ES2941526T3 - Un método para liofilizar cepas vacunales vivas de Francisella tularensis - Google Patents
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Abstract
Se proporcionan composiciones y métodos para la liofilización y/o el almacenamiento de cepas vacunales vivas de Francisella tularensis. Más específicamente, se proporcionan medios de liofilización y usos de los mismos para la preparación y almacenamiento a largo plazo de vacunas de Francisella tularensis. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Un método para liofilizar cepas vacunales vivas de Francisella tularensis
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reclama el beneficio de la prioridad de la Solicitud Provisional de EE.UU. N.° 62/645.409 presentada el 20 de marzo de 2018.
Campo
La presente divulgación proporciona un método para liofilizar cepas vacunales vivas de Francisella tularensis. Más específicamente, la divulgación se refiere al medio de liofilización y usos del mismo para la preparación y el almacenamiento a largo plazo de vacunas de Francisella tularensis.
Antecedentes
Francisella tularensis es un patógeno bacteriano intracelular facultativo que causa un espectro de enfermedades denominadas colectivamente tularemia. Dos subespecies, subsp. tularensis (tipo A) y subsp. holarctica (tipo B) son patógenos para los humanos. Ambas subespecies pueden causar una enfermedad grave después de la infección a través del contacto directo con animales infectados, a través de diversos insectos picadores, incluidos mosquitos y garrapatas, ingestión, imbibición o inhalación. Independientemente de la vía de entrada, las cepas de tipo B no suelen causar una infección letal. Sin embargo, la inhalación de pequeñas cantidades de cepas de tipo A (<20 unidades formadoras de colonias) se asocia con una tasa de mortalidad del 30-60 % si no se trata. Este es un escenario probable después de un ataque bioterrorista, ya que pocos médicos conocen los síntomas de la tularemia, pocos laboratorios clínicos emplean el tipo de medio de cultivo requerido para cultivar el patógeno a partir de sangre o tejidos humanos, y los antibióticos más exitosos contra F. tularensis (gentamicina y doxiciclina) rara vez se recetan durante las 2 a 4 semanas necesarias para tratar con éxito la tularemia. Por estas razones, existe un gran interés en desarrollar vacunas que puedan prevenir o mejorar la infección después de la inhalación de F. tularensis de tipo A.
Se ha usado una cepa de tipo B empíricamente atenuada de F. tularensis desarrollada hace más de 70 años, cepa vacunal viva de F. tularensis (LVS), para proteger contra la exposición a cepas virulentas de tipo A del patógeno. En pruebas formales realizadas durante la década de 1960 con voluntarios humanos, se mostró que la LVS aportaba una protección completa contra la exposición transdérmica a la cepa de tipo A SCHU S4, aunque brindaba menos protección contra una exposición de aerosol (Saslaw y col., Arch. Int. Med. 1961, 107: 689-714). Es la única vacuna que ha mostrado formalmente que posee estas propiedades. Sin embargo, debido a problemas de seguridad, nunca ha sido autorizada por la Administración de alimentos y medicamentos de los Estados Unidos (FDA).
La secuenciación genómica de cepas clínicas tipo A y tipo B de F. tularensis así como LVS permitió la identificación de las modificaciones genéticas en la cepa vacunal. Gran parte de la atenuación de la LVS frente a cepas clínicas de tipo B parece deberse a defectos en un gen de pilo, pilA, y un gen (FTT0918/fupA) implicado en la adquisición de hierro (Salomonsson, E. y col., Infect. Immun. 2009, 7: 3424-31; Lindgren, H. y col., Infect. Immun. 2009, 77(10): 4429 36). La LVS también contiene muchas otras mutaciones que, por separado o en conjunto, contribuyen a su atenuación. Se sabe que la LVS provoca tanto una respuesta de anticuerpos como una respuesta de células T CD4+ y CD8+ ante varias proteínas de F. tularensis (Twine, S.M. y col., Biochem. Biophys. Res. Comm. 2006, 346(3): 999-1008; Twine, S.M. y col., PLoS One 2010, 5(4): e10000; Sandstrom, G. y col., J. Clin. Microbiol. 1987, 25(4): 641-4; Sjostedt, A. y col., J. Immunol. 1990, 145(1): 311-7). Se desconocen los antígenos de LVS que son responsables de provocar la inmunidad protectora; además, debido a que la LVS es una vacuna generada a partir de una cepa de tipo B, faltan factores de virulencia y otras macromoléculas exclusivas de las cepas de tipo A. Estos hechos dificultan la tarea de diseñar vacunas basadas en antígenos específicos. Como resultado de los factores anteriores, actualmente no existe una vacuna aprobada por la FDA para uso general que pueda proporcionar protección profiláctica contra la tularemia respiratoria.
Previamente, se ha informado sobre el desarrollo de nuevas cepas vacunales de F. tularensis basadas en la inactivación del gen clpB de una cepa de tipo A totalmente virulenta (SCHU S4) (Conlan, J. W. y col., Vaccine 2010, 28(7): 1824-31; Shen, H. y col., PLoS One 2010, 5(10): e13349; Ryden, P. y col., Mol. Immunol. 2013, 54(1): 58-67) o cepa tipo B (FSC200) (Golovliov, I. y col., PLoS One 2013, 8(11): e78671; véase también la publicación de la solicitud internacional PCT N.2 WO 2010/124377.
Se han descritos cepas mutantes de F. tularensis que comprenden un gen clpB inactivado (por ejemplo, eliminado), composiciones que comprenden tales mutantes y métodos para conferir inmunidad contra F. tularensis en un hospedador que comprenden administrar las cepas mutantes descritas de F. tularensis (documento WO 2010/124377). Sin embargo, aunque los mutantes de clpB de F. tularensis descritos han mostrado ser útiles como vacunas para conferir inmunidad contra F. tularensis en un hospedador, existe la necesidad de métodos y composiciones para la preparación y el almacenamiento a largo plazo de tales vacunas. Tales métodos y reactivos podrían permitir una vacuna fácilmente disponible y acumulada que facilitaría las campañas de vacunación masiva en condiciones de amenaza.
Las formulaciones de vacunas sólidas generalmente tienen una marcada disminución en el movimiento molecular y la escisión hidrolítica, lo que da como resultado un producto biofarmacéutico con una estabilidad y una vida útil superiores. La liofilización (también conocida como secado por congelación) es un método común que se ha usado para deshidratar soluciones que contienen reactivos biológicamente activos y para estabilizar vacunas. Se ha mostrado que es útil para el almacenamiento a largo plazo de vacunas bacterianas, sin embargo, la viabilidad de la LVS después del secado por congelación ha sido baja (la pérdida de bacterias viables después de la liofilización es de hasta el 99 %), lo que indica que la LVS de F. tularensis es difícil de liofilizar sin una pérdida inmediata significativa de viabilidad (Ohtake, S. y col., J. Pharm. Sci. 2011, 100(8): 3076-87; Figelsbach, H. T. y col., J. Immunol. 1961, 87: 415-25).
Figelsbach y Downs (J. Immunol. 1961, 87:415-425) describen vacunas contra la tularemia vivas y muertas. La LVS derivada de la subespecie F. tularensis holarctica se liofilizó a partir de un medio líquido que consistía en sacarosa al 10 %, gelatina al 1,3 %, agar al 0,1 % y solución salina al 0,85 %. Tras la reconstitución en agua, la viabilidad disminuyó entre 10 y 20 veces, con una pérdida adicional de hasta 2 veces después del almacenamiento durante 1 año a 5 °C. Eneslatt y col. (Eur. J. Immunol. 2011, 41(4): 974-80) mostró que esta formulación retenía su viabilidad e inmunogenicidad posteriores a la liofilización durante más de 50 años cuando se almacenaba a -80 °C.
Más recientemente, se liofilizó LVS cultivada en fermentadores según estándares de GMP en tampón fosfato 10 mM que contenía 10 % de sacarosa y 1,3 % de gelatina (Pasetti y col., Vaccine 2008, 26(14): 1773-85). Pasetti y col. describen un análisis toxicológico e inmunológico de LVS administrada a conejos en dosis variables y por diferentes vías. Demuestran que una formulación novedosa de vacuna de LVS era segura y altamente inmunogénica durante los estudios preclínicos en conejos. La LVS se formuló en fosfato de potasio 10 mM, sacarosa al 10 % y gelatina al 1,3 %, se liofilizó y almacenó hasta su uso a 2-8 °C o -10 a -30 °C, pero no se informaron pérdidas de viabilidad después de la liofilización o el almacenamiento.
Leslie y col. (Appl. Environ. Microbiol. 1995, 61(10): 3592-3597) mostraron que la adición de trehalosa o sacarosa a muestras de dos cepas bacterianas, Escherichia coli DH5a y Bacillus thuringiensis HD-1, antes del secado por congelación, puede aumentar la viabilidad global de las muestras. Leslie y col. informan que la mayor tolerancia al secado puede deberse a la capacidad de los azúcares para reducir la temperatura de la transición de fase de la membrana seca y mantener la estructura general de la proteína en el estado seco.
Streeter (J. Appl. Microbiol. 2003, 95: 484-491) describe el efecto de la trehalosa sobre la supervivencia de Bradyrhizobium japonicum durante la desecación. Streeter informa que agregar trehalosa durante el crecimiento de la bacteria mejoraba significativamente la supervivencia después de la desecación.
