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ES2831374T3 - Anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos - Google Patents

Anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos Download PDF

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ES2831374T3
ES2831374T3 ES18199421T ES18199421T ES2831374T3 ES 2831374 T3 ES2831374 T3 ES 2831374T3 ES 18199421 T ES18199421 T ES 18199421T ES 18199421 T ES18199421 T ES 18199421T ES 2831374 T3 ES2831374 T3 ES 2831374T3
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ES
Spain
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cancer
egfr
met
antibody
bispecific
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Active
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ES18199421T
Other languages
English (en)
Inventor
Mark Chiu
Sheri Moores
Joost Neijssen
Paul Parren
Janine Schuurman
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Janssen Biotech Inc
Original Assignee
Janssen Biotech Inc
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Publication date
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Abstract

Un anticuerpo del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR)/receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (c-Met) biespecífico aislado, que comprende: a) una primera cadena pesada (HC1) que comprende un dominio constante 3 de HC1 (HC1 CH3) y una región variable 1 de HC1 (VH1); b) una segunda cadena pesada (HC2) que comprende un dominio constante 3 de HC2 (HC2 CH3) y una región variable 2 de HC2 (VH2); c) una primera cadena ligera (LC1) que comprende una región variable de cadena ligera 1 (VL1); y d) una segunda cadena ligera (LC2) que comprende una región variable de cadena ligera 2 (VL2), en donde la VH1 y la VL1 se emparejan para formar un primer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a EGFR, la VH2 y la VL2 se emparejan para formar un segundo sitio de unión al antígeno que se une específicamente a c-Met, la HC1 comprende por lo menos una sustitución en HC1 CH3 y la HC2 comprende por lo menos una sustitución en la HC2 CH3, y la sustitución en la HC1 CH3 y la sustitución en la HC2 CH3 tienen lugar en diferentes posiciones de residuos de aminoácidos, cuando la numeración de los residuos es de acuerdo al índice de la UE, en donde: i) la VH1 comprende las secuencias de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR) 1 (HCDR1), HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 210, 211 y 212, respectivamente; y ii) la VL1 comprende las secuencias de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR) 1 (LCDR1), LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 213, 214 y 215, respectivamente; y iii) la VH2 comprende las secuencias de aminoácidos de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 216, 217 y 218, respectivamente; y iii) la VL2 comprende las secuencias de aminoácidos de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 219, 220 y 221, respectivamente.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos y a métodos para fabricar y usar las moléculas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, ErbBl o HER1) es una glicoproteína transmembrana Tipo I de 170 kDa que está codificada por el proto-oncogén c-erbBl. El EGFR es un miembro de la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano (HER) de las tirosina quinasas receptoras (RTK) que incluye He R2 (ErbB2), HER3 (ErbB3) y HER4 (ErbB4). La señalización de EGFR se inicia mediante la unión de ligando seguido de la inducción del cambio conformacional, la homodimerización o la heterodimerización del receptor con otros miembros de la familia ErbB y la trans-autofosforilación del receptor (Ferguson et al., Annu Rev Biophys, 37:353-73, 2008), que inicia las cascadas de transducción de señales que afectan en última instancia a una amplia variedad de funciones celulares, incluyendo la proliferación y la supervivencia celular. Los aumentos en la expresión o la actividad de la quinasa de EGFR se han relacionado con una variedad de cánceres humanos, haciendo al EGFR un objetivo atractivo para la intervención terapéutica (Mendelsohn et al., Oncogene 19: 6550­ 6565, 2000; Grünwald et al., J Natl Cancer Inst 95: 851-67, 2003; Mendelsohn et al., Semin Oncol 33: 369-85, 2006). Los aumentos tanto en tanto el número de copias del gen EGFR como en la expresión de proteínas se han asociado con respuestas favorables al inhibidor de la tirosina quinasa EGFR, IRESSA™ (gefitinib), en cáncer de pulmón de células no pequeñas (Hirsch et al., Ann Oncol 18:752-60)., 2007).
Las terapias con EGFR incluyen tanto moléculas pequeñas como anticuerpos anti-EGFR, aprobados para el tratamiento del cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de cabeza y cuello y cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) (Baselga y Arteaga, J Clin Oncol 23:2445-2459 (20005; Gill et al., J Biol Chem, 259:7755-7760, 1984; Goldstein et al., Clin Cancer Res, 1:131 1-1318; 1995; Prewett et al., Clin Cancer Res, 4:2957-2966,1998).
La eficacia de las terapias anti-EGFR puede depender del tipo de tumor y del estado de mutación/amplificación de EGFR en el tumor. Los efectos secundarios de las terapias actuales pueden incluir toxicidad para la piel (De Roock et al., Lancet Oncol 11 :753-762, 2010; Linardou et al., Nat Rev Clin Oncol, 6: 352­ 366, 2009; Li y Perez-Soler, Targ Oncol 4: 107-119, 2009). Los inhibidores de la tirosina quinasa (TKI) de EGFR se usan comúnmente como terapias de 2a línea para el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), pero a menudo dejan de funcionar en un plazo de doce meses debido a las vías de resistencia (Riely et al., Clin Cancer Res 12: 839-44, 2006). Las Publicaciones de Patente Internacional N° WO2002/100348 y WO2004/056847 describen anticuerpos monoclonales humanos anti-EGFR para su uso en el tratamiento del cáncer.
c-Met codifica un receptor de tirosina quinasa transmembrana. Se identificó por primera vez como un protooncogén en 1984 después de que se descubrió que el tratamiento con un carcinógeno daba como resultado una proteína de fusión constitutivamente activa TPR-MET (Cooper et al., Nature 311: 29-33, 1984). La activación de c-Met por su factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) de ligando estimula una plétora de procesos celulares, incluyendo el crecimiento, la motilidad, la invasión, la metástasis, la transición epitelial-mesenquimal, la angiogénesis/curación de heridas y la regeneración de tejidos (Christensen et al., Cancer Lett 225:1-26, 2005; Peters y Adjei, Nat Rev Clin Oncol 9: 314-26, 2012). c-Met se sintetiza como una proteína de cadena sencilla que se escinde proteolíticamente en subunidades alfa de 50 kDa y beta de 140 kDa que están enlazadas por un enlace disulfuro (Ma et al., Cancer and Metastasis Reviews, 22: 309-325, 2003). c-Met es estructuralmente similar a otros receptores de membrana como RON y Sea. La estequiometría exacta de la unión de HGF:c-Met no está clara, pero en general se cree que dos moléculas de HGF se unen a dos moléculas de c-Met que llevan a la dimerización del receptor y la autofosforilación en las tirosinas 1230, 1234 y 1235 (Stamos et al., The EMBO Journal 23: 2325-2335, 2004). La autofosforilación de c-Met independiente del ligando también puede tener lugar debido a la amplificación génica, la mutación o la sobreexpresión del receptor.
c-Met se amplifica, muta o sobreexpresa frecuentemente en muchos tipos de cáncer, incluyendo cánceres gástrico, de pulmón, de colon, de mama, de vejiga, de cabeza y cuello, de ovario, de próstata, de tiroides, de páncreas y de SNC. Las mutaciones con cambio de sentido típicamente localizadas en el dominio de la quinasa se encuentran comúnmente en los carcinomas de células renales papilares (PRCC) hereditarios y en el 13% de los PRCC esporádicos (Schmidt et al., Oncogene 18:2343-2350, 1999). Las mutaciones de c-Met localizadas en los dominios de semaforina o yuxtamembrana de c-Met se encuentran frecuentemente en cánceres gástrico, de cabeza y cuello, de hígado, de ovario, NSCLC y tiroides (Ma et al., Cancer and Metastasis Reviews, 22: 309-325, 2003; Sakakura et al., Chromosomes and Cancer, 1999. 24: 299-305). La amplificación de c-Met se ha detectado en los cánceres de cerebro, colorrectal, gástrico y de pulmón, a menudo en correlación con la progresión de la enfermedad (Ma et al., Cáncer and Metástasis Reviews, 22: 309-325, 2003). Hasta el 4% y el 20% de los cánceres de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) y los cánceres gástricos, respectivamente, muestran amplificación de c-Met (Sakakura et al., Chromosomes and Cancer, 1999. 24:299-305 : Sierra y Tsao, Therapeutic Advances in Medical Oncology, 3:S21-35, 2011). Incluso en ausencia de amplificación génica, la sobreexpresión de c-Met se observa frecuentemente en el cáncer de pulmón (Ichimura et al., Jpn J Cancer Res, 87:1063-9, 1996).). Además, en las muestras clínicas, casi la mitad de los adenocarcinomas de pulmón mostraron niveles altos de c-Met y HGF, ambos de los cuales correlacionados con una tasa de crecimiento tumoral, metástasis y mal pronóstico aumentados (Sierra y Tsao, Therapeutic Advances in Medical Oncology, 3:S21-35, 2011; Siegfried et al., Ann Thorac Surg 66: 1915-8, 1998). La Publicación de Patente Internacional N° WO2011/110642 describe anticuerpos monoclonales anti-c-Met para su uso en el tratamiento del cáncer.
Casi el 60% de todos los tumores que se vuelven resistentes a los inhibidores de la tirosina quinasa de EGFR aumentan la expresión de c-Met, amplifican c-Met o aumentan el único ligando conocido de c-Met, HGF (Turke et al., Cancer Cell, 17:77-88, 2010), sugiriendo la existencia de una vía compensatoria para EGFR a través de c-Met. La amplificación de c-Met se identificó primero en células cultivadas que se volvieron resistentes a gefitinib, un inhibidor de la quinasa de EGFR, y mostró una supervivencia mejorada a través de la vía Her3 (Engelman et al., Science, 316:1039-43, 2007). Esto se validó adicionalmente en muestras clínicas en las que nueve de los 43 pacientes con resistencia adquirida a erlotinib o gefitinib mostraron amplificación de c-Met, en comparación con solo dos de 62 pacientes no tratados. Cuatro de los nueve pacientes tratados también adquirieron la mutación activadora de EGFR, T790M, demostrando vías de resistencia simultáneas (Beat et al., Proc Natl Acad Sci USA, 104:20932-7, 2007).
Los papeles individuales de tanto EGFR como c-Met en el cáncer están bien establecidos, haciendo estos objetivos atractivos para la terapia de combinación. Ambos receptores señalan a través de las mismas vías de supervivencia y antiapoptóticas (ERK y AKT); inhibir por tanto el par en combinación puede limitar el potencial de activación de la vía compensatoria, mejorando de este modo la eficacia general. Las terapias combinadas dirigidas a EGFR y c-Met se prueban en ensayos clínicos con Tarceva® (erlotinib) en combinación con anticuerpo monovalente anti-c-Met para NSCLC (pigel et al., 2011 ASCO Annual Meeting Proceedings 2011, Journal of Clinical Oncology: Chicago, iL. p. 7505) y Tarceva (erlotinib) en combinación con ARQ-197, un inhibidor de moléculas pequeñas de c-Met (Adjei et al., Oncologist, 16:788-99, 2011). Las terapias de combinación o las moléculas biespecíficas anti-EGFR/c-Met se han divulgado, por ejemplo, en: las Publicaciones de Patente Internacional N° WO2008/127710, WO2009/111691, WO2009/126834, WO2010/039248, WO2010/115551, WO2011/131746, WO2012/042026 y las Publicaciones de Patente de Estados Unidos N°. US2009/0042906 y US2010/0254989 .
Los enfoques terapéuticos de molécula pequeña y molécula grande actuales para antagonizar las vías de señalización de EGFR y/o c-Met para la terapia pueden ser subóptimos debido a la posible falta de especificidad, la actividad fuera del objetivo potencial y la toxicidad limitante de la dosis que pueden encontrarse con inhibidores e moléculas pequeñas. Los anticuerpos bivalentes monoespecíficos típicos pueden dar como resultado la agrupación de receptores unidos a la membrana y la activación no deseada de las vías de señalización descendentes. Los anticuerpos monovalentes que tienen cadenas pesadas de longitud completa (brazos medios) plantean una complejidad y un costo significativos para el proceso de fabricación.
Por consiguiente, existe la necesidad de inhibidores de EGFR y/o c-Met monoespecíficos y biespecíficos adicionales para propósitos tanto terapéuticos como de diagnóstico.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Un aspecto de la invención es un anticuerpo del receptor del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR)/receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (c-Met) biespecífico aislado, que comprende:
a) una primera cadena pesada (HC1) que comprende un dominio constante 3 de HC1 (HC1 CH3) y una región variable 1 de HC1 (VH1);
b) una segunda cadena pesada (HC2) que comprende un dominio constante 3 de HC2 (HC2 CH3) y una región variable 2 de HC2 (VH2);
c) una primera cadena ligera (LC1) que comprende una región variable de cadena ligera 1 (VL1); y d) una segunda cadena ligera (LC2) que comprende una región variable de cadena ligera 2 (VL2), en donde la VH1 y la VL1 se emparejan para formar un primer sitio de unión a antígeno que se une específicamente a EGFR, la VH2 y la VL2 se emparejan para formar un segundo sitio de unión al antígeno que se une específicamente a c-Met, la HC1 comprende por lo menos una sustitución en HC1 CH3 y la HC2 comprende por lo menos una sustitución en la HC2 CH3, y la sustitución en la HC1 CH3 y la sustitución en la HC2 CH3 tienen lugar en diferentes posiciones de residuos de aminoácidos, cuando la numeración de los residuos es de acuerdo al índice de la UE, en donde:
i) la VH1 comprende las secuencias de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR) 1 (HCDR1), HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 210, 211 y 212, respectivamente; y
ii) la VL1 comprende las secuencias de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR) 1 (LCDR1), LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 213, 214 y 215, respectivamente; y
iii) la VH2 comprende las secuencias de aminoácidos de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 216, 217 y 218, respectivamente; y
iii) la VL2 comprende las secuencias de aminoácidos de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 219, 220 y 221, respectivamente.
En algunas realizaciones, el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico de la invención inhibe la fosforilación de las quinasas relacionadas con señales extracelulares 1 y 2 (ERK1/2) en la línea celular NCI-H292, NCI-H1975 o SKMES-1 l con un valor de IC50 que es por lo menos aproximadamente 10 veces menos, por lo menos aproximadamente 20 veces menos, por lo menos aproximadamente 30 veces menos, por lo menos aproximadamente 40 veces menos, por lo menos aproximadamente 50 veces menos o por lo menos aproximadamente 60 veces menos en comparación con el valor IC50 de la inhibición de la fosforilación de ERK1/2 en líneas celulares NCI-H292, NCI-H1975 o SKMES-1 con una mezcla de un anticuerpo de EGFR monovalente de control que comprende una cadena pesada 3 (HC3) y una cadena ligera 3 (LC3) y un anticuerpo de c-Met monovalente de control que comprende una cadena pesada 4 (HC4) y una cadena ligera 4 (LC4), en donde la HC3 y la HC1, la LC3 y la LC1 , la HC4 y la HC2, y la LC4 y la LC2 tienen secuencias de aminoácidos idénticas, respectivamente, en las que la fosforilación de ERK1/2 se mide en lisados de células completas usando un inmunoensayo de tipo sándwich utilizando un anticuerpo anti-fosfoERK1/2 como anticuerpo de captura y un anticuerpo que se une a ERK1/2 no fosforilado y fosforilado conjugado con un compuesto electroquimioluminiscente como un anticuerpo de detección.
En otras realizaciones, el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico de la invención inhibe la fosforilación de la proteína quinasa B (AKT) en Ser473 en la línea celular NCI-H1975 con un valor IC50 que es por lo menos aproximadamente 70 veces menos cuando se compara con el valor IC50 de la inhibición de la fosforilación de AKT en Ser473 en la línea celular NCI-H1975 con la mezcla del anticuerpo de EGFR monovalente de control que comprende la HC3 y la LC3 y el anticuerpo de c-Met monovalente de control que comprende la HC4 y la LC4, en donde la HC3 y la Hc 1, la LC3 y la LC1, la HC4 y la HC2, y la LC4 y la LC2 tienen secuencias de aminoácidos idénticas, respectivamente, en donde la fosforilación de AKT en Ser473 se mide en lisados de células completas usando un inmunoensayo de tipo sándwich usando una unión de anticuerpos a AKT no fosforilado y fosforilado como un anticuerpo de captura y un anticuerpo anti-fosfoAKT Ser473 conjugado con un compuesto electroquimioluminiscente como un anticuerpo de detección.
En otras realizaciones, los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos de la invención se unen a EGFR de la SEQ ID NO: 73 en los residuos de EGFR KFR9, 1491, K467 y S492 y a c-Met en los residuos PEFRDSYPIKYVHAF (SEQ ID NO: 238) y FAQSKPDSAEPMDRSA (SEQ ID NO: 239).
En otras realizaciones, los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos de la invención inhiben el crecimiento de células NCI-H292 o NCI-H1975 con un valor de IC50 que es por lo menos aproximadamente 300 veces menos, por lo menos aproximadamente 400 veces menos, por lo menos aproximadamente 500 veces menos, por lo menos aproximadamente 600 veces menos, por lo menos aproximadamente 700 veces menos o por lo menos aproximadamente 800 veces menos cuando se compara con el valor de IC50 de la inhibición del crecimiento de células NCI-H292 o NCI-H1975 con cetuximab, cuando las células NCI-H292 o NCI-H1975 se cultivan en condiciones de unión baja.
En otras realizaciones, los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos de la invención inhiben el crecimiento del tumor de células SKMES-1 que expresan HGF en ratones SCID Beige con un porcentaje (%) de valor T/C de por lo menos 500 veces menos en el día 36 cuando en comparación con el cetuximab, cuando el anticuerpo biespecífico y el cetuximab se administran a una dosis de 20 mg/kg.
En otras realizaciones, en los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos de la invención, la HC1 CH3 comprende una sustitución K409R o una F405L y la HC2 CH3 comprende una sustitución K409R o F405L, en donde la numeración de residuos es de acuerdo con el índice de la UE.
En otras realizaciones, la invención proporciona anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos que comprenden ciertas secuencias de CDR, VH1, VL1, VH2, Vl2, HC1, LC1, HC2 y LC2 de cadena pesada y ligera como se define en las reivindicaciones.
La divulgación también proporciona un polinuclótido sintñetico aislado que codifica la HC1, la HC2, la LC1, o la LC2 de la invención.
La divulgación también proporciona un vector que comprende el polinucleótido de la divulgación.
La divulgación también proporciona una célula huésped que comprende el vector de la divulgación.
La divulgación también proporciona un método para producir el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico aislado, que comprende:
combinar un anticuerpo anti-EGFR bivalente monoespecífico aislado que comprende dos cadenas pesadas de la SEQ ID NO: 199 y dos cadenas ligeras de la SEQ ID NO: 200 y un anticuerpo anti-c-Met bivalente monoespecífico aislado que comprende dos cadenas pesadas de la SEQ ID NO: 201 y dos cadenas ligeras de la SEQ ID NO: 202 en una mezcla de aproximadamente una relación molar 1:1;
introducir un agente reductor en la mezcla;
incubar la mezcla de aproximadamente noventa minutos a aproximadamente seis horas;
eliminar el agente reductor; y
purificar el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico que comprende una primera cadena pesada de la SEQ ID NO: 199 y una segunda cadena pesada de la SEQ ID NO: 201, una primera cadena ligera de la SEQ ID NO: 200 y una segunda cadena ligera de la SEQ ID NO: 202, en donde la primera cadena pesada de la SEQ ID NO: 199 se empareja con la primera cadena ligera de la SEQ ID NO: 200 para formar el primer dominio de unión que se une específicamente a EGFR, y la segunda cadena pesada de la SEQ ID NO: 201 se empareja con la segunda cadena ligera de la SEQ ID NO: 202 para formar el segundo dominio de unión que se une específicamente a c-Met.
Otra realización de la invención es una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.
Otra realización de la invención es el anticuerpo biespecífico, como se define en la reivindicación 2(a) o 2(b), para su uso en un método para tratar un sujeto que tiene cáncer, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico a un paciente con necesidad de ello durante un tiempo suficiente para tratar el cáncer.
Otra realización de la invención es un método in vitro para inhibir el crecimiento o la proliferación de células que expresan EGFR y/o c-Met, que comprende poner en contacto las células con el anticuerpo biespecífico como se define en la reivindicación 2(a) o 2(b).
Otra realización de la invención es el anticuerpo biespecífico, como se define en la reivindicación 2(a) o la reivindicación 2(b), para su uso en un método para inhibir el crecimiento o metástasis de células tumorales o cancerosas que expresan EGFR y/o c-Met en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz del anticuerpo biespecífico para inhibir el crecimiento o la metástasis de células tumorales o cancerosas que expresan EGFR y/o c-Met.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Figura 1A y 1B. Alineación de aminoácidos de los dominios de FN3 de unión a EGFR. Los giros BC y FG están en un recuadro en los residuos 22-28 y 75-86 de la SEQ ID NO: 18. Algunas variantes incluyen estabilidad térmica que mejora las sustituciones de L17A, N46K y E86I (numeración de residuos de acuerdo con Tencon SEQ ID NO: 1).
Figura 2. Alineación de secuencias del andamiaje Tencon27 (SEQ ID NO: 99) y una biblioteca TCL14 (SEQ ID NO: 100) que tienen una superficie alternativa de C-CD-F-FG aleatorizada. Los residuos del giro están en un recuadro. Los giros y las cadenas se indican encima de las secuencias.
Figura 3. Alineación de secuencias de los dominios de FN3 de unión a c-Met. El giro C y la cadena CD y el giro F y la cadena FG están en un recuadro y abarcan los residuos 29-43 y 65-81.
Figura 4. Se muestra la inhibición de la fosforilación de c-Met en células NCI-H292 pre-tratadas con moléculas que contienen dominio de FN3 monoespecífico o biespecífico y estimuladas con HGF. Se observó un aumento sustancial en la potencia de la molécula de EGFR/c-Met biespecífica (ECB1) cuando se comparó con un dominio de FN3 de unión a c-Met monoespecífico (P114AR5P74-A5, mostrado como A5 en la Figura) por sí solo o en combinación con un dominio de FN3 de unión a EGFR (P54AR4-83v2, mostrado como 83v2 en la Figura).
Figura 5. Inhibición de la fosforilación de EGFR y c-Met en células pre-tratadas con moléculas que contienen dominio de FN3 monoespecífico o biespecífico. En líneas celulares que expresan altos niveles de EGFR, NCI-H292 (Figura 5A) y H596 (Figura 5B), las moléculas que contienen dominio de FN3 monoespecífico y biespecífico anti-EGFR son igualmente potentes para disminuir la fosforilación de EGFR. En líneas celulares que expresan niveles bajos de EGFR en relación con c-Met, NCI-H441 (Figura 5C), las moléculas de EGFR/c-Met biespecíficas mejoran la potencia de inhibición de la fosforilación de EGFR en comparación con el dominio de FN3 de unión a EGFR monoespecífico solamente. En líneas celulares con niveles bajos de c-Met, en relación con EGFR, NCI-H292 (Figura 5D) y H596 (Figura 5E), la inhibición de la fosforilación de c-Met se potencia significativamente con la molécula de EGFR/c-Met biespecífica, en comparación con el dominio de FN3 de unión a c-Met monoespecífico solamente. Las moléculas usadas en el estudio fueron: ECB5 biespecífica (mostrada como 17-A3 en la Figura), dominio de FN3 de unión a EGFR monoespecífico P53A1R5-17 (mostrado como "17" en la Figura), molécula de EGFR/c-Met biespecífica ECB3 (mostrada como 83-H9 en la Figura), y dominio de FN3 de unión a c-Met monoespecífico P114AR7P93-H9 (mostrado como H9 en la Figura).
Figura 6. Señalización farmacodinámica en tumores aislados de ratones dosificados con moléculas de EGFR/c-Met biespecíficas durante 6 horas o 72 horas. Todas las moléculas redujeron significativamente la fosforilación de c-Met, EGFR y ERK a las 6 h y 72 h, el grado de inhibición dependía de la afinidad de los dominios de FN3 para EGFR y/o c-Met. Las moléculas biespecíficas se generaron uniendo el dominio de FN3 de unión a EGFR con una afinidad alta ("83" en la Figura es p54AR4-83v2) o media ("17v2" en la Figura es sP53A1R5-17v2) a un dominio de FN3 de unión a c-Met con afinidad alta ("A3" en la Figura es P1 14AR7P94-A3) o media ("A5" en la Figura es P114AR5P74-A5).
Figura 7. La acumulación en plasma (parte superior) y tumoral (parte inferior) de moléculas de EGFR/c-Met biespecíficas de afinidades variables enlazadas a un dominio de unión a la albúmina (ABD) se muestra 6h (izquierda) y 72h (derecha) después de la dosificación IP. Seis horas después de la dosificación, la acumulación tumoral es máxima en ratones dosificados con una molécula biespecífica que alberga un dominio de FN3 de unión a EGFR de afinidad media (17v2) o un dominio de unión a EGFR de afinidad alta (83v2). Las moléculas biespecíficas incorporaron dominios de FN3 de unión a EGFR o c-Met de afinidad alta o media como sigue: 83v2-A5-ABD (ECB18; alta/media para EGFR/cMet) 83v2-A3-ABD (ECB38; alta/alta) 17v2-A5 (ECB28; media/media) 17v2-A3-ABD (ECB39; media/alta). En la figura, 83v2 se refiere a p54AR4-83v2; 17v2 se refiere a p53A1R5-17v2; A3 se refiere a p1 14AR7P94-A3 y A5 se refiere a p114AR5P74-A5.
Figura 8. Se implantaron xenoinjertos de tumor H292-HGF en ratones SCID Beige. Cuando los tumores alcanzaron un volumen medio de aproximadamente 80 mm3, los fueron dosificados tres veces por semana de moléculas de EGFR/c-Met biespecíficas (25 mg/kg) o vehículo PBS. Todas las moléculas biespecíficas redujeron el crecimiento tumoral, y la inhibición del crecimiento tumoral (TGI) siendo dependiente de las afinidades de las moléculas para c-Met y EGFR (EGFR alto-cMet alto se refiere a p54AR4-83v2-p114AR7P94-A3 (ECB38); EGFR alto-cMet medio se refiere a p54AR4-83v2-p114AR5P74-A5 (ECB18); EGFR medio-cMet alto se refiere a p53A1R5-17v2-p114AR7P94-A3 (ECB39); EGFR medio-cMet medio se refiere a p53A1R5-17-p114AR5P74-A ECB28)).
Figura 9. Se implantaron xenoinjertos de tumor H292-HGF en ratones SCID Beige y se trataron con diferentes terapias. Se muestra la actividad antitumoral de las terapias (la molécula de EGFR/c-Met biespecífica se refiere a p54AR4-83v2-p114AR7P94-A3-ABD (ECB38); las otras terapias son crizotinib, erlotinib, cetuximab y la combinación de crizotinib y erlotinib).
Figura 10. Se implantaron xenoinjertos de tumores SKMES-HGF en ratones SCID Beige y los ratones se trataron con diferentes terapias. La actividad antitumoral de las terapias se muestra como el cambio en el tamaño del tumor (mm3) a lo largo del tiempo. Se administró por vía intraperitoneal (i.p.) el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico EM1-mAb dos veces a la semana a 20 mg/kg, 5 mg/kg o 1 mg/kg; el cetuximab se administró i.p. dos veces por semana a 20 mg/kg. Las flechas en la figura muestran los días de administración. Los números después de los anticuerpos indicaron la dosis administrada.
Figura 11. Se implantaron xenoinjertos de tumor HCC827 en ratones desnudos y los ratones se trataron con erlotinib o EM1-mAb a las dosis indicadas. Se administró EM1-mAb cada dos semanas y erlotinib una vez al día durante cuatro semanas. Las flechas en la figura muestran los días de administración. La actividad antitumoral de las terapias se muestra como el cambio en el tamaño del tumor (mm3) a lo largo del tiempo. Figura 12. Se implantaron xenoinjertos de tumor SNU-5 en ratones CB17/SCID y los ratones se trataron con 10 mg/kg de cetuximab o 10 mg/kg o 1 mg/kg de EM1-mAb. Los anticuerpos se administraron dos veces por semana durante cuatro semanas. Las flechas en la figura muestran los días de administración. La actividad antitumoral de las terapias se muestra como el cambio en el tamaño del tumor (mm3) a lo largo del tiempo. Figura 13. Se implantaron xenoinjertos de tumor H1975-HGF en ratones desnudos y se trataron con 10 mg/kg de cetuximab, 10 mg/kg de EM1-mAb, 50 mg/kg de erlotinib, 15 mg/kg de afatinib o una combinación de 10 mg/kg EM1-mAb y 15 mg/kg de afatinib. Los anticuerpos se administraron dos veces por semanas y las moléculas pequeñas una vez al día durante tres semanas. Las flechas en la figura muestran los días de administración. La actividad antitumoral de las terapias se muestra como el cambio en el tamaño del tumor (mm3) a lo largo del tiempo.
Figura 14. Se implantaron xenoinjertos de tumor HCC827-ER1 en ratones desnudos y los ratones se trataron con 10 mg/kg de EM1-mAb, 25 mg/kg de erlotinib, o una combinación de los dos. Se administró EM1-mAb dos veces a la semana y el erlotinib una vez al día durante 19 días. Las flechas en la figura muestran los días de administración. La actividad antitumoral de las terapias se muestra como el cambio en el tamaño del tumor (mm3) a lo largo del tiempo.
Figura 15. Niveles de EGFR y c-Met medios en lisados tumorales aislados de xenoinjertos de tumor H1975 HGF implantados en ratones SCID Beige después de la administración de una dosis individual de 20 mg/kg de EM1-mAb. Los niveles de receptores se muestran como % de control de PBS en los momentos indicados después del tratamiento.
Figura 16. Se implantaron xenoinjertos de tumor H1975-HGF en ratones desnudos y se trataron con 10 mg/kg de EM1-mAb o 10 mg/kg de la variante de EM1-mAb IgG2 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S que no tenía unión al receptor Fc y carecía de funciones efectoras. Los anticuerpos se administraron dos veces a la semana en los días indicados. La actividad antitumoral de las terapias se muestra como el cambio en el tamaño del tumor (mm3) a lo largo del tiempo. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
El término "dominio de fibronectina tipo III (FN3)" (dominio de FN3) como se usa en la presente se refiere a un dominio que tiene lugar frecuentemente en proteínas incluyendo fibronectinas, tenascina, proteínas del citoesqueleto intracelular, receptores de citoquinas y enzimas procariotas (Bork y Doolittle, Proc Nat Acad Sci USA 89:8990-8994, 1992; Meinke et al., J Bacteriol 175:1910-1918, 1993; Watanabe et al., J Biol Chem 265:15659-15665, 1990). Los dominios de FN3 ejemplares son los 15 dominios de FN3 diferentes presentes en la tenascina C humana, los 15 dominios de FN3 diferentes presentes en la fibronectina humana (FN) y los dominios de FN3 sintéticos no naturales como se describen, por ejemplo, en la Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2010/0216708. Los dominios de FN3 individuales se denominan por número de dominio y nombre de la proteína, por ejemplo, el 3° dominio de FN3 de tenascina (TN3), o el 10° dominio de FN3 de fibronectina (FN10).
El término "sustituir" o "sustituido" o "mutar" o "mutado" como se usa en la presente se refiere a alterar, eliminar o insertar uno o más aminoácidos o nucleótidos en una secuencia de polipéptidos o polinucleótidos para generar una variante de esa secuencia.
El término "aleatorizar" o "aleatorizado" o "diversificado" o "diversificar" como se usa en la presente se refiere a hacer por lo menos una sustitución, inserción o deleción en una secuencia de polinucleótido o polipéptido.
"Variante" como se usa en la presente se refiere a un polipéptido o un polinucleótido que difiere de un polipéptido de referencia o un polinucleótido de referencia por una o más modificaciones, por ejemplo, sustituciones, inserciones o deleciones.
El término "se une específicamente" o "unión específica" como se usa en este la presente se refiere a la capacidad de un dominio de FN3, un agente biespecífico que se une específicamente a EGFR y c-Met, o un anticuerpo biespecífico de EGFR/c-Met de la invención para unirse a un antígeno predeterminado con una constante de disociación (Kd) de aproximadamente 1x10'6 M o menos, por ejemplo aproximadamente 1x10'7 M o menos, aproximadamente 1x10'8 M o menos, aproximadamente 1x10'9 M o menos, aproximadamente 1x10'1° M o menos, aproximadamente 1x10'11 M o menos, aproximadamente 1x10'12M o menos, o aproximadamente 1x10'13M o menos. Típicamente, el dominio de FN3, el agente biespecífico que se une específicamente a EGFR y c-Met o el anticuerpo biespecífico de EGFR/c-Met de la invención se une a un antígeno predeterminado (es decir, EGFR o c-Met) con una Kd que es por lo menos diez veces que menos que su Kd para un antígeno no específico (por ejemplo, BSA o caseína) medido por resonancia de plasmón de superficie usando, por ejemplo, un instrumento Proteon (BioRad). Por tanto, la molécula que contiene el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico, el agente biespecífico que se une específicamente a EGFR y c-Met o el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico de la invención se une específicamente a cada EGFR y c-Met con una afinidad de unión (Kd) de por lo menos aproximadamente 1x10'6 M o menos, por ejemplo, aproximadamente 1x10'7 M o menos, aproximadamente 1x10'8 M o menos, aproximadamente 1x10'9 M o menos, aproximadamente 1x10'10M o menos, aproximadamente 1x10'11 M o menos, aproximadamente 1x10'12 M o menos, o aproximadamente 1x10'13 M o menos. La molécula que contiene el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico, el agente biespecífico que se une específicamente a EGFR y c-Met o el anticuerpo biespecífico de EGFR/c-Met de la invención que se une específicamente a un antígeno predeterminado puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, por ejemplo, con el mismo antígeno predeterminado de otras especies (homólogos).
El término "biblioteca" se refiere a una colección de variantes. La biblioteca puede estar compuesta de variantes de polipéptidos o de polinucleótidos.
El término "estabilidad", como se usa en la presente, se refiere a la capacidad de una molécula para mantener un estado plegado en condiciones fisiológicas de tal manera que retiene por lo menos una de sus actividades funcionales normales, por ejemplo, la unión a un antígeno predeterminado como EGFR o c-Met.
"Receptor del factor de crecimiento epidérmico" o "EGFR" como se usa en la presente se refiere al EGFR humano (también conocido como HER1 o ErbB1 (Ullrich et al., Nature 309:418-425, 1984) que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 73 y en el número de acceso de GenBank n P_005219, así como las variantes de origen natural del mismo. Tales variantes incluyen la bien conocida EGFRvIII y otras variantes cortadas y empalmadas alternativamente (por ejemplo, como las identificadas con los números de acceso de SwissProt P00533-1 (tipo salvaje; idénticas a la SEQ ID NO: 73 y NP_005219), P00533-2 (F404L/L405S), P00533-3 (628-705: CTGPGLEGCP...GEAPNQALLR^PGNESLKAML..SVIITASSCH y 706-1210 delecionados), P00533-4 (C628S y 629-- 1210 delecionados), variantes GlnQ98, R266, K521, 1674, G962 y P988 (Livingston et al., NIEHS-SNPs, proyecto genoma ambiental, NIEHS ES15478), T790M, L858R/T790M y del(E746, A750).
"Ligando de EGFR" como se usa en la presente abarca todos los ligandos (por ejemplo, fisiológicos) para EGFR, incluyendo EGF, TGFa, EGF de unión a heparina (HB-EGF), anfiregulina (AR) y epirregulina (EPI).
El "factor de crecimiento epidérmico" (EGF), como se usa en la presente, se refiere al EGF humano de 53 aminoácidos bien conocido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 74.
"Receptor del factor de crecimiento de hepatocitos" o "c-Met", como se usa en la presente, se refiere a c-Met humano que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 101 o en el Número de Acceso de GenBank: NP_001120972 y variantes naturales del mismo.
"Factor de crecimiento de hepatocitos" (HGF), como se usa en la presente, se refiere a1HGF humano bien conocido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:102 que se escinde para formar un dímero de una cadena alfa y beta enlazadas por un enlace disulfuro.
"Bloquea la unión" o "inhibe la unión", como se usa en la presente indiferentemente, se refiere a la capacidad de los dominios de FN3, la molécula que contiene el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico, el agente biespecífico que se une específicamente a EGFR y c-Met o el anticuerpo de EGFR /c-Met biespecífico de la invención para bloquear o inhibir la unión del ligando de EGFR como EGF a EGFR y/o HGF a c-Met, y abarca tanto el bloqueo/inhibición parcial como la completa. El bloqueo/inhibición del ligando de EGFR, como EGF a EGFR y/o HGF a c-Met por los dominios de FN3, la molécula que contiene el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico, el agente biespecífico que se une específicamente a EGFR y c-Met o el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico de la invención reduce parcial o completamente el nivel normal de señalización de EGFR y/o señalización de c-Met cuando se compara con la unión del ligando de EGFR a EGFR y/o unión de HGF a c-Met sin bloqueo o inhibición. Los dominios de FN3, la molécula que contiene el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico, el agente biespecífico que se une específicamente a EGFR y c-Met o el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico de la invención "bloquean la unión" del ligando de EGFR como de EGF a EGFR y/o HGF a c-Met cuando la inhibición es por lo menos un 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%. La inhibición de la unión puede medirse usando métodos bien conocidos, por ejemplo midiendo la inhibición de la unión de EGF biotinilado en células A4321 que expresan EGFR expuestas al dominio de FN3, la molécula que contiene el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico usando FACS, y usando métodos descritos en la presente, o midiendo la inhibición de unión de HGF biotinilado en el dominio extracelular de c-Met usando métodos bien conocidos y métodos descritos en la presente
El término "señalización de EGFR" se refiere a la transducción de señales inducida por la unión del ligando de EGFR a EGFR que da como resultado la autofosforilación de por lo menos un residuo de tirosina en el EGFR. Un ligando de EGFR ejemplar es EGF.
"Neutraliza la señalización de EGFR" como se usa en la presente se refiere a la capacidad de los dominios de FN3, la molécula que contiene el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico, el agente biespecífico que se une específicamente a EGFR y c-Met o el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico de la invención para inhibir la señalización de EGFR inducida por el ligando de EGFR como EGF en por lo menos un 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%.
El término "señalización de c-Met" se refiere a la transducción de señales inducida por la unión de HGF a c-Met que da como resultado la autofosforilación de por lo menos un residuo de tirosina en el c-Met. Típicamente, por lo menos un residuo de tirosina en las posiciones 1230, 1234, 1235 o 1349 se autofosforila tras la unión de HGF.
"Neutraliza la señalización de c-Met" como se usa en la presente se refiere a la capacidad del dominio de FN3, la molécula que contiene el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico, el agente biespecífico que se une específicamente a EGFR y c-Met o el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico de la invención para inhibir la señalización de c-Met inducida por HGF en por lo menos un 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85 %, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%.
"Sobreexpresa", "sobreexpresado" y "sobreexpresión" como se usan en la presente se refieren indiferentemente a una célula cancerosa o maligna que tiene niveles mediblemente más altos de EGFR y/o c-Met en la superficie en comparación con una célula normal del mismo tipo de tejido. Dicha sobreexpresión puede estar provocada por la amplificación de genes o por transcripción o traducción aumentada. La expresión y sobreexpresión de EGFR y/o c-Met pueden medirse usando ensayos bien conocidos que usan, por ejemplo, ELISA, inmunofluorescencia, citometría de flujo o radioinmunoensayo en células vivas o lisadas. Alternativamente, o adicionalmente, los niveles de moléculas de ácidos nucleicos que codifican EGFR y/o c-Met pueden medirse en la célula, por ejemplo, usando hibridación fluorescente in situ, transferencia Southern, o técnicas de PCR. EGFR y/o c-Met se sobreexpresan cuando el nivel de EGFR y/o c-Met en la superficie de la célula es por lo menos 1,5 veces más alto que cuando se compara con la célula normal.
"Tencon", como se usa en la presente, se refiere al dominio de fibronectina sintética tipo III (FN3) que tiene la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1 y se describe en la Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2010/0216708.
Una "célula cancerosa" o una "célula tumoral" como se usan en la presente se refiere a una célula cancerosa, precancerosa o transformada, ya sea in vivo, ex vivo, y en el cultivo de tejidos, que tiene cambios fenotípicos espontáneos o inducidos que no implican necesariamente la captación de nuevo material genético. Aunque la transformación puede surgir de la infección con un virus transformante y la incorporación de un nuevo ácido nucleico genómico, o la captación de ácido nucleico exógeno, también puede surgir espontáneamente o después de la exposición a un carcinógeno, mutando así un gen endógeno. La transformación/cáncer se ejemplifica mediante, por ejemplo, cambios morfológicos, inmortalización de células, control de crecimiento aberrante, formación de focos, proliferación, malignidad, niveles de marcadores específicos de tumores, invasividad, crecimiento o supresión de tumores en huéspedes animales adecuados como ratones desnudos y similares, in vitro, in vivo y ex­ vivo (Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique (3a ed. 1994)).
El término "vector" significa un polinucleótido capaz de ser duplicado dentro de un sistema biológico o que puede moverse entre tales sistemas. Los polinucleótidos de vectores típicamente contienen elementos, como orígenes de replicación, señales de poliadenilación o marcadores de selección que funcionan para facilitar la duplicación o el mantenimiento de estos polinucleótidos en un sistema biológico. Los ejemplos de tales sistemas biológicos pueden incluir una sistemas biológicos celulares, de virus, animales, vegetales y reconstituidos que utilizan componentes biológicos capaces de duplicar un vector. El polinucleótido que comprende un vector puede ser moléculas de ADN o ARN o un híbrido de estas.
El término "vector de expresión" significa un vector que puede utilizarse en un sistema biológico o en un sistema biológico reconstituido para dirigir la traducción de un polipéptido codificado por una secuencia de polinucleótidos presente en el vector de expresión.
El término "polinucleótido" significa una molécula que comprende una cadena de nucleótidos unidos covalentemente por un esqueleto de azúcar-fosfato u otra química covalente equivalente. Los ADN y los ARN de cadena doble y sencilla son ejemplos típicos de polinucleótidos.
"ADN complementario" o "ADNc" se refiere a un polinucleótido sintético bien conocido que comparte la disposición de los elementos de secuencia encontrados en las especies de ARNm maduras nativas con exones contiguos, con los intrones intermedios presentes en el ADN genómico que eliminados. Los codones que codifican la metionina iniciadora pueden o no estar presentes en el ADNc. El ADNc puede sintetizarse, por ejemplo, mediante transcripción inversa o ensamblaje genético sintético.
"Sintético" o "no natural" o "artificial", como se usa en la presente, se refiere a un polinucleótido o una molécula polipeptídica no presente en la naturaleza.
El término "polipéptido" o "proteína" significa una molécula que comprende por lo menos dos residuos de aminoácidos unidos por un enlace peptídico para formar un polipéptido. Los polipéptidos pequeños de menos de aproximadamente 50 aminoácidos pueden denominarse "péptidos".
El término "molécula de EGFR/c-Met biespecífica " o "molécula que contiene el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífica", como se usa en la presente, se refiere a una molécula que comprende un dominio de FN3 de unión a EGFR y un dominio de FN3 de unión a c-Met distinto que están enlazados covalentemente entre sí ya sea directamente o a través de un conector. Una molécula de unión a EGFR/c-Met biespecífica ejemplar comprende un primer dominio de FN3 que se une específicamente a EGFR y un segundo dominio de FN3 que se une específicamente a c-Met.
"Valencia", como se usa en la presente, se refiere a la presencia de un número específico de sitios de unión específicos para un antígeno en una molécula. Como tales, los términos "monovalente", "bivalente", "tetravalente" y "hexavalente" se refieren a la presencia de uno, dos, cuatro y seis sitios de unión, respectivamente, específicos para un antígeno en una molécula.
"Mezcla", como se usa en la presente, se refiere a una muestra o preparación de dos o más dominios de FN3 no unidos covalentemente entre sí. Una mezcla puede consistir de dos o más dominios de FN3 idénticos o dominios de FN3 distintos. La mezcla como se usa en la presente también se refiere a una muestra o preparación de dos o más anticuerpos monovalentes que son monovalentes hacia EGFR y/o monovalentes hacia c-Met.
El término "agente biespecífico que se une específicamente a EGFR y c-Met" como se usa en la presente se refiere a una molécula que comprende un primer dominio que se une específicamente a EGFR y un segundo dominio que se une específicamente a c-Met. Un agente ejemplar que se une específicamente a EGFr y c-Met es un anticuerpo biespecífico. Otro agente biespecífico ejemplar que se une específicamente a EGFR y c-Met es una molécula que comprende un dominio de FN3 de unión a EGFR y un dominio de FN3 de unión a c-Met distinto. El agente biespecífico que se une específicamente a EGFR y c-Met puede estar compuesto por un único polipéptido o más de un polipéptido.
El término "anticuerpo anti-EGFR/c-Met biespecífico" o "anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo biespecífico que tiene un primer dominio que se une específicamente a EGFR y un segundo dominio que se une específicamente a c-Met. Los dominios que se unen específicamente a EGFR y c-Met son típicamente parejas VH/Vl , y el anticuerpo biespecífico anti-EGFR/c-Met es monovalente en términos de unión a EGFR y c-Met.
El término "anticuerpos" como se usa en la presente se entiende en un sentido amplio e incluye moléculas de inmunoglobulina que incluyen anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales incluyendo anticuerpos monoclonales murinos, humanos, humanos-adaptados, humanizados, quiméricos, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos, anticuerpos diméricos, tetraméricos o multiméricos, y anticuerpos de cadena sencilla.
Las inmunoglobulinas pueden asignarse a cinco clases principales, concretamente, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de la cadena pesada. IgA e IgG se subclasifican además como los isotipos IgA-i, IgA2, IgG-i, IgG2, IgG3 e IgG4. Las cadenas ligeras de anticuerpos de cualquier especie vertebrada pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, concretamente, kappa (k) y lambda (A), en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.
El término "fragmentos de anticuerpos" se refiere a una porción de una molécula de inmunoglobulina que retiene el sitio de unión al antígeno de la cadena pesada y/o la cadena ligera, como las regiones determinantes de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR) 1, 2 y 3, las regiones determinantes de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR) 1, 2 y 3, una región variable de la cadena pesada (VH), o una región variable de la cadena ligera (VL). Los fragmentos de anticuerpo incluyen un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CHI; un fragmento F(ab)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente de disulfuro en la región bisagra; un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CHI; un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo; un fragmento de anticuerpo de dominio (dAb) (Ward et al (1989) Nature 341: 544-546), que consiste de un dominio VH. Los dominios VH y VL pueden diseñarse y enlazarse entre sí mediante un conector sintético para formar varios tipos de diseños de anticuerpos de cadena sencilla donde los dominios VH/VL se emparejan intramolecularmente, o intermolecularmente en aquellos casos en los que los dominios VH y VL se expresan mediante constructos de anticuerpos de cadena sencilla separados, para formar un sitio de unión al antígeno monovalente, como Fv de cadena sencilla (scFv) o diacuerpo; descrito por ejemplo en las Publicaciones Internacionales de PCT N° WO1998/44001, WO1988/01649, WO1994/13804 y WO1992/01047. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen usando técnicas conocidas bien conocidas por los expertos en la técnica, y los fragmentos se seleccionan para determinar su utilidad de la misma manera que los anticuerpos de longitud completa.
La frase "anticuerpo aislado" se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen especificidades antigénicas diferentes (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico aislado que se une específicamente a EGFR y c-Met está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de EGFR y c-Met humanos). Sin embargo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a EGFR y c-Met puede tener reactividad cruzada con otros antígenos, como los ortólogos de EGFR y/o c-Met humanos, como EGFR y/o c-Met de Macaca fascicularis (cinomologo) Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otros materiales celulares y/o químicos.
Una región variable del anticuerpo consiste de una región "marco" interrumpida por tres "sitios de unión al antígeno". Los sitios de unión al antígeno se definen usando varios términos: (i) Regiones Determinantes de la Complementariedad (CDR), tres en la VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3) y tres en la VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3), se basan en la variabilidad de secuencias (Wu y Kabat J Exp Med 132: 211-50, 1970; Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). (ii) "Regiones hipervariables", "HVR" o "HV", tres en la VH (H1, H2, H3) y tres en la VL (L1, L2, L3), se refieren a las regiones de un dominio variable del anticuerpo que tienen una estructura hipervariable como se define por Chothia y Lesk (Chothia y Lesk Mol Biol 196:901-17, 1987). Otros términos incluyen "IMGT-CDR" (Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27: 55-77, 2003) y " Specificity Determining Residue Usage" (SDRU) (Almagro Mol Recognit 17:132-43, 2004). La base de datos de International ImMunoGeneTics (IMGT) (http: / / www_imgt_org) proporciona una numeración y definición estandarizada de los sitios de unión a antígenos. La correspondencia entre CDR, HV y delimitaciones IMGT se describe en Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27: 55-77, 2003 .
Los "residuos de Chothia", como se usan en este documento, son los residuos de VL y VH del anticuerpo numerados de acuerdo con Al-Lazikani (Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273:927-48, 1997).
"Marco" o "secuencias marco" son las secuencias restantes de una región variable diferentes de las definidas como sitios de unión al antígeno. Debido a que los sitios de unión al antígeno pueden definirse por varios términos como se ha descrito anteriormente, la secuencia de aminoácidos exacta de un marco depende de cómo se definió el sitio de unión al antígeno.
"Anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo en el que los sitios de unión al antígeno se derivan de especies no humanas y los marcos de la región variable se derivan de secuencias de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos humanizados pueden incluir sustituciones en las regiones marco, de tal manera que el marco puede no ser una copia exacta de las secuencias de genes de inmunoglobulina humana expresada o la línea germinal.
Los anticuerpos "adaptados a humanos " o anticuerpos "adaptados a marco humano (HFA)" se refieren a anticuerpos humanizados adaptados de acuerdo con los métodos descritos en la Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2009/0118127. Los anticuerpos adaptados a humanos se humanizan seleccionando los marcos humanos aceptores en base a las similitudes de CDR y FR máximas, las compatibilidades de longitud y las similitudes de secuencia de los giros de CDR1 y CDR2 y una parte de los giros de CDR3 de cadena ligera.
"Anticuerpo humano" se refiere a un anticuerpo que tiene regiones variables de la cadena pesada y ligera en las que tanto el marco como los sitios de unión al antígeno están derivados de secuencias de origen humano. Si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también se deriva de secuencias de origen humano.
El anticuerpo humano comprende regiones variables de la cadena pesada o ligera que se "derivan de" secuencias de origen humano si las regiones variables del anticuerpo se obtienen de un sistema que usa inmunoglobulina de la línea germinal humana o genes de inmunoglobulina reorganizados. Tales sistemas incluyen bibliotecas de genes de inmunoglobulina humana mostradas en fagos, y animales no humanos transgénicos, como ratones que llevan loci de inmunoglobulina humana como se describe en la presente. El "anticuerpo humano" puede contener diferencias de aminoácidos cuando se compara con la línea germinal humana o las secuencias de inmunoglobulina reorganizadas debido, por ejemplo, a mutaciones somáticas de origen natural o la introducción intencionada de sustituciones en el marco o en los sitios de unión al antígeno. Típicamente, el "anticuerpo humano" es por lo menos aproximadamente un 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntico en la secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos codificada por un gen de inmunoglobulina de línea germinal humana o reorganizado. En algunos casos, el "anticuerpo humano" puede contener secuencias marco de consenso derivadas de análisis de la secuencia marco humana, por ejemplo, como se describe en Knappik et al., J Mol Biol 296:57-86, 2000), o HCDR3 sintético incorporado en bibliotecas de genes de inmunoglobulina humana que se muestran en el fago, por ejemplo, como se describe en Shi et al., J Mol Biol 397:385-96, 2010 y la Publicación de Patente Internacional N° WO2009/085462). Los anticuerpos en los que los sitios de unión al antígeno se derivan de una especie no humana no se incluyen en la definición de "anticuerpo humano".
Los anticuerpos humanizados aislados pueden ser sintéticos. Los anticuerpos humanos, aunque se derivan de secuencias de inmunoglobulina humana, pueden generarse usando sistemas como la presentación de fagos incorporando CDR sintéticas y/o marcos sintéticos, o pueden someterse a mutagénesis in vitro para mejorar las propiedades de los anticuerpos, dando como resultado anticuerpos que no existen naturalmente dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.
El término "anticuerpo recombinante", como se usa en la presente, incluye todos los anticuerpos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, como anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico para los genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir de los mismos(descrito adicionalmente a continuación), anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo, anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos combinatorios recombinante y anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN, o anticuerpos que se generan in vitro mediante el intercambio del brazo Fab.
El término "anticuerpo monoclonal", como se usa en la presente, se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una especificidad de unión y afinidad únicas por un epítopo particular, o en el caso de un anticuerpo monoclonal biespecífico, una especificidad de unión dual a dos epítopos distintos.
