ES2952519T3

ES2952519T3 - Polipéptidos cíclicos, su procedimiento de obtención y su aplicación en terapéutica

Info

Publication number: ES2952519T3
Application number: ES16794681T
Authority: ES
Inventors: Dominique Bridon; STéPHANE GOBRON
Original assignee: Axoltis Pharma
Current assignee: Axoltis Pharma
Priority date: 2015-09-25
Filing date: 2016-09-23
Publication date: 2023-10-31
Anticipated expiration: 2036-09-23
Also published as: KR20180050755A; US20180265549A1; JP2018531284A; DK3353191T3; US10501497B2; AU2016328916B2; EP3353191B1; PL3353191T3; CN108350035A; FR3041644B1; CA2999797A1; FR3041644A1; AU2016328916A1; KR102806029B1; WO2017051135A1; JP6998878B2; EP3353191A1

Abstract

La invención se refiere a un polipéptido # que incluye la siguiente secuencia de aminoácidos: WS-X1-W-X2-X3-CS-X4-CG (SEQ ID NO: 59), en donde X1, X2 y X3 son, independientemente uno de otro, S o G, X4 es RS o VS o VT o RT, y ambas cisteínas forman un puente disulfuro. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptidos cíclicos, su procedimiento de obtención y su aplicación en terapéutica

[0001] El objeto de la invención son nuevos polipéptidos cíclicos, las composiciones farmacéuticas que los comprenden y su uso como medicamentos, en concreto su uso en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas y la regeneración de células del sistema nervioso central y periférico, y el procedimiento de obtención de estos polipéptidos cíclicos.

[0002] Los polipéptidos de la invención tienen una secuencia de aminoácidos derivada de uno de los dominios de consenso conservados de SCO-espondina denominada repetición de tromboespondina tipo 1 o TSR.

[0003] Es bien sabido que diferentes péptidos sintéticos deducidos de la estructura de la tromboespondina tienen acciones interesantes sobre diferentes tipos de células, en concreto inhiben tumores en mamíferos, influyen en la trombólisis y la angiogénesis y pueden ser moduladores del complemento o asegurar la promoción de la unión celular [Sipes JM et al., J Cell Biol, 121, 469-77, 1993; Rusnati M et al. Pharmaceuticals 3, 1241-1278, 2010; Lopez-Dee Z et al., Mediators of Inflammation, volumen 2011, artículo ID 296069, 10 páginas, 2011].

[0004] Las características generales de SCO-espondina se describen en particular en el artículo de Meiniel et al., Microsc Res Tech. 2, 484-95, 2001 y el artículo de Gobron et al. Glia 32, 177-91,2000.

[0005] La aplicación de un polipéptido de secuencia de aminoácidos:

W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G, [SEQ ID N°: 58] correspondiente a la secuencia de aminoácidos más representativa de uno de los motivos TSR de SCO-espondina, provoca en células B 104 de neuroblastoma de rata una diferenciación celular que induce crecimiento neurítico y agregación celular [F. El-Bitar et al., Cell Tissue Res., vol. 304, p. 361-369, 2001]. Este polipéptido no contiene un puente disulfuro entre las dos cisteínas.

[0006] Este polipéptido así como los polipéptidos en formas reducidas de fórmula SEQ ID N°: 70 y en particular de fórmula SEQ ID N°: 57 se describen y se reivindican en las solicitudes de patente internacional WO 1999/03890 (correspondiente a la patente estadounidense US 6.995.140) y WO2009027350 o pueden prepararse a partir de la descripción de estas patentes y de procedimientos conocidos por los expertos en la materia.

[0007] Sin embargo, la estabilidad del polipéptido W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G [SEQ ID N°: 58] disminuye en solución acuosa con el tiempo. Por lo tanto, sería necesario que este polipéptido fuera preparado extemporáneamente durante los tratamientos, lo que podría complicar su administración, limitando así las posibilidades de realizar tratamientos por inyección directa, o por ejemplo mediante bombas para la administración progresiva del medicamento a los pacientes. De manera general, esta baja estabilidad presentaría un cierto inconveniente para el desarrollo de conceptos terapéuticos basados en este polipéptido.

[0008] La solicitud de patente WO 2008/090285 describe análogos péptido-miméticos del polipéptido W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G [SEQ ID N°: 58]. Sin embargo, este enfoque tiene dos inconvenientes: estos polipéptidos contienen aminoácidos no naturales susceptibles de provocar fenómenos de inmunogenicidad y un aumento significativo de los costes de producción, siendo los aminoácidos no naturales mucho más caros que los naturales, lo que disminuye su interés comercial.

[0009] Uno de los objetivos de la invención es proporcionar compuestos peptídicos estables y solubles en soluciones compatibles en concreto con la administración intratecal conservando o mejorando las propiedades del polipéptido de secuencia W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G [SEQ ID N°: 58].

[0010] De hecho, es particularmente importante para ciertas indicaciones clínicas buscadas desarrollar una forma más soluble del polipéptido de secuencia de aminoácidos W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G [SEQ ID N°: 58] descrito en la solicitud de patente internacional WO 1999/03890.

[0011] De hecho, para inyecciones intratecales (IT), la elección de soluciones utilizadas para administrar el compuesto es muy limitada. En la práctica, solo se utilizan tres soluciones, líquido fisiológico, líquido cefalorraquídeo artificial y soluciones de glucosa al 5 %. Se pueden utilizar otras soluciones conocidas por los expertos en la materia si se utilizan otras vías de administración tales como la vía intraventricular, epidural, intrarraquídea, intraparenquimatosa, intravenosa, intraluminal, intravítrea, transfenoidal o tópica. Asimismo, las composiciones farmacéuticas podrán producirse en cualquier forma, en concreto líquida, en particular preparaciones inyectables en forma de soluciones, suspensiones o emulsiones, preparaciones para perfusión, o sólidas e incluir cualquier tipo de soporte, en particular geles, biopolímeros o biomateriales o cualquier dispositivo médico, como implantes o bombas implantables por ejemplo, que permita la liberación controlada o bien un sistema de vectorización.

