ES2833357T3

ES2833357T3 - Procedimiento de preparación de plaquetas con un dispositivo de agitación recíproca

Info

Publication number: ES2833357T3
Application number: ES16862024T
Authority: ES
Inventors: Tomohiro Shigemori; Haruki Okamoto; Yoshikazu Kato
Original assignee: Satake Chemical Equipment Mfg Ltd; Megakaryon Corp
Current assignee: Satake Chemical Equipment Mfg Ltd; Megakaryon Corp
Priority date: 2015-11-02
Filing date: 2016-10-31
Publication date: 2021-06-15
Anticipated expiration: 2036-10-31
Also published as: US20180318352A1; SG11201803591UA; RU2741871C2; US12121543B2; EP3372674B1; RU2018120143A; DK3372674T3; CA3003679A1; CN108473954A; AU2016350296A1; EP3372674A1; AU2016350296B2; WO2017077964A1; KR102664131B1; JP6856537B2; EP3372674A4; JPWO2017077964A1; RU2018120143A3; KR20180080261A

Abstract

Un procedimiento para producir plaquetas, que comprende: una etapa de cultivo de células megacariocíticas en una solución de cultivo en un recipiente de cultivo, donde en la etapa de cultivo, la solución de cultivo se agita con una pala de agitación que se mueve en forma reciproca.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento de preparación de plaquetas con un dispositivo de agitación recíproca

Campo técnico

[0001] La presente invención se refiere a un procedimiento de producción de plaquetas que utiliza un dispositivo de agitación que incluye una pala de agitación que se mueve en forma recíproca.

Antecedentes de la técnica

[0002] Se administra una preparación de plaquetas a sujetos que perdieron una gran cantidad de sangre en operaciones o lesiones o que tienen una tendencia a sangrar con una reducción de plaquetas después de los tratamientos con medicamentos contra el cáncer, con el fin de tratar o prevenir los síntomas. La producción de preparación de plaquetas actualmente depende de la donación de sangre por voluntarios sanos. Sin embargo, el número de donantes de sangre se está reduciendo debido a la composición de la población en Japón, y se estima que en 2027 habrá un déficit de sangre donada de alrededor de un millón de personas. Por lo tanto, un suministro estable de plaquetas es uno de los propósitos en el campo técnico de la presente invención, que está definido por las reivindicaciones.

[0003] Además, una preparación de plaquetas convencional tiene un alto riesgo de contaminación microbiana. Por lo tanto, se pueden producir enfermedades infecciosas graves después de la transferencia de la preparación de plaquetas. Por lo tanto, siempre se requieren más preparaciones de plaquetas de seguridad en los centros clínicos. Para satisfacer la necesidad, actualmente se desarrolla un procedimiento de producción de plaquetas a partir de células megacariocíticas cultivadas in vitro.

[0004] Las plaquetas se han producido convencionalmente a partir de células cultivadas en un sistema de cultivo estático usando una placa (WO 2014/100779 A1, Qiang Feng, y col., Stem Cell Reports). Sin embargo, la producción en el sistema de cultivo estático es onerosa e inadecuada para un cultivo en masa.

Lista de referencias

Documento de patente

[0005] Documento de patente 1: WO 2014/1007791

Documento de no patente

[0006] Documento de no patente 1: msts Feng, y col., Stem Cell Reports 31-15 (2014)

Resumen

Problema Técnico

[0007] Los inventores de la presente invención lograron producir plaquetas con una alta bioactividad mediante el uso de un procedimiento de cultivo en un sistema de cultivo de agitación con un matraz agitador, es decir, que incluye agitar un recipiente de cultivo en sí mismo. Sin embargo, se reveló que la cantidad de producción de plaquetas (CD41a+CD42b+) y la bioactividad (propiedad de unión a PAC1, P-selectina positiva) de plaquetas se reducen en el sistema de cultivo en matraz agitador en función de la ampliación de la cantidad del medio.

[0008] Además, se encontró que una reacción de degradación (reducción en la tasa positiva de CD42b) de plaquetas, considerada que es causada por una reacción de desprendimiento, se produce en el sistema de cultivo en matraz agitador. Además, se encontró que las plaquetas contienen muchas plaquetas anormales (plaquetas positivas para anexina V) que no son adecuadas para la transferencia a cuerpos biológicos.

[0009] Por lo tanto, la presente invención pretende proporcionar un procedimiento para producir una gran cantidad de plaquetas de alta calidad que se pueden transferir a cuerpos biológicos.

Solución del problema

[0010] Los inventores de la presente invención realizaron estudios serios para resolver el problema. Como resultado de los estudios serios, los inventores de la presente invención encontraron que la eficiencia de producción y la bioactividad de las plaquetas pueden aumentarse, la degradación de las plaquetas puede inhibirse y las plaquetas anormales pueden reducirse mediante el cultivo de células megacariocíticas mientras se mueve en forma recíproca una pala agitadora dispuesta en un recipiente de cultivo para agitar una solución de cultivo sin agitar el recipiente de cultivo. Además, los inventores de la presente invención llevaron a cabo estudios sobre otras condiciones tales como la densidad celular en el momento del cultivo en agitación al usar un dispositivo de agitación recíproca y completaron la presente invención.

[0011] La presente invención está definida por las reivindicaciones. La presente descripción proporciona un procedimiento para producir plaquetas, que incluye: una etapa de cultivo de cultivar células megacariocíticas en una solución de cultivo en un recipiente de cultivo, donde en la etapa de cultivo, la solución de cultivo se agita mediante el uso de un dispositivo de agitación irregular en el que una pala de agitación no se mueve en una dirección, sino que se mueve en forma recíproca o se invierte.

[0012] En el procedimiento para producir plaquetas, según la presente invención, el recipiente de cultivo es preferentemente un biorreactor cerrado.

[0013] En el procedimiento para producir plaquetas, según la presente invención, las células megacariocíticas se obtienen preferentemente sometiendo a una expresión forzada al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en genes de cáncer, genes Polycomb y genes inhibidores de la apoptosis en células antes de diferenciarse en células megacariocíticas y a continuación poniendo fin a la expresión forzada.

[0014] La presente descripción describe además un procedimiento para producir una preparación de plaquetas, que incluye: la etapa de producir plaquetas en células megacariocíticas mediante el procedimiento descrito anteriormente, y recolectar las plaquetas de un cultivo; y la etapa de eliminar un componente celular hematopoyético distinto a las plaquetas de las plaquetas.

[0015] La presente descripción describe además un procedimiento para producir una preparación de sangre, que incluye: una etapa de producción de producir una preparación de plaquetas mediante el procedimiento descrito anteriormente; y la etapa de obtención de mezclar la preparación de plaquetas y otro componente para obtener una preparación de sangre.