El término "sustancialmente idéntico" como se usa en la presente significa que las dos secuencias de aminoácidos de la región variable del anticuerpo que se comparan son idénticas o tienen "diferencias insustanciales". Las diferencias insustanciales son sustituciones de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos en una secuencia de la región variable del anticuerpo que no afectan adversamente a las propiedades del anticuerpo. Las secuencias de aminoácidos sustancialmente idénticas a las secuencias de la región variable divulgadas en la presente están dentro del alcance de la invención. En algunas realizaciones, la identidad de secuencia puede ser de aproximadamente el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más. El porcentaje de identidad puede determinarse, por ejemplo, mediante la alineación por parejas usando la configuración predeterminada del módulo AlignX de Vector NTI v.9.0.0 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las secuencias de proteínas de la presente invención pueden usarse como una secuencia de consulta para realizar una búsqueda en bases de datos públicas o de patentes para, por ejemplo, identificar secuencias relacionadas. Los programas ejemplares usados para realizar tales búsquedas son los programas XBLAST o BLASTP (http _ / / www_ncbi_nlm/nih_gov), o el paquete GenomeQuest™ (GenomeQuest, Westborough, MA) usando la configuración predeterminada.
El término "epítopo" como se usa en la presente significa una porción de un antígeno al que se une específicamente un anticuerpo. Los epítopos habitualmente consisten de agrupaciones superficiales químicamente activas (como polares, no polares o hidrófobas) de fracciones tales como cadenas laterales de aminoácidos o de polisacáridos y pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Un epítopo puede estar compuesto de aminoácidos contiguos y/o no contiguos que forman una unidad espacial conformacional. Para un epítopo no contiguo, los aminoácidos de diferentes porciones de la secuencia lineal del antígeno se acercan estrechamente en el espacio tridimensional a través del plegamiento de la molécula de proteína.
El término "en combinación con" como se usa en la presente significa que se pueden administrar dos o más agentes terapéuticos a un sujeto juntos en una mezcla, concurrentemente como agentes individuales o secuencialmente como agentes individuales en cualquier orden.
La numeración de los residuos de aminoácidos en la región constante del anticuerpo a lo largo de la especificación se realiza de acuerdo con el índice de la UE como se describe en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), a menos que se indique expresamente lo contrario.
Composiciones de la materia
La presente invención proporciona agentes biespecíficos que se unen específicamente a EGFR y c-Met. La presente invención proporciona polipéptidos y polinucleótidos de usarlos.
Moléculas de unión que contienen dominio de FN3 de EGFR y/o c-Met monoespecíficas y biespecíficas Moléculas de unión que contienen el dominio de FN3 de EGFR monoespecíficas
La presente divulgación proporciona dominios de fibronectina tipo III (FN3) que se unen específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y bloquean la unión del factor de crecimiento epidérmico (EGF) al EGFR, y por tanto pueden usarse ampliamente en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. La presente divulgación proporciona polinucleótidos que codifican los dominios de FN3 de la divulgación o ácidos nucleicos complementarios de los mismos, vectores, células huésped y métodos para prepararlos y usarlos.
Los dominios de FN3 de la divulgación se unen a EGFR con alta afinidad e inhiben la señalización de EGFR, y pueden proporcionar un beneficio en términos de especificidad y toxicidad fuera del objetivo reducida cuando se comparan con los inhibidores de EGFR de molécula pequeña, y penetración en el tejido mejorada cuando se comparan con las terapias con anticuerpos convencionales.
Una realización de la divulgación es un dominio de fibronectina tipo III (FN3) aislado que se une específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y bloquea la unión del factor de crecimiento epidérmico (EGF) al EGFR.
Los dominios de FN3 de la divulgación pueden bloquear la unión de EGF a EGFR con un valor de IC50 de menos de aproximadamente 1x10-7 M, de menos de aproximadamente 1x10-8 M, de menos de aproximadamente 1x10-9 M, de menos de aproximadamente 1x10-10 M, de menos de aproximadamente 1x10-11 M, o de menos de aproximadamente 1x10-12 M en un ensayo de competición empleando células A431 y detectando la cantidad de fluorescencia de EGF biotinilado unido usando conjugado de estreptavidina-ficoeritrina a 600 nM en células A431 incubadas con o sin los dominios de FN3 de la divulgación. Los dominios de FN3 ejemplares pueden bloquear la unión de EGF a EGFR con un valor de IC50 entre aproximadamente 1x10-9 M y aproximadamente 1x10-7 M, como los dominios de FN3 de unión a EGFR que tienen la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 18-29, 107-110 o 122-137. Los dominios de FN3 de la divulgación pueden bloquear la unión de EGF a EGFR en por lo menos un 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85 %, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% en comparación con la unión de EGF a EGFR en ausencia de los dominios de FN3 de la divulgación usando las mismas condiciones de ensayo.
El dominio de FN3 del anticuerpo puede inhibir la señalización de EGFR en por lo menos un 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% en comparación con el nivel de señalización en ausencia de los dominios de FN3 del anticuerpo usando las mismas condiciones de ensayo.
La unión de un ligando como EGF a EGFR estimula la dimerización del receptor, la autofosforilación, la activación del receptor interno, el dominio de la tirosina quinasa citoplasmático, y el inicio de múltiples vías de transducción de señales y transactivación implicadas en la regulación de la síntesis de ADN (activación del gen) y la progresión o división del ciclo celular. La inhibición de la señalización de EGFR puede dar como resultado la inhibición en una o más vías de señalización de EGFR descendentes y, por lo tanto, neutralizar EGFR puede tener varios efectos, incluida la inhibición de la proliferación y diferenciación celular, angiogénesis, motilidad celular y metástasis.
La señalización de EGFR puede medirse usando varios métodos bien conocidos, por ejemplo midiendo la autofosforilación del receptor en cualquiera de las tirosinas Y1068, Y1148 y Y1173 (Downward et al., Nature 311:483-5, 1984) y/o la fosforilación de sustratos naturales o sintéticos. La fosforilación puede detectarse usando métodos bien conocidos, como un ensayo ELISA o transferencia western usando un anticuerpo específico de fosfotirosina. Ensayos ejemplares pueden encontrarse en Panek et al., J. Pharmacol Exp Thera 283:1433-44, 1997 y Batley et al., Life Sci 62:143-50, 1998, y ensayos descritos en la presente.
El dominio de FN3 de la divulgación puede inhibir la fosforilación de EGFR inducida por EGF en la posición del residuo de EGFR Tirosina 1173 con un valor de IC50 de menos de aproximadamente 2,5x10'6 M, por ejemplo, de menos de aproximadamente 1x10'6 M, de menos de aproximadamente 1x10'7 M, de menos de aproximadamente 1x10'8 M, de menos de aproximadamente 1x10'9 M, de menos de aproximadamente 1x10'1° M, de menos de aproximadamente 1x10'11 M, o de menos de aproximadamente 1x10'12 M cuando se mide en células A431 usando 50 ng/ml de EGF humano.
El dominio de FN3 de la divulgación puede inhibir la fosforilación de EGFR inducida por EGF en la posición del residuo EGFR Tirosina 1173 con un valor de IC50 entre aproximadamente 1,8 X10'8 M y aproximadamente 2,5 x 1010'6 M cuando se mide en células A431 usando 50 ng/ml de EGF humano. Tales dominios de FN3 ejemplares son aquellos que tienen la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 18-29, 107-110 o 122-137.
El dominio de FN3 de la divulgación puede unirse al EGFR humano con una constante de disociación (Kd) de menos de aproximadamente 1x10'8 M, por ejemplo, menos de aproximadamente 1x10'9 M, menos de aproximadamente 1x10'10 M, menos de aproximadamente 1x10'11 M, menos de aproximadamente 1x10'12 M, o menos de aproximadamente 1x10'13 M como se determina por resonancia de plasmón de superficie o el método de Kinexa, tal como lo practican los expertos en la técnica. El dominio de FN3 de la divulgación puede unirse a EGFR humano con una Kd de entre aproximadamente 2x10'10 y aproximadamente 1x10'8 M. La afinidad de un dominio de FN3 para EGFR puede determinarse experimentalmente usando cualquier método adecuado. (Ver, por ejemplo, Berzofsky, et al., " Antibody-Antigen Interactions," en Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: Nueva York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: Nueva York, NY (1992) y los métodos descritos en la presente). La afinidad medida de una interacción particular dominio de NF3-antígeno particular puede variar si se mide en diferentes condiciones (por ejemplo, osmolaridad, pH). Por tanto, las mediciones de afinidad y otros parámetros de unión al antígeno (por ejemplo, Kd, Kon, Koff) se hacen preferiblemente con soluciones estandarizadas de andamiaje y antígeno de proteínas, y un tampón estandarizado, como el tampón descrito en la presente.
Los dominios de FN3 ejemplares de la divulgación que se unen a EGFR incluyen los dominios de FN3 de las SEQ ID NO: 18-29, 107-110, o 122-137.
En una realización, el dominio de FN3 que se une específicamente a EGFR comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos un 87% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27.
En una realización, el dominio de FN3 que se une específicamente a EGFR comprende
un giro FG que comprende la secuencia HNVYKDTNXgRGL (SEQ ID NO: 179) o la secuencia LGSYVFEHDVML (SEQ ID NO: 180), en donde X9 es M o I; y
un giro BC que comprende la secuencia X-|X2X3X4X5X6X7X8 (SEQ ID NO: 181);
en donde
Xi es A, T, G o D;
X2 es A, D, Y o W;
X3 es P, D o N;
X4 es L o está ausente;
X5 es D, H, R, G, Y o W;
X6 es G, D o A;
X7 es A, F, G, H o D; y
X8 es Y, F o L.
Los dominios de FN3 de la divulgación que se unen específicamente a EGFR e inhiben la autofosforilación de EGFR pueden comprender como una característica estructural un giro FG que comprende la secuencia HNVYKDTNX9RGL (SEQ ID NO: 179) o la secuencia LGSYVFEHDVML (SEQ ID NO: 180), en donde X9 es M o I. Tales dominios de FN3 pueden comprender además un giro BC de 8 o 9 aminoácidos de longitud y definido por la secuencia X1X2X3X4X5X6X7X8 (SEQ ID NO: 181), e inhibe la autofosforilación de EGFR con un valor de IC50 de menos de aproximadamente 2,5x10-6 M, o con un valor de IC50 de entre aproximadamente 1,8x10-8 M y aproximadamente 2,5x10-6 M cuando se mide en células A431 usando 50 ng/ml de EGF humano.
Los dominios de FN3 de la divulgación que se unen específicamente EGFR e inhiben la autofosforilación de EGFR comprenden además la secuencia de LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8DSFLIQYQESEKVGEAINLTVP GSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDTNX9RGLPLSAEFTT (SEQ ID NO: 182), o la secuencia
LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8DSFLIQYQESEKVGEAINLTVP
GSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVLGSYVFEHDVMLPLSAEFTT (SEQ ID NO:
183),
en donde
X1 es A, T, G o D;
X2 es A, D, Y o W;
X3 es P, D o N;
X4 es L o está ausente;
X5 es D, H, R, G, Y o W;
X6 es G, D o A;
X7 es A, F, G, H o D;
X8 es Y, F o L; y
X9 es M o I
Los dominios de FN3 de unión a EGFR pueden generarse y probarse por su capacidad para inhibir la autofosforilación de EGFR usando métodos bien conocidos y métodos descritos en la presente.
La divulgación también proporciona un dominio de FN3 aislado que se une específicamente a EGFR, en donde el dominio de FN3 comprende la secuencia mostrada en las SEQ ID NO: 18-29, 107-110, o 122-137.
Los dominios de FN3 de unión a EGFR pueden comprender una metionina iniciadora (Met) enlazada al extremo N-terminal o una cisteína (Cys) enlazada a un extremo C-terminal de un dominio de FN3 particular, por ejemplo para facilitar la expresión y/o conjugación de moléculas que extienden la vida media.
La divulgación también proporciona un dominio de fibronectina tipo III (FN3) aislado que se une específicamente a EGFR y bloquea la unión de EGF al EGFR, en donde el dominio de FN3 se aísla de una biblioteca diseñada en base a la secuencia Tencon de la SEQ ID NO: 1.
Moléculas de unión que contiene el dominio de FN3 de c-Met monoespecífico
La presente divulgación proporciona dominios de fibronectina tipo III (FN3) que se unen específicamente al receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (c-Met) y bloquean la unión del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) a c-Met, y por tanto pueden usarse ampliamente en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. La presente divulgación proporciona polinucleótidos que codifican los dominios de FN3 de la divulgación o ácidos nucleicos complementarios de los mismos, vectores, células huésped y métodos para hacerlos y usarlos.
Los dominios de FN3 de la divulgación se unen a c-Met con alta afinidad e inhiben la señalización de c-Met, y pueden proporcionar un beneficio en términos de especificidad y toxicidad fuera del objetivo reducida cuando se comparan con los inhibidores de c-Met de molécula pequeña, y penetración en el tejido mejorada cuando se comparan con la terapéutica de anticuerpos convencional. Los dominios de FN3 de la divulgación son monovalentes, por lo tanto evitan la agrupación y activación de receptores no deseadas que pueden tener lugar con otras moléculas bivalentes.
La divulgación también proporciona un dominio de fibronectina tipo III (FN3) aislado que se une específicamente al receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (c-Met) y bloquea la unión del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) a c-Met.
Los dominios de FN3 de la divulgación pueden bloquear la unión de HGF a c-Met con un valor de IC50 de menos de aproximadamente 1x10'7 M, de menos de aproximadamente 1x10'8 M, de menos de aproximadamente 1x10'9 M, de menos de aproximadamente 1x10'1° M, de menos de aproximadamente 1x10'11 M, o de menos de aproximadamente 1x10'12 M en un ensayo que detecta la inhibición de la unión de1HGF biotinilado a la proteína de fusión c-Met-Fc en presencia de los dominios de FN3 de la divulgación. Los dominios de FN3 ejemplares pueden bloquear la unión de HGF a c-Met con un valor de IC50 entre aproximadamente 2x10'1° M y aproximadamente 6x10'8 M. Los dominios de FN3 de la divulgación pueden bloquear la unión de HGF a c-Met en por lo menos un 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80 %, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% en comparación con la unión de HGF a c-Met en ausencia de los dominios de FN3 de la divulgación usando las mismas condiciones de ensayo.
El dominio de FN3 de la divulgación puede inhibir la señalización de c-Met en por lo menos un 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% en comparación con el nivel de señalización en ausencia de los dominios de FN3 de la divulgación usando las mismas condiciones de ensayo.
La unión de HGF a c-Met estimula la dimerización del receptor, la autofosforilación, la activación del receptor interno, el dominio de tirosina quinasa citoplasmático y el inicio de la transducción de señales múltiples y las vías de transactivación implicadas en la regulación de la síntesis de ADN (activación génica) y la progresión o división del ciclo celular. La inhibición de la señalización de c-Met puede dar como resultado la inhibición de una o más vías de señalización descendentes de c-Met y, por lo tanto, la neutralización de c-Met puede tener varios efectos, incluyendo la inhibición de la proliferación y diferenciación celular, la angiogénesis, la motilidad celular y la metástasis.
La señalización de c-Met puede medirse usando varios métodos bien conocidos, por ejemplo midiendo la autofosforilación del receptor en por lo menos un residuo de tirosina Y1230, Y1234, Y1235 o Y1349 y/o la fosforilación de sustratos naturales o sintéticos. La fosforilación puede detectarse, por ejemplo, usando un anticuerpo específico para la fosfotirosina en un ensayo ELISA o en una transferencia Western. Los ensayos para la actividad de la tirosina quinasa se describen, por ejemplo, en: Panek et al., J Pharmacol Exp Thera 283:1433-44, 1997 y Batley et al., Life Sci 62:143-50, 1998, y los ensayos descritos en la presente.
El dominio de FN3 de la divulgación puede inhibir la fosforilación de c-Met inducida por HGF en la posición 1349 del residuo de c-Met con un valor de IC50 de menos de aproximadamente 1x10'6 M, de menos de aproximadamente 1x10'7 M, de menos de aproximadamente 1x10'8 M, de menos de aproximadamente 1x10'9 M, de menos de aproximadamente 1x10'10 M, de menos de aproximadamente 1x10'11 M, o de menos de aproximadamente 1x10'12 M cuando se mide en células NCI-H441 utilizando 100 ng/ml de HGF humano recombinante.
El dominio de FN3 de la divulgación puede inhibir la fosforilación de c-Met inducida por HGF en la tirosina Y1349 c-Met con un valor de IC50 de entre aproximadamente 4x10'9 M y aproximadamente 1x10'6 M cuando se mide en células NCI-H441 usando 100 ng/ml de HGF humano recombinante.
El dominio de FN3 de la divulgación puede unirse a c-Met humano con una constante de disociación (Kd) igual o inferiora aproximadamente 1x10'7M, 1x10'8 M, 1x10'9 M, 1x10-10M, 1x10'11 M, 1x10'12M, 1x10'13M, 1x10'14 M, o 1x10'15 M como se determina por resonancia de plasmón de superficie o el método de Kinexa, como se practica por los expertos en la técnica. El dominio de FN3 de la divulgación puede unirse a c-Met humano con una Kd de entre aproximadamente 3x10'10 M y aproximadamente 5x10'8M. La afinidad de un dominio de FN3 para c-Met puede determinarse experimentalmente usando cualquier método adecuado. (Ver, por ejemplo, Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions," en Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: Nueva York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: Nueva York, NY (1992) y los métodos descritos en la presente). La afinidad medida de una interacción dominio de FN3-antígeno particular puede variar si se mide en condiciones diferentes (por ejemplo, osmolaridad, pH). Por tanto, las mediciones de afinidad y otros parámetros de unión al antígeno (por ejemplo, Kd, Kon, Koff) se elaboran preferiblemente con soluciones estandarizadas de andamiaje de proteínas y antígeno, y un tampón estandarizado, como el tampón descrito en la presente.
Los dominios de FN3 ejemplares de la divulgación que se unen a c-Met incluyen dominios de FN3 que tienen la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 32-49 o 111-114.
En una realización, el dominio de FN3 que se une específicamente a c-Met comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos un 83% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 41.
En una realización, el dominio de FN3 que se une específicamente a c-Met comprende
una cadena C y un giro CD que comprenden la secuencia DSFX10IRYX11EX12X13X14X15GX16 (SEQ ID NO: 184), en donde
X10 es W, F o V;
X11 es D, F o L;
X12 es V, F o L;
X13 es V, L o T;
X14 es V, R, G, L, T o S;
X15 es G, S, A, T o K; y
X16 es E o D; y
una cadena F y un giro FG que comprenden la secuencia TEYX17VX18IX19X20VKGGX21X22SX23 (SEQ ID NO: 185), en donde
X17 es Y, W, I, V, G o A;
X18 es N, T, Q o G;
X19 es L, M, N o I;
X20 es G o S;
X21 es S, L, G, Y, T, R, H o K;
X22 es I, V o L; y
X23 es V, T, H, I, P, Yo L.
Los dominios de FN3 de la divulgación que se unen específicamente a c-Met e inhiben la autofosforilación de c-Met comprenden además la secuencia:
LPAPKNLW SRVTEDSARLSW TAPDAAF DSFXioIRYXnE X12X13X14X15GX16
AIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYX17VX18IX19X20VKGGX21X22SX23PLSAEFTT
(SEQ ID NO: 186),
en donde
X10 es W
X11 es D, F o L;
X12 es V, F o L;
X13 es V, LoT;
X14 es V, R, G, L, T o S;
X15 es G, S, A, T o K;
X16 es E o D;
X17 es Y, W, I, V, G o A;
X18 es N, T, Q o G;
X19 es L, M, N o I;
X20 es G o S;
X21 es S, L, G, Y, T, R, H o K;
X22 es I, V o L; y
X23 es V, T, H, I, P, Yo L.
La divulgación también proporciona un dominio de FN3 aislado que se une específicamente a c-Met, en donde el dominio de FN3 comprende la secuencia mostrada en las SEQ ID NO: 32-49 o 111-114.
La divulgación también proporciona un dominio de fibronectina tipo III (FN3) aislado que se une específicamente a c-Met y bloquea la unión de HGF a c-Met, en donde el dominio de FN3 se aísla de una biblioteca diseñada en base a la secuencia Tencon de la SEQ ID NO: 1.
Aislamiento de los dominios de FN3 de EGFR o c-Met de una biblioteca basada en la secuencia Tencon
Tencon (SEQ ID NO: 1) es un dominio de fibronectina de tipo III (FN3) de origen no natural diseñado a partir de una secuencia de consenso de quince dominios de FN3 de tenascin-C humana (Jacobs et al., Protein Engineering, Design, and Selection, 25:107-117, 2012; Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2010/0216708). La estructura cristalina de Tencon muestra seis giros expuestos en la superficie que conectan siete cadenas beta como es característico de los dominios de FN3, las cadenas beta denominadas A, B, C, D, E, F y G, y los giros denominados giros AB, BC, CD, DE, EF y FG (Bork y Doolittle, Proc Natl Acad Sci USA 89:8990-8992, 1992; Patente de Estados Unidos N° 6.673.901). Estos giros, o residuos seleccionados dentro de cada giro, pueden aleatorizarse para construir bibliotecas de dominios de fibronectina tipo III (FN3) que pueden usarse para seleccionar nuevas moléculas que se unen a EGFR o c-Met. La Tabla 1 muestra las posiciones y secuencias de cada giro y cadena beta en Tencon (SEQ ID NO: 1).
La biblioteca diseñada en función de la secuencia Tencon puede por tanto tener un giro FG aleatorio, o giros BC y FG aleatorios, como las bibliotecas TCL1 o TCL2, como se describe a continuación. El giro BC de Tencon tiene una longitud de 7 aminoácidos, por lo tanto, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 aminoácidos pueden ser aleatorizados en la biblioteca diversificada en el giro BC y diseñados en base a la secuencia Tencon. El giro FG de Tencon tiene una longitud de 7 aminoácidos, por lo tanto, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 aminoácidos pueden ser aleatorizados en la biblioteca diversificada en el giro FG y diseñados en base a la secuencia de Tencon. La diversidad adicional en los giros en las bibliotecas Tencon puede lograrse mediante la inserción y/o deleciones de residuos en los giros. Por ejemplo, los giros FG y/o BC pueden extenderse en 1-22 aminoácidos, o disminuirse en 1-3 aminoácidos. El giro FG en Tencon tiene 7 aminoácidos de largo, mientras que el giro correspondiente en las cadenas pesadas de anticuerpos varía de 4 a 28 residuos. Para proporcionar la máxima diversidad, el giro FG puede diversificarse en secuencia así como en longitud para corresponderse con el intervalo de longitud de la DCR3 del anticuerpo de 4-28 residuos. Por ejemplo, el giro FG puede diversificarse adicionalmente en longitud extendiendo el giro en 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos adicionales.
La biblioteca diseñada en base a la secuencia Tencon también puede tener superficies alternativas aleatorizadas que se forman en un lado del dominio de FN3 y comprenden dos o más cadenas beta, y por lo menos un giro. Una de tales superficies alternativas está formada por aminoácidos en las cadenas beta C y F y los giros CD y FG (una superficie C-CD-F-FG). Un diseño de biblioteca basado en la superficie C-CD-F-FG alternativa de Tencon se muestra en la Figura 1 y la generación detallada de tales bibliotecas se describe en la Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2013/0226834.
La biblioteca diseñada en base a la secuencia Tencon también incluye bibliotecas diseñadas en base a las variantes de Tencon, como las variantes de Tencon que tienen sustituciones en las posiciones de residuos 11, 14, 17, 37, 46, 73 o 86 (la numeración de residuos correspondiente a la SEQ ID NO: 1), y tales variantes muestran estabilidad térmica mejorada. Variantes de Tencon ejemplares se describen en la Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2011/027462,3 e incluyen Tencon27 (SEQ ID NO: 99) que tiene las sustituciones E11R, L17A, N46V y E86I cuando se compara con Tencon de la SEQ ID NO: 1.
Tabla 1.
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Tencon y otras bibliotecas basadas en la secuencia de FN3 pueden aleatorizarse en las posiciones de residuos elegidas usando un conjunto aleatorio o definido de aminoácidos. Por ejemplo, las variantes en la biblioteca que tienen sustituciones aleatorias pueden generarse usando codones NNK, que codifican los 20 aminoácidos de origen natural. En otros esquemas de diversificación, pueden usarse codones DVK para codificar los aminoácidos Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly y Cys. Alternativamente, pueden usarse codones NNS para dar lugar a los 20 residuos de aminoácidos y al mismo tiempo reducir la frecuencia de los codones de terminación.
Las bibliotecas de dominios de FN3 con distribución de aminoácidos desplazada en las posiciones a diversificar pueden sintetizarse, por ejemplo, usando la tecnología Slonomics® (http: _ // www_sloning_com). Esta tecnología utiliza una biblioteca de tripletes de cadena doble preelaborados que actúan como bloques de construcción universales suficientes para miles de procesos de síntesis de genes. La biblioteca de tripletes representa todas las posibles combinaciones de secuencias necesarias para construir cualquier molécula de a Dn deseada. Las designaciones de codones son de acuerdo con el código IUB bien conocido.
Los dominios de FN3 que se unen específicamente a EGFR o c-Met de la divulgación pueden aislarse produciendo la biblioteca FN3 como la biblioteca Tencon que usa la pantalla cis para ligar fragmentos de ADN que codifican las proteínas del andamiaje a un fragmento de ADN que codifica RepA para generar una agrupación de complejos proteína-ADN formados después de la traducción in vitro, en donde cada proteína está asociada establemente con el ADN que la codifica (Patente de Estados Unidos N° 7.842.476; Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci USA 101, 2806-2810, 2004), y ensayando la biblioteca para la unión específica a EGFR y/o c-Met mediante cualquier método conocido en la técnica y descrito en el Ejemplo. Métodos bien conocidos ejemplares que pueden usarse son ELISA, inmunoensayos en sándwich y ensayos competitivos y no competitivos (ver, por ejemplo, Ausubel et al., Eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York). Los dominios de FN3 identificados que se unen específicamente a EGFR o c-Met se caracterizan además por su capacidad para bloquear el ligando de EGFR, como la unión de EGF a EGFR, o la unión de HGF a c-Met, y por su capacidad para inhibir la señalización de EGFR y/o c-Met usando los métodos descritos en la presente.
Los dominios de FN3 que se unen específicamente a EGFR o c-Met de la divulgación pueden generarse usando cualquier dominio de FN3 como plantilla para generar una biblioteca y examinando la biblioteca para moléculas que se unen específicamente a EGFR o c-Met usando los métodos proporcionados en ella. Dominios de FN3 ejemplares que pueden usarse son el 3° dominio de FN3 de tenascina C (Tn3) (SEQ ID NO: 75), Fibcon (SEQ ID NO: 7 6 ), y el 10° dominio de FN3 de fibronectina (FN10) (SEQ ID NO : 77). Se usan técnicas estándar de clonación y expresión para clonar las bibliotecas en un vector o sintetizar casetes de ADNc de cadena doble de la biblioteca, para expresar o traducir las bibliotecas in vitro. Por ejemplo, pueden usarse la visualización de ribosomas (Hanes y Pluckthun, Proc Natl Acad Sci USA, 94, 4937-4942, 1997), la visualización de ARNm (Roberts y Szostak Proc Natl Acad Sci USA, 94, 12297-12302, 1997), u otros sistemas libres de células (Patente de Estados Unidos N° 5.643.768). Las bibliotecas de las variantes del dominio de FN3 pueden expresarse como proteínas de fusión mostradas en la superficie, por ejemplo, de cualquier bacteriófago adecuado. Los métodos para mostrar los polipéptidos de fusión en la superficie de un bacteriófago son bien conocidos (Publicación de Patente de Estados Unidos 2011/0118144; Publicación de Patente Internacional N° WO2009/085462; Patente de Estados Unidos N° 6.969.108; Patente de Estados Unidos N° 6.172.197; Patente de Estados Unidos N° 5.223.409; Patente de Estados Unidos N° 6.582.915; Patente de Estados Unidos N° 6.472.147).
Los dominios de FN3 que se unen específicamente a EGFR o c-Met de la divulgación pueden modificarse para mejorar sus propiedades, como mejorar la estabilidad térmica y la reversibilidad del plegado y desplegado térmico. Se han aplicado varios métodos para aumentar la estabilidad térmica aparente de las proteínas y las enzimas, incluyendo el diseño racional basado en la comparación con secuencias termoestables altamente similares, el diseño de puentes disulfuro estabilizantes, las mutaciones para aumentar la propensión a la hélice alfa, el diseño de puentes salinos, la alteración de la carga superficial de la proteína, evolución dirigida y composición de secuencias de consenso (Lehmann y Wyss, Curr Opin Biotechnol, 12, 371-375, 2001). La estabilidad térmica alta puede aumentar el rendimiento de la proteína expresada, mejorar la solubilidad o la actividad, disminuir la inmunogenicidad, y minimizar la necesidad de una cadena de frío en la fabricación. Los residuos que pueden sustituirse para mejorar la estabilidad térmica de Tencon (SEQ ID NO: 1) son las posiciones de residuos 11, 14, 17, 37, 46, 73 u 8 6 , y se describen en la Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2011/0274623. Las sustituciones correspondientes a estos residuos pueden incorporarse a los dominios de FN3 o al dominio de FN3 biespecífico que contiene moléculas de la divulgación.
La divulgación también proporciona un dominio de FN3 aislado que se une específicamente a EGFR y bloquea la unión de EGF a EGFR, que comprende la secuencia mostrada en las SEQ ID NO: 18-29, 107-110, 122­ 137, que comprende además sustituciones en una o más posiciones de residuos correspondientes a las posiciones 11, 14, 17, 37, 46, 73 y 86 en Tencon (SEQ ID NO: 1).
La divulgación también proporciona un dominio de FN3 aislado que se une específicamente a c-Met y bloquea la unión de HGF a c-Met, que comprende la secuencia mostrada en las SEQ ID NO: 32-49 o 111-114, que comprende además sustituciones en una o más posiciones de residuos correspondientes a las posiciones 11, 14, 17, 37, 46, 73 y 86 en Tencon (SEQ ID NO: 1).
Las sustituciones ejemplares son las sustituciones E11N, E14P, L17A, E37P, N46V, G73Y y E8 6 I (numeración de acuerdo con la SEQ ID NO: 1).
Los dominios de FN3 de la divulgación pueden comprender sustituciones correspondientes a las sustituciones L17A, N46V y E8 6 I en Tencon (SEQ ID NO: 1).
Los dominios de FN3 que se unen específicamente a EGFR (Figura 1) tienen un giro FG extendido en comparación con Tencon (SEQ ID NO: 1). Por lo tanto, los residuos correspondientes a los residuos 11, 14, 17, 37, 46, 73 y 86 en Tencon (SEQ ID NO: 1) son los residuos 11, 14, 17, 37, 46, 73 y 91 en los dominios de FN3 de EGFR mostrados en la Figura 1A y 1B excepto para el dominio de FN3 de la SEQ ID NO: 24, en donde los residuos correspondientes son los residuos 11, 14, 17, 38, 74 y 92 debido a una inserción de un aminoácido en el giro BC.
La divulgación también proporciona un dominio de FN3 aislado que se une específicamente a EGFR y bloquea la unión de EGF a EGFR que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ ID NO: 18-29, 107-110 o 122-137, que tiene opcionalmente sustituciones correspondientes a las sustituciones L17A, N46V y E8 6 I en Tencon (SEQ ID NO: 1).
La divulgación también proporciona un dominio de FN3 aislado que se une específicamente a c-Met y bloquea la unión de HGF a c-Met que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ ID NO: 32-49 o 111-114, que tiene opcionalmente sustituciones correspondientes a las sustituciones L17A, N46V y E8 6 I en Tencon (SEQ ID NO: 1).
La medición de la estabilidad de la proteína y la labilidad de la proteína puede verse como aspectos iguales o diferentes de la integridad de la proteína. Las proteínas son sensibles o "lábiles" a la desnaturalización provocada por el calor, por radiación ultravioleta o ionizante, cambios en la osmolaridad ambiental y pH si están en solución líquida, fuerza de cizallamiento mecánica impuesta por filtración de poros pequeños, radiación ultravioleta, radiación ionizante, como radiación gamma, deshidratación química o por calor, o cualquier otra acción o fuerza que pueda provocar la alteración de la estructura de la proteína. La estabilidad de la molécula puede determinarse usando métodos estándar. Por ejemplo, la estabilidad de una molécula puede determinarse midiendo la temperatura de fusión térmica ("TM"), la temperatura en ° Celsius (°C) a la que se despliega la mitad de las moléculas, usando métodos estándar. Típicamente, cuanto más alta es la TM, más estable es la molécula. Además del calor, el entorno químico también cambia la capacidad de la proteína para mantener una estructura tridimensional particular.
Los dominios de FN3 que se unen a EGFR o c-Met de la divulgación pueden mostrar una estabilidad aumentada en por lo menos el 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55 %, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95% o más en comparación con el mismo dominio antes del diseño medido por el aumento en la TM.
La desnaturalización química también puede medirse de igual manera mediante una variedad de métodos. Los desnaturalizantes químicos incluyen clorhidrato de guanidinio, tiocianato de guanidinio, urea, acetona, disolventes orgánicos (DMF, benceno, acetonitrilo), sales (sulfato de amonio, bromuro de litio, cloruro de litio, bromuro de sodio, cloruro de calcio, cloruro de sodio); agentes reductores (por ejemplo, ditiotreitol, betamercaptoetanol, dinitrotiobenceno, e hidruros, como borohidruro de sodio), detergentes no iónicos e iónicos, ácidos (por ejemplo, ácido clorhídrico (HCl), ácido acético (CH3COOH), ácidos acéticos halogenados), moléculas hidrófobas (por ejemplo, fosofolípidos) y desnaturalizantes dirigidos. La cuantificación de la extensión de la desnaturalización puede depender de la pérdida de una propiedad funcional, como la capacidad de unirse a una molécula objetivo, o de las propiedades fisicoquímicas, como la tendencia a la agregación, la exposición de residuos anteriormente inaccesibles a los disolventes, o la ruptura o formación de enlaces de disulfuro.
El dominio de FN3 de la divulgación que se une a EGFR o c-Met puede mostrar una estabilidad aumentada en por lo menos un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55 %, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95% o más en comparación con el mismo andamiaje antes del diseño, medido usando clorhidrato de guanidinio como un desnaturalizante químico. La estabilidad aumentada puede medirse como una función de la disminución de la fluorescencia del triptófano tras el tratamiento con concentraciones crecientes de clorhidrato de guanidina utilizando métodos bien conocidos.
Los dominios de FN3 de la divulgación pueden generarse como monómeros, dímeros o multímeros, por ejemplo, como un medio para aumentar la valencia y por lo tanto la avidez de la unión de la molécula objetivo, o para generar andamiajes bi- o multiespecíficos que unen simultáneamente dos o más moléculas objetivo diferentes. Los dímeros y multímeros pueden generarse enlazando andamiajes de estructuras de proteínas monoespecíficas, bi- o multiespecíficas, por ejemplo, mediante la inclusión de un conector de aminoácidos, por ejemplo, un conector que contiene poliglicina, glicina y serina, o alanina y prolina. El conector ejemplar incluye conectores (GS)2, (SEQ ID NO: 78), (GGGGS)5 (SEQ ID NO: 79), (AP)2 (SEQ ID NO: 80), (AP)a (SEQ ID NO: 81), (AP)-,0 (SEQ ID NO: 82), (AP)20 (s EQ ID NO: 8 3 ) y A(EAAAK)sAAa (s Eq ID NO: 84). Los dímeros y multímeros pueden estar enlazados entre sí en una dirección N- a C-. El uso de conectores de péptidos de origen natural así como artificiales para conectar polipéptidos en nuevos polipéptidos de fusión enlazados es bien conocido en la bibliografía (Hallewell et al., J. Biol Chem 264, 5260-5268, 1989; Alfthan et al., Protein Eng. 8 , 725-731, 1995; Robinson & Sauer, Biochemistry 35, 109­ 116, 1996; Patente de Estados Unidos N° 5.856.456).
Agentes biespecíficos que se unen específicamente a EGFR y c-Met
Los agentes biespecíficos que se unen específicamente a EGFR y c-Met de la invención pueden proporcionar un beneficio en términos de especificidad y toxicidad fuera del objetivo reducida cuando se comparan con inhibidores de EGFR y/o de c-Met de molécula pequeña. La presente invención se basa, al menos en parte, en el sorprendente descubrimiento de que los agentes biespecíficos que se unen específicamente a EGFR y c-Met proporcionan un efecto inhibidor sinérgico significativamente mejorado cuando se comparan con una mezcla de agentes monoespecíficos que se unen a EGFR y que se unen a c-Met. Las moléculas pueden adaptarse a afinidad específica hacia EGFR y c-Met para maximizar la penetración y retención del tumor. Los agentes biespecíficos que se unen específicamente a EGFR y c-Met proporcionan una inhibición más eficiente de las vías de señalización de EGFR y/o c-Met e inhiben el crecimiento tumoral más eficazmente que el cetuximab (Erbitux®).
Los agentes biespecíficos que se unen específicamente a EGFR y c-Met pueden formarse por cualquier polipéptido o un polipéptido multimérico que comprenda un dominio de unión a EGFR y un dominio de unión a c-Met. Los dominios de unión a EGFR y c-Met pueden ser sitios de unión al antígeno de un anticuerpo, una pareja VH/VL de un anticuerpo u otro tipo de molécula de unión tal como un dominio basado en el dominio de fibronectina tipo III (FN3), un dominio de fibronectina tipo IX (FN9), o cualquier combinación de los mismos.
Los polipéptidos de unión a EGFR y c-Met pueden derivarse de los polipéptidos de unión a EGFR y c-Met monoespecíficos existentes o pueden aislarse de novo.
Moléculas que contienen el dominio FN3 de EGFR/c/Met biespecíficas
La divulgación también proporciona una molécula que contiene el dominio de FN3 biespecífica aislado que comprende un primer dominio de fibronectina tipo III (FN3) y un segundo dominio de FN3, en donde el primer dominio de FN3 se une específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y bloquea la unión del factor de crecimiento epidérmico (EGF) a EGFR, y el segundo dominio de FN3 se une específicamente al receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (c-Met) y bloquea la unión del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) a c-Met.
Las moléculas biespecíficas del dominio de FN3 de EGFR/c-Met de la divulgación pueden generarse enlazando covalentemente cualquier dominio de FN3 de unión a EGFR y cualquier dominio de FN3 de unión a c-Met de la divulgación directamente o mediante un conector. Por lo tanto, el primer dominio de FN3 de la molécula biespecífica puede tener las características descritas anteriormente para los dominios de FN3 de unión al EGFR, y el segundo dominio de FN3 de la molécula biespecífica puede tener las características descritas anteriormente para los dominios de FN3 de unión c-Met.
El primer dominio de FN3 de la molécula que contiene el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico puede inhibir la fosforilación de EGFR inducida por EGF en el residuo de EGFR Tirosina 1173 con un valor de IC50 de menos que aproximadamente 2,5x10'6 M cuando se mide en células A431 usando 50 ng/ml de EGF humano y el segundo dominio de FN3 de la molécula que contiene el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico inhibe la fosforilación de c-Met inducida por HGF en el residuo de c-Met Tirosina 1349 con un valor de IC50 de menos que aproximadamente 1,5x10'6 M cuando se mide en células NCI-H441 usando 100 ng/ml de HGF humano.
El primer dominio de FN3 de la molécula que contiene el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico puede inhibir la fosforilación de EGFR inducida por EGF en el residuo de EGFR Tirosina 1173 con un valor de IC50 de entre aproximadamente 1,8 X10'8 M y aproximadamente 2,5x10'6 M cuando se mide en células A431 usando 50 ng/ml de EGF humano, y el segundo dominio de FN3 de la molécula que contiene el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico inhibe la fosforilación de c-Met inducida por HGF en el residuo de c-Met Tirosina 1349 con un valor de IC50 de entre aproximadamente 4x10'9 M y aproximadamente 1,5x10'6 M cuando se mide en células NCI-H441 utilizando 100 ng/ml de HGF humano.
El primer dominio de FN3 de la molécula que contiene el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico puede unirse a EGFR humano con una constante de disociación (Kd) de menos de aproximadamente 1x10'8 M, y el segundo dominio de FN3 de la molécula que contiene el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico se une a c-Met humano con una Kd de menos de aproximadamente 5 X10'8 M.
En la molécula biespecífica que se une tanto a EGFR como c-Met, el primer dominio de FN3 se une a EGFR humano con una Kd de entre aproximadamente 2x10'1° y aproximadamente 1x10'8 M, y el segundo dominio de FN3 se une a c-Met humano con un Kd de entre aproximadamente 3x10'10 y aproximadamente 5 x10'8 m.
La afinidad de la molécula de EGFR/c-Met biespecífica para EGFR y c-Met puede determinarse como se ha descrito anteriormente para las moléculas monoespecíficas.
El primer dominio de FN3 en la molécula de EGFR/c-Met biespecífica de la divulgación puede bloquear la unión de eGf a EGFR con un valor de IC50 de entre aproximadamente 1x10'9 M y aproximadamente 1,5x10'7 M en un ensayo que emplea células A431 y detecta la cantidad de fluorescencia de EGF biotinilado unido usando el conjugado de estreptavidina-ficoeritrina a 600 nM en células A431 incubadas con o sin el primer dominio de FN3. El primer dominio de FN3 en la molécula de EGFR/c-Met biespecífica de la divulgación puede bloquear la unión de EGF a EGFR en por lo menos un 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% en comparación con la unión de EGF a EGFR en ausencia de los primeros dominios de FN3 usando las mismas condiciones de ensayo.
El segundo dominio de FN3 en la molécula de EGFR/c-Met biespecífica de la divulgación puede bloquear la unión de HGF a c-Met con un valor de IC50 de entre aproximadamente 2x10'1° M y aproximadamente 6x10 ’8 M en un ensayo que detecta la inhibición de la unión de hGf biotinilado a proteína de fusión c-Met-Fc en presencia del segundo dominio de FN3. El segundo dominio de FN3 en la molécula de EGFR/c-Met biespecífica puede bloquear la unión de HGF a c-Met en por lo menos un 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% en comparación con la unión de HGF a c-Met en ausencia del segundo dominio de FN3 usando las mismas condiciones de ensayo.
La molécula de EGFR/c-Met biespecífica de la invención puede inhibir la señalización de EGFR y/o c-Met en por lo menos un 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% cuando se compara con el nivel de señalización en ausencia de la molécula de EGFR/c-Met biespecífica de la invención usando las mismas condiciones de ensayo.
La señalización de EGFR y c-Met puede medirse usando varios métodos bien conocidos como los descritos anteriormente para las moléculas monoespecíficas.
Las moléculas de EGFR/c-Met biespecíficas de la divulgación que comprenden el primer dominio de FN3 que se une específicamente a EGFR y el segundo dominio de FN3 que se une específicamente a c-Met proporcionan una inhibición sinérgica significativamente aumentada de la señalización de EGFR y c-Met y la proliferación de células tumorales en comparación con la inhibición sinérgica observada por una mezcla del primer y segundo dominio de FN3. La inhibición sinérgica puede evaluarse, por ejemplo, midiendo la inhibición de la fosforilación de ERK por las moléculas que contienen el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico y mediante una mezcla de dos moléculas monoespecíficas, una de unión a EGFR y la otra a c-Met. Las moléculas de EGFR/c-Met biespecíficas de la divulgación pueden inhibir la fosforilación de ERK con un valor de IC50 por lo menos aproximadamente 100 veces más pequeño, por ejemplo por lo menos 500, 1.000, 5.000 o 10.000 veces más pequeño cuando se comparan con el valor de IC50 para una mezcla de dos dominios de FN3 monoespecíficos, indicando por lo menos 100 veces más potencia para las moléculas que contienen el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico cuando se compara con la mezcla de dos dominios de FN3 monoespecíficos. Las moléculas que contienen el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico pueden inhibir la fosforilación de ERK con un valor de IC50 de aproximadamente 5x10'9 M o menos. La fosforilación de ERK puede medirse usando métodos estándar y métodos descritos en la presente.
La molécula que contiene el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico de la divulgación puede inhibir la proliferación de células NCI-H292 con un valor de IC50 que es por lo menos 30 veces menor cuando se compara con el valor de IC50 de inhibición del crecimiento de células NCI-H292 con una mezcla del primer dominio de FN3 y el segundo FN3, en donde la proliferación celular se induce con medio que contiene FBS al 10% suplementado con 7.5 ng/ml de HGF. La molécula biespecífica de la divulgación puede inhibir la proliferación de células tumorales con un valor de IC50 que es aproximadamente 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, o aproximadamente 1000 veces menor cuando se compara con el valor de IC50 de inhibición de la proliferación de células tumorales con una mezcla del primer dominio de FN3 y el segundo dominio de FN3. La inhibición de la proliferación de células tumorales puede medirse usando métodos estándar y métodos descritos en la presente.
La divulgación también proporciona una molécula que contiene el dominio de FN3 biespecífico que comprende un primer dominio de fibronectina tipo III (FN3) y un segundo dominio de FN3, en donde el primer dominio de FN3 se une específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y bloquea la unión del factor de crecimiento epidérmico (EGF) a EGFR, y el segundo dominio de FN3 se une específicamente al receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (c-Met), y bloquea la unión del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) a c-Met, en donde
el primer dominio de FN3 comprende
un giro FG que comprende la secuencia HNVYKDTNXgRGL (SEQ ID NO: 179) o la secuencia LGSYVFEHDVML (SEQ ID NO: 180), en donde X9 es M o I; y
un giro BC que comprende la secuencia X1X2X3X4X5X6X7X8 (SEQ ID NO: 181), en donde
X1 es A, T, G o D;
X2 es A, D, Y o W;
X3 es P, D o N;
X4 es Lo está ausente;
es D, H, R, G, Y o W;
X6 es G,
X7 es A, F, G, H o D; y
es Y,
el segundo dominio de FN3 comprende
una cadena C y un giro CD que comprenden la secuencia DSFX10IRYX11EX12X13X14X15GX16 (SEQ ID NO: 184), en donde
X10 es W, F o V;
X11 es D, F o L;
X12 es V, F o L;
X13 es V, L o T;
X14 es V, R, G, L, T o S;
X15 es G, S, A, T o K; y
X16 es E o D; y
una cadena F y un giro FG que comprenden la secuencia TEYX17VX18IX19X20V KGGX21X22SX23 (SEQ ID NO: 185), en donde
X17 es Y, W, I, V, G o A;
X18 es N, T, Q o G;
X19 es L, M, N o I;
X20 es G o S;
X21 es S, L, G, Y, T, R, H o K;
X22 es I, V o L; y
X23 es V, T, H, I, P, Yo L.
La molécula biespecífica puede comprender el primer dominio de FN3 que se une a EGFR que comprende la secuencia:
LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8DSFLIQYQESEKVGEAINLTVP GSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDTNX9RGLPLSAEFTT (SEQ ID NO: 182), o la secuencia
LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8DSFLIQYQESEKVGEAINLTVP
GSERSYDLTGLKPGTEYTYSIYGY LGSYVFEHDVMLPLSAEFTT (SEQ ID NO:
183),
en donde en las SEQ ID NO: 182 y 183;
X1 es A, T, G o D;
X2 es A, D, Y o W;
X3 es P, D o N;
X4 es L o está ausente;
X5 es D, H, R, G, Y o W;
X6 es G, D o A;
X7 es A, F, G, H o D;
X8 es Y, F o L; y
X9 es M o I.
La molécula biespecífica puede comprender el segundo dominio de FN3 que se une a c-Met que comprende la secuencia
LPAPKNLW SRVTEDSARLSW TAPDAAF DSFX10IRYX11E X12X13X14X15GX16
AIVLTVPGSERSYDLTGLKPG TEYX17VX18IX19X20VKGGX21X22SX23PLSAEFTT
(SEQ ID NO: 186),
en donde
X10 es W, F o V; y
X11 es D, F o L;
X12 es V, F o L;
X13 es V, L o T;
X14 es V, R, G, L, T o S;
X15 es G, S, A, T o K;
X16 es E o D;
X17 es Y, W, I, V, G o A;
X18 es N, T, Q o G;
X19 es L, M, N o I;
X20 es G o S;
X21 es S, L, G, Y, T, R, H o K;
X22 es I, V o L; y
X23 es V, T, H, I, P, Yo L.
Las moléculas que contienen el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecíficas ejemplares comprenden la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ ID NO: 50-72, 106, 118-121 o 138-167.
Las moléculas de EGFR/c-Met biespecíficas de la divulgación comprenden ciertas características estructurales asociadas con sus características funcionales, como la inhibición de la autofosforilación de EGFR, como el giro FG del primer dominio de FN3 que se une al EGFR que comprende la secuencia HNVYKDTNX9RGL (SEQ ID NO: 179) o la secuencia LGSYVFEHDVML (SEQ ID NO: 180), en donde X9 es M o I.
Las moléculas que contienen el dominio de FN3 de EGFR/c-Met FN3 biespecíficas de la divulgación pueden inhibir la fosforilación de EGFR inducida por EGF en los residuos de EGFR Tirosina 1173 con un valor de IC50 de menos que aproximadamente 8x10-7 M cuando se mide en células H292 utilizando 50 ng/ml de EGF humano; inhibir la fosforilación de c-Met inducida por HGF en el residuo de c-Met Tirosina 1349 con un valor de C I50 inferior a aproximadamente 8.4x10 -7M cuando se mide en células NCI-H441 usando 100 ng/ml de HGF humano;
inhibir la proliferación de células NCI-H292 inducida por HGF con un valor de IC50 de menos de aproximadamente 9,5x10-6 M en donde la proliferación celular se induce con FBS al 10% que contiene 7,5 ng de HGF;
unirse a EGFR con una Kd de menos de aproximadamente 2,0x10-8 M; o
unirse a c-Met con una Kd de menos de aproximadamente 2,0x10-8 M.
Las moléculas que contienen el dominio de FN3 de EGFR/c-Met FN3 biespecíficas de la divulgación pueden inhibir la fosforilación de EGFR inducida por EGF en los residuos de EGFR Tirosina 1173 con y IC50 de entre aproximadamente 4,2x10-9 M y 8x10-7 M cuando se mide en células H292 usando 50 ng/ml de EGF humano; inhibir la fosforilación de c-Met inducida por HGF en los residuos de c-Met Tirosina 1349 con un valor de IC50 de entre aproximadamente 2,4x10 -8M y aproximadamente 8,4x10 -7 M cuando se mide en células NCI-H441 usando 100 ng/ml de HGF humano;
inhibir la proliferación de células NCI-H292 inducida por HGF con un valor de IC50 de entre aproximadamente 2,3x10' 8 M y aproximadamente 9,5x10-6M en donde la proliferación celular se induce con FBS al 10% que contiene 7,5 ng de HGF;
unirse a EGFR con una Kd de entre aproximadamente 2x10-10 M y aproximadamente 2,0x10-8 M; o
unirse a c-Met con una Kd de entre aproximadamente 1x10-9 M y aproximadamente 2,0x10-8 M.
Las moléculas de EGFR/c-Met biespecíficas comprenden el dominio de FN3 de unión a EGFR que -puede comprender la secuencia
LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5XaX7XgDSFLIQYQESEKVGEAINLTVP GSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGV HNVYKDTNX9RGL PLSAEFTT (SEQ ID NO: 182), en donde
X1 es D;
X2 es D;
X3 es P;
X4 está ausente
es H o W;
X6 es A;
X7 es F
es Y; y
X9 es M o I; y
el dominio de FN3 de unión a c-Met que comprende la secuencia
LPAPKNLVYSRVTEDSARLSWTAPDAAF DSFXioIRYXnE X12X13X14X15GX16
AIVLTVPGSERSYDLTGLKPG TEYXnYXi sIX 19X20 VKGGX21X22SX23 PLSAEFTT
(SEQ ID NO: 186),
en donde
X10 es W;
X11 es F;
X12 es F;
X13 es V o L;
X14 es G o S;
X15 es S o K;
X16 es E o D;
X17 es V;
X18 es N
X19 es L o M;
X20 es G o S;
X21 es S o K;
X22 es I; y
X23 es P.
Las moléculas de EGFR/c-Met biespecíficas ejemplares son aquellas que tienen la secuencia mostrada en las SEQ ID NO: 57, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 y 68.
