ES2837840T3

ES2837840T3 - Medida cuantitativa de la cinética de desarrollo de la morfología de mórula y blastocisto humanos

Info

Publication number: ES2837840T3
Application number: ES15715040T
Authority: ES
Inventors: Lei Tan; Martin Chian; Kim Alice Chen; Peter Lorenzen
Original assignee: Ares Trading SA
Current assignee: Ares Trading SA
Priority date: 2014-03-20
Filing date: 2015-03-20
Publication date: 2021-07-01
Anticipated expiration: 2035-03-20
Also published as: EP3120297A1; US10942170B2; US20150268227A1; WO2015143350A1; EP3120297B1

Abstract

Un método para seleccionar un embrión euploide que tiene el mayor potencial de implantación para la implantación en un útero para los fines de fertilización in vitro, midiendo la duración de la expansión de blastocisto, comprendiendo el método: (a) cultivar uno o más embriones en condiciones suficientes para el desarrollo del embrión; (b) obtener imágenes a intervalos de tiempo de dicho uno o más embriones para adquirir una o más imágenes que son almacenadas digitalmente, comprendiendo dichas imágenes una o más características de imagen; (c) analizada dicha una o más características de imagen, determinando con ello (1) un inicio de expansión de blastocisto, y (2) una resolución de expansión de blastocisto, para medir el porcentaje de tiempo total invertido en la expansión o el tiempo medio invertido en cada evento de expansión; y (d) seleccionar un embrión euploide que tiene el mayor potencial de implantación.

Description

DESCRIPCIÓN

Medida cuantitativa de la cinética de desarrollo de la morfología de mórula y blastocisto humanos

Campo de la invención

Esta invención se refiere al campo de la evaluación biológica y clínica, y particularmente de la obtención de imágenes y la evaluación de cigotos/embriones tanto de humanos como de animales.

Antecedentes de la invención

La infertilidad es un problema de salud habitual que afecta al 10-15% de las parejas en edad reproductiva. Solo en los Estados Unidos, en el año 2006, se realizaron aproximadamente 140.000 ciclos de fertilización in vitro (FIV) (cdc.gov/art). Esto dio como resultado el cultivo de más de un millón de embriones anuales con un potencial variable, y a menudo impreciso, para su implantación y desarrollo hasta término. La tasa de nacimientos vivos, por ciclo, tras FIV fue tan solo del 29%, mientras una media del 30% de los nacimientos vivos dio como resultado gestaciones múltiples (cdc.gov/art). Las gestaciones múltiples tienen resultados adversos bien documentados, tanto para la madre como para los fetos, tal como aborto natural, nacimiento prematuro, y baja tasa de nacimiento. Las causas potenciales para el fallo de la FIV son diversos; sin embargo, desde la introducción de la FIV en 1978, uno de los mayores retos ha sido identificar los embriones que son más adecuados para ser transferidos, y que tienen mayor probabilidad de conducir a un embarazo a término.

La comprensión en la técnica del desarrollo embrionario básico está limitada, ya que los estudios de biología embrionaria humana siguen siendo difíciles y a menudo carecen de financiación para investigación. En consecuencia, la mayor parte del conocimiento actual sobre desarrollo embrionario deriva de estudios de organismos modelo. Los embriones de especies diferentes pasan por etapas de desarrollo similares, sin embargo, los tiempos varían entre especies. Estas diferencias, y muchas otras, hacen inapropiada la extrapolación directa de una especie a otra. (Taft, R.E. (2008) Theriogenology 69(1): 10-16). Los mecanismos generales de desarrollo humano, así como los determinantes moleculares subyacentes fundamentales, son únicos para el desarrollo embrionario humano. Por ejemplo, en ratones, la transcripción embrionaria se activa aproximadamente 12 horas después de la fertilización, en concurrencia con la primera división de ruptura, mientras que la activación de genes embrionarios (EGA) humanos se produce en el día 3, aproximadamente en la etapa de 8 células (Bell, C. E., et al. (2008) Mol. Hum. Reprod. 14: 691 701; Braude, P., et al. (1988) Nature 332: 459-461; Hamatani, T. et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. 101: 10326-10331; Dobson, T. et al. (2004) Human Molecular Genetics 13(14): 1461-1470). Adicionalmente, los genes que son modulados en el desarrollo humano temprano son únicos (Dobson, T. et al. (2004) Human Molecular Genetics 13(14): 1461-1470). Además, en otras especies tales como el ratón, más del 85% de los embriones cultivados in vitro alcanzan la etapa de blastocisto, uno de los principales hitos en el desarrollo de mamíferos, mientras que los embriones humanos cultivados tienen una tasa de formación de blastocistos media de aproximadamente 30-50%, con una elevada incidencia de fenotipos de mosaicismo y aberrantes, tal como fragmentación y arresto del desarrollo (Rienzi, L. et al. (2005) Reprod. Biomed. Online 10: 669-681; Alikani, M., et al. (2005) Mol. Hum. Reprod. 11: 335-344; Keltz, M. D., et al. (2006) Fertil. Steril. 86: 321-324; French, D. B., et al. (2009) Fertil. Steril.). A pesar de dichas diferencias, la mayoría de los estudios de desarrollo embrionario preimplantación derivan de organismos modelo y son difíciles de relacionar con el desarrollo embrionario humano (Zernicka-Goetz, M. (2002) Development 129: 815-829; Wang, Q., et al. (2004) Dev Cell. 6: 133-144; Bell, C. E., et al. (2008) Mol. Hum. Reprod. 14: 691-701; Zernicka-Goetz, M. (2006) Curr. Opin. Genet. Dev. 16: 406-412; Mtango, N. R., et al. (2008) Int. Rev. Cell. Mol. Biol. 268: 223-290).

Tradicionalmente en las clínicas de FIV, la viabilidad de embriones humanos se ha evaluado mediante simples observaciones morfológicas, tales como la presencia de blastómeros mononucleados de tamaño uniforme y el grado de fragmentación celular (Rijinders PM, Jansen CAM. (1998) Hum Reprod 13: 2869-73; Milki AA, et al. (2002) Fertil Steril 77: 1191-5). Más recientemente, también se han usado métodos adicionales como el cultivo extendido de embriones (hasta la etapa de blastocisto en el día 5) y el análisis del status cromosómico vía diagnosis genética de preimplantación (PGD) para determinar la calidad del embrión (Milki A, et al. (2000) Fertil Steril 73: 126-9; Fragouli E, (2009) Fertil Steril Jun 21 [EPub antes de imprenta]; El-Toukhy T, et al. (2009) Hum Reprod 6: 20; Vanneste E, et al. (2009) Nat Med 15: 577-83). Sin embargo, también existen riesgos potenciales en dichos métodos, ya que prolongan el periodo de cultivo y alteran la integridad del embrión (Manipalviratn S, et al. (2009) Fertil Steril 91: 305-15; Mastenbroek S, et al. (2007) N Engl J Med. 357: 9-17).

La transferencia de embrión único (SET, del inglés “Single-embryo transfer’) es actualmente el método preferido para el tratamiento de fertilización in vitro (FIV) a fin de reducir el riesgo de resultados adversos asociados a un embarazo de gestación múltiple. Para la SET, los embriólogos necesitan un método de selección de embriones fiable que permita una identificación consistente de los embriones con el mayor potencial de desarrollo. Recientemente, se ha demostrado que el análisis a intervalos de tiempo de la cinética de desarrollo embrionario proporciona información valiosa para mejorar la selección del embrión y los resultados posteriores de embarazo. Filho et al. (Hum. Reprod. (2012) 27(9): 2641-2648) describen un método para graduar morfológicamente el trofoectodermo de blastocisto y la masa celular interior usando imágenes de microscopio estáticas. Los estudios de Iwata et al. (Hum. Reprod. (2010) 25 (Suppl. 1): 141-144), Campbell et al. (Reproductive BioMedicine Online, 9 May 2013), y Mazur et al. (Hum. Reprod.

(2013) 28 (Suppl. 1): 1149-1206) describen correlaciones entre la calidad de embriones humanos y los tiempos de compactación, cavitación, expansión y/o colapso usando análisis de vídeo manual.

Sin embargo, la revisión manual de vídeos a intervalos de tiempo es laboriosa y requiere mucho tiempo. Además, la evaluación manual es objeto de una alta variabilidad inter- e intra-observador. Esto es especialmente problemático para los parámetros de intervalos de tiempo que implican los eventos de etapa de mórula y/o blastocisto (p.ej., compactación, cavitación, expansión y colapso), ya que estos eventos se producen de modo gradual, y es difícil para observadores humanos marcar los puntos de inicio y finalización de cada evento de un modo consistente y reproducible.

A pesar de los recientes desarrollos en las imágenes a intervalos de tiempo que permiten a los médicos seleccionar los embriones con un mayor potencial de desarrollo en base a los parámetros temporales de los primeros ciclos celulares, la selección actual de embriones se basa principalmente en evaluaciones morfológicas que son muy subjetivas y que ofrecen un valor predictivo limitado de viabilidad embrionaria. Un fallo en la identificación correcta de los embriones más viables puede conducir a un tratamiento de FIV no exitoso o a un embarazo de gestación múltiple. La tecnología de imágenes a intervalos de tiempo permite una monitorización embrionaria en tiempo real y proporciona un acercamiento adicional a la biología del desarrollo de embriones humanos. Esta tecnología ha permitido la identificación y medida de nuevos parámetros morfológicos y temporales que pueden afectar al desarrollo embrionario, incluyendo eventos de las etapas de mórula y/o blastocisto como se describe en la presente memoria.

El documento WO 2013/178785 se refiere a un método y a un sistema para seleccionar embriones para la fertilización in vitro basado en la cinética celular y la morfología celular observadas. Una realización de la descripción se refiere a un método para determinar la calidad embrionaria, que comprende monitorizar el embrión durante un periodo de tiempo, comprendiendo dicho periodo de tiempo la transformación del embrión desde la compactación inicial o mórula hasta el blastocisto, y determinar uno o más criterios de calidad de blastocisto para dicho embrión, y, en base a dichos uno o más criterios de calidad de blastocisto, determinar la calidad del embrión.

G. Paternot et al., “Semi-automated morphometric analysis o f human embryos can reveal correlations between total embryo volume and clinicalpregnancy”, 2013, se refiere a la confirmación de que la evaluación asistida por ordenador del volumen embrionario total está asociada al resultado de embarazo clínico y puede usarse para complementar los procedimientos actuales de selección de embriones.

De Kock et al., “O-121", 2006, trata de un estudio para encontrar posibles correlaciones entre evaluaciones morfométricas y la implantación de blastocisto. Se identificaron correlaciones prometedoras que describen objetivamente las relaciones entre diferentes áreas de desarrollo de blastocistos considerados para transferencia. Parecía que las medidas de área eran más sensibles que las medidas de diámetro lineal. Una combinación de medidas objetivas de una serie de parámetros tales como la ratio blastocisto:ICM, el área de ICM, el área de blastocisto y el espesor de zona pueden ayudar a identificar objetivamente el mejor blastocisto para la transferencia.

El documento WO2007/144001 se refiere a un sistema y método para determinar la calidad embrionaria que comprende monitorizar el embrión durante un periodo de tiempo, teniendo dicho periodo de tiempo una duración suficiente para comprender al menos un periodo de división celular y al menos una parte de un periodo de inter división, y determinando la duración del al menos un periodo de división celular; y/o ii) determinando la extensión y/o la distribución espacial del movimiento celular o de orgánulo durante el periodo de división celular; y/o iii) determinar la duración de un periodo inter-división; y/o iv) determinar la extensión y/o la distribución espacial del movimiento celular o de orgánulo durante el periodo de inter-división, obteniendo con ello una medida de la calidad embrionaria. Por tanto, la selección de los embriones óptimos para ser implantados después de una fertilización in vitro (FIV) se ve facilitada en base al tiempo, la duración y la distribución espacial, y a la extensión de las divisiones celulares observadas y se asocia al movimiento celular y de orgánulo.

Yee et al., “An Automatic model-Based Approach For Measuring The Zona Pellucida Thickness In Day Five Human Blastocysts", 2013, se refiere a un método automático para medir la etapa de desarrollo de blastocisto en base al espesor medido de la zona pelúcida (ZP) en imágenes digitales de embriones de microscopios de contraste de modulación Hoffman (HMC). Se usaron modelos elipsoidales para capturar las fronteras de ZP observadas mediante mapas de borde. La comparación de los resultados adquiridos con los del estado de la técnica indica la eficacia y la precisión del método.

Filho et al., “A method for semi-automatic grading o f human blastocyst microscope images”, 2012, se refiere a un método para segmentación de imágenes (la división de una imagen en sus regiones constituyentes significativas) y la clasificación de imágenes de blastocistos humanos con el objetivo de automatizar la clasificación de embriones.

Filho et al., “A Review on Automatic Analysis o f Human Embryo Microscope Images”, 2010, describe sistemas de puntuación de embriones actualmente en uso y hace una revisión de trabajos relacionados sobre el análisis de imágenes de embriones.

El documento WO 2012/116185 se refiere a métodos, composiciones y kits para la determinación del potencial de desarrollo de uno o más embriones o células pluripotentes, y/o la presencia de anormalidades cromosómicas en uno o más embriones o células pluripotentes. Dichos métodos, composiciones y kits encuentran uso en la identificación de embriones y ovocitos in vitro que son los más útiles para tratar la infertilidad en humanos.

El documento US 8265357 se refiere a un método y un sistema para la determinación de un cambio en una población celular, así como un método para usar dicho método y sistema para estimar una medida de calidad de embriones y para seleccionar embriones para la fertilización in vitro, comprendiendo dicho método las etapas de adquirir secuencialmente al menos dos imágenes de la población celular, comparando al menos una parte de al menos dos imágenes obteniendo al menos una imagen de diferencia, calculando un parámetro a partir de la al menos una imagen de diferencia, y en base a dicho parámetro calculado determinando si se ha producido un cambio.

Swain et al., “Could time-lapse embryo imaging reduce the need for biopsy and PGS?’, 2013, hacen una revisión de estudios relevantes que examinan la relación entre la morfo-cinética de los embriones y la aneuploidía.

Campbell et al., “Modelling a risk classification o f aneuploidy in human embryos using non-invasive morphokinetics", 2013, se refiere a si las variables morfocinéticas entre embriones aneuploides y euploides difieren como ayuda potencial para seleccionar embriones euploides para la transferencia. Después de la inseminación, se tomaron imágenes a intervalos de tiempo de EmbryoScope de 98 blastocistos y se analizaron a ciegas respecto a la ploidía. Las variables morfocinéticas fueron comparadas retrospectivamente con la ploidía, que se determinó después de biopsia y análisis de trofoectodermo mediante hibridación genómica comparativa de sistema o mediante sistema polimórfico de nucleótido sencillo. Los embriones aneuploides múltiples se mostraron retrasados al inicio de la compactación (tSC; mediana 85,1 horas post-inseminación (hpi); P=0,02) y para el tiempo para alcanzar una etapa de blastocisto completa (tB; mediana 110,9 hpi, P=0,01) en comparación con los embriones euploides (tSC, mediana 79,7 hpi, tB mediana 105,9 hpi). Los embriones que presentaban aneuploidía sencilla o múltiple (mediana 103,4 hpi, P=0,004 y 101,9 hpi, P=0,006, respectivamente) presentaron un retraso en el inicio de la blastulación en comparación con los embriones euploides (mediana 95,1 hpi). No se observaron diferencias significativas en la longitud del primer o segundo ciclo celular, la sincronía del segundo o tercer ciclo celular, la duración de la blastulación, la multinucleación en la etapa de 2 células y los patrones de división irregular entre embriones euploides y aneuploides.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se define a través de las reivindicaciones anexas. La invención proporciona la evaluación cuantitativa de los cambios dinámicos de la morfología de embriones humanos en las etapas de mórula y/o blastocisto usando características de imagen. En particular, se proporcionan métodos para medir la cinética de compactación, cavitación y expansión y colapso de blastocistos. Estos métodos son útiles en métodos de tratamiento de la infertilidad en humanos y en otros animales.

Un aspecto de la descripción proporciona métodos para determinar la duración de la compactación y/o la cavitación y/o la expansión y/o el colapso. En una realización, un método para medir la duración de la compactación, la cavitación, la expansión y/o el colapso comprende las etapas de cultivar uno o más embriones en condiciones suficientes para el desarrollo embrionario; adquirir imágenes a intervalos de tiempo de dicho uno o más embriones; y analizar una o más características de imagen, determinando con ello (1) un inicio de compactación, cavitación, expansión o colapso, y (2) una resolución de compactación, cavitación, expansión y/o colapso. En una realización, se determina la duración de la expansión y el colapso de blastocistos. En una realización adicional, la una o más características de imagen es un área definida por una frontera exterior de embrión, textura en el área alrededor del borde del embrión, textura en el centro del embrión, detectores de características de imágenes locales tales como bordes, esquinas/puntos de interés, masas (regiones de interés), y crestas; en otra realización, el método comprende además medir uno o más parámetros celulares seleccionados entre la duración de la expansión; la duración del colapso; el intervalo de tiempo entre la expansión y el colapso, la frecuencia de colapso, la velocidad de expansión; la velocidad de colapso, el tamaño embrionario medio después de la expansión inicial, el grado de expansión, y el grado de colapso. En una realización, el método comprende medir uno o más parámetros celulares en un único plano (es decir, en 2 dimensiones). En otra realización, el método comprende medir uno o más parámetros celulares en múltiples planos (es decir, en 3 dimensiones). En una realización, la imagen emplea iluminación de campo oscuro, iluminación de campo brillante, o una combinación de estas dos modalidades. En una realización, el método comprende medir uno o más parámetros celulares y/o características de imagen seleccionados del intervalo de tiempo entre el inicio y el fin de una citoquinesis o evento de ciclo celular hasta el inicio o resolución de la compactación, cavitación, expansión o colapso. En una realización, el método comprende medir el intervalo de tiempo entre el inicio o el fin de la citoquinesis 1 hasta el inicio o resolución de la compactación, cavitación, expansión o colapso. En otra realización, el método comprende medir el intervalo de tiempo entre el inicio o el fin de la citoquinesis 2 hasta el inicio o resolución de la compactación, cavitación, expansión o colapso. En otra realización, el método comprende medir el intervalo de tiempo entre el inicio o el fin de la citoquinesis 3 hasta el inicio o resolución de la compactación, cavitación, expansión o colapso. En otra realización, el método comprende medir el intervalo de tiempo entre el inicio o el fin de la citoquinesis 4 hasta el inicio o resolución de la compactación, cavitación, expansión o colapso. En otra realización, el método comprende medir el intervalo de tiempo entre el inicio o el fin de la citoquinesis 5 hasta el inicio o resolución de la compactación, cavitación, expansión 0 colapso. En otra realización, el método comprende medir el intervalo de tiempo entre el inicio o el fin del ciclo celular 1 hasta el inicio o resolución de la compactación, cavitación, expansión o colapso. En otra realización, el método comprende medir el intervalo de tiempo entre el inicio o el fin del ciclo celular 2 hasta el inicio o resolución de la compactación, cavitación, expansión o colapso. En otra realización, el método comprende medir el intervalo de tiempo entre el inicio o el fin del ciclo celular 3 hasta el inicio o resolución de la compactación, cavitación, expansión o colapso. En otra realización, el método comprende medir el intervalo de tiempo entre el inicio o el fin del ciclo celular 4 hasta el inicio o resolución de la compactación, cavitación, expansión o colapso. En otra realización, el método comprende medir el intervalo de tiempo entre el inicio o el fin del ciclo celular 5 hasta el inicio o resolución de la compactación, cavitación, expansión o colapso.

