ES2837003T3

ES2837003T3 - Péptidos derivados de BMP-7 para su uso en el tratamiento de la artrosis

Info

Publication number: ES2837003T3
Application number: ES17715117T
Authority: ES
Inventors: Tim Johannes Maria Welting; Marjolein Maria Johanna Caron
Original assignee: Chondropeptix BV
Current assignee: Chondropeptix BV
Priority date: 2016-04-13
Filing date: 2017-03-31
Publication date: 2021-06-29
Anticipated expiration: 2037-03-31
Also published as: ZA201806806B; EP3442558A1; DK3442558T3; NZ747122A; EP3442558B1; EA201892320A1; US11872264B2; AU2017249629A1; US11141461B2; AU2017249629B2; WO2017178251A1; BR112018071214A2; EA037111B1; US20200261538A1; US20190125837A1; CN109310734B; US10617739B2; CA3020630A1; CN109310734A; US20220023386A1

Abstract

Péptido para su uso en el tratamiento, la mejora o la prevención de la artrosis, en el que el péptido tiene entre 12 y 28 aminoácidos de longitud y comprende una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 16 o una variante de la misma según la fórmula 2, en el que la secuencia de aminoácidos de dicho péptido está comprendida en la SEQ ID NO: 34 o una variante de la misma según la fórmula 1, en la que la fórmula 1 es: X1 X2 X3 G Y X4 A X5 Y S E G X6 S X7 X8 X9 L X10 X11 X12 M N A T X13 H A (SEQ ID NO: 47) en la que X1 = A o I o L o M o Y o V o E o H o K o Q o R, X2 = P o Y o M, X3 = E o R o H o K o N o P o Q o S o T o I o L o M o V, X4 = A o E o Q o R o S, X5 = Y o N o D, X6 = E o A o Q, X7 = A o D o E o H o K o S, X8 = F o A o D o E o H o Q o R o S, X9 = P o M, X10 = N o A o D o S o T o E o Q o R o I o V, X11 = S o A o D o E o H o K o N o P o Q o T, X12 = Y o H o D o G o H o N o R o S o T o en la que X13 = N o F o W o Y o H o K o R. y en la que la Fórmula 2 es: Y S E G X6 S X7 X8 X9 L X10 X11 (SEQ ID NO: 48) en la que X6 = E o A o Q, X7 = A o D o E o H o K o S, X8 = F o A o D o E o H o Q o R o S, X9 = P o M, X10 = N o A o D o S o T o E o Q o R o I o V o en la que X11 = S o A o D o E o H o K o N o P o Q o T.

Description

DESCRIPCIÓN

Péptidos derivados de BMP-7 para su uso en el tratamiento de la artrosis

Campo de la invención

La presente invención pertenece al campo de la medicina y proporciona medios y procedimientos para el tratamiento, la prevención o la mejora de la artrosis.

Antecedentes de la invención

La artrosis (OA, siglas del inglés osteoarthritis) es un tipo de artropatía resultante de una degradación del cartílago articular y del hueso subyacente, combinado con una patología articular general que incluye inflamación y fibrosis sinovial y patología del menisco. Los síntomas más comunes son dolor y rigidez en las articulaciones. Inicialmente, los síntomas pueden producirse solo después de realizar ejercicio, pero con el tiempo pueden volverse constantes. Otros síntomas pueden incluir hinchazón de las articulaciones, disminución de la amplitud del movimiento, y cuando la espalda se ve afectada por la OA, puede presentarse debilidad o entumecimiento de brazos y piernas. Las articulaciones más comúnmente afectadas son las que están cerca de las puntas de los dedos, en la base del pulgar, en el cuello, en la zona lumbar, en las rodillas y en las caderas. Las articulaciones de un lado del cuerpo suelen verse más afectadas que las del otro. Normalmente los problemas se presentan a lo largo de los años. Puede afectar al trabajo y a las actividades diarias normales. A diferencia de otros tipos de artritis, sólo suelen verse afectadas las articulaciones.

Las causas incluyen lesión articular previa, desarrollo anómalo de articulaciones o extremidades, ajuste anómalo de articulaciones y factores hereditarios. El riesgo es mayor en las personas con sobrepeso, en las que tienen una pierna de diferente longitud y en las que tienen trabajos que provocan altos niveles de estrés articular. Se cree que la artrosis se debe al estrés mecánico de las articulaciones y a procesos inflamatorios de grado bajo. Se desarrolla a medida que se pierde cartílago y, finalmente, el hueso subyacente se ve afectado. También se cree que el hueso subcondral participa de manera crucial en la etiología de la enfermedad. Como el dolor puede dificultar el ejercicio, puede producirse pérdida de masa muscular. El diagnóstico suele basarse en signos y síntomas con obtención de imágenes médicas y otras pruebas que se usan ocasionalmente para respaldar o descartar otros problemas. A diferencia de la artritis reumatoide, que es principalmente una afección inflamatoria, las articulaciones no suelen calentarse o enrojecerse.

El tratamiento incluye ejercicio, cuidados para disminuir el estrés articular, grupos de apoyo, lubricación articular y analgésicos (locales). Los cuidados para disminuir el estrés articular incluyen reposo y el uso de un bastón. La pérdida de peso puede ayudar a las personas con sobrepeso. Los analgésicos pueden incluir paracetamol (acetaminofeno). Si esto no funciona, se pueden usar fármacos AINE (antiinflamatorios no esteroideos) administrados por vía oral, tales como naproxeno, o se pueden usar corticosteroides administrados por vía local (por ejemplo, acetónido de triamcinolona), pero estos medicamentos están asociados a mayores efectos secundarios. Los opioides, si se usan, generalmente solo se recomiendan a corto plazo debido al riesgo de adicción. Si el dolor o la restricción de movimientos interfieren con la vida normal a pesar de otros tratamientos, la cirugía de artroplasia puede ayudar. Sin embargo, una articulación artificial, solo dura una cantidad limitada de tiempo y la cirugía de artroplasia total se asocia a complicaciones graves como la osteomielitis. Para la mayoría de las personas con artrosis, los resultados son buenos después de realizar una artroplasia (reemplazo de la articulación) total.

