ES2829254T3

ES2829254T3 - Nucleósidos de pirrolopirimidina y análogos de los mismos útiles como agentes antivíricos

Info

Publication number: ES2829254T3
Application number: ES16753540T
Authority: ES
Inventors: Leroy Townsend; John Drach; Roy W Ware; John Henry Bougher; Ramamurty V S Changalvala; Aaron Leigh Downey; Ernest Randall Lanier; Andrew Louis Mciver; Bradley David Robertson; Phiroze Behram Sethna; Dean Wallace Selleseth
Original assignee: Chimerix Inc; University of Michigan System
Current assignee: Chimerix Inc; University of Michigan System
Priority date: 2015-08-06
Filing date: 2016-08-08
Publication date: 2021-05-31
Anticipated expiration: 2036-08-08
Also published as: IL257122A

Abstract

Un compuesto de fórmula IB: **(Ver fórmula)** o una sal, solvato, enantiómero, diastereoisómero, racemato o mezcla farmacéuticamente aceptable de los mismos, en la que: A es: **(Ver fórmula)** X1 es -CR11R12- o -OCH2CH2-, en el que el átomo de oxígeno está distal al resto RIB en A; R11 y R12 son independientemente hidrógeno o alquilo C1-C4, en el que el alquilo está opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, -OH, -SH o -NH2; X2 está ausente, es -O-, -C(O)O-, o -OCH2-, en el que el átomo de oxígeno está distal al resto RIB en A; cada RIB es independientemente hidrógeno, -alquilo C1-C6, **(Ver fórmula)** o RIB es un residuo aminoacídico unido mediante el grupo carbonilo, en el que el alquilo está opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, -OH, -SH o -NH2; v es 0 o 1; n es 0, 1, 2 o 3 y cuando X2 es -C(O)O-, n es 0; p es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11; q es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18; Rz es hidrógeno, halógeno, -alquiltio C1-C4, -alcoxi C1-C4, -alquilo C1-C4, -alquenilo C2-C4, -alquinilo C2-C4, arilo, heteroarilo, -cicloalquilo C3-C8, -cicloalquenilo C4-C8 o heterociclo no aromático de 3 a 5 miembros, en el que cada alquiltio, alcoxi, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o heterociclo está opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, -OH, -SH o -NH2; Ra, Rb, Rx y Ry cada uno se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, -OH, -SH, -alcoxi C1-C6, ariloxi, -alquiltio C1-C6, ariltio, -OC(O)alquilo C1-C6, -OC(O)arilo, -alquilo C1-C6, -alquenilo C2-C6, -25 alquinilo C2-C6, arilo, heteroarilo, -cicloalquilo C3-C8 y -cicloalquenilo C4-C8, en el que cada alcoxi, ariloxi, alquiltio, ariltio, alquilo, arilo, alquenilo, alquinilo, heteroarilo, cicloalquilo o cicloalquenilo está opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, -OH, -SH o -NH2; o dos Ra o Rb cualesquiera, junto con el átomo al que están unidos ambos, pueden combinarse para formar un espirocicloalquilo C3-C8 o espiroheterociclo de 3 a 8 miembros; o dos Ra o Rb cualesquiera, cuando están en átomos adyacentes, pueden combinarse para formar un doble enlace carbono-carbono o un triple enlace carbono-carbono cis o trans; o dos Ra o Rb cualesquiera, cuando están en átomos adyacentes, pueden combinarse para formar un arilo, heteroarilo, -cicloalquilo C3-C10, -cicloalquenilo C4-C10 o heterociclo de 5 a 10 miembros en el anillo; o cualquier CRaRb puede remplazarse por -O-, -S-, -S(O)- o -SO2-; o dos Rx o Ry cualesquiera, junto con el átomo al que están unidos ambos, pueden combinarse para formar un - espirocicloalquilo C3-C8 o espiroheterociclo de 3 a 8 miembros; o dos Rx o Ry cualesquiera, cuando están en átomos adyacentes, pueden combinarse para formar un doble enlace carbono-carbono o un triple enlace carbono-carbono cis o trans; o dos Rx o Ry cualesquiera, cuando están en átomos adyacentes, pueden combinarse para formar un arilo, heteroarilo, -cicloalquilo C3-C10, -cicloalquenilo C4-C10 o heterociclo de 5 a 10 miembros en el anillo; o cualquier CRxRy puede remplazarse por -O-, -S-, -S(O)- o -SO2-; R1 y R45 cada uno es independientemente hidrógeno, halógeno, -N3, -OH, -NH2, -SH, -alquilo C1-C6, -cicloalquilo C3-C6, -alquenilo C2-C6, -cicloalquenilo C4-C8, -alquinilo C2-C6, -cicloalquinilo C8-C12, -alcoxi C1-C6 o -alquiltio C1-C6 en el que cada alquilo, cicloalquilo, alquenilo, cicloalquenilo, alquinilo, cicloalquinilo, alcoxi o alquiltio está independientemente sustituido con uno o más de halógeno, -N3, -OH, -NH2 o -SH; R2, R3, R4 y R44 cada uno es independientemente hidrógeno, halógeno, -N3, -OH, -NH2, -SH, -alquilo C1-C6, -alcoxi C1-C6 o -alquiltio C1-C6, en el que cada alquilo, alcoxi o alquiltio está opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, -N3, -OH, -NH2 o -SH; o R3 y uno de R4 y R44, junto con los átomos a los que están unidos pueden formar un doble enlace carbono-carbono; R5 es independientemente hidrógeno, -RIB, M+, arilo, aralquilo, -alquilo C1-C6, -heteroalquilo C1-C6, cicloalquilo, anillo heterocíclico no aromático o heteroarilo, en el que M+ es un catión y en el que cada arilo, aralquilo, alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterociclo o heteroarilo está opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, -N3, -OH, -NH2 o -SH, y en el que R5 no es un aminoácido; y Rc es -alquilo C1-C6, -cicloalquilo C3-C6, -alquenilo C2-C6, -cicloalquenilo C4-C8, -alquinilo C2-C6, -cicloalquinilo C8-C12 o arilo, en el que cada alquilo, cicloalquilo, alquenilo, cicloalquenilo o arilo está opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, -N3, -OH, -NH2 o -SH.

Description

DESCRIPCIÓN

Nucleósidos de pirrolopirimidina y análogos de los mismos útiles como agentes antivíricos

Solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica prioridad a y el beneficio de la solicitud provisional de Estados Unidos n.° 62/202010, presentada el 6 de agosto de 2015, y a la solicitud de Reino Unido n.° 1606645.8, presentada el 15 de abril de 2016.

Campo técnico

Esta solicitud se refiere a análogos nucleosídicos de pirrolopirimidina y conjugados fosfolipídicos de los mismos y métodos de síntesis de los mismos. Los análogos nucleosídicos de pirrolopirimidina y sus conjugados fosfolipídicos pueden usarse como agentes antivíricos para tratar infecciones víricas. Esta solicitud también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden análogos nucleosídicos de pirrolopirimidina y conjugados fosfolipídicos de los mismos.

Antecedentes

Las infecciones víricas pueden tener efectos adversos graves en los individuos y la sociedad en su conjunto. Además de infecciones víricas mortales tales como las del virus del Ébola, incluso infecciones que no son mortales pueden tener consecuencias sociales y económicas graves. Por ejemplo, los norovirus (NV) humanos son la causa más común de gastroenteritis aguda epidémica en todo el mundo con una estimación de 19-21 millones de casos cada año en los Estados Unidos, incluyendo 56000-71 000 hospitalizaciones y 570-800 muertes (Hall et al., Emerg.Infect.Dis. agosto 2013; 19(8): 1198-205).

Por consiguiente, es importante el desarrollo de un tratamiento antivírico eficaz que sea eficaz contra los virus para mejorar la salud de los individuos infectados y como medida de salud pública para evitar brotes de otros virus patógenos.

Sumario

La presente divulgación proporciona análogos nucleosídicos de pirrolopirimidina y conjugados fosfolipídicos de los mismos. También se incluyen composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos y métodos de síntesis de los mismos.

La presente divulgación también proporciona compuestos y composiciones de la invención para su uso en métodos de tratamiento y/o prevención de infecciones víricas o enfermedades o trastornos asociados con infecciones víricas. La divulgación aborda la necesidad de nuevos tratamientos que puedan usarse para tratar y/o prevenir enfermedades inducidas por virus usando antivíricos y vehículos de administración novedosos.

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a compuestos de fórmula IB:

o una sal, solvato, enantiómero, diastereoisómero, racemato o mezcla farmacéuticamente aceptable de los mismos, en la que:

A es:

X X1 es -CR11R12- o -OCH2CH2-, en el que el átomo de oxígeno está distal al resto RIB en A;

R11 y R12 son independientemente hidrógeno o alquilo C 1-C4, en el que el alquilo está opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, -OH, -SH o -NH2;

X2 está ausente, es -O-, -C(O)O- u -OCH2-, en el que el átomo de oxígeno está distal al resto RIB en A;

cada RIB es independientemente hidrógeno, -alquilo C1-C6,

o RIB es un residuo aminoacídico unido mediante el grupo carbonilo, en el que el alquilo está opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, -OH, -SH o -NH2;

v es 0 o 1;

n es 0, 1,2 o 3 y cuando X2 es -C(O)O-, n es 0;

p es 2 , 3 , 4 , 5, 6 , 7, 8, 9, 10 u 11;

Rz es hidrógeno, halógeno, -alquiltio C1-C4, -alcoxi C1-C4, -alquilo C1-C4, -alquenilo C2-C4, -alquinilo C2-C4, arilo, heteroarilo, -cicloalquilo C3-C8, -cicloalquenilo C4-C8 o heterociclo no aromático de 3 a 5 miembros, en el que cada alquiltio, alcoxi, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o heterociclo está opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, -OH, -SH o -NH2;

