ES2829404T3 - Método para la selección o el procesamiento de partículas, en particular células - Google Patents

Abstract

Método para la selección o el procesamiento de primeras partículas (CÉLULA) sensibles a la aplicación de un estímulo externo comprendiendo el paso de obtener, mediante la aplicación de dicho estímulo externo, la permeabilización de al menos una primera partícula seleccionada (CÉLULA), caracterizado porque comprende los pasos de: a) energizar selectivamente electrodos (EL) de una serie de electrodos seleccionables que tienen dimensiones comparables o inferiores a los de dichas primeras partículas (CÉLULA), para aplicar a todos dichos electrodos una primera configuración de voltajes para generar un primer campo de fuerza (FMAN), por medio del que dichas primeras partículas (CÉLULA) son organizadas llevando dichas primeras partículas (CÉLULA) hacia primeros puntos de equilibrio estable (MPEQ) situados en la proximidad de dichos electrodos (EL); b) aplicar a todos y los mismos electrodos seleccionables indicados una segunda configuración de voltajes diferente de la primera configuración, con el fin de proporcionar entre al menos dos electrodos seleccionados de dicha serie adyacentes uno a otro y colocados en la proximidad de la al menos única primera partícula seleccionada a permeabilizar (CÉLULA) un segundo campo de fuerza (FZAP), y de manera que se produzca la aplicación a dicha al menos una primera partícula seleccionada (CÉLULA) de un estímulo adecuado para poner dicha al menos una primera partícula seleccionada (CÉLULA) en un estado permeabilizado durante al menos una fracción de la longitud de dicho estímulo.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para la selección o el procesamiento de partículas, en particular células

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para la selección y/o el procesamiento de partículas, en particular partículas que constan de células o incluyendo células o material celular y tiene aplicación principalmente en la implementación de protocolos con una resolución en una sola célula. Por “procesamiento” de célula se entiende, aquí y en lo sucesivo, cualquier tipo de operaciones que se pueden llevar a cabo en una sola partícula o célula, o en grupos de las mismas.

Estado de la técnica

La patente PCT/WO 00/69565 de G. Medoro describe un aparato y un método para la manipulación y la detección/reconocimiento de partículas mediante el empleo de jaulas cerradas de potencial dielectroforético y sensores integrados, si los hay. El método descrito describe cómo controlar la posición de cada partícula independientemente de todas las otras en un espacio bidimensional. La fuerza usada para atrapar en suspensión partículas en un medio fluido es la dielectroforesis negativa. El único control de las operaciones de manipulación tiene lugar mediante la programación de elementos de memoria y circuitos asociados con cada elemento de una serie de electrodos y sensores integrados dentro de un mismo sustrato. El dispositivo permite aislar células, pero requiere el desplazamiento de éstas hacia una segunda microcámara, fluídicamente aislada de la primera. Además, no se prevé un método para transformar las células.

La patente US 6.294.063, de Becker y colaboradores, describe un método y un aparato para la manipulación de paquetes de material biológico sólido, líquido o gaseoso, mediante una distribución de fuerzas programables. La patente también menciona el uso de sensores. También en este caso el aislamiento de células puede tener lugar solamente moviendo físicamente las células por todo el dispositivo.

Otra fuerza para la manipulación de partículas es la fuerza de rozamiento viscoso generada por flujos electrohidrodinámicos (EHD), tales como los flujos electrotérmicos (ETF) o la electroósmosis AC. En NG. Green, A. Ramos y H. Morgan, J. Phys. D: Appl. Phys. 33 (2000), se usan EHDs para desplazar partículas. Por ejemplo, PCT WO 2004/071668 A1 describe un aparato para concentrar partículas en algunos electrodos, explotando los denominados flujos electrohidrodinámicos.

En la solicitud de patente italiana BO2005A000481, de Medoro y colaboradores., se reportan algunos métodos para manipular partículas con series de electrodos y algunos métodos y aparato para su detección. Además, en la solicitud de patente internacional número PCT/IT02/00524 se describe un método en el que primeras entidades biológicas pueden ser transformadas poniéndolas en contacto con segundas entidades biológicas (por ejemplo liposomas conteniendo ADN, o microbolas), donde las primeras entidades biológicas son inmovilizadas en una superficie definida por una matriz de primeros electrodos al menos parcialmente selectivamente activables y direccionables, dispuestos mirando hacia al menos un segundo electrodo, y se ponen en contacto con las segundas entidades biológicas desplazadas por medio de jaulas de dielectroforesis.

