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ES2950494T3 - Composición para prevenir, tratar y aliviar alteraciones urinarias, que contiene un extracto de Piper longum l - Google Patents

Composición para prevenir, tratar y aliviar alteraciones urinarias, que contiene un extracto de Piper longum l Download PDF

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ES2950494T3
ES2950494T3 ES15764235T ES15764235T ES2950494T3 ES 2950494 T3 ES2950494 T3 ES 2950494T3 ES 15764235 T ES15764235 T ES 15764235T ES 15764235 T ES15764235 T ES 15764235T ES 2950494 T3 ES2950494 T3 ES 2950494T3
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urination
dysfunction
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Da-Ae Park
Yoon-Young Chang
Kwang-Hyun Kim
Sang-Ho Lee
Chan-Seok Jeon
Hyun-Yong Lee
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Dong Wha Pharm Co Ltd
Original Assignee
Dong Wha Pharm Co Ltd
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Abstract

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica para prevenir o tratar trastornos urinarios y a un alimento saludable funcional para prevenir o aliviar trastornos urinarios, la composición farmacéutica y el alimento saludable funcional que contiene un extracto de Piper Longum L. como ingrediente activo. El extracto de Piper Longum L. de la presente invención, que es un extracto natural, es inofensivo para el cuerpo humano; aumenta el intervalo de micción interviniendo simultáneamente en varios mecanismos implicados en las alteraciones urinarias; reduce la presión del detrusor y aumenta el volumen de la vejiga; suprime la contracción de los músculos detrusores e induce la relajación de los músculos detrusores y, por tanto, tiene un efecto excelente en la prevención, el tratamiento o el alivio de diversos trastornos urinarios. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composición para prevenir, tratar y aliviar alteraciones urinarias, que contiene un extracto de Piper longum l
[Campo técnico]
La presente invención se refiere a una composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de una disfunción de la micción y a un alimento funcional saludable para su uso en la prevención o la mejora de una disfunción de la micción, que comprende extracto de Piper longum L. como principio activo.
[Antecedentes de la técnica]
La disfunción de la micción se refiere a todas las acciones de micción que se apartan de los patrones de micción normales. La disfunción de la micción puede sucederle a cualquier hombre y mujer, lo que incluye vejiga neurogénica desarrollada por anomalía neurológica, síntomas de las vías urinarias inferiores e hiperplasa prostética por causa no neurogénica, enfermedades urinarias femeninas representadas como incontinencia urinaria (Korean Continence Society, 2003). Se notificó que los adultos tienen una alta prevalencia de disfunción de la micción, y que aunque la disfunción de la micción aumenta con la edad, los hombres en particular muestran un aumento lineal. En los síntomas de las vías urinarias inferiores debidos a una disfunción de la micción, se cree que todos los hombres y mujeres tienen la prevalencia més alta de síntomas de disfunción de la fase de almacenamiento representados como micción frecuente y vejiga hiperactiva, y se notifica que desarrollan a su vez disfunción de la fase de micción, y síntomas después de la micción.
Diversos síntomas de la disfunción de la micción tales como vejiga hiperactiva afectan negativamente a la calidad de vida individual relacionada con la salud en diversos aspectos, puesto que no puede evitarse que la calidad de vida individual disminuya debido a la ingesta restringida de bebidas, la experiencia de incomodidad de ir al baño con frecuencia, el impacto sobre las relaciones personales y la vida social, la aparición de problemas de salud o sueño insuficiente por la noche (Jeung Im KIM, Young Ho KIM, & Hyun Chul AHN, 2002; Yoo Sik LEE, 2001a).
El síndrome vejiga hiperactiva (síndrome de OAB) es un grupo de afecciones compuestas que ha establecido recientemente un concepto de enfermedad, y se refiere a representar una o més afecciones tales como micción frecuente (al menos 8 veces al día), que orinan frecuentemente por contracción frecuente de la vejiga de un modo anómalo mientras que la vejiga se llena con la orina producida en los riñones, micción de urgencia, que es dificultad para contener la orina, y por tanto tiene que ir al baño rápidamente, incontinencia de urgencia, que al orinar no aguanta suficientemente la micción y se escapa la orina hasta empapar la ropa, y nicturia, que tiene que orinar una o més veces durante el sueño por la noche, independientemente de que sea incontinencia de urgencia, siempre que no haya infección de las vías urinarias y otra etiología clara. Las afecciones de vejiga hiperactiva estén relacionadas con la contracción involuntaria que da como resultado un estado de hiperactividad de la vejiga.
Puesto que la vejiga consiste en músculos lisos y la función de micción esté regulada por el sistema nervioso, pueden desarrollarse diversas disfunciones de la micción por anomalías de los músculos lisos y el sistema nervioso. Todavía no se conocen con claridad las causas principales de las enfermedades, puesto que una vejiga hiperactiva se desarrolla generalmente por una causa neurogénica derivada de enfermedades cerebrales o lesiones de la médula espinal, obstrucción de la salida de la vejiga representada como hiperplasia prostética masculina, debilidad de la estructura pélvica de la mujer y enfermedades locales de la uretra y la vejiga, pero hay muchos casos provocados por envejecimiento de miocitos del detrusor y disfunción oscura del detrusor (Tae Hyung KIM, Journal of Chung Ang University College of Medicine 28(3), p143-149, 2003).
Aunque los síndromes de vejiga hiperactiva no son un proceso del envejecimiento, la probabilidad de los eventos aumenta con la edad. La incontinencia de urgencia se desarrolla més comúnmente en mujeres, aunque la razón de hombres con respecto a mujeres es similar. Se notifica de manera diversa desde el 12,7 % hasta el 30,5 % en el hogar, y de acuerdo con una investigación en Europa, la vejiga hiperactiva es una enfermedad común de manera que se desarrolla en hombres en un 16 % y en mujeres en un 17 %, por encima de la edad de 40, y específicamente en hombres en un 42 % y en mujeres en un 31 %, por encima de la edad de 75, y estas estadísticas son también similares a países desarrollados tales como EE.UU. y Japón (2011, Korean Continence Society, Guidelines on Overactive Bladder). La vejiga hiperactiva mostró una disminución en la calidad de vida al afectar a la actividad física bésica, la vida sexual y ademés a la actividad social de manera social y mental, y como resultado de la encuesta HROOL (calidad de vida relacionada con la salud, healthrelated quality-of-life) para pacientes, mostró tener un mayor impacto sobre la calidad de vida que la diabetes (Liberman JN, Hunt TL, Stewart WF, Wein A, Zhou Z, HerzogAR, et al. Health-related quality of life among adults with symptoms of overactive bladder: results from a U.S. community-based survey. Urology 2001; 57:1044-50).
Aunque ahora se usan ampliamente férmacos antimuscarínicos como tratamiento convencional inicial de la vejiga hiperactiva, todavía no hay informes de ensayos clínicos controlados y puestos en préctica internacionalmente que demuestren con certeza la eficacia, y se notifica que, dado que estos férmacos tienen propiedades anticolinérgicas que afectan a todo el sistema nervioso, se producen acontecimientos adversos tales como sed, estreñimiento, visión borrosa y retención urinaria aguda a una tasa de 1-2 de cada 10 personas. Se notifican tales efectos adversos como una causa del menor cumplimiento del férmaco en el caso de que los pacientes con disfunción de la micción necesiten una ingesta regulada de agua, y por este motivo, se requiere constantemente el desarrollo de fármacos alternativos novedosos para la disfunción de la micción tal como vejiga hiperactiva (J. Korean Continence Soc 2009; 13:7-22).
La incontinencia de urgencia es la fuga involuntaria de orina que se desarrolla repentinamente después de una afección grave de urgencia urinaria, en la que su factor causal se conoce como una escena particular, sonidos, contacto con agua corriente y cambio de posición. La orina de urgencia también se denomina urgencia urinaria y se refiere a una afección en la que se produce un deseo de orinar repentinamente, y significa un estado en el que una vez que se siente la necesidad de orinar, no se aguanta la micción. En este caso, se sabe que si no se orina inmediatamente, puede inducirse dolor, y de manera grave, la vejiga puede contraerse arbitrariamente pasando a incontinencia de urgencia con pérdida de orina. La micción frecuente se definió como un caso de orinar 8 veces o más durante 24 horas, a diferencia de los adultos normales que orinan 4~6 veces al día con un volumen de micción cada vez de aproximadamente 300 cc, pero la definición de micción frecuente se amplió al definirla la International Continence Society en 2002 como un caso en el que el propio paciente siente que orina muy frecuentemente. La micción frecuente está provocada por una ingesta de agua en exceso, hiperactividad del detrusor, disminución de la capacidad de la vejiga y supersensibilidad de la vejiga como una de las afecciones representativas de la disfunción de la micción que se refieren a afecciones de micción anómala. La orina nocturna se refiere a orinar después de despertarse durante el sueño por la noche, lo que se clasifica como poliuria nocturna cuando el volumen de micción nocturno es relativamente alto con respecto al volumen de micción diario y nicturia cuando no lo es.
Para que se defina como orina nocturna, debe ir acompañada necesariamente de sueño antes y después de la micción, y el paciente con nicturia frecuentemente se despierta y no se queda dormido fácilmente, de modo que está soñoliento y cansado durante el día debido a la alteración del sueño dando como resultado molestias en su vida diaria. Además, una persona anciana tiene el problema del aumento del riesgo de caída o fractura. Se notifica que la nicturia está asociada con diversos factores tales como la edad, el hábito de vida, la poliuria, la poliuria nocturna, el trastorno de la vejiga, el trastorno del sueño y un factor psicológico. La cistitis intersticial también se denomina síndrome de dolor de la vejiga o cistitis crónica. No había manifestación patológica característica tal como infección bacteriana, y la causa exacta no se encontró todavía. Aunque se sabe que esto se desarrolla, ya que se producen defectos en las células epiteliales de la vejiga dañando el revestimiento mucoso de la vejiga entre la orina y el flujo sanguíneo, la inflamación en la vejiga o trastornos vasculares de la vejiga, los daños en la mucosa de la vejiga y los trastornos psicosomáticos pueden servir como inductor. Aunque esto se produce en todos los hombres y mujeres, se revela una magnitud del 90 % en mujeres, principalmente a mitad de sus cuarenta años. Como síntomas, se desarrollan micción de urgencia sensorial anómala y micción frecuente, quejándose de dolor de la vejiga principalmente. Cuando se llena de orina, los síntomas empeoran, mientras que tienen menos dolor al orinar. Al orinar 1~2 veces o más y un promedio de 4 veces por la noche, hay menos hematuria. Al orinar al menos 8 veces o más y un promedio de 16 veces durante el día, la persona normal tiene un volumen de micción cada vez de 250 ml, mientras que el paciente que padece esta enfermedad tiene un volumen promedio de 75 ml. 3 de 4 pacientes tienen síntomas más graves debido a las conductas sexuales y los ciclos de menstruación, el estrés y los alimentos también afectan al deterioro de los síntomas. Para el tratamiento, después de la administración de un antidepresivo y anestesia, se implementa una operación tal como hidrodistensión de la vejiga, cistolisis, agrandamiento de la vejiga, derivación urinaria o se administra un fármaco tal como un fármaco anticolinérgico o bloqueante de receptores adrenérgicos alfa, un fármaco antihistamínico, un esteroide, nitrato de plata, heparina, pero el efecto del tratamiento no es alto, y por tanto se requieren fármacos novedosos para tratar tal disfunción de la micción.
Mientras tanto, Piperis Longi Fructus nativo de la India como fruto de Piperis Longum L., que es una planta leñosa trepadora de Piperaceae, se cultiva en China e Indonesia exportándose a Corea, donde se usa con el nombre de medicina oriental de Pilbal en el hogar.
