ES2942846T3 - Inhibidores multiobjetivo de la vía de Hedgehog y su uso para el tratamiento de determinados tumores dependientes de Hedgehog (Hh) - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a compuestos que inhiben selectivamente la actividad de la vía Hedgehog (Hh), su preparación y usos de los mismos. Los compuestos de la presente invención son útiles en el tratamiento de tumores dependientes de Hh, como el meduloblastoma (MB). (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Inhibidores multiobjetivo de la vía de Hedgehog y su uso para el tratamiento de determinados tumores dependientes de Hedgehog(Hh)

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a compuestos que inhiben selectivamente la actividad de la vía de Hedgehog (Hh), su preparación y usos de los mismos. Los compuestos de la presente invención son útiles en el tratamiento de tumores dependientes de Hh, tal como el meduloblastoma (MB) y muchos otros cánceres.

La presente invención está definida por las reivindicaciones. Cualquier objetivo revelado en la descripción que no esté cubierto por las reivindicaciones no forma parte de la invención.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La activación de la vía de Hh requiere la unión de ligandos de Hh (es decir, Shh, Ihh y Dhh) al receptor de membrana Patched (PTCH) de 12 pasos, además de correceptores adicionales. Esta interacción alivia la actividad inhibidora de PTCH en el transductor de SMO, un receptor con dominios transmembrana de 7 pasos. A su vez, SMO desencadena factores de transcripción posteriores pertenecientes a la familia Gli (Gli1, Gli2 y Gli3), que actúan sobre un conjunto de genes diana promoviendo la proliferación celular y reduciendo la diferenciación celular. Estos genes diana incluyen el propio Gli1, lo que auto-refuerza la fuerza de la señalización y representa una lectura sensible de la vía.

La señalización de Hh juega un papel crucial en el desarrollo y proliferación de tejidos (Ruiz i Altaba, et al. 2002; Ingham y Placzek 2006). Un órgano objetivo paradigmático de la Hh es el cerebelo, donde la Hh, secretada por las células de Purkinje, mantiene la proliferación de progenitores de células granulares del cerebelo (GCPs), mientras que su terminación permite que las GCPs salgan del ciclo celular y se diferencien (Dahmane y Ruiz i Altaba 1999; Wallace 1999; Wechsler-Reya y Scott 1999).

La vía de Hh también es fundamental para el mantenimiento y la autorrenovación de las células madre neurales (NSCs) y para la tumorigénesis. Más específicamente, la señalización de Hh sustenta las NSCs embrionarias y postnatales de la zona subventricular del prosencéfalo y el hipocampo (Lai, et al. 2003; Machold, et al. 2003; Palma and Ruiz i Altaba 2004; Ahn and Joyner 2005; Palma, et al. 2005), así como NSCs del cerebelo y células madre de glioma (SCs) que sobreexpresan una firma del gen de troncalidad (por ejemplo, Nanog, Oct4, Sox2, CD133) (Clement, et al. 2007, Stecca and Ruiz i Altaba 2009).

La activación constitutiva de esta vía es responsable de varias neoplasias malignas, incluyendo el MB, el tumor cerebral infantil más frecuente (Ruiz i Altaba, et al. 2002). MB pertenece al grupo de tumores neuroepiteliales embrionarios y se produce en el cerebelo. Esta definición enfatiza la naturaleza peculiar de esta neoplasia, que está estrictamente relacionada con la edad pediátrica; tiene un origen exclusivo en la estructura única del sistema nervioso central (CNS) que continúa su morfogénesis durante la vida postnatal, y se origina a partir de células madre o células precursoras primitivas del cerebelo.

La señalización anómala de Hh ocurre en el MB como consecuencia de cambios genéticos o epigenéticos que afectan a varios componentes de la vía (Di Marcotullio, et al. 2006; Teglund and Toftgard 2010). La falta de desconexión del crecimiento promovido por las señales de Hh durante el desarrollo de GCPs es un suceso principal en el desarrollo del MB. De hecho, las mutaciones somáticas y de línea germinal de ganancia de función (SMO) o pérdida de función (PTCH y SUFU) en los componentes de la señalización de Hh, que conducen a la activación de señales independientes del ligando, se observan en MB humanos (Ellison et al., 2002; Taylor, et al. 2002). Además, los modelos de ratón en los que la eliminación heterocigota de PTCH o las mutaciones activadoras de los genes de SMO dan como resultado el desarrollo de tumores confirman la idea de que la activación incontrolada de la vía de Hh sustenta el desarrollo de MB (Goodrich, et al. 1997; Hallahan, et al. 2004).

El manejo de este tipo de tumor requiere tratamientos agresivos que consisten en resección quirúrgica seguida de radiación y quimioterapia estándar. Desafortunadamente, las terapias actuales tienen efectos adversos graves y los pacientes con enfermedad recurrente después de la terapia primaria tienen un pronóstico particularmente malo. Esto probablemente se deba a la presencia en la masa tumoral de células madre cancerosas que muestran una mayor resistencia al tratamiento tumoral convencional. En los últimos años, varias publicaciones han sugerido la vía de Hh como un objetivo terapéutico 'medicable' en el cáncer, debido a su papel crítico en el mantenimiento de las células madre cancerosas en los tumores. El uso experimental de antagonistas de Hh ha indicado que la supresión de Hh tiene un efecto inhibitorio sobre el crecimiento tumoral in vivo y se han desarrollado y patentado varios inhibidores de la vía de Hh (para una revisión, véase (Tremblay, et al. 2009). La mayoría de estos compuestos actúan sobre la actividad de SMO e inhiben su actividad. El compuesto teratogénico natural ciclopamina, el primer inhibidor de SMO identificado, ralentiza el crecimiento de tumores en varios modelos animales, validando así a SMO como diana terapéutica en el tratamiento de enfermedades relacionadas con Hh. Recientemente, se han descrito varios antagonistas de SMO muy potentes. Entre estos, vismodegib (GDC-0449) ha sido probado intensivamente y ha demostrado una buena actividad inhibidora en la vía de Hh. Este agente fue aprobado por la FDA en enero de 2012 para el tratamiento de adultos con carcinoma de células basales metastásico (BCC) o con BCC localmente avanzado y actualmente se encuentra en ensayos clínicos de fase II para el tratamiento de cáncer de ovario, colorrectal y MB (para una revisión véase De Smaele, et al. 2010). Sin embargo, estudios recientes han descrito un mecanismo potencial de escape de la actividad de vismodegib. De hecho, se ha reportado que después de una respuesta inicial, un paciente con MB mostró un rebrote del tumor dentro de los 3 meses debido a una mutación de SMO (D473H) capaz de conferir resistencia a vismodegib. También surgió una mutación que alteraba el residuo murino correspondiente (D477G) en un modelo de MB de ratón resistente a vismodegib (Yauch, et al. 2009; Dijkgraaf, et al. 2011). También se observó el desarrollo de resistencia en ratones que presentaban MB tratados con el antagonista de SMO NVP-LDE225, que también ha progresado a ensayos clínicos (Buonamici, et al. 2010). Estos hallazgos demuestran que las mutaciones adquiridas en SMO pueden servir como un mecanismo de resistencia al fármaco en el cáncer humano y, en particular, subrayan la necesidad de identificar nuevos inhibidores de SMO eficaces capaces de contrarrestar el crecimiento tumoral.

Además, la activación de la vía de Hh independiente de SMO, tal como la mutación en o la pérdida de heterocigosidad del gen SuFu (supresor de homólogo fusionado; SuFu es un inhibidor fisiológico de Gli1) (Taylor, et al. 2002), la amplificación del gen Gli (Kinzler, et al. 1987) y la translocación de Glil (Dahlen, et al. 2004), también se ha reportado en MB y otros tumores tales como el adenocarcinoma esofágico. Esto plantea la necesidad de identificar nuevos fármacos capaces de bloquear la vía de Hh posterior de SMO, tal como direccionamiento a Gli1, el efector más potente de la vía.

El documento de Patente US 2009/203713A1 se refiere a compuestos para modular la vía de hedgehog y para tratar afecciones relacionadas con la actividad anormal o anómala de la vía de hedgehog. La metoxivona es uno de los compuestos descritos. Las reivindicaciones incluyen el tratamiento del cáncer, incluyendo el tratamiento del cáncer de próstata, el cáncer de pulmón de células pequeñas, los carcinomas de esófago y próstata y el meduloblastoma.

El documento de Patente US 2012/283313A1 se refiere al tratamiento del cáncer de próstata mediante la inhibición de la MEK4 quinasa, incluyendo la inhibición de la metástasis del cáncer de próstata. Los compuestos activos son isoflavonas no sustituidas o hidroxi y/o metoxi sustituidas con hasta tres sustituyentes.

XING ZHENG ET AL ("Synthesis and cytotoxic activity of genistein derivatives", MEDICINAL CHEMISTRY RESEARCH, BIRKHÁUSER-VERLAG, BO, vol. 19, no. 9, 14 October 2009 (2009-10-14), pages 1296-1306; DOI: 10.1007/S00044-009-9271-Z) describen derivados de genisteína citotóxicos con actividad anticancerígena. Los compuestos están como máximo trisustituidos con grupos alcoxi o haloalcoxi.

JIYE HYUN ET AL ("Isoflavones inhibit the clonogenicity of human colon cancer cells", BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, vol. 22, no. 8, 1 April 2012 (2012-04-01), pages 2664-2669; DOI: 10.1016 /j.bmcl.2012.03.027) describen isoflavonas sustituidas, incluyendo 3',4',5,7-tetrametoxiisoflavona. Los compuestos inhiben la clonogenicidad de las células de cáncer de colon humano. El documento no describe el tratamiento de un tumor dependiente de Hedgehog (Hh) seleccionado del grupo que consiste en meduloblastoma (MB), adenocarcinoma esofágico, carcinomas de células basales (BCCs), cáncer de páncreas, próstata y pulmón de células pequeñas.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

En la presente invención se encontró sorprendentemente que los compuestos que tienen una fórmula general I

cómo se define en las reivindicaciones, inhiben selectivamente la actividad de la vía de Hedgehog (Hh). Un ejemplo de dichos compuestos es Glabrescione B, una isoflavona que tiene la fórmula química (a) que se encuentra de manera natural en las semillas de Derris Glabrescens (Leguminosas).

Su fórmula comprende el núcleo de 5,7-dimetoxiisoflavona y puede obtenerse según Delle Monache, Valera et al.

1977.

Los autores utilizaron modelos de farmacóforos para priorizar posibles antagonistas de SMO entre una biblioteca única de más de 800 compuestos naturales. Se generaron dos tipos diferentes de farmacóforos, basándose en la diferente combinación de características farmacofóricas, a saber, Tipo l (Figura 1A) y Tipo 2 (Figura 1B). La alineación del farmacóforo de Glabrescione B con el modelo de farmacóforo de Tipo 1 representativo se muestra en la Figura 2. Después del cribado de farmacóforos, se seleccionaron y probaron 16 moléculas in vitro. Entre ellas, 7 moléculas (Glabrescione B, 2,4,5,3',4'-penta-OMe Chalcona, Jaceidina, Auriculasina, 3,4-di-MDO-2',4',5'-tri-OMe dihidrochalcona, 2,3,4,6,3',4'-hexa-OMe Chalcona y Martinosido) resultaron inhibir la ruta de Hh en un ensayo de luciferasa donde el gen informador fue Gli1 y la ruta fue activada por la molécula de SAG, un potente agonista de SMO. El efecto de estas moléculas fue comparable hasta más fuerte que el de la ciclopamina, el compuesto natural de referencia inhibidor de la vía de Hh (Figura 4). Glabrescione B fue la iniciativa más potente identificada in vitro. En particular, los compuestos no activos in vitro tienen un peso molecular promedio significativamente más alto que los compuestos activos, lo que probablemente significa que el sitio de unión del ligando SMO no es lo suficientemente grande para acomodar estas moléculas. Por el contrario, cuando la estructura 3D del receptor diana se conoce a partir de la cristalografía de rayos X o la espectroscopia de NMR, pueden preferirse los métodos basados en la estructura para el diseño de los ligandos. Los autores utilizaron dinámica molecular (MD) para relajar la estructura cristalográfica del dominio de dedos de zinc de Gli1 (Gli1-ZF) en el complejo con DNA y el acoplamiento molecular para detectar la biblioteca interna de productos naturales hacia la estructura de Gli1-ZF relajada con MD. En particular, Glabrescione B, que ya se encontró que antagoniza el receptor de SMO, se encontró dentro de las posiciones más altas del cribado virtual basado en acoplamiento y, por lo tanto, se probó como antagonista de Gli1 in vitro. Los resultados mostraron que Glabrescione B es un potente inhibidor de Hh que actúa tanto sobre los objetivos de SMO como Gli1.

Dado que Glabrescione B fue el inhibidor de Hh más potente identificado por el cribado, se sintetizaron y probaron preliminarmente varios análogos de Glabrescione B (a saber, NT8, NT9, n T10, NT 11, NT12, NT13, NT14 y NT15) in vitro para mejorar la potencia inhibidora frente a la vía de Hh y para proporcionar Relaciones Estructura-Actividad (SAR) para la serie congenérica (véanse los ejemplos 8 y 9). La evaluación de la actividad inhibidora de Hh de estas moléculas se realizó a 5 pM in vitro en células Shh Light II (véase ejemplo 2). Los resultados preliminares mostraron que algunas de estas moléculas eran al menos activas como Glabrescione B, siendo NT8 y NT9 más potentes que Glabrescione B.

La interacción directa de Glabrescione B con el receptor de SMO se confirmó mediante un ensayo de desplazamiento con Bodipy-ciclopamina (véase ejemplo n.1), mientras que la unión directa de Glabrescione B a Gli1 se controló mediante espectroscopia de NMR (véase ejemplo n.14).

La presente invención también proporciona métodos para sintetizar los compuestos, en particular Glabrescione B y sus derivados (NT8, NT9, NT10, NT11, NT12, NT13, NT14 y NT15), mediante un proceso que consiste en transformaciones sintéticas posteriores. En el campo del tratamiento terapéutico de MB ya se conocen algunos principios activos de la clase de las isoflavonas, siendo la genisteína la más difundida entre ellos. Los estudios y experimentos llevados a cabo con ese fin dentro de la presente invención dieron como resultado la síntesis total de Glabrescione B y sus derivados. La caracterización química del compuesto mencionado de la presente invención se da más adelante en el ejemplo n.7, y se reportan los datos farmacológicos que prueban la alta actividad anticancerígena de dichos compuestos. La isoflavona Glabrescione B se sintetizó eficientemente a partir de 2,4,6-trimetoxiacetofenona mediante un procedimiento de seis etapas que implica la formación de una enaminocetona, seguida del cierre del anillo y una reacción de acoplamiento de Suzuki utilizando el catalizador Pd EnCat.®40.

Los compuestos NT, que tienen diferentes sustituyentes en el anillo B, se sintetizaron eficientemente a través de un método diferente, a partir de una acilación de Friedel-Craft entre 3,5-dimetoxifenol y ácido 3,4-dihidroxifenilacético mediante un procedimiento de tres etapas. La Glabrescione B también se sintetizó por esta vía proporcionando un mayor rendimiento y un menor número de etapas. La caracterización química de los compuestos mencionados de la presente invención se proporciona adicionalmente en los ejemplos n.8 y n.9.

Los compuestos de la presente invención son sorprendentemente útiles en el tratamiento de tumores dependientes de Hh, tal como el meduloblastoma MB, un tumor pediátrico agresivo que surge del desarrollo anómalo del cerebelo, y muchos otros cánceres, incluyendo los carcinomas de células basales (BCCs), cáncer pancreático, de próstata y de pulmón de células pequeñas que representan hasta el 25% de todas las muertes por cáncer en humanos (Epstein, 2008)

En particular, se muestra que los compuestos de la presente invención se unen al receptor de SMO y/o se dirigen a la proteína Gli1, siendo por lo tanto inhibidores de la vía de Hedgehog. Los compuestos de fórmula (l) de la presente invención son muy útiles en la terapia del cáncer, en el tratamiento de MB y otros tumores que utilizan la vía de transducción de señales de Hh para la proliferación y prevención de la apoptosis.