Ra, Rb, Rx y Ry cada uno se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, -OH, -SH, -alcoxi C1-C6, ariloxi, -alquiltio C1-C6, ariltio, -OC(O)alquilo C1-C6, -OC(O)arilo, -alquilo C1-C6, -alquenilo C2-C6, -alquinilo C2-C6, arilo, heteroarilo, -cicloalquilo C3-C8 y -cicloalquenilo C4-C8, en el que cada alcoxi, ariloxi, alquiltio, ariltio, alquilo, arilo, alquenilo, alquinilo, heteroarilo, cicloalquilo o cicloalquenilo está opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, -OH, -SH o -NH2;

o dos Ra o Rb cualesquiera, junto con el átomo al que están unidos ambos, pueden combinarse para formar un espirocicloalquilo C3-C8 o espiroheterociclo de 3 a 8 miembros;

o dos Ra o Rb cualesquiera, cuando están en átomos adyacentes, pueden combinarse para formar un doble enlace carbono-carbono o un triple enlace carbono-carbono cis o trans;

o dos Ra o Rb cualesquiera, cuando están en átomos adyacentes, pueden combinarse para formar un arilo, heteroarilo, -cicloalquilo C3-C10, -cicloalquenilo C4-C10 o heterociclo de 5 a 10 miembros en el anillo;

o cualquier CRaRb puede remplazarse por -O-, -S -, -S(O)- o -SO2-;

o dos Rx o Ry cualesquiera, junto con el átomo al que están unidos ambos, pueden combinarse para formar un -espirocicloalquilo C3-C8 o espiroheterociclo de 3 a 8 miembros;

o dos Rx o Ry cualesquiera, cuando están en átomos adyacentes, pueden combinarse para formar un doble enlace carbono-carbono o un triple enlace carbono-carbono cis o trans;

o dos Rx o Ry cualesquiera, cuando están en átomos adyacentes, pueden combinarse para formar un arilo, heteroarilo, -cicloalquilo C3-C10, -cicloalquenilo C4-C10 o heterociclo de 5 a 10 miembros en el anillo;

o cualquier CRxRy puede remplazarse por -O-, -S -, -S(O)- o -SO2-;

R1 y R45 cada uno es independientemente hidrógeno, halógeno, -N3, -OH, -NH2, -SH, -alquilo C1-C6, -cicloalquilo C3-C 6, -alquenilo C2-C6, -cicloalquenilo C4-C8, -alquinilo C2-C6, -cicloalquinilo C8-C12, -alcoxi C1-C6 o -alquiltio C1-C6, en el que cada alquilo, cicloalquilo, alquenilo, cicloalquenilo, alquinilo, cicloalquinilo, alcoxi o alquiltio está independientemente sustituido con uno o más de halógeno, -N3, -OH, -NH2 o -SH;

R2, R3, R4 y R44 cada uno es independientemente hidrógeno, halógeno, -N3, -OH, -NH2, -SH, -alquilo C1-C6, -alcoxi C1-C 6 o -alquiltio C1-C6, en el que cada alquilo, alcoxi o alquiltio está opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, -N3, -OH, -NH2 o -SH;

o R3 y uno de R4 y R44, junto con los átomos a los que están unidos pueden formar un doble enlace carbono-carbono; R5 es independientemente hidrógeno, -R IB, M+, arilo, aralquilo, -alquilo C1-C6, -heteroalquilo C1-C6, cicloalquilo, anillo heterocíclico no aromático o heteroarilo, en el que M+ es un catión y en el que cada arilo, aralquilo, alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterociclo o heteroarilo está opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, -N3, -OH, -NH2 o -SH, y en el que R5 no es un aminoácido; y

Rc es -alquilo C1-C6, -cicloalquilo C3-C6, -alquenilo C2-C6, -cicloalquenilo C4-C8, -alquinilo C2-C6, -cicloalquinilo C8-C12 o arilo, en el que cada alquilo, cicloalquilo, alquenilo, cicloalquenilo o arilo está opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, -N3, -OH, -NH2 o -SH .

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a compuestos de fórmula II:

o h 2n

RbÓ ÓRa (II)

y sales, solvatos, enantiómeros, diastereoisómeros, racematos o mezclas farmacéuticamente aceptables de los mismos, en la que:

Y es -C(O)-, o

en la que X 1 es independientemente O, NH o S, X 2 es independientemente un enlace, -O-, -S - o -NH-, y X3 es independientemente -OR, -N HRM o -S R M;

cada RM es independientemente -H, -alquilo C1-C20, -alquenilo C2-C20, -alquinilo C2-C20, -cicloalquilo C3-C8, -cicloalquenilo C4-C8, arilo, heteroarilo o heterociclilo, en el que cada alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, arilo, heteroarilo o heterociclilo está opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, oxo, R1, -O R1, -N R1R2, -S R 1, -OC(O)R1,-C(O)OR1, -NHC(O)OR1 o - NHC(O)R1;

Ra y Rb son cada uno independientemente, cada vez que aparecen, -H, -alquilo C1-C20, -alquenilo C2-C20, -alquinilo C2-C20, -cicloalquilo C3-C8, -cicloalquenilo C4-C8, arilo, heteroarilo o heterociclilo, en el que cada alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, arilo, heteroarilo o heterociclilo está opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, oxo, -O R 1, -N R1R2, -S R 1, -OC(O)R1,-C(O)OR1, -NHC(O)OR1 o -NHC(O)R1;

R1 y R2 son cada uno independientemente, cada vez que aparecen, -H, -alquilo C1-C20, -alquenilo C2-C20, -alquinilo C2-C20, -cicloalquilo C3-C8, -cicloalquenilo C4-C8, arilo, heteroarilo o heterociclilo, en el que cada alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, arilo, heteroarilo o heterociclilo está opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, oxo, -R 3, -R 4, -O R3, -N R3R4, -S R 3, -OC(O)R3, -C(O)OR3, -NHC(O)OR3 o -NHC(O)R3;

R3 y R4 son cada uno independientemente, cada vez que aparecen, -H, -alquilo C1-C20, -alquenilo C2-C20, -alquinilo C2-C20, -cicloalquilo C3-C8, -cicloalquenilo C4-C8, arilo, heteroarilo o heterociclilo, en el que cada alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, arilo, heteroarilo o heterociclilo está opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, oxo, arilo, heteroarilo, -OH, -NH2, -SH, -OC(O)H, -C(O)OH, -NHC(O)OH o -NHC(O)H;

Rd es independientemente -H o -D; y

n es independientemente 0, 1,2 o 3.

En algunas realizaciones, Ra es -H. En algunas realizaciones, Rb es -H. En algunas realizaciones, Rd es -H. En algunas realizaciones, n es 0. En algunas realizaciones, Ra, Rb y Rd son - H. En algunas realizaciones, Ra, Rb y Rd son -H y n es 0.

En algunas realizaciones, el compuesto es:

o una sal, solvato, enantiómero, diastereoisómero, racemato o mezcla farmacéuticamente aceptable del mismo; o

o una sal, solvato, enantiómero, diastereoisómero, racemato o mezcla farmacéuticamente aceptable del mismo o

o una sal, solvato, enantiómero, diastereoisómero, racemato o mezcla farmacéuticamente aceptable del mismo.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica que comprende un compuesto de fórmula IB, o fórmula II, o una sal, solvato, enantiómero, diastereoisómero, racemato o mezcla farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere una composición farmacéutica que comprende un compuesto 1, o una sal, solvato, enantiómero, diastereoisómero, racemato o mezcla farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica puede usarse para tratar una infección vírica (por ejemplo, norovirus).

En otro aspecto, la presente divulgación también se refiere a una formulación farmacéutica de los compuestos divulgados en este documento, o una sal, solvato, enantiómero, diastereoisómero, racemato o mezcla farmacéuticamente aceptable de los mismos, para su uso en un método para tratar o prevenir una infección vírica o enfermedad o trastorno asociado con infección vírica, por ejemplo, una infección de virus de ADN bicatenario (ADNbc) o de ARN monocatenario (ARNmc). En algunas realizaciones, el compuesto es compuesto 1. En algunas realizaciones, el virus es norovirus.

La presente divulgación también se refiere a un compuesto descrito en este documento, o una sal, solvato, enantiómero, diastereoisómero, racemato o mezcla farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento o prevención de una infección vírica o una enfermedad o trastorno asociado con infección vírica. El compuesto puede ser un compuesto de fórmula IB o fórmula II. En algunas realizaciones, el compuesto es compuesto 1, o una sal, solvato, enantiómero, diastereoisómero, racemato o mezcla farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunas realizaciones, el virus es norovirus.

Salvo que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el comprendido habitualmente por un experto en la materia a la que pertenece esta divulgación. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones. En la memoria descriptiva, las formas singulares también incluyen el plural, salvo que el contexto indique claramente lo contrario. Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento en la práctica o ensayo de la presente divulgación, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. Las referencias citadas en este documento no se admiten como técnica anterior a la divulgación reivindicada. Además, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos únicamente y no están destinados a ser limitantes.

Otros rasgos característicos y ventajas de la presente divulgación serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1A muestra la concentración de norovirus murino (unidades formadoras de placas por ml) en tejido y heces recogidos 3 días después de la infección como parte del estudio n.° 1.

La figura 1B muestra la concentración de norovirus murino (unidades formadoras de placas por mg de tejido) en tejido y heces recogidos 3 días después de la infección como parte del estudio n.° 1.

La figura 2A muestra la concentración de norovirus murino (unidades formadoras de placas por ml) en tejido y heces recogidos 3 días después de la infección como parte del estudio n.° 2.

La figura 2B muestra la concentración de norovirus murino (unidades formadoras de placas por mg de tejido) en tejido y heces recogidos 3 días después de la infección como parte del estudio n.° 2.

La figura 3A muestra el número de unidades formadoras de placas por gramo de ciego del estudio 1 en una escala lineal.

La figura 3B muestra el número de unidades formadoras de placas por gramo de heces del estudio 1 en una escala lineal.

La figura 4 muestra el primer duplicado de los resultados que demuestran la eficacia in vitro del compuesto 1 para inhibir el norovirus humano en comparación con trifosfato de 2'-C-metilcitidina y compuesto 2.

La figura 5 muestra el segundo duplicado de los resultados que demuestran la eficacia in vitro del compuesto 1 para inhibir el norovirus humano en comparación con trifosfato de 2'-C-metilcitidina y compuesto 2.

La figura 6 muestra una superposición del primer y segundo duplicado de los resultados que demuestran la eficacia in vitro del compuesto 1 para inhibir el norovirus humano en comparación con trifosfato de 2'-C-metilcitidina y compuesto 2.