La OA es la forma más común de artritis, afectando la enfermedad de la rodilla y la cadera a aproximadamente un 3,8 % de las personas en el 2010. Entre las personas mayores de 60 años, aproximadamente un 10 % de los hombres y un 18% de las mujeres se ven afectados. Es la causa de aproximadamente un 2% de los años vividos con discapacidad. En Australia, se ven afectadas aproximadamente 1,9 millones de personas y en los Estados Unidos aproximadamente 27 millones de personas. Antes de los 45 años es más común en los hombres, mientras que después de los 45 años es más común en las mujeres. Se vuelve más común en ambos sexos a medida que las personas envejecen.

Aunque la OA es una enfermedad degenerativa de las articulaciones que puede causar una gran pérdida de cartílago y daño morfológico a otros tejidos articulares, los cambios bioquímicos más sutiles aparecen en las primeras etapas del desarrollo de la OA. El contenido de agua del cartílago sano está meticulosamente equilibrado por la fuerza de compresión que expulsa el agua y por la presión de la hinchazón que atrae el agua, mantenido por una presión tisular osmótica distinta. Las fibras de colágeno ejercen la fuerza de compresión, mientras que el efecto de Gibbs-Donnan y los proteoglicanos del cartílago, crean una presión osmótica que tiende a atraer el agua.

Sin embargo, durante el inicio de la OA, la matriz de colágeno se vuelve más desorganizada y hay una disminución en el contenido de proteoglicanos dentro del cartílago. La degradación de las fibras de colágeno da como resultado un aumento neto del contenido de agua. Este aumento se produce porque aunque hay una pérdida general de proteoglicanos (y por tanto una disminución de la tracción osmótica), la pérdida de colágeno lo compensa. Sin los efectos protectores de los proteoglicanos, las fibras de colágeno del cartílago pueden volverse susceptibles a la degradación y por tanto agravar la degeneración. También puede producirse inflamación de la membrana sinovial (revestimiento de la cavidad articular) y de la cápsula articular circundante, aunque a menudo leve (en comparación con lo que ocurre en la artritis reumatoide).

Los cambios en el cartílago articular y en los condrocitos articulares que caracterizan a la OA, se asemejan al proceso de desarrollo celular que impulsa el desarrollo esquelético por osificación endocondral. La analogía entre la osificación endocondral y la evolución de la OA ha sido ampliamente reconocida. Muchas de las enzimas que degradan el cartílago, que son excretadas por los condrocitos hipertróficos en la placa de crecimiento, también son fundamentales en la evolución y empeoramiento de la afección de la OA. Además, rutas bien conocidas que controlan la diferenciación de condrocitos en la placa de crecimiento (RUNX2, COL10A1, ALP) también se encuentran activas o desreguladas en condrocitos articulares OA.

También pueden verse afectadas otras estructuras dentro de la articulación. Los ligamentos dentro de la articulación se vuelven más gruesos y fibróticos y el menisco puede dañarse y desgastarse. Cuando una persona se somete a una artroplasia puede carecer por completo de menisco. Nuevas excrecencias óseas, denominadas "espolones" u osteofitos, puede formarse en los márgenes de las articulaciones, posiblemente en un intento de mejorar la congruencia de las superficies del cartílago articular en ausencia del menisco. El volumen del hueso subcondral aumenta y se vuelve menos mineralizado (osteoporótico/osteopénico). Todos estos cambios pueden causar problemas en el funcionamiento y soporte mecánico de la capa de cartílago suprayacente. El dolor en una articulación artrósica se ha relacionado con un engrosamiento de la membrana sinovial y con lesiones del hueso subcondral.

Bioquímicamente, la OA se caracteriza por la síntesis de enzimas degradadoras de la matriz extracelular (MEC), tales como agrecanasas (una desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina (ADAMTS)) y metaloproteinasas de matriz (MMP), dando como resultado la degradación activa de la matriz tisular del cartílago. Se ha reconocido la analogía entre la osificación endocondral y la evolución de la OA y muchas de las enzimas de degradación y mineralización del cartílago que son secretadas por los condrocitos hipertróficos en la placa de crecimiento, también participan de manera crucial en la OA.

A pesar de los progresos realizados en la comprensión de los mecanismos de la enfermedad, el tratamiento establecido y experimental de la A es principalmente sintomático ya que alivia el dolor e interfiere en los procesos degenerativos del cartílago para posponer la artroplasia total.

Sumario de la invención

La invención se refiere a un péptido para su uso en el tratamiento, mejora o prevención de la artrosis, en el que el péptido tiene entre 12 y 28 aminoácidos de longitud y comprende una secuencia de aminoácidos según la s Eq ID NO: 16 o una variante de la misma según la fórmula 2, en el que la secuencia de aminoácidos de dicho péptido está comprendida en la SEQ ID NO: 34 o una variante de la misma según la fórmula 1.

Fórmula 1:

X1 X2 X3 G Y X4 A X5 Y S E G X6 S X7 X8 X9 L X10 X11 X12 M N A T X13 H A (SEQ ID NO: 47)

en la que

X I = A o I o L o M o Y o V o E o H o K o Q o R,

X2 = P o Y o M,

X3 = E o R o H o K o N o P o Q o S o T o I o L o M o V,

X4 = A o E o Q o R o S,

X5 = Y o N o D,

X6 = E o A o Q,

X7 = A o D o E o H o K o S,

X8 = F o A o D o E o H o Q o R o S,

X9 = P o M,

X10 = N o A o D o S o T o E o Q o R o I o V,

X I I = S o A o D o E o H o K o N o P o Q o T,

X12 = Y o H o D o G o H o N o R o S o T o en la que

X13 = N o F o W o Y o H o K o R.