La solicitud de patente PCT IB 2006000636 del mismo Solicitante se refiere a un método y un aparato para la caracterización y/o el recuento de partículas mediante campos de fuerza no uniformes, variables en el tiempo, y sensores ópticos o medidores de impedancia integrados. Los campos de fuerza pueden ser de dielectroforesis positiva o negativa, electroforesis o movimientos electrohidrodinámicos, caracterizados por un conjunto de puntos de equilibrio estables para las partículas (sólido, líquido o gaseoso); el mismo método es adecuado para la manipulación de gotitas (partículas líquidas) explotando efectos conocidos como electrohumectación sobre dieléctrico, con la finalidad de actuar en el control de la posición de cada partícula existente en la muestra, al objeto de desplazar tales partículas de forma determinista o estadística, con el fin de detectar su presencia con los sensores ópticos o medidores de impedancia integrados y/o caracterizar su tipo, al objeto de contarlas o manipularlas de forma eficiente.

En la solicitud italiana a nombre del mismo solicitante, número T02006A000226 de fecha 27.3.2006, se describen métodos y aparato para el procesamiento (por ejemplo lavado, incubación, etc) de partículas, donde las partículas en suspensión en un primer fluido son introducidas en un régimen de flujo laminar en al menos una primera microcámara o primera zona de la misma, donde se introduce un segundo fluido en un régimen de flujo laminar en al menos una segunda zona de la microcámara o una segunda microcámara, de forma que no se mezcle con el primer fluido, y donde dentro de la microcámara o microcámaras se activa al menos un campo de fuerza (F) que actúa en las partículas, con el fin de producir un desplazamiento de las partículas solamente en una dirección prefijada y transferirlas en suspensión en el segundo fluido; se emplea preferiblemente un aparato incluyendo al menos tres microcámaras dispuestas en secuencia una con otra a lo largo de una dirección, cada una conectada con la microcámara inmediatamente precedente y siguiente a través de dos orificios decalados uno de otro en una dirección perpendicular a la dirección de secuencia de las microcámaras.

Recientemente, en el artículo A single cell electroporation chip, Lab on a Chip, 2005, 5 (1), 38 - 43, Michelle Khine, Adrián Lau, Cristian lonascu-Zanetti, Jeonggi Seo y Luke P. Lee, se describe cómo incrementar la permeabilidad de membranas celulares a través de electroporación realizada en células solas; de esta forma, sustancias polares que de otro modo no podrían penetrar la membrana plasmática (tales como colorantes, medicamentos, ADN, proteínas, péptidos y aminoácidos) pueden ser introducidas dentro de la célula.

El artículo Flow-through micro-electroporation chip for high efficiency single-cell genetic manipulation, Sensors and Actuators A: Physical. Volumen 104, Número 3, 15 mayo 2003, páginas 205-212, Yong Huang, Boris Rubinsky, describe en particular la manipulación genética de células solas, que es de gran interés en campos tales como biología y biotecnologías, obtenidas a través de un chip de electroporación que emplea canales microfluídicos para manipular exactamente células solas; como es conocido, la electroporación es una técnica que emplea fuertes campos eléctricos para inducir reorganizaciones estructurales en la membrana celular; así se forman poros a través de la membrana cuando el potencial de transmembrana supera el voltaje de perforación dieléctrico de la membrana (0,2-1,5V) permitiendo que sustancias externas penetren en la membrana y lleguen al citoplasma que contiene. La electroporación de células solas es una técnica de interés también porque permite estudiar las variaciones que tienen lugar en una población celular célula por célula, con el fin de estudiar la química intracelular, por ejemplo, proporcionando fenotipos específicos a células solas activando o bloqueando la expresión de una proteína específica y sola. Usando una tecnología basada en el uso de matrices implementadas en chips es posible por lo tanto llevar a la práctica equipos de pruebas HTS (cribado de alta productividad) correlacionados tanto con la expresión de ADN y proteínas, como con compuestos químicos (por ejemplo, medicamentos) que son dirigidos hacia dianas celulares específicas (por ejemplo, receptores).

La electroporación de células solas es además una tecnología ventajosa con respecto a protocolos de electroporación “en masa” normalmente usados, que requieren voltajes muy altos (>103 V) y que no permiten un control efectivo de la permeabilidad de células solas, de modo que, por ejemplo, el nuevo cierre de poros previamente abiertos resulta difícil.

Los intentos realizados hasta ahora con el fin de lograr la electroporación de células solas incluyen el uso de microelectrodos hechos de fibra de carbono (Lundqvist y colaboradores, 1998) y otras técnicas, tales como capilares llenos de electrolitos, micropipetas y chips micromanufacturados.

Los chips micromanufacturados son ideales tanto para aislar células solas como para enfocar el campo eléctrico. Finalmente, el artículo “Controlling cell destruction using dielectrophoretic forces”, A. Menachery y R. Pethig, IEE Proc.-Nanobiotechnol., Vol. 152, número 4, agosto 2005, reporta un estudio sobre lisis de células para tipos diferentes de células en electrodos almenados o polinomiales, y propone la lisis o la electroporación diferencial de células de tipos diferentes existentes en una mezcla (seleccionando unas frecuencias y amplitudes tales que se realice la lisis o la electroporación de un tipo, pero se conserve otro tipo).