Es una realización de la presente invención un compuesto que tiene la fórmula general I:

en donde

Ri es ORa, en donde Ra es metilo;

R² es OR^b, en donde R^b es una cadena alifática ramificada o lineal, saturada o insaturada que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;

R³ es OR^c y R^c es metilo, etilo, propilo, isopropilo, prenilo, geranilo, farnesilo o bencilo, en donde el fenilo del grupo bencilo puede estar sustituido por halógeno, haloalquilo C¹-C⁶ , haloalcoxi C¹-C⁶ , alcoxi C¹-C⁶ , alquiltio C¹-C⁶ , amino, alquilamino C¹-C⁶ , dialquilamino C¹-C⁶ ;

R⁴ es ORd y Rd es metilo, etilo, propilo, isopropilo, prenilo, geranilo, farnesilo o bencilo, en donde el fenilo del grupo bencilo puede estar sustituido por halógeno, haloalquilo C¹-C⁶ , haloalcoxi C¹-C⁶ , alcoxi C¹-C⁶ , alquiltio C¹-C⁶ , amino, alquilamino C¹-C⁶ , dialquilamino C¹-C⁶ ; en donde dicho compuesto es un inhibidor de la vía de Hedgehog (Hh); 0 estereoisómeros del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto que tiene la fórmula general 1 o de dichos estereoisómeros para su uso en el tratamiento de un tumor dependiente de Hedgehog (Hh) seleccionado del grupo que consiste en: meduloblastoma (MB), adenocarcinoma esofágico, carcinomas de células basales (BCCs), cáncer de páncreas, próstata y de pulmón de células pequeñas. Es un objetivo adicional de la invención un compuesto que tiene la fórmula general I:

en donde

R¹ es OR^a y R^a es una cadena alifática ramificada o lineal, saturada o insaturada que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;

R² es OR^b y R^b es metilo;

R³ es ORc y Rc es metilo, etilo, propilo, isopropilo, prenilo, geranilo, farnesilo o bencilo, en donde el fenilo del grupo bencilo puede estar sustituido por halógeno, haloalquilo C¹-C⁶ , haloalcoxi C¹-C⁶ , alcoxi C¹-C⁶ , alquiltio C¹-C⁶ , amino, alquilamino C¹-C⁶ , dialquilamino C¹-C⁶ ;

R⁴ es ORd y Rd es metilo, etilo, propilo, isopropilo, prenilo, geranilo, farnesilo o bencilo, en donde el fenilo del grupo bencilo puede estar sustituido por halógeno, haloalquilo C¹-C⁶ , haloalcoxi C¹-C⁶ , alcoxi C¹-C⁶ , alquiltio C¹-C⁶ , amino, alquilamino C¹-C⁶ , dialquilamino C¹-C⁶ ; en donde dicho compuesto es un inhibidor de la vía de Hedgehog (Hh); 0 estereoisómeros del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto que tiene la fórmula general 1 o de dichos estereoisómeros para su uso en el tratamiento de un tumor dependiente de Hedgehog (Hh) seleccionado del grupo que consiste en: meduloblastoma (MB), adenocarcinoma esofágico, carcinomas de células basales (BCCs), cáncer de páncreas, próstata y de pulmón de células pequeñas.

El término "halógeno" se refiere a flúor, cloro, bromo o yodo.

Como se usa en la presente memoria, el término "cadena alifática ramificada o lineal, saturada o insaturada que tiene de 1 a 10 átomos de carbono" se refiere a un alquilo de C¹-C¹⁰, alquenilo de C²-C¹⁰ o alquinilo de C²-C¹⁰ lineal o ramificado.

El término alquilo de C¹-C¹⁰ se refiere a un radical de cadena hidrocarbonada lineal o ramificada, que consiste únicamente en átomos de carbono e hidrógeno, que tiene de uno a diez átomos de carbono. Ejemplos adecuados de alquilo de C¹-C¹⁰ incluyen metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, butilo, fe/f-butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo y decilo, etc.

El término alquenilo de C²-C¹⁰ se refiere a un radical de cadena hidrocarbonada insaturado, lineal o ramificado, que contiene al menos un doble enlace carbono-carbono, que consiste únicamente en átomos de carbono e hidrógeno, que tiene de dos a diez átomos de carbono. Ejemplos adecuados de alquenilo de C²-C¹⁰ son etenilo, propenilo, alilo, isobutenilo, pentenilo, prenilo, esenilo, geranilo, etc.

El término alquinilo de C²-C¹⁰ se refiere a un radical de cadena hidrocarbonada insaturado, lineal o ramificado, que contiene al menos un triple enlace carbono-carbono, que consiste únicamente en átomos de carbono e hidrógeno, que tiene de dos a diez átomos de carbono. Ejemplos adecuados de alquinilo de C²-C¹⁰ son acetilenilo, etinilo, propinilo, etc.

Ejemplos adecuados de "cadena alifática ramificada o lineal, saturada o insaturada que contiene uno, dos o tres heteroátomos seleccionados de nitrógeno, oxígeno y azufre y que tiene de uno a diez átomos de carbono" son éter, tioéter, amino, aminoalcohol, sulfonamida, (CH²) mNH2SO2CH3, (CH²)mOH; (CH²)mOGlucosa, en donde m es un número de 1 a 10;

El término “alcoxi C¹-C¹⁰ " se refiere a un O-alquilo C¹-C¹⁰ lineal o ramificado, donde alquilo es como se define en la presente memoria anteriormente. El grupo “alcoxi C¹-C¹⁰" es preferiblemente un grupo alcoxi C¹-C⁸ lineal o ramificado, más preferiblemente un grupo alcoxi C¹-C⁶ lineal o ramificado, más preferiblemente un grupo alcoxi C¹-C⁴ lineal o ramificado, más preferiblemente un grupo alcoxi C¹-C².

El término alquiltio C¹-C¹⁰ se refiere a un S-alquilo de C¹-C¹⁰ lineal o ramificado, donde alquilo es como se define en la presente memoria anteriormente. El grupo “alquiltio C¹-C¹⁰" es preferiblemente un grupo alquiltio C¹-C⁸ lineal o ramificado, más preferiblemente un grupo alquiltio C¹- C6 lineal o ramificado, más preferiblemente un grupo alquiltio C¹-C⁴ lineal o ramificado, más preferiblemente un grupo alquiltio C¹-C².

El término "haloalquilo C¹-C¹⁰ " se refiere a un radical de cadena hidrocarbonada lineal o ramificada, que está sustituido por uno o más átomos de halógeno y que tiene de uno a diez átomos de carbono. El grupo " haloalquilo C¹-C¹⁰ " es preferiblemente un grupo haloalquilo C¹-C⁸ lineal o ramificado, más preferiblemente un grupo haloalquilo C¹-C⁶ lineal o ramificado, aún más preferiblemente un grupo haloalquilo C¹-C⁴ lineal o ramificado, más preferiblemente un grupo haloalquilo C¹-C² , siendo en particular CF³.

El término "amino" se refiere a NH².

Los términos "alquilamino C¹-C¹⁰" y "dialquilamino C¹-C¹⁰" se refieren a NH-alquilo de C¹-C¹⁰ y N-(alquilo de C¹-C¹⁰)² respectivamente, donde alquilo es como se define en la presente memoria anteriormente.

El término "haloalcoxi C¹-C⁶ " se refiere a un O-haloalquilo C¹-C⁶ lineal o ramificado, donde haloalquilo es como se define en la presente memoria. El grupo “haloalcoxi C¹-C⁶" es preferiblemente un grupo haloalcoxi C¹-C⁴ lineal o ramificado, más preferiblemente un grupo haloalcoxi C¹-C² , siendo en particular OCF³ , OCHF² o OCH²F.

En una realización preferida de la invención Ra es CH³ y Rb es CH³.

En una realización preferida el compuesto de fórmula (I) es:

En una realización adicional, los compuestos de la invención son para su uso como un ligando del receptor de serpentina Smoothened (SMO)/Hh y/o de Gli1.

Más preferiblemente, la patología dependiente de Hh es resistente a un inhibidor de SMO, preferiblemente vismodegib o NVP-LDE225.

El tumor se selecciona del grupo que consiste en: meduloblastoma (MB), adenocarcinoma esofágico, carcinomas de células basales (BCCs), cáncer de páncreas, próstata y pulmón de células pequeñas. Más preferiblemente, el tumor está presente en un sujeto pediátrico.

La "sal farmacéuticamente aceptable" comprende una sal no tóxica convencional obtenida por salificación de un compuesto de fórmula (I) con ácidos inorgánicos (por ejemplo, ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico o fosfórico), o con ácidos orgánicos (por ejemplo, acético, propiónico, succínico, benzoico, sulfanílico, 2-acetoxi-benzoico, cinámico, mandélico, salicílico, glicólico, láctico, oxálico, málico, maleico, malónico, fumárico, tartárico, cítrico, ptoluenosulfónico, metanosulfónico, etanosulfónico o naftalensulfónico).

Además, se pueden formar sales de adición de base farmacéuticamente aceptables con una base inorgánica u orgánica adecuada tal como trietilamina, etanolamina, trietanolamina, colina, arginina, lisina o histidina. Otras sales farmacéuticamente aceptables adecuadas incluyen sales de metales alcalinos o alcalinotérreos farmacéuticamente aceptables tales como sales de sodio, potasio, calcio o magnesio; en particular sales farmacéuticamente aceptables de uno o más restos de ácido carboxílico que pueden estar presentes en el compuesto de fórmula (I).

Para revisiones sobre sales farmacéuticas adecuadas véase Berge S. M. et al., J. Pharm. Sci. 1977, 66, 1-19; Gould PL Int. J. Pharm 1986, 33, 201-217; y Bighley et al. Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, Marcel Dekker Inc, New York 1996, Volume 13, page 453-497. Otras sales, que no son farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, la sal de trifluoroacetato, pueden ser útiles en la preparación de compuestos de esta invención y forman un aspecto adicional de la invención. La invención incluye dentro de su alcance todas las posibles formas estequiométricas y no estequiométricas de las sales de los compuestos de fórmula (I).

Los compuestos de fórmula (I) de la invención tienen átomos de carbono asimétricos y, por lo tanto, pueden mostrarse como isómeros ópticos individuales, como mezclas racémicas o como cualquier otra mezcla que comprenda una mayoría de uno de los dos isómeros ópticos, todos los cuales deben entenderse dentro del alcance de la presente invención.

Asimismo, se entiende que los compuestos de la invención pueden existir en formas tautómeras distintas a las mostradas en la fórmula y éstas también se incluyen dentro del alcance de la presente invención.

La invención también incluye todas las variaciones isotópicas adecuadas de un compuesto de fórmula (I) de la invención. Una variación isotópica de un compuesto de la invención se define como aquella en la que al menos un átomo se reemplaza por un átomo que tiene el mismo número atómico pero una masa atómica diferente de la masa atómica que normalmente se encuentra en la naturaleza.

Los ejemplos de isótopos que se pueden incorporar a los compuestos de la invención incluyen isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, fósforo, azufre, flúor y cloro tales como 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 17O, 18O, 31P, 32P, 35S, 18F y 36Cl, respectivamente. Ciertas variaciones isotópicas de la invención, por ejemplo, aquellas en las que un isótopo radiactivo tal como 3H o 14C se incorpora, son útiles en estudios de distribución de fármacos y/o sustratos en tejidos. Los isótopos 3H tritiado y carbono-14 14C son particularmente preferidos por su facilidad de preparación y detectabilidad. Además, la sustitución con isótopos tales como el deuterio 2H, puede proporcionar ciertas ventajas terapéuticas resultantes de una mayor estabilidad metabólica, por ejemplo, una mayor vida media in vivo o requisitos de dosificación reducidos y, por lo tanto, puede preferirse en algunas circunstancias. Las variaciones isotópicas de los compuestos de la invención se pueden preparar generalmente mediante procedimientos convencionales tales como los métodos ilustrativos o mediante las preparaciones descritas en los ejemplos siguientes utilizando variaciones isotópicas apropiadas de reactivos adecuados.

Es una realización adicional de la invención una composición farmacéutica para su uso como se define en las reivindicaciones, comprendiendo la composición al menos un compuesto de la invención como se define en la presente memoria anteriormente y un vehículo y/o excipientes adecuados y/o diluyentes. Preferiblemente, el vehículo es un liposoma.

Es una realización adicional de la invención la composición farmacéutica para su uso como se define en la presente memoria anteriormente que además comprende al menos un agente terapéutico, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en fármacos contra el cáncer, preferiblemente seleccionado dentro del grupo que incluye los siguientes fármacos: Temozolomida, Bevacizumab, Gemcitabina, acetato de leuprolida, acetato de goserelina y Etopósido y Cisplatino.

Preferiblemente, la composición farmacéutica de la invención debe administrarse mediante inyección intratumoral.

La invención también proporciona composiciones farmacéuticas para los usos como se define en las reivindicaciones, comprendiendo las composiciones farmacéuticas uno o más compuestos de esta invención y uno o más excipientes y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. Las composiciones farmacéuticas se pueden elegir sobre la base de los requisitos del tratamiento. Dichas composiciones se preparan mediante mezclas y se adaptan adecuadamente a la administración oral o parenteral, y como tales pueden administrarse en forma de comprimidos, cápsulas, preparaciones orales, polvos, gránulos, píldoras, soluciones líquidas inyectables o infusibles, suspensiones, supositorios, preparación para inhalación, inyección intratumoral.

Los comprimidos y cápsulas para administración oral normalmente se presentan en forma de dosis unitaria y contienen excipientes convencionales tales como aglutinantes, rellenos (incluyendo celulosa, manitol, lactosa), diluyentes, agentes de formación de comprimidos, lubricantes (incluyendo estearato de magnesio), detergentes, disgregantes (por ejemplo, polivinilpirrolidona y derivados del almidón tales como almidón de glicolato de sodio), agentes colorantes, agentes aromatizantes y agentes humectantes (por ejemplo, lauril sulfato de sodio).

Las composiciones sólidas orales se pueden preparar mediante métodos convencionales de mezcla, relleno o formación de comprimidos. La operación de mezcla se puede repetir para distribuir el principio activo en composiciones que contienen grandes cantidades de relleno. Dichas operaciones son convencionales.

Las preparaciones líquidas orales pueden estar en forma de, por ejemplo, suspensiones acuosas u oleosas, soluciones, emulsiones, jarabes o elixires, o pueden presentarse como un producto seco para reconstitución con agua o con un vehículo adecuado antes de su uso. Dichas preparaciones líquidas pueden contener aditivos convencionales tales como agentes de suspensión, por ejemplo sorbitol, jarabe, metilcelulosa, gelatina, hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa, gel de estearato de aluminio o grasas comestibles hidrogenadas; agentes emulsionantes, tales como lecitina, monooleato de sorbitán o goma arábiga; vehículos no acuosos (que pueden incluir aceites comestibles), tales como aceite de almendras, aceite de coco fraccionado, ésteres oleosos tales como ésteres de glicerina, propilenglicol o alcohol etílico; conservantes, tales como p-hidroxibenzoato de metilo o propilo o ácido sórbico, y si se desea, agentes aromatizantes o colorantes convencionales. Las formulaciones orales también incluyen formulaciones convencionales de liberación lenta tales como comprimidos o gránulos con recubrimiento entérico.

La preparación farmacéutica para administración por inhalación puede administrarse desde un insuflador o un paquete presurizado nebulizador.