Ohtake y col. (J. Pharm. Sci. 2011, 100(8): 3076-3087) describen una formulación optimizada para el secado de espuma de LVS que comprende 30 % de trehalosa, 5 % de gelatina y 0,02 % de tensioactivo Pluronic F68 en tampón fosfato 25 mM a pH 8,0. Esta formulación de secado de espuma daba como resultado una disminución de la viabilidad de hasta 10 veces, pero esencialmente ninguna pérdida adicional de viabilidad después del almacenamiento a 4 °C durante 12 semanas. La formulación perdía aproximadamente 0,6 log10 a 25 °C y aproximadamente 2 log10 después de 6 semanas a 37 °C. Sin embargo, no se evaluó el almacenamiento a largo plazo de esta formulación. Además, para la inyección subcutánea o intradérmica, la cantidad máxima de trehalosa permitida por la Agencia de Alimentos y Medicamentos de EE. UU. es del 2 %, y la trehalosa de calidad clínica es relativamente costosa.
Sumario
La invención está definida por las reivindicaciones. Cualquier tema en cuestión que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona únicamente con fines informativos. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento, diagnóstico o cirugía se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para uso en un método de tratamiento, diagnóstico o cirugía del cuerpo humano o animal.
Es un objeto de la presente invención mejorar al menos algunas de las deficiencias presentes en la técnica anterior. Se han desarrollado realizaciones de la presente tecnología basándose en la apreciación de los inventores de que existe la necesidad de métodos y composiciones para la preparación y el almacenamiento a largo plazo de vacunas de Francisella tularensis que permitan su producción, almacenamiento y uso generalizados.
En particular, el medio de liofilización proporcionado en el presente documento es el primer medio de liofilización que ha mostrado ser capaz de conservar una cepa vacunal viva de F. tularensis subespecie tularensis. Estudios previos informaron pérdidas de al menos el 90 % de viabilidad y, en algunos casos, más del 99 % de viabilidad, de la LVS después de la liofilización. Por el contrario, en el presente documento se proporcionan métodos y composiciones para la liofilización de cepas vacunales vivas de F. tularensis que pueden conservar la viabilidad suficiente para mantener la utilidad como vacuna (es decir, mantener la inmunogenicidad) y puede almacenarse a largo plazo después de la liofilización sin una pérdida adicional significativa de viabilidad. En el presente documento se informa de medios y métodos de liofilización que pueden dar como resultado, en algunos casos, una pérdida de viabilidad de solo aproximadamente el 50 % después de la liofilización y/o la conservación de la viabilidad después de un almacenamiento a largo plazo de hasta 3 años.
Por consiguiente, en un primer aspecto se proporciona un medio de liofilización que comprende excipientes clínicamente aceptables para el almacenamiento a largo plazo de cepas vacunales vivas de F. tularensis, tales como mutantes ñelpB de F. tularensis, en estado liofilizado. En algunas realizaciones, el medio de liofilización es adecuado para el almacenamiento a largo plazo de F. tularensis. En algunas realizaciones, el medio de liofilización es adecuado para uso clínico en un sujeto, incluido el uso clínico en sujetos humanos.
En una realización, el medio de liofilización comprende manitol, un disacárido y gelatina en una relación en peso de 1:1:0,25, respectivamente, en el que el disacárido se selecciona de sacarosa, trehalosa y una mezcla de sacarosa y trehalosa. En una realización, el medio de liofilización comprende 1 % de manitol, 1 % de disacárido y 0,25 % de gelatina, en el que el disacárido se selecciona de sacarosa, trehalosa y una mezcla de sacarosa y trehalosa. En una realización, el medio de liofilización comprende 1 % de manitol, 1 % de disacárido y 0,25 % de gelatina en un tampón fosfato, en el que el disacárido se selecciona de sacarosa, trehalosa y una mezcla de sacarosa y trehalosa. En una realización, el tampón fosfato tiene una concentración de 10 mM. En una realización, el tampón fosfato es un tampón fosfato de potasio que tiene una concentración de 10 mM y un pH de 7,2. En una realización, el medio de liofilización comprende 1 % de manitol, 1 % de sacarosa y 0,25 % de gelatina en tampón fosfato de potasio 10 mM, pH 7,2.
En una realización, el medio de liofilización es adecuado para la liofilización y el almacenamiento a largo plazo de cepas de F. tularensis mutantes vivas en las que el gen clpB se inactiva. Tales cepas mutantes pueden atenuarse. La cepa mutante puede derivar de cualquier cepa clínica apropiada de F. tularensis tal como, sin limitación, una cepa clínica de tipo silvestre de F. tularensis seleccionada del grupo consistente en SCHU S4, FSC033, FSC108 y FSC200. En algunas realizaciones, la cepa mutante es una cepa de tipo A o una cepa de tipo B totalmente virulenta. En algunas realizaciones, el gen clpB se elimina, por ejemplo la cepa de F. tularensis puede ser SCHU S4 ñclpB o FSC200 ñclpB. En una realización, la cepa mutante es el número de depósito de CCUG CCUG 59672.
En una realización, el medio de liofilización es adecuado para conservar la viabilidad y/o conservar la inmunogenicidad de una cepa de F. tularensis viva durante la liofilización y/o durante el almacenamiento a largo plazo en un estado liofilizado. Por ejemplo, la viabilidad y/o la inmunogenicidad pueden conservarse después del almacenamiento de la cepa de F. tularensis liofilizada a temperaturas de 4 °C o inferiores durante al menos 3 meses, durante al menos 1 año o durante al menos 3 años, y/o a temperaturas de aproximadamente -20 °C durante al menos 3 meses, al menos 1 año o durante al menos 3 años.
En una realización, el medio de liofilización puede conservar mutantes de clpB de F. tularensis liofilizados (por ejemplo, mutantes ñclpB) a temperaturas de 4 °C o inferiores durante al menos 1 año. En algunas realizaciones, el medio de liofilización puede conservar mutantes de clpB de F. tularensis liofilizados (por ejemplo, mutantes ñclpB) a temperaturas de 4 °C o inferiores durante al menos 3 años. En algunas realizaciones, el medio de liofilización puede conservar mutantes de clpB de F. tularensis liofilizados (por ejemplo, mutantes ñclpB) a temperaturas de aproximadamente -20 °C durante al menos 1 año. En algunas realizaciones, el medio de liofilización puede conservar mutantes de clpB de F. tularensis liofilizados (por ejemplo, mutantes ñclpB) a temperaturas de aproximadamente -20 °C durante al menos 3 años.
En una realización, el medio de liofilización puede conservar mutantes de clpB de F. tularensis liofilizados (por ejemplo, mutantes ñclpB) a temperaturas de 4 °C o inferiores durante un máximo de 1 año. En algunas realizaciones, el medio de liofilización puede conservar mutantes de clpB de F. tularensis liofilizados (por ejemplo, mutantes ñclpB) a temperaturas de 4 °C o inferiores durante un máximo de 3 años. En algunas realizaciones, el medio de liofilización puede conservar mutantes de clpB de F. tularensis liofilizados (por ejemplo, mutantes ñclpB) a temperaturas de aproximadamente -20 °C durante un máximo de 1 año. En algunas realizaciones, el medio de liofilización puede conservar mutantes de clpB de F. tularensis liofilizados (por ejemplo, mutantes ñclpB) a temperaturas de aproximadamente -20 °C durante un máximo de 3 años.
En algunas realizaciones, el medio de liofilización puede conservar la viabilidad y/o la inmunogenicidad de la cepa de F. tularensis liofilizada durante al menos aproximadamente 5x, al menos aproximadamente 10x, al menos aproximadamente 15x, o al menos aproximadamente 20x más que un medio que consta de 10 % de sacarosa y 1,3 % de gelatina en una solución de fosfato de potasio 10 mM, tal como el medio usado para liofilizar LVS descrito en Pasetti y col., Vaccine 2008, 26(14): 1773-85.
En algunas realizaciones, la viabilidad y/o la inmunogenicidad de la cepa de F. tularensis liofilizada después del almacenamiento es al menos de 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 99 % de la viabilidad inicial posterior a la liofilización de la cepa de F. tularensis liofilizada.
En algunas realizaciones, la viabilidad y/o la inmunogenicidad de la cepa de F. tularensis liofilizada después del almacenamiento permanece sustancialmente sin cambios en comparación con la viabilidad inicial posterior a la liofilización de la cepa.
En algunas realizaciones, el medio de liofilización puede conservar la viabilidad y/o la inmunogenicidad de la cepa de F. tularensis durante la liofilización de tal manera que la viabilidad y/o inmunogenicidad inicial posterior a la liofilización de la cepa sea de al menos aproximadamente el 35 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos
aproximadamente el 45 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 55 %, o al menos alrededor del 60% de la viabilidad previa a la liofilización.
En una realización, el medio de liofilización puede conservar la viabilidad y/o la inmunogenicidad de la cepa de F. tularensis de tal manera que no se pierda más de aproximadamente el 40 % o aproximadamente el 50 % de la viabilidad después de la liofilización en comparación con la viabilidad previa a la liofilización, y la viabilidad y/o la inmunogenicidad permanezcan estables durante al menos 1 año después del almacenamiento a 4 °C o menos o al menos 3 años después del almacenamiento a -20 °C o menos. En una realización, el medio de liofilización puede conservar la viabilidad de la cepa de F. tularensis de tal manera que no haya más de aproximadamente el doble de pérdida de viabilidad después de la liofilización en comparación con la viabilidad previa a la liofilización (en otras palabras, la viabilidad después de la liofilización es aproximadamente el 50 % de la viabilidad previa a la liofilización).
En algunas realizaciones, el medio de liofilización puede conservar la viabilidad y/o la inmunogenicidad de la cepa de F. tularensis liofilizada cuando se liofiliza a bajas concentraciones de bacterias, por ejemplo, en 1 dosis de vacuna/vial (~ 107 UFC/vial).