Las moléculas biespecíficas de la divulgación pueden comprender además sustituciones en una o más posiciones de residuos en el primer dominio de FN3 y/o el segundo dominio de FN3 correspondientes a las posiciones 11, 14, 17, 37, 46, 73 y 86 en Tencon (SEQ ID NO. : 1) como se ha descrito anteriormente, y una sustitución en la posición 29. Las sustituciones ejemplares son las sustituciones E11N, E14P, L17A, E37P, N46V, G73Y, E86I y D29E (numeración de acuerdo con la SEQ ID NO: 1). Los expertos en la técnica apreciarán que pueden usarse otros aminoácidos para sustituciones, como aminoácidos dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales como se describe más adelante. Las variantes generadas pueden probarse para determinar su estabilidad y unión a EGFR y/o c-Met usando los métodos de la presente.
En una realización, la molécula que contiene el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico comprende el primer dominio de FN3 que se une específicamente a EGFR y el segundo dominio de FN3 que se une específicamente a c-Met, en donde el primer dominio de FN3 comprende la secuencia:
LPAPKNLWSX24VTX25DSX26RLSWDDPX27AFYX28SFLIQYQX29SEKVGEAIX30LT VPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYX31VHNVYKDTNX32RGLPLSAX33FTT(SEQ ID NO: 187), en donde
X24 es E, N o R;
X25 es E o P;
X26 es L o A;
X27 es H o W;
X28 es E o D;
X29 es E o P;
X30 es N o V;
X31 es G o Y;
X32 es M o I; y
X33 es E oI;
y el segundo dominio de FN3 comprende la secuencia LPAPKNLVVSX34VTX35DSX36RLSWTAPDAAFDSFWIRYFX37FX38X39X40GX41AIX42 LTVPGSERSYDLTGLKPGTEYWNIX43X44VKGGX45ISPPLSAX46FTT (SEQ ID NO: 188); en donde
X34 es E, N o R;
X35 es E o P;
X36 es L o A;
X37 es E o P;
X38 es V o L;
X39 es G o S;
es S o K;
X41 es E o D;
X42 es N o V;
X43 es L o M;
X44 es G o S;
X45 es S o K; y
X46 es E o I.
La molécula que contiene el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico puede comprender el primer dominio de FN3 que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos un 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27, y el segundo dominio de FN3 que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos un 83%, 84%, 85%, 86%, 87 %, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 41.
Las moléculas que contienen el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico de la divulgación pueden adaptarse a una afinidad específica hacia EGFR y c-Met para maximizar la acumulación tumoral.
La divulgación también proporciona una molécula que contiene el dominio de FN3 biespecífico aislado que comprende un primer dominio de fibronectina tipo III (FN3) y un segundo dominio de FN3, en donde el primer dominio de FN3 se une específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y bloquea la unión del factor de crecimiento epidérmico (EGF) a EGFR, y el segundo dominio de FN3 se une específicamente al receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (c-Met), y bloquea la unión del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) a c-Met, en donde el primer dominio de FN3 y el segundo dominio de FN3 se aíslan de un biblioteca diseñada en base a la secuencia Tencon de la SEQ ID NO: 1.
La molécula que contiene el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico de la divulgación puede generarse mediante acoplamiento covalente del dominio de FN3 de unión a EGFR y el dominio de FN3 de unión a c-Met de la divulgación usando métodos bien conocidos. Los dominios de FN3 pueden enlazarse a través de un conector, por ejemplo un conector que contiene poli-glicina, glicina y serina, o alanina y prolina. El conector ejemplar incluye conectores (GS)2, (SEQ ID NO: 78), (GGGGS)s (SEQ ID NO: 79), (AP)2 (SEQ ID NO: 80), (AP)5 (SEQ ID NO: 81), (AP)10 (SEQ ID NO: 82), (AP)20(SEQ ID NO: 83), A(EAAAK)5AAA (SEQ ID NO: 84). El uso de conectores peptídicos de origen natural así como artificiales para conectar polipéptidos en nuevos polipéptidos de fusión enlazados es bien conocido en la bibliografía (Hallewell et al., J. Biol Chem 264, 5260-5268, 1989; Alfthan et al., Protein Eng. 8, 725-731, 1995; Robinson & Sauer, Biochemistry 35, 109-116, 1996; Patente de Estados Unidos N° 5.856.456). Las moléculas de EGFR/c-Met biespecíficas de la divulgación pueden estar enlazadas entre sí desde un extremo C-terminal del primer dominio de FN3 al extremo N-terminal del segundo dominio de FN3, o desde el extremo C-terminal del segundo dominio de FN3 al extremo N-terminal del primer dominio de FN3. Cualquier dominio de FN3 de unión a EGFR puede estar enlazado covalentemente a un dominio de FN3 de unión a c-Met. Los dominios de FN3 de unión a EGFR ejemplares son dominios que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ ID NO: 18-29, 107-110 y 122-137, y los dominios de FN3 de unión a c-Met ejemplares son dominios que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 32-49 y 111-114. Los dominios de FN3 de unión a EGFR para ser acoplados a una molécula biespecífica pueden comprender adicionalmente una metionina iniciadora (Met) en su extremo N-terminal.
Las variantes de las moléculas que contienen el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico están dentro del alcance de la divulgación. Por ejemplo, pueden hacerse sustituciones en la molécula que contiene el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico siempre que la variante resultante mantenga una selectividad y una potencia similares hacia EGFR y c-Met cuando se compara con la molécula original. Las modificaciones ejemplares son, por ejemplo, sustituciones conservadoras que darán como resultado variantes con características similares a las de las moléculas originales. Las sustituciones conservadoras son aquellas que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos genéticamente codificados pueden dividirse en cuatro familias: (1) ácidos (aspartato, glutamato); (2) básicos (lisina, arginina, histidina); (3) no polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano); y (4) polares no cargados (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina). La fenilalanina, el triptófano y la tirosina a veces se clasifican conjuntamente como aminoácidos aromáticos. Alternativamente, el repertorio de aminoácidos puede agruparse como (1) ácido (aspartato, glutamato); (2) básica (lisina, arginina histidina), (3) alifático (glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina), con serina y treonina opcionalmente agrupadas por separado como hidroxilo alifático; (4) aromático (fenilalanina, tirosina, triptófano); (5) amida (asparagina, glutamina); y (6) que contiene azufre (cisteína y metionina) (Stryer (ed.), Biochemistry, 2a ed., WH Freeman and Co., 1981). Pueden hacerse sustituciones no conservadoras a la molécula que contiene el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico que implica sustituciones de residuos de aminoácidos entre diferentes clases de aminoácidos para mejorar las propiedades de las moléculas biespecíficas. Puede determinarse fácilmente si un cambio en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido o un fragmento del mismo da como resultado un homólogo funcional evaluando la capacidad del polipéptido o fragmento modificado para producir una respuesta de una manera similar al polipéptido o fragmento no modificado usando los ensayos descrito en la presente. Los péptidos, polipéptidos o proteínas en los que ha tenido lugar más de un reemplazo pueden probarse fácilmente de la misma manera.
Las moléculas que contienen el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecíficas de la divulgación pueden generarse como dímeros o multímeros, por ejemplo, como un medio para aumentar la valencia y, por tanto, la avidez de la unión de la molécula objetivo. Los multímeros pueden generarse enlazando uno o más dominios de FN3 de unión a EGFR y uno o más dominios de FN3 de unión a c-Met para formar moléculas que comprenden por lo menos tres dominios de FN3 individuales que son por lo menos biespecíficos para EGFR o c-Met, para Ejemplo mediante la inclusión de un conector de aminoácidos usando métodos bien conocidos.
La divulgación también proporciona una molécula que contiene el dominio de FN3 biespecífico que comprende un primer dominio de fibronectina tipo III (FN3) y un segundo dominio de FN3, en donde el primer dominio de FN3 se une específicamente al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y bloquea la unión del factor de crecimiento epidérmico (EGF) a EGFR, y el segundo dominio de FN3 se une específicamente al receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (c-Met), y bloquea la unión del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) a c-Met que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ ID NO: 50-72,106 o 138 -165.
Fracciones que extienden la vida media
Las moléculas que contienen el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico o los dominios de FN3 que se unen a EGFR o c-Met monoespecíficos de la divulgación pueden incorporar otras subunidades, por ejemplo, a través de la interacción covalente. En un aspecto de la divulgación, las moléculas que contienen el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico de la divulgación comprenden además una fracción de extensión de la vida media. Las fracciones de extensión de la vida media ejemplares son albúmina, variantes de albúmina, proteínas y/o dominios de unión a albúmina, transferrina y fragmentos y análogos de los mismos, y regiones Fc. Un ejemplo de dominio de unión a albúmina se muestra en la SEQ ID NO: 117.
Toda o una parte de una región constante de anticuerpo puede unirse a las moléculas de la divulgación para impartir propiedades similares a anticuerpos, especialmente aquellas propiedades asociadas con la región Fc, como funciones efectoras de Fc como la unión a C1q, la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), unión al receptor Fc, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), fagocitosis, regulación descendente de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor de células B; BCR), y puede modificarse adicionalmente modificando los residuos en el Fc responsable de estas actividades (para revisión, ver Strohl, CurrOpin Biotechnol. 20, 685-691, 2009).
Pueden incorporarse fracciones adicionales en las moléculas biespecíficas de la invención como moléculas de polietilenglicol (PEG), como PEG5000 o PEG20,000, ácidos grasos y ésteres de ácidos grasos de diferentes longitudes de cadena, por ejemplo laurato, miristato, estearato, araquidato, behenato, oleato, araquidonato, ácido octanodioico, ácido tetradecanodioico, ácido octadecanodioico, ácido docosanodioico y similares, polilisina, octano, carbohidratos (dextrano, celulosa, oligo- o polisacáridos) para las propiedades deseadas. Estas fracciones pueden ser fusiones directas con las secuencias que codifican el andamiaje de proteínas y pueden generarse mediante técnicas estándar de clonación y expresión. Alternativamente, pueden usarse métodos de acoplamiento químico bien conocidos para unir las fracciones a moléculas producidas de manera recombinante de la invención.
Por ejemplo, puede añadirse una fracción pegilo a las moléculas biespecíficas de la invención incorporando un residuo de cisteína al extremo C-terminal de la molécula y uniendo un grupo pegilo a la cisteína usando métodos bien conocidos. Las moléculas biespecíficas ejemplares con la cisteína C-terminal son aquellas que tienen la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID nO: 170-178.
Las moléculas biespecíficas de la invención que incorporan fracciones adicionales pueden compararse por su funcionalidad mediante varios ensayos bien conocidos. Por ejemplo, las propiedades alteradas de las moléculas biespecíficas debidas a la incorporación de dominios Fc y/o variantes de dominios Fc pueden ensayarse en ensayos de unión al receptor Fc usando formas solubles de los receptores, como los receptores FcyRI, FcyRII, FcyRIII o FcRn, o bien usando ensayos basados en células bien conocidos que miden, por ejemplo, ADCC o CDC, o evaluando las propiedades farmacocinéticas de las moléculas de la invención en modelos in vivo.
Polinucleótidos, vectores, células huésped.
La divulgación proporciona ácidos nucleicos que codifican los dominios de FN3 de unión a EGFR o unión a c-Met o las moléculas que contienen el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico de la divulgación como polinucleótidos aislados o como partes de vectores de expresión o como partes de secuencias de ADN lineal, incluyendo secuencias de ADN lineal usadas para la transcripción/traducción in vitro, vectores compatibles con expresión de fagos procariotas, eucariotas o filamentosos, secreción y/o presentación de las composiciones o mutágenos dirigidos de las mismas. En la presente se divulgan ciertos polinucleótidos ejemplares, sin embargo, otros polinucleótidos que, dada la degeneración del código genético o las preferencias de codones en un sistema de expresión dado, codifican los dominios de FN3 de unión a EGFR o unión a c-Met o el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico que contiene moléculas de la divulgación también están dentro del alcance de la divulgación.
La divulgación también proporciona un polinucleótido aislado que codifica el dominio de FN3 que se une específicamente a EGFR que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 18-29, 107-110 o 122-137.
La divulgación también proporciona un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de polinucleótidos de las SEQ ID NO: 97-98 o 168-169.
La divulgación también proporciona un polinucleótido aislado que codifica el dominio de FN3 que se une específicamente a c-Met que tiene la secuencia de aminoácidos de la secuencia mostrada en las SEQ ID NO: 32-49 o 111-114.
La divulgación también proporciona un polinucleótido aislado que codifica la molécula que contiene el dominio de FN3 de EGFR/-c-Met biespecífico que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO: 50-72, 106, 118-121 o 138-165.
La divulgación también proporciona un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de polinucleótidos de las SEQ ID NO: 115-116 o 166-167.
Los polinucleótidos de la invención pueden producirse mediante síntesis química tal como síntesis de polinucleótidos en fase sólida en un sintetizador de polinucleótidos automatizado y ensamblarse en moléculas completas de cadena sencilla o doble. Alternativamente, los polinucleótidos de la invención pueden producirse mediante otras técnicas como PCR seguida de clonación de rutina. Las técnicas para producir u obtener polinucleótidos de una secuencia conocida dada son bien conocidas en la técnica.
Los polinucleótidos de la invención pueden comprender por lo menos una secuencia no codificante, como una secuencia promotora o potenciadora, intrón, señal de poliadenilación, una secuencia cis que facilita la unión de RepA, y similares. Las secuencias de polinucleótidos también pueden comprender secuencias adicionales que codifican aminoácidos adicionales que codifican, por ejemplo, un marcador o una secuencia de etiqueta como una etiqueta de histidina o una etiqueta de HA para facilitar la purificación o detección de la proteína, una secuencia señal, un compañero de proteína de fusión, como RepA, Fc o proteína de cubierta de bacteriófagos como pIX o pIII.
Otra realización de la invención es un vector que comprende por lo menos un polinucleótido de la invención. Tales vectores pueden ser vectores de plásmidos, vectores virales, vectores para la expresión de baculovirus, vectores basados en transposones o cualquier otro vector adecuado para la introducción de los polinucleótidos de la invención en un organismo determinado o antecedente genético por cualquier medio. Tales vectores pueden ser vectores de expresión que comprenden elementos de secuencias de ácido nucleico que pueden controlar, regular, provocar permitir la expresión de un polipéptido codificado por dicho vector. Tales elementos pueden comprender sitios de unión al potenciador transcripcional, sitios de iniciación de la ARN polimerasa, sitios de unión a ribosomas y otros sitios que facilitan la expresión de polipéptidos codificados en un sistema de expresión dado. Tales sistemas de expresión pueden ser sistemas basados en células o libres de células bien conocidos en la técnica.
Otra realización de la invención es una célula huésped que comprende el vector de la invención. Una molécula que contiene el dominio FN3 de unión a EGFR o c-Met monoespecífico o el dominio de FN3 de unión a EGFR/c-Met biespecífico de la divulgación puede producirse opcionalmente por una línea celular, una línea celular mixta, una célula inmortalizada o una población clonal de células inmortalizadas, como es bien conocido en la técnica. Ver, por ejemplo, Ausubel, et al., Ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edición, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow y Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001).
La célula huésped elegida para la expresión puede ser de origen mamífero o puede seleccionarse de células COS-1, COS-7, HEK293, Bh K21, CHO, BSC-1, He G2, SP2/0, HeLa, mieloma, linfoma, levadura, de insecto o vegetales, o cualquier derivado, célula inmortalizada o transformada de las mismas. Alternativamente, la célula huésped puede seleccionarse de una especie u organismo incapaz de glicosilar polipéptidos, por ejemplo, una célula u organismo procariota, como BL21, BL21(DE3), BL21-GOLD(DE3), XL1-Blue, JM109, HMS174, HMS174(DE3), y cualquiera de las cepas de E. coli spp, Klebsiella spp. o Pseudomonas spp naturales o diseñadas.
La divulgación también proporciona un método para producir el dominio de FN3 aislado que se une específicamente a EGFR o c-Met de la divulgación o la molécula que contiene el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico aislado de la divulgación, que comprende cultivar la célula huésped aislada de la divulgación bajo condiciones tales que el dominio de FN3 aislado que se une específicamente a EGFR o c-Met o la molécula que contiene el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico aislado se expresa, y purifica el dominio o la molécula.
El dominio de FN3 que se une específicamente a EGFR o c-Met o la molécula que contiene el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico aislado de la divulgación puede purificarse a partir de cultivos celulares recombinantes mediante métodos bien conocidos, por ejemplo mediante purificación de proteína A, precipitación de sulfato de amonio o etanol, extracción de ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía por afinidad, cromatografía de hidroxilapatita y cromatografía de lectina, o cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
Anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos
Los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos se pueden generar de novo o pueden diseñarse a partir de los anticuerpos anti-EGFR y anti-c-Met monoespecíficos existentes.
Anticuerpos anti-EGFR ejemplares que se pueden usar para diseñar moléculas biespecíficas son, por ejemplo, panitumumab (ABX-EGF), nimotuzumab, necitumumab, matuzumab, y los descritos por ejemplo en: Patente de Estados Unidos N° US7.595.378, Patente de Estados Unidos N° US7.247.301, Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2011/0256142, Patente de Estados Unidos N° US5.891.996, Patente de Estados Unidos N° US5.212.290, Patente de Estados Unidos N° US5.558.864, o Patente de Estados Unidos N° US7.589.180. Por ejemplo, puede usarse el dominio de VH del anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 18 9 o 191 y el dominio de VL del anticuerpo que tiene las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID NO: 190 o 192.
Anticuerpos anti-c-Met ejemplares que pueden usarse para diseñar moléculas biespecíficas son, por ejemplo, Rilotumumab, Onartuzumab, Ficlatuzumab y los descritos, por ejemplo, en la Publicación Internacional de PCT N° WO2011/110642, Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2004/0166544, Publicación Internacional de PCT N° WO2005/016382 o Publicación Internacional de PCT N° WO2006/015371. Por ejemplo, pueden usarse el dominio de VH del anticuerpo que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID nO: 193 o 195 y el dominio de VL del anticuerpo que tiene las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID NO: 194 o 196. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos identificados por sus Nombres Adoptados en los Estados Unidos (USAN) están disponibles a través de la American Medical Association en http://_www_ama-assn_org o a través del registro CAS.
Los dominios variables de unión a EGFR y c-Met monoespecíficos pueden seleccionarse de novo, por ejemplo, de una biblioteca de presentación de fagos, donde el fago está diseñado para expresar inmunoglobulinas humanas o porciones de las mismas como Fabs, anticuerpos de cadena sencilla (scFv) o regiones variables de anticuerpos no emparejadas o emparejadas. (Knappik et al., J Mol Biol 296:57-86, 2000; Krebs et al., J Immunol Meth 254:67-84, 2001; Vaughan et al., Nature Biotechnology 14:309-314, 1996; Sheets et al., PITAS (USA) 95:6157-6162, 1998; Hoogenboom y Winter, J Mol Biol 227:381, 1991; Marks et al., J Mol Biol 222:581, 1991), y posteriormente diseñado en un formato biespecífico. Los dominios variables de unión a EGFR y c-Met monoespecíficos pueden aislarse, por ejemplo, de bibliotecas de expresión de fagos que expresan regiones variables de la cadena ligera y pesada del anticuerpo como proteínas de fusión con proteína de revestimiento pIX de bacteriófago como se describe en Shi et al (2010) J. Mol. Biol. 397: 385-96 y la Publicación Internacional de PCT N° WO09/085462). Las bibliotecas de anticuerpos se examinan para determinar la unión a los dominios extracelulares de EGFR o c-Met humano y los clones positivos obtenidos se caracterizan adicionalmente y los Fab se aíslan de los lisados de los clones. Tales métodos de presentación de fagos para aislar anticuerpos humanos están establecidos en la técnica. Ver por ejemplo Patente de Estados Unidos N° 5.223.409; Patente de Estados Unidos N° 5.403.484; y Patente de Estados Unidos N° 5.571.698, Patente de Estados Unidos N° 5.427.908, Patente de Estados Unidos N° 5,580.717, Patente de Estados Unidos N° 5.969.108, Patente de Estados Unidos N° 6.172.197, Patente de Estados Unidos N° 5.885.793; Patente de Estados Unidos N° 6.521.404; Patente de Estados Unidos N° 6.544.731; Patente de Estados Unidos N° 6.555.313; Patente de Estados Unidos N° 6.582.915 and US Pat. No. 6,593,081. Las regiones variables de novo obtenidas que se unen a EGFR o c-Met se diseñan para formatos biespecíficos usando los métodos descritos en la presente.
Formatos de anticuerpos biespecíficos
Los anticuerpos de la presente invención tienen dos o más sitios de unión al antígeno y son biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos de la invención incluyen anticuerpos que tienen una estructura de anticuerpo de longitud completa.
"Anticuerpo de longitud completa" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo que tiene dos cadenas pesadas de anticuerpo de longitud completa y dos cadenas ligeras de anticuerpo de longitud completa. Una cadena pesada (HC) de anticuerpo de longitud completa consiste de los dominios constante y variable de la cadena pesada VH, CH1, CH2 y CH3 bien conocidos. Una cadena ligera (LC)de anticuerpo de longitud completa consiste de los dominios constante y variable VL y CL de la cadena ligera bien conocidos. El anticuerpo de longitud completa puede carecer de la lisina C-terminal (K) en una o ambas cadenas pesadas.
El término "brazo Fab" o "media molécula" se refiere a una pareja de cadena pesada-cadena ligera que se une específicamente a un antígeno.
Los anticuerpos biespecíficos de longitud completa de la invención pueden generarse, por ejemplo, utilizando un intercambio de brazo Fab (o intercambio de media molécula) entre dos anticuerpos bivalentes monoespecíficos introduciendo sustituciones en la interfaz CH3 de la cadena pesada en cada media molécula para favorecer la formación de heterodímeros de dos medias moléculas de anticuerpo que tienen especificidad diferente ya sea in vitro en un entorno libre de células o usando coexpresión. La reacción de intercambio del brazo Fab es el resultado de una reacción de isomerización de enlaces disulfuro y disociación-asociación de los dominios CH3. Se reducen los enlaces disulfuro de la cadena pesada en las regiones bisagra de los anticuerpos monoespecíficos originales. Las cisteínas libres resultantes de uno de los anticuerpos monoespecíficos originales forman un enlace disulfuro inter cadena pesada con residuos de cisteína de una segunda molécula de anticuerpo monoespecífico original y simultáneamente los dominios CH3 de los anticuerpos originales se liberan y se reforman por disociaciónasociación. Los dominios CH3 de los brazos Fab pueden diseñarse para favorecer la heterodimerización sobre la homodimerización. El producto resultante es un anticuerpo biespecífico que tiene dos brazos Fab o medias moléculas, cada uno de los cuales se une a un epítopo distinto, es decir, un epítopo en EGFR y un epítopo en c-Met.
"Homodimerización" como se usa en la presente se refiere a una interacción de dos cadenas pesadas que tienen secuencias de aminoácidos de CH3 idénticas. "Homodímero", como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo que tiene dos cadenas pesadas con secuencias de aminoácidos de CH3 idénticas.
"Heterodimerización" como se usa en la presente se refiere a una interacción de dos cadenas pesadas que tienen secuencias de aminoácidos de CH3 no idénticas. "Heterodímero", como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo que tiene dos cadenas pesadas con secuencias de aminoácidos de CH3 no idénticas.
La estrategia "botón en el agujero" (ver, por ejemplo, Publicación Internacional de PCT N° WO 2006/028936) puede usarse para generar anticuerpos biespecíficos de longitud completa. Brevemente, los aminoácidos seleccionados que forman la interfaz de los dominios CH3 en la IgG humana pueden mutarse en las posiciones que afectan las interacciones del dominio CH3 para promover la formación de heterodímeros. Un aminoácido con una cadena lateral pequeña (agujero) se introduce en una cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un primer antígeno y un aminoácido con una cadena lateral grande (botón) se introduce en una cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un segundo antígeno. Después de la coexpresión de los dos anticuerpos, se forma un heterodímero como resultado de la interacción preferencial de la cadena pesada con un "agujero" con la cadena pesada con una "botón". Las parejas de sustitución de CH3 ejemplares que forman un botón y un agujero son (expresadas como posición modificada en el primer dominio CH3 de la primera cadena pesada/posición modificada en el segundo dominio CH3 de la segunda cadena pesada): T366Y/F405A, T366W/F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S y T366W/T366S_L368A_Y407V.
Se pueden usar otras estrategias, como promover la heterodimerización de la cadena pesada utilizando interacciones electrostáticas sustituyendo residuos cargados positivamente en una superficie de CH3 y residuos cargados negativamente en una segunda superficie de CH3, como se describe en la Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2010/0015133 ; Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2009/0182127; Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2010/028637 o la Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2011/0123532. En otras estrategias, la heterodimerización puede promoverse mediante las siguientes sustituciones (expresadas como posición modificada en el primer dominio CH3 de la primera cadena pesada/posición modificada en el segundo dominio CH3 de la segunda cadena pesada): L351Y_F405A_Y407V/T394W, T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V, T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V_K409F, Y407A/T366A_K409F, o T350V_L351Y_F405A_Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W como se describe en la Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2012/0149876 o la Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2013/0195849.
Además de los métodos descritos anteriormente, los anticuerpos biespecíficos de la invención pueden generarse in vitro en un entorno libre de células introduciendo mutaciones asimétricas en las regiones CH3 de dos anticuerpos homodiméricos monoespecíficos y formando el anticuerpo heterodimérico biespecífico de dos anticuerpos homodímeros monoespecíficos originales en las condiciones de reducción para permitir la isomerización del enlace disulfuro de acuerdo con los métodos descritos en la Publicación de Patente Internacional N° WO2011/131746. En los métodos, el primer anticuerpo bivalente monoespecífico (por ejemplo, anticuerpo anti-c-Met) y el segundo anticuerpo bivalente monoespecífico (por ejemplo, anticuerpo anti-EGFR) están diseñados para tener ciertas sustituciones en el dominio CH3 de la estabilidad del heterodímero promotor; los anticuerpos se incuban juntos en condiciones reductoras suficientes para permitir que las cisteínas en la región bisagra experimenten una isomerización de enlaces disulfuro; generando de este modo el anticuerpo biespecífico por intercambio de brazo Fab. Las condiciones de incubación pueden restaurarse óptimamente a no reductoras. Agentes reductores ejemplares que pueden usarse son 2-mercaptoetilamina (2-MEA), ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE), glutatión, tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP), L-cisteína y beta-mercaptoetanol, preferiblemente un agente reductor seleccionado del grupo que consiste de: 2-mercaptoetilamina, ditiotreitol y tris(2-carboxietil)fosfina. Por ejemplo, puede usarse la incubación durante al menos 90 minutos a una temperatura de por lo menos 20° C en presencia de por lo menos 25 mM de 2-MEA o en presencia de por lo menos 0,5 mM de ditiotreitol a un pH de 5 a 8, por ejemplo a un pH de 7.0 o un pH de 7.4.
Anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos
Los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos de la invención pueden proporcionar un beneficio en términos de especificidad y toxicidad fuera del objetivo reducida cuando se comparan con inhibidores de EGFR y/o de c-Met de molécula pequeña. La presente invención se basa, por lo menos en parte, en el sorprendente descubrimiento de que los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos de la invención proporcionan un efecto inhibidor sinérgico significativamente mejorado cuando se comparan con una mezcla de anticuerpos monoespecíficos de unión a EGFR y de unión a c-Met o anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos publicados. Dependiendo del ensayo, el efecto sinérgico observado varió entre aproximadamente 14 y aproximadamente 800 veces. Los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos de la invención proporcionan una inhibición más eficiente de las vías de señalización de EGFR y c-Met e inhiben el crecimiento tumoral más eficazmente que el cetuximab (Erbitux®). Los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos de la invención inhiben la señalización de EGFR en tumores y/o ines de células tumorales que tienen mutaciones de activación de EGFR y/o mutaciones en EGFR que se sabe dan como resultado la resistencia a tratamientos con inhibidores de tirosina quinasa como gefitinib e inhiben la vía de señalización de c-Met, una vía identificada como regulada por incremento y que proporciona una señalización compensatoria en el tratamiento con inhibidores de la tirosina quinasa de EGFr en cánceres como NSCLC. Los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos de la invención, además de inhibir directamente la señalización de EGFR y c-Met, muestran actividad antitumoral a través de una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) mejorada y la degradación de los receptores de EGFR y c-Met. Al contrario que las terapias actuales con EGFR (cetuximab y panitumumab), los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos de la invención inducen, a través de ADCC mejorada, la muerte de células tumorales que tienen mutaciones KRAS.
La Publicación de Patente Internacional N° WO2010/115551 describe un anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico (BSAB01) diseñado en un formato IgG-scFv usando la pareja VH/VL de unión a EGFR de cetuximab de EGFR, y la pareja VH/VL de unión a EGFR de un anticuerpo 5D5 (MetMab, onartuzumab) actualmente en ensayos de Fase III. BSAB01 demuestra una inhibición aumentada aproximadamente de dos veces (aditiva) de la proliferación de células A431 en comparación con los anticuerpos originales (Ejemplo 7,Figura 8b en la WO2010/115551), y una modesta inhibición aditiva de la proliferación de células Ovarc-8 (Figura 10a, Ejemplo 16 en la WO2010/115551) en comparación con la combinación de los dos anticuerpos originales (15% frente a 10% de inhibición). Por lo tanto, sorprendente e inesperadamente, la presente invención proporciona anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos que demuestran un efecto sinérgico significativo en la inhibición de la señalización de EGFR y c-Met, la supervivencia de células cancerosas y el crecimiento tumoral. Al no querer limitarse a ninguna teoría, se cree que el efecto sinérgico significativo de los anticuerpos biespecíficos de la invención se debe, por lo menos en parte, a la especificidad del epítopo de ambos brazos de unión de EGFR y c-Met, posiblemente dando como resultado la inhibición de la señalización a través no solo de los homodímeros de EGFR y c-Met, sino también de los heterodímeros de EGFR/HERx.
Una realización de la invención es un anticuerpo del receptor del factor de crecimiento epidérmico biespecífico (EGFR)/receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (c-Met) aislado, que comprende:
a) una primera cadena pesada (HC1) que comprende un dominio constante 3 de HC1 (HC1 CH3) y una región variable 1 de HC1 (VH1);
b) una segunda cadena pesada (HC2) que comprende un dominio constante 3 de HC2 (HC2 CH3) y una región variable 2 de HC2 (VH2);
c) una primera cadena ligera (LC1) que comprende una región variable de cadena ligera 1 (VL1); y una segunda cadena ligera (LC2) que comprende una región variable de cadena ligera 2 (VL2),
en donde la VH1 y la pareja de VL1 forman un primer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a EGFR y el VH2 y la pareja de VL2 forman un segundo sitio de unión al antígeno que se une específicamente a c-Met, en donde la HCl comprende por lo menos una sustitución en la HC1 CH3 y la HC2 comprenden por lo menos una sustitución en la HC2 CH3, en donde la sustitución en la HC1 CH3 y la sustitución en la HC2 CH3 se producen en diferentes posiciones de residuos de aminoácidos, cuando la numeración de residuos es de acuerdo con el índice de la UE,
en donde: i)
i) la VH1 comprende las secuencias de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR) 1 (HCDR1), HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 210, 211 y 212, respectivamente; y
ii) la VL1 comprende las secuencias de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR) 1 (LCDR1), LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 213, 214 y 215, respectivamente; y
iii) la VH2 comprende las secuencias de aminoácidos de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 216, 217 y 218, respectivamente; y
iv) la VL2 comprende las secuencias de aminoácidos de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 219, 220 y 221, respectivamente.
En algunas realizaciones descritas en la presente, el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico inhibe la fosforilación de las quinasas relacionadas con la señal extracelular 1 y 2 (ERK1/2) en la línea celular NCI-H292, NCI-H1975 o SKMES-1 con un valor de IC50 que es por lo menos aproximadamente 10 veces menos, por lo menos aproximadamente 20 veces menos, por lo menos aproximadamente 30 veces menos, por lo menos aproximadamente 40 veces menos, por lo menos aproximadamente 50 veces menos o por lo menos aproximadamente 60 veces menos cuando se compara con el valor de IC50 de la inhibición de la fosforilación de la línea celular ERK1/2 in NCI-H292, NCI-H1975 o SKMES-1 con una mezcla de un anticuerpo de EGFR monovalente de control que comprende una cadena pesada 3 (HC3) y una cadena ligera 3 (LC3) y un anticuerpo de c-Met monovalente de control que comprende una cadena pesada 4 (HC4) y una cadena ligera 4 (LC4), en donde la HC3 y la HC1, la LC3 y la LC1 , la HC4 y la HC2, y la LC4 y la LC2 tienen secuencias de aminoácidos idénticas, respectivamente, y la fosforilación de ERK1/2 se mide en lisados de células completas usando un inmunoensayo de sándwich que usa un anticuerpo anti-fosfoERK1/2 como un anticuerpo de captura y un anticuerpo que se une a ERK1/2 no fosforilado y fosforilado conjugado con un compuesto electroquimioluminiscente como un anticuerpo de detección. Los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos de la invención proporcionan una inhibición sinérgica más pronunciada de la señalización de EGFR y c-Met en comparación con la combinación de anticuerpos de EGFR monoespecíficos y anticuerpos de c-Met monoespecíficos, cuando la inhibición se evalúa mediante la inhibición de la fosforilacion de ERK1/2. Dicho anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico ejemplar es el anticuerpo EM1-mAb de la invención.
"Anticuerpo de EGFR monoespecífico de control", como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo que tiene un primer brazo Fab que se une a EGFR que es idéntico en la secuencia de aminoácidos al brazo Fab de unión a EGFR del anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico a probar, y tiene un segundo brazo Fab que es "inerte" y se une a un antígeno no relacionado/irrelevante, el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) gp120. El segundo brazo Fab tiene una cadena ligera que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 209 y una cadena pesada que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 198 en casos en los que el brazo Fab de unión a EGFR en el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico a probar comprende la sustitución F405L. El segundo brazo Fab tiene una cadena ligera que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 209 y una cadena pesada que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 197 en casos en los que el brazo Fab de unión a EGFR en el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico a probar comprende la sustitución K409R.
"Anticuerpo c-Met monoespecífico de control " como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo que tiene un primer brazo Fab que se une a c-Met que es idéntico en la secuencia de aminoácidos al brazo Fab que se une a c-Met del anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico a probar, y tiene un segundo brazo Fab que es "inerte" y se une al antígeno no relacionado/irrelevante VIH gp120. El segundo brazo Fab Fab tiene una cadena ligera que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 209 y una cadena pesada que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 198 en casos en los que el brazo Fab que se une a c-Met en el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico a probar comprende la sustitución F405L. El segundo brazo Fab inerte tiene una cadena ligera que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 209 y una cadena pesada que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 197 en casos en los que el brazo Fab de unión a EGFR en el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico a probar comprende la sustitución K409R
En algunas realizaciones descritas en la presente, el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico inhibe la fosforilación de ERK1/2 con un valor de IC50 de aproximadamente 2x10'9 M o menos, aproximadamente 1x10'9 M o menos, o alrededor de 1x10'1° M o menos .
En algunas realizaciones descritas en la presente, ERK1 se fosforila en los residuos Thr202 y Tyr204, y ERK2 se fosforila en los residuos Thr185 y Tyr197.
En algunas realizaciones descritas en la presente, el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico inhibe la fosforilación de la proteína quinasa B (AKT) en Ser473 en la línea celular NCI-H1975 con un valor de IC50 que es por lo menos aproximadamente 70 veces menos cuando se compara con el valor de IC50 de la inhibición de la fosforilación de AKT en Ser473 en la línea celular NCI-H1975 con la mezcla del anticuerpo de EGFR monovalente de control que comprende la HC3 y la LC3 y el anticuerpo de c-Met monovalente de control que comprende la HC4 y la LC4, en donde la HC3 y la HC1 , la LC3 y la LC1, la HC4 y la HC2, y la LC4 y la LC2 tienen secuencias de aminoácidos idénticas, respectivamente, en donde la fosforilación de AKT en Ser473 se mide en lisados de células completas usando un inmunoensayo de tipo sándwich usando una unión de anticuerpos a AKT no fosforilado y fosforilado como un anticuerpo de captura y un anticuerpo anti-fosfoAKT Ser473 conjugado con un compuesto electroquimioluminiscente como un anticuerpo de detección.
En algunas realizaciones descritas en la presente, el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico inhibe la fosforilación de la proteína quinasa B (AKT) en Thr308 en la línea celular NCI-H1975 con un valor de IC50 que es por lo menos aproximadamente 100 veces menos cuando se compara con valor de IC50 de la inhibición de la fosforilación de AKT en Thr308 en la línea celular NCI-H1975 con la mezcla del anticuerpo de EGFR monovalente de control que comprende la HC3 y la LC3 y el anticuerpo de c-Met monovalente de control que comprende la HC4 y la LC4, en donde la HC3 y la HC1, la LC3 y la LC1, la HC4 y la HC2, y la LC4 y la Lc2 tienen secuencias de aminoácidos idénticas, respectivamente, en donde la fosforilación de AKT en Thr308 se mide en lisados de células completas usando un inmunoensayo de tipo sándwich usando una unión de anticuerpos a AKT no fosforilado y fosforilado como un anticuerpo de captura y un anticuerpo anti-fosfoAKT Thr308 conjugado con un compuesto electroquimioluminiscente como un anticuerpo de detección.
Los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos de la invención proporcionan una inhibición sinérgica más pronunciada de la señalización de EGFR y c-Met cuando se comparan con la combinación de anticuerpos de EGFR monoespecíficos y anticuerpos de c-Met monoespecíficos, cuando la inhibición se evalúa mediante la inhibición de la fosforilación de AKT. Dicho anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico ejemplar es el anticuerpo EM1-mAb de la invención.
En algunas realizaciones descritas en la presente, el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico inhibe la fosforilación de AKT en Ser473 o en Thr308 con un valor de IC50 de aproximadamente 1x10'9 M o menos.
En algunas realizaciones descritas en la presente, el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico se une a EGFR de la SEQ ID NO: 73 en los residuos EGFR K489, 1491, K467 y S492 y a c-Met en los residuos PEFRDSYPIKYVHAF (SEQ ID NO: 238) y FAQSKPDSAEPMDRSA (SEQ ID NO: 239). Tal anticuerpo biespecífico de este tipo es el EM1-mAb. El anticuerpo EM-1 biespecífico se une a EGFR y c-Met en distintos epítopos cuando se compara con el anticuerpo BSAB01 como se ha descrito anteriormente y en la Publicación de Patente Internacional N° WO2010/115551. El brazo de unión al EGFR original (cetuximab) de BSAB01 se une a los residuos de aminoácidos del EGFR R353, Q384, Q408, H409, F412, S418, S440, K443, K465, 1467, S468, y N473 en EGFR maduro, correspondiente a los residuosR367, Q408, Q432, H433, F436, S442, S464, K467, K4 8 9 , 1491, S492 y N497 de EGFR de longitud completa de la SEQ ID NO: 73 (Li et al., Cancer Cell 7: 301-311, 2005). El brazo de unión c-Met original de BSAB01 (mAb 5D5) se une a los residuos de c-Met 325-340 PGAQLARQIGASLNDD (SEQ ID NO: 240). El mapeo de epítopos del anticuerpo original de unión a EGFR (2F8) del EM1-mAb se describe en la Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2011/0256142A1 . El cetuximab y el anticuerpo original 2F8 se unen a epítopos parcialmente superpuestos pero distintos.
El mapeo de epítopos se puede hacer usando métodos estándar. Por ejemplo, cuando se conocen las estructuras de ambos componentes individuales, se puede realizar un acoplamiento proteína-proteína in silico para identificar sitios compatibles de interacción. El intercambio de hidrógeno-deuterio (H/D) se puede llevar a cabo con el complejo de antígeno y anticuerpo para mapear regiones en el antígeno que pueden estar unidas por el anticuerpo. La mutagénesis segmentaria y puntual del antígeno se puede usar para localizar los aminoácidos importantes para la unión del anticuerpo.
En algunas realizaciones descritas en la presente, el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico neutraliza la señalización de EGFR y c-Met.
El anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico de la invención puede neutralizar la señalización de EGFR y c-Met en por lo menos un 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75 %, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% en comparación con el nivel de señalización en ausencia de la molécula de EGFR/c-Met biespecífica de la invención usando las mismas condiciones de ensayo.
La unión de un ligando como EGF a EGFR estimula la dimerización del receptor, la autofosforilación, la activación del receptor interno, el dominio citoplasmático de la tirosina quinasa y el inicio de múltiples vías de transducción de señales y de transactivación implicadas en la regulación de la síntesis de ADN (activación del gen) y la progresión o división del ciclo celular. La neutralización de la señalización de EGFR puede dar como resultado la inhibición de una o más vías de señalización descendentes de EGFR y, por lo tanto, la neutralización de EGFR puede tener varios efectos, incluyendo la inhibición de la proliferación y diferenciación celular, angiogénesis, motilidad celular y metástasis, y la inhibición de las vías de señalización descendentes.
La señalización de EGFR y la neutralización de la señalización de EGFR pueden medirse usando varios métodos bien conocidos, por ejemplo midiendo la autofosforilación del receptor en cualquiera de las tirosinas Y1068, Y1148 e Y1173 (Downward et al., Nature 311:483-5, 1984) y/o fosforilación de sustratos naturales o sintéticos, e inhibición de la autofosforilación y/o fosforilación de sustratos naturales o sintéticos por los anticuerpos biespecíficos de la invención. La fosforilación puede detectarse usando métodos bien conocidos, como un ensayo ELISA o una transferencia western usando un anticuerpo específico de fosfotirosina. Se pueden encontrar ensayos ejemplares en Panek et al., J Pharmacol Exp Thera 283:1433-44, 1997 y Batley et al., Life Sci 62: 143-50, 1998, y como se describe en la presente.
La unión de HGF a c-Met estimula la dimerización del receptor, la autofosforilación, la activación del dominio de tirosina quinasa citoplasmático del receptor y el inicio de múltiples vías de transducción de señales y de transactivación implicadas en la regulación de la síntesis del ADN (activación genética) y la progresión o división del ciclo celular. La inhibición de la señalización de c-Met puede dar como resultado la inhibición en una o más vías de señalización descendentes de c-Met y, por lo tanto, la neutralización de c-Met puede tener varios efectos, incluyendo la inhibición de la proliferación y diferenciación celular, la angiogénesis, la motilidad celular y la metástasis.
La señalización y neutralización de c-Met de la señalización de c-Met puede medirse usando varios métodos bien conocidos, por ejemplo midiendo la autofosforilación del receptor en por lo menos uno de los residuos de tirosina Y1230, Y1234, Y1235 o Y1349, y/o la fosforilación de sustratos naturales o sintéticos. La fosforilación puede detectarse, por ejemplo, usando un anticuerpo específico para la fosfotirosina en un ensayo ELISA o en una transferencia Western. Se pueden encontrar ensayos ejemplares en Panek et al., J Pharmacol Exp Thera 283:1433-44, 1997 y Batley et al., Life Sci 62: 143-50, 1998, y como se describe en la presente.
La señalización de EGFR y c-Met puede medirse usando varios métodos bien conocidos, como se describe en la presente, como la medición de la inhibición de la fosforilación de ERK1/2 y AKT. La inhibición de la fosforilación de ERK1 en Thr202 y Tyr204 y la de la fosforilación de ERK2 en Thr185 y Tyr187 y la inhibición de AKT en Ser473 o Thr308 pueden medirse, por ejemplo, en lisados de células NCI-H1975 utilizando un ensayo de sándwich con anticuerpo de captura recubierto sobre un soporte sólido y la detección de anticuerpo conjugado con un compuesto electroquimioluminiscente como el marcador Discover Meso Scale (MSD) SULFO-TAG, seguido de la detección de la señal con un lector de placas.
En algunas realizaciones descritas en la presente, el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico inhibe el crecimiento de las células NCI-H292 o NCI-H1975 con un valor de IC50 que es por lo menos aproximadamente 300 veces menos, por lo menos aproximadamente 400 veces menos, por lo menos aproximadamente 500 veces menos, por lo menos aproximadamente 600 veces menos, por lo menos aproximadamente 700 veces menos o por lo menos aproximadamente 800 veces menos cuando se compara con el valor de IC50 de inhibición del crecimiento de células NCI-H292 o NCI-H1975 con cetuximab, cuando las células NCI-H292 o NCI-H1975 se cultivan en condiciones de unión baja.
La inhibición del crecimiento celular puede evaluarse por métodos conocidos. Por ejemplo, las células pueden colocarse en placas recubiertas con hidrogeles o polímeros biomiméticos (por ejemplo, placas de unión ultra baja de Corning) para prevenir o reducir la unión celular, y el efecto de los anticuerpos sobre el crecimiento celular inducido por 7,5 ng/ml de HGF puede evaluarse midiendo el porcentaje de viabilidad celular después de la incubación durante 72 horas usando métodos estándar.
Los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos de la invención proporcionan una inhibición sinérgica más pronunciada de las células cancerosas que expresan EGFR y/o c-Met cuando se comparan con la combinación de anticuerpos de EGFR monoespecíficos y anticuerpos de c-Met monoespecíficos y con el estándar de tratamiento con cetuximab. Tal anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico ejemplar es el anticuerpo EM1-mAb de la invención. Los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos de la invención inhiben las células cancerosas que expresan el EGFR de tipo salvaje y el c-Met de tipo salvaje, y también las células cancerosas que expresan el mutante EGFR L858R/T790M, cuya mutación se ha identificado que contribuye a la resistencia a tratamientos con inhibidores de la tirosina quinasa de moléculas pequeñas (TKI), como el gefitinib. Por lo tanto los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos de la invención pueden proporcionar un beneficio en una población de paciente más amplia cuando se compara con cetuximab y TKIs.
En algunas realizaciones descritas en la presente, el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico inhibe el crecimiento del tumor de células SKMES-1 que expresan HGF en ratones SCID Beige con un porcentaje (%) valor T/C de por lo menos 500 veces menos en el día 36 cuando se compara con el cetuximab, cuando el anticuerpo biespecífico y el cetuximab se administran a una dosis de 20 mg/kg.
Los modelos de xenoinjerto tumoral que usan ratones SCID Beige son bien conocidos. Las células SKMES-1 pueden diseñarse para expresar HGF humano usando métodos estándar. Típicamente, los ratones SCID Beige pueden inocularse subcutáneamente con células SKMES-1 que expresan HGF humano incrustado en una matriz extracelular como CultureX en el costado dorsal de cada animal. Una semana después de la implantación, los ratones se pueden estratificar en grupos con volúmenes tumorales equivalentes, y luego se les puede dosificar por ejemplo tres veces por semana con los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos de la invención, anticuerpos de control o de referencia o moléculas pequeñas. Los volúmenes de los tumores se pueden registrar dos veces a la semana y la inhibición del crecimiento tumoral (TGI) puede observarse calculando el porcentaje (%) del valor T/C. El valor de % de T/C es indicativo de la eficacia antitumoral. T y C son los volúmenes medios de los grupos tratados y de control, respectivamente, en un día cualquiera.
Los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos de la invención proporcionan una eficacia significativamente mejorada en la destrucción de tumores in vivo en comparación con el tratamiento estándar con cetuximab, y por lo tanto pueden proporcionar un beneficio en una población de pacientes en comparación con el cetuximab.
En algunas realizaciones descritas en la presente, el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico comprende la HC1 y la HC2 de los isotipos IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.
En algunas realizaciones descritas en la presente, el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico comprende la HC1 y la HC2 del isotipo IgG1.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 del anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico comprende por lo menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho sustituciones y la HC2 CH3 comprende por lo menos una, dos, tres, cuatro Cinco, seis, siete u ocho sustituciones en las posiciones de residuos 350, 366, 368, 370, 399, 405, 407 o 409, cuando la numeración de residuos es de acuerdo con el índice de la UE.
En algunas realizaciones descritas en la presente, a HC1 CH3 del anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico comprende por lo menos una, dos, tres o cuatro sustituciones y la HC2 CH3 comprende por lo menos una, dos, tres o cuatro sustituciones en las posiciones de residuos 350, 370, 405 o 409, cuando la numeración de los residuos es de acuerdo con el índice de la UE.
Los dominios de anticuerpos y la numeración son bien conocidos. Dos dominios de CH3 (o regiones de CH3) no son idénticos cuando difieren con por lo menos en una sustitución de aminoácidos entre sí. Una región de CH3 de IgG1 consiste típicamente de los residuos 341-446 en IgG1 (numeración de residuos de acuerdo con el índice de la UE). Una región constante de IgG1 ejemplar se muestra en la SEQ ID NO: 203. El dominio de CH3 abarca los residuos 224-329 de la SEQ ID NO: 203, y corresponde a los residuos 341-446 de acuerdo con el índice de la UE.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 del anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico comprende por lo menos una sustitución y la HC2 CH3 comprende por lo menos una sustitución en las posiciones de residuos 405 o 409, cuando la numeración de residuos es de acuerdo con el índice de la UE.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 del anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico comprende una sustitución K409R o F405L y la HC2 CH3 comprende una sustitución K409R o F405L, en donde la numeración de los residuos es de acuerdo con el índice de la UE.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 del anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico comprende la sustitución F405L y la HC2 CH3 comprende la sustitución K409R.
En algunas realizaciones descritas en la presente, las sustituciones de HC1 CH3 y las sustituciones de HC2 CH3 son sustituciones en las posiciones 366, 368, 370, 399, 405, 407 o 409 (numeración de acuerdo con el índice de la UE). Estas posiciones corresponden a las posiciones de residuos lineales 248, 250, 252, 281, 287, 289 y 291, respectivamente, en una región constante de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 203 y 204.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la posición 409 de HC1 CH3 tiene una sustitución de aminoácido diferente de Lys, Leu o Met y la posición de HC2 c H3405 tiene una sustitución de aminoácido diferente de Phe.
En algunas realizaciones descritas en la presente , la posición 405 de HC1 CH3 tiene una sustitución de aminoácido diferente de Phe y la posición 409 de HC2 CH3 tiene una sustitución de aminoácido diferente de Lys, Leu o Met.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la posición 409 de HC1 CH3 tiene una sustitución de aminoácido diferente de Lys, Leu o Met y la posición 405 de HC2 CH3 tiene una sustitución de aminoácido diferente de Phe, Arg o Gly.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la posición 405 de HC1 CH3 tiene una sustitución de aminoácido diferente de Phe, Arg o Gly y la posición 409 de HC2 CH3 tiene una sustitución de aminoácido diferente de Lys, Leu o Met
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene Phe en la posición 405 y un aminoácido diferente de Lys, Leu o Met en la posición 409 y la HC2 CH3 tiene un aminoácido diferente de Phe en la posición 405 y un Lys en la posición 409.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene un aminoácido diferente de Phe en la posición 405 y Lys en la posición 409 y la HC2 c H3 tiene Phe en la posición 405 y un aminoácido diferente de Lys, Leu o Met en la posición 409.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene Phe en la posición 405 y un aminoácido distinto de Lys, Leu o Met en la posición 409 y la HC2 CH3 tiene una sustitución diferente de Phe, Arg o Gly en la posición 405 y Lys en la posición 409 .
