ES2833162T3

ES2833162T3 - Receptor de antígeno quimérico y su uso

Info

Publication number: ES2833162T3
Application number: ES15738356T
Authority: ES
Inventors: Hinrich Abken; Andreas Hombach
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-07-16
Filing date: 2015-07-16
Publication date: 2021-06-14
Anticipated expiration: 2035-07-16
Also published as: DK3169703T4; US20170145095A1; US20220002401A1; DK3169703T3; WO2016008973A1; US12410248B2; EP3169703B1; EP3169703B2; ES2833162T5; US10865243B2; EP3169703A1; FI3169703T4

Abstract

Polipéptido recombinante que es un receptor de antígeno quimérico (CAR) que contiene al menos los siguientes dominios en orden, comenzando desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal: a.) un primer dominio que contiene i) la unidad de anticuerpo anti-CD30 de cadena sencilla de HRS3-scFv de SEQ ID NO: 2 y ii) una unidad de anticuerpo que es una unidad de anticuerpo de scFv que se une específicamente a un antígeno asociado a tumor presente en la superficie de una célula diana predeterminada; b.) opcionalmente, un dominio espaciador; c.) un dominio transmembrana; y d.) un dominio de señalización citoplásmica.

Description

DESCRIPCIÓN

Receptor de antígeno quimérico y su uso

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido recombinante que contiene un dominio que comprende al menos dos unidades de anticuerpo, mediante lo cual una unidad de anticuerpo es una unidad de anticuerpo anti-CD30 de cadena sencilla mientras que otra unidad de anticuerpo es una unidad de anticuerpo que es específica de un antígeno presente en la superficie de una célula diana predeterminada según la reivindicación 1 o la reivindicación 2. En particular, la presente invención se refiere a un polipéptido recombinante que contiene al menos los siguientes dominios comenzando desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal: un primer dominio que contiene una unidad de anticuerpo anti-CD30 de cadena sencilla de HRS3-scFv de SEQ ID NO: 2 y una unidad de anticuerpo, siendo dicha unidad de anticuerpo específica de un antígeno presente en la superficie de una célula diana predeterminada, concretamente, siendo específica de un antígeno asociado a tumor; opcionalmente, un dominio espaciador; un dominio transmembrana; y un dominio de señalización citoplásmica. Del mismo modo, el polipéptido recombinante puede estar dispuesto en orden, en el que el dominio que comprende al menos dos unidades de anticuerpo tiene el orden: un primer dominio que contiene una unidad de anticuerpo específica de un antígeno asociado a tumor y el segundo dominio que contiene una unidad de anticuerpo anti-CD30 de cadena sencilla. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica para el polipéptido según la presente invención, así como a vectores y a células que contienen los mismos. Además, se proporcionan células T aisladas, como una célula T CD8+ o ^cD4+, que expresan en su superficie receptores de antígeno quiméricos que contienen una unidad de anticuerpo anti-CD30 de cadena sencilla y una unidad de anticuerpo, mediante lo cual dicha unidad de anticuerpo es específica de un antígeno presente en la superficie de una célula diana predeterminada.

Estas células son particularmente útiles en el tratamiento de cáncer, en particular cáncer CD30'. Es decir, las células son para su uso en terapia celular adoptiva para tratar cáncer en un sujeto que lo necesita.

Técnica anterior

La transferencia adoptiva de células T ha demostrado una eficacia significativa en el tratamiento de tumores malignos y puede ser curativa en pacientes con diversas enfermedades, incluyendo leucemia o tumores malignos asociados al virus de Epstein Barr. Normalmente, las células T derivadas del paciente se modifican por ingeniería ex vivo para expresar un receptor de células T recombinante o, alternativamente, un receptor de antígeno quimérico. Dicho receptor de antígeno quimérico (CAR, Chimeric Antigen Receptor) se compone normalmente de un dominio de unión a antígeno extracelular derivado de un anticuerpo y un dominio de activación de células T intracelular derivado del endodominio del receptor de células T. A diferencia del TCR fisiológico, el CAR se compone de una sola cadena de polipéptido que combina la unión del antígeno a través del resto extracelular con una maquinaria de activación de células T proporcionada por el resto de señalización intracelular. Por tanto, debido al dominio de unión derivado del anticuerpo, las células T modificadas con CAR reconocen su diana, normalmente, un antígeno de superficie celular, independientemente de la presentación de antígeno del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH), y no se ven comprometidas por variantes de células tumorales con posesión reducida o deficiente de antígeno, que representa un mecanismo observado comúnmente del escape inmunitario tumoral. Los CAR se encuentran en el foco de investigación en los últimos años. En particular, su capacidad para dirigir y lisar células predefinidas se encuentra en el foco de la inmunoterapia. Ensayos clínicos recientes han destacado el potencial de la terapia adaptativa de cáncer con células T redirigidas con CAR. Por ejemplo, los pacientes con neuroblastoma tratados con células T de CAR específicas de gangliósido GD2 mostraron algunos efectos antitumorales alentadores, aunque las células T persisten sólo durante un breve periodo. Estudios adicionales probaron el concepto de que las células T modificadas por ingeniería con CAR pueden iniciar una respuesta antitumoral productiva en pacientes que padecen diversos tumores malignos. El enfoque con CAR difiere de otras estrategias de terapia inmunitaria mediada por anticuerpos, por ejemplo, usando inmunotoxinas, en la medida en que se usan células modificadas por ingeniería en lugar de moléculas individuales.

En los últimos años, se han realizado esfuerzos en la optimización del diseño de CAR, véase, por ejemplo, Bridgeman J.S., et al., Curr Gene Ther 2010, 10, 77-90. Sin embargo, sigue habiendo muchos desafíos, en particular, la necesidad de una respuesta antitumoral más efectiva y la prolongación de la supervivencia de células T que permita una persistencia a largo plazo de las células T de dichas células T modificadas por ingeniería en el cuerpo. Además, las señales coestimuladoras requeridas para una aplicación clínica con éxito siguen siendo ilusorias, por ejemplo, véase Hombach A, et al., Curr Mol Med. Agosto de 2013; 13(7):1079-88. Así, existe trabajo en curso sobre la optimización de CAR para diversos enfoques, incluyendo la inmunoterapia adaptativa.

Hombach A., et al., Gene Therapy, 2010, 17, 1206-1213 describen la modificación del dominio espaciador de IgG1-Fc en el resto extracelular de receptores de antígeno quiméricos para evitar la activación fuera de la diana y el inicio imprevisto de una respuesta inmunitaria innata. En ese documento, se han usado células T modificadas por ingeniería con CAR modificado, o bien un CAR anti-CD30 o bien un CAR anti-CEA. Tal como se demostró en ese documento, las células T de CAR anti-CEA no son eficaces contra células negativas para CEA ni las células T de CAR anti-CD30 contra células CD30\ La modificación dada a conocer en esta publicación se refiere a evitar la activación de la diana por el inicio imprevisto de la respuesta inmunitaria, por ejemplo, debido a la reactividad cruzada con un dominio espaciador en el resto extracelular del CAR.

