ES2946415T3 - Mini-GDE para el tratamiento de la enfermedad de almacenamiento de glucógeno III - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a un mini-GDE para el tratamiento de la enfermedad por almacenamiento de glucógeno III. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Mini-GDE para el tratamiento de la enfermedad de almacenamiento de glucógeno III
La presente invención se refiere al tratamiento de la enfermedad de almacenamiento de glucógeno III (EAGIII).
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las mutaciones en el gen AGL provocan una deficiencia genética de la enzima desramificadora de glucógeno (GDE) o "amilo-alfa-1,6-glucosidasa, 4-alfa-glucanotransferasa", una enzima implicada en la degradación del glucógeno. La GDE tiene dos actividades catalíticas independientes que ocurren en diferentes sitios de la proteína: una actividad de 4-alfa-glucotransferasa y una actividad de amilo-1,6-glucosidasa. La deficiencia genética de GDE provoca una glucogenólisis incompleta en la enfermedad de almacenamiento de glucógeno III (EAGIII), lo que da como resultado la acumulación de glucógeno anormal con una cadena externa corta en diversos órganos, principalmente hígado y músculo. La enfermedad se caracteriza por hepatomegalia, hipoglucemia, baja estatura, miopatía variable y cardiomiopatía. La mayoría de los pacientes tienen enfermedades que implican tanto al hígado como al músculo (tipo IIIa), mientras que algunos pacientes (~15 por ciento) solo tienen implicación hepática (tipo IIIb). Los síntomas hepáticos normalmente ocurren en la infancia. En algunos casos se han notificado cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular (Chen et al., 2009, Scriver’s Online Metabolic & Molecular Bases of Inherited Disease, Nueva York: McGraw-Hill; Kishnani et al., 2010, Genet Med 12, 446-463). Podría estar presente debilidad muscular durante la infancia. Se vuelve más prevalente en adultos con inicio en la tercera o cuarta década. Existe una morbilidad significativa por la debilidad muscular progresiva y los pacientes en etapas posteriores pueden quedarse en silla de ruedas. Los pacientes también pueden desarrollar cardiomiopatía. Existe una variabilidad clínica significativa en la gravedad de los síntomas que desarrollan estos pacientes. La miopatía progresiva y/o la miocardiopatía y/o la neuropatía periférica son causas importantes de morbilidad en adultos (Kishnani et al., 2010, Genet Med 12, 446-463; Cornelio et al., 1984, Arch Neurol 41, 1027-1032; Coleman et al., 1992, Ann Intern Med 116, 896-900). Los informes de posibles manifestaciones neurológicas asociadas con la enfermedad provienen de médicos que trabajan con pacientes de EAGIII, quienes informaron de fluctuaciones de atención, deficiencias en las funciones ejecutivas y deterioro de las habilidades emocionales (Michon et al., 2015, J Inherit Metab Dis, 38(3): 573-580). Por consiguiente, en el modelo de ratón GDE-/- de la enfermedad, se documentó una gran acumulación de glucógeno en todo el sistema nervioso (Pagliarani et al., 2014, Biochim Biophys Acta, 1842(11): 2318-2328; Liu et al., 2014, Mol Genet Metab, 111(4): 467-476) aunque aún falta una caracterización cuidadosa del fenotipo asociado a la acumulación de glucógeno. El tratamiento actual es sintomático y no existe una terapia eficaz para la enfermedad. La hipoglucemia se puede controlar con comidas frecuentes ricas en carbohidratos con suplementos de almidón de maíz o alimentación por goteo gástrico nocturno. Los pacientes con miopatía han sido tratados con una dieta rica en proteínas durante el día más una infusión enteral durante la noche. En algunos pacientes se ha documentado una mejoría transitoria de los síntomas, pero no hay estudios sistémicos o datos a largo plazo que demuestren que la dieta rica en proteínas previene o trata la miopatía progresiva (Kishnani et al., 2010, Genet Med 12, 446-463). Estos enfoques hacen poco por alterar el curso a largo plazo y la morbilidad de estas enfermedades. Vidal P et al., "Rescue of GSDIII phenotype with gene transfer requires liver- and muscle-targeted GDE expression", Molecular Therapy, vol. 26, n.° 3, doi:10.1016/j.ymthe.2017.12.019, diciembre de 2017, describe la terapia génica en un modelo de ratón de la enfermedad de almacenamiento de glucógeno III (enfermedad de Fabri Cori). La terapia génica con GDE expresada en hígado en un sistema de vector dual tenía un impacto directo en el metabolismo de la glucosa. Prueba de concepto de que la EAGIII se puede corregir con vectores AAV, pero no divulga mejoras de la terapia de vectores usando GDE acortada. Baodong S et al., "Preclinical development of new therapy for glycogen storage diseases", Curr Gen Therapy, vol.15, n.° 4, págs. 338-347, 15 de julio de 2015, es una revisión sobre las opciones de tratamiento de las enfermedades de almacenamiento de glucógeno, entre ellas la AEGIII. Se discute la posibilidad de la terapia génica, se menciona la opción de la terapia basada en AAV de vector dual, pero no hay ninguna sugerencia para acortar la GDE y usar solo un vector. Más bien se sugiere como alternativa a la terapia de vector dual la administración de pequeñas moléculas que penetran en el hígado y el músculo e inhiben allí la síntesis de glucógeno.
Por lo tanto, todavía existe la necesidad de un tratamiento a largo plazo de AEGIII. La terapia génica destinada a reemplazar de manera estable la proteína GDE en los tejidos afectados aparece como un enfoque terapéutico potencial. Sin embargo, el gran tamaño del transgén de GDE constituye un gran impedimento ya que no puede ajustarse al límite de tamaño de la mayoría de los vectores de terapia génica. De hecho, el gen AGL humano tiene una longitud de 85 kb y está compuesto por 35 exones, codificando un ARNm de 7,4 kb que incluye una región codificante de 4596 pb y una secuencia no traducida 3' de 2371 pb para expresar una proteína GDE de 175 kDa (Bao Y et al., 1996, Genomics., 38(2):155-65). Esto constituye un verdadero problema ya que el tamaño mínimo de un módulo de expresión de GDE (que incluye, por ejemplo, al menos un promotor, la secuencia codificante de GDE, una señal poliA y las dos ITR para un vector AAV) sería superior a 5 kb, el tamaño del genoma límite que se puede empaquetar en un vector de terapia génica AAV para el suministro de genes in vivo. Los inventores han propuesto previamente el uso de vectores AAV duales para superar esta limitación de tamaño. (Vidal P et al., "Adeno-associated vector-based gene therapy strategy for type glycogen storage disease", Neuromuscular disorders, vol. 27, doi:10.1016/J.NMD.2017.06.544, 1 de mayo de 2017).
Siguiendo este enfoque, se usan dos vectores, cada uno de los cuales contiene una parte de la secuencia codificante del transgén grande, para transducir la misma célula. Aunque el uso de vectores AAV duales es prometedor, sería preferible proporcionar una estrategia de terapia génica que implemente solo un vector vírico por razones tanto económicas como prácticas.
Por lo tanto, existe la necesidad de nuevas estrategias para mejorar la terapia génica en el tratamiento de EAGIII.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Un primer aspecto de la invención se refiere a un polipéptido de GDE humano truncado funcional, que tiene deleciones de al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 100, 125, 150, 175, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 o al menos aproximadamente 525 aminoácidos con respecto a una secuencia de GDE humana de longitud completa de referencia. En una realización particular, la secuencia de GDE humana de longitud completa de referencia tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40 o SEQ ID NO: 41.
En realizaciones particulares:
(i) la secuencia de GDE humana de longitud completa de referencia tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 1, y dicho polipéptido de GDE humano truncado comprende al menos los residuos de aminoácidos en las posiciones 429-666, 770-892, 1088- 1194 y 1235-1532 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
(ii) la secuencia de GDE humana de longitud completa de referencia tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 40, y dicho polipéptido de GDE humano truncado comprende al menos los residuos de aminoácidos en las posiciones 412-649, 753-875, 1071- 1177, 1218-1515 con respecto a la SEQ ID NO: 40; o
(iii) la secuencia de GDE humana de longitud completa de referencia tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 41, y dicho polipéptido de GDE humano truncado comprende al menos los residuos de aminoácidos en las posiciones 413-650, 754-876, 1072- 1178, 1219-1516 con respecto a la SEQ ID NO: 41.
En otras realizaciones:
(i) la secuencia de GDE humana de longitud completa de referencia tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 1, y los aminoácidos eliminados son al menos un aminoácido en las posiciones 1 -428, 668-769, 895-1087 y /o 1195-1232 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
(ii) la secuencia de GDE humana de longitud completa de referencia tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 40, y los aminoácidos eliminados son al menos un aminoácido en las posiciones 1-411,651 -752, 878-1070 y /o 1178-1215 con respecto a la SEQ ID NO: 40; o
(iii) la secuencia de GDE humana de longitud completa de referencia tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 41, y los aminoácidos eliminados son al menos un aminoácido en las posiciones 1 -412, 652-753, 879-1071 y /o 1179-1216 con respecto a la SEQ ID NO: 41.
En otras realizaciones más:
(i) la secuencia de GDE humana de longitud completa de referencia tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 1, y en dicho polipéptido de GDE humano truncado se elimina:
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 428 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o al menos 400 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 428 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 668 a 769 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 10, 15, 20, 30, 40, 50, 80 o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 668 a 769 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 895 a 1087 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 10, 15, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 125, 150, 175, o al menos 200 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 895 a 1087 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1195 a 1232 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 10, 15, 20 o al menos 30 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1195 a 1232 con respecto a la SEQ ID NO: 1; o (ii) la secuencia de GDE humana de longitud completa de referencia tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 40, y en dicho polipéptido de GDE humano truncado se elimina:
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 411 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o al menos 400 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 411 con respecto a la SEQ ID NO: 40; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 651-752 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 10, 15, 20, 30, 40, 50, 80 o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 651-752 con respecto a la SEQ ID NO: 40; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 878-1070 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 10, 15, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 125, 150, 175, o al menos 200 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 878-1070 con respecto a la SEQ ID NO: 40; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1178-1215 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 10, 15, 20 o al menos 30 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1178-1215 con respecto a la SEQ ID NO: 40; o (iii) la secuencia de GDE humana de longitud completa de referencia tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 41, y en dicho polipéptido de GDE humano truncado se elimina:
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 412 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o al menos 400 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 412 con respecto a la SEQ ID NO: 41; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 652-753 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 10, 15, 20, 30, 40, 50, 80 o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 652-753 con respecto a la SEQ ID NO: 41; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 879-1071 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 10, 15, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 125, 150, 175, o al menos 200 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 879-1071 con respecto a la SEQ ID NO: 41; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1179-1216 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 10, 15, 20 o al menos 30 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1179-1216 con respecto a la SEQ ID NO: 41. En realizaciones adicionales:
(i) la secuencia de GDE humana de longitud completa de referencia tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 1 y el polipéptido de GDE humano truncado funcional comprende al menos una deleción con respecto a la SEQ ID NO: 1, en la que la deleción se selecciona del grupo que consiste en:
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 156 con respecto a la SEQ ID NO: 1; - deleción de aminoácidos desde la posición 361 a la 428 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- deleción de aminoácidos desde la posición 668 a la 769 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- deleción de aminoácidos desde la posición 895 a la 1087 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1195 a la 1232 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- deleción de aminoácidos desde la posición 223 a la 320 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- deleción de aminoácidos desde la posición 360 a la 428 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- deleción de aminoácidos desde la posición 669 a la 720 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 280 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 425 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 230 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 15 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 30 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 81 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 103 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 129 con respecto a la SEQ ID NO: 1; o
(ii) la secuencia de GDE humana de longitud completa de referencia tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 40 y el polipéptido de GDE humano truncado funcional comprende al menos una deleción con respecto a la SEQ ID NO: 40, en la que la deleción se selecciona del grupo que consiste en:
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 139 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 344 a la 411 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 651 a la 752 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 878 a la 1070 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1178 a la 1215 con respecto a la SEQ ID NO: 40; - deleción de aminoácidos desde la posición 206 a la 303 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 343 a la 411 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 652 a la 703 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 263 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 408 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 213 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 13 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 64 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 86 con respecto a la SEQ ID NO: 40; y
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 112 con respecto a la SEQ ID NO: 40; o (iii) la secuencia de GDE humana de longitud completa de referencia tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 41 y el polipéptido de GDE humano funcional truncado comprende al menos una deleción con respecto a la SEQ ID NO: 41, en la que la deleción se selecciona del grupo que consiste en:
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 140 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- deleción de aminoácidos desde la posición 345 a la 412 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- deleción de aminoácidos desde la posición 652 a la 753 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- deleción de aminoácidos desde la posición 879 a la 1071 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1179 a la 1216 con respecto a la SEQ ID NO: 41; - deleción de aminoácidos desde la posición 207 a la 304 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- deleción de aminoácidos desde la posición 344 a la 412 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- deleción de aminoácidos desde la posición 653 a la 704 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 264 con respecto a la SEQ ID NO: 41; - deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 409 con respecto a la SEQ ID NO: 41; - deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 214 con respecto a la SEQ ID NO: 41; - deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 14 con respecto a la SEQ ID NO: 41; - deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 65 con respecto a la SEQ ID NO: 41; - deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 87 con respecto a la SEQ ID NO: 41; y - deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 113 con respecto a la SEQ ID NO: 41. En realizaciones particulares adicionales:
(i) la secuencia de GDE humana de longitud completa de referencia tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 1 y el polipéptido de GDE humano truncado funcional comprende al menos una deleción con respecto a la SEQ ID NO: 1, en la que la deleción se selecciona del grupo que consiste en:
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 156 con respecto a la SEQ ID NO: 1; - deleción de aminoácidos desde la posición 361 a la 428 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- deleción de aminoácidos desde la posición 668 a la 769 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- deleción de aminoácidos desde la posición 895 a la 1087 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1195 a la 1232 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- deleción de aminoácidos desde la posición 223 a la 320 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- deleción de aminoácidos desde la posición 360 a la 428 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- deleción de aminoácidos desde la posición 669 a la 720 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 280 con respecto a la SEQ ID NO: 1; - deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 425 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y - deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 230 con respecto a la SEQ ID NO: 1; o (ii) la secuencia de GDE humana de longitud completa de referencia tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 40 y el polipéptido de GDE humano truncado funcional comprende al menos una deleción con respecto a la SEQ ID NO: 40, en la que la deleción se selecciona del grupo que consiste en:
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 139 con respecto a la SEQ ID NO: 40; - deleción de aminoácidos desde la posición 344 a la 411 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 651 a la 752 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 878 a la 1070 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1178 a la 1215 con respecto a la SEQ ID NO: 40; - deleción de aminoácidos desde la posición 206 a la 303 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 343 a la 411 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 652 a la 703 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 263 con respecto a la SEQ ID NO: 40; - deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 408 con respecto a la SEQ ID NO: 40; y - deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 213 con respecto a la SEQ ID NO: 40; o (iii) la secuencia de GDE humana de longitud completa de referencia tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 41 y el polipéptido de GDE humano funcional truncado comprende al menos una deleción con respecto a la SEQ ID NO: 41, en la que la deleción se selecciona del grupo que consiste en:
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 140 con respecto a la SEQ ID NO: 41; - deleción de aminoácidos desde la posición 345 a la 412 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- deleción de aminoácidos desde la posición 652 a la 753 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- deleción de aminoácidos desde la posición 879 a la 1071 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1179 a la 1216 con respecto a la SEQ ID NO: 41; - deleción de aminoácidos desde la posición 207 a la 304 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- deleción de aminoácidos desde la posición 344 a la 412 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- deleción de aminoácidos desde la posición 653 a la 704 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 264 con respecto a la SEQ ID NO: 41; - deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 409 con respecto a la SEQ ID NO: 41; y - deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 214 con respecto a la SEQ ID NO: 41. En otra realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención comprende una deleción o una combinación de deleciones como se muestra en la tabla 2 a continuación. En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional comprende:
(i) una deleción o una combinación de deleciones, como se muestra en la tabla 2 a continuación, y
(ii) una deleción o una combinación de deleciones, como se muestra en la tabla 3 a continuación.
Tales polipéptidos de GDE humanos truncados funcionales incluyen, sin limitación, aquellos que tienen una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 2-10 y SEQ ID NO: 48-52, en particular de las SeQ ID NO: 2-6. En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención tiene una secuencia que comprende o consiste en la secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 2, 5 o 6. En una realización particular adicional, el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención tiene una secuencia que comprende o consiste en la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 5.
En otro aspecto, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de GDE humano truncado funcional divulgado en el presente documento.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un constructo de ácido nucleico que comprende, preferiblemente en este orden:
- un promotor;
- opcionalmente, un intrón;
- la molécula de ácido nucleico divulgada en el presente documento, que codifica el polipéptido humano truncado funcional de la invención; y
- una señal de poliadenilación.
En otro aspecto más, la invención se refiere a un vector que comprende:
- la molécula de ácido nucleico de la invención; o
- el constructo de ácido nucleico de la invención.
En ciertas realizaciones, el vector puede ser un vector vírico.
Según un aspecto adicional, la invención se refiere a un vector vírico que comprende un constructo de ácido nucleico que codifica un polipéptido de GDE no humano funcional, en el que el polipéptido de GDE no humano funcional comprende menos de aproximadamente 1500 aminoácidos. El polipéptido de GDE no humano funcional se puede seleccionar, sin limitación, del grupo que consiste en: polipéptido de GDE de caballo de SEQ ID NO: 11, polipéptido de GDE de gorila de SEQ ID NO: 12, polipéptido de GdE de orangután de SEQ ID NO: 13, polipéptido de GdE de Pteropus alecto de SEQ ID NO: 14, polipéptido de GDE de mangabey gris de SEQ ID NO: 15, polipéptido de GDE de ornitorrinco de SEQ ID NO: 16 y polipéptido de GDE de pato de SEQ ID NO: 17. En una realización particular, el polipéptido de GDE no humano funcional es el polipéptido de GDE de gorila de SEQ ID NO: 12.
En realizaciones particulares de los vectores de la invención, dichos vectores pueden ser vectores AAV o vectores retrovíricos, tales como vectores lentivíricos. En una realización particular, el vector es un vector AAV, tal como un vector AAV autocomplementario monocatenario o bicatenario, preferiblemente un vector AAV con una cápside derivada de AAV, tal como AAV1, AAV2, AAV2 variante, AAV3, AAV3 variante, AAV3B, AAV3B variante, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6 variante, AAV7, AAV8, aAv9, AAV9P1, AaV10 tal como AAVcy10 y AAVrh10, AAVrh74, AAVdj, AAV-Anc80, AAV-LK03, AAV2i8 y AAV porcino, tal como la cápside de AAVpo4 y AAVpo6 o con una cápside quimérica. En una realización particular, el vector AAV tiene una cápside de AAV9, AAV9P1 o AAV6.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a una célula aislada transformada con la molécula de ácido nucleico, el constructo de ácido nucleico o el vector de la invención. La célula puede ser, por ejemplo, una célula hepática, una célula muscular, una célula cardiaca o una célula del SNC.