Piper Longum L. contiene diversos componentes tales como aceites esenciales (canfeno, piperonal, sabineno, limoneno, mirceno), un ácido graso (ácido palmítico) y alcaloides (piperidina, piperina, piperanina), tiene un efecto de alivio del dolor en el cuerpo caliente como medicamento de calentamiento interior que calienta el bazo y el estómago, en la medicina oriental, y se hace referencia a que se usa en la disentería, los vómitos, la distensión abdominal, el dolor de muelas, la analgesia y la diarrea. En la India, Ayurveda, Piper Longum L. se usa actualmente con el nombre de PIPPALI, y se hace referencia a que se ha usado como estimulador digestivo, carminativo, expectorante, broncodilatador, anthelmíntico, sedante, estimulador de la circulación, afrodisíaco (Traditional Medicine of India, Shinilbooks, diciembre de 2011), y como acciones farmaceúticas de Piper Longum L., se han notificado acciones antibacterianas, anticonvulsivas, vasodilatadoras de la piel, antioxidantes, frente a la isquemia miocárdica, antilipidémicas, anticancerígenas y frente a la obesidad. El documento US 7014872B2 enseña formulaciones herbales nutracéuticas promotoras, protectoras de la salud y preventivas de enfermedades para diabéticos. Este documento enseña que las formulaciones pueden comprender Piper Longum L. "Piper Longum, Long Pepper, Pippal Herb, Benefits, Information", (http://www.ayushveda.com/herbs/piperlongum.html) describe los constituyentes del polvo de Piper Longum e indica que puede usarse para varias indicaciones incluida la tonificación de las vías urinarias.
Thomas Gevaert et al ("TRPV1 is involved in stretch-evoked contractile changes in the rat autonomous bladder model: a study with piperine, a new TRPV1 agonist", Neurourology and Urodynamics, 26, 2007, págs. 440-450) proporcionan enseñanzas de piperina como alternativa a la capsaicina y resiniferatoxina para el tratamiento de la hiperactividad del detrusor.
Finalmente, el documento CN 102861170A se refiere a una composición de medicina china usada para el tratamiento de la micción frecuente. Este documento enseña una composición que comprende Fructus cinnamomi immaturus, Fructus Piperis Longi, Poria, Herba Cistanches, Folium Malvae y Radix Rehmanniae. Sin embargo, todavía no se conoce un efecto de mejora de una disfunción de la micción con Piper Longum L.
[Divulgación]
[Problema técnico]
Aunque los presentes inventores han estudiado intensamente productos naturales que sean capaces de prevenir, tratar y mejorar con eficacia diversas disfunciones de la micción, han encontrado que el extracto de Piper Longum L. no solo es inocuo, sino que también revela efectos excelentes de prevención, tratamiento y mejora de una disfunción de la micción al estar implicado en diversos mecanismos relacionados con la disfunción de la micción simultáneamente, y por tanto completaron la presente invención.
Por consiguiente, la presente invención pretende proporcionar una composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de una disfunción de la micción que comprende un principio activo, en donde dicho principio activo consiste en un extracto de Piper longum L, en donde dicho extracto de Piper Longum L. inhibe un receptor muscarínico M3 o un receptor muscarínico M2 , y en donde dicho extracto de Piper Longum L. es un agonista del receptor adrenérgico Pa.
Además, la presente invención pretende proporcionar un alimento funcional saludable para su uso en la prevención o la mejora de una disfunción de la micción que comprende un principio activo, en donde dicho principio activo consiste en un extracto de Piper longum L., en donde dicho extracto de Piper Longum L. inhibe un receptor muscarínico M3 o un receptor muscarínico M2 , y en donde dicho extracto de Piper Longum L. es un agonista de un receptor adrenérgico p3.
[Solución técnica]
La presente invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de una disfunción de la micción que comprende un principio activo, en donde dicho principio activo consiste en un extracto de Piper longum L., en donde dicho extracto de Piper Longum L. inhibe un receptor muscarínico M3 o un receptor muscarínico M2 , y en donde dicho extracto de Piper Longum L. es un agonista de un receptor adrenérgico p3.
Además, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de una disfunción de la micción, en donde el extracto de Piper Longum L. se extrae de uno o más disolventes de extracción seleccionados del grupo que consiste en agua, alcohol, glicerina, butilenglicol, propilenglicol, acetato de metilo, acetato de etilo, acetona, benceno, hexano, dietil éter, cloroformo y diclorometano. Preferiblemente, el disolvente de extracción puede ser uno o más disolventes de extracción seleccionados del grupo que consiste en agua, alcohol, acetato de etilo, n-hexano, cloroformo, diclorometano. Más preferiblemente, el disolvente de extracción puede ser agua, alcohol o alcohol hidratado (disolución acuosa de alcohol). El alcohol puede ser metanol, etanol o isopropanol. Todavía más preferiblemente, el disolvente de extracción puede ser agua o etanol hidratado (disolución acuosa de etanol).
Además, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de una disfunción de la micción, en donde el alcohol es alcohol inferior anhidro o hidratado con de 1 a 4 átomos de carbono. Preferiblemente, el alcohol puede ser metanol hidratado (disolución acuosa de metanol) o etanol hidratado. Más preferiblemente, el alcohol puede ser etanol hidratado (disolución acuosa de etanol).
Además, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de una disfunción de la micción, en donde el alcohol inferior anhidro o hidratado es del 30 al 100 % en volumen de metanol o etanol. Preferiblemente, el alcohol inferior hidratado puede ser del 30 al 100 % en volumen (volumen/volumen; vol/vol) de disolución acuosa de etanol. Más preferiblemente, el alcohol inferior hidratado puede ser del 30 al 95 % en volumen de disolución acuosa de etanol. Todavía más preferiblemente, el alcohol inferior hidratado puede ser el 95 % en volumen de disolución acuosa de etanol.
Además, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de una disfunción de la micción, en donde el extracto de Piper Longum L. es un extracto soluble en disolvente polar o un extracto soluble en disolvente no polar. El extracto soluble en disolvente polar puede ser un extracto soluble en un disolvente seleccionado de agua, metanol, butanol o disolventes mixtos de los mismos, y preferiblemente, un extracto soluble en n-butanol saturado, y el extracto soluble en disolvente no polar puede ser un extracto soluble en diclorometano o acetato de etilo.
Además, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de una disfunción de la micción, en donde el extracto de Piper Longum L. aumenta el intervalo de micción.
Además, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de una disfunción de la micción, en donde el extracto de Piper Longum L. disminuye la presión de micción y aumenta la capacidad de la vejiga.
Además, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de una disfunción de la micción, en donde el extracto de Piper Longum L. induce la inhibición de la contracción del detrusor y la relajación del detrusor.
Tal como se indica en el presente documento, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de una disfunción de la micción, en donde el extracto de Piper Longum L. inhibe un receptor muscarínico M3 o un receptor muscarínico M2.
Tal como se indica en el presente documento, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de una disfunción de la micción, en donde el extracto de Piper Longum L. es un agonista de un receptor adrenérgico p3.
Además, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de una disfunción de la micción, en donde la disfunción de la micción es una o más seleccionada del grupo que consiste en síndrome de vejiga hiperactiva, incontinencia de urgencia, orina de urgencia, micción frecuente, nicturia y cistitis intersticial.
Además, la presente invención proporciona un alimento funcional saludable para su uso en la prevención o la mejora de una disfunción de la micción que comprende un principio activo, en donde dicho principio activo consiste en un extracto de Piper longum L., en donde dicho extracto de Piper Longum L. inhibe un receptor muscarínico M3 o un receptor muscarínico M2 , y en donde dicho extracto de Piper Longum L. es un agonista de un receptor adrenérgico p3.
Además, la presente invención proporciona un alimento funcional saludable para su uso en la prevención o la mejora de una disfunción de la micción, en donde la disfunción de la micción es una o más seleccionada del grupo que consiste en síndrome de vejiga hiperactiva, incontinencia de urgencia, orina de urgencia, micción frecuente, nicturia y cistitis intersticial.
Además, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de una disfunción de la micción, en donde el extracto de Piper Longum L. es un extracto soluble en disolvente polar o un extracto soluble en disolvente no polar.
[Efectos ventajosos]
El extracto de Piper Longum L. según la presente invención no solo es inocuo, sino que también tiene efectos excelentes de prevención, tratamiento y mejora de una disfunción de la micción al estar implicado en diversos mecanismos relacionados con la disfunción de la micción simultáneamente de modo que puede aumentar el intervalo de micción, disminuir la presión de micción, aumentar la capacidad de la vejiga, inhibir la contracción del detrusor e inducir la relajación del detrusor.
[Descripción de los dibujos]
La figura 1 muestra el resultado de comparar los cambios en la presión basal (BP), la presión de micción (MP) y el intervalo de micción (Ml) después de administrar un 95 % en volumen de disolución acuosa de extracto etanólico (200 mg/kg) del Piper Longum L. con el grupo de control normal y el grupo de control de disolvente.
La figura 2 muestra el resultado de comparar los cambios en la presión basal (BP), la presión de micción (MP), la presión umbral (TP) y el intervalo de micción (Ml) después de administrar un 95 % en volumen de disolución acuosa de extracto etanólico (200 mg/kg) del Piper Longum L. con el grupo de control normal, el grupo de control de disolvente y el grupo de control positivo (oxibutinina).
La figura 3 muestra el resultado de comparar los cambios en el intervalo de micción (Ml) y el volumen de micción (VV) después de administrar un extracto acuoso (200 mg/kg) y un 95 % en volumen de extracto en disolución acuosa de etanol (200 mg/kg) del Piper Longum L.
La figura 4 muestra el resultado de comparar los cambios en la frecuencia de micción, el volumen miccionado total y el volumen por micción después de administrar un extracto acuoso (300 mg/kg) y un 30 % en volumen de disolución acuosa de extracto etanólico (300 mg/kg) del Piper Longum L.
La figura 5 muestra el resultado de comparar los cambios en la capacidad de la vejiga (BC), el volumen de micción (VV) y el intervalo de micción (Ml) antes y después de administrar un extracto acuoso (300 mg/kg) del Piper Longum L. con un grupo de control positivo (tolterodina).
[Mejor modo]
La presente invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de una disfunción de la micción que comprende un principio activo, en donde dicho principio activo consiste en un extracto de Piperlongum L., en donde dicho extracto de PiperLongum L. inhibe un receptor muscarínico M3 o un receptor muscarínico M2 , y en donde dicho extracto de Piper Longum L. es un agonista de un receptor adrenérgico p3.
El extracto de Piper Longum L. según la presente invención no solo es inocuo, sino que también está implicado en diversos mecanismos relacionados con la disfunción de la micción simultáneamente de modo que puede aumentar el intervalo de micción, disminuir la presión de micción, aumentar la capacidad de la vejiga, inhibir la contracción del detrusor e inducir la relajación del detrusor. Se supone que los efectos de prevenir, tratar y mejorar la disfunción de la micción con el extracto de Piper Longum L. según la presente invención resultan del hecho de que el extracto de Piper Longum L. inhibe un receptor muscarínico M3 o un receptor muscarínico M2 o activa un receptor adrenérgico p3, que está implicado en la contracción y relajación de la vejiga en el sistema nervioso entérico de la médula espinal y la ruta de la médula espinal superior así como en la vejiga.
El "Piper Longum L." de acuerdo con la presente invención puede utilizarse sin limitación, a partir de los que se cultivan, recogen o comercializan, y comprenden tallos, hojas, raíces y frutos de los mismos siempre que revelen efectos de prevención, tratamiento o mejora de una disfunción de la micción, y preferiblemente, frutos del Piper Longum L..
El extracto de Piper Longum L. de acuerdo con la presente invención puede ser uno que se extrae de un disolvente de extracción habitual, que incluye, pero no se limita a, por ejemplo, agua; alcohol anhidro o hidratado; polialcohol tal como glicerina, butilenglicol y propilenglicol; disolventes a base de hidrocarburos tales como acetato de metilo, acetato de etilo, acetona, benceno, hexano, dietil éter y diclorometano; o mezclas de los mismos. Además, el extracto de Piper Longum L. de acuerdo con la presente invención puede ser uno que se extrae de uno o más disolventes de extracción, preferiblemente seleccionados del grupo que consiste en agua, alcohol, glicerina, butilenglicol, propilenglicol, acetato de metilo, acetato de etilo, acetona, benceno, hexano, dietil éter, cloroformo y diclorometano. Preferiblemente, el disolvente de extracción puede ser uno o más disolventes de extracción seleccionados del grupo que consiste en agua, alcohol, acetato de etilo, n-hexano, cloroformo, diclorometano. Más preferiblemente, el disolvente de extracción puede ser agua, alcohol o alcohol hidratado. El alcohol puede ser metanol, etanol o isopropanol. Todavía más preferiblemente, el disolvente de extracción puede ser agua o etanol hidratado.
