ES2942533T3

ES2942533T3 - Plataforma de purificación para anticuerpos biespecíficos

Info

Publication number: ES2942533T3
Application number: ES21170436T
Authority: ES
Inventors: Andrew Tustian; Christine Endicott; Benjamin Adams; John Mattila; Hanne Bak
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2014-07-26
Filing date: 2015-07-24
Publication date: 2023-06-02
Anticipated expiration: 2035-07-24
Also published as: WO2016018740A2; TWI704155B; EP3912987B1; EA036154B1; AR101262A1; EA201790247A1; US20160024147A1; CN107074906A; MY187051A; AU2015298156B2; BR112017001443A2; TW201617359A; PL3172221T3; AU2015298156A1; SG10201900661YA; MX2017001217A; EP3912987B9; EP3172221A2; DK3172221T3; EP3912987A1

Abstract

La cromatografía de proteína A de alta resolución que emplea un agente caotrópico y un tampón de elución de gradiente de pH o paso de pH da como resultado una resolución máxima mejorada entre especies moleculares estrechamente relacionadas. Los anticuerpos biespecíficos que contienen un dominio CH3 de sustitución que elimina la unión a la proteína A emparejado con un dominio CH3 de unión a la proteína A se separan con alta resolución máxima de los anticuerpos monoespecíficos que contienen un dominio CH3 sustituido que elimina la unión a la proteína A emparejado con el dominio CH3 de unión a la proteína A. ablación del dominio CH3 sustituido y anticuerpos monoespecíficos que contienen un dominio CH3 de unión a proteína A emparejado con el dominio CH3 de unión a proteína A. Los agentes caotrópicos útiles incluyen cloruro de magnesio y cloruro de calcio. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Plataforma de purificación para anticuerpos biespecíficos

Campo

Se proporciona un método para purificar una proteína multimérica específica de una mezcla compleja de proteínas a través de cromatografía de afinidad. Específicamente, se proporciona un método para aislar un heterodímero (un anticuerpo biespecífico) de una mezcla compleja de monómeros y homodímeros a través de cromatografía de afinidad (incluyendo cromatografía de proteína A) usando un agente caótropo.

Antecedentes

Se han propuesto múltiples formatos de anticuerpos biespecíficos que se están desarrollando actualmente. Uno de dichos formatos se basa en un anticuerpo IgG totalmente humano convencional que tiene un perfil farmacocinético mejorado y una inmunogenicidad mínima (véase la Patente de los EE.UU. N.° 8.586.713). Una única cadena ligera común y dos cadenas pesadas distintas se combinan para formar el anticuerpo biespecífico. Una de las cadenas pesadas contiene una secuencia de Fc sustituida (en adelante "Fc*") que reduce o elimina la unión del Fc* a la Proteína A. Por ejemplo, una de dichas secuencias de Fc* contiene H435R/Y436F (según el sistema de numeración EU; H95R/Y96F según el sistema de numeración de exones IMGT) en el dominio CH3. Como resultado de la coexpresión de las dos cadenas pesadas y la cadena ligera común, se crean tres productos: dos de los cuales son homodiméricos para las cadenas pesadas y uno de los cuales es el producto biespecífico heterodimérico deseado. La secuencia de Fc* permite la purificación selectiva del producto biespecífico FcFc* en columnas de afinidad disponibles en el mercado, debido a la afinidad de unión intermedia para la Proteína A en comparación con el homodímero de cadena pesada FcFc de avidez alta o el homodímero Fc*Fc* de unión débil.

Para conseguir la purificación a escala comercial del heterodímero biespecífico, se requiere una buena resolución entre el homodímero FcFc, el heterodímero Fc*Fc y el homodímero Fc*Fc*. En este caso, los Solicitantes describen un proceso de separación mejorado que optimiza la resolución de estas tres formas moleculares.

Se hace mención a los siguientes documentos:

• WO 2010/151792 que se refiere a anticuerpos biespecíficos fácilmente aislados con formato de inmunoglobulina nativa;

• WO 2014/049003 que se refiere a la purificación de inmunoglobulinas heterodiméricas; y

• US 2002/062010 A1 que se refiere a un método para preparar anticuerpos multiespecíficos que tienen componentes heteromultiméricos y comunes.

Sumario

En uno o más aspectos y realizaciones de la misma, la invención se refiere a métodos de purificación de una proteína heterodimérica, que es un anticuerpo biespecífico, de una mezcla compleja de proteínas que incluye homodímeros y heterodímeros, empleando un proceso de captura y elución por afinidad.

En un primer aspecto, la invención se refiere a un método de purificación de un anticuerpo biespecífico que comprende:

a. cargar una matriz de afinidad con una mezcla de proteínas multiméricas que comprende (i) un primer homodímero que comprende dos copias de un primer polipéptido de cadena pesada y dos copias de un polipéptido de cadena ligera, (ii) un segundo homodímero que comprende dos copias de un segundo polipéptido de cadena pesada y dos copias del polipéptido de cadena ligera, y (iii) un anticuerpo biespecífico heterodimérico que comprende el primer polipéptido de cadena pesada y el segundo polipéptido de cadena pesada y dos copias del polipéptido de cadena ligera, en donde el primer polipéptido de cadena pesada tiene mayor afinidad por la matriz de afinidad que el segundo polipéptido de cadena pesada, en donde la matriz de afinidad comprende un ligando de Proteína A fijado a un sustrato que comprende una multiplicidad de partículas que tienen un diámetro medio de 45 pm y que comprende poros que tienen un diámetro medio de 1100 A; y

b. eluir y recoger el anticuerpo biespecífico heterodimérico de la matriz de afinidad en un tampón que comprende CaCl²o MgCl²y que tiene un primer intervalo de pH,

en donde el primer homodímero eluye de la matriz de afinidad en el tampón a un segundo intervalo de pH y el segundo homodímero eluye de la matriz de afinidad en el tampón a un tercer intervalo de pH, en donde el tercer intervalo de pH comprende un pH superior al del primer intervalo de pH, que comprende un pH superior al del segundo intervalo de pH.

En una realización, la matriz de afinidad se carga inicialmente con 5 a 50 gramos de proteína por litro de matriz de afinidad. En algunos casos, la mezcla de proteínas multiméricas es producida por una pluralidad de células eucariotas, tales como, por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO) en un cultivo celular.

[Eliminado]

La unión diferencial a una matriz de afinidad puede manipularse cambiando, entre otras cosas, el pH y/o la fuerza iónica de una solución que se hace pasar por la matriz de afinidad. La adición del agente caótropo a la solución potencia la elución de cada especie de dímero de la matriz de afinidad, aumentando de este modo la pureza de cada especie de dímero individual. El anticuerpo biespecífico heterodimérico se eluye de la matriz de afinidad en un tampón que comprende CaCb o MgCb y que tiene un primer intervalo de pH, y el primer homodímero se eluye de la matriz de afinidad en un tampón que tiene un segundo intervalo de pH. Se recoge el heterodímero. El segundo homodímero se eluye de la matriz de afinidad en un tampón de lavado que tiene un tercer intervalo de pH. El tercer intervalo de pH comprende un pH superior al del primer intervalo de pH, que comprende un pH superior al del segundo intervalo de pH.

La matriz de afinidad comprende un ligando de Proteína A fijado a un sustrato que comprende una multiplicidad de partículas que tienen un diámetro medio de 45 pm y que comprenden poros que tienen un diámetro medio de 1100 A. La Proteína A puede ser una Proteína A estafilocócica de origen natural o modificada, o puede ser una Proteína A modificada por ingeniería genética. La Proteína A modificada por ingeniería genética puede ser, por ejemplo, un tetrámero de dominios Z, un tetrámero de dominios Y o una Proteína A modificada por ingeniería genética que carece de los dominios D y E. Estos ejemplos de Proteína A modificada por ingeniería genética son incapaces de unirse (o se unen con una afinidad muy baja, si es que lo hacen) al dominio VH3 de una inmunoglobulina, pero todavía puede unirse a los dominios CH3 de IgG1, IgG2 e IgG4.

En algunos casos, el sustrato de la matriz de afinidad contiene o está hecho de agarosa, poli(estirenodivinilbenceno), polimetacrilato, vidrio de poro controlado, sílice esférica, celulosa y similares. Las partículas tienen un diámetro medio de 45 pm y contienen poros con un diámetro medio de 1100 A.

En algunas realizaciones, después de la carga inicial de la matriz de afinidad con la mezcla de proteínas, la matriz se lava con un tampón que tiene un pH superior a pH 5. En algunos casos, el tampón comprende fosfato de sodio 20 mM a pH 7,2. Cuando se incluye el segundo homodímero en la mezcla de proteínas, el segundo homodímero se lava de la matriz de afinidad en el tampón de lavado. Por lo tanto, en el presente documento el tampón de lavado es del tercer intervalo de pH.