En Kofler et al., 2011, Mol. Ther. 19, 760-767 se describe una molécula de CAR que tiene un endodominio de CD28 combinado con un endodominio de CD3 y un ectodominio de scFv derivado de anticuerpo específico de CEA. En ese documento se describe que una deleción del resto de unión lck en el endodominio de CAR de CD28 mejora la actividad antitumoral redirigida en presencia de células T reguladoras sin alterar la secreción, la proliferación y la citolisis de interferón-gamma. Se especula que el CAR con el endodominio de CD28 modificado facilita la implementación de la terapia adoptiva con células T en pacientes con una variedad de tipos de cáncer que están muy infiltrados por células T reguladoras (células Treg).

Se proporciona un resumen del presente conocimiento sobre células T redirigidas con receptores de antígeno quiméricos en el artículo de revisión de Chmielewski M., et al, Frontiers in immunology, 2013, 4, 1-7, así como en Melenhorst JJ, Levine BL., Cytotherapy. Septiembre de 2013; 15(9):1046-53. Además, se proporciona un resumen de terapia adoptiva de cáncer con células T redirigidas con CAR en Hombach A., et al., Curr Mol Med, 2013, 13(1), 1-10. En ese documento, se resumen los efectos de CAR, incluyendo la actividad de coestimulación así como la mejora y la prolongación de la respuesta antitumoral redirigida de las células T. Además, se describen los efectos adversos de esta clase de terapia adaptativa, incluyendo la “tormenta de citocinas” y la “represión de células T”. Recientemente, Chmielewski et al, Immunol Reviews vol. 257, 2014, p83-90 comentan la posibilidad de que las células T de CAR modificadas por ingeniería con una citocina inducible modulan el estroma tumoral.

Wilkie, S. et al., J. Clin. Immunol., 2012, 32, 1059-1070 describen un doble direccionamiento de ErB2 y MUC1 en cáncer de mama usando dos CAR independientes, cada uno capaz de la activación completa de células T. Kloss et al., Nat Biotechnol. Enero de 2013; 31(1 ):71-5 notifican células T modificadas por ingeniería con dos CAR independientes que proporcionan señalización complementaria. Los vectores descritos en ese documento codifican para dos moléculas de CAR independientes expresadas simultáneamente por las propias células T.

Grada, Z. et al., Molecular Therapy-Nucleic Acids, 2013, vol. 2, página 105 se refieren a TanCAR, un novedoso CAR biespecífico para la inmunoterapia contra el cáncer. Las moléculas de CAR descritas en ese documento están diseñadas para identificar ligandos, estando presentes ambas en la célula diana.

Es decir, las células T modificadas con receptores de antígeno quiméricos (CAR) usadas en la actualidad para el direccionamiento redirigido por antígenos hacia células tumorales muestran un rendimiento insuficiente en el ataque antitumoral debido a diversos motivos, en particular, debido a una amplificación y una actividad citolítica menores después de la transferencia adoptiva al paciente. Así, el mayor obstáculo de la estrategia para su uso clínico es el rendimiento insuficiente de las células T modificadas por ingeniería a largo plazo.

Además, aparte del efecto beneficioso de las células T que expresan CAR en la terapia adoptiva, se conocen efectos de sobra que actualmente dificultan el desarrollo favorito de la terapia respectiva tal como se mencionó anteriormente.

Breve descripción de la presente invención

La presente invención tiene como objetivo mejorar la persistencia y el rendimiento de células T de CAR.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido recombinante, tal como se define en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que contiene al menos los siguientes dominios comenzando desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal: un primer dominio que contiene una unidad de anticuerpo anti-CD30 de cadena sencilla de HRS3-scFv de SEQ ID NO: 2 y una unidad de anticuerpo, siendo dicha unidad de anticuerpo específica de un antígeno presente en la superficie de una célula diana predeterminada que es específica de un antígeno asociado a tumor; opcionalmente, un dominio espaciador; un dominio transmembrana; y un dominio de señalización citoplásmica. En particular, la presente invención se refiere a un péptido recombinante en el que el primer dominio comprende la unidad de anticuerpo anti-CD30 de cadena sencilla en combinación con una unidad de anticuerpo, mediante lo cual esta unidad de anticuerpo es específica de un antígeno asociado a tumor. La unidad de anticuerpo anti-CD30 de cadena sencilla es el HRS3-scFv de SEQ ID NO: 2, mientras que la unidad de anticuerpo es una unidad que se une al antígeno asociado a tumor del antígeno carcinoembrionario (CEA), en particular de SEQ ID NO: 4. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico que codifica para el polipéptido según la presente invención, así como a un vector que comprende dicha secuencia de ácido nucleico. Además, se proporciona una célula aislada, una línea de células o una célula huésped que contiene dicha secuencia de ácido nucleico o dicho vector.

Además, la presente invención se refiere a una célula T aislada, como una célula T CD8+ y/o CD4+, que expresa en su superficie receptores de antígeno quiméricos que tienen en su dominio extracelular dos unidades de anticuerpo, una unidad de anticuerpo que es específica de un antígeno presente en la superficie de una célula diana predeterminada y una unidad de anticuerpo anti-CD30 de cadena sencilla, tal como se define en las reivindicaciones. Estas unidades están o bien presentes en un único polipéptido, tal como se define en el presente documento, o bien presentes en receptores de antígeno quiméricos funcionales diferentes. Estas células son particularmente útiles para tratar células tumorales que expresan el antígeno en su superficie pero que no pueden expresan CD30 en su superficie. Es decir, combinando estas dos unidades, concretamente, la unidad de anticuerpo anti-CD30 de cadena sencilla y un dominio de anticuerpo que es específico de un antígeno asociado a tumor, pueden tratarse de manera más eficaz células tumorales que expresan el antígeno específico de tumor en su superficie pero que son CD30-. Así, en el presente documento, se describe un método para tratar sujetos que padecen cáncer, mediante lo cual las células tumorales de dicho cáncer expresan el antígeno pero son CD30-(negativas para CD30).