Además, preferiblemente, el extracto de Piper Longum L. de acuerdo con la presente invención puede ser uno que se extrae con alcohol inferior anhidro o hidratado con de 1 a 4 átomos de carbono como disolvente de extracción, en donde el alcohol inferior anhidro o hidratado con de 1 a 4 átomos de carbono puede ser del 10 al 100 % en volumen, preferiblemente del 30 al 100 % en volumen, todavía preferiblemente del 70 al 100 % en volumen de metanol o etanol. Preferiblemente, el disolvente de extracción puede ser agua o del 30 al 95 % en volumen de etanol. A continuación en el presente documento, '% de alcohol' tal como se describe en el presente documento se usa con el mismo significado que '% en volumen de alcohol.'
Se prefiere que el extracto de Piper Longum L. se prepare mediante un proceso de preparación que comprende las siguientes etapas, pero no se limita a las mismas.
(1) Trocear Piper Longum L. después de secar;
(2) añadir un disolvente de extracción al Piper Longum L. troceado para extraer un extracto;
(3) filtrar el extracto después de enfriar; y
(4) concentrar el extracto filtrado.
El Piper Longum L. usado en la etapa (1) puede utilizarse, sin limitación, de los que se cultivan, recogen o comercializan, y el secado en la etapa (1) es preferiblemente mediante secado al aire en la sombra.
La extracción en la etapa (2) puede utilizarse a partir de un método de extracción, tal como, pero sin limitarse a, extracción con agitación, extracción por enfriamiento a reflujo, extracción por crioprecipitación, extracción por ultrasonidos y extracción supercrítica. La temperatura de extracción es preferiblemente de 50 a 120 °C, y más preferiblemente de 80 a 100 °C. Además, el tiempo de extracción es preferiblemente de 1 a 20 horas, y más preferiblemente de 2 a 5 horas. Además, la frecuencia de extracción puede ser de 1 a 5 veces, más preferiblemente 2 o 3 veces. Además, la extracción en la etapa (2) puede hacerse añadiendo el disolvente de extracción al Piper Longum L. en un factor de 1 a 10 basándose en el volumen del Piper Longum L.
Aunque la filtración en la etapa (3) puede realizarse con una malla de 100~500, se prefiere utilizar una malla de 300.
La concentración en la etapa (4) puede hacerse a de 10 a 100 °C, preferiblemente de 50 a 80 °C, y se prefiere utilizar un concentrador a vacío o evaporador rotatorio a vacío.
Además, adicionalmente al proceso anterior, puede comprender además una etapa de secado como etapa (5), en donde el secado puede hacerse usando un método de secado a presión reducida, secado a vacío, secado por ebullición, secado por pulverización o liofilización.
Además, el extracto de Piper Longum L. según la presente invención puede comprender una fracción extraída del extracto de Piper Longum L. La fracción extraída del extracto de Piper Longum L. puede obtenerse del extracto de Piper Longum L. obtenido usando alcohol inferior anhidro o hidratado con de 1 a 4 átomos de carbono como disolvente de extracción por medio de un método para obtener en general fracciones en la técnica tal como cromatografía en columna de gradiente de concentración usando un disolvente mixto de alcohol anhidro o hidratado con de 1 a 4 átomos de carbono o acetonitrilo y agua como fase móvil.
Además, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de una disfunción de la micción, en donde el extracto de Piper Longum L. es un extracto soluble en disolvente polar o un extracto soluble en disolvente no polar. El extracto soluble en disolvente polar puede ser un extracto soluble en un disolvente seleccionado de agua, metanol, butanol o disolventes mixtos de los mismos, y preferiblemente, un extracto soluble en n-butanol saturado, y el extracto soluble en disolvente no polar puede ser un extracto soluble en diclorometano o acetato de etilo. Preferiblemente, puede ser uno que se extrae fraccionalmente mediante un proceso de preparación que comprende añadir agua y diclorometano a la disolución acuosa de extracto etanólico del Piper Longum L. para preparar un extracto soluble en diclorometano y un extracto no soluble en diclorometano (fase acuosa), añadir agua y acetato de etilo al extracto no soluble en diclorometano para preparar un extracto soluble en acetato de etilo y un extracto no soluble en acetato de etilo (fase acuosa), y añadir agua y n-butanol saturado al extracto no soluble en acetato de etilo para preparar un extracto soluble en n-butanol saturado y un extracto no soluble en n-butanol saturado (fase acuosa). La disolución acuosa de etanol puede ser del 30 al 95 % en volumen de disolución acuosa de etanol, y más preferiblemente, el alcohol inferior hidratado puede ser el 95 % en volumen de disolución acuosa de etanol.
El extracto de Piper Longum L. según la presente invención puede estar implicado en la ruta de señalización de cAMP del receptor adrenérgico p3 así como un mecanismo antimuscarínico que es convencionalmente una diana de agentes terapéuticos para la disfunción de la micción para seleccionar como diana mecanismos compuestos implicados en la disfunción de la micción, y así revelar efectos de mejora de la disfunción de la micción.
Por consiguiente, el extracto de Piper Longum L. según la presente invención puede disminuir la presión de micción, y aumentar la capacidad de la vejiga. Además, el extracto de Piper Longum L. según la presente invención puede inducir la inhibición de la contracción del detrusor y la relajación del detrusor.
Además, el extracto de Piper Longum L. según la presente invención inhibe un receptor muscarínico M3 o un receptor muscarínico M2 , y es un agonista de un receptor adrenérgico p3.
Los receptores M3/M2 son receptores que afectan a los nervios parasimpáticos, que están distribuidos en el ojo, los órganos urinarios, el tracto gastrointestinal, el sistema cardiovascular y sus enfermedades o síntomas relacionados incluyen enfermedad pulmonar obstructiva crónica, bronquitis crónica, asma, síndrome de dificultad respiratoria aguda/del adulto, enfermedad respiratoria crónica obstrucción, hiperactividad bronquial, fibrosis pulmonar, enfisema o rinitis alérgica, síndrome del intestino irritable, colitis convulsiva, úlcera gastroduodenal, convulsión gastrointestinal o hiperanacinesia, diverticulitis, dolor que acompaña a convulsiones del músculo blando gastrointestinal; disfunción de la micción que incluye sinuria neurogénica, vejiga neurogénica, enuresis, vejiga psicosomática, incontinencia relacionada con convulsiones de la vejiga o cistitis crónica, síndrome de vejiga hiperactiva, urgencia o sinuria.
Los receptores adrenérgicos p3 se distribuyen en el cuerpo de la vejiga, así como en los adipocitos blancos y los adipocitos marrones, y sus enfermedades o síntomas relacionados incluyen sobrepeso, obesidad, trastorno de tolerancia a la glucosa, diabetes mellitus tipo 1, diabetes mellitus tipo 2, orina de urgencia, enuresis y disfunción de la micción que incluye incontinencia, vejiga neurógena, síndrome de vejiga hiperactiva, urgencia o sinuria.
Por tanto, una "disfunción de la micción" según la presente invención puede incluir diversas disfunciones que se apartan de los patrones de micción normales que se representan con respecto a la micción, y pueden ser disfunciones que se deben a la hipoactividad del detrusor, tal como la contracción o relajación anómalas del detrusor, la inestabilidad del detrusor y la orina de urgencia sensorial. En particular, la disfunción de la micción puede incluir, preferiblemente, síntomas de almacenamiento que incluyen sinuria, nicturia, orina de urgencia, incontinencia, enuresis; síntomas de micción que incluyen chorro débil, división, intermitencia, vacilación urinaria, micción con esfuerzo abdominal, goteo terminal; síntomas después de la micción que incluyen sensación de orina residual, goteo posmiccional o cistitis intersticial, y más preferiblemente, pueden ser uno o más seleccionados del grupo que consiste en síndromes de vejiga hiperactiva, incontinencia de urgencia, orina de urgencia, sinuria, nicturia y cistitis intersticial.
Además, para prevenir, tratar o mejorar la disfunción de la micción, la composición farmacéutica según la presente invención puede usarse sola o en combinación con cirugía, tratamiento hormonal, tratamiento farmacológico y métodos que usan modificadores de la respuesta biológica.
La composición farmacéutica según la presente invención puede formularse añadiendo un portador farmacéuticamente aceptable a la misma, y los detalles de la formulación pueden consultarse en Remington's Pharmaceutical Science (edición reciente), Mack Publishing Company, Easton PA. El portador farmacéuticamente aceptable significa uno que un experto habitual en la técnica en el campo de la invención farmacéutica usa habitualmente en la preparación de composiciones farmacéuticas. Por ejemplo, incluye lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, xilitol, eritritol, maltitol, almidón, goma arábiga, alginato, gelatina, fosfato de calcio, silicato de calcio, celulosa, metilcelulosa, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, agua, hidroxibenzoato de metilo, hidroxibenzoato de propilo, talco, estearato de magnesio y aceite mineral. Además, el portador farmacéuticamente aceptable incluye diluyentes o excipientes tales como cargas, extensores, aglutinantes, agentes humectantes, agentes disgregantes y tensioactivos.
Una formulación sólida para administración oral incluye comprimidos, píldoras, polvos, gránulos y cápsulas, y tal formulación sólida se prepara mezclando la composición farmacéutica de la presente invención con al menos uno de los excipientes tales como almidón, carbonato de calcio, sacarosa, lactosa, sacarosa, lactosa y gelatina. También, además del excipiente simple, puede usarse un lubricante tal como estearato de magnesio, talco.
Una formulación líquida para administración oral, que corresponde a suspensiones, fármacos internos, emulsiones y jarabes, puede incluir diversos excipientes, por ejemplo, agentes humectantes, agentes edulcorantes, agentes aromáticos y conservantes, así como agua y parafina líquida como diluyentes simples que son de uso común.
Como ejemplos de administración percutánea, pueden mencionarse portadores y/o excipientes, que son adecuados para producir polvos para espolvorear, emulsiones, suspensiones, aceites, aerosoles, ungüentos, ungüentos grasos, pastas en crema, geles, espumas o disoluciones, y adecuados para un sistema terapéutico transdérmico (TTS). Las formulaciones farmacéuticas locales según la presente invención pueden ser formas de dosificación semisólidas y específicamente ungüentos (ungüentos en solución, ungüentos en suspensión), cremas, geles o pastas. En la fase oleosa se usa principalmente lo siguiente: alcohol graso, como alcohol láurico, alcohol cetílico, alcohol estearílico, ácido graso, como ácido palmítico o ácido esteárico, parafina líquida o sólida u ozoquerita, cera líquida o sólida, tal como miristato de isopropilo, grasa natural o grasa sintética parcial, tal como triglicérido de ácido graso de coco, aceite endurecido, como aceite de cacahuete o de ricino hidrogenado, o éster parcial de ácido graso de glicerol, tal como monoestearato de glicerol o diestearato de glicerol. Los emulsionantes adecuados incluyen tensioactivos, tales como tensioactivos no iónicos, por ejemplo, éster de ácido graso de polialcohol o aductos de óxido de etileno del mismo, por ejemplo, éster de ácido graso de poliglicerol o éster de ácido graso de polioxietilensorbitán, éster de ácido graso de sorbitán, por ejemplo, oleato de sorbitán y/o isoestearato de sorbitán, isoestearato, esterol o éter de alcohol graso de polioxietileno o éster de ácido graso; tensioactivos aniónicos, por ejemplo, sales de metales alcalinos de sulfato de alcohol graso, por ejemplo, laurilsulfato de sodio, cetilsulfato de sodio o estearilsulfato de sodio, que generalmente se usan en presencia del alcohol graso anterior, por ejemplo, alcohol cetílico o alcohol estearílico. Entre estos, es posible añadir una formulación que inhiba la sequedad de la crema, tal como polialcohol, por ejemplo, glicerol, sorbitol, propilenglicol y/o polietilenglicol a la fase acuosa o añadir un conservante y una fragancia a la fase acuosa.
Sin embargo, la presente invención no está restringida por los portadores farmacéuticamente aceptables enumerados anteriormente, que son solo a modo de ejemplo.