En una realización, se determina la duración de la compactación. En una realización adicional, la una o más características de imagen es la distribución espacial de los segmentos de frontera celular, la intensidad media en una región alrededor del centro del embrión, o la desviación estándar de la densidad en el centro del embrión. En otra realización, el método comprende además medir uno o más parámetros celulares seleccionados entre la forma del embrión; la textura del área alrededor del borde del embrión; la textura en el centro del embrión; los detectores de característica de imagen local tal como bordes, esquinas/puntos de interés, masas (regiones de interés), crestas. Se pueden usar los métodos de extracción y descripción de características, tales como Canny, Sobel, transformada de característica invariante de escala (SIFT); características robustas aceleradas (SURF). Dichas características pueden usarse entonces para medir múltiples eventos de desarrollo embrionario y los correspondientes intervalos de tiempo entre eventos, tal como el intervalo de tiempo entre la compactación y la cavitación.

En una realización, se determina la duración de la cavitación. En una realización adicional, la una o más características de imagen es la distribución de segmentos de frontera celular, la intensidad media en el centro del embrión, o la desviación estándar de la intensidad en el centro del embrión. En otra realización, el método comprende además medir uno o más parámetros celulares seleccionados entre la forma del embrión; la textura en el borde del embrión; la textura en el centro del embrión; características de imagen globales o locales tales como los descriptores de punto clave que pueden incluir o se basan en transformada de característica invariante de escala (SIFT), características robustas aceleradas (SURF), u otros descriptores adecuados conocidos por el especialista en la técnica, que incluyen Patrones Binarios Locales (LBP), características GLOH de tipo SIFT, PCA-SIFT, descriptor SIFT-Rank; y un intervalo de tiempo entre la compactación y la cavitación.

En determinadas realizaciones, el uno o más embriones se producen mediante fertilización de ovocitos in vitro. En una realización adicional, los ovocitos son madurados in vitro. En otra realización adicional, los ovocitos madurados in vitro son suplementados con factores de crecimiento. En otra realización, el uno o más embriones no han sido congelados antes del cultivo. En otra realización adicional, el uno o más embriones han sido congelados antes del cultivo.

En una realización, la etapa de medida está automatizada. En otra realización, la obtención de imágenes adquiere imágenes que son almacenadas digitalmente. En una realización, el sistema de obtención de imágenes emplea iluminación de campo oscuro, iluminación de campo brillante, o una combinación de las dos modalidades de imagen. También se pueden usar otras modalidades tal como contraste de fase, contraste de modulación de Hoffman, contraste de interferencia diferencial, luz polarizada, fluorescencia, sencillas o multiplano o combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, se puede usar la iluminación de campo oscuro para proporcionar un contraste de imagen mejorado para la posterior extracción de características y análisis de imagen.

En una realización, el uno o más embriones humanos se colocan en una placa de cultivo antes de cultivar en condiciones suficientes para el desarrollo del embrión. En una realización adicional, la placa de cultivo comprende una pluralidad de micropocillos. En otra realización, se coloca uno o más embriones humanos dentro de un micropocillo antes de cultivar en condiciones suficientes para el desarrollo del embrión. En una realización, la medida se lleva a cabo en una estación de imagen.

Un aspecto de la descripción proporciona métodos para determinar la probabilidad de que uno o más embriones sean euploides, alcancen la etapa de blastocisto, se conviertan en un blastocisto de buena calidad, se implanten en el útero y/o den lugar a un nacimiento vivo. En algunos aspectos, la determinación de la probabilidad de euploidía y/o de alcanzar la etapa de blastocisto y/o de convertirse en un blastocisto de buena calidad y/o de implantarse en el útero se determina a través de la des-selección con alta especificidad de uno o más embriones humanos que probablemente son aneuploides, probablemente no alcancen la etapa de blastocistos, se conviertan en un blastocisto de buena calidad, se implanten en el útero o den lugar a un nacimiento vivo. En tales aspectos, los parámetros de imágenes a intervalos de tiempo, tal como los parámetros de compactación y/o cavitación y/o expansión y/o colapso de un embrión se miden para llegar a una medida de parámetro que será empleada para proporcionar una determinación de la probabilidad del embrión para ser euploide, alcanzar la etapa de blastocisto, convertirse en un blastocisto de buena calidad, implantarse en un útero, y/o nacer vivo, determinación que puede usarse para guiar un curso de acción clínica. En algunas realizaciones, se usan variables clínicas tales como la edad de la paciente, el número de óvulos recuperados y la tasa de fertilización junto con los parámetros de imágenes a intervalos de tiempo tales como los parámetros de compactación y/o cavitación y/o expansión y/o colapso de un embrión, se miden para obtener una medida de parámetros que se emplea para proporcionar una determinación de la probabilidad de que el embrión sea euploide, alcance la etapa de blastocisto, se convierta en un blastocisto de buena calidad, se implante en un útero, y/o nazca vivo. En algunas realizaciones, el parámetro de compactación y/o cavitación y/o expansión y/o colapso es un evento morfológico que puede medirse mediante microscopía de intervalos de tiempo. En una realización, el método comprende la determinación de la probabilidad de que el embrión sea euploide o aneuploide a través de la medida de uno o más parámetros celulares y/o características de imagen seleccionadas entre el intervalo de tiempo entre el inicio y el fin de una citoquinesis o evento de ciclo celular y el inicio o resolución de la compactación, cavitación, expansión o colapso. En una realización, el método comprende medir el intervalo de tiempo entre el inicio o final de la citoquinesis 1 y el inicio o resolución de la compactación, cavitación, expansión o colapso. En otra realización, el método comprende medir el intervalo de tiempo entre el inicio o final de la citoquinesis 2 y el inicio o resolución de la compactación, cavitación, expansión o colapso. En otra realización, el método comprende medir el intervalo de tiempo entre el inicio o final de la citoquinesis 3 y el inicio o resolución de la compactación, cavitación, expansión o colapso. En otra realización, el método comprende medir el intervalo de tiempo entre el inicio o final de la citoquinesis 4 y el inicio o resolución de la compactación, cavitación, expansión o colapso. En otra realización, el método comprende medir el intervalo de tiempo entre el inicio o final de la citoquinesis 5 y el inicio o resolución de la compactación, cavitación, expansión o colapso. En otra realización, el método comprende medir el intervalo de tiempo entre el inicio o final del ciclo celular 1 y el inicio o resolución de la compactación, cavitación, expansión o colapso. En otra realización, el método comprende medir el intervalo de tiempo entre el inicio o final del ciclo celular 2 y el inicio o resolución de la compactación, cavitación, expansión o colapso. En otra realización, el método comprende medir el intervalo de tiempo entre el inicio o final del ciclo celular 3 y el inicio o resolución de la compactación, cavitación, expansión o colapso. En otra realización, el método comprende medir el intervalo de tiempo entre el inicio o final del ciclo celular 4 y el inicio o resolución de la compactación, cavitación, expansión o colapso. En otra realización, el método comprende medir el intervalo de tiempo entre el inicio o final del ciclo celular 5 y el inicio o resolución de la compactación, cavitación, expansión o colapso.

En una realización, la descripción proporciona métodos para determinar la probabilidad de que un embrión sea aneuploide. En una realización, la descripción proporciona métodos para distinguir entre tipos de aneuploidía. En una realización, la descripción proporciona métodos para determinar la probabilidad de que un embrión presente una aneuploidía compleja. En otra realización, la aneuploidía compleja es una aneuploidía de 2 o más cromosomas. En otra realización, la aneuploidía compleja es una aneuploidía de 3 o más cromosomas. En otra realización, la aneuploidía compleja es una aneuploidía de 4 o más cromosomas. En otra realización, la aneuploidía compleja es una aneuploidía de 5 o más cromosomas. En otra realización, la aneuploidía compleja es una aneuploidía de 6 o más cromosomas.

En otra realización, la descripción proporciona métodos para determinar la probabilidad de que un embrión presente una aneuploidía no viable. En una realización, la aneuploidía no viable es trisomía 2. En otra realización, la aneuploidía no viable es monosomía 1. En otra realización, la aneuploidía no viable es tanto una trisomía 2 como una monosomía 1. En otra realización adicional, la aneuploidía no viable es una aneuploidía compleja que comprende como uno de sus 2 o más cromosomas aneuploides, trisomía 2 o monosomía 1. En otra realización adicional más, la descripción proporciona métodos para determinar la probabilidad de que un embrión presente una enfermedad que causa aneuploidía que puede ser una aneuploidía viable o no viable. En una realización, la enfermedad que causa la aneuploidía es trisomía 21, trisomía 18, trisomía 13, trisomía 16, trisomía 22 o aneuploidías de cromosoma sexual tales como monosomía X o XXY.

En una realización, el contenido cromosómico (es decir, euploide frente a aneuploide) en embriones se determina/se puede confirmar mediante cribado cromosómico completo basado en qPCR (Treff y Scott, (2013) Fertil. Steril. 99(4): 1049-53). En otra realización, el contenido cromosómico se determina/se puede confirmar mediante Hibridación Genómica Comparativa basada en sistema (aCGH, Wells y Delhanty, (2000) 6(11): 1055-62). En otra realización adicional, el contenido cromosómico se determina/se puede confirmar mediante cariomapeado (Handyside et al, (2010) J. Med. Genet. 47(10): 651-8). En otra realización adicional, el contenido cromosómico se determina/se puede confirmar mediante sistema de Polimorfismo de Nucleótido Sencillo (SNP) (van Uum et al, (2012) Eur. J. Genet. 20(9): 938-44). En otra realización, el contenido cromosómico se determina/se puede confirmar mediante Secuenciamiento de Nueva Generación (NGS, Treff et al (2013) Fertil. Steril. 100: S82).

Un aspecto de la descripción proporciona métodos para clasificar la probabilidad de un embrión o blastocisto de ser euploide entre los embriones o blastocistos disponibles de una paciente, de tal modo que se maximiza la probabilidad de seleccionar un embrión euploide para la transferencia, y se minimiza el tiempo para embarazo. En algunos aspectos de la descripción, se proporcionan métodos para clasificar la probabilidad de que un embrión sea euploide, o de que se convierta en un blastocisto euploide. En dichos aspectos, se miden los parámetros de compactación y/o cavitación y/o expansión y/o colapso de un embrión para obtener una medida de parámetros que pueda emplearse para proporcionar una clasificación de la probabilidad del embrión de ser euploide o de convertirse en un blastocisto euploide, proporcionando de este modo un medio para seleccionar el embrión con la mayor probabilidad de ser euploide para la transferencia. En algunas realizaciones, el parámetro de compactación y/o cavitación y/o expansión y/o colapso es un evento morfológico que se puede medir mediante microscopía a intervalos de tiempo.

Un aspecto de la descripción proporciona métodos para determinar la probabilidad de que uno o más embriones euploides se implantarán en el útero o nacerán vivos. En tales aspectos, se miden parámetros de imagen a intervalos de tiempo que incluyen, por ejemplo, los parámetros de compactación y/o cavitación y/o expansión y/o colapso de un embrión para obtener una medida de parámetros que se emplea para proporcionar una determinación de la probabilidad del embrión euploide de implantarse en un útero. En algunas realizaciones, el parámetro de compactación y/o cavitación y/o expansión y/o colapso es un evento morfológico que se mide mediante microscopía a intervalos de tiempo. En otra realización, variables clínicas tales como la edad de la paciente, el número de óvulos recuperados y la tasa de fertilización se usan en conjunción con los parámetros de imagen a intervalos de tiempo que incluye, por ejemplo, los parámetros de compactación y/o cavitación y/o expansión y/o colapso de un embrión para determinar la probabilidad del embrión euploide de implantarse en un útero.

Un aspecto de la descripción proporciona métodos para clasificar la probabilidad de un embrión o blastocisto euploide de implantarse en un útero o dar como resultado un nacimiento vivo entre los embriones o blastocistos euploides disponibles de una paciente. En una realización, se maximiza la probabilidad de seleccionar un embrión euploide con el mayor potencial de implantación para pacientes con más de un embrión euploide entre los que elegir. En algunos aspectos de la descripción, se proporcionan métodos para clasificar la probabilidad de que un embrión euploide se implante en un útero. En tales aspectos, se miden parámetros de imagen a intervalos de tiempo que incluyen, por ejemplo, los parámetros de compactación y/o cavitación y/o expansión y/o colapso de un embrión para alcanzar una medida de parámetros que se emplea para proporcionar una clasificación de la probabilidad del embrión de ser euploide o de convertirse en un blastocisto euploide. En una realización adicional, se usa la determinación para seleccionar el embrión con la mayor probabilidad de ser euploide para la transferencia. En algunas realizaciones, el parámetro de compactación y/o cavitación y/o expansión y/o colapso es un evento morfológico que se puede medir mediante microscopía a intervalos de tiempo. En una realización adicional, se usan variables clínicas tales como la edad de la paciente, el número de óvulos recuperados y la tasa de fertilización junto con los parámetros de imagen a intervalos de tiempo que incluye, por ejemplo, parámetros de compactación y/o cavitación y/o expansión y/o colapso de un embrión, que se miden para alcanzar una medida de parámetros que se emplea para proporcionar una clasificación de la probabilidad del embrión de ser euploide o de convertirse en un blastocisto euploide.

En otro aspecto de la descripción, se proporcionan métodos para determinar la probabilidad de que una paciente quede embarazada y/o sufra un aborto tras la transferencia de uno o más embriones humanos determinados por tener un buen potencial de desarrollo y/o ser euploides. En determinadas realizaciones, el método incluye medir la duración de la compactación, cavitación, expansión y/o colapso. En determinados aspectos, el método incluye las etapas de cultivar uno o más embriones en condiciones suficientes para el desarrollo del embrión; obtener imágenes a intervalos de tiempo de dicho uno o más embriones; y analizar una o más características de imagen, determinando de este modo (1) un inicio de la compactación, cavitación, expansión o colapso, y (2) una resolución de la compactación, cavitación, expansión y/o colapso. En una realización, se determina la duración de la expansión y colapso de blastocistos. En una realización adicional, la una o más características de imagen están definidas por el área de la frontera exterior del embrión. En otra realización, el método comprende además medir uno o más parámetros celulares seleccionados entre la duración de la expansión; la duración del colapso; el intervalo de tiempo entre la expansión y el colapso, la frecuencia del colapso, la velocidad de expansión; la velocidad de colapso, el tamaño embrionario medio después de la expansión inicial, el grado de expansión, y el grado de colapso.

En otra realización, se proporcionan métodos para determinar la probabilidad de que una paciente tenga al menos un blastocisto euploide. En una realización, el método comprende medir la duración de la compactación, cavitación, expansión y/o colapso, y comprende las etapas de cultivar uno o más embriones en condiciones suficientes para el desarrollo del embrión; obtener imágenes a intervalos de tiempo de dicho uno o más embriones; y analizar una o más características de imagen, determinando de este modo (1) un inicio de la compactación, cavitación, expansión o colapso, y (2) una resolución de la compactación, cavitación, expansión y/o colapso. En una realización, se determina la duración de la expansión y el colapso de blastocistos. En una realización adicional, la una o más características de imagen están definidas por el área establecida por la frontera exterior del embrión. En otra realización, el método comprende además medir uno o más parámetros celulares seleccionados entre la duración de la expansión; la duración del colapso; el intervalo de tiempo entre la expansión y el colapso, la frecuencia del colapso, la velocidad de expansión; la velocidad de colapso, el tamaño medio del embrión después de la expansión inicial, el grado de expansión y el grado de colapso.

En otra realización, se proporciona un método para clasificar un embrión humano en base a su probabilidad relativa de ser aneuploide. En un aspecto, el método incluye cultivar uno o más embriones humanos en condiciones suficientes para el desarrollo del embrión, obtener imágenes a intervalos de tiempo del uno o más embriones, analizar una o más características de imagen para determinar el tamaño medio del embrión después de una expansión inicial (Pexp-area) y/o el tiempo entre la segunda y la tercera citoquinesis (P3) y/o el tiempo entre la primera división hasta la cavitación (tCav) y clasificar el embrión en las categorías 1 -5 en base a la probabilidad relativa de que el embrión sea aneuploide. En una realización, se usa un clasificador Bayesiano ingenuo para clasificar los embriones. En otra realización, se usa un clasificador SVM para clasificar los embriones. En otra realización adicional, se usa un clasificador Random Forest para clasificar el embrión. En otra realización más, se usa un clasificador Boosting Tree para clasificar el embrión. En otra realización adicional se usa una combinación de dos o más de un clasificador Bayesiano ingenuo, un clasificador SVM, un clasificador Random Forest y un clasificador Boosting Tree, para clasificar el embrión. En una realización, también se usa el número de pronúcleos (#2PN) y la edad para clasificar el embrión. En una realización particular, se usan #2PN, tCav y Psyn para clasificar el embrión humano en base a su probabilidad relativa de ser aneuploide. En otra realización particular, se usan Pexp-area, Edad y P3 para clasificar el embrión en base a su probabilidad relativa de ser aneuploide.

En otra realización, se proporciona un sistema automatizado para determinar el potencial de desarrollo humano o la probabilidad de que un embrión sea euploide. En una realización, el sistema automatizado comprende una incubadora, uno o más microscopios configurados en la incubadora, un ordenador que comprende software para capturar imágenes secuenciales del uno o más microscopios a lo largo de un periodo de hasta 5 días del desarrollo de embrión humano, software para determinar una pluralidad de parámetros de actividad celular, y software para emplear la pluralidad de parámetros para determinar el potencial de desarrollo del embrión o la probabilidad de que el embrión sea euploide. En una realización, cada microscopio configurado en la incubadora comprende una placa de cultivo multipocillo posicionada para la obtención de imágenes y una cámara capaz de capturar imágenes de embriones humanos en la placa de cultivo de micropocillos. En una realización, el software para determinar una pluralidad de parámetros celulares determina uno o más de la duración de la expansión, la duración del colapso, el grado de expansión, el grado de colapso, la velocidad de expansión, la velocidad de colapso, el tamaño medio del embrión después de la expansión inicial y el intervalo de tiempo entre la expansión y el colapso. En una realización adicional, los parámetros celulares comprenden además un parámetro de división celular basado en el intervalo entre la primera y la segunda citoquinesis del embrión humano y/o un parámetro celular basado en el intervalo entre la segunda y la tercera citoquinesis del embrión humano. En una realización particular, el parámetro de división celular es P2 o P3.