En algunas realizaciones, se aplica un gradiente de pH tamponado a la matriz de afinidad cargada o, como alternativa, se aplican tampones de elución secuencial, que tienen cada uno un pH diferente, a la matriz de afinidad cargada. En una realización, el gradiente de pH se ejecuta de pH 6 a pH 3. El primer intervalo de pH, dentro del cual el heterodímero se eluye de la matriz de afinidad, es de aproximadamente pH 5,5 a aproximadamente pH 3,6. En algunos casos, el tampón de elución y/o el gradiente de pH tamponado contienen un tampón adecuado, tal como citrato, acetato, 4-Morfolinetanosulfonato (MES), citrato-fosfato, succinato y similares, que en una realización es acetato 40 mM, y un agente caótropo. El agente caótropo puede ser una sal, que tenga un catión seleccionado de litio, magnesio, calcio y guanidinio, y un anión seleccionado de cloruro, nitrato, bromuro, clorato, yoduro, perclorato y tiocianato. En una realización particular, el agente caótropo es CaCb, por ejemplo, CaCb 250 - 500 mM. En otra realización particular, el agente caótropo es MgCb, por ejemplo, MgCb 250 - 500 mM.

En una realización, el heterodímero es un anticuerpo biespecífico, donde el primer polipéptido comprende un dominio CH3 que es capaz de unirse a la Proteína A ("Fc") y el segundo polipéptido comprende un dominio CH3 que no es capaz de unirse a la Proteína A ("Fc*"). En algunos casos, el segundo polipéptido comprende un H435R/Y436F (según el sistema de numeración EU; H95R/Y96F según el sistema de numeración de exones IMGT) en su dominio CH3 (también conocido como "Fc*" o "sustitución en estrella"). Por lo tanto, en algunas realizaciones, el primer homodímero es un anticuerpo monoespecífico que tiene dos dominios CH3 no sustituidos (es decir, FcFc); el segundo homodímero es un anticuerpo monoespecífico que tiene dos dominios CH3 sustituidos con H435R/Y436F (es decir, Fc*Fc*); y el heterodímero es un anticuerpo biespecífico que tiene un dominio CH3 no sustituido y un dominio CH3 sustituido con H435R/Y436F (es decir, Fc*Fc).

En una realización, el heterodímero que se recoge de la matriz de afinidad se carga posteriormente en un medio de cromatografía con un pH más ácido y se eluye de ese medio en un tampón más alcalino que carece del agente caótropo (o tiene una cantidad inferior o una cantidad traza de caótropo). En un caso, el medio de cromatografía es una resina de cromatografía multimodal. El heterodímero puede purificarse adicionalmente.

También se desvela un método en el que el segundo homodímero se retira en primer lugar de la mezcla de proteínas aplicando la mezcla a una primera matriz de afinidad de manera que el primer homodímero y el heterodímero permanezcan unidos a la matriz mientras que el segundo homodímero fluye a través de ella y se desecha. El primer homodímero y el heterodímero se eluyen posteriormente de la primera matriz de afinidad y se aplican después a una segunda matriz de afinidad. En un ejemplo, la primera matriz de afinidad se carga inicialmente con 5 a 50 gramos de proteína por litro de matriz de afinidad. La mezcla de proteínas multiméricas es producida en algunos casos por una pluralidad de células eucariotas, tales como, por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO) en un cultivo celular.

En un ejemplo, la mezcla de proteínas multiméricas aplicada a la primera matriz de afinidad contiene (i) un primer homodímero que comprende dos copias de un primer polipéptido, (ii) un heterodímero que comprende el primer polipéptido y un segundo polipéptido y (iii) un segundo homodímero que comprende dos copias del segundo polipéptido. En este caso, los polipéptidos primero y segundo tienen afinidades diferentes por la primera matriz de afinidad y por la segunda matriz de afinidad, de manera que el primer homodímero, el heterodímero y el segundo homodímero pueden separarse basándose en la unión diferencial a la primera y/o segunda matriz de afinidad.

En un ejemplo, la primera matriz de afinidad comprende un ligando de Proteína A modificado por ingeniería genética, que carece de la capacidad de unirse al dominio VH3 de una inmunoglobulina, fijado a un sustrato. En algunos casos, la proteína A carece de un dominio D y de un dominio E, tal como las proteínas A modificadas por ingeniería genética que comprenden un tetrámero Z o un tetrámero Y.

La unión diferencial del primer homodímero y el heterodímero a la segunda matriz de afinidad puede manipularse cambiando, entre otras cosas, el pH y/o la fuerza iónica de una solución que se hace pasar por la matriz de afinidad. La adición de un agente caótropo a la solución potencia la elución de cada especie de dímero de la segunda matriz de afinidad en fracciones no superpuestas, aumentando de este modo la pureza de cada especie de dímero. En un ejemplo, el heterodímero se eluye de la segunda matriz de afinidad en un tampón que tiene un primer intervalo de pH, y el primer homodímero se eluye de la segunda matriz de afinidad en un tampón que tiene un segundo intervalo de pH. Se recoge el heterodímero. En este caso, el primer intervalo de pH comprende un pH superior al del segundo intervalo de pH.

En un ejemplo, la segunda matriz de afinidad comprende un ligando de Proteína A fijado a un sustrato. En algunos casos, el sustrato es una perla o partícula, de manera que la segunda matriz de afinidad es una pluralidad de partículas fijadas con ligando de Proteína A. La Proteína A puede ser una Proteína A estafilocócica de origen natural o modificada, o puede ser una Proteína A modificada por ingeniería genética. La proteína A modificada por ingeniería genética puede ser, por ejemplo, un tetrámero de dominios Z, un tetrámero de dominios Y u otra Proteína A modificada por ingeniería genética que carece de los dominios D y E. Estas moléculas de proteína A modificada por ingeniería genética son incapaces de unirse (o se unen con una afinidad muy baja, si es que lo hacen) al dominio VH3 de una inmunoglobulina, pero siguen siendo capaces de unirse a los dominios CH3 de IgG1, IgG2 e IgG4. En algunos casos, el sustrato contiene o está hecho de agarosa, poli(estireno-divinilbenceno), polimetacrilato, vidrio de poro controlado, sílice esférica, celulosa (por ejemplo, HYPERCEL) y similares. Las partículas tienen un diámetro medio de 45 pm y contienen poros con un diámetro medio de 1100 A.

En algunos casos, después de la carga inicial de la segunda matriz de afinidad con la mezcla que contiene el primer homodímero y el heterodímero, la matriz se lava con un tampón que tiene un pH superior a pH 5. En algunos casos, el tampón comprende fosfato de sodio 20 mM a pH 5 - 8,5, por ejemplo, pH 7,2. En algunos casos, se aplica un gradiente de pH tamponado a la matriz de afinidad cargada o, como alternativa, se aplican tampones de elución secuencial, que tienen cada uno un pH diferente, a la segunda matriz de afinidad cargada. En una realización, el gradiente de pH se ejecuta de pH 6 a pH 2,5. El primer intervalo de pH, dentro del cual el heterodímero se eluye de la matriz de afinidad, es de aproximadamente pH 5,5 a aproximadamente pH 3,6. En algunos casos, el tampón de elución y/o el gradiente de pH tamponado contienen acetato, que en una realización es acetato 40 mM, y un agente caótropo. El agente caótropo es CaCb o MgCb. En un caso particular, el agente caótropo es CaCb, por ejemplo, CaCl²500 mM. En otro caso particular, el agente caótropo es MgCb, por ejemplo, MgCb 500 mM.

En una realización, el heterodímero es un anticuerpo biespecífico, en donde el primer polipéptido comprende un dominio CH3 que es capaz de unirse a la Proteína A ("Fc") y el segundo polipéptido comprende un dominio CH3 que no es capaz de unirse a la Proteína A ("Fc*"). En algunos casos, el segundo polipéptido comprende una sustitución con H435R/Y436F (también denominada "estrella") en su dominio CH3 ("Fc*"). Por lo tanto, en algunas realizaciones, el primer homodímero es un anticuerpo monoespecífico que tiene dos dominios CH3 no sustituidos (es decir, FcFc); el segundo homodímero es un anticuerpo monoespecífico que tiene dos dominios CH3 sustituidos con H435R/Y436F (es decir, Fc*Fc*); y el heterodímero es un anticuerpo biespecífico que tiene un dominio CH3 no sustituido y un dominio CH3 sustituido con H435R/Y436F (es decir, Fc*Fc).

En un ejemplo, el heterodímero que se recoge de la segunda matriz de afinidad se carga posteriormente en un medio de cromatografía a un pH ácido y se eluye de ese medio en un tampón más alcalino y sin el agente caótropo (o niveles reducidos o cantidades traza de caótropo). En un caso, el medio de cromatografía es una resina de cromatografía multimodal. El heterodímero puede purificarse adicionalmente.

También se desvela un heterodímero purificado preparado de acuerdo con los métodos de los aspectos descritos anteriormente. En un ejemplo, el heterodímero es un anticuerpo biespecífico.

Descripción de los dibujos

La Figura 1 representa cromatogramas que ilustran el pH (línea punteada) y la absorbancia a 280 nm (línea continua) durante la etapa de elución para la purificación de bsAb E con una resina de Proteína A recombinante (MABSELECT XTRA™, panel A), y una resina a base de Proteína A modificada por ingeniería genética que carece de unión a VH (MABSELECT SURE™, panel B).