[0012] Las soluciones acuosas se pueden preparar utilizando diversos disolventes compatibles con la vía de administración, idealmente un disolvente isotónico como cloruro de sodio al 0,9 % o glucosa al 5 %, pero el disolvente también puede ser agua, una solución salina, tampones de fosfato, citrato o acetato o cualquier otro. Opcionalmente, la preparación también puede contener, en combinación o no, cualquier excipiente, adyuvante o aditivo tales como propilenglicol, glicerol, polietilenglicol o cualquier agente tensioactivo, humectante, viscosificante, quelante, isotonizante, antioxidante o estabilizante.

[0013] Las preparaciones en forma de solución podrán administrarse mediante inyección en embolada o mediante perfusión.

[0014] En el caso del polipéptido de secuencia de aminoácidos: W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G, [SEQ ID N°: 58], la solubilidad en el líquido fisiológico es baja, del orden de 1-2 mg/ml, y por tanto dificulta la obtención de las dosis clínicas máximas deseadas, que son del orden de 10 mg/ml. La solubilidad es particularmente importante para las inyecciones IT porque existe una limitación del volumen de inyección, un límite que es mucho mayor que el de las inyecciones periféricas, y una limitación en los disolventes y solutos que se pueden utilizar, por ejemplo. El uso de una solución de glucosa al 5 % mejora la solubilidad del polipéptido de secuencia de aminoácidos: W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G [SEQ ID N°: 58] llevándola a aproximadamente l0 mg/ml, quedando esta solución como una solución isotónica y compatible con una inyección IT.

[0015] Sin embargo, se sabe que la presencia de glucosa en contacto con el polipéptido forma bases de Schiff, provenientes de la reacción de la forma aldehido de la glucosa con las aminas primarias de los polipéptidos según el esquema de reacción:

[0016] Estas bases de Schiff teóricamente podrían complicar la preparación e implementación de composiciones farmacéuticas. Sin embargo, en el caso de los presentes polipéptidos, estas bases son reversibles in vivo.

[0017] Por lo tanto, es muy importante desarrollar una forma más soluble del polipéptido de secuencia de aminoácidos: W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G, [SEQ ID N°: 58] en un disolvente que no sea glucosa al 5 % y preferentemente en líquido fisiológico o líquido cefalorraquídeo artificial.

[0018] Otro aspecto de la invención es proporcionar compuestos peptídicos eficaces en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas o traumatismos nerviosos en los que es necesaria la regeneración de las células nerviosas, así como composiciones farmacéuticas que los comprenden.

[0019] Otro aspecto de la invención es proporcionar un procedimiento de obtención de estos compuestos peptídicos.

[0020] La presente invención es tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

[0021] Dentro del significado de la presente invención, por "aminoácidos" o "aminoácidos" se entiende tanto aminoácidos naturales como aminoácidos no naturales.

[0022] Por "aminoácidos naturales" se entienden los aminoácidos en forma L que se pueden encontrar en las proteínas naturales, es decir, alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina.

[0023] Por "aminoácido no natural" se entienden los aminoácidos precedentes en su forma D, así como las formas homo de ciertos aminoácidos tales como arginina, lisina, fenilalanina y serina o las formas nor de la leucina o la valina.

[0024] La nomenclatura utilizada para describir las secuencias peptídicas es la nomenclatura internacional que utiliza el código de una letra y donde el extremo amino-terminal se muestra a la izquierda y el extremo carboxi-terminal se muestra a la derecha.

[0025] Los guiones "-" representan enlaces peptídicos comunes que unen los aminoácidos de las secuencias.

[0026] En el sentido de la presente invención, por "polipéptido" se entiende cualquier polímero de aminoácidos interconectados por enlaces peptídicos, independientemente de su longitud. Así, en el sentido de la presente invención, el término polipéptido también engloba péptidos y proteínas.

[0027] La invención se refiere a un polipéptido que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (SEQ ID N°: 2) en la que las dos cisteínas forman un puente disulfuro.

[0028] El producto SEQ ID N°: 2 por lo tanto tiene la estructura:

[0029] Que también se puede representar, con la nomenclatura internacional mediante el código de tres letras, según la fórmula:

[0030] O según la fórmula:

[0031] Sorprendentemente, los inventores descubrieron que la formación de un puente disulfuro entre las dos cisteínas presentes en el polipéptido de secuencia de aminoácidos W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G [SEQ ID N°: 2] no solo permitía conservar la eficacia del polipéptido para inducir un aumento del crecimiento neurítico y un aumento de los contactos sinápticos, sino también obtener un polipéptido que tenga una mejor estabilidad y una mejor solubilidad en soluciones compatibles con las administraciones, en concreto intratecales.

[0032] Esta invención es tanto más sorprendente en cuanto que, en la proteína SCO-espondina de la que se deriva esta secuencia peptídica, las dos cisteínas presentes en la secuencia W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G [SEQ ID N°: 2] anterior no forman un puente disulfuro entre ellas sino que están, por el contrario, implicadas en puentes disulfuro con otras cisteínas presentes en la proteína.

[0033] La expresión "prácticamente desprovisto" significa que el polipéptido según la realización preferida indicada anteriormente, comprende cantidades muy reducidas de las impurezas que han identificado los inventores de la presente solicitud. Estas impurezas comprenden la estructura reducida en la que los dos grupos tiol de las dos cisteínas están en forma libre, dímeros (o polímeros) así como formas oxidadas en las que los grupos tiol están en forma de sulfóxido o sulfona. La obtención de esta forma prácticamente pura se realiza preferentemente implementando el procedimiento que se describe a continuación. En estas condiciones, la pureza del producto obtenido es del orden del 80 % como mínimo. Esta pureza puede llegar al 85, 90 o incluso al 95 %.

[0034] Según una realización más particular, la invención se refiere así a un polipéptido que consiste en la siguiente secuencia de aminoácidos:

W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (SEQ ID N°: 2)

en la que las dos cisteínas forman un puente disulfuro,

estando dicho polipéptido prácticamente desprovisto de formas reducidas o diméricas u oligoméricas de dicho polipéptido así como de derivados de dicho polipéptido en los que los grupos tiol están en forma de sulfóxido o sulfona.

[0035] Pueden usarse procedimientos de purificación convencionales, por ejemplo por cromatografía, para purificar los productos deseados que incluyen un puente disulfuro.