En otra realización, el sistema automatizado proporcionado para determinar el potencial de desarrollo de embriones humanos o la probabilidad de que el embrión sea euploide in vitro comprende una incubadora, uno o más microscopios configurados en la incubadora, comprendiendo cada uno una placa de cultivo multipocillo posicionada para la obtención de imágenes y una cámara capaz de capturar imágenes de embriones humanos en la placa de cultivo multipocillo; y un ordenador que comprende software para capturar imágenes secuenciales del uno o más microscopios a lo largo de un periodo de hasta 5 días del desarrollo del embrión humano, software para determinar una pluralidad de parámetros de actividad celular y software para emplear dicha pluralidad de parámetros para clasificar el embrión humano para el potencial de desarrollo del embrión o para la probabilidad de que el embrión humano sea euploide. En una realización, la pluralidad de parámetros celulares comprende uno o más del tamaño medio del embrión después de la expansión inicial (Pexp-area), el tiempo entre la segunda y la tercera citoquinesis (P3), el tiempo desde la singamia hasta la primera citoquinesis (Psyn) y el tiempo entre la primera división y la cavitación (tCav). En una realización, se usan también @2PN y Edad en combinación con la una o más características de imagen para clasificar el embrión. En otra realización, se usan Edad, #2PN, tCav y Psyn para clasificar el embrión humano. En una realización, se usan Pexp-area, Edad y P3 para clasificar el embrión.

En otra realización, se proporciona un método para determinar la probabilidad de que el embrión euploide se implante en el útero de una mujer. En una realización, el método incluye cultivar uno o más embriones en condiciones suficientes para el desarrollo del embrión; la obtención de imágenes a intervalos de tiempo de dicho uno o más embriones; y analizar una o más características de imagen determinando de este modo (1) el porcentaje de tiempo que emplea el embrión en la expansión (Exp Time), y/o (2) el tiempo medio que emplea el embrión en cada evento de expansión (Avg. Exp. Time) empleando dichas características de imagen para determinar la probabilidad de que el embrión euploide humano se implante en el útero de dicha mujer. En una realización, el método incluye primero determinar que un embrión es euploide. En una realización, el método para determinar primero que un embrión es euploide comprende medir la duración de la compactación, cavitación, expansión y/o colapso, que comprende las etapas de cultivar uno o más embriones en condiciones suficientes para el desarrollo embrionario; la obtención de imágenes a intervalos de tiempo de dicho uno o más embriones; y analizar una o más características de imagen, determinando de este modo (1) un inicio de la compactación, cavitación, expansión o colapso, y (2) una resolución de la compactación, cavitación, expansión y/o colapso. En una realización, se determina la duración de la expansión y el colapso de blastocistos. En una realización adicional, la una o más características de imagen están definidas por el área establecida por la frontera exterior del embrión. En otra realización, el método comprende además medir uno o más parámetros celulares seleccionados entre la duración de la expansión; la duración del colapso; el intervalo de tiempo entre la expansión y el colapso, la frecuencia de colapso, la velocidad de expansión; la velocidad de colapso, el tamaño medio del embrión después de la expansión inicial, el grado de expansión, y el grado de colapso. En una realización adicional, se determina primero si el embrión humano es euploide mediante el cultivo de uno o más embriones humanos en condiciones suficientes para el desarrollo del embrión, la obtención de imágenes a intervalos de tiempo de dicho uno o más embriones humanos, el análisis de una o más características de imagen, determinando de este modo el tamaño medio del embrión después de la expansión inicial (Pexp-area), y/o el tiempo entre la segunda y la tercera citoquinesis (P3) y/o el tiempo entre la singamia y la primera citoquinesis (Psyn) y/o el tiempo entre la primera división y la cavitación (tCav), y clasificar el embrión en base a su probabilidad de ser euploide. En otra realización, primero se determina que el embrión humano euploide es euploide mediante cribado genético pre-implantación (PGS).

En una realización, se determina que el embrión euploide humano tiene mayor probabilidad de implantarse si el Exp Time es superior a aproximadamente el 85% o 86% o 87% o 88% o 89% o 90%. En otra realización, se determina que el embrión euploide tiene menos probabilidad de implantarse si el Exp Time es inferior a aproximadamente el 85%. En una realización, se determina que el embrión euploide tiene más probabilidad de implantarse si el Avg Exp Time es de al menos aproximadamente 120 minutos, 125 minutos, 130 minutos o 135 minutos o más. En otra realización, se determina que un embrión euploide tiene menos probabilidad de implantarse si el Avg Exp Time es inferior a aproximadamente 120 minutos o inferior a aproximadamente 115 minutos. En otra realización, el método proporciona la medición de uno o más parámetros celulares adicionales seleccionados del grupo que consiste en los parámetros incluidos en las tablas 1 o 2.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La invención se entenderá mejor a partir de la siguiente descripción detallada cuando se lea en combinación con las figuras acompañantes. Cabe destacar que, según la práctica habitual, las diversas características de las figuras no están a escala. Por el contrario, las dimensiones de las diversas características están expandidas o reducidas de forma arbitraria para mayor claridad. En las figuras se incluyen las siguientes:

Figura 1: es una serie de imágenes a intervalos de tiempo que muestra la segmentación de la frontera exterior del embrión en tres puntos temporales para el mismo embrión que está viéndose sometido a expansión de blastocisto.

Figura 2: es un gráfico lineal que muestra el área de segmentación de frontera exterior del embrión frente al tiempo, donde un aumento en el área con el tiempo indica expansión y una disminución del área con el tiempo indica colapso.

Figura 3: es una serie de imágenes a intervalos de tiempo que muestra las distribuciones de segmento de frontera celular de embrión en la etapa de división (izquierda superior), la etapa compactada/de mórula (derecha superior), la etapa de blastocisto temprana (cavitación) (izquierda inferior), y blastocisto que está siendo sometido a expansión (derecha inferior).

Figura 4: es un gráfico lineal que muestra el número de píxeles en los segmentos de frontera celular de embrión en el centro del embrión frente al tiempo. En la parte superior de la curva se muestran tres ejemplos de imágenes de embrión con segmentos etiquetados en la división, mórula y blastocisto temprano (cavitación). El proceso de compactación está destacado en el primer recuadro sombreado y corresponde a una disminución del número de píxeles en segmentos, y el proceso de cavitación está destacado en el segundo recuadro sombreado y corresponde a un aumento en el número de píxeles en segmentos.

Figura 5: es un gráfico lineal que muestra la intensidad media en el centro del embrión frente al tiempo. El proceso de compactación está destacado en el primer recuadro sombreado y corresponde a una disminución de la intensidad media, y el proceso de cavitación está destacado en el segundo recuadro sombreado y corresponde a un aumento de la intensidad media.

Figura 6: es un gráfico lineal que muestra la desviación estándar de la intensidad en el centro del embrión frente al tiempo. El proceso de compactación está destacado en el primer recuadro sombreado y corresponde a una disminución en la desviación estándar de la intensidad, y el proceso de cavitación está destacado en el segundo recuadro sombreado y corresponde a un aumento de la desviación estándar de la intensidad.

Figura 7: es una serie de gráficos lineales que muestran múltiples características de imagen (esto es, el área de la segmentación de frontera exterior de embrión (abajo), la desviación estándar de la intensidad en el centro del embrión (medio), y una intensidad media en el centro del embrión (arriba)) frente al tiempo usado para extraer medidas de tiempo para la compactación (primer recuadro), la cavitación (segundo recuadro), la expansión de blastocisto (tercer recuadro) y el colapso de blastocisto (cuarto recuadro).

Figura 8: muestra que el tiempo desde la división a la cavitación es predictivo de aneuploidía en embriones humanos.

Figura 9: muestra el uso de cuatro clasificadores diferentes que la edad del embrión combinada con el número de embriones 2PN, el tiempo a cavitación y Psyn es predictivo de aneuploidía en embriones humanos.

Figura 10: muestra que el tamaño medio después de la expansión inicial es predictivo de aneuploidía en embriones humanos.

Figura 11: muestra mediante cuatro clasificadores diferentes que la edad del embrión combinada con el tamaño medio después de la expansión inicial y P3 son indicativos de aneuploidía en embriones humanos y pueden clasificarse en cinco categorías de riesgo creciente de aneuploidía.

Figura 12: ilustra un diagrama esquemático de un aparato, según una realización de la descripción.

Figura 13: ilustra un diagrama esquemático de un sistema de obtención de imágenes, según una realización de la descripción.

Figura 14A-C: ilustra vistas esquemáticas de ejemplos de sistemas de iluminación de campo oscuro que pueden ser usados por el microscopio 4, según una realización de la descripción.

Figura 15: muestra que el porcentaje de tiempo invertido en la expansión (Exp Time) y el tiempo medio invertido en cada evento de expansión (Avg Exp Time) son predictivos de la probabilidad de que los embriones euploides se implanten en el útero.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Cuando se proporciona un rango de valores, debe entenderse que cada valor interviniente, hasta la décima de unidad, del límite inferior a menos que el contexto claramente indique lo contrario, entre los límites superior e inferior de dicho rango, también queda específicamente descrito. Todo rango más pequeño entre cualquier valor establecido o valor interviniente en un rango establecido y cualquier otro valor establecido o interviniente en dicho rango establecido queda abarcado dentro de la invención. Los límites superior e inferior de dichos rangos más pequeños pueden incluirse o excluirse de forma independiente del rango, y cada rango donde cualquiera, ninguno o ambos límites están incluidos en los rangos más pequeños también queda abarcado por la invención, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el rango establecido. Cuando el rango establecido incluye uno o ambos límites, los rangos que excluyen cualquiera o ambos de dichos límites incluidos también están incluidos en la invención.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado entendido habitualmente por el especialista en la técnica a la cual pertenece esta invención. Aunque se pueden usar cualesquier métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria para llevar a la práctica o evaluar la presente invención, a continuación se describen algunos métodos y materiales potenciales y preferidos.

Cabe destacar que, tal como se usan en la presente memoria y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares “un”, “una”, “el” y “la” incluyen los referentes en plural a menos que el contexto claramente dicte lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a “una célula” incluye una pluralidad de dichas células, y la referencia a “el péptido” incluye referencia a uno o más péptidos y equivalentes del mismo, p.ej., polipéptidos, conocidos por los especialistas en la técnica, etcétera.

Las publicaciones discutidas en la presente memoria ser proporciona únicamente por su descripción anterior a la fecha de presentación de la presente solicitud. En la presente memoria nada debe considerarse como una admisión de que la presente invención no está autorizada a preceder en fecha a dicha publicación en virtud a la invención previa. Adicionalmente, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales, que pueden necesitar ser confirmadas de forma independiente.

En la presente memoria se proporcionan métodos para determinar cuantitativamente cambios dinámicos en la morfología de embriones humanos en la etapa de mórula y/o blastocisto (p.ej., compactación, cavitación, expansión y colapso) usando características de imagen. Los métodos descritos proporcionan herramientas cuantitativas que posibilitan la medición semi-automática o automática de eventos de desarrollo en etapa de mórula y/o blastocisto, y proporcionan una guía de medida objetiva estandarizada para los eventos cinéticos de etapa de mórula y/o blastocisto.

También se proporcionan métodos, composiciones y kits para determinar la probabilidad de alcanzar la etapa de blastocisto y/o de implantarse en el útero y/o de nacer vivo. Dichos métodos, composiciones y kits encuentran utilidad en la identificación in vitro de los embriones que son más útiles para el tratamiento de la infertilidad en humanos. Éstos y otros objetivos, ventajas y características de la invención serán evidentes para los especialistas en la técnica una vez leídos los detalles de los métodos y composiciones de la presente, tal como se describen más detalladamente a continuación.

Los términos “potencial de desarrollo” y “competencia de desarrollo” se usan en la presente memoria para referirse a la habilidad o la capacidad de un embrión sano para crecer o desarrollarse. Los términos pueden referirse a la habilidad o la capacidad de un embrión sano para alcanzar la etapa de blastocisto, o para desarrollarse en un blastocisto de buena calidad, para implantarse en el útero y/o para nacer vivo.

El término “especificidad” cuando se usa en la presente memoria con respecto a los métodos de predicción y/o evaluación se usa para referirse a la capacidad para predecir o evaluar un embrión para determinar la probabilidad de que el embrión no se desarrolle en un blastocisto o de que sea o no euploide, a través de la evaluación, determinación, identificación o selección de embriones que no tienen probabilidad de alcanzar la etapa de blastocisto y/o de implantarse en el útero y/o de ser aneuploides. Tal como se usa en la presente memoria, alta especificidad se refiere a cuando al menos aproximadamente el 70%, 72%, 75%, 77%, 80%, 82%, 85%, 88%, 90%, 92%, 95% o más, o el 100% de los embriones humanos no seleccionados no tienen probabilidad de alcanzar la etapa de blastocisto y/o de implantarse en el útero y/o de ser aneuploides. En algunas realizaciones, se des-seleccionan los embriones que no tienen probabilidad de alcanzar la etapa de blastocisto y/o de implantarse y/o de ser aneuploides en la etapa de útero.

El término “AUC” o “área bajo la curva” cuando se usan en la presente memoria con respecto a los métodos de predicción y/o evaluación, se usan para referirse al comportamiento del método de predicción (esto es, la probabilidad de que el método de predicción clasifique un embrión euploide o un blastocisto euploide elegido aleatoriamente mayor que un embrión aneuploide o un blastocisto aneuploide elegido aleatoriamente). La AUC se calcula a partir de la característica operativa de receptor (ROC) y es igual a la probabilidad de que un clasificador clasifique un caso positivo elegido aleatoriamente mayor que uno negativo elegido aleatoriamente. La AUC puede calcularse para caracterizar el comportamiento de una serie de clasificadores diferentes, sin limitación, Bayesiano ingenuo, SVM, Random Forest y Boosting Tree. Cualquiera de los cuales, solo o en combinación, puede usarse para clasificar embriones en base a uno o más parámetros celulares.

El término ratio de posibilidades (OR, del inglés “odds ratio”) cuando se usa en la presente memoria con respecto a métodos de predicción y/o evaluación se usa para referirse a una medida de la eficacia del método de predicción. OR = (TP/FN)/(FP/TN); donde TP, FN, FP y TN son el número de positivos auténticos, negativos falsos, positivos falsos y negativos auténticos, respectivamente.

El término “embrión” se usa en la presente memoria para referirse al zigoto que se forma cuando dos células gaméticas haploides, p.ej., un ovocito secundario no fertilizado y una célula de esperma, se unen para formar una célula totipotente diploide, p.ej., un óvulo fertilizado, y al embrión que resulta de las divisiones celulares inmediatamente posteriores, es decir, división embriónica, hasta la mórula, es decir, la etapa de 16 células y la etapa de blastocisto (con trofoectodermo diferenciado y masa celular interior).

El término “blastocisto” se usa en la presente memoria para describir todos los embriones que alcanzan la cavitación (es decir, la formación de cavidades).

Los términos “nacer vivo” o “nacimiento vivo” se usan en la presente memoria para incluir, aunque sin limitación, los nacimientos sanos y/o cromosómicamente normales (número normal de cromosomas, estructura cromosómica normal, orientación cromosómica normal, etc.).

El término “arrestado” se usa en la presente invención para referirse a cualquier embrión que no cumple la definición de blastocisto.

El término “ovocito” se usa en la presente memoria para referirse a una célula germinal femenina, o gameto, no fertilizada. Los ovocitos de la presente solicitud pueden ser ovocitos primarios, en cuyo caso se posicionan para pasar o están pasando la meiosis I, u ovocitos secundarios, en cuyo caso se posicionan para pasar o están pasando la meiosis II.

Por “meiosis” se pretende indicar los eventos del ciclo celular que dan como resultado la producción de gametos. En el primer ciclo celular meiótico, o meiosis I, los cromosomas de una célula se duplican y se reparten en dos células hijas. Dichas células hijas se dividen entonces en un segundo ciclo celular meiótico, o meiosis II, que viene acompañado por la síntesis de ADN, dando como resultado gametos con un número haploide de cromosomas.

Por “ciclo celular mitótico”, se pretende indicar los eventos en una célula que dan como resultado la duplicación de los cromosomas de la célula y la división de dichos cromosomas y una materia citoplasmática celular en dos células hijas. El ciclo celular mitótico se divide en dos fases: interfase y mitosis. En la interfase, la célula crece y replica su ADN. En la mitosis, la célula inicia y completa la división celular, primero particionando su material nuclear, y después dividiendo su material citoplasmático y su material nuclear particionado (citoquinesis) en dos células separadas.

Por un “primer ciclo celular mitótico” o “ciclo celular 1 ” se pretende indicar el intervalo de tiempo desde la fertilización a la finalización del primer evento de citoquinesis o primera mitosis, es decir, la división del ovocito fertilizado en dos células hijas. En los ejemplos en los que los ovocitos son fertilizados in vitro, el intervalo de tiempo entre la inyección de gonadotropina coriónica humana (HCG) (normalmente administrada antes de la recuperación del ovocito) hasta la finalización del primer evento de citoquinesis puede usarse como intervalo de tiempo sustituto.

“P1” o “duración P1” se usa en la presente memoria para referirse al intervalo de tiempo entre la aparición del primer surco de división hasta la finalización de la 1a división celular o primer evento de citoquinesis.

“Fenotipo de 1a citoquinesis” o “fenotipo P1” se usa en la presente memoria para referirse a las características celulares, bioquímicas y/o morfológicas de un embrión antes de completar P1 (es decir, las características celulares, físicas, bioquímicas y/o morfológicas de un embrión antes de completar la 1a división celular o primer evento de citoquinesis).

“Fenotipo P1 anormal” o “A1cyt” se usa en la presente memoria para referirse a eventos celulares, bioquímicos y/o morfológicos no característicos de un embrión antes de completar P1 (es decir, antes de completar la 1 a división celular o primer evento de citoquinesis) en comparación con un embrión de referencia o control que tiene una alta probabilidad de llegar a blastocisto, convertirse en un blastocisto de buena calidad y/o implantarse en el útero. “Fenotipo P1 anormal” o “A1cyt” tal como se usa en la presente memoria incluye pliegue de oolema, pliegue de membrana y/o formación de uno o más surcos de pseudo-división antes del inicio y/o la finalización de P1 (el intervalo de tiempo entre la aparición del primer surco de división hasta la finalización de la 1a división celular o primer evento de citoquinesis).