Para la administración parenteral, se pueden preparar dosis unitarias fluidas que contengan el compuesto y un vehículo estéril. El compuesto puede suspenderse o disolverse, dependiendo del vehículo y la concentración. Las soluciones parenterales normalmente se preparan disolviendo el compuesto en un vehículo, esterilizando por filtración, llenando viales adecuados y sellando. De manera ventajosa, también se pueden disolver en el vehículo adyuvantes tales como anestésicos locales, conservantes y agentes tamponadores. Para aumentar la estabilidad, la composición se puede congelar después de haber llenado los viales y eliminado el agua al vacío. Las suspensiones parenterales se preparan sustancialmente de la misma manera, excepto que el compuesto puede suspenderse en el vehículo en lugar de disolverse y esterilizarse mediante la exposición a óxido de etileno antes de suspenderlo en el vehículo estéril. De manera ventajosa, se puede incluir en la composición un tensioactivo o un agente humectante para facilitar la distribución uniforme del compuesto de la invención.

Para la administración bucal o sublingual, las composiciones pueden ser comprimidos, pastillas, pastillas o gel.

Los compuestos pueden formularse farmacéuticamente como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, conteniendo bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao, polietilenglicol u otros glicéridos, para administración rectal.

Otro medio de administración de los compuestos de la invención se refiere al tratamiento tópico. Las formulaciones tópicas pueden contener, por ejemplo, ungüentos, cremas, lociones, geles, soluciones, pastas y/o pueden contener liposomas, micelas y/o microesferas. Los ejemplos de ungüentos incluyen ungüentos oleaginosos tales como aceites vegetales, grasas animales, hidrocarburos semisólidos, ungüentos emulsionables tales como sulfato de hidroxiestearina, lanolina anhidra, vaselina hidrófila, alcohol cetílico, monoestearato de glicerol, ácido esteárico, ungüentos solubles en agua que contienen polietilenglicoles de diversos pesos moleculares. Las cremas, como las conocen los expertos en formulación, son líquidos viscosos o emulsiones semisólidas y contienen una fase oleosa, un emulsionante y una fase acuosa. La fase oleosa generalmente contiene vaselina y un alcohol tal como alcohol cetílico o esteárico. Las formulaciones adecuadas para la administración tópica en el ojo también incluyen gotas para los ojos, en las que el ingrediente activo se disuelve o suspende en un vehículo adecuado, especialmente un disolvente acuoso para el ingrediente activo.

Un método adicional de administración de los compuestos de la invención se refiere a la administración transdérmica. Las formulaciones transdérmicas típicas comprenden vectores acuosos y no acuosos convencionales, tales como cremas, aceites, lociones o pastas, o pueden estar en forma de membranas o parches medicados.

Una referencia para las formulaciones es el libro de Remington ("Remington: The Science and Practice of Pharmacy", Lippincott Williams & Wilkins, 2000).

Los compuestos de la presente invención se pueden emplear solos como terapia única o en combinación con otros agentes terapéuticos para el tratamiento de las afecciones mencionadas anteriormente. La combinación se puede administrar como composiciones separadas (simultáneas, secuenciales) de los componentes individuales del tratamiento o como una forma de dosificación única que contiene ambos agentes. Cuando los compuestos de esta invención se combinan con otros ingredientes activos, los ingredientes activos se pueden formular por separado en preparaciones de un solo ingrediente de una de las formas descritas anteriormente y después proporcionarse como preparaciones combinadas, que se administran al mismo tiempo o en tiempos diferentes, o pueden formularse juntos en una preparación de dos o más ingredientes.

Los compuestos de fórmula general (I) se pueden administrar a un paciente en una dosis diaria total de, por ejemplo, de 0,001 a 1000 mg/kg de peso corporal al día. Las composiciones de unidades de dosificación pueden contener dichas cantidades de submúltiplos de las mismas para completar la dosis diaria. La determinación de las dosis óptimas para un paciente particular es bien conocida por los expertos en la técnica.

Como es práctica habitual, las composiciones normalmente van acompañadas de instrucciones escritas o impresas para su uso en el tratamiento en cuestión.

En la presente invención, un "inhibidor de la vía de Hedgehog (Hh)" significa una pequeña molécula de origen natural, semisintético o sintético que es capaz de inhibir la transducción de la señal de Hedgehog dentro de la célula, medida in vitro y/o in vivo. Un inhibidor de la vía de Hedgehog es, por lo tanto, una molécula pequeña capaz de unirse al receptor de serpentina Smoothened (SMO)/Hh y/o al factor de transcripción de dedo de zinc Gli1 (P08151)

Por lo tanto, un inhibidor de la vía de Hedgehog tiene relevancia médica para el tratamiento de una patología dependiente de Hedgehog (Hh), donde una patología dependiente de Hedgehog (Hh) es un cáncer, cuyo desarrollo y/o progresión se deben a una actividad anómala de la vía de Hedgehog. Actividad anómala significa sobreexpresión, mutación, ganancia de función o pérdida de función de las proteínas de la vía de Hedgehog, sobreproducción de los ligandos de Hedgehog, disminución de la degradación mediada por ubiquitinación o acetilación de las proteínas Gli, amplificación de genes, aumento de la fosforilación dependiente de la PI3K/mTOR/S6K1 quinasa, (Di Marcotullio et al, 2006, Di Marcotullio et al, 2011, Atwood et al. 2012).

Un antagonista o inhibidor de SMO es una pequeña molécula de origen natural, semisintético o sintético que puede interactuar con el receptor de SMO e inhibir la función del receptor de SMO en el contexto de la vía de Hedgehog.

Un antagonista o inhibidor de Gli1 es una pequeña molécula de origen natural, semisintético o sintético que es capaz de inhibir su función y/o inhibir su unión al DNA. El antagonista o inhibidor de Gli1 deseado se une directamente a Gli1 y compite con los ácidos nucleicos por el mismo sitio de unión en la superficie de Gli1. Otra clase de antagonistas o inhibidores de Gli1 se unen a otros receptores o proteínas y obstaculizan las funciones de Gli1 mediante un mecanismo indirecto.

La invención se ilustrará ahora mediante ejemplos que se refieren a las siguientes figuras.

Figura 1. Modelos representativos de farmacóforos de Tipo 1 (A) y Tipo 2 (B) utilizados para cribar la biblioteca interna de compuestos naturales. Las características farmacofóricas se muestran como esferas. Aceptor de enlaces de hidrógeno (HBA); hidrófobo (HYD); Donante de enlaces de hidrógeno (HBD).

Figura 2. La mejor alineación del compuesto más potente Glabrescione B hacia el farmacóforo de Tipo 1 representativo. Para mayor claridad, se ocultaron los átomos de hidrógeno no polares. Los átomos pesados se colorean de la siguiente manera: gris = carbono; rojo = oxígeno.

Figura 3. El modo de unión predicho de Glabrescione B (mostrado como barras). A: Gli1-ZF (dedo de zinc) se representa como líneas y caricaturas. Los residuos que interactúan con Glabrescione B se muestran como barras. Los enlaces de H están resaltados por líneas discontinuas. B: Gli1-ZF se muestra como una superficie transparente y Glabrescione B interactúa dentro de ZF4 y ZF5. Los dedos de zinc 3 y 5 también están etiquetados. La proteína está en la misma orientación que en A. T374 es Treonina 374, S378 es Serina 378, K350 es Lisina 350 y F342 es Fenilalanina 342.

Figura 4. Efecto de los compuestos naturales activos identificados por el cribado de farmacóforos en un ensayo de luciferasa, donde el gen informador fue Gli1 y la vía fue activada por la molécula SAG, un potente agonista de SMO. Se probaron compuestos naturales a tres concentraciones diferentes (1, 10 y 20 pM) y se comparó su actividad con la de la ciclopamina, el compuesto natural inhibidor de referencia de la vía de Hedgehog, que se probó a las mismas dosis (1, 10 y 20 pM). En ambos gráficos se reporta la actividad de la ciclopamina como estándar de referencia. (A) ciclopamina, 2,4,5,3',4'-penta-Ome chalcona y Auriculasina; (B) ciclopamina, Martinósido, Jaceidina, 2,4,5,3',4'-penta-Ome chalcona, 3,4-di-MDO-2',4',5'-tri-Ome dihidrochalcona.

Figura 5. (A) Las células HEK293 se transfectaron de manera transitoria con el vector pcDNA-SMO y se incubaron con Bodipy-ciclopamina (BC 5 nM) solo (control) o en presencia de concentraciones crecientes de KAAD (ciclopamina-KAAD, antagonista Smoothened) o concentraciones crecientes de Glabrescione B, como se indica. La unión de bodipy-ciclopamina (unión de BC) (verde) se visualiza mediante microscopía de fluorescencia en un campo representativo. (B) La curva de concentración-respuesta para Glabrescione B se obtuvo mediante la cuantificación de la fluorescencia de Bodipy-ciclopamina en tres fotografías para cada cubreobjetos. Los valores se expresan como porcentaje de la fluorescencia detectada en células HEK293 de control incubadas con Bodipy-ciclopamina solo. Los datos mostrados son la media de triplicados derivados de un experimento representativo de tres. Las barras de error indican la SD (desviación estándar).

Figura 6. Curva dosis-respuesta de Glabrescione B en células NIH 3T3 Shh-light II (Shh-LII) tratadas con SAG (agonista Smoothened, 200 nM). El tiempo de tratamiento fue de 48h y la normalización fue frente a Renilla luciferasa.

Se muestra el aumento en veces de la actividad del informador de Hh en comparación con las células no tratadas con SAG.

Figura 7. Inhibición de la transcripción inducida por Gli1 en células HEK293 transfectadas. Las células HEK293 se transfectaron con Renilla 12XGliBS-Luc y pRL-TK (control de normalización) más control (vector vacío) o vector Gli1 y se trataron con Glabrescione B o GANT61 (20 pM) o vehículo solo (DMSO, dimetilsulfóxido al 0,5% - Glil barra en el gráfico) durante 24 h y se probó la actividad de luciferasa. Se muestra la media de tres experimentos independientes. Las barras de error indican la SD.

Figura 8. Las células MEF-Ptch confluente-7' se trataron con DMSO (0,5%, vehículo), KAAD (1 pM, como control positivo) o diferentes concentraciones de Glabrescione B durante 48 h. (A) Los niveles de mRNA de Glil se determinaron mediante RT-PCR cuantitativa, normalizándose a la expresión de HPRT (hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa). Las barras de error indican la SD. (B) El análisis de transferencia de Western muestra la disminución de los niveles de proteína Gli1 después de 48 h de tratamiento con el compuesto 10 pM.

Figura 9. Las células MEF-SuFu confluente-7- se trataron con DMSO (0,5%, vehículo), GANT61 (10 pM, como control positivo) o diferentes concentraciones de Glabrescione B durante 48 h. Los niveles de mRNA de Gli1 se determinaron mediante RT-PCR cuantitativa, normalizándose a la expresión de HPRT. Las barras de error indican la SD.

Figura 10. Las células progenitoras de gránulos del cerebelo (GCPs) se trataron con Shh (Recombinant mouse Sonic Hedgehog, péptido amino-terminal, 3 pg/ml) y con diferentes concentraciones de Glabrescione B, como se indica, durante 48 h. La inhibición de la proliferación celular se midió como porcentaje de incorporación de BrdU en comparación con la muestra tratada con DMSO (0,5%, vehículo).

Figura 11. (A) Se trataron células D283 de MB humano con diferentes concentraciones de Glabrescione B como se indica durante 48 h. La inhibición de la proliferación celular se midió como porcentaje de incorporación de BrdU en comparación con la muestra tratada con DMSO (0,5%, vehículo). (B) Se trataron células D283 de MB humano durante 48 h con concentraciones crecientes de Glabrescione B como se indica. Después de 48h, se añadió el reactivo CellTiter 96® Aqueous One Solution a cada pocillo según las instrucciones del fabricante. Después de una hora de cultivo, se determinó la viabilidad celular (expresada en % de viabilidad) midiendo la absorbancia a 490 nm comparando el tratamiento con el control de DMSO (0,5%, vehículo).

Figura 12. Se trataron células D283 de MB humano con DMSO (0,5%, vehículo) o con diferentes concentraciones de Glabrescione B como se indica y se compararon con una muestra no tratada (NT). Después de 48h se realizó un conteo de azul de tripano para determinar el porcentaje de muerte celular.

Figura 13. Las células madre cancerosas (CSCs) aisladas de Ptch+/- de MB murino se trataron con DMSO (0,5%, vehículo), KAAD (1 pM), utilizado como control positivo, o diferentes concentraciones de Glabrescione B como se indica durante 48 h. Los niveles de mRNA de Gli1 se determinaron mediante RT-PCR cuantitativa usando HPRT como normalizador.

Figura 14. La suspensión de CSCs individuales aisladas de Ptch+/- de MB murino se trataron con DMSO (0,5%, vehículo), KAAD (1 pM) o diferentes concentraciones de Glabrescione B como se indica. Después de siete días de tratamiento, se contó el número de neuroesferas secundarias derivadas de un número conocido de células individuales. La capacidad de autorrenovación de las CSCs se expresa como porcentaje de células formadoras de neuroesferas.

Figura 15. Inhibición del crecimiento de células tumorales BCC dependientes de Gli. Las células ASZ001 BCC se trataron con Glabrescione B (GlaB) 5 pM o DMSO solo (A) o con Glabrescione B 1, 5 y 10 pM (GlaB) o DMSO solo (B). Después de los tiempos indicados, se realizó un conteo de azul de tripano para determinar la tasa de crecimiento (A) o el porcentaje de muerte celular (B). (C) Los niveles de expresión de mRNA de G lil se determinaron mediante qRT-PCR después del tratamiento de células ASZ001 BCC con Glabrescione B (GlaB) o DMSO solo durante los tiempos indicados. Los resultados se expresan en unidades arbitrarias como cuantificación relativa normalizada con control endógeno ¡52-microglobulina y HPRT. En todos los experimentos, los datos muestran la media de tres experimentos independientes. Las barras de error indican la SD. *P< 0,05 frente a DMSO.

Figura 16. La qRT-PCR muestra los niveles de expresión de mRNA de objetivos de Hh determinados en progenitores de cerebelo de ratón de 6 días de edad después de las inyecciones s.c. de Glabrescione B. Los resultados se expresan en unidades arbitrarias como cuantificación relativa normalizada con control endógeno ¡52-microglobulina y HPR^t. Los datos muestran la media ± SD de tres experimentos independientes. *P<0.05 frente a CTR

Figura 17. Glabrescione B inhibe el crecimiento tumoral de MB dependiente de Gli1 in vivo (aloinjertos Ptch1+/- de MB). (A) Cambio del volumen del tumor durante el período de tratamiento con Glabrescione B (GlaB) o vehículo (CTR) (18 días). (B) Volúmenes promedio de aloinjertos de costado representativos (panel superior); tinción H&E representativa de tumores (panel central); la inmunohistoquímica muestra tinción con Ki67 (panel inferior). (C) qRT-PCR de los niveles de expresión de mRNA de G lil y Ptchl normalizados con control endógeno ¡52-microglobulina y HPRT. Los datos muestran la media ± SD del tumor (n=6) para cada tratamiento. *P<0,05 frente a CTR.

Figura 18. Glabrescione B inhibe el crecimiento del tumor BCC dependiente de Gli1 in vivo. (Aloinjertos ASZ001 BCC). (A) Cambio del volumen del tumor durante el período de tratamiento con Glabrescione B (GlaB) o vehículo (CTR) (18 días). (B) Volúmenes promedio de aloinjertos de costado representativos (panel superior); tinción H&E representativa de tumores (panel central); la inmunohistoquímica muestra tinción con Ki67 (panel inferior). (C) qRT-PCR de mRNA de Gli1 y Ptchl. Se muestra la media ± SD del tumor (n=6) para cada tratamiento. *P<0,05 frente a CTR.