En particular, las células útiles para la terapia adoptiva con células según la presente invención expresan en su superficie receptores de antígeno quiméricos que tienen en el dominio extracelular la unidad de anticuerpo que es específica de un antígeno presente en la superficie de una célula predeterminada, en particular, en los que la unidad de anticuerpo es una unidad de anticuerpo que es específica de un antígeno asociado a tumor, y una unidad de anticuerpo anti-CD30 de cadena sencilla, mediante lo cual estas dos unidades pueden estar presentes o bien en un único polipéptido que representa un CAR o bien pueden estar presentes en receptores de antígeno quiméricos funcionales diferentes.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: representación esquemática de la composición modular de las moléculas de CAR. El n.° 1138 representa el CAR anti-CD30; el n.° 946 representa el Ca R anti-CEA. El CAR n.° 1457 es la molécula de CAR biespecífica según la presente invención que se compone del anticuerpo anti-CD30 de cadena sencilla de HRS3-scFv, el scFv anti-CEA BW431/26, el dominio espaciador de IgG1-Fc, el dominio transmembrana de CD28 y el dominio de señalización citoplásmica de la cadena CD28^ALCK y CD3zeta.

Figura 2: se modificaron por ingeniería linfocitos de sangre periférica con CAR mediante procedimientos convencionales. Después del cultivo, se analizaron las células CD3+ para determinar la expresión de CAR utilizando los anticuerpos anti-CD3 conjugados con FITC y anti-IgG1-Fc humanos conjugados con PE. Tal como se demostró, se llevó a cabo con éxito la transducción, y las células T expresan el CAR anti-CD30/CEA en la superficie celular en cantidades similares a las células T transducidas con el CAR anti-CD30 y anti-CEA, respectivamente.

Figura 3: se modificaron por ingeniería células T humanas con CAR, tal como se indica, con una tasa de expresión inicial de CAR de CAR anti-CEA: 22,2%; CAR anti-CD30: 28,9%; CAR anti-CEA/CD30: 22,8%. Se cultivaron las células T de CAR 300 horas en presencia de IL-2 y se monitorizaron las células que expresaban CAR. Las células T de CAR con un dominio de unión a CD30 se expanden de manera más eficaz que las células T con sólo el CAR anti CEA.

Figura 4: células T humanas modificadas por ingeniería que expresan diferentes clases de CAR, tal como se indica (expresión inicial de CAR: CAR anti-CEA: 8,5%; CAR anti-CD30: 9,39%; CAR anti-CEA/CD30: 8,2%). Se incubaron conjuntamente células T de CAR (0,625-5x104 células/pocillo) durante 24 horas con células tumorales (2,5-5x104 células/pocillo), tal como se indica. Se usaron tres tipos diferentes de líneas de células que eran o bien positivas para CEA o bien para CD30, o control negativo tanto para CEA como para CD30. La línea de células que era negativa tanto para CEA como para CD30 no se lisó, mientras que se observó lisis específica de células LS174T, que es una línea de células CEA+/CD30-. En estas, las células T de CAR anti-CEA/CD30 demuestran una mayor lisis específica en comparación con las células T de CAR anti-CEA.

Figura 5: se muestra la liberación de interferón-gamma, un marcador para la activación de células T, durante el cultivo conjunto de diferentes números de células efectoras con las células tumorales. Después de 24 horas de cultivo conjunto, se recogieron los sobrenadantes y se analizaron para determinar interferón-gamma mediante ELISA. Se realizó el ensayo por triplicado y se determinó la DE. Tal como se muestra, las células T de CAR anti-CEA/CD30 produjeron IFN-gamma cuando se incubaron conjuntamente con las células LS174T CEA+/CD30-, así como con las células CEA' CD30+. No se produjo IFN-gamma tras la incubación conjunta con células Colo320 CEA' CD30'. Las células T con el CAR anti-CEA o el CAR anti-CD30 liberaron IFN-gamma sólo tras la incubación conjunta con células CEA+ o CD30+, respectivamente.

Figura 6: la figura 6 muestra la actividad citolítica de células T CIK de CAR (células citolíticas inducidas por citocinas con fenotipo de células T NK). Se demuestra que se logra la destrucción potenciada de células diana CEA+ CD30-usando las células T CIK de CAR anti-CEA/CD30. Las líneas de células tumorales son las mismas que las descritas en la figura 2.

Figura 7: la figura 7 demuestra la destrucción in vivo mejorada de células tumorales CEA+ mediante células T de CAR anti-CEA/CD30 en comparación con las células T de CAR monoespecífico anti-CEA. Se inyectaron conjuntamente dosis subterapéuticas de células T (2,5x105 células/ratón) sin CAR y células T modificadas por ingeniería o bien con el CAR anti-CEA/CD30 o bien con el CAR anti-CEA con células tumorales C15A3 CEA+ CD30-(1x106 células/ratón) en ratones inmunodeficientes en Rag-/- y cadena gamma común-/-. Para su comparación, se inyectaron células tumorales C15A3 sin células T (w/o). Se determinaron los volúmenes tumorales y el área bajo la curva (AUC). Se determinó la significación mediante la prueba de la t de Student. Se indicaron mediante asteriscos las diferencias significativas (p<0,05).

Figura 8: la figura 8A muestra la representación esquemática de CAR anti-CD30 y el CAR biespecífico de CD25/CEA de SEQ ID NO: 18 codificado por la secuencia de SEQ ID NO: 17. Se cambió HRS3-scFv del CAR n.° 1457 por el scFv anti-CD25 RFT5. La estructura principal del CAR n.° 1576 resultante es idéntica al CAR n.° 1457 mostrado en la figura 1. La figura 8B muestra la especificidad de la citotoxicidad. Se incubaron conjuntamente células T de CAR (0,625-5x104 células/pocillo) durante 24 horas con células tumorales CEA+ o CEA- (2,5-5x104 células/pocillo), tal como se indica. Sólo las células T de CAR que expresaban el CAR biespecífico anti-CD30/CEA lisaron las células diana CEA+, mientras que las células T de CAR con el CAR biespecífico anti-CD25/CEA y las células T de CAR con un CAR monoespecífico anti-CEA lisaron las dianas CEA+ con menor eficiencia. Las células tumorales CEA- no se lisaron, lo que demuestra la especificidad para CEA- de las células T de CAR.

Figura 9: la figura 9A es una representación esquemática de la composición molecular de las moléculas de CAR con especificidad para CD30/MUC1 de SEQ ID NO: 20 codificado por la secuencia de SEQ ID NO: 19 y CD30/TAG-72 de SEQ ID nO: 22 codificado por la secuencia de SEQ ID NO: 21. Se usa B72.3 para el CAR anti-TAG-72. Excepto para el scFv anti-CEA, las moléculas son idénticas al CAR mostrado en la figura 1. La expresión en la superficie de las células de los CAR CD30/Muc1 y CD30/TAG-72 se demuestra en la figura 9B mediante citometría de flujo.