Aún en otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende, en un portador farmacéuticamente aceptable, el polipéptido de GDE humano truncado funcional, la molécula de ácido nucleico, el constructo de ácido nucleico, el vector o la célula de la invención.
La invención también se refiere, en un aspecto particular, al polipéptido de GDE humano truncado funcional, el polipéptido de GDE no humano funcional, la molécula de ácido nucleico, el constructo de ácido nucleico, el vector o la célula de la invención, para usar como un medicamento.
En un aspecto adicional, la invención se refiere al polipéptido de GDE humano truncado funcional, el polipéptido de GDE no humano funcional, la molécula de ácido nucleico, el constructo de ácido nucleico, el vector o la célula de la invención, para usar en un método para el tratamiento de EAGIII (enfermedad de Cori).
La presente invención también se refiere al polipéptido de GDE de gorila de SEQ ID NO: 12, para uso en un método para tratar la EAGIII (enfermedad de Cori).
LEYENDAS DE LAS FIGURAS
Figura 1. Tamaño reducido de secuencias de GDE de mamíferos no humanos. Se informa del tamaño, expresado como número de aminoácidos, de diferentes proteínas GDE de mamíferos (paGDE: secuencia de GDE de Pteropus alecto, oGDE: secuencia de GDE de orangután, gGDE: secuencia de GDE de gorila, hoGDE: secuencia de GDE de caballo, hGDE: secuencia de GDE de isoforma 1 humana).
Figura 2. Representación esquemática de los diferentes truncamientos en la secuencia de GDE humana. Se informa de tres truncamientos de GDE humana diferentes, A1, A2-3 y A4.
Figura 3. Expresión de la proteína gGDE. A ratones con desactivación génica (KO) de GDE se les inyectó 1 x 1012 gv/ratón de un solo vector AAV9 que expresa GDE de gorila (gGDE). Tres meses después de la inyección del vector, se sacrificaron los animales y se detectó GDE mediante transferencia Western en el corazón. Se usaron animales de tipo silvestre (WT) y GDE-KO como controles positivos y negativos, respectivamente.
Figura 4. El vector AAV9-gGDE retira eficazmente el glucógeno del cuádriceps. A ratones con desactivación génica (KO) de GDE se les inyectó 1 x 1012 gv/ratón de un solo vector AAV9 que expresa GDE de gorila (AAV9-gGDE) o 2 x 1012 gv/ratón de vectores AAV9 duales que expresan GDE humana (AAV9-GDEov). Tres meses después de la inyección del vector, los animales fueron sacrificados y se midió la acumulación de glucógeno en los cuádriceps. Paralelamente, se midió el glucógeno en animales de tipo silvestre (WT) y con desactivación génica (KO) de GDE de la misma edad. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA (***= p< 0,001, ****= p<0,0001, ns = no significativo).
Figura 5. El vector AAV9-gGDE recupera la función muscular en ratones con EAGIII. A ratones con desactivación génica (KO) de GDE se les inyectó 1 x 1012 gv/ratón de un solo vector AAV9 que expresa GDE de gorila (AAV9-gGDE) o 2 x 1012 gv/ratón de vectores AAV9 duales que expresan GDE humana (AAV9-GDEov). Tres meses después de la inyección del vector, se puntuó la función muscular mediante la prueba de suspensión de alambre. En el gráfico se muestran los rendimientos de suspensión de alambre medidos en animales de tipo silvestre (WT) y con desactivación génica (KO) de GDE de la misma edad. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA (****= p< 0,0001, ns = no significativo).
Figura 6. Medición de la actividad de GDE truncadas in vitro. Se transfectaron células Huh-7 con plásmidos que expresan GDE humana de tamaño completo (hGDE), una GDE humana truncada (GDE A4) o GDE de gorila (gGDE) bajo el control de un promotor de CMV. En paralelo, las células se transfectaron con un plásmido que expresa GFP como control. 48 horas después de la transfección, se prepararon extractos citosólicos y se midió la actividad de GDE. En el histograma se muestran los niveles de actividad de GDE expresados como glucosa liberada por la digestión de dextrina limitada. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA (*= p< 0,05 frente a CMV-hGDE).
Figura 7. Las GDE truncadas se producen in vivo. Se inyectaron en los músculos tibiales anteriores (TA) de ratones con desactivación génica de GDE 1 x 1011 gv/ratón de un vector AAV9 que expresa una GDE humana truncada (AAV9-A1-GDE) o una GDE de gorila (AAV9-gGDE) o 2x10” gv/ratón de vectores AAV9 duales que expresan GDE humana de tamaño completo (AAV9-GDEov). 15 días después de la inyección, se obtuvieron los TA y se procesaron para analizar la expresión de GDE por transferencia Western. Se usó actina como control de carga.
Figura 8. Las GDE truncadas son activas in vivo. Se inyectaron en los músculos tibiales anteriores (TA) de ratones con desactivación génica de GDE 1 x 1011 gv/ratón de un vector AAV9 que expresa GDE humanas truncadas (AAV9-A1-GDE, AAV9-A4-GDE, AAV9-A2/3-GDE) derivadas de una secuencia de codificación de GDE humana de tipo silvestre (wt) o con codones optimizados (co). En paralelo, a los ratones se les inyectó 1 x 1011 gv/ratón de un vector AAV9 que expresa GDE de gorila con codones optimizados (AAV9-gGDEco) o PBS como control. 15 días después de la inyección, se obtuvieron los TA y se procesaron para analizar la actividad de GDE.
Figura 9. Las GDE truncadas se producen in vitro. Se transfectaron células HEK293T con plásmidos que expresan GDE de tamaño completo (GDEfs) o 5 GDE humanas truncadas (A9 A2/3; A10 A2/3; A11 A2/3; A12 A2/3; A13 A2/3). Las células transfectadas con GFP se usaron como control. 3 días después de la transfección, las células se recolectaron y procesaron para analizar la expresión de GDE por transferencia Western.
Figura 10. Las GDE truncadas se producen in vivo. Se inyectaron en los músculos tibiales anteriores (TA) de ratones con desactivación génica de GDE 2 x 1011 gv/ratón de un vector AAV9 que expresa GDE de tamaño completo (GDEfs) o 7 GDE humanas truncadas (A2/3; A9 A2/3; A10 A2/3; A13 A2/3; y A1). 15 días después de la inyección, se obtuvieron los TA y se procesaron para analizar la expresión de GDE por transferencia Western.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Como se usa en el presente documento con respecto a los valores o intervalos divulgados, el término "aproximadamente" indica que el valor numérico establecido permite una ligera imprecisión, por ejemplo, razonablemente cerca del valor o casi, tal como más o menos 10 %, en particular tal como más o menos 5%, de los valores o intervalos establecidos.
A pesar de la falta de conocimiento sobre la estructura tridimensional de la proteína GDE, los presentes inventores han identificado polipéptidos de GDE cuyas secuencias de codificación son lo suficientemente pequeñas como para empaquetarse en un vector de terapia génica, conservando al mismo tiempo la funcionalidad de GDE, también denominada "minipolipéptidos de GDE".
Por "vector de terapia génica" se entiende cualquier vector adecuado para la terapia génica. En particular, el vector de terapia génica puede ser un plásmido o un virus recombinante tal como un vector vírico derivado de un retrovirus o un lentivirus. Preferiblemente, el vector vírico es un vector AAV, tal como un vector AAV adecuado para transducir tejidos hepáticos o células musculares. La amplia experiencia en ensayos clínicos y en modelos preclínicos de enfermedades musculares indica que el virus adenoasociado (AAV) es el vector de elección para la terapia génica in vivo para EAGIII. Estos vectores transducen eficazmente el hígado y el músculo, su producción es escalable y, en comparación con otros vectores de terapia génica, tienen un perfil de inmunogenicidad relativamente bajo. Sin embargo, una de las mayores limitaciones en el uso de AAV para el reemplazo de genes es su límite de tamaño de encapsidación limitado (aproximadamente 5 kb). De hecho, durante la producción de AAV recombinante, los genomas de más de 5 kb se encapsidan con baja eficacia y el AAV resultante puede contener genomas fragmentados que reducen la eficacia de la transferencia génica.
Como se explicará en detalle a continuación, en el contexto de la presente invención, la expresión "minipolipéptido de GDE" abarca (i) polipéptidos de GDE humanos truncados funcionales o (ii) polipéptidos de GDE no humanos funcionales.
Un primer aspecto de la presente invención es, por tanto, un minipolipéptido de GDE funcional cuya secuencia codificante es lo suficientemente pequeña para empaquetarse eficazmente en un solo vector AAV.
Por polipéptido de GDE "funcional" se entiende un polipéptido que retiene, al menos en parte, al menos una de las actividades enzimáticas de la proteína GDE, preferiblemente todas las actividades enzimáticas de la proteína GDE. Como consecuencia, el polipéptido de GDE funcional implementado en la presente invención es capaz de recuperar la acumulación de glucógeno y la fuerza muscular in vivo. Como se ha definido anteriormente, las actividades enzimáticas de GDE son una actividad 4-alfa-glucotransferasa y una actividad amilo-1,6-glucosidasa, implicadas en la degradación del glucógeno. La actividad transferasa de GDE traslada tres unidades de glucosa de glucógeno de una cadena a otra. Esto deja una unidad de glucosa en el punto de ramificación, que posteriormente se libera como glucosa por la actividad glucosidasa. En una realización particular, el minipolipéptido de GDE funcional de la invención tiene la misma funcionalidad que un polipéptido de GDE de longitud completa, en particular como un polipéptido de GDE humano de longitud completa. Por ejemplo, un minipolipéptido de GDE funcional de la invención puede tener una actividad de al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o al menos 99 % en relación con una, preferiblemente ambas, actividades enzimáticas descritas anteriormente, o al menos el 100 %, en comparación con una proteína GDE humana de longitud completa, en particular la proteína GDE humana de longitud completa de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40 o SEQ ID NO: 41. La actividad de la miniproteína GDE de la invención puede ser incluso superior al 100 %, tal como superior al 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 200 %, 500 %, 700 %, o incluso más del 1000 % de la actividad de una proteína GDE humana de longitud completa, en particular la proteína GDE humana de longitud completa de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40 o SEQ ID NO: 41.
Un experto en la materia puede determinar fácilmente si un polipéptido es un polipéptido de GDE funcional. Los métodos adecuados serán evidentes para los expertos en la materia. Por ejemplo, un método in vitro adecuado implica insertar un ácido nucleico que codifica un polipéptido en un vector, tal como un plásmido o vector vírico, transfectar o transducir células hospedadoras, tales como células 293T o HeLa, u otras células tales como Huh7, con el vector, y ensayar la actividad de GDE. Los métodos adecuados se describen con más detalle en la parte experimental a continuación. Por ejemplo, la actividad de GDE puede determinarse midiendo la glucosa producida después de incubar tejidos de ratón homogeneizados con dextrina límite. Otros métodos incluyen ensayar la actividad de GDE determinando la expresión de GDE en tejidos de un animal GDE KO, tal como por transferencia Western, siguiendo la glucosa producida a partir del glucógeno digerido con glucógeno fosforilasa, evaluando la fuerza muscular de los animales GDE-KO tratados por suspensión de alambre después de la administración de los vectores, tal como después de uno, dos o tres meses después de la administración, o evaluando la recuperación de la acumulación de glucógeno en tejido muscular y/o cardíaco.
En una primera variante del primer aspecto de la invención, el minipolipéptido de GDE es un polipéptido de GDE humano truncado funcional, que está truncado con respecto a una secuencia de GDE humana de longitud completa de referencia.
El término "polipéptido de GDE humano truncado" abarca cualquier polipéptido de GDE humano que se vuelve más corto por deleción de aminoácidos, con respecto a una secuencia de GDE humana de longitud completa de referencia de la que se deriva la GDE humana truncada. En particular, en el polipéptido de GDE humano truncado funcional se elimina al menos 1 aminoácido con respecto a una secuencia de GDE humana de longitud completa de referencia. Preferiblemente, en el polipéptido de GDE humano truncado funcional se eliminan al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 100, 125, 150, 175, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 o al menos aproximadamente 525 aminoácidos con respecto a una secuencia de GDE humana de longitud completa de referencia. En una realización preferida, en el polipéptido de GDE humano truncado funcional se eliminan al menos aproximadamente 50, 100 o 150 aminoácidos con respecto a una secuencia de GDE humana de longitud completa de referencia.
En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional que está truncado con respecto a una secuencia de GDE humana de longitud completa de referencia puede comprender una o más modificaciones de aminoácidos adicionales con respecto a dicha secuencia de GDE humana de longitud completa de referencia. En particular, además de la deleción o deleciones que se describen más adelante, el polipéptido de GDE humano truncado funcional puede comprender una o más modificaciones de aminoácidos tales como inserción, deleción y/o sustitución de aminoácidos en comparación con la secuencia de GDE humana de longitud completa de referencia. Por ejemplo, el polipéptido de GDE humano truncado funcional puede comprender de 1 a 10 (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) modificaciones de aminoácidos adicionales, en particular de 1 a 5 (por ejemplo, 1, 2, 3, 4 o 5) modificaciones de aminoácidos adicionales, siempre que se conserve la funcionalidad del polipéptido de GDE humano truncado. En una realización particular, cuando el polipéptido de GDE humano truncado funcional comprende una deleción N-terminal, se puede añadir una metionina en el extremo N-terminal.
En el contexto de la presente invención, "una secuencia de GDE humana de longitud completa de referencia" abarca todas las isoformas nativas de GDE humana. Bao y colegas (Genomics, 1997, 38, 155-165) identificaron la presencia de seis variantes de transcripción que codifican tres isoformas de proteína GDE. Las variantes de transcripción 1-4 codifican la misma proteína, a saber, la isoforma 1 de GDE. Las variantes de transcripción 5 y 6 codifican las isoformas 2 y 3 de GDE, respectivamente.
El término "polipéptido de GDE humano de longitud completa de referencia" abarca por tanto todas las ¡soformas nativas de GDE humana, incluida la forma precursora, así como las proteínas GDE modificadas o mutadas por inserción o inserciones, deleción o deleciones y/o sustitución o sustituciones o fragmentos de las mismas que son derivados funcionales de GDE. En particular, la secuencia de GDE humana de longitud completa de referencia se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 (correspondiente a la isoforma 1 de GDE), SEQ ID NO: 40 (correspondiente a la isoforma 2 de GDE) y SEQ ID NO: 41 (correspondiente a la isoforma 3 de GDE).
En una realización particular, la secuencia de GDE humana de longitud completa de referencia tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 1, que corresponde a la isoforma 1 de GDE.
En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención comprende al menos los residuos de aminoácidos en las posiciones 429-666, 770-892, 1088-1194, 1235-1532 con respecto a la SEQ ID NO: 1.
En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención comprende al menos los residuos de aminoácidos en las posiciones 429-667, 770-894, 1088-1194, 1233-1532 con respecto a la SEQ ID NO: 1.
En otra realización particular, en el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención se elimina al menos un aminoácido con respecto a la SEQ ID NO: 1, en el que el aminoácido o aminoácidos eliminados son al menos un aminoácido en las posiciones 1-428, 668-769, 895-1087 y/o 1195-1232 con respecto a la SEQ ID NO: 1. En una realización particular adicional, en el polipéptido de GDE humano truncado funcional se eliminan al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 100, 125, 150, 175, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 o al menos aproximadamente 525 aminoácidos, en los que los aminoácidos eliminados se seleccionan de cualquier aminoácido en las posiciones 1-428, 668-769, 895-1087 y/o 1195-1232 con respecto a la SEQ ID NO: 1. En esta realización, los aminoácidos eliminados pueden ser aminoácidos consecutivos o aminoácidos no consecutivos, siempre que se seleccionen de cualquier aminoácido en las posiciones 1-428, 668-769, 895-1087 y/o 1195-1232 con respecto a la SEQ ID NO: 1
En una realización particular, en el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención se elimina:
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 428 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o al menos 400 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 428 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 668 a 769 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 10, 15, 20, 30, 40, 50, 80 o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 668 a 769 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 895 a 1087 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 10, 15, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 125, 150, 175, o al menos 190 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 895 a 1087 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1195 a 1232 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 10, 15, 20 o al menos 30 aminoácidos consecutivos seleccionados de los aminoácidos en las posiciones 1195 a 1232 con respecto a la SEQ ID NO: 1.
En una realización particular adicional, en el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención se elimina:
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 428 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 110 o al menos 120 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 428 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 668 a 769 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 10, 15, 20, 30, 40, 50, 80 o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 668 a 769 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 895 a 1087 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 10, 15, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 125, 150, 175, o al menos 190 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 895 a 1087 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1195 a 1232 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 10, 15, 20 o al menos 30 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1195 a 1232 con respecto a la SEQ ID NO: 1.
En una realización particular, en el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención se elimina:
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 156 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 156 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 361 a 428 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos o al menos 50 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 361 a 428 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 668 a 769 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 668 a 769 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 895 a 1087 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos, al menos 100 aminoácidos consecutivos, al menos 150 aminoácidos consecutivos ácidos, al menos 175 aminoácidos consecutivos o al menos 190 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 895 a 1087 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1195 a 1232 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1195 a 1232 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 223 a 320 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos o al menos 50 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 223 a 320 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 360 a 428 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos o al menos 50 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 360 a 428 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 669 a 720 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos o al menos 50 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 669 a 720 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 280 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados entre los aminoácidos en las posiciones 1 a 280 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 425 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 425 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 230 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 230 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 15, con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 10 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 15 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 30 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos o al menos 25 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 30 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 81 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos o al menos 50 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 81 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 103 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos o al menos 50 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 103 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 129 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 129 con respecto a la SEQ ID NO: 1.
En una realización particular adicional, en el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención se elimina:
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 156 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 156 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 361 a 428 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos o al menos 50 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 361 a 428 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 668 a 769 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 668 a 769 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 895 a 1087 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos, al menos 100 aminoácidos consecutivos, al menos 150 aminoácidos consecutivos, al menos 175 aminoácidos consecutivos o al menos 190 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 895 a 1087 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1195 a 1232 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1195 a 1232 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 223 a 320 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos o al menos 50 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 223 a 320 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 360 a 428 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos o al menos 50 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 360 a 428 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 669 a 720 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos o al menos 50 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 669 a 720 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 280 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 280 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 425 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 425 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 230 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 230 con respecto a la SEQ ID NO: 1.