Figura 19. Efecto de los derivados NT8, NT9, NT10, NT11, NT12, NT13, NT14 y NT15 sobre la vía de Hedgehog, medido a dosis de 5 pM en un ensayo de luciferasa donde el gen informador fue Gli1 y la vía fue activada por la molécula SAG, un potente agonista de SMO.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Para descubrir compuestos naturales como inhibidores de la vía de Hh (dirigidos al receptor de SMO y/o la proteína Gli1), se establecieron dos protocolos de cribado computacional distintos, basados en la disponibilidad de información estructural o molecular. Se siguió un enfoque basado en ligandos para buscar antagonistas del receptor de SMO, basándose en la estructura química de los potentes antagonistas de SMO descritos en la literatura. Además, se utilizó un enfoque basado en receptores para dirigir a Gli1, basándose en la disponibilidad de una estructura cristalográfica de Gli1Gli1-ZF en complejo con ^d N^a (PDB ID: 2GLI) (Pavletich and Pabo 1993).

Cribado in silico

Generación de farmacóforos

Se eligió un conjunto de formación de 9 antagonistas de SMO activos, extraídos de la literatura y de patentes, para generar modelos de farmacóforos basados en ligandos. Dado que se permiten múltiples esquemas de alineación para los compuestos seleccionados en el espacio 3D, se generaron múltiples farmacóforos en consecuencia mediante el protocolo "Common Feature Pharmacophore Generation" implementado en la suite de modelado molecular Discovery Studio 2.5 de Accelrys (http://accelrys.com/) (Barnum, Greene et al. 1996). Después, los farmacóforos se puntuaron y clasificaron en función de su capacidad para mapear el conjunto de formación y se seleccionaron los seis farmacóforos de mayor rango. Pertenecen a dos grupos diferentes: Tipo 1: se necesitan tres características aceptoras de enlaces de hidrógeno (HBA) y tres hidrofóbicas (HYD) para representar el patrón de interacción de los potentes antagonistas de SMO con el receptor de SMO (Figura 1A); Tipo 2: se necesitan tres características de HBA, dos de HYD y un donante de enlaces de hidrógeno (HBD) para representar el patrón de interacción de los potentes antagonistas de SMO con el receptor de SMO (Figura 1B). Las coordenadas de las características farmacofóricas y las distancias entre características se reportan en las Tablas 1-4. Cabe especificar que este conjunto de formación ya se ha utilizado para propósitos similares (Manetti, Faure et al. 2010). Sin embargo, el uso de múltiples farmacóforos representa una característica única de la presente invención, ya que en el intento anterior se usó un único farmacóforo para filtrar bibliotecas químicas en la búsqueda de antagonistas de SMO (Manetti, Faure et al. 2010). El uso de múltiples farmacóforos para representar la unión del ligando a SMO explica mejor la flexibilidad del receptor, así como también mejora la investigación de moléculas líder candidatas químicamente diversas con respecto al conjunto de formación. Además, se utilizó por primera vez una característica de HBD para representar la interacción del ligando con SMO, ya que varios antagonistas de SMO conocidos están dotados de al menos un grupo HBD.

Cribado farmacofórico

Los seis farmacóforos descritos anteriormente se utilizaron como consulta 3D para filtrar la biblioteca única de compuestos naturales, cuyas características se describen en el ejemplo n.10. El análisis conformacional del ligando se realizó mediante el algoritmo CAESAR. El cribado de farmacóforos se realizó con Discovery Studio 2.5. Los protocolos Search 3D Database y "Ligand Pharmacophore Mapping" se usaron posteriormente para filtrar la biblioteca virtual y calcular el FitValue para cada ligando, como una medida de qué tan bien se ajusta un ligando a un farmacóforo. Basándose en los resultados del cribado de farmacóforos, los ligandos se dividieron en tres grupos: 1) ligandos que mapean todos los farmacóforos; 2) ligandos que mapean solo farmacóforos de Tipo 1 y 3) ligandos que mapean solo farmacóforos de Tipo 2. Se aplicó un procedimiento de consenso "rango por rango" para fusionar los resultados obtenidos al filtrar a través de cada modelo de farmacóforo. Dado que la biblioteca incluía productos naturales con dimensiones moleculares que iban desde pequeñas a muy grandes (por ejemplo, el volumen molecular varía entre 465,9 y 2981,8 A3, área de superficie polar de 8,2 a 265,6 A2), con el objetivo de priorizar los compuestos moleculares pequeños, se calculó además la Eficiencia del Ligando (LE) para cada compuesto seleccionado como la relación entre el FitValue y el número de átomos pesados del ligando (LE = FitValue/n° átomos pesados). 16 moléculas dotadas con los valores de LE más altos se consideraron de máxima prioridad y se seleccionaron para los estudios in vitro. La alineación de un compuesto ejemplificado, Glabrescione B, a un modelo de farmacóforo se muestra en la Figura 2.

Refinamiento de farmacóforos

Basándose en los resultados biológicos de un ensayo de luciferasa en donde el gen informador fue Gli1 y la vía fue activada por la molécula de SAG, un potente agonista de SMO, se clasificaron 2 moléculas como inhibidores de Hh altamente activos, mostrando una inhibición de más del 50 % a 5 pM (Glabrescione B y 2,4,5,3',4'-penta-OMe Chalcona), 5 como moderadamente activos, mostrando hasta un 30% de inhibición a 30 pM (Jaceidina, Auriculasina, 3,4-di-MDO-2',4',5'-tri-OMe dihidrochalcona, 2,3,4,6,3',4'-hexa-OMe Chalcona, Martinósido) y 9 no fueron activos (Ácido barbinérvico, Kuwanol-E, Miricetina, Soroceina-A, Soroceina-B, Isoforanona, Veratrina, Hesperidina, Naringina). En particular, se observó un peso molecular promedio altamente comparable para los inhibidores de Hh altamente activos (MW promedio = 404,45) y moderadamente activos (MW promedio = 390,80), mientras que los compuestos inactivos mostraron un peso molecular significativamente mayor (MW promedio = 503,51). Dado que los compuestos probados estaban compuestos solo por átomos de C, O y H, el peso molecular se consideró en este caso como proporcional a la dimensión molecular. Por lo tanto, los inventores imaginaron que los compuestos que tienen un alto MW no eran activos probablemente porque el sitio de unión del ligando en el receptor de SMO no era lo suficientemente grande para acomodar estas sustancias, o porque encuentran un impedimento estérico dentro del sitio de unión de SMO. La reducción de la accesibilidad estérica de los modelos de farmacóforos puede mejorar los resultados computacionales. Por lo tanto, se utilizaron compuestos inactivos para el refinamiento estérico de farmacóforos mediante el protocolo "Steric Refinement with Excluded Volumes" de Discovery Studio 2.5 que coloca los volúmenes excluidos a modelos de farmacóforos.

Cribado virtual basado en estructuras

Basándose en la disponibilidad de una estructura cristalina del dominio de dedos de zinc de Gli1-ZF en el complejo con el DNA, se estableció un protocolo de cribado virtual basado en la estructura para cribar la biblioteca única de compuestos naturales, cuyas características se describen en el ejemplo n.10. Primero, se realizaron simulaciones MD para relajar las coordenadas de los átomos en un disolvente explícito y para muestrear el espacio conformacional. Se simularon cuatro réplicas diferentes de MD sin restricciones durante 20 ns cada una, a partir de coordenadas iniciales ligeramente diferentes. Se extrajo una estructura representativa de las trayectorias de MD en la convergencia y se relajó aún más por medio de la minimización de energía después de la eliminación del DNA. Posteriormente, se utilizó el acoplamiento molecular para predecir el modo de unión teórico y la afinidad de los compuestos naturales hacia la estructura Gli1-ZF representativa refinada por MD. Basándose en los datos de la literatura, el sitio de unión se centró en T374 que se encuentra dentro de ZF4 y ZF5 (Sheng, et al. 2006). Los compuestos de la biblioteca única se acoplaron a Gli1-ZF por medio de la función GoldScore del programa GOLD (versión 5.0.1) (Verdonk, et al. 2003), que generalmente se recomienda para sitios de unión particularmente expuestos a disolventes o que representan varias interacciones proteína-ligando de unión a H, tal como el ZF4. Además, se aplicó un procedimiento de re-puntuaje que consiste en el cálculo de la energía delta de unión del ligando mediante los métodos MM-GBSA, con el objetivo de disminuir tanto como sea posible el número de falsos positivos identificados por acoplamiento. Después de acoplar y volver a puntuar, el LE se calculó como la relación entre la energía delta de unión y el número de átomos pesados de cada ligando. Curiosamente, Glabrescione B, que ya se evaluó como antagonista de SMO, se encontró dentro de las posiciones más altas del cribado virtual basada en las estructuras. Por esta razón, además de explotar la posibilidad de desarrollar un inhibidor multidiana de la vía de Hh, Glabrescione B se consideró de máxima prioridad para los ensayos in vitro. El modo de unión basado en acoplamiento de Glabrescione B a Gli1-ZF se muestra en la Figura 3.

Farmacología

La potencia de Glabrescione B se evaluó midiendo su capacidad para inhibir la vía de Hh en un contexto celular de hiperactivación de señalización de Hh. Esta condición, que conduce a la activación constitutiva de los factores de transcripción de Gli, puede desencadenarse al sobreexpresar Gli1 o tratar líneas celulares sensibles a Hh con ligando Shh o SAG, un potente agonista de SMO o puede producirse en células después de mutaciones de componentes clave de la vía.

Los efectos de Glabrescione B como SMO y antagonista de Gli1 se han examinado mediante bioquímica y en varios ensayos basados en células.

Ensayo bioquímico.

La afinidad de Glabrescione B y su unión directa al receptor de SMO se cuantificó en un ensayo de desplazamiento. El ensayo se basa en el uso de Bodipy-ciclopamina (BC), un derivado fluorescente de la ciclopamina, que interactúa con SMO a nivel de su haz heptahelicoidal. Con este fin, las células HEK293 se transfectaron con un vector que expresa la proteína SMO y después se incubaron con BC en ausencia o presencia de varias concentraciones de Glabrescione B. Este ensayo reveló que Glabrescione B bloqueaba la unión de BC a SMO de manera dependiente de la dosis con una IC⁵⁰ de 1 pM (Figura 5). KAAD, utilizado como control positivo, anuló la unión de BC a células que expresan SMO. Juntos, estos resultados muestran que el ensayo de desplazamiento es específico y demuestran que Glabrescione B se une al receptor de SMO al nivel del sitio de unión de Bodipy-ciclopamina.

Ensayo Celular.

Para investigar las propiedades inhibitorias de Glabrescione B en la señalización de Hh, los inventores examinaron sus efectos en células Shh-light II (Shh-LII) NIH 3T3 que incorporan de manera estable un informador sensible a Hh (Gli-RE), en donde se produce la inducción de la vía después del tratamiento con el agonista de SMO SAG. Este ensayo in vitro reveló que Glabrescione B redujo significativamente la actividad de la luciferasa en las células tratadas con SAG de manera dependiente de la dosis (Figura 6) y suprimió la señalización. La IC⁵⁰ en este ensayo fue de 0,8 pM.

También se probó la eficacia de Glabrescione B para dirigirse directamente a la proteína Gli1, el efector final de la vía de Hh. Las células HEK293 que expresan transitoriamente Gli1 y un informador de luciferasa dependiente de Gli, mostraron que Glabrescione B era capaz de reducir la transcripción mediada por Gli1 de una manera dependiente de la dosis con una IC⁵⁰ de “ 15 pM (Figura 7). GANT61, la única molécula pequeña descrita para inhibir la función de Gli1 (Lauth et al., PNAS 104: 8455-8460), se incluyó como control positivo.

Para analizar las propiedades antagonistas de Glabrescione B en condiciones más fisiológicas, los inventores utilizaron células MEF-PtchÁ fibroblastos embrionarios derivados de Ptch'A de ratón, en donde la activación de la señalización de Hh es consecuencia de la supresión de Ptchl. Dado que Patched actúa como represor anterior de SMO, se previene la inhibición de la vía de Hedgehog de Patched y la vía de Hedgehog se activa constitutivamente en estas líneas celulares, lo que resultó ser un modelo celular fiable para estudiar el efecto de los inhibidores de Hedgehog. Estas células mostraron niveles fuertemente reducidos de mRNA y proteína de Glil (una lectura de la señalización de Hh) cuando se trataron con Glabrescione B a diferentes concentraciones (Figuras 8A y B). Además, los autores probaron la actividad inhibidora de Glabrescione B en células MEF-SuFuÁ que representan otro modelo celular de la vía de Hedgehog activada. De hecho, en esta línea celular, la activación anómala de la vía de Hh se debe a la ablación genética del regulador negativo posterior SuFu. El tratamiento de las células MEF-SuFu^ con Glabrescione B condujo a una reducción significativa de los altos niveles de expresión de Gli1, como se indica mediante RT-PCR cuantitativa (Figura 9). Estos resultados confirman que Glabrescione B es un inhibidor multiobjetivo de la señalización de Hh, capaz de actuar tanto anteriormente mediante su unión directa al receptor de SMO como después de SMO y SuFu al suprimir las funciones de transcripción de Gli1.

Se realizó un ensayo biológico en células progenitoras neurales del cerebelo obtenidas de ratones de 4 días de edad, cuando proliferan activamente bajo el estímulo de Sonic Hedgehog (Shh). Como era de esperar, el tratamiento de estas células con Shh aumentó la tasa de proliferación, como se evaluó mediante el ensayo de incorporación de BrdU. Es importante destacar que Glabrescione B antagonizó este efecto (Figura 10). Para evaluar además el efecto antiproliferativo de Glabrescione B, las líneas de células D283 de MB humano se trataron con Glabrescione B a diferentes concentraciones. El ensayo de incorporación de MTS y BrdU demostró un efecto inhibidor dependiente de la dosis sobre la proliferación celular después de 48 h de exposición al intervalo de dosis de 1 - 50 pM (Figuras 11A y B). La biomolécula era activa, como lo demuestra la inhibición de la tasa de crecimiento (70-95%). En particular, el efecto inhibitorio de Glabrescione B sobre la proliferación de células D283 de MB se asoció con un aumento del porcentaje de muerte celular, de manera dependiente de la dosis (Figura 12). Más importante aún, Glabrescione B fue ineficaz en vías de transducción de señales no relacionadas (activación de Wnt/pcatenina y Jun/AP1; 0 % de inhibición a 30 pM de Glabrescione B), lo que demuestra un alto grado de selectividad para la señalización de Hh.

La actividad de Hh se asocia preferiblemente a características de fortaleza. Por esta razón, el antagonista de la vía de Hh Glabrescione B también se ha investigado para su capacidad para modular el comportamiento de las células madre cancerosas de MB (CSCs). El análisis por RT-PCR cuantitativa reveló un efecto inhibitorio de la Glabrescione B sobre la actividad de Hh, como se muestra por la reducción de los niveles de mRNA de Gli1 (Figura 13). Además, el tratamiento con Glabrescione B tuvo un efecto supresor sobre la autorrenovación de las CSCs de MB, en particular sobre el porcentaje de células formadoras de neuroesferas derivadas de Ptch+A de MB murino (condición de activación constitutiva de la vía de Hh). En particular, este efecto inhibitorio fue significativamente mayor que el efecto logrado con el conocido antagonista de Hh, como KAAD (Figura 14).

Síntesis química de las sustancias bioactivas

Las abreviaturas utilizadas en la descripción de la química y en los ejemplos que siguen son: MD: Dinámica Molecular; MM-GBSA: Área de Superficie Nacida Generalizada de Mecánica Molecular; Gli1-ZF: dominio de dedo de zinc de Gli1; BrdU: 5'-bromo-2Ldesoxiuridina; DMSO: dimetilsulfóxido; MeOH: metanol; EtOH: etanol; EtOAc: acetato de etilo; EDTA: ácido etilendiaminotetraacético; HBSS: solución salina equilibrada de Hank; HPRT: hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa; ciclopamina-KAAD: 3-ceto-N-(aminoetil-aminocaproil-dihidrocinamoil)-ciclopamina; M: molar; min: minutos; h: hora(s); g (gramos); pL (microlitros); mL (mililitros); mmol (milimoles); nm (nanómetros); pM (micromolar); r.t.: temperatura ambiente; RT-QPCR: PCR cuantitativo en tiempo real; Gli-luc: indicador de luciferasa dependiente de Gli, ESI (ionización por electroespray).