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene una sustitución diferente de Phe, Arg o Gly en la posición 405 y Lys en la posición 409 y la HC2 CH3 tiene Phe en la posición 405 y un aminoácido diferente de Lys, Leu o Met en la posición 409.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene Phe en la posición 405 y un aminoácido diferente de Lys, Leu o Met en la posición 409 y la HC2 CH3 tiene Leu en la posición 405 y Lys en la posición 409.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene Leu en la posición 405 y Lys en la posición 409 y la HC2 CH3 tiene Phe en la posición 405 y un aminoácido diferente de Lys, Leu o Met en la posición 409.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene Phe en la posición 405 y Arg en la posición 409 y la HC2 CH3 tiene un aminoácido diferente de Phe, Arg o Gly en la posición 405 y Lys en la posición 409.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene un aminoácido diferente de Phe, Arg o Gly en la posición 405 y Lys en la posición 409 y la HC2 CH3 tiene Phe en la posición 405 y Arg en la posición 409.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene Phe en la posición 405 y Arg en la posición 409 y la HC2 CH3 tiene Leu en la posición 405 y Lys en la posición 409.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene Leu en la posición 405 y Lys en la posición 409 y la HC2 CH3 tiene Phe en la posición 405 y Arg en la posición 409.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene Phe en la posición 405 y Lys en la posición 409 y la HC2 CH3 tiene Leu en la posición 405 y aArg en la posición 409.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene Leu en la posición 405 y aArg en la posición 409 y la HC2 CH3 tiene Phe en la posición 405 y Lys en la posición 409.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene un aminoácido diferente de Lys, Leu o Met en la posición 409 y la HC2 CH3 tiene Lys en la posición 409, Thr en la posición 370 y Leu en la posición 405.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene Lys en la posición 409, Thr en la posición 370 y Leu en la posición 405 y la HC2 CH3 tiene un aminoácido diferente de Lys, Leu o Met en la posición 409.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene Arg en la posición 409 y la HC2 CH3 tiene Lys en la posición 409, Thr en la posición 370 y Leu en la posición 405.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene Lys en la posición 409, Thr en la posición 370 y Leu en la posición 405 y la HC2 CH3 tiene Arg en la posición 409.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene Lys en la posición 370, Phe en la posición 405 y aArg en la posición 409 y la HC2 CH3 tiene Lys en la posición 409, Thr en la posición 370 y Leu en la posición 405.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene Lys en la posición 409, Thr en la posición 370 y Leu en la posición 405 y la HC2 CH3 tiene Lys en la posición 370, Phe en la posición 405 y Arg en la posición 409.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene un aminoácido diferente de Lys, Leu o Met en la posición 409 y la HC2 CH3 tiene un aminoácido diferente de Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser o Thr en la posición 407.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene un aminoácido diferente de Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser o Thr en la posición 407 y la HC2 CH3 tiene un aminoácido diferente de Lys, Leu o Met en la posición 409.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene un aminoácido diferente de Lys, Leu o Met en la posición 409 y la HC2 CH3 tiene Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val o Trp en la posición 407.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val o Trp en la posición 407 y la HC2 CH3 tiene un aminoácido diferente de Lys, Leu o Met en la posición 409.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene un aminoácido diferente de Lys, Leu o Met en la posición 409 y la HC2 CH3 tiene Gly, Leu, Met, Asn o Trp en la posición 407.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene Gly, Leu, Met, Asn o Trp en la posición 407 y la HC2 CH3 tiene un aminoácido diferente de Lys, Leu o Met en la posición 409.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene Tyr en la posición 407 y un aminoácido diferente de Lys, Leu o Met en la posición 409 y la HC2 CH3 tiene un aminoácido diferente de Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser o Thr en la posición 407 y Lys en la posición 409.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene un aminoácido diferente de Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser o Thr en la posición 407 y Lys en la posición 409 y la HC2 CH3 tiene Tyr en la posición 407 y un aminoácido diferente de Lys, Leu o Met en la posición 409.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC! el CH3 tiene Tyr en la posición 407 y un aminoácido diferente de Lys, Leu o Met en la posición 409 y la HC2 CH3 tiene Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val o Trp en la posición 407 y Lys en la posición 409.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val o Trp en la posición 407 y Lys en la posición 409 y la HC2 CH3 tiene Tyr en la posición 407 y un aminoácido diferente de Lys, Leu o Met en la posición 409.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene Tyr en la posición 407 y un aminoácido diferente de Lys, Leu o Met en la posición 409 y la HC2 CH3 tiene Gly, Leu, Met, Asn o Trp en la posición 407 y Lys en la posición 409.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene Gly, Leu, Met, Asn o Trp en la posición 407 y Lys en la posición 409 y la HC2 CH3 tiene Tyr en la posición 407 y un aminoácido diferente de Lys, Leu o Met en la posición 409 .
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene Tyr en la posición 407 y Arg en la posición 409 y la HC2 CH3 tiene un aminoácido diferente de Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser o Thr en la posición 407 y Lys en la posición 409.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene un aminoácido diferente de Tyr, Asp, Glu, Phe, Lys, Gln, Arg, Ser o Thr en la posición 407 y Lys en la posición 409 y la HC2 CH3 tiene Tyr en la posición 407 y Arg en la posición 409.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene Tyr en la posición 407 y Arg en la posición 409 y la HC2 CH3 tiene Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val o Trp en la posición 407 y Lys en la posición 409.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene Ala, Gly, His, Ile, Leu, Met, Asn, Val o Trp en la posición 407 y Lys en la posición 409 y la HC2 CH3 tiene Tyr en la posición 407 y Arg en la posición 409.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene Tyr en la posición 407 y Arg en la posición 409 y la HC2 CH3 tiene Gly, Leu, Met, Asn o Trp en la posición 407 y Lys en la posición 409.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene Gly, Leu, Met, Asn o Trp en la posición 407 y Lys en la posición 409 y la HC2 CH3 tiene Tyr en la posición 407 y Arg en la posición 409.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene un aminoácido diferente de Lys, Leu o Met en la posición 409, y la HC2 CH3 tiene (i) un aminoácido diferente de Phe, Leu y Met en la posición 368, o (ii) un Trp en la posición 370, o (iii) un aminoácido diferente de Asp, Cys, Pro, Glu o Gln en la posición 399.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene (i) un aminoácido diferente de Phe, Leu y Met en la posición 368, o (ii) un Trp en la posición 370, o (iii) un aminoácido diferente de Asp, Cys, Pro, Glu o Gln en la posición 399 y la HC2 CH3 tiene un aminoácido diferente de Lys, Leu o Met en la posición 409.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene Arg, Ala, His o Gly en la posición 409, y la HC2 CH3 tiene (i) Lys, Gln, Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Asn, Arg, Ser, Thr, Val o Trp en la posición 368, o (ii) Trp en la posición 370, o (iii) Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr, Trp, Phe, His, Lys, Arg o Tyr en la posición 399.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene (i) Lys, Gln, Ala, Asp, Glu, Gly, His, Ile, Asn, Arg, Ser, Thr, Val o Trp en la posición 368 o (ii) Trp en la posición 370, o (iii) Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Asn, Ser, Thr, Trp, Phe, His, Lys, Arg o Tyr en la posición 399 y la HC2 CH3 tiene Arg, Ala, His o Gly en la posición 409.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 tiene Arg en la posición 409, y la HC2 CH3 tiene (i) Asp, Glu, Gly, Asn, Arg, Ser, Thr, Val o Trp en la posición 368, o (ii) Trp en la posición 370, o (iii) Phe, His, Lys, Arg o Tyr en la posición 399.
En algunas realizaciones descritas la presente, la HC1 CH3 tiene (i) Asp, Glu, Gly, Asn, Arg, Ser, Thr, Val o Trp en la posición 368, o (ii) Trp en la posición 370, o (iii) Phe, His, Lys, Arg o Tyr en la posición 399 y la HC2 CH3 tiene Arg en la posición 409.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 comprende una sustitución K409R o una sustitución de F405L y la HC2 CH3 comprende una sustitución K409R o una sustitución de F405L, en donde la numeración de residuos es de acuerdo con el índice de la UE.
En algunas realizaciones descritas en la presente, la HC1 CH3 comprende la sustitución F405L y la HC2 CH3 comprende la sustitución K409R.
Las sustituciones se hacen típicamente a nivel de ADN en una molécula, como el dominio constante del anticuerpo, usando métodos estándar.
En algunas realizaciones descritas en la presente, el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico comprende la VH1 y la VL1, en donde
la VH1 comprende las secuencias de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR) 1 (HCDR1), HCDR 2 (HCDR2) y HCDR 3 (HCDR3) de las SEQ ID NO: 210, 211 y 212, respectivamente; y
la VL1 comprende las secuencias de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR) 1 (LCDR1), LCDR 2 (LCDR2) y LCDR 3 (LCDR3) de las SEQ ID NO: 213, 214 y 215, respectivamente.
En algunas realizaciones descritas en la presente, el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico comprende la VH2 y la VL2, en donde
la VH2 comprende las secuencias de aminoácidos de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 216, 217 y 218, respectivamente; y
la Vl2 comprende las secuencias de aminoácidos LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 219, 220 y 221, respectivamente.
En algunas realizaciones descritas en la presente, el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico comprende las secuencias de aminoácidos de la VH1, la VL1, la VH2 y la VL2 de las SEQ ID NO: 189, 190, 193 y 194, respectivamente.
En algunas realizaciones descritas en la presente, el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico comprende las secuencias de aminoácidos de la HC1, la LC1, la HC2 y la LC2 de las SEQ ID NO: 199, 200, 201 y 202, respectivamente, teniendo opcionalmente una lisina C-terminal eliminada de la HC1, la HC2, o tanto la HC1 como la HC2.
En algunas realizaciones descritas en la presente documento, el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico comprende la VH1 y la VL1, en donde
la VH1 comprende las secuencias de aminoácidos de la HCDR1, la HCDR2 y la HCDR3 de las SEQ ID NO: 222, 223 y 224, respectivamente; y
la v L1 comprende las secuencias de aminoácidos de la LCDR1, la LCDR2 y la LCDR3 de las SEQ ID NO: 225, 226 y 227, respectivamente.
En algunas realizaciones descritas en la presente, el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico comprende la VH2 y la VL2, en donde
la VH2 comprende las secuencias de aminoácidos de la HCDR1, la HCDR2 y la HCDR3 de las SEQ ID NO: 228, 229 y 230, respectivamente; y
la v L2 comprende las secuencias de aminoácidos de la LCDR1, la LCDR2 y la LCDR3 de las SEQ ID NO: 231, 232 y 233, respectivamente.
En algunas realizaciones descritas en la presente, el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico comprende las secuencias de aminoácidos la VH1, la VL1, la VH2 y la VL2 de las SEQ ID NO: 191, 192, 195 y 196, respectivamente.
En algunas realizaciones descritas en la presente, el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico comprende las secuencias de aminoácidos de la HC1, la LC1, la HC2 y la LC2 de las SEQ ID NO: 234, 235, 236 y 237, respectivamente, teniendo opcionalmente la lisina C-terminal eliminada de la HC1, la HC2, o tanto la HC1 como la HC2.
En algunas realizaciones descritas en la presente, los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos pueden bloquear la unión de EGF a EGFR y la unión de hGf a c-Met con un valor de IC50 de menos de aproximadamente 1x10' 8 M, de menos de aproximadamente 1x10' 9 M, de menos de aproximadamente 1x10'1° M, de menos de aproximadamente 1 x1 0 '11 M, o de menos de aproximadamente 1x 1 0 '12 M en un ensayo de competición empleando dominios extracelulares de EGFR humano recombinante o de c-Met humano recombinante recubiertos en placas e incubados con o sin los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos de la invención. Los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos descritos en la presente pueden bloquear la unión de EGF a EGFR y la unión de hGf a c-Met en por lo menos un 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% en comparación con la unión de EGF a EGFR y la unión de HGF a c-Met en ausencia de los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos de la invención descritos en la presente usando las mismas condiciones de ensayo.
En algunas realizaciones descritas en la presente, el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico comprende la HC1, LC1, HC2 y LC2, en donde la HC1, la LC1, la HC2 y la LC2 están codificadas por polinucleótidos sintéticos que comprenden la secuencia de las SEQ ID NO: 205206, 207 y 208, respectivamente.
Los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos de la invención pueden generarse usando técnicas descritas en la presente, como utilizar diseño de CH3 y generar los anticuerpos usando intercambio de brazo Fab in vitro. Puede generarse un anticuerpo biespecífico ejemplar a partir de dos anticuerpos monoespecíficos combinando aproximadamente 1-20 mg/ml de cada anticuerpo a una relación molar de 1:1 en PBS a pH 7.0-7.4 en un tampón que tiene una concentración final de 75 mM de 2- mercaptoetanolamina (2-MEA), incubando durante 2 a 6 horas a 25-37° C, seguido de la eliminación de 2-MEA mediante diálisis, diafiltración, filtración de flujo tangencial y filtración de células centrifugadas. El rendimiento del anticuerpo biespecífico puede ser más de aproximadamente el 80%, más de aproximadamente el 90%, más de aproximadamente el 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%.
Algunas realizaciones descritas en la presente proporcionan métodos para producir el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico aislado, que comprende:
combinar un anticuerpo anti-EGFR bivalente monoespecífico aislado que comprende dos cadenas pesadas de la SEQ ID NO: 199 y dos cadenas ligeras de la SEQ ID NO: 200 y un anticuerpo anti-c-Met bivalente monoespecífico aislado que comprende dos cadenas pesadas de la SEQ ID NO: 201 y dos cadenas ligeras de la SEQ ID NO: 202 en una mezcla de aproximadamente una relación molar 1:1;
introducir un agente reductor en la mezcla;
incubar la mezcla de aproximadamente unos noventa minutos a aproximadamente seis horas;
eliminar el agente reductor; y
purificar el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico que comprende una primera cadena pesada de la SEQ ID NO: 199 y una segunda cadena pesada de la SEQ ID NO: 201, una primera cadena ligera de la SEQ ID NO: 200 y una segunda cadena ligera de la SEC. ID NO: 202, en donde la primera cadena pesada de la SEQ ID NO: 199 se empareja con la primera cadena ligera de la SEQ ID NO: 200 para formar el primer dominio de unión que se une específicamente a EGFR, y la segunda cadena pesada de la SEQ ID NO: 201 se empareja con la segunda cadena ligera de la SEQ ID NO: 202 para formar el segundo dominio de unión que se une específicamente a c-Met.
En algunas realizaciones descritas en la presente, el agente reductor es 2-mercaptoetanolamina (2-MEA). En algunas realizaciones descritas en la presente, la 2-MEA está presente a una concentración de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 75 mM.
En algunas realizaciones descritas en la presente, el paso de incubación se realiza a una temperatura de aproximadamente 25° C a aproximadamente 37° C.
Algunas realizaciones descritas en la presente proporcionan un anticuerpo de EGFR/-c-Met biespecífico aislado que comprende una HC1, una LC1, una HC2 y una LC2, en donde la HC1 comprende la secuencia de la SEQ ID No : 199, la LC1 comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 200, la HC2 comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 201 y la LC2 comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 202, en donde la HC1, la LC1, la HC2 y/o la LC2 comprenden además 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 sustituciones de aminoácidos conservadoras. Algunas realizaciones descritas en la presente proporcionan un anticuerpo de EGFR/-c-Met biespecífico aislado que comprende la HC1, la LC1, la HC2 y la LC2, en donde la HC1 comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 234, la LC1 comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 235, la HC2 comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 236, y la LC2 comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 237, en donde la HC1, la LC1, la HC2 y/o la LC2 comprenden además 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 sustituciones de aminoácidos conservadoras.
Los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos cuyas secuencias de aminoácidos de HC1, LC1, HC2 y LC2 difieren sustancialmente de los anticuerpos divulgados en la presente están incluidos dentro del alcance de la invención. Típicamente, esto implica una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras con un aminoácido que tiene características de carga, hidrófobas o estereoquímicas similares en los sitios de unión al antígeno o en los marcos sin alterar adversamente las propiedades del anticuerpo. También se pueden hacer sustituciones conservadoras para mejorar las propiedades del anticuerpo, por ejemplo, la estabilidad o afinidad. Se pueden hacer 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, a la VH1, la VL1, la VH2 y/o la VL2. Por ejemplo, una "sustitución de aminoácidos conservadora " puede implicar la sustitución de un residuo de aminoácido nativo con un residuo no nativo, de tal manera que haya poco o ningún efecto sobre la polaridad o carga del residuo de aminoácido en esa posición. Además, cualquier residuo nativo en el polipéptido también puede sustituirse con alanina, como se ha descrito anteriormente para la mutagénesis de barrido de alanina (MacLennan et al., Acta Physiol Scand Suppl 643:55-67, 1998; Sasaki et al., Adv Biophys 35:1-24, 1998). Las sustituciones de aminoácidos deseadas pueden ser determinadas por los expertos en la técnica en el momento en que se desean tales sustituciones. Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos pueden usarse para identificar residuos importantes de la secuencia de la molécula, o para aumentar o disminuir la afinidad de las moléculas descritas en la presente documento. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras ejemplares se describen más arriba.
Las sustituciones de aminoácidos pueden hacerse, por ejemplo, mediante mutagénesis por PCR (Patente de Estados Unidos N° 4.683.195). Se pueden generar bibliotecas de variantes usando métodos bien conocidos, por ejemplo, usando codones aleatorios (NNK) o no aleatorios, por ejemplo codones DVK, que codifican 11 aminoácidos (Ala, Cys, Asp, Glu, Gly, Lys, Asn, Arg, Ser, Tyr, Trp) y evaluando de las bibliotecas en busca de variantes con las propiedades deseadas.
En algunas realizaciones descritas en la presente, pueden hacerse sustituciones de aminoácidos en la región constante del anticuerpo. Por ejemplo, pueden usarse diferentes alotipos de IgG1 en los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos de la invención, como el alotipo G1m17, el alotipo G1m3 o el alotipo G1m1 bien conocidos, o una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones descritas en la presente, las propiedades farmacocinéticas de los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos pueden mejorarse mediante sustituciones en el dominio Fc que modulan la vida media del anticuerpo. En algunas realizaciones descritas en la presente, el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico comprende una sustitución M252Y/S254T/T256E en la HC1 y/o la HC2, en donde la numeración de los residuos es de acuerdo con el índice de la UE. Se ha demostrado que las sustituciones M252Y/S254T/T256E aumentan la vida media del anticuerpo (Dall'Acqua et al., J Biol Chem 281:23514-24, 2006).
Los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos que tienen sustituciones conservadoras y/o sustituciones adicionales en su región Fc se prueban en cuanto a sus características usando los métodos descritos en la presente.
En alguna realización descrita en la presente, las propiedades efectoras inmunes de los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos pueden mejorarse o silenciarse a través de modificaciones de Fc mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las funciones efectoras de Fc, como la unión a C1q, la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), la fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP), la regulación por disminución de los receptores de la superficie celular (por ejemplo, receptor celular C; BCR), etc. puede proporcionarse y/o controlarse modificando los residuos en el Fc responsable de estas actividades.
"Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" o "ADCC" se refiere a una reacción mediada por células en la que las células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fc (FcRs) (por ejemplo, células asesinas naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo de unión en una célula objetivo y, posteriormente, provocan la lisis de la célula objetivo.
La capacidad de los anticuerpos monoclonales para inducir ADCC puede mejorarse diseñando su componente oligosacárido. Las IgG1 o IgG3 humanas están N-glicosiladas en Asn297 con la mayoría de los glicanos en las formas biantenarias G0, G0F, G1, G1F, G2 o G2F bien conocidas. Los anticuerpos producidos por células CHO no modificadas tienen típicamente un contenido de glicano fucosa de aproximadamente por lo menos el 85%. La eliminación de la fucosa del núcleo de los oligosacáridos de tipo complejo biantenario unidos a las regiones Fc mejora la ADCC de los anticuerpos mediante la unión a FcyRIIIa mejorada sin alterar la unión al antígeno o la actividad de los CDC. Tales mAb pueden lograrse usando diferentes métodos que se informa llevan a la expresión exitosa de anticuerpos defucosilados relativamente altos que llevan el tipo complejo biantenario de oligosacáridos Fc, como el control de la osmolalidad del cultivo (Konno et al., Cytotechnology 64 (: 249-65, 2012), aplicación de una Lec13 de la línea CHO variante como la línea de la célula huésped (Shields et al., J Biol Chem 277: 26733-26740, 2002), aplicación de una EB6 6 de la línea CHO variante como la línea celular huésped (Olivier et al., MAbs; 2 (4), 2010; Epub ahead of print; PMID: 20562582), aplicación de una YB2/0 de línea celular de hibridoma de rata como la línea celular huésped (Shinkawa et al., J Biol Chem 278: 3466-3473, 2003), introducción de ARN pequeño interferente específicamente contra el gen de la a 1,6-fucosiltrasferasa (FUT8) (Mori et al., Biotechnol Bioeng8 8 : 901-908, 2004), o la coexpresión de p-1,4-W-acetilglucosaminiltransferasa III y Golgi a-manosidasa II o un inhibidor de la alfa-manosidasa I potente, la kifunensina (Ferrara et al., J Biol Chem281: 5032-5036, 2006, Ferrara et al., Biotechnol Bioeng 93: 851-861, 2006; Xhou et al., Biotechnol Bioeng 99: 652-65, 2008).
En algunas realizaciones descritas en la presente, la ADCC provocada por los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos también puede mejorarse mediante ciertas sustituciones en el Fc del anticuerpo. Las sustituciones ejemplares son, por ejemplo, sustituciones en las posiciones de aminoácidos 256, 290, 298, 312, 356, 330, 333, 334, 360, 378 o 430 (numeración de residuos de acuerdo con el índice de la UE) como se describe en la Patente de Estados Unidos N° US6737056.
En algunas realizaciones descritas en la presente, el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico de la invención tiene una estructura de glicano biantenario con un contenido de fucosa de aproximadamente entre el 1 % y aproximadamente el 15%, por ejemplo el 15%, 14%, 13%, 12%, 11 % 10%, 9%, 8 %, 7%, 6 %, 5%, 4%, 3%, 2% o 1% En algunas realizaciones, el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico tiene una estructura de glicano con un contenido de fucosa de aproximadamente el 50%, 40%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25% o 20%.
"Contenido de fucosa" significa la cantidad del monosacárido de fucosa dentro de la cadena de azúcar en Asn297. La cantidad relativa de fucosa es el porcentaje de estructuras que contienen fucosa relacionadas con todas las glicoestructuras. Estas pueden caracterizarse y cuantificarse mediante múltiples métodos, por ejemplo: 1) utilizando MALDI-TOF de la muestra tratada con N-glicosidasa F (por ejemplo, estructuras complejas, híbridas y oligo- y con alto contenido de manosa) como se describe en la Publicación de Patente Internacional N° WO2008/077546 2); 2) mediante liberación enximática de los glicanos de Asn297 con derivación y detección/cuantificación subsiguientes por HPLC (UPLC) con detección de fluorescencia y/o HPLC-MS (UPLC-MS); 3) análisis de proteínas intactas del mAb nativo o reducido, con o sin tratamiento de los glicanos Asn297 con Endo S u otra enzima que escinde entre el primer y el segundo monosacáridos de GlcNAc, dejando la fucosa unida a la primera GlcNAc; 4) digestión del mAb a péptidos constituyentes por digestión enzimática (por ejemplo, tripsina o endopeptidasa Lys-C), y posterior separación, detección y cuantificación por HPLC-MS (UPLC-MS); 5) Separación de los oligosacáridos mAb de la proteína mAb por desglicosilación enzimática específica con PNGasa F en Asn 297. Los oligosacáridos liberados de este modo pueden marcarse con un fluoróforo, separarse e identificarse por varias técnicas complementarias que permiten, la caracterización buena de las estructuras de glicano por espectrometría de masas de desorción ionización con láser asistida por matriz (MALDI) mediante la comparación de las masas experimentales con las masas teóricas, determinación del grado de sialilación mediante HPLC de intercambio iónico (GlycoSep C), separación y cuantificación de las formas de oligosacorrado de acuerdo con los criterios de hidrofilia por HPLC de fase normal (GlycoSep N), y separación y cuantificación de los oligosacáridos mediante fluorescencia inducida por electroforesis-laser capilar de alto rendimiento (HPCE-LIF).
"Fucosa baja" o "bajo contenido de fucosa", tal como se utiliza en la solicitud, se refiere a anticuerpos con un contenido de fucosa de aproximadamente entre el 1%-15%.
"Fucosa normal" o "contenido de fucosa normal", como se usa en la presente, se refiere a anticuerpos con un contenido de fucosa de más del 50%, aproximadamente de más del 80% o más del 85%.
Algunas realizaciones de la invención proporcionan un ácido nucleico sintético que codifica las cadenas pesadas y las cadenas ligeras de los anticuerpos de unión a EGFR/c-Met biespecíficos de la invención como se describe en la presente como polinucleótidos aislados o como porciones de vectores de expresión o como porciones de secuencias de ADN lineales, incluyendo las secuencias de ADN lineales usadas para la transcripción/traducción in vitro, vectores compatibles con la expresión de fagos procariotas, eucariotas o filamentosos, la secreción y/o presentación de las composiciones o mutágenos dirigidos de los mismos.
Algunas realizaciones de la invención proporcionan un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de polinucleótidos de las SEQ ID NO: 205, 206, 207 o 208.
Los polinucleótidos de la invención pueden producirse mediante síntesis química como síntesis de polinucleótidos en fase sólida en un sintetizador de polinucleótidos automatizado y ensamblarse en moléculas completas de cadena sencilla o doble. Alternativamente, los polinucleótidos de la invención pueden producirse mediante otras técnicas como PCR seguido de clonación de rutina. Las técnicas para producir u obtener polinucleótidos de una secuencia conocida dada son bien conocidas en la técnica.
Los polinucleótidos de la invención pueden comprender por lo menos una secuencia no codificante, como una secuencia promotora o potenciadora, intrón, señal de poliadenilación, una secuencia cis que facilita la unión de RepA, y similares. Las secuencias de polinucleótidos también pueden comprender secuencias adicionales que codifican aminoácidos adicionales que codifican, por ejemplo, un marcador o una secuencia de etiqueta como una etiqueta de histidina o una etiqueta de HA para facilitar la purificación o detección de la proteína, una secuencia señal, un compañero de proteína de fusión, como RepA, Fc o proteína de cubierta de bacteriófagos como pIXo pIII.
Algunas realizaciones descritas en la presente proporcionan un vector que comprende el polinucleótido de la invención. Tales vectores pueden ser vectores de plásmidos, vectores virales, vectores para la expresión de baculovirus, vectores basados en transposones o cualquier otro vector adecuado para la introducción del polinucleótido de la invención en un organismo determinado o antecedente genético por cualquier medio. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos biespecíficos de la invención pueden insertarse en vectores de expresión. Las cadenas ligeras y pesadas pueden clonarse en los mismos vectores de expresión o en diferentes. Los segmentos de ADN que codifican cadenas de inmunoglobulina pueden enlazarse operativamente a secuencias de control en el vector(es) de expresión que aseguran la expresión de polipéptidos de inmunoglobulina. Tales secuencias de control incluyen secuencias señal, promotores (por ejemplo, promotores asociados de manera natural o heterólogos), elementos potenciadores y secuencias de terminación de la transcripción, y pueden elegirse para que sean compatibles con la célula huésped elegida para expresar el anticuerpo. Una vez que el vector se ha incorporado al huésped apropiado, el huésped puede mantenerse bajo condiciones adecuadas para la expresión de alto nivel de las proteínas codificadas por los polinucleótidos sintéticos incorporados.
Los vectores de expresión adecuados son típicamente replicables en los organismos huéspedes ya sea como episomas o como una parte integral del ADN cromosómico del huésped. Comúnmente, los vectores de expresión contienen marcadores de selección como resistencia a la ampicilina, resistencia a la higromicina, resistencia a la tetraciclina, resistencia a la kanamicina o resistencia a la neomicina para permitir la detección de aquellas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas.
Algunas realizaciones descritas en la presente proporcionan una célula huésped que comprende el vector de la invención. El término "célula huésped" se refiere a una célula en la que se ha introducido un vector. Se entiende que el término célula huésped se pretende que se refiera no solo a la célula sujeto particular sino a la progenie de dicha célula. Como ciertas modificaciones pueden tener lugar en generaciones sucesivas debido a mutaciones o influencias ambientales, dicha progenie puede no ser idéntica a la célula original, pero aún están incluidas dentro del alcance del término "célula huésped" como se usa en la presente. Dichas células huésped pueden ser células eucariotas, células procariotas, células vegetales o células archeales.
Las células eucariotas ejemplares pueden ser de origen mamífero, insecto, aviar u otro animal. Las células eucariotas de mamífero incluyen líneas celulares inmortalizadas, como hibridomas o líneas celulares de mieloma, como las líneas celulares murinas SP2/0 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, CRL-1581), NS0 (European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, Reino Unido, ECACC N° 85110503), FO (ATCC CRL-1646) y Ag653 (ATCC CRL-1580). Una línea celular de mieloma humano ejemplar es U266 (At TC CRL-TIB-196). Otras líneas celulares útiles incluyen las derivadas de células de ovario de hámster chino (CHO) como CHO-K1SV (Lonza Biologics, Walkersville, MD), CHO-K1 (ATCC CRL-61) o DG44.
Usos de las moléculas que contienen del dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico de la divulgación, anticuerpos de EGFR/-c-Met biespecíficos de la invención y dominios de FN3 de unión a EGFR o de unión a c-Met de la divulgación.
Las moléculas que contienen el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico, los dominios de FN3 de unión a EGFR, los dominios de FN3 de unión a c-Met de la divulgación o los anticuerpos de EGFR-c-Met biespecíficos de la invención pueden usarse para diagnosticar, monitorizar, modular, tratar, aliviar, ayudar a prevenir la incidencia de, o reducir los síntomas de enfermedades o patologías humanas específicas en células, tejidos, órganos, fluidos o, en general, un huésped. Los métodos de la divulgación pueden usarse para tratar a un paciente animal que pertenece a cualquier clasificación. Ejemplos de tales animales incluyen mamíferos tales como humanos, roedores, perros, gatos y animales de granja/domésticos.
Un aspecto de la invención es un método in vitro para inhibir el crecimiento o la proliferación de células que expresan EGFR y/o c-Met, que comprende poner en contacto las células con el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico definido en la reivindicación 2(a) o 2(b).
Otro aspecto de la invención es el anticuerpo biespecífico como se define en la reivindicación 2(a) o 2(b) para su uso en un método para inhibir el crecimiento o metástasis de células cancerosas o tumorales que expresan EGFR y/o c-Met en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz del anticuerpo biespecífico de modo que se inhiba el crecimiento o la metástasis del tumor o célula cancerosa que expresa EGFR y/o c-Met.
Otro aspecto de la invención es el anticuerpo biespecífico como se define en la reivindicación 2(a) o 2(b) para SU uso en un método para tratar a un sujeto que tiene cáncer, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo biespecífico a un paciente con necesidad de ello durante un tiempo suficiente para tratar el cáncer.
La molécula que contiene el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico, el dominio de FN3 de unión a EGFR, el dominio de FN3 de unión a c-Met de la divulgación o los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos de la invención pueden usarse para el tratamiento de cualquier enfermedad o trastorno caracterizado por la activación o producción anormal de EGFR, c-Met, EGF, EGFR soluble, c-Met soluble u otro ligando de EGFR o HGF, o un trastorno relacionado con la expresión de EGFR o c-Met, que puede o no implicar malignidad o cáncer, donde está teniendo lugar una activación y/o producción de EGFR, c-Met, EGF u otro ligando de EGFR, o HGF anormal en células o tejidos de un sujeto que tiene, o está predispuesto, a la enfermedad o trastorno.
Los dominios de FN3 que se unen específicamente a c-Met y bloquean la unión de HGF a c-Met pueden ser para el tratamiento de tumores, incluyendo cánceres y tumores benignos. Los cánceres susceptibles de tratamiento por los dominios de FN3 de unión a c-Met de la divulgación incluyen aquellos que sobreexpresan c-Met. Los cánceres ejemplares que son susceptibles de tratamiento por los dominios de FN3 de la divulgación incluyen cánceres de células epiteliales, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, cáncer gástrico, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer oral, cáncer de esófago, cáncer de vagina, cáncer cervical, cáncer de bazo, cáncer de testículo y cáncer de timo.
Los dominios de FN3 que se unen específicamente a EGFR y bloquean la unión de EGF al EGFR de la divulgación pueden usarse para el tratamiento de tumores, incluyendo cánceres y tumores benignos. Los cánceres susceptibles de ser tratados por los dominios de FN3 de la divulgación incluyen aquellos que sobreexpresan EGFR o variantes. Los cánceres ejemplares que son susceptibles de tratamiento por los dominios de FN3 de la divulgación incluyen cánceres de células epiteliales, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer de ano, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer oral, cáncer de esófago, cáncer de vagina, cáncer cervical, cáncer de bazo, cáncer de testículo y cáncer de timo. Las moléculas que contienen el dominio de FN 3 de EGFR/c-Met biespecífico de la divulgación o los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos de la invención pueden usarse para el tratamiento de tumores, incluyendo cánceres y tumores benignos. Cánceres ejemplares que son susceptibles de ser tratados por la molécula que contiene el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico de la divulgación o el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico de la invención incluyen aquellos que sobreexpresan EGFR y/o c-Met, cánceres asociados con actividad y/o niveles de expresión de EGFR elevados (como, por ejemplo, una mutación activadora de EGFR, una amplificación génica de EGFR, o activación de EGFR mediada por ligandos) y niveles de actividad y/o expresión de c-Met elevados (como, por ejemplo, una mutación activadora de c-Met, una amplificación del gen c-Met o una activación de c-Met mediada por hGf ).
Las mutaciones activadoras de EGFR ejemplares que pueden estar asociadas con el cáncer incluyen mutaciones de punto, mutaciones de deleción, mutaciones de inserción, inversiones o amplificaciones de genes que llevan a un aumento de por lo menos una actividad biológica de EGFR, como la actividad de tirosina quinasa elevada, la formación de homodímeros y heterodímeros de receptores, unión a ligandos mejorada, etc. Las mutaciones pueden localizarse en cualquier porción de un gen de EGFR o región reguladora asociada con un gen de EGFR e incluyen mutaciones en el exón 18, 19, 20 o 21 o mutaciones en el dominio de la quinasa. Las mutaciones de EGFR activadoras ejemplares son sustituciones G719A, L861X (X siendo cualquier aminoácido), L858R, E746K, L747S, E749Q, A750P, A755V, V765M, L858P o T790M, eliminación de E746-A750, eliminación de R748-P753, inserción de Ala entre M766 y A767, inserción de SVA (Ser, Val, Ala) entre S768 y V769, e inserción de NS (Asn, Ser) entre P772 y H773. Otros ejemplos de mutaciones activadoras de EGFR son conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, la Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2005/0272083). La información sobre EGFR y otros receptores de ErbB, incluyendo los homo- y heterodímeros receptores, ligandos de receptores, sitios de autofosforilación y moléculas de señalización implicadas en la señalización mediada por ErbB es conocida en la técnica (ver, por ejemplo, Hynes y Lane, Nature Reviews Cancer 5: 341- 354, 2005).
Las mutaciones activadoras de c-Met ejemplares incluyen mutaciones de punto, mutaciones de deleción, mutaciones de inserción, inversiones o amplificaciones de genes que llevan a un aumento de por lo menos una actividad biológica de una proteína de c-Met, como actividad de tirosina quinasa elevada, la formación de homodímeros y heterodímeros de receptores, unión a ligandos mejorada, etc. Las mutaciones pueden estar localizadas en cualquier porción del gen c-Met o regiones reguladoras asociadas con el gen, como las mutaciones en el dominio de quinasa de c-Met. Las mutaciones activadoras de c-Met ejemplares son mutaciones en las posiciones de residuos N375, V13, V923, R175, V136, L229, S323, R988, S1058/T1010 y E168. Los métodos para detectar mutaciones de EGFR y c-Met o amplificaciones de genes son bien conocidos.
Los cánceres ejemplares que son susceptibles de tratamiento por los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos de la invención incluyen cánceres de células epiteliales, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), adenocarcinoma de pulmón, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer colorrectal, cáncer anal, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de faringe, cáncer de la nariz, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer oral, cáncer de lengua, cáncer de esófago, cáncer de vagina, cáncer cervical, cáncer de bazo, cáncer de testículo, cáncer gástrico, cáncer de timo, cáncer de colon, cáncer de tiroides, cáncer de hígado (carcinoma hepatocelular (CHC)) o carcinoma de células renales papilar esporádico o hereditario (PRCC).
Otro aspecto de la invención es el anticuerpo biespecífico como se define en la reivindicación 2(a) o 2(b) para su uso en un método para tratar a un sujeto que tiene cáncer, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico aislado de la invención a un paciente con necesidad de ello durante un tiempo suficiente para tratar el cáncer, en donde el sujeto es homocigoto para la fenilalanina en la posición 158 de CD16 (genotipo FcyRIIIa-158F/F) o heterocigoto para la valina y la adenocina en la posición 158 de CD16 (Genotipo FcYRIIIa-158F/V). CD16 también se conoce como el receptor gamma Illa de Fc (FcyRIII) o la isoforma del receptor Ill-A de la región Fc de gamma inmunoglobulina de baja afinidad. Se ha demostrado que el polimorfismo de valina/fenilalanina (V/F) en la posición 158 del residuo de la proteína FcyRIIIa afecta la afinidad de FcyRIIIa a la IgG humana. El receptor con polimorfismos FcyRIIIa-158F/F o FcYRIIIa-l58F/V demuestra un acoplamiento de Fc reducido y, por lo tanto, ADCC reducido cuando se compara con el FcYRIIIa-158V/V. La falta o la baja cantidad de fucosa en oligosacáridos N-enlazados humanos mejora la capacidad de los anticuerpos para inducir ADCC debido a una unión mejorada de los anticuerpos a FcyRIIIa (CD16) humano (Shields et al., J Biol Chem 277: 26733-40, 2002). Los anticuerpos de la invención tienen un contenido de fucosa reducido de aproximadamente entre el 1% y aproximadamente el 10%. En algunas realizaciones, el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico tiene una estructura de glicano con un contenido de fucosa de aproximadamente el 50%, 40%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% o 1%. Por lo tanto, los anticuerpos de la invención pueden ser más eficaces en el tratamiento de pacientes con genotipos FcyRIIIa-158F/F o FcYRIIIa-158F/V. Los pacientes pueden ser analizados por su polimorfismo FcyRIIIa usando métodos de rutina.
En algunos métodos descritos en la presente, los anticuerpos de la invención pueden usarse para tratar a un sujeto que tiene cáncer que es resistente o que ha adquirido resistencia al tratamiento con uno o más inhibidores de EGFR. Los inhibidores de EGFR ejemplares para los cuales el cáncer puede adquirir resistencia son los anticuerpos anti-EGFR cetuximab (Erbitux®), pantinumumab (Vectibix®), matuzumab, nimotuzumab, inhibidores de EGFR de molécula pequeña Tarceva® (erlotinib), IRESSA (gefitinib), EKB-569 (pelitinib), TKI de EGFR irreversible), pan-ErbB y otros inhibidores de la tirosina quinasa receptora, lapatinib (inhibidor de EGFR y HER2), pelitinib (inhibidor de EGFR y HER2), vandetanib (ZD6474, ZACTIMA™, EGFR, VEGFR2 y RET TKI), PF00299804 (dacomitinib, pan-ErbB TKI irreversible), CI-1033 (pan-erbB TKI irreversible), afatinib (BIBW2992, pan-ErbB TKI irreversible), AV-412 (inhibidor de EGFR y ErbB2 dual), EXEL-7647 (inhibidor de EGFR, ErbB2, GEVGR y EphB4), CO-1686 (EGFR TKI selectivo de mutantes irreversible), AZD9291 (Eg FR TKI selectivo de mutantes irreversible) y HKI-272 (neratinib, inhibidor de EGFR/ErbB2 irreversible). Los métodos descritos en la presente pueden usarse para tratar el cáncer que es resistente al tratamiento con gefitinib, erlotinib, afatinib, CO-1686, AZD9291 y/o cetuximab. Un anticuerpo ejemplar que se puede usar es el EM1-mAb.
Otro aspecto de la invención es el anticuerpo biespecífico como se define en la reivindicación 2(a) o 2(b) para su uso en un método para tratar un sujeto que tiene cáncer, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo biespecífico aislado a un paciente con necesidad de ello durante un tiempo suficiente para tratar el cáncer, en donde el sujeto es resistente o ha adquirido resistencia al tratamiento con erlotinib, gefitinib, afatinib, CO-1686, AZD9291 o cetuximab.
Pueden usarse varios métodos cualitativos y/o cuantitativos para determinar si un sujeto es resistente, ha desarrollado o es susceptible de desarrollar una resistencia al tratamiento con un inhibidor de EGFR. Los síntomas que pueden asociarse con la resistencia a un inhibidor de EGFR incluyen, por ejemplo, una disminución o meseta del bienestar del paciente, un aumento en el tamaño de un tumor, una detención o disminución ralentizada del crecimiento de un tumor, y/o la diseminación de células cancerosas en el cuerpo de una localización a otros órganos, tejidos o células. El restablecimiento o el empeoramiento de varios síntomas asociados con el cáncer también puede ser una indicación de que un sujeto ha desarrollado o es susceptible de desarrollar resistencia a los inhibidores de EGFR, como anorexia, disfunción cognitiva, depresión, disnea, fatiga, trastornos hormonales, neutropenia, dolor, neuropatía periférica, y disfunción sexual. Los síntomas asociados con el cáncer pueden variar según el tipo de cáncer. Por ejemplo, los síntomas asociados con el cáncer cervical pueden incluir sangrado anormal, flujo vaginal pesado inusual, dolor pélvico que no está relacionado con el ciclo menstrual normal, dolor vesical o dolor durante la micción, y sangrado entre los períodos menstruales regulares, después de relaciones sexuales, duchas vaginales, o examen pélvico. Los síntomas asociados con el cáncer de pulmón pueden incluir tos persistente, tos con sangre, dificultad para respirar, dolor en el pecho con sibilancia, pérdida de apetito, pérdida de peso sin intentarlo y fatiga. Los síntomas del cáncer de hígado pueden incluir pérdida de apetito y peso, dolor abdominal, especialmente en la parte superior derecha del abdomen que puede extenderse hacia la espalda y el hombro, náuseas y vómitos, debilidad general y fatiga, un hígado agrandado, inflamación abdominal (ascitis), y una decoloración amarilla de la piel y el blanco de los ojos (ictericia). Un experto en oncología puede identificar fácilmente los síntomas asociados con un tipo de cáncer particular.
Otros medios para determinar si un sujeto ha desarrollado una resistencia a un inhibidor de EGFR incluyen examinar la fosforilación de EGFR, la fosforilación de ERK1/2 y/o la fosforilación de AKT en células cancerosas, donde la fosforilación aumentada puede ser indicativa de que el sujeto se ha desarrollado o es susceptible de desarrollar resistencia a un inhibidor de EGFR. Los métodos para determinar la fosforilación de EGFR, ERK1/2 y/o AKT son bien conocidos y se describen en la presente. La identificación de un sujeto que ha desarrollado una resistencia a un inhibidor de EGFR puede implicar la detección de niveles de expresión de c-Met elevados o actividad de c-Met elevada, por ejemplo, que surgen de niveles elevados de HGF circulante, una mutación activadora del gen de c-Met o una amplificación del gen de c-Met.
Otra realización de la invención es el anticuerpo biespecífico como se define en la reivindicación 2(a) o 2(b) para su uso en un método para tratar NSCLC en un paciente que tiene un tumor NSCLC o metástasis tumoral que tiene una mutación de EGFR activadora o una amplificación del gen de EGFR, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo biespecífico.
Los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos de la invención pueden usarse para tratar cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), que incluye carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma y carcinoma de células grandes. En algunas realizaciones, las células del NSCLC tienen un fenotipo epitelial. En algunas realizaciones, el NSCLC ha adquirido resistencia al tratamiento con uno o más inhibidores de EGFR.
En el NSCLC, las mutaciones específicas en el gen de EGFR se asocian con tasas de respuesta altas (70-80%) a los inhibidores de la tirosina quinasa de EGFR (EGFR-TKI). Una deleción de 5 aminoácidos en el exón 19 o la mutación de punto L858R en EGFR se asocian con sensibilidad a EGFR-TKI (Nakata y Gotoh, Expert Opin Ther Targets 16:771-781, 2012). Estas mutaciones dan como resultado una activación independiente de ligandos de la actividad de la quinasa de EGFR. Las mutaciones de EGFR activadoras tienen lugar en el 10-30% de los pacientes con NSCLC y son significativamente más comunes en asiáticos orientales, mujeres, nunca fumadores y pacientes con histología de adenocarcinoma (Janne y Johnson Clin Cancer Res 12 (14 Suppl): 4416s-4420s, 2006). La amplificación del gen de EGFR está también fuertemente correlacionada con la respuesta después del tratamiento con EGFR-TKI (Cappuzzo et al., J Natl Cancer Inst 97: 643-55, 2005).
Aunque la mayoría de los pacientes con NSCLC con mutaciones de EGFR responden inicialmente a la terapia con EGFR TKI, prácticamente todos adquieren una resistencia que impide una respuesta duradera. El 50-60% de los pacientes adquieren resistencia debido a una mutación de punto en el segundo sitio en el dominio de quinasa de EGFR (T790M). Casi el 60% de todos los tumores que se vuelven resistentes a los inhibidores de la tirosina quinasa de EGFR aumentan la expresión de c-Met, amplifican el gen c-Met o aumentan su único ligando conocido, HGF (Turke et al., Cancer Cell, 17: 77-88, 2010).
Otra realización de la invención es el anticuerpo biespecífico como se define en la reivindicación 2(a) o 2(b) para su uso en un método para tratar un paciente que tiene cáncer, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo biespecífico a un paciente con necesidad de ello durante un tiempo suficiente para tratar el cáncer, en donde el cáncer está asociado con una mutación activadora de EGFR, una amplificación del gen de EGFR, niveles aumentados de HGF circulante, una mutación activadora de c-Met, una amplificación del gen de c-Met o un KRAS mutante.
En algunas realizaciones, la mutación activadora de EGFR es una sustitución de G719A, G719X (siendo X cualquier aminoácido), L861X (siendo X cualquier aminoácido), L858R, E746K, L747S, E749Q, A750P, A755V, V765M, L858P o T790m , deleción de E746 -A750, deleción de R748-P753, inserción de Ala (A) entre M766 y A767, inserción de Ser, Val y Ala (SVA) entre S768 y V769, e inserción de Asn y Ser (NS) entre P772 y H773.
Otra realización de la invención es el anticuerpo biespecífico como se define en la reivindicación 2(a) o 2(b) para su uso en un método para tratar un paciente que tiene cáncer, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo biespecífico a un paciente con necesidad de ello durante un tiempo suficiente para tratar el cáncer, en donde el cáncer está asociado con una mutación de EGFR L858R, T790M o eliminación de los residuos E746-A750 (del(E746, A750)), amplificación de EGFR o amplificación de c-Met.
En algunas realizaciones, el cáncer está asociado con EGFR de tipo salvaje y c-Met de tipo salvaje.
En algunas realizaciones, el cáncer está asociado con EGFR de tipo salvaje y amplificación de c-Met. En algunas realizaciones, el cáncer está asociado con las mutaciones L858R y T790M de EGFR y c-Met de tipo salvaje.
En algunas realizaciones, el cáncer está asociado con la deleción del(E764, A750) de EGFR y c-Met de tipo salvaje.
En algunas realizaciones, el cáncer está asociado con la deleción del(E764, A750) de EGFR y la amplificación de c-Met.
En algunas realizaciones, el cáncer está asociado con la deleción del(E764, A750) de EGFR, la amplificación de EGFR y la amplificación de c-Met.
En algunas realizaciones, el paciente tiene un NSCLC asociado con las mutaciones L858R y T790M de EGFR y c-Met de tipo salvaje.
En algunas realizaciones, el paciente tiene un NSCLC asociado con la amplificación de EGFR y c-Met de tipo salvaje.
En algunas realizaciones, el paciente tiene un NSCLC asociado con la amplificación de EGFR y la amplificación de c-Met.
En algunas realizaciones, el paciente tiene un NSCLC asociado con la deleción del(E764, A750) de EGFR y c-Met de tipo salvaje.
En algunas realizaciones, el paciente tiene un NSCLC asociado con la deleción del(E764, A750) de EGFR y amplificación de c-Met.
En algunas realizaciones, los pacientes se tratan con el EM1-mAb de la invención. El EM1-mAb de la invención muestra eficacia en modelos animales de tumores in vivo, cuando los tumores están asociados con EGFR de L858R, T790M, del(E746, A750), con amplificación de EGFR, c-Met de tipo salvaje y/o amplificación con c-Met. La amplificación de EGFR o c-Met puede evaluarse mediante métodos estándar, por ejemplo, determinando el número de copias del gen de EGFR o c-Met mediante transferencia Southern, FISH o hibridación genómica comparativa (CGH).
Otra realización de la invención es el anticuerpo biespecífico como se define en la reivindicación 2(a) o 2(b) para su uso en un método para tratar a un paciente que tiene cáncer, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo biespecífico a un paciente con necesidad de ello durante un tiempo suficiente para tratar el cáncer, en donde el cáncer está asociado con las mutaciones L858R, T790M de EGFR o la deleción de los residuos E746-A750 (del(E746, A750)), la amplificación de EGFR o la amplificación de c-Met, y KRAS mutante.
En algunas realizaciones, el KRAS mutante tiene una sustitución G12V. KRAS pertenece a la familia de los protooncogenes RAS que codifican las trifosfatasas de guanosina (GTPasas) y media la transducción de señal de EGFR descendiente del receptor. Los tumores con mutaciones KRAS proto-oncogénicas, como la mutación G12V o G12C activadora, no se espera, por lo tanto, que sean tratables con anticuerpos de EGFR. Los estudios clínicos con anticuerpos anti-EGFR cetuximab o panitumumab demostraron que los pacientes con tumores colorrectales mutados con KrAs no responden a estos agentes (Van Cutsem et al., N Eng J Med 360:1408-1417, 2009; Lievre et al., J Clin Oncol 26:374-379, 2008; Amado et al., J Clin Oncol 26:1626-1634m 2008). Los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos de la invención median la destrucción de la línea celular mutante KRAS a través de ADCC efectiva y, por lo tanto, al contrario que las terapias anti-EGFR actuales, pueden ser eficaces en el tratamiento de pacientes cuyo cáncer está asociado con mutaciones activadoras de KRAS. Dicho anticuerpo ejemplar es el EM1-mAb.
Los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren tanto al tratamiento tanto terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas, en donde el objetivo es prevenir o ralentizar (disminuir) un cambio o trastorno fisiológico no deseado, como el desarrollo o la diseminación del cáncer. Para los propósitos de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no están limitados a, alivio de los síntomas, disminución de la extensión de la enfermedad, estado estabilizado (es decir, sin empeoramiento) de la enfermedad, retraso o ralentización de la progresión de la enfermedad, mejoría o paliación del estado de la enfermedad, y la remisión (ya sea parcial o total), ya sea detectable o no detectable. "Tratamiento" también puede significar prolongar la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se recibe tratamiento. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos ya con la afección o trastorno así como los propensos a tener la afección o trastorno o aquellos en los que la afección o trastorno se ha de prevenir.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificacioness y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico de la invención puede variar de acuerdo con factores como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico de la invención para provocar una respuesta deseada en el individuo. Los indicadores ejemplares de un agente terapéutico de EGFR/c-Met eficaz que puede disminuir o reducir en asociación con la resistencia incluyen, por ejemplo, el bienestar mejorado del paciente, la disminución o la reducción del tamaño de un tumor, el crecimiento de un tumor detenido o ralentizado, y/o ausencia de metástasis de células cancerosas a otras localizaciones en el cuerpo.
Administración/Composiciones Farmacéuticas
La invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. Para uso terapéutico, las moléculas que contienen el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico, los dominios de FN3 de unión a EGFR, los dominios de FN3 de unión a c-Met de la divulgación o los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos de la invención pueden prepararse como composiciones farmacéuticas que contienen una cantidad eficaz del dominio, molécula o anticuerpo como ingrediente activo en un portador farmacéuticamente aceptable. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo con el que se administra el compuesto activo. Tales vehículos pueden ser líquidos, como agua y aceites, incluyendo los derivados del petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, como el aceite de cacahuete, el aceite de soja, el aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Por ejemplo, se puede usar un 0,4% de solución salina y un 0,3% de glicina. Estas soluciones son estériles y generalmente libres de material particulado. Pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas (por ejemplo, filtración). Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a condiciones fisiológicas como agentes de ajuste del pH y tamponamiento, agentes estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes, etc. La concentración de las moléculas de la divulgación o los anticuerpos de la invención en dicha formulación farmacéutica puede variar ampliamente, es decir, de menos de aproximadamente el 0,5%, habitualmente a por lo menos aproximadamente el 1% hasta tanto como el 15 o el 20% en peso y se seleccionará principalmente en base a la dosis requerida, los volúmenes de fluidos, las viscosidades, etc., de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado. Los vehículos y formulaciones adecuados, incluyendo otras proteínas humanas, por ejemplo, albúmina sérica humana, se describen, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Filadelfia. PA 2006, Parte 5, Pharmaceutical Manufacturing, páginas 691-1092, Ver especialmente las páginas 958-989.
El modo de administración para el uso terapéutico de las moléculas que contienen el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico, los dominios de FN3 de unión a EGFR, los dominios de FN3 de unión a c-Met de la divulgación o los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos de la invención. puede ser cualquier vía adecuada que administre el agente al huésped, como la administración parenteral, por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o subcutánea, pulmonar, transmucosal (oral, intranasal, intravaginal, rectal), usando una formulación en un comprimido, cápsula, solución, polvo, gel, partícula; y contenido en una jeringuilla, un dispositivo implantado, bomba osmótica, cartucho, microbomba; u otro medio apreciado por el experto en la técnica, como es bien conocido en la técnica. La administración específica del sitio puede lograrse, por ejemplo, mediante administración intrarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitaria, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intrahepática, intracardiaca, intraésa, intrapélvica, intrapericardiaca, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarectal, intrarenal, intraretinal, intraespinal, intrasinovial, intratorácica, intrauterina, intravascular, intravesical, intralesional, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal, o transdérmica.