La Figura 2 representa las resoluciones de pico (Rs) obtenidas entre los picos de homodímero biespecífico (Fc*Fc) y no sustituidos con CH3 (FcFc) en función del tiempo de residencia durante una elución en gradiente de 30 volúmenes de columna ("VC") en acetato 40 mM, cloruro de calcio 500 mM con MABSELECT SURE™ (círculos abiertos) o POROS MABCAPTURE A™ (cuadrados cerrados) como fase estacionaria.

La Figura 3 representa cromatogramas que ilustran el pH (línea discontinua) y la absorbancia a 280 nm (línea continua) durante la etapa de elución para la purificación de bsAb A con citrato de sodio (panel A), cloruro de sodio (panel B), cloruro de magnesio (panel C) o cloruro de calcio (panel D) añadidos como modificadores a la fase móvil de elución. El fraccionamiento del pico del anticuerpo biespecífico está marcado con líneas discontinuas verticales.

La Figura 4 representa el esquema de flujo de procesos de purificación para anticuerpos biespecíficos (Fc*Fc) que contienen sustitución en estrella (Fc*, sustituido con CH3) que presentan (panel A) y no presentan (panel B) la unión a SpA del dominio VH.

Descripción detallada

La presente invención no se limita a métodos particulares y condiciones experimentales descritos, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También ha de comprenderse que la terminología utilizada en el presente documento únicamente tiene el fin de describir realizaciones particulares, y no se pretende que sea limitante, puesto que el alcance de la presente invención se define por las reivindicaciones.

A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que habitualmente comprende un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Aunque puede usarse en la puesta en práctica o los ensayos de la presente invención cualquier método y material similar o equivalente a los que se describen en el presente documento, a continuación se describen los métodos y materiales particulares.

El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, incluye moléculas de inmunoglobulina compuestas por cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco conservadas (FR). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestas del extremo amino al extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (las CDR de cadena pesada pueden abreviarse como HCDR1, HCDR2 y HCDR3; las CDR de cadena ligera pueden abreviarse como LCDR1, LCDR2 y LCDR3. La expresión anticuerpo "de alta afinidad" se refiere a aquellos anticuerpos que tienen una afinidad de unión a su diana de al menos 10-9 M, al menos 10-1 M; al menos 10-11 M; o al menos 10-12 M, medida por resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, BIACORE™ o ELISA de afinidad en solución.

La expresión "anticuerpo biespecífico" incluye un anticuerpo capaz de unirse selectivamente a dos o más epítopos. Los anticuerpos biespecíficos comprenden en general dos cadenas pesadas diferentes, uniéndose específicamente cada cadena pesada a un epítopo diferente, ya sea en dos moléculas diferentes (por ejemplo, antígenos) o en la misma molécula (por ejemplo, en el mismo antígeno). Si un anticuerpo biespecífico es capaz de unirse selectivamente a dos epítopos diferentes (un primer epítopo y un segundo epítopo), la afinidad de la primera cadena pesada por el primer epítopo en general será al menos de uno a dos o tres o cuatro órdenes de magnitud inferior a la afinidad de la primera cadena pesada por el segundo epítopo, y viceversa. Los epítopos reconocidos por el anticuerpo biespecífico pueden estar en la misma diana o en una diferente (por ejemplo, en la misma proteína o en una diferente). Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse, por ejemplo, combinando cadenas pesadas que reconocen diferentes epítopos del mismo antígeno. Por ejemplo, las secuencias de ácido nucleico que codifican secuencias variables de cadena pesada que reconocen diferentes epítopos del mismo antígeno pueden fusionarse con secuencias de ácido nucleico que codifican diferentes regiones constantes de cadena pesada, y dichas secuencias pueden expresarse en una célula que expresa una cadena ligera de inmunoglobulina. Un anticuerpo biespecífico típico tiene dos cadenas pesadas que tienen cada una tres CDR de cadena pesada, seguidas (de extremo N a extremo C) de un dominio CH1, una bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3, y una cadena ligera de inmunoglobulina que no confiere especificidad de unión a antígeno, pero que puede asociarse a cada cadena pesada, o que puede asociarse a cada cadena pesada y que puede unirse a uno o más de los epítopos unidos por las regiones de unión a antígeno de cadena pesada, o que puede asociarse a cada cadena pesada y posibilitar la unión de una o ambas cadenas pesadas a uno o ambos epítopos.

La expresión "cadena pesada", o "cadena pesada de inmunoglobulina" incluye una secuencia de la región constante de cadena pesada de inmunoglobulina de cualquier organismo y, a menos que se especifique otra cosa, incluye un dominio variable de cadena pesada. Los dominios variables de cadena pesada incluyen tres CDR de cadena pesada y cuatro regiones FR, a menos que se especifique otra cosa. Los fragmentos de cadenas pesadas incluyen CDR,

CDR y FR, y combinaciones de las mismas. Una cadena pesada típica tiene, después del dominio variable (del extremo N al extremo C), un dominio CH1, una bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3. Un fragmento funcional de una cadena pesada incluye un fragmento que es capaz de reconocer específicamente un antígeno (por ejemplo, reconocer el antígeno con una KD en el intervalo micromolar, nanomolar o picomolar), que es capaz de expresarse y secretarse de una célula, y que comprende al menos una CDR.

La expresión "cadena ligera" incluye una secuencia de la región constante de cadena ligera de inmunoglobulina de cualquier organismo y, a menos se especifique otra cosa, incluye las cadenas ligeras kappa y lambda humanas. Los dominios variables de cadena ligera (VL) normalmente incluyen tres CDR de cadena ligera y cuatro regiones marco conservadas (FR), a menos que se especifique otra cosa. En general, una cadena ligera de longitud completa incluye, del extremo amino al extremo carboxilo, un dominio VL que incluye FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 y un dominio constante de cadena ligera. Las cadenas ligeras que pueden usarse con la presente invención incluyen aquellas, por ejemplo, que no se unen selectivamente al primer o segundo antígeno unidos selectivamente por la proteína de unión a antígeno. Las cadenas ligeras adecuadas incluyen aquellas que pueden identificarse cribando las cadenas ligeras empleadas más habitualmente en las bibliotecas de anticuerpos existentes (colecciones líquidas o informatizadas), donde las cadenas ligeras no interfieren sustancialmente con la afinidad y/o selectividad de los dominios de unión a antígeno de las proteínas de unión a antígeno. Las cadenas ligeras adecuadas incluyen aquellas que pueden unirse a uno o ambos epítopos que se unen por las regiones de unión a antígeno de la proteína de unión a antígeno.

La expresión "dominio variable" incluye una secuencia de aminoácidos de una cadena ligera o cadena pesada (modificada según se desee) de inmunoglobulina que comprende las siguientes regiones de aminoácidos, en secuencia, del extremo N al extremo C (a menos se indique otra cosa): FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Un "dominio variable" incluye una secuencia de aminoácidos capaz de plegarse en un dominio canónico (VH o VL) que tiene una estructura doble de lámina beta en donde las láminas beta se conectan por un enlace disulfuro entre un resto de una primera lámina beta y una segunda lámina beta.

La expresión "región determinante de la complementariedad", o el término "CDR", incluye una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico de los genes de inmunoglobulina de un organismo que normalmente (es decir, en un animal de tipo silvestre) aparece entre dos regiones marco en una región variable de una cadena ligera o pesada de una molécula de inmunoglobulina (por ejemplo, un anticuerpo o un receptor de linfocitos T). Una CDR puede estar codificada por, por ejemplo, una secuencia de la estirpe germinal o una secuencia reorganizada o no reorganizada, y, por ejemplo, por un linfocito B o un linfocito T virgen o maduro. En algunas circunstancias (por ejemplo, para una CDR3), las CDR pueden estar codificadas por dos o más secuencias

(por ejemplo, secuencias de la estirpe germinal) que no son contiguas (por ejemplo, en una secuencia del ácido nucleico no reordenada) pero son contiguas en una secuencia del ácido nucleico de un linfocito B, por ejemplo, como resultado del corte y empalme o de la conexión de las secuencias (por ejemplo, recombinación V-D-J para formar una CDR3 de cadena pesada).

La expresión "proteína que contiene Fc" incluye anticuerpos, anticuerpos biespecíficos, inmunoadhesinas y otras proteínas de unión que comprenden al menos una porción funcional de una región CH2 y CH3 de inmunoglobulina.

Una "porción funcional" se refiere a una región CH2 y CH3 que puede unirse a un receptor de Fc (por ejemplo, un

F^cyR; o un FcRn, es decir, un receptor de Fc neonatal) y/o que puede participar en la activación del complemento. Si la región CH2 y CH3 contiene supresiones, sustituciones y/o inserciones u otras modificaciones que lo hacen incapaz de unirse a cualquier receptor de Fc y también incapaz de activar el complemento, las regiones CH2 y CH3 no son funcionales.