[0036] Por ejemplo, la síntesis del compuesto correspondiente a la secuencia SEQ ID N°: 2 efectuada por los procedimientos conocidos por el experto en la materia en ausencia de albúmina, produce una mezcla de aproximadamente 60 productos, entre los que se encuentra el producto deseado con una pureza del 44,51 % determinada por HPLC. Varias HPLC sucesivas realizadas con un gradiente de TFA al 0,1 %/agua/acetonitrilo seguido de una mezcla de fracciones idénticas (pooling) permiten aislar el compuesto correspondiente a la secuencia SEQ ID N°: 2 con una pureza final del 99 %.

[0037] Según una realización aún más particular, la invención se refiere por lo tanto a un polipéptido tal como se ha definido anteriormente, que consiste en la siguiente secuencia de aminoácidos:

W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (SEQ ID N°: 2)

en la que las dos cisteínas forman un puente disulfuro,

presentando dicho polipéptido una pureza superior al 80 %, preferentemente al 85 %, más preferentemente al 90 %, aún más preferentemente igual o superior al 95 %.

[0038] Según otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento de obtención del polipéptido de secuencia de aminoácidos SEQ ID N°: 2:

W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (SEQ ID N°: 2) en la que:

las dos cisteínas forman un puente disulfuro,

que comprende una etapa de formación de un puente disulfuro en presencia de albúmina en el polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 58:

W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (SEQ ID N°: 58)

[0039] Los inventores de la presente solicitud han descubierto un procedimiento inventivo e inesperado de formación de un puente disulfuro. Este procedimiento consiste en utilizar albúmina como catalizador oxidante para reducir o evitar la formación de impurezas y también para acelerar la cinética de reacción, resultado siempre favorable para la producción industrial de péptidos.

[0040] La presencia de albúmina en la reacción permite en concreto acelerar la oxidación del producto de partida. En una reacción de oxidación, a menudo es deseable acelerar suavemente la reacción para evitar la creación de productos indeseables a partir de una oxidación incontrolada. Los resultados proporcionados en la parte experimental muestran que la reacción en presencia de albúmina permite un mejor control de los productos formados (más particularmente del polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 2) y por lo tanto una mejor pureza.

[0041] Más particularmente, la invención se refiere a un procedimiento de obtención del polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 2 tal como se ha definido anteriormente, caracterizado porque la albúmina y el polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 58 están presentes en una proporción albúmina:polipéptido de 1: 1 a 1:100, preferentemente de 1:1 a 1:10 y más preferentemente de 1:1.

[0042] Según otra realización particular, la invención se refiere a un procedimiento de obtención del polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 2 tal como se ha definido anteriormente, caracterizado porque la etapa de formación de un puente disulfuro en presencia de albúmina en el polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 58 se realiza al aire ambiente.

[0043] Según una realización ventajosa, la invención se refiere a un procedimiento de obtención del polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 2 tal como se ha definido anteriormente, caracterizado porque la etapa de formación de un puente disulfuro en presencia de albúmina en el polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 58 se realiza sin separar el polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 58 de la resina utilizada para la síntesis peptídica de estos polipéptidos y porque el polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 2 se obtiene a continuación separando el polipéptido de la resina después de la etapa de formación del puente disulfuro.

[0044] El procedimiento de preparación del polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 58 se basa en la síntesis peptídica en fase sólida utilizando aminoácidos protegidos por N-a-Fmoc como bloques de construcción para la construcción del polipéptido.

[0045] El residuo de glicilo en la posición C-terminal se acopla a la resina MBHA como parte del enlazador Fmoc-Gly-MPPA-OH. Los otros residuos de aminoácidos se incorporan mediante una sucesión de ciclos de desprotección del grupo Fmoc y acoplamiento de aminoácidos para producir el polipéptido protegido unido a la resina. Después del ensamblaje en fase sólida del polipéptido, se lleva a cabo una reacción de escisión del polipéptido de la resina y desprotección de dicho polipéptido simultáneamente en una etapa con una mezcla de ácido trifluoroacético (TFA)/agua para producir el polipéptido bruto, que es se precipitó con ayuda de una mezcla de MTBE/hexano, a continuación se filtró y se secó.

[0046] Antes de la purificación, el polipéptido bruto de secuencia SEQ ID N°: 58 se disuelve en una mezcla de acetonitrilo/agua/ácido acético (AcOH). La purificación se realiza por cromatografía de fase inversa preparativa usando primero un eluyente de ácido trifluoroacético (TFA) y después un eluyente de acetato. El polipéptido purificado obtenido (en forma de sal de acetato) y en solución se diluye con agua y se concentra. Después de la adición de acetonitrilo al 5 %, la solución obtenida se filtra y se liofiliza para dar el polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 58 en su forma de sustancia farmacológica.

[0047] Este procedimiento presenta varias ventajas. Los trabajos efectuados directamente sobre la resina se controlan mejor y, por lo tanto, son más limpios. Producen menos impurezas y evitan varias etapas intermedias (incluyendo la compleja purificación de los polipéptidos de secuencia SEQ ID N°: 58). Las condiciones experimentales optimizadas en términos de concentración, disolventes y tiempo de incubación pueden ser determinadas por los expertos en la materia.

[0048] La invención también se refiere a un polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 2 tal como obtenido mediante el procedimiento definido anteriormente.

[0049] Según otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende como principio activo un polipéptido como el descrito anteriormente y opcionalmente uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

[0050] Los compuestos peptídicos según la invención se pueden utilizar en una composición farmacéutica o para producir un medicamento. En estas composiciones o medicamentos, el principio activo puede incorporarse a composiciones que se presentan en diversas formas, a saber, en forma de soluciones, generalmente acuosas, o en forma liofilizada, o en forma de gel o hidrogel, o en forma de emulsión o bien cualquier otra forma farmacéutica y fisiológicamente aceptable.

[0051] Las dosis a utilizar pueden oscilar entre 1 μg/kg y 1000 μg/kg y las vías de administración que pueden utilizarse pueden elegirse entre las vías intrarraquídea, intratecal, intraventricular, epidural, intraparenquimatosa, intravítrea, transfenoidal o tópica.