En un segundo aspecto, se proporciona un método para liofilizar una cepa vacunal viva de Francisella tularensis (F. tularensis), que comprende las etapas de: 1) sedimentar un cultivo de la cepa vacunal viva por centrifugación; 2) resuspender la cepa vacunal viva en el medio de liofilización proporcionado en el presente documento; y 3) secar por congelación la cepa vacunal viva resuspendida, obteniendo así una cepa vacunal liofilizada. La cepa puede ser, por ejemplo, una cepa mutante en la que el gen cIpB está inactivado tal como, sin limitación, SCHU S4 ñclpB o FSC200 ñclpB.
En algunas realizaciones, particularmente cuando se usan cultivos grandes (por ejemplo, cultivos de 25 litros o más), se pueden usar diafiltración, filtración de flujo tangencial u otros métodos reconocidos en la materia para intercambiar el medio de cultivo con el medio de liofilización en lugar de la etapa (1) anterior de sedimentación del cultivo. Debe entenderse que el método usado para suspender la cepa en el medio de liofilización en la preparación para secado por congelación no pretende estar particularmente limitado, y muchos de tales métodos son conocidos en la materia. De igual forma, la cepa vacunal viva puede ser resuspendida en un volumen de medio de liofilización igual al volumen inicial del cultivo o menor o mayor que el volumen inicial, y el cultivo puede o no ser diluido previo al intercambio con el medio de liofilización; tales etapas las determinará el experto en la materia basándose en técnicas reconocidas en la materia.
En algunas realizaciones, el método comprende además una etapa de almacenamiento de la cepa vacunal liofilizada a una temperatura de aproximadamente 4 °C o inferior o a una temperatura de aproximadamente -20 °C o inferior, por ejemplo, durante varios meses, durante al menos un año, o durante al menos tres años. En algunas realizaciones, el método comprende además una etapa de almacenamiento de la cepa vacunal liofilizada a una temperatura de aproximadamente 4 °C o inferior o a una temperatura de aproximadamente -20 °C o inferior, por ejemplo, durante varios meses, durante aproximadamente un año, o durante aproximadamente tres años.
En una realización, la cepa vacunal liofilizada se almacena durante al menos 1 año o al menos 3 años a una temperatura de aproximadamente 4 °C o menos o a una temperatura de aproximadamente -20 °C o menos, y la viabilidad de la cepa vacunal liofilizada después del almacenamiento es al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 95 %, o al menos aproximadamente el 99 % de la viabilidad inicial posterior a la liofilización de la cepa vacunal liofilizada.
En algunas realizaciones, los métodos proporcionados en el presente documento pueden conservan la viabilidad y/o la inmunogenicidad de la cepa vacunal liofilizada después de la liofilización y/o del almacenamiento, como se describe en el presente documento. En una realización, la cepa vacunal liofilizada es capaz de inducir una respuesta inmune y/o conferir inmunidad contra F. tularensis (por ejemplo, F. tularensis de tipo A virulenta) en un sujeto (p. ej., un animal o un ser humano) después de su administración.
En algunas realizaciones, los métodos y composiciones proporcionados en el presente documento pueden conservar la viabilidad de un mutante F. tularensis ñclpB, por ejemplo, F. tularensis SCHU S4 ñclpB, F. tularensis FSC200 ñclpB al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 15 veces o al menos 20 veces más que los medios de liofilización previamente conocidos, incluidos los medios de liofilización usados históricamente para fabricar LVS (tales como, sin limitación, medios que comprenden 10 % de sacarosa y 1,3 % de gelatina).
En algunas realizaciones, la cepa de F. tularensis se liofiliza a bajas concentraciones, por ejemplo, a 1 dosis de vacuna/vial (~107 UFC/vial). En otras realizaciones, la cepa de F. tularensis se liofiliza a concentraciones de aproximadamente 100 dosis de vacuna/vial o aproximadamente 500 dosis de vacuna/vial.
En un tercer aspecto, se proporciona una vacuna para la prevención o tratamiento de infección por F. tularensis y/o tularemia en un sujeto que comprende la cepa vacunal liofilizada producida según los métodos proporcionados en el presente documento y/o usando el medio de liofilización proporcionado en el presente documento. La cepa vacunal liofilizada se puede reconstituir en un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Tal vacuna puede
administrarse, por ejemplo, por vía intradérmica, intranasal, subcutánea, por escarificación, intramuscular, oral, por aerosol o por inhalación, a un animal o a un ser humano.
En un cuarto aspecto, se proporciona un método para inducir una respuesta inmune y/o conferir inmunidad contra F. tularensis en un sujeto, que comprende administrar una cepa mutante de F. tularensis en la que el gen cIpB se inactiva para el sujeto, en el que la cepa mutante de F. tularensis comprende la cepa vacunal liofilizada producida según los métodos proporcionados en el presente documento y/o usando el medio de liofilización proporcionado en el presente documento. En una realización, el método induce una respuesta inmune y/o confiere inmunidad contra F. tularensis de tipo A virulenta en el sujeto.
En un quinto aspecto, se proporciona un método para prevenir, mejorar o tratar la tularemia en un sujeto, que comprende administrar una cepa mutante de F. tularensis en la que el gen cIpB se inactiva para el sujeto, en el que la cepa mutante de F. tularensis comprende la cepa vacunal liofilizada producida según los métodos proporcionados en el presente documento y/o usando el medio de liofilización proporcionado en el presente documento, de tal manera que se previene, mejora o trata la tularemia en el sujeto.
En otro aspecto, se proporciona el uso del medio de liofilización proporcionado en el presente documento en la fabricación de una vacuna para la prevención o el tratamiento de infección por F. tularensis. También se proporciona el uso de la cepa vacunal liofilizada producida según los métodos proporcionados en el presente documento y/o usando el medio de liofilización proporcionado en el presente documento en la fabricación de una vacuna para la prevención o el tratamiento de infección por F. tularensis.
En algunas realizaciones, los métodos y composiciones proporcionados en el presente documento pueden mejorar la estabilidad al almacenamiento y/o térmica de vacunas de F. tularensis. Tal estabilidad mejorada puede proporcionar una o más de las siguientes ventajas: 1) mitigar los riesgos de pérdida de potencia de la vacuna durante el almacenamiento a largo plazo, envío o distribución; 2) permitir la acumulación en preparación para una amenaza biológica; 3) mitigar los riesgos de pérdida de potencia de la vacuna durante el suministro en áreas geográficas con climas cálidos; y 4) permitir el desarrollo y la producción de una vacuna ñcIpBcomercialmente viable contra la tularemia que cumpla con los estándares de licencia de la FDA.
En otro aspecto, se proporciona un método para liofilizar una cepa vacunal viva de F. tularensis que comprende las etapas de: 1) descongelar una preparación líquida congelada concentrada de una cepa vacunal viva, comprendiendo la preparación líquida congelada concentrada un medio de crecimiento o el medio de liofilización de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; 2) si la preparación líquida congelada concentrada comprende el medio de crecimiento, retirar sustancialmente el medio de crecimiento y resuspender la cepa vacunal en el medio de liofilización de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y 3) secar por congelación la cepa vacunal en el medio de liofilización, obteniendo así una cepa vacunal liofilizada.
En algunas realizaciones, la preparación líquida congelada concentrada comprende el medio de cultivo. En algunas realizaciones, el medio de cultivo es medio hidrolizado parcial de caseína modificado (MCPH) o medio definido de Chamberlain (CDM). En algunas realizaciones, la cepa vacunal viva deriva de una cepa clínica de tipo silvestre de F. tularensis seleccionada del grupo que consiste en SCHU S4, FSC033, FSC108 y FSC200. En algunas realizaciones, el método comprende además diluir la cepa vacunal a una sola dosis por recipiente en el medio de liofilización antes del secado por congelación. En algunas realizaciones, la vacuna se diluye en una dosis única de aproximadamente 107 UFC por recipiente.
Los aspectos y ventajas adicionales de la presente invención serán evidentes a la vista de la siguiente descripción. La descripción detallada y los ejemplos, si bien indican realizaciones particulares de la invención, se proporcionan únicamente a modo de ilustración, ya que los expertos en la materia apreciarán diversos cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención a la luz de las enseñanzas de esta invención.
Breve descripción de los dibujos
Para una mejor comprensión de la invención y para mostrar más claramente cómo se puede llevar a la práctica, ahora se hará referencia a modo de ejemplo a los dibujos adjuntos, que ilustran aspectos y características según las realizaciones preferidas de la presente invención, y en que:
La FIG. 1 muestra la viabilidad de las muestras liofilizadas almacenadas a diversas temperaturas durante diversos períodos de tiempo. Se cultivaron bacterias SCHU S4úcIpB en caldo de hidrolizado parcial de caseína modificada (MCPH), se sedimentaron mediante centrifugación y se resuspendieron y liofilizaron en medio de liofilización (tampón fosfato de potasio 10 mM que contenía 1 % de manitol, 1 % de sacarosa y 0,25 % de gelatina, pH final de 7,2) a aproximadamente 1010 unidades formadoras de colonias (UFC). Estos viales se almacenaron a temperatura ambiente (~22 °C), temperatura de refrigerador (+4 °C) o congelador (-20 °C o -80 °C), según se indica. En diversos momentos, como se indica, los viales de muestra se descongelaron, el material liofilizado se solubilizó en agua y se sembró en placas para determinar la viabilidad. Se muestra en la figura el % de viabilidad determinado (recuento de UFC después de la reconstitución/recuento de UFC antes de la liofilización x 100).
La FIG. 2 muestra el porcentaje de viabilidad de SCHU S4 AclpB resuspendido en medio de liofilización, diluido en serie como se indica y sembrado en placas antes de la liofilización y 63 días después del almacenamiento a -80 °C. Se observó una modesta disminución de la viabilidad a los 63 días con los viales más diluidos, pero incluso a una dilución de 1:1000 todavía había un ~70 % de viabilidad retenida después de la liofilización inicial.