Las proteínas que contienen Fc pueden comprender modificaciones en los dominios de inmunoglobulina, incluso cuando las modificaciones afectan a una o más funciones efectoras de la proteína de unión (por ejemplo, modificaciones que afectan a la unión a F^cyR, la unión a FcRn y, por lo tanto, la semivida y/o la actividad de CDC).

Dichas modificaciones incluyen, pero sin limitación, las siguientes modificaciones y combinaciones de las mismas, con referencia a la numeración EU de una región constante de inmunoglobulina: 238, 239, 248, 249, 250, 252, 254,

255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 298, 301, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 315, 318, 320, 322,

324, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 335, 337, 338, 339, 340, 342, 344, 356, 358, 359, 360, 361, 362, 373, 375, 376, 378, 380, 382, 383, 389, 398, 414, 416, 419, 428, 430, 433, 434, 435, 437, 438 y 439.

Por ejemplo, y no a modo de limitación, la proteína de unión es una proteína que contiene Fc y presenta una semivida sérica potenciada (en comparación con la misma proteína que contiene Fc sin la modificación o modificaciones citadas) y tiene una modificación en la posición 250 (por ejemplo, E o Q); 250 y 428 (por ejemplo, L o F); 252 (por ejemplo, L/Y/F/W o T), 254 (por ejemplo, S o T) y 256 (por ejemplo, S/R/Q/E/D o T); o una modificación en 428 y/o 433 (por ejemplo, L/R/SI/P/Q o K) y/o 434 (por ejemplo, H/F o ^y); o una modificación en 250 y/o 428; o una modificación en 307 o 308 (por ejemplo, 308F, V308F) y 434. En otro ejemplo, la modificación puede comprender una modificación 428L (por ejemplo, M428L) y 434S (por ejemplo, N434S); una modificación 428L, 2591 (por ejemplo, V259I) y 308F (por ejemplo, V308F); una modificación 433^k(por ejemplo, H433K) y una 434 (por ejemplo, 434Y); una modificación en 252, 254 y 256 (por ejemplo, 252Y, 254t y 256E); una modificación 250Q y 428L (por ejemplo, T250Q y M428L); y una modificación en 307 y/o 308 (por ejemplo, 308F o 308P).

La expresión "sustitución en estrella", "Fc*" y "HC*" incluye cualquier molécula, cadena pesada de inmunoglobulina, fragmento Fc, molécula que contiene Fc y similares que contienen una secuencia dentro del dominio CH3 que anula la unión a la Proteína A. Se ha observado anteriormente (Lindhofer, H. et al (1995) J. Immunol. 155:219-225) que debido a que la lgG3 humana no se une a la Proteína A, puede usarse potencialmente junto con cualquiera de las otras tres subclases de IgG humana en una estrategia de purificación similar a la utilizada para los híbridos de ratónrata. Sin embargo, aunque las secuencias de las cuatro subclases de IgG humanas son altamente homólogas, no se sabe con qué facilidad las porciones Fc de IgG1, lgG2 e lgG4 forman heterodímeros con lgG3; incluso la mera formación preferente de homodímeros tendría un impacto negativo sobre los rendimientos totales de los heterodímeros deseados en determinadas circunstancias (por ejemplo, el aislamiento de cuadromas). Se ha publicado (Jendeberg, L. et al. (1997) J. Immunological Meth. 201:25-34)) que la incapacidad de lgG3 para unirse a la Proteína A está determinada por un único resto de aminoácido, Arg435 (numeración EU; Arg95 según IMGT), cuya posición correspondiente en las otras subclases de IgG está ocupada por un resto de histidina. Por lo tanto, es posible usar, en lugar de lgG3, una secuencia de IgG1 en la que His435 está mutada a Arg. Por lo tanto, una única mutación puntual en IgG1 debería ser suficiente para crear las diferentes afinidades de unión susceptibles de un nuevo esquema de purificación. Esta modificación se denominará IgG1 AA, para indicar su incapacidad de unirse a la Proteína A (y, de forma similar, lgG2AA y lgG4AA, o más generalmente, FcAA).

Sin embargo, la mutación puntual especificada introduce una secuencia peptídica novedosa a través de la mutación, que podría ser potencialmente inmunógena. La mutación puntual podría cargarse, en teoría, en una molécula de MHC de clase Il y presentarse a linfocitos T y, en consecuencia, desencadenar una respuesta inmunitaria. Para evitar este escollo, puede usarse una mutación dipeptídica, H435R/Y436F (numeración EU; H95R/Y96F según IMGT). La secuencia resultante en la proximidad de la alteración es idéntica a la de lgG3 y, por lo tanto, se esperaría que fuera inmunitariamente "invisible", porque no habría péptidos cortos no nativos disponibles para la presentación a los linfocitos T. Se ha publicado que este doble mutante sigue sin unirse a la Proteína A (Jendeberg, L. et al. (1997) J. Immunological Meth. 201:25-34). Por último, la mutación dipeptídica no incluye ninguno de los restos que forman la interfaz del dímero de Fc, por lo que es poco probable que interfiera en la formación de heterodímeros. Esta mutación dipeptídica se denomina "sustitución en estrella".

El término "célula" incluye cualquier célula que sea adecuada para expresar una secuencia de ácido nucleico recombinante. Las células incluyen aquellas de procariotas y eucariotas (unicelulares o pluricelulares), células bacterianas (por ejemplo, cepas de E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., etc.), células de micobacterias, células fúngicas, células de levadura (por ejemplo, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, etc.), células vegetales, células de insectos (por ejemplo, SF-9, SF-21, células de insectos infectadas por baculovirus, Trichoplusiani, etc.), células animales no humanas, células humanas o fusiones de células tales como, por ejemplo, hibridomas o cuadromas. En algunas realizaciones, la célula es una célula humana, de mono, de simio, de hámster, de rata o de ratón. En algunas realizaciones, la célula es eucariota y se selecciona de las siguientes células: CHO (por ejemplo, CHO K1, CHO DXB-11, Veggie-CHO), COS (por ejemplo, COS-7), célula retiniana, Vero, CV1, de riñón (por ejemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (por ejemplo, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidérmica), CV-1, U937, 3T3, célula L, célula C127, SP2/0, NS-0, MmT 060562, célula de Sertoli, célula BRL 3A, célula HT1080, célula de mieloma, célula tumoral y una estirpe celular derivada de una célula mencionada anteriormente. En algunas realizaciones, la célula comprende uno o más genes víricos, por ejemplo, una célula retiniana que expresa un gen vírico (por ejemplo, una célula PER.C6™).

La expresión "modificador de la fase móvil" incluye restos que reducen el efecto de, o alteran, interacciones iónicas no específicas (es decir, sin afinidad) y otras interacciones no covalentes entre proteínas. Los "modificadores de la fase móvil" incluyen, por ejemplo, sales, combinaciones iónicas de metales del Grupo I y del Grupo II con acetato, bicarbonato, carbonato, un halógeno (por ejemplo, cloruro o fluoruro), nitrato, fosfato o sulfato. Una lista ilustrativa no limitante de "modificadores de la fase móvil" incluye sales de berilio, litio, sodio y potasio de acetato; bicarbonatos de sodio y potasio; carbonatos de litio, sodio, potasio y cesio; cloruros de litio, sodio, potasio, cesio y magnesio; fluoruros de sodio y potasio; nitratos de sodio, potasio y calcio; fosfatos de sodio y potasio; y sulfatos de calcio y magnesio.

Los "modificadores de la fase móvil" también incluyen agentes caótropos, que debilitan o interfieren de otro modo con las fuerzas no covalentes y aumentan la entropía en los sistemas biomoleculares. Los ejemplos no limitantes de agentes caótropos incluyen butanol, cloruro de calcio, etanol, cloruro de guanidinio, perclorato de litio, acetato de litio, cloruro de magnesio, fenol, propanol, dodecilsulfato de sodio, tiourea y urea. Los agentes caótropos incluyen sales que afectan a la solubilidad de proteínas. Los aniones más caótropos incluyen, por ejemplo, cloruro, nitrato, bromuro, clorato, yoduro, perclorato y tiocianato. Los cationes más caótropos incluyen, por ejemplo, litio, magnesio, calcio y guanidinio.

Los "modificadores de la fase móvil" incluyen aquellos restos que afectan a las interacciones iónicas u otras no covalentes que, tras la adición a un gradiente o etapa de pH, o tras el equilibrado de un soporte de Proteína A en un "modificador de la fase móvil" y de la aplicación de una etapa o gradiente de pH, da como resultado una ampliación de la distancia de la unidad de pH entre la elución de una IgG homodimérica y una IgG heterodimérica (por ejemplo, una IgG humana de tipo silvestre y la misma IgG pero que porta una o más modificaciones de su dominio CH3 como se describe en el presente documento). La concentración adecuada de un "modificador de la fase móvil" puede determinarse por su concentración empleando la misma columna, etapa o gradiente de pH, con la concentración creciente del "modificador de la fase móvil" hasta alcanzar una distancia máxima de pH en una etapa de pH o un gradiente de pH dados. Los "modificadores de la fase móvil" también pueden incluir modificadores no polares, incluyendo, por ejemplo, propilenglicol, etilenglicol y similares.