La figura 7a muestra un diagrama de HPLC del compuesto 1.

La figura 7b muestra un diagrama de HPLC del compuesto 1 después de suspensión 3 horas a temperatura ambiente. La figura 7c muestra un diagrama de HPLC del compuesto 1 después de suspensión 3 horas a 50 °C.

La figura 7d muestra un diagrama de HPLC del compuesto 1 después de suspensión 24 horas a aproximadamente temperatura ambiente.

La figura 8a muestra un espectro de RMN de 1H del compuesto 1 de aproximadamente -2 a aproximadamente 14 ppm. La figura 8b muestra un espectro de RMN de 1H del compuesto 1 de aproximadamente 2 a aproximadamente 9 ppm. La figura 8c muestra un espectro de RMN de 1H del compuesto 1 de aproximadamente 0 a aproximadamente 9 ppm.

Descripción detallada

Los fosfonatos nucleosídicos (por ejemplo, derivados ribonucleosídicos) representan una clase diana de antivíricos para inhibir virus, que se basan en las enzimas codificadas por los virus que usan ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos como sustratos, tales como determinadas polimerasas víricas para muchos virus de ARN y/o helicasas víricas para virus de ARN (por ejemplo, ARNmc) o de ADN. Sin embargo, sin el deseo de limitarse a teoría alguna, un impedimento a la eficacia de esta clase de antivíricos es la necesidad de modificación bioquímica del agente administrado dentro de las células diana para formar el trifosfato nucleosídico antivírico activo. En algunas realizaciones, si se administra un nucleósido, se requieren tres etapas de fosforilación para formar el trifosfato. La administración de fosfonatos nucleosídicos evita de forma eficaz la primera fosforilación, pero puede exacerbar problemas de administración de cantidades clínicamente útiles del fármaco cargado a través de las bicapas lipídicas que rodean las células.

Sin el deseo de limitarse a teoría alguna, puede usarse conjugación con lípidos para ocultar los fármacos orales, incluyendo los fosfonatos nucleosídicos, como compuestos naturales que se absorban fácilmente por el organismo. Específicamente, en algunas realizaciones, los fosfonatos nucleosídicos pueden modificarse para que se parezcan a fosfolípidos parcialmente metabolizados (monoacilfosfolípidos). En algunas realizaciones, en contraste con los diacilfosfolípidos normales, los nucleótidos modificados con monoacil lípidos pueden penetrar fácilmente en los enterocitos que revisten la luz del intestino, entrar en la sangre circulante y/o el sistema linfático y, a diferencia de los fármacos convencionales, permanecer intactos. Por consiguiente, el resto lipídico puede hacer algo más que administrar el nucleósido al plasma; puede facilitar la captación eficaz en las células diana. El lípido puede escindirse en el compartimento citoplásmico de las células diana y, en el caso de conjugados de análogos nucleosídicos, puede producir el monofosfato correspondiente. Globalmente, esta estrategia puede dar lugar a niveles enormemente aumentados del antivírico activo en el sitio de replicación del virus.

La presente divulgación proporciona compuestos, composiciones farmacéuticas y métodos de síntesis y uso de los compuestos para tratar o prevenir una infección vírica o enfermedad o trastorno asociado con infección vírica, por ejemplo, una infección por virus de ARNmc.

En algunas realizaciones, los compuestos de la presente divulgación tienen una relación de eficacia/toxicidad mejorada en comparación con compuestos de la técnica usados de forma similar.

Definiciones

Determinados compuestos de la presente divulgación y definiciones de grupos funcionales específicos también se describen en más detalle a continuación.

Se apreciará que los compuestos, como se describe en este documento, pueden sustituirse con muchísimos sustituyentes o restos funcionales. En general, el término "sustituido", ya esté precedido por el término "opcionalmente" o no, y los sustituyentes contenidos en fórmulas divulgadas en este documento, se refieren al remplazo de radicales hidrógeno en una estructura dada con el radical de un sustituyente especificado. Cuando puede sustituirse más de una posición en cualquier estructura dada con más de un sustituyente seleccionado de un grupo especificado, el sustituyente puede ser igual o diferente en cada posición. Como se usa en este documento, se contempla que el término "sustituido" incluye todos los sustituyentes permisibles de compuestos orgánicos. En un aspecto amplio, los sustituyentes permisibles incluyen sustituyentes acíclicos y cíclicos, ramificados y no ramificados, carbocíclicos y heterocíclicos, aromáticos y no aromáticos de compuestos orgánicos. Para los propósitos de esta divulgación, heteroátomos tales como nitrógeno pueden tener sustituyentes hidrógeno y/o cualquier sustituyente permisible de compuestos orgánicos descritos en este documento que satisfaga las valencias de los heteroátomos. Los heteroátomos de nitrógeno y azufre opcionalmente pueden oxidarse, y el heteroátomo de nitrógeno opcionalmente puede cuaternizarse. Ejemplos de sustituyentes en los restos divulgados en este documento (por ejemplo, grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, alcoxi, arilo, heteroarilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, heterociclo no aromático) incluyen, aunque sin limitación, alquenilo, alquinilo, halógeno, haloalquilo, alcoxi, alquiltio, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, heteroarilo, arilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, heterociclo no aromático, hidroxilo, carbamoilo, oxo, amino, nitro, azido, -SH y -CN.

La presente divulgación pretende incluir todos los isótopos de átomos que aparecen en los presentes compuestos. Los isótopos incluyen aquellos átomos que tienen el mismo número atómico, pero diferentes números másicos. En particular uno, alguno o todos los hidrógenos pueden ser deuterio. Pueden usarse isótopos radioactivos, por ejemplo, para análisis estructural o para facilitar el rastreo del destino de los compuestos o sus productos metabólicos después de la administración. A modo de ejemplo general y sin limitación, los isótopos de hidrógeno incluyen deuterio y tritio y los isótopos de carbono incluyen C -13 y C -14. Por ejemplo, los compuestos de fórmula I incluyen aquellos en los que Ri es H o D; R2 y R3 son independientemente H, D, OH, OD, CH3 o CD3; y/o R4 es H, D, CH3 o CD3.

El término "independientemente" se usa en este documento para indicar que la variable, tal como el átomo o grupo funcional, que se aplica independientemente, varía independientemente de una aplicación a otra. Por ejemplo, cuando existe más de un sustituyente o átomo (carbono o heteroátomo, tal como oxígeno (O), azufre (S) o nitrógeno (N)), cada sustituyente o átomo es independiente de otro sustituyente o átomo y dichos sustituyentes o átomos también pueden alternar.

El término "alquilo", como se usa en este documento, se refiere a radicales hidrocarbonados saturados, de cadena lineal o ramificados que contienen, en determinadas realizaciones, entre uno y veinte, incluyendo entre uno y diez, o entre diez y seis, átomos de carbono. Ramificado significa que uno o más grupos alquilo C1-C6 inferior, tales como metilo, etilo o propilo están unidos a una cadena de alquilo lineal. Grupos alquilo ejemplares incluyen metilo, etilo, npropilo, i-propilo, n-butilo, t-butilo, n-pentilo y 3-pentilo. Ejemplos de radicales alquilo C1-C6 incluyen, aunque sin limitación, radicales metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, ferc-butilo, neopentilo, n-hexilo; y ejemplos de radicales alquilo Ci -Ca incluyen, aunque sin limitación, radicales metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, tere-butilo, neopentilo, n-hexilo, heptilo, octilo. Ejemplos de radicales alquilo C1-C20 incluyen, aunque sin limitación, hexadecametilo, hexadecaetilo, hexadecapropilo, octadecametilo, octadecaetilo, octadecapropilo y similares.

El término "alquenilo", como se usa en este documento, se refiere a un grupos lineal o ramificado monovalente derivado de un resto hidrocarbonado que contiene, en determinadas realizaciones, de dos a seis, o de dos a ocho, o de dos a veinte átomos de carbono, que tiene al menos un doble enlace carbono-carbono. El doble enlace puede ser o no el punto de adhesión a otro grupo. Ejemplos de grupos alquenilo C2-C8 incluyen, aunque sin limitación, por ejemplo, etenilo, propenilo, butenilo, 1-metil-2-buten-1-ilo, heptenilo, octenilo y similares. Como se define en este documento, los grupos "alquenilo" incluyen isómeros tanto eis como trans.

El término "alquinilo", como se usa en este documento, se refiere a un grupos lineal o ramificado monovalente derivado de un resto hidrocarbonado que contiene, en determinadas realizaciones, de dos a seis, o de dos a ocho, o de dos a veinte átomos de carbono, que tiene al menos un triple enlace carbono-carbono. El triple enlace puede ser o no el punto de adhesión a otro grupo. Ejemplos de grupos alquinilo C2-C8 incluyen, aunque sin limitación, por ejemplo, etinilo, propinilo, butinilo y similares.

El término "alcoxi" se refiere a un radical -O-alquilo.

El término "tioalquilo" o "alquiltio" se refiere a un radical -S-alquilo. En algunas realizaciones, el grupo tio puede remplazarse por un sulfinilo (SO) o sulfonilo (SO2).

Los términos "hal", "halo" o "halógeno", como se usan en este documento, se refieren a un átomo seleccionado de flúor, cloro, bromo y yodo.

Los términos "haloalquilo", "haloalquenilo" o "haloalquinilo", como se usan en este documento, se refieren a un alquilo, alquenilo o alquinilo que está sustituido con uno o más halógenos o grupos halo. Ejemplos de haloalquilo incluyen, aunque sin limitación, CF3, CH2CF3, CCl3.

El término "arilo", como se usa en este documento, se refiere a un sistema de anillos carbocíclico mono- o policíclico que tiene uno o más anillos aromáticos, condensados o no condensados incluyendo, aunque sin limitación, fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo, idenilo y similares. El término arilo incluye indolina.

El término "cicloalquilo", como se usa en este documento, se refiere a un grupo monovalente derivado de un compuesto de anillo carbocíclico saturado monocíclico o policíclico. Ejemplos de cicloalquilo C3-C8 (cicloalquilo de 3 a 8 miembros) incluyen, aunque sin limitación, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, ciclopentilo y ciclooctilo; y ejemplos de cicloalquilo C3-C12 incluyen, aunque sin limitación, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, biciclo [2.2.1] heptilo y biciclo [2.2.2]octilo y similares.