Aunque la cantidad de aplicación del extracto de Piper Longum L. contenido en la composición farmacéutica varía dependiendo del estado y el peso de un paciente, la gravedad de la enfermedad, las formas del fármaco, la vía de administración y el período, puede seleccionarse adecuadamente, si es necesario. El término "administración" en el presente documento significa introducir una composición para su uso en la prevención o el tratamiento de la disfunción de la micción según la presente invención en un paciente mediante cualquier método adecuado, y la vía de administración de la composición para su uso en la prevención o el tratamiento de la disfunción de la micción según la presente invención puede ser cualquier vía general siempre que pueda llegar a los tejidos diana. Por ejemplo, el extracto de Piper Longum L. puede administrarse en una dosificación de 1 a 2400 mg/día, preferiblemente de 10 a 1000 mg/día, basándose en un adulto de 60 kg de peso, aplicándose una o varias veces al día. Además, la composición farmacéutica puede comprender el extracto de Piper Longum L. en una cantidad del 0,0001 al 50 % en peso con respecto al peso total de la composición. La composición farmacéutica puede aplicarse a un mamífero tal como un ser humano por varias vías, por ejemplo, percutánea, oral, inyección intravenosa, intramuscular o subcutánea.
Además, la presente invención proporciona un alimento funcional saludable para su uso en la prevención o la mejora de una disfunción de la micción que comprende un principio activo, en donde dicho principio activo consiste en un extracto de Piper Longum L., en donde dicho extracto de Piper Longum L. inhibe un receptor muscarínico M3 o un receptor muscarínico M2 , y en donde dicho extracto de Piper Longum L. es un agonista de un receptor adrenérgico p3.
El alimento funcional saludable según la presente invención incluye alimentos definidos en Ley de Alimentos Funcionales Saludables legislada el 26 de agosto de 2002 en Corea. Específicamente, el "alimento funcional saludable" incluye un alimento que se prepara o se procesa en forma de comprimido, cápsula, polvo, gránulo, líquido o píldora, usando materias primas o componentes que tienen funciones útiles en el cuerpo humano.
La disfunción de la micción puede incluir diversas disfunciones que se apartan de los patrones de micción normales que representan la micción, y pueden ser disfunciones que se deben a hipoactividad del detrusor, tal como una contracción o relajación anómalas del detrusor, inestabilidad del detrusor y orina de urgencia sensorial, y preferiblemente, ser una o más seleccionadas del grupo que consiste en síndromes de vejiga hiperactiva, incontinencia de urgencia, orina de urgencia, sinuria, nicturia y cistitis intersticial.
El alimento funcional saludable puede contener diversos nutrientes, vitaminas, minerales (electrolitos), agentes aromatizantes tales como agentes aromatizantes sintéticos y agentes aromatizantes naturales, colorantes y potenciadores (queso y chocolate), ácido péctico y sales del mismo, ácido algínico y sales del mismo, ácidos orgánicos, espesantes coloidales protectores, reguladores de pH, estabilizantes, conservantes, glicerina, alcohol, gasificantes utilizados en bebidas carbonatadas y además zumos y pulpas de frutas naturales para preparar bebidas de zumos de frutas y bebidas vegetales. Tales componentes pueden usarse independientemente o en combinación con los mismos.
El alimento funcional saludable puede ser cualquier forma de carne, salchicha, pan, chocolate, dulces, bocadillos, confitería, pizza, ramen, chicles, helados, sopas, bebidas, té, agua funcional, bebidas saludables, bebidas alcohólicas y compuestos vitamínicos.
El alimento funcional saludable puede comprender además aditivos alimentarios, cuya compatibilidad como "aditivos alimentarios" se decide mediante normas y criterios sobre artículos correspondientes de acuerdo con reglas generales y métodos de prueba generales del Codex de Aditivos Alimentarios aprobados por el Ministerio de Seguridad de Alimentos y Fármacos de Corea, a menos que haya otras reglas.
Los elementos enumerados en el "Codex de Aditivos Alimentarios" pueden incluir, por ejemplo, productos químicos sintéticos tales como cetonas, glicina, citrato de potasio, ácido nicotínico y ácido cinámico, aditivos naturales tales como color caqui, extracto de regaliz, celulosa cristalina, color kaoliang y goma guar, formulaciones mixtas tales como formulaciones de glutamato de L-sodio, agentes alcalinos para fideos, formulaciones de conservantes y formulaciones de color de alquitrán.
El contenido del extracto de Piper Longum L. según la presente invención añadido a alimentos incluidas bebidas durante los procedimientos para preparar el alimento funcional saludable según la presente invención puede disminuirse o aumentarse adecuadamente, si es necesario, y preferiblemente, se prefiere añadirlo en el intervalo del 1 al 15 % en peso en relación con el 100 % en peso del alimento total.
Los valores numéricos descritos en la memoria descriptiva debe interpretarse que incluyen intervalos equivalentes, a menos que se indique lo contrario.
A continuación, para ayudar a comprender la presente invención, se describen ejemplos de preparación, ejemplos y ejemplos de formulación preferidos. Sin embargo, los siguientes ejemplos de preparación, ejemplos y ejemplos de formulación solo se proporcionan para comprender fácilmente la presente invención, que no está restringida por los ejemplos de preparación, ejemplos y ejemplos de formulación. En los siguientes ejemplos de preparación 1 a 5, para la preparación del extracto de Piper Longum L., se usaron sus frutos adquiridos de BooYoung Oriental Medicine (147 Wangsan-ro, Dongdaemun-ku, Seúl) en el mercado de GyeungDong.
Ejemplo de preparación 1: Preparación del extracto de Piper Longum L.
Ejemplo de preparación 1-1: Preparación del extracto acuoso de Piper Longum L.
Se añadió 1 L de agua a 100 g de los frutos de Piper Longum L. secados a la sombra para extraerse en un baño de agua a temperatura constante (HYNDAE Science, B-90) a 95 °C durante 3,5 horas bajo reflujo. El extracto resultante se filtró con un papel de filtro a presión reducida, y entonces el filtrado resultante se concentró a presión reducida con un evaporador rotatorio a vacío (EYELA, N-1100) bajo una condición de 50-60 °C para producir 9,6 g±0,1 g de extracto blando del extracto de Piper Longum L. (el extracto acuoso de Piper Longum L.), que se usó como muestra para el experimento de identificación de toxicidad a continuación.
Ejemplo de preparación 1-2: Preparación de un 30 % en volumen de disolución acuosa de extracto etanólico de Piper Longum L.
Para preparar un 30 % en volumen de disolución acuosa de extracto etanólico, se añadió 1 L de un 30 % en volumen de disolución acuosa de etanol a 120 g de los frutos de Piper Longum L. secados a la sombra para extraerse en un baño de agua a temperatura constante (HYNDAE Science, B-90) a 85-95 °C durante 3,5 horas bajo reflujo. El extracto resultante se filtró con un papel de filtro a presión reducida, y entonces el filtrado resultante se concentró por evaporación con un evaporador rotatorio a vacío (EYELA, N-1100) bajo una condición de 50-60 °C y se secó con un secador a vacío (JEIO Tech, OV-12) durante al menos 12 horas para producir 10,86 g de un 30 % en volumen de disolución acuosa de extracto etanólico del Piper Longum L., que se usó como muestra para el experimento de identificación de toxicidad a continuación.
Ejemplo 1: Identificación de toxicidad del extracto de Piper Longum L.
1.1 Experimento de toxicidad aguda
El estudio de toxicidad aguda se realizó usando ratas macho y hembra SD libres de patógenos específicos (SPF) de 6 semanas de edad (ORIENT, Corea). Los animales se dividieron en 5 ratas por grupo. El extracto acuoso del Piper Longum L. preparado en el ejemplo de preparación 1.1 se administró por vía oral una vez en una sola dosis de 2 g/kg. Después de la administración del material experimental, se observaron la mortalidad, los síntomas clínicos y el cambio de peso corporal y se realizaron observaciones macroscópicas de los órganos en la cavidad abdominal y torácica después de la necropsia.
Como resultado, no hubo animales muertos ni síntomas clínicos anómalos, y no se observó ningún cambio tóxico en el cambio de peso corporal, observaciones macroscópicas, y similares. A partir de los resultados anteriores, la DL50 (dosis letal para el 50 % de la población de animales de prueba) del extracto acuoso de Piper Longum L. estaba por encima de 2 g/kg. Por tanto, se concluyó que el extracto acuoso de Piper Longum L. era un material seguro.
1.2 Estudio de toxicidad con dosis orales repetidas durante 1 semana
A efectos de establecimiento de la dosis basándose en un estudio de toxicidad de dosis repetidas a largo plazo, se realizó un estudio de toxicidad con dosis orales repetidas durante 1 semana usando ratones ICR hembra libres de patógenos específicos (SPF) (ORIENT, corea). Los animales se dividieron en 5 ratas por grupo. El extracto en disolución acuosa de etanol al 30 % en volumen del Piper Longum L. preparado en el ejemplo de preparación 1.2 se administró por vía oral una vez al día durante 7 días a niveles de dosis de 1000, 500 y 250 mg/kg. Después de la administración del material experimental, se observaron la mortalidad, los síntomas clínicos y el cambio de peso corporal y se realizaron observaciones macroscópicas de los órganos en la cavidad abdominal y torácica después de la necropsia.
No hubo animales muertos en ningún grupo de dosificación. Aunque se observó una tendencia a ligeras disminuciones en el peso corporal y el movimiento hasta 2 días después del comienzo de la administración en el grupo de dosificación de 1000 mg/kg, estos cambios se recuperaron luego hasta la normalidad después de 2 días. A partir de los resultados anteriores, no se observaron síntomas clínicos anómalos, cambios de peso corporal ni cambios tóxicos en las observaciones macroscópicas. A partir de los resultados anteriores, la disolución acuosa al 30 % en volumen de extracto etanólico del Piper Longum L. se identificó como un material seguro que no muestra toxicidad, incluso si se administraba repetidamente al ratón hasta 1 g/kg durante 1 semana.
1.3 Estudio de toxicidad con dosis orales repetidas durante 4 semanas
Para identificar la toxicidad en la dosis a largo plazo, se realizó un estudio de toxicidad con dosis orales repetidas durante 4 semanas usando ratones ICR libres de patógenos específicos (SPF). Los animales se dividieron en 5 ratas por grupo. El extracto acuoso del Piper Longum L. preparado en el ejemplo de preparación 1.1 se administró por vía oral una vez al día durante 28 días a niveles de dosis de 2000, 1000, 500, 250 y 125 mg/kg. Después de la administración del material experimental, se observaron la mortalidad, los síntomas clínicos y el cambio de peso corporal y se realizaron observaciones macroscópicas de los órganos en la cavidad abdominal y torácica después de la necropsia.
No hubo animales muertos ni síntomas clínicos anómalos, y no se observó ningún cambio tóxico en el cambio de peso corporal ni en las observaciones macroscópicas. A partir de los resultados anteriores, el extracto acuoso de Piper Longum L. se identificó como un material seguro que no muestra toxicidad, incluso si se administraba repetidamente al ratón hasta 2 g/kg durante 4 semanas.
1.3 Experimento de toxicidad con dosis repetidas durante 4 semanas
Para identificar la toxicidad en la dosis a largo plazo, se realizó un experimento de toxicidad con dosis orales repetidas durante 4 semanas usando ratones ICR libres de patógenos específicos (SPF). El extracto acuoso de Piper Longum L. preparado en el ejemplo de preparación 1.1 se administró por vía oral a 5 animales experimentales por grupo en una dosis de 2000, 1000, 500, 250, 125 mg /kg una vez al día durante 28 días. Después de la administración del material experimental, hayan muerto o no los animales, se observaron los síntomas clínicos y los cambios en el peso corporal, y luego se observaron a simple vista anomalías de los órganos en la cavidad abdominal y la cavidad torácica después de la autopsia.
Como resultado, no hubo animales con síntomas clínicos observados específicamente y que estuvieran muertos en ninguno de los animales a los que se les administró el material experimental, y además no se observaron cambios en la toxicidad a partir de cambios en el peso corporal y manifestación en la autopsia, y similares. A partir de los resultados anteriores, el extracto acuoso de Piper Longum L. se identificó como un material seguro que no muestra toxicidad, incluso si se administraba repetidamente al ratón hasta 2 g/kg durante 4 semanas.
Ejemplo de preparación 2: Preparación de extractos de Piper Longum L.
Usando agua y un disolvente orgánico, tal como etanol, metanol, acetato de etilo, isopropanol, diclorometano, cloroformo y n-hexano como disolvente de extracción, se prepararon extractos de Piper Longum L., respectivamente.