Por tanto, una composición farmacéutica de la invención para inyección intramuscular puede prepararse para contener 1 ml de agua tamponada estéril, y entre aproximadamente 1 ng y aproximadamente 10 0 mg/kg, por ejemplo, de aproximadamente 50 ng a aproximadamente 30 mg/kg o más preferiblemente, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 25 mg/kg, de las moléculas que contienen el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico, los dominios de FN3 de unión a EGFR o los dominios de FN3 de unión a c-Met de la divulgación.
Los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos de la invención pueden administrarse a un paciente por cualquier vía adecuada, por ejemplo, por vía parenteral mediante infusión intravenosa (IV) o inyección en bolo, por vía intramuscular o subcutánea o intraperitoneal. La infusión IV puede administrarse durante tan solo 15 minutos, pero con más frecuencia durante 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos o incluso 2 o 3 horas. Los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos de la invención también pueden inyectarse directamente en el sitio de la enfermedad (por ejemplo, el propio tumor). La dosis administrada a un paciente que tiene cáncer es suficiente para aliviar o por lo menos detener parcialmente la enfermedad que se está tratando ("cantidad terapéuticamente eficaz") y puede ser algunas veces de de 0,1 a 10 mg/kg por peso corporal, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9 o 10 mg/kg, pero puede ser incluso más alta, por ejemplo, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/kg. También puede administrarse una dosis unitaria fija, por ejemplo, 50, 100, 200, 500 o 1000 mg, o la dosis puede basarse en el área superficial del paciente, por ejemplo, 400, 300, 250, 200, o 100mg/m 2 Habitualmente, pueden administrarse entre 1 y 8 dosis, (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7 u 8 ) para tratar el cáncer, pero se pueden administrar 10, 12, 20 o más dosis. La administración del anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico de la invención puede repetirse después de un día, dos días, tres días, cuatro días, cinco días, seis días, una semana, dos semanas, tres semanas, un mes, cinco semanas, seis semanas, siete semanas, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses o más. También son posibles procesos de tratamiento repetidos, al igual que la administración crónica. La administración repetida puede ser a la misma dosis o a una dosis diferente.
Por ejemplo, una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico de la invención para infusión intravenosa puede estar compuesta de hasta aproximadamente 200 ml de solución de Ringer estéril y de aproximadamente 8 mg a aproximadamente 2400 mg, de aproximadamente 400 mg a aproximadamente 1600 mg, o de aproximadamente 400 mg a aproximadamente 800 mg del anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico para la administración a un paciente de 80 kg. Los métodos para preparar composiciones administrables por vía parenteral son bien conocidos y se describen con más detalle en, por ejemplo, " Remington's Pharmaceutical Science", 15a edición, Mack Publishing Company, Easton, PA .
Las moléculas que contienen el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico, los dominios de FN3 de unión a EGFR, los dominios de FN3 de unión a c-Met de la divulgación o los anticuerpos EGFR/c-Met biespecíficos de la invención pueden liofilizarse para su almacenamiento y reconstituirse en un portador adecuado antes de su uso. Esta técnica ha demostrado ser eficaz con preparaciones de proteínas convencionales y pueden emplearse técnicas bien conocidas de liofilización y reconstitución.
Las moléculas que contienen el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico, los dominios de FN3 de unión a EGFR, los dominios de FN3 de unión a c-Met de la divulgación o los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos de la invención pueden administrarse en combinación con un segundo agente terapéutico simultáneamente, secuencialmente o por separado. El segundo agente terapéutico puede ser un agente quimioterapéutico o una terapia dirigida anti-cancerosa.
El anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico puede administrarse junto con uno cualquiera o más de los fármacos quimioterapéuticos u otros agentes terapéuticos anticancerosos conocidos por los expertos en la técnica. Los agentes quimioterapéuticos son compuestos químicos útiles en el tratamiento del cáncer e incluyen agentes inhibidores del crecimiento u otros agentes citotóxicos e incluyen agentes alquilantes, antimetabolitos, inhibidores anti-microtúbulos, inhibidores de topoisomerasa, inhibidores de la tirosina quinasa del receptor, inhibidores de la angiogénesis y similares. Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes como tiotepa y ciclosfosfamida (CYTOXAN®); sulfonatos de alquilo como busulfán, improsulfán y piposulfán; aziridinas como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilaminasas incluyendo altretamina, trietilenemelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosfoamida y trimetilolomelamina; mostazas nitrogenadas como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina, epirubicina, esorrubicina, idarubicina, marcellomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicinina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos como metotrexato y 5-FU; análogos del ácido fólico como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; antiadrenales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reponedores de ácido fólico como ácido frolínico; aceglatona; glicósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglucido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidracida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; mannomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosine; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; miembros de la familia taxoide o taxana, como paclitaxel (TAXOL®docetaxel (TAXOTERE®) y análogos de los mismos; clorambucil; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino como cisplatina y carboplatina; vinoblastina; platino; etopósido (Vp-l6); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinoico; esperamicinas; capecitabina; inhibidores de tirosina quinasas receptoras y/o angiogénesis, incluyendo sorafenib (NEXAVAR®), sunitinib (SUTENT®), pazopanib (VOTRIENT™), toceranib (PALLADIA™), vandetanib (ZACTIMA™), cediranib (RECENTIN®), regorafenib (BAY 73-4506), axitinib (AG013736), lestaurtinib (CEP-701), erlotinib (TARCEVA®), gefitinib (IRESSA™), BIBW 2992 (TOVOK™), lapatinib (TYKERB®), neratinib (HKI-272), y similares, y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. También se incluyen en esta definición los agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción de hormonas en tumores como los antiestrógenos, incluyendo por ejemplo tamoxifeno, raloxifeno, aromatasa que inhibe 4(5)-imidazoles, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY 117018, onapristona, y toremifeno (FARESTON®); y anti-andrógenos como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. Otros compuestos químicos citotóxicos convencionales como los divulgados en Wiemann et al., 1985, en Medical Oncology (Calabresi et aL, eds.), Capítulo 10, McMillan Publishing, también son aplicables a los métodos que usan los anticuerpos biespecíficos de la presente invención.
Agentes ejemplares que pueden usarse en combinación con las moléculas que contienen el dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico, los dominios de FN3 de unión a EGFR, los dominios de FN3 de unión a c-Met de la divulgación o los anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos de la invención incluyen inhibidores de la tirosina quinasa y terapias anti-cancerígenas dirigidas como Iressa® (gefitinib) y Tarceva (erlotinib) y otros antagonistas de HER2, HER3, HER4 o VEGF. Los antagonistas de HER2 ejemplares incluyen CP-724-714, HERCEPTIN™ (trastuzumab), OMNITARG™ (pertuzumab), TAK-165, lapatinib (inhibidor de EGFR y HER2) y GW-282974. Los antagonistas de HER3 ejemplares incluyen anticuerpos anti-Her3 (ver, por ejemplo, Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2004/0l97332). Los antagonistas de HER4 ejemplares incluyen ARNip anti-HER4 (ver, por ejemplo, Maatta et al., Mol Biol Cell 17: 67-79, 2006. Un antagonista de VEGF ejemplar es el Bevacizumab (Avastin™).
Cuando se usa una molécula pequeña en combinación con el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico de la invención, se administra típicamente con más frecuencia, preferiblemente una vez al día, pero también es posible 2, 3, 4 o más veces al día, como es cada dos días, semanalmente o en algún otro intervalo. Los fármacos de moléculas pequeñas se toman a menudo oralmente, pero también es posible la administración parenteral, por ejemplo, mediante infusión IV o inyección de bolo o subcutánea o intramuscularmente. Las dosis de fármacos de moléculas pequeñas pueden ser típicamente de 10 a 1000 mg, o de aproximadamente 100, 150, 200 o 250 mg.
Cuando el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico de la invención se administra en combinación con un segundo agente terapéutico, la combinación puede tener lugar durante cualquier marco temporal conveniente. Por ejemplo, el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico y el segundo agente terapéutico pueden administrarse a un paciente el mismo día, e incluso en la misma infusión intravenosa. Sin embargo, el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico y el segundo agente terapéutico también pueden administrarse en días alternos o semanas alternas, quincenas o meses, y así sucesivamente. En algunos métodos, el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico y el segundo agente terapéutico se administran con proximidad suficiente en el tiempo para que están presentes simultáneamente (por ejemplo, en el suero) a niveles detectables en el paciente que se está tratando. En algunos métodos, un curso de tratamiento completo del anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico que consiste de una serie de dosis durante un período de tiempo es seguido o precedido por un curso de tratamiento del segundo agente terapéutico que también consiste de una serie de dosis. En algunos métodos, el tratamiento con el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico administrado en segundo lugar se inicia si el paciente tiene resistencia o desarrolla resistencia al segundo agente terapéutico administrado inicialmente. El paciente puede recibir solo un curso único o cursos múltiples de tratamiento con uno o ambos del anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico y el segundo agente terapéutico. Se puede usar un período de recuperación de 1, 2 o varios días o semanas entre la administración del anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico y el segundo agente terapéutico. Cuando ya se ha establecido un régimen de tratamiento adecuado para el segundo agente terapéutico, ese régimen puede usarse en combinación con el anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico de la invención. Por ejemplo, Tarceva® (erlotinib) se toma como una píldora de 100 mg o 150 mg una vez al día, e Iressa® (gefitinib) se toma como un comprimido de 250 mg diariamente.
El anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico, opcionalmente en combinación con el segundo agente terapéutico, puede administrarse junto con cualquier forma de radioterapia que incluya radiación de haz externo, radioterapia de intensidad modulada (IMRT) y cualquier forma de radiocirugía incluyendo Gamma Knife, Cyberknife, Linac y radiación intersticial (por ejemplo, semillas radiactivas implantadas, globo GliaSite) y/o con cirugía. La combinación con radioterapia puede ser especialmente adecuada para el cáncer de cabeza y cuello y tumores cerebrales.
Aunque se ha descrito la invención en términos generales, en los siguientes ejemplos se divulgarán adicionalmente las realizaciones de la invención que no deben interpretarse como limitativas del alcance de las reivindicaciones.
Ejemplo 1. Construcción de bibliotecas Tencon.
Tencon (SEQ ID NO: 1) es un andamiaje similar a inmunoglobulina, dominio de fibronectina tipo III (FN3), diseñado a partir de una secuencia de consenso de quince dominios de FN3 de tenascin-C humana (Jacobs et al., Protein Engineering, Design and Selection), 25:107-117, 2012; Publicación de Patente de Estados Unidos N° 2010/0216708). La estructura cristalina de Tencon muestra seis giros expuestos en la superficie que conectan siete cadenas beta. Estos giros, o residuos seleccionados dentro de cada giro, pueden aleatorizarse para construir bibliotecas de dominios de fibronectina tipo III (FN3) que pueden usarse para seleccionar nuevas moléculas que se unen a objetivos específicos.
Tencon:
LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLK
PGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT (SEQ ID NO 1):
Construcción de la biblioteca TCL1
Se construyó una biblioteca diseñada para aleatorizar solo el giro FG de Tencon (SEQ ID NO: 1), TCL1, para su uso con el sistema de visualización cis (Jacobs et al., Protein Engineering, Design, and Selection, 25:107-117, 2012). En este sistema, se produce una secuencia de ADN de cadena sencilla para un promotor Tac, una secuencia de codificación de la biblioteca Tencon, una secuencia de codificación RepA, un elemento cis y un elemento ori. Tras la expresión en un sistema de transcripción/traducción in vitro, se produce un complejo de la proteína de fusión Tencon-RepA unida en cis al ADN a partir del cual se codifica. Los complejos que se unen a una molécula objetivo se aíslan y amplifican mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), como se describe a continuación.
La construcción de la biblioteca TCL1 para su uso con la visualización cis se logró mediante rondas sucesivas de PCR para producir las moléculas de ADN de cadena doble lineal final en dos mitades; el fragmento 5' contiene las secuencias promotoras y Tencon, mientras que el fragmento 3' contiene el gen repA y los elementos cis y ori. Estas dos mitades se combinan mediante digestión de restricción para producir el constructo completo. La biblioteca TCL1 se diseñó para incorporar aminoácidos aleatorios solo en el giro FG de Tencon, KGGHRSN (SEQ ID NO: 8 6 ). Se usaron codones NNS en la construcción de esta biblioteca, lo que dio como resultado la posible incorporación de los 20 aminoácidos y un codón de terminación en el giro FG. La biblioteca TCL1 contiene seis sub­ bibliotecas separadas teniendo cada una, una longitud de giro FG aleatoriazada diferente, de 7 a 12 residuos, con el propósito de aumentar aún más la diversidad. El diseño de las bibliotecas basadas en Tencon se muestra en la Tabla 2.
Tabla 2.
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Para construir la biblioteca TCL1, se realizaron rondas sucesivas de PCR para adjuntar el promotor Tac, construir la degeneración en el giro FG, y añadir los sitios de restricción necesarios para el ensamblaje final. Primero, se generó una secuencia de ADN que contenía la secuencia promotora y la secuencia Tencon 5' del giro FG por PCR en dos pasos. El ADN correspondiente a la secuencia génica Tencon completa se usó como plantilla de PCR con los cebadores POP2220 (SEQ ID NO: 2) y TC5' a FG (SEQ ID NO: 3). El producto de PCR resultante de esta reacción se usó como plantilla para la siguiente ronda de amplificación por PCR con los cebadores 130mer (SEQ ID NO: 4) y Tc5' a FG para completar la adición de las secuencias 5' y promotora a Tencon. Luego, se introdujo diversidad en el giro FG amplificando el producto de ADN producido en el primer paso con el cebador directo POP2222 (SEQID NO: 5). y cebadores inversos TCF7 (SEQ ID NO: 6 ), TCF8 (SEQ ID NO: 7), TCF9 (SEQ ID NO: 8 ), TCF10 (SEQ ID NO: 9), TCF11 (SEQ ID NO: 10), o TCF12 (SEQ ID NO: 10). 11), que contienen nucleótidos degenerados. Se realizaron por lo menos ocho reacciones de PCR de 100 pl para cada sub-biblioteca para minimizar los ciclos de PCR y maximizar la diversidad de la biblioteca. Por lo menos 5 pg de este producto de PCR se purificaron en gel y se usaron en un paso posterior de PCR, con los cebadores POP2222 (SEQ ID NO: 5) y POP2234 (SEQ ID NO: 12), resultando en la unión de una etiqueta 6 xHis y un sitio de restricción NotI en el extremo 3' de la secuencia Tencon. Esta reacción de PCR se llevó a cabo usando solo quince ciclos de PCR y por lo menos 500 ng de ADN plantilla. El producto de la PCR resultante se purificó en gel, se digirió con la enzima de restricción NotI y se purificó con una columna Qiagen.
El fragmento 3' de la biblioteca es una secuencia de ADN constante que contiene elementos para mostrar, incluyendo un sitio de restricción PspOMI, la región codificante del gen repA y los elementos cis y ori. Las reacciones de PCR se realizaron usando un plásmido (pCR4Blunt) (Invitrogen) que contiene este fragmento de ADN con los cebadores M13 DIrecto y M13 Inverso. Los productos de PCR resultantes se digirieron con PspOMI durante la noche y se purificaron en gel. Para ligar la porción 5' del ADN de la biblioteca al ADN 3' que contiene el gen repA, se ligaron 2 pmol de ADN 5' a una cantidad molar igual de ADN repA 3'en presencia de las enzimas NotI y PspOMI y la ligasa T4. Después de la ligadura durante la noche a 37° C, una pequeña porción del ADN ligado se ejecutó en un gel para comprobar la eficacia de la ligadura. El producto de la biblioteca ligado se dividió en doce amplificaciones de pCr y se realizó una reacción de PCR de 12 ciclos con la pareja de cebadores POP2250 (SEQ ID NO: 13) y DidLigRev (SEQ ID NO: 14). El rendimiento de ADN para cada sub-biblioteca de la biblioteca TCL1 varió de 32-34 |jg.
Para evaluar la calidad de la biblioteca, una pequeña parte de la biblioteca de trabajo se amplificó con los cebadores Tcon5new2 (SEQ ID NO: 15) y Tcon6 (SEQ ID NO: 16), y se clonó en un vector pET modificado mediante clonación independiente de la ligasa. El ADN plasmídico se transformó en células competentes BL21-GOLD (DE3) (Stratagene) y se secuenciaron 96 colonias seleccionadas aleatoriamente usando un cebador promotor T7. No se encontraron secuencias duplicadas. En general, aproximadamente el 70-85% de los clones tenían una secuencia codificante del promotor y de Tencon completa sin mutación por cambio de marco. La tasa de secuencia funcional, que excluye los clones con codones STOP, estaba entre el 59% y el 80%.
Construcción de la biblioteca TCL2
Se construyó la biblioteca TCL2 en la que se aleatorizaron tanto el giro BC como el FG de Tencon y se controló estrictamente la distribución de aminoácidos en cada posición. La Tabla 3 muestra la distribución de aminoácidos en las posiciones de giro deseadas en la biblioteca TCL2. La distribución de aminoácidos diseñada tenía dos objetivos. Primero, la biblioteca se desplazó hacia los residuos que se había predicho que serían estructuralmente importantes para el plegamiento y la estabilidad de Tencon en base al análisis de la estructura cristalina de Tencon y/o al modelo de homología. Por ejemplo, la posición 29 se fijó para ser solo un subconjunto de aminoácidos hidrófobos, ya que este residuo se enterró en el núcleo hidrófobo del pliegue de Tencon. Una segunda capa de diseño incluyó desplazar la distribución de aminoácidos hacia la de los residuos encontrados preferentemente en la cadena pesada HCDR3 de anticuerpos, para producir eficientemente enlazadores de alta afinidad (Birtalan et al., J Mol Biol 377:1518-28, 2008; Olson et al., Protein Sci 16:476-84, 2007). Hacia esta meta, la "distribución diseñada" de la Tabla 3 se refiere a la distribución de la siguiente manera: 6 % de alanina, 6 % de arginina, 3,9% de asparagina, 7,5% de ácido aspártico, 2,5% de ácido glutámico, 1,5% de glutamina, 15% de glicina, 2,3% de histidina, 2,5% de isoleucina, 5% de leucina, 1,5% de lisina, 2,5% de fenilalanina, 4% de prolina, 10% de serina, 4,5% de treonina, 4% de triptófano, 17,3% de tirosina y 4% de valina. Esta distribución está vacía de codones de metionina, cisteína y STOP.
Tabla 3.
Posición del residuo * Residuos de WT Distribución en la biblioteca TCL2
22 T distribución diseñada
23 A distribución diseñada
24 P 50% P distribución diseñada 25 D distribución diseñada
26 A 20% A 20% G distribución diseñada
27 A distribución diseñada
28 F 20% F, 20% I, 20% L, 20% V, 20% Y
29 D 33% D, 33% E, 33% T
75 K distribución diseñada
76 G distribución diseñada
77 G distribución diseñada
78 H distribución diseñada
79 R distribución diseñada
80 S 100% S
81 N distribución diseñada
82 P 50% P distribución diseñada * la numeración de los residuos se basa en la secuencia Tencon de la SEQ ID NO: 1
El fragmento 5' de la biblioteca TCL2 contenía el promotor y la región codificante de Tencon (SEQ ID NO: 1), que se sintetizó químicamente como un grupo de bibliotecas (Sloning Biotechnology). Este grupo de ADN contenía por lo menos 1 X1011 miembros diferentes. Al final del fragmento, se incluyó un sitio de restricción BsaI en el diseño para la ligadura a RepA.
El fragmento 3' de la biblioteca era una secuencia de ADN constante que contenía elementos para su visualización incluyendo una etiqueta 6 xHis, la región codificante del gen repA, y el elemento cis. El ADN se preparó por reacción de PCR usando una plantilla de ADN existente (arriba) y los cebadores LS1008 (SEQ ID NO: 17) y DidLigRev (SEQ ID NO: 14). Para ensamblar la biblioteca TCL2 completa, se ligó un total de 1 jg de ADN de la biblioteca Tencon 5' digerido con BsaI a 3,5 jg del fragmento 3' que se preparó mediante digestión de restricción con la misma enzima. Después de la ligación durante la noche, el ADN se purificó mediante una columna Qiagen y el ADN se cuantificó midiendo la absorbancia a 260 nm. El producto de la biblioteca ligada se amplificó mediante una reacción de PCR de 12 ciclos con la pareja de cebadores POP2250 (SEQ ID NO: 13) y DidLigRev (SEQ ID NO: 14). Se realizaron un total de 72 reacciones, cada una de las cuales contenía 50 ng de productos de ADN ligado como una plantilla. El rendimiento total de ADN de la biblioteca de trabajo de TCL2 fue de aproximadamente 100 |jg. Una pequeña parte de la biblioteca de trabajo se subclonó y se secuenció, como se ha descrito anteriormente para la biblioteca TCL1. No se encontraron secuencias duplicadas. Alrededor del 80% de las secuencias contenían las secuencias codificantes promotoras y Tencon completas sin mutaciones de cambio de marco.
Construcción de la biblioteca TCL14
Los giros superiores (BC, DE y FG) e inferiores (AB, CD y EF), por ejemplo, las superficies de unión informadas en los dominios de FN3 están separadas por las cadenas beta que forman el centro de la estructura de FN3. Las superficies alternativas que residen en los dos "lados" de los dominios de FN3 que tienen formas diferentes a las superficies formadas por giros solo se forman en un lado del dominio de FN3 por dos cadenas beta anti­ paralelas, las cadenas beta C y F, y los giros CD y FG, y en la presente se denomina superficie C-CD-F-FG.
Se generó una biblioteca que aleatorizaba una superficie alternativa de Tencon mediante la aleatorización de residuos expuestos de la superficie seleccionados de las cadenas C y F, así como porciones de los giros CD y FG como se muestra en Figura 1. Se usó una variante de Tencon, Tencon27 (SEQ ID NO: 99) que tenía las siguientes sustituciones en comparación con Tencon (SEQ ID NO: 1) para generar la biblioteca; E11R L17A, N46V, E8 6 I. Una descripción completa de los métodos usados para construir esta biblioteca se describe en la Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2013/0226834.
Ejemplo 2: Selección de dominios de fibronectina tipo III (FN3) que se unen a EGFR e inhiben la unión a EGF Selección de la biblioteca
Se usó visualización Cis para seleccionar dominios de unión a EGFR de las bibliotecas TCL1 y TCL2. Se biotiniló un dominio extracelular humano recombinante de EGFR fusionado a un Fc de IgG1 (R&D Systems) usando métodos estándar y se usó para adsorción (residuos 25-645 de EGFR de longitud completa de la SEQ ID NO: 73). Para la transcripción y traducción in vitro (ITT), se incubaron 2-6 jg de ADN de biblioteca con aminoácidos completos 0.1 mM, componentes de premezcla 1XS30 y 30 j l de extracto S30 (Promega) en un volumen total de 100 j l y se incubaron a 30° C. Después de 1 hora, se añadieron 450 j l de solución de bloqueo (PBS pH 7.4, suplementado con 2% de albúmina de suero bovino, 100 jg/ml de ADN de esperma de arenque y 1 mg/ml de heparina) y la reacción se incubó en hielo durante 15 minutos. Se ensamblaron los complejos de EGFR-Fc:EGF en relaciones molares de EGFR a EGF 1:1 y 10:1 mezclando EGF humano recombinante (R&D Systems) con EGFR-Fc recombinante biotinilado en solución de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente. Para la unión, se mezclaron 500 j l de reacciones de ITT bloqueadas con 100 j l de complejos EGFR-Fc:EGF y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente, después de lo cual los complejos unidos se bajaron con perlas de neutravidina magnética o estreptavidina (Seradyne). Los miembros de la biblioteca sin unir se eliminaron mediante lavados sucesivos con PBST y PBS. Después del lavado, el ADN se eluyó de los complejos unidos calentando a 65° C durante 10 minutos, se amplificó por PCR y se unió a un fragmento de ADN que codifica RepA mediante digestión de restricción y ligación para rondas adicionales de adsorción. Se aislaron enlazadores de alta afinidad reduciendo sucesivamente la concentración de EGFR-Fc objetivo durante cada ronda de 200 nM a 50 nM y aumentando la rigurosidad del lavado. En las rondas 4 y 5, los dominios de FN3 no unidos y débilmente unidos se eliminaron mediante lavado en presencia de un exceso molar de 10 veces de EGFR-Fc no biotinilado durante la noche en PBS.
Después de la adsorción, los dominios de FN3 seleccionados se amplificaron mediante PCR usando los oligonucleótidos Tcon5new2 (SEQ ID NO: 15) y Tcon6 (SEQ ID NO: 16), se subclonaron en un vector pET modificado para incluir un sitio de clonación independiente de la ligasa y se transformaron en células BL21-GOLD (DE3) (Stratagene) para la expresión soluble en E. coli usando técnicas de biología molecular estándar. Se añadió una secuencia génica que codifica una etiqueta de poli-histidina C-terminal a cada dominio de FN3 para permitir la purificación y detección. Los cultivos se cultivaron hasta una densidad óptica de 0,6-0,8 en medio 2YT suplementado con 100 jg/ml de carbenicilina en bloques de 96 pocillos de 1 ml a 37° C antes de la adición de IPTG a 1 mM, momento en el cual la temperatura se redujo a 30° C. Las células se recogieron aproximadamente 16 horas después mediante centrifugación y se congelaron a -20° C. La lisis celular se logró incubando cada sedimento en 0,6 ml de tampón de lisis BugBuster® HT (Novagen EMD Biosciences) con agitación a temperatura ambiente durante 45 minutos.
Selección de dominios de FN3 que se unen a EGFR en las células
Para evaluar la capacidad de diferentes dominios de FN3 para unirse a EGFR en un contexto más fisiológico, se midió su capacidad para unirse a células A431. Las células A431 (American Type Culture Collection, N° de catálogo CRL-1555) sobreexpresan EGFR con ~2 X106 receptores por célula. Las células se colocaron en placas a 5.000/pocillo en placas de 96 pocillos negras opacas y se dejaron unir durante la noche a 37° C, en una atmósfera con 5% de CO2 humidificada. Los lisados bacterianos que expresan el dominio de FN3 se diluyeron 1.000 veces en tampón de tinción FACS (Becton Dickinson) y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en placas por triplicado. Los lisados se eliminaron y las células se lavaron 3 veces con 150 pl/pocillo de tampón de tinción FACS. Las células se incubaron con 50 pl/pocillo de conjugado de anticuerpo anti-penta His-Alexa488 (Qiagen) diluido 1:100 en tampón de tinción FACS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron 3 veces con 150 pl/pocillo de tampón de tinción FACS, después de lo cual los pocillos se llenaron con 100 pl de tampón de tinción FACS y se leyó la fluorescencia a 488 nm usando un lector Acumen eX3. Se analizaron los lisados bacterianos que contenían dominios de FN3 para determinar su capacidad para unirse a células A431 (1320 lisados bacterianos brutos para las bibliotecas de TCL1 y TCL2) y se identificaron 516 clones positivos, donde el enlace era >10 veces sobre la señal de fondo. Se analizaron 300 lisados de la biblioteca TCL14 para su unión, resultando en 58 secuencias de dominio de FN3 únicas que se unen a EGFR.
Selección de dominios de FN3 que inhiben la unión de EGF a EGFR en células
Para caracterizar mejor el mecanismo de unión a EGFR, se midió la capacidad de varios clones del dominio de FN3 identificados para unirse a EGFR de una manera competitiva para EGF usando células A431 y se ejecutó en paralelo con la selección del ensayo de unión a A431. Las células A431 se colocaron en placas a 5.000/pocillo en placas de 96 pocillos negras opacas y se dejaron unir durante la noche a 37° C en una atmósfera con 5% de CO2 humidificada. Las células se incubaron con 50 pl/pocillo de lisado bacteriano diluido 1:1.000 durante 1 hora a temperatura ambiente en placas por triplicado. Se añadió EGF biotinilado (Invitrogen, N° de catálogo E-3477) a cada pocillo para una concentración final de 30 ng/ml y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron 3 veces con 150 pl/pocillo de tampón de tinción FACS. Las células se incubaron con 50 pl/pocillo de conjugado de estreptavidina-ficoeritrina (Invitrogen) diluido 1:100 en tampón de tinción FACS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron 3 veces con 150 pl/pocillo de tampón de tinción FACS, después de lo cual los pocillos se llenaron con 10 0 pl de tampón de tinción FACS y se leyó la fluorescencia a 600 nm usando un lector Acumen eX3.
Los lisados bacterianos que contenían los dominios de FN3 se seleccionaron en el ensayo de competición de EGF descrito anteriormente. Se seleccionaron 1320 lisados bacterianos brutos de las bibliotecas TCL1 y TCL2 resultando en 451 clones positivos que inhibían la unión de EGF en> 50%.
Expresión y purificación de dominios de FN3 identificados que se unen a EGFR
Los dominios de FN3 His-etiquetados se purificaron a partir de lisados de E. coli clarificados con placas His MultiTrap™ HP (GE Healthcare) y se eluyeron en un tampón que contenía fosfato sódico 20 mM, cloruro sódico 500 mM y imidazol 250 mM a pH 7,4. Las muestras purificadas se intercambiaron en PBS pH 7.4 para análisis usando placas PD MultiTrap™ G-25 (GE Healthcare).
Análisis de cromatografía de exclusión por tamaño
Se usó cromatografía de exclusión por tamaño para determinar el estado de agregación de los dominios de FN3 que se unen a EGFR. Se inyectaron alícuotas (10 pl) de cada dominio de FN3 purificado en una columna SuperdeX75 5/150 (GE Healthcare) a un caudal de 0,3 ml/min en una fase móvil de PBS pH 7,4. La elución de la columna se monitorizó mediante absorbancia a 280 nm. Los dominios de FN3 que mostraron niveles altos de agregación por SEC se excluyeron de análisis posteriores.
Constante de disociación de los dominios de FN3 de unión a EGFR seleccionados de EGFR-Fc
Se seleccionaron los dominios de FN3 de unión a EGFR seleccionados para identificar aquellos con tasas de disociación bajas (koff)) en la unión a EGFR-Fc en un instrumento ProteOn XPR-36 (Bio-Rad) para facilitar la selección de enlazadores de alta afinidad. La IgG Fc antihumana de cabra (R&D systems), a una concentración de 5 pg/ml, se inmovilizó directamente mediante acoplamiento de amina (a pH 5.0) en los 6 canales de ligando en orientación horizontal en el chip con un caudal de 30 pl/min en PBS que contenía 0,005% de Tween-20. Las densidades de inmovilización variaron de aproximadamente 1500 Unidades de Respuesta (RU) con menos del 5% de variación entre los diferentes canales. El EGFR-Fc se capturó en la superficie de IgG Fc anti-humana a una densidad de aproximadamente 600 RU en orientación de ligando vertical. Todos los dominios de FN3 probados se normalizaron a una concentración de 1 pM y se probaron para determinar su unión en orientación horizontal. Los 6 canales de analito se utilizaron para los dominios de FN3 para maximizar el rendimiento de la selección La fase de disociación se monitorizó durante 10 minutos a un caudal de 100 pl/min. Las señales de unión entre puntos se usaron como referencias para monitorizar la unión no específica entre analitos y la superficie de IgG inmovilizada, y se restaron de todas las respuestas de unión. Los datos de enlace procesados se ajustaron localmente a un modelo de unión Langmuir simple 1:1 para extraer la koff para cada unión de dominio de FN3 a EGFR-Fc capturado.
Inhibición de la fosforilación de EGFR estimulada por EGF
Los dominios de FN3 de unión a EGFR purificados se probaron para su capacidad para inhibir la fosforilación de EGFR estimulada por EGF en células A431 a una concentración única. La fosforilación de EGFR se monitorizó usando el kit EGFR phospho(Tyr1173) (Meso Scale Discovery). Las células se colocaron en placas a 20.000/pocillo en placas tratadas con cultivo de tejidos de 96 pocillos transparentes (Nunc) en 100 pl/pocillo de medio RPMI (Gibco) que contenía GlutaMAX™ con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Gibco) y se dejó unir durante la noche a 37° C en una atmósfera con 5% de CO2 humidificada . El medio de cultivo se eliminó completamente y las células se mantuvieron en ayunas durante la noche en 100 pl/pocillo de medio que no contenía FBS a 37° C en una atmósfera con 5% de CO2 humidificada. Las células se trataron luego con 100 pl/pocillo de medio de inanición pre­ calentado (37° C) que contenía dominios de FN3 de unión a EGFR a una concentración de 2 pM durante 1 hora a 37° C en una atmósfera con 5% de CO2 humidificada. Los controles se trataron con medio de inanición solamente. Las células se estimularon mediante la adición y la mezcla suave de 100 pl/pocillo de medio de inanición precalentado (37° C) que contenía 100 ng/ml de EGF humano recombinante (R&D Systems, N° de catálogo 236-EG), para concentraciones finales de 50 ng/ml de EGF y 1 pM de dominio de FN3 de unión a EGFR, e incubación a 37° C, 5% de CO2 durante 15 minutos. Un conjunto de pocillos de control se dejó sin estimular como controles negativos. El medio se eliminó completamente y las células se lisaron con 100 pl/pocillo de tampón de lisis completo (Meso Scale Discovery) durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación, según las instrucciones del fabricante. Las placas de ensayo configuradas para medir el EGFR fosforilado en la tirosina 1173 (Meso Scale Discovery) se bloquearon con la solución de bloqueo proporcionada según las instrucciones del fabricante a temperatura ambiente durante 1,5 a 2 horas. Las placas se lavaron 4 veces con 200 pl/pocillo de tampón de lavado 1X Tris (Meso Scale Discovery). Se transfirieron alícuotas de lisado celular (30 pl/pocillo) a placas de ensayo, que se cubrieron con película de sellado de placa (VWR) y se incubaron a temperatura ambiente con agitación durante 1 hora. Las placas de ensayo se lavaron 4 veces con 200 pl/pocillo de tampón de lavado Tris, después de lo cual se agregaron a cada pocillo 25 pl de solución de anticuerpo de detección helada (Meso Scale Discovery), teniendo cuidado de no introducir burbujas. Las placas se incubaron a temperatura ambiente con agitación durante 1 hora, seguido de 4 lavados con 2 0 0 pl/pocillo de tampón de lavado Tris. Las señales se detectaron mediante la adición de 150 pl/pocillo de tampón de lectura (Meso Scale Discovery) y se leyeron en un instrumento SECTOR® Imager 6000 (Meso Scale Discovery) usando las configuraciones predeterminadas específicas del ensayo instaladas por el fabricante. El porcentaje de inhibición de la señal de control positiva estimulada por EGF se calculó para cada dominio de FN3 de unión a EGFR.
La inhibición de la fosforilación de EGFR estimulada por EGF se midió para 232 clones identificados de las bibliotecas TCL1 y TCL2. 22 de estos clones inhibieron la fosforilación de EGFR en >50% a una concentración de 1 pM. Después de la eliminación de los clones que o se expresaron pobremente o se juzgó que eran multiméricos por cromatografía de exclusión por tamaño, se llevaron adelante nueve clones para caracterización biológica adicional. Las secuencias de giro BC y FG de estos clones se muestran en la Tabla 4. Ocho de los nueve clones seleccionados tenían una secuencia de giro FG común (HNVYKDTNMRGL; SEQ ID NO: 95) y se observaron áreas de similitud significativa entre varios clones en sus secuencias de giro BC.
Tabla 4
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Ejemplo 3: Caracterización de los dominios de FN3 de unión a EGFR que inhiben la unión de EGF
Expresión a gran escala, purificación y eliminación de endotoxinas
Los dominios de FN3 mostrados en la Tabla 4 se amplificaron para proporcionar más material para una caracterización detallada. Se usó un cultivo durante la noche que contenía cada variante del dominio de FN3 de unión a EGFR para inocular 0,8 l de medio de cultivo Terrific suplementado con 100 pg/ml de ampicilina a una dilución de 1/80 de cultivo durante la noche en medio fresco, y se incubó con agitación a 37° C. El cultivo se indujo cuando la densidad óptica a 600 nm alcanzó —1.2-1.5 mediante la adición de IPTG a una concentración final de 1 mM y la temperatura se redujo a 30° C. Después de 4 horas, las células se recogieron por centrifugación y el sedimento celular se almacenó a -80° C hasta que fue necesario.
Para la lisis celular, el sedimento descongelado se resuspendió en 1X BugBuster® suplementado con 25 U/ml de Benzonase® (Sigma-Aldrich) y 1 kU/ml de rLysozyme™ (Novagen EMD Biosciences) a una proporción de 5 ml de BugBuster® por gramo de sedimento. La lisis procedió durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave, seguido de centrifugación a 56.000 x g durante 50 minutos a 4° C. El sobrenadante se recogió y se filtró a través de un filtro de 0,2 pm, luego se cargó en una columna HisTrap FF de 5 ml pre-equilibrada con Tampón A (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM) usando el sistema de cromatografía GE Healthcare ÁKTAexplorer 100s. La columna se lavó con 20 volúmenes de columna de tampón A y se lavó adicionalmente con 16% de tampón B (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazol 250 mM) durante 6 volúmenes de columna. Los dominios de FN3 se eluyeron con 50% de B para 10 volúmenes de columna, seguido de un gradiente de 50-100% B sobre 6 volúmenes de columna. Las fracciones que contenían la proteína del dominio de FN3 se agruparon, se concentraron usando un concentrador Millipore 10K MWCO, y se filtraron antes de cargarlas en una columna HiLoad™ 16/60 SuperdeX™ 75 (GE Healthcare) pre-equilibrada con PBS. Se mantuvo el pico de monómero de proteína que se eluye de la columna de exclusión por tamaño.
Las endotoxinas se eliminaron usando un enfoque por lotes con resina ActiClean EtoX (Sterogene Bioseparations). Antes de la eliminación de la endotoxina, la resina se pre-trató con NaOH 1 N durante 2 horas a 37° C (o durante la noche a 4° C) y se lavó extensamente con PBS hasta que el pH se estabilizó a ~7 como se mide con papel indicador de pH. La proteína purificada se filtró a través de un filtro de 0,2 pm antes de añadir 1 ml de resina EtoX a una proporción de 10 ml de proteína por 1 ml de resina. Se permitió que procediese la unión de la endotoxina a la resina a temperatura ambiente durante por lo menos 2 horas con rotación suave. La resina se eliminó mediante centrifugación a 500 x g durante 2 minutos y se mantuvo el sobrenadante de la proteína. Los niveles de endotoxinas se midieron usando cartuchos EndoSafe®-PTS™ y se analizaron en un lector EndoSafe®-MCS (Charles River). Si los niveles de endotoxinas estaban por encima de 5 EU/mg después del primer tratamiento con Etox, se repitió el procedimiento anterior hasta que los niveles de endotoxinas disminuyeron a >5 EU/mg. En los casos en que el nivel de endotoxinas estaba por encima de 5 EU/mg y se estabilizó después de dos tratamientos consecutivos con Etox, se establecieron condiciones de cromatografía de intercambio aniónico o de interacción hidrófoba para que la proteína eliminara las endotoxinas restantes.
Determinación de afinidad de los dominios de FN3 de unión a EGFR seleccionados para EGFR-Fc (afinidad de EGFR-Fc)
La afinidad de unión de los dominios de FN3 de unión a EGFR seleccionados para el dominio extracelular de EGFR recombinante se caracterizó adicionalmente por métodos de resonancia de plasmón de superficie usando un Instrumento Proteon (BioRad). La configuración del ensayo (preparación de chip, captura de EGFR-Fc) fue similar a la descrita anteriormente para el análisis de velocidad de disociación. Los dominios de FN3 de unión a EGFR seleccionados se probaron a una concentración de 1 pM en series de dilución de 3 veces en la orientación horizontal. También se inyectó una muestra de tampón para controlar la estabilidad del valor de referencia. La fase de disociación para todas las concentraciones de cada dominio de FN3 de unión a EGFR se controló a un caudal de 100 pl/min durante 30 minutos (para aquellos con koff ~10' 2 s_1 de la selección de la velocidad de disociación), o 1 hora (para aquellos con koff ~10' 3 s_1 o más lento). Se restaron dos conjuntos de datos de referencia de los datos de respuesta: 1) las señales entre puntos para corregir las interacciones no específicas entre el dominio de FN3 de unión a EGFR y la superficie de IgG inmovilizada; 2) las señales del canal de tampón para corregir el desplazamiento del valor de referencia debido a la disociación de la superficie de EGFR-Fc capturada en el tiempo. Los datos de unión procesados a todas las concentraciones para cada dominio de FN3 se ajustaron globalmente a un modelo de unión de Langmuir simple 1:1 para extraer estimaciones de las constantes cinéticas (kon, koff) y de afinidad (Kd). La Tabla 5 muestra las constantes cinéticas para cada una de los constructos, con una afinidad que varía de 200 pM a 9.6 nM.
Unión de los dominios de FN3 de unión a EGFR seleccionados para EGFR en células ("Ensayo de unión de células A431")
Las células A431 se colocaron en placas a 5.000/pocillo en placas de 96 pocillos negras opacas y se permitió que se uniesen durante la noche a 37° C, en una atmósfera con 5% de CO2 humidificada. Los dominios de FN3 de unión a EGFR purificados (1,5 nM a 30 pM) se añadieron a las células (en 50 ul) durante 1 hora a temperatura ambiente en placas por triplicado. Se eliminó el sobrenadante y las células se lavaron 3 veces con 150 pl/pocillo de tampón de tinción FACS. Las células se incubaron con 50 pl/pocillo de conjugado de anticuerpo antipenta His-Alexa488 (Qiagen) diluido 1:100 en tampón de tinción FACS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron 3 veces con 150 pl/pocillo de tampón de tinción FACS, después de lo cual los pocillos se llenaron con 100 pl de tampón de tinción FACS y se leyó la fluorescencia a 488 nm usando un lector Acumen eX3. Los datos se representaron como señal de fluorescencia bruta frente al logaritmo de la concentración molar del dominio de FN3 y se ajustaron a una curva de respuesta a la dosis sigmoidal con pendiente variable usando GraphPad Prism 4 (software GraphPad) para calcular los valores de EC50. La Tabla 5 informa de los EC50 para cada uno de los constructos que varían de 2,2 nM a >20 pM.
Inhibición de la unión de EGF a EGFR en células usando dominios de FN3 de unión a EGFR seleccionados (ensayo de competición de EGF de células A431)
Las células A431 se colocaron en placas a 5.000/pocillo en placas de 96 pocilios negras opacas y se dejaron unir durante la noche a 37° C, en una atmósfera con 5% de CO2 humidificada. Se añadieron dominios de FN3 de unión a EGFR purificados (1,5 nM a 30 j M) a las células (50 jl/pocillo) durante 1 hora a temperatura ambiente en placas por triplicado. Se añadió EGF biotinilado (Invitrogen, N° de catálogo: E-3477) a cada pocillo para dar una concentración final de 30 ng/ml y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron 3 veces con 150 jl/pocillo de tampón de tinción FACS. Las células se incubaron con 50 jl/pocillo de conjugado de estreptavidina-ficoeritrina (Invitrogen) diluido 1:100 en tampón de tinción FACS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron 3 veces con 150 jl/pocillo de tampón de tinción FACS, después de lo cual los pocillos se llenaron con 100 j l de tampón de tinción FACS y se leyó la fluorescencia a 600 nm usando un lector Acumen eX3. Los datos se representaron como señal de fluorescencia bruta frente al logaritmo de la concentración molar del dominio de FN3 y se ajustaron a una curva de respuesta a la dosis sigmoidal con pendiente variable usando GraphPad Prism 4 (software GraphPad) para calcular los valores de IC50. La Tabla 5 informa de los valores de IC50 que varían de 1.8 nM a 121 nM.
Inhibición de la fosforilación de EGFR estimulada por EGF (ensayo Phoshpo EGFR)
Los dominios de FN3 seleccionados que inhibieron significativamente la fosforilación de EGFR estimulada por EGF se evaluaron más completamente midiendo los valores de IC50 para la inhibición. La inhibición de la fosforilación de EGFR estimulada por EGF se evaluó a concentraciones del dominio de FN3 variables (0,5 nM a 10 j M) como se describe anteriormente en "inhibición de la fosforilación de EGFR estimulada por EGF". Los datos se representaron como señal de electroquimioluminiscencia frente al logaritmo de la concentración molar del dominio de FN3 y los valores de IC50 se determinaron ajustando los datos a una respuesta a la dosis sigmoidal con pendiente variable utilizando GraphPad Prism 4 (GraphPad Software). La Tabla 5 muestra los valores de IC50 que variaron de 18 nM a > 2.5 jM.
Inhibición del crecimiento de células tumorales humanas (crecimiento de NCI-H292 y ensayo de crecimiento de NCI-H322)
La inhibición del crecimiento celular dependiente de EGFR se evaluó midiendo la viabilidad de las líneas celulares de tumores humanos que sobreexpresan EGFR, NCI-H292 y NCI-H322 (American Type Culture Collection, N° de catálogo CRL-1848 y N° CRL-5806, respectivamente), tras la exposición a los dominios de FN3 de unión a EGFR. Las células se colocaron en placas a 500 células/pocillo (NCI-H292) o 1.000 células/pocillo (NCI-H322) en placas tratadas con cultivo de tejidos de 96 pocillos blancas opacas (Nunc) en 100 jl/pocillo de medio RPMI (Gibco) que contenía GlutaMAX™ y 10 mM HEPES, suplementado con 10% de suero fetal bovino inactivado por calor (Gibco) y 1% de penicilina/estreptomicina (Gibco) y se dejó unir durante una noche a 37° C en una atmósfera con 5% de CO2 humidificada. Las células se trataron mediante la adición de 5 jl/pocillo de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía un intervalo de concentración de dominios de FN3 de unión a EGFR. Los controles se trataron con 5 jl/pocillo de PBS solo o con ácido etilendiaminotetraacético 25 mM en PBS. Las células se incubaron a 37° C, 5% de CO2 durante 120 horas. Las células viables se detectaron mediante la adición de 75 jl/pocillo de reactivo CellTiter-Glo® (Promega), seguido de mezclado en un agitador de placas durante 2 minutos, y la incubación a oscuras a temperatura ambiente durante otros 10 minutos. Las placas se leyeron en un lector de placas SpectraMaX M5 (Molecular Devices) configurado en modo de luminiscencia, con un tiempo de lectura de 0,5 segundos/pocillo contra un blanco de medio solamente. Los datos se representaron como un porcentaje del crecimiento celular tratado con PBS frente al logaritmo de la concentración molar del dominio de FN3. Los valores de IC50 se determinaron ajustando los datos a la ecuación para una respuesta a la dosis sigmoidal con pendiente variable utilizando GraphPad Prism 4 (software GraphPad). La Tabla 5 muestra los valores de IC50 que varían de 5,9 nM a 1,15 jM y 9,2 nM a >3,1 jM, usando las células NCI-H292 y NCI-H322 respectivamente. La Tabla 5 muestra el resumen de las propiedades biológicas de los dominios de FN3 de unión a EGFR para cada ensayo.
Tabla 5
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Ejemplo 4: Diseño de los dominios de FN3 de unión a EGFR
Se diseñó un subconjunto de los dominios de FN3 de unión a EGFR para aumentar la estabilidad conformacional de cada molécula. Las mutaciones L17A, N46V y E8 6 I que han demostrado mejorar la estabilidad del dominio de FN3 (descritas en la Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2011/0274623) se incorporaron en los clones P54AR4-83, P54CR4-31 y P54AR4-37 mediante síntesis de ADN. Los nuevos mutantes, P54AR5-83v2, P54CR431-v2 y P54AR4-37v2 se expresaron y purificaron como se describe anteriormente. Se usó calorimetría diferencial de barrido en PBS para evaluar la estabilidad de cada mutante para compararla con la de la molécula original correspondiente. La Tabla 6 muestra que cada molécula variante se estabilizó significativamente, con un aumento medio en Tm de 18,5° C.
Tabla
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Ejemplo 5: Selección de dominios de fibronectina tipo III (FN3) que se unen a c-Met e inhiben la unión de HGF
Adsorción en c-Met humano
La biblioteca TCL14 se seleccionó frente al dominio extracelular de c-Met humano biotinilado (bt-c-Met) para identificar dominios de FN3 capaces de unirse específicamente a c-Met. Para las selecciones, 3 |jg de la biblioteca TCL14 se transcribieron y tradujeron in vitro (IVTT) en extracto lineal de E. coli S30 (Promega, Madison, WI) y la biblioteca expresada bloqueada con bloqueo Cis (2% de BSA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 100 jg/ml de ADN de esperma de arenque (Promega), 1 mg/ml de heparina (Sigma-Aldrich)). Para las selecciones, se añadió btc-Met a concentraciones de 400 nM (Ronda 1 ), 2 0 0 nM (Rondas 2 y 3) y 10 0 nM (Rondas 4 y 5). Los miembros de la biblioteca unidos se recuperaron usando perlas magnéticas de neutravidina (Thermo Fisher, Rockford, IL) (Rondas 1, 3 y 5) o perlas magnéticas de estreptavidina (Promega) (Rondas 2 y 4) y los miembros de la biblioteca no unidos se eliminaron lavando las perlas 5 -14 veces con 500 ul de PBS-T seguido de 2 lavados con 500 j l de PBS.
Se realizaron rondas de selección adicionales para identificar las moléculas de dominios de FN3 con afinidades mejoradas. En resumen, los resultados de la ronda 5 se prepararon como se ha descrito anteriormente y se sometieron a rondas de selección iterativas adicionales con los siguientes cambios: la incubación con bt-c-Met se redujo de 1 hora a 15 minutos y la captura de perlas se redujo de 20 minutos a 15 minutos el bt-c-Met se redujo a 25 nM (Rondas 6 y 7) o 2,5 nM (Rondas 8 y 9), y se realizó un lavado adicional de 1 hora en presencia de un exceso de c-Met no biotinilado. El objetivo de estos cambios fue seleccionar simultáneamente para enlazadores con una constante de afinidad potencialmente más rápida y una constante de disociación más lenta produciendo una Kd sustancialmente menor.
Los resultados de las rondas 5, 7 y 9 se clonaron por PCR en un vector pET15 modificado (EMD Biosciences, Gibbstown, NJ) que contenía un sitio de clonación independiente de la ligasa (pET15-LIC) usando cebadores TCON6 (SEQ ID NO. 30) y TCON5 E86I corto (SEQ ID NO 31), y las proteínas se expresaron como proteínas etiquetadas con His6 C-terminales después de las transformaciones y la inducción de IPTG (1 mM final, 30° C durante 16 horas) utilizando protocolos estándar. Las células se recogieron por centrifugación y posteriormente se lisaron con Bugbuster HT (EMD Biosciences) suplementado con 0,2 mg/ml de lisozima blanca de huevo de gallina (Sigma-Aldrich). Los lisados bacterianos se clarificaron por centrifugación y los sobrenadantes se transfirieron a nuevas placas de 96 pocillos profundas.
Detección de dominios de FN3 que inhiben la unión de HGF a c-Met
Los dominios de FN3 presentes en lisados de E. coli se seleccionaron por su capacidad para inhibir la unión de HGF al dominio extracelular de c-Met purificado en un formato bioquímico. La quimera de c-Met Fc humana recombinante (0,5 pg/ml en PBS, 100 pl/pocillo) se recubrió en placas Maxisorp blancas de 96 pocillos (Nunc) y se incubó durante la noche a 4° C. Las placas se lavaron dos veces con 300 pl/pocillo de solución salina tamponada con Tris con 0,05% de Tween 20 (TBS-T, Sigma-Aldrich) en un lavador de placas Biotek. Las placas de ensayo se bloquearon con StartingBlock T20 (200 pl/pocillo, Thermo Fisher Scientific, Rockland, IL) durante 1 hora a temperatura ambiente (RT) con agitación y se lavaron de nuevo dos veces con 300 pl de TBS-T. Los lisados del dominio de FN3 se diluyeron en StartingBlock T20 (de 1:10 a 1:100.000) usando el sistema robótico Hamilton STARplus. Los lisados (50 pl/pocillo) se incubaron en placas de ensayo durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Sin lavar las placas, se añadió bt-HGF (1 pg/ml en StartingBlock T20, 50 pl/pocillo, biotinilado) a la placa durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación. Los pocillos de control que contenían lisados Tencon27 recibieron o B StartingBlock T20 o bt-HGF diluido. Las placas se lavaron cuatro veces con 300 pl/pocillo de TBS-T y se incubaron con 100 pl/pocillo de estreptavidina-HRP (1:2000 en TBS-T, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) durante 30-40 minutos a temperatura ambiente con agitación. Las placas se lavaron de nuevo cuatro veces con TBS-T. Para desarrollar la señal, se añadió a la placa sustrato de quimioluminiscencia POD (50 pl/pocillo, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y en aproximadamente 3 minutos se leyó la luminiscencia en un Molecular Devices M5 usando SoftMaXPro. El porcentaje de inhibición se determinó usando el siguiente cálculo: 100-((RLUmuestra-Medio RLUsin control m-hgf)/(RLU mediobt-HGF-control - RLU medioSin control bt-HGF)*100). Los valores de porcentaje de inhibición del 50% o más se consideraron aciertos.