Descripción detallada de la presente invención

Los inventores tienen como objetivo proporcionar nuevos polipéptidos recombinantes, tal como se menciona en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que contienen al menos los siguientes dominios comenzando desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal: un primer dominio que contiene una unidad de anticuerpo anti-CD30 de cadena sencilla de HRS3-scFv de SEQ ID NO: 2 y una unidad de anticuerpo, siendo dicha unidad de anticuerpo específica de un antígeno presente en la superficie de una célula diana predeterminada que es específica de un antígeno asociado a tumor; opcionalmente, un dominio espaciador; un dominio transmembrana; y un dominio de señalización citoplásmica. Estos polipéptidos recombinantes representan péptidos de CAR biespecíficos. En una realización de la presente invención, estos polipéptidos de CAR se expresan por células T modificadas por ingeniería genética que contienen y eventualmente expresan estos polipéptidos de CAR.

Es decir, la presente invención se refiere a un polipéptido recombinante que tiene al menos los siguientes dominios comenzando desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal: un primer dominio que contiene una unidad de anticuerpo anti-CD30 de cadena sencilla de HRS3-scFv de SEQ ID NO: 2 y una unidad de anticuerpo, siendo dicha unidad de anticuerpo específica de un antígeno presente en la superficie de una célula diana predeterminada, en particular, siendo específica de un antígeno asociado a tumor; opcionalmente, un dominio espaciador; un dominio transmembrana; y un dominio de señalización citoplásmica según la reivindicación 2.

Del mismo modo, la presente invención se refiere a los siguientes dominios, un primer dominio una unidad de anticuerpo, siendo dicha unidad de anticuerpo específica de un antígeno presente en la superficie de una célula diana predeterminada, y un segundo dominio que contiene una unidad de anticuerpo anti-CD30 de cadena sencilla; opcionalmente, un dominio espaciador; un dominio transmembrana; y un dominio de señalización citoplásmica. Tal como se usa en el presente documento, el término “comprende” o “que comprende”, así como los términos “contiene” o “que contiene”, incluyen la realización de “consiste” o “que consiste”.

El término “homólogo”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a moléculas, ya sean ADN o polipéptidos, que tienen una homología de secuencia de una determinada cantidad, concretamente, de al menos el 95%, como al menos el 96%, el 97%, el 98%, el 99% de la secuencia de ácido nucleico o la secuencia de aminoácidos a la que se refiere. La homología se refiere a la magnitud de identidad entre dos secuencias. Las secuencias homólogas tienen las mismas características o similares, en particular, tienen la misma propiedad o similar de la secuencia que se identifica. Por ejemplo, el homólogo de la secuencia de HRS3-scFv de s Eq ID NO: 2 tiene la misma especificidad de unión o similar que la molécula de CD30, como es el caso de la molécula de HRS3-scFv. Además, los homólogos incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican para el mismo péptido pero pueden variar en su secuencia debido a la degeneración del código genético. Además, “identificar” se refiere a la presencia de moléculas de aminoácido o ácido nucleico idénticas en orden tal como se describe para la secuencia a la que se refiere. Es decir, en el caso de al menos el 90% de identidad, el 90% o más de las moléculas de ácido nucleico y aminoácido, respectivamente, son idénticas en las posiciones respectivas. A menos que se identifique lo contrario, los términos “homología” e “identidad” se usan de manera intercambiable en el presente documento. En particular, el homólogo de la secuencia de HRS3-scFv de SEQ ID NO: 2 incluye unidades de anticuerpo anti-CD30 de cadena sencilla que se unen al mismo epítopo reconocido por HRS3-scFv.

Además, el término “modificadas por ingeniería genética” se refiere a que las células se manipulan mediante ingeniería genética. Es decir, las células contienen una secuencia heteróloga que no se produce de manera natural en dichas células. Normalmente, la secuencia heteróloga se introduce a través de un sistema de vectores u otros medios para introducir moléculas de ácido nucleico en las células, incluyendo liposomas. La molécula de ácido nucleico heteróloga puede integrarse en el genoma de dichas células o puede estar presente de manera extracromosómica, por ejemplo, en forma de plásmidos. El término también incluye realizaciones de introducir polipéptidos de CAR aislados, modificados por ingeniería genética, en la célula.

Generalmente, los CAR son proteínas de fusión que consisten en un dominio de reconocimiento de tipo anticuerpo extracelular fusionado a proteínas de señalización de células T intracelulares. Normalmente, el ectodominio que contiene la región de reconocimiento de antígeno comprende un péptido señal y una unidad de reconocimiento de antígeno. Según la presente invención, el ectodominio comprende una unidad anti-CD30 de cadena sencilla en combinación con una unidad de anticuerpo que es específica de un antígeno presente en la superficie de una célula diana predeterminada, en particular, que es específica de un antígeno asociado a tumor. La unidad de cadena sencilla es una unidad de cadena sencilla de HRS3-scFv de SEQ ID NO: 2. Es decir, la unidad anti-CD30 de cadena sencilla es una unidad de cadena sencilla que es específica del epítopo de la molécula de CD30 reconocida por la unidad anti-CD30 de cadena sencilla de HRS3-scFv de SEQ ID NO: 2.

El ectodominio puede estar espaciado del dominio transmembrana por la presencia de un dominio espaciador. Dicho dominio espaciador opcional une el dominio de unión a antígeno al dominio transmembrana, y se prefiere que dicho dominio transmembrana sea lo suficientemente flexible como para permitir que el dominio de unión a antígeno se oriente en direcciones diferentes para facilitar el reconocimiento de antígeno.

El dominio transmembrana es normalmente una hélice alfa hidrófoba que atraviesa la membrana. Finalmente, el endodominio representa el dominio de señalización en el citoplasma de las células.

Además, el término “unidad de anticuerpo que es específica de un antígeno presente en la superficie de una célula diana predeterminada” se refiere al sitio de unión derivado de un anticuerpo de cualquier especie, o bien en forma de una sola cadena de polipéptido o bien múltiples cadenas de polipéptido asociadas de manera covalente o no covalente. Estos dominios se caracterizan por la unión específica a una molécula en la superficie de una célula diana. Alternativamente, puede usarse cualquier otro resto de unión distinto de un anticuerpo como dominio de direccionamiento en un cAr , por ejemplo, el resto de unión de un receptor, como un receptor de citocinas.

Además, el término “unidad de anticuerpo que es específica de un antígeno asociado a tumor” se refiere a un dominio de unión con especificidad para una molécula diana presente en la superficie celular expresada por células tumorales y que se compone de un polipéptido, un hidrato de carbono o un lípido, o combinaciones de los mismos, que se expresa de manera exclusiva o preferente por células malignas.

El término “CAR funcional” se refiere a un CAR expresado por células inmunitarias que, mediante la unión específica a la molécula diana relacionada, activa la propia célula inmunitaria para aumentar la biosíntesis de proteínas, la secreción de citocinas, la proliferación celular y la lisis de células diana.

