 21-His en combinación con otros compuestos, midiendo la síntesis de ADN, utilizando el etiquetado con BrdU (BrdU, ELISA de proliferación celular, Roche). En resumen, se sembraron 10000 células por pocillo, en una placa de 96 pocillos en 100 μl de medio completo, y se incubaron durante 24 horas. Se añadieron la Proteína n° 21-His y/o los compuestos durante 72 horas adicionales. Se añadió BrdU para el etiquetado celular durante las últimas 24 horas. Las células etiquetadas (proliferantes) se detectaron según el protocolo del fabricante. Los datos se analizaron utilizando el software GraphPad prism (representación de log[c] vs DO450-602 nm). Los datos se ajustaron utilizando un ajuste de regresión no lineal (log[antagonista] vs respuesta- variable de pendiente [cuatro parámetros]).

Combinación de la Proteína n° 21-His con Eribulina, un inhibidor de microtúbulos: Se ensayaron la Proteína n° 21-His, la Eribulina, o una combinación de Proteína n° 21-His y Eribulina, en cuanto a su capacidad para inhibir la proliferación de células BT474 y MDA-MB175. La Eribulina se tituló comenzando a 1.000 nM en el máximo de una concentración subóptima de Proteína n° 21-His (2 nM en BT474, y 4 nM en MDA-MB175). Una combinación de ambas moléculas fue superior a la Eribulina por sí misma, en ambas líneas celulares. La Eribulina no estuvo activa en las células BT474 como agente único, pero mostró una potente inhibición en combinación con la Proteína n° 21-His. La Eribulina mostró muy poca potencia por sí misma en células MDA-MB175, pero eso mejoró en combinación con la Proteína n° 21-His. Los valores de CI50 figuran en la Tabla 3. Estos datos muestran que la Proteína n° 21-His puede combinarse con Eribulina, y potencia su actividad.

Combinación de la Proteína n° 21-His y GDC-0941, un inhibidor de pI3K: Se ensayaron la Proteína n° 21-His, el GDC-0941, o una combinación de Proteína n° 21-His y GDC-0941, en cuanto a su capacidad para inhibir la proliferación de células BT474 y MDA-MB175. Se tituló el GDC-0941 comenzando en 20.000 nM en el máximo de una concentración subóptima de la Proteína n° 21-His (2 nM en BT474, y 4 nM en MDA-MB175). Una combinación de ambas moléculas fue superior al GDC-0941 por sí mismo, en ambas líneas celulares. GDC-0941 mostró actividad por sí mismo, pero su potencia se aumentó en combinación con la Proteína n° 21-His. La potencia de GDC-0941 en BT474 se aumentó fuertemente, sugiriendo un efecto sinérgico. De manera similar, la Proteína n° 21-His aumentó la potencia de GDC-0941 en células MDA-MB175, donde el efecto parecía ser aditivo. Los valores de CI50 figuran en la Tabla 3. Estos datos muestran que la Proteína n° 21-His se puede combinar con GDC-0941, y potencia su actividad.

Combinación de la Proteína n° 21-His con Everolimus, un inhibidor de mTOR: Se ensayaron la Proteína n° 21-His, el Everolimus, o una combinación de Proteína n° 21-His y Everolimus, en cuanto a su capacidad para inhibir la proliferación de células BT474 y MDA-MB175. El Everolimus se tituló comenzando a 1 mM en el máximo de una concentración subóptima de Proteína n° 21-His (2 nM en BT474, y 4 nM en MDA-MB175). Una combinación de ambas moléculas fue superior al Everolimus por sí mismo en ambas líneas celulares. El Everolimus mostró actividad por sí mismo, pero su potencia se aumentó en combinación con la Proteína n° 21-His. La potencia del Everolimus en las células BT474 se aumentó fuertemente, sugiriendo un efecto sinérgico. De manera similar, la Proteína n° 21-His aumentó la potencia de Everolimus en las células MDA-MB175, donde el efecto parecía ser aditivo. Los valores de CI50 figuran en la Tabla 3. Estos datos muestran que la Proteína n° 21-His se puede combinar con Everolimus, y potencia su actividad.

Combinación de Proteína n° 21-His con Lapatinib, un inhibidor pan-HER: Se ensayaron la Proteína n° 21-His, Lapatinib, o una combinación de Proteína n° 21-His y Lapatinib, en cuanto a su capacidad para inhibir la proliferación de células BT474 y MDA-MB175. Se tituló el Lapatinib comenzando a 10000 nM en el máximo de una concentración subóptima de Proteína n° 21-His (2 nM en BT474, y 4 nM en MDA-MB175). Una combinación de ambas moléculas fue superior al Lapatinib por sí mismo en ambas líneas celulares. El Lapatinib mostró actividad por sí mismo, pero su potencia se aumentó en combinación con la Proteína n° 21-His. La potencia del Lapatinib en las células BT474 se aumentó fuertemente, sugiriendo un efecto sinérgico. De manera similar, la Proteína n° 21-His aumentó la potencia del Lapatinib en células MDA-MB175, donde el efecto parecía ser aditivo. Los valores de CI50 figuran en la Tabla 3. Estos datos muestran que la Proteína n° 21-His puede combinarse con el Lapatinib, y potencia su actividad.