Fórmula 2:

Y S E G X6 S X7 X8 X9 L X10 X11 (SEQ ID NO: 48)

en la que

X6 = E o A o Q,

X7 = A o D o E o H o K o S,

X8 = F o A o D o E o H o Q o R o S,

X9 = P o M,

X10 = N o A o D o S o T o E o Q o R o I o V o en la que

X11 = S o A o D o E o H o K o N o P o Q o T.

Descripción detallada de la invención

Los condrocitos artrósicos presentan un fenotipo típico que se caracteriza por la expresión disminuida de genes condrogénicos SOX9, COL2A1, ACAN y BAPX1/NKX3.2 y expresión aumentada de genes hipertróficos RUNX2, COL10A1, ALP, genes que codifican enzimas que degradan la matriz del cartílago MMP13, ADAMTS5 y genes inflamatorios COX-2 e IL-6 (figura 1). En el presente documento, los autores de la invención muestran que una proteína denominada proteína morfogenética ósea 7 (BMP-7, por las siglas del inglés bone morphogenetic protein-7, denominada también OP-1), es capaz de rescatar el fenotipo OA (figura 1). Nuestros estudios y los anteriores, que abordan las propiedades modificadoras de la enfermedad de la proteína BMP-7, muestran que disminuye la expresión de MMP13 en condrocitos expuestos a IL-1 p, estimula la síntesis de proteoglicanos en los condrocitos OA, contrarresta las citocinas inflamatorias (por ejemplo, IL-1p) e induce una respuesta anabólica en condrocitos sanos. La administración intraarticular de la proteína BMP-7 protege contra el desarrollo de la OA y retrasa la evolución de la OA en ratas. Se realizó un ensayo clínico en fase 1 en pacientes con OA y después de la inyección intraarticular de la proteína BMP-7, no se notificaron acontecimientos adversos graves. En congruencia con esto, los datos notificados en el presente documento, revelan que la BMP-7 suprime activamente el fenotipo hipertrófico de condrocitos (OA) (figura 1).

A pesar de estos resultados prometedores, el uso intraarticular de la BMP-7 humana recombinante de longitud completa para el tratamiento de la OA, puede estar en riesgo para el uso clínico. Las pruebas preclínicas mostraron que para obtener un resultado relevante, se necesitaban inyecciones intraarticulares semanales de BMP-7. Esta alta frecuencia de inyecciones intraarticulares no es aceptable para el uso clínico debido al riesgo de artritis séptica y malestar del paciente. Aunque una solución para evitar las frecuentes inyecciones intraarticulares abarcaría la encapsulación de la BMP-7 en un sistema de liberación intraarticular para su liberación prolongada y controlada, la conservación de la actividad biológica de la BMP-7, representará un enorme desafío debido a las condiciones de desnaturalización que generalmente se aplican al proceso de producción de los sistemas de liberación controlada actualmente existentes. El líquido sinovial OA, en el que es probable que se suministre la BMP-7, es un entorno hidrolítico y proteolítico riguroso que se espera que cause una rápida degradación de la BMP-7 administrada. Por último, la producción de BMP-7 de grado g Mp (siglas del inglés Good Manufacturing Practic, practicas adecuadas de fabricación) es tecnológicamente exigente con altos costes asociados.

Para salvaguardar y permitir el uso clínico de las características sumamente favorables de la actividad de BMP-7 para el tratamiento de la OA, se buscaron imitadores moleculares de la BMP-7 que fuesen más compatibles con el riguroso entorno del líquido sinovial OA y que pudiesen incorporarse potencialmente en sistemas de liberación molecular intraarticular para una liberación prolongada. Por esa razón, los autores de la invención se propusieron preparar un conjunto de péptidos de 20 meros (unidades monoméricas) superpuestos (tabla 1) que, en su conjunto, abarcaban todo el polipéptido de BMP-7 maduro de 139 aminoácidos (tabla 4). Los resultados confirmaron hallazgos anteriores [20, 21] en el sentido de que ninguno de los péptidos imitaba el potencial de la BMP-7 para rescatar el fenotipo OA. Todos los péptidos mostrados en la tabla 1 se examinaron más detalladamente con respecto a la expresión de los genes de ALP, MMP13, ADAMTS5, COL10A, COX-2, BAPX1 NKX3.2 y RUNX2 y se descubrió que suscitaban respuestas prohipertróficas, promineralizantes, procatabólicas y proinflamatorias. Esto no fue inesperado, ya que se han descrito péptidos promineralizantes/proosteogénicos a partir de BMP-2 [20] y BMP-7 [21, 31].

Tabla 4: Secuencia de aminoácidos de la BMP-7 madura, los restos de cisterna y serina se indican subrayados

Sin embargo, sorprendentemente, cuando los restos de cisteína se reemplazaron por los de serina en la BMP-7, nuestros datos revelaron la presencia de una región sumamente definida dentro de la BMP-7 que de hecho alberga péptidos con la actividad imitadora de BMP-7 buscada.

En el presente documento los péptidos de esta región se denominan "péptidos de la región A". Los péptidos consecutivos de esta región causaron una disminución significativa de la expresión de los marcadores fenotípicos de condrocitos OA COL10A1, ALP, RUNX2, ADAMTS5, IL-6, MMP13 y COX-2, así como una mayor expresión de marcadores condrogénicos SOX9, ACAN, BAPX1/NKX3.2 y COL2A1 en condrocitos articulares OA.

Por lo tanto, en un aspecto, la invención se refiere a un péptido para su uso en el tratamiento, mejora o prevención de la artrosis, en el que el péptido comprende una secuencia de aminoácidos de al menos los 12 aminoácidos consecutivos según la SEQ ID NO: 16. Esto se deduce de los resultados mostrados en la tabla 2.

La tabla 2 muestra los resultados del análisis de expresión de varios genes en presencia de varios péptidos para su uso según la invención. En el apartado de Ejemplos se proporcionan más detalles.