Excepto donde se indique lo contrario, todas las temperaturas se expresan en °C (grados centígrados) o K (Kelvin).

Los espectros de 1H NMR y 13C NMR se registraron utilizando un espectrómetro Bruker 400 Ultra ShieldTM (que funciona a 400 MHz para 1H y 100 MHz para 13C) utilizando tetrametilsilano (TMS) como patrón interno. Los desplazamientos químicos se reportan en partes por millón (ppm). Las señales para el carbono -NCH3 no están presentes en los datos de 13C NMR.

Los desplazamientos químicos se expresan en partes por millón (ppm, unidades ó). Las constantes de acoplamiento se expresan en Hertz (Hz) y los patrones de división se describen como s (singlete), bs (señal ancha), d (doblete), t (triplete), q (cuarteto), quint (quinteto), m (multiplete).

La espectrometría de masas se realizó utilizando un espectrómetro de masas con trampa de iones lineal Thermo Finnigan LXQ, equipado con una fuente de iones de ionización por electroespray (ESI). Los espectros de masas de alta resolución (HRMS) se obtuvieron utilizando un espectrómetro de resonancia de ciclotrón de iones por transformada de Fourier (FT-ICR) Bruker BioApex equipado con una fuente ESI.

Ejemplo n. 1: Ensayo de desplazamiento con Bodipy-ciclopamina

Para investigar las propiedades de unión de Glabrescione B al receptor de SMO, se llevó a cabo un ensayo de competición. En este experimento se analizó si Glabrescione B podía competir con Bodipy-cyclopamine (BC; 5nM USBiological, cat. # B2527), un derivado fluorescente de la ciclopamina, que se sabe que interactúa con el receptor de SMO a nivel de su haz heptahelicoidal. Con este fin, se transfectaron células HEK293 (ATCC, cat. # CRL-1573) con el vector de expresión de SMO (Chen et al, 2002) utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, cat # 11668-019); 24 horas después de la transfección, las células se fijaron en paraformaldehído al 4 % y se incubaron con BC 5 nM solo o en presencia de cantidades crecientes de Glabrescione B durante 2 horas a 37°C. Las células también se trataron con el alcaloide esteroidal antagonista de SMO ciclopamina-KAAD (3-ceto-N-(aminoetil-aminocaproildihidrocinamoil)-ciclopamina, 1 pM Calbiochem, cat. # 239804), un análogo químico de la ciclopamina, incluido como control positivo. Las células se analizaron con un microscopio Carl Zeiss (Axio Observer ZI). Se tomaron imágenes de cultivos celulares con un objetivo de 20X para el análisis. Las señales de bodipy-ciclopamina (verde) y DAPI (azul) se analizaron en 3-4 campos representativos para cubreobjetos. El resultado mostrado en la Figura 5 indica que Glabrescione B anuló la unión de BC a las células que expresan SMO con una IC⁵⁰ de 1 pM al interactuar con el receptor de SMO.

Ejemplo n. 2: Efectos de Glabrescione B en la señalización de Hh.

La capacidad de Glabrescione B para suprimir la señalización de Hh se evaluó en un contexto celular de inducción de la vía de Hh. Para ello, se determinaron las propiedades antagonistas de Glabrescione B en Shh Light II (ATCC, cat. # CRL-2795), una línea celular de fibroblastos murinos NIH 3T3. Estas células, que incorporan de forma estable el informador Gli-luc y el pRL-TK Renilla reniformis (como se describe en Taipale, Chen et al. 2000) son una herramienta estándar utilizada para analizar la actividad de la vía de Hh. Las células que alcanzaron la confluencia se trataron durante 48 h con el agonista de SMO SAG (200 nM, Alexis, cat. # ALX-270-426-M001) en ausencia o en presencia de Glabrescione B en la cantidad indicada en la Figura 6. SAG es un potente compuesto de benzotiofeno permeable a las células que promueve el acoplamiento de SMO con su efector posterior al interactuar con el dominio heptahelicoidal de SMO (kd = 59 nM) y se ha demostrado que induce la activación de la vía de Hedgehog. Las células de control se trataron solo con DMSO (0,5 %, SERVA, cat. # 39757.02). La determinación de las actividades de luciferasa se llevó a cabo mediante el ensayo Luciferasa Dual según las instrucciones del fabricante (Dual-luciferase® Reporter assay system; Promega, cat. # E1980). Todos los datos presentados son actividad de luciferasa de luciérnaga reportada a la actividad de control de Renilla. Como se muestra en la Figura 6, Glabrescione B inhibe la señalización de Hh tras la activación de SAG, como lo demuestra la disminución dependiente de la dosis en la actividad del informador de luciferasa. La IC⁵⁰ de 0,8 pM, representa la concentración de Glabrescione B necesaria para tener un cincuenta por ciento de inhibición.

Ejemplo n. 3: Inhibición de la transcripción mediada por Gli1 en células HEK293.

Para investigar la capacidad de Glabrescione B para bloquear la señalización de Hh posterior dirigiéndose a las funciones de la proteína Gli1, los inventores realizaron un ensayo de luciferasa en células HEK293 que expresan Gli1 de forma transitoria. Las células se sembraron en placas de 24 pocillos múltiples y al día siguiente se transfectaron con el vector de expresión de Gli1 junto con los plásmidos informadores 12xGliBS-Luc y pRL-TK de Renilla reniformis (Kogerman P et al, 1999; Everett L et al, 1999). Veinticuatro horas más tarde, se añadió Glabrescione B a una concentración diferente a la indicada y se añadió GANT61 (incluido como control positivo, Enzo Life Science, cat. # ALX-270-482) a la concentración final de 20 pM en DMSO (0,5%, SERVA, cat. # 39757.02). Después de 24 h de tratamiento, las células se lisaron y analizaron utilizando el kit de Luciferasa Dual según las instrucciones del fabricante (Dual-luciferase® Reporter assay system; Promega, cat. # E1980). Todos los datos presentados son actividad de luciferasa de luciérnaga reportada a la actividad de control de Renilla. Como se muestra en la Figura 7, Glabrescione B fue capaz de interferir con la transcripción inducida por Gli1 de una manera dependiente de la dosis y de manera similar a GANT61.

Ejemplo n. 4: Efectos de Glabrescione B en la línea celular sensible a Hh.

Para determinar si Glabrescione B regula las células con una activación constitutiva de la vía de Hh, la línea celular MEF-Ptch'7' (una donación de M. Scott, Stanford University, CA, en la que la activación de la señalización de Hh es consecuencia de la eliminación de Ptch1, Goodrich, L. V. et al, 1997) se trató con Glabrescione B en diferentes concentraciones y el efecto sobre la expresión de la vía de Hh/Gli1 se determinó mediante RT-PCR cuantitativa y análisis de transferencia Western. El RNA total se aisló con reactivo TRI (Invitrogen, cat. # AM9738) y se transcribió de forma inversa con transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen, cat. # PN100004925) y hexámeros aleatorios (Invitrogen, cat. # PN58875). El análisis de PCR cuantitativa (QPCR) de la expresión de mRNA de Gli1 se realizó en cada muestra de cDNA utilizando el sistema de detección de secuencias ABI Prism 7900 empleando reactivos de ensayo bajo demanda (Life Technologies). Se amplificó una mezcla de reacción que contenía una plantilla de cDNA, una mezcla maestra TaqMan Universal PCR (ABI) y una mezcla de sonda de cebador usando los parámetros estándar del termociclador QPCR. Cada reacción de amplificación se realizó por triplicado y se usó el promedio de los tres ciclos de umbral para calcular la cantidad de transcrito en la muestra (usando el software SDS versión 2.3). Todos los valores se normalizaron con controles endógenos de HPRT (hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa) (Life Technologies, cat. # Mm 00494645_m1 Glil; Mm 01545399_m1). Para el análisis de transferencia Western, las células se lisaron en Tris-HCl (pH 7,6) 50 mM, NaCl 150 mM, NP-40 al 1 %, EDTA 5 mM, sal sódica del ácido desoxicólico al 0,5 %, NaF 100 mM e inhibidores de proteasa. Los lisados se centrifugaron a 13000 g durante 20 minutos, se separaron mediante SDS-PAGE al 8 % y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. La inmunotransferencia se realizó con un anticuerpo monoclonal de ratón contra Gli1 (Cell Signaling, cat. # L42B10) o un anticuerpo policlonal de cabra contra actina (Santa Cruz Biotechnology, cat. # I1012), utilizado como control de carga. Se utilizaron anticuerpos secundarios conjugados con HRP IgG anti-ratón o anti-cabra (Santa Cruz Biotechnology, cat. # SC-2005, n.° SC-2020) y las bandas inmunorreactivas se visualizaron mediante quimioluminiscencia mejorada (Perkin Elmer, cat. # NEL105001EA). Se usó KAAD (1 pM, Calbiochem, cat. # 239804) como control. Como se muestra en la Figura 8, Glabrescione B regula a la baja la expresión de Glil en comparación con el control no tratado.

Para dilucidar aún más el concepto de inhibición posterior de la vía por Glabrescione B, los inventores utilizaron células MEF-SuFu^ (una donación de R. Toftgard, Karolinska Institutet, Sweden, Svard, J. et al, 2006), en donde la activación posterior de la vía de Hh es consecuencia de la ablación genética de SuFu. Las células confluentes se trataron con Glabrescione B en la cantidad indicada en la Figura 9 y los niveles de expresión de Gli1 se determinaron mediante RT-PCR cuantitativa como se describió anteriormente. Como se muestra en la Figura 9, Glabrescione B promovió una regulación a la baja significativa de los niveles de mRNA de Gli1. Los datos se normalizaron con controles endógenos de HPRT, como se describe anteriormente. Estos hallazgos confirman que Glabrescione B es, de hecho, un inhibidor de la señalización posterior de Hh de SMO y SuFu.

Otro experimento para evaluar si Glabrescione B también regula la vía de Hh en un contexto fisiológico se llevó a cabo en precursores de células granulares del cerebelo (GCPs) aisladas de ratones de 4 días de edad según protocolos establecidos (Wechsler-Reya y Scott, 1999). Brevemente, los cerebelos se extrajeron asépticamente, se cortaron en trozos pequeños y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 min en tampón de digestión [PBS de Dulbecco (Invitrogen, Gaithersburg, MD) con 0,1 % de tripsina, 0,2 % de EDTA y ADNasa 100 pg/ml]. Después, los tejidos se trituraron con pipetas Pasteur pulidas al fuego para obtener una suspensión unicelular. Las células se centrifugaron, se resuspendieron en medio Neurobasal suplementado con B27, penicilina-estreptomicina y L-glutamina (2 mM) (Invitrogen) y se sembraron en placas a una densidad de 8 * 105 células/cm2 en placas de cultivo de tejidos o portaobjetos de cámara Lab-Tek de ocho pocillos (Permanox slide; Nunc, cat. # 177445) recubiertos con poli-L-lisina 1 mg/ml. Estas células se trataron con Shh solo (Recombinant mouse Sonic Hedgehog, amino-terminal peptide; 3 pg/ml, R&D system, cat. # 461-SH) o en combinación con diferentes concentraciones de Glabrescione B durante 48 h y las dosis de IC⁵⁰ de inhibición del crecimiento se determinaron mediante ensayo de marcaje con BrdU (bromodesoxiuridina, 5'-bromo-2Ldesoxiuridina, Roche, cat. # 11296 736001) según métodos estándar (Figura 10). Después de la incorporación de BrdU, las GCPs se fijaron en paraformaldehído al 4 % durante 20 min a temperatura ambiente, se incubaron en Triton X-100 al 0,2 % para permeabilizar las células y se trataron con HCl 2N para desnaturalizar el DNA. La detección de BrdU se realizó según las instrucciones del fabricante.

Para determinar si Glabrescione B también inhibe la proliferación de células cancerosas, se trataron células D283 de MB humano (ATCC, cat. # HTB-185) con Glabrescione B y se midió la tasa de proliferación/viabilidad mediante la incorporación de BrdU y los ensayos de MTS, respectivamente. Las células, como se muestra en la Figura 11, mostraron un efecto inhibidor dependiente de la dosis sobre la proliferación celular (Figura 11A) y la viabilidad (Figura 11B) después de 48 h de exposición al intervalo de dosis de 1 - 50 pM. Más importante aún, Glabrescione B fue capaz de promover la muerte celular de las células D283 de MB, según lo reportado por el ensayo de conteo con Trypan Blue (Figura 12). La proliferación celular se evaluó mediante un ensayo de marcaje con BrdU (pulso de 8 h; Roche, cat. # 11296736001) como se ha descrito anteriormente; la viabilidad celular se evaluó mediante MTS (un compuesto de tetrazolio [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio, sal interna; MTS; Promega, cat. # G3580). La muerte celular se midió por exclusión con T rypan Blue (Sigma, cat. # T8154) contando al menos 200 células, en muestras duplicadas. Todos los ensayos descritos se evaluaron a las 48 h después del tratamiento.

Ejemplo n. 5: Efectos de Glabrescione B en células madre cancerosas de MB y células similares a células derivadas del cáncer.

Se ha descrito que la actividad de Hh se asocia preferentemente a características de fortaleza. Con el fin de determinar si Glabrescione B también modula el comportamiento de las células madre cancerosas de MB (CSCs), las neuroesferas aisladas de Ptch+/_ de MB murino se trataron con Glabrescione B durante 48 h y los niveles de Glil se determinaron mediante RT-PCR cuantitativa. Los MBs murinos se aislaron de Ptch1+/_ de ratones (Goodrich, Milenkivic et al. 1997). Los tejidos se recogieron en HBSS suplementado con glucosa al 0,5 % y penicilina-estreptomicina, se trituraron groseramente con una pipeta serológica y se trataron con DNasa I hasta una concentración final del 0,04 % durante 20 min. Finalmente, los agregados de células se disociaron mecánicamente utilizando pipetas de diámetro interior decreciente para obtener una suspensión de células individuales. Las CSCs se cultivaron como neuroesferas en medio selectivo después de la centrifugación, DMEM/F12 suplementado con glucosa al 0,6 %, insulina 25 mg/ml, N-acetil-L-cisteína 60 mg/ml, heparina 2 mg/ml, EGF 20 ng/ml, bFGF 20 ng/ml, penicilina-estreptomicina 1X y suplemento de B27 sin vitamina A. Las neuroesferas se trataron con el alcaloide esteroidal antagonista de SMO, ciclopamina-KAAD (1 pM Calbiochem, cat. # 239804). La extracción de RNA y el análisis de expresión de mRNA se realizaron como se describe anteriormente. Como se muestra en la Figura 13, la expresión de Gli1 se reguló a la baja en comparación con el control no tratado. Todos los valores se normalizaron con controles internos de HPRT.

Se llevó a cabo otro experimento para determinar la capacidad de Glabrescione B para suprimir la autorrenovación de CSCs de MB. Con este fin, las neuroesferas derivadas de Ptch+/- de MB murino se trataron con Glabrescione B a diferentes concentraciones y se midió el porcentaje de células formadoras de neuroesferas. Para el ensayo de formación de neuroesferas, las células se sembraron a una densidad clonal (1-2 células/mm2) en placas de 96 pocillos y se cultivaron en medio selectivo como se describe anteriormente.

Los resultados que se muestran en la Figura 14 indican que Glabrescione B tiene un efecto inhibidor sobre la autorrenovación de las células madre cancerosas. En particular, este efecto inhibidor fue significativamente mayor que el efecto logrado con el conocido antagonista de Hh kAa D, lo que refuerza que Glabrescione B es un potente inhibidor del crecimiento tumoral a través de la inhibición de la vía de señalización de Hh.