[0052] También se pueden utilizar otras vías de administración conocidas por el experto en la materia, tales como la vía subcutánea, intravenosa, intraluminal o intranasal. Cuando se utiliza una o más de estas vías de administración, las dosis a utilizar pueden oscilar entre 1 μg/kg y 50 mg/kg.

[0053] Estos medicamentos o composiciones están destinados en particular al tratamiento de enfermedades neurodegenerativas y/o a la regeneración de células del sistema nervioso central (cerebro, médula espinal) o nervios periféricos después de traumatismos. Su uso en la regeneración de células del sistema nervioso puede realizarse tanto por administración directa a un paciente como de forma extracorpórea. Estos medicamentos o composiciones pueden utilizarse en concreto en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson, o cualquier otra patología neurodegenerativa, o patologías de tipo accidental o traumático tales como lesiones medulares, traumatismos craneoencefálicos o accidentes cerebrovasculares. Estos medicamentos o composiciones también pueden ser utilizados en el tratamiento de lesiones de los nervios auditivos, ópticos, olfativos o de cualquier nervio craneal o periférico, ya sea de origen traumático, accidental o degenerativo.

[0054] Según otro aspecto, la invención se refiere a un polipéptido como se ha descrito anteriormente, para su uso en el tratamiento de patologías neurodegenerativas o traumatismos en los que se busca la regeneración del sistema nervioso central. El polipéptido según la presente invención se puede utilizar para el tratamiento de lesiones traumáticas o no traumáticas del sistema nervioso periférico.

[0055] Según otra realización ventajosa, la invención se refiere a un polipéptido como el descrito anteriormente para su uso en el tratamiento de patologías de tipo accidental, traumático o degenerativo, en particular la enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson, accidentes cerebrovasculares, lesión medular, traumatismos craneoencefálicos o daño a los nervios ópticos, olfativos, auditivos o cualquier nervio craneal o periférico. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[0056]

Figura 1: La figura 1 representa la observación al microscopio óptico de una gota de una solución del polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 58 (A, aumento x 25; B, aumento x 100) y del polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 2 (C, aumento x 25) a una concentración de 29,4 mg/ml en NaCl al 0,9 %.

Figura 2: La figura 2 representa los cromatogramas superpuestos de la reacción de ciclación del polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 58 al polipéptido de secuencia s Eq ID N°: 2 en presencia de albúmina humana realizados al inicio de la reacción (T0 min) y después 60 min de reacción de ciclación (T60 min).

Figura 3: La figura 3 representa la observación al microscopio óptico de contraste de fase (aumento x400) del efecto del polipéptido cíclico de secuencia SEQ ID N°: 2 sobre las células B104 después de 48 h. Las células se cultivan durante 2 días en medio libre de suero y en ausencia (A) o presencia (B) del polipéptido cíclico de secuencia SEQ ID N°: 2 a 1 mg/ml.

Figura 4: La figura 4 representa la observación al microscopio óptico de contraste de fase (aumento x400) del efecto del polipéptido cíclico de secuencia SEQ ID N°: 2 sobre las células B104 después de 72 h. Las células se cultivan durante 3 días en medio libre de suero y en ausencia (A) o en presencia (B) de polipéptido cíclico de secuencia SEQ ID N°: 2 a 500 μg/ml.

Figura 5: La figura 5 representa la cuantificación del efecto del polipéptido cíclico de secuencia SEQ ID N°: 2 sobre el número de células. El número medio de células B104 se analiza después de 1,2 o 3 días de cultivo. Los valores son medias ± SEM (n=3). Las células se cultivan en un medio libre de suero solo (control) o en un medio libre de suero que contiene el polipéptido cíclico de secuencia SEQ ID N°: 2 a concentraciones de 1 mg/ml o 500 μg/ml. El término SEM, para “standard error of the mean”, significa el error estándar de la media.

Figura 6: La figura 6 representa la cuantificación del efecto del polipéptido cíclico de secuencia SEQ ID N°: 2 sobre el número de neuritas. Se analiza el número medio de sprouting (brotes) por células B104 después de 1, 2 o 3 días de cultivo. Los valores son medias ± SEM (n=3). Las células se cultivan en un medio libre de suero solo (control) 0 en un medio libre de suero que contiene el polipéptido cíclico de secuencia SEQ ID N°: 2 a concentraciones de 1 mg/ml o 500 μg/ml.

Figura 7: La figura 7 representa la cuantificación del efecto del polipéptido cíclico de secuencia SEQ ID N°: 2 sobre la longitud de las neuritas. La longitud media de neuritas por célula B104 se analiza después de 1, 2 o 3 días de cultivo. Los valores son medias ± SEM (n=3). Las células se cultivan en un medio libre de suero solo (control) o en un medio libre de suero que contiene el polipéptido cíclico de secuencia SEQ ID N°: 2 a concentraciones de 1 mg/ml o 500 μg/ml.

Figura 8: La figura 8 representa el resultado de la evaluación del rendimiento locomotor estudiado mediante la escala de Basso, Beattie, Bresnahan (BBB) (Basso DM et al. J Neurotrauma, 12, 1-21, 1995, Basso DM et al. Exp Neurol, 139, 244-256, 1996). Los valores son medias ± SEM. Las puntuaciones de BBB varían de 0 (sin movimiento de las patas traseras) a 21 (marcha normal con coordinación y colocación paralela de las patas).

Figura 9: La figura 9 representa el porcentaje de ratas para las que la puntuación BBB es mayor o igual a 14. Figura 10: La figura 10 representa el porcentaje de ratas para las que la puntuación BBB está entre mayor o igual a 8 y menor a 14.

Figura 11: La figura 11 representa el resultado de la evaluación de las actividades del reflejo de separación de los dedos. Las puntuaciones consideradas son: 0 = sin actividad refleja, 1 = considerablemente inferior a lo normal, 2 = ligeramente inferior a lo normal, 3 = normal.

Figura 12: La figura 12 representa el resultado de la evaluación de la colocación de las patas posteriores. Las puntuaciones consideradas son: 0 = sin actividad refleja, 1 = considerablemente inferior a lo normal, 2 = ligeramente inferior a lo normal, 3 = normal.