Por un “segundo ciclo celular mitótico” o “ciclo celular 2” o “P2” se pretende indicar el segundo evento de ciclo celular observado en un embrión, el intervalo de tiempo entre la producción de células hijas a partir de un ovocito fertilizado por mitosis y la producción de un primer conjunto de células nietas a partir de una de dichas células hijas (la “célula hija líder”, o célula hija A) por mitosis. P2 también abarca la duración del tiempo en el que el embrión es un embrión de 2 células, es decir la duración de la etapa de 2 células. El ciclo celular 2 puede medirse usando varios eventos morfológicos que incluyen el final de la citoquinesis 1 y el inicio de la citoquinesis 2, o el final de la citoquinesis 1 y el final de la citoquinesis 2, o el inicio de la citoquinesis 1 y el inicio de la citoquinesis 2, o el inicio de la citoquinesis 1 y el final de la citoquinesis 2, o el final de la mitosis 1 y el inicio de la mitosis 2, o el final de la mitosis 1 y el final de la mitosis 2, o el inicio de la mitosis 1 y el inicio de la mitosis 1, o el inicio de la mitosis 1 y el final de la mitosis 2. Tras completarse el ciclo celular 2, el embrión consta de 3 células. En otras palabras, el ciclo celular 2 puede identificarse visualmente como el tiempo entre el embrión que contiene 2 células y el embrión que contiene 3 células.

Por un “tercer ciclo celular mitótico” o “ciclo celular 3” o “P3” se pretende indicar el tercer evento de ciclo celular observado en un embrión, típicamente el intervalo de tiempo entre la producción de un primer conjunto de células hijas a partir de un ovocito fertilizado por mitosis y la producción de un segundo conjunto de células nietas a partir de la segunda célula hija (la “célula hija rezagada” o célula hija B) por mitosis. El ciclo celular 3 se puede medir usando varios eventos morfológicos que incluyen el final de la citoquinesis 2 y el inicio de la citoquinesis 3, o el final de citoquinesis 2 y el final de la citoquinesis 3, o el inicio de la citoquinesis 2 y el inicio de la citoquinesis 3, o el inicio de la citoquinesis 2 y el final de la citoquinesis 3, o el final de la mitosis 3 y el inicio de la mitosis 3, o el final de la mitosis 2 y el final de la mitosis 3, o el inicio de la mitosis 2 y el inicio de la mitosis 3, o el inicio de la mitosis 2 y el final de la mitosis 3. En otras palabras, el ciclo celular 3 se puede identificar visualmente como el tiempo entre el embrión que contiene 3 células y el embrión que contiene 4 células.

Por “primer evento de división” o “primera división”, se pretende indicar la primera división, es decir, la división del ovocito en dos células hijas, es decir, el ciclo celular 1. Tras completarse el primer evento de división, el embrión consiste en 2 células.

Por “segundo evento de división” o “segunda división”, se pretende indicar el segundo conjunto de divisiones, es decir, la división de la célula hija líder en dos células nietas y la división de la célula hija rezagada en dos células nietas. En otras palabras, el segundo evento de división consiste tanto en el ciclo celular 2 como en el ciclo celular 3. Tras completarse la segunda división, el embrión consiste en 4 células.

Por “tercer evento de división”, se pretende indicar el tercer conjunto de divisiones, es decir, las divisiones de todas las células nietas. Tras completarse el tercer evento de división, el embrión típicamente consiste en 8 células.

Por “citoquinesis” o “división celular” se pretende indicar la fase de mitosis en la que una célula sufre una división celular. En otras palabras, es la etapa de mitosis en la que el material nuclear particionado de una célula y su material citoplasmático son divididos para producir dos células hijas. El periodo de citoquinesis se puede identificar como el periodo, o ventana de tiempo, desde que se observa por primera vez una constricción de la membrana celular (“un surco de división”) hasta la resolución de dicho evento de constricción, es decir, la generación de dos células hijas. El inicio del surco de división puede identificarse visualmente como el punto en el que la curvatura de la membrana celular cambia de convexa (redondeada hacia afuera) a cóncava (curvada hacia el interior con una melladura o hendidura). Esto se ilustra, por ejemplo, en la Fig. 4 de la Patente de EE.UU. n° 7.963.906, panel superior, mediante flechas blancas que señalan a 2 surcos de división. El inicio de la elongación celular también puede usarse para marcar el inicio de la citoquinesis, en cuyo caso el periodo de citoquinesis se define como el periodo de tiempo entre el inicio de la elongación celular y la resolución de la división celular.

Por “primera citoquinesis” o “citoquinesis 1” se pretende indicar el primer evento de división celular después de la fertilización, es decir, la división de un ovocito fertilizado para producir dos células hijas. La primera citoquinesis normalmente se produce aproximadamente un día después de la fertilización.

Por “segunda citoquinesis” o “citoquinesis 2” se pretende indicar el segundo evento de división celular observado en un embrión, es decir, la división de una célula hija del ovocito fertilizado (la “célula hija líder”, o hija A) en un primer conjunto de dos nietas.

Por “tercera citoquinesis” o “citoquinesis 3” se pretende indicar el tercer evento de división celular observado en un embrión, es decir, la división de la otra hija del ovocito fertilizado (la “célula hija rezagada”, o hija B) en un segundo conjunto de dos nietas.

El término “marcador fiduciario” es un objeto usado en el campo de la visualización de un sistema de imágenes que aparece en la imagen producida, para uso como punto de referencia o como medida. Puede ser algo colocado dentro o sobre la imagen objeto, o un marcador o conjunto de marcadores de la retícula de un instrumento óptico.

El término “micro-pocillo” se refiere a un recipiente que se dimensiona en una escala celular, preferiblemente para proporcionar la acomodación de células eucarióticas o de un único ovocito o embrión.

El término “seleccionar” o “selección” se refieren a cualquier método conocido en la técnica para mover uno o más embriones, blastocistos u otra célula o células como las descritas en la presente memoria desde una localización hasta otra localización. Es puede incluir, aunque sin limitación, mover uno o más embriones, blastocistos u otra célula o células dentro de un pocillo, placa u otro compartimento o dispositivo, de tal modo que se separe el uno o más embriones, blastocistos u otra célula o células seleccionadas de la descripción del uno o más embriones no seleccionados o des-seleccionados de la descripción (tal como por ejemplo moviéndolo de un área de un pocillo, placa, compartimento o dispositivo a otro área de un pocillo, placa, compartimento o dispositivo). Este también puede incluir mover uno o más embriones, blastocistos u otra célula o células desde un pocillo, placa, compartimento o dispositivo a otro pocillo, placa, compartimento o dispositivo. Con los métodos de la presente invención, se puede emplear cualquier medio conocido en la técnica para separar o distinguir el uno o más embriones, blastocistos u otra célula o células seleccionados, del uno o más embriones, blastocistos u otra célula o células no seleccionados o des seleccionados. En una realización, los embriones seleccionados se seleccionan para transferencia a un recipiente para gestación. En otra realización, los embriones seleccionados se seleccionan para congelación para una potencial futura implantación. En otra realización, los embriones se seleccionan para cultivo continuado. En otra realización, los embriones se seleccionan para evaluación adicional mediante otros métodos, tales como evaluación genética pre implantación, genómica, proteómica y/o secretómica.

El término “des-seleccionado” o “des-selección” tal como se usa en la presente memoria se refiere a embriones con un bajo potencial de desarrollo, que no son elegidos para implantación o que son elegidos para no implantación. En algunas realizaciones, los embriones des-seleccionados no son transferidos o implantados al útero. Por ejemplo, un embrión con un elevado riesgo de aneuploidía es des-seleccionado.

Tras la fertilización, ambos gametos contribuyen con un conjunto de cromosomas (contenido haploide), cada uno contenido en una estructura referida en la presente memoria como “pronúcleo” (“PN”). Tras una fertilización normal, cada embrión muestra dos pronúcleos (PNs), uno que representa el material genético paterno y otro que representa el material genético materno. “Singamia” tal como se usa en la presente memoria se refiere a la descomposición de los pronúcleos (PNs) cuando los dos conjuntos de cromosomas se unen, lo que se produce en las primeras dos horas antes de la primera citoquinesis.

El parámetro temporal “P^syn” o “S” o “Pm¹”, tal como se usan de forma intercambiable en la presente memoria, se refieren a un parámetro definido por el tiempo entre la singamia y el inicio de la primera citoquinesis. Algunas veces no es posible visualizar el PN o medir la singamia, dichos embriones se dice que presentan “singamia no medible” o “US”. Adicionalmente, es posible que un embrión muestre patrones o tiempos de singamia atípicos. Dichos embriones se dice que presentan “singamia anormal” o “AS”. Los embriones AS muestran un movimiento de PNs desordenado dentro del citoplasma sin una rápida dispersión de las envolturas nucleares, y típicamente presentan un P^synmás corto en comparación con los embriones de singamia normal o “NS”. Esto puede visualizarse mediante microscopía a intervalos de tiempo cuando los PN se mueven de forma discontinua dentro del citoplasma, tanto juntos como separados, antes de su desaparición. Los embriones AS a menudo muestra movimiento activo de oolema antes de la dispersión de las envolturas nucleares. Por otro lado, los embriones NS muestran una desaparición puntual de PNs con una dispersión suave de las envolturas nucleares, con un movimiento pronuclear mínimo o nulo dentro del citoplasma, y un movimiento de oolema mínimo o nulo antes de la dispersión de las envolturas nucleares.

El parámetro “AC” tal como se usa en la presente memoria se refiere a divisiones anormales donde más de dos células surgen a partir de una única división. Por ejemplo, cuando un blastómero da lugar a más de dos células hijas, el embrión se refiere como embrión AC o se dice que el embrión presenta AC. Por “AC1” se pretende indicar que el fenotipo AC se produce en la primera división. En un embrión AC1, un embrión de célula individual se divide una vez y da lugar a un embrión de tres o más células (p.ej., 1 ^ 3 células) (Figura 4A). Por “AC2” se pretende indicar que el fenotipo AC se produce en la segunda división. En un embrión AC2, un blastómero individual se divide para dar lugar a tres o más células (p.ej., 1 ^ 4 células) (Figura 4B) durante la segunda división. Por “AC3- se pretende indicar que el fenotipo AC se produce en la tercera división. En un embrión AC3, un blastómero individual de un embrión de tres células se divide para dar lugar a tres o más células. La AC se puede producir en cualquier división, y/o durante más de un evento de división. Por ejemplo, un embrión AC1 (p.ej., 1 ^ 3 células) también puede presentar AC2 (p.ej., 3 ^ 5 células).

El término #2PN en la presente memoria se refiere al número de embriones que formaron dos pronúcleos después de la fertilización de una cohorte de óvulos in vitro. #2PN está relacionado con el número de óvulos recuperados de un paciente o donante particular, y la tasa de éxito de la fertilización in vitro (FIV) o del proceso de inyección de esperma intracitoplasmático (ICSI). Por ejemplo, si se recuperan 10 óvulos de una paciente o donante, se lleva a cabo una FIV o ICSI, y 7 óvulos son fertilizados y forman embriones con dos pronúcleos, #2PN sería 7.

El término “compactación” se refiere a la unión de las células exteriores del embrión mediante conexiones intercelulares, tales como uniones fijas, uniones de hueco y desmosomas, empezando aproximadamente en la etapa de 8 células. La compactación da como resultado una esfera compacta de células fuertemente unidas de la etapa de mórula. Durante la compactación, las fronteras de las células individuales se vuelven menos distinguibles.

El término “cavitación” se refiere al proceso que comienza cuando la capa externa de células de la mórula comienza a secretar fluido que crea una cavidad, formando de este modo un blastocisto que comprende un trofoectodermo externo y una masa celular interior.

El término “expansión de blastocisto” o “expansión” se refiere al proceso en el que aumenta el volumen, o el tamaño, del blastocisto. Por el contrario, el término “colapso de blastocisto” o “colapso” se refiere a una disminución del volumen o del tamaño de un blastocisto. Un blastocisto puede repetir la expansión y el colapso una o más veces.

El término “euploide” se usa en la presente memoria para referirse a una célula que contiene un número entero múltiple del haploide, o monoploide. Por ejemplo, una célula autosomática humana que tiene 46 cromosomas es euploide, y un gameto humano que tiene 23 cromosomas es euploide. Por “embrión euploide” se pretende indicar que las células del embrión son euploides.

El término “aneuploide” se usa en la presente memoria para referirse a una célula que contiene un número anormal de cromosomas. Por ejemplo, una célula que tiene un cromosoma adicional, o una parte de un cromosoma, y una célula a la que le falta un cromosoma, o una parte de un cromosoma, son ambas aneuploides. Por “embrión aneuploide” se pretende indicar que una o más células de un embrión son aneuploides. Por “cromosoma aneuploide” se pretende indicar un cromosoma que tiene más o menos de dos copias. Por ejemplo, el cromosoma 21 es aneuploide en embriones con trisomía 21. Los embriones aneuploides no son cromosómicamente normales y presentan un bajo potencial de desarrollo.

Por el término “monosomía” se pretende indicar una aneuploidía en la que un cromosoma específico está presente solo en una copia. Por “trisomía” se pretende indicar una aneuploidía en la que un cromosoma específico está presente en tres copias.

El término “aneuploidía compleja” se usa en la presente memoria para referirse a aneuploidías en las que 2 o más, por ejemplo 3 o más, o 4 o más, o 5 o más, o más de 6, cromosomas están afectados. Una aneuploidía compleja puede ser una mezcla de monosomías y trisomía. Por ejemplo, una aneuploidía compleja puede comprender ambas, una trisomía 21 y una monosomía 17, o cualquier otra combinación de monosomías y trisomías.

El término “aneuploidía no viable” se usa en la presente memoria para referirse a aneuploidías que, cuando están presentes, no dan como resultado un embrión viable. Los ejemplos de “aneuploidías no viables” incluyen, sin limitación, trisomía 2 y/o monosomía 1.

El término “aneuploidía que causa enfermedad” pretende indicar aquellas aneuploidías que pueden dar lugar, aunque no necesariamente, a embriones viables, pero para los cuales hay una enfermedad asociada. Los ejemplos de enfermedades que causan aneuploidías incluyen, aunque sin limitación, trisomía 21 (síndrome de Down), trisomía 18 (síndrome de Edward), trisomía 13 (síndrome de Patau), trisomía 16, trisomía 22 y aneuploidías de cromosoma sexual que incluyen, aunque sin limitación, monosomía X o 45X (síndrome de Turner) y XXY o 47XXY (síndrome de Klinefelter).

El foco de patentes y solicitudes previas, que incluyen las Patentes de EE.UU. n° 7.963.906, 8.323.177 y 8.337.387 y la Solicitud de Patente Internacional WO 2012/163363, se centra principalmente en los criterios de selección para embriones humanos en la fertilización in vitro. Aunque dichas patentes/solicitudes discuten cada una la determinación de si los embriones presentan un potencial de desarrollo bueno o malo (es decir, si tienen probabilidad o no de desarrollarse según se desea), los parámetros temporales descritos en las mismas se usan típicamente en la clínica en gran parte para seleccionar embriones con un buen potencial de desarrollo. Por el contrario, los métodos de la presente invención se centran en los eventos cinéticos de la etapa de mórula y/o blastocisto (p.ej., compactación, cavitación, expansión y colapso) usando características de imagen, y los parámetros de etapa de mórula y/o blastocisto se pueden usar para des-seleccionar embriones humanos y marcarlos para no transferencia en el tratamiento de fertilización in vitro. Estos parámetros pueden usarse solos o en combinación con los parámetros de selección descritos en las Patentes de EE.UU. n° 7.963.906, 8.323.177 y 8.337.387 y la Solicitud de Patente Internacional WO 2012/163363. Por ejemplo, una vez que se determina que un embrión tiene un buen potencial de desarrollo a través de los métodos de las Patentes de Ee .UU. n° 7.963.906, 8.323.177 y 8.337.387 y la Solicitud de Patente Internacional WO 2012/163363, dicho embrión puede analizarse adicionalmente para determinar uno o más de los nuevos parámetros de compactación, cavitación, expansión y colapso descritos en la presente memoria para aumentar adicionalmente la sensibilidad y la especificidad de los métodos reivindicados.

Los criterios de des-selección de la presente descripción incluyen una duración prolongada o acortada de la compactación, cavitación, expansión y colapso, así como los parámetros enumerados en la Tabla 1.

Tabla 1: Parámetros derivados de la expansión/colapso.

Se puede usar cualquiera de los parámetros enumerados en la Tabla 1 solo o en combinación unos con otros, o con otros parámetros celulares que incluyen los parámetros de criterios previamente descritos, que incluyen, aunque sin limitación, los descritos en la Tabla 2. Para los parámetros descritos tanto en la Tabla 1 como en la Tabla 2, y a lo largo de la especificación, a menos que se indique lo contrario, “tiempo desde” se usa para abarcar tanto el tiempo de inseminación hasta el parámetro de tiempo establecido como el tiempo desde la primera división hasta el parámetro establecido. Por ejemplo, el parámetro t5 incluido a continuación en la Tabla 2, aunque en la tabla se describe como el tiempo desde ICSI hasta un embrión de 5 células, dicho parámetro también contempla el tiempo entre la primera citoquinesis y un embrión de 5 células. De forma similar, el parámetro tCav descrito antes en la Tabla 1 se describe como el tiempo desde la primera división hasta la cavitación, pero también abarca el tiempo desde la inseminación hasta la cavitación.

Tabla 2. Lista de parámetros

En una realización, edad, #2PN, tCav y Psyn se usan en combinación para determinar la probabilidad de aneuploidía. En otra realización, Edad, Pexp-area y P3 se usan para determinar la probabilidad de aneuploidía. En algunas realizaciones, se usan clasificadores para clasificar estos modelos multi-parámetro en una de cinco categorías (1-5 o A-E) donde los embriones de la categoría n°1 (o categoría A) son los que tienen mayor probabilidad de ser euploides, mientras que los embriones de la categoría 5 (o categoría E) son los que tienen mayor probabilidad de ser aneuploides.