Como se usa en el presente documento, "cromatografía de afinidad" es un método cromatográfico que hace uso de las interacciones reversibles y específicas entre biomoléculas en lugar de las propiedades generales de la biomolécula tales como el punto isoeléctrico, la hidrofobia o el tamaño, para efectuar la separación cromatográfica. "Cromatografía de afinidad de Proteína A" o "cromatografía de Proteína A" se refiere a un método cromatográfico de afinidad específico que hace uso de la afinidad de los dominios de unión a IgG de la Proteína A por la porción Fc de una molécula de inmunoglobulina. Esta porción Fc comprende dominios constantes de inmunoglobulina humana o animal CH2 y CH3 o dominios de inmunoglobulina sustancialmente similares a éstos. La Proteína A abarca la proteína nativa de la pared celular de Staphylococcus aureus, la Proteína A producida mediante métodos recombinantes o sintéticos, y variantes que conservan la capacidad de unirse a una región Fc. En la práctica, la cromatografía de Proteína A implica usar Proteína A inmovilizada en un soporte sólido. Véase Gagnon, Protein A Affinity Chromotography, Purification Tools for Monoclonal Antibodies, pág. 155-198, Validated Biosystems, 1996. También pueden usarse proteína G y proteína L para la cromatografía de afinidad. El soporte sólido es una matriz no acuosa sobre la que se adhiere la Proteína A. Dichos soportes incluyen agarosa, sefarosa, vidrio, sílice, poliestireno, nitrocelulosa, carbón vegetal, arena, celulosa y cualquier otro material adecuado. Dichos materiales son bien conocidos en la técnica. Puede usarse cualquier método adecuado para fijar la segunda proteína al soporte sólido. Los métodos para fijar proteínas a soportes sólidos adecuados son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Ostrove, en Guide to Protein Purification, Methods in Enzymology, 182:357-371, 1990. Dichos soportes sólidos, con y sin Proteína A inmovilizada, están disponibles en muchas fuentes comerciales, tales como Vector Laboratory (Burlingame, California), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, California), BioRad (Hércules, California), Amersham Biosciences (parte de GE Healthcare, Upsala, Suecia), Pall (Port Washington, NY) y EMD-Millipore (Billerica, Massachussets). La Proteína A inmovilizada en una matriz de vidrio poroso está disponible en el mercado como PROSEP®-A (Millipore). La fase sólida también puede ser una matriz a base de agarosa. La Proteína A inmovilizada en una matriz de agarosa está disponible en el mercado como MABSELECT™ (Amersham Biosciences).

La cromatografía de afinidad también incluye medios que pueden usarse para unir selectivamente, y por lo tanto purificar, anticuerpos, fragmentos de anticuerpos o proteínas de fusión quiméricas que contienen dominios y/o secuencias de inmunoglobulina. Los anticuerpos incluyen los tipos IgG, IgA, IgM, IgY, IgD e IgE. Los anticuerpos también incluyen anticuerpos monocatenarios tales como anticuerpos de camélidos, anticuerpos de camélidos modificados por ingeniería genética, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos de un solo dominio, nanocuerpos y similares. Los fragmentos de anticuerpos incluyen secuencias VH, VL, E y C^h. Los fragmentos de anticuerpos y las proteínas de fusión que contienen secuencias de anticuerpos incluyen, por ejemplo, F(ab')3, F(ab')², Fab, Fc, Fv, dsFv, (scFv)², scFv, scAb, minicuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, proteínas de fusión de Fc, moléculas trampa y similares (véase Ayyar et al., Methods 56 (2012): 116-129). Dichos medios de cromatografía de afinidad pueden contener ligandos que se unen selectivamente a anticuerpos, sus fragmentos y proteínas de fusión contienen esos fragmentos. Dichos ligandos incluyen proteínas de unión a anticuerpos, receptores derivados de bacterias, antígenos, lectinas o anti-anticuerpos dirigidos contra la molécula diana, requiriendo el anticuerpo purificación. Por ejemplo, pueden usarse ligandos de afinidad derivados de camélidos dirigidos contra uno cualquiera o más de IgG-CH1, IgG-Fc, IgG-CH3, IgG1, LC-kappa, LC-lambda, IgG3/4, IgA, IgM y similares como ligandos de afinidad (disponibles en el mercado como resinas de cromatografía CAPTURESELECT, Life Technologies, Inc., Carlsbad, California). El método de la presente invención es uno para purificar anticuerpos biespecíficos.

EJEMPLO 1: PROCESO DE RESOLUCIÓN DE PICOS

Los anticuerpos biespecíficos se separaron de los homodímeros contaminantes a través de cromatografía de Proteína A utilizando la sustitución en estrella de la siguiente manera. Puesto que el homodímero Fc*Fc* tiene ambos sitios de unión a la Proteína A suprimidos de la región Fc, se esperaba que esta impureza relacionada con el producto fluyera a través de la columna y se retirara, mientras que se esperaba que el anticuerpo biespecífico y el homodímero FcFc quedaran retenidos en la columna. Se aplicó una serie de lavados para retirar los contaminantes relacionados con el proceso tales como ADN de CHO o proteína de la célula hospedadora (HCP). Después, el anticuerpo biespecífico se eluyó selectivamente a través de un gradiente o etapa de pH, mientras que el contaminante FcFc quedó retenido debido a su unión más fuerte con respecto al anticuerpo biespecífico.

Se observó una variabilidad amplia en el rendimiento de la separación de anticuerpo biespecífico a anticuerpo biespecífico cuando se realizaron experimentos iniciales usando una resina cromatográfica de Proteína A estafilocócica (SpA) recombinante. Mientras que en algunos casos se obtuvo una resolución de base entre los homodímeros FcFc de unión y el producto biespecífico, un subgrupo de anticuerpos biespecíficos ("bsAb") presentó una resolución muy escasa. Para estas moléculas, pudo obtenerse una buena resolución cuando se realizó la separación en una resina de afinidad modificada por ingeniería genética para que presentara una estabilidad de la base mejorada. Un ejemplo de esto es el bsAb E, para el que se cargó líquido de cultivo celular clarificado cosechado a 5 g/l en una resina de SpA (MABSELECT XTRA™, Figura 1A) o una resina a base de Proteína A modificada por ingeniería genética (MABSELECT SURE™, Figura 1B). Después de una serie de etapas de lavado con tampón (por ejemplo, pH 6 - 8), se aplicó un gradiente de 40 volúmenes de columna ("VC") de pH 5 a 3 en acetato 40 mM NaCl 500 mM para eluir las especies unidas. En MABSELECT XTRA™ (Figura 1A) un pico de elución de entre 25 - 35 VC contenía tanto el anticuerpo biespecífico como el homodímero FcFc sin resolución. Además, a pesar de la falta de unión de la Proteína A en la región Fc del contaminante Fc*Fc*, un pico de elución poco profundo (0 - 25 VC) consistía en la Proteína de homodímero Fc*Fc*. Sin embargo, la misma carga de bsAb E aplicada a MABSELECT SURE™ produjo dos picos bien resueltos que contenían el anticuerpo biespecífico y el homodímero FcFc, respectivamente (Figura 1B), con todo el homodímero Fc*Fc* fluyendo a través de la columna durante la carga. Esto puede deberse a las diferentes interacciones entre la IgG y la Proteína A nativa ("SpA") y el ligando SuRe modificado por ingeniería genética.

Además del sitio de unión clásico, se ha demostrado que algunos anticuerpos contienen un sitio alternativo de unión a SpA alternativo en la región variable de la cadena pesada ("VH"). En particular, se ha demostrado que algunas IgG que contienen cadenas pesadas de la familia del gen de VH3 humano presentan este comportamiento, con casi la mitad de los genes de la estirpe germinal de VH humana pertenecientes a la subfamilia VH3. (Véase Sasso et al., Journal of Immunology 1989; 142:2778-83; Sasso et al., Journal of Immunology 1991; 147:1877-83; Schroeder et al., International immunology 1990; 2:41-50; y Walter, M.A. y D.W. Cox, American Journal of Human Genetics 1988; 42:446-51.) Por lo tanto, parece probable que en las resinas a base de SpA, los anticuerpos biespecíficos, tales como bsAb E, presentan una resolución escasa de las dos especies de unión y la retención de las resinas de homodímero Fc*Fc* "no de unión" debido a la unión a VH. Por lo tanto, se cree que la unión a VH reduce la diferencia de avidez entre el anticuerpo biespecífico y el homodímero FcFc, y la baja afinidad de unión de Fc*Fc*.

Esta hipótesis está respaldada por la purificación mejorada observada con MABSELECT SURE™. Los estudios de unión entre la SpA y anticuerpos han demostrado que mientras los cinco dominios de la SpA (E, D, A, B y C) se unen a la IgG a través de la región Fc, solo los dominios D y E presentan una unión a Fab significativa. (Véase, por ejemplo, Starovasnik et al., Protein Science 1999; 8:1423-31). El ligando de afinidad MABSELECT SU^rE™ modificado por ingeniería genética es un tetrámero del dominio Z, una versión modificada por ingeniería de proteínas del dominio B de SpA no de unión a Fab nativo. Se sabe que el dominio Z tiene una unión insignificante a la región variable del anticuerpo (Starovasnik, citado anteriormente). Por lo tanto, cuando se usa esta resina que lleva el ligando MABSELECT SURE™, la mayor diferencia de avidez entre el anticuerpo biespecífico y el homodímero FcFc permite una resolución mejorada de esos picos; y el homodímero Fc*Fc* no queda retenido.