Figura 13: La figura 13 representa el porcentaje de ratas para las que la puntuación de colocación de la pata trasera es igual a 3 (normal).

Figura 14: La figura 14 representa la media del día en que las ratas recuperaron el control de la vejiga. Los valores son medias ± SEM.

EJEMPLOS:

Ejemplo 1: Procedimientos de síntesis del polipéptido de secuencia W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G en la que las 2 cisteínas están unidas por un puente disulfuro (SEQ ID N°: 2):

1) Oxidación del polipéptido de secuencia W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (SEQ ID N°: 58) en presencia de albúmina humana

[0057] Para realizar esta síntesis se puso el polipéptido de secuencia W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (SEQ ID N°: 58) en presencia de diferentes cantidades de albúmina de manera que las proporciones de polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 58:albúmina humana (HSA) son del orden de 1:100, 1:10 y 1:1.

[0058] Partiendo del polipéptido de secuencia W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (SEQ ID N°: 58) colocado en presencia de una proporción 1:1 de HSA e incubado de 1 a 3 horas a temperatura ambiente con agitación al aire, se observó por HPLC la formación de un pico correspondiente al polipéptido de secuencia W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G en la que las 2 cisteínas están unidas por un puente disulfuro (SEQ ID N°: 2). Después de la eliminación de la albúmina por precipitación, el producto se purifica y analiza por HPLC. El uso de diferentes proporciones de albúmina y de polipéptido correspondiente a la secuencia SEQ ID N°: 58 permite influir en la velocidad de ciclación y el rendimiento final de la ciclación sabiendo que a menor cantidad de albúmina es más fácil de eliminar.

2) Otro procedimiento para preparación del polipéptido correspondiente a la secuencia SEQ ID N°: 2 evitando la separación y purificación previa del polipéptido lineal (polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 58)

[0059] El polipéptido de secuencia W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (SEQ ID N°: 58) se sintetiza en resina de manera similar al procedimiento convencional indicado en la solicitud de patente internacional WO 1999/03890 pero sin escindirlo o separarlo de la resina. Esto permite evitar dos etapas costosas en tiempo y dinero que consisten en aislar y a continuación purificar el polipéptido antes de volver a ponerlo en solución para oxidarlo en el producto deseado correspondiente a la secuencia SEQ ID N°: 2. La oxidación en presencia de albúmina se produce directamente con el polipéptido de secuencia W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (^sE^qID N°: 58) unido a la resina. La purificación es similar a la descrita en el ejemplo anterior, pero la etapa de separación de la albúmina es más fácil porque se realiza mediante un simple lavado, estando el polipéptido todavía unido a la resina. Una vez que se ha eliminado la albúmina, el polipéptido se puede separar de la resina mediante procedimientos convencionales.

Ejemplo 2: Efecto de la albúmina sobre la ciclación del polipéptido de secuencia W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (SEQ ID N°: 58), es decir su transformación en un polipéptido de secuencia W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G en la que las 2 cisteínas están unidas por un puente disulfuro (SEQ ID N°: 2)

[0060] Hemos estudiado el comportamiento del polipéptido de secuencia W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (SEQ ID N°: 58) en ausencia y presencia de albúmina humana (HSA) y la formación resultante del polipéptido de secuencia W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G en la que las 2 cisteínas están unidas por un puente disulfuro (S^eQ ID N°: 2).

[0061] El procedimiento es el siguiente:

Una solución que contenía polipéptido de secuencia W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (SEQ ID N°: 58) a 50 μg/ml en PBS y glucosa al 5 % se preparó en presencia o ausencia de HSA a 2,5 mg/ml.

[0062] La proporción de polipéptido de secuencia W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (SEQ ID N°: 58): HSA es del orden de 1:1 y por lo tanto equimolar.

[0063] Las soluciones se mezclaron y la mezcla se inyectó directamente mediante HPLC de fase inversa siguiendo un procedimiento que utiliza una columna Phenomenex Jupiter de 300 A y disolventes de elución constituidos por agua de HPLC con ácido trifluoroacético al 0,1 % y acetonitrilo con ácido trifluoroacético al 0,1 %, lo que permite separar los picos de HSA, de polipéptido de secuencia W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (SEQ ID N°: 58) y de polipéptido de secuencia W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G en la que las dos cisteínas forman un puente disulfuro (SEQ ID N°: 2).

[0064] Esta operación se repitió a T=0 min y a T=60 min.

[0065] Los perfiles cromatográficos permitieron establecer las siguientes observaciones:

- En 60 minutos, en ausencia de albúmina (HSA) y por lo tanto por oxidación al aire, el pico del polipéptido de secuencia W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G en el que las dos cisteínas forman un puente disulfuro (SEQ ID N°: 2) aumenta un 9,1 % con respecto al pico de partida del polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 58.

- En condiciones idénticas, pero en presencia de albúmina, a T=60 min, el pico del polipéptido de secuencia W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G en el que las dos cisteínas forman un puente disulfuro (S^eQ ID N°: 2) aumenta un 38 % con respecto al pico de partida del polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 58.

[0066] Este resultado muestra un efecto acelerador de la albúmina sobre la ciclación del polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 58 que conduce a la formación del polipéptido de secuencia W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G en el que las dos cisteínas forman un puente disulfuro (SEQ ID N°: 2).

- En ausencia de albúmina, en 60 minutos, el 25 % del pico del polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 58 se transforma en un polipéptido de secuencia W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G en el que las dos cisteínas forman un puente disulfuro (SEQ ID N° 2)

- En presencia de albúmina y en las mismas condiciones, en 60 minutos, el 54 % del polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 58 se transforma en un polipéptido de secuencia W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G en el que las dos cisteínas forman un puente disulfuro (SEQ ID N° 2)

[0067] Este resultado muestra que en presencia de albúmina se forma una mayor cantidad de producto correspondiente a la SEQ ID N°: 2 en comparación con la oxidación por aire, lo que corresponde a una mayor especificidad y pureza a favor de la albúmina.