[0016] Las plaquetas producidas por cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente se describen en esta invención.

[0017] En esta invención se describe una preparación de plaquetas producida por cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente o una preparación de plaquetas que contiene las plaquetas.

[0018] En esta invención se describe una preparación de sangre producida por el procedimiento descrito anteriormente o una preparación de sangre que contiene las plaquetas.

Efectos ventajosos de la invención

[0019] El procedimiento de la presente invención puede mejorar adicionalmente la eficiencia de producción de plaquetas en comparación con el cultivo agitado convencional. Además, las plaquetas producidas por el procedimiento de la presente invención tienen una bioactividad más alta que las producidas por el cultivo agitado convencional.

[0020] El procedimiento de la presente invención puede inhibir la reacción de degradación (reducción de la tasa positiva de CD42b) de plaquetas y también puede inhibir la producción de plaquetas anormales (plaquetas positivas para anexina V).

Breve descripción de los dibujos

[0021]

La Fig. 1 muestra un biorreactor según una realización de la presente invención.

La Fig. 2 muestra ejemplos de colocación de un cierre, un eje de accionamiento, una pala de agitación en el biorreactor según la realización de un procedimiento de la presente invención.

La Fig. 3 muestra estructuras de la pala de agitación en el biorreactor según la realización de un procedimiento de la presente invención.

La Fig. 4 muestra una estructura del dispositivo de cultivo VMF utilizado en el ejemplo del procedimiento de la presente invención.

La Fig. 5 muestra los resultados obtenidos al someter las plaquetas obtenidas mediante cultivo agitado o cultivo en agitación de células megacariocíticas a citometría de flujo usando un anticuerpo anti-CD42b y un anticuerpo anti-CD41a.

La Fig. 6 muestra los resultados obtenidos al someter las plaquetas obtenidas mediante cultivo agitado o cultivo en agitación de células megacariocíticas a citometría de flujo antes o después de la estimulación con PMA o ADP usando un anticuerpo anti-CD42b y un anticuerpo anti-PAC-1.

La Fig. 7 muestra los resultados obtenidos al someter las plaquetas obtenidas mediante cultivo agitado o cultivo en agitación de células megacariocíticas a citometría de flujo antes o después de la estimulación con PMA o ADP usando un anticuerpo anti-CD42b y un anticuerpo anti-CD62p.

La Fig. 8 muestra los resultados obtenidos al medir la velocidad de unión a anexina V en las plaquetas obtenidas mediante cultivo agitado o cultivo en agitación de células megacariocíticas, usando citometría de flujo.

La Fig. 9 muestra esquemáticamente un ejemplo de configuración de un biorreactor provisto de palas de agitación en múltiples etapas.

Descripción de las realizaciones

[0022] La presente invención está definida por las reivindicaciones. Un procedimiento para producir plaquetas según la presente descripción incluye: una etapa de cultivo de cultivar células megacariocíticas en una solución de cultivo en un recipiente de cultivo, y en la etapa de cultivo, la solución de cultivo se agita mediante el uso de un dispositivo de agitación irregular en el que una pala de agitación no se mueve en una dirección sino que se mueve en forma recíproca o se invierte. Por ejemplo, la solución de cultivo puede agitarse con la pala de agitación de modo que la pala de agitación pueda tener una resistencia de un fluido a la superficie principal. Más preferentemente, la pala de agitación se mueve en forma recíproca en la dirección del eje de soporte. Más preferentemente, el recipiente de cultivo está parado, un eje de soporte que soporta la hoja de agitación se mueve en forma recíproca en la dirección en la que el eje de soporte se extiende para mover la pala de agitación en la dirección vertical.

[0023] En la presente memoria descriptiva, el "recipiente de cultivo" es un recipiente capaz de cultivar células megacariocíticas mientras se agita una solución de cultivo con un dispositivo de agitación recíproca y no se limita a recipientes particulares. Los ejemplos del recipiente de cultivo incluyen una placa de cultivo en un sistema abierto, un matraz con una tapa roscada en un sistema cerrado y un biorreactor (que incluye un biorreactor cerrado).

[0024] En la presente memoria descriptiva, la "pala de agitación" solo es necesaria para poder disponerse en la solución de cultivo y agitar directamente la solución de cultivo. Como pala de agitación, se utiliza una pala de agitación en forma de placa o una pala de agitación que tiene una estructura de flexión, por ejemplo.

[0025] A continuación, se describe un ejemplo que usa un biorreactor 10 que incluye una pala de agitación como una realización de la presente invención.

[0026] El biorreactor 10 según la presente realización incluye: un tanque de cultivo 11, un cierre 12, un eje de accionamiento (eje de agitación) 13 y una pala de agitación 14, tal como se muestra en la Fig. 1. Las condiciones en las que el eje de accionamiento 13 y similares se colocan en el tanque de cultivo 11 pueden incluir, tal como se muestra en la Fig. 2, un acoplamiento inferior donde el eje de accionamiento 13 está unido a una parte inferior del tanque de cultivo 11 y un acoplamiento lateral donde el eje de accionamiento 13 está unido a una parte lateral del tanque de cultivo 11. El tanque de cultivo 11 tiene una parte del cuerpo tridimensional que tiene una forma obtenida al extender una forma plana circular o rectangular en la dirección longitudinal. El cierre 12 está formado por un elemento de película hecho de un material flexible, tal como caucho, que sigue el movimiento del eje de accionamiento 13, o una estructura de fuelle hecha de un material tal como un metal o teflón (marca registrada), y cubre una abertura superior del tanque de cultivo 11 para que sea hermético. El eje de accionamiento 13 está unido, en la parte superior del mismo, a un dispositivo de movimiento vertical, por ejemplo, un motor de movimiento recíproco 15, penetra el cierre 12 en la parte media del mismo y se fija herméticamente al cierre 12. La pala de agitación 14 tiene una forma plana o una estructura plegada, y la forma de cepillo es, por ejemplo, tal como se muestra en la Fig. 3, una forma ovalada (Fig. 3(B)), un rectángulo (Fig. 3(C)) o una estructura de orificio pasante (Fig. 3(D)) obtenida al proporcionar una placa circular con un orificio pasante 16, cada uno de los cuales se obtiene al reducir un área de una forma circular (Fig. 3(A)) ortogonalmente. Una pala de agitación 14 en una o más etapas se fija al eje de accionamiento 13. Cuando la pala de agitación 14 tiene un orificio pasante 16, se puede aumentar una acción de cizallamiento en un fluido o células que pasan a través del orificio pasante 16 (ver Fig. 9). El orificio pasante 16 puede estar constituido por un orificio grande proporcionado en la pala de agitación 14 (Fig. 3(D)) o una pluralidad de orificios pequeños proporcionados en un área predeterminada de la pala de agitación 14 (Fig. 9).