Sin embargo, dado que los electrodos son mucho más grandes que las células, el empleo de este acercamiento no se propone, y probablemente no es posible emplearlo para destruir/electroporar selectivamente células solas independientemente de su tipo. De hecho, dado que la posición con respecto a electrodos relativamente grandes (y consiguientemente la intensidad de campo a la que se someten) varía considerablemente, tal método no puede operar de forma homogénea en células diferentes.

La lisis es inducida preferiblemente usando campos en un rango de frecuencia incluido entre la frecuencia de cruce (por encima de la que las células cambian de electroforesis negativa (nDEP) a positiva (pDEP), e inferiores a la frecuencia por encima de la que el potencial de membrana resulta debilitado debido a la superación de la relajación constante de la membrana.

Otros documentos de una publicación reciente, tal como WO2005/075656 y US2005/0070018A1, se refieren a aparatos para electroporación de células solas en base al uso de una serie o una matriz de microelectrodos, en los que se cultivan células adherentes (según la solicitud de patente internacional) o equipadas con microhilos conductores para conectar células a electroporar a los electrodos y canales microfluídicos para el desplazamiento de células. Tales aparatos no ofrecen la posibilidad de organizar las células de forma determinista, y la posición de las células con respecto a los electrodos resulta aleatoria. Por lo tanto, el campo eléctrico al que se someten en el momento de la electroporación resulta bastante variable, de modo que el estímulo aplicado es a veces estadísticamente excesivo (produciendo la muerte de la célula), o insuficiente, por carecer de electroporación de la célula. El porcentaje de éxito en el proceso de electroporación resulta entonces inferior al óptimo y menos efectivo.

Resumen de la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar un método para operar en muestras de fluido conteniendo partículas, generalmente células, para llevar a cabo la transformación de una o varias células, que carece de las limitaciones y/o los inconvenientes descritos de la técnica conocida.

En particular, un objeto de la presente invención es actuar en el control de la posición de cada partícula existente en la muestra, al objeto de desplazar tales partículas de forma determinista, para operar de forma selectiva en cada célula y/o realizar de forma más efectiva operaciones tales como electroporación.

Aquí y en lo sucesivo, por los términos “partículas” o “partícula” se entienden entidades micrométricas o nanométricas, naturales o artificiales, tales como células, componentes subcelulares, virus, liposomas, niosomas, microbolas. A veces, se empleará el término célula, pero donde no se indique lo contrario, deberá entenderse como un ejemplo no limitador del uso para la detección y la caracterización de partículas en el sentido más amplio antes descrito.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método especificado en la reivindicación 1.

En particular, se emplean campos de fuerza no uniformes, variables en el tiempo, y sensores ópticos integrados. Los campos de fuerza pueden ser de dielectroforesis positiva o negativa, electroforesis o movimientos electrohidrodinámicos, caracterizado por un conjunto de puntos de equilibrio estables para las partículas (sólidas, líquidas o gaseosas).

De esta forma, la presente invención supera las limitaciones de la técnica conocida.

La implementación del método según la invención permite transformar células de forma efectiva y selectiva, por ejemplo, con la introducción de material genético exógeno. Además, permite purificar exactamente una muestra de células, posiblemente transformadas, también de contaminantes existentes en un porcentaje bajo. Finalmente, permite aislar rápidamente unas pocas células de interés de una muestra heterogénea. Todo ello mediante la adopción de una tecnología única en base a una misma serie de microelectrodos que se usan tanto para mover células dentro de una microcámara, en la que la serie de electrodos está incorporada, como para producir su electroporación.

Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción siguiente de algunas realizaciones no limitadoras de la misma, que se hace con referencia a las figuras de los dibujos anexos.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 representa de forma diagramática los pasos del método según la invención realizados en un aparato de manipulación representado en una vista en sección y en alzado.

La figura 2 representa con secuencias fotográficas tomadas en una vista en planta superior con respecto al aparato de la figura 1, la ejecución práctica del método de la figura 1.

La figura 3 representa con secuencias fotográficas algunas células antes y después de la electroporación.

Las figuras 4, 5a, 5b muestran diagramáticamente posibles protocolos de ejecución del método según la invención.

Descripción detallada

El objeto de la presente invención es llevar a la práctica un método para la manipulación y/o la transformación y/o el estudio de las condiciones de electroporación óptimas y/o la detección de partículas.

El método de la invención se basa en el uso de un campo de fuerza no uniforme a través del que atrae partículas solas o grupos de partículas hacia posiciones de equilibrio estable (JAULA). Tal campo puede ser por ejemplo un campo de dielectroforesis negativo o positivo, un campo electroforético o un campo de movimiento electrohidrodinámicos.

El procesamiento operado en células se basa en la aplicación de campos eléctricos localizados capaces de producir la permeabilización temporal de la membrana celular.