Combinación de la Proteína n° 21 con Trastuzumab: Se ensayaron la Proteína n° 21, Trastuzumab, o una combinación de Proteína n° 21 y Trastuzumab, en cuanto a su capacidad para inhibir la proliferación de células BT474 y MDA-MB175. El Trastuzumab se tituló comenzando a 100 nm en el máximo de una concentración subóptima de Proteína n° 21 (1 nM en BT474, y 10 nM en MDA-MB175). Una combinación de ambas moléculas fue superior al Trastuzumab por sí mismo en ambas líneas celulares. El Trastuzumab mostró solo una actividad limitada por sí mismo, y solo indujo una detección de la proliferación, pero no apoptosis, mientras que la Proteína n° 21 induce la apoptosis. Una combinación de una concentración subóptima de Proteína n° 21 con Trastuzumab, dio como resultado la inhibición de la proliferación. Esto muestra que se pueden combinar ambas moléculas, y que la Proteína n° 21 potencia la actividad del Trastuzumab. El efecto de una combinación también se pudo confirmar, al titular la Proteína n° 21 en el máximo de una concentración constante de Trastuzumab (50 nM).

De manera similar, la combinación de la Proteína n° 21 con Apitolisib, Taselisib, Alpelisib, Palbociclib, Trametinib, Cobimetinib, o Salirasib, fue más eficiente inhibiendo la proliferación de células BT474 que bien la Proteína n° 21 por sí sola, o bien Apitolisib, Taselisib, Alpelisib, Palbociclib, Trametinib, Cobimetinib, o Salirasib por sí solos (véase la Tabla 3). Para los experimentos con Apitolisib, Taselisib, Alpelisib o Palbociclib, la Proteína n° 21 se utilizó a 2 nM, y las concentraciones de Apitolisib, Taselisib, Alpelisib o Palbociclib, se titularon para determinar los valores CI50. Para los experimentos con Trametinib (10‘5 M), Cobimetinib (10‘5 M), o Salirasib (3*10-5 M), la Proteína n° 21 se tituló para determinar los valores CI50.

En resumen, la Proteína n° 21 o la Proteína n° 21-His se podrían combinar con varias clases de fármacos de tratamiento estándar para el cáncer de mama, para potenciar sus efectos inhibidores del crecimiento en las células sobreexpresantes del HER2. Esto indica posibilidades clínicas de eficacia mejorada y/o una reducción de la dosis estándar de tratamiento para reducir la toxicidad.

Tabla 3. Ejemplos de constantes de inhibición de proliferación celular (CI50 [nM]) de diferentes compuestos, y combinación de la Proteína n° 21-His con los compuestos en células BT474 y MDA-MB175

Compuesto BT474 MDA-MB175

Lapatinib 765 2814

Lapatinib Proteína n° 21-His 132 784

GDC-0941 176 203

GDC-0941 Proteína n° 21-His 38 83

Everolimus 263490

Everolimus Proteína n° 21-His 148441

Eribulin 104

Eribulin Proteína n° 21-His 27

Apitolisib 204

Apitolisib Proteína n° 21 105

Taselisib 105

Taselisib Proteína n° 21 14

Alpelisib 2544

Alpelisib Proteína n° 21 350

Palbociclib 2599

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una proteína de unión recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 21, en donde dicha proteína de unión recombinante comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HER2, y dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión por la albúmina sérica.

2. La proteína de unión recombinante de la reivindicación 1, en donde cada uno de dichos dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

3. La proteína de unión recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde dicha proteína de unión recombinante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la proteína de unión recombinante que consiste en la SEQ ID NO: 21.

4. La proteína de unión recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde cada uno de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, presenta una estabilidad de almacenamiento mejorada en PBS, en comparación con un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica que comprenda la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.

5. La proteína de unión recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha proteína de unión recombinante comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.

6. La proteína de unión recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha proteína de unión recombinante consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21.

7. La proteína de unión recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicha proteína de unión recombinante inhibe la proliferación de células BT474 con una constante de inhibición menor de 10-7 M.

8. La proteína de unión recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicha proteína de unión recombinante a una concentración de 100 nM, presenta una regulación negativa más intensa de la fosforilación de AKT-S473 en células BT474, que Trastuzumab a una concentración de 100 nM.

9. Un ácido nucleico que codifica la proteína de unión recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de unión recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o el ácido nucleico de la reivindicación 9, y un vehículo y/o un diluyente farmacéuticamente aceptables.

11. La composición farmacéutica de la reivindicación 10, para su uso en el tratamiento de una enfermedad.

12. La composición farmacéutica de la reivindicación 10, para su uso en el tratamiento de un cáncer.

13. La composición farmacéutica de la reivindicación 10, para su uso en el tratamiento de cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer gástrico, cáncer de estómago, cáncer uterino, cáncer colorrectal, cáncer de vejiga, o un cáncer sobreexpresante del HER2.

14. Un kit que comprende la proteína de unión recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o el ácido nucleico de la reivindicación 9, o la composición farmacéutica de la reivindicación 10.

15. Un método para producir la proteína de unión recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, comprendiendo el método las etapas de (i) expresar dicha proteína de unión en bacterias, y (ii) purificar dicha proteína de unión, utilizando cromatografía.