La FIG. 3 muestra las puntuaciones clínicas observadas en ratones BALB/c inmunizados por vía intradérmica con 1 x 105 UFC de AclpB liofilizadas durante 3 años y almacenadas a 4 °C, -20 °C o -80 °C. Las puntuaciones clínicas se determinan de la siguiente manera: 1 = saludable; 2 = ligera piloerección; 3 = ligera piloerección y disminución de la movilidad; 4 = ligera piloerección, disminución de la movilidad y encorvamiento; 5 = ligera piloerección, disminución de la movilidad, encorvamiento y escalofríos; 6 = muerto. El AclpB almacenado a 4 °C parece mostrar una toxicidad algo reducida, pero en general no hubo diferencias significativas en la puntuación clínica entre los animales vacunados con AclpB liofilizado durante 3 años y almacenados a 4 °C, -20 °C o -80 ° C. * indica un punto temporal que no se puntuó, por lo que los datos no están disponibles.
La FIG. 4 muestra los niveles de AclpB en tejidos de ratones BALB/c 4 días después de la inmunización intradérmica con 1 x 105 UFC de AclpB liofilizadas durante 3 años y almacenadas a 4 °C, -20 °C o -80 °C.
La FIG.5A muestra la reactogenicidad de la piel en el sitio de inmunización observada en ratones BALB/c inmunizados por vía intradérmica con 1 x 105 UFC de AclpB liofilizadas durante 3 años y almacenadas a 4 °C, -20 °C o -80 °C. * denota p<0,5 (Kruskal-Wallis con corrección de Tukey para comparaciones múltiples). La FIG. 5B muestra la tabla de puntuación de la reacción cutánea de Francisella utilizada para la puntuación.
La FIG.6 muestra la supervivencia de ratones expuestos por vía intranasal a bacterias SCHU S4, 6 semanas después de la inmunización intranasal con 1 x 104 UFC de AclpB liofilizadas durante 3 años y almacenadas a 4 °C, -20 °C o -80 °C. Las diferencias entre las curvas de supervivencia no fueron estadísticamente significativas por la prueba de Mantel-Cox.
La FIG. 7 muestra la supervivencia de ratones después de la inmunización intradérmica con 1 x 105 UFC de AclpB liofilizadas durante 3 años y almacenadas a 4 °C, -20 °C o -80 °C y expuestos por vía intranasal (IN) a SCHU S4 seis semanas después.
La FIG. 8 muestra el nivel de bacterias SCHU S4 que quedan en los órganos de ratones después de la inmunización intradérmica (ID) o intranasal (IN) con 1 x 105 UFC de AclpB liofilizadas durante 3 años y almacenadas a 4 °C, -20 °C o -80 °C y expuestos a SCHU S4 seis semanas después.
Descripción detallada
Definiciones
Como se usa en el presente documento, las formas singulares "un", "un" y "el/la" incluyen referencias en plural a menos que el contenido dicte claramente lo contrario.
Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" se refiere a un valor que está dentro de los límites de error de la medición o determinación experimental. Por ejemplo, dos valores que están separados entre sí por aproximadamente 1 %, aproximadamente 2 %, aproximadamente 3 %, aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 15 % o aproximadamente 20 %, después de corregir el error estándar, pueden considerarse que son "casi iguales" o "similares". En algunas realizaciones, "aproximadamente" se refiere a una variación de ±20 %, ±10 %, ±5 %, ±3 %, ±2 % o ±1 % del valor especificado, según corresponda para realizar los métodos divulgados o para describir las composiciones y métodos divulgados, como entenderá el experto en la materia.
Por el término "atenuación" o "atenuado", se entiende que un patógeno se mantiene vivo, pero exhibe una virulencia reducida de tal manera que no causa la enfermedad causada por el patógeno virulento. La atenuación de una cepa particular puede ser el resultado de, p. ej., la inactivación del gen cIpB, o puede ser el resultado de otros mecanismos para la atenuación, por ejemplo, y sin limitación, mutagénesis, deleción o inactivación de genes diana, o atenuación natural, o una combinación de los mismos.
Por el término "cepa virulenta de F. tularensis", se entiende una cepa que puede causar cualquier enfermedad en el espectro denominado tularemia, ya sea leve o grave. Los ejemplos no limitativos de cepas virulentas de F. tularensis incluyen SCHU S4, FSC033, FSC108 y FSC200. En algunas realizaciones, una cepa mutante de F. tularensis puede tener mutaciones adicionales introducidas para atenuar aún más el patógeno (ya sea parcial o completamente) o para otro propósito.
Debe entenderse que los métodos y composiciones proporcionados en el presente documento pueden usarse para la preparación y/o almacenamiento de mutantes de F. tularensis, incluyendo mutantes de F. tularensis con cIpB inactivado. En algunas realizaciones, los mutantes de F. tularensis son cepas en las que el gen clpB ha sido eliminado (mutantes AclpB). En algunas realizaciones, un mutante de F. tularensis AclpB es una cepa virulenta de tipo A (p. ej., SCHU S4). En algunas realizaciones, un mutante de F. tularensis AclpB es una cepa de tipo B (p. ej., FSC200).
En una realización, la cepa muíante de F. tularensis es SCHU S4 úelpB, tal como, sin limitación, la cepa depositada en la Colección de Cultivos de la Universidad de Gotemburgo (CCUG; Academia Sahlgrenska de la Universidad de Gotemburgo, Box 7193, SE-402 34, Gotemburgo, Suecia) y de número de acceso concedido CCUG 59672.
Un gen puede "inactivarse" de cualquier manera adecuada conocida en la materia. Por ejemplo, y sin ánimo de ser limitativo, el gen cIpB se puede inactivar usando métodos conocidos en la materia, por ejemplo, mediante su deleción total o parcial de la cepa de F. tularensis, mediante una mutación de inactivación tal como una sustitución de múltiples nucleótidos, o mediante una inserción de inactivación tal como una inserción de transposón. Además, la inactivación del gen cIpB puede dar como resultado la atenuación total o parcial de una cepa mutante de F. tularensis.
La "liofilización", también conocida como "secado por congelación", es un proceso usado para conservar material biológico, tal como vacunas, bacterias y proteínas, mediante la retirada del agua de la muestra, lo que típicamente implica primero congelar la muestra y luego secarla, a vacío, a muy bajas temperaturas. Los métodos de liofilización son bien conocidos en la materia. Debe entenderse que puede usarse cualquier procedimiento de liofilización estándar conocido en la materia con las composiciones y los métodos proporcionados en el presente documento; está dentro de las capacidades de los expertos en la materia seleccionar los procedimientos para la liofilización.
Como se usa en el presente documento, los términos "medio de liofilización" y "matriz de liofilización" se usan indistintamente para referirse a una composición en la que las muestras (por ejemplo, bacterias) se suspenden antes de someterse al proceso de secado por congelación. Las bacterias generalmente se resuspenden en un medio de liofilización antes de la liofilización usando procedimientos estándares, como se conocen en la materia. Típicamente, un medio de liofilización adecuado para bacterias ayudará a mantener su viabilidad a través del proceso de secado por congelación y posterior almacenamiento, por ejemplo, estabilizando las células y/o ayudando a retener la estructura de las biomoléculas.
Como se usa en el presente documento, "viabilidad" se refiere al número de bacterias vivas o al porcentaje de bacterias vivas frente a muertas en una muestra antes de la congelación, después de la congelación pero antes de la liofilización, o después de la liofilización y el almacenamiento durante períodos de hasta 3 años. La viabilidad a menudo se proporciona como un porcentaje, en referencia al porcentaje de bacterias en una muestra que están vivas después del tratamiento (p. ej., congelación o liofilización) en comparación con la cantidad de bacterias viables antes de tal tratamiento. Como alternativa, la viabilidad puede proporcionarse en el presente documento como el número de unidades formadoras de colonias (UFC) en una muestra tratada dividida por las UFC antes de dicho tratamiento. En la materia se conocen muchos métodos para determinar la viabilidad de una muestra bacteriana y se puede usar cualquier técnica o ensayo reconocido en la materia. En algunas realizaciones, la viabilidad posterior a la liofilización se determina como el recuento de UFC después de la reconstitución/recuento de UFC antes de la liofilización x 100.
Los términos "conservación de la viabilidad" y "estabilidad de la viabilidad" se usan en el presente documento para indicar que la viabilidad no cambia sustancialmente. Tal como se usa en el presente documento, viabilidad "sustancialmente sin cambios" significa que la viabilidad es aproximadamente la misma, por ejemplo, dentro de aproximadamente el 10 % o aproximadamente el 20 % de los valores iniciales, o que hay una pérdida de no más de aproximadamente 0,5 log10 UFC, aproximadamente 1 log10 UFC, o aproximadamente 2 log10 UFC. En algunas realizaciones, en el contexto de una vacuna, viabilidad "sustancialmente sin cambios" significa que la viabilidad se mantiene en un nivel suficiente para la utilidad como vacuna, por ejemplo, que se mantiene la inmunogenicidad. La conservación de un cierto nivel de viabilidad significa que se mantiene un cierto nivel de células viables en una muestra en relación con el nivel de células viables presentes en un punto de partida, por ejemplo, antes de un tratamiento (por ejemplo, liofilización) y/o antes del paso del tiempo. Por ejemplo, una conservación del 50 % de viabilidad significa que al menos el 50 % de las células de la muestra permanecen vivas, en relación con el número de células vivas en un punto de partida. La conservación de la viabilidad después de la liofilización puede evaluarse evaluando la viabilidad del cultivo después de la liofilización en comparación con la viabilidad del cultivo inmediatamente antes de la liofilización. La conservación de la viabilidad después de la liofilización significa que la viabilidad del cultivo es un porcentaje dado, o superior, de la viabilidad del cultivo inmediatamente antes de la liofilización. Por ejemplo, una conservación de la viabilidad del 35 % significa que el 35 % de las células permanecen vivas después de la liofilización en relación con la población inicial de células viables inmediatamente antes de la liofilización. Como otro ejemplo, si la viabilidad inicial de una muestra inmediatamente después de la liofilización es del 80 %, en relación con la viabilidad de la muestra inmediatamente antes de la liofilización, una conservación del 50 % de viabilidad en un punto temporal dado significa que se mantiene una viabilidad de al menos el 40 %, relativa a la viabilidad de la muestra inmediatamente antes de la liofilización, en ese punto temporal.