Nuestros experimentos también revelaron que el péptido tiene una longitud máxima de 28 aminoácidos o aproximadamente. Esto se deduce de los experimentos mostrados en las tablas 2 y 3, en las que se muestra que el péptido está preferentemente contenido completamente en la secuencia APEGYa Ay YSEGESAFPLNSYMNa Tn HA (SEQ ID NO: 34). Cada péptido que se extendió más allá de esta secuencia de aminoácidos, ya sea en el extremo NH2 terminal o en el COOH terminal, perdió su actividad en los ensayos empleados en el presente documento. La tabla 3 también muestra algunos ejemplos de péptidos para su uso según la invención.

Por supuesto, esta descripción no debe interpretarse tan limitada que no se permita una variación en el péptido. El experto en la materia es consciente del hecho de que la conformación del péptido se conserva incluso cuando se cambian uno o más, tal como dos, tres, cuatro o incluso cinco, aminoácidos, en particular cuando estos cambios se refieren a sustituciones conservativas de aminoácidos. Estos péptidos se conocen en la técnica como péptidos homólogos. Por tanto, el término "homólogos", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a péptidos que conservan su actividad pero que difieren con respecto a su secuencia de aminoácidos. Los homólogos pueden ser 75 % idénticos a las secuencias según las SEQ ID NO: 16 o SEQ ID NO: 34, o más, tal como 77, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % idénticos.

Como se usa en el presente documento, el grado de identidad entre dos o más secuencias de aminoácidos es equivalente a una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = número de posiciones idénticas dividido entre el número total de posiciones x 100), excluidos los espacios, que deben introducirse para obtener una alineación óptima de las dos secuencias, y los salientes. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos o más secuencias, pueden realizarse usando procedimientos estándar conocidos en la materia. Por ejemplo, un programa de libre acceso utilizado convencionalmente para este fin es la herramienta "Align" en el recurso del NCBI http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=blast2s eq&LINK_LOC=align2seq

En una realización preferida, la alineación de dos secuencias debe realizarse sobre toda la longitud de los polipéptidos.

Como se usa en el presente documento, dependiendo del contexto, el término "puede" incluye la palabra "poder", y la expresión "puede ser" incluye las palabras "es" o "son". Así mismo, la presencia de la palabra "puede" tiene la intención de explicar opciones para llevar a la práctica o implementar la divulgación, sin limitación.

Los autores de la presente invención llegaron a la conclusión de que los péptidos derivados de la BMP-7 humana, como los descritos en el presente documento, son capaces de imitar las características favorables de la proteína BMP-7 humana de longitud completa en el fenotipo de condrocitos OA.

Con ello hemos determinado la ubicación y la naturaleza de la acción supresora del fenotipo OA de la BMP-7, mientras que los péptidos de otras regiones en la BMP-7 no presentaron actividad o acciones promineralizantes/hipertróficas. La fuerza bioactiva de los péptidos candidatos fue inesperadamente alta. Independientemente de la concentración examinada (se examinó una concentración de 1000, 100, 10 y 1 nanoMolar (nM)), en la exploración, casi todos los péptidos de la región A indujeron diferencias de magnitud de expresión génica de factor de cambio, mientras que un péptido de control (SEQ ID NO: 49) no lo hizo.

La proteína BMP-7 tiene acciones supresoras únicas de fenotipo de condrocitos OA (Figura 1). Esta acción es más pronunciada cuando se usa una concentración de BMP-7 de aproximadamente 1 nM. Las concentraciones de BMP-7 superiores a 1 nM (por ejemplo, 10 nM o 100 nM) tienen efectos opuestos y negativos sobre el fenotipo de los condrocitos y, por tanto, causan un aumento desfavorable de los niveles de hipertrofia, aumento de mineralización, aumento de expresión de genes de degradación de cartílago y aumento de expresión de genes inflamatorios. Sin querer quedar ligado a ninguna teoría, se supone que la BMP-7 incorpora una actividad dual que depende de la concentración de BMP-7.

En cambio, con el polipéptido BMP-7, los péptidos de 20 meros según las SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 y 15, suprimieron eficazmente el fenotipo de condrocitos OA, independiente de la concentración examinada (se examinó una concentración de 1000, 100, 10 y 1 nM). Con esto, se ha identificado inesperadamente, la región que comprende la actividad biológica supresora y favorable del fenotipo OA de la BMP-7, mientras que los péptidos de otras regiones en la BMP-7, presentaron acciones promineralizantes, prohipertróficas, procatabólicas y proinflamatorias.

Después de las 24 horas a las que los condrocitos OA se expusieron a péptidos individuales, la acción supresora del fenotipo OA de los péptidos candidatos fue sumamente eficaz cuando los péptidos se añadieron a cultivos de condrocitos OA cada segundo hasta el día 10 en cultivo. Sorprendentemente, la acción supresora del fenotipo OA de los péptidos desvelados en el presente documento, duró incluso hasta 8 días en cultivo después de una sola exposición inicial de 48 horas.

La actividad biológica sumamente fuerte a concentraciones en el intervalo nanomolar, es similar a la de la BMP-7 madura de longitud completa y desde el punto de vista terapéutico es un determinante importante, mostrando que los péptidos para su uso según la invención son, en efecto, poderosos imitadores de la BMP-7 para su uso terapéutico en la OA.

Además de la acción de los péptidos sobre los condrocitos OA, los péptidos candidatos presentaron acciones similares desde el punto de vista biológico en un modelo in vitro de diferenciación condrogénica. De manera destacable, ocho días de exposición única, y aún más pronunciada, con la exposición continua al péptido de las células condroprogenitoras diferenciadoras (ATDC5), disminuyó firmemente la expresión de marcadores de hipertrofia y mineralización, mientras que la expresión de agrecano (marcador de condrocitos sanos) y la expresión de BAPX1/NKX3.2 (factor antihipertrofia) se incrementó aún más bajo una exposición continua a los péptidos para su uso según la invención.