En una realización particular adicional, el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención comprende al menos una deleción con respecto a la SEQ ID NO: 1, en el que la deleción se selecciona del grupo que consiste en:
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 156 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- deleción de aminoácidos desde a posición 361 a la 428 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- deleción de aminoácidos desde a posición 668 a la 769 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- deleción de aminoácidos desde a posición 895 a la 1087 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- deleción de aminoácidos desde a posición 1195 a la 1232 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- deleción de aminoácidos desde a posición 223 a la 320 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- deleción de aminoácidos desde a posición 360 a la 428 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- deleción de aminoácidos desde a posición 669 a la 720 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- deleción de aminoácidos desde a posición 1 a la 280 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- deleción de aminoácidos desde a posición 1 a la 425 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- deleción de aminoácidos desde a posición 1 a la 230 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- deleción de aminoácidos desde a posición 1 a la 15 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- deleción de aminoácidos desde a posición 1 a la 30 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- deleción de aminoácidos desde a posición 1 a la 81 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- deleción de aminoácidos desde a posición 1 a la 103 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y
- deleción de aminoácidos desde a posición 1 a la 129 con respecto a la SEQ ID NO: 1.
En una realización particular adicional, el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención comprende al menos una deleción con respecto a la SEQ ID NO: 1, en el que la deleción se selecciona del grupo que consiste en:
deleción de aminoácidos desde a posición 1 a la 156 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
deleción de aminoácidos desde a posición 361 a la 428 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
deleción de aminoácidos desde a posición 668 a la 769 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
deleción de aminoácidos desde a posición 895 a la 1087 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
deleción de aminoácidos desde a posición 1195 a la 1232 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
deleción de aminoácidos desde a posición 223 a la 320 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
deleción de aminoácidos desde a posición 360 a la 428 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
deleción de aminoácidos desde a posición 669 a la 720 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
deleción de aminoácidos desde a posición 1 a la 280 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
deleción de aminoácidos desde a posición 1 a la 425 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y
deleción de aminoácidos desde a posición 1 a la 230 con respecto a la SEQ ID NO: 1.
En aras de la claridad, en esta realización, la deleción se refiere a la deleción de todos los aminoácidos consecutivos en el intervalo de posiciones mencionado. Por ejemplo, un polipéptido de GDE humano truncado funcional que comprende la deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 156 con respecto a la SEQ ID NO: 1 corresponde a un polipéptido de GDE en el que se eliminan todos los aminoácidos consecutivos desde la posición 1 a la 156 con respecto a la SEQ ID NO: 1.
También en aras de la claridad, un polipéptido de GDE humano truncado funcional que comprende, por ejemplo:
- la deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 156 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y
- la deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 280 con respecto a la SEQ ID NO: 1
corresponde a un polipéptido de GDE del que se eliminan todos los aminoácidos consecutivos desde la posición 1 a la 280, ya que el intervalo 1 -156 está incluido en el intervalo 1 -280.
Además, un polipéptido de GDE humano truncado funcional que comprende, por ejemplo:
- la deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 280 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y
- la deleción de aminoácidos desde la posición 223 a la 320 con respecto a la SEQ ID NO: 1
corresponde a un polipéptido de GDE en el que se eliminan todos los aminoácidos consecutivos desde la posición 1 a la 320, ya que el intervalo 1-280 se superpone al intervalo 223-320.
En otra realización, la secuencia de GDE humana de longitud completa de referencia tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 40, que corresponde a la isoforma 2 de GDE.
En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención comprende al menos los residuos de aminoácidos en las posiciones 412-649, 753-875, 1071-1177, 1218-1515 con respecto a la SEQ ID NO: 40.
En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención comprende al menos los residuos de aminoácidos en las posiciones 412-650, 753-877, 1071-1177, 1216-1515 con respecto a la SEQ ID NO: 40.
En otra realización particular, en el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención se elimina al menos un aminoácido con respecto a la SEQ ID NO: 40, en el que el aminoácido o aminoácidos eliminados son al menos un aminoácido en las posiciones 1-411, 651-752, 878-1070 y/o 1178-1215 con respecto a la SEQ ID NO: 40. En una realización particular adicional, en el polipéptido de GDE humano truncado funcional se eliminan al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 100, 125, 150, 175, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 o al menos aproximadamente 525 aminoácidos, en los que los aminoácidos eliminados se seleccionan de cualquier aminoácido en las posiciones 1-411, 651 -752 , 878-1070 y/o 1178-1215 con respecto a la SEQ ID NO: 40. En esta realización, los aminoácidos eliminados pueden ser aminoácidos consecutivos o aminoácidos no consecutivos, siempre que se seleccionen de cualquier aminoácido en las posiciones 1-411, 651-752, 878-1070 y/o 1178-1215 con respecto a la SEQ ID NO: 40.
En una realización particular, en el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención se elimina:
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 411 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o al menos 400 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 411 con respecto a la SEQ ID NO: 40; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 651-752 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 10, 15, 20, 30, 40, 50, 80 o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 651-752 con respecto a la SEQ ID NO: 40; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 878-1070 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 10, 15, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 125, 150, 175, o en al menos 190 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 878-1070 con respecto a la SEQ ID NO: 40; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1178-1215 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 10, 15, 20 o al menos 30 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1178-1215 con respecto a la SEQ ID NO: 40.
En una realización particular, en el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención se elimina:
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 139 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 139 con respecto a la SEQ ID NO: 40; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 344 a 411 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos o al menos 50 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 344 a 411 con respecto a la SEQ ID NO: 40; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 651 a 752 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 651 a 752 con
respecto a la SEQ ID NO: 40; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 878 a 1070 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos, al menos 100 aminoácidos consecutivos, al menos 150 aminoácidos consecutivos ácidos, al menos 175 aminoácidos consecutivos o al menos 190 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 878 a 1070 con respecto a la SEQ ID NO: 40; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1178 a 1215 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1178 a 1215 con respecto a la SEQ ID NO: 40; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 206 a 303 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos o al menos 50 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 206 a 303 con respecto a la SEQ ID NO: 40; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 343 a 411 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos o al menos 50 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 343 a 411 con respecto a la SEQ ID NO: 40; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 652 a 703 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos o al menos 50 aminoácidos consecutivos seleccionados de los aminoácidos en las posiciones 652 a 703 con respecto a la SEQ ID NO: 40; y/o - al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 263 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 263 con respecto a la SEQ ID NO: 40; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 408 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 408 con respecto a la SEQ ID NO: 40; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 213 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 213 con respecto a la SEQ ID NO: 40; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 13 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos o al menos 25 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 13 con respecto a la SEQ ID NO: 40; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 64 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos o al menos 50 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 64 con respecto a la SEQ ID NO: 40; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 86 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos o al menos 50 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 86 con respecto a la SEQ ID NO: 40; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 112 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 112 con respecto a la SEQ ID NO: 40.
En otra realización particular, en el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención se elimina:
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 139 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 139 con respecto a la SEQ ID NO: 40; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 344 a 411 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos o al menos 50 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 344 a 411 con respecto a la SEQ ID NO: 40; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 651 a 752 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 651 a 752 con respecto a la SEQ ID NO: 40; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 878 a 1070 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos, al menos 100 aminoácidos consecutivos, al menos 150 aminoácidos consecutivos ácidos, al menos 175 aminoácidos consecutivos o al menos 190 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 878 a 1070 con respecto a la SEQ ID NO: 40; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1178 a 1215 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1178 a 1215 con respecto a la SEQ ID NO: 40; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 206 a 303 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos o al menos 50 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 206 a 303 con respecto a la SEQ ID NO: 40; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 343 a 411 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos o al menos 50 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 343 a 411 con respecto a la SEQ ID NO: 40; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 652 a 703 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos o al menos 50 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 652 a 703 con respecto a la SEQ ID NO: 40; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 263 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 263 con respecto a la SEQ ID NO: 40; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 408 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 408 con respecto a la SEQ ID NO: 40; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 213 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 213 con respecto a la SEQ ID NO: 40.
En una realización particular adicional, el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención comprende al menos una deleción con respecto a la SEQ ID NO: 40, en el que la deleción se selecciona del grupo que consiste en:
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 139 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 344 a la 411 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 651 a la 752 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 878 a la 1070 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1178 a la 1215 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 206 a la 303 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 343 a la 411 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 652 a la 703 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 263 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 408 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 213 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 13 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 64 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 86 con respecto a la SEQ ID NO: 40; y
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 112 con respecto a la SEQ ID NO: 40.
En una realización particular adicional, el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención comprende al menos una deleción con respecto a la SEQ ID NO: 40, en el que la deleción se selecciona del grupo que consiste en:
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 139 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 344 a la 411 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 651 a la 752 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 878 a la 1070 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1178 a la 1215 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 206 a la 303 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 343 a la 411 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 652 a la 703 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 263 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 408 con respecto a la SEQ ID NO: 40; y
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 213 con respecto a la SEQ ID NO: 40.
En aras de la claridad, en esta realización, la deleción se refiere a la deleción de todos los aminoácidos consecutivos en el intervalo de posiciones mencionado. Por ejemplo, un polipéptido de GDE humano truncado funcional que comprende la deleción de los aminoácidos de la posición 1 a la 139 con respecto a la SEQ ID NO: 40 corresponde a un polipéptido de GDE en el que se eliminan todos los aminoácidos consecutivos de la posición 1 a la 139 con respecto a la SEQ ID NO: 40.
También en aras de la claridad, un polipéptido de GDE humano truncado funcional que comprende, por ejemplo:
- la deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 139 con respecto a la SEQ ID NO: 40; y
- la deleción de aminoácidos de la posición 1 a la 263 con respecto a la SEQ ID NO: 40
corresponde a un polipéptido de GDE del que se eliminan todos los aminoácidos consecutivos desde la posición 1 a la 263, ya que el intervalo 1 -139 está incluido en el intervalo 1 -263.
Además, un polipéptido de GDE humano truncado funcional que comprende, por ejemplo:
- la deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 263 con respecto a la SEQ ID NO: 40; y
- la deleción de aminoácidos de la posición 206 a la 303 con respecto a la SEQ ID NO: 40
corresponde a un polipéptido de GDE del que se eliminan todos los aminoácidos consecutivos desde la posición 1 a la 303, ya que el intervalo 1-263 se superpone al intervalo 206-303.
En otra realización, la secuencia de GDE humana de longitud completa de referencia tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 41, que corresponde a la isoforma 3 de GDE.
En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención comprende al menos los residuos de aminoácidos en las posiciones 413-650, 754-876, 1072-1178, 1219-1516 con respecto a la SEQ ID NO: 41. En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención comprende al menos los residuos de aminoácidos en las posiciones 413-651,754-878, 1072-1178, 1217-1516 con respecto a la SEQ ID NO: 41.
En otra realización particular, en el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención se elimina al menos un aminoácido con respecto a la SEQ ID NO: 41, en el que el aminoácido o aminoácidos eliminados son al menos un aminoácido en las posiciones 1-412, 652-753, 879-1071 y/o 1179-1216 con respecto a la SEQ ID NO: 41. En una realización particular adicional, en el polipéptido de GDE humano truncado funcional se eliminan al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 100, 125, 150, 175, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 o al menos aproximadamente 525 aminoácidos, en los que los aminoácidos eliminados se seleccionan de cualquier aminoácido en las posiciones 1-412, 652-753, 879-1071 y/o 1179-1216 con respecto a la SEQ ID NO: 41. En esta realización, los aminoácidos eliminados pueden ser aminoácidos consecutivos o aminoácidos no consecutivos, siempre que se seleccionen de cualquier aminoácido en las posiciones 1-412, 652-753, 879-1071 y/o 1179-1216 con respecto a la SEQ ID NO: 41.
En una realización particular, en el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención se elimina:
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 412 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250, 300, 350 o al menos 400 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 412 con respecto a la SEQ ID NO: 41; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 652-753 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 10, 15, 20, 30, 40, 50, 80 o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 652-753 con respecto a la SEQ ID NO: 41; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 879-1071 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 10, 15, 20, 30, 40, 50, 80, 100, 125, 150, 175, o al menos 190 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 879-1071 con respecto a la SEQ ID NO: 41; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1179-1216 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 10, 15, 20 o al menos 30 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1179-1216 con respecto a la SEQ ID NO: 41.
En una realización particular, en el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención se elimina:
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 140 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 140 con respecto a la SEQ ID NO: 41; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 345 a 412 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos o al menos 50 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 345 a 412 con respecto a la SEQ ID NO: 41; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 652 a 753 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 652 a 753 con respecto a la SEQ ID NO: 41; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 879 a 1071 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos, al menos 100 aminoácidos consecutivos, al menos 150 aminoácidos consecutivos ácidos, al menos 175 aminoácidos consecutivos o al menos 190 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 879 a 1071 con respecto a la SEQ ID NO: 41; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1179 a 1216 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1179 a 1216 con respecto a la SEQ ID NO: 41; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 207 a 304 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos o al menos 50 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 207 a 304 con respecto a la SEQ ID NO: 41; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 344 a 412 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos o al menos 50 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 344 a 412 con respecto a la SEQ ID NO: 41; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 653 a 704 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos o al menos 50 aminoácidos consecutivos
seleccionados de aminoácidos en las posiciones 653 a 704 con respecto a la SEQ ID NO: 41; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 264 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 264 con respecto a la SEQ ID NO: 41; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 409 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 409 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 214 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 214 con respecto a la SEQ ID NO: 41; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 14 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos o al menos 25 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 14 con respecto a la SEQ ID NO: 41; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 65 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos o al menos 50 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 65 con respecto a la SEQ ID NO: 41; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 87 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos o al menos 50 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 87 con respecto a la SEQ ID NO: 41; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 113 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 113 con respecto a la SEQ ID NO: 41.
En una realización particular, en el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención se elimina:
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 140 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 140 con respecto a la SEQ ID NO: 41; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 345 a 412 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos o al menos 50 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 345 a 412 con respecto a la SEQ ID NO: 41; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 652 a 753 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 652 a 753 con respecto a la SEQ ID NO: 41; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 879 a 1071 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos, al menos 100 aminoácidos consecutivos, al menos 150 aminoácidos consecutivos, al menos 175 aminoácidos consecutivos o al menos 190 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 879 a 1071 con respecto a la SEQ ID NO: 41; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1179 a 1216 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1179 a 1216 con respecto a la SEQ ID NO: 41; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 207 a 304 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos o al menos 50 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 207 a 304 con respecto a la SEQ ID NO: 41; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 344 a 412 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos o al menos 50 aminoácidos consecutivos
seleccionados de aminoácidos en las posiciones 344 a 412 con respecto a la SEQ ID NO: 41; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 653 a 704 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos o al menos 50 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 653 a 704 con respecto a la SEQ ID NO: 41; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 264 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 264 con respecto a la SEQ ID NO: 41; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 409 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 409 con respecto a la SEQ ID NO: 41; y/o
- al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 214 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos o al menos 100 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 214 con respecto a la SEQ ID NO: 41.
En una realización particular adicional, el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención comprende al menos una deleción con respecto a la SEQ ID NO: 41, en el que la deleción se selecciona del grupo que consiste en:
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 140 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- deleción de aminoácidos desde la posición 345 a la 412 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- deleción de aminoácidos desde la posición 652 a la 753 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- deleción de aminoácidos de la posición 879 a la 1071 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- deleción de aminoácidos de la posición 1179 a la 1216 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- deleción de aminoácidos desde la posición 207 a la 304 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- deleción de aminoácidos desde la posición 344 a la 412 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- deleción de aminoácidos desde la posición 653 a la 704 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 264 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 409 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 214 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 14 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 65 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 87 con respecto a la SEQ ID NO: 41; y
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 113 con respecto a la SEQ ID NO: 41.
En una realización particular adicional, el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención comprende al menos una deleción con respecto a la SEQ ID NO: 41, en el que la deleción se selecciona del grupo que consiste en:
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 140 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- deleción de aminoácidos desde la posición 345 a la 412 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- deleción de aminoácidos desde la posición 652 a la 753 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- deleción de aminoácidos desde la posición 879 a la 1071 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1179 a la 1216 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- deleción de aminoácidos desde la posición 207 a la 304 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- deleción de aminoácidos desde la posición 344 a la 412 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- deleción de aminoácidos desde la posición 653 a la 704 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 264 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 409 con respecto a la SEQ ID NO: 41; y
- deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 214 con respecto a la SEQ ID NO: 41.
En aras de la claridad, en esta realización, la deleción se refiere a la deleción de todos los aminoácidos consecutivos en el intervalo de posiciones mencionado. Por ejemplo, un polipéptido de GDE humano truncado funcional que comprende la deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 140 con respecto a la SEQ ID NO: 41 corresponde a un polipéptido de GDE en el que se eliminan todos los aminoácidos consecutivos desde la posición 1 a la 140 con respecto a la SEQ ID NO: 41.
También en aras de la claridad, un polipéptido de GDE humano truncado funcional que comprende, por ejemplo:
- la deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 140 con respecto a la SEQ ID NO: 41; y
- la deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 264 con respecto a la SEQ ID NO: 41
corresponde a un polipéptido de GDE del que se eliminan todos los aminoácidos consecutivos desde la posición 1 a la 264, ya que el intervalo 1 -140 está incluido en el intervalo 1 -264.
Además, un polipéptido de GDE humano truncado funcional que comprende, por ejemplo:
- la deleción de aminoácidos desde la posición 1 a la 264 con respecto a la SEQ ID NO: 41; y
- la deleción de aminoácidos desde la posición 207 a la 304 con respecto a la SEQ ID NO: 41 corresponde a un polipéptido de GDE del que se eliminan todos los aminoácidos consecutivos desde la posición 1 a la 304, ya que el intervalo 1-264 se superpone al intervalo 207-304.
En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención comprende una deleción o una combinación de deleciones con respecto a la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40 o SEQ ID NO: 41 en el que la deleción o deleciones se seleccionan de cualquier deleción denominada A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7 y A8 en la tabla 1:
Tabla 1:
En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención puede comprender una combinación de 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 deleciones, en el que la deleción o deleciones se seleccionan de cualquier deleción denominada A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7 y A8 en la tabla 1.
En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención puede comprender una deleción o una combinación de deleciones, como se muestra en la tabla 2, en el que la deleción o delecciones son como se indican en la tabla 1.