En el contexto de una cepa o una vacuna de F. tularensis, "estabilidad" significa que se mantiene la inmunogenicidad y/o que la viabilidad no cambia sustancialmente, por ejemplo, que el título bacteriano es suficiente para un uso eficaz como vacuna contra la tularemia en un sujeto.
Como se usa en el presente documento, el almacenamiento "a largo plazo" se usa para referirse al almacenamiento durante un período prolongado de tiempo. Sin pretender limitar el término, generalmente se refiere al almacenamiento durante al menos varios meses (por ejemplo, aproximadamente o al menos 2 meses, aproximadamente o al menos 3 meses, aproximadamente o al menos 6 meses), o aproximadamente o al menos un año, aproximadamente o al menos dos años, aproximadamente o al menos tres años, o más.
Composiciones y métodos farmacéuticos
En el presente documento se proporcionan composiciones y métodos para la prevención o mejora de la tularemia en un sujeto que comprenden cepas de F. tularensis preparadas y/o almacenadas como se describe en el presente documento. Se proporcionan también composiciones y métodos para inducir una respuesta inmune a F. tularensis. Los métodos proporcionados en el presente documento comprenden la administración de una cepa de F. tularensis preparada y/o almacenada como se describe en el presente documento a un sujeto en una cantidad efectiva para inducir una respuesta inmune contra F. tularensis, reduciendo, eliminando, mejorando o previniendo de ese modo la tularemia. Las composiciones y los métodos proporcionados también se pueden usar para la generación de anticuerpos para usar en la inmunización pasiva contra la tularemia y el tratamiento de la misma.
Una cepa de F. tularensis preparada y/o almacenada usando las composiciones y los métodos proporcionados en el presente documento se puede usar por tanto para vacunar a un sujeto, administrar a un sujeto para prevenir o tratar la tularemia, etc., como se describe más adelante en el presente documento. El experto en la materia entenderá que la cepa liofilizada proporcionada en el presente documento generalmente se reconstituirá en forma líquida antes de la administración a un sujeto. Por ejemplo, una cepa liofilizada se puede reconstituir en un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable y/o en un medio de liofilización adecuado para la administración. Debe entenderse que la referencia a la administración o el uso de una cepa liofilizada en el presente documento pretende incluir la administración o el uso de una cepa que fue liofilizada y/o almacenada en un estado liofilizado como se describe en el presente documento, y que ha sido reconstituida en una forma adecuada para la administración. En una realización, una cepa liofilizada proporcionada en el presente documento se reconstituye en agua antes de la administración a un sujeto.
De manera similar, la dosificación para la administración dependerá de diversos factores, incluido el tamaño del sujeto y las especificaciones de la composición formulada, y como se discute más adelante. Basado en la experiencia con LVS, y sin ánimo de limitar de ninguna manera, puede usarse una dosis de aproximadamente 107 UFC en algunos casos para la administración a humanos. Estaría dentro de las capacidades de los expertos en la materia determinar las dosificaciones apropiadas para la vacunación.
Los términos "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un sujeto que necesita prevención para la tularemia. Un sujeto puede ser un vertebrado, tal como un mamífero, por ejemplo, un ser humano, un primate no humano, un conejo, una rata, un ratón, una vaca, un caballo, una cabra u otro animal. Los animales incluyen todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como ratones, ovejas, perros, vacas, especies de aves, patos, gansos, cerdos, pollos, anfibios y reptiles. En una realización, un sujeto es un ser humano.
"Tratar" o "tratamiento" se refiere a (i) la prevención de infección o reinfección, por ejemplo, profilaxis, o (ii) la reducción o eliminación de los síntomas de la enfermedad de interés, por ejemplo, terapia. "T ratar" o "tratamiento" puede referirse a la administración de una composición que comprende una cepa vacunal de F. tularensis preparada y/o almacenada como se describe en el presente documento, o a la administración de anticuerpos generados contra estas cepas vacunales de F. tularensis. El tratamiento de un sujeto puede prevenir o reducir el riesgo de infección y/o inducir una respuesta inmune a F. tularensis.
El tratamiento puede ser profiláctico (p. ej., para prevenir o retrasar la aparición de la enfermedad, para prevenir la manifestación de síntomas clínicos o subclínicos de la misma, o para prevenir la recurrencia de la enfermedad) o terapéutico (p. ej., supresión o alivio de los síntomas después de la manifestación de la enfermedad). "Prevenir" o "prevención" se refiere a la administración profiláctica o vacunación con una cepa vacunal de F. tularensis preparada y/o almacenada como se describe en el presente documento o composiciones de la misma a un sujeto que no ha sido infectado o que no presenta síntomas y/o está en riesgo de infección.
Como se usa en el presente documento, el término "respuesta inmune" se refiere a la respuesta de las células del sistema inmunitario a estímulos externos o internos (p. ej., antígenos, receptores de superficie celular, citocinas, quimiocinas y otras células) que producen cambios bioquímicos en las células inmunitarias que dan como resultado migración de células inmunitarias, destrucción de células diana, fagocitosis, producción de anticuerpos, producción de efectores solubles de la respuesta inmune y similares. Una molécula "inmunogénica" es aquella que es capaz de producir una respuesta inmune en un sujeto después de la administración.
"Inmunización activa" se refiere al proceso de administrar un antígeno (p. ej., una molécula inmunogénica, p. ej., una cepa vacunal de F. tularensis descrita en el presente documento) a un sujeto con el fin de inducir una respuesta inmune. Por el contrario, "inmunización pasiva" se refiere a la administración de inmunidad humoral activa, habitualmente en forma de anticuerpos preformados, a un sujeto. La inmunización pasiva es una forma de inmunización a corto plazo que puede lograrse mediante la administración de un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Los anticuerpos se pueden administrar en varias formas posibles, por ejemplo, como suero o plasma sanguíneo humano o animal, como inmunoglobulina animal o humana combinada, como anticuerpos humanos o animales de alto título de sujetos inmunizados o de donantes que se recuperan de una enfermedad, como anticuerpos policlonales, o como anticuerpos monoclonales. Típicamente, la inmunidad derivada de la inmunización pasiva proporciona protección o tratamiento inmediatos, pero puede durar solo un breve período de tiempo.
Como se usa en el presente documento, "tularemia" se refiere a todas las enfermedades asociadas a F. tularensis, es decir, enfermedades causadas por infección por F. tularensis.
En algunas realizaciones, se proporcionan composiciones y métodos para la inmunización activa contra la tularemia. Se proporcionan composiciones y métodos para inducir una respuesta inmune a bacterias F. tularensis en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto una cepa vacunal de F. tularensis preparada y/o almacenada como se describe en el presente documento, opcionalmente en presencia de un adyuvante, en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmune en el sujeto. En una realización, se proporciona una composición que comprende una cantidad inmunizante eficaz de una cepa vacunal de F. tularensis como se proporciona en el presente documento y un adyuvante, en el que la composición es eficaz para prevenir o tratar la tularemia en un sujeto que lo necesite. En una realización, no se requiere un adyuvante, es decir, se proporcionan composiciones y métodos para inducir una respuesta inmune a bacterias F. tularensis en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto una cepa vacunal de F. tularensis tal como se proporciona en el presente documento y un portador, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable, en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmune en el sujeto.
Los adyuvantes generalmente aumentan la especificidad y/o el nivel de respuesta inmune. Un adyuvante puede así reducir la cantidad de antígeno necesaria para inducir una respuesta inmune y/o la frecuencia de inyección necesaria para generar una respuesta inmune suficiente para beneficiar al sujeto. Cualquier compuesto o compuestos que actúen para aumentar una respuesta inmune a un antígeno y que sean adecuados para usar en un sujeto (p. ej., farmacéuticamente aceptables) pueden usarse como adyuvante en composiciones, vacunas y métodos de la invención. En algunas realizaciones, el adyuvante puede ser la molécula portadora (por ejemplo, pero sin limitación, subunidad B de la toxina del cólera, liposoma, etc.) en un antígeno conjugado o recombinante. En realizaciones alternativas, el adyuvante puede ser una molécula no relacionada que se sabe que aumenta la respuesta del sistema inmunitario (por ejemplo, pero sin limitación, vectores bacterianos o víricos atenuados, AMVAD, etc.). En una realización, el adyuvante puede ser uno que genere una fuerte respuesta inmune de la mucosa tal como un virus atenuado o bacterias, o sales de aluminio.
Los ejemplos de un adyuvante incluyen, pero no se limitan a, toxina del cólera, enterotoxina termolábil de E. coli, liposoma, complejo inmunoestimulante (ISCOM), secuencias inmunoestimulantes de oligodesoxinucleótido e hidróxido de aluminio. La composición también puede incluir un polímero que facilite el suministro in vivo (Véase, por ejemplo, Audran R. y col. Vaccine 21:1250-5, 2003; y Denis-Mize y col., Cell Immunol., 225:12-20, 2003). Otros adyuvantes adecuados son bien conocidos por los expertos en la materia. Como alternativa, en algunas realizaciones, se usan las cepas vacunales de F. tularensis que se proporcionan en el presente documento en vacunas contra la tularemia sin adyuvante adicional.