Para utilizar transferencia de embrión individual (SET) en el tratamiento de FIV para reducir el riesgo de resultados adversos asociados a embarazos de gestación múltiple, los embriólogos necesitan un método de selección de embriones fiable que permita una identificación consistente de los embriones con el mayor potencial de desarrollo. Recientemente, se ha demostrado que el análisis a intervalos de tiempo de la cinética de desarrollo embrionario proporciona una información valiosa para mejorar la selección de embriones, y los consiguientes resultados de embarazo. Sin embargo, las publicaciones previas que describen los eventos de etapa de mórula y/o blastocisto se basan en imágenes microscópicas estáticas (Fiilio et al. Hum. Reprod, (2012) 27(9): 2641-2648) o en el uso de análisis de vídeo manual (lwata et al. Hum, Reprod, (2010) 25 (Suppl, 1): 141-144; Campbell et al. Reproductive BioMedicine Online, 9 May 2013; y Mazur et al. Hum. Reprod. (2013) 28(Suppl. 1): 1149-1206). Aunque estas publicaciones correlacionan la calidad de embriones humanos y los tiempos de compactación, cavitación, expansión y/o colapso, la revisión manual de vídeos a intervalos de tiempo requiere mucho trabajo y tiempo. Además, la evaluación manual está sujeta a grandes variaciones inter- e intra-observador. Esto es especialmente problemático para los parámetros a intervalos de tiempo que implican los eventos de etapa de mórula y/o blastocisto (p.ej., compactación, cavitación, expansión y colapso), ya que dichos eventos se producen de un modo gradual, y es difícil para observadores humanos marcar el punto inicial y el punto final de cada evento de un modo consistente y reproducible. Por el contrario, los métodos de la presente invención proporcionan una medida más cuantitativa y automática o semi-automática para extraer los parámetros temporales de la cinética de desarrollo embrionario. Los métodos descritos en la presente memoria reducen las variaciones inter- e intra-observador asociadas al análisis manual subjetivo, y aumentan la eficacia de la medida de parámetros en comparación con el análisis manual.

Los métodos de la presente invención también proporcionan nuevos parámetros celulares de selección o des selección de embriones humanos que pueden medirse mediante microscopía a intervalos de tiempo.

En los métodos de la descripción, se evalúa uno o más embriones para determinar su probabilidad de ser euploides, y/o de alcanzar la etapa de blastocisto y/o de convertirse en un blastocisto de buena calidad y/o de implantarse en el útero y/o de nacer vivos, a través de la medición de uno o más parámetros celulares, que incluyen parámetros de compactación, cavitación, expansión y/o colapso, del embrión(es) y emplear dichas medidas para determinar la probabilidad de que el embrión(es) alcance la etapa de blastocisto o se implante en el útero. Dichos parámetros han sido descritos, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. n° 7.963.906; 8.323.177 y 8.337.387 y en la Solicitud de Patente internacional WO 2012/163363. La información derivada de esta forma puede usar para guiar decisiones clínicas, p.ej., para decidir si se transfiere o no un embrión fertilizado in vitro, si se trasplanta o no una célula o células cultivadas, si se congela o no un embrión para una implantación posterior, si se continúa o no con el cultivo del embrión, o si se evalúa o no el embrión mediante otros métodos tales como evaluación genética preimplantación, genómica, proteómica y/o secretómica.

Los ejemplos de embriones que pueden evaluarse mediante los métodos de la invención incluyen embriones de 1 célula (también referidos como zigotos), embriones de 2 células, embriones de 3 células, embriones de 4 células, embriones de 5 células, embriones de 6 células, embriones de 8 células, etc., típicamente hasta, incluido, embriones de 16 células, mórulas y blastocistos, cualquiera de los cuales puede ser derivado mediante cualquier modo conveniente, p.ej., de un ovocito que ha madurado in vivo o de un ovocito que ha madurado in vitro.

Los embriones pueden derivarse de cualquier organismo, p.ej., de cualquier especie de mamífero, p.ej., humano, primate, equino, bovino, porcino, canino, felino, etc. Preferiblemente, derivan de un humano. Pueden ser congelados previamente, p.ej., embriones criopreservados en la etapa de 1 células y después descongelados. Alternativamente, pueden haber sido recién preparados, p.ej., embriones que han sido recién preparados (no congelados antes de su cultivo) a partir de ovocitos mediante técnicas de fertilización in vitro (ovocitos frescos o previamente congelados); ovocitos que han sido recién recolectados y/o recién madurados mediante técnicas de maduración in vitro (que incluye, p.ej., ovocitos que son recolectados in vitro de tejido de ovario). Pueden ser cultivados en cualesquier condiciones convenientes (que incluyen diferentes tipos de medios de cultivo) conocidas en la técnica para promover la supervivencia, el crecimiento y/o el desarrollo de la muestra que va a ser evaluada, p.ej. para embriones, en condiciones tales como las usadas en la técnica de la fertilización in vitro; véase, p.ej., la Patente de EE.UU. n° 6.610.543, la Patente de EE.UU. n° 6.130.086, la Patente de EE.UU. n° 5.837.543; para ovocitos, en condiciones tales como las usadas en la técnica para promover la maduración de ovocitos; véase, p.ej., la Patente de EE.UU. n° 5.882.928 y la Patente de EE.UU. n° 6.281.013; para células madre en condiciones tales como las usadas en la técnica para promover el mantenimiento, la diferenciación y la proliferación, véase, p.ej., la Patente de EE.UU. n° 6.777.233, la Patente de EE.UU. n° 7.037.892, la Patente de e E.u U. n° 7.029.913, la Patente de EE.UU. n° 5.843.780 y la Patente de EE.UU. n° 6.200.806, la Solicitud de Patente de EE.UU. n° 2009/0047263; la Solicitud de Patente de EE.UU. n° 2009/0068742. A menudo, los embriones son cultivados en un medio disponible comercialmente tal como DMEM bloqueado, DMEM-F12, o Medio de Dulbecco Modificado iscoves que ha sido suplementado con suero o sustituto de suero, aminoácidos, factores de crecimiento y hormonas ajustados a las necesidades del embrión particular que esté siendo evaluado.

En algunas realizaciones, los embriones son evaluados midiendo parámetros celulares mediante imágenes a intervalos de tiempo. Los embriones pueden cultivarse en placas de cultivo estándar. Alternativamente, los embriones pueden cultivarse en placas de cultivo a medida, p.ej. placas de cultivo a medida con micropocillos de calidad óptica, tal como se describe en la presente memoria. En dichas placas de cultivo a medida, cada micropocillo contiene un único óvulo fertilizado o embrión, y la superficie del fondo de cada micropocillo tiene un acabado de calidad óptica, de tal modo que el grupo entero de embriones de una sola placa pueden ser sometido a obtención de imágenes simultáneamente con un único microscopio de miniatura con resolución suficiente para seguir los procesos de mitosis celular. El grupo entero de micropocillos comparte la misma gota de medio en la placa de cultivo, y también puede incluir una pared exterior posicionada alrededor de los micropocillos para estabilizar la gota de medio, así como marcadores fiduciarios ubicados cerca de los micropocillos. Las gotas de medio pueden tener diferentes volúmenes. La hidrofobicidad de la superficie se puede ajustar con marcaje de plasma u otro tratamiento para evitar la formación de burbujas en los micropocillos cuando se llenan de medio. independientemente de si se utiliza una placa de cultivo estándar o una placa de cultivo a medida, durante el cultivo se puede cultivar uno o más embriones en desarrollo en el mismo medio de cultivo, p.ej., se pueden cultivar entre 1 y 30 embriones por placa. Realizaciones específicas de placas de cultivo se describen, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. n° 2014/0106389. Otras realizaciones adicionales de placas de cultivo adecuadas para uso en sistemas automatizados de obtención de imágenes con el tiempo se describen en la Patente de EE.UU. n° 8.633.017.

Se adquieren imágenes con el tiempo, y entonces son analizadas para obtener las medidas de uno o más parámetros celulares. La obtención de imágenes a intervalos de tiempo se puede realizar mediante cualquier microscopio controlado por ordenador que esté equipado para el almacenamiento y análisis de imágenes digitales, por ejemplo, microscopios invertidos equipados con etapas calefactadas y cámaras de incubación, o sistemas de microscopios en miniatura construidos a medida que se ajustan dentro de una incubadora convencional. El sistema de microscopios en miniatura permite el cultivo concurrente de múltiples placas de muestras en la misma incubadora, y es escalable para acomodar múltiples canales sin limitaciones en el intervalo de tiempo mínimo entre sucesivas capturas de imagen. El uso de microscopios múltiples elimina la necesidad de mover la muestra, lo que mejora la precisión del sistema y la fiabilidad general del sistema. Los microscopios individuales de la incubadora pueden estar aislados parcial o completamente, proporcionando a cada placa de cultivo su propio entorno controlado. Esto permite que las placas sean transferidas a y desde estaciones de imagen sin afectar al entorno de las otras muestras. Los ejemplos de sistemas de imagen preferidos se describen, por ejemplo, en la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. n1 2014/0106389. En la Figura 13 se ilustra un diagrama esquemático de un sistema de imagen 200 según una realización de la descripción. El sistema de imagen 200 incluye un sistema de microscopio de canal individual o de canal múltiple que incluye electrónica incorporada ubicada dentro de una caja externa 205, en referencia a las Figs. 12 y 13, en una realización, el sistema de imagen 200 puede comunicarse con el ordenador 125. Alternativamente, el sistema de imagen 200 puede comunicarse con un controlador fuera de la incubadora 105 y puede incluir un conjunto reducido de elementos electrónicos incorporados. El resto de elementos electrónicos incorporados puede estar incluido en el controlador. La caja 205 puede estar construida en materiales no tóxicos para los embriones, tal como aluminio y plásticos. En una realización, una plataforma de carga 210 que se extiende hacia el exterior de la caja 205 permite que una placa 215 de cultivo multipocillo sea posicionada para la obtención de imágenes con el sistema de microscopio. Alternativamente, la placa de cultivo multipocillo 215 puede cargarse en una cámara de cultivo integrada en la caja 20.5. Los embriones se pueden ubicar en la placa 215 con la pipeta 225. En una realización, el sistema de microscopio incluye software para monitorizar la carga de una placa 215 en la plataforma de carga 210 y hacer los ajustes necesarios para la obtención de imágenes apropiadas de los embriones cultivados en la placa. Otra realización de un sistema de obtención de imágenes para monitorizar simultáneamente múltiples embriones humanos que es útil para la presente descripción se describe en la Patente de EE.UU. n° 8.265.357 y la Patente de EE.UU. n° 8.633.017, y en la Publicación de Patente de EE.UU. n° 2014/0212911.

El sistema de obtención de imágenes para las imágenes a intervalos de tiempo puede emplear iluminación de campo brillante, iluminación de campo oscuro, contraste de fase, contraste de modulación Hoffman, contraste de interferencia diferencial, luz polarizada, fluorescencia, sencilla o multiplano o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, se puede usar iluminación de campo oscuro para proporcionar un contraste de imagen mejorado para la posterior extracción de características y análisis de imagen. Adicionalmente, se pueden usar fuentes de luz infrarroja o próxima al infrarrojo para reducir la fototoxicidad y mejorar la relación contraste entre las membranas celulares y la porción interna de las células. La Figura 14A-C ilustra una vista esquemática de sistemas de iluminación de campo oscuro que pueden usarse en los microscopios. El sistema de iluminación de campo oscuro 500 de la Fig. 14A ilustra un ejemplo de una estrategia de iluminación de campo oscuro tradicional para uso con microscopios a intervalos de tiempo tal como el microscopio 400, el sistema de iluminación de campo oscuro 505 de la Fig. 14B ilustra un ejemplo de una estrategia que usa epi-iluminación, y el sistema de iluminación de campo oscuro 530 de la Fig. 14C ilustra otra estrategia para campo oscuro epi-iluminado. En el sistema 505, por ejemplo, se puede colocar un espejo 510 en un ángulo de 45 grados con un agujero circular en el medio bajo el objetivo de obtención de imágenes 515. Un cono hueco de luz es reflejado por el espejo hacia arriba, al objetivo de obtención de imágenes 515, donde es enfocado sobre la muestra 520. La luz dispersada por la muestra 520 es captada por el mismo objetivo de obtención de imágenes 515 y pasa a través del agujero del espejo 510 y hacia un tubo-lente y cámara 525 para la captación de la imagen. Adicionalmente, se pueden usar fuentes de luz infrarroja o del infrarrojo cercano para reducir la fototoxicidad y mejorar la relación de contraste entre las membranas celulares y la porción interna de las células. En otras realizaciones, las imágenes pueden ser capturadas usando una o más longitudes de onda de iluminación, y las diversas imágenes pueden combinarse o usarse para proporcionar información adicional.

En una realización, se puede colocar una apertura de campo oscuro 502 tal como se ilustra en la Fig. 14A. Alternativamente, la apertura de campo oscuro 502 puede colocarse en otras configuraciones, tal como entre el espejo de 45 grados 504 y la lente de condensación 506, o después de la lente de condensación 506.

Las imágenes que son adquiridas pueden almacenarse de forma continua, como en un video en directo, o de forma intermitente, como fotografías a intervalos de tiempo, donde se captan imágenes del objetivo de forma repetida en una imagen fija. Las imágenes también pueden ser adquiridas en respuesta a un evento detectado o a un evento programado a fin de, por ejemplo, obtener unas características basadas en imagen más granulares a partir de un muestreo aumentado o disminuido de una secuencia de imágenes. Preferiblemente, el intervalo de tiempo entre imágenes debería ser entre 1 y 30 minutos, o entre 1 y 20 minutos o entre 1 y 15 minutos, o entre 1 y 10 minutos, o entre 1 y 5 minutos, para capturar los eventos morfológicos significativos, como se describe más adelante. En una realización alternativa, el intervalo de tiempo entre imágenes podría variar dependiendo de la cantidad de actividad celular. Por ejemplo, durante los periodos activos se podrían tomar imágenes cada pocos segundos o cada minuto, mientras que durante los periodos inactivos se podrían tomar imágenes cada 10 o 15 minutos, o más. El análisis de imágenes en tiempo real de las imágenes capturadas podría usarse para detectar cuándo y cómo varían los intervalos de tiempo. En nuestros métodos, la cantidad total de luz recibida por las muestras se estima que es equivalente a aproximadamente 52 segundos de exposición de luz continua de bajo nivel durante 5 días de obtención de imágenes. La intensidad lumínica para un sistema de obtención de imágenes a intervalos de tiempo es significativamente más baja que la intensidad lumínica usada en un microscopio de reproducción asistida debido a la baja potencia de los LEDs (por ejemplo, usando un LED de 1 W en comparación con una bombilla halógena típica de 100 W) y a la elevada sensibilidad del sensor de la cámara. Por tanto, la cantidad total de energía lumínica recibida por un embrión usando el sistema de obtención de imágenes a intervalos de tiempo es comparable o inferior a la cantidad de energía recibida durante el manejo rutinario en una clínica de FIV. Adicionalmente, el tiempo de exposición se puede acortar significativamente para reducir la cantidad total de exposición de luz al embrión. Para la obtención de imágenes de 2 días, capturando imágenes cada 5 minutos a 0,5 segundos de exposición de luz por imagen, la cantidad total de exposición a luz de bajo nivel es inferior a 21 segundos. Un sistema de cámara adecuado para capturar imágenes es el descrito en la Patente de EE.UU. n° 8.265.357. En este sistema, la grabación a intervalos de tiempo de los embriones es dirigida por un software de análisis de imágenes que controla los movimientos de la etapa de escaneo que sostiene el portaobjetos del microscopio; la operación de una videocámara de alta sensibilidad lumínica; y el almacenamiento y grabación de secuencias a intervalos de tiempo en un disco duro de ordenador.

Después de la adquisición de imágenes, los embriones son localizados y analizados para determinar diferentes parámetros celulares o parámetros basados en imagen, por ejemplo, tamaño de zigoto, tamaño de blastómero, espesor de la zona pelúcida, suavidad o plegamiento de la membrana plasmática, suavidad o plegamiento del oolema, formación de uno o más surcos de pseudo división, grado de fragmentación, simetría de células hijas resultantes de una división celular, intervalos de tiempo entre las primeras mitosis, duración de la citoquinesis, tiempo y calidad de la singamia, área de segmentación de frontera externa, distribución de segmentos de frontera en el centro del embrión, cambios en la desviación estándar de la distribución de segmentos en el centro del embrión, forma del embrión y textura en el borde o el centro del embrión. Los métodos de análisis de imagen que pueden usarse para analizar parámetros celulares y basados en imagen incluyen, por ejemplo, métodos basados en la forma (p.ej., determinación de umbrales, extracción de masa, ajuste de plantilla y transformadas de Hough (líneas, elipses, forma arbitraria, etc.)), métodos de nivel bajo (p.ej., detección de bordes, textura, crestas, esquinas, masas; detectores de características de imagen local tales como transformada de característica invariante de escala (SIFT) y características robustas aceleradas (SURF), patrones binarios locales (LBP), características GLOH de tipo SIFT, PCA-SIFT y detector SIFT-Rank), y métodos de curvatura (p.ej., dirección de borde, cambio de intensidad y correlación). Otros parámetros adicionales celulares y basados en imagen que pueden analizarse se describen en los documentos WO 2014/001312 y WO 2014/033210. El análisis puede implicar medir características, p.ej. la textura, del embrión completo, o en regiones específicas del embrión tal como el borde del embrión y/o el centro del embrión. Estos parámetros celulares o basados en imagen pueden usarse en conjunción con clasificadores, métodos de agrupación y similares para producir la predicción pretendida de las variables clínicas.

Los parámetros celulares que pueden medirse mediante obtención de imágenes a intervalos de tiempo normalmente son eventos morfológicos. Por ejemplo, para la evaluación de embriones se pueden usar imágenes a intervalos de tiempo para visualizar la duración de la compactación y/o cavitación y/o expansión y/o colapso. Adicionalmente, se pueden usar imágenes a intervalos de tiempo para medir la duración de tiempo entre la compactación y el inicio o resolución de la cavitación, expansión o colapso, o el tiempo entre la primera división y la cavitación (tCav). Adicionalmente, se pueden usar las imágenes a intervalos de tiempo para medir la duración de tiempo entre la cavitación y el inicio o resolución de la expansión o colapso. Se pueden usar las imágenes a intervalos de tiempo para medir el tiempo entre el inicio de la expansión y el inicio o resolución del colapso. Otro parámetro de interés es la frecuencia de expansión y/o colapso de blastocistos. Otros parámetros de interés son la velocidad de expansión, la velocidad de colapso, el tamaño medio de embrión después de la expansión inicial (Pexp-area), el grado de expansión y el grado de colapso. Los parámetros celulares de interés que pueden medirse mediante imágenes a intervalos de tiempo incluyen intervalos de tiempo definidos por dichos eventos celulares, p.ej., (a) el intervalo de tiempo entre la compactación y la cavitación, definible como cualquiera de los intervalos entre el inicio de la compactación y el inicio de la cavitación, el intervalo entre la resolución de la compactación y la resolución de la cavitación, el intervalo entre el inicio de la compactación y la resolución de la cavitación; o el intervalo entre la resolución de la compactación y el inicio de la cavitación; o (b) el intervalo de tiempo entre la cavitación y la expansión, definible como cualquiera de los intervalos entre el inicio de la cavitación y el inicio de la expansión, o el intervalo entre la resolución de la cavitación y la resolución de la expansión, o el intervalo entre el inicio de la cavitación y la resolución de la expansión, o el intervalo entre la resolución de la cavitación y el inicio de la expansión; o (c) el intervalo de tiempo entre la expansión y el colapso, definible como cualquiera de los intervalos entre el inicio de la expansión y el inicio del colapso, el intervalo entre la resolución de la expansión y la resolución del colapso, el intervalo entre el inicio de la expansión y la resolución del colapso; o el intervalo entre la resolución de la expansión y el inicio del colapso. Se puede estimar o determinar el volumen o el tamaño midiendo, por ejemplo, el diámetro y/o la circunferencia y/o el área del blastocisto. Por ejemplo, los parámetros de imagen de microscopía a intervalos de tiempo, tal como la segmentación de frontera exterior de embrión, se pueden usar para calcular el área del embrión descrita en la presente memoria.