[0027] La pala de agitación 14 puede ser palas de agitación en múltiples etapas. Por ejemplo, el biorreactor 10 que se muestra en la Fig. 9 tiene una configuración de pala de dos etapas que incluye: una pala de agitación 14 en una etapa superior, unida al eje de accionamiento 13; y una pala de agitación 14 en una etapa inferior, provista de orificios pasantes 16 y, en particular, se mejora adicionalmente un efecto de cizallamiento en la pala de agitación 14 en la etapa inferior.

[0028] En el biorreactor 10 en la presente realización, se puede hacer que la pala de agitación unida al eje de accionamiento (eje de agitación) 13 realice perpendicularmente una rotación hacia adelante y hacia atrás mientras se controla con un servomotor. Además, el control de la rotación hacia delante y hacia atrás por este servomotor es controlado por un impulsor, de modo que se configura un motor de movimiento hacia delante y hacia atrás 15. Por lo tanto, la rotación hacia delante y hacia atrás (la aceleración, el perfil de onda y la velocidad) puede ser controlada por el servomotor.

[0029] El biorreactor 10 proporciona un entorno fisicoquímico favorable para el crecimiento celular óptimo, el metabolismo celular, la madurez diferenciada de las células megacariocíticas, la multinucleación de las células megacariocíticas, la formación de proplaquetas, la producción de plaquetas y el mantenimiento de la bioactividad de las plaquetas. El biorreactor 10 puede incluir un aireador, un extractor de aire, un ajustador de temperatura, un controlador de pH, un ajustador de tensión de oxígeno disuelto (DOT), un deflector, un rociador y un puerto.

[0030] La forma del tanque de cultivo 11 en el biorreactor 10 no se limita a formas particulares. El tanque de cultivo 11 puede tener, por ejemplo, una forma tubular vertical larga y tener una superficie plana en cada una de las partes superior e inferior.

[0031] El volumen del tanque de cultivo es de al menos 300 ml, preferentemente de al menos 1 l, 50 l, más preferentemente de al menos 200 l, más preferentemente de al menos 500 l, aún más preferentemente de al menos 1000 l, y aún más preferentemente de al menos 2000 l.

[0032] En la presente memoria descriptiva, las "células megacariocíticas" son las células más grandes que residen en la médula ósea in vivo y se caracterizan por la liberación de plaquetas. Las células megacariocíticas se caracterizan por ser positivas para los marcadores de superficie celular CD41a-, CD42a- y CD42b y además expresan un marcador seleccionado del grupo que consiste en C^d9, CD61, CD62p, CD42c, CD42d, CD49f, CD51, CD110, CD123, CD131 y CD203c en algunos casos. Las "células megacariocíticas" multinucleadas (poliploidizadas) tienen genomas que son 16 a 32 veces los de las células generales. Sin embargo, cuando las "células megacariocíticas" meramente mencionadas en la presente memoria descriptiva incluyen células megacariocíticas multinucleadas y células megacariocíticas antes de la multinucleación, siempre que incluyan las características descritas anteriormente. Las "células megacariocíticas antes de la multinucleación" significan lo mismo que "células megacariocíticas inmaduras" o "células megacariocíticas en estado de crecimiento".

[0033] Las células megacariocíticas se pueden obtener mediante varios procedimientos conocidos. Un ejemplo no taxativo de un procedimiento para producir células megacariocíticas puede ser el procedimiento descrito en el documento WO 2011/034073. En el procedimiento, los genes de cáncer y los genes Polycomb en las "células antes de diferenciarse en células megacariocíticas" se someten a expresión forzada, de modo que se puede obtener una cepa de células megacariocíticas inmortalizadas de crecimiento infinito. Las células megacariocíticas inmortalizadas también se pueden obtener al someter un gen inhibidor de la apoptosis en las "células antes de diferenciarse en células megacariocíticas" a expresión forzada según el procedimiento descrito en el documento WO 2012/157586. La multinucleación de estas células megacariocíticas inmortalizadas avanza al poner fin a las expresiones forzadas de los genes, liberando así plaquetas.

[0034] Para obtener células megacariocíticas, se pueden combinar los procedimientos descritos en los documentos anteriores. En este caso, las expresiones forzadas de genes de cáncer, genes Polycomb y genes inhibidores de la apoptosis se pueden realizar en paralelo o en secuencia. Por ejemplo, los genes de cáncer y los genes Polycomb se someten a expresión forzada, la expresión forzada se inhibe, los genes inhibidores de la apoptosis se someten posteriormente a expresión forzada, y la expresión forzada se inhibe, para obtener células megacariocíticas multinucleadas. Las células megacariocíticas multinucleadas también se pueden obtener al someter genes de cáncer, genes Polycomb y genes inhibidores de la apoptosis a expresión forzada en paralelo. Las células megacariocíticas multinucleadas también se pueden obtener al someter genes de cáncer y genes Polycomb a expresión forzada, sometiendo posteriormente genes inhibidores de la apoptosis a expresión forzada e inhibiendo las expresiones forzadas en paralelo.

[0035] En la presente memoria descriptiva, las "células antes de diferenciarse en células megacariocíticas" son células que tienen un potencial de diferenciación a megacariocitos y significa células en varias etapas de diferenciación desde el sistema de células madre hematopoyéticas hasta las células megacariocíticas. Ejemplos no limitantes de células antes de diferenciarse en megacariocitos incluyen células madre hematopoyéticas, células progenitoras hematopoyéticas, células CD34 positivas y células progenitoras de megacariocitos/eritrocitos (MEP). Estas células se pueden obtener al aislar, por ejemplo, de médula ósea, sangre del cordón umbilical y sangre periférica o al inducir la diferenciación de células madre pluripotentes tales como células ES, células iPS que además son células indiferenciadas.

[0036] En la presente memoria descriptiva, "genes de cáncer" son genes que inducen el cáncer de células in vivo, y ejemplos de estos incluyen genes de la familia MYC (por ejemplo, c-MYC, N-MYC, L-MYC), genes de la familia SRC, genes de la familia RAS, genes de la familia RAF y genes de la familia de proteínas cinasas tales como c-Kit, PDGFR y Abl.