Se cribaron múltiples resinas cromatográficas a base de Proteína A con el fin de identificar una resina para la producción clínica y comercial de anticuerpos biespecíficos. Se eligieron dos bsAb para su evaluación, se observó anteriormente que uno se une a SpA a través de la región VH (bsAb A) y otro carece de esta capacidad (bsAb B). El material de carga se sometió anteriormente a cromatografía de afinidad de modo positivo convencional para retirar la impureza de Fc*Fc*. Las purezas de anticuerpos biespecíficos de partida (Fc*Fc/[Fc*Fc Fc*Fc* FcFc]) fueron del 84 % y del 76 % para bsAb A y bsAb B, respectivamente. Todas las resinas se cargaron a 10 g de proteína total/l de resina. Después de una serie de lavados, los anticuerpos se eluyeron usando un gradiente de 30 VC de pH 6 a 3 con NaCl 500 mM o CaCb 500 mM como modificadores de la fase móvil.

Las seis resinas de Proteína A seleccionadas disponibles en el mercado presentan una diversidad de matrices base, tamaños de perlas y tipos de ligando. De las cuatro resinas utilizadas SpA, una era un tetrámero del dominio Z (MABSELECT SU^rE™) y otra era un multímero de una versión estabilizada por base del dominio C no de unión a Fab, denominado dominio Y (TOYOPEARL AF-rProteína A-650F). Estos datos y la resolución de los picos (Rs = 1,18([tR2 - tR¹]/[W1^ ²+ W!4i]; en donde Rs es la resolución de los picos, W1^ es el ancho de pico a la mitad de la altura y tR es el tiempo de retención) obtenidos entre el producto biespecífico y el homodímero FcFc de unión se detallan en la Tabla 1.

Tabla 1: Comparación de la eficacia de separación de la unión del anticuerpo biespecífico a la impureza obtenida usando una gama de medios de Proteína A con dos anticuerpos: Unión VH-Proteína A (bsAb A) y unión no a V^h(bsAb B). aResolución calculada usando el ancho a la mitad de la altura. Si no ha podido calcularse el ancho de los picos a la mitad de la altura debido a la convergencia de los picos, la resolución se marca como "sin resolución".

Cuando se usó NaCI como modificador de la fase móvil en el tampón de elución, se observó un aumento de la resolución en proporción inversa al tamaño de la perla, sin que se observara ninguna resolución para las resinas de SpA con una partícula media superior a 45 pm. Curiosamente, MABSELECT SURE™ (Rs= 0,92) mostró un rendimiento comparable al de TOYOPEARL AF-rProteína A-650F (Rs=0,87) con bsAb A. Esto no se esperaba debido (i) al menor tamaño promedio de perla de TOYOPEARL AF-rProteína A-650F (45 frente a 85 pm) y (ii) a la similitud del ligando de afinidad, que se basa en el dominio Y (derivado del dominio C) y, por lo tanto, se espera que carezca de unión a VH (Starovasnik, citado anteriormente). Para bsAb B, POROS MABCAPTURE A™ presentó una resolución superior en comparación con TOYOPEARL AF-rProteína A-650F y ABSOLUTE HICAP™ (2,50 frente a 2,37 y 2,41, respectivamente), a pesar de no tener el tamaño de partícula más pequeño. La hipótesis es que esto se debe al elemento de flujo perfusivo en esta matriz base, facilitado por los grandes poros pasantes y el diámetro medio de poro de 1100 Angstroms, ayudando a la transferencia de masa. POROS MABCAPTURE A™ también presentó una mejor resolución de bsAb A que cualquier otra resina de SpA, con una resolución comparable a la de las resinas no de unión a VH de TOYOPEARL AF-rProteína A-650F y MABSELECT SURE™ (0,70 frente a 0,87 y 0,92, respectivamente).

Cuando se reemplazó el NaCl por CaCb como modificador de la fase móvil, se observó que POROS MABCAPTURE A™ mejoró en gran medida la potencia de resolución, superando a MABSELECT SURE™ por un margen considerable (Rs de 1,83 frente a 1,08, respectivamente). Basándose en la totalidad de estos datos, POROS MABCAPTURE A™ y MABSELECT SURE™ se evaluaron adicionalmente como posibles resinas cromatográficas de resolución para la elución isocrática.

Puesto que la comparación de resinas se realizó a una velocidad lineal relativamente rápida de 400 cm/h, la resina MABSELECT SURE podría haber visto reducida su eficacia con respecto a POROS MABCAPTURE A debido (i) al mayor tamaño de la perla y (ii) a la falta de flujo perfusivo. Por lo tanto, las resinas se compararon en un intervalo de tiempos de residencia pertinentes para la producción. Se seleccionó BsAb A como molécula modelo debido a su unión observada a la SpA a través de su región VH (proporcionando de este modo una mayor diferencia de avidez entre el anticuerpo biespecífico y la impureza FcFc por MABSELECT SURE sin unión a VH). Obsérvese que para esta evaluación se eligió un anticuerpo de unión a VH, ya que sin esta ventaja de avidez se esperaría que MABSELECT SURE fuera inferior debido al menor tamaño de perla de MABCAPTURE A. Se usó el mismo material de carga de bsAb A capturado por afinidad que se usó para el estudio de evaluación de la resina, a una exposición de 10 g de proteína total/l de resina. Todas las etapas cromatográficas se realizaron con un tiempo de residencia de 3 minutos, a excepción de la elución, que varió 2-8 minutos (600-150 cm/h). El cálculo de la resolución del pico del anticuerpo biespecífico del pico del homodímero FcFc mostró que, aunque la resolución de las resinas aumentaba con el tiempo de residencia, el efecto fue más pronunciado para MABSELECT SURE que para POROS MABCAPTURE A (aumento de Rs de 0,7 y 0,3, respectivamente, Figura 2). Adicionalmente, la resina POROS MABCAPTURE A mostró una resolución superior a la de MABSELECT SURE en todas las condiciones sometidas a ensayo, a pesar de la desventaja de la unión a VH para esta resina, confirmando la superioridad global de la resina con respecto a la potencia de resolución de las dos especies de unión.

La inclusión de modificadores de la fase móvil en el tampón de elución alteró y mejoró potencialmente la resolución del producto biespecífico del homodímero FcFc (véase la Tabla 1). Por lo tanto, se planteó la hipótesis de que el uso de sales de posición variable en la serie de Hofmeister mejoraría la selectividad de la resina mediante la moderación de las interacciones hidrófobas entre las especies de anticuerpos y el ligando de Proteína A. El bsAb A de unión a VH se cargó a 10 g/l en resina MABCAPTURE A. Después de una serie de lavados, los anticuerpos se eluyeron usando un gradiente de 30 VC de pH 6 a 3 con los siguientes modificadores de la fase móvil de elución: citrato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de magnesio y cloruro de calcio, clasificados en orden de cosmótrofas a caótrofas en la serie de Hofmeister. Se usó un nivel de sal de 500 mM para todas las sales excepto el citrato de sodio, donde se usó 250 mM debido a la precipitación de proteína en el material de carga cuando se le hacen adiciones de concentraciones superiores a 300 mM. Se obtuvo una resolución superior entre el producto biespecífico y el homodímero FcFc de unión con las sales más caótropas (Figura 3). Los picos de anticuerpos biespecíficos se recogieron desde el despegue del primer pico, hasta la inflexión pico-valle como se detalla en la Figura 3. Se midieron el porcentaje de rendimiento del anticuerpo biespecífico, el porcentaje de pureza del anticuerpo biespecífico, la resolución de los picos (Rs) y el porcentaje de agregados solubles (Tabla 2). El pH en el ápice del pH del anticuerpo biespecífico también se calculó a partir de los cromatogramas. El uso de las sales más caótropas (cloruro de calcio y cloruro de magnesio) presentó un rendimiento y una pureza del anticuerpo biespecífico mayores. La proteína también se eluyó a un pH superior con cloruro de magnesio y cloruro de calcio. Ni las sales más caótropas ni las más cosmótropas utilizadas indujeron una agregación significativa durante la elución del anticuerpo biespecífico. Por lo tanto, se demostró que el uso de sales caótropas, tales como el cloruro de calcio, como modificadores de la fase móvil en el tampón de elución, potencia la resolución de los picos y la posterior purificación de los bsAb.

Tabla 2: Se midieron el rendimiento, el agregado soluble, el pH del ápice del pico, la resolución del pico y la pureza del anticuerpo biespecífico en fracciones de anticuerpo biespecífico recogidas durante la elución en gradiente de bsAb A de POROS MABCAPTURE A™ usando una diversidad de modificadores de la fase móvil de elución.