Ejemplo de preparación 2.1: Preparación de extracto acuoso de Piper Longum L.
Usando 100 mL de agua purificada, cada 5 g de los frutos de Piper Longum L. secados a a sombra se extrajeron en un baño de agua a temperatura constante (HYNDAE Science, B-90) a 80-90 °C durante 3 horas bajo reflujo. El extracto resultante se filtró con un papel de filtro a presión reducida, y entonces el filtrado resultante se concentró por evaporación con un evaporador rotatorio a vacío (EYELA, N-1100) bajo una condición de 50-60 °C y se secó con un secador a vacío (JEIO Tech, OV-12) durante al menos 12 horas para producir 0,76 g de extracto acuoso de Piper Longum L., que se representó en la tabla 1 a continuación.
Ejemplo de preparación 2.2: Preparación de extractos en disolventes orgánicos de Piper Longum L.
Los extractos se prepararon mediante el mismo método que el ejemplo de preparación 2.1 anterior excepto porque se usaron etanol, un 95 % en volumen de disolución acuosa de etanol, metanol y acetato de etilo como disolvente de extracción en lugar de agua, respectivamente. Entonces, cuando el disolvente como disolvente de extracción se cambió a diclorometano, cloroformo y hexano, respectivamente, se prepararon extractos mediante el mismo método que el ejemplo de preparación 2.1 anterior excepto porque se extrajeron en un baño de agua a temperatura constante (HYNDAE Science, B-90) a 60-70 °C. Se obtuvieron de 0,21 g a 0,81 g de extractos, que se representaron específicamente en la tabla 1.
[Tabla 1]
Figure imgf000011_0001
Ejemplo de preparación 2.3: Preparación de disolución acuosa de extractos etanólicos de Piper Longum L. según las concentraciones
Se prepararon extractos mediante el mismo método que el ejemplo de preparación 2.1 anterior excepto porque se usaron el 30 % en volumen, el 50 % en volumen, el 70 % en volumen y el 95 % en volumen de disolución acuosa de etanol como disolvente de extracción. Se obtuvieron de 0,61 g a 0,86 g de extractos, que se representaron específicamente en la tabla 2.
[Tabla 2]
Figure imgf000011_0002
Ejemplo de preparación 2.4: Preparación de fracciones de disolventes orgánicos del 95 % en volumen de disolución acuosa de extractos etanólicos de Piper Longum L.
Usando aproximadamente 10 L del 95 % en volumen de disolución acuosa de etanol, se extrajo dos veces 1 kg de los frutos de Piper Longum L. secados a la sombra en un baño de agua a temperatura constante (JISICO, J-BAL) durante 3,5 horas bajo reflujo. El extracto resultante se filtró con un papel de filtro a presión reducida, y entonces el filtrado resultante se concentró por evaporación con un evaporador rotatorio a vacío (EYELA, N-1100) bajo una condición de 50-60 °C y se secó con un secador a vacío (JE10 Tech, OV-12) durante al menos 12 horas para producir 82,99 g del 95 % en volumen de disolución acuosa de extracto etanólico del Piper Longum L. El 95 % en volumen de disolución acuosa de extracto etanólico del Piper Longum L. se suspendió añadiendo 1,5 L de agua destilada a un embudo de fraccionamiento, se agitó añadiendo de 1,2 a 1,5 L de un disolvente orgánico para confirmar la separación de las fases del disolvente orgánico, y luego se llevó a cabo un procedimiento de concentración a presión reducida tomando el correspondiente disolvente orgánico. Usando diclorometano, acetato de etilo, n-butanol saturado con agua en orden, se llevó a cabo el proceso para preparar las fracciones de disolventes orgánicos (de 56,13 g a 2,2 g), y la fracción (aproximadamente 10 g) de la fase acuosa excluyendo las fases de disolventes orgánicos, que se representaron en la tabla 3 a continuación.
[Tabla 3]
Figure imgf000012_0001
Ejemplo 2: Medición del efecto de inhibición de la actividad del receptor muscarínico M 3
Las células de músculo liso de vejiga humana (hBdSMC) donde se había expresado el receptor muscarínico M3 se adquirieron de Lonza (cambrex), y se usaron. Un medio para células de músculo liso (SmGM-2) que incluía suero bovino fetal (5 %), factores de crecimiento recombinantes (factor de crecimiento epidérmico humano; hEGF, factor de crecimiento de fibroblastos humanos; hFGF), antibiótico (gentamicina) e insulina, que también se adquirió de Lonza (cambrex), se usó como fluido de cultivo, y las células anteriores se subcultivaron en un incubador con un 5 % de CO2 mediante 10~13 pases. Las células cultivadas se sembraron en una placa de 6 pocillos, y después de 24 horas, se cultivaron en medio DMEM libre de suero durante otras 48 horas. Los extractos de Piper Longum L. preparados en el ejemplo de preparación 2 se constituyeron hasta las concentraciones representadas en las tablas 4 y 5 para pretratar las células cultivadas durante 2 horas, a las que se les administró 25 |jM de acetilcolina (Ach) provocando la contracción del detrusor durante 2 minutos para inducir la actividad del receptor M3. Células que no se trataron con acetilcolina ni extracto de Piper Longum L. y células que se trataron con 25 j M de acetilcolina solo se usaron como grupo de control. Las células anteriores se limpiaron con PBS enfriado con hielo, se disolvieron en una disolución tampón para lisis (NaCl 100 mM, DOC (ácido desoxicólico) al 0,75 %, SDS (dodecilsulfato de sodio al 0,5 %), DTT (ditiotreitol) 1 mM, Tris/HCl 20 mMpH 8,0), y se centrifugaron, y luego se separó el sobrenadante mediante SDS-PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio). Entonces, usando fosfo-MLC20 (anticuerpo frente a p-MLC20), se identificó la actividad de MLC20 (cadena ligera de miosina), que es la más importante para la contracción de células de músculo liso, por medio de un método de inmunotransferencia de tipo Western (Biochem. J. (2003) 374:145), y se cuantificó el grado de activación con un densitómetro (Bio-rad, GS-700). Basándose en el valor resultante en el pocillo del grupo de control en el que solo se colocó acetilcolina para tener una inhibición del 0 %, se calcularon las tasas de inhibición (%) de la actividad de MLC20 (μMLC20) según las concentraciones de fármacos, y los resultados se representaron en las tablas 4 y 5 a continuación.
[Tabla 4]
Figure imgf000013_0001
Tabla 5]
Figure imgf000013_0002
Como resultado de la búsqueda de las tasas de inhibición de la actividad por los extractos de Piper Longum L. tras la inducción de la actividad de MLC20 implicada en la contracción involuntaria del detrusor tratando células de músculo liso de vejiga humana con acetilcolina, que es un neurotransmisor, pudo saberse que los extractos Piper Longum L. extraídos a partir de diversos disolventes revelan actividad de inhibición, tal como se mostró en la tabla 4 anterior. Basándose en los resultados de extractos de Piper Longum L. de estos disolventes, se prepararon extractos según el contenido de etanol y fracciones de extracto etanólico al 95 % por medio del método descrito en el ejemplo de preparación 2 para medir la actividad de MLC20 mediante el mismo método anterior. Como resultado, todos los extractos extraídos de una disolución acuosa de etanol que contenía al menos el 30 % en volumen de etanol mostraron tasas de inhibición de al menos el 45~50 % en grupos de tratamiento de 100 |jg/ml como en la tabla 5, y las fracciones de diclorometano y acetato de etilo del extracto etanólico al 95 % también mostraron una alta inhibición de la actividad de MLC20. A través de los resultados anteriores, se supone que los extractos de PiperLongum L. y fracciones del extracto etanólico según la presente invención inhiben la hiperactividad del detrusor (contracción) inducida por acetilcolina, que se transmite por medio del receptor M3 en la fase de almacenamiento de orina, teniendo efecto de mejora de la disfunción de la micción.
Ejemplo de preparación 3: Preparación de un 95 % en volumen de disolución acuosa de extracto etanólico de Piper Longum L.
Se añadieron 7 L del 95 % en volumen de disolución acuosa de etanol a 700 g de los frutos de Piper Longum L. secados después de secar a la sombra para extraerse a 95 °C durante 3,5 horas bajo reflujo. El extracto resultante se filtró, y luego se concentró a presión reducida en una condición de 50-60 °C con un evaporador rotatorio a vacío para producir 52,7±0,1 g de extracto blando del 95 % en volumen de disolución acuosa de extracto etanólico del Piper Longum L., que se usó en el siguiente experimento.
Ejemplo 3: Medición del efecto de inhibición de la actividad del receptor muscarínico M 2
Se sabe que cuando el receptor muscarínico M2 , que es uno de GPCR (receptores acoplados a proteínas G), se acopla con acetilcolina, que es un agonista, inhibe la actividad de la enzima adenilil ciclasa disminuyendo la concentración de cAMP en las células, en las que si la cantidad de cAMP aumenta, el detrusor se relaja, o por el contrario, si la cantidad de cAMP disminuye, el detrusor se contrae. Por tanto, al confirmar la mejora de la disfunción de la micción, es importante identificar un efecto de ser capaz de aumentar o disminuir la cantidad de cAMP. Por consiguiente, se identificó si el extracto de Piper Longum L. tenía o no actividad de inhibición del receptor muscarínico que puede inhibir la disminución de la concentración de cAMP por acetilcolina, mediante pretratamiento con el 95 % en volumen de disolución acuosa de extracto etanólico de Piper Longum L., tratándolo con acetilcolina que puede servir como activador del receptor muscarínico M2 para inducir una disminución de la concentración de cAMP, y tratándolo con forskolina que puede elevar la concentración de cAMP en células. Más específicamente, el procedimiento es tal como sigue.
Las células de músculo liso de vejiga humana (hBdSMC) donde se había expresado el receptor muscarínico M2 se adquirieron de Lonza (cambrex), y se usaron. Un medio para células de músculo liso (SmGM-2) que incluía suero bovino fetal (5 %), factores de crecimiento recombinantes (hEGF, factor de crecimiento de fibroblastos humanos; hFGF), antibiótico (gentamicina) e insulina, que también se adquirió de Lonza (cambrex), se usó como fluido de cultivo, y las células anteriores se subcultivaron en un incubador con un 5 % de CO2 mediante 10~13 pases. Las células de músculo liso de vejiga humana cultivadas (hBdSMC) se hicieron crecer hasta la confluencia en una placa de 24 pocillos, y luego se lavaron con PBS, se pretrataron con 3-isobutil-I-metilxantina (IBMX) 0,5 mM en medio DMEM libre de suero durante 30 minutos y se trataron con oxibutinina que es un fármaco de control o extractos etanólicos de Piper Longum L. preparados en el ejemplo de preparación 3 a cada concentración durante 30 minutos. Entonces, después de administrar 10 jM de acetilcolina (ACh) a las mismas durante 5 minutos, se cultivaron con 10 jM de forskolina durante 15 minutos, y se completó la reacción añadiendo HCl 0,1 M. La cantidad de cAMP en las células se evaluó midiendo la absorbancia (408 nm) con un kit de ELISA a partir del sobrenadante tomado después de centrifugar las células disueltas en HCl 0,1 M.
Los resultados se representaron en la tabla 6 a continuación.
[Tabla 6]
Figure imgf000014_0001
Tal como se mostró en la tabla 6 anterior, el grupo tratado con acetilcolina sola redujo el aumento drástico de cAMP en las células inducido por la activación directa de la enzima adenilil ciclasa con forskolina hasta un nivel de aproximadamente el 11 %, mientras que el grupo experimental tratado con extractos de PiperLongum L. aumentó la concentración de cAMP dependiendo de las concentraciones de tratamiento de extractos de Piper Longum L.. Es decir, pudo demostrarse que los extractos de Piper Longum L. pueden aumentar la concentración de cAMP en células inhibiendo el receptor muscarínico M2 para aliviar la inhibición de la acumulación de cAMP en las células. Específicamente, el grupo experimental tratado con 150 |jg/ml del extracto de Piper Longum L. reveló el excelente efecto de recuperar un nivel de concentración de cAMP hasta el 84,82 % del grupo tratado con forskolina sola. Puede observarse a partir de tal resultado que los extractos de Piper Longum L. pueden usarse como material que puede servir para relajar el detrusor eficazmente aumentando las cantidades de cAMP.