[0037] En la presente memoria descriptiva, los "genes Polycomb" se conocen como genes que funcionan para regular negativamente los genes CDKN2a (INK4a/ARF) y evitar la senescencia celular (Ogura y col. Regenerative Medicine, vol. 6, No. 4, págs. 26 a 32; Jseus y col., Jseus y col., Nature Reviews Molecular Cell Biology vol. 7, págs.

667-677, 2006; Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol. 100, págs. 211-216, 2003). Los ejemplos no taxativos de los genes Polycomb incluyen BMI1, Mel18, Ring1a/b, Phc1/2/3, Cbx2/4/6/7/8, Ezh2, Eed, Suz12, HADC y Dnmt1/3a/3b.

[0038] En la presente memoria descriptiva, el "gen inhibidor de la apoptosis" es un gen que tiene una función de inhibición de la apoptosis de células, y sus ejemplos incluyen un gen BCL2, un gen BCL-xL, un gen Survivin y un gen MCL1.

[0039] Las expresiones forzadas de los genes y la cancelación de las expresiones forzadas se pueden realizar mediante los procedimientos descritos en los documentos WO 2011/034073, W^o2012/157586, WO 2014/123242 y Nakamura S y col., Cell Stem Cell. 14, 535-548, 2014, otros procedimientos conocidos o procedimientos equivalentes a estos.

[0040] En la presente memoria descriptiva, las "plaquetas" son uno de los componentes celulares en sangre y se caracterizan por ser positivas para CD41a y positivas para CD42b. Las plaquetas desempeñan un papel importante en la formación de trombos y hemostasia, y participan en la fisiopatología de la regeneración tisular y la inflamación después de una lesión. Cuando las plaquetas se activan por hemorragia, se expresan receptores de citoadhesión tales como integrina aIIBp3 (glicoproteína Ilb/IIIa; un complejo de CD41a y CD61) en las membranas. A continuación, las plaquetas se agregan y la fibrina se coagula por varios factores de coagulación sanguínea liberados de las plaquetas. Por lo tanto, se forman trombos y avanza la hemostasia.

[0041] La función de las plaquetas se puede evaluar a través de mediciones por procedimientos conocidos. Por ejemplo, la cantidad de plaquetas activadas se puede medir usando anticuerpos contra PAC-1 que se unen específicamente a integrina aIIBp3 en las membranas plaquetarias activadas. Como alternativa, la cantidad de plaquetas activadas se puede medir detectando CD62P (P-selectina) que es un marcador de activación de plaquetas con un anticuerpo. Por ejemplo, la medición se puede realizar activando plaquetas con un anticuerpo a un marcador plaquetario independiente de activación CD61 o CD41 y luego detectando la unión de un anticuerpo anti-PAC-1 y un anticuerpo anti-CD62P, mediante citometría de flujo. Estas etapas se pueden realizar en presencia de difosfato de adenosina (ADP).

[0042] La función de las plaquetas se puede evaluar comprobando si las plaquetas se unen al fibrinógeno en presencia de ADP. Cuando las plaquetas se unen al fibrinógeno, se activa la integración que se requiere al comienzo de la formación del trombo.

[0043] La función de las plaquetas también se puede evaluar mediante un procedimiento para visualizar y observar una capacidad de formación de trombos in vivo como se muestra en la Fig. 6 del documento WO 2011/034073.

[0044] Cuando las plaquetas tienen una baja tasa de expresión de CD42b o una baja tasa positiva de anexina V, las plaquetas se evalúan como degradadas o anormales. Estas plaquetas no tienen una función de formación de trombos suficiente y una función de hemostasia suficiente y, por lo tanto, no son clínicamente convenientes.

[0045] En la presente memoria descriptiva, "degradación de plaquetas" se refiere a una reducción de CD42b (GPIba) en membranas plaquetarias. Por lo tanto, las plaquetas degradadas contienen plaquetas que tienen un nivel de expresión reducido de CD42b y plaquetas donde los dominios extracelulares de CD42b se escinden mediante una reacción de desprendimiento. Cuando CD42b no está presente en las membranas plaquetarias, las plaquetas no pueden coarmarse con un factor von Willebrand (VWF), y por lo tanto, se pierde la función de coagulación de la sangre de las plaquetas. La degradación de plaquetas se puede evaluar mediante una tasa negativa de CD42b (o la cantidad de partículas negativas de CD42b) respecto a la tasa positiva de CD42b (o la cantidad de partículas positivas de CD42b) en fracciones de plaquetas como indicador. Cuanto mayor sea la tasa negativa de CD42b respecto a la tasa positiva de CD42b, o mayor sea la cantidad de partículas negativas de CD42b respecto a la cantidad de partículas positivas de CD42b, mayor será la degradación de las plaquetas. La tasa positiva de CD42b significa una proporción de plaquetas que se pueden unir a un anticuerpo anti-CD42b en las plaquetas contenidas en fracciones de plaquetas, y la tasa negativa de CD42b significa la proporción de plaquetas a las que un anticuerpo anti-CD42b no se une en las plaquetas contenidas en fracciones de plaquetas.

[0046] En la presente memoria descriptiva, las "plaquetas anormales" son plaquetas donde la fosfatidilserina que es fosfolípido cargado negativamente se expone desde el interior de una bicapa lipídica hacia el exterior. Se sabe que la fosfatidilserina se expone a las membranas plaquetarias in vivo con la activación de las plaquetas, y muchos factores de coagulación de la sangre se unen a la fosfatidilserina, y, por lo tanto, se amplifica una reacción en cascada de coagulación de la sangre. En plaquetas anormales, mucha fosfatidilserina está expuesta siempre a membranas plaquetarias anormales, y cuando las plaquetas anormales se administran a un sujeto, se puede provocar una reacción de coagulación de la sangre excesiva, lo que da como resultado una afección patológica grave como una coagulación intravascular diseminada. La anexina V se une a fosfatidilserina y, por lo tanto, la fosfatidilserina en las membranas plaquetarias se puede detectar mediante un citómetro de flujo utilizando una cantidad de unión de anexina V marcada con fluorescencia como indicador. Por lo tanto, la cantidad de plaquetas anormales se puede evaluar mediante la tasa positiva de anexina V, es decir, la proporción del número de plaquetas a las que se une la anexina en fracciones de plaquetas. Cuanto mayor sea la tasa positiva de anexina V, o cuanto mayor sea el número de partículas de anexina V, mayor será la cantidad de plaquetas anormales.

[0047] Las condiciones de cultivo de las células megacariocíticas en la presente invención pueden ser condiciones normales. Por ejemplo, la temperatura puede ser de aproximadamente 35 °C a aproximadamente 42 °C, de aproximadamente 36 °C a aproximadamente 40 °C, o de aproximadamente 37 °C a aproximadamente 39 °C con el CO²entre el 5 % y el 15 % de y/o O²al 20 %.