Expresión y purificación de alto rendimiento de dominios de FN3
Los dominios de FN3 His-etiquetados se purificaron a partir de lisados de E. coli clarificados con placas His MultiTrap™ HP (GE Healthcare) y se eluyeron en un tampón que contenía fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 500 mM e imidazol 250 mM a pH 7,4. Las muestras purificadas se intercambiaron en PBS pH 7.4 para análisis usando placas PD MultiTrap™ G-25 (GE Healthcare).
Determinación de IC 50 de la inhibición de la unión de HGF a c-Met
Los dominios de FN3 seleccionados se caracterizaron adicionalmente en el ensayo de competición HGF. Se generaron curvas de respuesta a la dosis para dominios de FN3 purificados utilizando el ensayo descrito anteriormente (concentraciones iniciales de 5 pM). Se calcularon los valores de porcentaje de inhibición. Los datos se representaron como % de inhibición frente al logaritmo de las concentraciones molares del dominio de FN3 y los valores de IC50 se determinaron ajustando los datos a una respuesta de dosis sigmoidal con pendiente variable utilizando GraphPad Prism 4.
Se identificaron 35 secuencias únicas de la Ronda 5 para mostrar actividad a diluciones de 1:10, con valores de IC50 que oscilan entre 0,5 y 1500 nM. La ronda 7 produjo 39 secuencias únicas con actividad a diluciones de 1:100 y valores de IC50 que oscilaron entre 0,16 y 2,9 nM. Se identificaron 66 secuencias únicas de la Ronda 9, donde los aciertos se definieron como activos a diluciones de 1:1000. Se observaron valores de IC50 tan bajos como 0,2 nM en la Ronda 9 (Tabla 8).
Determinación de afinidad de dominios de FN3 de unión a c-Met seleccionados para c-Met-Fc (afinidad EGFR-Fc)
Se determinaron las afinidades para los dominios de FN3 de unión a c-Met seleccionados como se describe en el Ejemplo 3 para la determinación de afinidad para los dominios de FN3 de unión a EGFR seleccionados, excepto que se usó c-Met-Fc en los ensayos.
Ejemplo 6: Caracterización de dominios de FN3 que se unen a c-Met e inhiben la unión de HGF
Los dominios de FN3 se expresaron y purificaron como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 2. La cromatografía de exclusión por tamaño y el análisis cinético se realizaron como se ha descrito anteriormente en los Ejemplos 1 y 2, respectivamente. La Tabla 7 muestra las secuencias de la cadena C, el giro CD, la cadena F y el giro FG, y una SEQ ID NO: para la secuencia de aminoácidos completa para cada dominio.
Tabla 7
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Unión de dominios de FN3 de unión a c-Met seleccionados para c-Met en células ("Ensayo de unión de células H441")
Se colocaron en placas células NCI-H441 (N° de Catálogo HTB-174, American Type Culture Collection, Manassas, VA) a 20.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos de fondo transparente negro recubiertas con Poli-D-lisina (BD Biosciences, San Jose, CA) y se permitió que se uniesen durante la noche a 37° C, 5% de CO2. Se añadieron dominios de FN3 purificados (50 pl/pocillo; 0 a 1000 nM) a las células durante 1 hora a 4° C en placas duplicadas. Se eliminó el sobrenadante y las células se lavaron tres veces con tampón de tinción FACS (150 pl/pocillo, BD Biosciences, N° de catálogo 554657). Las células se incubaron con anticuerpo anti-HIS biotinilado (diluido 1:160 en tampón de tinción FACS, 50 pl/pocillo, R&D Systems, N° de de catálogo BAM050) durante 30 minutos a 4° C. Las células se lavaron tres veces con tampón de tinción FACS (150 pl/pocillo), después de lo cual los pocillos se incubaron con anticuerpo conjugado anti-IgG1-Alexa 488 (diluido 1:80 en tampón de tinción FACS, 50 pl/pocillo, Life Technologies, N° de catálogo A21121) durante 30 minutos a 4° C. Las células se lavaron tres veces con tampón de tinción FACS (150 pl/pocillo) y se dejaron en tampón de tinción FACS (50 pl/pocillo). La fluorescencia total se determinó usando un lector Acumen eX3. Los datos se representaron como señal de fluorescencia bruta frente a logaritmo de la concentración molar del dominio de FN3 y se ajustaron a una curva de respuesta a la dosis sigmoidal con pendiente variable usando GraphPad Prism 4 (GraphPad Software) para calcular los valores de EC50. Se descubrió que los dominios de FN3 mostraban un intervalo de actividades de unión, con valores de EC5 0entre 1,4 nM y 22,0 nM, como se muestra en la Tabla 8.
Inhibición de la fosforilación de c-Met estimulada por HGF
Los dominios de FN3 purificados se probaron para determinar su capacidad para inhibir la fosforilación de c-Met estimulada por HGF en NCI-H441, usando el kit c-Met phospho(Tyr1349) de Meso Scale Discovery (Gaithersburg, MD). Las células se colocaron en placa a 20.000/pocillo en placas tratadas con cultivo de tejido de 96 pocillos transparentes en 100 pl/pocillo de medio RPMI (que contenía GlutamaX y HEPES, Life Technologies) con 10% de suero bovino fetal (FBS; Life Technologies) y se permitió que se uniese durante la noche a 37° C, 5% de CO2 . El medio de cultivo se eliminó completamente y las células se mantuvieron en ayunas durante la noche en medio RPMI libre de suero (100 pl/pocillo) a 37° C, 5% de CO2. Las células se repusieron con medio RPMI libre de suero nuevo (100 pl/pocillo) que contenía dominios de FN3 a una concentración de 20 pM e inferior durante 1 hora a 37° C, 5% de CO2. Los controles se trataron con medio solamente. Las células se estimularon con 100 ng/ml de HGF humano recombinante (100 pl/pocillo, R&D Systems N° de catálogo 294-HGN) y se incubaron a 37° C, 5% de CO2.durante 15 minutos. Un conjunto de pocillos de control se dejó sin estimular como controles negativos. El medio se eliminó completamente y las células se lisaron con tampón de lisis completo (50 pl/pocillo, Meso Scale Discovery) durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación, según las instrucciones del fabricante. Las placas de ensayo configuradas para medir el c-Met fosforilado se bloquearon con la solución de bloqueo proporcionada según las instrucciones del fabricante a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron luego tres veces con tampón de lavado Tris (200 pl/pocillo, Meso Scale Discovery). Los lisados celulares (30 pl/pocillo) se transfirieron a placas de ensayo y se incubaron a temperatura ambiente con agitación durante 1 hora. Las placas de ensayo se lavaron luego cuatro veces con tampón de lavado Tris, después de lo cual se añadió solución de anticuerpo de detección se enfrió con hielo (25 pl/pocillo, Meso Scale Discovery) a cada pocillo durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Las placas se enjuagaron de nuevo cuatro veces con tampón de lavado Tris. Las señales se detectaron mediante la adición de 150 de tampón de lavado (150 pl/pocillo, Meso Scale Discovery) y la lectura en un instrumento SECTOR® Imager 6000 (Meso Scale Discovery) usando la configuración predeterminada específica del ensayo instalada por el fabricante. Los datos se representaron como señal de electroquimioluminiscencia frente al logaritmo de la concentración molar del dominio de FN3 y los valores de a IC50 se determinaron ajustando los datos a una respuesta de dosis sigmoidal con pendiente variable usando GraphPad Prism 4. Se descubrió que los dominios de FN3 inhiben el c-Met fosforilado con valores de IC50 que varían de 4,6 nM a 1415 nM, como se muestra en la Tabla 8.
Inhibición del crecimiento o viabilidad de células tumorales humanas
La inhibición del crecimiento celular dependiente de c-Met se evaluó midiendo la viabilidad de las células U87-MG (American Type Culture Collection, N° de catálogo HTB-14), después de la exposición a los dominios de FN3 de unión a c-Met. Las células se colocaron en placas a 8000 células por pocillo en placas tratadas con cultivo de tejido de 96 pocillos blancas opacas (Nunc) en 100 pl/pocillo de medio RPMI, suplementado con 10% de FBS y se permitió que se uniesen durante la noche a 37° C, 5% de CO2. Veinticuatro horas después de la colocación en placas, el medio se aspiró y las células se repusieron con medio RPMI libre de suero. Veinticuatro horas después de la inanición del suero, las células se trataron mediante la adición de medio libre de suero que contenía dominios de FN3 de unión a c-Met (30 pl/pocillo). Las células se incubaron a 37° C, 5% de CO2 durante 72 horas. Las células viables se detectaron mediante la adición de 100 pl/pocillo de reactivo CellTiter-Glo® (Promega), seguido de mezclado en un agitador de placas durante 10 minutos. Las placas se leyeron en un lector de placas SpectraMaXM5 (Molecular Devices) configurado en modo de luminiscencia, con un tiempo de lectura de 0,5 segundos/pocillo. Los datos se representaron como unidades de luminiscencia brutas (RLU) frente al logaritmo de la concentración molar del dominio de FN3. Los valores de IC50 se determinaron ajustando los datos a una ecuación para una respuesta a la dosis sigmoidal con pendiente variable usando GraphPad Prism 4. La Tabla 8 informa de los valores de IC50 que varían de 1 nM a >1000 nM. Las características de los dominios de FN3 de unión a c-Met se resumen en la Tabla 8.
Tabla 8
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Estabilidad térmica de los dominios de FN3 de unión a c-Met
Se usó calorimetría diferencial de barrido en PBS para evaluar la estabilidad de cada dominio de FN3. Los resultados del experimento se muestran en la Tabla 9.
Tabla 9.
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Ejemplo 7. Generación y caracterización de moléculas anti-EGFR/c-Met biespecíficas
Generación de moléculas de EGFR/c-Met biespecíficas
Numerosas combinaciones de los dominios de FN3 de unión a EGFR y c-Met descritas en los Ejemplos 1-6 se unieron en moléculas biespecíficas capaces de unirse tanto a EGFR como a c-Met. Adicionalmente, los dominios de FN3 de unión a EGFR que tienen secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO: 107-110 y los dominios de FN3 de unión a c-Met que tienen secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NO: 111-114 se hicieron y se unieron en moléculas biespecíficas. Se crearon genes sintéticos para codificar las secuencias de aminoácidos descritas en las SEQ ID NO: 50-72 y 106 (Tabla 10) de tal manera que se mantuvo el siguiente formato: dominio de FN3 de unión a EGFR seguido de un conector peptídico seguido de un dominio de FN3 de unión a c-Met. Se incorporó una etiqueta de poli-histidina en el extremo C-terminal para ayudar a la purificación. Además de las moléculas descritas en la Tabla 10, el conector entre dos dominios de FN3 se varió de acuerdo a la longitud, composición de secuencia y estructura de acurdo a las enumerados en la Tabla 11. Se prevé que se podría usar una serie de otros conectores para enlazar tales moléculas de EGFR/c-Met biespecíficas de dominios de FN3 que se expresaron y purificaron a partir de E. coli como se describe para los dominios de FN3 de EGFR o c-Met monoespecíficos usando pasos de IMAC y de cromatografía de filtración en gel.
Tabla 10
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Tabla 11
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Las moléculas de EGFR/c-Met biespecíficas mejoran la potencia en comparación con las moléculas monoespecíficas solas, lo que sugiere avidez
Se colocaron en placas células NCI-H292 en placas de 96 pocilios en medio RPMI que contenía 10% de FBS. 24 horas después, el medio se reemplazó con RPMI sin suero. 24 horas después de la inanición del suero, las células se trataron con concentraciones variables de dominios de FN3: ya sea un dominio de FN3 de EGFR monoespecífico de alta afinidad (P54AR4-83v2), un dominio de FN3 de c-Met monoespecífico de afinidad debil (P114AR5P74-A5), la mezcla de los dos dominios monoespecíficos de FN3 de EGFR y c-Met, o moléculas de EGFR/c-Met biespecíficas compuestas del dominio de FN3 de c-Met de baja afinidad enlazado al dominio de FN3 de EGFR de alta afinidad (ECB1). Las células se trataron durante 1 h con las moléculas monoespecíficas o biespecíficas y luego se estimularon con EGF, HGF o una combinación de EGF y HGF durante 15 minutos a 37° C, 5% de CO2. Las células se lisaron con Tampón de lisis MSD y la señalización celular se evaluó usando placas de ensayo MSD adecuadas, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, como se ha descrito anteriormente.
El dominio de FN3 de c-Met de baja afinidad inhibió la fosforilación de c-Met con un IC50 de 610 nM (Figura 4). Como se esperaba, el dominio de FN3 de EGFR no fue capaz de inhibir la fosforilación de c-Met y la mezcla de las moléculas monoespecíficas parecía idéntica al dominio de FN3 de c-Met solo. Sin embargo, la molécula de EGFR/c-Met biespecífica inhibió la fosforilación de c-Met con un IC50 de 1 nM (Figura 4), proporcionando más de un cambio de 2 log en la mejora de la potencia en relación con el c-Met monoespecífico solamente.
El potencial de la molécula de EGFR/c-Met biespecífica para mejorar la inhibición de la fosforilación de c-Met y/o EGFR a través de un efecto de avidez se evaluó en múltiples tipos de células con densidades y proporciones de c-Met y EGFR variables (Figura 5). Las células NCI-H292, NCI-H441 o NCI-H596 se colocaron en placas en placas de 96 pocillos en medio RPMI que contenía 10% de FBS. 24 horas después, el medio se reemplazó con RPMI libre de suero. 24 horas después de la inanición del suero, las células se trataron con concentraciones variables de o dominio de FN3 de unión a EGFR monoespecífico, dominio de FN3 de c-Met monoespecífico o una molécula de EGFR/c-Met biespecífica (ECB5, compuesta de P53A1R5-17v2 y P114AR7P94-A3) . Las células se trataron durante 1 h con las moléculas monoespecíficas o biespecíficas y luego se estimularon con EGF, HGF, o una combinación de EGF y HGF durante 15 minutos a 37° C, 5% de CO2. Las células se lisaron con tampón de lisis MSD y la señalización celular se evaluó usando placas de ensayo MSD adecuadas, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, como se ha descrito anteriormente.
La Figura 5 (A-C) muestra la inhibición de EGFR usando un dominio de FN3 de unión a EGFR monoespecífico en comparación con una molécula de EGFR/cMet biespecífica en tres líneas celulares diferentes. Para evaluar la avidez en un ensayo de fosforilación de EGFR, se comparó un dominio de FN3 de unión a EGFR de afinidad media (1,9 nM) (P53A1R5-17v2) con una molécula de EGFR/c-Met biespecífica que contenía el mismo dominio de FN3 de unión a EGFR enlazado a un dominio de FN3 de unión a c-Met de alta afinidad (0,4 nM) (P114AR7P94-A3). En las células NCI-H292 y H596, la inhibición de la fosforilación de EGFR fue comparable para las moléculas monoespecíficas y biespecíficas (Figuras 5A y 5B), probablemente porque estas líneas celulares tienen una alta proporción de receptores de EGFR a de c-Met. Para probar esta teoría, se evaluó la inhibición de la fosforilación de EGFR en células NCI-H441 que muestran más receptores de c-Met que de EGFR. El tratamiento de células NCI-H441 con la molécula de EGFR/c-Met biespecífica disminuyó el IC50 para la inhibición de la fosforilación de EGFR en comparación con el dominio de FN3 de unión de EGFR monoespecífico en 30 veces (Figura 5C).
El potencial de potencia mejorada con una molécula de EGFR/c-Met biespecífica se evaluó en un ensayo de fosforilación de c-Met usando una molécula con una afinidad alta por EGFR (0,26 nM) y afinidad media por c-Met (10,1 nM). Tanto en las células NCI-H292 como en NCI-H596, la inhibición de la fosforilación de c-Met se mejoró con la molécula biespecífica en comparación con el dominio de FN3 de unión a c-Met monoespecífico, en 134 y 1012 veces, respectivamente (Figura 3D y 3E).
Se verificó que la potencia mejorada para la inhibición de la fosforilación de EGFR y c-Met con las moléculas de EGFR/c-Met biespecíficas se tradujo en una inhibición mejorada de la señalización y la proliferación. Para estos experimentos, la mezcla de los dominios de FN3 de unión a EGFR y unión a c-Met se comparó con una molécula de EGFR/c-Met biespecífica. Como se describe en las Tablas 12 y 13, los valores de IC50 para la fosforilación de ERK (Tabla 12) y la proliferación de células NCI-H292 (Tabla 13) disminuyeron cuando las células se trataron con la molécula de EGFR/c-Met biespecífica en comparación con la mezcla de los enlazadores monoespecíficos. El IC50 para inhibición de la fosforilación de ERK para la molécula de EGFR/c-Met biespecífica fue 143 veces más baja con respecto a la mezcla de los dos dominios de FN3 de EGFR y c-Met monoespecíficos, mostrando el efecto de la avidez en la potencia de las moléculas en este ensayo. En la Tabla 12, los dominios de FN3 de unión a EGFR y c-Met monoespecíficos no inhiben completamente la actividad y, por lo tanto, los valores de IC50 mostrados deben considerarse límites inferiores. El ensayo de proliferación se completó usando diferentes combinaciones de dominios de FN3 de unión a EGFR y c-Met, ya sea como una mezcla o enlazados en un formato biespecífico. El IC50 para la inhibición de la proliferación de la molécula de EGFR/c-Met biespecífica fue 34-236 veces más bajo en relación con la mezcla de los dominios de FN3 de unión a EGFR o c-Met originales monoespecíficos. Esto confirmó que el efecto de avidez observado a nivel de los receptores (Figura 4 y Figura 5) se traduce en una mejora en la inhibición de la señalización celular (Tabla 12) y la proliferación celular (Tabla 13).
Tabla 12
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Tabla 13
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Xenoinjertos tumorales in vivo : PK/PD
Para determinar la eficacia de las moléculas del dominio de FN3 monoespecíficas y biespecíficas in vivo, se diseñaron células tumorales para secretar HGF humano (el HGF murino no se une a c-Met humano). E1HGF humano se expresó de manera estable en células NCI-H292 usando una infección lentiviral (vector de ADN lentiviral que expresa HGF humano (N° de acceso X16322) y un kit de empaquetamiento lentiviral de Genecopoeia). Después de la infección, las células que expresan HGF se seleccionaron con 4 pg/ml de puromicina (Invitrogen). La proteína de HGF humana se detectó en el medio condicionado de las células agrupadas usando placas de ensayo de MesoScale Discovery.
Se inocularon subcutáneamente ratones SCID beige con células NCI-H292 que expresan HGF humano (2,0x106 células en Cultrex (Trevigen) en un volumen de 200 pl) en el costado dorsal de cada animal. Las mediciones del tumor se tomaron dos veces por semana hasta que los volúmenes del tumor variaron entre 150-250 mm3. Luego se administró a los ratones una única dosis i.p. de moléculas de EGFR/c-Met biespecíficas (enlazadas a un dominio de unión a la albúmina para aumentar la vida media) o vehículo PBS. A las 6 h o 72 h después de la dosificación, los tumores se extrajeron y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido. Se recogieron muestras de sangre mediante punción cardíaca en inhibidores de proteasa que contenían citrato al 3,8%. Inmediatamente después de la recogida, las muestras de sangre se centrifugaron y el plasma resultante se transfirió a los tubos de muestra y se almacenó a -80° C. Los tumores se pesaron, se cortaron en trozos pequeños y se lisaron en tubos Lysing Matrix A (LMA) que contenían tampón RIPA con inhibidores de proteasa/fosfatasa HALT (Pierce), fluoruro de sodio 50 mM (Sigma), ortovanadato de sodio activado 2 mM (Sigma) y PMSF1 mM (MesoScale Discovery). Los lisados se eliminaron de la matriz de LMA y se centrifugaron para eliminar la proteína insoluble. La proteína tumoral soluble se cuantificó con un ensayo de proteína BCA y se diluyó hasta niveles de proteína equivalentes en tampón de lisis tumoral. Se midieron c-Met, EGFR y ERK fosforilados usando placas de ensayo de MesoScale Discovery (de acuerdo con el protocolo del fabricante y como se ha descrito anteriormente).
La Figura 6 muestra los resultados de los experimentos. Cada molécula de EGFR/c-Met biespecífica redujo significativamente los niveles de c-Met, EGFR y e Rk fosforilados tanto a las 6 h como a las 72 h. Los datos presentados en la Figura 6 muestran la importancia de inhibir simultáneamente tanto c-Met como EGFR y cómo la afinidad de la molécula de EGFR/c-Met biespecífica para cada receptor desempeña un papel en la inhibición de ERK descendiente. Las moléculas que contienen los dominios de FN3 de unión a EGFR de alta afinidad (P54AR4-83v2; mostrados como "8 " en la Figura, Kd=0,26 nM) inhibieron la fosforilación de EGFR en mayor medida en comparación con las que contienen los dominios de FN3 de unión a EGFR de afinidad media (P53A1R5-17v2; mostrados como "17" en la figura Kd=1,9 nM) tanto a las 6 h como a las 72 h. Las cuatro moléculas biespecíficas probadas inhibieron completamente la fosforilación de ERK en el punto temporal de 6 horas, independientemente de la afinidad. En el punto temporal de 72 horas, las moléculas que contenían el dominio de unión c-Met de afinidad ajustada (P114AR7P94-A3; mostradas como "A3" en la figura Kd=0,4 nM) inhibieron significativamente la fosforilación de ERK en comparación con el dominio de FN3 de unión a c-Met de afinidad media (P114AR5P74-A5; mostrado como "A5" en la Figura; Kd=10,1 nM; Figura 6 ).
La concentración de cada molécula de EGFR/c-Met biespecífica se midió a las 6 y 72 horas después de la dosificación en la sangre y en el tumor (Figura 7). Curiosamente, la molécula biespecífica con el dominio de unión a EGFR de afinidad media (P53A1R5-17v2; Kd=1,9 nM) pero el dominio de FN3 de unión a c-Met de alta afinidad (P114AR7P94-A3; Kd=0,4 nM) tuvo una acumulación tumoral significativamente mayor a las 6 horas en relación con las otras moléculas, mientras que la diferencia se reduce en 72 horas. Se puede suponer que las células fuera del tumor tienen niveles más bajos de expresión de superficie de tanto EGFR como de c-Met y, por lo tanto, la molécula de EGFR de afinidad media no se une al tejido normal tan estrechamente en comparación con el dominio de FN3 de unión a EGFR de mayor afinidad. Por lo tanto, hay más dominio de FN3 de unión a EGFR de afinidad media libre disponible para unirse al tumor. Por lo tanto, identificar las afinidades apropiadas para cada receptor puede permitir la identificación de un agente terapéutico con toxicidades sistémicas disminuidas y acumulación tumoral aumentada.
Estudios de eficacia tumoral con moléculas de EGFR/c-Met biespecíficas
Se inocularon subcutáneamente ratones SCID beige con células NCI-H292 que expresaban HGF humano (2,0x106 células en Cultrex (Trevigen) en 200 jl) en el costado dorsal de cada animal. Una semana después de la implantación, los ratones fueron estratificados en grupos con volúmenes tumorales equivalentes (volumen tumoral medio=77,9 /- 1,7 mm3). Los ratones recibieron dosis tres veces por semana con las moléculas biespecíficas y los volúmenes tumorales se registraron dos veces por semana. La inhibición del crecimiento tumoral (TGl) se observó con cuatro moléculas biespecíficas diferentes, con afinidades variables para c-Met y EGFR. La Figura 8 muestra el beneficio de inhibir tanto c-Met como EGFR ya que se observó un retraso en el crecimiento tumoral en los ratones tratados con moléculas que contenían el dominio de FN3 de unión a EGFR de alta afinidad en comparación con el dominio de FN3 de unión a EGFR de afinidad media cuando el dominio de FN3 de unión a c-Met era de afinidad media (triángulos abiertos frente a cerrados, P54AR4-83v2-P114AR5P74-A5 en comparación con P53A1R5-17-P114AR5P74-A5). Además, los datos muestran la importancia de tener un dominio de FN3 de unión a c-Met de alta afinidad como moléculas biespecíficas que contienen el dominio de FN3 de unión a EGFR de afinidad alta o media, pero el dominio de FN3 de unión a c-Met de alta afinidad mostró la mayor eficacia (líneas de puntos grises y negras discontinuas, P54AR4-83v2-P114AR7P94-A3 y P53A1R5-17v2-P114AR7P94-A3).
Eficacia de la molécula biespecífica y otros inhibidores de EGFR y c-Met
Se evaluaron las eficacias terapéuticas in vivo de una molécula de EGFR/c-Met biespecífica (ECB38) y los inhibidores de moléculas pequeñas crizotinib (inhibidor de c-Met) y erlotinib (inhibidor de EGFR), cetuximab (anticuerpo anti-EGFR), cada uno como agente individual, y la combinación de crizotinib y erlotinib en el tratamiento del modelo de xenoinjerto de cáncer de pulmón humano H292-HGF subcutáneo en ratones SCID/Beige.
Las células H292-HGF se mantuvieron in vitro en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal (10% v/v), y L-glutamina (2 mM) a 37° C en una atmósfera con 5% de CO2 en el aire. Las células se subcultivaron rutinariamente dos veces por semana mediante tratamiento con tripsina-EDTA. Las células que crecían en una fase de crecimiento exponencial se recogieron y se contaron para la inoculación del tumor.
Cada ratón se inoculó subcutáneamente en la región del costado derecho con células tumorales H292-HGF (2x106) en 0,1 ml de PBS con Cultrex (1:1) para el desarrollo del tumor. Los tratamientos se iniciaron cuando el tamaño medio del tumor alcanzó 139 mm3. La administración del artículo de prueba y el número de animales en cada grupo de estudio se mostraron en la tabla de diseño experimental siguiente. La fecha de la inoculación de las células tumorales se denotó como el día 0. La tabla 14 muestra los grupos de tratamiento.
Tabla 14.
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Antes del comienzo del tratamiento, se pesaron todos los animales y se midieron los volúmenes del tumor. Dado que el volumen del tumor puede afectar la efectividad de cualquier tratamiento dado, los ratones se asignaron a grupos usando un diseño de bloques aleatorizado basado en sus volúmenes tumorales. Esto asegura que todos los grupos sean comparables en el valor de referencia. El diseño de bloques aleatorizado se usó para asignar animales experimentales a grupos. Primero, los animales experimentales se dividieron en bloques homogéneos de acuerdo con su volumen tumoral inicial. En segundo lugar, dentro de cada bloque, se realizó la aleatorización de animales experimentales a tratamientos. Usar un diseño de bloques aleatorizado para asignar animales experimentales aseguró que cada animal tuviera la misma probabilidad de ser asignado a un tratamiento dado y, por lo tanto, se redujo el error sistemático.
En el momento de la monitorización de rutina, se comprobó en los animales cualquier efecto del crecimiento tumoral y los tratamientos sobre el comportamiento normal, como la movilidad, la estimación visual del consumo de alimentos y agua, la ganancia/pérdida de peso corporal (los pesos corporales se midieron dos veces por semana), el ojo/apelmazamiento del pelo y cualquier otro efecto anormal.
El punto final fue si el crecimiento tumoral puede retrasarse o los ratones portadores de tumores pueden curarse. El tamaño del tumor se midió dos veces por semana en dos dimensiones usando un calibre, y el volumen se expresó en mm3 usando la fórmula: V = 0.5 a x b2 donde a y b son los diámetros largo y corto del tumor, respectivamente. El tamaño del tumor se usó luego para los cálculos de los valores de tanto T-C como T/C. El T-C se calculó con T como el tiempo (en días) requerido para que el tamaño tumoral medio del grupo de tratamiento alcanzase los 1000 mm3 y C fue el tiempo (en días) para que el tamaño tumoral medio del grupo de control alcanzase el mismo tamaño. El valor T/C (en porcentaje) era una indicación de la eficacia antitumoral; T y C fueron el volumen tumoral medio de los grupos tratados y de control, respectivamente, en un día determinado. La regresión tumoral completa (CR) se define como los tumores que se reducen por debajo del límite de palpación (62,5 mm3). La regresión tumoral parcial (RP) se define como tumores que se reducen del volumen tumoral inicial. Se requiere una duración mínima de CR o PR en 3 o más mediciones de tumores sucesivas para que un CP o PR se considere duradero.
Los animales para los cuales la pérdida de peso corporal superó el 20%, o para los cuales el tamaño tumoral medio del grupo excede los 2000 mm3 se sacrificaron. El estudio finalizó después de dos semanas de observación después de la dosis final.
Los resúmenes estadísticos, incluyendo la media y el error estándar de la media (SEM), se proporcionan para el volumen tumoral de cada grupo en cada punto temporal que se muestra en la Tabla 15. Los análisis estadísticos de la diferencia en el volumen tumoral entre los grupos se evaluaron usando ANOVA una vía seguido de comparaciones individuales usando Games-Howell (varianza igual no asumida). Todos los datos fueron analizados utilizando SPSS 18.0. Se consideró que p<0,05 como estadísticamente significativo.
Tabla 15
Figure imgf000066_0001
El tamaño tumoral medio del grupo tratado con vehículo (Grupo 1) alcanzó 1.758 mm3 en el día 23 después de la inoculación del tumor. El tratamiento con la molécula de EGFR/c-Met biespecífica a un nivel de dosis de 25 mg/kg (Grupo 2) condujo a una regresión tumoral completa (CR) en todos los ratones que fueron duraderos en >3 mediciones de tumores sucesivas (TV medio = 23 mm3, valor de T/C=1%, p=0,004 comparado con el grupo del vehículo en el día 23).
El tratamiento con crizotinib como agente único a un nivel de dosis de 50 mg/kg (Grupo 3) no mostró actividad antitumoral; el tamaño tumoral medio fue de 2.102 mm3 en el día 23 (valor de T/C=120%, p=0,944 en comparación con el grupo del vehículo).
El tratamiento con erlotinib como agente único a un nivel de dosis de 50 mg/kg (Grupo 4) mostró actividad antitumoral menor, pero no se encontraron diferencias significativas en comparación con el grupo del vehículo; el tamaño tumoral medio fue de 1.122 mm3 en el día 23 (valor de T/C=64%, p=0,429 en comparación con el grupo del vehículo), con 4 días de retraso en el crecimiento tumoral al tamaño del tumor de 1.000 mm3 en comparación con el grupo del vehículo.
La combinación de crizotinib (50 mg/kg, Grupo 5) y erlotinib (50 mg/kg, Grupo 5) mostró una actividad antitumoral significativa; el tamaño tumoral medio fue de 265 mm3 en el día 23 (T/C=15%; p=0,008), con 17 días de retraso del crecimiento tumoral en el tamaño tumoral de 1 . 0 00 mm3 en comparación con el grupo del vehículo.
El cetuximab a nivel de dosificación de 1 mg/ratón como agente único (Grupo 6 ) mostró actividades antitumorales significativas; el tamaño tumoral medio fue de 485 mm3 en el día 23 (T/C=28%; p=0,018), con 17 días de retraso del crecimiento tumoral en el tamaño tumoral de 1 . 00 0 mm3en comparación con el grupo del vehículo. La Figura 15 y la Tabla 16 muestran las actividades antitumorales de las diversas terapias.
Tabla 16
Figure imgf000067_0001
Se observó una pérdida de peso corporal media a grave en el grupo del vehículo que podría deberse al aumento de la carga tumoral; 3 ratones murieron y 1 ratón se sacrificó cuando BWL> 20% el día 23. Se observó una ligera toxicidad de la molécula de EGFR/c-Met biespecífica en el Grupo 2; 3 ratones se sacrificaron cuando BWL >2 0 % durante el período de tratamiento; el peso corporal se recuperó gradualmente cuando se retiró el tratamiento durante las 2 semanas del período de observación. Se observó una pérdida de peso corporal más grave en el grupo de monoterapia con crizotinib o erlotinib en comparación con el grupo del vehículo, lo que sugiere toxicidad relacionada con el tratamiento. La combinación de crizotinib y erlotinib se toleró generalmente durante la fase de dosificación, pero al final del estudio se observó una pérdida grave de peso corporal, que podría deberse a la reanudación del crecimiento tumoral rápido durante el período sin tratamiento. La monoterapia de cetuximab fue bien tolerada en el estudio; la pérdida de peso corporal solo se observó al final del estudio debido a la reanudación del crecimiento tumoral.
En resumen, la molécula de EGFR/c-Met biespecífica a 25 mg/kg (3 veces/semana x 3 semanas) produjo una respuesta completa en el modelo de xenoinjerto de cáncer de pulmón humano H292-HGF en ratones SCID/Beige. El tratamiento fue tolerado en 7 de cada 10 ratones y dio como resultado una pérdida de peso corporal grave en 3 de cada 10 ratones. La Figura 9 muestra el impacto de las varias terapias sobre el tamaño del tumor durante los puntos temporales posteriores al tratamiento.
Ejemplo 8: Extensión de la vida media de las moléculas de EGFR/c-Met biespecíficas
Se han descrito numerosos métodos para reducir la filtración renal y, por tanto, extender la vida media en suero de las proteínas, incluyendo la modificación con polietilenglicol (p Eg ) u otros polímeros, la unión a la albúmina, la fusión con los dominios de proteínas que se unen a la albúmina u otras proteínas del suero, la fusión genética a la albúmina, la fusión a dominios Fc de IgG y la fusión a secuencias de aminoácidos largas no estructuradas.
Las moléculas de EGFR/c-Met biespecíficas se modificaron con PEG para aumentar el radio hidrodinámico incorporando una cisteína libre en el extremo C-terminal de la molécula. Más comúnmente, el grupo tiol libre del residuo de cisteína se usa para unir moléculas de PEG que están funcionalizadas con grupos de maleimida o yodoacetemida usando métodos estándar. Pueden usarse varias formas de PEG para modificar la proteína, incluyendo PEG lineal de 1000, 2000, 5000, 10.000, 20.000 o 40.000 kDa. También pueden usarse moléculas de PEG ramificadas de estos pesos moleculares para la modificación. Los grupos PEG también pueden unirse a través de aminas primarias en las moléculas de EGFR/c-Met biespecíficas en algunos casos.
Además de la PEGilación, la vida media de las moléculas de EGFR/c-Met biespecíficas se extendió produciendo estas proteínas como moléculas de fusión con un dominio de unión a la albúmina sérica (ABD) del haz de 3 hélices de origen natural o un dominio de unión a la albúmina de consenso (ABDCon) . Estos dominios de proteínas se enlazaron al extremo C-terminal del dominio de FN3 de unión a c-Met a través de cualquiera de los conectores descritos en la Tabla 12. El dominio ABD o ABDCon también puede colocarse entre el dominio de FN3 de unión a EGFR y el dominio de FN3 de unión a c-Met en la secuencia primaria.
Ejemplo 9: Caracterización de moléculas de EGFR/c-Met biespecíficas seleccionadas
Las moléculas de EGFR/c-Met biespecíficas seleccionadas se caracterizaron por su afinidad tanto para EGFR como para c-Met, su capacidad para inhibir la autofosforilación de EGFR y c-Met, y su efecto sobre la proliferación de células HGF. La afinidad de unión de las moléculas de EGFR/c-Met biespecíficas al dominio extracelular de EGFR y/o c-Met recombinante se evaluó adicionalmente mediante métodos de resonancia de plasmón de superficie usando un Instrumento de Proteon (BioRad) de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 3. Los resultados de la caracterización se muestran en la Tabla 17.
Tabla 17
Figure imgf000068_0001
Ejemplo 10. Generación de anticuerpos de EGFR/cMet biespecíficos
Varios anticuerpos de EGFR y c-Met monoespecíficos se expresaron como IgG1, kappa, que tienen sustituciones Fc K409R o F405L (numeración de acuerdo con el índice de la UE) en sus regiones Fc. Los anticuerpos monoespecíficos se expresaron en dos líneas celulares de CHO, una línea celular que tiene capacidad de fucosilación reducida que da como resultado anticuerpos con un contenido de fucosa del 1-15% en la cadena de polisacáridos del anticuerpo.
Los anticuerpos monoespecíficos se purificaron usando métodos estándar usando una columna de Proteína A (columna HiTrap MabSelect SuRe). Después de la elución, las agrupaciones se dializaron en D-PBS, pH 7,2.
Se generaron anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos combinando un mAb de EGFR monoespecífico y un mAb de c-Met monoespecífico en un intercambio de brazo Fab in vitro (como se describe en la WO2011/131746). Brevemente, a aproximadamente 1-20 mg/ml a una relación molar de 1:1 de cada anticuerpo en PBS, pH 7-7.4 y 2-mercaptoetanolamina 75 mM (2-MEA) se mezclaron juntos y se incubaron a 25-37° C durante 2-6 h, seguido de la eliminación del 2-MEA mediante diálisis, diafiltración, filtración de flujo tangencial y/o filtración de células centrifugadas usando métodos estándar.
Se combinaron varios anticuerpos anti-EGFR y anticuerpos anti-c-Met monoespecíficos en matriz en intercambio del brazo Fab in vitro para generar anticuerpos biespecíficos que posteriormente se caracterizaron adicionalmente. Los anticuerpos biespecíficos generados se clasificaron usando una estrategia de cuatro pasos usando los ensayos como sigue: Paso 1: unión a células NCI-H441, NCI-H1975 y A549 en un ensayo FACS. Paso 2: inhibición de la fosforilación de pMet en células A549. Paso 3: inhibición de la proliferación en células NCI-H1975, KP4 y NCI-H441. Paso 4: inhibición de la fosforilación de EGFR en células A549 y SNU-5. Cabe destacar que las características de los anticuerpos originales no se conservaron en el anticuerpo biespecífico. Por ejemplo, la presencia de ciertos brazos de unión a EGFR en el anticuerpo biespecífico dio lugar a una pérdida o inhibición reducida, o una fosforilación de c-Met mejorada. En base a los estudios de caracterización se seleccionaron parejas seleccionadas.
Se generó un anticuerpo anti-EGFR bivalente monoespecífico E1-K409R que comprende las regiones VH y VL de un anticuerpo anti-EGFR 2F8 que tiene la VH de la SEQ ID NO: 189 y la VL de la SEQ ID NO: 190 (el anticuerpo 2F8 se describe en la Publicación de Patente Internacional N° WO2002/100348 ) y una región constante de IgG1 con una sustitución K409R.
Se generó un anticuerpo anti-EGFR bivalente monoespecífico E1-F405L que comprende las regiones VH y VL de un anticuerpo anti-EGFR 2F8 que tiene la VH de la SEQ ID NO: 189 y la VL de la SEQ ID NO: 190 (el anticuerpo 2F8 se describe en la Publicación de Patente Internacional N° WO2002/100348 ) y una región constante IgG1 con una sustitución F405L.
Se generó un anticuerpo anti-EGFR bivalente monoespecífico E2-K409R que comprende las regiones VH y VL de un anticuerpo anti-EGFR 018 que tiene la VH de la SEQ ID NO: 191 y la VL de la SEQ ID NO: 192 (el anticuerpo 018 se describe en la Publicación de Patente Internacional N° WO2009/030239 ) y una región constante de IgG1 con una sustitución K409R.
Se generó un anticuerpo anti-EGFR bivalente monoespecífico E2-F405L que comprende las regiones VH y VL de un anticuerpo anti-EGFR 018 que tiene la VH de la SEQ ID NO: 191 y la VL de la SEQ ID NO: 192 (el anticuerpo 018 se describe en la Publicación de Patente Internacional N° WO2009/030239 ) y una región constante IgG1 con una sustitución F405L.
Se generó un anticuerpo monoespecífico bivalente anti-c-Met M1-K409R que comprende las regiones VH y VL de un anticuerpo anti-c-Met 069 que tiene la VH de la SEQ ID NO: 193 y la VL de la SEQ ID NO: 194 (el anticuerpo 069 se describe en la WO2011/110642 ) y una región constante de IgG1 con una sustitución K409R.
Se generó un anticuerpo monoespecífico bivalente anti-c-Met M1-F405L que comprende las regiones VH y VL de un anticuerpo anti-c-Met 069 que tiene la VH de la SEQ ID NO: 193 y la VL de la SEQ ID NO: 194 (el anticuerpo 069 se describe en la WO2011/110642 ) y una región constante IgG1 con una sustitución F405L.
Se generó un anticuerpo monoespecífico anti-c-Met M2-K409R que comprende las regiones VH y VL de un anticuerpo anti-c-Met 058 que tiene la VH de la SEQ ID NO: 195 y la VL de la SEQ ID NO: 196 (el anticuerpo 058 se describe en la WO2011/110642 ) y una región constante de IgG1 con una sustitución K409R.
Se generó un anticuerpo monoespecífico anti-c-Met M2-F405L que comprende las regiones VH y VL de un anticuerpo anti-c-Met 058 que tiene la VH de la SEQ ID NO: 195 y la VL de la SEQ ID NO: 196 (el anticuerpo 058 se describe en la WO2011/110642 ) y una región constante IgG1 con una sustitución F405L.
Las secuencias de VH, VL, HC y LC de los anticuerpos se muestran a continuación:
>SEQ ID NO: 189 EGFR mAb E1 VH
QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWD
DGSYKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGITMVRGV
MKDYFDYWGQGTLVTVSS
> SEQ ID NO: 190EGFR mAb E1 VL
AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSALVWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESG
VPSRFSGSESGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIK
> SEQ ID NO: 191 EGFR mAb E2 VH
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMNWVRQA PGKGLEWVAN
IKKDGSEKYY YDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAYYYCARDL
GWGWGWYFDL WGRGTLYTYSS
> SEQ ID NO: 192 EGFR mAb E2 VL
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD
ASNRATGIPARFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPPTFGQ
GTKVEIK
> SEQ ID NO: 193 cMet mAb M1 VH
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCETSGYTFTSYGISWVRQAPGHGLEWMGWISAY NGYTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDLRGTNYFD YWGQGTLVTVSS
> SEQ ID NO: 194 cMet mAb M1VL DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWFQHKPGKAPKLLIYAASSLLS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFP-ITFGQGTRLEIK
> SEQ ID NO: 195 cMet mAb M2 VH EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVATISDD GS YTYYPD S VKGRFTIS RDN AKNNL YLQMS S LKSEDT AM YY C AREGL Y Y Y GS GS YYNQD YWGQGTLVTVSS
> SEQ ID NO: 196 cMet mAb M2 VL QLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGLSSALAWYRQKPGKAPKLLIYDASSLESGV PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFTSYPQITFGQGTRLEIK
> SEQ ID NO: 199EM1-mAb H1 (anti-EGFR, 405L) QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWD DGSYKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGITMVRGV MKDYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPV
TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK VDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDV SHEDPE VKFN WYVD GVE VHNAKTKPREEQ YNST Y R W S VLT VLHQD WLN GKE Y KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK
> SEQ ID NO: 200EM-1 mAb L1 AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSALVWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESG VPSRFSGSESGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
> SEQ ID NO: 201 EM-1 mAb H2 (K409R, anti-cMet) QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCETSGYTFTSYGISWVRQAPGHGLEWMGWISAY NGYTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDLRGTNYFD YW GQ GTL VT V S S ASTKGP S VF PL AP S SKSTSGGT AALGCL VKD YFPEPVT V S WN S GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEV KFNWYYDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVV S VLTYLH QD WLNGKEYKCKV SN KALP APIEKTISKAKGQPREPQ YYTLPP SREEMTKN Q V SLT CL VKGF YPSDI AVE W ESNGQPENNYKTTPPYLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSYMHEALHNH YTQKSLSLSPGK
> SEQ ID NO: 202 EM-1 mAb L2 DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWFQHKPGKAPKLLIYAASSLLS GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPITFGQGTRLEIKRTVAAPS VFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
> SEQ ID NO: 234 E2 mAb HC1 (EGFR-F405L)
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMNWVRQA PGKGLEWVAN IKKDGSEKYY VDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARDL GWGWGWYFDLWGRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYF PEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
> SEQ ID NO: 235E2 mAb LC1 (EGFR)
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPARFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPPTFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR GEC
> SEQ ID NO: 236 E2 mAb HC2 (c-Met-K409R)
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVATISDD
GSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLKSEDTAMYYCAREGLYYYGSGS
YYNQDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT
VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV
DKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEYTCYWDYS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYK
CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI
AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA
LHNHYTQKSLSLSPGK
> SEQ ID NO: 237 E2 mAb LC2 (cMet)
QLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGLSSALAWYRQKPGKAPKLLIYDASSLESGV
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFTSYPQITFGQGTRLEIKRTVAAPSV
FIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD
STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Los anticuerpos anti-EGFR y c-Met monoespecíficos generados se mezclaron para el intercambio del brazo Fab in vitro en la matriz y se caracterizaron en varios ensayos. El anticuerpo biespecífico EM1-mAb comprende el brazo de unión a EGf R del mAb E1-F405L y el brazo de unión a c-Met del mAb M1-K409R. El anticuerpo biespecífico EM2-mAb comprende el brazo de unión a EGFR del mAb E2-F405L y el brazo de unión a c-Met del mAb M2-K409R. El anticuerpo biespecífico EM3-mAb comprende el brazo de unión a EGFR del mAb E1-K409R y el brazo de unión a c-Met del mAb M1-F405L. El anticuerpo biespecífico EM4-mAb comprende el brazo de unión a EGFR del mAb E2-K409R y el brazo de unión a c-Met del mAb M2-F405L. EM1-mAb y EM3-mAb tenían características comparables.
El EM1-mAb biespecífico se cultivó en una línea celular de CHO que tiene una capacidad de fucosilación reducida de glicoproteínas y, por lo tanto, tiene un contenido de fucosilo de aproximadamente 1-15%. La eliminación de la fucosa del núcleo de los oligosacáridos de tipo complejo biantenario unidos a las regiones Fc mejora significativamente la ADCC de los anticuerpos a través de la unión mejorada a FcyRINa sin alterar la unión al antígeno o la actividad de los CDC. Dichos mAb pueden lograrse usando diferentes métodos que se ha informado que llevan a la expresión con éxito de anticuerpos terapéuticos defucosilados relativamente altos que llevan el tipo de complejo biantenario de oligosacáridos Fc y se describen más arriba.
Ejemplo 11. Purificación de anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos
El EM1-mAb biespecífico se purificó adicionalmente después del intercambio de brazo Fab in vitro usando cromatografía de interacción hidrófoba para minimizar los anticuerpos de c-Met y EGFR originales residuales usando métodos estándar.
Ejemplo 12. Caracterización de anticuerpos de EGFR/c-Met biespecíficos
El anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico EM1-mAb se probó en varios ensayos para sus características, incluyendo la inhibición de la fosforilación de EGFR estimulada por EGF, la fosforilación de c-Met estimulada por HGF, la fosforilación de ERK1/2, la fosforilación de AKT, la inhibición de la unión a ligandos y la viabilidad celular. Las características del EM1-mAb se compararon con los anticuerpos de unión a EGFR o c-Met monovalentes de control, y con los inhibidores conocidos de EGFR como erlotinib (CAS 183321-74-6; inhibidor de tirosina quinasa) y cetuximab (CAS 205923-56-4).
Como los anticuerpos originales de los anticuerpos mAb EM-1 son bivalentes, se generaron anticuerpos de EGFR y c-Met monovalentes de control en un formato biespecífico combinado con un brazo Fab que se une a un antígeno no relacionado/irrelevante para comparar con precisión la sinergia y la avidez de un EM1 mAb biespecífico en comparación con una mezcla de las moléculas monovalentes de control correspondientes.
Para generar los anticuerpos de EGFR y c-Met monovalentes de control, se generó un anticuerpo anti-VIH gp120 monoespecíficogp120-K409R monoespecífico que comprende una cadena pesada de la SEQ ID NO: 198 y una cadena ligera de la SEQ ID NO: 209. Se generó un anticuerpo anti-VIH gp120 monoespecífico gp120-F405L que comprende la cadena pesada de la SEQ ID NO: 197 y la cadena ligera de la SEQ ID NO: 209.
El mAb E1-F405L-gp120-K409R anti-EGFR monovalente de control se generó mediante intercambio de brazos Fab in vitro entre E1-F405L y gp120-K409R, y el mAb M1- K409R -gp120- F405 anti-c-Met monovalente de control se generó mediante intercambio de brazos Fab in vitro entre M1-K409R y gp120-F405L y se purificó como se ha descrito anteriormente.
Se usaron las siguientes líneas celulares en la caracterización de los anticuerpos biespecíficos: NCI-H292 (American Type Culture Collection (ATCC), N° de Catálogo CRL-1848), NCI-H1975 (ATCC N° de catálogo CRL-5908), SKMES- 1 (ATCC N° de catálogo HTB-58), A431 (ATCC N° de catálogo CRL-1555), NCI-H441 (ATCC N° de catálogo HTB-174), NCI-H3255 (depósito de tumor DCTD/líneas celulares, NCI, Frederick, NCI-Navy Medical oncology Cell Line supplement. J Cell Biochem suppl 24, 1996; Tracy S. cancer Res 64:7241-4, 2004; Shimamura T. cancer Res 65: 6401-8, 2005) y HCC-827 (ATCC N° de catálogo CRL-2868). Las células NCI-H292 y SKMES-1 expresan tanto EGFR de tipo salvaje como c-Met de tipo salvaje. NCI-3255 expresa L858R EGFR mutante y muestra amplificación de EGFR y c-Met. H1975 expresa L858R/T790M EGFR mutante y el c-Met de tipo salvaje. HCC-827 expresa A (E746, A750) EGFR y muestra amplificación de EGFR. La línea celular NCI-H292, NCI-H975, NCI-H441 y NCI-H3255 se denominan de manera intercambiable H292, H975, H441 y H3255, respectivamente, en la especificación.
Unión de anticuerpos biespecíficos EGFR/cMet a EGFR y c-Met en células (ensayo de unión de células A431)
Se probó el anticuerpo EM1-mAb de EGFR/c-Met biespecífico para determinar la unión a EGFR y c-Met en células utilizando el protocolo descrito en el Ejemplo 3 ("Ensayo de unión a células A431") y el Ejemplo 6 ("Ensayo de unión a células H441"). Se usaron cetuximab y un anticuerpo monovalente de control hacia EGFR E1-F405L-gp120-K409R como controles para las células A431. El cetuximab tenía un valor de EC50 de 5,0 nM. La tabla 18 muestra los valores de EC50 para la unión. El EM1-mAb demostró una disminución de 1,9 veces (células A431) y 2,3 veces (células H441) en la unión cuando se comparó con los anticuerpos de control originales monoespecíficos bivalentes. El cetuximab fue comparable con los anticuerpos de control bivalentes originales. EM1-mAb muestra valores de EC50 más altos de unión que los valores de los mAbs originales debido a la unión monovalente de EGFR y c-Met. EM1-mAb tiene valores de EC50 de unión similares a los mAbs monovalentes biespecíficos E1/brazo inerte y E2/brazo inerte.
Tabla 18
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Inhibición de la unión del ligando al receptor.
Los anticuerpos biespecíficos se probaron para determinar su capacidad para bloquear la unión de EGF al dominio extracelular de EGFR y de HGF al dominio extracelular de c-Met en un ensayo ELISA. Se recubrió R-Fc de EGF humano recombinante (R&D Systems, N° de catálogo: 344-ER-050) o HGF humano (R&D Systems, N° de catálogo: 294-HGN-025/CF) sobre placas MSD HighBind (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) durante 2 horas a temperatura ambiente. Se añadió tampón MSD Blocker A (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) a cada pocillo y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con tampón HEPES 0,1 M, pH 7,4, seguido por la adición de una mezcla de o EGF marcado con tinte fluorescente (MSD) o proteínas HGF biotiniladas con diferentes concentraciones de anticuerpos. La proteína EGF marcada con rutenio se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente con concentraciones crecientes de diferentes anticuerpos, de 1 nM a 4 |jM. Después de 2 horas de incubación con agitación suave a temperatura ambiente, las placas se lavaron 3 veces con tampón HEPES 0,1 M (pH 7,4). Se diluyó MSD Read Buffer T y se dispensó y las señales se analizaron con un SECTOR Imager 6000. Los ensayos de inhibición de HGF se realizaron como los ensayos de inhibición de EGF/EGFR, excepto que se incubaron 10 nM de HGF biotinilado durante 30 minutos a temperatura ambiente con concentraciones crecientes de diferentes anticuerpos, de 1 nM a 2 jM.