El término "cicloalquenilo", como se usa en este documento, se refiere a un grupo monovalente derivado de un compuesto de anillo carbocíclico parcialmente insaturado monocíclico o policíclico (es decir, no aromático). En otras palabras, se refiere a un grupo monovalente derivado de un compuesto de anillo carbocíclico monocíclico o policíclico que tiene al menos un doble enlace carbono-carbono. Los ejemplos de dichos grupos incluyen, aunque sin limitación, ciclopropenilo, ciclobutenilo, ciclopentenilo, ciclohexenilo, cicloheptenilo, ciclooctenilo y similares.

El término "cicloalquinilo", como se usa en este documento, indica un grupo monovalente derivado de un compuesto carbocíclico parcialmente insaturado monocíclico o policíclico (es decir, no aromático) que tiene al menos un triple enlace carbono-carbono. Ejemplos incluyen ciclooctino.

El término "heteroarilo", como se usa en este documento, se refiere a un radical o sistema de anillos mono- o policíclico (por ejemplo, bi- o tricíclico o más) condensado o no condensado, que tiene al menos un anillo aromático, que tiene de cinco a diez átomos en el anillo, de los que al menos un átomo del anillo se selecciona de S, O, P y N. En otras palabras, heteroarilo es arilo que contiene al menos un heteroátomo. Ejemplos de heteroarilo incluyen, aunque sin limitación, piridinilo, furanilo, tiazolilo, imidazolilo, indolilo, benzofuranilo y similares.

Se acepta que la expresión "heteroarilo de 5 o 6 miembros", significa un anillo que tiene de cinco a doce átomos en el anillo, de los que al menos un átomo del anillo se selecciona de S, O, P y N. Heteroarilo incluye, aunque sin limitación, piridinilo, pirazinilo, pirimidinilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isooxazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, tiofenilo, furanilo, quinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, benzooxazolilo, quinoxalinilo y similares.

La expresión anillo "heterocíclico no aromático" o "heterociclo no aromático", como se usa en este documento, se refiere a un sistema saturado o insaturado, no aromático monocíclico o policíclico, condensado o no condensado, donde, por ejemplo, al menos un anillo contiene entre uno y cuatro heteroátomos seleccionados independientemente de oxígeno, azufre, fósforo y nitrógeno. Los heteroátomos de nitrógeno y azufre opcionalmente pueden oxidarse, y el heteroátomo de nitrógeno opcionalmente puede cuaternizarse. Los grupos heterocíclicos no aromáticos representativos incluyen, aunque sin limitación, [1,3]dioxolano, pirrolidinilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, imidazolinilo, imidazolidinilo, piperidinilo, piperazinilo, oxazolidinilo, isoxazolidinilo, morfolinilo, tiazolidinilo, isotiazolidinilo y tetrahidrofurilo.

Como se usa en este documento, se entiende que el término "oxo" describe un grupo carbonilo (es decir, C(O)).

Como se describe en este documento, los compuestos de la divulgación pueden sustituirse opcionalmente con uno o más sustituyentes, tales como los ilustrados en general anteriormente, o como se ejemplifica por clases, subclases y especies particulares de la divulgación. Se apreciará que la frase "opcionalmente sustituido" se usa indistintamente con la frase "sustituido o sin sustituir". En general, el término "sustituido", ya esté precedido por el término "opcionalmente" o no, se refiere al remplazo de radicales hidrógeno en una estructura dada con el radical de un sustituyente especificado. Salvo que se indique de otro modo, un grupo opcionalmente sustituido puede tener un sustituyente en cada posición sustituible del grupo, y cuando puede sustituirse más de una posición en cualquier estructura dada con más de un sustituyente seleccionado de un grupo especificado, el sustituyente puede ser igual o diferente en cada posición.

El término "protegido", como se describe en este documento, se refiere a grupos funcionales o compuestos de la presente divulgación que tienen un grupo protector usando en la síntesis para enmascarar temporalmente la química característica de un grupo funcional (tal como hidroxilo, amino, carboxilo, etc.) porque interfiere con otra reacción. Después de completarse la reacción, estos grupos protectores se retiran por métodos comunes, o los compuestos protegidos se usan como profármacos o como los compuestos de la divulgación.

La expresión "profármaco" o "profármacos farmacéuticamente aceptables", como se usa en este documento, se refiere a compuestos que se transforman rápidamente in vivo para producir el compuesto precursor, por ejemplo, por hidrólisis en la sangre (T. Higuchi y V. Stella, Pro-drugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14 del A.C.S. Symposium Series; Edward B. Roche, ed., Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987).

La expresión "farmacéutico" o "farmacéuticamente aceptable", cuando se usan en este documento como un adjetivo, significa sustancialmente no tóxico y sustancialmente no perjudicial para el destinatario. Como se usa en este documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellos compuestos, materiales, composiciones, vehículos y/o formas farmacéuticas que son, según el juicio médico razonable, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de los seres humanos y los animales sin provocar una toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación excesiva, y acordes con una relación de beneficio/riesgo razonable.

Por "formulación farmacéutica" se entiende además que el vehículo, disolvente, uno o más excipientes y sal deben ser compatibles con el ingrediente activo de la formulación (por ejemplo, un compuesto de la divulgación). Los expertos en la materia entienden que las expresiones "formulación farmacéutica" y "composición farmacéutica" son, en general, intercambiables, y por tanto se usan para los propósitos de esta solicitud e incluyen preparaciones adecuadas para su administración a mamíferos, por ejemplo, seres humanos.

Una "composición farmacéutica", como se usa en este documento, se refiere a una formulación que contiene un compuesto de la presente divulgación en una forma adecuada para su administración a un sujeto. En una realización, la composición farmacéutica está a granel o en una forma farmacéutica unitaria. La forma farmacéutica unitaria es cualquiera de una diversidad de formas incluyendo, por ejemplo, una cápsula, una bolsa IV, un comprimido, una bomba individual en un inhalador de aerosol o un vial. La cantidad de ingrediente activo (por ejemplo, una formulación del compuesto divulgado o sal, hidrato, solvato o isómero del mismo) en una dosis unitaria de la composición es una cantidad eficaz y se varía de acuerdo con el tratamiento particular implicado. Un experto en la materia apreciará que, a veces, es necesario hacer variaciones rutinarias en la dosificación dependiendo de la edad y estado del paciente. La dosificación también dependerá de la vía de administración. Como se usa en este documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" puede incluir todos los disolventes, diluyentes u otros vehículos líquidos, auxiliares de dispersión o suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o emulsionantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubricantes y similares, adecuados para la forma farmacéutica particular deseada. Remington's Pharmaceutical Sciences, decimosexta edición, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980) divulga diversos vehículos usados en la formulación de composiciones farmacéuticas y técnicas conocidas para la preparación de las mismas. Excepto en la medida que cualquier medio de vehículo convencional sea incompatible con los compuestos, tal como al producir algún efecto biológico indeseable o al interactuar de otro modo de una manera perjudicial con cualquier otro componentes o componentes de la composición farmacéutica, su uso se contempla dentro del alcance de esta divulgación. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, aunque sin limitación, glúcidos tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes tales como manteca de cacao y ceras de supositorio; aceites tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón; aceite de cártamo, aceite de sésamo; aceite de oliva; acete de maíz y aceite de soja; glicoles; tales como propilenglicol; ésteres tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes tamponantes tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua apirógena; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico y soluciones de tampón fosfato, así como otros lubricantes compatibles atóxicos tales como laurilsulfato de sodio y estearato de magnesio, así como agente colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, aromatizantes y perfumantes, conservantes y antioxidantes también pueden estar presentes en la composición, de acuerdo con el criterio del formulador. "Excipiente o vehículos farmacéuticamente aceptable" también se refiere a un excipiente o vehículo que es útil en la preparación de una composición farmacéutica que en general es segura, atóxica y ni biológicamente indeseable ni indeseable de otro modo, e incluye un excipiente que es aceptable para uso veterinario, así como uso farmacéutico en seres humanos. Un "excipiente farmacéuticamente aceptable", como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones incluye tanto uno como más de uno de dicho excipiente.

Los compuestos divulgados en este documento incluyen los propios compuestos, así como sus sales, sus solvatos y sus profármacos, si fuera aplicable. Una sal, por ejemplo, puede formarse entre un anión y un grupo cargado positivamente (por ejemplo, amino protonado) en un compuesto de esta divulgación. Los aniones adecuados incluyen cloruro, bromuro, yoduro, sulfato, bisulfato, sulfamato, nitrato, fosfato, citrato, metanosulfonato, trifluoroacetato, glutamato, glucuronato, glutarato, malato, maleato, succinato, fumarato, tartrato, tosilato, salicilato, lactato, naftalenosulfonato y acetato (por ejemplo, trifluroacetato). La expresión "anión farmacéuticamente aceptable" se refiere a un anión adecuado para formar una sal farmacéuticamente aceptable. Asimismo, una sal también puede formarse entre un catión y un grupo cargado negativamente (por ejemplo, carboxilato) en un compuesto de esta divulgación. Los cationes adecuados incluyen ion sodio, ion potasio, ion magnesio, ion calcio y un catión amonio tal como ion tetrametilamonio. Los compuestos de esta divulgación también incluyen aquellas sales que contienen átomos de nitrógeno cuaternario. Ejemplos de profármacos incluyen ésteres y otros derivados farmacéuticamente aceptables que, tras su administración a un sujeto, pueden proporcionar compuestos activos de esta divulgación.

Adicionalmente, las sales fisiológicamente aceptables, es decir, farmacéuticamente compatibles pueden ser sales de los compuestos divulgados en este documento con ácidos inorgánicos u orgánicos. Se da preferencia a sales con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico o ácido sulfúrico, o a sales con ácidos carboxílicos o sulfónicos orgánicos tales como, por ejemplo, ácido acético, ácido trifluoroacético, ácido propiónico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido málico, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido láctico, ácido benzoico o ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido bencenosulfónico, ácido toluenosulfónico o ácido naftalenodisulfónico.