Tabla 2:
En aras de la claridad, la Tabla 2 debe entenderse como sigue. Tomando como ejemplo el polipéptido de GDE humano truncado funcional que comprende la siguiente combinación de deleciones: "A1+A2+A3", el polipéptido de GDE humano truncado funcional comprende las deleciones A1, A2 y A3 con respecto a la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40 o SEQ ID NO: 41, como se indica en la Tabla 1. En otras palabras, en este ejemplo, cuando la secuencia de GDE de longitud completa de referencia es la SEQ ID NO: 1, el polipéptido de GDE humano truncado funcional "A1+A2+A3" corresponde a un polipéptido de GDE humano truncado funcional derivado de la SEQ ID NO: 1 en que se eliminan todos los aminoácidos consecutivos desde la posición 1 a la 156, desde la posición 361-428 y desde la posición 668 769 con respecto a la SEQ ID NO: 1. Por consiguiente, cuando la secuencia de GDE de longitud completa de referencia es la SEQ ID NO: 40, el polipéptido de GDE humano truncado funcional "A1+A2+A3" corresponde a un polipéptido de GDE humano truncado funcional derivado de la SEQ ID NO: 40 en que se eliminan todos los aminoácidos consecutivos desde la posición 1 a la 139, desde la posición 344-411 y desde la posición 651-752 con respecto a la SEQ ID NO: 40.
En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención comprende las deleciones A2 y A3 denominadas en la tabla 1. En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención comprende las deleciones A2 y A3 denominadas en la tabla 1 y deriva de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40 o SEQ ID NO: 41, en particular de la SEQ ID NO: 1.
En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional deriva de la SEQ ID NO: 1 y comprende:
(i) una deleción o una combinación de deleciones, como se muestra en la tabla 2 con respecto a la SEQ ID NO: 1, y
(ii) una deleción N-terminal de al menos un aminoácido y de un máximo de 132 aminoácidos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 132 con respecto a la SEQ ID NO: 1.
En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional deriva de la SEQ ID NO: 1 y comprende:
(i) una deleción o una combinación de deleciones, como se muestra en la tabla 2 con respecto a la SEQ ID NO: 1, y
(ii) una deleción N-terminal de al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 132 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 25 aminoácidos consecutivos, al menos 30 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos, al menos 75 aminoácidos consecutivos, al menos 80 aminoácidos consecutivos, al menos 81 aminoácidos consecutivos, al menos 100 aminoácidos consecutivos, al menos 103 aminoácidos consecutivos, al menos 125 aminoácidos consecutivos, o al menos 132 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 132 con respecto a la SEQ ID NO: 1.
En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional deriva de la SEQ ID NO: 1 y comprende:
(i) las deleciones A2 y A3 denominadas en la tabla 1 con respecto a la SEQ ID NO: 1, y
(ii) una deleción N-terminal de al menos un aminoácido y de un máximo de 132 aminoácidos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 132 con respecto a la SEQ ID NO: 1.
En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional deriva de la SEQ ID NO: 1 y comprende:
(i) las deleciones A2 y A3 denominadas en la tabla 1 con respecto a la SEQ ID NO: 1, y
(ii) una deleción N-terminal de al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 132 con respecto a la SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 25 aminoácidos consecutivos, al menos 30 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos, al menos 75 aminoácidos consecutivos, al menos 80 aminoácidos consecutivos, al menos 81 aminoácidos consecutivos, al menos 100 aminoácidos consecutivos, al menos 103 aminoácidos consecutivos, al menos 125 aminoácidos consecutivos, o al menos 132 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 132 con respecto a la SEQ ID NO: 1.
En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional deriva de la SEQ ID NO: 40 y comprende:
(i) una deleción o una combinación de deleciones, como se muestra en la tabla 2 con respecto a la SEQ ID NO: 40, y
(ii) una deleción N-terminal de al menos un aminoácido y de un máximo de 115 aminoácidos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 115 con respecto a la SEQ ID NO: 40.
En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional deriva de la SEQ ID NO: 40 y comprende:
(i) una deleción o una combinación de deleciones, como se muestra en la tabla 2 con respecto a la SEQ ID NO: 40, y
(ii) una deleción N-terminal de al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 115 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 10 aminoácidos consecutivos, al menos 13 aminoácidos consecutivos, al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 25 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos, al menos 60 aminoácidos consecutivos, al menos 64 aminoácidos consecutivos, al menos 75 aminoácidos consecutivos, al menos 80 aminoácidos consecutivos, al menos 85 aminoácidos, al menos 86 aminoácidos consecutivos, al menos 100 aminoácidos consecutivos, al menos 110 aminoácidos consecutivos, al menos 112 aminoácidos consecutivos, o al menos 115 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 115 con respecto a la SEQ ID NO: 40.
En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional deriva de la SEQ ID NO: 40 y comprende:
(i) las deleciones A2 y A3 denominadas en la tabla 1 con respecto a la SEQ ID NO: 40, y
(ii) una deleción N-terminal de al menos un aminoácido y de un máximo de 115 aminoácidos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 115 con respecto a la SEQ ID NO: 40.
En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional deriva de la SEQ ID NO: 40 y comprende:
(i) las deleciones A2 y A3 denominadas en la tabla 1 con respecto a la SEQ ID NO: 40, y
(ii) una deleción N-terminal de al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a Z2 con respecto a la SEQ ID NO: 40, preferiblemente al menos 10 aminoácidos consecutivos, al menos 13 aminoácidos consecutivos, al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 25 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos, al menos 60 aminoácidos consecutivos, al menos 64 aminoácidos consecutivos, al menos 75 aminoácidos consecutivos, al menos 80 aminoácidos consecutivos, al menos 85 aminoácidos consecutivos, al menos 86 aminoácidos consecutivos, al menos 100 aminoácidos consecutivos, al menos 110 aminoácidos consecutivos, al menos 112 aminoácidos consecutivos, o al menos 115 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 115 con respecto a la SEQ ID NO: 40.
En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional deriva de la SEQ ID NO: 41 y comprende:
(i) las deleciones A2 y A3 denominadas en la tabla 1 con respecto a la SEQ ID NO: 41, y
(ii) una deleción N-terminal de al menos un aminoácido y de un máximo de 115 aminoácidos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 115 con respecto a la SEQ ID NO: 41.
En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional deriva de la SEQ ID NO: 41 y comprende:
(i) una deleción o una combinación de deleciones, como se muestra en la tabla 2 con respecto a la SEQ ID NO: 41, y
(ii) una deleción N-terminal de al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 116 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 10 aminoácidos consecutivos, al menos 14 aminoácidos consecutivos, al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 25 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos, al menos 60 aminoácidos consecutivos, al menos 65 aminoácidos consecutivos, al menos 75 aminoácidos consecutivos, al menos 80 aminoácidos consecutivos, al menos 85 aminoácidos consecutivos, al menos 87 aminoácidos consecutivos, al menos 100 aminoácidos consecutivos, al menos 110 aminoácidos consecutivos, al menos 113 aminoácidos consecutivos, o al menos 116 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 116 con respecto a la SEQ
ID NO: 41.
En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional deriva de la SEQ ID NO: 41 y comprende:
(i) las deleciones A2 y A3 denominadas en la tabla 1 con respecto a la SEQ ID NO: 41, y
(ii) una deleción N-terminal de al menos un aminoácido seleccionado de aminoácidos en las posiciones 1 a 116 con respecto a la SEQ ID NO: 41, preferiblemente al menos 10 aminoácidos consecutivos, al menos 14 aminoácidos consecutivos, al menos 15 aminoácidos consecutivos, al menos 25 aminoácidos consecutivos, al menos 50 aminoácidos consecutivos, al menos 60 aminoácidos consecutivos, al menos 65 aminoácidos consecutivos, al menos 75 aminoácidos consecutivos, al menos 80 aminoácidos consecutivos, al menos 85 aminoácidos consecutivos, al menos 87 aminoácidos consecutivos, al menos 100 aminoácidos consecutivos, al menos 110 aminoácidos consecutivos, al menos 113 aminoácidos consecutivos, o al menos 116 aminoácidos consecutivos seleccionados de aminoácidos en las posiciones 1 a 116 con respecto a la SEQ ID NO: 41.
En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional comprende:
(i) una deleción o una combinación de deleciones, como se muestra en la tabla 2 con respecto a la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40 o SEQ ID NO: 41, y
(ii) una deleción o una combinación de deleciones seleccionadas de cualquier deleción denominada A9, A10, A11, A12 y A13 en la tabla 3, con respecto a la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40 o SEQ ID NO: 41.
Tabla 3
En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional deriva de la SEQ ID NO: 1 y comprende:
(i) una deleción o una combinación de deleciones, como se muestra en la tabla 2 con respecto a la SEQ ID NO: 1, y
(ii) la deleción A9, denominada en la Tabla 3 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
o
(i) una deleción o una combinación de deleciones, como se muestra en la tabla 2 con respecto a la SEQ ID NO: 1, y
(ii) la deleción A10, denominada en la Tabla 3 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
o
(i) una deleción o una combinación de deleciones, como se muestra en la tabla 2 con respecto a la SEQ ID NO: 1, y
(ii) la deleción A11, denominada en la Tabla 3 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
o
(i) una deleción o una combinación de deleciones, como se muestra en la tabla 2 con respecto a la SEQ ID NO: 1, y
(ii) la deleción A12, denominada en la Tabla 3 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
o
(i) una deleción o una combinación de deleciones, como se muestra en la tabla 2 con respecto a la SEQ ID NO: 1 y
(ii) la deleción A13, denominada en la Tabla 3 con respecto a la SEQ ID NO: 1.
En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional deriva de la SEQ ID NO: 1 y comprende:
(i) las deleciones A2 y A3 denominadas en la tabla 1 con respecto a la SEQ ID NO: 1, y
(ii) una deleción o una combinación de deleciones seleccionadas de las deleciones A9, A10, A11, A12 y A13 denominadas en la tabla 3 con respecto a la SEQ ID NO: 1.
En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional deriva de la SEQ ID NO: 1 y comprende:
(i) las deleciones A2 y A3 denominadas en la tabla 1 con respecto a la SEQ ID NO: 1, y
(ii) la deleción A9 denominada en la tabla 3 con respecto a la SEQ ID NO: 1.
En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional deriva de la SEQ ID NO: 1 y comprende:
(i) las deleciones A2 y A3 denominadas en la tabla 1 con respecto a la SEQ ID NO: 1, y
(ii) la deleción A10 denominada en la tabla 3 con respecto a la SEQ ID NO: 1.
En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional deriva de la SEQ ID NO: 1 y comprende:
(i) las deleciones A2 y A3 denominadas en la tabla 1 con respecto a la SEQ ID NO: 1, y
(ii) la deleción A11 denominada en la tabla 3 con respecto a la SEQ ID NO: 1.
En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional deriva de la SEQ ID NO: 1 y comprende:
(i) las deleciones A2 y A3 denominadas en la tabla 1 con respecto a la SEQ ID NO: 1, y
(ii) la deleción A12 denominada en la tabla 3 con respecto a la SEQ ID NO: 1.
En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional deriva de la SEQ ID NO: 1 y comprende:
(i) las deleciones A2 y A3 denominadas en la tabla 1 con respecto a la SEQ ID NO: 1, y
(ii) la deleción A13 denominada en la tabla 3 con respecto a la SEQ ID NO: 1.
En una realización particular adicional, el polipéptido de GDE humano truncado funcional deriva de la SEQ ID NO: 1 y comprende:
(i) las deleciones A2 y A3 denominadas en la tabla 1 con respecto a la SEQ ID NO: 1, y
(ii) una deleción o una combinación de deleciones seleccionadas de las deleciones A9, A10 y A13 denominadas en la tabla 3 con respecto a la SEQ ID NO: 1.
En otra realización particular más, el polipéptido de GDE humano truncado funcional deriva de la SEQ ID NO: 1 y comprende:
(i) las deleciones A2 y A3 denominadas en la tabla 1 con respecto a la SEQ ID NO: 1, y
(ii) una deleción o una combinación de deleciones seleccionadas de las deleciones A9 y A10 denominadas en la tabla 3 con respecto a la SEQ ID NO: 1.
En otra realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional deriva de la SEQ ID NO: 40 y comprende:
(i) una deleción o una combinación de deleciones, como se muestra en la tabla 2 con respecto a la SEQ ID NO: 40, y
(ii) la deleción A10, denominada en la Tabla 3 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
o
(i) una deleción o una combinación de deleciones, como se muestra en la tabla 2 con respecto a la SEQ ID NO: 40, y
(ii) la deleción A11, denominada en la Tabla 3 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
o
(i) una deleción o una combinación de deleciones, como se muestra en la tabla 2 con respecto a la SEQ ID NO: 40, y
(ii) la deleción A12, denominada en la Tabla 3 con respecto a la SEQ ID NO: 40;
o
(i) una deleción o una combinación de deleciones, como se muestra en la tabla 2 con respecto a la SEQ ID NO: 40 y
(ii) la deleción A13, denominada en la Tabla 3 con respecto a la SEQ ID NO: 40.
En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional deriva de la SEQ ID NO: 40 y comprende:
(i) las deleciones A2 y A3 denominadas en la tabla 1 con respecto a la SEQ ID NO: 40, y
(ii) una deleción o una combinación de deleciones seleccionadas de las deleciones A10, A11, A12 y A13 denominadas en la tabla 3 con respecto a la SEQ ID NO: 40.
En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional deriva de la SEQ ID NO: 40 y comprende:
(i) las deleciones A2 y A3 denominadas en la tabla 1 con respecto a la SEQ ID NO: 40, y
(ii) la deleción A10 denominada en la tabla 3 con respecto a la SEQ ID NO: 40.
En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional deriva de la SEQ ID NO: 40 y comprende:
(i) las deleciones A2 y A3 denominadas en la tabla 1 con respecto a la SEQ ID NO: 40, y
(ii) la deleción A11 denominada en la tabla 3 con respecto a la SEQ ID NO: 40.
En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional deriva de la SEQ ID NO: 40 y comprende:
(i) las deleciones A2 y A3 denominadas en la tabla 1 con respecto a la SEQ ID NO: 40, y
(ii) la deleción A12 denominada en la tabla 3 con respecto a la SEQ ID NO: 40.
En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional deriva de la SEQ ID NO: 40 y comprende:
(i) las deleciones A2 y A3 denominadas en la tabla 1 con respecto a la SEQ ID NO: 40, y
(ii) la deleción A13 denominada en la tabla 3 con respecto a la SEQ ID NO: 40.
En una realización particular adicional, el polipéptido de GDE humano truncado funcional deriva de la SEQ ID NO: 40 y comprende:
(i) las deleciones A2 y A3 denominadas en la tabla 1 con respecto a la SEQ ID NO: 40, y
(ii) una deleción o una combinación de deleciones seleccionadas de las deleciones A10 y A13 denominadas en la tabla 3 con respecto a la SEQ ID NO: 40.
En otra realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional deriva de la SEQ ID NO: 41 y comprende:
(i) una deleción o una combinación de deleciones, denominadas en la tabla 2 con respecto a la SEQ ID NO:
41, y
(ii) la deleción A10, denominada en la Tabla 3 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
o
(i) una deleción o una combinación de deleciones, como se muestra en la tabla 2 con respecto a la SEQ ID NO: 41, y
(ii) la deleción A11, denominada en la Tabla 3 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
o
(i) una deleción o una combinación de deleciones, como se muestra en la tabla 2 con respecto a la SEQ ID NO: 41, y
(ii) la deleción A12, denominada en la Tabla 3 con respecto a la SEQ ID NO: 41;
o
(i) una deleción o una combinación de deleciones, como se muestra en la tabla 2 con respecto a la SEQ ID NO: 41 y
(ii) la deleción A13, denominada en la Tabla 3 con respecto a la SEQ ID NO: 41.
En una realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional deriva de la SEQ ID NO: 41 y comprende:
(i) las deleciones A2 y A3 denominadas en la tabla 1 con respecto a la SEQ ID NO: 41, y
(ii) una deleción o una combinación de deleciones seleccionadas de las deleciones A9, A10, A11, A12 y A13 denominadas en la tabla 3 con respecto a la SEQ ID NO: 41.
En una realización particular adicional, el polipéptido de GDE humano truncado funcional deriva de la SEQ ID NO: 41 y comprende:
(i) las deleciones A2 y A3 denominadas en la tabla 1 con respecto a la SEQ ID NO: 1, y
(ii) una deleción o una combinación de deleciones seleccionadas de las deleciones A10 y A13 denominadas en la tabla 3 con respecto a la SEQ ID NO: 41.
En otra realización particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención se selecciona del grupo que consiste en:
- SEQ ID NO: 2: un polipéptido de GDE humano truncado funcional que comprende una deleción de aminoácidos de la posición 1 a 156 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- SEQ ID NO: 3: un polipéptido de GDE humano truncado funcional que comprende una deleción de aminoácidos de la posición 361 a 428 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- SEQ ID NO: 4: un polipéptido de GDE humano truncado funcional que comprende una deleción de aminoácidos de la posición 668 a 769 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- SEQ ID NO: 5: un polipéptido de GDE humano truncado funcional que comprende una primera deleción de aminoácidos de la posición 361 a 428 y una segunda deleción de aminoácidos de la posición 668 a 769 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- SEQ ID NO: 6: un polipéptido de GDE humano truncado funcional que comprende una deleción de aminoácidos de la posición 895 a 1087 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- SEQ ID NO: 7: un polipéptido de GDE humano truncado funcional que comprende una primera deleción de aminoácidos de la posición 223 a 320, una segunda deleción de aminoácidos de la posición 360 a 428 y una tercera deleción de aminoácidos de la posición 669 a 720 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- SEQ ID NO: 8: un polipéptido de GDE humano truncado funcional que comprende una deleción de aminoácidos de la posición 1 a 280 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- SEQ ID NO: 9: un polipéptido de GDE humano truncado funcional que comprende una deleción de aminoácidos de la posición 1 a 425 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- SEQ ID NO: 10: un polipéptido de GDE humano truncado funcional que comprende una deleción de aminoácidos de la posición 1 a 230 con respecto a la SEQ ID NO: 1
- SEQ ID NO: 48: un polipéptido de GDE humano truncado funcional que comprende una primera deleción de aminoácidos de la posición 1-15, una segunda deleción de aminoácidos de la posición 361 a 428 y una tercera deleción de aminoácidos de la posición 668 a 769 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- SEQ ID NO: 49: un polipéptido de GDE humano truncado funcional que comprende una primera deleción de aminoácidos de la posición 1-30, una segunda deleción de aminoácidos de la posición 361 a 428 y una tercera deleción de aminoácidos de la posición 668 a 769 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- SEQ ID NO: 50: un polipéptido de GDE humano truncado funcional que comprende una primera deleción de aminoácidos de la posición 1-81, una segunda deleción de aminoácidos de la posición 361 a 428 y una tercera deleción de aminoácidos de la posición 668 a 769 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- SEQ ID NO: 51: un polipéptido de GDE humano truncado funcional que comprende una primera deleción de aminoácidos de la posición 1-103, una segunda deleción de aminoácidos de la posición 361 a 428 y una tercera deleción de aminoácidos de la posición 668 a 769 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y
- SEQ ID NO: 52: un polipéptido de GDE humano truncado funcional que comprende una primera deleción de aminoácidos de la posición 1-129, una segunda deleción de aminoácidos de la posición 361 a 428 y una tercera deleción de aminoácidos de la posición 668 a 769 con respecto a la SEQ ID NO: 1.