Ejemplo 4: Medición del efecto de activación del receptor adrenérgico P 3
Puesto que se sabía que el receptor adrenérgico p3 estaba implicado en la relajación del detrusor por medio de la ruta de señalización de cAMP, se confirmó el efecto de mejora de los síntomas anómalos de la micción en los extractos de Piper Longum L. midiendo las cantidades de cAMP en las células, que es su parámetro de activación. Se dispensaron SK-N-MC (células de neuroblastoma) donde se habían sobreexpresado receptores adrenérgicos p3 y p1 en una placa de 24 pocilios a 5*105 células/pocillo, se enjuagaron con PBS después de 24 horas y luego se transfirieron a un medio libre de suero, y se pretrataron con 0,5 mM de 3-isobutil-l-metilxantina (IBMX) y 5 jM de CGP-20712A que es un antagonista del receptor adrenérgico pi para excluir el efecto del receptor adrenérgico pi durante 30 minutos. Este pretratamiento se llevó a cabo con el fin de excluir un efecto por el receptor adrenérgico pi e identificar el cambio de las cantidades de cAMP por el efecto del receptor adrenérgico p3. El extracto de Piper Longum L. del ejemplo de preparación 2 se constituyó hasta las concentraciones representadas en la siguiente tabla, se administró a las células tratadas y se hizo reaccionar en un incubador durante 3o minutos, y luego se disolvieron las células añadiendo HCl 0,1 M. Las cantidades de cAMP en las células se midieron con un kit de ELISA, comparando el grupo de tratamiento con extractos con el grupo de control no tratado con los extractos, y los resultados se representaron en las tablas 7 y 8 a continuación.
[Tabla 7]
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Tabla 8]
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Tal como se mostró en la tabla 7 anterior, el extracto etanólico de Piper Longum L. aumentó evidentemente la cantidad de cAMP en las células dependiendo de las concentraciones, en comparación con el grupo de control no tratado con el extracto de Piper Longum L., y en el grupo tratado con el extracto de Piper Longum L. a 100 |jg/ml o más, pudo identificarse el excelente efecto sobre el aumento de cAMP en un factor de 3 o más. Además, se mostró que el extracto acuoso de Piper Longum L., así como los extractos metanólico y en diclorometano de Piper Longum L., aumentaron la cantidad de cAMP. De acuerdo con los resultados de los extractos etanólicos al 95 % en la tabla 7 anterior, las células se trataron con los extractos según el contenido de etanol y las fracciones del extracto etanólico al 95 % mediante el mismo método anterior para medir las cantidades de cAMP en las células, que se compararon con el grupo de control. Como resultado, pudo identificarse el efecto de aumento de cAMP en un factor de aproximadamente 2 o más en el grupo de 100 jg/m l a partir de todos los extractos extraídos a partir de una disolución acuosa que contenía al menos el 30 % en volumen de etanol en relación con el grupo de control, como en la tabla 8, y también se identificó el efecto de aumento de cAMP incluso en la fracción de diclorometano del extracto etanólico al 95 %. Por tanto, se mostró que la disolución acuosa de extractos etanólicos de Piper Longum L. extraídos con etanol hidratado a diversas concentraciones y diversas fracciones de disolventes orgánicos de la disolución acuosa de extractos etanólicos pueden inducir relajación del detrusor.
Según los resultados anteriores, se identificó que los extractos de Piper Longum L. eran materiales tales que pueden inhibir la actividad de MLC20 inducida por acetilcolina, aliviar eficazmente la inhibición de la acumulación de cAm P en las células por medio del receptor muscarínico M2 y aumentar la cantidad de cAMP en las células, que es un parámetro de la actividad del receptor adrenérgico p3 implicado en la relajación del detrusor. Por tanto, puede suponerse que los extractos de Piper Longum L. tienen un efecto de tratamiento o mejora sobre los síntomas anómalos de la micción, puesto que no solo pueden servir como antagonista de receptores muscarínicos M3/M2 al inhibir estos receptores y los sistemas de señalización relacionados con los mismos, sino que también inhiben la contracción del detrusor e inducen la relajación del detrusor por medio de acciones combinadas de acciones agonistas del receptor adrenérgico p3.
Ejemplo de preparación 4: Preparación de extractos de Piper Longum L.
Ejemplo de preparación 4.1: Preparación de una disolución acuosa al 95 % de extracto etanólico de Piper Longum L.
Para identificar adicionalmente un efecto de mejora de la disfunción de la micción en modelos animales por extractos de Piper Longum L., se prepararon una disolución acuosa al 95 % de extracto etanólico y extracto acuoso de Piper Longum L. Se añadieron 1,0 L del 95 % en volumen de disolución acuosa de etanol a 200 g de los frutos de Piper Longum L. y se extrajo dos veces a 95 °C durante 3,5 horas bajo reflujo. El extracto resultante se filtró, y luego se concentró hasta sequedad para preparar una disolución acuosa al 95 % de extracto etanólico.
Ejemplo de preparación 4.2: Preparación de extracto acuoso de Piper Longum L.
El extracto acuoso de Piper Longum L. se preparó usando el mismo método que la preparación del 95 % en volumen de extracto etanólico en el ejemplo de preparación 4.1 anterior excepto porque el disolvente de extracción se cambió a agua.
Ejemplo 5: Efecto de control de la presión de micción y el intervalo de micción en un modelo de cistitis inducida por CYP pretratado con extractos de Piper Longum L. durante 7 días
Se identificó el efecto de extractos de Piper Longum L. sobre la presión de micción y la capacidad de la vejiga usando el modelo de rata de cistitis inducida por CYP.
El modelo de rata inducida por ciclofosfamida (denominada CYP a continuación) como modelo animal de cistitis tiene las ventajas de que la inflamación se producía solo en la vejiga en el plazo de unas pocas horas después de la dosificación y no se requiere procedimiento quirúrgico o intubación traqueal. Además, los tipos de dolor y los síntomas de micción son similares a los humanos porque CYP también provoca cistitis en seres humanos (The Effect of Botulinum Toxin and Resiniferatoxn on the Detrusor Overactivity Induced by Cyclophosphamide in Rat Bladder, Korean Journal of Urology: vol.
47 n.° 1, 2006). Por tanto, CYP induce hiperactividad de la vejiga en vejigas de animales y seres humanos mediante inflamación química mostrando hiperactividad del detrusor en el estudio urodinámico junto con síntomas de micción irritable, de modo que el modelo de rata de cistitis inducida por CYP se considera un modelo animal para la vejiga hiperactiva (Journal of physiology and pharmacology 2009, 60, 4, 85-91. Urodynamic effects of the bladder c-fiber afferent activity modulation in chronic model of overactive bladder in rats).
5.1. Animal experimental
Se adquirieron 20 ratas SD hembra libres de patógenos específicos (SPF) (8 semanas de edad en la recepción) de ORIENT (Corea) y se usaron. El día y la noche se controlaron mediante un ciclo de 12 horas, y se les permitió libre acceso a alimento y agua.
5.2. Efecto de extractos de Piper Longum L. sobre la mejora de los parámetros urodinámicos
Para medir la presión de la vejiga y el intervalo de micción, que son parámetros para identificar la mejora de la disfunción de la micción, se administró ciclofosfamida (150 mg/kg) una vez por vía intraperitoneal a ratas excluyendo un grupo de control normal para inducir síntomas de vejiga irritable 3 días antes de la cistometría. Desde 7 días antes de la cistometría, se había administrado un disolvente (DMSO/Cremophor EL al 10 %=1:9, vol/vol) a un grupo de control de disolvente, y se había administrado el 95 % en volumen de extracto en disolución acuosa de etanol de frutos de Piper Longum L. preparado en el ejemplo de preparación 4.1 a un grupo experimental a 200 mg/kg.
Para la cistometría y la inyección de una solución salina fisiológica, después de que se anestesiara una rata el día de la medición de los parámetros urodinámicos, se fijó un catéter de polietileno con manguito (PE-50, Becton Dickinson, Parsippany, EE.UU.) en la cúpula de su vejiga con sutura en bolsa de tabaco por medio de una incisión central de su abdomen inferior. Después de llevar a cabo la inserción de un vaso vesical y un vaso para medir la presión abdominal, el vaso vesical de la rata se acopló a una bomba de microinyección (KDS100 Single Syringe Infusion Pump; KD Scientifics) y un transductor de presión (GrASS MODEL 7 POLYGRAPH; g Ra SS instrument Co. EE.UU.) con una llave de 3 vías. Entonces, 30 minutos después de la inserción, se midieron los parámetros urodinámicos tales como la presión intravesical, con la inyección de una solución salina fisiológica a una velocidad de 0,04 ml/min durante 2 horas usando una bomba de infusión intravesical. El análisis de la adquisición de datos de presión intravesical se observó con Chart 4 PowerLab (ADinstument, EE.UU.), y se seleccionaron 4 ~ 5 picos de contracción de micción continuos antes y después de la administración del fármaco en los ciclos de micción medidos para calcular el promedio de cada uno.
Los valores medidos del estudio urodinámico en modelos animales de CYP y sus definiciones son tal como sigue.
La presión basal (BP), que es un parámetro de presión intravesical en 5 ciclos de micción repetidos, es la presión más baja en la cistometría, la presión umbral (TP) es la presión inmediatamente antes de la contracción de micción y la presión de micción (MP) significa la presión máxima de la vejiga representada en la micción. Se determinó el intervalo de micción (MI) calculando el intervalo de tiempo entre presiones de micción consecutivas. Los ciclos de micción se midieron durante 120 minutos, y se calcularon los valores promedio de cada parámetro seleccionando los 5 ciclos continuos más representativos entre los ciclos de micción medidos.
Los resultados se representaron en la tabla 9 y la figura 1 a continuación.
[Tabla 9] Parámetro urodinámico relacionado con las presiones y los intervalos de micción
Figure imgf000018_0001
Como puedo observarse a partir de la tabla 9 anterior y la figura 1, se demostró que el extracto etanólico de Piper Longum L. aumentó notablemente el intervalo de micción hasta 195,90±92,91, en comparación con el grupo de control de disolvente de síndromes de vejiga hiperactiva no tratados con extracto de Piper Longum L., y mantuvo uniformemente todos de BP, IMP, MP y TP, que son diversos índices de presión de la vejiga, a los niveles del grupo de control normal, y en particular, se identificó que muestra el efecto de mejora significativa de la presión umbral (TP) que es un parámetro que mide la presión de la vejiga relacionada con una función de almacenamiento de la vejiga.
Ejemplo 6: Efecto de extractos de Piper Longum L. sobre la presión de micción, la capacidad de la vejiga y el intervalo de micción en un modelo de cistitis inducida por CYP después de la dosificación de los extractos de Piper Longum L. durante 3 días
6.1. Animal experimental
Se adquirieron 65 ratas hembra SD libres de patógenos específicos (SPF) de ORIENT (Corea) y se usaron. El día y la noche se controlaron mediante un ciclo de 12 horas, y se les permitió libre acceso a alimento y agua.
6.2. Efecto de extractos de Piper Longum L. sobre la mejora de los parámetros urodinámicos
Para medir la presión de la vejiga, la capacidad de la vejiga y el volumen de micción, que son parámetros para identificar la mejora de una disfunción de la micción, se administró ciclofosfamida (150 mg/kg) una vez por vía intraperitoneal a ratas excluyendo un grupo de control normal para inducir síntomas de vejiga irritable 3 días antes de la cistometría. Desde 3 días antes de la cistometría, se había administrado un disolvente (DMSO/Cremophor EL al 10 %=1:9, vol/vol) a un grupo de control de disolvente, y se había administrado el 95 % en volumen de extracto en disolución acuosa de etanol de frutos de Piper Longum L. preparado en el ejemplo de preparación 4.1 a un grupo experimental a 200 mg/kg. Además, se inyectó oxibutinina como grupo de control positivo por medio de la vena caudal a 0,3 mg/kg el día del experimento.
Para la cistometría y la inyección de una solución salina fisiológica, los instrumentos para la cistometría y la inserción de un vaso vesical fueron los mismos que en el ejemplo 5.2 anterior, y el volumen de micción y el volumen residual se registraron tomando muestras de orina en un tubo de 1,5 ml y midiendo su peso.
Los valores medidos del estudio urodinámico en modelos animales de CYP y sus definiciones son tal como sigue.