El método también puede usar sensores integrados, preferiblemente de un tipo de medidor óptico y/o de impedancia, por ejemplo, en todos los pasos en los que es necesario comprobar el tipo de partículas en proximidad de ciertos electrodos. Alternativamente, puede obtenerse una información similar mediante sensores ópticos no integrados, acoplados con un microscopio que permita examinar el contenido de la microcámara.

Generación de fuerzas

Hay diferentes métodos para la generación de fuerzas para desplazar partículas, según la técnica conocida, a través de series de electrodos (EL), soportados en un sustrato. Generalmente, según derechos de patente precedentes del mismo Solicitante (figura 1), se usa una cubierta (TAPA), que, a su vez, puede ser un electrodo, que delimita una microcámara dentro de la que las partículas se encuentran generalmente en una suspensión líquida. En caso de dielectroforesis, los voltajes aplicados son voltajes periódicos en fase representados por el símbolo de adición (+) y voltajes periódicos de contrafase representados por el símbolo de sustracción (-). Por el término “voltajes de contrafase” se entiende voltajes 180 grados fuera de fase. El campo genera una fuerza que actúa en las partículas en una zona espacial (JAULA), atrayéndolas hacia un punto de equilibrio. En caso de DEP negativa, es posible generar jaulas de fuerza cerradas, según la técnica conocida, si la cubierta (TAPA) es un electrodo conductor; en este caso, el punto de equilibrio se establece en correspondencia con cada electrodo conectado a Vphin(-) si los electrodos adyacentes están conectados a la fase opuesta Vphip (+) y si la cubierta (TAPA) está conectada con la fase Vphin (-). Tal punto de equilibrio está normalmente espaciado en el líquido en comparación con los electrodos, por lo que las partículas están, en un estado constante, en levitación. En caso de DEP positiva, el punto de equilibrio se halla normalmente en correspondencia con la superficie en la que los electrodos están dispuestos, y las partículas, en un estado de régimen, contactan con ellos. Para la presencia de más electrodos en la cubierta (TAPA) no es necesario, porque los puntos de equilibrio del PDEP corresponden a los máximos del campo eléctrico. Para los movimientos electrohidrodinámicos, las configuraciones de los electrodos generan algunos flujos que mueven las partículas hacia puntos de mínimo del flujo.

A continuación, para facilidad, el uso de jaulas cerradas de dielectroforesis negativa como una fuerza de ejecución para el desplazamiento de partículas en la descripción de los métodos de la invención se considera simplemente como un ejemplo no limitador a los efectos de la presente invención (por esta razón, hay que usar una tapa que actúe como un electrodo). Para los expertos en la técnica con conocimientos ordinarios, es evidente cómo generalizar los métodos y el aparato descritos más adelante para el uso de diferentes fuerzas de ejecución y diferentes tipos de partículas.

Electroporación de partículas asistida por manipulación dielectroforética

Las partículas se colocan en la proximidad del intervalo entre dos electrodos por medio de una de las fuerzas de ejecución antes mencionadas, por ejemplo, energizando los electrodos propiamente dichos con voltajes sinusoidales de una primera amplitud y frecuencia. El intervalo es preferiblemente inferior a 10 pm, y generalmente del orden de 1-2 pm, de tal manera que también un estímulo de bajo voltaje, compatible con el voltaje de alimentación de un circuito integrado (por ejemplo, 2,5, 3,3 o 5 V) es suficiente para determinar un potencial de transmembrana capaz de efectuar la permeabilización reversible de la partícula.

Este estímulo consta preferiblemente de un tren de impulsos sinusoidales de una segunda amplitud y una segunda frecuencia.

La figura 1 representa en una vista en sección la evolución temporal de los campos de fuerza y las “configuraciones” de voltaje (o el complejo de configuraciones del estado (+) o (-) de los electrodos) aplicados a los electrodos según una realización preferida de la invención. En la figura 1(a) hay células (CÉLULA) en nDEP, en suspensión en el líquido en un primer punto de equilibrio (MPEQ). En la figura 1(b), la configuración de voltajes aplicada a los electrodos (EL) cambia, así como la frecuencia y opcionalmente la amplitud de los voltajes aplicados, de tal manera que también la fuerza a la que se someten las células (CÉLULA) cambia en pDEP (FZA^p ). Sin embargo, gracias al cambio de la configuración de voltaje solamente la célula a electroporar (CÉLULAZ) se somete a una fuerza significativa, por lo tanto, es atraída hacia un nuevo punto de equilibrio estable (ZPEQ). En la proximidad de tal punto, el campo eléctrico es el más alto y la frecuencia es tal que se determina un potencial de transmembrana suficiente para electroporar la célula. De esta forma, al menos un compuesto (PL) existente en suspensión es capaz de penetrar dentro de la célula.

Tal compuesto puede ser un compuesto químico (tinte, medicamento, péptido) en solución en el fluido en el que las partículas están sumergidas, o podría ser, por ejemplo, un plásmido, etc, según la técnica conocida, o segundas partículas PL del tipo y la cantidad deseados podrían estar presentes en suspensión dentro del fluido.