Además, el término “células CD30+” o “células cancerosas CD30+” se refiere a células (ya sean células no cancerosas o cancerosas) que expresan en su superficie la molécula de CD30.

Los términos “células no tumorales” y “células tumorales”, así como “células no cancerosas” y “células cancerosas”, se usan de manera intercambiable en el presente documento, a menos que se defina lo contrario.

El término “células T CIK” o “células T NK”, que se usan de manera intercambiable en el presente documento, se refiere a un grupo heterogéneo de células T que comparten propiedades tanto de células T como de linfocitos citolíticos naturales (NK). Las células T CIK de CAR se obtienen mediante técnicas de cultivo conocidas para obtener, en primer lugar, células T NK o células T CIK y, después de eso, modificar por ingeniería las propias células con el CAR mediante métodos conocidos.

El polipéptido recombinante según la presente invención representa un CAR biespecífico, también identificado en el presente documento como CAR específico dual. En una realización, el orden en el primer dominio es, desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal: i) una unidad de anticuerpo anti-CD30 de cadena sencilla y una unidad de anticuerpo, siendo dicha de anticuerpo específica de un antígeno presente en la superficie de una célula diana predeterminada, o ii) una unidad de anticuerpo, mediante lo cual dicha unidad de anticuerpo es específica de un antígeno presente en la superficie de una célula diana predeterminada, y una unidad de anticuerpo anti-CD30 de cadena sencilla.

Se prefiere que la unidad de anticuerpo que es específica de un antígeno presente en la superficie de una célula diana predeterminada sea una unidad de anticuerpo que es específica de un antígeno asociado a tumor.

En una realización de la presente invención, el CAR presente en la célula T comprende una secuencia líder que se ubica de manera N-terminal con respecto al primer dominio que contiene la unidad de cadena sencilla anti-CD30 y la unidad de anticuerpo.

Además, en otra realización, la unidad de anticuerpo anti-CD30 de cadena sencilla es un péptido HRS3-scFv, en particular, de SEQ ID NO: 2, por ejemplo, codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1. En el presente documento se ha reconocido que un fragmento de anticuerpo anti-CD30 de cadena sencilla de la región variable (scFv), en particular, de HRS3, permite mostrar la actividad deseada. En una realización, el fragmento de anticuerpo anti-CD30 de cadena sencilla es un fragmento que reconoce y se une al epítopo de HRS-scFv.

En otra realización, el dominio espaciador de la molécula de CAR es un dominio CH2CH3 bisagra de IgG1 de SEQ ID NO: 6 u homólogos del mismo, que tiene al menos el 95% de identidad con el mismo, preferiblemente, el dominio espaciador es un dominio CH2CH3 bisagra de IgG1 mutado según SEQ ID NO: 6, por ejemplo, codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 5.

En algunas realizaciones, puede ubicarse un ligador entre el dominio espaciador y el dominio transmembrana. Además, otra realización se refiere a una célula T con un receptor de antígeno quimérico en el que el dominio transmembrana se deriva de la molécula de CD28, por ejemplo, el dominio transmembrana de la molécula de CD28 que carece del dominio lck de SEQ ID NO: 8, por ejemplo, codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7.

El dominio de señalización o endodominio o dominio intracelular, que se usan de manera intercambiable en el presente documento, contiene un CD3 zeta o una cadena de señalización de la cadena gamma del receptor de FcÉpsilon o un dominio coestimulador, o tanto CD3zeta como un dominio coestimulador o tanto la cadena gamma del receptor de FcÉpsilon como un dominio coestimulador. Por ejemplo, el dominio intracelular es un dominio de señalización CD3 zeta de SEQ ID NO: 10, por ejemplo, codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 9, o un homólogo del mismo que tiene al menos el 95% de homología. En otra realización, el dominio intracelular es el dominio de señalización gamma del receptor de Fc de IgE de SEQ ID NO: 12, por ejemplo, codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 11, o un homólogo del mismo que tiene al menos el 95% de identidad. El dominio de señalización es responsable de la activación de las células T, en particular, de la actividad citotóxica y de la liberación de citosinas, incluyendo la secreción de interferón-gamma.

La molécula de CAR puede ser una molécula de CAR de la denominada segunda generación. Las moléculas de CAR de segunda generación tienen dominios de señalización mejorados que contienen adicionalmente un segundo dominio de señalización (coestimulador), por ejemplo, derivado de CD28, CD134 (OX40) o CD137 (4-1BB). Las moléculas de CAR de tercera generación contienen un dominio de señalización coestimulador combinado, por ejemplo, CD28 combinado con CD137 o CD134.

Una visión general sobre las moléculas de CAR se proporciona, por ejemplo, en Gilham D.E. et al., Trans. and Molecular Medicine, 2012, 18(7), 377-384.

En una realización preferida de la presente invención, la célula T es una célula T con un receptor de antígeno quimérico, en la que el receptor de antígeno quimérico es un polipéptido de SEQ ID NO: 14, por ejemplo, codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 13. Dicho CAR también se denomina en el presente documento n.° 1457.

El CAR anti-CD30 anti-CEA n.° 1457 se expresa en la superficie de células T y se compone de la parte extracelular del fragmento de anticuerpo anti-CD30 de cadena sencilla de la región variable (scFv) HRS3, el anticuerpo BW431/26-scFv correspondiente a SEQ ID NO: 4, por ejemplo, codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3, correspondiente al anticuerpo anti-CEA BW431/26, y el dominio CH2CH3 de IgG1 humana modificado como espaciador entre scFv y el dominio transmembrana. La modificación del dominio de IgG1 consiste en mutaciones puntuales para convertir la secuencia de aminoácidos de tipo natural PELLGGP X¹³MISRT (SEQ ID NO: 15) en PPVA-GP X¹³MIART (SEQ ID NO: 16), que reduce la unión imprevista del dominio Fc de ^cA^ra los receptores de Fc en otras células, como células inmunitarias innatas, que mediarían en su activación. La parte proximal a la membrana intracelular y transmembrana de CAR n.° 1457 se deriva de CD28 humano y se fusiona con la parte intracelular de CD3zeta humano. La secuencia de CD28 está mutada en P560 > A560, P563 > A563, P564 > A564 (Kofler et al., Mol. Ther. 19, 760 - 767 (2011). Por tanto, se destruye el sitio de unión a CD28 para la lck cinasa con la consecuencia de que se evitan la activación de la ruta de señalización de lck y la posterior secreción de IL-2 mediada por CAR. Los modelos preclínicos implican que, en estas condiciones, se reduce la represión mediada por células Treg de las funciones efectoras de las células T de CAR.