Se observaron resultados similares en células de carcinoma basocelular (BCC) ASZ001, previamente caracterizadas como una línea celular tumoral dependiente de Hh/Gli que albergaba la supresión de Ptch1 (Aszterbaum et al, 1999). El RNA total se aisló con Trizol (Invitrogen, Eugene, OR, USA) y se transcribió de manera inversa con transcriptasa inversa Superscript II y hexámeros aleatorios (Invitrogen, Eugene, OR, USA). El análisis cuantitativo por PCR en tiempo real (qRT-PCR) de Gli1, Gli2, Ptchl, Ptch2, Nanog, Oct-4, Cyclin D1, Cyclin D2, Nmyc, HIP1, Sfrpl, Bmp2, IGF2, ¡5-2 microglobulina, HPRT, la expresión de mRNA se realizó en cada muestra de cDNA utilizando el sistema de detección de secuencias ABI Prism 7900HT empleando reactivos de ensayo bajo demanda (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.). Se amplificó una mezcla de reacción que contenía una plantilla de cDNA, una mezcla maestra TaqMan Universal PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) y una mezcla de sonda de cebador utilizando los parámetros estándar del termociclador qRT-PCR. Cada reacción de amplificación se realizó por triplicado y se usó el promedio de los tres ciclos de umbral para calcular la cantidad de transcrito en la muestra (usando el software SDS versión 2.3). La cuantificación del mRNA se expresó, en unidades arbitrarias, como la relación entre la cantidad de muestra y la cantidad del calibrador.

Todos los valores se normalizaron con dos controles endógenos, ¡5-2 microglobulina y HPRT, que dieron resultados similares.

La proliferación de células BCC se vio afectada por el tratamiento in vitro con Glabrescione B junto con una supresión del mRNA de Gli1 antes de que ocurriera una muerte celular inducida por fármacos (Figura 15). En particular, no se observó ningún efecto en células de carcinoma hepatocelular HepG2 independientes de Hh o células de leucemia Jurkat T, que muestran niveles indetectables de Gli1 (Lauth et al, 2007).

En resumen, la actividad inhibidora de Glabrescione B en el subconjunto de células madre/progenitoras tanto normales como tumorales, así como en las poblaciones de células tumorales completas, está restringida a las células dependientes de Hh/Gli.

Ejemplo n. 6: Glabrescione B inhibe el crecim iento tumoral dependiente de Gli1 in vivo

Para evaluar la actividad in vivo de Glabrescione B, primero probamos su capacidad para suprimir la señalización de Hh en progenitores de cerebelos de ratón de 6 días de edad, considerados la célula de origen de MB. Los ratones CD1 de 6 días de edad se dividieron aleatoriamente en dos grupos (n = 6) y se inyectaron s.c. solo con disolvente (2-hidroxipropil-p-ciclodextrina:etanol, 3:1) o Glabrescione B en disolvente (100 pmol/Kg) durante 2 días (la 2-hidroxipropil-p-ciclodextrina se adquirió de Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA). Se recogieron los cerebelos y se determinaron los niveles de mRNA mediante qRT-PCR. El tratamiento con Glabrescione B redujo significativamente los niveles de cerebelos de los genes diana de Hh (Figura 16).

Por lo tanto, para verificar la eficacia de Glabrescione B para inhibir el crecimiento de células tumorales dependientes de Hh in vivo, recurrimos a un modelo de aloinjerto de células de MB. Meduloblastomas espontáneos de Ptch1+/_de ratones se aislaron, se trituraron, se pipetearon para obtener una suspensión unicelular y se injertaron s.c. en el costado posterior de hembras de ratones nude BALB/c (nu/nu) (Charles River Laboratories, Lecco, Italy). Los tumores se cultivaron hasta un tamaño medio de ~100 mm3. Los animales se dividieron aleatoriamente en dos grupos (n = 6) y se trataron solo con disolvente (2-hidroxipropil-p-ciclodextrina:etanol, 3:1) o Glabrescione B en disolvente (75 pmol/Kg) durante 18 días (la 2-hidroxipropil-p-ciclodextrina se adquirió de Sigma Aldrich , St. Louis, MO, USA). 2 x 106 células ASZ001 BCC se resuspendieron en un volumen igual de medio 154CF y Matrigel (BD Biosciences, Heidelberg, Germany) y se inyectaron s.c. en el costado posterior de ratones hembra NOD/SCID (Charles River Laboratories, Lecco, Italia), como se describió previamente (Eberl et al, 2012). Los tumores crecieron hasta un tamaño medio de ~200 mm3. Los animales se dividieron aleatoriamente en dos grupos (n = 6) y se trataron solo con disolvente (2-hidroxipropil-p-ciclodextrina:etanol, 3:1) o Glabrescione B en disolvente (100 pmol/Kg) durante 18 días. El cambio de volumen tumoral se calculó mediante la fórmula largo x ancho x 0,5 x (largo ancho) (Lauth et al, 2007).

Los ratones nude se injertaron con MB primario espontáneo de Ptch1+A de ratones y se trataron cada dos días con inyecciones s.c. de Glabrescione B a una concentración de 75 pmol/Kg o disolvente solo (n = 6 para cada grupo). Durante un período de tratamiento de 18 días, Glabrescione B suprimió significativamente la masa tumoral en comparación con los controles, como se confirma por la disminución in vivo de la tinción de Ki67 en tumores tratados con Glabrescione B junto con una reducción de los niveles de mRNA de Gli1 (Figura 17). En particular, la inhibición in vivo del crecimiento tumoral inducida por Glabrescione B también se observó en aloinjertos s.c. de BCC. Se observó una reducción significativa del crecimiento tumoral, así como de los niveles de mRNA de Gli1, 18 días después de la administración de Glabrescione B (100 gmol/Kg) en comparación con el disolvente solo (Figura 18).

Ejemplo n. 7: Síntesis química de Glabrescione B

La síntesis total de la isoflavona Glabrescione B es una ruta sintética de seis etapas, con un rendimiento global del 7%. También permite la preparación de numerosos derivados de Glabrescione B. El uso de Pd EnCat ™40, como catalizador, introduce un aspecto de química verde en la síntesis.

Los rendimientos se calcularon asumiendo que los productos eran 100% puros si no se indica lo contrario.

1) PbtOAcU benceno seto 80‘C. durante la noche

2)THF/HjO. A^cOH zrc th

acetona. 80"C

Intermedio 2: 2-hidroxi-4,6-dimetoxiacetofenona (2)

Se cargó un matraz secado a la llama con 2,4,6-trimetoxiacetofenona (23,8 mmol, 5 g) (SIGMA-ALDRICH 630594) y CH²Cl² seco (75 ml) bajo argón. BBr3 (87,3 mmol, 15 ml) se añadió gota a gota. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 h antes de añadir NaOH 4 M (90 ml) y se dejó reposar durante 30 min. La solución se extrajo con CH²Cl² y las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2SO4 y finalmente se concentraron a presión reducida. El sólido resultante se recristalizó de EtOH y se obtuvieron cristales blancos de 2-hidroxi-4,6-dimetoxiacetofenona 2 (4,43 g, 98% de rendimiento).

2-hidroxi-4,6-dimetoxiacetofenona (2)

Sólido blanco, (4,43 g) 98 % de rendimiento. Mp: 81-82°C. 1H NMR (400 MHz, Acetona-d6): 5 (ppm) 13,8 (s, 1H, OH), 5,94 (d, 1H, J = 2,4 Hz, ArH), 5,91 (d, 1H, J = 2,4 Hz, ArH), 3,80 (s, 3H, OCH³), 3,72 (s, 3H, OCH³), 2,43 (s, 3H, CH³); 13C NMR (400 MHz, Acetona-d6): 5 (ppm) 202,5 (s, C=O), 167,36 (s, C-4), 166,34 (s, C-6), 163,15 (s, C-2), 105,5 (s, C-1), 93,42 (d, C-3), 90,43 (d, C-5), 55,20, 55,00 (q, 2 x OCH³), 31,94 (q, CH³). ESI-EM (positivo): m/z calculado para C¹⁰H¹²O⁴+H+: 197,080800 [M+H]+ (masa monoisotópica); encontrado: 197,080848.

Intermedio 4: 3-yodo-5,7-dimetoxi-4H-cromen-4-ona (4)

Una mezcla de 2-hidroxi-4,6-dimetoxiacetofenona 2 (23,1 mmol, 4,5 g) y N,N-dimetilformamida dimetilacetal (97,1 mmol, 13 ml) se agitó a 95°C durante 3 h, después se concentró al vacío para dar la enamino cetona 3 (5,8 g) en rendimiento cuantitativo. (Biegasiewicz, St Denis et al. 2010). El Compuesto 3 se disolvió en MeOH (450 ml) y se añadió I² (46,2 mmol, 11,7 g) a la solución. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora y después se evaporó el disolvente. Para eliminar I² residual, el crudo se trató con una solución acuosa saturada de Na2S2O3 hasta que la mezcla se volvió transparente. A continuación, la mezcla se extrajo con CHCb, las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna usando hexano-EtOAc como eluyente para obtener 3-yodo-5,7-dimetoxi-4H-cromen-4-ona 4 (2,5 g, 33 % de rendimiento) como un polvo blanco.

3-dimetilamino-1 -(2-hidroxi-4,6-dimetoxifenil)propenona (3)

Sólido rojo, (5,8 g) rendimiento cuantitativo. Mp: 145-147°C. 1H NMR (400 MHz, CDCb): 6 (ppm) 15,65 (s, 1H, OH), 7,92 (d, 1H, J = 12 Hz, =CH-N ), 6,25 (d, 1H, J = 12,0 Hz, =CH-(CO)), 6,07 (d, 1H, J = 2,4 Hz, ArH), 5,91 (d, 1H, J = 2,4 Hz, ArH), 3,84 (s, 3H, OCH³), 3,80 (s, 3H, OCH³), 3,15 (s, 3H, NCH³), 2,92 (s, 3H, NCHs); 13C NMR (400 MHz, CDCb): 6 (ppm) 191,64 (s, C=O), 169,00 (s, C-4), 165,54 (s, C-6), 162,86 (s, C-2), 155,83 (d, =CH-N), 106,58 (s, C-1), 96,27 (d, =CH-(CO)), 95,59 (d, C-3), 92,06 (d, C-5), 57,09, 56,57 (q, 2 x OCH³). ESI-EM (positivo): m/z calculado para C¹³H¹⁷O⁴+H+: 252,1 [M+H]+ (masa monoisotópica); encontrado: 252,1.

3-yodo-5,7-dimetoxi-4W-chromen-4-one (4)

Sólido blanco, (2,5 g) 33 % de rendimiento. Mp: 156-157°C. 1H NMR (400 MHz, CDCb): 6 (ppm) 8,02 (s, 1H, H-2), 6,37 (d, J = 2,0 Hz, 1H, ArH), 6,32 (d, J = 2,0 Hz, 1H, ArH), 3,87 (s, 3H, OCH³), 3,82 (s, 3H, OCH³); 13C NMR (400 MHz, CDCb): 6 (ppm) 183,43 (s, C=O), 164,28 (s, C-7), 160,97 (s, C-5), 159,81 (s, C-9), 155,33 (d, C-2), 107,53 (s, C-10), 96,59 (d, C-8), 92,44 (d, C-6), 89,71 (d, =CH-I), 56,41,55,79 (q, 2 x OCH³). ESI-EM (positivo): m/z calculado para C¹¹H⁹O⁴ I+H+: 332,961800 [M+H]+ (masa monoisotópica); encontrado: 332,961633.

Intermedio 5: 3-(3',4'-metilendioxifenil)-5,7-dimetoxi-4H-cromen-4-ona (5)

A una solución de 4 (7,5 mmol, 2,5 g) en 1,2-dimetoxietano/H2O= 50 : 50 (150 ml) se añadieron Na2CO3 (30 mmol, 3,18 g), ácido 3,4-(metilendioxi)-fenilborónico (11 mmol, 1,8 g) y Pd EnCat™40 (937 mg, 5%). La mezcla resultante se agitó a 45°C durante 2 h y después se filtró. El catalizador se lavó con H²O y CH²Cl². La fase acuosa se extrajo con CH²Cl². Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron a presión reducida. El residuo crudo se purificó mediante cromatografía ultrarrápida para dar 3-(3',4'-metilendioxifenil)-5,7-dimetoxi-4H-cromen-4-ona 5 (1,4 g, 57% de rendimiento) como polvo gris.

3-(3',4'-metilendioxifenil)-5,7-dimetoxi-4H-cromen-4-ona (5)

Sólido gris, (1,4 g) 57 % de rendimiento. Mp: 155-156°C. 1H NMR (400 MHz, CDCla): 5 (ppm) 7,75 (s, 1H, H-2), 7,1 (d, J = 2,0 Hz, 1H, H-2'), 6,94 (dd, J = 8,0 Hz y 2,0 Hz, 1H, H-6' ), 6,83 (d, J = 8,0 Hz, 1H, H-5' ), 6,44 (d, J = 2,2 Hz, 1H, H-6), 6,37 (d, J = 2,2 Hz, 1H, H-8), 5,97 (s ancho, 2H, O-CH²-O), 3,94 (s, 3H, OCH³), 3,89 (s, 3H, OCH³); 13C NMR (400 MHz, CDCb): 5 (ppm) = 175,09 (s, C=O), 164,02 (s, C-7), 161,54 (s, C-5), 160,30 (s, C-9), 150,05 (d, C-2), 147,58 (s, C-3'), 147,58 (s, C-4'), 126,5 (s, C-3), 126,04 (s, C-1'), 122,84 (d, C-6'), 110,50 (d, C-2'), 110,0 (s, C-10), 108,35 (d, C-5'), 101,30 (t, O-CH²-O), 96,74 (d, C-6), 92,73 (d, C-8), 56,41,55,79 (q, 2 x OCH³). ESI-EM (positivo): m/z calculado para C18H14O6+H+: 327,086300 [M+H]+ (masa monoisotópica); encontrado: 327,086206.

Intermedio 6: 3-(3',4'-dihidroxifenil)-5,7-dimetoxi-4W-chromen-4-one (6)

Una mezcla de 5 (4,3 mmoles, 1,4 g) y Pb(OAc)⁴ (17 mmol, 7,5 g, recién recristalizado de AcOH) en C6H6 seco (100 ml) se agitó a 80°C bajo argón durante la noche. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se filtró a través de una capa de Celite, se lavó con CH²Cl² y se concentró a presión reducida. El crudo se diluyó con THF/H²O = 5 : 1 (50 ml) y CH³COOH (50 ml) y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 6 h. (Ye, Koshino et al. 2009). Posteriormente, una solución acuosa saturada de NaHCO3 se añadió hasta pH 8 y se extrajo con EtOAc. A las capas orgánicas combinadas se añadió una solución de NaOH 0,1 M. La capa de agua se trató con CH³COOH y después se extrajo con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron a presión reducida para obtener 3-(3',4'-dihidroxifenil)-5,7-dimetoxi-4H-cromen-4-ona 6 (570 mg, 42% de rendimiento).

3-(3',4'-dihidroxifenil)-5,7-dimetoxi-4H-cromen-4-ona (6)

Sólido amarillo, (570 mg) 42 % de rendimiento. Mp: 127-129°C. 1H NMR (400 MHz, MeOD): 5 (ppm) 7,86 (s, 1H, H-2), 6,88 (s ancho, 1H, H-2'), 6,70 (s ancho, 2H, H-5' y H-6'), 6,50 (d, J = 2,0 Hz, 1H, H-6), 6,40 (d, J = 2,0 Hz, 1H, H-8), 3,80 (s, 3H, OCH³), 3,79 (s, 3H, OCH³); 13C NMR (400 MHz, MeOD): 5 (ppm) 175,00 (s, C=O), 165,08 (s, C-7), 161,13 (s, C-5), 159,91 (s, C-9), 151,28 (d, C-2), 145,12 (s, C-3'), 145,0 (s, C-4'), 126,49 (s, C-3), 123,12 (s, C-1'), 120,50 (d, C-6'), 116,99 (d, C-2'), 110,00 (s, C-10), 114,48 (d, C-5'), 95,86 (d, C-6), 92,82 (d, C-8), 55,09 (q, 2 x OCH³). ESI-MS (positivo): m/z calculado para C¹⁷H¹⁴O⁶+H+: 315,086300 [M+H]+ (masa monoisotópica); encontrado: 315,086363.