La presión basal (BP), la presión umbral (TP), la presión de micción (MP) y el intervalo de micción (Ml) que se definen como en el ejemplo 5.2 anterior. Además, el volumen de micción, que es un parámetro del parámetro de volumen, se definió tomando muestras de orina en un tubo de 1,5 ml en la última micción durante las mediciones urodinámicas y midiendo su peso. Después de la finalización de la micción, se definió el volumen residual colocando el catéter insertado en la vejiga en una parte más baja que la rata y midiendo el peso de la solución salina fisiológica obtenida. Se calculó la capacidad de la vejiga (BC) combinando el volumen residual (RV) y el volumen de micción (VV) medidos de la rata.
Los ciclos de micción se midieron durante 120 minutos, y se calcularon los valores promedio de cada parámetro seleccionando los 5 ciclos continuos más representativos entre los ciclos de micción medidos.
Los resultados se representaron en la tabla 10 y la figura 2.
[Table 10] Parámetros urodinámicos relacionados con el volumen y el peso de la vejiga
Figure imgf000019_0001
Tal como se muestra en la tabla 10 anterior y la figura 2, el extracto etanólico de Piper Longum L. reveló el efecto de mejora significativa del intervalo de micción (MI), que es un parámetro relacionado con micción frecuente tal como se representa en la vejiga hiperactiva del estado de disfunción de la micción, con respecto al grupo de control de disolvente inducido por síntomas de vejiga hiperactiva. Además, también reveló el efecto de mejora de los síntomas de vejiga hiperactiva en la presión basal (BP), la presión de micción (MP) y la presión umbral (TP) sin micción, que son parámetros para medir la presión de la vejiga relacionada con la función de almacenamiento de la vejiga. Se identificó que el volumen de micción (VV) pudo mejorarse hasta un nivel similar a un grupo tratado con oxibutinina como grupo de control positivo.
6.3. Efectos de extractos etanólicos y acuosos de Piper Longum L. sobre la mejora de los parámetros urodinámicos
Se identificó si el extracto acuoso del Piper Longum L. podía mejorar también los parámetros urodinámicos. Más específicamente, se evaluó el efecto de mejora de los parámetros urodinámicos usando modelos animales de CYP mediante el mismo método que el ejemplo 6.2 anterior excepto porque se trataron con extracto acuoso de Piper Longum L. en el ejemplo de preparación 4.2 como grupo experimental adicional, además del 95 % en volumen de extracto etanólico de Piper Longum L. en el ejemplo de preparación 4.1, y se compararon midiendo el volumen de micción y el intervalo de micción (MI) que son parámetros representativos que evalúan la disfunción de la micción relacionada con síndromes de vejiga hiperactiva.
Los resultados se representaron en la tabla 11 y la figura 3 a continuación.
[Tabla 11]
Figure imgf000019_0002
Como puede observarse a partir de la tabla 11 anterior y la figura 3, los extractos tanto etanólico como acuoso de Piper Longum L. aumentaron el volumen de micción (VV) en un grado muy significativo en relación con los grupos de control de disolvente de vejiga hiperactiva, y también aumentaron notablemente el intervalo de micción (MI) en un factor de aproximadamente 2 o más en relación con los grupos de control de disolvente. Según los resultados anteriores, puesto que los extractos tanto acuoso como etanólico de PiperLongum L. pudieron mejorar la disminución del intervalo de micción y la disminución del volumen de micción concomitante con la disfunción de la micción, se identificó que eran materiales que tenían el excelente efecto de ser capaces de prevenir o tratar diversas disfunciones de la micción tales como síndromes de vejiga hiperactiva que acompañan a orina frecuente y orina de urgencia en un nivel similar de la oxibutinina disponible comercialmente.
Ejemplo de preparación 5: Preparación de los extractos de Piper Longum L.
Ejemplo de preparación 5.1: Preparación del extracto acuoso de Piper Longum L.
Se añadieron 6,0 L de agua a 1 kg de los frutos de Piper Longum L. secados a la sombra para extraerse dos veces en un baño de agua a temperatura constante (HYNDAE Science, B-90) a 80-90 °C durante 3,5 horas bajo reflujo. El extracto resultante se filtró con un papel de filtro a presión reducida, y entonces el filtrado resultante se concentró por evaporación con un evaporador rotatorio a vacío (EYELA, N-1100) bajo una condición de 50-60 °C y se secó con un secador a vacío (JEIO Tech, OV-12) durante al menos 12 horas para producir el extracto acuoso de Piper Longum L..
Ejemplo de preparación 5.2: Preparación de un 30 % en volumen de disolución acuosa de extracto etanólico de Piper Longum L.
Se añadieron 6,0 L del 30 % en volumen de disolución acuosa de etanol a 1 kg de los frutos de Piper Longum L. secados a la sombra para extraerse dos veces en un baño de agua a temperatura constante (HYNDAE Science, B-90) a 80-90 °C durante 3,5 horas bajo reflujo. El extracto resultante se filtró con un papel de filtro a presión reducida, y entonces el filtrado resultante se concentró por evaporación con un evaporador rotatorio a vacío (EYELa , N-1100) bajo una condición de 50­ 60 °C y se secó con un secador a vacío (JEIO Tech, OV-12) durante al menos 12 horas para producir el 95 % en volumen de disolución acuosa de extracto etanólico de Piper Longum L.
Ejemplo de preparación 5.3: Preparación de un 95 % en volumen de disolución acuosa de extracto etanólico de Piper Longum L.
Se añadieron 7,0 L del 95 % en volumen de disolución acuosa de etanol a 700 g de los frutos de Piper Longum L. secados a la sombra para extraerse dos veces en un baño de agua a temperatura constante (HYNDAE Science, B-90) a 80-90 °C durante 3,5 horas bajo reflujo. El extracto resultante se filtró con un papel de filtro a presión reducida, y entonces el filtrado resultante se concentró por evaporación con un evaporador rotatorio a vacío (EYELa , N-1100) bajo una condición de 50­ 60 °C y se secó con un secador a vacío (JEIO Tech, OV-12) durante al menos 12 horas para producir el 95 % en volumen de disolución acuosa de extracto etanólico de Piper Longum L.
El detalle se representó en la tabla 12 a continuación.
[Tabla 12]
Figure imgf000020_0001
Ejemplo 7: Efecto de los extractos de Piper Longum L. por medio del modelo de evaluación sin anestesia SHR para la frecuencia de micción
Puesto que la disfunción de la micción se diagnostica basándose en los síntomas que experimenta un paciente, además del control de la vejiga y los sistemas nerviosos, un factor psicológico desempeña un papel importante. Por tanto, para evaluar la disfunción de la micción, es importante observar objetivamente los parámetros de micción en animales conscientes. En vista de tales necesidades, la investigación sobre la vejiga hiperactiva humana está aumentando continuamente usando modelos de ratas espontáneamente hipertensas (a continuación en el presente documento, denominadas SHR). Aunque las ratas espontáneamente hipertensas se desarrollaron originalmente como un modelo animal para la hipertensión humana, se han usado recientemente como modelo de vejiga hiperactiva, mostraron hiperactividad del detrusor en el estudio urodinámico junto con micción frecuente, y por tanto se consideraron un modelo animal aprobado objetivamente para vejiga hiperactiva humana (Jin LH et al. Substantial detrusor overactivity in conscious spontaneously hypertensive rats with hyperactive behaviour. Scand J Urol Nephrol 2009; 43: 3-7). En experimentos que usan ratas espontáneamente hipertensas los más similares a síndromes de vejiga hiperactiva humana, un modelo para evaluar el aumento de los intervalos de micción después de la dosificación del fármaco es un modelo avanzado para evaluar el grado de mejora mediante diversos mecanismos en vez del efecto por uno cualquiera de los mecanismos. Por tanto, el efecto de mejora y tratamiento de los síndromes de vejiga hiperactiva mediante extractos de Piper Longum L. según la presente invención se identificó a partir de modelos de SHR.
7.1 Animales experimentales
Se adquirieron ratas SHR macho de 12 semanas de edad de SLC (Japón) y se usaron. El día y la noche se controlaron mediante un ciclo de 12 horas, y se les permitió libre acceso a alimento y agua. Después de administrar disolventes y fármacos en el ejemplo de preparación 5 a SHR de 18 semanas de edad, se llevó a cabo un experimento para medir las frecuencias de micción.
7.2 Efecto de los extractos de Piper Longum L. sobre la disminución de las frecuencias de micción
El primer día del experimento en las mismas SHR, se administró un disolvente a las mismas, y el segundo día, se administraron fármacos experimentales en el ejemplo de preparación 5.2 (extracto acuoso y el 3o % en volumen de extracto en disolución acuosa de etanol de Piper Longum L.) a 300 mg/kg. Los volúmenes de administración durante dos días fueron los mismos a kg/10 ml. En este momento, el disolvente administrado a un grupo de administración de extracto acuoso de Piper Longum L. el primer día es agua destilada (D.W.), y el disolvente administrado a un grupo de administración del 30 % en volumen de disolución acuosa de etanol de Piper Longum L. es DMSO/Cremophor al 10 % EL=1:9, vol/vol.
Los resultados de medición de las ratas a las que se les administraron disolventes se consideraron como grupos de control para indicadores de frecuencias de micción, mientras que las ratas a las que se les administraron fármacos experimentales se convirtieron en grupos experimentales. Específicamente, después de administrar los disolventes (primer día), la SHR se colocó en jaulas metabólicas, y se midieron las frecuencias de micción, el volumen de micción y el volumen de micción individual con suministro de agua solo durante 16 horas (5 PM ~ 9 AM), usando un transductor isométrico (Harvard Apparatus) y MP150 (modelo de sistemas BIOPAC n.° MP150CE), y el resultado se consideró como un valor para el grupo de control. Después de administrar los fármacos experimentales del ejemplo de preparación 5.2 (segundo día) (extracto acuoso y el 30 % en volumen de extracto en disolución acuosa de etanol de Piper Longum L.) a SHR donde se administró el disolvente el primer día, la SHR se colocó en jaulas metabólicas, y se midieron las frecuencias de micción, el volumen de micción y el volumen de micción individual con suministro de agua solo durante 16 horas (5 PM ~ 9 AM), usando un transductor isométrico (Harvard Apparatus) y MP150 (modelo de sistemas BIOPAC n.° MP150CE), y el resultado se consideró como un valor para los grupos experimentales. Los datos de frecuencias de micción durante 16 horas después de administrar los disolventes (primer día) y los fármacos experimentales (segundo día) se compararon y se calcularon estadísticamente (prueba de la t de Student apareada).
Los resultados se representaron en la tabla 13 y la figura 4 a continuación.
[Tabla 13]
Figure imgf000021_0001
Como puede observarse a partir de la tabla 13 anterior y la figura 4, el extracto acuoso de Piper Longum L. y el 30 % en volumen de extracto en disolución acuosa de etanol de Piper Longum L. revelaron efectos de mejora significativa sobre las frecuencias de micción, que son un parámetro relacionado con la micción frecuente desarrollada en la vejiga hiperactiva, en relación con el grupo de control de disolvente. Específicamente, el 30 % en volumen de disolución acuosa de extracto etanólico de PiperLongum L. también aumentó significativamente el volumen de micción individual relacionado con la función de almacenamiento de la vejiga y, por tanto, se identificó que tenía un mejor efecto de mejora sobre los síntomas de vejiga hiperactiva que el extracto acuoso de Piper Longum L.
Ejemplo 8: Efecto de extractos de Piper Longum L. por medio de estudio urodinámico en SHR sin anestesia
8.1 Animales experimentales
Se adquirieron SHR macho de 12 ~ 18 semanas de edad de Charles River (Japón) y se usaron. El día y la noche se controlaron mediante un ciclo de 12 horas, y se les permitió libre acceso a alimento y agua. Todas las ratas tenían que orinar en 3-5 ciclos bajo una condición sin administración. Los parámetros de micción de ratas bajo una condición sin administración se consideraron como grupos de control para los parámetros urodinámicos, mientras que las ratas a las que se les administró directamente el extracto acuoso de frutos de Piper Longum L. preparado en el ejemplo de preparación 4.2 en el tracto gastrointestinal a 300 mg/kg por medio de catéteres acoplados a los estómagos se convirtieron en grupos experimentales. Como grupo de control positivo, se usaron ratas a las que se les administró tolterodina a 1 mg/kg. Los grupos de dosificación de extracto acuoso de Piper Longum L. y tolterodina se establecieron cada uno por 6 ratas.