Como ejemplo, el polipéptido recombinante es el polipéptido de SEQ ID NO: 14, por ejemplo, codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 13, que corresponde al CAR n.° 1457 mostrado en la figura 1.

En otra realización, el polipéptido recombinante es un polipéptido en el que la unidad de anticuerpo se une a un antígeno asociado a tumor, incluyendo uno cualquiera de antígeno carcinoembrionario (CEA), CA19-9, CA72-4 también conocido como TAG-72, PSCA, Muc-1, HMW-MAA, melanotransferrina p97, receptor de acetilcolina fetal, ErbB2 (Her2/neu), proteína de resistencia a múltiples fármacos (MDR), CD19, C^d20, TOSO.

Por ejemplo, el CAR n.° 1457 de SEQ ID NO: 14 corresponde a un polipéptido en el que la unidad de anticuerpo es específica de CEA. Además, los CAR útiles según la presente invención se muestran en la figura 9, concretamente, CAR de CD30/MUC-1 o CAR de CD30/Tag72. Estos CAR son el n.° 1587, anti-CD30/MUC1, de SEQ ID NO: 20, codificado por la secuencia de SEQ ID NO: 19, y el n.° 1650, anti-CD30/TAG-72, de SEQ ID NO: 22, codificado por la secuencia de SEQ ID NO: 21.

Tal como se demuestra en los ejemplos, las células T (ya sean células T de CD4 o de CD8) o las células CIK demuestran la lisis específica de células que no expresan CD30 pero que expresan el antígeno al que sólo se une específicamente la unidad de anticuerpo. Es decir, sorprendentemente, el porcentaje de lisis específica es mayor con la molécula de CAR biespecífica en comparación con la molécula monoespecífica que sólo contiene la unidad de unión a anticuerpo específica del antígeno presente en la superficie de la célula diana predeterminada.

La célula diana es una célula tumoral.

Además, la célula diana predeterminada puede ser una célula implicada en defectos autoinmunitarios en un sujeto. En ese caso particular, se modifican las células supresoras, en particular las células T reguladoras, con el CAR descrito con el fin de reprimir la reacción inmunitaria inflamatoria aguda en el tejido seleccionado como diana. El CAR se une al antígeno tisular con un scFv, por ejemplo, anti-HLA B27, y a CD30 con el otro scFv.

Aunque no se expresa por las células diana predeterminadas, la unidad de anticuerpo anti-CD30 de cadena sencilla presente en la molécula de CAR aumenta la lisis específica de las células diana. Además, se ha demostrado sorprendentemente que, en el caso de células negativas para CD30, puede aumentarse el porcentaje de lisis específica tal como se demuestra en los ejemplos. Esto no sólo es cierto para la lisis por CAR que expresa células T, sino también por células CIK de CAR. Se considera que la autoestimulación de las células T de CAR permite aumentar la lisis específica de las células diana.

Además, la presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido según la presente invención. Además, se proporcionan vectores que comprenden la secuencia de ácido nucleico según la presente invención que codifica para el polipéptido que se describe. El experto conoce bien vectores y sistemas de vectores adecuados y, en particular, vectores que permiten la transfección y transducción de células eucariotas, en particular, células T. Por ejemplo, el vector es un vector viral. Además, la presente invención proporciona una célula aislada, una línea de células o una célula huésped que contiene el vector según la presente invención o una molécula de ácido nucleico según la presente invención. Preferiblemente, dicha célula, línea de células o célula huésped es una célula T aislada, por ejemplo, una célula T CD4+ o una célula T CD8+.

Además, se describe un kit o sistema que contiene el vector según la presente invención, la célula, la línea de células o la célula huésped según la presente invención, o el polipéptido según la presente invención o una molécula de ácido nucleico según la presente invención, o mezclas de los mismos, para su uso en la producción de células T que expresan el receptor de antígeno quimérico. El kit o sistema puede contener componentes adicionales, incluyendo medios para introducir el vector, el polipéptido o las moléculas de ácido nucleico en las células. El experto conoce bien medios adecuados para hacerlo.

Además, en el presente documento se proporcionan células T, como células T CD8 y/o CD4, que expresan en su superficie receptores de antígeno quiméricos que tienen en el dominio extracelular una unidad de anticuerpo, siendo dicha unidad de anticuerpo específica de un antígeno asociado a tumor y/o siendo específica de un antígeno viral presente en la superficie para un antígeno presente en la superficie de una célula diana predeterminada, y una unidad de anticuerpo anti-CD30 de cadena sencilla expresada por dichas células. Las unidades pueden estar presentes o bien en un único polipéptido, por ejemplo, un polipéptido tal como se define en el presente documento, o bien, alternativamente, pueden estar presentes en receptores de antígeno quiméricos diferentes.

En otro aspecto, el linfocito puede ser una célula T CIK de CAR, tal como se define en el presente documento. Los linfocitos (células T), incluyendo las células T CD8+, CD4+ o CIK, demuestran una mayor lisis específica de las células diana, reduciendo de ese modo los efectos secundarios y, además, superando el problema de rendimiento insuficiente en la unión antitumoral debido a diversos motivos, por ejemplo, una amplificación y una actividad citolítica menores después de la transferencia adoptada al paciente.

Se considera que la presencia de la unidad de anticuerpo anti-CD30 de cadena sencilla permite amplificar los linfocitos modificados por ingeniería genética y mejorar la persistencia de los mismos, superando de ese modo el problema de rendimiento insuficiente.

Las células son particularmente útiles en el tratamiento de cáncer, en particular cáncer CD30-, mediante lo cual dicho cáncer es un cáncer que expresa en las células cancerosas el antígeno al que se dirige el anticuerpo del antígeno antitumoral.

En un aspecto adicional, se da a conocer el uso de células T con un receptor de antígeno quimérico según la presente invención en terapia adaptativa con células para tratar cáncer CD30- o CD30+ en un sujeto que lo necesita. Por ejemplo, el cáncer CD30+ puede ser linfoma de Hodgkin, linfoma anaplásico de células grandes, leucemia linfocítica aguda, linfoma cutáneo, micosis fungoide, enfermedades linfoproliferativas, mastocitosis sistémica, teratocarcinoma, tumores malignos derivados de células madre, o células madre cancerosas u otras. En particular, la invención se refiere al uso de tales células inmunitarias para el tratamiento de cánceres CD30-, por ejemplo, de mama, de pulmón, de próstata, de páncreas, carcinomas gastrointestinales, cáncer neuronal y otros. Por tanto, la presente invención puede fomentar la terapia inmunitaria adaptativa mediante células T de CAR.

La presente invención se describe además por medio de ejemplos. Dichos ejemplos ilustran la invención adicionalmente sin limitarla a los mismos.