La figura 2 representa la electroporación de una sola célula. Células, figura 2(a), están atrapadas en nDEP (frecuencia = 50 kHz, voltaje de pico a pico a electrodos 3,3 V, voltaje de pico a pico a la tapa 6,6 V). La figura 2(b) representa la imagen de fluorescencia. El campo es mutado entonces en pDEP (dos impulsos de 500 kHz, amplitud de voltaje de pico a pico a electrodos 2 V, amplitud de voltaje de pico a pico a la tapa 4 V), y la célula seleccionada experimenta una abertura de poros que produce la liberación de calceína (previamente cargada dentro de las células, al objeto de realizar el experimento) y la disminución de fluorescencia (figura 2(c)).

Con los sensores integrados de tipo óptico con detección de fluorescencia (véanse las patentes anteriores del mismo Solicitante), la transformación efectiva puede ser verificada, por ejemplo, mediante la expresión de proteína verde fluorescente (GFP).

Método para la optimización de estímulos de electroporación

Sobre la serie de electrodos pueden colocarse células y pueden intentarse estímulos con diferentes parámetros de amplitud y/o frecuencia en cada uno de ellos o grupos de ellos, con el fin de determinar rápidamente el estímulo más efectivo.

Por ejemplo, la electroporación puede ser verificada con sensores ópticos integrados, como se ha descrito anteriormente, o con la supervisión de una posible introducción de un tinte (tinte o materia colorante) dentro de la célula (por ejemplo, azul tripán), normalmente incapaz de penetrar la membrana.

La figura 3 representa células en azul tripán antes, figura 3(a), y después, figura 3(b), de la electroporación según el protocolo antes descrito. En la figura 3(b), se puede observar que el azul tripán ha penetrado dentro de la célula. Con sensores ópticos integrados puede detectarse la entrada del tinte, así como la aparición de la electroporación. Alternativamente, puede controlarse la dispersión de un tinte presente dentro de la célula producida por la difusión del tinte fuera en la abertura de poros. Por ejemplo, calceína fluorescente de dentro de la célula podría liberarse fuera y determinar una disminución de la fluorescencia de la célula, como se ha descrito anteriormente.

El método prevé aplicar iterativamente estímulos de intensidad creciente en células individuales, medir el número de células electroporadas para definir la curva de dependencia del porcentaje de electroporación en función de los estímulos aplicados.

Método para el ajuste de estímulos de electroporación para cada célula

En la serie de electrodos pueden colocarse células y pueden intentarse estímulos de intensidad creciente encima de ellas, y la posible entrada de un tinte normalmente incapaz de penetrar la membrana puede controlarse con sensores ópticos integrados.

En base a lo descrito, es evidente que la invención permite llevar a la práctica la selección o el procesamiento de primeras partículas sensibles a la aplicación de un estímulo externo y proporciona el paso de producir, mediante la aplicación de tal estímulo externo, la permeabilización de al menos una primera partícula seleccionada; en particular, proporciona los pasos de:

a) energizar selectivamente electrodos (EL) de una serie de electrodos seleccionables que tienen dimensiones comparables o inferiores a las de dichas partículas, con el fin de aplicar a todos dichos electrodos una primera configuración de voltajes para generar un primer campo de fuerza (FMAN), por medio del que dichas primeras partículas (CÉLULA) son organizadas llevando primeras partículas (CÉLULA) hacia primeros puntos de equilibrio estable (MPEQ) situados en la proximidad de dichos electrodos (EL);

b) aplicar a todos y los mismos electrodos seleccionables indicados una segunda configuración (PZAP) de voltajes diferente de la primera configuración (PMAN), con el fin de proporcionar entre al menos dos electrodos seleccionados de dicha serie adyacentes uno a otro y colocados en proximidad de la al menos única primera partícula seleccionada a permeabilizar (CÉLULA) un segundo campo de fuerza (FZAP), y de manera que produzcan la aplicación de un estímulo adecuado a dicha al menos una primera partícula seleccionada para poner dicha al menos una primera partícula seleccionada en un estado permeabilizado durante al menos una fracción de la longitud de dicho estímulo.

El método según la invención incluye además el paso de:

c) poner dicha al menos una primera partícula seleccionada en un estado permeabilizado en contacto con al menos una segunda partícula; donde los pasos b) y c) se realizan con el fin de producir la penetración de dicha al menos una segunda partícula dentro de dicha al menos una primera partícula seleccionada en un estado permeabilizado, como se muestra diagramáticamente en la figura 1.

Primeras partículas son sumergidas en un fluido y el paso c) se lleva a cabo sumergiendo segundas partículas dentro del fluido y prolongando dicho paso b) durante un tiempo suficiente para permitir que al menos una dicha segunda partícula penetre dentro de dicha al menos una primera partícula seleccionada, que está en un estado permeabilizado.