Otras sales farmacéuticamente compatibles que pueden mencionarse son sales con bases habituales tales como, por ejemplo, sales de metales alcalinos (por ejemplo sales de sodio o potasio), sales de metales alcalinotérreos (por ejemplo, sales de calcio o magnesio) o sales de amonio, derivadas de amoniaco o aminas orgánicas tales como, por ejemplo, dietilamina, trietilamina, etildiisopropilamina, procaína, dibencilamina, N-metilmorfolina, dihidroabietilamina o metilpiperidina.

Como se usa en este documento, "sales farmacéuticamente aceptables" puede hacer referencia a derivados de los compuestos de la presente divulgación en los que el compuesto precursor se modifica haciendo sales de ácidos o de bases de los mismos. Ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, aunque sin limitación, sales de ácidos minerales u orgánicos de residuos básicos tales como aminas, sales alcalinas u orgánicas de residuos ácidos tales como ácidos carboxílicos, y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales atóxicas convencionales o las sales de amonio cuaternario del compuesto precursor formadas, por ejemplo, a partir de ácidos inorgánicos u orgánicos atóxicos. Por ejemplo, dichas sales atóxicas convencionales incluyen, aunque sin limitación, las derivadas de ácidos inorgánicos y orgánicos seleccionados de 2-acetoxibenzoico, 2-hidroxietanosulfónico, acético, ascórbico, bencenosulfónico, benzoico, bicarbónico, carbónico, cítrico, edético, etanodisulfónico, 1,2-etanosulfónico, fumárico, glucoheptónico, glucónico, glutámico, glicólico, glicoliarsanílico, hexilresorcínico, hidrabámico, bromhídrico, clorhídrico, yodhídrico, hidroximaleico, hidroxinaftoico, isetiónico, láctico, lactobiónico, laurilsulfónico, maleico, málico, mandélico, metanosulfónico, napsílico, nítrico, oxálico, pamoico, pantoténico, fenilacético, fosfórico, poligalacturónico, propiónico, salicíclico, esteárico, subacético, succínico, sulfámico, sulfanílico, sulfúrico, tánico, tartárico, toluenosulfónico y los aminoácidos de origen naturales, por ejemplo, glicina, alanina, fenilalanina, arginina, etc.

Otros ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables pueden incluir ácido hexanoico, ácido ciclopentanopropiónico, ácido pirúvico, ácido malónico, ácido 3-(4-hidroxibenzoil)benzoico, ácido cinámico, ácido 4-clorobencenosulfónico, ácido 2-naftalenosulfónico, ácido 4-toluenosulfónico, ácido alcanforsulfónico, ácido 4-metilbiciclo-[2.2.2]-oct-2-eno-1-carboxílico, ácido 3-fenilpropiónico, ácido trimetilacético, ácido ferc-butilacético, ácido mucónico, y similares. La presente divulgación también abarca sales formadas cuando un protón ácido presente en el compuesto precursor se remplaza por un ion metálico, por ejemplo, un iones de metal alcalino o un ion de metal alcalinotérreo, por ejemplo, un ion aluminio; o se coordina con una base orgánica tal como etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina, N-metilglucamina, dietilamina, dietilaminoetanol, etilendiamina, imidazol, lisina, arginina, morfolina, 2-hidroxietilmorfolina, dibenciletilendiamina, trimetilamina, piperidina, pirrolidina, bencilamina, hidróxido de tetrametilamonio y similares.

Debe entenderse que todas las referencias a sales farmacéuticamente aceptables incluyen formas de adición de disolvente (solvatos) o formas cristalinas (polimorfos) como se define en este documento, de la misma sal.

Los compuestos de la presente divulgación también pueden prepararse como profármacos. En determinadas realizaciones, uno o más compuestos de la presente divulgación se formulan como un profármaco. En determinadas realizaciones, tras la administración in vivo, un profármaco se convierte químicamente en la forma biológica, farmacéutica o terapéuticamente más activa. En determinadas realizaciones, los profármacos son útiles porque son más fáciles de administrar que la correspondiente forma activa. Por ejemplo, en determinados casos, un profármaco puede estar más biodisponible (por ejemplo, mediante administración oral) de lo que está la correspondiente forma activa. En determinados casos, un profármaco puede tener solubilidad mejorada en comparación con la correspondiente forma activa. En determinadas realizaciones, los profármacos son menos solubles en agua que la correspondiente forma activa. En determinados casos, dichos profármacos tienen transmisión superior a través de las membranas celulares, donde la solubilidad en agua se perjudicial para la movilidad. En determinadas realizaciones, un profármaco es un éster. En determinadas realizaciones de este tipo, el éster se hidroliza metabólicamente en ácido carboxílico tras su administración. En determinados casos, el compuesto que contiene ácido carboxílico es la correspondiente forma activa. En determinadas realizaciones, un profármaco comprende un péptido corto (poliaminoácido) unido a un grupo ácido. En determinadas realizaciones de este tipo, el péptido se escinde tras su administración para formar la correspondiente forma activa.

En determinadas realizaciones, un profármaco se produce modificando un compuesto farmacéuticamente activo de modo que el compuesto activo se regenerará tras su administración in vivo. El profármaco puede diseñarse para alterar la estabilidad metabólica o las características de transporte de un fármaco, para enmascarar los efectos secundarios o la toxicidad, para mejorar el aroma de un fármaco o para alterar otras características o propiedades de un fármaco. Como consecuencia del conocimiento de los procesos farmacológicos y el metabolismo de los fármacos in vivo, los expertos en la materia, una vez conozcan un compuesto farmacéuticamente activo, podrán diseñar profármacos del compuesto (véase, por ejemplo, Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, Nueva York, páginas 388-392).

Además, los compuestos de la presente divulgación, por ejemplo, las sales de los compuestos, pueden existir en su forma hidratada o no hidratada (la anhidra) o como solvatos con otras moléculas de disolvente. Ejemplos no limitantes de hidratos incluyen monohidratos, dihidratos, etc. Ejemplos no limitantes de solvatos incluyen solvatos de etanol, solvatos de acetona, etc.

Algunos de los compuestos de la presente divulgación pueden existir en formas no solvatadas, así como solvatadas tales como, por ejemplo, hidratos.

"Solvato" significa una forma de adición de disolvente que contiene cantidades estequiométricas o no estequiométricas de disolvente. Algunos compuestos pueden tener una tendencia a atrapar una relación molar fija de moléculas de disolvente en el estado sólido cristalino, formando, por tanto, un solvato. Si el disolvente es agua, el solvato formado es un hidrato, cuando el disolvente es alcohol, el solvato formado es un alcoholato. Los hidratos se forman mediante la combinación de una o más moléculas de agua con una de las sustancias en que el agua retiene su estado molecular como H2O, pudiendo dicha combinación formar uno o más hidratos. En los hidratos, las moléculas de agua se unen a través de valencias secundarias mediante fuerzas intermoleculares, en particular, puentes de hidrógeno. Los hidratos sólidos contienen agua como la denominada agua cristalina en relaciones estequiométricas, donde las moléculas de agua no tienen que ser equivalentes con respecto a su estado de unión. Ejemplos de hidratos son sesquihidratos, monohidratos, dihidratos o trihidratos. Igual de adecuados son los hidratos de sales de los compuestos de la divulgación.

La divulgación también incluye metabolitos de los compuestos descritos en este documento. Los metabolitos de compuestos químicos, ya sean inherentes o farmacéuticos, se forman como parte del proceso bioquímico natural de degradación y eliminación de los compuestos. La tasa de degradación de un compuesto es un determinante importante de la duración e intensidad de su acción. Perfilar los metabolitos de compuestos farmacéuticos, el metabolismo de los fármacos, es una parte importante del descubrimiento de fármacos, que da lugar a una comprensión de cualquier efecto secundario indeseable.

Como se usa en este documento, el término "tratar", "que trata" o "tratamiento" significa disminuir los síntomas, marcadores y/o cualquier efecto negativo de una afección en cualquier grado apreciable en un paciente que actualmente tiene la afección. En algunas realizaciones, el tratamiento puede administrarse a un sujeto que muestra solamente signos iniciales de la afección con el fin de disminuir el riesgo de desarrollar la enfermedad, trastorno y/o afección.

Como se usa en este documento, el término "prevenir", "prevención" o "que previene" se refiere a cualquier método para prevenir parcial o completamente o retardar la aparición de uno o más síntomas o rasgos característicos de una enfermedad, trastorno y/o afección. El tratamiento de prevención puede administrarse a un sujeto que no muestra signos de una enfermedad, trastorno y/o afección.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa en este documento, se refiere a una cantidad de un agente farmacéutico para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o afección identificada, o para mostrar un efecto terapéutico o inhibidor detectable. El efecto puede detectarse mediante cualquier método de ensayo conocido en la técnica. Como se usa en este documento, "cantidad terapéuticamente eficaz" también puede significar esa cantidad necesaria para generar una mejora clínicamente observada en el paciente. En algunas realizaciones, la composición se formula de tal manera que comprende una cantidad que no provocaría uno o más efectos secundarios indeseados.

Una cantidad eficaz de un agente farmacéutico también puede significar esa que proporciona una mejora objetivamente identificable apreciada por el médico u otro observador cualificado. La cantidad eficaz precisa para un sujeto dependerá del peso corporal, tamaño y salud del sujeto; la naturaleza y grado de la afección; y el agente terapéutico o combinación de agentes terapéuticos seleccionados para su administración. Las cantidades terapéuticamente eficaces para un situación dada pueden determinarse mediante experimentación rutinaria, acorde a las habilidades y criterio del médico.

Como se usa en este documento, "sujeto" significa un ser humano o animal (en el caso de un animal, más típicamente un mamífero). En un aspecto, el sujeto es un ser humano. En un aspecto, el sujeto es masculino. En un aspecto, el sujeto es femenino.

Los compuestos de la presente divulgación también pueden prepararse como ésteres, por ejemplo, ésteres farmacéuticamente aceptables. Por ejemplo, un grupo con función ácido carboxílico en un compuesto puede convertirse en su éster correspondiente, por ejemplo, un metilo, etilo u otro éster. Además, un grupo alcohol o hidroxilo en un compuesto puede convertirse en su éster correspondiente, por ejemplo, acetato, propionato u otros ésteres.