[0068] Discusión:

Los dos experimentos descritos en este ejemplo muestran el importante papel de la albúmina en la producción del polipéptido de secuencia W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G en el que las dos cisteínas forman un puente disulfuro (SEQ ID N°: 2) a partir del polipéptido de secuencia W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (SEQ ID N°: 58) en comparación con la oxidación al aire. En efecto, la reacción es al menos 2 veces más rápida, preferentemente 5 veces más rápida y más preferentemente 10 veces más rápida dependiendo de las proporciones de péptido/albúmina al aire. En el ejemplo indicado anteriormente, observamos la formación de un 9,1 % sin albúmina frente a un 38 % con albúmina, por lo que la reacción aquí es aproximadamente 4 veces más rápida y también se lleva a cabo con mejor especificidad (25 % sin albúmina frente a 54 % con albúmina) lo que corresponde a una mayor pureza. En efecto, en 60 minutos, el 25 % de transformación del polipéptido de secuencia W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (SEQ ID N°: 58) en ausencia de albúmina corresponde a la posible formación del 75 % de impurezas y en presencia de albúmina, el 54 % de transformación del polipéptido de secuencia W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (S^eQ ID N°: 58) corresponde a la formación de solo el 46 % de impurezas.

Ejemplo 3: Efecto de las proporciones del polipéptido de secuencia W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (SEQ ID N°: 58) con respecto a la albúmina sobre la eficacia de la ciclación del polipéptido de secuencia W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (S^eQ ID N°: 58) a un polipéptido de secuencia W-S-G-W-S-S-C- S-R-S- C-G en la que las 2 cisteínas están unidas por un puente disulfuro (SEQ ID N°: 2)

[0069] El ejemplo 2 mostró cómo una proporción equimolar (proporción molar idéntica) de albúmina y de polipéptido permitía obtener una mayor cantidad de polipéptido correspondiente a la secuencia SEQ ID N°: 2 a partir del polipéptido de secuencia SEQ iD N°: 58 y con mayor pureza. El siguiente ejemplo describe cómo las diferentes proporciones de albúmina y polipéptido influyen en la velocidad de formación del puente disulfuro y la pureza del polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 2.

[0070] Tres cantidades de polipéptido de secuencia W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (SEQ ID N°: 58) se incuban durante aproximadamente 1 hora a 37 °C en el mismo volumen de líquido cefalorraquídeo de rata en el que hay una cantidad fisiológica constante de albúmina y la velocidad de formación del polipeptídico cíclico de secuencia W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G en el que las dos cisteínas forman un puente disulfuro (SEQ ID N°: 2) se observa por HPLC. El estudio busca demostrar la influencia de la proporción polipéptido:albúmina sobre la velocidad de ciclación del polipéptido lineal de secuencia SEQ ID N°: 58 medida por el Tmáx.

[0071] El Tmáx, correspondiente al tiempo en que se forma la mayor cantidad de polipéptido cíclico de secuencia W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G en el que las dos cisteínas forman un puente disulfuro (SEQ ID N°: 2), se indica en la tabla 1.

[0072] Las proporciones correspondientes a las diferentes dosis de polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 58 añadidas se indican en la tabla 1.

Tabla 1: Efecto de las proporciones de polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 58:albúmina sobre el Tmáx de la reacción de ciclación del polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 58 al polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 2

[0073] Conclusión: Se observa un efecto catalizador para la albúmina, como lo ejemplifican las proporciones presentadas en la Tabla 1 que demuestran la implicación de la albúmina en la aceleración de la ciclación. En efecto, una muy ligera diferencia en la cantidad de albúmina puesta en presencia del polipéptido (tal como se representa por las proporciones 20:1 y 200:1) permite acelerar la ciclación y, por consiguiente, reducir su Tmáx de 120 a 30 minutos.

[0074] En conclusión, existe una correlación entre la proporción de polipéptido de secuencia W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (SEQ ID N°: 58) con respecto a la albúmina y la cinética de ciclación.

[0075] En efecto, cuanto menor es la proporción polipéptido:albúmina, más rápida es la reacción. En otras palabras, cuanto más se acerca la proporción de polipéptido a albúmina a 1:1, más rápida es la reacción. Finalmente, una pequeña cantidad de albúmina es suficiente para acelerar la reacción de ciclación y la formación de disulfuro (efecto catalizador).

[0076] Como alternativa, la ciclación y producción de disulfuro en presencia de albúmina puede tener lugar en ausencia total de aire o en presencia de una cantidad muy pequeña de aire, y por lo tanto de oxígeno, lo que puede permitir evitar la formación de productos contaminantes a partir de reacciones de oxidación incontroladas.

Ejemplo 4: Estudio de la solubilidad del polipéptido cíclico de secuencia W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G en el que las dos cisteínas forman un puente disulfuro (SEQ ID N°: 2) en solución acuosa de NaCl

[0077] Se realizan dos pesajes de 0,5 mg en un microtubo de 1,5 ml para el polipéptido

W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (SEQ ID N°: 58) y el polipéptido:

[0078] En cada tubo se añaden 17 microlitros de una solución de NaCl al 0,9 % previamente preparada para producir una solución peptídica a 29,4 mg/ml. A continuación, se agitan los tubos durante unos segundos y se coloca una gota de cada solución de polipéptido obtenida en un portaobjetos de vidrio para su observación al microscopio óptico. En estas condiciones, sólo el polipéptido de secuencia ^sE^qID N°: 2 parece soluble sin ninguna partícula o agregado visible (figura 1). El polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 58 presenta un gran número de partículas.

[0079] El límite de solubilidad del polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 58 en una solución acuosa de NaCl al 0,9 % se determina en aproximadamente 2 mg/ml al microscopio y mediante examen visual.

[0080] Se estima que la solubilidad del polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 2 en NaCl al 0,9 % es superior a 29 mg/ml mediante examen visual.

[0081] El límite de solubilidad del polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 2 en una solución de NaCl al 0,9 % es, por lo tanto, al menos 15 veces mayor que el del polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 58 en la misma solución. Ejemplo 5: Mejor estabilidad del polipéptido W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G en el que las 2 cisteínas están unidas por un puente disulfuro (SEQ ID N°: 2) frente a W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (SeQ ID N°: 58) en presencia de enzimas

[0082] Se realizó una digestión enzimática implementando neprilisina incubada con la forma purificada del polipéptido de interés ya sea en su forma lineal (SEQ ID N°: 58) o en su forma cíclica (SEQ ID N°: 2). Los parámetros de tiempo (t=0 y t=30 minutos) se exploraron con una enzima diluida a la décima parte en agua. Se realizó una muestra denominada "control" sin enzima y realizada en paralelo para establecer una referencia analítica durante cada parámetro explorado.