EJEMPLO 2: DESARROLLO DE UN PROCESO COMERCIAL

Con el fin de determinar la viabilidad de una plataforma basada en la sustitución en estrella para la purificación de anticuerpos biespecíficos, se desarrolló un proceso escalable para la purificación de bsAb C. Esta proteína se eligió como ensayo del peor caso para la plataforma, ya que se descubrió que mostraba una unión significativa de VH a SpA. Los objetivos clave del desarrollo fueron: (i) conseguir la elución isocrática (por etapas) para simplificar el ajuste de la planta y la transferencia de tecnología, reduciendo al mismo tiempo el consumo de tampón y el tiempo de procesamiento, (ii) identificar la etapa de pulido interconectada con la etapa de resolución por afinidad con poco o ningún acondicionamiento de la carga.

El cribado inicial de factores y la evaluación del espacio de diseño se realizaron usando un cribado de alto rendimiento en el formato de placa de 96 pocillos (HTPD). Se identificaron el pH de elución, la carga de la columna (g/l de proteína total) y la concentración de modificador de la fase móvil como entradas clave del proceso (véase la Figura 2). También se tuvo en cuenta el tiempo de residencia de elución. El material de carga para este estudio se había sometido anteriormente a una cromatografía de afinidad de modo positivo convencional para retirar la impureza Fc*Fc*, dando como resultado una pureza del anticuerpo biespecífico del 64 %. Se realizaron dos estudios de diseño de experimentos de composición central (CCD DoE) de 18 ejecuciones con el fin de evaluar tanto MABSELECT SURE como POROS MABCAPTURE A en un modo de elución isocrática. Los factores estudiados para la resina POROS MABCAPTURE A fueron la carga de la columna (intervalo de 10-25 g de proteína total/l), el pH de elución (4,5-5,5) y la concentración de cloruro de calcio en el tampón de elución (250-500 mM). El tiempo de residencia se mantuvo constante en 3 min (400 cm/h). Después, se evaluó MABSELECT SURE en términos de la carga de la columna (intervalo de 10-25 g de proteína total/l), el pH de elución (3,8-5,0) y el tiempo de residencia de elución (5-11 min). La concentración de cloruro de calcio en el tampón de elución se mantuvo constante en 500 mM.

Para MABCAPTURA A, se obtuvieron modelos buenos tanto para el rendimiento del anticuerpo biespecífico (R2 = 0,97) como para la pureza del anticuerpo biespecífico (R2 = 0,92) usando un algoritmo convencional de ajuste por mínimos cuadrados. En todas las condiciones, se observó que el aumento de los niveles de cloruro de calcio de 250 - 500 mM en el tampón de elución aumentaba los rendimientos del anticuerpo biespecífico en un 10 - 20 % sin reducir la pureza del anticuerpo biespecífico (los datos no se muestran). Usando el modelo, se realizó un análisis del punto dulce a CaCb 500 mM. El análisis ilustró que un pH de elución de 5,0 - 5,1 permitiría alcanzar objetivos de pureza de > 95 % y un rendimiento de > 80 % con una exposición de resina de 17-25 g/l. Se han utilizado condiciones cromatográficas similares a una escala de producción de hasta 2 kl y se han obtenido purezas del anticuerpo biespecífico superiores al 99 % después una optimización adicional.

Evaluando los datos de MABSELECT SURE, se obtuvieron ajustes buenos del modelo para el rendimiento del anticuerpo biespecífico (R2 = 0,99) y la pureza del anticuerpo biespecífico (R2 = 1,00). El tiempo de residencia no demostró ser un factor significativo para ninguna de las respuestas. En cuanto a MABCAPTURE A, se impusieron restricciones en los gráficos de contorno a un tiempo de residencia de 8 minutos para excluir las regiones en las que se obtuvo un rendimiento del anticuerpo biespecífico < 80 % y una pureza del anticuerpo biespecífico < 95 %. La ventana operativa deseable o punto dulce es mucho más pequeña que la observada con MABCAPTURE A. Por lo tanto, el uso de MABSELECT SURE puede dar como resultado un proceso que presente una robustez insuficiente a escala de producción, ya que pequeños cambios de pH o de carga pueden dar como resultado purezas o rendimientos de anticuerpo biespecífico inaceptables.

EJEMPLO 3: PULIDO POSTERIOR A LA AFINIDAD

Después de la etapa de resolución por afinidad, el anticuerpo biespecífico puede someterse a etapas de pulido destinadas a retirar las impurezas relacionadas con el proceso y con el producto de forma muy similar a los anticuerpos monoclonales convencionales. Sin embargo, el uso de una concentración alta de cloruro de calcio en el tampón de elución de la etapa de resolución por afinidad podría complicar potencialmente las operaciones unitarias corriente abajo. Podría usarse una ultrafiltración/diafiltración (UF/DF) para reducir la conductividad de la combinación con el fin de facilitar las etapas tradicionales de pulido de mAb, tales como la cromatografía de intercambio catiónico o de intercambio aniónico. Sin embargo, la identificación de una etapa cromatográfica de modo positivo tolerante a la sal podría evitar la introducción de esta operación unitaria adicional. La cromatografía multimodal o de modo mixto combina diversos tipos de interacciones, tales como la interacción hidrófoba, el enlace de hidrógeno y la interacción iónica con una única resina. Se ha observado que esto puede facilitar la adsorción tolerante a la sal.

Se tuvo en cuenta una diversidad de resinas multimodales como etapas de pulido: (i) CAPTO ADHERE y (ii) CAPTO ADHERE IMPRES (el ligando de N-bencil-metil etanolamina de ambos contiene grupos de interacción por intercambio aniónico, hidrófoba y por enlace de hidrógeno), (iii) hidroxiapatita cerámica y (iv) CAPTO MMC, una resina de intercambio catiónico multimodal con interacción hidrófoba y enlace de hidrógeno potencial. En última instancia, se desarrolló CAPTO MMC para retirar simultáneamente las impurezas relacionadas con el proceso y con el producto, reduciendo al mismo tiempo la conductividad de la corriente de proceso. Después del desarrollo del proceso, se confirmó la prueba de concepto a escala de fabricación utilizando la cromatografía CAPTO MMC en modo positivo con bsAb C y bsAb D (véase la Tabla 3). En ambos casos se obtuvo una capacidad de unión dinámica razonable (19-25 g/l) con rendimientos > 85 %, una reducción de hasta 3 veces en los agregados solubles y un aclaramiento moderado (retirada de 0,2 - 0,7 log) de proteínas de la célula hospedadora CHO.

Tabla 3: Rendimiento y retirada de contaminantes obtenidos mediante cromatografía multimodal en modo positivo usando un medio de CAPTOMMC cargado con una combinación de afinidad de resolución que contiene CaCl²

250 mM.

EJEMPLO 4: ESTRATEGIAS DE DEPURACION

Basándose en los descubrimientos realizados y descritos anteriormente, se prevén dos plataformas de procesos de anticuerpos biespecíficos corriente abajo (Figura 4). Si el anticuerpo biespecífico deriva de la familia de fragmentos del gen de VH3 y es capaz de unirse a SpA a través de la región VH, puede emplearse una operación adicional de la unidad de cromatografía de afinidad, denominada cromatografía de captura por afinidad (Figura 4A). Después de la retirada de las células y los residuos mediante cosecha, se realiza una cromatografía de captura por afinidad usando la resina MABSELECT SURE, puesto que la falta de unión a VH a través del dominio Z garantiza la retirada de la impureza del anticuerpo parental Fc*Fc*. Esta etapa puede realizarse usando condiciones convencionales de unión a Proteína A, lavado y elución para anticuerpos monoclonales comerciales y también actúa para aumentando la concentración de proteína y retirando las impurezas relacionadas con el proceso y con el producto. A medida que la proteína se eluye a pH bajo, también es conveniente realizar una retención a pH bajo para la inactivación vírica con la combinación de producto. Después de esto, la retirada de la impureza FcFc se consigue mediante una segunda etapa de Proteína A de modo positivo denominada "cromatografía de resolución por afinidad". El uso de la resina POROS MABCAPTURE A acoplada a modificadores caótropos en el tampón de elución puede dar como resultados combinaciones con una pureza de anticuerpo biespecífico > 95 %. Después de la cromatografía de resolución por afinidad, el uso de la cromatografía multimodal tolerante a la sal en modo positivo facilita la interconexión directa con la etapa de resolución por afinidad, obviando de este modo la necesidad de una operación intermedia de UF/DF para retirar la sal caótropa de la corriente del proceso. Acoplada con una etapa adicional de pulido, tal como la cromatografía de intercambio aniónico y la filtración retentiva de virus, pueden retirarse agregados, HCP, ADN, virus y otras impurezas a niveles aceptables. Por último, el producto purificado se concentra en el tampón de formulación final mediante metodologías convencionales de ultrafiltración/diafiltración. Esta serie de purificación puede simplificarse si la molécula biespecífica no presenta unión de VH a SpA mediante la retirada de la etapa de captura por afinidad (Figura 4B). En este caso, puede realizarse la retirada de las impurezas FcFc y Fc*Fc* mediante cromatografía de resolución por afinidad.