En una realización particular adicional, el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención se selecciona del grupo que consiste en:
- SEQ ID NO: 2: un polipéptido de GDE humano truncado funcional que comprende una deleción de aminoácidos de la posición 1 a 156 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- SEQ ID NO: 3: un polipéptido de GDE humano truncado funcional que comprende una deleción de aminoácidos de la posición 361 a 428 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- SEQ ID NO: 4: un polipéptido de GDE humano truncado funcional que comprende una deleción de aminoácidos de la posición 668 a 769 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- SEQ ID NO: 5: un polipéptido de GDE humano truncado funcional que comprende una primera deleción de aminoácidos de la posición 361 a 428 y una segunda deleción de aminoácidos de la posición 668 a 769 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- SEQ ID NO: 6: un polipéptido de GDE humano truncado funcional que comprende una deleción de aminoácidos de la posición 895 a 1087 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- SEQ ID NO: 7: un polipéptido de GDE humano truncado funcional que comprende una primera deleción de aminoácidos de la posición 223 a 320, una segunda deleción de aminoácidos de la posición 360 a 428 y una tercera deleción de aminoácidos de la posición 669 a 720 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- SEQ ID NO: 8: un polipéptido de GDE humano truncado funcional que comprende una deleción de aminoácidos de la posición 1 a 280 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
- SEQ ID NO: 9: un polipéptido de GDE humano truncado funcional que comprende una deleción de aminoácidos de la posición 1 a 425 con respecto a la SEQ ID NO: 1; y
- SEQ ID NO: 10: un polipéptido de GDE humano truncado funcional que comprende una deleción de aminoácidos de la posición 1 a 230 con respecto a la SEQ ID NO: 1.
Cuando la deleción es una deleción N-terminal, se puede añadir una metionina en el extremo N-terminal de la secuencia. Por ejemplo, la SEQ ID NO: 9 comprende una deleción de aminoácidos de la posición 1 a 425 con respecto a la SEQ ID NO: 1 y una adición de una metionina en el extremo N-terminal de la secuencia resultante de esta deleción. La presente solicitud divulga todas las formas truncadas de GDE funcional específicamente divulgadas en la misma, en la que dichas formas truncadas de GDE funcional tienen un residuo de metionina en su extremo N-terminal.
En una realización particular adicional, el polipéptido de GDE humano truncado funcional de la invención comprende o consiste en una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 2 a 10 y las SEQ ID NO: 48 a 52, en particular una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 2 a 10, en particular una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, más particularmente la SEQ ID NO: 5. El polipéptido de GDE humano truncado funcional puede comprender una o más modificaciones de aminoácidos tales como inserción, deleción y/o sustitución de aminoácidos, en comparación con las SEQ ID NO: 2 a 10 y las SEQ ID NO: 48
a 52, en particular una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 2 a 10, en particular una secuencia seleccionada de las sEq ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SeQ ID NO: 6, más particularmente la SEQ ID NO: 5. En particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional puede comprender modificaciones de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos en comparación con las SEQ ID NO: 2 a 10 y las SEQ ID NO: 48 a 52, en particular una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 2 a 10, en particular una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID No: 6, más particularmente la SEQ ID NO: 5. En particular, el polipéptido de GDE humano truncado funcional puede tener al menos un 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o al menos un 99 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 2 a 10 y las SEQ ID NO: 48 a 52, en particular una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 2 a 10, en particular una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, más particularmente la SEQ ID NO: 5.
En una segunda variante del primer aspecto de la invención, el mini-GDE es un polipéptido de GDE no humano funcional.
El polipéptido de GDE no humano funcional de la invención puede ser cualquier polipéptido de GDE cuya secuencia codificante sea lo suficientemente pequeña para empaquetarse en un vector de terapia génica, en particular en un vector AAV. De hecho, los presentes inventores han demostrado que los polipéptidos de GDE no humanos cuya secuencia de codificación es más corta que la secuencia de codificación de GDE humana nativa pueden usarse para tratar EAGIII, usando vectores de terapia génica. En una realización particular, el polipéptido de GDE no humano funcional comprende menos de aproximadamente 1500, 1480, 1460, 1440, 1420, 1400, 1380, 1360, 1340, 1320, 1300, 1280, 1260, 1240, 1220, 1200, 1180, 1160, 1140, 1120, 1100, 1080, 1060, 1040, 1020 o menos de aproximadamente 1000 aminoácidos. En una realización particular, el polipéptido de GDE no humano funcional comprende entre aproximadamente 1000 y 1500 aminoácidos, entre aproximadamente 1000 y 1300 aminoácidos, entre aproximadamente 1300 y 1500 aminoácidos o entre aproximadamente 1300 y 1400 aminoácidos.
Según la invención, el polipéptido de GDE no humano funcional de la invención retiene la función biológica del polipéptido de GDE humano, como se define anteriormente. En particular, el polipéptido de GDE no humano es capaz de recuperar la acumulación de glucógeno y la fuerza muscular in vivo.
La secuencia de aminoácidos del polipéptido de GDE no humano funcional o su secuencia codificante puede derivar de cualquier fuente eucariótica no humana, tal como levadura o animales no humanos, incluidos mamíferos no humanos o especies aviares. En una realización particular, el polipéptido de GDE no humano funcional es un polipéptido de GDE de mamífero no humano.
Además, el polipéptido de GDE no humano puede ser una variante funcional de un polipéptido de GDE no humano de tipo silvestre, que comprende una o más modificaciones de aminoácidos tales como inserción, deleción y/o sustitución de aminoácidos en comparación con un polipéptido de GDE nativo de referencia. Por ejemplo, el polipéptido de GDE no humano puede ser un derivado funcional de un polipéptido de GDE no humano, en particular de un polipéptido de GDE animal no humano, tales como los polipéptidos de SEQ ID NO: 11 a SEQ ID NO: 17, que tienen al menos un 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o al menos un 99 % de identidad de secuencia con estos polipéptidos de GDE animales.
En una realización particular, el polipéptido de GDE no humano funcional o su secuencia codificante deriva de caballo, gorila, orangután, Pteropus alecto, mangabey gris, ornitorrinco, pato o diablo de Tasmania.
En una realización particular, el polipéptido de GDE no humano se selecciona en el grupo que consiste en: polipéptido de GDE de caballo de SEQ ID nO: 11, polipéptido de GDE de gorila de SEQ ID NO: 12, polipéptido de GdE de orangután de SEQ ID NO: 13, polipéptido de GdE de Pteropus alecto de SEQ ID NO: 14, polipéptido de GDE de mangabey gris de SEQ ID NO: 15, polipéptido de GDE de ornitorrinco de SEQ ID NO: 16 y polipéptido de GDE de pato de SEQ ID NO: 17.
En una realización particular adicional, el polipéptido de GDE no humano es un polipéptido de GDE de gorila, en particular el polipéptido de GDE de gorila de SEQ ID NO: 12.
En otro aspecto, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica el minipolipéptido de GDE de la invención.
El término "molécula de ácido nucleico" (o secuencia de ácido nucleico) se refiere a una molécula de ADN o ARN en forma monocatenaria o bicatenaria, particularmente a un ADN que codifica un polipéptido de GDE humano truncado funcional o un polipéptido de GDE no humano funcional según la invención.
Según la presente invención, la molécula de ácido nucleico que codifica el minipolipéptido de GDE es lo suficientemente pequeña para empaquetarse en un vector de terapia génica, en el que el vector de terapia génica es como se define anteriormente. En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico que codifica el minipolipéptido de GDE es lo suficientemente pequeña para empaquetarse en un vector AAV. Preferiblemente, el tamaño de la molécula de ácido nucleico que codifica el minipolipéptido de GDE tiene menos de aproximadamente 5, 4,7, 4,5, 4,2, 4,1,4, 3,7, 3,5, 3,2, 3, 2,7, 2,5, 2,2, 2 o 1,5 kb. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico que codifica el minipolipéptido de GDE tiene menos de aproximadamente 4,1 kb.
La secuencia de la molécula de ácido nucleico de la invención, que codifica un minipolipéptido de GDE, puede optimizarse para la expresión del polipéptido de GDE in vivo. La optimización de la secuencia puede incluir una serie de cambios en una secuencia de ácido nucleico, incluida la optimización de codones, el aumento del contenido de GC, la disminución del número de islas de CpG, la disminución del número de marcos de lectura abiertos (ARF) alternativos y la disminución del número de sitios donantes de corte y empalme y aceptores de corte y empalme. Debido a la degeneración del código genético, diferentes moléculas de ácido nucleico pueden codificar la misma proteína. También es bien sabido que los códigos genéticos de diferentes organismos suelen estar sesgados hacia el uso de uno de los varios codones que codifican el mismo aminoácido sobre los demás. A través de la optimización de codones, se introducen cambios en una secuencia de nucleótidos que aprovechan el sesgo de codones existente en un contexto celular dado, de modo que es más probable que la secuencia de nucleótidos de codones optimizados resultante se exprese en tal contexto celular dado a un nivel relativamente alto en comparación con la secuencia de codones no optimizados. En una realización preferida de la invención, tal secuencia de nucleótidos de secuencia optimizada que codifica un minipolipéptido de GDE tiene codones optimizados para mejorar su expresión en células humanas en comparación con secuencias de nucleótidos sin codones optimizados que codifican el mismo minipolipéptido de GDE, por ejemplo aprovechando el sesgo de uso de codones específicos humanos. La secuencia de ácido nucleico que codifica la isoforma 1 de GDE humana de longitud completa es como se muestra en la SEQ ID NO: 37. Los ejemplos de la secuencia de codones optimizados correspondiente son los que se muestran en las SEQ ID NO: 38 o SEQ ID NO: 39.
En una realización particular, la molécula de ácido nucleico de la invención comprende o consiste en:
- la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 18, que codifica el polipéptido de GDE humano truncado funcional que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 2;
- la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 20, que codifica el polipéptido de GDE humano truncado funcional que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 3;
- la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 21, que codifica el polipéptido de GDE humano truncado funcional que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 4;
- la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 22, que codifica el polipéptido de GDE humano truncado funcional que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 5;
- la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 24, que codifica el polipéptido de GDE humano truncado funcional que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO 6;
- la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 26, que codifica el polipéptido de GDE humano truncado funcional que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 7;
- la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 27, que codifica el polipéptido de GDE humano truncado funcional que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 8;
- la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 28, que codifica el polipéptido de GDE humano truncado funcional que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 9;
- la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 29, que codifica el polipéptido de GDE humano truncado funcional que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 10;
- la secuencia que se muestra en las SEQ ID NO: 53 o SEQ ID NO: 59, que codifica el polipéptido de GDE humano truncado funcional que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 48;
- la secuencia que se muestra en las SEQ ID NO: 54 o SEQ ID NO: 60, que codifica el polipéptido de GDE humano truncado funcional que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 49;
- la secuencia que se muestra en las SEQ ID NO: 55 o SEQ ID NO: 61, que codifica el polipéptido de GDE humano truncado funcional que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 50;
- la secuencia que se muestra en las SEQ ID NO: 56 o SEQ ID NO: 62, que codifica el polipéptido de GDE humano truncado funcional que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 51; o
- la secuencia que se muestra en las SEQ ID NO: 57 o SEQ ID NO: 63, que codifica el polipéptido de GDE humano truncado funcional que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 52.
En una realización particular adicional, la molécula de ácido nucleico de la invención comprende o consiste en:
- la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 18, que codifica el polipéptido de GDE humano truncado funcional que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 2;
- la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 20, que codifica el polipéptido de GDE humano truncado funcional que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 3;
- la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 21, que codifica el polipéptido de GDE humano truncado funcional que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 4;
- la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 22, que codifica el polipéptido de GDE humano truncado funcional que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 5;
- la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 24, que codifica el polipéptido de GDE humano truncado funcional que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO 6;
- la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 26, que codifica el polipéptido de GDE humano truncado funcional que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 7;
- la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 27, que codifica el polipéptido de GDE humano truncado funcional que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO 8;
- la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 28, que codifica el polipéptido de GDE humano truncado funcional que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 9; o
- la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 29, que codifica el polipéptido de GDE humano truncado funcional que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 10.
Como ya se mencionó, en las secuencias anteriores pueden optimizarse los codones. Las secuencias que se muestran en las SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 25 son ejemplos de secuencias con codones optimizados correspondientes a las SEQ ID NO: 18, sEq ID NO: 22 y SEQ ID No: 24, respectivamente.
En otra realización particular, la molécula de ácido nucleico de la invención comprende o consiste en:
- la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 30, que codifica el polipéptido de GDE no humano que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 11;
- la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 31, que codifica el polipéptido de GDE no humano que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 12;
- la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 32, que codifica el polipéptido de GDE no humano que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 13;
- la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 33, que codifica el polipéptido de GDE no humano que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 14;
- la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 34, que codifica el polipéptido de GDE no humano que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 15;
- la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 35, que codifica el polipéptido de GDE no humano que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 16; o
- la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 36, que codifica el polipéptido de GDE no humano que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 17.
La molécula de ácido nucleico que codifica el minipolipéptido de GDE como se define anteriormente puede tener al menos un 90 o al menos un 95 % de identidad con cualquiera de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 18 a 26. En una realización particular, la molécula de ácido nucleico que codifica el minipolipéptido de GDE como se define anteriormente puede tener al menos un 90 o al menos un 95 % de identidad con cualquiera de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 18 a 36 y SEQ ID NO: 53 a 57. En una realización particular, la molécula de ácido nucleico de la invención tiene al menos un 95 % de identidad, por ejemplo, al menos un 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con cualquiera de las secuencias de nucleótidos de SEQ ID NO: 18 a 36. En una realización particular adicional, la molécula de ácido nucleico de la invención tiene al menos un 95 % de identidad, por ejemplo, al menos un 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con cualquiera de las secuencias de nucleótidos de SeQ ID NO: 18 a 36 y SEQ ID NO: 53 a 57.
El término "idéntico" y sus declinaciones se refieren a la identidad de secuencia entre dos moléculas de ácido nucleico o entre dos moléculas de polipéptido. Cuando una posición en las dos secuencias comparadas está ocupada por la misma base o el mismo aminoácido, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones coincidentes compartidas por las dos secuencias dividido por el número de posiciones comparadas X 100. Por ejemplo, si 6 de 10 de las posiciones en dos secuencias
coinciden, entonces las dos secuencias son 60 % idénticas. Generalmente, se hace una comparación cuando se alinean dos secuencias para dar la máxima identidad. Se podrían usar diversas herramientas bioinformáticas conocidas por los expertos en la materia para alinear secuencias de ácidos nucleicos, tales como BLAST o FASTA.
La invención también se refiere a un constructo de ácido nucleico que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención. El constructo de ácido nucleico puede corresponder a un módulo de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico de la invención, ligada operativamente a una o más secuencias de control de expresión y/u otras secuencias que mejoran la expresión. Como se usa en el presente documento, el término "ligado operativamente" se refiere a un grupo de enlace de elementos polinucleotídicos en una relación funcional. Un ácido nucleico está "ligado operativamente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor, u otra secuencia reguladora de la transcripción, se liga operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia codificante. Tales secuencias de control de la expresión son conocidas en la materia, tales como promotores, potenciadores (tales como los módulos reguladores en cis (CRM)), intrones, señales poliA, etc.
En una realización particular, el módulo de expresión puede incluir un promotor. El promotor puede ser un promotor ubicuo o específico de tejido, en particular un promotor capaz de promover la expresión en células o tejidos en los que es deseable la expresión de GDE, tal como en células o tejidos en los que es deseable la expresión de GDE en pacientes con deficiencia de GDE.
En una realización particular, el promotor es un promotor específico de músculo. Los ejemplos no limitantes de promotores específicos de músculo incluyen el promotor de creatina quinasa muscular (MCK). Son ejemplos no limitantes de promotores de creatina quinasa muscular adecuados promotores de creatina quinasa muscular humana y promotores de creatina quinasa muscular murina truncados [(tMCK)] (Wang B et al, Construction and analysis of compact muscle-selective promoters for AAV vectors. Gene Ther. noviembre de 2008; 15 (22): 1489-99) (número de acceso a GenBank representativo AF188002). La creatina quinasa muscular humana tiene el Gene Id NO. 1158 (número de acceso a GenBank representativo NC_000019.9, consultado el 26 de diciembre de 2012). Otros ejemplos de promotores específicos de músculo incluyen un promotor sintético C5.12 (spC5.12, denominado como alternativa en el presente documento "C5.12"), tal como el spC5.12 o el promotor spC5.12 (divulgado en Wang et al., Gene Therapy volumen 15, páginas 1489-1499 (2008)), el promotor MHCK7 (Salva et al. Mol Ther. febrero de 2007; 15 (2 ): 320-9), promotores de la cadena ligera de miosina (MLC), por ejemplo MLC2 (Gene ID NO. 4633; número de acceso a GenBank representativo NG_007554.1, consultado el 26 de diciembre de 2012); promotores de cadena pesada de miosina (MHC), por ejemplo alfa-MHC (Gene ID NO. 4624; número de acceso a GenBank representativo NG_023444.1, consultado el 26 de diciembre de 2012); promotores de desmina (Gene ID NO. 1674; número de acceso a GenBank representativo NG_008043.1, consultado el 26 de diciembre de 2012); promotores de troponina C cardiaca (Gene ID NO. 7134; número de acceso a GenBank representativo NG_008963.1, consultado el 26 de diciembre de 2012); promotores de troponina I (Gene ID NO. 7135, 7136 y 7137; números de acceso a GenBank representativos N G _016649.1, NG 011621.1 y n G_007866.2, consultados el 26 de diciembre de 2 0 1 2 ); promotores de la familia de genes myoD (Weintraub et al., Science, 251, 761 (1991); Gen ID NO. 4654; número de acceso a GenBank representativo NM_002478, consultado el 26 de diciembre de 2012); promotores de alfa actina (Gene ID NO. 58, 59 y 70; números de acceso a GenBank representativos NG_006672.1, NG_011541.1 y NG_007553.1, consultados el 26 de diciembre de 2012); promotores de beta actina (Gene ID NO. 60; número de acceso a GenBank representativo NG 007992.1, consultado el 26 de diciembre de 2012); promotores de actina gamma (Gene ID NO. 71 y 72; números de acceso a GenBank representativos N G _011433.1 y NM_001199893, consultados el 26 de diciembre de 2012); promotores específicos del músculo que residen dentro del intrón 1 de la forma ocular de Pitx3 (Gene ID NO. 5309) (Coulon et al; el promotor selectivo del músculo corresponde a los residuos 11219-11527 del número de acceso a GenBank representativo NG 008147, consultado el 26 de diciembre, 2012); y los promotores descritos en la publicación de patente de EE. UU. US 2003/0157064 y promotores CK6 (Wang et al 2008 doi: 10.1038/gt.2008.104). En otra realización particular, el promotor específico de músculo es el promotor E-Syn descrito en Wang et al., Gene Therapy volumen 15, páginas 1489-1499 (2008), que comprende la combinación de un potenciador derivado de MCK y del promotor spC5.12. En una realización particular de la invención, el promotor específico del músculo se selecciona del grupo que consiste en un promotor spC5.12, el promotor MHCK7, el promotor E-syn, un promotor de la cadena ligera (MLC) de miosina de creatina quinasa muscular, un promotor de la cadena pesada de miosina (MHC), un promotor de troponina C cardíaca, un promotor de troponina I, un promotor de la familia de genes myoD, un promotor de actina alfa, un promotor de actina beta, un promotor de actina gamma, un promotor específico de músculo que reside dentro del intrón 1 del forma ocular de Pitx3, un promotor CK6 , un promotor CK8 y un promotor Acta1. En una realización particular, el promotor específico de músculo se selecciona del grupo que consiste en los promotores spC5.12, de desmina y MCK. En otra realización, el promotor específico de músculo se selecciona del grupo que consiste en los promotores spC5.12 y MCK. En una realización particular, el promotor específico de músculo es el promotor spC5.12.