[0048] Un medio que se utilizará en el cultivo de células megacariocíticas no se limita a medios particulares, y cualquiera de los medios conocidos que son favorables para producir plaquetas a partir de células megacariocíticas y medios equivalentes a estos se pueden usar según corresponda. Por ejemplo, un medio utilizado para cultivar células animales se puede preparar como un medio basal. Los ejemplos del medio basal incluyen un IMDM, un Medio 199, un Medio Esencial Mínimo de Eagle (EMEM), un aMEM, un Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), un medio F12 de Ham, un medio RPMI 1640, un medio de Fischer y un Medio Neurobasal (Life Technologies Corporation), y mezclas de los mismos.

[0049] El medio puede contener un suero o plasma o no contiene suero. Si es necesario, el medio puede contener al menos una sustancia seleccionada de, por ejemplo, albúmina, insulina, transferrina, selenio, ácido graso, oligoelementos, 2-mercaptoetanol, tiol glicerol, monotioglicerol (MTG), lípidos, aminoácidos (por ejemplo, L-glutamina), ácido ascórbico, heparina, aminoácidos no esenciales, vitaminas, factores de crecimiento, compuestos de bajo peso molecular, antibióticos, agentes antioxidantes, ácido pirúvico, agentes amortiguadores, sales inorgánicas y citocina. La citocina es una proteína que acelera la diferenciación hematopoyética, y sus ejemplos incluyen factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), trombopoyetina (TPO), varias sustancias activas similares a TPO, factor de células madre (SCF), un suplemento ITS (insulina-transferina-selenio) y un inhibidor de ADAM. Un medio preferido en la presente invención es un medio IMDM que contiene suero, insulina, transferrina, serina, tiol glicerol, ácido ascórbico y TPO. El medio puede contener además SCF y puede contener además heparina. La concentración de cada componente no se limita a concentraciones particulares y, por ejemplo, la concentración de TPO puede ser de alrededor de 10 ng/ml a alrededor de 200 ng/ml, o de alrededor de 50 ng/ml a alrededor de 100 ng/ml, la concentración de SCF puede ser de alrededor de 10 ng/ml a alrededor de 200 ng/ml o alrededor de 50 ng/ml, y la concentración de heparina puede ser de alrededor de 10 U/ml a alrededor de 100 U/ml o alrededor de 25 U/ml. El éster de forbol (por ejemplo, forbol-12-miristato-13-acetato; PMA) se puede agregar adicionalmente al medio.

[0050] Cuando se usa un suero, es deseable un suero humano. Por ejemplo, se puede usar un plasma humano como un sustituto del suero. Por el procedimiento según la presente invención, las plaquetas que son comparables a las obtenidas usando un suero pueden obtenerse incluso usando estos componentes.

[0051] Cuando se utiliza un sistema de inducción de expresión génica sensible a fármacos tal como un sistema Tet-On (marca registrada) o Tet-Off (marca registrada) para la expresión forzada de genes o la cancelación de la expresión de fuerza, se puede hacer que un fármaco adecuado tal como tetraciclina o doxiciclina esté contenido en un medio en la etapa de la expresión forzada, y la expresión forzada se puede inhibir mediante la eliminación del fármaco adecuado del medio.

[0052] La etapa de cultivo de células megacariocíticas en la presente invención se lleva a cabo mediante cultivo en suspensión y, por lo tanto, se puede llevar a cabo sin células alimentadoras.

[0053] La presente descripción abarca plaquetas producidas por el procedimiento según la presente invención.

[0054] Un procedimiento para producir una preparación plaquetaria según la presente descripción incluye: la etapa de cultivar células megacariocíticas mediante el procedimiento según la presente invención para producir plaquetas y recolectar una fracción en la que las plaquetas son abundantes a partir de un cultivo; y la etapa de eliminar un componente celular hematopoyético diferente de las plaquetas de la fracción. La etapa de eliminación de un componente celular hematopoyético se puede llevar a cabo mediante la eliminación de un componente celular hematopoyético distinto de las plaquetas que contienen células megacariocíticas usando un filtro de eliminación de leucocitos (por ejemplo, fabricado por Terumo corporation o Asahi Kasei Medical Co., Ltd.). Un procedimiento específico adicional para producir una preparación de plaquetas se describe, por ejemplo, en WO 2011/034073.

[0055] El procedimiento para producir una preparación de sangre según la presente descripción incluye: la etapa de producir una preparación de plaquetas mediante el procedimiento según la presente invención; y la etapa de mezclar la preparación de plaquetas y otro componente. Otro componente puede ser, por ejemplo, una célula eritroide.

[0056] Otros componentes que contribuyen a la estabilización de las células se pueden agregar adicionalmente a la preparación de plaquetas y la preparación de sangre.

[0057] En la presente memoria descriptiva se citan documentos de patentes y documentos no relacionados con patentes.

Ejemplo 1

,

[0058] A continuación se describe la presente invención en detalle sobre la base de los ejemplos. Sin embargo, la presente invención no se limita en modo alguno a los mismos.

1. Producción de megacariocitos inmortalizados

1-1. Preparación de células progenitoras hematopoyéticas a partir de células iPS

[0059] Se realizó un cultivo de diferenciación de células iPS humanas (células TKDN SeV2: iPS derivadas de fibroblastos cutáneos fetales humanos, establecidas utilizando el virus Sendai) a células sanguíneas según el procedimiento descrito en Takayama N., y col., J Exp Med. 2817-2830 (2010). Es decir, las colonias de células ES/iPS humanas se co-cultivaron con células alimentadoras C3H10T1/2 en presencia de 20 ng/ml de VEGF (R&D Systems, Inc.) durante 14 días para producir células progenitoras hematopoyéticas (HPC). El co-cultivo se llevó a cabo en condiciones de cultivo con el O²al 20 % y al el CO²al 5 % (en lo sucesivo, las mismas, a menos que se describa específicamente lo contrario).

1-2. Sistema de administración de genes

[0060] Como sistema de administración de genes, se utilizó un sistema vectorial lentiviral. Un vector lentiviral es un vector del sistema de inducción de la expresión génica Tet-On (marca registrada) controlado por tetraciclina. Los vectores lentivirales se produjeron reemplazando el casete mOKS de LV-TRE- mOKS-Ubc-tTA-I2G (Kobayashi, T., y col., Cell 142, 787-799 (2010)) con c-MYC, BMI1 y BCL-xL. Los vectores lentivirales fueron LV-TRE-c-Myc-UbctTA-I2G, LV-TRE-BMI1-Ubc-tTA-I2G y LV-TRE-BCL-xL-Ubc-tTA- I2G.