La presente divulgación incluye compuestos nuevos representados en general por la fórmula IB o fórmula II, o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y métodos para la preparación y usos de los mismos.

Durante toda la descripción, cuando se describen composiciones que tienen, que incluyen o que comprenden componentes específicos, se contempla que las composiciones también consisten esencialmente en, o consisten en, los componentes enumerados.

Compuestos

La presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula IB:

A es:

istal al resto RIB en A;

cada RIB es independientemente hidrógeno, -alquilo C¹-C⁶,

v es 0 o 1;

n es 0, 1,2 o 3 y cuando X2 es -C(O)O-, n es 0;

p es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11;

q es 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18;

Rz es hidrógeno, halógeno, -alquiltio C1-C4, -alcoxi C1-C4, -alquilo C1-C4, -alquenilo C2-C4, -alquinilo C2-C heteroarilo, -cicloalquilo C3-C8, -cicloalquenilo C4-C8 o heterociclo no aromático de 3 a 5 miembros, en el que cada alquiltio, alcoxi, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o heterociclo está opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, -OH, -SH o -NH2;

Ra, Rb, Rx y Ry cada uno se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, -OH, -SH, -alcoxi C1-C6, ariloxi, -alquiltio C1-C6, ariltio, -OC(O)alquilo C1-C6, -OC(O)arilo, -alquilo C1-C6, -alquenilo alquinilo C2-C6, arilo, heteroarilo, -cicloalquilo C3-C8 y -cicloalquenilo C4-C8, en el que cada alcoxi, ariloxi, alquiltio,

ariltio, alquilo, arilo, alquenilo, alquinilo, heteroarilo, cicloalquilo o cicloalquenilo está opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, -OH, -SH o -NH2;

o cualquier CRaRb puede remplazarse por -O-, -S-, -S(O)- o -SO2-;

o cualquier CRxRy puede remplazarse por -O-, -S-, -S(O)- o -SO2-;

R1 y R45 cada uno es independientemente hidrógeno, halógeno, -N3, -OH, -NH2, -SH, -alquilo C1-C6, -cicloalquilo C3-C6, -alquenilo C2-C6, -cicloalquenilo C4-C8, -alquinilo C2-C6, -cicloalquinilo C8-C12, -alcoxi C1-C6 o -alquiltio C1-C6, en el que cada alquilo, cicloalquilo, alquenilo, cicloalquenilo, alquinilo, cicloalquinilo, alcoxi o alquiltio está independientemente sustituido con uno o más de halógeno, -N3, -OH, -NH2 o -SH;

R2, R3, R4 y R44 cada uno es independientemente hidrógeno, halógeno, -N3, -OH, -NH2, -SH, -alquilo C1-C6, -alcoxi C1-C6 o -alquiltio C1-C6, en el que cada alquilo, alcoxi o alquiltio está opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, -N3, -OH, -NH2 o -SH;

o R3 y uno de R4 y R44, junto con los átomos a los que están unidos pueden formar un doble enlace carbono-carbono; R5 es independientemente hidrógeno, -RIB, M+, arilo, aralquilo, -alquilo C1-C6, -heteroalquilo C1-C6, cicloalquilo, anillo heterocíclico no aromático o heteroarilo, en el que M+ es un catión y en el que cada arilo, aralquilo, alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterociclo o heteroarilo está opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, -N3, -OH, -NH2 o -SH, y en el que R5 no es un aminoácido; y

Rc es -alquilo C1-C6, -cicloalquilo C3-C6, -alquenilo C2-C6, -cicloalquenilo C4-C8, -alquinilo C2-C6, -cicloalquinilo C8-C12 o arilo, en el que cada alquilo, cicloalquilo, alquenilo, cicloalquenilo o arilo está opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, -N3, -OH, -NH2 o -SH.

En algunas realizaciones, A se selecciona de A1 a A14:

En algunas realizaciones, A es

En al unas realizaciones, A es

En algunas realizaciones, A es

En algunas realizaciones, Ri es -H. En algunas realizaciones, R2 es -OH. En algunas realizaciones, R4 es -OH. En algunas realizaciones, R3 es -H. En algunas realizaciones, R44 es -H. En algunas realizaciones, RIB es -H. En algunas realizaciones, Rc es -CH3. En algunas realizaciones, v es 1, X2 es -O-, n es 0 y RIB es -H. En algunas realizaciones, R5 es -H o M+, en el que M+ es Na+, Li+, K+, C a2+, Mg2+ o NRgRdReRf+, y en el que Rg, Rd, Re y Rf cada uno es independientemente hidrógeno o -alquilo C1-C5.

En una o más realizaciones, RIB se selecciona de: -H,

En una o más realizaciones, el compuesto es de fórmula l-a:

o una sal, solvato, enantiómero, diastereoisómero, racemato o mezcla farmacéuticamente aceptable del mismo. En una o más realizaciones, el compuesto es de fórmula l-b:

o una sal, solvato, enantiómero, diastereoisómero, racemato o mezcla farmacéuticamente aceptable del mismo. En una o más realizaciones, el compuesto es de fórmula l-c:

En una o más realizaciones, el compuesto es de fórmula l-d:

En una o más realizaciones, el compuesto de la divulgación es compuesto 1:

(compuesto 1; 4-am¡no-7-((2R,3R,4S,5R)-3,4-d¡h¡drox¡-5-(h¡drox¡metil)tetrah¡drofurano-2-¡l)-2-met¡l-7H-p¡rrolo[2,3-d]pirimidin-5-carboxamida) o una sal, solvato, enantiómero, diastereoisómero, racemato o mezcla farmacéuticamente aceptable del mismo.

En una o más realizaciones, el compuesto de la divulgación es compuesto 1 -trifosfato (compuesto 1-TP o compuesto 1-PPP) o una sal, solvato, enantiómero, diastereoisómero, racemato o mezcla farmacéuticamente aceptable del mismo:

En una o más realizaciones, el compuesto de la divulgación se selecciona de:

o una sal, solvato, enantiómero, diastereoisómero, racemato o mezcla farmacéuticamente aceptable del mismo. En una o más realizaciones, el compuesto de la divulgación se selecciona de:

o una sal, solvato, enantiómero, diastereoisómero, racemato o mezcla farmacéuticamente aceptable del mismo En una o más realizaciones, el compuesto de la divulgación se selecciona de:

Ċ

En una o más realizaciones, el compuesto de la divulgación se selecciona de:

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un compuesto como se describe en este documento para su uso en el tratamiento de una enfermedad.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona el compuesto

para su uso en el tratamiento de una enfermedad. En algunas realizaciones, la enfermedad es una enfermedad vírica. En algunas realizaciones, la infección vírica es infección por norovirus.

En algunas realizaciones, el compuesto de la divulgación se selecciona de compuesto 1,2, 3, 4, 5, 6, 71, 77, 76, 107, 111, 126, 133, 137, 139, 141, 143 o 145, o una sal, solvato, enantiómero, diastereoisómero, racemato o mezcla farmacéuticamente aceptable del mismo, o cualquier combinación de los mismos.

Métodos de síntesis

Los compuestos de la presente divulgación pueden prepararse mediante una diversidad de métodos, incluyendo química convencional. Las rutas sintéticas adecuadas se representan en los esquemas dados a continuación.

Los compuestos descritos en este documento (por ejemplo, compuestos de fórmula IB o fórmula II) pueden prepararse por métodos conocidos en la técnica de síntesis orgánica como se expone, en parte, por los siguientes esquemas sintéticos y ejemplos. En los esquemas descritos a continuación, está bien comprendido que se emplean grupos protectores para grupos sensibles o reactivos donde es necesario de acuerdo con los principios generales de química. Los grupos protectores se manipulan de acuerdo con métodos convencionales de síntesis orgánica (T. W. Greene y P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", tercera edición, Wiley, Nueva York 1999). Estos grupos se retiran en una fase conveniente de la síntesis del compuesto usando métodos que son muy evidentes para los expertos en la materia. Los procesos de selección, así como las condiciones de reacción y el orden de su ejecución, deben ser coherentes con la preparación de compuestos de fórmula IB o fórmula II

Los expertos en la materia reconocerán si existe un estereocentro en los compuestos de fórmula IB o fórmula II. Por consiguiente, la presente divulgación incluye ambos posibles estereoisómeros (salvo que se especifique en la síntesis) e incluye no solamente los compuestos racémicos, sino también los enantiómeros y/o diastereoisómeros individuales. Cuando se desea un compuesto como un solo enantiómero o diastereoisómero, puede obtenerse por síntesis estereoespecífica o por resolución del producto final o cualquier intermedio conveniente. La resolución del producto final, un intermedio o un material de partida puede lograrse por cualquier método adecuado conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, "Stereochemistry of Organic Compounds" de E. L. Eliel, S. H. Wilen y L. N. Mander (Wileylnterscience, 1994).

Los compuestos descritos en este documento pueden prepararse a partir de materiales de partida disponibles en el mercado o sintetizarse usando procesos orgánicos, inorgánicos y/o enzimáticos conocidos.

Esquema 1: Síntesis general de compuestos de la invención

Como se muestra anteriormente en el esquema 1, puede yodarse 4-cloro-2-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina (a; numeración del esquema 1) en presencia de N-yodosuccinimida (NIS). La 4-cloro-5-yodo-2-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidina resultante (b) puede tratarse con un furano protegido (c) como se muestra en la etapa 2 para dar el compuesto (d). La sustitución de radicales de (d) da el derivado ciano correspondiente (e) que puede experimentar desprotección y sustitución aromática nucleófila en el carbono unido a cloro para dar el derivado amina (f). Finalmente, la hidratación del nitrilo de (f) da 4-amino-7-((2R,3R,4S,5R)-3,4-dihidroxi-5-(hidroximetil)tetrahidrofuran-2-il)-2-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-5-carboxamida (1).