[0083] Los polipéptidos se diluyen en agua desoxigenada para mantener la estabilidad de las dos formas a lo largo del tiempo. Las digestiones se analizaron mediante la técnica de espectrometría de masas LC/MS/MS.

[0084] Los resultados (áreas bajo la curva y porcentaje de digestión) se presentan en la tabla 2. El porcentaje de digestión corresponde, para un polipéptido dado, al porcentaje del área bajo la curva en presencia de enzima con respecto al área bajo la curva control para este mismo polipéptido.

Tabla 2: Áreas bajo la curva medidas tras el análisis de la digestión de los polipéptidos por neprilisina por LC/MS/MS y porcentaje de digestión para el polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 58 y el polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 2.

[0085] Conclusión: A t=0, los dos polipéptidos parecen estables en presencia de neprilisina. A t=30 min, el péptido cíclico (SEQ ID N°: 2) es más estable que el polipéptido lineal (SEQ ID N°: 58) (28 % de digestión frente a 8,5 %).

Ejemplo 6: Separación de los dos picos correspondientes a los polipéptidos de las secuencias SEQ ID N°: 2 y SEQ I^dN°: 58 que muestran la diferencia de conformación

[0086] Se efectúa una síntesis del polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 2 a partir del polipéptido de SEQ ID N°: 58 en presencia de albúmina humana. Durante la reacción de síntesis se realizan dos análisis por HPLC de los compuestos presentes: el primero a T=0 minutos, y el segundo a T=60 minutos. En la figura 2 se muestran superpuestos los cromatogramas obtenidos.

[0087] Las condiciones analíticas practicadas para la separación de compuestos son las siguientes:

• Columna: XBridge® C18, 2,1 x 100 mm, 3,5 |jm

• Fase móvil: A: acetonitrilo con 0,1 % de TFA (ácido trifluoroacético)

B: agua destilada que contiene el 0,1 % de TFA

• Velocidad de elución: 0,500 ml/min

• Gradiente:

[0088] La figura 2 muestra que los picos correspondientes a los polipéptidos de las secuencias SEQ ID N°: 2 (cíclica) y SEQ ID N°: 58 (lineal, no cíclica) se pueden separar fácilmente.

Ejemplo 7: Farmacología in vitro

[0089] Se cultivan células de neuroblastoma de la línea B104 en un matraz de 75 cm2 a 37 °C bajo 5 % de CO²en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con glutamina 2 mM, penicilina G a 50 U/ml, sulfato de estreptomicina 50 jg/ml y suero fetal bovino al 10 % (FBS). Las células se siembran en placas de 48 pocillos cubiertas con una matriz de poli-D-lisina a 10 μg/ml para obtener una densidad celular final de 5000 células/pocillo. Cuatro horas después de la inoculación, se reemplaza el medio de cultivo por medio sin FBS a razón de 200 μl/pocillo que contenga o no polipéptido cíclico de secuencia SEQ ID N°: 2 a una concentración de 1000, 500, 375 o 150 μg/ml. El medio de cultivo ya no se cambia durante toda la duración del experimento. La ausencia de suero inducirá entonces un inicio de la diferenciación de B104 con aparición de extensiones neuríticas más o menos importantes.

[0090] Para cuantificar los efectos del polipéptido cíclico de secuencia SEQ ID N°: 2 sobre los cultivos, se observan las células después de 1, 2 y 3 días de cultivo en campos seleccionados al azar bajo un microscopio de contraste de fase utilizando un objetivo de rejilla (1 * 1 cm, dividida en cuadrados de 10x10) y con un aumento de x400. Cada pocillo se cuenta por triplicado para cada experimento y se examinan 3 campos por pocillo. Los parámetros analizados son el número de células, el número de neuritas (extensión celular al menos tan grande como el diámetro del cuerpo celular) por célula y la longitud media de las 10 neuritas más largas.

• En estas condiciones, se observa que: El péptido cíclico de secuencia SEQ ID N°: 2 tiene un efecto sobre el número de células B104:

En condiciones estándar, es decir en ausencia del polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 2, el crecimiento de células B104 aumenta durante 48 horas antes de que el número de células empiece a disminuir debido a la ausencia de suero y a un empobrecimiento del medio de cultivo. Sin embargo, en presencia del polipéptido cíclico de secuencia SEQ ID N°: 2, el número de células aumenta a partir de las 24 h con 5 veces más células en comparación con la condición de control.

En las figuras 2, 3, 4 y 5 se presentan ejemplos de crecimiento de células B104.

• El polipéptido cíclico de secuencia SEQ ID N°: 2 tiene un efecto sobre la morfología de las células B104: Mientras que las células B104 tienen una morfología de tipo fibroblástica cuando se cultivan en presencia de suero, se involucran en la diferenciación de tipo neuronal cuando se cultivan en ausencia de suero. A las 24 h, en cultivo sin suero e independientemente de la presencia o ausencia de factores de diferenciación, las células B104 presentan extensiones mono o bipolares, así como brotes (sprouting, pequeñas extensiones menores al diámetro del cuerpo celular) y neuritas (extensiones celulares al menos tan grande como el diámetro del cuerpo celular), morfología típica para estas condiciones (Schubert D et al., Nature. 249(454), 224-2271974).

[0091] El polipéptido cíclico de secuencia SEQ ID N°: 2, cualquiera que sea su concentración, no tiene ningún efecto sobre el número de sprouting. Sin embargo, la presencia del polipéptido cíclico de secuencia SEQ ID N°: 2 aumenta el número de neuritas por célula (figura 6) y su longitud (figura 7).

[0092] Después de 3 días de cultivo, las B104 tratadas desarrollaron extensiones neuríticas significativas que crecieron a medida que avanzaba el tiempo de cultivo. Este efecto sobre la longitud de las neuritas parece dependiente de la dosis.