Tomados en conjunto, los péptidos para su uso según la invención tienen acciones supresoras únicas sobre el fenotipo de condrocitos OA hipertróficos/mineralizantes, suprimen la expresión de enzimas degradadoras de la MEC del cartílago y reducen el fenotipo inflamatorio de condrocitos OA, mientras que al mismo tiempo soportan una acción procondrogénica sobre condrocitos OA y condrocitos sanos. A diferencia de la proteína BMP-7 madura de longitud completa, los péptidos se pueden usar ventajosamente en terapia porque, en general, son menos susceptibles a la inactivación conformacional y enzimática. Los péptidos pueden ajustarse bioquímicamente para aumentar su estabilidad y actividad; funcionalizarse para transportadores; son mucho más pequeños y, por tanto, adecuados para su incorporación en sistemas de liberación especializados a la aplicación para una liberación intraarticular prolongada.

Se pueden sintetizar variantes de los péptidos descritos anteriormente que sean más resistentes a la degradación en la degradación proteolítica en el líquido sinovial. Además, se pueden preparar variantes que estén más restringidas conformacionalmente y, por tanto, sean más bioactivas en comparación con sus secuencias iniciales originales. Esto está al alcance de un experto y solo requiere técnicas habituales ahora que se ha identificado la región A como la región activa para la actividad anabólica de la BMP-7.

Dichas variantes pueden incluir péptidos lineales, péptidos lineales retroinversos, péptidos retroinversos, péptidos cíclicos, péptidos de un solo bucle y péptidos de dos bucles. La tecnología CLIPS permite la producción habitual de dichos péptidos (http://www.pepscan.com/therapeutics/clips-platform). Los péptidos de dos bucles pueden contener dos péptidos idénticos como se describe en el presente documento o dos péptidos diferentes como se describe en el presente documento.

Todos los alfa aminoácidos, denominados aminoácidos L o D, excepto la glicina, pueden existir en forma de dos enantiómeros o variantes quirales, que son imágenes especulares entre sí. Aunque los L-aminoácidos representan todos los aminoácidos que se encuentran en las proteínas durante la traducción en el ribosoma, los D-aminoácidos se encuentran muy raramente en proteínas traducidas en eucariotas. Dado que los ribosomas son específicos para los L-aminoácidos, los péptidos D rara vez se encuentran de manera natural en los organismos y, por tanto, no se digieren o degradan fácilmente.

Un péptido L tiene tres secuencias análogas construidas a partir de L y D aminoácidos: el enantiómero D o péptido inverso con la misma secuencia, pero compuesto por D-aminoácidos y una conformación especular; el retropéptido, que consiste en la misma secuencia de L aminoácidos pero en orden inverso; y el péptido retroinverso o D-retroenantiómero, que consiste en D-aminoácidos en la secuencia inversa. Mientras que el péptido L y su enantiómero D son estructuras especulares entre sí, el retropéptido L es la imagen especular del péptido D-retroinverso. Por otro lado, el péptido L y el péptido D retroinverso comparten una disposición similar de cadenas laterales, aunque sus grupos carboxilo y amino apuntan en direcciones opuestas. Para péptidos pequeños que no dependen de una estructura secundaria para unirse, es probable que un péptido L y su péptido D-retroinverso tengan una afinidad de unión similar con una proteína L diana.

Los péptidos pueden ser más activos cuando están en forma de bucle, como los péptidos cíclicos. Dichos péptidos también pueden ser más estables y resistentes a la degradación proteolítica.

Dichos péptidos y polipéptidos pueden ser más estables en un entorno hostil a los polipéptidos, tal como un entorno hidrolítico o proteolítico. En particular con fines terapéuticos, puede resultar ventajoso utilizar péptidos más estables, tales como los mencionados anteriormente. Por tanto, la descripción también se refiere al uso de péptidos seleccionados del grupo que consiste en péptidos lineales, péptidos lineales retroinversos, péptidos retroinversos, péptidos cíclicos, péptidos de un solo bucle y péptidos de dos bucles.

En la técnica se conocen formas de hacer que un péptido sea menos susceptible a la degradación, tal como la inclusión de uno o más aminoácidos no naturales, tal como el enantiómero D de un L-aminoácido y la retroorientación del esqueleto peptídico en la variante retroinversa. Estos péptidos no son naturales, por tanto, las proteasas naturales no pueden escindirlos.

En la técnica también se conocen medios y procedimientos para aumentar la actividad biológica de los péptidos para su uso según la invención. Son ejemplos de dichas técnicas la ciclación y la formación en bucle de los péptidos, que proporciona un contexto conformacional más restrictivo de restos de aminoácidos esenciales.

La solicitud de patente US2006/0058231 desvela variantes de BMP-7 con propiedades mejoradas. El documento US2006/0058231 desvela que algunos aminoácidos de BMP-7 pueden sustituirse por otros aminoácidos sin que ello afecte a la función de la proteína BMP-7.

Entre las propiedades mejoradas de la BMP-7, como resultado de las sustituciones de aminoácidos mencionadas anteriormente, se encuentran: aumento del rendimiento de la expresión, expresión en ausencia de un pro-dominio, aumento de la solubilidad, aumento de la estabilidad, aumento de la actividad biológica específica, especificidad del receptor alterada, afinidad de unión al receptor alterada, especificidad del co-receptor alterada, afinidad de unión al co-receptor alterada, aumento de la unión con la proteína nogina, reducción de la unión con la proteína nogina y disminución de la inmunogenicidad.

Con respecto a los aminoácidos de la región A, esto significa que los aminoácidos en las posiciones 1-3, 6, 8, 13, 15 17, 19-21 y 26 de la SEQ ID NO: 34, pueden estar alterados o sustituidos, sin que ello afecte a la actividad de la BMP-7. En algunos casos, estas modificaciones (sustituciones de aminoácidos), incluso mejoraron la actividad de la BMP-7.

Por lo tanto, la región correspondiente a la SEQ ID NO: 34 también se puede describir como se muestra en la fórmula 1:

Fórmula 1:

X1 X2 X3 G Y X4 AX5 Y S E G X6 S X7 X8 X9 L X 10 X11 X12 M N AT X13 H A (SEQ ID NO: 47)

en la que

Los péptidos anteriores según la fórmula 1 pueden considerarse equivalentes o variantes del péptido según la SEQ ID NO: 34. En una realización de la invención, una variante de la s Eq ID NO: 34 comprende 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en sustituciones X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, X10, X11, X12 y X13.