Alternativamente, segundas partículas son sumergidas en el fluido y luego al menos una segunda partícula seleccionada es desplazada hacia dicha al menos una primera partícula seleccionada mantenida en un estado permeabilizado, preferiblemente aplicando a al menos dicha segunda partícula seleccionada un campo de fuerza (FMAN) obtenido energizando selectivamente los electrodos (EL) de la serie de electrodos seleccionables aplicando a los electrodos una secuencia de configuraciones de voltaje adecuadamente seleccionadas.

El estímulo aplicado por el campo puede ser tal que mantenga las primeras partículas seleccionadas en un estado permeabilizado durante un tiempo predeterminado también después de la extracción del estímulo propiamente dicho; por lo tanto, el paso c) puede ser realizado sumergiendo segundas partículas dentro del fluido en el que primeras partículas están sumergidas y moviendo primeras partículas en un estado permeabilizado hacia segundas partículas aplicando a las mismas un campo de fuerza (FMAN) obtenido energizando selectivamente los electrodos (EL) de la serie de electrodos seleccionables aplicando a los electrodos una secuencia de configuraciones de voltaje prefijadas.

Con referencia a las figuras 4, 5a, 5b, primeras partículas pueden sumergirse en un primer fluido, por ejemplo, pueden contenerse ya en suspensión en el primer fluido; y el paso c) se puede llevar a cabo sumergiendo segundas partículas en un segundo fluido contiguo al primer fluido (en el segundo fluido, por ejemplo, pueden estar sumergidas ya segundas partículas) y desplazando partículas en un estado permeabilizado (electroporado) presentes en el primer fluido desde el primer fluido al segundo aplicando a las partículas un campo de fuerza (FMAN) adecuado energizando los electrodos aplicando a los mismos electrodos una secuencia de configuraciones de voltaje prefijadas. Posteriormente, primeras partículas transformadas para recibir dentro de ellas segundas partículas pueden ponerse de nuevo en el primer fluido, de nuevo aplicando una configuración adecuada o secuencia de configuraciones de voltaje a los electrodos.

Cuando las primeras partículas son sumergidas en un fluido, el método descrito puede incluir alternativamente el paso de

c) introducir dentro del fluido en el que primeras partículas están sumergidas al menos un compuesto en solución; y d) permitir que dicho compuesto penetre dentro de primeras partículas que están en un estado permeabilizado (previamente electroporadas mediante los electrodos).

Cuando las primeras partículas son sumergidas en un primer fluido contenido en una microcámara equipada con la serie de electrodos, el método según la invención (figura 4) incluye los pasos de:

c) introducir dentro de la microcámara un segundo fluido operando en un movimiento laminar de tal manera que el segundo fluido no se mezcle con el primero (figura 5a);

d) introducir en el segundo fluido al menos un compuesto disuelto (una operación que, obviamente, puede realizarse también antes del paso de introducción del segundo fluido en la microcámara, figura 5a);

e) desplazar primeras partículas en un estado permeabilizado del primer fluido al segundo aplicando a las partículas un campo de fuerza (FMAN) obtenido energizando selectivamente dichos electrodos (EL) de dicha serie de electrodos seleccionables aplicando a dichos electrodos una secuencia de configuraciones de voltaje prefijadas (figura 5b);

f) permitir que dicho compuesto penetre dentro de primeras partículas seleccionadas en un estado permeabilizado, sujeto a electroporación de tales primeras partículas seleccionadas, una operación que puede tener lugar mientras las primeras partículas son sumergidas en el segundo líquido/fluido o, si el estímulo impartido es adecuado para mantener las primeras partículas a las que se aplica en un estado permeabilizado durante un tiempo predeterminado también después de la extracción del estímulo, mientras las primeras partículas todavía están en el primer fluido, con el fin de desplazarlas entonces en el segundo fluido mientras todavía están en un estado permeabilizado.

En términos generales, las primeras partículas pueden ser sumergidas en una pluralidad de diferentes fluidos contenidos en una microcámara equipada con dicha serie de electrodos y que han sido introducidos en dicha microcámara operando en un movimiento laminar de tal manera que dichos fluidos diferente no se mezclen.

Preferiblemente, como se ha descrito anteriormente, las primeras partículas son entidades biológicas que tienen una membrana permeabilizable y lisable, por ejemplo, una célula, y el estímulo consiste en poner el potencial de transmembrana de las partículas seleccionadas a un valor tal que produzca la permeabilización de la membrana. El fluido en el que, según la invención, se sumergen las partículas a electroporar siempre se selecciona de manera que presente una conductividad eléctrica relativamente baja, de tal manera que sea posible pasar a pDEP con el fin de atraer células en los máximos del campo, suficientes para hacer que tal potencial de transmembrana cree poros. Finalmente, según una posible variante del método de la invención, prevé aplicar estímulos de una intensidad creciente a una pluralidad de dichas primeras partículas seleccionadas y medir, con respecto a cada estímulo aplicado, el número de partículas existente en un estado permeabilizado mediante sensores integrados con dicha serie de electrodos, en un solo chip. Por ejemplo, las primeras partículas son sumergidas en un fluido y el fluido contiene un compuesto adecuado para ser detectado por los sensores al menos cuando penetra dentro de dichas primeras partículas que están en un estado permeabilizado.