Para los propósitos de la fertilización in vitro, se considera ventajoso que el embrión sea transferido al útero de forma temprana en el desarrollo para reducir la pérdida de embriones debido a las desventajas de las condiciones de cultivo relativas al entorno in vitro, y para reducir los potenciales resultados adversos asociados a errores epigenéticos que pueden producirse durante el cultivo (Katari et al. (2009) Hum Mol Genet. 18(20): 3769-78; Sepúlveda et al. (2009) Fertil Steril. 91(5): 1765-70). Por consiguiente, es preferible que la medida de los parámetros de compactación y/o cavitación y/o expansión y/o colapso tenga lugar en las primeras aproximadamente 36 horas, aproximadamente 54 horas, aproximadamente 60 horas, aproximadamente 72 horas, aproximadamente 84 horas, aproximadamente 96 horas, aproximadamente 120 horas, o más. La formación de mórula y de blastocisto generalmente se produce aproximadamente entre el día 3 y el día 5 después de la fertilización y, por tanto, determinados parámetros, p.ej., la expansión y colapso de blastocistos, pueden requerir el cultivo in vitro del embrión durante hasta aproximadamente 5 días o más.

Los parámetros se pueden medir manualmente, o pueden medirse automáticamente, p.ej., mediante un software de análisis de imágenes. Cuando se emplea un software de análisis de imágenes, se pueden usar algoritmos de análisis de imágenes que emplean una técnica de estimación de modelos probabilísticos. La técnica de estimación de modelos probabilísticos puede basarse en un método de Monte Carlo secuencial, p.ej., generando distribuciones de modelos de embrión hipotéticas, simulando imágenes en base a un modelo óptico sencillo, y comparando dichas simulaciones con los datos de imágenes observadas. Cuando se emplean dichas estimaciones de modelos probabilísticos, las células pueden modelizarse en cualquier forma apropiada, p.ej., como colecciones de elipses en espacio 2D, colecciones de elipsoides en espacio 3D, y similares. Para tratar con las oclusiones y las ambigüedades de profundidad, el método puede forzar restricciones geométricas que se correspondan con el comportamiento físico esperado. Para mejorar la robustez, las imágenes se pueden capturar en uno o más planos focales. Una descripción más detallada de dicha técnica se proporciona en la Patente de EE.UU. n° 7.963.906. Alternativa o adicionalmente, el algoritmo de análisis de imagen puede hacer uso de características celulares observables tales segmentos de frontera en un modelo de campo aleatorio condicional (CRF) sobre el que se puede realizar una inferencia aproximada dirigida por datos multi-paso. Una descripción más detallada de dicha técnica se proporciona en Moussavi et al. (2014) “A Unified Graphical Models Framework for Automated Human Embryo Tracking in Time Lapse Microscopy”, International Symposium on Biomedical Imaging, en prensa. También se pueden emplear otros métodos diferentes a los modelos probabilísticos que no siguen a las células individualmente si no que extraen características directamente de las imágenes y usan dichas características para clasificación o análisis. Por ejemplo, se puede emplear la clasificación celular basada en imágenes y/o la clasificación basada en resultado aplicada a series de imágenes. La clasificación se puede basar en características que incluyen características manufacturadas y/u obtenidas mecánicamente. Una descripción más detallada de dicha estrategia de clasificación se proporciona en “Automated embryo stage classification in time-lapse microscopy video of early human embryo development”, Yu Wang, Farshid Moussavi, Peter Lorenzen, International Conference on Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention (MICCAI), vol.

8150 de “Lecture Notes in Computer Science”, páginas 460-467, Springer, 2013. También se pueden usar estrategias basadas en clasificación en conjunción con estrategias basadas en seguimiento, tal como se describe en Moussavi et al. (2014) “A Unified Graphical Models Framework for Automated Human Embryo Tracking in Time Lapse Microscopy”, International Symposium on Biomedical Imaging, en prensa. Otros algoritmos y métodos para analizar imágenes se describen en la Patente de EE.UU. n28.265.357, WO 2014/001312 y WO 2014/033210.

Una vez obtenidas las medidas de parámetros celulares, las medidas se emplean para determinar la probabilidad de que el embrión se desarrolle en un blastocisto y/o se convierta en un blastocisto de buena calidad y/o se implante en el útero y/o nazca vivo y/o sea euploide. Por ejemplo, se puede usar un parámetro de compactación y/o cavitación y/o expansión y/o colapso para determinar la probabilidad de que el embrión sea euploide. Alternativamente, se puede usar un parámetro de compactación y/o cavitación y/o expansión y/o colapso para determinar la probabilidad de que el embrión sea aneuploide.

Alternativamente, las medidas se pueden emplear para hacer predicciones del resultado de tratamiento de una paciente, que incluye la probabilidad de que una paciente que ha recibido uno o más de dichos embriones quede embarazada y/o de que lleve el embarazo a término o sufra un aborto espontáneo. Las medidas también pueden usarse para determinar la probabilidad de que una hembra particular produzca al menos un blastocisto euploide.

En algunas realizaciones, la medida del parámetro de compactación y/o cavitación se usa directamente para determinar la probabilidad de que un embrión sea euploide, alcance la etapa de blastocisto o se convierta en un embrión de buena calidad. En algunas realizaciones, la medida del parámetro de compactación y/o cavitación y/o expansión y/o colapso se usa directamente para determinar la probabilidad de que un embrión sea euploide y/o se implante con éxito en el útero y/o nazca vivo. En otras palabras, el valor absoluto de la propia medida es suficiente para determinar la probabilidad de que un embrión sea euploide y/o alcance la etapa de blastocisto y/o se implante en el útero y/o nazca vivo.

En algunas realizaciones, la medida del parámetro de compactación y/o cavitación y/o expansión y/o colapso se emplea para compararlo con la respectiva medida de parámetro de compactación y/o cavitación y/o expansión y/o colapso de un embrión de referencia, o de control, y usando el resultado de dicha comparación para proporcionar una determinación de la probabilidad de que el embrión sea euploide, alcance o no alcance la etapa de blastocisto y/o se convierta en un blastocisto de buena calidad, y/o se implante en el útero y/o nazca vivo. Los términos “referencia” y “control”, tal como se usan en la presente memoria significan un embrión o célula estandarizado para usarse en la interpretación de las medidas de parámetro de compactación y/o cavitación y/o expansión y/o colapso de un embrión dado, y asignar una determinación de la probabilidad de que el embrión sea euploide, alcance la etapa de blastocisto, y/o se convierta en un blastocisto de buena calidad y/o se implante en el útero y/o nazca vivo. La referencia o control puede ser un embrión que se sepa que presenta un fenotipo deseado, p.ej., euploide, que probablemente alcance la etapa de blastocisto, y/o que se convierta en un blastocisto de buena calidad y/o se implante en el útero y/o nazca vivo, y por tanto puede ser un embrión de referencia o control positivo. Alternativamente, el embrión de referencia/control puede ser un embrión que se sepa que no presenta el fenotipo deseado, p.ej., un embrión aneuploide, y que por tanto sea un embrión de referencia o control negativo.

En determinadas realizaciones, los parámetros de compactación y/o cavitación y/o expansión y/o colapso son empleados primero para determinar si un embrión será euploide, si tendrá probabilidad de alcanzar la etapa de blastocisto, y/o de convertirse en un blastocisto de buena calidad y/o de implantarse en un útero y/o de nacer vivo. En dichas realizaciones, los embriones que entran dentro de uno o más de los anteriormente referenciados marcos temporales de parámetros de compactación y/o cavitación y/o expansión y/o colapso (p.ej., duración de la compactación, duración de la cavitación, duración de la expansión, duración del colapso, duración entre compactación y cavitación, duración entre cavitación y expansión, y/o duración entre expansión y colapso) se seleccionan por presentar un buen potencial de desarrollo. Dichos embriones son analizados entonces para determinar si presentan una duración normal de compactación y/o cavitación y/o expansión y/o colapso, y/o una duración normal del intervalo entre compactación y/o cavitación y/o expansión y/o colapso. Los embriones seleccionados previamente por presentar un buen potencial de desarrollo son des-seleccionados cuando se determina que presentan una duración prolongada o acortada de la compactación y/o cavitación y/o expansión y/o colapso, y/o uno o más intervalos de duración anormal entre compactación y/o cavitación y/o expansión y/o colapso, de este modo seleccionando para implantación o congelación para una futura implantación potencial, solo aquellos embriones que entran dentro de los criterios de selección y queda fuera de los criterios de des-selección.

En determinadas realizaciones, la(s) medida(s) obtenida(s) de parámetros de compactación y/o cavitación y/o expansión y/o colapso se compara(n) con una(s) medida(s) comparable(s) de parámetros de compactación y/o cavitación y/o expansión y/o colapso de un único embrión de referencia/control para obtener información al respecto del fenotipo del embrión/célula que está siendo evaluado. En otras realizaciones adicionales, la(s) medida(s) obtenida(s) de parámetros de compactación y/o cavitación y/o expansión y/o colapso se compara(n) como una(s) medida(s) comparable(s) de parámetros de compactación y/o cavitación y/o expansión y/o colapso de dos o más embriones de referencia/control diferentes para obtener más información respecto al fenotipo del embrión/célula evaluado. Por ejemplo, las medidas obtenidas de parámetros de compactación y/o cavitación y/o expansión y/o colapso del embrión(es) que está(n) siendo evaluado(s) pueden compararse tanto con un embrión positivo como con uno negativo para obtener información confirmada relativa a si el embrión/célula presenta el fenotipo de interés.

Tal como se ha discutido anteriormente, se puede medir uno o más parámetros y emplearse para determinar la probabilidad de un embrión de ser euploide, de alcanzar la etapa de blastocisto y/o de convertirse en un blastocisto de buena calidad y/o de implantarse en el útero y/o de nacer vivo. En algunas realizaciones, una medida de dos parámetros puede ser suficiente para alcanzar una determinación de la probabilidad de ser euploide, alcanzar la etapa de blastocisto y/o convertirse en un blastocisto de buena calidad y/o implantarse en el útero y/o nacer vivo. En algunas realizaciones, puede ser deseable emplear medidas de más de dos parámetros, por ejemplo, 3 parámetros celulares o 4 o más parámetros celulares. En algunas realizaciones, puede ser deseable medir uno o más parámetros para seleccionar un embrión con un buen potencial de desarrollo y uno o más parámetros para des-seleccionar embriones con un mal potencial de desarrollo. En determinadas realizaciones, se mide 1 parámetro de selección y 1 parámetro de des-selección. En otra realización, se mide 1 parámetro de selección y 2 parámetros de des-selección. En otra realización, se mide 1 parámetro de selección y 3 parámetros de des-selección. En otra realización, se miden 2 parámetros de selección y 1 parámetro de des-selección. En otra realización, se miden 3 parámetros de selección y 1 parámetro de des-selección. En otra realización, se miden más de 3 parámetros de selección y 1 parámetro de des selección. En otra realización, se miden 2 parámetros de selección y 2 parámetros de des-selección. En otra realización, se miden 2 parámetros de selección y 3 parámetros de des-selección. En otra realización, se miden 3 parámetros de selección y 2 parámetros de des-selección. En otra realización, se miden más de 3 parámetros de selección y 2 parámetros de des-selección. En otra realización, se miden más de 3 parámetros de selección y 3 parámetros de des-selección.

En algunas realizaciones, la Edad se puede combinar con uno o más parámetros adicionales enumerados en las Tablas 1 y 2 para determinar la probabilidad de que un embrión sea aneuploide o euploide. En una realización, se combina la Edad en un único clasificador con #2PN, tCav y Psyn. En otra realización, se combina la Edad en un único clasificador con Pexp-area y P3. En algunas realizaciones, el clasificador se usa para categorizar los embriones en grados o rankings de 1-5 para determinar la probabilidad relativa de aneuploidía en un embrión. Los métodos de clasificador y los algoritmos descritos en la Solicitud de Patente de EE.UU. 14/194.386 se puede usar para analizar combinaciones de los parámetros y para categorizar los embriones.

En algunas realizaciones, los parámetros celulares descritos en la presente memoria pueden usarse para determinar la probabilidad de que un embrión se implante en el útero de una hembra. En dichas realizaciones, los embriones que han sido determinados en primer lugar como euploides bien por PGS o bien por los métodos descritos en la presente memoria (o por ambos) son analizados adicionalmente para determinar el porcentaje de tiempo que el embrión invierte en expandirse o, puesto de otro modo, la cantidad media de tiempo que un embrión invierte en la expansión. En dichas realizaciones, un embrión que invierte un periodo más largo de tiempo en la expansión que otro embrión, tiene más probabilidad de implantarse que el embrión que invierte un periodo de tiempo más corto en la expansión. En esta realización, los embriones se pueden clasificar unos respecto a los otros en base al porcentaje de tiempo que invierte cada uno en la expansión. En otra realización, se puede usar el propio porcentaje de tiempo como una métrica de la probabilidad de que un embrión euploide se implante en el útero. En dichas realizaciones, un embrión que invierte al menos el 85% del tiempo en expansión tiene una mayor probabilidad de implantarse que un embrión que pasa menos de aproximadamente el 85% del tiempo en expandirse. Adicionalmente, un embrión que pasa al menos el 86%, 87%, 88%, 89% o 90% o más en la expansión tiene una alta probabilidad de implantación. Inversamente, un embrión euploide que pasa menos de aproximadamente el 85% del tiempo expandiéndose tiene una probabilidad reducida de implantarse en el útero.

En algunas realizaciones, la cantidad media de tiempo que invierte cada embrión euploide en cada evento de expansión es predictiva de si el embrión euploide se implantará en el útero o no. En esta realización, cuanto más tiempo pase un embrión euploide en cada evento de expansión respecto a otro embrión mayor será la probabilidad de que el embrión euploide se implante en el útero. En otra realización, el tiempo medio invertido en cada evento de expansión en sí mismo puede usarse como métrica para la probabilidad de que un embrión euploide se implante en el útero. En dichas realizaciones, un embrión que pasa al menos aproximadamente una media de 120 minutos o más en cada evento de expansión tiene una mayor probabilidad de implantación que un embrión que pasa menos de aproximadamente 120 minutos en cada evento de expansión. Además, un embrión que pasa una media de al menos aproximadamente 125, 130 o 135 minutos, o más, en cada evento de expansión tiene una mayor probabilidad de implantación. Inversamente, un embrión euploide que pasa menos que una media de aproximadamente 120 minutos o 115 minutos en cada expansión tiene una menor probabilidad de implantación.

En determinadas realizaciones, la evaluación de múltiples parámetros puede ser deseable, ya que evaluar múltiples parámetros puede proporcionar una mayor sensibilidad y especificidad. Por sensibilidad se pretende indicar la proporción de positivos reales que son identificados correctamente como tales. Esto se puede representar matemáticamente del siguiente modo:

(.Número de positivos verdaderos)

Sensibilidad =

(.Número de positivos verdaderos Número de negativos falsos)

De esta mantera, en un método en el que los “positivos” son los embriones que presentan un buen potencial de desarrollo, es decir, que se convertirán en un blastocisto de buena calidad y/o se implantarán en el útero y/o son euploides, y “negativos” son los embriones que tienen un bajo potencial de desarrollo, es decir, que no se desarrollarán en blastocistos de buena calidad y/o no se implantarán en el útero y/o no serán euploides, una sensibilidad del 100% significa que el test reconoce que todos los embriones se convertirán en blastocistos de buena calidad o se implantarán en el útero o serán cromosómicamente normales como tales. En algunas realizaciones, la sensibilidad del ensayo puede ser de aproximadamente 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o más, p.ej., 100%. Por especificidad se pretende indicar la proporción de “negativos” que son identificados correctamente como tales. Como se ha discutido antes, el término “especificidad” cuando se usa en la presente memoria en relación a los métodos de predicción y/o evaluación se usa para referirse a la capacidad para predecir o evaluar un embrión para determinar la probabilidad de que el embrión no se convierta en un blastocisto de buena calidad o no se implante en el útero o no sea euploide, a través de la evaluación, determinación, identificación o selección de embriones que no tienen probabilidad de convertirse en un blastocisto de buena calidad y/o de implantarse en el útero y/o de ser euploides. Esto se puede representar matemáticamente del siguiente modo:

(Número de negativos verdaderos)

Especificidad =

(Número de negativos verdaderos Número de positivos falsos)

De esta manera, en un método en el que los positivos son los embriones que tienen probabilidad de convertirse en blastocistos de buena calidad y/o de implantarse en el útero y/o de ser euploides, y negativos son los embriones que no tienen probabilidad de desarrollarse en blastocistos de buena calidad y/o de implantarse en el útero y/o de ser euploides, una especificidad del 100% significa que el test reconoce que ninguno de los embriones se desarrollará en blastocistos de buena calidad y/o se implantará en el útero y/o será euploide. En algunas realizaciones, la especificidad puede ser una “especificidad alta”. Adicionalmente, los valores medios especificados y/o los puntos de corte pueden modificarse dependiendo del conjunto de datos usado para calcular dichos valores, así como de la aplicación específica. La identificación de embriones que tienen probabilidad de convertirse en blastocistos de buena calidad y/o de implantarse en el útero y/o de ser euploides, se puede realizar usando un software de clasificación tal como el descrito en la Solicitud de Patente de los EE.UU. 14/194.386.