En una realización particular, el promotor es un promotor específico de hígado. Los ejemplos no limitantes de promotores específicos del hígado incluyen el promotor de alfa-1-antitripsina (hAAT), el promotor de transtiretina, el promotor de albúmina, el promotor de globulina fijadora de tiroxina (TBG), el promotor de LSP (que comprende una secuencia promotora de globulina de unión a hormona tiroidea, dos copias de una secuencia potenciadora de alfa1 -microglobulina/bikunina y una secuencia líder - III, C. R., et al. (1997). Optimization of the human factor VIII complementary DNA expression plasmid for gene therapy of hemophilia A. Blood Coag. Fibrinol. 8 : S23-S30.), etc. En
la materia se conocen otros promotores específicos de hígado útiles, por ejemplo, los enumerados en la base de datos de promotores de genes específicos de hígado compilada por el Cold Spring Harbor Laboratory (http://rulai.cshl.edu/LSPD/). Un promotor específico de hígado preferido en el contexto de la invención es el promotor hAAT.
En otra realización particular, el promotor es un promotor específico de neuronas. Los ejemplos no limitantes de promotores específicos de neuronas incluyen, pero sin limitación, los siguientes: promotor de sinapsina-1 (Syn), promotor de enolasa específica de neuronas (NSE) (Andersen et al., Cell. mol. Neurobiol., 13:503-15 (1993)), promotor del gen de la cadena ligera del neurofilamento (Piccioli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:5611-5 (1991)), y el promotor del gen vgf específico de neuronas (Piccioli et al. Neuron, 15:373-84 (1995)), entre otros que serán evidentes para el experto en la materia. En una realización particular, el promotor específico de neuronas es el promotor Syn. Otros promotores específicos de neuronas incluyen, sin limitación: el promotor de sinapsina-2, el promotor de tirosina hidroxilasa, el promotor de dopamina p-hidroxilasa, el promotor de hipoxantina fosforribosiltransferasa, el promotor del receptor de NGF de baja afinidad y el promotor de colina acetiltransferasa (Bejanin et al., 1992; Carroll et al., 1995; Chin y Greengard, 1994; Foss-Petter et al., 1990; Harrington et al., 1987; Mercer et al., 1991; Patei et al., 1986). Los promotores representativos específicos para las neuronas motoras incluyen, sin limitación, el promotor del péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP), un factor conocido derivado de las neuronas motoras. Otros promotores funcionales en las neuronas motoras incluyen los promotores de colina acetiltransferasa (ChAT), enolasa específica de neurona (NSE), sinapsina y Hb9. Otros promotores específicos de neuronas útiles en la presente invención incluyen, sin limitación: GFAP (para astrocitos), calbindina 2 (para interneuronas), Mnx1 (neuronas motoras), nestina (neuronas), parvalbúmina, somatostatina y Plp1 (oligodendrocitos y células de Schwann).
En otra realización particular, el promotor es un promotor ubicuo. Los promotores ubicuos representativos incluyen el potenciador de citomegalovirus/promotor de beta actina de pollo (CAG), el potenciador/promotor de citomegalovirus (CMV) (opcionalmente con el potenciador de CMV) [véase, por ejemplo, Boshart et al., Cell, 41:521-530 (1985)], el promotor PGK, el promotor temprano SV40, el promotor LTR retrovírico del virus del sarcoma de Rous (RSV) (opcionalmente con el potenciador de RSV), el promotor de la dihidrofolato reductasa, el promotor de p-actina, el promotor de fosfoglicerol quinasa (PGK) y el promotor EF1 alfa.
Además, el promotor también puede ser un promotor endógeno tal como el promotor de albúmina o el promotor de GDE.
En una realización particular, el promotor está asociado a una secuencia potenciadora, tal como un módulo regulador en cis (CRM) o una secuencia potenciadora artificial. Los CRM útiles en la práctica de la presente invención incluyen los descritos en Rincón et al., Mol Ther. enero de 2015; 23(1):43-52, Chuah et al., Mol Ther. septiembre de 2014; 22 (9): 1605-13 o Nair et al., Blood. 15 de mayo de 2014; 123(20): 3195-9. Otros elementos reguladores que son, en particular, capaces de potenciar la expresión de genes específicos del músculo, en particular la expresión en el músculo cardíaco y/o el músculo esquelético, son los divulgados en el documento WO2015110449. Los ejemplos particulares de elementos reguladores de ácidos nucleicos que comprenden una secuencia artificial incluyen los elementos reguladores que se obtienen reorganizando los sitios de unión del factor de transcripción (TFBS) que están presentes en las secuencias divulgadas en el documento WO2015110449. Dicha reorganización puede comprender cambiar el orden de los TFBS y/o cambiar la posición de uno o más TFBS con respecto a los otros TFBS y/o cambiar el número de copias de uno o más de los TFBS. Por ejemplo, un elemento regulador de ácido nucleico para potenciar la expresión génica específica del músculo, en particular la expresión génica específica del músculo cardíaco y esquelético, puede comprender sitios de unión para E2A, HNH1, NF1, C/EBP, LRF, MyoD y SREBP; o para E2A, NF1, p53, C/EBP, LRF y SREBP; o para E2A, HNH1, HNF3a, HNF3b, NF1, C/EBP, LRF, MyoD y SREBP; o E2A, HNF3a, NF1, C/EBP, LRF, MyoD y SREBP; o para E2A, HNF3a, NF1, CEBP, LRF, MyoD y SREBP; o para HNF4, NF1, RSRFC4, C/EBP, LRF y MyoD, o NF1, PPAR, p53, C/EBP, LRF y MyoD. Por ejemplo, un elemento regulador de ácido nucleico para potenciar la expresión génica específica del músculo, en particular la expresión génica específica del músculo esquelético, también puede comprender sitios de unión para E2A, NF1, SRFC, p53, C/EBP, LRF y MyoD; o para E2A, NF1, C/EBP, LRF, MyoD y SREBP; o para E2A, HNF3a, C/EBP, LRF, MyoD, SEREBP y Tal1_b; o para E2A, SRF, p53, C/EBP, LRF, MyoD y SREBP; o para HNF4, NF1, RSRFC4, C/EBP, LRF y SREBP; o para E2A, HNF3a, HNF3b, NF1, SRF, c /e BP, l Rf , MyoD y SREBP; o para E2A, CEBP y MyoD. En ejemplos adicionales, estos elementos reguladores de ácidos nucleicos comprenden al menos dos, tal como 2, 3, 4 o más copias de uno o más de los TFBS enumerados anteriormente. Otros elementos reguladores que son, en particular, capaces de potenciar la expresión de genes específicos del hígado, son los divulgados en el documento WO2009130208.
En otra realización particular, el constructo de ácido nucleico comprende un intrón, en particular un intrón colocado entre el promotor y la secuencia codificante de GDE. Puede introducirse un intrón para aumentar la estabilidad del ARNm y la producción de la proteína. En una realización adicional, el intrón es un intrón de beta globina b2 humana (o HBB2), un intrón del factor de coagulación IX (FIX), un intrón de SV40, un intrón A de CMVh (hCMVI), un intrón de TPL (TPLI), un intrón 1 del gen CHEF1 (CHEFI), un intrón de MVM (Wu et al, 2008), un intrón 1 truncado de FIX (Wu et al., 2 0 0 8 , Mol Ther, 16(2): 280-289; Kurachi et al., 1995, J Biol Chem., 270(10): 5276-5281), un intrón híbrido de cadena pesada de globina p/inmunoglobina (sitio donante 5' de un intrón de globina p humana y sitio receptor 3' de un intrón de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina, Wu et al., 2008, Mol Ther, 16(2): 280-289 ; Kurachi et al., 1995, J Biol Chem., 270(10): 5276-5281), un intrón híbrido que consiste en un donante de corte y empalme de adenovirus y un corte y empalme de inmunoglobulina G (Wong et al., 1985, Chromosoma, 92(2): 124-135 ; Yew et al.,
1997, Hum Gene Ther, 8(5): 575-584; Choi T. et al., 1991, Mol Cell Biol, 11(6): 3070-3074; Huang et al., 1990, Mol Cell Biol., 10(4): 1805-1810), un intrón híbrido de SV40 19S/16S (sitio donante 5' del intrón 19S y sitio aceptor 3' del intrón 16S, Yew et al., 1997, Hum Gene Ther, 8(5): 575-584) o un intrón de beta-globina de pollo. En otra realización adicional, el intrón es un intrón modificado (en particular, un intrón HBB2 o FIX modificado) diseñado para disminuir el número de, o incluso retirar totalmente, marcos de lectura abiertos alternativos (ARF) que se encuentran en dicho intrón. Preferiblemente, se retiran los ARF cuya longitud se extiende por encima de las 50 pb y tienen un codón de terminación en fase con un codón de inicio. Los ARF pueden retirarse modificando la secuencia del intrón. Por ejemplo, la modificación puede llevarse a cabo mediante sustitución, inserción o deleción de nucleótidos, preferiblemente mediante sustitución de nucleótidos. Como ilustración, uno o más nucleótidos, en particular un nucleótido, en un codón de inicio ATG o GTG presente en la secuencia del intrón de interés pueden reemplazarse dando como resultado un codón que no es de inicio. Por ejemplo, un ATG o un GTG pueden ser reemplazados por un CTG, que no es un codón de inicio, dentro de la secuencia del intrón de interés.
El intrón HBB2 clásico se muestra en la SEQ ID NO: 42. Por ejemplo, este intrón HBB2 puede modificarse eliminando los codones de inicio (codones ATG y GTG) dentro de dicho intrón. En una realización particular, el intrón HBB2 modificado tiene la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 43. El intrón FIX clásico deriva del primer intrón de FIX humana y se muestra en la SEQ ID NO: 44. El intrón FIX puede modificarse eliminando los codones de inicio (codones ATG y GTG) dentro de dicho intrón. En una realización particular, el intrón FIX modificado tiene la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 45. El intrón de beta-globina de pollo clásico usado en constructos de ácido nucleico se muestra en la SEQ ID NO: 46. El intrón de beta-globina de pollo se puede modificar eliminando los codones de inicio (codones ATG y GTG) dentro de dicho intrón. En una realización particular, el intrón de beta-globina de pollo modificado tiene la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 47.
Los inventores han mostrado previamente en el documento WO2015/162302 que tal intrón modificado, en particular un intrón HBB2 o FIX modificado, tiene propiedades ventajosas y puede mejorar significativamente la expresión de un transgén.
En una realización particular, el constructo de ácido nucleico de la invención es un módulo de expresión que comprende, en orientación 5' a 3', un promotor precedido opcionalmente por un potenciador, la secuencia codificante de la invención (es decir, la molécula de ácido nucleico que codifica un minipolipéptido de GDE) y una señal de poliadenilación tal como la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (poliA de bGH), la señal de poliadenilación de SV40 u otra señal de poliadenilación de origen natural o artificial. En particular, la señal de poliadenilación es la poliA de bGH. En una realización preferida, se prefiere una señal poliA muy corta. Por ejemplo, se prefiere una señal poliA muy corta que comprenda menos de 20 nucleótidos. En una realización particular, la señal de poliadenilación es la señal de poliadenilación de neuropilina-1 soluble humana (sNRP) (sNRP poliA; SEQ ID NO: 58).
En una realización particular, el constructo de ácido nucleico de la invención es un módulo de expresión que comprende, en orientación 5' a 3', un promotor precedido opcionalmente por un potenciador, un intrón, la secuencia codificante de la invención y una señal de poliadenilación. En otra realización, el constructo de ácido nucleico de la invención es un módulo de expresión que comprende, en orientación 5' a 3', un promotor, la secuencia codificante de la invención y una señal de poliadenilación. En otra realización, el constructo de ácido nucleico de la invención es un módulo de expresión que comprende, en orientación 5' a 3', un potenciador, un promotor, la secuencia codificante de la invención y una señal de poliadenilación. En otra realización, el constructo de ácido nucleico de la invención es un módulo de expresión que comprende, en orientación 5' a 3', un promotor SpC5-12, la secuencia codificante de la invención y una señal de poliadenilación (tal como poliA de bGH o una poliA de sNRP, en particular una poliA de bGH). En otra realización, el constructo de ácido nucleico de la invención es un módulo de expresión que comprende, en orientación 5' a 3', un potenciador, un promotor SpC5-12, la secuencia codificante de la invención y una señal de poliadenilación (tal como una poliA de bGH o una poliA de sNRP, en particular una poliA de bGH). En otra realización particular, el constructo de ácido nucleico de la invención es un módulo de expresión que comprende, en orientación 5' a 3', un potenciador, un promotor, un intrón, la secuencia codificante de la invención y una señal de poliadenilación. En otra realización particular de la invención el módulo de expresión comprende, en orientación 5' a 3', un promotor, un intrón opcional, la secuencia codificante de la invención y una señal poliA. En otra realización particular, el módulo de expresión comprende, en orientación 5' a 3': un promotor SpC5-12; un intrón de SV40; una secuencia que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 o SEQ ID NO: 52, en particular SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6, en particular SEQ ID NO: 5; y una poliA de bGH. En una realización particular adicional, el constructo de ácido nucleico de la invención es un módulo de expresión que comprende, en orientación 5' a 3', un promotor, la secuencia codificante de la invención y una señal de poliadenilación. En una realización particular adicional de la invención, el módulo de expresión comprende, en orientación 5' a 3', un potenciador, un promotor, la secuencia codificante de la invención y una señal poliA. En una realización particular adicional, el módulo de expresión comprende, en orientación 5' a 3': un promotor SpC5-12; una secuencia que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 o SEQ ID NO: 52, en particular SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6, en particular SEQ ID NO: 5; y una poli A de bGH o poliA de sNRP, en particular una poliA de bGH. En otra realización, el módulo de expresión comprende, en orientación 5' a 3': un promotor de CMV; un intrón de SV40; una secuencia que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2,
SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 o SEQ ID NO: 52, en particular SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6, en particular SEQ ID NO: 5; y una poli A de bGH. En una realización adicional, el módulo de expresión comprende, en orientación 5' a 3': un promotor de CMV; una secuencia que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 o SEQ ID NO: 52, en particular SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6, en particular SEQ ID NO: 5; y una poliA de bGH o poliA de sNRP, en particular una poliA de bGH. En una realización particular adicional, el módulo de expresión comprende, en orientación 5' a 3': un promotor SpC5-12; un intrón de SV40; una secuencia que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; y una poliA de bGH. En una realización particular adicional, el módulo de expresión comprende, en orientación 5' a 3': un promotor SpC5-12; una secuencia que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; y una poliA de bGH o poliA de sNRP, en particular una poliA de bGH. En otra realización, el módulo de expresión comprende, en orientación 5' a 3': un promotor de CMV; un intrón de SV40; una secuencia que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; y una poluiA de bGH. En otra realización, el módulo de expresión comprende, en orientación 5' a 3': un promotor de CMV; una secuencia que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; y una poliA de bGH o poliA de sNRP, en particular una poliA de bGH.
Al diseñar el constructo de ácido nucleico de la invención, un experto en la materia tendrá cuidado de respetar el límite de tamaño del vector usado para suministrar dicho constructo a una célula u órgano. En particular, un experto en la materia sabe que una limitación principal del vector AAV es su capacidad de carga, que puede variar de un serotipo de AAV a otro, pero se cree que está limitada a aproximadamente el tamaño del genoma vírico parental. Por ejemplo, 5 kb es el tamaño máximo que generalmente se piensa que se empaqueta en una cápside AAV8 (Wu Z. et al., Mol Ther., 2010, 18(1): 80-86; Lai Y. et al., Mol Ther., 2010, 18(1): 75-79; Wang Y. et al., Hum Gene Ther Methods, 2012, 23(4): 225-33). Además, durante la producción de AAV recombinante, los genomas de más de 5 kb se encapsidan con baja eficacia y el AAV resultante puede contener genomas fragmentados que reducen la eficacia de la transferencia génica. Por consiguiente, los expertos en la materia tendrán cuidado en la práctica de la presente invención de seleccionar los componentes del constructo de ácido nucleico de la invención de modo que la secuencia de ácido nucleico resultante, incluidas las secuencias que codifican 5'- y 3'-ITR de AAV, preferiblemente no supere el 110 % de la capacidad de carga del vector AAV implementado, en particular, preferentemente no supere los 5 kb. Los vectores AAV que tienen mayor capacidad de carga también se pueden usar en el contexto de la presente invención. Por ejemplo, se muestra que las partículas de AAV que carecen de la subunidad Vp2 empaquetan con éxito genomas más grandes (es decir, 6 kb) mientras conservan la integridad de los genomas encapsidados (Grieger et al., 2005, J Virol., 79(15):9933-9944).
La presente invención también se refiere a un vector que comprende una molécula o constructo de ácido nucleico como se divulga en el presente documento. En una realización particular, el vector comprende una molécula o un constructo de ácido nucleico que codifica un polipéptido de GDE humano truncado funcional como se define anteriormente. En otra realización particular, el vector comprende una molécula o constructo de ácido nucleico que codifica un polipéptido de GDE no humano funcional como se define anteriormente.