Método para ajustar a priori estímulos de electroporación para cada célula

Si se dispone de información acerca del valor óptimo de los estímulos, dependiendo de las características de la célula, (por ejemplo, después de caracterizaciones como las de los métodos anteriores), puede adoptarse el método siguiente “a priori”.

En la serie de electrodos, es posible detectar previamente con los sensores (preferiblemente sensores ópticos y/o medidores de impedancia integrados dentro del chip) las características de cada célula a electroporar, tales como, por ejemplo, las dimensiones, y programar estímulos a aplicar localmente, con el fin de optimizar, localmente lugar por lugar, o electrodo por electrodo, el porcentaje de éxito de la electroporación para cada célula específica.

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Método para la selección o el procesamiento de primeras partículas (CÉLULA) sensibles a la aplicación de un estímulo externo comprendiendo el paso de obtener, mediante la aplicación de dicho estímulo externo, la permeabilización de al menos una primera partícula seleccionada (CÉLULA), caracterizado porque comprende los pasos de:

a) energizar selectivamente electrodos (EL) de una serie de electrodos seleccionables que tienen dimensiones comparables o inferiores a los de dichas primeras partículas (CÉLULA), para aplicar a todos dichos electrodos una primera configuración de voltajes para generar un primer campo de fuerza (FMAN), por medio del que dichas primeras partículas (CÉLULA) son organizadas llevando dichas primeras partículas (CÉLULA) hacia primeros puntos de equilibrio estable (MPEQ) situados en la proximidad de dichos electrodos (EL);

b) aplicar a todos y los mismos electrodos seleccionables indicados una segunda configuración de voltajes diferente de la primera configuración, con el fin de proporcionar entre al menos dos electrodos seleccionados de dicha serie adyacentes uno a otro y colocados en la proximidad de la al menos única primera partícula seleccionada a permeabilizar (CÉLULA) un segundo campo de fuerza (FZAP), y de manera que se produzca la aplicación a dicha al menos una primera partícula seleccionada (CÉLULA) de un estímulo adecuado para poner dicha al menos una primera partícula seleccionada (CÉLULA) en un estado permeabilizado durante al menos una fracción de la longitud de dicho estímulo.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además el paso de

c) poner en contacto dicha al menos una primera partícula seleccionada (CÉLULA) en un estado permeabilizado con al menos una segunda partícula (PL); realizándose dichos pasos b) y c) de manera que se produzca la penetración de dicha al menos una segunda partícula (PL) dentro de dicha al menos una primera partícula seleccionada en un estado permeabilizado (CÉLULAZ).

3. Método según la reivindicación 2, caracterizado porque dichas primeras partículas son sumergidas en un fluido; realizándose dicho paso c) con dichas segundas partículas también sumergidas en dicho fluido y prolongando dicho paso b) durante un tiempo suficiente para permitir que al menos una segunda partícula indicada penetre dentro de dicha al menos una primera partícula seleccionada, que está en un estado permeabilizado.

4. Método según la reivindicación 2, caracterizado porque dichas primeras partículas son sumergidas en un fluido; realizándose dicho paso c) con dichas segundas partículas también sumergidas en dicho fluido y desplazando al menos una segunda partícula seleccionada indicada hacia dicha al menos una primera partícula seleccionada mantenida en un estado permeabilizado aplicando a al menos dicha segunda partícula seleccionada un campo de fuerza (FMAN) obtenido energizando selectivamente dichos electrodos (El ) de dicha serie de electrodos seleccionables aplicando a dichos electrodos una secuencia de configuraciones de voltaje prefijadas.

5. Método según la reivindicación 2, caracterizado porque dicho estímulo es adecuado para mantener dicha al menos una primera partícula seleccionada en un estado permeabilizado durante un tiempo prefijado también después de la extracción del estímulo; sumergiendo dichas primeras partículas en un primer fluido; realizándose dicho paso c) con dichas segundas partículas también sumergidas en dicho primer fluido y desplazando al menos una primera partícula seleccionada en un estado permeabilizado hacia dicha segunda partícula aplicando a la partícula un campo de fuerza (FMAN) obtenido energizando selectivamente dichos electrodos (EL) de dicha serie de electrodos seleccionables aplicando a dichos electrodos una secuencia de configuraciones de voltaje prefijadas.