Ejemplos

Preparación de CAR n.° 1457

Se generó el casete de expresión del CAR biespecífico anti-CD30/CEA de la siguiente manera: Se amplificaron por PCR el scFv anti-CD30 (HRS3) y el scFv anti-CEA (BW431/26) y se flanquearon con un ligador mediante secuencias solapantes en el extremo 3' terminal de CD30-scFv y el extremo 5' terminal de scFv anti-CEA mientras que el ligador codificada para un ligador (Gly(4)-Ser(1))5 de 40 A^a. Se ensamblaron los ADN de los scFv mediante SOE-PCR, se digirieron con Ncol y BamHI y se ligaron en el sitio Ncol/BamHI del vector retroviral pBullet-HRS3-scFv-Fc-CD28deltalck-zeta, reemplazando de ese modo el HRS3-scFv por el HRS3scFv-BW431/26scFv combinado. El vector resultante que codifica para el CAR biespecífico anti-CD30/CEA se denominó n.° 1457. Las composiciones modulares del CAR n.° 1457 y sus equivalentes monoespecíficos anti-CEA (n.° 946) y anti-CD30 (n.° 1138) se muestran esquemáticamente en la figura 1.

Se produjo el vector retroviral que codifica para el CAR n.° 1457 según SOP-GL-VectProd usando una envuelta pseudotipada de Galv. En resumen, se realizó de manera transitoria la producción de partículas de vectores en la línea de células de riñón embrionarias humanas 293T después de la transfección de ADN mediada por Polyfect®. Se pseudotiparon las partículas de vectores con Galv. No se determinó el título de los vectores.

Se realizó la transducción de linfocitos sanguíneos humanos según técnicas convencionales SOP. En resumen, se transdujeron linfocitos humanos con un sobrenadante de 2 días a partir de células 293T transfectadas durante 2 días. Se expresó el CAR n.° 1457 por el 20-35% de células T humanas, tal como se midió el día 2 mediante citometría de flujo usando un anticuerpo dirigido al dominio constante extracelular CH2 CH3 de IgG1 del CAR.

Pueden registrarse las células T CD4+ y CD8+ que expresan el CAR n.° 1457 en la superficie celular mediante el uso del anticuerpo 9G10 que se une específicamente al dominio HRS3-scFv del CAR. Las células T modificadas por ingeniería con el CAR n.° 1457 se unen específicamente a células que expresan CD30 y se activan, indicado por el aumento de secreción de citocinas incluyendo IFN-y, por el aumento de la proliferación y de la citolisis de células diana CD30+. Cabe destacar que sólo se secretan niveles de fondo de IL-2 cuando las células T se estimulan por el CAR. Sin embargo, IL-2 se secreta en cantidades fisiológicas cuando las células T se estimular por su TCR fisiológico y CD28. La activación de las células T de n.° 1457 es específica de antígeno tal como se define por la especificidad del CAR, dado que las células CD30- no desencadenan la activación de células T. El CD30 soluble, que se acumular en el suero de pacientes con linfoma CD30+, no bloquea la activación de células T mediada por CAR en concentraciones de hasta 10 pg/ml [Hombach A, et al., Cancer Res. 15 de marzo de 1998; 58(6):1116-9]. Esto se debe al hecho de que el CAR debe reticularse mediante la unión de múltiples copias del antígeno dirigido con el fin de desencadenar la activación de células T, que sólo puede producirse cuando CD30 se inmoviliza o expresa en la superficie de células diana pero no se produce cuando la proteína CD30 está presente en disolución. Ejemplo 1: actividad de células T modificadas con CAR específico dual hacia líneas de células CEA+ y/o CD30+ Se realizó la modificación por ingeniería de células T con CAR n.° 1457 tal como se describió anteriormente. Se detectó el CAR en la superficie de células T mediante citometría de flujo utilizando un anticuerpo contra el dominio Fc en el resto extracelular del CAR (figura 1, 2). Se expresó el CAR anti-CEA/CD30 con una eficiencia similar a los CAR monoespecíficos con el dominio de unión o bien de CD30 o bien de CEA. Para someter a prueba la especificidad dual del CAR n.° 1457, se incubaron conjuntamente células T injertadas con células diana o bien CD30+ o bien CEA+ y se monitorizaron la citotoxicidad redirigida y la secreción de IFN-gamma. Mientras que las células T con CAR anti-CEA y anti-CD30 sólo se activaron por células diana CEA+ o CD30+, respectivamente, el CAR biespecífico activa las células T después del cultivo conjunto con células tumorales tanto ^cE^a+ CD30- como CEA' CD30+. La activación de células T da como resultado la lisis específica de células diana y la secreción de IFN-gamma (consúltese la figura 4, 5 y el ejemplo 3).

Conclusión:

Las células T con el CAR n.° 1457 presentan especificidad dual de unión, es decir, para CD30 y CEA. Las células T que expresan el CAR biespecífico se activaron mediante el acoplamiento de las células diana con un único antígeno de CAR relacionado así como mediante células diana con ambos antígenos.

Ejemplo 2: expansión específica de células T modificadas con CAR n.° 1457

Se modificaron por ingeniería células T con el CAR n.° 1457 o, para su comparación, con el CAR monoespecífico de CD30 o CEA correspondiente, respectivamente, y se cultivaron en presencia de IL-2 (400 U/ml). El número inicial de células T CAR+ fue del 20-30%. Se sometieron a prueba las células en diferentes puntos de tiempo para determinar la expresión de CAR mediante citometría de flujo. Tal como se resume en la figura 3, el número de células T con el CAR anti-CD30 y el CAR anti-CEA/CD30 n.° 1457 aumentó hasta el 90% de células T durante el cultivo, mientras que el número de células T de CAR anti-CEA no superó el 50%.

Conclusión:

Los datos demuestran que las células T de CAR con el dominio de unión a CD30 se expanden más en comparación con las células T de CAR con un dominio de unión a CEA. El efecto superior también está presente cuando el dominio de unión anti-CD30 se une con el dominio de unión anti-CEA.

Ejemplo 3: lisis específica aumentada por células T modificadas por ingeniería con CAR n.° 1457 y células T CIK modificadas por ingeniería con CAR n.° 1457 hacia células diana negativas para CD30

(a) Células T

Se modificaron por ingeniería células T humanas para expresar el CAR n.° 1457, el CAR específico de CEA y el CAR específico de CD30, respectivamente. Se incubaron conjuntamente el mismo número de células T de CAR con células tumorales que expresan o bien CEA o bien CD30, o ambos. Los datos presentados en la figura 4 muestran que la línea celular que es negativa tanto para CEA como para CD30 (Colo320) no se lisó, mientras que se observó lisis específica de células LS174T, que es una línea de células CEA+/CD30-. En este caso, las células T de CAR anti-CEA/CD30 demuestran una mayor lisis específica en comparación con las células T de CAR anti-CEA.