En particular, el vector de la invención es un vector adecuado para la expresión de proteínas, preferiblemente para uso en terapia génica. En una realización, el vector es un vector plasmídico. En otra realización, el vector es una nanopartícula que contiene una molécula de ácido nucleico de la invención, en particular un ARN mensajero que codifica el minipolipéptido de GDE de la invención. En otra realización, el vector es un sistema basado en transposones, que permite la integración de la molécula o constructo de ácido nucleico de la invención en el genoma de la célula diana, tal como el sistema transposón hiperactivo Sleeping Beauty (SB100X) (Mates et al. 2009). En otra realización, el vector es un vector vírico adecuado para la terapia génica, orientado a cualquier célula de interés, tal como células o tejido hepático, células musculares, células del SNC (tales como células cerebrales) o citoblastos hematopoyéticos, tales como células del linaje eritroide (tales como eritrocitos). En este caso, el constructo de ácido nucleico de la invención también contiene secuencias adecuadas para producir un vector vírico eficaz, como es bien conocido en la materia.
Se prefieren los vectores víricos para suministrar la molécula o constructo de ácido nucleico de la invención, tales como un vector retrovírico, por ejemplo, un vector lentivírico, o un parvovirus no patógeno, más preferiblemente un vector AAV. El virus adenoasociado (AAV) del parvovirus humano es un dependovirus que es naturalmente defectuoso para la replicación y que es capaz de integrarse en el genoma de la célula infectada para establecer una infección latente. La última propiedad parece ser única entre los virus de mamíferos porque la integración ocurre en un sitio específico en el genoma humano, llamado AAVS1, localizado en el cromosoma 19 (19q13.3-qter).
Por lo tanto, los vectores AAV han despertado un interés considerable como vectores potenciales para la terapia génica humana. Entre las propiedades favorables del virus se encuentran su falta de asociación con ninguna enfermedad humana, su capacidad para infectar tanto células en división como que no se dividen, y el amplio intervalo de estirpes celulares derivadas de diferentes tejidos que pueden infectarse.
Entre los serotipos de AAV aislados de seres humanos o primates no humanos (NHP) y bien caracterizados, el serotipo 2 humano es el primer AAV que se desarrolló como vector de transferencia de genes. Otros serotipos de AAV usados actualmente incluyen las variantes AAV-1, AAV-2 (tales como el AAV-2 optimizado con cápside mutante cuádruple
que comprende una cápside genomanipulada con cambios Y44+500+730F+T491V, divulgada en Ling et al., 18 de julio de 2016, Hum Gene Ther Methods), las variantes -3 y AAV-3 (tales como la variante AAV3-ST que comprende una cápside de AAV3 genomanipulada con dos cambios de aminoácidos, S663V+T492V, divulgada en Vercauteren et al., 2016, Mol. Ther. vol. 24(6), pág. 1042), variantes -3B y AAV-3B, variantes -4, -5, -6 y AAV-6 (tales como la variante AAV6 que comprende la forma Y731HY705HT492V de la cápside de AAV6 triplemente mutada divulgada en Rosario et al., 2016, Mol Ther Methods Clin Dev. 3, pág.16026), -7, -8, -9, -2G9, -10 tales como cy10 y -rh10, -rh74, -dj, Anc80, LK03, AAV2i8, serotipos de AAV porcinos tales como AAVpo4 y AAVpo6, y mutantes de tirosina, lisina y serina de la cápside de los serotipos de AAV, etc. Además, también pueden ser útiles otras variantes genomanipuladas no naturales y AAV quimérico.
Los virus AAV pueden genomanipularse usando técnicas convencionales de biología molecular, lo que hace posible optimizar estas partículas para el suministro específico a células de secuencias de ácido nucleico, para minimizar la inmunogenicidad, para ajustar la estabilidad y la vida útil de las partículas, para una degradación eficiente y para un suministro preciso al núcleo.
Los fragmentos de AAV deseables para ensamblar en vectores incluyen las proteínas cap, incluidas las regiones vp1, vp2, vp3 e hipervariable, las proteínas rep, incluidas rep 78, rep 68, rep 52 y rep 40, y las secuencias que codifican estas proteínas. Estos fragmentos se pueden utilizar fácilmente en una variedad de sistemas de vectores y células hospedadoras.
Los vectores recombinantes basados en AAV que carecen de la proteína Rep se integran con poca eficacia en el genoma del hospedador y se presentan principalmente como episomas circulares estables que pueden persistir durante años en las células diana. Como alternativa al uso de serotipos naturales de AAV, se pueden usar serotipos de AAV artificiales en el contexto de la presente invención, incluidos, sin limitación, AAV con una proteína de la cápside de origen no natural. Dicha cápside artificial puede generarse mediante cualquier técnica adecuada, usando una secuencia de AAV seleccionada (por ejemplo, un fragmento de una proteína de la cápside vp1) en combinación con secuencias heterólogas que pueden obtenerse de un serotipo de AAV seleccionado diferente, porciones no contiguas del mismo serotipo de AAV, de una fuente vírica no AAV, o de una fuente no vírica. Un serotipo de AAV artificial puede ser, sin limitación, una cápside de AAV quimérica, una cápside de AAV recombinante o una cápside de AAV "humanizada".
En el contexto de la presente invención, el vector AAV comprende una cápside de AAV capaz de transducir las células diana de interés, es decir, células del tejido tolerogénico (por ejemplo, hepatocitos) y células del tejido o tejidos de interés terapéutico, tales como células musculares, células del SNC o células cardíacas.
Según una realización particular, el vector AAV es de las variantes AAV-1, -2, AAV-2 (tales como el AAV-2 optimizado con cápside cuádruple mutante que comprende una cápside genomanipulada con cambios Y44+500+730F+T491V, divulgada en Ling et al., 18 de julio de 2016, Hum Gene Ther Methods. [Epub antes de la impresión]), variantes -3 y AAV-3 (tales como la variante AAV3-ST que comprende una cápside de AAV3 genomanipulada con dos cambios de aminoácidos, S663V+T492V, divulgada en Vercauteren et al., 2016, Mol. Ther. vol. 24(6), pág. 1042), variantes -3B y AAV-3B, variantes -4, -5, -6 y AAV-6 (tales como la variante AAV6 que comprende la forma Y731HY705HT492V de la cápside de AAV6 triplemente mutada divulgada en Rosario et al., 2016, Mol Ther Methods Clin Dev. 3, pág.16026), -7, -8, -9, -9P1, -2G9, -10 tales como -cy10 y -rh10, -rh39, -rh43, -rh74, -dj, Anc80, LK03, AAV.PHP, AAV2i8, AAV porcinos tales como AAVpo4 y AAVpo6, y mutantes de tirosina, lisina y serina de la cápside de serotipos de AAV. En una realización particular, el vector AAV es del serotipo AAV6, AAV8, AAV9, AAV9P1, AAVrh74 o AAV2i8 (es decir, el vector AAV tiene una cápside del serotipo AAV6, AaV8, AAV9, AAV9P1, AAVrh74 o AAV2i8). En una realización particular adicional, el vector AAV es un vector seudotipado, es decir, su genoma y cápside derivan de AAV de diferentes serotipos. Por ejemplo, el vector AAV seudotipado puede ser un vector cuyo genoma deriva de uno de los serotipos de AAV mencionados anteriormente, y cuya cápside deriva de otro serotipo. Por ejemplo, el genoma del vector seudotipado puede tener una cápside derivada del serotipo AAV6, AAV8, AAV9, AAV9P1, AAVrh74 o AAV2i8, y su genoma puede derivar de un serotipo diferente. En una realización particular, el vector AAV tiene una cápside del serotipo AAV6, AAV8, AAV9 o AAVrh74, en particular del serotipo AAV6, AAV8, AAV9 o AAV9P1, más particularmente del serotipo aAv6, aAv9 o AAV9P1.
En una realización específica, en la que el vector se usa para suministrar el transgén terapéutico a células musculares, el vector AAV se puede seleccionar, entre otros, del grupo que consiste en AAV8, AAV9 y AAVrh74.
En otra realización específica, en la que el vector se usa para suministrar el transgén a células hepáticas, el vector AAV se puede seleccionar, entre otros, del grupo que consiste en AAV1, AAV5, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAVrh39, AAVrh43, AAVrh74, AAV-LK03, AAV2G9, AAV.PHP, AAV-Anc80 y AAV3B.
En una realización específica adicional, en la que el vector se usa para suministrar el transgén al SNC, el vector AAV se puede seleccionar, entre otros, del grupo que consiste en AAV9, AAV9P1, AAV10 y AAV2G9.
En otra realización, la cápside es una cápside modificada. En el contexto de la presente invención, una "cápside modificada" puede ser una cápside quimérica o una cápside que comprende una o más proteínas de cápside VP variantes derivadas de una o más proteínas de cápside VP de AAV de tipo silvestre.
En una realización particular, el vector AAV es un vector quimérico, es decir, su cápside comprende proteínas de cápside VP derivadas de al menos dos serotipos de AAV diferentes, o comprende al menos una proteína VP quimérica que combina regiones o dominios de proteína VP derivados de al menos dos serotipos de AAV. Se describen ejemplos de tales vectores AAV quiméricos útiles para transducir células hepáticas en Shen et al., Molecular Therapy, 2007 y en Tenney et al., Virology, 2014. Por ejemplo, un vector AAV quimérico puede derivar de la combinación de una secuencia de cápside de AAV8 con una secuencia de un serotipo de AAV diferente del serotipo AAV8, tal como cualquiera de los específicamente mencionados anteriormente. En otra realización, la cápside del vector AAV comprende una o más proteínas de cápside VP variantes tales como las descritas en el documento WO2015013313, en particular las variantes de cápside RHM4-1, RHM15-1, RHM15-2, RHM15-3/RHM15-5, RHM15-4 y RHM15-6, que presentan un elevado tropismo hepático.
En otra realización, la cápside modificada también puede derivar de modificaciones de la cápside insertadas por PCR propensa a errores y/o inserción de péptido (por ejemplo, como se describe en Bartel et al., 2011). En una realización particular, la cápside modificada incluye la modificación P1, como se describe como se divulga en el documento PCT/EP2019/058560. Además, las variantes de la cápside pueden incluir cambios de un solo aminoácido, tales como mutantes de tirosina (p. ej., como se describe en Zhong et al., 2008)
Además, el genoma del vector AAV puede ser un genoma monocatenario o bicatenario autocomplementario (McCarty et al., Gene Therapy, 2003). Los vectores AAV bicatenarios autocomplementarios se generan eliminando el sitio de resolución terminal de una de las repeticiones terminales de AAV. Estos vectores modificados, cuyo genoma replicante tiene la mitad de la longitud del genoma de AAV de tipo silvestre, tienen la tendencia a empaquetar dímeros de ADN. En una realización preferida, el vector AAV implementado en la práctica de la presente invención tiene un genoma monocatenario, y además comprende preferiblemente una cápside de AAV8, AAV9, AAVrh74 o AAV2i8, en particular una cápside de AAV8, AAV9 o AAVrh74, tal como una cápside de AAV8 o AAV9, más particularmente una cápside de AAV9.
El vector AAV usado para empaquetar la secuencia de GDE de la invención también puede modificarse para aumentar su capacidad de carga. Por ejemplo, se muestra que los vectores AAV que carecen de la subunidad Vp2 empaquetan con éxito genomas más grandes (es decir, 6 kb) mientras conservan la integridad de los genomas encapsidados (Grieger et al., 2005).
Como se sabe en la materia, pueden introducirse secuencias adecuadas adicionales en el constructo de ácido nucleico de la invención para obtener un vector vírico funcional. Las secuencias adecuadas incluyen las ITR de AAV.
En una realización particular, el vector AAV comprende un promotor específico de músculo como se describe anteriormente, en particular un promotor específico de músculo que presenta alguna pérdida de expresión en las células hepáticas.
En otra realización particular de la invención, el vector AAV comprende un promotor específico de hígado como se describe anteriormente. Las propiedades protolerogénicas y metabólicas del hígado se implementan ventajosamente gracias a esta realización para desarrollar vectores altamente eficientes y optimizados para expresar GDE en hepatocitos e inducir inmunotolerancia a la proteína.
La invención también se refiere a una célula, en particular una célula aislada, por ejemplo una célula hepática, una célula cardíaca, una célula del SNC o una célula muscular, que se transforma o transduce con la molécula de ácido nucleico, el constructo o el vector de la invención. En una realización particular, la célula es una célula humana aislada. En realización particular adicional, la célula no es un citoblasto embrionario humano. La célula de la invención expresa un minipolipéptido de GDE. Las células de la invención pueden suministrarse al sujeto que las necesita, tal como un paciente con deficiencia de GDE, mediante cualquier vía de administración apropiada, tal como inyección en el hígado, en el SNC, en el corazón, en el músculo o músculos o en el torrente sanguíneo de dicho sujeto. En una realización particular, la invención implica transducir células hepáticas o musculares, en particular células hepáticas o musculares del sujeto a tratar, y administrar al sujeto dichas células hepáticas y/o musculares transducidas en las que se ha introducido el ácido nucleico. En una realización particular, las células hepáticas son células hepáticas del paciente a tratar, o son citoblastos hepáticos que se transforman y diferencian adicionalmente in vitro en células hepáticas, para su posterior administración al paciente. En otra realización, la célula es una célula muscular del paciente a tratar, o es un citoblasto muscular que se transforma adicionalmente y, opcionalmente, se diferencia in vitro en células musculares, para su posterior administración al paciente.
La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden la molécula de ácido nucleico, el constructo de ácido nucleico, el vector, el minipolipéptido de GDE o la célula de la invención. Tales composiciones pueden comprender una cantidad terapéuticamente eficaz del agente terapéutico (la molécula de ácido nucleico, el constructo de ácido nucleico, el vector, el minipolipéptido de GDE o la célula de la invención) y un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización específica, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerado en la farmacopea estadounidense o europea u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales y seres humanos. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el agente terapéutico. tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluidos los de origen petrolífero,
animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua es un portador preferido cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Las soluciones salinas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol también se pueden emplear como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares.
La composición, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponadores del pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La formulación oral puede incluir portadores estándares tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Se describen ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E. W. Martin. Tales composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del producto terapéutico, preferiblemente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de portador para proporcionar la forma de administración apropiada al sujeto. En una realización particular, el ácido nucleico, vector o célula de la invención se formula en una composición que comprende solución salina tamponada con fosfato y suplementada con albúmina de suero humano al 0,25 %. En otra realización particular, el ácido nucleico, vector o célula de la invención se formula en una composición que comprende lactato de Ringer y un tensioactivo no iónico, tal como Pluronic F68 a una concentración final de 0,01 -0,0001 %, tal como a una concentración de 0,001 %, en peso de la composición total. La formulación puede comprender además albúmina sérica, en particular albúmina sérica humana, tal como albúmina sérica humana al 0,25 %. Se conocen en la materia otras formulaciones apropiadas para el almacenamiento o la administración, en particular por los documentos WO 2005/118792 o Allay et al., 2011.
En una realización preferida, la composición se formula de acuerdo con los procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para la administración intravenosa a seres humanos. Típicamente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local tal como lignocaína para aliviar el dolor en el lugar de la inyección.
En una realización, la molécula de ácido nucleico, el constructo de ácido nucleico, el vector, el minipolipéptido de GDE o la célula de la invención pueden suministrarse en una vesícula, en particular un liposoma. En otra realización más, la molécula de ácido nucleico, el constructo de ácido nucleico, el vector, el minipolipéptido de GDE o la célula de la invención pueden suministrarse en un sistema de liberación controlada.
En una realización particular, la molécula de ácido nucleico se suministra como un ARNm, correspondiente al transcrito que codifica el minipolipéptido de GDE de la invención. En particular, el ARNm de la invención puede suministrarse usando liposomas tales como nanopartículas lipídicas (LNP).
Los métodos de administración de la molécula de ácido nucleico, el constructo de ácido nucleico, el vector, el minipolipéptido de GDE o la célula de la invención incluyen, pero sin limitación, las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. En una realización particular, la administración es por vía intravenosa o intramuscular. La molécula de ácido nucleico, el constructo de ácido nucleico, el vector, el minipolipéptido de GDE o la célula de la invención, ya sea vectorizada o no, puede administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en bolo, por absorción a través del epitelio o revestimientos mucocutáneos (p. ej., mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y puede administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.
En una realización específica, puede ser deseable administrar las composiciones farmacéuticas de la invención localmente en el área que necesita tratamiento, p. ej., el hígado o el músculo. Esto puede conseguirse, por ejemplo, por medio de un implante, siendo dicho implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas, tales como membranas sialásticas o fibras.
En una realización particular, el minipolipéptido de GDE de la invención se usa en la terapia de reemplazo enzimático (TRE), en particular para tratar EAGIII. El término "terapia de reemplazo enzimático" o "TRE" generalmente se refiere a la introducción de una enzima purificada en un individuo que tiene una deficiencia de tal enzima. El polipéptido administrado de la invención se puede obtener de fuentes naturales, mediante expresión recombinante, producirse in vitro o purificarse a partir de tejido o fluido aislado. En particular, cuando se usa en TRE, el polipéptido de la invención se puede administrar por vía parenteral, tal como por vía intraperitoneal, intramuscular, intravascular (es decir, intravenosa o intraarterial). En particular, el polipéptido se administra mediante inyección intravenosa. Dicha administración puede repetirse con frecuencia, tal como cada día, cada semana, cada dos semanas o cada mes, en particular cada semana o cada dos semanas.
La cantidad del agente terapéutico (es decir, la molécula de ácido nucleico, el constructo de ácido nucleico, el vector, el minipolipéptido de GDE o la célula de la invención) de la invención que será eficaz en el tratamiento de EAGIII puede determinarse mediante pruebas clínicas estándares. Además, opcionalmente se pueden emplear ensayos in vivo y/o in vitro para ayudar a predecir los intervalos de dosificación óptimos. La dosis precisa a emplear en la
formulación también dependerá de la vía de administración y de la gravedad de la enfermedad, y deberá decidirse según el criterio del médico y las circunstancias de cada paciente. La dosificación de la molécula de ácido nucleico, el constructo de ácido nucleico, el vector, el minipolipéptido de GDE o la célula de la invención administrada al sujeto que lo necesita variará en función de varios factores que incluyen, sin limitación, la vía de administración, la enfermedad específica tratada, la edad del sujeto o el nivel de expresión necesario para lograr el efecto terapéutico. Un experto en la materia puede determinar fácilmente, en base a su conocimiento en este campo, el intervalo de dosificación requerido en base a estos factores y otros. En el caso de un tratamiento que comprenda la administración de un vector vírico, tal como un vector AAV, al sujeto, las dosis típicas del vector son de al menos 1x108 genomas de vector por kilogramo de peso corporal (gv/kg), tal como al menos 1x109 gv/kg, al menos 1x1010 gv/kg, al menos 1x10” gv/kg, al menos 1x1012 gv/kg al menos 1x1013 gv/kg, o al menos 1 x1014 gv/kg.