6. Método según la reivindicación 2, caracterizado porque dichas primeras partículas son sumergidas en un primer fluido; realizándose dicho paso c) con dichas segundas partículas sumergidas en un segundo fluido contiguo al primero y desplazando dicha al menos una primera partícula seleccionada del primer fluido al segundo aplicando a la partícula un campo de fuerza (FMAN) obtenido energizando selectivamente dichos electrodos (EL) de dicha serie de electrodos seleccionables aplicando a dichos electrodos una secuencia de configuraciones de voltaje prefijadas.

7. Método según la reivindicación 6, caracterizado porque dichos pasos b) y c) se realizan en dicha al menos una primera partícula seleccionada cuando ésta está sumergida en el segundo fluido; o, alternativamente, cuando dicha al menos una primera partícula seleccionada está sumergida dentro del primer fluido, a condición de que dicho estímulo sea adecuado para mantener dicha al menos una primera partícula seleccionada en un estado permeabilizado durante un tiempo prefijado también después de la extracción del estímulo, suficiente para permitir el desplazamiento de la partícula del primer al segundo fluido.

8. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque dichas primeras partículas son sumergidas en un fluido; comprendiendo además dicho método el paso de

c) tener, en el fluido en el que primeras partículas son sumergidas, al menos un compuesto en solución; y d) permitir que dicho compuesto en solución penetre dentro de dicha al menos una primera partícula seleccionada en un estado permeabilizado.

9. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque dichas primeras partículas son sumergidas en un primer fluido contenido en una microcámara equipada con dicha serie de electrodos; comprendiendo además dicho método los pasos de:

c) introducir en dicha microcámara un segundo fluido operando en un movimiento laminar de tal manera que el segundo fluido no se mezcle con el primero, conteniendo el segundo fluido al menos un compuesto disuelto; d) desplazar dicha al menos una primera partícula del primer fluido al segundo aplicando a la partícula un campo de fuerza (FMAN) obtenido energizando selectivamente dichos electrodos (EL) de dicha serie de electrodos seleccionables aplicando a dichos electrodos una secuencia de configuraciones de voltaje prefijadas;

e) permitir que dicho compuesto penetre dentro de dicha al menos una primera partícula en un estado permeabilizado; realizándose dichos pasos a) y b) cuando dicha al menos una primera partícula está en el segundo fluido o, alternativamente, a condición de que dicho estímulo sea adecuado para mantener dicha al menos una primera partícula seleccionada en un estado permeabilizado durante un tiempo predeterminado también después de la extracción del estímulo, y suficiente para permitir el desplazamiento del primer al segundo fluido, cuando dicha al menos una primera partícula esté dentro del primer fluido.

10. Método según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque dichas primeras partículas son sumergidas en una pluralidad de diferentes fluidos contenidos en una microcámara equipada con dicha serie de electrodos y que han sido introducidos en dicha microcámara operando en un movimiento laminar de tal manera que dichos fluidos diferentes no se mezclen.

11. Método según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque dichas primeras partículas son entidades biológicas que tienen una membrana permeabilizable y lisable, por ejemplo, una célula, donde dicho estímulo consiste en poner el potencial de transmembrana de dicha al menos una partícula seleccionada a un valor tal que produzca la permeabilización de la membrana.

12. Método según alguna de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende un paso de verificar si se produce la permeabilización de dicha al menos una partícula seleccionada, realizado preferiblemente a través de sensores integrados con dicha serie de electrodos en un solo chip.

13. Método según la reivindicación 2 o 8, caracterizado porque comprende un paso de verificar si se produce la penetración de dicha al menos una segunda partícula o dicho compuesto en solución en dicha al menos una primera partícula seleccionada, preferiblemente realizado a través de sensores integrados con dicha serie de electrodos en un solo chip.

14. Método según alguna de las reivindicaciones precedentes, donde dichas partículas están suspendidas en un fluido, caracterizado porque dicho fluido se selecciona de tal forma que presente una conductividad eléctrica relativamente baja.

15. Método según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque permite aplicar estímulos con una intensidad creciente a una pluralidad de dichas primeras partículas seleccionadas y medir, para cada estímulo aplicado, el número de partículas existente en un estado permeabilizado a través de sensores integrados con dicha serie de electrodos en un solo chip.

16. Método según la reivindicación 15, caracterizado porque dichas primeras partículas son sumergidas en un fluido y porque dicho fluido contiene un compuesto adecuado para ser detectado por dichos sensores al menos cuando penetra dentro de dichas primeras partículas que están en un estado permeabilizado.

17. Método según una de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque proporciona los pasos de

- recoger información acerca del valor óptimo de estímulos a aplicar a través de dichos electrodos dependiendo de características conocidas de las primeras partículas;

- detectar previamente, mediante sensores preferiblemente integrados en chips, dichas características conocidas para identificar primeras partículas seleccionadas; y

- programar estímulos a aplicar localmente con el fin de optimizar el porcentaje de éxito de la permeabilización de cada primera partícula seleccionada específica.