En algunas realizaciones, la evaluación de un embrión incluye generar un informe escrito que incluya la evaluación del especialista de embrión objeto, p.ej., “evaluación/selección/determinación de embriones que tienen probabilidad o no de desarrollarse en blastocistos de buena calidad y/o de implantarse en el útero”, una “evaluación de anormalidades cromosómicas”, etc. Por tanto, un método objeto puede incluir además una etapa de generar o dar salida a un informe que proporcione los resultados de dicha evaluación, informe que puede ser proporcionado en formato de medio electrónico (p.ej., una pantalla electrónica en un monitor de ordenador), o en formato de medio tangible (p.ej., un informe impreso en papel u otro medio tangible).

Un “informe”, tal como se describe en la presente memoria, es un documento electrónico o tangible que incluye elementos de informe que proporcionan información de interés relativa a una evaluación realizada mediante los métodos de la invención. Un informe objeto puede ser generado completa o parcialmente de forma electrónica. Un informe sujeto incluye al menos una evaluación de la probabilidad de que el embrión objeto alcance la etapa de blastocisto y/o se implante en el útero, una evaluación de la probabilidad de la existencia de anormalidades cromosómicas, etc. Un informe objeto puede incluir además uno o más de: 1) información relativa a las instalaciones de evaluación; 2) información del proveedor del servicio; 3) datos del sujeto; 4) datos de la muestra; 5) una sección detallada de informe de evaluación, que proporciona información relativa a cómo se realizó la evaluación, p.ej., a) las medidas de parámetros celulares tomadas, b) valores de referencia empleados, si los hay; y 6) otras características.

El informe puede incluir información sobre las instalaciones de evaluación, información que es relevante para el hospital, clínica o laboratorio en el que se realiza la recolección de muestras y/o la generación de datos. La recolección de muestras puede incluir cómo se generó la muestra, p.ej., cómo fue tomada de un sujeto, y/o cómo fue cultivada, etc. La generación de datos puede incluir cómo se adquirieron las imágenes o cómo se analizaron los perfiles de expresión génica. Esta información puede incluir uno o más detalles relativos, por ejemplo, al nombre y localización de las instalaciones de evaluación, la identidad del técnico de laboratorio que llevó a cabo el ensayo y/o que introdujo los datos de partida, la fecha y hora en que se llevó a cabo y/o se analizó el ensayo, la localización donde se almacenan los datos de la muestra y/o el resultado, el número de lote de los reactivos o medio de cultivo (p.ej., kit, etc.) usados en el ensayo, y otros similares. Los campos del informe con esta información se pueden poblar de forma general con información proporcionada por el usuario.

El informe puede incluir información sobre el proveedor del servicio, que puede estar localizado fuera del centro sanitario en la que se localiza el usuario, o dentro del centro sanitario. Los ejemplos de dicha información pueden incluir el nombre y la localización del proveedor del servicio, el nombre del revisor, y cuando sea necesario o se desee el nombre del individuo que llevó a cabo la preparación de la muestra y/o la generación de datos. Los campos del informe con esta información se pueden poblar de forma general usando datos introducidos por el usuario, que pueden seleccionarse entre selecciones predefinidas (p.ej., usando un menudo desplegable). Otra información del proveedor del servicio en el informe puede incluir información de contacto para información técnica sobre el resultado y/o sobre el informe interpretativo.

El informe puede incluir una sección de datos del sujeto, que incluyen el historial médico de sujetos de las que se obtienen los ovocitos, la edad de la paciente, las características del ciclo de fertilización in vitro (p.ej., tasa de fertilización, nivel de hormona estimulante de folículos (FSH) en el día 3), y, cuándo se recolectan los ovocitos, parámetros de cohorte de zigoto/embrión (p.ej., el número total de embriones). Estos datos del sujeto pueden integrase para mejorar la evaluación del embrión y/o para ayudar a determinar el número óptimo de embriones para transferencia. El informe también incluye datos administrativos del sujeto (es decir, datos que no son esenciales para la evaluación de la probabilidad de implantación en el útero) tal como información para identificar al sujeto (p.ej., nombre, fecha de nacimiento del sujeto (DOB), género, dirección de correo y/o de residencia, número de registro médico (MRN), número de habitación y/o cama en un centro sanitario), información del seguro, y similares), el nombre del facultativo del sujeto o de otro profesional sanitario que solicitara la evaluación del potencial de desarrollo y, si es diferente del facultativo solicitante, el nombre de un médico de plantilla que sea responsable del cuidado del sujeto (p.ej., médico de atención primaria).

El informe puede incluir una sección de datos de muestra, que puede proporcionar información sobre la muestra biológica analizada durante la evaluación, tal como cómo se realizó el manejo de la muestra (p.ej., temperatura de almacenamiento, protocolos preparatorios) y la fecha y hora recogidas. Los campos del informe con esta información se pueden poblar de forma general usando datos introducidos por el usuario, algunos de los cuales pueden ser proporcionados como selecciones predefinidas (p.ej., usando un menú desplegable).

El informe puede incluir una sección de informe de evaluación, que puede incluir información relativa a cómo se obtuvieron las evaluaciones/determinaciones tal como se describe en la presente memoria. El informe interpretativo puede incluir, por ejemplo, imágenes a intervalos de tiempo del embrión que está siendo evaluado, y/o los resultados de expresión génica. La porción de evaluación de informe puede incluir opcionalmente también una sección de recomendación(es). Por ejemplo, cuando los resultados indican que el embrión tiene probabilidad de alcanzar la etapa de blastocisto y/o de implantarse en el útero, la recomendación puede incluir una recomendación de que se trasplante un número limitado de embriones al útero durante el tratamiento de fertilidad, según se recomienda en la técnica.

También es fácilmente apreciable que los informes pueden incluir elementos adicionales o elementos modificados. Por ejemplo, cuando sea electrónico, el informe puede contener hiperenlaces que lleven a bases de datos internas o externas que proporcionen información más detallada sobre los elementos seleccionados en el informe. Por ejemplo, el elemento de datos del paciente del informe puede incluir un hiperenlace a un registro electrónico del paciente, o a un sitio para acceder a dicho registro del paciente, registro del paciente que se mantiene en un base de datos confidencial. Esta última realización puede ser de interés en un sistema intra-hospitalario o en un formato intra-clínico. Cuando está en formato electrónico, el informe es guardado en un medio físico adecuado, tal como un medio legible en ordenador, p.ej. en una memoria de ordenador, disco ZIP, CD, CVD, etc.

Es fácilmente apreciable que el informe puede incluir todos o algunos de los elementos anteriores, siempre que el informe de forma general incluya al menos los elementos suficientes para proporcionar el análisis requerido por el usuario (p.ej., una evaluación de la probabilidad de alcanzar la etapa de blastocisto, y/o de desarrollarse en blastocistos de buena calidad y/o de implantarse en el útero).

Tal como se ha discutido anteriormente, se pueden usar los métodos de la descripción para evaluar embriones o células para determinar la probabilidad de que los embriones sean euploides, alcancen la etapa de blastocisto y/o se desarrollen en blastocistos de buena calidad y/o se implanten en el útero y/o nazcan vivos. Esta determinación de la probabilidad de los embriones para ser euploides, alcanzar la etapa de blastocisto y/o implantarse en el útero y/o nacer vivos se puede usar para guiar decisiones y/o acciones clínicas. Por ejemplo, a fin de aumentar las tasas de embarazo, los médicos a menudo transfieren múltiples embriones a las pacientes, dando potencialmente como resultado embarazos múltiples que suponen riesgos de salud tanto a la madre como a los fetos. Usando los resultados obtenidos de los métodos de la descripción, se puede determinar la probabilidad de alcanzar la etapa de blastocistos, y/o desarrollarse en blastocistos de buena calidad y/o implantarse en el útero y/o nacer vivos, para los embriones que están siendo transferidos. Dado que los embriones que tienen probabilidad de ser euploides alcanzan la etapa de blastocisto, y/o se desarrollan en blastocistos de buena calidad y/o se implantan en el útero y/o nacen vivos, tienen mayor probabilidad de desarrollarse en fetos, la determinación de la probabilidad del embrión de ser euploide, alcanzar la etapa de blastocisto, y/o desarrollarse en blastocistos de buena calidad y/o implantarse en el útero y/o nacer vivos antes del trasplante permite al facultativo decidir cuántos embriones transferir para maximizar las posibilidades de éxito de obtener un embarazo a término, a la vez que se minimizan los riesgos.

Las evaluaciones realizadas siguiendo los métodos de la descripción también pueden encontrar utilidad en la clasificación de embriones en un grupo de embriones en función de la probabilidad que tienen los embriones de ser euploides, de alcanzar la etapa de blastocistos, así como de la calidad del blastocisto que se alcanzará (p.ej., en algunas realizaciones esto incluiría la probabilidad de implantarse en el útero y/o de ser cromosómicamente normales). Por ejemplo, en algunos casos, múltiples embriones pueden ser euploides y/o capaces de desarrollarse en blastocistos, es decir múltiples embriones tienen probabilidad de alcanzar la etapa de blastocistos. Sin embargo, algunos embriones tendrán más probabilidad de ser euploides y/o de alcanzar la etapa de blastocistos, es decir, tendrán una mejor probabilidad de alcanzar la etapa de blastocistos, o una mejor probabilidad de desarrollarse en blastocistos de buena calidad, o una mejor probabilidad de implantarse en el útero que otros embriones. En tales casos, se pueden usar los métodos de la descripción para clasificar los embriones del grupo. En tales métodos, uno o más parámetros celulares de cada embrión se miden para alcanzar una medida de parámetros celulares para cada embrión. Las una o más medidas de parámetros celulares de cada uno de los embriones se emplean entonces para determinar la probabilidad relativa de los embriones unos respecto a los otros de ser euploides, alcanzar la etapa de blastocisto y/o implantarse en el útero y/o nacer vivos. En algunas realizaciones, las medidas de parámetros celulares de cada uno de los embriones son empleadas comparándolas directamente unas con otras para determinar la probabilidad de ser euploide, alcanzar la etapa de blastocisto y/o implantarse en el útero y/o nacer vivo. En algunas realizaciones, las medidas de parámetros celulares de cada uno de los embriones se emplean comparando las medidas de parámetros celulares con una medida de parámetro celular de un embrión de referencia para determinar la probabilidad de ser euploide, alcanzar la etapa de blastocisto, implantarse en el útero y/o nacer vivo para cada embrión, y a continuación comparando la determinación de la probabilidad de ser euploide, alcanzar la etapa de blastocisto, implantarse en el útero y/o nacer vivo para cada embrión para determinar la probabilidad relativa de alcanzar la etapa de blastocisto, implantarse en el útero y/o nacer vivo de los embriones unos respecto de los otros.

De este modo, un facultativo que evalúe, por ejemplo, múltiples zigotos/embriones, puede elegir solo los embriones de mejor calidad, es decir, aquellos con la mayor probabilidad de implantarse en el útero y/o de ser euploides para ser transferidos, de tal modo que se maximicen las posibilidades de éxito de un embarazo completo a término a la vez que se minimizan los riesgos.

También se proporcionan reactivos, dispositivos y kits de los mismos para llevar a la práctica uno o más de los métodos anteriormente descritos. Los reactivos, dispositivos y sus kits objeto de la invención pueden variar enormemente. Los reactivos y dispositivos de interés incluyen los mencionados anteriormente en relación a los métodos de medida de cualquiera de los parámetros celulares mencionados anteriormente, donde dichos reactivos pueden incluir placas de cultivo, medios de cultivo, microscopios, software de obtención de imágenes, software de análisis de imágenes, cebadores de ácido nucleico, sistemas de sondas de ácido nucleico, anticuerpos, reactivos de sistema de producción de señal, etc., dependiendo del protocolo de medida a llevar a cabo.

Además de los componentes anteriores, los kits objeto incluirán además instrucciones para llevar a la práctica los métodos objeto. Dichas instrucciones pueden estar presentes en los kits objeto en una variedad de formas, uno o más de las cuales pueden estar presentes en el kit. Una forma en la que dichas instrucciones pueden estar presentes es como información impresa en un medio o sustrato adecuado, p.ej., como un papel o papeles sobre los que se imprime la información, en el embalaje del kit, en un panfleto del paquete, etc. Otro medio adicional sería un medio legible en ordenador, p.ej., diskette, CD, etc., en el que se puede grabar la información. Otro medio adicional que puede estar presente es una dirección de página web que puede usarse vía internet para acceder a la información en un sitio retirado. Cualquier medio conveniente puede estar presente en los kits.

Algunos de los métodos descritos anteriormente requieren la capacidad para observar el desarrollo del embrión mediante imágenes a intervalos de tiempo. Esto se puede lograr usando un sistema que consta de un sistema de microscopio multi-canal en miniatura que pueda alojarse dentro de una incubadora estándar. Esto permite obtener imágenes de múltiples muestras de forma rápida y simultánea sin tener que mover físicamente las placas. Un prototipo ilustrativo, mostrado en la Fig. 22 de la Patente de EE.UU. n° 7.963.906, consiste en un sistema de microscopio de 3 canales con iluminación de campo oscuro, aunque se podrían usar otros tipos de iluminación. Por “tres canales” se pretende indicar que hay tres microscopios independientes obteniendo imágenes de tres placas de cultivo distintas simultáneamente. Se usa motor de pasos para ajustar la posición focal para el enfoque o para adquirir series de imágenes en 3D. Para la iluminación se usan LEDs de luz blanca, aunque hemos observado que, para embriones humanos, el uso de LEDs rojos o del infrarrojo cercano (IR) puede mejorar la relación de contraste entre las membranas celulares y las porciones interiores de las células. Adicionalmente, moverse a la región del infrarrojo puede reducir la fototoxicidad de las muestras. Las imágenes se capturan con cámaras web de alta resolución, de bajo coste, aunque se pueden usar otros tipos de cámaras.

Tal como se muestra en la Fig. 22 de la Patente de EE.UU. n° 7.963.906, cada microscopio del prototipo de sistema descrito antes se usa para obtener imágenes de una placa de cultivo que podría contener un número cualquiera entre 1 y 30 embriones. El microscopio recoge la luz procedente de una luz LED blanca conectada a un disipador de calor para ayudar a disipar el calor generado por el LED, que es muy pequeño para tiempos de exposición breves. La luz pasa a través de un parte de campo oscuro convencional para detener la luz directa, a través de una lente condensadora y sobre un espécimen marcado como “placa petri”, que es una placa de cultivo que contiene los embriones que están siendo cultivados y estudiados. La placa de cultivo puede presentar pocillos que ayudan a mantener el orden de los embriones y a evitar que se muevan cuando la placa es transportada al interior o al exterior de la incubadora. Los pocillos se pueden espaciar suficientemente próximos entre sí para que los embriones puedan compartir la misma gota de medio. La luz dispersa se hace pasar entonces a través del objetivo del microscopio, después a través de un doblete acromático, y sobre un sensor CMOS. El sensor CMOS actúa como cámara digital y está conectado a un ordenador para el análisis de imagen y para el seguimiento, tal como se ha descrito anteriormente.

El diseño es fácilmente escalabre para proporcionar significativamente más canales y diferentes técnicas de iluminación, y puede modificarse para acomodar dispositivos de fluidos para alimentar las muestras. Adicionalmente, el diseño se puede integrar con un sistema de control retroalimentado, donde se optimizan condiciones de cultivo tales como temperatura, CO2 (para controlar el pH), y medio, en tiempo real en base a una retroalimentación y a los datos de imágenes. Este sistema se usó para adquirir vídeos a intervalos de tiempo del desarrollo de embriones humanos, lo que tiene utilidad para determinar la viabilidad del embrión para los procedimientos de fertilización in vitro (FIV). Otras aplicaciones incluyen terapia de células madre, cribado de fármacos e ingeniería de tejidos.

En una realización del dispositivo, la iluminación es proporcionada por un diodo emisor de luz (LED) blanco Luxeon montado en un disipador de calor de aluminio y alimentado por un transformador de corriente BuckPuck. La luz del LED se hace pasar a través de una lente colimante. La luz colimada pasa entonces a través de un tapón de parche procesado con láser a medida, tal como se muestra en la Fig. 22 de la Patente de EE.UU. n° 7.963.906, y es enfocada en un cono hueco de luz usando una lente condensadora esférica. La luz que es transmitida directamente a través de la muestra es rechazada por el objetivo, mientras que la luz dispersada por la muestra es recogida. En una realización, se usan objetivos Olympus con aumentos 20X, aunque se pueden usar aumentos menores para ampliar el campo de visión, o se pueden usar aumentos mayores para incrementar la resolución. La luz recogida se hace pasar entonces a través de una lente doblete acromática (es decir, lente tubular) para reducir los efectos de aberración cromática y esférica. Alternativamente, la luz recogida del objetivo de imagen puede hacerse pasar a través de otro objetivo, dirigirse en la dirección opuesta que actúa como sustituto de la lente tubular. En una configuración, el objetivo de imagen puede ser un objetivo 10X, mientras que el objetivo de lente tubular puede ser un objetivo 4X. La imagen resultante es capturada por un sensor CMOS con una resolución de 2 megapíxeles (1600 x 1200 píxeles). También se pueden usar diferentes tipos de sensores y resoluciones.

Por ejemplo, la Figura 23A de la Patente de EE.UU. n° 7.963.906 muestra un esquema del sistema de microscopio multi-canal que tiene 3 microscopios idénticos. Todos los componentes ópticos están montados en tubos de lentes. Durante la operación del sistema, las placas de Petri son cargadas en plataformas acrílicas que están montadas en escenarios de inclinación de 2-ejes manuales, lo que permite el ajuste del plano de la imagen con respecto al eje óptico. Dichos escenarios están fijados a la base del microscopio y no se mueven después de un alineamiento inicial. Los módulos de iluminación, que consisten en los LEDs, las lentes colimadoras, las paradas de parche, y las lentes condensadoras, están montados en escenarios xyz manuales para el posicionamiento y el enfoque de la luz de iluminación. Los módulos de imagen, que consisten en los objetivos, las lentes acromáticas, y los sensores CMOS también están montados en escenarios xyz manuales para el posicionamiento del campo de visión y el enfoque de los objetivos. Los 3 módulos de imagen están unidos a portaobjetos lineales y soportados por un único brazo de palanca, que es accionado usando un motor de pasos. Esto permite el enfoque asistido por ordenador y la captura automática de series de imágenes. Se pueden usar otros métodos de enfoque automático y de actuación.

El sistema de microscopios se colocó dentro de una incubadora estándar, tal como se muestra, por ejemplo, en la Fig. 23B de la Patente de EE.UU. n° 7.963.906. Los sensores de imagen CMOS están conectados a través de la conexión USB a un único centro localizado dentro de la incubadora, que está enrutado a un PC externo junto con otras líneas de comunicación y de potencia. Todos los cables eléctricos salen de la incubadora a través del centro de un tapón de goma sellado con pegamento de silicona.