Ejemplo 8: Farmacología in vivo - Evaluación sobre un modelo de lesión medular

[0093] El modelo de contusión se reconoce y se utiliza para imitar la lesión de la médula espinal observada en ser humano (Young W., Prog Brain Res., 137, 231-55, 2002).

[0094] Este modelo se utiliza para evaluar la eficacia de los principios activos en la recuperación funcional. Los experimentos se llevan a cabo en ratas Sprague-Dawley hembra adultas que pesan aproximadamente 250 g. El procedimiento quirúrgico se realiza bajo anestesia general con isoflurano al 5 % (en 70 % de N²O y 30 % de O²; caudal 300 ml/min).

[0095] Después de laminectomía a nivel de las vértebras torácicas T9 y T10, la lesión medular se obtiene mediante un dispositivo controlado electromagnéticamente (sistema PinPoint, Hatteras Inc., EE. UU.) que permite obtener una contusión calibrada (profundidad 2 mm, diámetro del Impactador de 2 mm, propulsado a una velocidad de 1,5 m/s durante 85 ms) (según Bilgen M. Neurorehab y Neuralre. 19(3), 2005).

[0096] Dentro de los quince minutos siguientes al traumatismo, se inyectan 3 μl del polipéptido cíclico de secuencia SEQ ID N°: 2 a una concentración de 7 μg/ml o el vehículo mediante una jeringa Hamilton (10 μl, modelo 1701) y un sistema de micro-perfusión (aparato de Harvard) que permite la inyección en el espacio intrarraquídeo. Después de la inyección, la aguja se deja colocada durante 5 min. Tan pronto como se retira la aguja, se aplica un adhesivo celular en el lugar de la inyección para sellar la duramadre y evitar cualquier fuga de líquido biológico. Después de la sutura de la piel, las ratas se alojan individualmente en jaulas estándar a una temperatura de 22 °C ± 1 °C bajo iluminación controlada (12 h/día), agua y comida ad libitum. Se realiza una segunda inyección 2 días después. Se realizan pruebas de comportamiento en cada animal observado individualmente, con enmascaramiento.

[0097] El rendimiento locomotor se estudia mediante la escala de Basso, Beattie, Bresnahan (BBB) (Basso DM et al. J Neurotrauma, 12, 1-21, 1995, Basso DM et al. Exp Neurol, 139, 244-256, 1996).

[0098] Cada animal es evaluado antes del traumatismo y después una vez por semana. Al mismo tiempo, cada animal es pesado antes del traumatismo y después una vez por semana.

[0099] En la escala de evaluación de la locomoción: puntuación BBB, los datos estadísticos se expresan por sus medias ± SEM.

[0100] Las puntuaciones de BBB varían de 0 (sin movimiento de las patas traseras) a 21 (marcha normal con coordinación y colocación paralela de las patas). Las puntuaciones de 0 a 7 indican el regreso de los movimientos aislados de las tres articulaciones de las patas traseras (tobillo, rodilla, cadera), 8 a 13 indican el regreso de la colocación de las patas traseras y la coordinación con las patas delanteras, 14 a 21 indican el regreso de la separación de los dedos, de la posición de las patas y de la cola, y de la estabilidad del tronco.

[0101] La evaluación de las puntuaciones BBB se realiza antes de la lesión, después en los días 1, 7, 14, 21 y 28 después del tratamiento por dos observadores independientes (figuras 8, 9, 10).

[0102] Las actividades reflejas de la separación de los dedos (figura 11) y la colocación de las patas traseras (figuras 12 y 13) se analizan los días 1, 7, 14, 21 y 28 después del tratamiento. Las puntuaciones consideradas son: 0 = sin actividad refleja, 1 = considerablemente inferior a lo normal, 2 = ligeramente inferior a lo normal, 3 = normal.

[0103] El día de retorno del control de la vejiga también es un parámetro medido (figura 14).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Polipéptido que consiste en la siguiente secuencia de aminoácidos:

2. Polipéptido según la reivindicación 1, estando dicho polipéptido prácticamente desprovisto de formas reducidas o diméricas u oligoméricas de dicho polipéptido así como derivados de dicho polipéptido en los que los grupos tiol están en forma de sulfóxido o de sulfona.

3. Polipéptido según la reivindicación 1 o 2, presentando dicho polipéptido una pureza superior al 80 %, preferentemente al 85 %, más preferentemente al 90 %, aún más preferentemente igual o superior al 95 %.

4. Procedimiento de obtención del polipéptido de secuencia de aminoácidos SEQ ID N°: 2:

W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (SEQ ID N°: 2)

en la que las dos cisteínas forman un puente disulfuro,

comprendiendo el procedimiento una etapa de formación de un puente disulfuro en presencia de albúmina en el polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 58 :

W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G (SEQ ID N°: 58).

5. Procedimiento de obtención del polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 2 según la reivindicación 4, caracterizado porque la albúmina y el polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 58 están presentes en una proporción de 1:1 a 1:100, preferentemente de 1:1 a 1:10 y más preferentemente de 1:1.

6. Procedimiento de obtención del polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 2 según una de las reivindicaciones 4 o 5, caracterizado porque la etapa de formación de un puente disulfuro en presencia de albúmina en el polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 58 se realiza al aire ambiente.

7. Procedimiento de obtención del polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 2 según una de las reivindicaciones 4, 5 o 6, caracterizado porque la etapa de formación de un puente disulfuro en presencia de albúmina en el polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 58 se realiza sin separar el polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 58 de la resina utilizada para la síntesis peptídica de este polipéptido y porque el polipéptido de secuencia SEQ ID N°: 2 se obtiene a continuación separando el polipéptido de la resina después de la etapa de formación del puente disulfuro.

8. Composición farmacéutica que comprende como principio activo un polipéptido tal como se describe en una de las reivindicaciones 1 a 3 y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

9. Polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 3, para su uso en el tratamiento de patologías o traumatismos neurodegenerativos en los que se busque la regeneración del sistema nervioso central.

10. Polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 3, para su uso en el tratamiento de patologías de tipo accidental, traumático o degenerativo, en concreto la enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson, lesión, traumatismos craneoencefálicos o daños en los nervios ópticos, olfatorios, auditivos o cualquier nervio craneal o periférico.