Las cepas vacunales de F. tularensis que se proporcionan en el presente documento pueden combinarse con un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable para formar una composición farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto. Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden incluir un compuesto fisiológicamente aceptable que actúa, por ejemplo, para estabilizar, aumentar o disminuir la tasa de absorción o aclaramiento de una composición farmacéutica. Generalmente, un portador farmacéuticamente aceptable debe ser compatible con el ingrediente activo de la composición, opcionalmente capaz de estabilizar el ingrediente activo y no perjudicial para el sujeto a tratar. Los compuestos fisiológicamente aceptables pueden incluir, por ejemplo, agua, solución salina tamponada con fosfato, una solución de bicarbonato, carbohidratos tales como glucosa, sacarosa o dextranos, antioxidantes tales como ácido ascórbico o glutatión, agentes quelantes, proteínas de bajo peso molecular, composiciones que reducen el aclaramiento o hidrólisis de glicopéptidos, o excipientes u otros estabilizadores y/o tampones. Otros compuestos fisiológicamente aceptables incluyen agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes dispersantes o conservantes que son particularmente útiles para prevenir el crecimiento o la acción de microorganismos. Diversos conservantes son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, fenol y ácido ascórbico. También se pueden usar detergentes para estabilizar o aumentar o disminuir la absorción de la composición farmacéutica, incluidos los portadores liposómicos. Los portadores y formulaciones farmacéuticamente aceptables son conocidos por el experto en la materia y se describen en detalle en la bibliografía científica y de patentes, véase, por ejemplo, la última edición de Remington’s Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania. ("Remington"). Un experto en la materia apreciaría que la elección de un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable que incluya un compuesto fisiológicamente aceptable depende, por ejemplo, del modo y la vía de administración de la vacuna, la composición o la cepa bacteriana de la invención, y de sus características fisicoquímicas particulares. En algunas realizaciones, las cepas de vacunas de F. tularensis liofilizadas que se proporcionan en el presente documento se combinan con agua para formar una composición farmacéutica adecuada para la administración a un sujeto.
Las composiciones y vacunas de la presente invención pueden administrarse por cualquier medio adecuado, por ejemplo, por vía oral, tal como en forma de píldoras, comprimidos, cápsulas, gránulos o polvos; por vía sublingual; por vía bucal; por vía parenteral, tal como por inyección subcutánea, intradérmica, intranasal, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o intraesternal o usando técnicas de infusión (por ejemplo, como soluciones o suspensiones acuosas o no acuosas inyectables estériles); por vía nasal, tal como por inhalación en aerosol, aerosol, neblina o nebulizador; por vía tópica, tal como en forma de crema, ungüento, pomada, polvo o gel; por vía transdérmica, tal como en forma de parche; por vía transmucosa; o por vía rectal, tal como en forma de supositorios. Las presentes composiciones también pueden administrarse en una forma adecuada para liberación inmediata o liberación prolongada. La liberación
inmediata o prolongada puede lograrse mediante el uso de composiciones farmacéuticas adecuadas o, particularmente en el caso de liberación prolongada, mediante el uso de dispositivos tales como implantes subcutáneos o bombas osmóticas.
En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento pueden administrarse por vía parenteral, por ejemplo, mediante inyección subcutánea, intradérmica o intramuscular, o usando otros modos de administración, tales como supositorios y formulaciones orales. Para los supositorios, los aglutinantes y portadores pueden incluir, por ejemplo, polialcalenglicoles o triglicéridos. Las formulaciones orales pueden incluir excipientes empleados normalmente tales como grados farmacéuticos de sacarina, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos. Las composiciones se pueden preparar como productos finales para inyecciones, como soluciones líquidas o emulsiones, por ejemplo (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N.° 4.601.903, 4.599.231,4.599.230 y 4.596.792).
A menudo es ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de unidades de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. La forma de unidad de dosificación se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico o inmunogénico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La unidad de dosificación se puede alojar dentro de un recipiente, como un vial, una botella o una ampolla.
En una realización, una composición o vacuna se prepara como inyectable, ya sea como una solución o suspensión líquida, o como una forma sólida que es adecuada para solución o suspensión en un vehículo líquido antes de la inyección. En otra realización, se prepara una composición o vacuna en forma sólida, emulsionada o encapsulada en un vehículo liposómico u otro portador particulado usado para el suministro sostenido. Por ejemplo, una vacuna puede estar en forma de emulsión de aceite, emulsión de agua en aceite, emulsión de agua en aceite en agua, emulsión de sitio específico, emulsión de larga duración, emulsión pegajosa, microemulsión, nanoemulsión, liposoma, micropartícula, microesfera, nanoesfera o nanopartícula. Una vacuna puede incluir un polímero hinchable tal como un hidrogel, un polímero reabsorbible tal como el colágeno o ciertos poliácidos o poliésteres tales como los que se usan para hacer suturas reabsorbibles, que permiten la liberación sostenida de una vacuna.
Se entenderá que el nivel de dosis específico y la frecuencia de dosificación para cualquier sujeto en particular pueden variar y pueden depender de una variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto específico empleado, la estabilidad metabólica y la duración de la acción de ese compuesto, la especie , edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del sujeto, el modo y tiempo de administración, la velocidad de excreción y aclaramiento, combinaciones de fármacos y la gravedad de la afección particular.
Kits
Se proporcionan kits para prevenir o tratar la tularemia, que comprenden una o más cepas vacunales, composiciones y/o vacunas de F. tularensis como se describen en el presente documento. Las instrucciones de uso o para llevar a cabo los métodos descritos en el presente documento también se pueden proporcionar en un kit. Un kit puede incluir además reactivos, disolventes, tampones, adyuvantes, etc. adicionales, necesarios para llevar a cabo los métodos descritos en el presente documento. Por ejemplo, un kit puede comprender un medio de liofilización que comprende: manitol, un disacárido seleccionado de sacarosa, trehalosa y una mezcla de sacarosa y trehalosa, y gelatina en una relación en peso de 1 manitol: 1 disacárido: 0,25 gelatina; un medio de liofilización que comprende 1 % de manitol, 1 % de disacárido seleccionado de sacarosa, trehalosa y una mezcla de sacarosa y trehalosa, y 0,25 % de gelatina en tampón fosfato; un medio de liofilización que comprende 1 % de manitol, 1 % de sacarosa y 0,25 % de gelatina en tampón fosfato 10 mM pH 7,2; y/o los reactivos manitol, sacarosa y/o trehalosa, y gelatina en una relación en peso de 1 manitol: 1 disacárido (sacarosa, trehalosa o una mezcla de sacarosa y trehalosa): 0,25 gelatina.
EJEMPLOS
La presente invención se entenderá más fácilmente con referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan para ilustrar la invención y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la misma de ninguna manera.
A menos que se definan de otro modo o que el contexto indique claramente lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la materia a la que pertenece esta invención. Debe entenderse que cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento puede usarse en la práctica o prueba de la presente tecnología.
Procedimientos generales para el ensayo de matrices de liofilización.
Para el ensayo de matrices de liofilización en los ejemplos a continuación, se cultivaron pequeños volúmenes de mutantes F. tularensisñelpBen medio definido de Chamberlain (CDM) (Chamberlain, R. E., Appl. Microbiol. 1965, 13: 232-5) o medio líquido hidrolizado parcial de caseína modificada (MCPH) (Karlsson, J. y col., Microb. Comp. Genomics 2000, 5(1): 25-39; Chamberlain, R. E., Appl. Microbiol. 1965, 13: 232-5). A continuación, los cultivos se sedimentaron mediante centrifugación y se resuspendieron en un volumen igual de diversas matrices de liofilización.
Para volúmenes mayores (por ejemplo, a partir de 25 litros de SCHU S4 ñclpB crecido en un termentador), la filtración de flujo tangencial podría usarse para intercambiar el medio de crecimiento con la matriz de liofilización. Después de eso, las cepas ñcipB se liofilizaron de la siguiente manera:
Se sedimentaron cultivos de ñcipB y se resuspendieron en (un volumen igual) de matriz de liofilización. Se dispensaron alícuotas de dos ml en viales de vidrio de 10 ml y se colocaron sin apretar tapones de goma ranurados en la parte superior. Los viales se colocaron en los estantes de la cámara superior de un liofilizador Lyph-Lock de 6 litros (Labconco, Kansas City, MO) a temperatura ambiente. A continuación, la temperatura de la cámara superior se redujo lentamente desde la temperatura ambiente hasta -40 °C durante 60-90 minutos. La temperatura se mantuvo a -40 °C durante 1 hora más para permitir que las muestras se congelaran. Luego se encendió la bomba de vacío hasta que se estabilizó la lectura del sistema (habitualmente 5-10 M BAR x 10-3). La temperatura de la cámara superior se elevó luego a -10 °C mientras que la cámara inferior permanecía a -40 °C. A continuación, el sistema se hizo funcionar durante la noche durante 18-19 horas en estas condiciones (secado primario). Al día siguiente se ajustó la temperatura de la cámara superior a 20 °C durante un período de aproximadamente 45 minutos, luego se dejaron secar las muestras durante otras dos horas (secado secundario). Después del secado secundario, los viales se sellaron a vacío elevando la vejiga por debajo de los estantes de la cámara superior. Se apagó el vacío y los viales a almacenar se taparon con tapones metálicos. Las muestras se reconstituyeron con 2 ml de agua estéril y se colocaron en placas en los medios apropiados para determinar el recuento de bacterias viables después de la liofilización y el almacenamiento hasta durante 3 años. Esto se comparó con el recuento de bacterias viables de la resuspensión original para determinar el porcentaje de pérdida después de la liofilización.