El sistema de microscopios descrito antes, o uno similar, se puede usar para grabar imágenes a intervalos de tiempo del desarrollo temprano de embriones humanos y documentar el crecimiento desde la etapa de zigoto hasta la etapa de blastocisto. En algunas realizaciones, las imágenes se pueden capturar cada 5 minutos con aproximadamente 1 segundo de exposición de luz baja por imagen. La cantidad total de luz recibida por las muestras puede ser equivalente a 52 segundos de exposición continua, similar al nivel total experimentado en el manejo clínico durante la FIV. La duración de 1 segundo de la exposición de luz por imagen en algunas realizaciones se puede reducir. Antes de trabajar con embriones humanos, se llevaron a cabo experimentos de control extensivos con embriones de ratón pre implantación para asegurar que la tasa de formación de blastocistos y los patrones de expresión génica no se veían afectados por el proceso de obtención de imágenes.

Se puede seguir la evolución de embriones individuales con el tiempo, incluso aunque sus posiciones en el campo fotográfico se desplacen según se producen cambio de medio en los embriones, en algunos casos el medio se cambió en el día 3. El uso de medio secuencial puede ser necesario para cumplir los requisitos específicos de etapa de los embriones en desarrollo. Durante el cambio de medio, los embriones fueron retirados de la estación de obtención de imágenes durante unos pocos minutos y transferidos a nuevas placas petri. La cuestión del seguimiento de la identidad del embrión se puede mitigar usando pocillos que ayuden a disponer los embriones en un orden particular.

Cuando se transfieren las placas petri entre diferentes estaciones, los embriones a veces pueden moverse, dificultando de este modo el seguimiento de la identidad del embrión. Esto supone un reto cuando se lleva a cabo la obtención de imágenes a intervalos de tiempo en una estación, y los embriones son movidos posteriormente a una segunda estación para la selección y transferencia de embriones. Uno método es cultivar embriones en placas petri individuales. Sin embargo, esto requiere que cada embrión tenga su propia gota de medio. En un procedimiento de FIV típico, habitualmente es deseable cultivar todos los embriones de una paciente en la misma placa petri y en la misma gota de medio. Para abordar este problema, hemos diseñado una placa petri a medida con micro-pocillos. Esto impide que los embriones se muevan y mantiene la disposición sobre la placa petri cuando se transfieren dentro o fuera de la incubadora o las estaciones de captación de imágenes. Adicionalmente, los pocillos son lo suficientemente pequeños y están los suficientemente próximos para que puedan compartir la misma gota de medio y todos se puedan visualizar simultáneamente con el mismo microscopio. La superficie inferior de cada micro-pocillo tiene un acabado de calidad óptica. Por ejemplo, la Figura 27A de la Patente de EE.UU. n° 7.963.906 muestra un dibujo con las dimensiones de un ejemplo de realización. En esta versión, existen 25 micropocillos espaciados en proximidad unos de otros en un campo de visión de 1,7 x 1,7 mm. La Fig. 27B de la Patente de EE.UU. n° 7.963.906 muestra una vista en 3D de los micropocillos, que están empotrados aproximadamente 100 micrómetros en la superficie de la placa. La placa petri puede presentar de 1 a 25 o más micropocillos. Por ejemplo, en una realización, se utiliza una placa petri con 12 pocillos. En la placa se incluyen marcadores fiduciarios, que incluyen letras, números y otros marcajes, para ayudar a la identificación.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se incluyen para proporcionar a los especialistas en la técnica una descripción de cómo preparar y usar la presente invención, y no se pretende que limiten el alcance de lo que los inventores consideran su invención, ni se pretende que representen que los experimentos incluidos a continuación constituyen la totalidad y los únicos experimentos llevados a cabo. Se han realizado esfuerzos para asegurar la precisión en relación a los números usados (p.ej., cantidades, temperaturas, etc.) pero se deberían tener en cuenta ciertos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular medio en peso, la temperatura está en grados centígrados y la presión es la atmosférica, o próxima a ella.

EJEMPLO 1

Medida cuantitativa de la dinámica de expansión y colapso de blastocistos

A fin de medir cuantitativamente la dinámica de expansión y colapso de blastocistos, se obtuvieron imágenes de embriones usando un sistema de obtención de imágenes a intervalos de tiempo hasta el día 5, con una frecuencia de imágenes de 5 minutos por fotograma. En primer lugar, para cada fotograma se generó la segmentación de frontera exterior del embrión en una secuencia de imágenes a intervalos de tiempo, tal como se ilustra en la Figura 1. A continuación se calculó el área de la segmentación de frontera exterior del embrión y se representó frente al tiempo (Figura 2). Entonces se analizaron los tiempos, duraciones y frecuencias de la expansión y colapso de blastocistos. Los aumentos del área con el tiempo indican expansión de blastocitos, y las disminuciones de área con el tiempo indican colapso. Estos datos demuestran que una única característica de imagen, el área de la segmentación de frontera exterior del embrión, puede usarse para identificar el inicio y la resolución de la expansión y el colapso.

EJEMPLO 2

Medida cuantitativa de la dinámica de compactación y cavitación

La compactación y la cavitación son procesos de transición gradual, y supone un reto para observadores humanos identificar un único punto temporal en el que se produce la transición. A fin de medir cuantitativamente los eventos de compactación y cavitación, se obtuvieron imágenes de los embriones usando un sistema de obtención de imágenes a intervalos de tiempo hasta el día 5, con una frecuencia de imágenes de 5 minutos por fotograma.

En primer lugar, se realizó el análisis en todas las imágenes para obtener características de frontera coherentes (es decir, segmentos) como se muestra en la Figura 3. El proceso de compactación se correlaciona con un descenso de los segmentos basados en borde localizados en el centro del embrión, mientras que el proceso de cavitación se correlaciona con un aumento de los segmentos basados en borde localizados en el centro del embrión. Por tanto, se analizaron los cambios en el patrón de distribución de segmentos con el tiempo, y en la Figura 4 se muestra un ejemplo.

La segunda característica de imagen analizada fue la media de los cambios de intensidad de imagen integrados en el centro del embrión con el tiempo. El proceso de compactación se correlaciona con un descenso en la intensidad en el centro del embrión, mientras que el proceso de cavitación se correlaciona con un aumento de la intensidad en el centro del embrión. Por tanto, se analizaron los cambios de intensidad en el centro del embrión con el tiempo, y en la Figura 5 se muestra un ejemplo.

La tercera característica de imagen analizada fue la desviación estándar de las intensidades de imagen en el centro del embrión con el tiempo. El proceso de compactación se correlaciona con un descenso de la desviación estándar en el centro del embrión, mientras que el proceso de cavitación se correlaciona con un aumento de la desviación estándar en el centro del embrión. Por tanto, se analizaron los cambios en la desviación estándar de la intensidad en el centro del embrión, y la Figura 6 muestra un ejemplo.

Además de las tres características de imagen descritas anteriormente, también se analizaron otros cambios en las características de imagen con el tiempo que son marcadores de la compactación y la cavitación. Las características de imagen adicionales incluyen la forma del embrión, las características de textura en el borde o el centro del embrión, la transformada de característica invariante de escala (SIFT), y características generadas por Características Robustas Aceleradas (SURF).

Estos datos demuestran que se pueden usar tres características de imagen (distribución de segmentos basada en borde, cambios de la intensidad de imagen en el centro del embrión, y cambios en la desviación estándar de la intensidad de imagen en el centro del embrión) solas o en combinación para identificar el inicio y la resolución de la compactación y la cavitación.

Adicionalmente, los datos del Ejemplo 1 pueden combinarse con los datos relacionados para detectar la compactación y la cavitación a fin de establecer definiciones y medidas robustas de la compactación, cavitación y expansión y colapso de blastocistos. Tal como se muestra en la Figura 7, los datos se pueden combinar para identificar de forma robusta el inicio y parada distintivos (es decir, el inicio y la resolución) de cada uno de los parámetros de compactación, cavitación, expansión y colapso. Por lo tanto, estos parámetros pueden medirse de forma precisa y eficiente automáticamente o semi-automáticamente con entradas manuales.

EJEMPLO 3

Los parámetros de cavitación son predictivos de aneuploidía y pueden combinarse con otros parámetros para clasificar el riesgo de aneuploidía embrionaria

Se ha publicado que más del 50% de los embriones humanos cultivados en clínicas de FIV son embriones aneuploides que presentan un número anormal de cromosomas. Estos embriones aneuploides tienen menores tasas de implantación y no es probable que den como resultado el nacimiento vivo de bebes sanos. Actualmente, el cribado genético pre-implantación (PGS) es la estrategia más efectiva para seleccionar contra embriones aneuploides. Sin embargo, debido a su elevado coste, requerimiento de trabajo intensivo y naturaleza invasiva, menos del 10% de las pacientes tratadas para reproducción asistida son sometidas a PGS antes de la transferencia de embriones.

Para desarrollar un ensayo no invasivo asistido por imágenes a intervalos de tiempo para determinar el riesgo de los embriones de ser aneuploides, se descubrió que evaluando el parámetro tCav, solo o en combinación con otros parámetros celulares, la morfología del embrión y la información del paciente, se puede determinar la probabilidad de un embrión de ser aneuploide.

Evaluando los valores de tCav a partir de datos a intervalos de tiempo de 376 embriones, se descubrió que los embriones euploides tienen un tCav más corto que los embriones aneuploides. Tal como se muestra en la Figura 8, el parámetro tCav tiene una distribución diferente estadísticamente significativa (p=0,0002, test de Wilcoxon-Mann-Whitney) entre embriones aneuploides (74,4±6,2 horas, n=128) y embriones euploides (72,3±5,7 horas, n=278).

tCav se combina con la edad, #2PN y Psyn para predecir la aneuploidía. Se entrenaron cuatro clasificadores (Bayesiano ingenuo, SVM, Random Forest y Boosting T ree) en base a 276 embriones, y se evaluaron los valores AUC para un conjunto diferente de 184 embriones. Las curvas Características Operativas de Receptor (ROC) de estos cuatro clasificadores se muestran en la Figura 9. Se obtuvo una AUC de 0,73. Estos datos muestra que se puede usar tCav junto con otros parámetros para proporcionar una estimación de la probabilidad de aneuploidía del embrión.

EJEMPLO 4

Los parámetros de expansión son predictivos de aneuploidía y pueden combinarse con otros parámetros para clasificar el riesgo de aneuploidía embrionaria

A fin de desarrollar un ensayo no invasivo habilitado para imágenes a intervalos de tiempo para determinar el riesgo de que los embriones sean euploides, se descubrió que determinando el parámetro Pexp-area, solo o en combinación con otros parámetros celulares, la morfología del embrión y la información de la paciente, se puede determinar la probabilidad de que un embrión sea aneuploide.

Evaluando los valores de Pexp-area de datos de imágenes a intervalos de tiempo de 374 embriones, se descubrió que los embriones euploides tiene mayores Pexp-area que los embriones aneuploides. Tal como se muestra en la Figura 10, el parámetro Pexp-area tiene una distribución diferente estadísticamente significativa (p<0,0001, test de Wilcoxon-Mann-Whitney) entre embriones euploides (21 ±4k píxeles, n=258) y embriones aneuploides (18±4k píxeles, n=116).

tCav se combina con la edad y P3 para predecir la aneuploidía. Se entrenaron cuatro clasificadores (Bayesiano ingenuo, SVM, Random Forest y Boosting Tree) en base a 224 embriones, y se evaluaron los valores AUC para un conjunto diferente de 150 embriones. Las curvas Características Operativas de Receptor (ROC) de estos cuatro clasificadores se muestran en la Figura 11. Se obtuvo una AUC de 0,74. En base a los resultados de clasificador, el conjunto de datos de entrenamiento se dividió en cinco categorías que contenían números similares de embriones, y los valores de umbral determinados en el conjunto de datos de entrenamiento se aplicaron a un conjunto de datos de ensayo independiente. El % de embriones euploides de cada categoría, de la 1 a la 5, se muestra en la Figura 11, donde la categoría superior presentó >90% de embriones euploides y la categoría inferior presentó 40-50% de embriones euploides. Estos datos muestran que se puede usar Pexp-area junto con otros parámetros para proporcionar una estimación de la probabilidad de aneuploidía de embrión.

EJEMPLO 5

Los parámetros de expansión son predictivos del potencial de implantación para embriones euploides

Los embriones aneuploides presentan menores tasas de implantación y no es probable que den como resultado nacimientos vivos de bebés sanos, y por tanto la selección de embriones euploides para transferencia mediante PGS es una estrategia para mejorar la selección de embriones. Sin embargo, no todos los embriones euploides se implantan y dan como resultado un nacimiento vivo. Por lo tanto, los pacientes de PGS que tienen múltiples embriones euploides disponibles para transferencia necesitan herramientas que predicen el potencial de implantación para asistir adicionalmente en la selección entre embriones euploides.

A fin de desarrollar un ensayo no invasivo habilitado para la obtención de imágenes a intervalos de tiempo para determinar el potencial de implantación de embriones euploides, se descubrió que determinando los parámetros de expansión (Exp Time, Avg Exp Time), solos o en combinación con otro parámetro(s) celular(es), la morfología del embrión y la información del paciente, se puede determinar la probabilidad de implantación para un embrión euploide.

Evaluando los valores de Exp Time de datos de imágenes a intervalos de tiempo de 67 embriones euploides transferidos, se descubrió que los embriones euploides invierten más tiempo en la expansión que los embriones euploides no implantados. Tal como se muestra en la Figura 15, el parámetro de Exp Time tiene una distribución diferente estadísticamente significativa (p=0,01, test de Wilcoxon-Mann-Whitney) entre embriones euploides implantados (89%±16%, n=43) y embriones euploides no implantados (85%±24%, n=24).

Evaluando los valores de Avg Exp Time a partir de los datos de imágenes obtenidas a intervalos de tiempo de 67 embriones euploides transferidos, se descubrió que los embriones euploides implantados presentaron una expansión continua más larga por evento que los embriones euploides no implantados. Tal como se muestra en la Figura 15, el parámetro Avg Exp Time tiene una distribución diferente estadísticamente significativa (p=0,03, test de Wilcoxon-Mann-Whitney) entre embriones euploides implantados (27±27, n=43) y embriones euploides no implantados (23±12, n=24). Estos números representan el número de fotogramas, correspondiendo cada fotograma a un periodo de 5 minutos. Por tanto, calculada en minutos, la cantidad media de tiempo que los embriones euploides implantados invierten en cada evento de expansión es (135 minutos ± 135 minutos) mientras que la cantidad media de tiempo que un embrión euploide no implantado invierte en cada evento de expansión es (115 minutos ± 60 minutos).

Estos datos demuestran que Exp Time y/o Avg Exp Time pueden usarse para proporcionar una estimación de la probabilidad de implantación de un embrión euploide. Un Exp Time y/o Avg Exp Time mayor se puede usar para seleccionar embriones euploides que tienen mayor probabilidad de implantarse, mientras que un Exp Time y/o Avg Exp Time más corto puede usar para des-seleccionar embriones euploides que tienen menos probabilidad de implantarse. De esta manera, Exp Time y/o Avg Exp Time pueden usarse solos o en combinación con otros parámetros descritos previamente para seleccionar entre embriones euploides.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para seleccionar un embrión euploide que tiene el mayor potencial de implantación para la implantación en un útero para los fines de fertilización in vitro, midiendo la duración de la expansión de blastocisto, comprendiendo el método:

(a) cultivar uno o más embriones en condiciones suficientes para el desarrollo del embrión;

(b) obtener imágenes a intervalos de tiempo de dicho uno o más embriones para adquirir una o más imágenes que son almacenadas digitalmente, comprendiendo dichas imágenes una o más características de imagen;

(c) analizada dicha una o más características de imagen, determinando con ello (1) un inicio de expansión de blastocisto, y (2) una resolución de expansión de blastocisto, para medir el porcentaje de tiempo total invertido en la expansión o el tiempo medio invertido en cada evento de expansión; y

(d) seleccionar un embrión euploide que tiene el mayor potencial de implantación.

2. El método de la reivindicación 1, donde dicha una o más características de imagen incluyen al menos una de: distribución de segmento de frontera celular, intensidad media en el centro del embrión, o desviación estándar de la intensidad en el centro del embrión.

3. El método de la reivindicación 1, que además comprende la determinación de un parámetro a partir de una o más características de imagen, donde el parámetro identifica uno de: duración de colapso, frecuencia de colapso, grado de expansión, grado de colapso, velocidad de expansión, velocidad de colapso, tamaño medio de embrión después de la expansión inicial o el intervalo de tiempo entre expansión y colapso.

4. El método de la reivindicación 1, donde dicho cultivo comprende además que dicho uno o más embriones hayan sido producidos por fertilización de ovocitos in vitro, donde dichos ovocitos han sido madurados in vitro y han sido suplementados con factores de crecimiento.

5. El método de la reivindicación 1, donde dicho uno o más embriones no han sido congelados antes del cultivo.

6. El método de la reivindicación 1, donde dicho uno o más embriones han sido congelados antes del cultivo.

7. El método de la reivindicación 1, donde dicha obtención de imágenes emplea iluminación de campo oscuro, iluminación de campo brillante o una combinación de iluminación de campo oscuro y campo brillante.

8. El método de la reivindicación 1, donde dicho uno o más embriones son ubicados en una placa de cultivo antes de cultivar en condiciones suficientes para el desarrollo del embrión, donde dicha placa de cultivo comprende una pluralidad de micropocillos, donde uno o más embriones humanos son ubicados dentro de un micropocillo antes de cultivar en condiciones suficientes para el desarrollo del embrión.

9. El método de la reivindicación 1, donde la una o más características de imagen se seleccionan del grupo que consiste en la forma del embrión, la textura en la región definida alrededor del borde del embrión, la textura en el centro del embrión, o descriptores clave relacionados con características de imagen locales.

10. El método de la reivindicación 1, donde dicho análisis de una o más características de imagen comprende un método basado en la forma, un método de nivel bajo, un método basado en la curvatura o una combinación de los mismos.

11. El método de la reivindicación 10, donde dicho método basado en la forma es la determinación de umbrales, extracción de masa, comparación de plantilla, transformadas de Hough, o una combinación de los mismos.

12. El método de la reivindicación 10, donde dicho método de nivel bajo es la detección de borde, detección de textura, detección de cresta, detección de esquina, detección de masa, transformada de característica invariante de escala (SIFT), característica robusta acelerada (SURF), o una combinación de las mismas.

13. El método de la reivindicación 10, donde dicho método basado en curvatura es la dirección de borde, intensidad cambiante, correlación de curvatura, o una combinación de las mismas.

14. El método de la reivindicación 1, donde la una o más características de imagen están relacionadas con un área o circunferencia de imagen de uno o más embriones.