El EM1-mAb inhibió la unión de EGF a EGFR con un valor de IC50 de 10,7 nM ± 1,2 en presencia de EGF 50 nM y con un valor de IC50 de 10,6 ± 1,5 nM en presencia de EGF 80 nM. El anticuerpo bivalente original inhibió la unión de EGF a EGFR con un valor de IC50 de 0,14 ± 1,5 nM en presencia de EGF 50 nM y con un valor de IC50 de 1,7 ± 1,4 nM en presencia de EGF 80 nM. El mAb EM1 tenía una inhibición más débil de la unión de EGF al dominio extracelular de EGFR debido a la unión monovalente de mAb EM1 en comparación con el mAb bivalente original.
El EM1-mAb inhibió la unión de HGF a c-Met con un valor de IC50 de 29,9 ± 1,5 nM. El anticuerpo bivalente original inhibió la unión de HGF a c-Met con un IC 50 de 14,8 ± 1,6 nM. El mAb EM1 tenía una inhibición más débil de unión de HGF al dominio extracelular de cMet debido a la unión monovalente de EM1-mAb en comparación con el mAb bivalente original.
Inhibición de la fosforilación de EGFR estimulada por EGF y de la fosforilación de c-Met estimulada por HGF Se probaron los anticuerpos para determinar los valores de IC50 para la inhibición de la fosforilación de EGFR y c-Met. La inhibición de la fosforilación de EGFR estimulada por EGF y la fosforilación de c-Met estimulada por HGF se evaluaron a concentraciones de anticuerpo variables (0,035-700 nM final) como se describe en el Ejemplo 2 ("Inhibición de la fosforilación de EGFR estimulada por EGF") y el Ejemplo 6 ("Inhibición de la fosforilación de c-met estimulada por HGF "). En algunos experimentos, tanto el EGF como e1HGF se añadieron a las células para que el mismo lisado celular pudiera usarse para detectar tanto la fosforilación de EGFR como la de c-Met.
Se usaron como anticuerpos de control el mAb E1-F405L-gp120-K409R anti-EGFR de control monovalente para EGFR y el anticuerpo anti-EGFR bivalente original con bajo contenido de fucosa. La Tabla 19 muestra los valores de IC50 de los ensayos.
Tabla 19.
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Inhibición mejorada de pERK y pAKT con EM1-mAb en comparación con la mezcla de anticuerpos monovalentes (ensayo mAb pERK) (ensayo mAb pAKT)
El potencial de potencia mejorada con un anticuerpo de EGFR/c-Met biespecífico se evaluó mediante la evaluación de los efectos de mAb en la señalización descendente de pERK y pAKT. Para estos experimentos, la mezcla anticuerpos de EGFR de control monovalente y de c-Met de control monovalente se comparó con el EM1-mAb biespecífico. Las células se colocaron en placas tratadas con cultivo de tejido de 96 pocillos transparentes (Nunc) en 100 pl/pocillo de medio RPMI que contenía GlutaMAX y Hepes 25 mM (Invitrogen), suplementado con piruvato sódico 1 mM (Gibco), NEAA 0,1 mM (Gibco), 10% de suero fetal bovino inactivado por calor (Gibco), y 7,5 ng/ml de HGF (R&D Systems N° de catálogo 294-HGN) y se dejó unir durante una noche a 37° C en una atmósfera con 5% de CO2 humidificada. Las células no estaban privadas de suero. Las células se trataron durante 30 minutos (ensayo pERK) o 1 hora (ensayo pAkt) con concentraciones variables (0,11-700 nM final) de anticuerpos de control monovalentes o EM1-mAb.
Las células se evaluaron para determinar los niveles de pERK o pAKT usando los siguientes kits y de acuerdo con las instrucciones del fabricante de Meso Scale Discovery: kit de lisado celular completo de ensayo Phospho-ERK1/2 (Thr202/Tyr204; Thr185/Tyr187) (N° de catálogo K151DWD, kit de lisado celular completo de ensayo Phospho-Akt ( Ser473) (N° de catálogo K151CAD), kit de lisado celular completo de ensayo Phospho-Akt (Thr308) (N° de catálogo K151DYD). Para el ensayo de pERK, las células se lisaron y los lisados de células completas se añadieron a las placas recubiertas con anticuerpo anti-fosfo-ERK1/2 (que reconoce ERK1 fosforatado en los residuos Thr202 y Tyr204 y ERK2 fosforilado en los residuos Thr185 y Tyr187), y se detectó ERK1/2 fosforilado con anticuerpo de ERK1/2 anti-total conjugado con reactivo MSD SULFO-TAG™. Para el ensayo de pAKT Ser473, el anticuerpo de captura era un anticuerpo anti-totalAKT y el anticuerpo de detección el anticuerpo anti-pAKT Ser473 conjugado con reactivo MSD SULFO-TAG™. Para el ensayo de pAKT Thr308, el anticuerpo de captura era un anticuerpo anti-totalAKT y el anticuerpo de detección anticuerpo anti-pAKT thr308 conjugado con reactivo MSD SULFO-TAG™.
Las placas se leyeron en un instrumento SECTOR® Imager 6000 (Meso Scale Discovery) usando la configuración predeterminada específica del ensayo instalada por el fabricante. Los datos se representaron como una señal de electroquimioluminiscencia frente al logaritmo de la concentración de anticuerpos y los valores de IC50 se determinaron ajustando los datos a una respuesta a la dosis sigmoidal con pendiente variable usando el software GraphPad Prism 5. En estos ensayos se usaron líneas celulares NCI-H292, H1975 y SKMES-1.
El IC50 para la inhibición de la fosforilación de ERK por el EM1-mAb biespecífico fue aproximadamente 14­ 63 veces menor que la mezcla de los dos anticuerpos de control monovalentes, dependiendo de la línea celular probada (Tabla 20). La potencia mejorada del EM1-mAb en comparación con la mezcla de los dos anticuerpos de control monovalentes sugiere un efecto cooperativo o de avidez debido a la unión mejorada de EM1-mAb a estas líneas celulares. El IC50 para la inhibición de Ser475 (pAKTS475) y Thr308 (pAKTT308), la fosforilación de AKT en la línea celular NCI-H1975 fue de aproximadamente 75 veces y 122 veces más baja, respectivamente, cuando se comparó con la mezcla de los dos anticuerpos de control monovalentes (Tabla 21). La potencia mejorada del EM1-mAb en comparación con la mezcla de los dos anticuerpos de control monovalentes sugiere un efecto cooperativo o de avidez debido a la unión mejorada de EM1-mAb a estas líneas celulares. Por tanto, la naturaleza biespecífica del EM1-mAb dio como resultado un efecto mejorado en los efectores de señalización descendentes.
Tabla 20.
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Tabla 21.
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Inhibición del crecimiento de células tumorales humanas o viabilidad por anticuerpos
La inhibición del crecimiento celular dependiente de c-Met se evaluó midiendo la viabilidad de varias células tumorales después de la exposición al EM1-mAb biespecífico. En los estudios se usaron células NCI-H292, SKMES-1, NCI-H1975 y NCI-H3255.
Las células se cultivaron en formatos estándar 2D y de unión baja. Se usaron erlotinib y cetuximab como controles. La Tabla 22 resume los valores de IC50 para el ensayo.
Inhibición del crecimiento de células tumorales humanas o viabilidad por anticuerpos - Formato 2D estándar La inhibición del crecimiento celular se evaluó midiendo la viabilidad de NCI-H292 y NCI-H1975 tras la exposición a anticuerpos en dos formatos. Para el formato 2D estándar, las células se colocaron en placas tratadas con cultivo de tejidos de 96 pocillos blancas opacas (PerkinElmer) en medio RPMI que contenía GlutaMAXy Hepes 25 mM (Invitrogen), suplementado con piruvato sódico 1 mM (Gibco), NEAA 0,1 mM (Gibco), y 10% de suero fetal bovino inactivado por calor (Gibco) y se dejó unir durante la noche a 37° C, 5% de CO2. Las células se trataron con concentraciones variables de anticuerpos (0,035-700 nM final), junto con HGF (7,5 ng/ml, R&D Systems N° de catálogo 294-HGF), luego se incubaron a 37° C, 5% de CO2 durante 72 horas. Algunos pocillos se dejaron sin tratar con HGF o anticuerpos como controles. Se detectaron células viables usando el reactivo CellTiter-Glo® (Promega), y los datos se analizaron como se describe en el Ejemplo 3 en "Inhibición del crecimiento de células tumorales humanas (ensayo de crecimiento de NCI-H292 y de crecimiento de NCI-H322)".
Inhibición del crecimiento o viabilidad de células tumorales humanas por anticuerpos-Formato de unión baja Para evaluar la supervivencia en condiciones de baja unión, las células se colocaron en placas de 96 pocillos de fijación ultra baja (Corning Costar) en 50 pl/pocillo de medio RPMI (Invitrogen) que contenía GlutaMAX y Hepes 25 mM, suplementado con piruvato sódico 1 mM (Gibco), 0,1 mM NEAA (Gibco), y 10% inactivado por calor suero fetal bovino (Gibco) y se dejó unir durante una noche a 37° C, 5% de CO 2 . Las células se trataron con concentraciones variables de anticuerpos (0,035-700 nM final), junto con HGF (7,5 ng/ml, R & D Systems N° de catálogo 294-HGN), luego se incubaron a 37° C, 5% de CO 2Durante 72 horas. Algunos pozos se dejaron sin tratar con HGF o anticuerpos como controles. Las células viables se detectaron utilizando el reactivo CellTiter-Glo® (Promega), y los datos se analizaron como se describe anteriormente en "Inhibición del crecimiento de células tumorales humanas (crecimiento de NCI-H292 y ensayo de crecimiento de NCI-H322)" en el Ejemplo 3, excepto que los lisados fueron transferido a placas blancas opacas tratadas con cultivo tisular de 96 pocillos (PerkinElmer) antes de leer la luminiscencia.
En el cultivo 2D estándar, EM1-mAb inhibió el crecimiento de NCI-H292 con un IC50 de 31 nM, y en condiciones de baja unión con un IC50 de 0,64 nM. El mAb EM-1 inhibió el crecimiento celular de NCI-H1975 con un IC50 de >700 nM y 0,8-1,35 nM en cultivo 2D estándar y de unión baja, respectivamente. En las células NCI-H292 que expresan tanto EGFR de tipo salvaje como cMet, el EM1-mAb tenía una potencia mejorada 22 veces en el 2D estándar y una potencia mejorada 330 veces en las condiciones de cultivo de baja unión cuando se comparó con el cetuximab. En las células NCI-H1975, que expresan mutante L858R, EGFR T790M y cMet de tipo salvaje, el EM-1 mAb tenía una potencia mejorada por lo menos 518 veces en comparación con cetuximab en condiciones de cultivo de unión baja. La tabla 22 muestra el resumen de los ensayos.
Tabla 22.
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La combinación de erlotinib y EM1-mAb es eficaz en la inhibición del crecimiento de líneas celulares mutantes de EGFR
La inhibición del crecimiento celular por la combinación de erlotinib más EM1-mAb se evaluó en condiciones de cultivo tanto 2D estándar como en el formato de baja unión. Las células NCI-H3255 y HCC-827 se colocaron en placas como se describe anteriormente en "Inhibición del crecimiento de células tumorales humanas o viabilidad por anticuerpos". Se añadió HGF (7,5 ng/ml, R&D Systems N° de catálogo 294-HGN) a las células junto con el tratamiento con anticuerpos. Las células se trataron con concentraciones variables de anticuerpos (0,11-700 nM final), o erlotinib (0,46-3000 nM final), o la combinación de erlotinib más anticuerpo, usando cantidades crecientes de cada uno en una proporción fija (por ejemplo, la concentración más baja de combinación = la concentración más baja de anticuerpo (0,11 nM) la concentración más baja de erlotinib (0,46 nM)). Algunos pocillos se dejaron sin tratar con HGF o anticuerpos como controles. Las células se incubaron a 37° C, 5% de CO2 durante 72 horas, luego se detectaron células viables usando el reactivo CellTiter-Glo® (Promega), y los datos se analizaron como se ha descrito anteriormente en "Inhibición del crecimiento de células tumorales humanas (ensayo de crecimiento de NCI-H292 y de crecimiento de NCI-H322)". La Tabla 23 resume los resultados del experimento. En la tabla, los valores de 1C50 para las combinaciones son relativos para cualquiera del anticuerpo, o erlotinib, dependiendo de lo que se indica entre paréntesis.
Tanto en las células NCI-H3255 como en las HCC-827 (líneas celulares mutantes de EGFR), la adición de EM1-mAb a erlotinib aumento la potencia de inhibición de la viabilidad celular y fue más eficaz dando como resultado menos células viables en general. En las células NCI-H3255 usando condiciones 2D estándar, el IC50 para erlotinib solo fue de 122 nM, mientras que la combinación fue de 49 nM. De manera similar, en las células HCC-827, el IC50 para solo erlotinib fue de 27 nM, mientras que la combinación fue de 15 nM. Además, la combinación de erlotinib más EM1-mAb fue más eficaz que la combinación de erlotinib más cetuximab. Por tanto, en presencia de HGF, la adición de EM1-mAb aumentó la eficacia de erlotinib en este ensayo.
Las células NCI-H3255 expresan EGFR mutante L858R y cMet amplificado. Las células HCC-827 expresan mutantes de EGFR con deleciones en las posiciones de aminoácidos 746 y 750 y c-Met de tipo salvaje. El EM1-mAb tiene efectos más fuertes en la viabilidad de HCC-827 y NCI-3255 en presencia de erlotinib que erlotinib solo en cultivos estándar o de unión o baja.
Tabla 23.
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Ejemplo 13. Citotoxicidad celular mediada por anticuerpos (ADCC) de EM1-mAb en líneas celulares in vitro .
Los ensayos de ADCC se realizaron como se ha descrito anteriormente (Scallon et al., Mol Immunol 44:1524-15342007). Brevemente, las PBMC se purificaron a partir de sangre humana mediante gradientes de Ficoll y se usaron como células efectoras para los ensayos de ADCC. Se usaron células NCI-H292, NCI-H1975 o NCI-H441 como células objetivo con una proporción de 1 célula objetivo por 50 células efectoras. Las células objetivo se pre-marcaron con BATDA (PerkinElmer) durante 20 minutos a 37° C, se lavaron dos veces y se resuspendieron en DMEM, FBS al 10% inactivado por calor, L-glutamina 2 mM (todos de Invitrogen). Las células objetivo (1x104 células) y efectoras (0,5x106 células) se combinaron y se añadieron 100 pl de células a los pocillos de las placas con fondo en U de 96 pocillos. Se añadieron 100 pl adicionales con o sin constructos de mAb de tipo salvaje y resistentes a proteasas. Todas las muestras se realizaron por duplicado. Las placas se centrifugaron a 200 g durante 3 minutos, se incubaron a 37° C durante 2 horas, y luego se centrifugaron de nuevo a 200 g durante 3 minutos. Se eliminó un total de 2 0 pl de sobrenadante por pocillo y la lisis celular se midió mediante la adición de 2 0 0 pl del reactivo a base de europio DELPHIA (PerkinElmer). La fluorescencia se midió utilizando un lector Envision 2101 Multilabel (PerkinElmer). Los datos se normalizaron a la citotoxicidad máxima con 0,67% de Triton X-100 (Sigma Aldrich) y el control mínimo se determinó mediante la liberación espontánea de BATDA de las células objetivo en ausencia de cualquier anticuerpo usando la siguiente ecuación: (liberación experimental - liberación espontánea)/(liberación máxima - liberación espontánea) x100%. Los datos se ajustaron a un modelo de respuesta a la dosis sigmoidal usando GraphPad Prism v5.
Los resultados de ADCC para los EM1 mAb y los comparadores se resumen en la Tabla 24 (células NCI-H292), la Tabla 25 (células NCI-H1975) y la Tabla 26 (células NCI-H441) y la Tabla 27 (células NCI-H1993) enumeran los valores de EC50 y la lisis máxima alcanzada. Las células NCI-H292 expresan EGFR de tipo salvaje (WT), c-Met WT y KRAS WT; las células NCI-H1975 expresan EGFR mutante (L858R T790M), cMet WT y KRAS WT; las NCI-H441 expresan EGFR WT, cMet WT, y células KRAS mutantes (G12V), y NCI-H1993 expresan EGFR WT, cMet amplificado, KRAS WT. KRAS también se conoce como GTPasa KRas y como homólogo del oncogén viral del sarcoma de rata V-Ki-ras2 Kirsten.
El EM1-mAb tiene una potencia más alta de las respuestas de ADCC que el cetuximab y la versión de fucosa normal de EM1-mAb, como se indica al tener valores de EC50 más bajos. El mAb EM1 tiene eficacia más alta en términos de la lisis máxima lograda que el cetuximab y el mAb biespecífico de fucosa normal. De los perfiles de las Tablas 24-27, el mAb EM-1 tiene actividad de ADCC en células que tienen mutante y EGFR WT, WT con niveles normales y amplificados de cMet, y KRAS mutante y WT.
Tabla 24.
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Tabla 25.
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Tabla 26.
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Tabla 27.
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Ejemplo 14. Estudios de eficacia tumoral con el EM1-mAb.
La eficacia del mAb EM1 contra el crecimiento tumoral se realizó como se describe en el Ejemplo 7 "Estudios de eficacia tumoral con moléculas de EGFR/c-Met biespecíficas". Brevemente, las células NCI-H292-HGF se implantaron subcutáneamente (s.c.) con Cultrex a 2x106 en ratones SCID beige hembra Los ratones se estratificaron por el volumen del tumor 7 días después del implante en 5 grupos con 10 ratones por grupo. La dosificación comenzó después de que el volumen tumoral medio inicial por grupo variase de 62 a 6 6 mm3 (tumores pequeños). Se dosificaron PBS o terapéutico intraperitonealmente (i.p.) 2 veces por semana.
La evaluación de la eficacia también empleó SKMES-HGF, un carcinoma de células escamosas humano que se transfectó con HGF humano (factor de crecimiento hepático). Estas células se implantaron s.c. a 10x106 en ratones SCID beige hembra. Estos ratones se estratificaron por el volumen del tumor 12 días después del implante en 5 grupos con 8 ratones por grupo. El primer estudio comenzó cuando el volumen tumoral medio inicial por grupo varió de 98 a 101 mm3 (tumores grandes). Se dosificaron PBS o mAbs terapéuticos i.p. 2x/semana durante 4 semanas. En el estudio de tumores de mayor tamaño, los ratones que se estratificaron después de que los volúmenes del tumor eran de aproximadamente 200-300 mm3 dividiéndolos en 2 grupos. Estos ratones se trataron con cetuximab (20 mg/kg) o EM1-mAb (20 mg/kg), i.p., 2x/semana (3 semanas).
El resumen de los datos se muestra en la Tabla 28. La Figura 10 muestra la eficacia de las moléculas a lo largo del tiempo. El EM1-mAb tiene un perfil de supresión tumoral mejorado en comparación con el cetuximab en el modelo de tumor pequeño de H292-HGF y en los modelos de tumor pequeño y grande de SKMES-HGF.
Tabla 28.
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La tabla 29 muestra los tamaños tumorales en los grupos de tratamiento de los tumores SKMES-HGF, y la tabla 30 muestra la actividad antitumoral.
El EM1-mAb inhibió el crecimiento tumoral en el modelo de SKMES-HGF el 97% o más en dosis múltiples de hasta 1 mg/kg. Si bien inicialmente el cetuximab fue muy eficaz (8 8 % de TGI a 20 mg/kg), una vez finalizada la dosificación, los tumores tratados con cetuximab volvieron a crecer. Por el contrario, los tumores tratados con EM1-mAb a 5 o 20 mg/kg no volvieron a crecer durante el curso del estudio (>2 meses).
Tabla 29
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Tabla 30
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Ejemplo 15. Inhibición de migración celular con EM1-mAb in vitro
Método
El efecto del EM-mAb y los anticuerpos monovalentes de control sobre la inhibición de la migración de células tumorales se evaluó en células NIH-1650. Se cultivó la línea celular mutante de EGFR H1650 (células de carcinoma de pulmón bronquioloalveolar que albergan una mutación del exón 19 [deleción E746, A750]) GFR H1650 en matraces de cultivo de tejidos bajo condiciones de cultivo normales (37° C, 5% de CO2, 95% de humedad). Todos los medios y la suplementación fueron los sugeridos por el proveedor de las células (American Type Culture Collection, Manassas, VA, EE. UU.).
Los esferoides se generaron colocando en placas células tumorales de pulmón H1650 a 10.000 células/pocillo en placas de 96 pocillos de adherencia ultrabaja (ULA) de fondo en "U" (Corning, Tewksbury, USA) a 200 pl/pocillo. Estas placas estimulan la formación espontánea de un esferoide individual de células dentro de las 24 horas posteriores (después de incubación a 37° C, 5% de CO2) y los esferoides se cultivaron durante cuatro días bajo condiciones de cultivo normales.
Se recubrieron placas de 96 pocillos de fondo redondo (BD Bioscience) con gelatina al 0,1% (EMD Millipore, Billerica, USA) en agua estéril durante 1 hora a 37° C. Para los estudios de evaluación de compuestos, se transfirieron 10.000 esferoides de tumores de células del día 4 (H1650 y NCI-H1975) a las placas de fondo redondo recubiertas y se trataron con EM1-mAb, el mAb E1-F405L-gp120-K409R monovalente de control con bajo contenido de fucosa, el mAb M1- K409R -gp120- F405L anti-cMet de control monovalente con bajo contenido de fucosa, y una combinación de los dos anticuerpos monovalentes E1-F405L-gp120-K409R y M1- K409R -gp120- F405L (producido en fucosa baja) en una serie de diluciones con 20 ng/ml de HGF (R&D systems). Los controles se trataron con vehículo que era control de isotipo de IgG1 kappa (concentración igual a las células tratadas con fármaco más alto). Los efectos de los compuestos se analizaron a las 48 horas midiendo el área cubierta por las células migratorias utilizando imágenes de campo brillante en un sistema de formación de imágenes de alto contenido Opereta completamente automatizado (Perkin Elmer) con un objetivo de 2x. La inhibición de la migración celular (área total) debida al efecto del tratamiento se evaluó normalizando los datos dividiendo por el control de solo medios para crear un porcentaje de migración celular al control. Por lo tanto, un valor inferior a 1 sería inhibidor de la migración celular.
Resultados
El EM1-mAb demostró una inhibición sinérgica potente de la migración celular en células H1650 (mutante de EGFR L858R) y H1975 (mutante de EGFR L858R/T790M) cuando se comparó con una combinación de los anticuerpos anti-EGRF y anti-c-Met E1-F405 monovalentes de control E1-F405L-gp120-K409R y M1-K409R -gp120-F405L. En las células H1650, las seis concentraciones más altas del EM1-mAb inhibieron significativamente la migración celular (p <0,001) en comparación con el control de isotipo. El valor de EC50 para el EM1-mAb fue de 0,23 nM, mientras que el valor de EC50 para la combinación de los anticuerpos de control monoespecíficos fue de 4,39 nM. El EM1-mAb por lo tanto fue aproximadamente 19 veces más eficiente en la inhibición de la migración de las células H1650 en comparación con la combinación de los anticuerpos de control monovalentes. El nivel de inhibición de la migración celular de EM1-mAb fue superior a la combinación de mAbs de control monoespecíficos para células H1650 y H1975. La Tabla 31 muestra los valores de EC50 para el ensayo.
Tabla 31.
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Ejemplo 16. Mapeo de epítopos del anticuerpo anti-c-Met 069 y 5D5
El epítopo de unión de mAb 069 anti-c-Met se mapeó usando la tecnología de péptidos CLIPS lineal y restringida. Los péptidos escanearon los dominios SEMA, PSI e Ig de cMet humano. Los péptidos lineales y CLIPS se sintetizaron usando la secuencia de aminoácidos del cMet anteriormente mencionado usando química de Fmoc estándar y se desprotegieron usando ácido trifluórico con captadores. Los péptidos restringidos se sintetizaron en andamiajes químicos para reconstruir los epítopos conformacionales usando la tecnología de Péptidos químicamente enlazados sobre andamiajes (CLIPS) (Timmerman et al., J Mol Recognition 20:283, 2007). Los péptidos lineales y restringidos se acoplaron a tarjetas PEPSCAN y se seleccionaron usando un ELISA basado en PEPSCAN (Slootstra et al., Molecular Diversity 1, 87-96, 1996).). El epítopo de unión anti-c-Met mab 069 es un epítopo discontinuo que consiste de los aminoácidos de c-Met 239-253 PEFRDSYPIKYVHAF (SEQ ID NO: 238) y 346-361 FAQSKPDSAEPMDRSA (SEQ ID NO: 239). La secuencia de aminoácidos de c-Met se muestra en la s EQ ID NO: 201.
Se usaron métodos similares para mapear el epítopo mAb 5D5 (MetMab, Onartuzumab). El mAb 5D5 se une a los residuos 325-340 de c-Met PGAQLARQIGASLNDD (SEQ ID NO: 240).
Ejemplo 17. Estudios de eficacia tumoral in vivo con EM1-mAb
La eficacia de EM1 mAb contra el crecimiento tumoral se realizó como se describe en el Ejemplo 7 "Estudios de eficacia tumoral con moléculas de EGFR/c-Met biespecíficas" y el Ejemplo 14 empleando líneas celulares tumorales adicionales con mutación de EGFR o EGFR y/o amplificaciones de c-Met. Brevemente, las células SNU-5, H1975, HCC827, las células H1975 que expresan HGF humano o un clon de células HCC827 seleccionadas por su resistencia incrementada al erlotinib (células HCC827-ER1) se implantaron subcutáneamente (s.c.) en ratones hembra desnudos, excepto que las células SNU-5 se implantaron en ratones CR17/SCID. Los ratones se dosificaron intraperitonealmente con PBS o EM1-mAb, cetuximab (CAS 205923-56-4), erlotinib (CAS 183321-74-6), afatinib (CAS 439081-18-2).), o una combinación de mAb EM-1 y afatinib y mAb EM-1 y erlotinib a la dosificación indicada y el programa mostrado en la Tabla 32. La eficacia antitumoral se midió como % de TGI (inhibición del crecimiento tumoral) calculada como 100- % de T/C (T=tamaño tumoral medio del grupo de tratamiento; C = tamaño tumoral medio del grupo de control en un día determinado como se describe en el Ejemplo 7).
En tumores con mutaciones activadoras de EGFR primarias (sin resistencia a TKI de EGFR): (tumor HCC827, EGFR del(E746, A750)), EM1-mAb a dosis de 10 mg/kg inhibió el crecimiento tumoral en un 82%. El Erlotinib fue igualmente eficaz en este modelo, al igual que la combinación de erlotinib y EM1-mAb.La Figura 11 muestra la eficacia del agente terapéutico a lo largo del tiempo en el modelo de tumor HCC827.
En tumores con amplificación del gen de EGFR y c-Met de tipo salvaje (modelo de cáncer gástrico SNU-5), el EM1-mAb mostró actividad antitumoral con regresión tumoral completa (98% de TGI, en el día 34 p <0,01, en comparación con el vehículo que se usa ANOVA de una vía seguido de comparaciones individuales usando Games-Howell). La actividad antitumoral del mAb anti-EGFR cetuximab fue menor, 49% en el día 34, en este modelo. La Figura 12 Muestra la eficacia de los agentes terapéuticos a lo largo del tiempo en el modelo SNU-5.
El EM1-mAb se probó en un modelo NSCLC que contiene la mutación activadora de EGFR primaria y la mutación de EGFR T790M que hace que los tumores sean resistentes a TKI de EGFR de 1a Generación (modelo H1975). El EM1-mAb inhibió el crecimiento tumoral con un 57% de TGI en el modelo de la línea celular H1975 implantado en ratones desnudos (p <0,0001, en comparación con el vehículo de PBS usando el análisis Logrank con Prism 3.03). Como se esperaba, el erlotinib no fue efectivo en este modelo con la mutación T790M. El afatinib fue igual de efectivo que el EM1-mAb (57% de TGI). El cetuximab y la combinación de EM1-mAb con afatinib fueron los tumores más efectivos, con regresión del 91% y el 96% de la inhibición del crecimiento tumoral, respectivamente (p <0,0001 para tanto cetuximab en comparación con PBS como EM1-mAb afatinib en comparación con PBS grupo de vehículos afatinib usando el análisis Logrank con Prism 3.03). Las vías de señalización de c-Met no se activan en este modelo, ya que el HGF del ratón no se une a c-Met humano.
El EM1-mAb se probó en varios modelos que se diseñaron para expresar HGF humano usando un sistema de transducción lentiviral. Esto permite el modelado de la activación del ligando de la vía de c-Met in vivo ya que el HGF de ratón no activa el c-Met humano en las células tumorales humanas implantadas. Los resultados con el modelo de SKMES-HGF se muestran en el Ejemplo 14 y la Figura 10, y el % de TGI se resume en la Tabla 32. El EM1-mAb inhibió el crecimiento tumoral en el modelo H1975-HGF el 71% (p <0,0001, en comparación con el vehículo de PBS usando el análisis Logrank con Prism 3.03). El afatinib, erlotinib y cetuximab fueron menos eficaces en este modelo. La combinación de EM1-mAb y afatinib fue muy eficaz (96% de TGI, p <0,0001, en comparación con el grupo de vehículos de PBS afatinib usando el análisis Logrank con Prism 3.03).La Figura 13 muestra la eficacia de las moléculas a lo largo del tiempo en el modelo H1975-HGF. El erlotinib, afatinib y cetuximab pierden por tanto su eficacia antitumoral en los modelos de tumores en los que se activa la vía de c-Met.
El EM1-mAb se probó en un modelo de tumor caracterizado por una mutación activadora de EGFR primaria y una mayor resistencia a TKI de EGFR de 1a generación (erlotinib) debido a la amplificación del gen de c-Met (modelo HCC827-ER1). El EM1-mAb administrado a 10 mg/kg revirtió parcialmente tumores HCC827-ER1 implantados con 8 6 % de TGI en el día 25, y fue más eficaz que solo el erlotinibo (65% de TGI en el día 25). La combinación de EM1-mAb y erlotinib no mejoró más la eficacia. La Figura 14 muestra la eficacia de las moléculas a lo largo del tiempo.
El EM1-mAb por tanto demuestra eficacia en modelos tumorales con EGFR de tipo salvaje, con mutaciones de EGFR de activación primaria, con la mutación T790M de EGFR asociada con resistencia a agentes terapéuticos de EGFR, así como en modelos en los que se activa c-Met de una manera dependiente de ligandos (expresión autocrina de HGF) o independiente de ligandos (amplificación del gen c-Met). La combinación de EM1-mAb con erlotinib o afatinib puede mejorar la eficacia en algunos modelos tumorales.
Tabla 32.
Figure imgf000082_0001
E je m p lo 18. El EM1 m A b in d u jo la d e g ra d a c ió n d e E G F R y c -M e t in vivo
Para demostrar el acoplamiento de tanto EGFR como de c-Met por EM1-mAb en el tumor, se tomaron muestras de tumores H1975-HGF varias veces después de una única dosis de 20 mg/kg de EM1-mAb. Se prepararon lisados tumorales, normalizados a proteína total, y las muestras se ejecutan en geles SDS-PAGE. Los geles se transfirieron a nitrocelulosa y se transfirieron con Western para EGFR (EGFR antihumano de ratón (mAb) (EGF-R2); Santa Cruz Biotechnology, N° de catálogo sc-73511) o c-Met (Met antihumano de ratón (mAb) (L41G3); T Cell Signaling Technology, N° de catálogo 3148). Los niveles de EGFR se normalizaron a GAPDH; los niveles de c-Met se normalizaron a actina. Los niveles de receptores de los tumores tratados con EM1-mAb se compararon con los de los tumores tratados con PBS para obtener el % de receptor total. El tratamiento con EM1-mAb disminuyó los niveles de receptores de EGFR y cMet totales en los tumores H1975-HGF a entre el 20% y el 60% del control. dependiendo del punto temporal analizado. La Figura 15muestra los niveles de receptores medios en comparación con PBS a lo largo del tiempo. pEGFR, pc-Met y pAKT también disminuyeron a las 72 horas después de la dosis única de EM1.
E je m p lo 19 A c tiv id a d a n titu m o ra l q u e c o m p a ra las iso fo rm as v a ria n te s d e IgG i e Ig G 2 a d e m A b b ie s p e c ífic o s d e E G F R /c -M e t
Para comprender mejor la contribución de la función efectora a la eficacia observada en el modelo H1975-HGF, se realizó una comparación entre EM1-mAb y una variante de EM1-mAb que tenía una IgG2 Fc con sustituciones de silenciamiento del efector V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S en IgG2 (sustituciones descritas en la Solicitud de Patente Internacional N° WO2011/066501) (Numeración de acuerdo con el índice de la UE). Un anticuerpo de IgG2 con sustituciones V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S no interactúa con los receptores de Fc o las células efectoras (como las células NK y los macrófagos). Por tanto, cualquier pérdida de actividad observada con la variante de IgG2 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S de EM1-mAb puede representar actividad antitumoral contribuida los por mecanismos mediados por efectores como ADCC y/o ADCP. Después de 32 días tras el implante de células tumorales en el modelo H1975-HGF descrito anteriormente, hay una indicación de pérdida de actividad antitumoral con la variante de IgG2 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S de EM1-mAb en comparación con el EM1-mAb original, lo que sugiere que los mecanismos mediados por efectores contribuyen a la función del EM-1mAb.La Figura 16 muestra la actividad antitumoral de las moléculas.
LISTADO DE SECUENCIAS
Figure imgf000083_0001
continuación
Figure imgf000084_0001
continuación
Figure imgf000085_0001
continuación
Figure imgf000086_0001
continuación
Figure imgf000087_0001
continuación
Figure imgf000088_0001
SEQ ID NO: 73, PRT, Homo Sapiens, EGFR (incluye la secuencia de señal de 24 aa. La proteína madura comienza en el residuo 25)
1 MRPSGTAGAA LLALLAALCP ASRALEEKKV CQGTSNKLTQ LGTFEDHFLS LQRMFNNCEV
61 VLGNLEITYV QRNYDLSFLK TIQEVAGYVL IALNTVERIP LENLQIIRGN MYYENSYALA
121 VLSNYDANKT GLKELPMRNL QEILHGAVRF SNNPALCNVE SIQWRDIVSS DFLSNMSMDF
181 QNHLGSCQKC DPSCPNGSCW GAGEENCQKL TKIICAQQCS GRCRGKSPSD CCHNQCAAGC
241 TGPRESDCLV CRKFRDEATC KDTCPPLMLY NPTTYQMDVN PEGKYSFGAT CVKKCPRNYV
301 VTDHGSCVRA CGADSYEMEE DGVRKCKKCE GPCRKVCNGI GIGEFKDSLS INATNIKHFK
361 NCTSISGDLH ILPVAFRGDS FTHTPPLDPQ ELDILKTVKE ITGFLLIQAW PENRTDLHAF
421 ENLEIIRGRT KQHGQFSLAV VSLNITSLGL RSLKEISDGD VIISGNKNLC YANTINWKKL
481 FGTSGQKTKI ISNRGENSCK ATGQVCHALC SPEGCWGPEP RDCVSCRNVS RGRECVDKCN
541 LLEGEPREFV ENSECIQCHP ECLPQAMNII CTGRGPDNCI QCAHYIDGPH CVKTCPAGVM
601 GENNTLVWKY ADAGHVCHLC HPNCTYGCTG PGLEGCPTNG PKIPSIATGM VGALLLLLW
661 ALGIGLFMRR RHIVRKRTLR RLLQERELVE PLTPSGEAPN QALLRILKET EFKKIKVLGS
721 GAFGTVYKGL WIPEGEKVKI PVAIKELREA TSPKANKEIL DEAYVMASVD NPHVCRLLGI
781 CLTSTVQLIT QLMPFGCLLD YVREHKDNIG SQYLLNWCVQ IAKGMNYLED RRLVHRDLAA
841 RNVLVKTPQH VKITDFGLAK LLGAEEKEYH AEGGKVPIKW MALESILHRI YTHQSDVWSY
901 GVTVWELMIF GSKPYDGIPA SEISSILEKG ERLPQPPICT IDVYMIMVKC WMIDADSRPK
961 FRELIIEFSK MARDPQRYLV IQGDERMHLP SPTDSNFYRA LMDEEDMDDV VDADEYLIPQ
1021 QGFFSSPSTS RTPLLSSLSA TSNNSTVACI DRNGLQSCPI KEDSFLQRYS SDPTGALTED
1081 SIDDTFLPVP EYINQSVPKR PAGSVQNPVY HNQPLNPAPS RDPHYQDPHS IAVGNPEYLN
1141 TVQPTCVNSI FDSPAHWAQK GSHQISLDNP DYQQDFFPKE AKPNGIFKGS TAENAEYLRV
1201 APQSSEFIGA
Figure imgf000089_0001
SEQ ID NO: 75, PRT, Homo Sapiens, Tenascin-C
1 mgamtqllag vflaflalat eggvlkkvir hkrqsgvnat lpeenqpvvf nhvyniklpv 61 gsqcsvdles asgekdlapp sepsesfqeh tvdgenqivf thrmiprra cgcaaapdvk 21 ellsrleele nlvsslreqc tagagcclqp atgrldtrpf csgrgnfste gcgcvcepgw 81 kgpncsepec pgndilrgrc idgqcicddg ftgedcsqla cpsdcndqgk cvngvcicfe 41 gyagadcsre icpvpcseeh gtcvdglcvc hdgfagddcn kplclnncyn rgrcvenecv 01 cdegftgedc selicpndcf drgrcingtc yceegftged cgkptcphac htqgrceegq 61 cvcdegfagv dcsekrcpad chnrgrcvdg rcecddgñg adcgelkcpn gcsghgrcvn 21 gqcvcdegyt gedcsqlrcp ndchsrgrcv egkcvceqgf kgydcsdmsc pndchqhgrc 81 vngmcvcddg ytgedcrdrq cprdcsnrgl cvdgqcvced gftgpdcael scpndchgqg 41 rcvngqcvch egfmgkdcke qrcpsdchgq grcvdgqcic licgllgldcg qhscpsdcnn 01 lgqcvsgrci cnegysgedc sevsppkdlv vtevteetvn lawdnemrvt eylvvytpth 61 egglemqfrv pgdqtstiiq elepgveyfi rvfailenkk sipvsarvat ylpapeglkf 21 ksiketsvev ewdpldiafe tweiifrnmn kedegeitks lrrpetsyrq tglapgqeye 81 islhivknnt rgpglkrvtt trldapsqie vkdvtdttal itwfkplaei dgieltygik 41 dvpgdrttid ltedenqysi gnlkpdteye vslisrrgdm ssnpaketñ tgldaprnlr
901 rvsqtdnsit lewrngkaai dsyrikyapi sggdhaevdv pksqqattkt tltglrpgte 961 ygigvsavke dkesnpatin aateldtpkd lqvsetaets ltllwktpla kfdryrlnys 1021 lptgqwvgvq lprnttsyvl rglepgqeyn vlltaekgrh kskparvkas teqapelenl 1081 tvtevgwdgl rlnwtaadqa yehfiiqvqe ankveaarnl tvpgslravd ipglkaatpy 1141 tvsiygviqg yrtpvlsaea stgetpnlge vwaevgwda lklnwtapeg ayeyffiqvq 1201 eadtveaaqn ltvpgglrst dlpglkaath ytitirgvtq dfsttplsve vlteevpdmg 1261 nltvtevswd alrlnwttpd gtydqftiqv qeadqveeah nltvpgslrs meipglragt 1321 pytvtlhgev rgh.strplav ewtedlpql gdlavsevgw dglrlnwtaa dnayehfviq 1381 vqevnkveaa qnltlpgslr avdipgleaa tpyrvsiygv irgyrtpvls aeastakepe 1441 ignlnvsdit pesfnlswma tdgifetfti eiidsnrlle tveynisgae rtahisglpp 1501 stdfivylsg lapsirtkti satattealp llenltisdi npygftvswm asenafdsfl 1561 vtvvdsgkll dpqeftlsgt qrklelrgli tgigyevmvs gñqghqtkp lraeivteae 1621 pevdnllvsd atpdgfrlsw tadegvfdnf vlkirdtkkq sepleitlla pertrditgl 1681 reateyeiel ygiskgrrsq tvsaiattam gspkevifsd itensatvsw raptaqvesf 1741 rityvpitgg tpsmvtvdgt ktqtrlvkli pgveylvsii amkgfeesep vsgsfttald 1801 gpsglvtani tdsealarwq paiatvdsyv isytgekvpe itrtvsgntv eyaltdlepa 1861 teytlrifae kgpqksstit akfttdldsp rdltatevqs etalltwrpp rasvtgyllv 1921 yesvdgtvke vivgpdttsy sladlspsth ytakiqalng plrsnmiqti ñtigllypf 1981 pkdcsqamln gdttsglyti ylngdkaeal evfcdmtsdg ggwivflrrk ngrenfyqnw 2041 kayaagfgdr reefwlgldn lnkitaqgqy elrvdlrdhg etafavydkf svgdaktryk 2101 lkvegysgta gdsmayhngr sfstfdkdtd saitncalsy kgafwyrnch rvnlmgrygd 2161 nnhsqgvnwf hwkghehsiq faemklrpsn frnlegrrkr a
Figure imgf000090_0001
> SEQ ID NO: 101 PRT
Homo sapiens cMet 1 mkapavlapg ilvllftlvq rsngeckeal aksemnvnmk yqlpnftaet piqnvilheh 61 hiflgatnyi yvlneedlqk vaeyktgpvl ehpdcíjpcqd csskanlsgg vwkdninmal 121 vvdtyyddql iscgsvnrgt cqrhvíjphnh tadiqsevhc ifspqieeps qcpdcwsal 181 gakvlssvkd rfinffvgnt inssyfpdhp lhsisvrrlk etkdgfmflt dqsyidvlpe
41 frdsypikyv hafesnnfiy fltvqretld aqtfhtriir fcsinsglhs ymemplecil
01 tekrkkrstk kevfnilqaa yvslq)gaqla rqigaslndd ilfgvfaqsk pdsaepmdrs 61 amcaípikyv ndffnkivnk nnvrclqhíy gpnhehcfnr tllrnssgce arrdeyrtef 21 ttalqrvdlf mgqfsevllt sistfikgdl tianlgtseg rfmqvwsrs gpstphvnfl
81 ldshpvspev ivehtlnqng ytlvitgkki tkiplnglgc rhfqscsqcl sappfvqcgw 41 chdkcvrsee clsgtwtqqi clpaiykvfp nsapleggtr lticgwdfgf rrnnkfdlkk 601 trvllgnesc tltlsestmn tlkctvgpam nkhfnmsiii snghgttqys tfsyvdpvit 661 sispkygpma ggtlltltgn ylnsgnsrhi siggktctlk svsnsilecy tpaqtistef 721 avklkidlan retsifsyre dpivyeihpt ksfistwwke plnivsflfc fasggstitg 781 vgknlnsvsv prmvinvhea grnftvacqh rsnseiicct tpslqqlnlq lplktkaffm 841 ldgilskyfd liyvhnpvfk pfekpvmism gnenvleikg ndidpeavkg evlkvgnksc 901 enihlhseav lctvpndllk lnselniewk qaisstvlgk vivqpdqnft gliagvvsis 961 talllllgff lwlkkrkqik dlgselvryd arvhtphldr lvsarsvspt temvsnesvd 1021 yratfjpedqf pnssqngscr qvqypltdms piltsgdsdi sspllqntvh idlsalnpel 1081 vqavqhvvig psslivhfne vigrghfgcv yhgtlldndg kkihcavksl nritdigevs 1141 qfltegiimk dfshpnvlsl lgiclrsegs plvvlpymkh gdlrnfime thnptvkdli 1201 gfglqvakgm kylaskkfvh rdlaarncml dekftvkvad fglardmydk eyysvhnktg 1261 aklpvkwmal eslqtqkñt ksdvwsfgvl lwelmtrgap pypdvntfdi tvyllqgrrl 1321 lqpeycpdpl yevmlkcwhp kaemrpsfse lvsrisaifs tfigehyvhv natyvnvkcv 1381 apypsllsse dnaddevdtr pasfwets
Figure imgf000092_0001
continuación
Figure imgf000093_0001
continuación
Figure imgf000094_0001
continuación
Figure imgf000095_0001
continuación
Figure imgf000096_0001
continuación
Figure imgf000097_0001
continuación
Figure imgf000098_0001
continuación
Figure imgf000099_0001
> SEQ ID NO: 179
PRT
Artificial
Un giro FG de dominio de FN3 de unión a EGFR HNVYKDTNXg RGL;
en donde Xg es M o I
gg > SEQ ID NO: 180
PRT
Artificial
Un giro FG de dominio de FN3 de unión a EGFR
LGSYVFEHDVML (SEQ ID NO: 180),
> SEQ ID NO: 181
PRT
Artificial
un giro BC de dominio de FN3 de unión a EGFR
X1X2X3X4X5X6X7X8 (SEQ ID NO: 181); en donde
X1 es A, T, G o D;
X2 es A, D, Y o W;
X3 es P, D o N;
X4 es L o está ausente;
X5 es D, H, R, G, Y o W;
X6 es G, D o A;
X7 es A, F, G, H o D; y
X8 es Y, F o L.
> SEQ ID NO: 182
PRT
Artificial
Dominio de FN3 de unión a EGFR
LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8DSFLIQYQESEKVGEAINLTVP
GSERSYDLTGLKPGTEYTYSIYGYHNYYKDTNXgRGLPLSAEFTT (SEQ ID NO:
182),
X! es A, T, G o D;
X2 es A, D, Y o W;
X3 es P, D o N;
X4 es L o está ausente;
es D, H, R, G, Y o W;
X6 es G, D o A;
X7 es A, F, G, H o D;
es Y, F o L; y
X9 es M oI
> SEQ ID NO: 183
PRT
Artificial
Dominio de FN3de unión a EGFR
LPAPKNLWSEVTEDSLRLSWX1X2X3X4X5X6X7X8DSFLIQYQESEKVGEAINLTVP
GSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVLGSYVFEHDVMLPLSAEFTT (SEQ ID NO:
183),
en donde
X1 es A, T, G o D;
X2 es A, D, Yo W;
X3 es P, D o N;
X4 es Lo está ausente;
X5 es D, H, R, G, Y o W;
X6 es G, D o A;
X7 es A, F, G, H o D; y
X8 es Y, F o L.
> SEQ ID NO: 184
PRT
Artificial
Una cadena C del dominio de FN3 de unión a C-met y una secuencia de giro CD DSFX10IRYX11EX12X13X14X15GX16 (SEQ ID NO: 184), en donde
X10 es W, F o V;
X11 es D, F o L;
X12 es V, F o L;
X13 es V, L o T;
X14 es V, R, G, L, T o S;
X15 es G, S, A, T o K; y
X16 es E o D; y
> SEQ ID NO: 185
PRT
Artificial
Una cadena F del dominio de FN3 de unión a c-Met y un giro FG
TEYX17VX1bIX19X20VKGGX21X22SX23 (SEQ ID NO: 185), en donde
X17 es Y, W, I, V, G o A;
X18 es N, T, Q o G;
X19 es L, M, N o I;
X20 es G o S;
X21 es S, L, G, Y, T, R, H o K;
X22 es I, V o L; y
X23 es V, T, H, I, P, Yo L.
> SEQ ID NO: 186
PRT
Artificial
un dominio de FN3 de unión a c-Met
LPAPKNLW SRVTEDSARLSW TAPDAAF DSFX10IRYX11E X12X13X14X15GX16
AIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYX17VX18IX19X20VKGGX21X22SX23PLSAEFTT
(SEQ ID NO: 186 ),
en donde
X 10 es W
X11 es D, F o L;
X12 es V, F o L;
X13 es V, LoT;
X14 es V, R, G, L, T o S;
X15 es G, S, A, T o K;
X16 es E o D;
X17 es Y, W, I, V, G o A;
X18 es N, T, Q o G;
X19 es L, M, N o I;
X20 es G o S;
X21 es S, L, G, Y, T, R, H o K;
X22 es I, V o L; y
X23 es V, T, H, I, P, Yo L.
> SEQ ID NO: 187
PRT
Artificial
dominio de FN3 de EGFR de un dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico que contiene molécula LPAPKNLWSX24VTX25DSX26RLSWDDPX27AFYX28SFLIQYQX29SEKVGEAIX30LT VPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYX31VHNVYKDTNX32RGLPLSAX33FTT(SEQ ID NO: 187), en donde
X24 es E, N o R;
X25 es E o P;
X26 es L o A;
X27 es H o W;
X28 es E o D;
X29 es E o P;
X30 es N o V;
X31 es G o Y;
X32 es M o i; y
X33 es E o I;
> SEQ ID NO: 188
dominio de FN3 de c-Met de un dominio de FN3 de EGFR/c-Met biespecífico que contiene la molécula LPAPKNLWSX34VTX35DSX36RLSWTAPDAAFDSFWIRYFX37FX38X39X40GX41AIX42 LTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVNIM43X44VKGGX45ISPPLSAX6FTT (SEQ ID NO: 188); en donde
X34 es E, No R;
X35 es E o P;
X36 es L o A;
X37 es E o P;
X38 es V o L;
X39 es G o S;
es S o K;
X41 es E o D;
X42 es N o V;
X43 es L o M;
X44 es G o S;
es S o K; y
X46 es E o I.