Por consiguiente, la región correspondiente a la SEQ ID NO: 16 también puede por tanto describirse como se muestra en la fórmula 2: Fórmula 2:

Y S E G X6 S X7 X8 X9 L X10 X11 (SEQ ID NO: 48)

en la que

X6 = E o A o Q,

X7 = A o D o E o H o K o S,

X8 = F o A o D o E o H o Q o R o S,

X9 = P o M,

X10 = N o A o D o S o T o E o Q o R o I o V o en la que

X11 = S o A o D o E o H o K o N o P o Q o T.

Los péptidos anteriores según la fórmula 2 pueden considerarse equivalentes o variantes del péptido según la SEQ ID NO: 16. En una realización de la invención, una variante de SEQ ID NO: 16 comprende 5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en sustituciones X6, X7, X8, X9, X10 y X11.

Los aminoácidos mostrados en negrita en las fórmulas 1 y 2, representan los aminoácidos en los péptidos según las SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 34 (secuencia de tipo silvestre) que preferentemente no deben cambiarse ni sustituirse. Los aminoácidos preferidos en las posiciones X1 - X13 están subrayados. Estos representan los aminoácidos de tipo silvestre en las posiciones correspondientes.

Leyendas de las figuras

Figura 1: La BMP-7 rescata el fenotipo de condrocitos asociado a la OA.

Los condrocitos artrósicos presentan un fenotipo típico que se caracteriza por la expresión disminuida de los ARNm de SOX9, COL2A1, ACAN y BAPX1/NKX3.2 y por la expresión aumentada de los ARNm de RUNX2, COL10A1, ALP, MMP13, ADAMTS5, COX-2 e IL-6 (véase el cuadro de la izquierda). La BMP-7 (1 nM) es capaz de rescatar este fenotipo de condrocitos asociado a la OA normalizando la expresión de los genes anteriores (cuadro de la izquierda).

La actividad de la enzima ALP funcional en lisados celulares y la secreción de PGE2 en el medio de cultivo también se normalizó después del tratamiento con BMP-7 de condrocitos OA (cuadro de la derecha).

La expresión de los ARNm indicados, se determinó mediante RT-qPCR (reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa en tiempo real (RT)), en relación con las condiciones de control (normalizadas para la expresión de ARNr 28S). En los gráficos, las barras de error representan la media ± el EEM (error estándar de la media), las diferencias estadísticas se calcularon en comparación con el estado saludable. *= p<0,05.

Figuras 2 - 8: Acciones de péptidos derivados de BMP-7 en condrocitos articulares OA humanos primarios.

La acción de los péptidos de 20-meros (10 nM) de la SEQ ID NO: 2-15 (péptidos con intervalos de 1 aminoácido (superposición de 19 aminoácidos)) y de la SEQ ID NO: 49 sobre la expresión de los genes indicados, se determinó en un grupo validado de condrocitos articulares humanos OA de pase 2 (n = 18) y se comparó con la de la BMP-7 recombinante de longitud completa (1 nM). Las muestras se recogieron después de 24 horas y se analizaron en busca de los genes indicados mediante RT-qPCR (corregida para la expresión de ARNr 28S y en relación con las condiciones de control (sin exposición a péptidos)). En los gráficos, los números en el eje x representan péptidos individuales según su SEQ ID NO:, las barras de error representan la media ± el EEM, las diferencias estadísticas se calcularon (ANOVA unidireccional con corrección de Bonferroni) con respecto a la condición de control. *=p <0,05 menor que la condición de control para COL10A1, ALP, RUNX2, COX-2, MMP13 y ADAMTS5 y mayor que la condición de control para BAPX1/NKX3.2. Un péptido aleatorio es un péptido según la SEQ ID NO: 49 con la secuencia de aminoácidos SFILKKVLYDRVNDSANIYS.

Figura 9: Diagrama que muestra la expresión relativa de COL2A1, Col10A1, COX-2 y RUNX2 en condrocitos aislados de pacientes con OA en presencia de un péptido de control, BMP-7 y un péptido según la SEQ ID NO: 16.

Figura 10: Diagramas que muestran la expresión relativa de COL10A1 y MMP13 en explantes de cartílago de pacientes con OA en presencia de un péptido de control, BMP-7 y un péptido según la SEQ ID NO: 16.

Ejemplos

Ejemplo 1: Acciones supresoras del fenotipo de condrocitos OA de los péptidos BMP-7 en presencia de líquido sinovial OA.

Analizamos los péptidos candidatos de la región A para determinar sus acciones supresoras del fenotipo OA en condrocitos articulares OA primarios en presencia de líquido sinovial OA al 20 % (v/v). Se combinaron datos de tres aislados de condrocitos OA individuales (n=3), cada uno de ellos se examinó por triplicado. Condrocitos de OA de pase 2 sembrados, se expusieron a 100 nM de péptido en ausencia o en presencia de líquido sinovial de OA y después de 24 horas se analizaron para determinar la expresión de ARNm de los genes de COL10A1, ALP, RUNX2, COL2A1, ACAN, SOX9, COX-2, IL-6, PGE, MMP13 y ADAMTS5 (corregida para la expresión de ARNr 28S y en relación con las condiciones de control (sin exposición a péptidos)).

La secreción de PGE2 en el sobrenadante del cultivo se analizó mediante EIA (enzimoinmunoensayo) y la actividad de la enzima ALP (fosfatasa alcalina) se determinó mediante un ensayo colorimétrico desarrollado internamente para determinar la actividad de la ALP. El contenido de GAG (glicosaminoglicanos) se determinó mediante ensayo colorimétrico con azul alcián.