Como se informa más adelante, las bacterias ensayadas perdieron aproximadamente un 50 % de viabilidad después de la liofilización en manitol al 1 %, sacarosa al 1 %, gelatina al 0,25 % en tampón fosfato 10 mM, pero luego permanecieron estables durante al menos 1 año si se almacenan a 4 °C o menos, y durante al menos 3 años si se almacenan a -20 °C o menos. Por el contrario, las mismas bacterias liofilizadas mantenidas a temperatura ambiente (22 °C) habían perdido prácticamente toda viabilidad el día 105 de almacenamiento. Además, se mostró que diluir las bacterias 100 veces conservaba la viabilidad de ~ 50 % inmediatamente después de la liofilización y durante al menos 3 años después.
Ejemplo 1. Viabilidad de diversas cepas de
F. tularensis
después de la liofilización.
En primer lugar, se ensayó una matriz de liofilización comercial denominada "Microbial freeze drying buffer” (MFDB) de OPS Diagnostics LLC, NJ. El MFDB es una solución de liofilización de uso general para usar cuando no se necesita una alta viabilidad (p. ej., para el almacenamiento a largo plazo de cultivos iniciadores) y no es adecuado para uso clínico. Sin embargo, se ensayó para dar una idea de las condiciones necesarias para liofilizar cepas vacunales vivas de F. tularensis con alta viabilidad después de un almacenamiento prolongado. Se usó MFDB con varias cepas atenuadas de F. tularensis y dos medios de crecimiento diferentes (Tabla 1). Como se muestra en la Tabla 1, solo SCHUS4ñclpB cultivadas en medio de hidrolizado parcial de caseína modificado (MCPH) y liofilizadas en MFDB dieron como resultado una viabilidad prolongada cuando se almacenaron a -80 °C. Todas las cepas cultivadas en medio definido de Chamberlain (CDM) sobrevivieron a la liofilización con una viabilidad inaceptablemente baja.
Tabla 1. Viabilidad de diversas cepas de F. tularensis después de crecimiento en CDM o MCPH y liofilización en MFDB.
1 Cepa vacunal viva de F. tularensis.
2 CDM: medio definido de Chamberlain (líquido).
3 MFDB: Matriz de liofilización comercial para bacterias en general.
4 Recuento de UFC después de la reconstitución/recuento de UFC antes de la liofilización x 100.
5 FSC043: cepa naturalmente atenuada de SCHU S4.
6 MPCH: caldo de hidrolizado parcial de caseína modificada.
Dado que una matriz de liofilización no aprobada para uso humano podría conservar la viabilidad de SCHU S4AcIpB, se examinaron matrices alternativas usando únicamente excipientes clínicamente aceptables. Primero se ensayó sacarosa al 10 %, gelatina al 1,3 %, fosfato de potasio 10 mM, ya que esta mezcla se usó previamente para la producción de LVS clínica (Tabla 2). Sin embargo, sacarosa al 10 %, gelatina al 1,3 % no proporcionó una supervivencia satisfactoria de SCHU S4 AclpB, ni la sustitución de la sacarosa por manitol al 5 % (otro excipiente común de liofilización).
Tabla 2. Liofilización de SCHU S4 A cIpB en sacarosa o manitol.
Recuento de UFC después de la reconstitución/recuento de UFC antes de la liofilización x 100.
A continuación, se examinó si añadir trehalosa al propio medio de crecimiento mejoraría la supervivencia después de la liofilización (Tabla 3). La trehalosa no afectaba la supervivencia, aunque la supervivencia de las bacterias cultivadas únicamente en MCPH antes de la liofilización mostraba un aumento de dos veces en la viabilidad en comparación con las pruebas anteriores.
Tabla 3. Efecto de la adición de trehalosa al medio de cultivo sobre la viabilidad de SCHU S4 A cIpB después de la liofilización.
1Recuento de UFC después de la reconstitución/recuento de UFC antes de la liofilización x 100.
A continuación, se ensayaron diversas relaciones de sacarosa y manitol (Tabla 4). La alteración en un 1 % de la relación de cualquiera de los azúcares causó una disminución notable de la viabilidad después de la liofilización, sin un patrón evidente.
Tabla 4. Efecto de la relación de manitol:sacarosa sobre la viabilidad de SCHU S4 ú clpBdespués de la liofilización.
A continuación, la sacarosa se reemplazó por trehalosa (Tabla 5), ya que la trehalosa había sido usada por otros para la liofilización y el almacenamiento a corto plazo de LVS. La alteración en más del 1 % de cualquiera de los azúcares fue perjudicial para la supervivencia después de la liofilización. La supervivencia de SCHU S4AclpB con manitol al 1 % sacarosa al 1 % o trehalosa al 1 % fue similar.
Tabla 5. Efecto de las relaciones de manitol: trehalosa sobre la viabilidad de SCHU S4 ú cIpB después de la liofilización.
1 Recuento de UFC después de la reconstitución/recuento de UFC antes de la liofilización x 100.
Se ensayó el efecto de añadir gelatina a una mezcla de liofilización de manitol al 1 %:sacarosa al 1 %, con cantidades variables de gelatina. La gelatina se había usado previamente en dos preparaciones distintas de LVS para vacunación humana (Tabla 6).
Tabla 6. Efecto de diferentes concentraciones de gelatina sobre la viabilidad de SCHU S4 ú cIpB después de la liofilización.
1 Recuento de UFC después de la reconstitución/recuento de UFC antes de la liofilización x 100.
Dado que cantidades más bajas de gelatina parecían conservar mejor la viabilidad, la gelatina se ensayó a continuación en un intervalo más bajo (Tabla 7).
Tabla 7. Efecto de concentraciones muy bajas de gelatina sobre la viabilidad de SCHU S4 A clpB después de la liofilización.
1Recuento de UFC después de la reconstitución/recuento de UFC antes de la liofilización x 100.
A continuación, se determinó si el momento de recogida de SCHU S4 A cIpB del matraz de crecimiento en MCPH tenía un efecto sobre la viabilidad después de la liofilización y la resuspensión. En todos los casos, la viabilidad era mayor en presencia que en ausencia de gelatina al 0,25 % (Tabla 8). Este experimento se repitió parcialmente usando los puntos temporales 18h y 21 h para recoger AcIpB del caldo MCPH, con resultados similares de > 55% de viabilidad (Tabla 9). El material liofilizado estaba a una concentración de ~1x1010 UFC/ml, y tuvo que ser diluido a 6-8 log10 para recuentos de colonias manejables. Por tanto, las viabilidades informadas podrían subestimarse de manera conservadora, dado el potencial de errores de pipeteo en un intervalo de dilución tan grande.
Tabla 8. Efecto de la gelatina y el momento de recogida sobre la viabilidad de SCHU S4 A cIpB después de la liofilización.
1 Recuento de UFC después de la reconstitución/recuento de UFC antes de la liofilización x 100.
Tabla 9. Efecto de la gelatina y el momento de recogida sobre la viabilidad de SCHU S4 ú clpB después de la liofilización.
1Recuento de UFC después de la reconstitución/recuento de UFC antes de la liofilización x 100.
Se sabe que las suspensiones de bacterias por choque en frío pueden potenciar la viabilidad después de la liofilización. Por lo tanto, se determinó si esto supondría una diferencia en presencia o ausencia de gelatina o trehalosa (Tabla 10). En este caso, el choque en frío se logró enfriando durante 1 h a 4 °C con agitación. De nuevo, la adición de gelatina al 0,25 % a bacterias no sometidas a choque en frío resuspendidas en tampón fosfato 10 mM que contenía manitol al 1 % y sacarosa al 1 % daba como resultado una viabilidad de aproximadamente el 50 % después de la liofilización.
Tabla 10. Efecto del choque en frío y la adición de gelatina o trehalosa sobre la viabilidad de SCHU S4 ú cIpB después de la liofilización.
1 Recuento de UFC después de la reconstitución/recuento de UFC antes de la liofilización x 100
A continuación, se ensayó la necesidad de tampón fosfato 10 mM en la matriz de liofilización. Como se puede ver claramente, el tampón fosfato 10 mM tenía un efecto significativo para conservar la viabilidad de úcIpB a todas las diluciones (Tabla 11).
Tabla 11. Efecto del tampón fosfato 10 mM sobre la viabilidad de SCHU S4 ú cIpB después de la liofilización.
1Recuento de UFC después de la reconstitución/recuento de UFC antes de la liofilización x 100.
A continuación, las bacterias liofilizadas se cultivaron en MCPH, se sedimentaron mediante centrifugación y se resuspendieron en tampón fosfato 10 mM que contenía manitol al 1 %, sacarosa al 1 % y gelatina al 0,25 %. Estos viales se almacenaron a temperatura ambiente (~22 °C), de refrigerador (+4 °C) o congelador (-20 °C o -80 °C). En diversos momentos, los viales de muestra se descongelaron y se determinó la viabilidad como se muestra en la FIG.
1. Este experimento mostró que SCHU S4úcIpB podía almacenarse durante al menos un año a 4 °C o menos y aún
conservar esencialmente el 100 % de su viabilidad posterior a la liofilización original cuando se almacena bajo cero, o ~70 % de su viabilidad posterior a la liofilización original cuando se almacena a temperatura de refrigeración. La concentración de bacterias en este experimento era de 2,0 x 1010 UFC/ml, lo que representa aproximadamente 400 dosis equivalentes en humanos de LVS, una cantidad que es potencialmente aceptable para una vacuna desarrollada para uso de emergencia.
Luego se determinó si el procedimiento de liofilización antes mencionado funcionaría cuando las bacterias se diluyeran a una sola dosis/vial. Los resultados se muestran en la FIG. 2. Se observó una modesta disminución de la viabilidad a los 63 días con los viales más diluidos, pero incluso a una dilución de 1:1000 todavía había un ~70 % de viabilidad retenida después de la liofilización inicial.