Compuesto 1: Glabrescione B: 3-(3',4'-bis(3-metilbut-2-eniloxi)fenil)-5,7-dimetoxi-4H-cromen-4-ona (1)

A una solución de 6 (61,8 mmol, 570 mg) en acetona (100 ml) se añadió K²CO³ (5,4 mmol, 7,4 g) y, tras 10 minutos de agitación a temperatura ambiente, se añadió bromuro de 3,3-dimetilalilo (6,5 mmol, 968 mg). Después, la mezcla se agitó a 80°C durante la noche. Posteriormente, se evaporó el disolvente. El sólido resultante se disolvió en EtOAc y se extrajo con agua. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2SO4 y finalmente se concentraron a presión reducida. El crudo se purificó por cromatografía en columna usando hexano-EtOAc como eluyente para obtener el compuesto 1 como polvo blanco. El polvo se recristalizó de hexano dando como resultado cristales blancos.

3-(3,,4,-bis(3-metilbut-2-eniloxi)fenil)-5,7-dimetoxi-4H-cromen-4-ona (1)

Sólido blanco, (696 mg) 86% de rendimiento. Mp 102-104°C. 1H NMR (400 MHz, Acetona-06): 5 (ppm) 7,94 (s, 1H, H-2), 7,16 (d, 1H, J = 1,6 Hz, H-2'), 6,99 (dd, 1H, J = 8,0 Hz y 1,6 Hz, H-6'), 6,89 (d, 1H, J = 8,0 Hz H-5'), 6,50 (d, 1H, J = 2,0 Hz, H-8), 6,42 (d, 1H, J = 2,0 Hz, H-6), 5,43 (m, 2H, 2 x =CH), 4,51 (d, J = 6,8 Hz, 4H, 2 x OCH²), 3,86 (s, 3H, OCH³), 3,81 (s, 3H, OCH³), 1,70 (s, 6H, 2 x CH³), 1,67 (s, 6H, 2 x CH³); 13C NMR (400 MHz, CDCh): 5 (ppm) 175,59 (s, C=O), 164,02 (s, C-7), 161,23 (s, C-5), 159,67 (s, C-9), 150,20 (d, C-2), 148,89 (s, C-3'), 148,51 (s, C-4'), 136,85 (s, 2 x C=), 126,50 (s, C-3), 125,00 (s, C-1'), 121,44 (d, C-6'), 120,65 (d, 2 x =CH), 115,50 (d, C-2'), 110,00 (s, C-10), 114,00 (d, C-5'), 96,47 (d, C-6), 92,60 (d, C-8), 65,95 (t, 2 x OCH²), 56,44 (q, OCH³), 55,93 (q, OCH³), 25,62 (q, 2 x CH³), 18,13 (q, 2 x CH³). ESI-EM (positivo): m/z calculado para C²⁷H³⁰O⁶+H+: 451,211500 [M+H]+ (masa monoisotópica); encontrado: 451,211495.

Los datos de 1H-NMR de este producto fueron idénticos a los de una muestra auténtica de Glabrescione B.

Ejemplo n. 8: Síntesis química de los compuestos NT8, NT9, NT10 y NT11

Una mezcla de 3,5-dimetoxifenol (1,3 mmol, 463 mg) (SIGMA-ALDRICH 132632), ácido 3,4-dihidroxifenilacético (2,3 mmol, 504,5 mg) (SIGMA-ALDRlCH 850217) y BF3^Et2O (15,3 mmol, 1,94 ml) se agitó a 90°C durante 90 min bajo argón. La mezcla de reacción se vertió en una solución acuosa de NaOAc al 10 % (100 ml) y se dejó reposar durante 4 h. La solución se extrajo con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con solución saturada de NaHCO3, se secaron sobre Na2SO4 y finalmente se concentraron a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna utilizando una mezcla de hexano-EtOAc como eluyente para obtener 1-(2-hidroxi-4,4-dimetoxi-fenil)-2-(3-hidroxi-4-metoxi-fenil)-etanona 7.

Una mezcla de 7 (3 mmol) y BF3Et2O se enfrió (9 mmol, 1,2 ml) a 10°C y se añadió gota a gota DMF (4,6 ml). En otro matraz, se enfrió DMF (8mL) a 10°C y se añadió PCl5 (4,5 mmol). A continuación, la mezcla se dejó reposar a 55°C durante 20 min. La solución de color amarillo claro que contenía cloruro de N,N'-dimetil(clorometilen)amonio se añadió después a la mezcla de reacción anterior a 20-25°C. La mezcla se agitó a r.t. durante 2 h, después se vertió en HCl metanólico (0,1 N) y se dejó reposar a 70° durante 2 h. Después de eliminar el disolvente, la solución se extrajo con EtOAc (3 x 100 ml) y la capa orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4 y finalmente se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna usando hexano-EtOAc como eluyente para dar 3-(3'-hidroxi-4'-metoxi-fenil)-5,7-dimetoxi-cromen-4-ona 8.

A una solución de 8 (0,18 mmol, 60 mg) en acetona (5 ml) a 45°C se añadió K²CO³ sólido (8 equiv.). Se añadió gota a gota R⁵Br (1,5 eq) a la mezcla y se agitó a 45°C durante 3 h. El progreso de la reacción se controló mediante cromatografía en capa fina (gel de SIO² , disolvente de desarrollo V hexano : V EtOAc = 3:7). Cuando solo había una mancha en la TLC, la reacción se detuvo, se extrajo con EtOAc, la capa orgánica combinada se secó sobre Na²SO⁴ y se evaporó a presión reducida.

3-[3'-(3-metil-but-2-eniloxi)-4'-metoxifenil]-5,7-dimetoxi-4H-cromen-4-ona (NT8)

Aceite amarillo, 47% de rendimiento. 1H NMR(400 MHz, CDCb): 5 (ppm) 7,76 (s, 1H, H-2), 7,22 (d, 1H, J = 1,6 Hz, H-2'), 7,01 (dd, 1H, J = 8 Hz y J = 1,6 Hz, H-6'), 6,88 (d, 1H, J = 8,4 Hz, H-5'), 6,44 (d, 1H, J = 2 Hz, H-8), 6,37 (d, 1H, J = 2 Hz, H-6), 5,55 (t, 1H, J = 6,4 Hz, =CH), 4,59 (d, 2H, J = 6,8 Hz, CH²), 3,94 (s, 3H, OCH³), 3,88 (s, 6H, ² XOCH³), 1,76 (s, 3H, CH³), 1,71 (s, 3H, CH³).

3-(3'-Benciloxi-4'-metoxifenil)-5,7-dimetoxi-4H-cromen-4-ona (NT9)

Polvo blanco, 44% de rendimiento. Mp: 126°C. 1H NMR (400 MHz, CDCb): 5 (ppm) 7,71 (s, 1H, H-2), 7,46 (dd, 2H, J = 7,6 y J = 1,6 Hz, ArH), 7,36 (t, 2H, J = 7,6 Hz, ArH) 7,31 (dd, 1H, J = 7,2 y J = 2 Hz, ArH), 7,29 (d, 1H, J = 2 Hz, H-2') 7,07 (dd, 1H, J = 8,4 y J = 2 Hz, H-6'), 6,92 (d, 1H, J = 8,4 Hz, H-5'), 6,44 (d, 1H, J = 2 Hz, H-8), 6,37 (d, 1H, J = 2 Hz, H-6), 5,17 (s, 2H, OCH²), 3,95 (s, 3H, OCH³), 3,90 (s, 3H, OCH³), 3,89 (s, 3H, OCH³).

3-[3-(3,7-Dimetil-octa-2,6-dieniloxi)-4-metoxi-fenil]-5,7-dimetoxi-cromen-4-ona (NT10)

Polvo blanco, rendimiento del 44% 1H NMR (400 MHz, CDCb): 5 (ppm) 7,76 (s, 1H, H-2), 7,22 (d, 1H, J = 1,6 Hz, H-2'), 7,01 (dd, 1H, J = 8 Hz y J = 1,6 Hz, H-6'), 6,88 (d, 1H, J = 8, Hz, H-5'), 6,44 (d, 1H, J = 2 Hz, H-8), 6,37 (d, 1H, J =2 Hz, H-6), 5,55 (t, 1H, J = 6,4 Hz, =CH), 5,39 (t, 1H, J = 7 Hz, =CH), 4,59 (d, 2H, J = 6,4 Hz, OCH²), 3,94 (s, 3H, OCH³), 3,88 (s, 6H, 2xOCH3), 2,14 (t, 2H, J = 6,9 Hz CH²), 2,00 (q, 2H, J = 7 Hz, CH²-CH²-CH=), 1,76 (s, 3H, CH³), 1,71 (s, 6H, 2xCH3).

5,7-Dimetoxi-3-[4-metoxi-3-(4-trifluorometil-benciloxi)-fenil]-cromen-4-ona (NT11)

Polvo blanco, 78% de rendimiento. Mp: 128,6-129,1°C. 1H NMR (400 MHz, acetona-d6): 5 (ppm) 8,01 (s, 1H, H-2), 7,78 (m, 4H, ArH), 7,36 (d, 1H, J = 2,1 Hz, H-2'), 7,15 (dd, 1H, J = 8,3 Hz y J = 2,1 Hz, H-6'), 7,02 (d, 1H, J = 8,4, H-5'), 6,57 (d, 1H, J = 2,3 Hz, H-8), 6,49 (d, 1H, J = 2,3 Hz, H-6), 5,27 (s, 2H, OCH²), 3,93 (s, 3H, OCH³), 3,89 (s, 3H, OCH³), 3,88 (s, 3H, OCH³).

Ejemplo n. 9: Síntesis química de los compuestos NT12, NT13, NT14 y NT15

Una mezcla de 3,5-dimetoxifenol (1,3 mmol, 463 mg), ácido 3,4-dihidroxifenilacético (2, 3 mmol, 504,5 mg) y BF3^Et2Ü (15,3 mmol, 1,94 ml) se agitó a 90°C durante 90 min bajo argón. La mezcla de reacción se vertió en una solución acuosa de NaOAc al 10 % (100 ml) y se dejó reposar durante 4 horas. La solución se extrajo con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con solución saturada de NaHCܳ , se secaron sobre Na2SÜ4 y finalmente se concentraron a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna usando una mezcla de hexano-EtOAc como eluyente para obtener 9.

Una mezcla de 9 (3 mmol) y BF³ Et²Ü (9 mmol, 1,2 ml) se enfrió a 10°C y se añadió gota a gota DMF (4,6 ml). En otro matraz, se enfrió DMF (8mL) a 10°C y se añadió PCl5 (4,5 mmol). A continuación, la mezcla se dejó reposar a 55°C durante 20 min. La solución de color amarillo claro que contenía cloruro de N,N'-dimetil(clorometilen)amonio se añadió después a la mezcla de reacción anterior a 20-25°C. La mezcla se agitó a r.t. durante 2 h, después se vertió en HCl metanólico (0,1 N) y se dejó reposar a 70° durante 2 h. Después de eliminar el disolvente, la solución se extrajo con EtOAc (3 x 100 ml) y la capa orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SÜ4 y finalmente se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna usando hexano-EtOAc como eluyente para dar 10.

A una solución de 10 (0,18 mmol, 60 mg) en acetona (5 ml) a 45°C se añadió K²CO³ sólido (8 equiv.). Se añadió gota a gota RsBr (1,5 eq) a la mezcla y se agitó a 45°C durante 3 h. El progreso de la reacción se controló mediante cromatografía en capa fina (gel de SIO² , disolvente de desarrollo V hexano:V EtOAc = 3:7). Cuando solo había una mancha en la TLC, la reacción se detuvo, se extrajo con EtOAc, la capa orgánica combinada se secó sobre Na2SÜ4 y se evaporó a presión reducida.

5,7-dimetoxi-3-[3'-metoxi-4'-(3-metil-but-2-eniloxi)-fenil]-cromen-4-ona (NT12)

Polvo amarillo, rendimiento del 45%. Mp: 130,7-131,8°C. 1H NMR (400 MHz, CDCls): 5 (ppm) 7,78 (s, 1H, H-2), 7,23 (d, 1H, J = 2,0 Hz, H-2'), 6,96 (dd, 1H, J = 8,0 y J = 2,0 Hz, H-6'), 6,88 (d, 1H, J = 8,0 Hz, H-5'), 6,44 (d, 1H, J = 2,4 Hz, H-8), 6,37 (d, 1H, J = 2,4 Hz, H-6), 5,53 (m, 1H, =CH), 4,60 (d, 2H, J = 6,8 Hz, OCH²), 3,94 (s, 3H, OCH³), 3,89 (s, 6H, ² XÜCH³), 1,77 (s, 3H, CH³), 1,73 (s, 3H, CH³).

3-(4-Benciloxi-3-metoxi-fenil)-5,7-dimetoxi-cromen-4-ona (6b) (NT13)

Polvo blanco, rendimiento del 56 %. Mp: 142,8-143,7°C. 1H NMR(400 MHz, CDCla): 5 (ppm) 7,77 (s, 1H, H-2), 7,45 (dd, 2H, J = 8,0 Hz y J = 2,0 Hz, ArH), 7,37 (t, 2H, J = 8,0 Hz, ArH), 7,31 (dd, 1H, J = 8 Hz y J = 1,6 Hz, ArH), 7,30 (d, 1H, J = 2,0 Hz, H-2'), 6,89 (m, 2H, H-6' y H-5'), 6,45 (d, 1H, J = 2 Hz, H-8), 6,38 (d, 1H, J=2 Hz, H-6), 5,19 (s, 1H, OCH²), 3,94 (s, 3H, OCH³), 3,93 (s, 3H, OCH³), 3,90 (s, 3H, OCH³)

3-[4'-(3,7-Dimetil-octa-2,6-dieniloxi)-3'-metoxi-fenil]-5,7-dimetoxi-cromen-4-ona (NT14)

Polvo blanco, rendimiento del 44% 1H NMR (400 MHz, CDCla): 5 (ppm) 7,76 (s, 1H, H-2), 7,22 (d, 1H, J = 1,6 Hz, H-2'), 7,01 (dd, 1H, J = 8 Hz y J = 1,6 Hz, H-6'), 6,88 (d, 1H, J = 8 Hz, H-5'), 6,44 (d, 1H, J = 2 Hz, H-8), 6,37 (d, 1H, J = 2 Hz, H-6), 5,42 (t, 1H, J = 6,4 Hz, =CH), 5,12 (t, 1H, J = 7 Hz, =CH), 4,41 (d, 2H, J = 6,4 Hz, OCH²), 3,94 (s, 3H, OCH³), 3,90 (s, 3H, OCH³), 3,88 (s, 3H, OCH³), 2,14 (t, 2H, J = 6,9 Hz CH²), 2,00 (q, 2H, J = 7 Hz, CH²-CH²-CH=), 1,76 (s, 3H, CH³), 1,71 (s, 6H, 2xCH3).

5,7-Dimetoxi-3-[3-metoxi-4-(4-trifluorometil-benciloxi)-fenil]-cromen-4-ona (NT15)

Polvo blanco, rendimiento del 25%. Mp: 128,4-130,2°C. 1H NMR (400 MHz, acetona-d6): 5 (ppm) 8,04 (s, 1H, H-2), 7,76 (m, 4H, ArH ), 7,29 (d, 1H, J = 2,1 Hz, H-2'), 7,06 (m, 2H, H-5' y H-6'), 6,58 (d, 1H, J = 2 Hz, H-8), 6,50 (d, 1H, J = 2 Hz, H-6), 5,28 (s, 2H, OCH²), 3,94 (s, 3H, OCH³), 3,89 (s, 6H, ² XOCH³).

Ejemplo n.10: Preparación de la biblioteca virtual.