Los resultados se puntuaron como o - donde significa que el péptido disminuyó la actividad de los genes de COL10A1, ALP, RUNX2, COX-2, IL-6, PGE, MMP13 y ADAMTS5 o aumentó la actividad de COL2A1, ACAN y SOX9. Para la actividad de la ALP, un significa una disminución de la actividad y para la actividad de GAG, un significa un aumento de la actividad.

Ejemplo 2: Acción supresora de la hipertrofia de los péptidos BMP-7 durante la diferenciación condrogénica de células ATDC5.

Células ATDC5 se diferenciaron usando protocolos estándar durante 8 días en presencia o en ausencia de péptidos 1 nM de la región A. Los péptidos se añadieron al inicio de la diferenciación y en cada cambio de medio (múltiple) o solo al inicio de la diferenciación y no durante cada cambio de medio (sencillo). En el día 8 en diferenciación, las muestras se recogieron y analizaron con respecto a los genes de COL10A1, ALP, RUNX2, ACAN y BapX/Nkx3.2 mediante RT-qPCR (corregida para la expresión de b-actina y en relación con t=0).

Ejemplo 3: Evaluación de acciones supresoras de OA en modelos de OA ex vixo.

Los péptidos para su uso según la invención también pueden investigarse en pruebas ex vivo: Biopsias de cartílago de grosor completo (perforaciones de 3 mm) de cóndilos femorales procedentes de TKA (siglas del inglés total knee replacement, artroplasia de rodilla total) (K&L grado 2-3) pueden recogerse directamente después de la cirugía, aleatorizarse por paciente y llevarse a cultivo ex vivo como se describió anteriormente. Las biopsias de los pacientes pueden exponerse a péptidos seleccionados después de veinticuatro horas a 0,1, 1, 10 o 100 nM durante 7, 14 o 21 días y el medio puede cambiarse diariamente con péptido reciente.

Como control positivo puede usarse BMP-7 a 1 nM y como control negativo puede usarse vehículo o péptido aleatorio. Después de la exposición, las biopsias de cartílago pueden procesarse para estudiar los principales parámetros determinantes de la calidad del cartílago. El contenido de ADN y el contenido de GAG puede determinarse por peso húmedo. También se puede investigar la actividad de la enzima ALP. Puede analizarse la secreción de PGE2 y GAG en el medio de cultivo. La expresión génica puede determinarse para los principales genes marcadores del fenotipo de condrocitos OA como se describe en el presente documento.

Los cambios locales relacionados con la OA en las biopsias como resultado de la exposición a los péptidos pueden analizarse mediante (inmuno)histoquímica (azul alcián e inmunotinciones para ALP, COL10A1, RUNX2, COL2A1, SOX9 y COX-2, para confirmar adicionalmente la idea de que los péptidos desvelados en el presente documento son adecuados para su uso médico en la OA.

La difusión y localización de los péptidos en biopsias de cartílago se puede abordar en una configuración similar en la que se puede usar una variante biotinilada de los péptidos. Después del cultivo, estas biopsias pueden procesarse para histoquímica. El péptido que se difunde en las biopsias de cartílago puede visualizarse con fluorescencia mediante detección mediada por Estreptavidina-Alexafluor 488. Este enfoque también puede ayudar a visualizar el contexto fenotípico y la localización del péptido por MALDIIMS y ayudar a discriminarlo de los posibles fragmentos endógenos de BMP-7.

Ejemplo 4: Pruebas in vivo.

Las secuencias de aminoácidos de la región A son 100 % homólogas entre seres humanos y ratones. Para establecer adicionalmente la actividad in vivo de los péptidos para su uso según la invención, los péptidos representativos se pueden examinar en un modelo bien aceptado de OA postraumática, el modelo de DMM (desestabilización del menisco medial). El menisco medial puede desestabilizarse en ratones C57BL/6 de 12 semanas de vida. Una semana después de la inducción de la DMM, los péptidos se pueden administrar por vía intraarticular mediante inyecciones dos veces por semana como se describió anteriormente. La dosis puede basarse en estudios de BMP-7 intraarticular en los que las inyecciones semanales de 250 ng de BMP-7 en una articulación de rodilla de rata (en 100 pl) mostraron resultados favorables. Dado que en una articulación de ratón con OA se pueden inyectar 10 pl, se puede inyectar una cantidad equivalente de 25 ng de péptido en este volumen por articulación de rodilla. Para determinar la fuerza farmacológica del péptido, también se puede examinar una cantidad de 2,5 y 0,25 ng de péptido en 2 grupos más. Como controles pueden usarse inyecciones de solución salina. El tamaño de la muestra de este experimento es ventajosamente de 8 ratones por grupo. Los animales pueden sacrificarse en puntos temporales consecutivos después de iniciar el tratamiento con el péptido (2, 4, 8 semanas). Las articulaciones de la rodilla pueden procesarse para análisis (inmuno)histoquímicos y puntuaciones de la OARSI (siglas del inglés Osteoarthritis Research Society International, Sociedad Internacional para la Investigación de la Artrosis) (Safranina-O; modificada de Pritzker).

Ejemplo 5: Tratamiento de condrocitos aislados de pacientes con OA

Durante 24 h, condrocitos aislados de pacientes con OA (n=6), se trataron con BMP-7 (1 nM) o con el péptido de 12 meros según la SEQ ID NO: 16 (1 nM). La expresión de genes procondrogénicos (figura 9A) e hipertróficos (figuras 9B, 9C y 9D) se determinó mediante qRT-PCR (PCR cuantitativa en tiempo real) y se normalizó con respecto a los niveles de ARNr 28S. Estos resultados confirmaron los hallazgos previos de los autores de la presente invención de que la BMP-7 o el péptido de 12 meros inducían una regulación positiva de genes procondrogénicos, tales como Col2a1 (A), y una regulación negativa de genes prohipertróficos, tales como COL10A1, COX-2 y RUNX2 (B, C, D). Estos resultados muestran la actividad biológica imitadora de BMP-7 de la secuencia central del péptido de la región A.

Ejemplo 6: tratamiento de explantes de cartílago.