[0061] Las partículas de virus se produjeron mediante transferencia génica de los vectores lentivirales en células 293T usando cualquier procedimiento.

[0062] Los genes de BMI1, MYC y BCL-xL se transfieren a secuencias genómicas de células diana mediante la infección de varias partículas con las células diana. Estos genes transferidos de forma estable a las secuencias genómicas se pueden someter a expresión forzada mediante la adición de doxiciclina a un medio (#631311, Clontech Laboratories, Inc.).

1-3. Infección del virus c-MYC y BMI1 a células progenitoras hematopoyéticas

[0063] En placas de 6 pocillos a las que se sembraron previamente células alimentadoras C3H10T1/2, se sembraron 53104 células/pocillo de HPC obtenidas por el procedimiento descrito anteriormente, y c-MYC y BMI1 se sometieron a expresión forzada por el procedimiento de lentivirus. En este caso, se utilizaron 6 pocillos por cada tipo de cepa celular. Es decir, se añadieron partículas de virus a un medio para ser una MOI de 20. Las células se infectaron con las diversas partículas mediante infección por centrifugación (centrifugación a 32°C y 900 rpm durante 60 minutos). Esta operación se realizó un total de dos veces cada 12 horas.

[0064] Como medio, un medio obtenido mediante la adición adicional de protamina a un medio (en lo sucesivo, un medio de diferenciación) que se obtiene mediante la adición de 50 ng/mlL de trombopoyetina humana (TPO) (R&D Systems, Inc.), 50 ng/ml de factor de células madre humanas (SCF) (R&D Systems, Inc.) y 2 pg/ml de doxiciclina (Dox) a un medio basal (IMDM (medio de Dulbecco modificado de Iscove) (Sigma-Aldrich) que contiene suero fetal bovino al 15 % (GIBCO), penicilina-estreptomicina-glutamina al 1 % (GIBCO), solución de insulina, transferrina, selenio al 1 % (ITS-G) (GIBCO), 1 -tioglicerol 0,45 mM (Sigma-Aldrich) y 50 pg/ml de ácido L-ascórbico (Sigma-Aldrich)), para tener una concentración final de 10 pg/ml. 1-4. Cultivo de producción y mantenimiento de cepa de autocrecimiento de megacariocitos

[0065] Suponiendo que el día en que se realizó la infección con el virus de cMYC yBMI1 mediante el procedimiento descrito anteriormente fue el día 0 de la infección, se produjeron cepas de autocrecimiento de megacariocitos mediante el cultivo de células megacariocíticas de tipo transferencia génica cMYC y células megacariocíticas de tipo transferencia génica BMI1. La expresión forzada del gen BMI1 y el gen c-MYC se realizó mediante la adición de 1 pg/mL de doxiciclina (#631311, Clon-tech Laboratories, Inc.) a un medio.

• Del día 2 al día 11 de infección

[0066] Las células sanguíneas infectadas con el virus mediante el procedimiento descrito anteriormente se recolectaron mediante pipeteo, se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 minutos para eliminar el sobrenadante, a continuación se suspendieron en un nuevo medio de diferenciación y se sembraron en nuevas células alimentadoras C3H10T1/2 (placas de 6 pocillos). El día 9 de la infección, se realizó la misma operación para subcultivo. El número de células se contó y las células se sembraron en células alimentadoras C3H10T1/2 a 13 105 células/2 ml/pocillo (placas de 6 pocillos).

• Del día 12 al día 13 de infección

[0067] Se realizó la misma operación realizada el día 2 de la infección. El número de células se contó y las células se sembraron en células alimentadoras C3H10T1/2 a 33105 células/10 ml/placa de 100 mm (placa de 100 mm).

• Día 14 de infección

[0068] Se recogieron células sanguíneas infectadas con el virus y se realizó una reacción de anticuerpo usando 2 |jl de anticuerpo anti-CD41a-APC humano (BioLegend, Inc.), 1 j l de anticuerpo anti-CD42b-PE humano (eBioscience, Inc.) y 1 j l de anticuerpo anti-humano CD235ab Pacific Blue (BioLegend, Inc.) por 1.03 105 células. Después de la reacción de anticuerpos, el análisis se realizó utilizando FACS Verse (BD). Las células que tenían la tasa positiva de CD41a del 50% o más el día 14 de infección se consideraron cepas de autocrecimiento de megacariocitos.

1-5. Infección de cepas de autocrecimiento de megacariocitos con el virus BCL-xL

[0069] BCL-xL se transfirió a las cepas de autocrecimiento de megacariocitos el día 14 de la infección mediante el procedimiento de lentivirus. Las partículas de virus se añadieron a un medio para que sea una MOI de 10. Las células se infectaron con el virus BCL-xL mediante infección por centrifugación (centrifugación a 32 °C y 900 rpm durante 60 minutos). La expresión forzada del gen BCL-xL se realizó mediante 1 jg/mL de doxiciclina (#631311, Clontech Laboratories, Inc.) al medio.

1-6. Cultivo de producción y mantenimiento o megacariocito inmortalizado

• Del día 14 al día 18 de infección

[0070] Se recogieron cepas de autocrecimiento de megacariocitos a las que se transfirió BCL-xL, obtenidas por el procedimiento descrito anteriormente y se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 minutos. Después de la centrifugación, las células precipitadas se suspendieron en un nuevo medio de diferenciación y luego se sembraron en células alimentadoras C3H10T1/2 a 23105 células/2 ml/pocillo (placas de 6 pocillos).

• Día 18 de infección: subcultivo

[0071] El número de células se contó y las células se sembraron a 3 x 105 células/10 ml/100 mm-dish.

• Día 24 de infección: subcultivo

[0072] El número de células se contó y las células se sembraron a 1 x 105 células/10 ml/placa de 100 mm. A partir de entonces, el subcultivo se realizó cada 4 a 7 días para el cultivo de mantenimiento.

[0073] Las cepas de autocrecimiento de megacariocitos a las que se transfirió BCL-xL se recolectaron el día 24 de la infección, y la inmunotinción se realizó usando 2 j l de anticuerpo anti-CD41a-APC humano (BioLegend, Inc.), 1 j l de anticuerpo anti-CD42b-PE humano (eBioscience, Inc.) y 1 j l de anticuerpo anti-humano CD235ab Pacific Blue (Anti-CD235ab-PB; BioLegend, Inc.) por 1.0 x 105 células. Después de la inmunotinción, el análisis se realizó utilizando FACS Verse (BD). Las células que tenían la tasa positiva de CD41a del 50 % o más el día 24 de la infección se consideraron cepas de células megacariocíticas inmortalizadas. Las células que podrían cultivarse durante 24 días o más después de la infección se determinaron como una cepa de células megacariocíticas inmortalizadas SeV2-MKCL.