>SEQ ID NO: 189
EGFR mAb E1 VH
Q V Q L YES G G G W QPGRS L R L S C A A S G FTF ST Y G M H W V R Q A P G K G L E W V A V IW D
D G S Y K Y Y G D S V K G R F T IS R D N S K N T L Y
L Q M N S LR A E D T A V Y Y C A R D G IT M V R G V M K D Y F D Y W G Q G T L V T V S S
> SEQ ID NO: 190
EGFR mAb E1 VL
A IQ L T Q S P S S L S A S V G D R V T IT C R A S Q D IS S A L V W Y Q Q K P G K A P K L L IY D A S S L E S G
VPSR FSG SESG TD FTLTISSLQ P
ED F A T Y Y C Q Q FN S Y P L T F G G G T K V E IK
> SEQ ID NO: 191
EGFR mAb E2 VH
1 E V Q LV E S G G G LV Q P G G S L R L SCAASG FTFS S Y W M N W V R Q A
P G K G L E W V A N IK K D G S E K Y Y
61 V D S V K G R F T I S R D N A K N S L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A R D L
G W G W G W Y F D L W G R G T L Y T V S
121 S
> SEQ ID NO: 192
EGFR mAb E2 VL
1 E IV L T Q S P A T LS LS P G E R A T LSC R ASQ SVS S Y L A W Y Q Q K P G Q A P R L L IY D
A S N R A T G IP A
61 RFSGSGSGTD F TLT IS S LE P E D F A V Y Y C Q Q R SN W PPTFG Q G T K V E IK
> SEQ ID NO: 193
cMet mAb M1 VH
QVQLVQSGAEYKKPGASVKVSCETSGYTFTSYGISWVRQAPGHGLEWMGWISAY
NGYTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDLRGTNYFD
YWGQGTLVTVSS
> SEQ ID NO: 194
cMet mAb M1VL
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWFQHKPGKAPKLLIYAASSLLS
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFP-ITFGQGTRLEIK
> SEQ ID NO: 195
cMet mAb M2 VH
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVATISDD
GSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLKSEDTAMYYCAREGLYYYGSGS
YYNQD YWGQGTLVTVSS
> SEQ ID NO: 196
cMet mAb M2 VL
QLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGLSSALAWYRQKPGKAPKLLIYDASSLESGV
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFTSYPQITFGQGTRLEIK
> SEQ ID NO: 197
Cadena pesada de Gp120 con F405L qvqlvqsgaevkkpgasvkvscqasgyrfsnfvihwvrqapgqrfewmgwinpyngnkefsakfqdrvtftadtsantay melrslrsadtavyycarvgpyswddspqdnyymdvwgkgttvivssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfp epvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslsswtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapell ggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvwdvshedpevkfhwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrwsvltvlhqdwln gkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttpp vldsdgsfllyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
> SEQ ID NO: 198
Cadena pesada de Gp120 con K409R qvqlvqsgaevkkpgasvkvscqasgyrfsnfvihwvrqapgqrfewmgwinpyngnkefsakfqdrvtftadtsantay melrslrsadtavyycarvgpyswddspqdnyymdvwgkgttvivssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfp epvtvswnsgaltsgvhtlpavlqssglyslsswtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapell
ggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvwdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrwsvltvlhqdwln gkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttpp vldsdgsfflysrltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
> SEQ ID NO: 199
EM1-mAb H1 (anti-EGFR, 405L)
QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWD
DGSYKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGITMVRGV
MKDYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPY
TVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTK
VDKRVEPKSCDKTHT CPPCPAPELLGGP S VFLFPPKPKDTLMISRTPEVT C V W D V
SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEY
KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS
DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH
EALHNHYTQKSLSLSPGK
> SEQ ID NO: 200
EM-1 mAb L1
AIQLTQSPSSLSASYGDRYTITCRASQDISSALYWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESG
VPSRFSGSESGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPS
VFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK
DSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
> SEQ ID NO: 201
EM-1 mAb H2 (K409R, anti-cMet)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCETSGYTFTSYGISWVRQAPGHGLEWMGWISAY
NGYTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDLRGTNYFD
YWGQGTLVTVSS
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV
LQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPC
PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV
HNAKTKPREEQ YN ST Y R W S VLTVLHQD WLN GKEYKCKV SNKALP APIEKTISK
AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT
TPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
> SEQ ID NO: 202
EM-1 mAb L2
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWFQHKPGKAPKLLIYAASSLLS
GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPITFGQGTRLEIK
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES
VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
> SEQ ID NO: 203
Región constante de H1
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV
LQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPC
PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV
HNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK
AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT
TPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
> SEQ ID NO: 204
Región constante de H2
ASTKGPSYFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPYTYSWNSGALTSGYHTFPAV
LQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPC
PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV
HNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK
AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT
TPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
> SEQ ID NO: 205
ADNc de EM1-mAb H1 pdr000015499 caggtgcagctggtcgagagcggcggaggggtggtgcagcccggcagaagcctgaggctgtcctgcgccgccagcggcttc accttcagcacctacggcatgcactgggtgcggcaggccccaggcaagggcctggagtgggtggccgtgatctgggacgacg gcagctacaagtactacggcgacagcgtgaagggcaggttcaccatcagcagggacaacagcaagaacaccctgtacctgca gatgaacagcctgagggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccagggacggcatcaccatggtgcggggcgtgatgaag gactacttcgactactggggccagggcaccctggtgaccgtgagcagcgccagcaccaagggcccaagcgtgttccccctggc ccccagcagcaagagcaccagcggcggcacagccgccctgggctgcctggtgaaggactacttccccgagccagtgaccgtg
tcctggaactctggcgccctgacctccggcgtgcacaccttccccgccgtgctgcagagcagcggcctgtacagcctgagcagc gtggtgaccgtgcccagcagcagcctgggcacccagacctacatctgcaacgtgaaccacaagcccagcaacaccaaggtgg acaagagagtggagcccaagagctgcgacaagacccacacctgccccccctgcccagccccagagctgctgggcggaccca gcgtgttcctgttcccccccaagcccaaggacaccctgatgatcagcaggacccccgaggtgacctgcgtggtggtggacgtga gccacgaggacccagaggtgaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcacaacgccaagaccaagcccagagagg agcagtacaacagcacctacagggtggtgtccgtgctgaccgtgctgcaccaggactggctgaacggcaaggaatacaagtgc aaggtctccaacaaggccctgccagcccccatcgaaaagaccatcagcaaggccaagggccagccacgggagccccaggtg tacaccctgccccccagccgggaggagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctggtgaagggcttctaccccagcgac atcgccgtggagtgggagagcaacggccagcccgagaacaactacaagaccacccccccagtgctggacagcgacggcagc ttcctcctgtacagcaagctgaccgtggacaagtccaggtggcagcagggcaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggcc ctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgagccccggcaaatga
> SEQ ID NO: 206
ADNc de EM1-mAb L1 pDR000015499
atccagctgacccagagccccagcagcctgagcgccagcgtgggcgaccgggtgaccatcacctgccgggccagccaggac atcagcagcgccctggtctggtatcagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacgacgccagctccctggaaag cggcgtgcccagccggttcagcggcagcgagagcggcaccgacttcaccctgaccatcagcagcctgcagcccgaggacttc gccacctactactgccagcagttcaacagctaccccctgacctttggcggcggaacaaaggtggagatcaagcgtacggtggcc gctcccagcgtgttcatcttcccccccagcgacgagcagctgaagagcggcaccgccagcgtggtgtgcctgctgaacaacttct acccccgggaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagagcggcaacagccaggagagcgtcaccgagcag gacagcaaggactccacctacagcctgagcagcaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctg cgaggtgacccaccagggcctgtccagccccgtgaccaagagcttcaacaggggcgagtgctga
> SEQ ID NO: 207
ADNc de EM-1 mAbH2pDR000016584
caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcgagacttctggttacacctt taccagctatggtatcagctgggtgcgacaggcccctggacacgggcttgagtggatgggatggatcagcgcttacaatggttac acaaactatgcacagaagctccagggcagggtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgagga gcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagagatctgagaggaactaactactttgactactggggccagggaac cctggtcaccgtctcctcagcctccaccaagggcccaagcgtgttccctctggcccccagcagcaagagcacatctggcggaac agccgccctgggctgcctggtgaaagactacttccccgagcccgtgaccgtgtcctggaactctggcgccctgaccagcggcgt gcacacctttccagccgtgctgcagagcagcggcctgtacagcctgtccagcgtggtgaccgtgcccagcagctccctgggcac ccagacctacatctgcaacgtgaaccacaagcccagcaacaccaaggtggacaagcgggtggaacccaagagctgcgacaag acccacacctgtcccccctgccctgcccctgaactgctgggcggaccctccgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccc tgatgatcagccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccacgaggaccctgaagtgaagttcaattggtacgt ggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagtacaacagcacctaccgggtggtgtccgtgctg acagtgctgcaccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtctccaacaaggccctgcctgctcccatcgagaa aaccatcagcaaggccaagggccagccccgcgagcctcaggtgtacacactgcctcccagccgggaagagatgaccaagaa ccaggtgtccctgacctgtctggtgaaaggcttctaccccagcgatatcgccgtggaatgggagagcaacggacagcccgagaa caactacaagaccaccccccctgtgctggacagcgacggctccttcttcctgtactctcggctgaccgtggacaagagccggtgg cagcagggaaacgtgttcagctgcagcgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgagcctgagccc cgggaagtga
> SEQ ID NO: 208
ADNc de EM-1 mAb L2 pDR000016584
gacatccagatgacccagtccccctcctccgtgtccgcctctgtgggcgacagagtgaccatcacctgtcgggcctcccagggc atctccaactggctggcctggttccagcacaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacgccgcctcctccctgctgtccg gcgtgccctccagattctccggctctggctccggcaccgacttcaccctgaccatctccagcctgcagcccgaggacttcgccac ctactactgccagcaggccaactccttccccatcaccttcggccagggcacccggctggaaatcaagcgtacggtggccgctcc cagcgtgttcatcttcccccccagcgacgagcagctgaagagcggcaccgccagcgtggtgtgcctgctgaacaacttctaccc ccgggaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagagcggcaacagccaggagagcgtcaccgagcaggaca gcaaggactccacctacagcctgagcagcaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgag gtgacccaccagggcctgtccagccccgtgaccaagagcttcaacaggggcgagtgctga
> SEQ ID NO: 209
Cadena ligera de Gp120
Eivltqspgtlslspgeratfscrsshsirsrrvawyqhkpgqaprlvihgvsnrasgisdrfsgsgsgtdftltitrvepedfalyy cqvygassytfgqgtklerkrtvaapsvfifppsdeqlksgtaswcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskd styslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
>SEQ ID NO: 210
E1 HC1 HCDR1
TYGMH
>SEQ ID NO: 211
E1 HC1 HCDR2
VIWDDGSYKYYGDSVKG
>SEQ ID NO: 212
E1 HC1 HCDR3
DGITMVRGVMKDYFDY
>SEQ ID NO: 213
E1 LC1 LCDR1
RASQDISSALV
>SEQ ID NO: 214
E1 LC1 LCDR2
DASSLES
>SEQ ID NO: 215
E1 LC1 LCDR3
QQFNSYPLT
>SEQ ID NO: 216
E1 HC2 HCDR1
SYGIS
>SEQ ID NO: 217
E1 HC2 HCDR2
WISAYNGYTNYAQKLQG
>SEQ ID NO: 218
E1 HC2 HCDR3
DLRGTNYFDY
>SEQ ID NO: 219
E1 LC2 LCDR1
RASQGISNWLA
>SEQ ID NO: 220
E1 LC2 LCDR2
AASSLLS
>SEQ ID NO: 221
E1 LC2 LCDR3 QQANSFPIT
>SEQ ID NO: 222
E2 mAB HC1 HCDR1 SYWMN
>SEQ ID NO: 223
E2 mAb HC1 HCDR2 NIKKDGSEKYYVDSVKG
>SEQ ID NO: 224
E2 mAb HC1 HCDR3 DLGWGWGWYFDL
>SEQ ID NO: 225
E2 mAB LC1 LCDR1 RASQSVSSYLA
>SEQ ID NO: 226
E2 mAb LC1 LCDR2 DASNRAT
>SEQ ID NO: 227
E2 mAb LC1 LCDR3 QQRSNWPPT
>SEQ ID NO: 228
E2 mAB HC2 HCDR1 DYYMY
>SEQ ID NO: 229
E2 mAb HC2 HCDR2 TISDDGSYTYYPDSVKG
>SEQ ID NO: 230
E2 mAb HC2 HCDR3 EGLYYYGSGSYYNQDY
>SEQ ID NO: 231
E2 mAB LC2 LCDR1 RASQGLSSALA
>SEQ ID NO: 232
E2 mAb LC2 LCDR2 DASSLES
>SEQ ID NO: 233
E2 mAb LC2 LCDR3 QQFTSYPQIT
>SEQ ID NO: 234
E2 mAb HC1 (EGFR-F405L)
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMNWVRQA PGKGLEWVAN
IKKDGSEKYY
VDSYKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARDL GWGWGWYFDL
WGRGTLYTYSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSG
ALTSGVHTFP AVLQ S SGLYS LS S W TVPS SSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEP
KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEV
KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN
KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW
ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFLLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMFIEALHNH
YTQKSLSLSPGK
> SEQ ID NO: 235
E2 mAb LC1 (EGFR)
EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD
ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPPTFGQ GTKVEIK
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES
VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
> SEQ ID NO: 236
E2 mAb HC2 (c-Met-K409R)
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVATISDD
GSYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNNLYLQMSSLKSEDTAMYYCAREGLYYYGSGS
YYNQDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVT
VSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKV
DKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYK
CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDI
AVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA
LHNHYTQKSLSLSPGK
> SEQ ID NO: 237
E2 mAb LC2 (cMet)
QLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGLSSALAWYRQKPGKAPKLLIYDASSLESGV
PSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFTSYPQITFGQGTRLEIK
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES
VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
> SEQ ID NO: 238
epítopo discontinuo de c-Met del mAb 069
PEFRDSYPIKYVHAF
> SEQ ID NO: 239
epítopo discontinuo de c-Met del mAb 069
FAQSKPDSAEPMDRSA

Claims (1)

  1. R E IV IN D IC A C IO N E S
    1. Un anticuerpo del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR)/receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (c-Met) biespecífico aislado, que comprende:
    a) una primera cadena pesada (HC1) que comprende un dominio constante 3 de HC1 (HC1 CH3) y una región variable 1 de HC1 (VH1);
    b) una segunda cadena pesada (HC2) que comprende un dominio constante 3 de HC2 (HC2 CH3) y una región variable 2 de HC2 (VH2);
    c) una primera cadena ligera (LC1) que comprende una región variable de cadena ligera 1 (VL1); y d) una segunda cadena ligera (LC2) que comprende una región variable de cadena ligera 2 (VL2), en donde la VH1 y la VL1 se emparejan para formar un primer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a EGFR, la VH2 y la VL2 se emparejan para formar un segundo sitio de unión al antígeno que se une específicamente a c-Met, la HC1 comprende por lo menos una sustitución en HC1 CH3 y la HC2 comprende por lo menos una sustitución en la HC2 CH3, y la sustitución en la HC1 CH3 y la sustitución en la HC2 CH3 tienen lugar en diferentes posiciones de residuos de aminoácidos, cuando la numeración de los residuos es de acuerdo al índice de la UE, en donde:
    i) la VH1 comprende las secuencias de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de la cadena pesada (HCDR) 1 (HCDR1), HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 210, 211 y 212, respectivamente; y
    ii) la VL1 comprende las secuencias de aminoácidos de la región determinante de la complementariedad de la cadena ligera (LCDR) 1 (LCDR1), LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 213, 214 y 215, respectivamente; y
    iii) la VH2 comprende las secuencias de aminoácidos de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de las SEQ ID NO: 216, 217 y 218, respectivamente; y
    iii) la VL2 comprende las secuencias de aminoácidos de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de las SEQ ID NO: 219, 2 2 0 y 2 2 1 , respectivamente.
    2. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1, en el que:
    a) el anticuerpo es un anticuerpo humano, y en donde la VH1, la VL1, la VH2 y la VL2 comprenden las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 189, 190, 193 y 194, respectivamente; y/o
    b) el anticuerpo inhibe la fosforilación de las quinasas relacionadas con la señal extracelular 1 y 2 (ERK1/2) en la línea celular NCI-H292, NCI-H1975 o SKMES-1 con un valor de IC50 que es por lo menos 1o veces menos, por lo menos 20 veces menos, por lo menos 30 veces menos, por lo menos 40 veces menos, por lo menos 50 veces menos o por lo menos 6 0 veces menos cuando se compara con el valor de IC50 de inhibición de la fosforilación de ERK1/2 en líneas celulares NCI-H292, NCI-H1975 o SKMES-1 con una mezcla de un anticuerpo de EGFR monovalente de control que comprende una cadena pesada 3 (HC3) y una cadena ligera 3 (LC3) y un anticuerpo de c-Met monovalente de control que comprende una cadena pesada 4 (HC4) y una cadena ligera 4 (LC4), en donde
    la HC3 y la HC1, la LC3 y la LC1, la HC4 y la HC2, y la LC4 y la LC2 tienen secuencias de aminoácidos idénticas, respectivamente, y
    la fosforilación de ERK1/2 se mide en lisados celulares completos mediante un inmunoensayo en sándwich usando un anticuerpo anti-fosfo ERK1/2 como un anticuerpo de captura y un anticuerpo que se une a ERK1/2 fosforilado y no fosforilado conjugado con un compuesto electroquimioluminiscente como un anticuerpo de detección, opcionalmente en donde:
    i) el anticuerpo inhibe la fosforilación de ERK1/2 con un valor de IC50 de 2x10'9 M o menos, 1x10'9 M o menos, o 1x10'1° M o menos; y/o
    ii) ERK1 se fosforila en los residuos Thr202 y Tyr204, y ERK2 se fosforila en los residuos Thr185 y Tyr197; y/o
    y/o;
    c) el anticuerpo inhibe la fosforilación de la proteína quinasa B (AKT) en Ser473 en la línea celular NCI-H1975 con un valor de IC50 que es por lo menos 70 veces menos cuando se compara con el valor de IC50 de inhibición de la fosforilación de AKT en Ser473 en la línea celular NCI-H1975 con la mezcla del anticuerpo de EGFR monovalente de control comprendiendo la HC3 y la LC3 y el anticuerpo de c-Met monovalente de control comprendiendo la HC4 y la LC4, en donde
    la HC3 y la HC1, la LC3 y la LC1, la HC4 y la HC2, y la LC4 y la LC2 tienen secuencias de aminoácidos idénticas, respectivamente, y
    la fosforilación de AKT en Ser473 se mide en lisados celulares completos mediante un inmunoensayo en sándwich usando un enlace de anticuerpo con A K T no fosforilado y fosforilado como un anticuerpo de captura y un anticuerpo S er473 anti-fosfo A K T conjugado con un com puesto electroquimioluminiscente com o un anticuerpo de detección, opcionalm ente en donde el anticuerpo inhibe la fosforilación de A K T en S er473 con un valor de IC 50 de 1x10 '9 M o menos; y/o
    d) el anticuerpo inhibe la fosforilación de A K T en Thr308 en la línea celular N C I-H 1975 con un valor de IC 50 que es por lo menos 100 veces menos cuando se com para con el valor de IC 50 de inhibición de la fosforilación de AK T en Thr308 en la línea celular N C I-H 1975 con la m ezcla del anticuerpo de E G FR m onovalente de control que com prende la H C 3 y la LC3 y el anticuerpo de c-M et m onovalente de control que com prende la H C 4 y la LC4, en donde
    la H C 3 y la HC 1, la LC3 y la LC1, la H C 4 y la HC2, y la LC4 y la LC2 tienen secuencias de am inoácidos idénticas, respectivam ente, y
    la fosforilación de A K T en Thr308 se mide en lisados celulares completos m ediante un inm unoensayo en sándwich usando un enlace de anticuerpo con A K T no fosforilado y fosforilado como un anticuerpo de captura y un anticuerpo anti-fosfo A K T Thr308 conjugado a un com puesto electroquim iolum iniscente com o un anticuerpo de detección, opcionalm ente en donde el anticuerpo inhibe la fosforilación de A K T en T hr308 con un valor de IC 50 de 1x10 '9 M o menos; y/o;
    e) el anticuerpo biespecífico se une a E G FR que tiene la secuencia de am inoácidos m ostrada en la S E Q ID NO: 73 en los residuos KFR9, 1491, K 467 y S 492 de E G FR y en c-M et en los residuos P E F R D S Y P IK Y V H A F (S E Q ID NO: 238 ) y F A Q S K P D S A E P M D R S A (S E Q ID NO: 239); y/o
    f) el anticuerpo inhibe el crecim iento de células N C I-H 292 o N C I-H 1975 con un valor de IC 50 que es por lo menos 300 veces menos, por lo menos 400 veces menos, por lo menos 500 veces menos, por lo m enos 600 veces menos, por lo menos 700 veces menos o por lo menos 800 veces m enos cuando se com para con el valor de IC 50 de inhibición del crecim iento de células N C I-H 292 o N C I-H 1975 con cetuxim ab cuando las células N C I-H 292 o N C I-H 1975 se cultivan en condiciones de unión baja; y/o
    g) el anticuerpo inhibe el crecim iento del tum or de células S K M E S -1 que expresa H G F en ratones S C ID Beige con un porcentaje (% ) de valor de T /C de por lo menos 500 veces menos en el día 36 en com paración con cetuximab, cuando el anticuerpo biespecífico y el cetuxim ab se administran a dosis de 20 mg/kg; y/o; h) el anticuerpo neutraliza la señalización de E G FR y c-Met.
    3. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la HC1 y la H C 2 son del isotipo IgG1, IgG2, IgG 3 o IgG4, por ejemplo, en el que la HC1 y la H C 2 son del isotipo IgG1; opcionalm ente, en el que la HC1 C H 3 com prende por lo menos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho sustituciones y la H C 2 C H 3 com prende por lo m enos una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho sustituciones en las posiciones de residuos 350, 366, 368, 370, 399, 405, 407 o 409, cuando la num eración de los residuos es de acuerdo con el índice de la UE, como
    a) en el que la HC1 C H 3 com prende por lo menos una, dos, tres o cuatro sustituciones y la H C 2 C H 3 com prende por lo m enos una, dos, tres o cuatro sustituciones en las posiciones de residuos 350, 370, 405 o 409;
    b) en el que la HC1 C H 3 com prende por lo m enos una sustitución y la H C 2 C H 3 com prende por lo menos una sustitución en las posiciones de residuos 405 o 409;
    c) en el que la HC1 C H 3 com prende una sustitución K 409R o F405L y la H C 2 C H 3 com prende una sustitución K 409R o F405L; o
    d) en el que la HC1 C H 3 com prende la sustitución F405L y la H C 2 C H 3 com prende la sustitución K409R. 4. El anticuerpo biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3:
    a) que com prende adem ás 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 sustituciones de am inoácidos conservadoras en la HCl 1, la LC1, la H C 2 o la LC2, que com prende opcionalm ente una sustitución M 252 Y /S 254 T /T 256 E en la HC1 y/o la HC 2, en donde la num eración de los residuos es de acuerdo con el índice de la UE; y/o
    b) en donde el anticuerpo tiene una estructura de glicano biantenaria con un contenido de fucosa de entre el 1% y el 15% .
    5. Una composición farm acéutica que com prende el anticuerpo biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un portador farm acéuticam ente aceptable.
    6 . El anticuerpo biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso en un m étodo para tratar el cáncer, que com prende adm inistrar una cantidad terapéuticam ente eficaz del anticuerpo de E G F R /c -M et biespecífico a un paciente con necesidad de ello durante un tiem po suficiente para tratar el cáncer, opcionalm ente en donde: a) el cáncer está asociado con una mutación activadora de E G FR , una amplificación del gen de EG FR , niveles aumentados de HGF circulante, una mutación activadora de c-Met, una amplificación del gen de c-Met o un KRAS mutante, como en donde:
    (i) la mutación activadora de EGFR es sustitución de G719A, G719X (siendo X cualquier aminoácido), L861X (siendo X cualquier aminoácido), L858R, E746K, L747S, E749Q, A750P, A755V, V765M, L858P o T790M, deleción de E746 -A750, deleción de R748-P753, inserción de Ala (A) entre M766 y A767, inserción de Ser, Val y Ala (SVA) entre S768 y V769, e inserción de Asn y Ser (NS) entre P772 y H773, opcionalmente en donde la mutación activadora de EGFR es sustitución de L858R, del (E476, a 750) y/o T790M; o
    (ii) el KRAS mutante tiene una sustitución G12V o G12C; o
    (iii) el sujeto es resistente o ha adquirido resistencia al tratamiento con erlotinib, gefitinib, afatinib, CO-1686, AZD9192 o cetuximab; o
    (iv) el cáncer es un cáncer de células epiteliales, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), adenocarcinoma de pulmón, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer colorrectal, cáncer de ano, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de faringe, cáncer de nariz, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer oral, cáncer de lengua, cáncer de esófago, cáncer de vagina, cáncer cervical, cáncer de bazo, cáncer de testículo, cáncer gástrico, cáncer de timo, cáncer de colon, cáncer de tiroides, cáncer de hígado, carcinoma hepatocelular (HCC) o carcinoma de células renales papilar esporádico o hereditario (PRCC);
    o
    b) el sujeto es homocigótico para la fenilalanina en la posición 158 de CD16 o heterocigoto para la valina y la felanilalanina en la posición 158 de CD16.
    7. El anticuerpo biespecífico para su uso de acuerdo con la reivindicación 6(a)(iv), que comprende administrar un segundo agente terapéutico, opcionalmente en donde:
    a) el segundo agente terapéutico es un agente quimioterapéutico o una terapia dirigida contra el cáncer, como en donde:
    i) el agente quimioterapéutico es cisplatino o vinblastina; o
    ii) el agente quimioterapéutico o la terapia dirigida contra el cáncer es un inhibidor de la tirosina quinasa de EGFR, c-Met, HER2, HER3, HEr4 o VEGFR, opcionalmente en donde el inhibidor de la tirosina quinasa es erlotinib, gefitinib o afatinib; o
    b) el segundo agente terapéutico se administra de forma simultáneamente, secuencialmente o por separado.
    8. Un método in vitro para inhibir el crecimiento o la proliferación de células que expresan EGFR y/o c-Met, que comprende poner en contacto las células con el anticuerpo biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
    9. El anticuerpo biespecífico de de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso en un método para inhibir el crecimiento o la metástasis de células tumorales o cancerosas que expresan EGFR y/o c-Met en un sujeto que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz del anticuerpo biespecífico para inhibir el crecimiento o la metástasis de células tumorales o cancerosas que expresan EGFR y/o c-Met, opcionalmente en donde el tumor que expresa EGFR y/o c-Met es un cáncer de células epiteliales, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), adenocarcinoma de pulmón, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer colorrectal, cáncer de ano, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de faringe, cáncer de nariz, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer oral, cáncer de lengua, cáncer de esófago, cáncer de vagina, cáncer cervical, cáncer de bazo, cáncer de testículo, cáncer gástrico, cáncer de timo, cáncer de colon, cáncer de tiroides, cáncer de hígado, carcinoma hepatocelular (HCC) o carcinoma de células renales papilar esporádico o hereditario (PRCC), como en donde el tumor que expresa EGFR y/o c-Met está asociado con una mutación activadora de EGFR, una amplificación del gen de EGFR, niveles aumentados de HGF circulante, una mutación activadora de c-Met, una amplificación del gen de c-Met o un KRAS mutante, opcionalmente en donde:
    a) la mutación activadora de EGFR es una sustitución G719A, G719X (siendo X cualquier aminoácido), L861X (siendo X cualquier aminoácido), L858R, E746K, L747S, E749Q, A750P, A755V, V765M, L858P o T790M, deleción de E746- A750, deleción de R748-P753, inserción de Ala (A) entre M766 y A767, inserción de Ser, Val y Ala (SVA) entre S768 y V769, e inserción de Asn y Ser (NS) entre P772 y H773; o
    b) el KRAS mutante tiene una sustitución G12V o G12C.
    10. El anticuerpo biespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para su uso en terapia, como para su uso en el tratamiento del cáncer, opcionalmente en donde el cáncer es un cáncer de células epiteliales, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), adenocarcinoma de pulmón, cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer colorrectal, cáncer de ano, cáncer de próstata, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de faringe, cáncer de nariz, cáncer de páncreas, cáncer de piel, cáncer oral, cáncer de la lengua, cáncer de esófago, cáncer de vagina, cáncer cervical, cáncer de bazo, cáncer de testículo, cáncer gástrico, cáncer de timo, cáncer de colon, cáncer de tiroides, cáncer de hígado, carcinoma hepatocelular (HCC) o carcinoma de células renales papilares esporádico o hereditario (PRCC).
    11. El anticuerpo biespecífico para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el anticuerpo biespecífico se administra en combinación con un segundo agente terapéutico simultáneamente, secuencialmente o por separado, opcionalmente en donde el segundo agente terapéutico es un agente quimioterapéutico, como:
    a) un agente alquilante como tiotepa y ciclosfosfamida;
    b) un alquil sulfonato como busulfán, improsulfán y piposulfán;
    c) una aziridina como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa;
    d) una etilenimina o metilamelamina incluyendo altretamina, trietilenemelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina;
    e) una mostaza nitrogenada como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza uracilo;
    f) una nitrosurea como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina;
    g) un antibiótico como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorrubicina;
    h) un antimetabolito como metotrexato y 5-FU;
    i) un análogo de ácido fólico como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato;
    j) un análogo de purina como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina;
    k) análogos de pirimidina como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina;
    l) andrógenos como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; m) un anti-adrenal como aminoglutetimida, mitotano, trilostano;
    n) un regenerador de ácido fólico como el ácido frolínico
    o) aceglatona; glucósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; etoglucid; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK; razoxano; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2',2”-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinósido; ciclofosfamida; o tiotepa;
    p) un miembro de la familia de los taxoides o de los taxanos, como paclitaxel y análogos del mismo; clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato;
    q) un análogo de platino como cisplatino y carboplatino;
    r) vinblastina; platino; etopósido; ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilomitina (DMFO); ácido retinoico; esperamicinas; o capecitabina;
    s) un inhibidor de los receptores de tirosina quinasas y/o angiogénesis, incluyendo sorafenib, sunitinib, pazopanib, toceranib, vandetanib, cediranib, regorafenib, axitinib, lestaurtinib, erlotinib, gefitinib, BIBW 2992, lapatinib, neratinib
    t) un agente antihormonal que actúa para regular o inhibir la acción hormonal en tumores como antiestrógenos, incluyendo por ejemplo tamoxifeno, raloxifeno, 4(5)-imidazoles inhibidores de aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY 117018, onapristona y toremifeno; o
    u) un antiandrógeno como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina;
    y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.
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Families Citing this family (98)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2008234248C1 (en) 2007-03-29 2015-01-22 Genmab A/S Bispecific antibodies and methods for production thereof
SI2506871T1 (sl) * 2009-11-30 2016-12-30 Janssen Biotech, Inc. Mutanti Fc protitelesa z odstranjenimi efektorskimi funkcijami
RS66008B1 (sr) 2010-03-10 2024-10-31 Genmab As Monoklonska antitela protiv c-met
CN110066339A (zh) * 2010-04-20 2019-07-30 根马布股份公司 含异二聚体抗体fc的蛋白及其制备方法
CA3051311A1 (en) 2010-05-27 2011-12-01 Genmab A/S Monoclonal antibodies against her2
SG11201401422VA (en) 2011-10-27 2014-09-26 Genmab As Production of heterodimeric proteins
US20170275367A1 (en) 2012-11-21 2017-09-28 Janssen Biotech, Inc. Bispecific EGFR/C-Met Antibodies
PL2922872T3 (pl) * 2012-11-21 2019-03-29 Janssen Biotech, Inc. Bispecyficzne przeciwciała przeciwko egfr/c-met
US9695228B2 (en) 2012-11-21 2017-07-04 Janssen Biotech, Inc. EGFR and c-Met fibronectin type III domain binding molecules
IL244623B (en) 2013-10-14 2022-08-01 Janssen Biotech Inc Cysteine engineered fibronectin type iii domain binding molecules
EA033304B1 (ru) 2014-02-04 2019-09-30 Астеллас Фарма Инк. Фармацевтическая композиция, включающая диамино-гетероциклическое карбоксамидное соединение в качестве активного ингредиента
SG11201607109QA (en) 2014-02-28 2016-09-29 Merus Nv Antibodies that bind egfr and erbb3
KR102309881B1 (ko) 2014-11-21 2021-10-06 삼성전자주식회사 c-Met 및 EGFR의 이중 저해제 및 IGF-1R 저해제를 포함하는 병용 투여용 약학 조성물
CN114224894B (zh) * 2014-12-03 2025-01-07 奥克兰联合服务有限公司 用于治疗癌症的激酶抑制剂前药
CA2971186A1 (en) 2014-12-15 2016-06-23 The Regents Of The University Of California Cytotoxic molecules responsive to intracellular ligands for selective t cell mediated killing
US11253546B2 (en) 2014-12-15 2022-02-22 The Regents Of The University Of California Bispecific OR-gate chimeric antigen receptor responsive to CD19 and CD20
DK3233907T3 (da) 2014-12-19 2021-06-07 Genmab As Bispecifikke heterodimeriske proteiner hos gnavere
CN106659779B (zh) * 2014-12-22 2021-05-18 西雅图免疫公司 双特异性四价抗体及其制造和使用方法
GB201506870D0 (en) 2015-04-22 2015-06-03 Ucb Biopharma Sprl Method
WO2016182513A1 (en) * 2015-05-13 2016-11-17 Singapore Health Services Pte Ltd Profiling of hepatocellular carcinoma and applications thereof
BR112018008068A2 (en) * 2015-10-23 2018-11-13 Merus N.V. binding molecules that inhibit cancer growth
SI3370768T1 (sl) 2015-11-03 2022-04-29 Janssen Biotech, Inc. Protitelesa, ki se specifično vežejo na PD-1, in njihove uporabe
US11235063B2 (en) 2015-11-03 2022-02-01 Merck Patent Gmbh Bi-specific antibodies for enhanced tumor selectivity and inhibition and uses thereof
AU2017214692B2 (en) * 2016-02-06 2021-11-04 Epimab Biotherapeutics, Inc. Fabs-in-tandem immunoglobulin and uses thereof
SG11201809751XA (en) 2016-05-26 2018-12-28 Zeno Royalties & Milestones Llc Egfr inhibitor compounds
KR101985299B1 (ko) * 2016-06-03 2019-09-03 삼성전자주식회사 항-c-Met/항-Nrp1 이중 특이 항체
SG11201811062XA (en) * 2016-06-21 2019-01-30 Janssen Biotech Inc Cysteine engineered fibronectin type iii domain binding molecules
JP2019530440A (ja) 2016-09-02 2019-10-24 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア インターロイキン６受容体α結合単鎖可変断片を含む方法および組成物
TWI782930B (zh) 2016-11-16 2022-11-11 美商再生元醫藥公司 抗ｍｅｔ抗體，結合ｍｅｔ之雙特異性抗原結合分子及其使用方法
WO2018094282A1 (en) * 2016-11-18 2018-05-24 The Regents Of The University Of California Engineered antibodies and uses thereof
WO2018111976A1 (en) 2016-12-14 2018-06-21 Janssen Biotech, Inc. Pd-l1 binding fibronectin type iii domains
JP7104703B2 (ja) 2016-12-14 2022-07-21 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド Ｃｄ８ａ結合フィブロネクチンｉｉｉ型ドメイン
EP3554561B1 (en) 2016-12-14 2023-06-28 Janssen Biotech, Inc. Cd137 binding fibronectin type iii domains
EP3576767A4 (en) * 2017-02-06 2020-12-02 Academia Sinica RECOMBINATED PROTEINS AND THEIR USES
CA3058343A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Merus N.V. Erbb-2 and erbb-3 binding bispecific antibodies for use in the treatment of cells that have an nrg1 fusion gene
US12195551B2 (en) 2017-05-17 2025-01-14 Merus N.V. Combination of an ErbB-2/ErbB-3 bispecific antibody with endocrine therapy for breast cancer
KR102078292B1 (ko) * 2017-05-30 2020-02-19 주식회사 종근당 신규한 항 c-Met 항체 및 이의 용도
WO2018221969A1 (en) * 2017-05-30 2018-12-06 Chong Kun Dang Pharmaceutical Corp. A novel anti-c-met antibody and use thereof
HUE071182T2 (hu) * 2017-08-09 2025-08-28 Merus Nv EGFR és CMET kötõ antitestek
EP3672611A4 (en) * 2017-08-25 2021-07-14 Janssen Biotech, Inc. TYPE III DOMAINS OF FIBRONECTIN BINDER FCyRII, THEIR CONJUGATES AND MULTISPECIFIC MOLECULES INCLUDING THEM
WO2019114793A1 (zh) * 2017-12-13 2019-06-20 凯惠科技发展(上海)有限公司 一种egfr抗体及其制备方法和应用
US20190184028A1 (en) * 2017-12-14 2019-06-20 Janssen Biotech, Inc. Targeting with firbronectin type iii like domain molecules
US12398209B2 (en) 2018-01-22 2025-08-26 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating cancers with antagonistic anti-PD-1 antibodies
JOP20200303A1 (ar) 2018-05-24 2020-11-23 Janssen Biotech Inc عوامل ربط psma واستخداماتها
US20200061015A1 (en) 2018-08-23 2020-02-27 Janssen Biotech, Inc. Lipase Degradation Resistant Surfactants for Use in Large Molecule Therapeutic Formulations
CA3112043A1 (en) 2018-09-10 2020-03-19 Mirati Therapeutics, Inc. Combination therapies
CA3111980A1 (en) * 2018-09-10 2020-03-19 Mirati Therapeutics, Inc. Combination therapies
CR20210193A (es) 2018-10-22 2021-06-15 Janssen Pharmaceutica Nv Proteínas de fusión de péptido similar al glucagón 1 (glp1)-factor de diferenciación de crecimiento 15 (gdf15) y usos de estas
CA3112129A1 (en) 2018-12-05 2020-06-11 Mirati Therapeutics, Inc. Combination therapies
TWI874341B (zh) * 2018-12-18 2025-03-01 美商健生生物科技公司 產生異二聚體抗體之方法
US11459391B2 (en) * 2019-02-26 2022-10-04 Janssen Biotech, Inc. Combination therapies and patient stratification with bispecific anti-EGFR/c-Met antibodies
KR20220002899A (ko) 2019-04-19 2022-01-07 얀센 바이오테크 인코포레이티드 항-psma/cd3 항체로 전립선암을 치료하는 방법
MX2021013955A (es) * 2019-05-14 2022-03-11 Janssen Biotech Inc Terapias de combinación con anticuerpos anti-egfr/c-met biespecíficos e inhibidores de tirosina quinasa de egfr de 3.a generación.
JOP20210304A1 (ar) 2019-05-14 2023-01-30 Janssen Biotech Inc علاجات مركبة باستخدام الأجسام المضادة ثنائية النوعية المضادة لمستقبل عامل نمو البشرة (EGFR)/ مستقبل عامل نمو خلايا الكبد (c-Met) ومثبطات كيناز التيروسين الخاصة بمستقبل عامل نمو البشرة (EGFR) من الجيل الثالث
US11850248B2 (en) 2019-05-14 2023-12-26 Yuhan Corporation Therapies with 3rd generation EGFR tyrosine kinase inhibitors
KR20220063185A (ko) 2019-09-16 2022-05-17 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 면역-pet 영상화를 위한 방사성 표지된 met 결합 단백질
EP4045061A4 (en) 2019-10-14 2024-04-17 ARO Biotherapeutics Company FIBRONECTIN TYPE III DOMAINS BINDING TO CD137
WO2021076543A1 (en) 2019-10-14 2021-04-22 Aro Biotherapeutics Company Epcam binding fibronectin type iii domains
WO2021076574A2 (en) 2019-10-14 2021-04-22 Aro Biotherapeutics Company Fn3 domain-sirna conjugates and uses thereof
JOP20220184A1 (ar) * 2020-02-12 2023-01-30 Janssen Biotech Inc علاج مصابي السرطان ممن لديهم طفرات تخطي c-Met إكسون14
TW202207940A (zh) 2020-04-14 2022-03-01 美商健生生物科技公司 包含胺基嘧啶衍生物或其醫藥上可接受之鹽、水合物、或溶劑化物之用於經口投予之醫藥組成物
CA3192922A1 (en) * 2020-08-25 2022-03-03 Janssen Biotech, Inc. Treatment of non-small cell lung cancer with egfr mutations
AR123340A1 (es) * 2020-08-26 2022-11-23 Janssen Biotech Inc FORMULACIONES ESTABLES QUE COMPRENDEN UN ANTICUERPO BIESPECÍFICO PARA EGFR / c-MET
CA3191538A1 (en) 2020-09-14 2022-03-17 Ademi Elena SANTIAGO-WALKER Fgfr inhibitor combination therapies
AU2022214491A1 (en) 2021-01-28 2023-09-14 Janssen Biotech, Inc. Psma binding proteins and uses thereof
WO2022189942A1 (en) * 2021-03-09 2022-09-15 Janssen Biotech, Inc. Treatment of cancers lacking egfr-activating mutations
BR112023021318A2 (pt) 2021-04-14 2023-12-19 Aro Biotherapeutics Company Conjugados de domínio fn3-sirna e usos dos mesmos
JP2024517610A (ja) 2021-04-14 2024-04-23 アロ・バイオセラピューティクス・カンパニー Ｃｄ７１に結合するフィブロネクチンｉｉｉ型ドメイン
TW202308689A (zh) * 2021-04-21 2023-03-01 美商健生生物科技公司 高濃度的雙特異性抗體調配物
TW202309094A (zh) * 2021-05-18 2023-03-01 美商健生生物科技公司 用於識別癌症患者以進行組合治療之方法
CA3225715A1 (en) * 2021-07-14 2023-01-19 Xin Ye Antigen-binding molecule specifically binding to hgfr and egfr, and pharmaceutical use thereof
CN118339188A (zh) 2021-09-21 2024-07-12 齐鲁普吉湾生物治疗公司 用于制备融合蛋白和双特异性抗体的异二聚体Fc
WO2023069888A1 (en) * 2021-10-18 2023-04-27 Tavotek Biotherapeutics (Hong Kong) Limited ANTI-EGFR ANTIBODIES, ANTI-cMET ANTIBODIES, ANTI-VEGF ANTIBODIES, MULTISPECIFIC ANTIBODIES, AND USES THEREOF
US20230183360A1 (en) * 2021-12-09 2023-06-15 Janssen Biotech, Inc. Use of Amivantamab to Treat Colorectal Cancer
CN118742325A (zh) 2022-01-28 2024-10-01 上海岸阔医药科技有限公司 预防或治疗与抗肿瘤剂相关的疾病或病症的方法
TW202342057A (zh) 2022-02-07 2023-11-01 美商健生生物科技公司 用於減少用ｅｇｆｒ／ｍｅｔ雙特異性抗體治療之患者的輸注相關反應之方法
WO2023155905A1 (zh) 2022-02-21 2023-08-24 上海岸阔医药科技有限公司 化合物及其用途
CN114740108B (zh) * 2022-03-28 2023-07-14 天津键凯科技有限公司 一种聚合物修饰抗体类药物的修饰度的测定方法
EP4526354A1 (en) * 2022-06-29 2025-03-26 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Anti-egfr/met antibodies and uses thereof
JP2025522814A (ja) 2022-06-30 2025-07-17 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 胃癌又は食道癌を治療するための抗ｅｇｆｒ／抗ｍｅｔ抗体の使用
JP2025539837A (ja) * 2022-11-24 2025-12-09 江▲蘇▼恒瑞医▲薬▼股▲フン▼有限公司 Ｈｇｆｒとｅｇｆｒに特異的に結合する二重特異性抗体を含む医薬組成物
WO2024189544A1 (en) 2023-03-13 2024-09-19 Janssen Biotech, Inc. Combination therapies with bi-specific anti-egfr/c-met antibodies and anti-pd-1 antibodies
KR20250161618A (ko) * 2023-03-17 2025-11-17 바이오사이토젠 파마슈티컬스 (베이징) 컴퍼니 리미티드 항-her3 및 항-met 항체 및 이의 용도
EP4454706A1 (en) * 2023-04-24 2024-10-30 Universität Stuttgart Novel egfr binding proteins
WO2024240634A1 (en) 2023-05-19 2024-11-28 Les Laboratoires Servier Anti-met antibodies, antibody-drug conjugates, compositions and uses thereof
CA3228195A1 (en) 2023-05-23 2025-06-30 Janssen Biotech Inc Methods for treatment of non-small cell lung cancer (nsclc)
WO2024258870A2 (en) 2023-06-12 2024-12-19 Amgen Inc. Lymphotoxin beta receptor agonist binding proteins
TW202502822A (zh) * 2023-07-07 2025-01-16 大陸商四川科倫博泰生物醫藥股份有限公司 Ｅｇｆｒ／ｃ－ｍｅｔ雙特異性結合蛋白及其用途
WO2025017409A1 (en) 2023-07-14 2025-01-23 Janssen Biotech, Inc. Dosing regimen for therapies comprising bispecific antiegfr/c-met antibodies
WO2025025434A1 (zh) * 2023-08-02 2025-02-06 百泰生物药业有限公司 EGFR/c-Met双特异性抗体及其应用
WO2025052273A1 (en) 2023-09-05 2025-03-13 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating non-small cell lung cancer
CN119700964A (zh) * 2023-09-28 2025-03-28 上海翰森生物医药科技有限公司 一种双特异性抗体在制备治疗癌症的药物中的用途
WO2025079020A1 (en) 2023-10-12 2025-04-17 Janssen Biotech, Inc. First line treatment in egfr exon 20 insertion-mutated advanced non-small cell lung cancer
WO2025103450A1 (en) * 2023-11-15 2025-05-22 Sichuan Kelun-Biotech Biopharmaceutical Co., Ltd. Antibody-drug conjugates targeting egfr/c-met and preparation methods and uses thereof
WO2025131053A1 (en) * 2023-12-22 2025-06-26 Fortvita Biologics Inc. Bispecific antibody-drug conjugates targeting b7h3 and egfr and the use thereof
WO2025153988A1 (en) 2024-01-16 2025-07-24 Janssen Biotech, Inc. Use of amivantamab to treat colorectal cancer
WO2025158277A1 (en) 2024-01-22 2025-07-31 Janssen Biotech, Inc. Use of amivantamab to treat head and neck cancer
WO2025191459A1 (en) 2024-03-11 2025-09-18 Janssen Biotech, Inc. Use of bispecific anti-egfr/c-met antibodies to treat solid tumors

Family Cites Families (61)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CU22545A1 (es) 1994-11-18 1999-03-31 Centro Inmunologia Molecular Obtención de un anticuerpo quimérico y humanizado contra el receptor del factor de crecimiento epidérmico para uso diagnóstico y terapéutico
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
DE3785186T2 (de) 1986-09-02 1993-07-15 Enzon Lab Inc Bindungsmolekuele mit einzelpolypeptidkette.
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
ATE135373T1 (de) 1989-09-08 1996-03-15 Univ Johns Hopkins Modifikationen der struktur des egf-rezeptor-gens in menschlichen glioma
CA2067194C (en) 1989-10-05 2003-03-18 Glenn Kawasaki Cell-free synthesis and isolation of novel genes and polypeptides
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
DK0531472T3 (da) 1991-03-06 2003-12-01 Merck Patent Gmbh Humaniserede monoklonale antistoffer
ATE408012T1 (de) 1991-12-02 2008-09-15 Medical Res Council Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
WO1994012520A1 (en) 1992-11-20 1994-06-09 Enzon, Inc. Linker for linked fusion polypeptides
EP0672142B1 (en) 1992-12-04 2001-02-28 Medical Research Council Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
AUPO591797A0 (en) 1997-03-27 1997-04-24 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation High avidity polyvalent and polyspecific reagents
EP0985039B1 (en) 1997-06-12 2008-02-20 Novartis International Pharmaceutical Ltd. Artificial antibody polypeptides
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6472147B1 (en) 1999-05-25 2002-10-29 The Scripps Research Institute Methods for display of heterodimeric proteins on filamentous phage using pVII and pIX, compositions, vectors and combinatorial libraries
US20130226834A1 (en) 2000-04-27 2013-08-29 Networth Services, Inc. Systems and methods for determining the financial status of bonds
PT1392359E (pt) 2001-05-11 2010-01-27 Ludwig Inst For Cancer Res Ltd Proteínas de ligação específica e suas utilizações
CZ200438A3 (cs) * 2001-06-13 2004-06-16 Genmab A/S Název neuveden
US7595378B2 (en) * 2001-06-13 2009-09-29 Genmab A/S Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor (EGFR)
EP1283053A1 (en) 2001-08-09 2003-02-12 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Inhibitors of HER3 activity
JP4602614B2 (ja) 2001-09-26 2010-12-22 アイシン精機株式会社 自動車用ドア
US7842476B2 (en) 2002-09-06 2010-11-30 Isogenica Limited In vitro peptide expression library
BRPI0407446A (pt) 2003-02-13 2006-01-31 Pharmacia Corp Anticorpos para c-met para o tratamento de cânceres
RS53476B (sr) * 2003-07-18 2014-12-31 Amgen Fremont Inc. Sredstva za specifično vezivanje faktora rasta hepatocita
HN2004000285A (es) 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
EP2592155B2 (en) 2004-06-04 2019-09-11 Genentech, Inc. EGFR mutations
US7476724B2 (en) 2004-08-05 2009-01-13 Genentech, Inc. Humanized anti-cmet antibodies
CA2577082A1 (en) 2004-09-02 2006-03-16 Genentech, Inc. Heteromultimeric molecules
JP5620626B2 (ja) 2005-03-31 2014-11-05 中外製薬株式会社 会合制御によるポリペプチド製造方法
DE102005028778A1 (de) 2005-06-22 2006-12-28 SUNJÜT Deutschland GmbH Mehrlagige Folie mit einer Barriere- und einer antistatischen Lage
WO2007147901A1 (en) 2006-06-22 2007-12-27 Novo Nordisk A/S Production of bispecific antibodies
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
EP2851091B1 (en) 2007-04-13 2017-12-27 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for treating cancer resistant to ERBB therapeutics
US20090042906A1 (en) 2007-04-26 2009-02-12 Massachusetts Institute Of Technology Methods for treating cancers associated with constitutive egfr signaling
US20110256142A1 (en) 2007-09-06 2011-10-20 Genmab A/S Novel methods and antibodies for treating cancer
US8748356B2 (en) 2007-10-19 2014-06-10 Janssen Biotech, Inc. Methods for use in human-adapting monoclonal antibodies
ES2564523T3 (es) 2007-12-19 2016-03-23 Janssen Biotech, Inc. Diseño y generación de bibliotecas de presentación en fago por pIX de novo humanas mediante fusión con pIX o pVII, vectores, anticuerpos y métodos
WO2009085468A2 (en) 2007-12-19 2009-07-09 Centocor, Inc. Engineered phage vectors for the design and the generation of a human non-antibody peptide or protein phage library via fusion to pix of m13 phage
JP2011513427A (ja) 2008-03-06 2011-04-28 ジェネンテック， インコーポレイテッド ｃ−ｍｅｔ及びＥＧＦＲアンタゴニストの併用療法
TW201002346A (en) 2008-04-11 2010-01-16 Galaxy Biotech Llc Combination of HGF inhibitor and EGF inhibitor to treat cancer
BRPI0917871A2 (pt) * 2008-08-15 2017-06-20 Merrimack Pharmaceuticals Inc agente terapêutico anti-erbb3 para uso em terapia de um tumor, métodos para predizer responsividade de um tumor de um agente terapêutco anti-erbb3, para selecionar terapia anti-erbb3 para um paciente, para predizer a resposta de células ao tratamento com um agente terapêutico, para identificar um biomarcador, e para evitar administração de uma droga para câncer anti-erbb3, e, kit para predizer a resposta das células ao tratamento com um agente terapêutico
WO2010039248A1 (en) 2008-10-01 2010-04-08 Ludwig Institute For Cancer Research Methods for the treatment of cancer
CN102307896B (zh) 2008-10-31 2016-10-12 森托科尔奥索生物科技公司 基于iii型纤连蛋白结构域的支架组合物、方法及用途
US8545839B2 (en) * 2008-12-02 2013-10-01 Pierre Fabre Medicament Anti-c-Met antibody
US20100173013A1 (en) * 2009-01-08 2010-07-08 Denis Drygin Treatment of neoplastic disorders using combination therapies
MX2011010158A (es) * 2009-04-07 2011-10-17 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos anti-erbb-2/anti-c-met.
CN102459346B (zh) 2009-04-27 2016-10-26 昂考梅德药品有限公司 制造异源多聚体分子的方法
TW201119673A (en) * 2009-09-01 2011-06-16 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
SI2506871T1 (sl) 2009-11-30 2016-12-30 Janssen Biotech, Inc. Mutanti Fc protitelesa z odstranjenimi efektorskimi funkcijami
RS66008B1 (sr) * 2010-03-10 2024-10-31 Genmab As Monoklonska antitela protiv c-met
CN110066339A (zh) * 2010-04-20 2019-07-30 根马布股份公司 含异二聚体抗体fc的蛋白及其制备方法
HUE029622T2 (en) 2010-04-30 2017-03-28 Janssen Biotech Inc Stabilized fibronectin domain compositions, methods and uses
CA2804335A1 (en) * 2010-06-15 2011-12-22 Alberto Bardelli Mlk4 gene, a new diagnostic and prognostic marker in cancers
WO2012042026A1 (en) * 2010-09-30 2012-04-05 Ablynx Nv Biological materials related to c-met
RU2604490C2 (ru) 2010-11-05 2016-12-10 Займворкс Инк. ДИЗАЙН УСТОЙЧИВОГО ГЕТЕРОДИМЕРНОГО АНТИТЕЛА С МУТАЦИЯМИ В Fc ДОМЕНЕ
WO2013055404A1 (en) * 2011-10-10 2013-04-18 City Of Hope Meditopes and meditope-binding antibodies and uses thereof
KR102052774B1 (ko) 2011-11-04 2019-12-04 자임워크스 인코포레이티드 Ｆｃ 도메인 내의 돌연변이를 갖는 안정한 이종이합체 항체 설계
PL2922872T3 (pl) * 2012-11-21 2019-03-29 Janssen Biotech, Inc. Bispecyficzne przeciwciała przeciwko egfr/c-met
US9695228B2 (en) * 2012-11-21 2017-07-04 Janssen Biotech, Inc. EGFR and c-Met fibronectin type III domain binding molecules

Also Published As

Publication number Publication date
UA117121C2 (uk) 2018-06-25
IL238796B (en) 2019-06-30
EP4420727A3 (en) 2024-10-23
JP2016505537A (ja) 2016-02-25
CL2015001356A1 (es) 2015-11-06
KR20250054125A (ko) 2025-04-22
AU2024203417A1 (en) 2024-06-13
PE20151181A1 (es) 2015-08-19
CY1121270T1 (el) 2020-05-29
DK3447069T3 (da) 2020-11-16
PH12015501118A1 (en) 2016-02-01
US20140255408A1 (en) 2014-09-11
EP4420727A2 (en) 2024-08-28
SI3447069T1 (sl) 2021-02-26
AU2013347962A1 (en) 2015-05-28
JP2024026236A (ja) 2024-02-28
US20170101475A1 (en) 2017-04-13
RS58192B1 (sr) 2019-03-29
AU2021202394A1 (en) 2021-05-20
US9593164B2 (en) 2017-03-14
EP3447069B1 (en) 2020-09-23
AU2019200441B2 (en) 2021-01-28
LUC00257I2 (es) 2025-04-25
IL238796A0 (en) 2015-06-30
US9695242B2 (en) 2017-07-04
NL301173I2 (nl) 2022-06-15
FIC20220016I1 (fi) 2022-05-31
BR112015011717A2 (pt) 2017-08-15
EA201590985A1 (ru) 2015-11-30
FR22C1018I1 (fr) 2022-06-17
HRP20182128T1 (hr) 2019-02-08
JP2021006561A (ja) 2021-01-21
FR22C1018I2 (fr) 2023-05-05
EP3447069A1 (en) 2019-02-27
SI2922872T1 (sl) 2019-01-31
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