La biblioteca única interna estaba compuesta por 816 productos naturales diferentes. Las entradas moleculares individuales se generaron en formato SMILES y después se transformaron en formato 3D SDF. Se utilizó la aplicación LigPrep de la suite Schrodinger Maestro (https://www.schrodinger.com) para ionizar compuestos a pH = 7,5 ± 1, para generar tautómeros y para minimizar la energía con el campo de fuerza OPLS2005 (Jorgensen, Maxwell et al. 1996). Los estados de ionización y tautomerización dotados de una probabilidad normalizada superior a 0,6 se conservaron en la biblioteca. Después de esta etapa, la biblioteca quedó compuesta por 1111 entradas individuales. La aplicación QikProp de la suite Maestro se utilizó para predecir las características químicas y químico-físicas de todos los compuestos. El análisis conformacional se realizó mediante el protocolo "Build 3D Database" de Discovery Studio 2.5 utilizando el método de conformación CAESAR con opciones por defecto y manteniendo de hasta 600 confórmeros para cada ligando.

Ejemplo n.11: Generación de modelos de farmacóforos.

Se usó un conjunto de formación de 9 potentes antagonistas de SMO para generar modelos de farmacóforos según un procedimiento basado en ligandos. Se utilizó el protocolo "Common Feature Pharmacophore Generation" implementado en Discovery Studio 2.5 de Accelrys. Se generaron hasta 20 farmacóforos, compuestos por un máximo de 10 características. La distancia mínima entre funciones se estableció en 2,0 Á, mientras que el número de derivaciones que pueden perderse se mantuvo en el valor predeterminado (1). El análisis conformacional del conjunto de formación se llevó a cabo con el método CAESAR. El número máximo de características omitidas durante la alineación del conjunto de formación con los farmacóforos se estableció en 1. Este procedimiento generó veinte farmacóforos (valor máximo permitido, según la configuración personalizada). Los seis farmacóforos de mayor rango se dividen en dos grupos, basándose en la composición de las características farmacofóricas. Los farmacóforos de Tipo 1 tienen tres características aceptoras de enlaces de hidrógeno (HBA) y tres hidrófobas (HYD). Los farmacóforos ^{de Tipo 2 tienen tres características HBA, dos HYD y un donante de enlace de hidrógeno} (^hB^d) ^{(Figura 1). Las} coordenadas de los farmacóforos y las distancias entre características se proporcionan en las Tablas 1 y 2 para el modelo de farmacóforo de Tipo 1 representativo (3 HYD; 3 HBA) y en las Tablas 3 y 4 para el farmacóforo de Tipo 2 ^{representativo (2 HYD; 1} H^bD; ^{3 HBA).}

Tabla 1. Coordenadas del farmacóforo representativo de Tipo 1. HYD: característica hidrofóbica; HBA: característica de aceptador de enlace de H. Las coordenadas están en A

Tabla 2. Matriz de distancias del farmacóforo representativo de Tipo 1. Para las características HBA, las distancias se han calculado con referencia a la cola. Las distancias se expresan en A.

Tabla 3. Coordenadas del farmacóforo representativo de Tipo 2. HYD: característica hidrofóbica; HBA: característica de aceptador de enlaces de H; HBD: característica de donante de enlace de hidrógeno. Las coordenadas están en A.

Tabla 4. Matriz de distancia del farmacóforo representativo de Tipo2. Para las características HBA y HBD, las distancias se han calculado con referencia a la cola. Las distancias se expresan en A.

Ejemplo n.12: Cribado farmacofórico.

La biblioteca interna única de productos naturales, generada como se describe en el ejemplo n.10, se examinó a través de los seis farmacóforos. En primer lugar, se utilizó el protocolo "Search 3D Database" implementado en Discovery Studio 2.5 para seleccionar moléculas capaces de mapear los farmacóforos. Se utilizó el método de búsqueda "Best", que realiza un ajuste flexible de las conformaciones del ligando frente al farmacóforo. Posteriormente se usó el protocolo "Ligand Pharmacophore Mapping" para ajustar las conformaciones seleccionadas a los farmacóforos y calcular el FitValue. No se permitieron características omitidas durante el ajuste del ligando a los farmacóforos. Se utilizó el método de ajuste flexible, que permite una ligera modificación de la conformación de cada ligando para adaptarse mejor al farmacóforo.

Mediante el cribado de farmacóforos, se seleccionaron tres grupos de moléculas de la biblioteca inicial: 1) ligandos que mapean todos los farmacóforos; 2) ligandos que mapean solo farmacóforos de Tipo 1 y 3) ligandos que mapean solo farmacóforos de Tipo 2. Con el objetivo de priorizar los compuestos moleculares pequeños, se calculó adicionalmente la eficiencia del ligando (LE) para cada compuesto como la relación entre su FitValue y el número de átomos pesados (LE = FitValue/n° átomos pesados). Se seleccionaron 16 compuestos naturales dotados de la mayor LE para estudios in vitro (véase anteriormente).

Ejemplo n.13: cribado virtual basado en estructuras.

Las coordenadas iniciales del complejo Gli1-ZF/DNA se recuperaron del Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do) con el código de acceso a PDB 2GLI. Las coordenadas de las moléculas de agua cristalina se eliminaron manualmente del complejo, mientras que los iones de cobalto se reemplazaron manualmente con iones de zinc dentro del sistema de coordinación de cada dedo de zinc. Se utilizó el programa Amber 11 (Case, Cheatham et al. 2011) para generar trayectorias de MD y realizar cálculos de energía. El software AmberTools1.5 se utilizó para preparar coordenadas de entrada y archivos de topología, y para realizar análisis preliminares en trayectorias de MD por los módulos ptraj y cpptraj. Los campos de fuerza ff99bsc0 y General Amber (GAFF) se utilizaron para parametrizar proteínas y ligandos, respectivamente. Los iones de zinc se trataron siguiendo un enfoque de unión; los parámetros para el ion de zinc y los residuos de coordinación de zinc se adaptaron de un cálculo previo de QM (Mori, Dietrich et al. 2010). El complejo Gli1-ZF/DNA se solvató en una caja rectilínea de moléculas de agua explícitas, amortiguando 8 A del sistema macromolecular. Se utilizó el modelo de agua TIP3P. La carga total del sistema se neutralizó mediante la adición de contraiones de sodio (Na+). El sistema macromolecular solvatado primero se minimizó en energía de la siguiente manera: el disolvente de agua y los contraiones primero se minimizaron durante 250 etapas usando un algoritmo de descenso más pronunciado (SD) y durante 750 etapas usando un algoritmo de gradiente conjugado (CG), mientras se mantiene las coordenadas Gli1-ZF/DNA como congeladas; después, se minimizó la energía del sistema solvatado durante 1000 estapas SD y otras 4000 etapas CG sin restricciones posicionales. Antes de la producción final de trayectorias, el sistema de energía minimizada se calentó gradualmente de 0 a 300 K durante 50 ps utilizando el control de temperatura de Langevin a presión constante y restringiendo el esqueleto de Gli1-ZF y el esqueleto del fosfato de DNA con una constante de fuerza armónica de 5,0 kca lm oM A'2. Después, la densidad del sistema se equilibró para 50 ps, aplicando la misma máscara de restricciones utilizada en la etapa de calentamiento. Se produjeron trayectorias de MD restringidas por 3 ns mientras que la constante de fuerza aplicada a Gli 1 -ZF y el esqueleto del DNA disminuía gradualmente de 5 a 2 a 1 kcal mol-1A-2 cada 1 ns. Después de esta etapa, se generaron trayectorias de MD sin restricciones por 20 ns utilizando SANDER. Durante todas las simulaciones de MD, se utilizó una etapa de tiempo de 0,001 ps. Se extrajo una estructura de Gli1-ZF representativa de trayectorias de MD y se usó como receptor rígido para simulaciones de acoplamiento. El programa de acoplamiento GOLD (versión 5.0.1) se utilizó para acoplar la biblioteca interna hacia el sitio de unión centrado en la cadena lateral de Thr374 y que tiene un radio de 18 A. Se utilizó la función GoldScore con la eficacia del algoritmo genético (GA) establecida en 150 % y generando 50 corridas para los ligandos, mientras que otros parámetros se mantuvieron en sus valores predeterminados. Las poses de acoplamiento se volvieron a puntuar mediante el método MM-GBSA implementado en Amber11.

Ejemplo núm.14

Se llevaron a cabo experimentos de NMR para probar la interacción directa de Glabrescione B con Gli1-ZF y para respaldar los datos computacionales y biológicos.

Una muestra de Glabrescione B 0,412 mM en DMSO-cfó se preparó y se añadió a 20 pL de una solución de proteína de fusión Gli1-GST (Glutatión S-transferasa) a 5 pg/pL, proporcionando una relación molar de Glabrescione B/Gli1-GST de 150:1. Las velocidades de relajación de los protones de Glabrescione B se monitorearon mediante NMR (600 MHz), los resultados se muestran en la Tabla 5. En condiciones experimentales, los protones de Glabrescione B que experimentaron la perturbación más significativa de la velocidad de relajación, debido a la presencia de Gli1-GST, pertenecen al anillo A del núcleo de isoflavonas, a saber, los protones aromáticos H¹, H³ y los pertenecientes a los grupos metoxilo 2' y 4'. Además, los protones H¹¹ y H¹⁵ pertenecientes al anillo C mostraron una perturbación significativa de la velocidad de relajación en presencia de Gli1, mientras que H8 mostró sólo una pequeña variación.

Vale la pena señalar que los mismos experimentos se realizaron también en presencia de GST solo para monitorear la influencia de GST en la proteína de fusión Gli1-GST en la unión de Glabrescione B. Los resultados mostraron que la perturbación normalizada de la velocidad de relajación es significativamente menor que lo observado en presencia de Gli1-GST (Tabla 5) y sugirió que Glabrescione B interactúa más fuertemente con Gli 1 que con GST.

Tabla 5- velocidad de relajación normalizada (AR/R.) de los protones

de Glabrescione B (0,412mlVI) en presencia de Glil-GST y GST solo.

GlaB GlaB:Gli1-GST GlaB:GST

1:150 1:150

protón Rfms (s-1) AR/Rf AR/Rf

1 0,41 0,341 0,024

2' 1,20 0,267 0,058

3 0,63 0,206 0,100

4' 1,39 0,482 0

8 0,36 0,028 0

11 0,63 0,286 n.d.

12 0,89 0 0,034

15 0,76 0,329 0,138

19 0,85 0 0

Además, los protones de Glabrescione B implicados en la unión a GST son significativamente diferentes de los implicados en la unión a Gli1.

Finalmente, dado que Gli1 es una proteína de unión a zinc, se monitorizó mediante NMR la interacción directa entre Glabrescione B y Zn2+, mostrando que la molécula no es capaz de unirse a los iones metálicos.

Ejemplo n.15

Dado que Glabrescione B fue el inhibidor de Hh más potente identificado por el cribado, se sintetizaron y probaron varios análogos de Glabrescione B (a saber, NT8, NT9, NT10, NT 11, NT12, NT13, NT14 y NT15) in vitro para mejorar la potencia inhibidora frente a la vía de Hh y para proporcionar Relaciones Estructura-Actividad (SAR) para la serie congenérica (véanse los ejemplos 8 y 9). Se realizó una evaluación preliminar de la actividad inhibidora de Hh de estas moléculas a 5 pM in vitro en células Shh Light II (véase ejemplo 2). Los resultados preliminares mostraron que algunas de estas moléculas eran al menos tan activas como Glabrescione B, siendo NT8 y NT9 más potentes que Glabrescione B (véase Figura 19).

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Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto que tiene la fórmula general I:

en donde

R¹ es ORa y Ra es metilo;

R² es ORb y Rb es una cadena alifática ramificada o lineal, saturada o insaturada que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;

R³ es OR^c y R^c es metilo, etilo, propilo, isopropilo, prenilo, geranilo, farnesilo o bencilo, en donde el fenilo del grupo bencilo puede estar sustituido por halógeno, haloalquilo C¹-C⁶ , haloalcoxi C¹-C⁶ , alcoxi C¹-C⁶ , alquiltio C¹-C⁶ , amino, alquilamino C¹-C⁶ , dialquilamino C¹-C⁶ ;

R⁴ es OR^d y R^d es metilo, etilo, propilo, isopropilo, prenilo, geranilo, farnesilo o bencilo, en donde el fenilo del grupo bencilo puede estar sustituido por halógeno, haloalquilo C¹-C⁶ , haloalcoxi C¹-C⁶ , alcoxi C¹-C⁶ , alquiltio C¹-C⁶ , amino, alquilamino C¹-C⁶ , dialquilamino C¹-C⁶ ;

en donde dicho compuesto es un inhibidor de la vía de Hedgehog (Hh);

o estereoisómeros del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto que tiene la fórmula general I o de dichos estereoisómeros para su uso en el tratamiento de un tumor dependiente de Hedgehog (Hh) seleccionado del grupo que consiste en: meduloblastoma (MB), adenocarcinoma esofágico, carcinomas de células basales (BCCs), cáncer de páncreas, próstata y de pulmón de células pequeñas.

2. Un compuesto que tiene la fórmula general I:

en donde

R¹ es ORa y Ra es una cadena alifática ramificada o lineal, saturada o insaturada que tiene de 1 a 10 átomos de carbono;

R² es OR^b y R^b es metilo;

R³ es OR^c y R^c es metilo, etilo, propilo, isopropilo, prenilo, geranilo, farnesilo o bencilo, en donde el fenilo del grupo bencilo puede estar sustituido por halógeno, haloalquilo C¹-C⁶ , haloalcoxi C¹-C⁶ , alcoxi C¹-C⁶ , alquiltio C¹-C⁶ , amino, alquilamino C¹-C⁶ , dialquilamino C¹-C⁶ ;

R⁴ es OR^d y R^d es metilo, etilo, propilo, isopropilo, prenilo, geranilo, farnesilo o bencilo, en donde el fenilo del grupo bencilo puede estar sustituido por halógeno, haloalquilo C¹-C⁶ , haloalcoxi C¹-C⁶ , alcoxi C¹-C⁶ , alquiltio C¹-C⁶ , amino, alquilamino C¹-C⁶ , dialquilamino C¹-C⁶ ;

en donde dicho compuesto es un inhibidor de la vía de Hedgehog (Hh);

o estereoisómeros del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable de dicho compuesto que tiene la fórmula general I o de dichos estereoisómeros para su uso en el tratamiento de un tumor dependiente de Hedgehog (Hh) seleccionado del grupo que consiste en: meduloblastoma (MB), adenocarcinoma esofágico, carcinomas de células basales (BCCs), cáncer de páncreas, próstata y de pulmón de células pequeñas.

3. El compuesto para su uso según la reivindicación 1, en donde Rb es CH³.

4. El compuesto para su uso según la reivindicación 1 que es

5. El compuesto para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho compuesto es un ligando del receptor de serpentina Smoothened (SMO)/Hh y/o de Gli1.

6. El compuesto para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el tumor dependiente de Hh es resistente a un inhibidor de SMO.

7. El compuesto para su uso según la reivindicación 6, en donde el tumor dependiente de Hh es resistente a vismodegib o NVP-LDE225.

8. El compuesto para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el tumor está presente en un sujeto pediátrico.

9. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de un tumor dependiente de Hedgehog (Hh), seleccionado del grupo que consiste en: meduloblastoma (MB), adenocarcinoma esofágico, carcinomas de células basales (BCCs), cáncer de páncreas, próstata y pulmón de células pequeñas, en donde la composición farmacéutica comprende el compuesto de fórmula general I como se define en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un vehículo y/o excipientes y/o diluyentes adecuados.

10. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 9, en la que el vehículo es un liposoma.

11. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 9 o 10, en la que dicha composición farmacéutica se administra mediante inyección intratumoral.

12. La composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 9-11 que comprende además al menos un agente terapéutico.

13. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 12, en la que el al menos un agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en fármacos anticancerosos.

14. La composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 12 o 13, en donde el al menos un agente terapéutico se selecciona dentro del grupo que consiste en los siguientes fármacos: Temozolomida, Bevacizumab, Gemcitabina, acetato de leuprolida, acetato de goserelina, Etopósido y Cisplatino.