[0074] El SeV2-MKCL obtenido se sometió a cultivo estático en disco de 10 cm (10 ml/placa). Como medio, un medio obtenido mediante la adición, a un IMDM como medio basal, de los siguientes componentes (las concentraciones son concentraciones finales).

FBS (#172012, lote.12E261, Sigma), 15 %

L-Glutamina (#25030-081, Gibco), 2 mM

ITS (#41400-045, Gibco), 100X

MTG (monotioglicerol, #M6145-25ML, Sigma) 450 jM

Ácido ascórbico (#A4544, Sigma) 50 |jg/ml

Puromicina (#P8833-100MG, Sigma) 2 jg/ml

SCF (#193-15513, Wako Pure Chemical Industries Ltd.) 50 ng/ml

Sustancia de acción similar a TPO, 200 ng/ml

Las condiciones de cultivo fueron 37 °C y 5 % de CO²

2. Generación de plaquetas

[0075] Posteriormente, la expresión forzada se canceló mediante el cultivo del SeV2-MKCL en un medio que no contenía doxiciclina. Específicamente, la cepa de células megacariocíticas inmortalizadas (SeV2-MKCL) obtenida en el procedimiento del punto 1 anterior se lavó con PBS (-) dos veces y se suspendió en el siguiente medio a una densidad de siembra de 1.0 x 105 células/ml.

[0076] El medio se obtiene añadiendo los siguientes componentes al IMDM (las concentraciones son concentraciones finales).

FBS, 15 %

L-Glutamina (#25030-081, Gibco), 2 mM

ITS (#41400-045, Gibco), 100X

MTG (monotioglicerol, #M6145-25ML, Sigma), ácido ascórbico 450 jM (#A4544, Sigma), 50 jg/ml

SCF (#193-15513, Wako Pure Chemical Industries Ltd.), 50 ng/ml

Sustancia activa similar a TPO, 200 ng/ml

Inhibidor de ADAM, 15 jM

SR1, 750 nM

Inhibidor de ROCK, 10 jM

[0077] La cepa celular de megacariocitos inmortalizados (SeV2-MKCL) obtenida por el procedimiento del punto 1 anterior se suspendió en el medio para preparar una suspensión celular. A un biorreactor 10, se añadieron 2,4 l o la suspensión celular, y a un matraz agitador de 125 ml, se añadieron 25 ml de la suspensión celular. El biorreactor 10 tiene una pala de agitación 14 en una o más etapas, y se utilizó un dispositivo de cultivo 3.0 L-VMF (en lo sucesivo denominado VMF) que puede mover recíprocamente la pala de agitación 14 en la dirección vertical. Las especificaciones de VMF son las siguientes. Dimensiones exteriores del cuerpo (mm): 300 A 3485 P 3890 A; las dimensiones del tanque de cultivo 11 (mm):140 (diámetro interior) x 203 (profundidad); la cantidad líquida del tanque de cultivo 11: 3,0 l; la pala de agitación 14: estructura ovalada plegada (etapa inferior) forma ovalada plana (etapa superior), fijación en dos etapas; el tipo accionado directamente: tipo no sellado accionado por eje lineal; intervalo de ajuste de temperatura: temperatura ambiente 5 °C a 20 °C; intervalo de oscilación vertical: 10 mm a 30 mm; velocidad máxima de la pala en movimiento vertical: 80 mm/s a 150 mm/s; control de medición: agitación, temperatura, pH, oxígeno disuelto, nivel, campo. La Fig. 4 muestra el VMF.

[0078] En el FVM, se cultivaron 2,4 Ll de la suspensión de la cepa de células megacariocíticas inmortalizadas. El ambiente de cultivo fue de 37 °C y de CO²al 5 %. La velocidad de agitación fue de 1,6 Hz, y la longitud de la carrera de agitación fue de 3 cm.

[0079] En un matraz agitador de 125 ml, se cultivaron 25 ml de la suspensión de la cepa de células megacariocíticas inmortalizadas. El cultivo agitado se realizó usando una incubadora de agitación (AniCell, N-BIOTEK Inc.) a 37 °C, CO²al 5 % y 100 rpm.

3. Medición de plaquetas

[0080] Para someter a medición las plaquetas producidas en el procedimiento del punto 2 anterior, se recogió una muestra de sobrenadante cultivada después de 6 días del cultivo y se tiñó y analizó mediante citometría de flujo. La cantidad de partículas CD41a positivas, CD42b positivas se determinó como la cantidad de plaquetas normales, la cantidad de partículas CD41a positivas, CD42b negativas se determinó como la cantidad de plaquetas degradadas. La cantidad de partículas positivas para anexina V se determinó como la cantidad de plaquetas anormales. Además, la muestra se estimuló con PMA o ADP/trombina, y la tasa positiva PAC-1 y la tasa positiva CD62p antes después de la estimulación se calcularon para medir la bioactividad.

[0081] Los procedimientos de medición específicos son los siguientes.

3-1. Medición de plaquetas

[0082] Para medir la bioactividad de cada una de las plaquetas normales, las plaquetas degradadas y las plaquetas, se agregaron 900 ml de diluyente a cada microtubo de 1,5 ml y a continuación se agregaron 100 ml de un sobrenadante de cultivo, se mezclaron. A cada tubo FACS, se dispensaron 200 ml de sobrenadante de cultivo mezclado diluido, y el siguiente anticuerpo o proteína etiquetado se añadió adicionalmente a la tinción. Para someter las plaquetas anormales a medición, se dispensaron 100 ml del sobrenadante de cultivo a cada tubo FACS, y el siguiente anticuerpo o proteína marcado se añadió adicionalmente a la tinción, y la mezcla se diluyó 5 veces con un amortiguador de unión a anexina V (BD) inmediatamente antes del análisis mediante un citómetro de flujo, y a continuación se llevó a cabo el análisis.

[0083] Los anticuerpos utilizados son los siguientes.

Medición de plaquetas normales y plaquetas degradadas

0,5 |jl de anticuerpo anti-CD41, marcado con APC (303710, BioLegend, Inc.)

0,5 j l de anticuerpo anti-CD42a, marcado con PB (48-0428-42, eBioscience, Inc.)

0,5 j l de anticuerpo anti-CD42b, marcado con PE (12-0428-42, eBioscience, Inc.)

Medición de la bioactividad de las plaquetas

0,5 j l de anticuerpo anti-CD62p, marcado con APC (304910, BioLegend, Inc.)