La actividad citolítica está acompañada por la liberación de IFN-g, un marcador para la activación de las células T, tal como se muestra en la figura 5. Las células T de CAR anti-CEA/CD30 n.° 1457 produjeron IFN-gamma cuando se incubaron conjuntamente con las células LS174T CEA+/CD30- así como con las células CEA' CD30+. No se produjo IFN-gamma tras la incubación conjunta con células Colo320 CEA- CD30-. Las células T con el CAR anti-CEA o el CAR anti-CD30 liberaron IFN-gamma sólo tras la incubación conjunta con células CEA+ o CD30+, respectivamente. (b) Células CIK

Se generaron células CIK según procedimientos convencionales y se modificaron por ingeniería con el CAR anti-CD30/CEA n.° 1457. Después de 8 días tras la transducción, se cultivaron conjuntamente células CIK de CAR n.° 1457 con células diana CD30- CEA+, CD30- CEA- o CD30- CEA- y se registró la lisis de células diana. Las células CIK que expresan el CAR monoespecífico anti-CD30 y anti-CEA correspondiente, respectivamente, sirvieron como control. Las células T de CAR biespecífico anti-CD30/CEA y monoespecífico anti-CD30 lisaron las células diana CD30+ con una eficiencia similar. En cambio, las células CIK de CAR n.° 1457 lisaron las células diana CEA+ CD30-de manera más eficiente que las células CIK con el CAR anti-CEA (figura 6). Los datos indican que, sorprendentemente, las células CIK de CAR n.° 1457 muestran una mayor actividad citolítica contra células tumorales que no expresan CD30 que las células CIK con un CAR específico de CEA.

Conclusión:

Las células T y las células CIK modificadas por ingeniería con el CAR n.° 1457 muestran una reactividad antitumoral potenciada contra células diana, ambas que expresan y que carecen de CD30, en comparación con las células T con el CAR monoespecífico. Esto es inesperado, en particular para aquellas células diana que carecen de CD30. Ejemplo 4: actividad antitumoral mejorada de células T de CAR n.° 1457 en un modelo de xenoinjerto de ratón. Se monitorizó la actividad in vivo de células T de CAR anti-CD30/CEA n.° 1457 en ratón inmunodeficiente en Rag-/- y cadena gamma común-/-. Se modificaron por ingeniería células T de CAR anti-CEA y CAR anti-CD30/CEA n.° 1457 tal como se describió anteriormente, y se inyectaron conjuntamente por vía subcutánea en una dosis subterapéutica (2,5x105 células T de CAR/animal) con células tumorales C15^a3 CEA+ CD30-(1x106 células/animal), que se transfectaron para expresar CEA humano, en ratones. Se usaron ratones sin células T y con células T sin modificar como control y se monitorizó el crecimiento tumoral cada 2°-3° día. Se determinaron las curvas de crecimiento (figura 7A) y el área bajo la curva (figura 7B). Mientras que las células T de CAR anti-CEA produjeron un ligero retardo del crecimiento tumoral, las células T de CAR anti-CD30/CEA ralentizaron significativamente el crecimiento

Claims

REIVINDICACIONES

i . Polipéptido recombinante que es un receptor de antígeno quimérico (CAR) que contiene al menos los siguientes dominios en orden, comenzando desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal: a. ) un primer dominio que contiene i) la unidad de anticuerpo anti-CD30 de cadena sencilla de HRS3-scFv de SEQ ID NO: 2 y ii) una unidad de anticuerpo que es una unidad de anticuerpo de scFv que se une específicamente a un antígeno asociado a tumor presente en la superficie de una célula diana predeterminada;

b. ) opcionalmente, un dominio espaciador;

c. ) un dominio transmembrana; y

d. ) un dominio de señalización citoplásmica.
2. Polipéptido recombinante que es un CAR que contiene al menos los siguientes dominios en orden, comenzando desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal:

a. ) un primer dominio que contiene i) una unidad de anticuerpo que es una unidad de anticuerpo de scFv que se une específicamente a un antígeno asociado a tumor presente en la superficie de una célula diana predeterminada; y ii) una unidad de anticuerpo anti-CD30 de cadena sencilla de HRS3-scFv de SEQ ID NO: 2,

b. ) opcionalmente, un dominio espaciador;

c. ) un dominio transmembrana; y

d. ) un dominio de señalización citoplásmica.
3. Polipéptido recombinante que es un CAR según la reivindicación 1 ó 2, que comprende además una secuencia líder que se ubica de manera N-terminal con respecto al primer dominio.
4. Polipéptido recombinante que es un CAR según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el dominio espaciador es un dominio CH2 CH3 de IgG1 de SEQ ID NO: 6 u homólogos del mismo que tiene al menos el 95% de identidad con el mismo.
5. Polipéptido recombinante que es un CAR según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el dominio transmembrana se deriva de CD28.
6. Polipéptido recombinante que es un CAR según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el dominio intracelular contiene un CD3zeta o una cadena de señalización de I-gamma del receptor de Fcépsilon o una unidad coestimuladora.
7. Polipéptido recombinante que es un CAR según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el dominio intracelular es un dominio de señalización de CD28.
8. Polipéptido recombinante que es un CAR según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la unidad de anticuerpo de scFv se une a un antígeno asociado a tumor seleccionado de antígeno carcinoembrionario (c Ea ), CA19-9, CA72-4 (TAG-72), PSCA, Muc-1, HMW-MAA, melanotransferrina p97, receptor de acetilcolina fetal, ErbB2 (Her2/neu), proteína de resistencia a múltiples fármacos (MDR), CD19, CD20 y TOSO.
9. Molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica para el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. Vector que comprende la secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 9.
11. Célula aislada que contiene un vector según la reivindicación 10 o una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 9.
12. Célula aislada según la reivindicación 12, que es una célula T que expresa en su superficie el CAR según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
13. Célula T aislada que expresa en su superficie

a. ) un primer receptor de antígeno quimérico que tiene en su dominio extracelular el anticuerpo anti-CD30 de cadena sencilla de HRS3-scFv de SEQ ID NO: 2 y

b. ) un segundo receptor de antígeno quimérico que tiene en su dominio extracelular una unidad de anticuerpo que es una unidad de anticuerpo de scFv que se une específicamente a un antígeno asociado a tumor presente en la superficie de una célula diana predeterminada.
14. Célula T aislada según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 13, para su uso en el tratamiento de cáncer, mediante lo cual dicho cáncer es un cáncer que expresa el antígeno al que se dirige el anticuerpo del antígeno antitumoral.