Se divulga, pero no forma parte de la invención, un método para tratar EAGIII, que comprende la etapa de suministrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la molécula de ácido nucleico, el constructo de ácido nucleico, el vector, el minipolipéptido de GDE, la composición farmacéutica o la célula de la invención a un sujeto que lo necesite.
La cirrosis y el carcinoma hepatocelular también pueden desarrollarse en pacientes con EAGIII. Por tanto, la invención también se refiere a un método para tratar la cirrosis y el carcinoma hepatocelular en un paciente con EAGIII que comprende la etapa de suministrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la molécula de ácido nucleico, el constructo de ácido nucleico, el vector, el minipolipéptido de GDE, la composición farmacéutica o la célula de la invención a un sujeto que lo necesite.
La invención también se refiere a un método para tratar EAGIII, no induciendo dicho método una respuesta inmune al transgén (es decir, al minipolipéptido de GDE codificado por la molécula de ácido nucleico), o induciendo una respuesta inmune reducida al transgén, que comprende la etapa de suministrar una cantidad terapéuticamente eficaz del ácido nucleico, el vector, el minipolipéptido de GDE, la composición farmacéutica o la célula de la invención a un sujeto que lo necesite. La invención también se refiere a un método para tratar EAGIII, comprendiendo dicho método la administración repetida de una cantidad terapéuticamente eficaz del ácido nucleico, el vector, el minipolipéptido de GDE, la composición farmacéutica o la célula de la invención a un sujeto que lo necesite. En este aspecto, la molécula de ácido nucleico, el constructo de ácido nucleico o el vector de la invención comprende un promotor que es funcional en las células hepáticas, lo que permite la inmunotolerancia al minipolipéptido de GDE expresado producido a partir de las mismas. Asimismo, en este aspecto, la composición farmacéutica usada en este aspecto comprende una molécula de ácido nucleico, un constructo de ácido nucleico o un vector que comprende un promotor que es funcional en células hepáticas. En el caso de suministro de células, en particular de células hepáticas, cardíacas, del SNC o musculares, dichas células pueden ser células previamente recolectadas del sujeto que necesita el tratamiento y que se genomanipularon introduciendo en ellas la molécula de ácido nucleico, el constructo de ácido nucleico o el vector de la invención para hacerlas así capaces de producir el minipolipéptido de GDE. Según una realización, en el aspecto que comprende una administración repetida, dicha administración puede repetirse al menos una o más veces, e incluso puede considerarse que se realiza según un programa periódico, tal como una vez por semana, por mes o por año. El programa periódico también puede comprender una administración una vez cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 años, o más de 10 años. En otra realización particular, la administración de cada administración de un vector vírico de la invención se realiza usando un virus diferente para cada administración sucesiva, evitando así una reducción de la eficacia por una posible respuesta inmune frente a un vector vírico previamente administrado. Por ejemplo, se puede realizar una primera administración de un vector AAV que comprende una cápside de AAV8, seguida de la administración de un vector que comprende una cápside de AAV9.
Según la presente invención, un tratamiento puede incluir efectos curativos, de alivio o profilácticos. Por consiguiente, el tratamiento terapéutico y profiláctico incluye la mejora de los síntomas de EAGIII o de otro modo la prevención o reducción del riesgo de desarrollar una enfermedad de almacenamiento de glucógeno particular. Puede considerarse que el término "profiláctico" reduce la gravedad o la aparición de una afección particular. "Profiláctico" también incluye prevenir la recurrencia de una afección particular en un paciente previamente diagnosticado con la afección. "Terapéutico" también puede reducir la gravedad de una afección existente. El término "tratamiento" se usa en el presente documento para referirse a cualquier régimen que pueda beneficiar a un animal, en particular a un mamífero, más particularmente a un sujeto humano.
La invención también se refiere a un método ex vivo de terapia génica para el tratamiento de EAGIII, que comprende introducir la molécula de ácido nucleico, el constructo de ácido nucleico o el vector de la invención en una célula aislada de un paciente que lo necesite, por ejemplo, un citoblasto hematopoyético aislado, e introducir dicha célula en dicho paciente que lo necesite.
La invención también se refiere a la molécula de ácido nucleico, el constructo de ácido nucleico, el vector, el minipolipéptido de GDE, la célula o la composición farmacéutica de la invención para su uso como medicamento.
La invención también se refiere a la molécula de ácido nucleico, el constructo de ácido nucleico, el vector, el minipolipéptido de GDE, la célula o la composición farmacéutica de la invención, para su uso en un método para tratar una enfermedad causada por una mutación en el gen GDE, en particular un método para tratar EAGIII (enfermedad de Cori).
La invención se refiere además al uso de la molécula de ácido nucleico, el constructo de ácido nucleico, el vector, el minipolipéptido de GDE, la célula o la composición farmacéutica de la invención, en la fabricación de un medicamento útil para tratar EAGIII (enfermedad de Cori).
EJEMPLOS
La invención se describe con más detalle con referencia a los siguientes ejemplos experimentales y las figuras adjuntas. Estos ejemplos se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y no pretenden ser limitativos.
MATERIAL Y MÉTODOS
Análisis de transferencia Western
Se homogeneizaron tejidos de ratón en agua libre de ADNasa/ARNasa y se determinó la concentración de proteína usando un ensayo de proteína BCA. Se realizó la electroforesis PAGE-SDS en un gel de poliacrilamida con un gradiente de 4-15 %. Después de la transferencia, la membrana se bloqueó y se incubó con un anticuerpo anti-GDE y un anticuerpo anti-actina. La membrana se lavó, se incubó con el anticuerpo secundario apropiado y se visualizó mediante el sistema de imágenes Odyssey.
Mediciones de actividad enzimática
Los tejidos homogeneizados como se describe anteriormente se incubaron de 3 a 16 horas a 37 °C con dextrina límite disuelta en tampón fosfato a pH 6,9. La reacción se detuvo incubando 10 min a 95 °C y luego se centrifugó 10 min a 11000 x g. Se usaron los sobrenadantes para medir la glucosa producida usando un kit de ensayo de glucosa comercial. La reacción se detuvo con H2SO4 concentrado y la absorbancia resultante se midió en un lector de placas EnSpire alfa (Perkin-Elmer, Waltham, MA) a 540 nm.
Medición del contenido de glucógeno
El contenido de glucógeno se midió indirectamente en homogeneizados de tejido como la glucosa liberada después de la digestión total con amiloglucosidasa de AspergillusnNiger (Sigma Aldrich, Saint Louis, MO). Las muestras se incubaron durante 5 min a 95 °C y luego se enfriaron a 4 °C; a continuación, se añadieron a cada muestra 25 μl de amiloglucosidasa diluida 1:50 en acetato de potasio 0,1 M pH 5,5. Se preparó una reacción de control sin amiloglucosidasa para cada muestra. Tanto las reacciones de muestra como las de control se incubaron a 37 °C durante 90 minutos. La reacción se detuvo incubando las muestras durante 5 min a 95 °C. La glucosa liberada se determinó con un kit de análisis de glucosa comercial (Sigma Aldrich, Saint Louis, MO) y la absorbancia resultante se adquirió en un lector de placas EnSpire alfa (Perkin-Elmer, Waltham, MA) a una longitud de onda de 540 nm.
Pruebas de función muscular
Para medir el tiempo medio de suspensión, se realizó una prueba de suspensión de tres minutos de duración en un alambre de 4 mm. Al comienzo de la prueba, se atribuye a cada animal una puntuación de "caída" de 10. Se sujeta un ratón por la cola y se acerca al alambre. El operador suspende al animal solo por las extremidades delanteras. Tan pronto como el animal esté correctamente suspendido, se inicia un cronómetro de 180 segundos. Si el animal cae, el cronómetro se detiene, la puntuación de caída se reduce en 1 y se anota el tiempo transcurrido. Luego se suspende al animal por las extremidades delanteras y el cronómetro vuelve a empezar. La prueba se detiene cuando el cronómetro o la puntuación de caídas llegan a 0. Los resultados se expresan como número de caídas por minuto.
RESULTADOS
Los AAV son el vector de elección para la terapia génica in vivo. Una de las mayores limitaciones en el uso de AAV para el reemplazo génico es su tamaño de encapsidación que está limitado a 5 Kb. De hecho, durante la producción de AAV recombinante, los genomas de más de 5 Kb se encapsidan con baja eficacia y el AAV resultante puede contener genomas fragmentados que reducen la eficacia de la transferencia génica. Se han desarrollado diferentes enfoques para superar esta limitación. En particular, se ha informado sobre el uso de vectores AAV duales. Siguiendo este enfoque, se usan dos vectores, cada uno de los cuales contiene una parte de la secuencia codificante del transgén grande, para transducir la misma célula. La recombinación de los dos vectores puede ocurrir a través de i) una secuencia superpuesta derivada del transgén, ii) repeticiones terminales internas (ITR) combinadas con un donante y aceptor de corte y empalme o iii) una secuencia heteróloga altamente recombinogénica acoplada con un donante y aceptor de corte y empalme. Sin embargo, aunque los vectores AAV duales demostraron eficacia en diferentes modelos animales, tienen algunos inconvenientes. Aquí se informa de los primeros datos sobre el uso de un GDE de gorila que cabe en un solo AAV y recupera la acumulación de glucógeno y la función muscular en ratones con AEGIII con una eficacia similar a la de los vectores duales AAV a una dosis más baja.
La Figura 1 representa 4 proteínas GDE no humanas de mamíferos más pequeñas que la GDE humana (hGDE), sin ser esto exhaustivo.
En la Figura 2 se representan las secuencias A1, A2-3 y A4 de la GDE humana truncada (hGDE).
Primero, se evaluaron los efectos inducidos en ratones con AEGIII por un GDE de mamífero no humano corto. A continuación, se usó un módulo de expresión transgénica compuesto por un promotor específico de músculo (SpC5-12), el intrón de SV40, la secuencia de codificación para GDE de gorila (gGDE) y poliA de bGH (AAV9-gGDE, tamaño total: 5,1 Kb) para producir un vector AAV9 por transfección triple y purificación en gradiente de cloruro de cesio.
A continuación, se inyectó el vector AAV9-gGDE en ratones con AEGIII de 3 meses de edad a la dosis de 1x1012 gv/ratón en paralelo con un vector AAV dual que expresa GDE bajo el control de traducción del promotor de CMV a la dosis de 2 x 1012 gv/ratón. Tres meses después de la inyección del vector, se sacrificaron los ratones y se analizaron los tejidos para evaluar la corrección bioquímica de la AEGIII. La transferencia Western realizada en el corazón de ratones tratados como se describe anteriormente con un anticuerpo específico para GDE indica que la inyección de AAV9-gGDE induce la expresión de una proteína más pequeña que GDE (tamaño estimado ~ 130 KDa) y reconocida por un anticuerpo específico anti-GDE (Figura 3). Luego se evaluó la acumulación de glucógeno en los cuádriceps de animales GDE-KO inyectados con AAV9-gGDE en comparación con un vector AAV9 dual que expresaba GDE bajo el control transcripcional de CMV (Dual-GDE). En el gráfico de la Figura 4 se indican los niveles de glucógeno medidos en animales tratados con AAV y en animales de tipo silvestre (WT) y KO no tratados. El tratamiento con un solo vector que expresaba gGDE retiró la acumulación de glucógeno a niveles comparables a los observados con vectores AAV duales. Además, la medición de la función muscular mediante la suspensión de alambre indica que ambos enfoques son igualmente eficientes en la recuperación de la fuerza muscular (Figura 5). En conjunto, estos datos indican que la expresión de gGDE mediada por AAV en el músculo recupera la acumulación de glucógeno y la fuerza muscular de los ratones con AEGIII.
Luego se evaluó la actividad de las formas truncadas de la secuencia de GDE humana tanto in vitro como in vivo. Primero se transfectaron células de hepatoma hepático (Huh-7) con plásmidos que codifican una forma truncada derivada de GDE humana bajo el control transcripcional de un promotor de CMV. El módulo de expresión también contenía un intrón de SV40 y una señal de poliadenilación de bGH. Dos días después de la transfección, se midió la actividad en extractos citosólicos obtenidos de esas células. La prueba de actividad, basada en la liberación de glucosa a partir de dextrina limitada, permitió detectar una actividad basal en la estirpe celular, debido a la expresión endógena de GDE. La sobreexpresión de GDE humana de tamaño completo dio como resultado un aumento de la actividad de GDE. Se obtuvieron resultados similares con GDE humana truncada A4 pero no con GDE de gorila (Figura 6). Luego se obtuvieron resultados in vivo mediante inyección intramuscular de vectores AAV que expresan GDE. Se inyectaron animales GDE-KO por vía intramuscular con vectores AAV9 que expresan una GDE truncada humana (A1), la GDE de gorila o un vector dual que expresa GDE de tamaño completo humano. 15 días después de la inyección, se diseccionó el tibial anterior y se analizó la expresión y actividad de GDE (Figura 7). El análisis de transferencia Western con un anticuerpo anti-GDE demostró claramente la presencia de una banda con un peso molecular más bajo que la GDE de tamaño completo (Figura 7).
Se derivaron vectores AAV que expresan tres hGDE truncados diferentes, ya sea de tipo silvestre (wt) o con codones optimizados (co) bajo el control transcripcional del promotor SpC5.12. Estos vectores se inyectaron directamente en el tibial anterior derecho (TA) de ratones hembra GDE-KO a la dosis de 1E11 gv/ratón. Quince días después de la inyección, se midió la actividad de GDE en extractos obtenidos de TA de los ratones inyectados. Las actividades de GDE medidas en el TA izquierdo que no recibió ninguna inyección se usaron como control (Agl-/-, CTRL). Los extractos de proteínas obtenidos de TA de ratones tratados con vectores únicos AAV que expresan las diferentes formas truncadas de GDE mostraban niveles más altos de actividad de GDE en comparación con el control (Figura 8).
La Figura 9 demuestra la expresión exitosa de GDE humanas truncadas adicionales: A9 A2/3; A10 A2/3; A11 A2/3; A12 A2/3; A13 A2/3, por transfección en células HEK293.
La Figura 10 demuestra además la expresión exitosa de GDE humanas truncadas adicionales: A2/3; A9 A2/3; A10 A2/3; A13 A2/3, en el tibial anterior de ratones GDE-KO, 15 días después de la inyección de vectores AAV9 que expresan dicha GDE truncada humana.
Los datos mostrados demuestran claramente que las formas más cortas de GDE, ya sean formas truncadas de GDE humana o GDE no humana, se pueden expresar tanto in vitro como in vivo en una forma activa y que se pueden usar para degradar el glucógeno acumulado en ratones con AEGIII.
Claims (15)
1. Un polipéptido de GDE humano truncado funcional, en que se eliminan al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 90, 100, 125, 150, 175, 190, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 o al menos aproximadamente 525 aminoácidos con respecto a una secuencia GDE de humana de longitud completa de referencia, en particular una secuencia de GDE humana de longitud completa de referencia que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 40 o SEQ ID NO: 41.
2. El polipéptido de GDE humano truncado funcional de la reivindicación 1, en el que:
(i) la secuencia de GDE humana de longitud completa de referencia tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 1, y dicho polipéptido de GDE humano truncado comprende al menos los residuos de aminoácidos en las posiciones 429-666, 770-892, 1088-1194 y 1235-1532 con respecto a la SEQ ID NO: 1;
(ii) la secuencia de GDE humana de longitud completa de referencia tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 40, y dicho polipéptido de GDE humano truncado comprende al menos los residuos de aminoácidos en las posiciones 412-649, 753-875, 1071- 1177, 1218-1515 con respecto a la SEQ ID NO: 40; o
(iii) la secuencia de GDE humana de longitud completa de referencia tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NO: 41, y dicho polipéptido de GDE humano truncado comprende al menos los residuos de aminoácidos en las posiciones 413-650, 754-876, 1072-1178, 1219-1516 con respecto a la SEQ ID NO: 41.
3. El polipéptido de GDE humano truncado funcional de la reivindicación 1 o 2, que comprende una deleción o una combinación de deleciones, como se muestra en la tabla 2.
4. El polipéptido de GDE humano truncado funcional de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que tiene una secuencia seleccionada de las SEQ ID NO: 2-6 y SEQ ID NO: 48-52.
5. El polipéptido de GDE humano truncado funcional de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que tiene una secuencia de aminoácidos que consiste en la SEQ ID NO: 5.
6. Una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de GDE humano truncado funcional de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
7. Un constructo de ácido nucleico que comprende, preferiblemente en este orden:
- un promotor;
- opcionalmente, un intrón;
- la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6; y
- una señal de poliadenilación.
8. Un vector, en particular un vector vírico, que comprende:
- la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6; o
- el constructo de ácido nucleico de la reivindicación 7.
9. Un vector vírico que comprende un constructo de ácido nucleico que codifica un polipéptido de GDE no humano funcional, en el que el polipéptido de GDE no humano funcional comprende menos de aproximadamente 1500 aminoácidos.
10. El vector vírico según la reivindicación 9, en el que el polipéptido de GDE no humano funcional se selecciona del grupo que consiste en: polipéptido de GDE de caballo de SEQ ID NO: 11, polipéptido de GDE de gorila de SEQ ID NO: 12, polipéptido de GDE de orangután de SEQ ID NO: 13, polipéptido de GDE de Pteropus alecto de SEQ ID NO: 14, polipéptido de GDE de mangabey gris de SEQ ID NO: 15, polipéptido de GDE de ornitorrinco de SEQ ID NO: 16, y polipéptido de GDE de pato de SEQ ID NO: 17, siendo el polipéptido de GDE no humano funcional preferiblemente el polipéptido de GDE de gorila de SEQ ID NO: 12.
11. El vector de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, que es un vector AAV y en el que la molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de GDE es lo suficientemente pequeña para empaquetarse en el vector AAV.
12. Una célula aislada transformada con la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6, el constructo de ácido nucleico de la reivindicación 7 o el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en la que la célula es en particular una célula hepática, una célula muscular, una célula cardíaca o célula del SNC.
13. El polipéptido de GDE humano truncado funcional de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, el polipéptido de GDE no humano funcional como se define en la reivindicación 9, la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6, el constructo de ácido nucleico de la reivindicación 7, el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, o la célula según la reivindicación 12, para su uso como medicamento.
14. El polipéptido de GDE humano truncado funcional de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, el polipéptido de GDE no humano funcional como se define en la reivindicación 9, la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 6, el constructo de ácido nucleico de la reivindicación 7, el vector de una cualquiera de reivindicaciones 8 a 11, o la célula según la reivindicación 12, para uso en un método para tratar EAGIII (enfermedad de Cori).
15. El polipéptido de GDE de gorila de SEQ ID NO: 12, para usar en un método para tratar EAGIII (enfermedad de Cori).
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