10 j l de anticuerpo anti-PAC-1, marcado con FITC (303704, BD)

Medición del número de plaquetas anormales

0,5 j l de anticuerpo anti-CD41, marcado con APC (303710, BioLegend, Inc.)

5 (L, marcado con Anexina V FITC (556419, BD)

3-2. Medición de la cantidad de plaquetas normales producidas

[0084] La Fig. 5 muestra los resultados. La cantidad de plaquetas normales producidas fue mayor en el cultivo en el VMF, en comparación con la del cultivo con un matraz agitador (Fig. 5(B)). Cuando la cantidad de plaquetas normales por la cantidad de células megacariocíticas se calcula como eficiencia de producción de las plaquetas normales, la eficiencia de producción de las plaquetas normales fue alrededor de 6,0 a 7,7 veces mayor en el cultivo en el VMF que en el cultivo usando un matraz agitador (Fig. 5(C)). Es decir, la cantidad de plaquetas normales producidas por la cantidad de células megacariocíticas podría aumentarse mediante el cultivo en el VMF, en comparación con el cultivo convencional usando un matraz agitador.

3-3. Medición de plaquetas degradadas

[0085] En la medición de las plaquetas degradadas, cada muestra tratada se analizó mediante el procedimiento del punto 3-1 anterior utilizando un citómetro de flujo, y se midió el número de partículas CD41a-positivas, CD42b positivas, y el número de partículas CD41a positivas, CD42b negativas. A continuación, la cantidad de partículas CD41a-positivas, CD42b positivas se determinó como la cantidad de plaquetas normales, y la cantidad de partículas CD41a positivas, CD42b negativas se determinó como la cantidad de plaquetas degradadas, y se calculó la relación de la cantidad de plaquetas degradadas con respecto a la cantidad de plaquetas normales.

[0086] La Fig. 5 muestra los resultados. La relación de la cantidad de plaquetas degradadas con respecto a la cantidad de plaquetas normales en el cultivo en el VMF fue alrededor de 0,31 a 0,39 veces menor que la de cultivo usando un matraz agitador (Figura 5(A)). Es decir, la cantidad de plaquetas degradadas producidas podría reducirse en el cultivo en el VMF, en comparación con el cultivo convencional utilizando un matraz agitador.

3-3. Medición de la bioactividad de las plaquetas

[0087] La estimulación de las plaquetas se llevó a cabo usando PMA 0,2 mM (Forbol 12-miristato 13-acetato, #P1585-1MG, Sigma) o ADP 100 jM (#A2754, Sigma) y 0,5 U/ml de trombina (Sigma) a temperatura ambiente. Después de 30 minutos desde la estimulación, se realizó una medición utilizando FACSverce fabricado por BD. La tasa positiva de PAC-1 y la tasa positiva de CD62p en fracciones de las plaquetas CD42a positivas antes y después de la estimulación se midieron y evaluaron comparativamente.

[0088] Las Figuras 6 y 7 muestran los resultados. La tasa positiva de PAC-1 en el momento de la estimulación con PMA o ADP/trombina fue aproximadamente 1,9 a 3,1 veces mayor en el cultivo en el VMF, en comparación con el cultivo con un matraz agitador (Fig. 6). La tasa positiva de CD62p fue de alrededor de 1,8 a 2,7 veces o más mayor en el cultivo en el VMF, en comparación con el cultivo usando un matraz agitador (Fig. 7). Es decir, la cantidad de plaquetas producidas que tienen alta bioactividad podría aumentar mediante el cultivo en el VMF, en comparación con el cultivo convencional utilizando un matraz agitador.

3-4. Medición de plaquetas anormales

[0089] Cada muestra tratada se analizó mediante el procedimiento del punto 3-1 anterior utilizando un citómetro de flujo, y se midió el número de partículas positivas para anexina V. La cantidad de partículas positivas para CD42b, positivas para anexina V se determinó como la cantidad de plaquetas anormales.

[0090] La Fig. 8 muestra los resultados. El número de partículas positivas para CD42b y anexina V fue de aproximadamente 0,31 a menos de 0,34 veces menor en el cultivo en el VMF, en comparación con el cultivo usando un matraz agitador (Fig. 8). Es decir, la cantidad de plaquetas anormales producidas podría reducirse cultivando en el VMF, en comparación con el cultivo convencional usando un matraz agitador.

Aplicación Industrial

[0091] Es obvio que las plaquetas de alta calidad que no se pueden obtener agitando el cultivo usando matraces agitadores se pueden obtener mediante la presente invención. Por lo tanto, la presente invención puede contribuir a la producción de una gran cantidad de plaquetas a escala industrial.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para producir plaquetas, que comprende:

una etapa de cultivo de células megacariocíticas en una solución de cultivo en un recipiente de cultivo, donde en la etapa de cultivo, la solución de cultivo se agita con una pala de agitación que se mueve en forma reciproca.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, donde

se utiliza un biorreactor que mueve en forma recíproca la pala de agitación utilizada en la etapa de cultivo en una dirección vertical, una dirección horizontal o una dirección de rotación hacia adelante y hacia atrás para someter la solución de cultivo a una agitación irregular.

3. El procedimiento según la reivindicación 1, donde

la pala de agitación utilizada en la etapa de cultivo tiene una forma ovalada, y en la etapa de cultivo se utiliza un biorreactor que mueve en forma recíproca la pala de agitación en dirección vertical para agitar la solución de cultivo.

4. El procedimiento según la reivindicación 1, donde

la pala de agitación utilizada en la etapa de cultivo tiene una estructura de forma ovalada doblada, y en la etapa de cultivo se utiliza un biorreactor que mueve en forma recíproca la pala de agitación en dirección vertical para agitar la solución de cultivo.

5. El procedimiento según la reivindicación 1, donde

la pala de agitación utilizada en la etapa de cultivo tiene una forma ovalada plegada y está unida a un eje de agitación en al menos una etapa para ser ortogonal a una pala de agitación que tiene una forma ovalada plana, y en la etapa de cultivo se utiliza un biorreactor que mueve en forma recíproca la pala de agitación en dirección vertical para agitar la solución de cultivo.

6. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde

como la pala de agitación, se utiliza una pala de agitación que tiene un orificio pasante.

7. El procedimiento según la reivindicación 1, donde

el recipiente de cultivo es un biorreactor cerrado.

8. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde

las células megacariocíticas se obtienen sometiendo a una expresión forzada al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en genes de cáncer, genes Polycomb y genes inhibidores de la apoptosis en células antes de diferenciarse en células megacariocíticas y a continuación poniendo fin la expresión forzada.