8.2. Efecto de mejora de los parámetros urodinámicos por extractos de Piper Longum L.
Para medir la presión de la vejiga, la capacidad de la vejiga, el volumen de micción y el intervalo de micción, que son parámetros para identificar la mejora de la disfunción de la micción, se llevó a cabo la inserción de un tubo vesical y un vaso para medir la presión abdominal en modelos de SHR. Para la cistometría y la inyección de una solución salina fisiológica, se realizó una incisión en una rata en el centro de su abdomen inferior 3 días antes del día de medición de los parámetros urodinámicos, y se fijó un catéter de polietileno con manguito (PE-50, Becton Dickinson, Parsippany, EE.UU.) en la cúpula de su vejiga con sutura en bolsa de tabaco. Además, se fijó un catéter de polietileno (PE-10, Becton Dickinson, Parsippany, EE.UU.) con un globo para medir la presión abdominal en la vejiga, y se fijó otro catéter de polietileno (PE-10, Becton Dickinson, Parsippany, EE.UU.) tras insertarse en el tracto gastrointestinal. Los catéteres anteriores se pasaron por debajo de la piel, y luego se fijaron sobre la piel dorsal, cuyos extremos se cerraron aplicando calor. Una rata sin anestesia que estaba libre se colocó en una jaula metabólica 3 días después de insertar un tubo vesical y un vaso para medir la presión abdominal. El tubo en la parte posterior de su cuello se acopló a una bomba de microinyección (bomba PHD22/2000; Harvard Apparatus) y un transductor de presión (transductor de presión sanguínea de calidad para investigación; Harvard Apparatus, Holliston, EE.UU.) con un tubo en T, y luego se midieron las presiones intravesicales, con inyección de una solución salina fisiológica a temperatura ambiente a una velocidad de 10 ml/hora. Esto es para medir las presiones intravesicales en la rata usando el principio de que cuando la vejiga se llena con un volumen predeterminado de solución salina fisiológica, se contrae para orinar. Se midió la presión abdominal acoplando el vaso para medir la presión abdominal al otro transductor de presión. Además, para medir el volumen de micción, que es un indicador del parámetro de volumen, se midió el volumen de micción a partir de la cantidad de orina recogida en un recipiente colector de orina (colector de fluido) acoplado a un transductor de desplazamiento de fuerza (transductor isométrico de calidad para investigación; Harvard Apparatus). El análisis de la adquisición de datos de presiones intravesicales, presiones abdominales y volúmenes de micción se observó con el sistema de adquisición de datos MP150 (sistemas BIOPAC, Goleta, EE.UU.) y el software Acq Knowledge 3.8.1.
Comenzando a medir los parámetros urodinámicos antes de la administración de los extractos de Piper Longum L. y tolterodina, se obtuvieron registros de 3 a 5 ciclos de micción estabilizados. Entonces, se administraron por vía oral los extractos de Piper Longum L. y tolterodina después de desacoplar el catéter. Los catéteres se acoplaron de nuevo a los mismos 20 minutos después de la administración oral de los fármacos, y se llevaron a cabo ciclos de micción el estudio urodinámico haciendo que la rata orinara de 3 a 5 veces. Los valores promedio de cada parámetro se midieron seleccionando los 3 ciclos continuos más representativos de los ciclos de micción medidos antes y después de la administración del fármaco.
Los valores urodinámicos en este experimento y sus definiciones son tal como sigue.
En 3 ciclos de micción repetidos, la presión basal (BP), que es un parámetro de presión intravesical, es la presión más baja en la cistometría, la presión umbral (TP) es la presión inmediatamente antes de la contracción de micción y la presión de micción (MP) significa la presión máxima de la vejiga representada en la micción. Después de la finalización de la micción, se dedujo el volumen residual colocando el catéter insertado en la vejiga en una parte más baja que la rata y midiendo el peso de la solución salina fisiológica obtenida. Se calculó la capacidad de la vejiga (BC) combinando el volumen residual y el volumen de micción (VV) medidos de la rata.
En el modelo de SHR, el intervalo de micción (MI) significa un valor obtenido determinando el intervalo de tiempo entre la presión de micción en 3 ciclos de micción y la presión de micción en el siguiente ciclo de micción y deduciendo el tiempo de medición de la orina residual a partir del intervalo de tiempo.
Los resultados se representaron en la tabla 14 y la figura 5 a continuación.
[Tabla 14]
Figure imgf000023_0001
Como puede observarse a partir de la tabla 14 anterior y la figura 5, los extractos de Piper Longum L. aumentaron el intervalo de micción (MI) en un 60,7 % en relación con el grupo de control antes de la dosificación. Esto significa que la micción frecuente, que es el síntoma más distinto de los síndromes de vejiga hiperactiva, pudo mejorarse eficazmente. También aumentaron el volumen de micción (VV) y la capacidad de la vejiga (BC) en un 60 % o más en relación con el grupo de control. A partir de los resultados anteriores, se demostró que los extractos de Piper Longum L. según la presente invención pueden mejorar notablemente el volumen de micción (VV), que es un parámetro de volumen relacionado con micción frecuente tal como se representa en la vejiga hiperactiva, la capacidad de la vejiga (BC) y el intervalo de micción (MI), y revelan un mejor efecto que la tolterodina disponible comercialmente.
Ejemplo de formulación 1: Preparación de medicamentos
1.1. Preparación de polvos
Extracto de Piper Longum L. 100 mg
Lactosa 100 mg
Talco 10 mg
Se mezclan los componentes anteriores y se llenan bolsas de polvo herméticas con los mismos para preparar polvos.
1.2. Preparación de comprimidos
Extracto de Piper Longum L. 100 mg
Almidón de maíz 100 mg
Lactosa 100 mg
Estearato de magnesio 2 mg
Se mezclan los componentes anteriores, y luego se comprimen según procesos generales de preparación de comprimidos para preparar comprimidos.
1.3. Preparación de cápsulas
Extracto de Piper Longum L. 100 mg
Almidón de maíz 100 mg
Lactosa 100 mg
Estearato de magnesio 2 mg
Según procesos generales para preparar cápsulas, se mezclan los componentes anteriores y se llenan cápsulas de gelatina con los mismos para preparar cápsulas.
1.4. Preparación de inyecciones
Extracto de Piper Longum L. 100 mg
Agua destilada estéril para inyección c.s.
Regulador del pH g.s.
Según procesos generales para preparar inyecciones, se preparan a partir de los componentes anteriores a las cantidades anteriores por ampolla (2 ml).
1.5. Preparación de formulaciones líquidas
Extracto de Piper Longum L. 100 mg
Azúcar 20 g
Azúcar isomerizada 20 g
Aroma de limón c.s.
Agua purificada para ajustarse a 1,00 ml. Según procesos generales para preparar formulaciones líquidas, se mezclan los componentes anteriores y luego se llena un vial marrón con los mismos y se esteriliza para preparar formulaciones líquidas.
Ejemplo de formulación 2: Preparación de alimentos funcionales saludables
Extracto de Piper Longum L. 100 mg
Mezcla de vitaminas c.s.
Acetato de vitamina A 70 μg
Vitamina E 1,0 mg
Vitamina B1 0,13 mg
Vitamina B20,15 mg
Vitamina B60,5 mg
Vitamina B120,2 μg
Vitamina C 10 mg
Biotina 10 μg
Amida de ácido nicotínico 1,7 mg
Ácido fólico 50 μg
Pantotenato de calcio 0,5 mg
Mezcla de minerales c.s.
Sulfato ferroso 1,75 mg
Óxido de zinc 0,82 mg
Dihidrogenofosfato de potasio 15 mg
Fosfato de dicalcio 55 mg
Citrato de potasio 90 mg
Carbonato de calcio 100 mg
Cloruro de magnesio 24,8 mg
Aunque las mezclas de vitaminas y minerales anteriores se han mezclado y compuesto de componentes relativamente adecuados para alimentos funcionales para curar como ejemplo preferido en la razón de composición anterior, puede permitirse variar opcionalmente la razón de combinación, y según procesos generales para preparar alimentos funcionales saludables en general, los componentes anteriores pueden mezclarse y luego, según métodos generales, usarse para preparar composiciones de alimentos funcionales saludables (por ejemplo, dulces nutritivos, etc.).
Ejemplo de formulación 3: Preparación de bebidas funcionales saludables
Extracto de Piper Longum L. 100 mg
Ácido cítrico 1000 mg
Oligosacárido 100 g
Extracto de ciruela 2 g
Taurina 1 g
Añadir agua purificada hasta un total de 900 mi
Según procesos generales para la preparación de bebidas funcionales saludables, los componentes anteriores se mezclan, se calientan con agitación a 85 °C durante aproximadamente 1 hora y luego la disolución resultante se filtra y se obtiene en un recipiente esterilizado de 2 L, que se sella y esteriliza, manteniéndose bajo refrigeración, y luego se usa en la preparación de composiciones de bebidas funcionales saludables según la presente invención.
Aunque se han mezclado y compuesto componentes relativamente adecuados para las bebidas favoritas como ejemplo preferido en la razón de composición anterior, puede permitirse variar opcionalmente la razón de combinación, dependiendo de la preferencia regional o racial, como demandan las clases, demandan las naciones y el uso.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Una composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de una disfunción de la micción, que comprende un principio activo, en donde dicho principio activo consiste en un extracto de Piper Longum L., en donde dicho extracto de Piper Longum L. inhibe un receptor muscarínico M3 o un receptor muscarínico M2 , y en donde dicho extracto de Piper Longum L. es un agonista de un receptor adrenérgico p3.
2. La composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de una disfunción de la micción según la reivindicación 1, en donde dicho extracto de Piper Longum L. se extrae de uno o más disolventes de extracción seleccionados del grupo que consiste en agua, alcohol, glicerina, butilenglicol, propilenglicol, acetato de metilo, acetato de etilo, acetona, benceno, hexano, dietil éter, cloroformo y diclorometano.
3. La composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de una disfunción de la micción según la reivindicación 2, en donde dicho alcohol es alcohol inferior anhidro o hidratado con de 1 a 4 átomos de carbono.
4. La composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de una disfunción de la micción según la reivindicación 3, en donde dicho alcohol inferior anhidro o hidratado es del 30 al 100 % en volumen de metanol o etanol.
5. La composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de una disfunción de la micción según la reivindicación 1, en donde dicho extracto de Piper Longum L. aumenta el intervalo de micción.
6. La composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de una disfunción de la micción según la reivindicación 1, en donde dicho extracto de Piper Longum L. disminuye la presión de micción y aumenta el volumen de la vejiga.
7. La composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de una disfunción de la micción según la reivindicación 1, en donde dicho extracto de Piper Longum L. induce la inhibición de la contracción del detrusor y la relajación del detrusor.
8. La composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de una disfunción de la micción según la reivindicación 1, en donde dicha disfunción de la micción es una o más seleccionadas del grupo que consiste en síndromes de vejiga hiperactiva, incontinencia de urgencia, orina de urgencia, micción frecuente, nicturia y cistitis intersticial.
9. Un alimento funcional saludable para su uso en la prevención o la mejora de una disfunción de la micción, que comprende un principio activo, en donde dicho principio activo consiste en un extracto de Piper Longum L., en donde dicho extracto de Piper Longum L. inhibe un receptor muscarínico M3 o un receptor muscarínico M2 , y en donde dicho extracto de Piper Longum L. es un agonista de un receptor adrenérgico p3.
10. El alimento funcional saludable para su uso en la prevención o la mejora de una disfunción de la micción según la reivindicación 9, en donde dicha disfunción de la micción es una o más seleccionadas del grupo que consiste en síndromes de vejiga hiperactiva, incontinencia de urgencia, orina de urgencia, micción frecuente, nicturia y cistitis intersticial.
11. La composición farmacéutica para su uso en la prevención o el tratamiento de una disfunción de la micción según la reivindicación 1, en donde dicho extracto de Piper Longum L. es un extracto soluble en disolvente polar o un extracto soluble en disolvente no polar.
12. El alimento funcional saludable para su uso en la prevención o la mejora de una disfunción de la micción según la reivindicación 9, en donde dicho extracto de Piper Longum L. es un extracto soluble en disolvente polar o un extracto soluble en disolvente no polar.
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