EJEMPLO 5: MATERIALES Y MÉTODOS

Todos los anticuerpos biespecíficos y el líquido de cultivo celular utilizados en estos ejemplos se expresaron en células CHO. Las resinas cromatográficas se obtuvieron de sus fabricantes: MABSELECT SURE, MABSELECT XTRA, CAPTO MMC (GE Healthcare), POROS MABCAPTURE A (Life Technologies), TOYOPEARL AF-rProteína A-650F (TOSOH Biosciences), ABSOLUTE HIGH CAP (Novasep Inc.), PROSEP ULTRA PLUS (EMD Millipore). Todos los productos químicos utilizados fueron suministrados por J.T. Baker.

Las separaciones cromatográficas a escala de laboratorio se realizaron usando un sistema cromatográfico AKTA AVANT de GE Healthcare y columnas de cromatografía OMNIFIT BENCHMARK (Omnifit Ltd) con un diámetro interno (D.I.) de 1,0 cm. En la cromatografía a escala piloto se aplicaron sistemas cromatográficos AKTA PILOT y columnas de cromatografía INdEX de GE Healthcare con un D.I. de 7,0 cm. La cromatografía a escala de producción se realizó en un equipo de cromatografía AKTAPROCESS y columnas CHROMOFLOW con un D.I. de 40 cm (GE Healthcare). El análisis por UPLC se realizó con un sistema de UPLC ACQUITY de Waters Corporation. El cultivo de células se realizó usando un biorreactor de sobremesa BIOSTAT B-DCU de 2 l (Sartorius), un biorreactor de un solo uso HYCLONE de 50, 250 o 2000 l (Thermo Scientific) o un biorreactor de acero inoxidable de 160 l (ABEC Inc.).

Cuando el líquido de cultivo celular clarificado no se usó directamente, se produjo material de carga para el desarrollo de la resolución por afinidad mediante cromatografía de captura por afinidad usando columnas MABSELECT SURE de una altura de lecho de 20 ± 1 cm. Después del equilibrado con dos volúmenes de columna (VC) de fosfato de sodio 20 mM pH 7,2, las columnas se cargaron a 10 - 40 g de anticuerpo de unión/l con líquido de cultivo celular clarificado. La concentración de anticuerpos de unión se determinó mediante la suma de los títulos de anticuerpo biespecífico y FcFc. Las columnas se lavaron y la proteína eluyó con un sistema de tampón patentado antes de una extracción en columna de 2 VC. Se recogió todo el pico de elución y se neutralizó a pH 7,5 ± 0,5 con base Tris 2 M.

Toda la cromatografía de resolución por afinidad se realizó usando columnas de altura de lecho de 20 ± 1 cm. Las columnas de Proteína A estudiadas se equilibraron con dos VC de fosfato de sodio 20 mM pH 7,2 antes de la aplicación de la carga. Después de la carga, las columnas se lavaron con un sistema de tampón de lavado patentado y se eluyeron con elución en gradiente o isocrática, según se especifique. Para las ejecuciones isocráticas se usó un volumen de elución de cuatro VC, recogiendo la combinación de 0,5 - 4 VC después del inicio de la etapa de elución. Tanto los tampones de elución en gradiente como isocrática contenían acetato 40 mM como especie tampón. Después de la elución, las columnas se extrajeron con 2 VC de tampón. A menos que se indique otra cosa, todas las etapas se realizaron a una velocidad lineal de 400 cm/h. Se usó el software UNICORN 6.1 (GE Healthcare) para el análisis cromatográfico, incluyendo el cálculo de la resolución de los picos (Rs) asumiendo picos gaussianos usando el método del ancho a la mitad de la altura. Cuando se realizó un fraccionamiento automatizado, el despegue del pico se definió por un aumento de > 50 mUa en UV280 basal. El diseño estadístico de los experimentos, el análisis y el modelado se realizaron usando JMP 11.1.1 (SAS Institute Inc.).

La cromatografía CAPTO MMC se realizó usando columnas de 25,1 l (altura del lecho de 20 cm; D.I. de 40 cm) con todas las etapas realizadas a un tiempo de residencia de 4 min (velocidad lineal de 300 cm/h). Las combinaciones de resolución por afinidad se diluyeron al 50 % con agua y se ajustaron a un pH de 5,0 ± 0,1. Las columnas se preequilibraron con 2 VC de NaCl 2 M antes de un equilibrado con 2 VC en acetato de sodio 40 mM, cloruro de calcio 250 mM, pH 5,0 ± 0,1. Después de la aplicación de la carga, las columnas se lavaron con 3 VC de Tris 40 mM, acetato 40 mM, pH 5,0 ± 0,1 y el producto después se eluyó con 8 VC de Tris 20 mM, acetato 60 mM, pH 8,0 ± 0,1 (bsAb C) o Tris 20 mM, acetato 40 mM, pH 8,0 ± 0,1 (bsAb D). Las combinaciones se recogieron desde el despegue de UV²⁸⁰nm hasta el final de la etapa de elución. Después de la elución, las columnas se limpiaron con 2 VC de NaCl 2 M seguidas de 2 VC de NaOH 1 M.

La cuantificación de proteína de la célula hospedadora ("HCP") se realizó usando un kit ELISA disponible en el mercado N.° de Cat. F550 (Cygnus Technologies). Cuantificación de agregados solubles mediante dos columnas ACQUITY UPLC PrST SEC, 200 A, 1,7 |jm, 4,6 mm x 150 mm, N.° de cat. 186005225 en serie en una fase móvil de fosfato de sodio 10 mM, cloruro de sodio 500 mM, pH 7,0. La pureza del anticuerpo biespecífico se midió usando tres columnas POROS A de 20 jm rellenadas previamente (2,1 mm x 30 mm, 0,1 ml) N.° de cat. 2-1001-00 en serie y un sistema de tampón de elución isocrática. Los títulos de anticuerpo biespecífico y FcFc se midieron usando una columna POROS A de 20 |jm (2,1 mm x 30 mm, 0,1 ml) N.° de cat. 2-1001-00 y los títulos de Fc*Fc* se midieron cargando el flujo en una columna POROS G de 20 jm (2,1 mm x 30 mm, 0,1 ml).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método de purificación de un anticuerpo específico que comprende:

a. cargar una matriz de afinidad con una mezcla de proteínas multiméricas que comprende (i) un primer homodímero que comprende dos copias de un primer polipéptido de cadena pesada y dos copias de un polipéptido de cadena ligera, ii) un segundo homodímero que comprende dos copias de un segundo polipéptido de cadena pesada y dos copias del polipéptido de cadena ligera y (iii) un anticuerpo biespecífico heterodimérico que comprende el primer polipéptido de cadena pesada y el segundo polipéptido de cadena pesada y dos copias del polipéptido de cadena ligera, en donde el primer polipéptido de cadena pesada tiene mayor afinidad por la matriz de afinidad que el segundo polipéptido de cadena pesada, en donde la matriz de afinidad comprende un ligando de Proteína A fijado a un sustrato que comprende una multiplicidad de partículas que tienen un diámetro medio de 45 pm y que comprende poros que tienen un diámetro medio de 1100 A; y

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el sustrato comprende uno cualquiera o más de agarosa, poli(estireno-divinilbenceno), polimetacrilato, celulosa, vidrio de poro controlado y sílice esférica.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde se cargan de 5 a 50 gramos de proteína por litro de matriz de afinidad.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende aplicar un gradiente de pH a la matriz de afinidad cargada de la etapa (a).

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4 que comprende lavar la matriz de afinidad cargada de la etapa (a) con una solución a pH 6-8 antes de aplicar el gradiente de pH.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el gradiente de pH se ejecuta entre pH 6 y pH 3.

7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en donde el primer intervalo de pH se selecciona de un intervalo entre pH 5,5 y pH 3,6.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el tampón comprende acetato, opcionalmente en donde el tampón comprende acetato 40 mM.

9. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el tampón comprende CaC^b.

10. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el tampón comprende MgC^b.

11. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el tampón comprende CaC^b250-500 mM.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el tampón comprende MgC^b250-500 mM.

13. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el primer polipéptido de cadena pesada comprende un dominio CH3 que es capaz de unirse a la Proteína A y el segundo polipéptido de cadena pesada comprende un dominio CH3 que no es capaz de unirse a la Proteína A.

14. El método de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el segundo polipéptido de cadena pesada comprende una sustitución HY a RF en su dominio CH3.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la mezcla de proteínas multiméricas es producida por una pluralidad de células eucariotas en un cultivo celular, opcionalmente en donde las células eucariotas comprenden células de ovario de hámster chino (CHO) o derivados de las mismas.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende las etapas de:

c. aplicar el anticuerpo biespecífico heterodimérico recogido de la etapa (b) a una resina de cromatografía multimodal en un tampón que tiene un pH ácido;

d. eluir el anticuerpo biespecífico heterodimérico de la resina de cromatografía multimodal en un tampón que tiene un pH más alcalino; y

e. recoger el anticuerpo biespecífico heterodimérico.