A continuación, se determinó si la matriz de liofilización optimizada podría usarse para otras cepas de F. tularensis, empezando con F. tularensis cepa LVS (Tabla 12). Se realizó una comparación conjunta de medios de liofilización comerciales (MFDB), medios de liofilización que tienen manitol al 1 %, sacarosa al 1 % y gelatina al 0,25 %, y uno de los medios de liofilización originales usados para LVS (mayor cantidad de sacarosa (10 %) y gelatina (1,3 %) pero sin manitol) (Tabla 12). En comparación con LVS cultivada en medio definido de Chamberlain (Tabla 1), la LVS cultivada en MCPH sobrevivía mucho mejor a la liofilización en MFDB. Sin embargo, su viabilidad era menor que para SCHU S4 ñelpB usando la matriz de liofilización optimizada.
Tabla 12. Capacidad de la matriz de liofilización optimizada para conservar la viabilidad de LVS.
1 Recuento de UFC después de la reconstitución/recuento de UFC antes de la liofilización x 100.
Para determinar si se obtendrían los mismos resultados con otras cepas de F. tularensis subespecie holarctica, se repitió el experimento anterior con FSC200úcIpB. Para esta cepa, el momento de la recogida parecía tener un impacto importante sobre la supervivencia de las bacterias después de la liofilización y la resuspensión (Tabla 13). Además, en este caso, el MFDB tenía un desempeño deficiente en comparación con los resultados obtenidos con LVS o FSC237AclpB.
Tabla 13. Capacidad de la matriz de liofilización optimizada para conservar la viabilidad de FSC200 ú cIpB.
1 Recuento de UFC después de la reconstitución/recuento de UFC antes de la liofilización x 100.
Finalmente, se determinó si el medio de liofilización de fosfato 10 mM con manitol al 1 %, sacarosa al 1 % y gelatina al 0,25 %, se podía utilizar en SCHU S4 úclpB generado bajo condiciones estándares de fabricación. Con este fin, se descongelaron 2,0 ml de una reserva congelada y se usó para inocular 1 litro de caldo MCPH fresco en un matraz deflector de 4 litros. El matraz se incubó durante 18 h a 37 °C con agitación y luego se transfirieron 16,5 ml a un fermentador de 25 litros que contenía 22 litros de caldo MCPH fresco. Después de 22 h de crecimiento controlado, se retiraron 200 ml de SCHU S4úcIpB del fermentador. Se sedimentaron 50 ml de esta muestra mediante centrifugación, se resuspendieron en matriz de liofilización y se secaron por congelación puros o a una dilución de 1:100 y se
mantuvieron a 4 °C, -20 °C o -80 °C durante 3 años. A la temperatura de almacenamiento más alta, había una pérdida de viabilidad de aproximadamente el 50 % en comparación con la viabilidad inicial posterior a la liofilización, pero a temperaturas de almacenamiento de -20 °C y -80 °C, se retenía esencialmente el 100 % de viabilidad (Tabla 14).
Además, las tres preparaciones de vacunas eran idénticas en cuanto a su seguridad y capacidad para proteger a los ratones de exposición intranasal a la cepa virulenta SCHU S4 (Figuras 3-8). La FIG. 3 muestra que el almacenamiento de la vacuna durante 3 años a cualquiera de las tres temperaturas antes mencionadas producía puntuaciones clínicas similares en ratones BALB/c inmunizados ID con 1x 105 UFC. La FIG. 4 muestra las cargas bacterianas de AclpB 4 días después de la vacunación ID con 1x 105 UFC. Las FIG. 5A y 5B muestran la puntuación de reactogenicidad de la piel en el sitio de inyección de los ratones representados en la FIG. 3. La FIG. 6 muestra que las tres preparaciones de la vacuna almacenadas durante 3 años tenían una letalidad similar para los ratones BALB/c cuando se administraban a una dosis de 1 x 104 UFC por la vía IN. La FIG. 7 muestra que los ratones inmunizados ID con 1 x 105 UFC de cualquiera de las tres preparaciones de vacunas estaban igualmente protegidos de una exposición IN posterior con 100 UFC de la cepa virulenta SCHU S442 días después, mientras que la FIG. 8 muestra que 28 días después de la exposición, los números residuales de SCHU S4 en los órganos diana del patógeno también eran similares.
Tabla 14. Capacidad de la matriz de liofilización optimizada para conservar la viabilidad a largo plazo.
1 Recuento de UFC después del almacenamiento/recuento de UFC inmediatamente después de la liofilización x 100
Claims (15)
1. Un medio de liofilización para secar por congelación una cepa de Francisella tularensis (F. tularensis), comprendiendo el medio de liofilización manitol, un disacárido y gelatina en una relación en peso de 1 manitol: 1 disacárido: 0,25 gelatina, en el que el disacárido se selecciona de sacarosa, trehalosa y una mezcla de sacarosa y trehalosa.
2. El medio de liofilización de la reivindicación 1, en el que el medio comprende 1 % de manitol, 1 % del disacárido y 0,25 % de gelatina en un tampón fosfato.
3. El medio de liofilización de la reivindicación 2, en el que el medio comprende 1 % de manitol, 1 % de sacarosa y 0,25 % de gelatina en tampón fosfato 10 mM, pH 7,2.
4. Un método para liofilizar una cepa vacunal viva de Francisella tularensis (F. tularensis) que comprende las etapas de:
a) suspender la cepa vacunal viva en el medio de liofilización de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y
b) secar por congelación la suspensión.
5. El método de la reivindicación 4, en el que la etapa a) comprende intercambiar un medio de crecimiento que contiene la cepa vacunal por el medio de liofilización.
6. El método de la reivindicación 5, en el que el medio de crecimiento se intercambia por el medio de liofilización usando filtración.
7. El método de la reivindicación 6, en el que el medio de crecimiento se intercambia por el medio de liofilización usando filtración de flujo tangencial.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en el que la cepa de F. tularensis es una cepa mutante en la que el gen cIpB se inactiva.
9. El método de la reivindicación 8, en el que la cepa mutante deriva de una cepa clínica de tipo silvestre de F. tularensis seleccionada del grupo consistente en SCHU S4, FSC033, FSC108 y FSC200.
10. El método de la reivindicación 8 y 9, en el que el gen cIpB se elimina.
11. El método de la reivindicación 10, en el que la cepa mutante es SCHU S4 ñclpB.
12. El método de la reivindicación 10, en el que la cepa mutante es FSC200 ñclpB.
13. El método de la reivindicación 10, en el que la cepa mutante es el número de depósito CCUG CCUG 59672.
14. Una vacuna para uso en la prevención o tratamiento de infección por F. tularensis y/o tularemia en un sujeto, en la que la vacuna comprende una cepa vacunal liofilizada producida según el método definido en una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 13.
15. Una cepa vacunal viva liofilizada para su uso en la prevención o el tratamiento de infección por F. tularensis y/o tularemia en un sujeto, estando la cepa vacunal viva liofilizada producida según el método definido en una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 13.
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Family Cites Families (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4596792A (en) | 1981-09-04 | 1986-06-24 | The Regents Of The University Of California | Safe vaccine for hepatitis containing polymerized serum albumin |
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| JPH09504429A (ja) | 1993-10-12 | 1997-05-06 | チロン ビアジーン，インコーポレイティド | 組換えウイルスの保存方法 |
| CN1053590C (zh) | 1998-10-19 | 2000-06-21 | 卫生部长春生物制品研究所 | 冻干甲型肝炎减毒活疫苗及其保护剂 |
| WO2000029018A1 (en) * | 1998-11-12 | 2000-05-25 | Changchun Institute Of Biological Products Ministry Of Public Health | Combined vaccine against both hav and measle virus and method of producing it |
| US20040044393A1 (en) * | 2002-08-27 | 2004-03-04 | Remon Medical Technologies Ltd. | Implant system |
| US20050131515A1 (en) * | 2003-12-16 | 2005-06-16 | Cully Edward H. | Removable stent-graft |
| US20050175630A1 (en) * | 2003-12-23 | 2005-08-11 | Eyal Raz | Immunogenic compositions and methods of use thereof |
| CA2502999A1 (en) * | 2005-04-20 | 2006-10-20 | National Research Council Of Canada | Mutant f. tularensis strain and uses thereof |
| EP2666508B1 (en) * | 2005-05-13 | 2019-07-24 | Boston Scientific Limited | Integrated stent repositioning and retrieval loop |
| US20070100414A1 (en) * | 2005-11-02 | 2007-05-03 | Cardiomind, Inc. | Indirect-release electrolytic implant delivery systems |
| CA2917512C (en) * | 2007-10-12 | 2025-08-05 | President And Fellows Of Harvard College | VACCINE NANOTECHNOLOGY |
| US8268354B2 (en) * | 2007-11-07 | 2012-09-18 | Aridis Pharmaceuticals | Sonic low pressure spray drying |
| WO2010124377A1 (en) * | 2009-04-29 | 2010-11-04 | National Research Council Of Canada | Mutants of francisella tularensis and uses thereof |
| CN101537186B (zh) * | 2009-04-30 | 2011-04-06 | 长春百克生物科技股份公司 | 一种不含明胶的疫苗冻干保护剂 |
| WO2014115306A1 (ja) * | 2013-01-25 | 2014-07-31 | テルモ株式会社 | ステントデリバリーデバイス |
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| US10828340B2 (en) * | 2015-06-09 | 2020-11-10 | Rebiotix, Inc. | Microbiota restoration therapy (MRT) compositions and methods of manufacture |
| US11224647B2 (en) * | 2016-08-01 | 2022-01-18 | The Regents Of The University Of California | Safe potent single platform vaccine against Tier 1 select agents and other pathogens |
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