Se tomaron explantes de cartílago de 4 mm2 de zonas no lesionadas de cartílago articular de la rodilla de un paciente con OA (n=5) y se asignaron al azar a diferentes condiciones de tratamiento experimental (4 explantes por grupo de tratamiento). Después de un período de equilibrio de 24 h, los explantes se trataron durante 24 h con BMP-7 (1 nM) o con el péptido de 12 meros según la SEQ ID NO: 16 (10 nM). La expresión de genes hipertróficos se determinó mediante qRT-PCR y se normalizó con respecto a los niveles de ARNr 28S. Después del tratamiento con BMP-7 o con el péptido de 12 meros, observamos una regulación negativa de genes prohipertróficos, tales como Col10a1 (figura 10A) y MMP13 (figura 10B). Estos resultados están en línea con los efectos descritos anteriormente y muestran la actividad biológica imitadora de BMP-7 de los péptidos desvelados en el presente documento.

Ejemplo 7: Tinción de explantes de cartílago

Durante 14 días se cultivaron explantes de cartílago obtenidos de 2 pacientes en presencia de BMP-7 (1 nM) o de péptido imitador de BMP-7 GYAAYYSEGESAFPLNSYMN (SEQ ID NO: 8) a 10 nM. Los glicosaminoglicanos (GAG), un componente importante de la matriz extracelular (MEC), se tiñeron (de color rojo) con safranina-O y los otros tejidos con tinción de contraste Fast green (de color azul verdoso).

En comparación con el control, los explantes de ambos pacientes tratados con BMP7 y con péptido GYAAYYSEGESAFPLNSYMN (SEQ ID NO: 8) mostraron mayor intensidad de tinción con safranina-O.

Estos resultados están en línea con los efectos descritos anteriormente y muestran la actividad biológica imitadora de BMP-7 de los péptidos desvelados en el presente documento.

Ejemplo 8: tratamiento de explantes de cartílago.

Se tomaron explantes de cartílago de 3 mm2 del cartílago de la rodilla de un paciente con OA (n=6) y se trataron durante 14 días con BMP-7 (1 nM), con el péptido GYAAYYSEGESAFPLNSYMN (SEQ ID NO: 8) a 10 nM o con un péptido de control irrelevante desordenado (10 nM). Los niveles de prostaglandina E2 (PGE2), un factor prohipertrófico, se determinaron mediante un ELISA.

Muestras de tejido sinovial de pacientes con OA (n=6), se trataron durante 24 h con BMP-7 (1 nM), con el péptido GYAAYYSEGESAFPLNSYMN (SEQ ID NO: 8) a 10 nM o con un péptido de control irrelevante desordenado (10 nM). Los niveles de PGE2 se determinaron mediante un ELISA.

Muestras de tejido de panículo adiposo de Hoffa de pacientes con OA (n=6), se trataron durante 24 h con BMP-7 (1 nM), con el péptido GYAAYYSEGESAFPLNSYMN (SEQ ID NO: 8) a 10 nM o con un péptido de control irrelevante desordenado (10 nM). Los niveles de PGE2 se determinaron mediante un ELISA.

Muestras de tejido de menisco de pacientes con OA (n=6), se trataron durante 24 h con BMP-7 (1 nM), con el péptido GYAAYYSEGESAFPLNSYMN (s Eq ID NO: 8) a 10 nM o con un péptido de control irrelevante desordenado (10 nM). Los niveles de PGE2 se determinaron mediante un ELISA.

Los resultados mostraron inequívocamente niveles reducidos de PGE2 en el cartílago y en los tejidos circundantes después del tratamiento con BMP-7 o con el péptido GYAAYYSEGESAFPLNSYMN (SEQ ID NO: 8). El tratamiento con el péptido desordenado no dio como resultado una reducción de los niveles de PGE2.

Referencias

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Péptido para su uso en el tratamiento, la mejora o la prevención de la artrosis, en el que el péptido tiene entre 12 y 28 aminoácidos de longitud y comprende una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 16 o una variante de la misma según la fórmula 2, en el que la secuencia de aminoácidos de dicho péptido está comprendida en la SEQ ID NO: 34 o una variante de la misma según la fórmula 1, en la que la fórmula 1 es:

X1 X2 X3 G Y X4 A X5 Y S E G X6 S X7 X8 X9 L X10 X11 X12 M N A T X13 H A (SEQ ID NO: 47)

en la que

X I = A o I o L o M o Y o V o E o H o K o Q o R,

X2 = P o Y o M,

X3 = E o R o H o K o N o P o Q o S o T o I o L o M o V,

X4 = A o E o Q o R o S,

X5 = Y o N o D,

X6 = E o A o Q,

X7 = A o D o E o H o K o S,

X8 = F o A o D o E o H o Q o R o S,

X9 = P o M,

X10 = N o A o D o S o T o E o Q o R o I o V,

X I I = S o A o D o E o H o K o N o P o Q o T,

X12 = Y o H o D o G o H o N o R o S o T o en la que

X13 = N o F o W o Y o H o K o R.

y en la que la Fórmula 2 es:

Y S E G X6 S X7 X8 X9 L X10 X11 (SEQ ID NO: 48)

en la que

X6 = E o A o Q,

X7 = A o D o E o H o K o S,

X8 = F o A o D o E o H o Q o R o S,

X9 = P o M,

X10 = N o A o D o S o T o E o Q o R o I o V o en la que

X11 = S o A o D o E o H o K o N o P o Q o T.

2. Péptido para su uso según la reivindicación 1, en el que el péptido consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 5-13.

3. Péptido para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el péptido consiste en una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 10.

4. Péptido para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el péptido comprende una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 16.

5. Péptido para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la secuencia de aminoácidos del péptido está completamente comprendida en la SEQ ID NO: 34.

6. Péptido para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el péptido se selecciona del grupo que consiste en péptidos lineales, péptidos lineales retroinversos, péptidos retroinversos, péptidos cíclicos, péptidos de un solo bucle y péptidos de dos bucles.