Esquema 2: Síntesis general de compuestos de la invención

Etapa 1: 4-Amino-6-bromo-2-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-5-carbonitrilo, dibenzoato de (3R,4R,5R)-2-acetoxi-5-((benzoiloxi)metil)tetrahidrofuran-3,4-diilo y DCE se cargaron en un reactor. Se inició la agitación y se añadió DBU. Se añadió lentamente TMSOTf (8,01 kg). La mezcla de reacción se diluyó con DCM y se inactivó lentamente con agua mientras se enfriaba. La reacción se extrajo con DCM (19,90 kg) y se lavó con NaHCO3 sat. La fase acuosa se extrajo adicionalmente con DCM (19,71 kg) y se lavó con salmuera.

Etapa 2: En un reactor se cargaron dibenzoato de (2R,3R,4R,5R)-2-(4-amino-6-bromo-5-ciano-2-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-5-((benzoiloxi)metil)tetrahidrofuran-3,4-diilo, Pd al 10 % sobre C y THF. Se envió hidrógeno al reactor y la mezcla se agitó durante aproximadamente 4 horas a temperatura ambiente a aproximadamente 212,35 kPa (31 psi).

La mezcla de reacción se filtró sobre Celite (7,2 kg) y un filtro de pulido y el residuo del filtro se lavó con THF. El filtrado y el lavado combinados se transfirieron a un reactor encamisado de 100 l con la ayuda de un lavado con THF. Los contenidos del reactor se destilaron al vacío con una temperatura discontinua máxima de 30,0 °C durante un periodo de aproximadamente 6 horas hasta un volumen final de 27 l. Se cargó IPA en el reactor. Los contenidos del reactor se destilaron al vacío. Se cargó IPA en el reactor. Los contenidos del reactor se calentaron hasta aproximadamente 60 °C, se agitaron y se enfriaron lentamente hasta aproximadamente 5 °C. Se continuó la agitación en frío durante un periodo de aproximadamente 9 h con una temperatura mínima de aproximadamente 1 °C. La suspensión se filtró y se lavó con IPA. El residuo se secó al vacío con una purga de nitrógeno para proporcionar un LOD de un 0,36 %. Rendimiento: (73,9 %). La RMN de 1H confirma la estructura. Pureza: 97,78 % (HPLC, ABC).

Etapa 3: Una solución de dibenzoato de (2R,3R,4R,5R)-2-(4-amino-5-ciano-2-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-5-((benzoiloxi)metil)tetrahidrofuran-3,4-diilo y THF se calentó y se inició la adición de NaOH. La adición inicial dio una mezcla bifásica y respuesta endotérmica, pero según continuó la adición se formó una solución transparente de una sola fase que estuvo acompañada de una exotermia rápida; la temperatura de reacción se mantuvo durante el resto de la adición y durante ~2 A h adicionales. La IPC mostró que no quedaba dibenzoato de (2R,3R,4R,5R)-2-(4-amino-5-ciano-2-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-5-((benzoiloxi)metil)tetrahidrofuran-3,4-diilo.

La mezcla de reacción se enfrió hasta 21 °C y se neutralizó con HCl 3 N con enfriamiento externo hasta pH neutro. La mezcla continuó enfriándose y la mezcla neutralizada resultante se destiló al vacío hasta que se observó aparición de sólidos en el recipiente. La suspensión se enfrió y se agitó durante aproximadamente 2 h a aproximadamente 2 °C. La suspensión beis se filtró para producir un filtrado oscuro; el residuo blanquecino se lavó una vez con agua fría.

En determinadas realizaciones, los compuestos de la divulgación, por ejemplo, fórmula IB o fórmula II, pueden prepararse como enantiómeros, diastereoisómeros y racematos. En algunas realizaciones, los compuestos de la divulgación, por ejemplo, fórmula IB o fórmula II, incluyen todas las formas isoméricas (por ejemplo, enantioméricas, diastereoisoméricas y geométricas (o conformacionales)) de la estructura; por ejemplo, las configuraciones R y S para cada centro asimétrico, isómeros de doble enlace (Z) y (E), e isómeros conformacionales (Z) y (E). Por lo tanto, los isómeros estereoquímicos individuales, así como las mezclas enantioméricas, diastereoisoméricas y geométricas (o conformacionales) de los presentes compuestos están dentro del alcance de la divulgación. Salvo que se indique de otro modo, todas las formas tautoméricas de los compuestos divulgados en este documento están dentro del alcance de la divulgación.

Los compuestos de la divulgación, por ejemplo, fórmula IB o fórmula II, pueden sintetizarse sustancialmente sin impurezas. Los compuestos de la divulgación son más que o igual que aproximadamente un 99 % p/p puros. En determinadas realizaciones, los ésteres fosfonato pueden prepararse a gran escala, por ejemplo, a escala de producción industrial en lugar de a escala experimental/de laboratorio. Por ejemplo, un proceso de tipo discontinuo de acuerdo con los métodos de la divulgación permite la preparación de lotes de al menos 1 g, o al menos 5 g, o al menos 10 g, o al menos 100 g, o al menos 1 kg, o al menos 100 kg de producto de éster fosfonato. Además, los métodos permiten la preparación de un producto de éster fosfonato que tiene una pureza de al menos un 98 %, o al menos un 98,5 %, medida por HPLC. En realizaciones preferidas, estos productos se obtienen en una secuencia de reacción que no implica purificación por cualquier forma de cromatografía (por ejemplo, cromatografía de gases, HPLC, LC preparativa, cromatografía por exclusión de tamaño y similares).

Composiciones farmacéuticas y métodos de tratamiento

Como se expone anteriormente, en este documento se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos de la divulgación (por ejemplo, fórmula IB o fórmula II) o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos de fórmula IB o fórmula II o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona compuestos de fórmula IB o fórmula II formulados como una composición farmacéutica. En una realización, los compuestos de fórmula IB o fórmula II se formulan como un comprimido. En otra realización, los compuestos de fórmula IB o fórmula II se formulan como una suspensión.

Pueden encontrarse técnicas para la formulación y administración de los compuestos divulgados en Remington: the Science and Practice of Pharmacy, 22.a edición, Pharmaceutical Press (2012).

En una realización, los compuestos descritos en este documento, y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, se usan en preparaciones farmacéuticas en combinación con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen rellenos sólidos inertes o diluyentes y soluciones acuosas u orgánicas estériles. Los compuestos estarán presentes en dichas composiciones farmacéuticas en cantidades suficientes para proporcionar la cantidad de dosificación deseada en el intervalo descrito anteriormente.

Los compuestos de la divulgación, por ejemplo, compuestos de fórmula IB o fórmula II o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos descritos en este documento pueden combinarse con un vehículo farmacéuticamente aceptable de acuerdo con técnicas de composición farmacéutica convencionales. Además, el vehículo puede adoptar una amplia diversidad de formas dependiendo de la forma de la preparación deseada para administración, por ejemplo, oral, nasal, rectal, vaginal, parenteral (incluyendo inyecciones o infusiones intravenosas). En la preparación de las composiciones para forma farmacéutica oral puede emplearse cualquiera de los medios farmacéuticos usuales. Los medios farmacéuticos usuales incluyen, por ejemplo, agua, glicoles, aceites, alcoholes, agentes aromatizantes, conservantes, agentes colorantes y similares en el caso de preparaciones líquidas orales (tales como, por ejemplo, suspensiones, soluciones, emulsiones y elixires); aerosoles; o vehículos tales como almidones, glúcidos, celulosa microcristalina, diluyentes, agentes de granulación, lubricantes, aglutinantes, agentes disgregantes y similares, en el caso de preparaciones sólidas orales (tales como, por ejemplo, polvos, cápsulas y comprimidos).

En otra realización, la divulgación proporciona un compuesto de fórmula IB o fórmula II o sales farmacéuticamente aceptables del mismo, para su uso en un método para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de infecciones víricas en un sujeto, por ejemplo, un sujeto inmunodeficiente. En algunas realizaciones, la sal tiene una pureza de igual a o mayor de un 91 % p/p, por ejemplo, tiene menos de o igual a un 9 % p/p de impurezas, para el sujeto.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos de la presente divulgación (por ejemplo, compuestos de fórmula IB o fórmula II) pueden formularse para que tengan cualquier concentración deseada. En algunas realizaciones, la composición se formula de modo que comprenda al menos una cantidad terapéuticamente eficaz.

Las composiciones farmacéuticas incluyen aquellas adecuadas para administración oral, sublingual, nasal, rectal, vaginal, tópica, bucal y parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular e intravenosa), aunque la vía más adecuada dependerá de la naturaleza y gravedad de la afección que se esté tratando. Las composiciones puede presentarse convenientemente en forma farmacéutica unitaria, y prepararse por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de farmacia. En determinadas realizaciones, la composición farmacéutica se formula para administración oral en forma de una pastilla, cápsula, pastilla para chupar o comprimido. En otras realizaciones, la composición farmacéutica está en forma de una suspensión.

Cuando los compuestos de la presente divulgación son administrados como productos farmacéuticos a mamíferos, por ejemplo, seres humanos, pueden administrarse per se o como una composición farmacéutica que contiene, por ejemplo, de aproximadamente un 0,1 % a un 99,9 %, de aproximadamente un 0,2 a un 98 %, de aproximadamente un 0,3 % a un 97 %, de aproximadamente un 0,4 % a un 96 %, o de aproximadamente un 0,5 a un 95 % de ingrediente activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización, una composición farmacéutica que contiene de aproximadamente un 0,5 % a un 90 % de ingrediente activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable es adecuada para su administración a mamíferos, por ejemplo, seres humanos. Algunas realizaciones de la presente divulgación proporcionan una preparación de una composición farmacéutica que comprende de aproximadamente un 0,1 % a un 99,9 %, de aproximadamente un 0,2 a un 98 %, de aproximadamente un 0,3 % a un 97 %, de aproximadamente un 0,4 % a un 96 % o de aproximadamente un 0,5 a un 95 % de los compuestos de fórmula IB o fórmula II o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, por ejemplo, uno cualquiera de los compuestos de la tabla 7 o sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, para su uso en el tratamiento, prevención o profilaxis de infecciones víricas o trastornos asociados con infecciones víricas. La presente divulgación proporciona el uso de aproximadamente un 0,1 % a un 99,9 %, de aproximadamente un 0,2 a un 98 %, de aproximadamente un 0,3 % a un 97 %, de aproximadamente un 0,4 % a un 96 % o de aproximadamente un 0,5 a un 95 % de los compuestos de fórmula IB o fórmula II o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos para la fabricación de un medicamento que contiene cantidades eficaces del compuesto para su uso en el tratamiento, prevención o profilaxis de infecciones víricas y enfermedades asociadas con infecciones víricas.

La presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula IB o fórmula II para su uso en el tratamiento de una infección vírica o una enfermedad o trastorno asociado con infección vírica. Los compuestos pueden estar en una formulación farmacéutica que comprende de aproximadamente un 0,1 % a un 99,9 %, de aproximadamente un 0,2 a un 98 %, de aproximadamente un 0,3 % a un 97 %, de aproximadamente un 0,4 % a un 96 % o de aproximadamente un 0,5 a un 95 % de los compuestos de fórmula IB o fórmula II.

Para cualquier compuesto, la cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto o composición puede estimarse inicialmente en ensayos de cultivo celular, por ejemplo, de células neoplásicas, o en modelos animales, habitualmente ratas, ratones, conejos, perros o cerdos. El modelo animal también puede usarse para determinar el intervalo de concentración y la vía de administración apropiados. Dicha información entonces puede usarse para determinar las dosis y rutas útiles para administración en seres humanos. La eficacia terapéutica/profiláctica y la toxicidad pueden determinarse por procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, la DE⁵⁰(la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población) y la DL⁵⁰(la dosis letal para el 50 % de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación de DL⁵⁰/DE⁵⁰. Se prefieren composiciones farmacéuticas que muestran índices terapéuticos grandes. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma farmacéutica empleada, la sensibilidad del paciente y la vía de administración.

Las composiciones farmacéuticas que contienen compuestos de fórmula IB o fórmula II de la presente divulgación pueden fabricarse de una manera que es conocida en general, por ejemplo, por medio de procesos convencionales de mezcla, disolución, granulación, fabricación de grageas, levigación, emulsión, encapsulación, inclusión o liofilización. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse de manera convencional usando uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables que comprenden excipientes y/o auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. La formulación apropiada depende de la vía de administración elegida.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación improvisada de soluciones inyectables estériles o dispersión. Para administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser líquida en la medida que sea fácil de inyectar. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe estar conservada contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. Se puede mantener la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede conseguirse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, glúcidos, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede lograr incluyendo en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. En general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, métodos de preparación son secado al vacío y liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución previamente filtrada a esterilidad del mismo.

Las composiciones orales en general incluyen un diluyente inerte o un vehículo farmacéuticamente aceptable comestible. Se confinan en cápsulas de gelatina o se comprimen en comprimidos. Con fines de administración terapéutica oral, al compuesto activo se le pueden incorporar excipientes y usarse en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas. Las composiciones orales también pueden prepararse usando un vehículo líquido para su uso como colutorio, en las que el compuesto en el vehículo líquido se aplica por vía oral y se remueve enjuagando y se expectora o se traga. Pueden incluirse agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles y/o materiales adyuvantes como parte de la composición. Los comprimidos, pastillas, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente disgregante tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un emoliente tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo o aromatizante de naranja.

Los compuestos activos pueden prepararse con vehículos farmacéuticamente aceptables que protegeran el compuesto contra la rápida eliminación del organismo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres y poli(ácido láctico). Los métodos para la preparación de dichas formulaciones serán evidentes para los expertos en la materia. En algunas realizaciones, los materiales también pueden obtenerse en el mercado, por ejemplo, de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. También pueden usarse suspensiones liposómicas (que incluyen liposomas dirigidos a las células infectadas, con anticuerpos monoclonales contra antígenos víricos) como vehículos farmacéuticamente aceptables.

Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en una forma farmacéutica unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación. La forma farmacéutica unitaria, como se usa en este documento, se refiere a unidades físicamente diferenciadas adecuadas como dosis unitarias para el sujeto a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas farmacéuticas unitarias de la divulgación están dictaminadas por y dependen directamente de las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a conseguir.

Los compuestos de fórmula IB o fórmula II o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos pueden formularse como una composición farmacéutica. Además, la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula IB o fórmula II, o una composición que comprende un compuesto de fórmula IB o fórmula II para su uso en el tratamiento de una infección vírica o una enfermedad o trastorno asociado con infección vírica. La composición puede formularse como un comprimido o suspensión. Los comprimidos de los compuestos de fórmula IB o fórmula II o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos se formulan comprendiendo tampones, excipientes, vehículos, incluyendo emulsionantes, potenciadores (por ejemplo, potenciadores de la absorción), disgregantes (por ejemplo, polivinilpolipirrolidona (polivinilpolipirrolidona, PVPP, crospovidona, crospolividona o E1202), que es una modificación altamente reticulada de polivinilpirrolidona (PVP)) y/o polímeros farmacológicamente aceptables divulgados en la presente divulgación y bien conocidos en la técnica.

En una realización, la presente divulgación proporciona la formulación en comprimido de los compuestos de fórmula IB o fórmula II o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos para su uso en tratamiento, tratamiento profiláctico o prevención de infecciones víricas y/o enfermedades o trastornos asociados con infecciones víricas. La presente divulgación proporciona la formulación en comprimido de los compuestos de fórmula IB o fórmula II o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos para su uso en el tratamiento de sujetos que necesitan dicho tratamiento incluyendo, aunque sin limitación, sujetos inmunodeficientes, o sujetos antes o después del trasplante de órganos y/o tejidos.

En una realización, la presente divulgación proporciona formulaciones en suspensión de los compuestos de fórmula IB o fórmula II o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos para su uso en tratamiento profiláctico o prevención de infecciones víricas y/o enfermedades y/o trastornos asociados con infecciones víricas. La presente divulgación proporciona la formulación en suspensión de los compuestos de fórmula IB o fórmula II o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos para su uso en el tratamiento de sujetos que necesitan dicho tratamiento incluyendo, aunque sin limitación, sujetos inmunodeficientes, o sujetos antes o después del trasplante de órganos y/o tejidos.

En otra realización, excipientes adicionales incluyen, aunque sin limitación, fosfato de sodio, ácido cítrico dibásico (monohidrato) (aproximadamente un 0,01-5 % en peso), citrato de sodio (aproximadamente un 0,01-5 % en peso), goma xantana (aproximadamente un 0,01-5 % en peso), metilparabeno (sal de sodio) (aproximadamente un 0,01-5 % en peso), propilparabeno (sal de sodio) (aproximadamente un 0,01-5 % en peso), sucralosa (aproximadamente un 0,01-5 % en peso), celulosa microcristalina y carboximetilcelulosa de sodio (VivaPur MCG 591) (aproximadamente un 0,5-10 % en peso), jarabe de maíz de alto contenido de fructosa (aproximadamente un 10-70 % en peso), aroma de lima-limón (WONF220J15) (aproximadamente un 0,01-5 % en peso), gránulos de hidróxido de sodio, hidróxido de sodio/ácido clorhídrico y agua purificada (aproximadamente un 68,93 % en peso).

En otra realización, la presente divulgación proporciona composiciones (por ejemplo, composiciones farmacéuticas) con características farmacocinéticas deseables. Por ejemplo, las composiciones de la divulgación pueden proporcionar un nivel en sangre de los compuestos de fórmula IB o fórmula II o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos que, después del metabolismo en la forma terapéuticamente activa (por ejemplo, el equivalente difosfato), provoca niveles en sangre del metabolito que no inducen toxicidad.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto descrito en este documento (por ejemplo, compuesto 1, 2, 3, 4, 5, 6, 71, 77, 76, 107, 111, 126, 133, 137, 139, 141, 143 o 145, o una sal, solvato, enantiómero, diastereoisómero, racemato o mezcla farmacéuticamente aceptable de los mismos, o cualquier combinación de los mismos).

Enfermedades

En este documento se divulga un método de tratamiento de una infección vírica o una enfermedad o trastorno asociado con infección vírica, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita un compuesto de la divulgación (por ejemplo, compuesto 1, 2, 3, 4, 5, 6, 71, 77, 76, 107, 111, 126, 133, 137, 139, 141, 143 o 145, o una sal, solvato, enantiómero, diastereoisómero, racemato o mezcla farmacéuticamente aceptable de los mismos, o cualquier combinación de los mismos).

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un compuesto de la divulgación (por ejemplo, compuesto 1, 2, 3, 4, 5, 6, 71, 77, 76, 107, 111, 126, 133, 137, 139, 141, 143 o 145, o una sal, solvato, enantiómero, diastereoisómero, racemato o mezcla farmacéuticamente aceptable de los mismos, o cualquier combinación de los mismos) para su uso en el tratamiento de una enfermedad (por ejemplo, una infección vírica o una enfermedad o trastorno asociado con infección vírica).

En este documento se divulga el tratamiento y/o prevención de una infección vírica con los compuestos divulgados en este documento y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Los compuestos representados por la fórmula IB o fórmula II se usan en el tratamiento, prevención y/o fabricación de un medicamento para tratar y/o prevenir al menos un virus seleccionado de, aunque sin limitación, virus de ARNmc. En algunas realizaciones, el virus puede ser un norovirus, citomegalovirus humano (HCMV), virus BK (BKV), virus de Epstein-Barr (EBV), adenovirus, virus JC (JCV), SV40, virus MC (MCV), virus KI (KIV), virus WU (WUV), virus de la variolovacuna, virus del herpes simple 1 (HSV-1), virus del herpes simple 2 (HSV-2), virus del herpes humano 6 (HHV-6), virus del herpes humano 8 (HHV-8), virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus de la varicela-zóster (VZV), viruela grave, viruela leve, viruela, viruela vacuna, viruela de camélidos, viruela de simios, poliovirus, picornaviridae (por ejemplo, rinovirus), paramyxoviridae (por ejemplo, virus respiratorio sincitial, RSV), virus del Ébola, virus de Marburgo, virus de Epstein-Barr (EBV), virus de la gripe, enterovirus (por ejemplo, EV68 y EV71, virus del papiloma, virus del Nilo Occidental, virus de la fiebre amarilla, virus de la fiebre aftosa, virus de la fiebre del Valle de la Gran Falla y otros flavivirus, arenavirus, bunyavirus, alfavirus e infecciones por virus de la inmunodeficiencia humana (HIV (o VIH por sus siglas en español)), y cualquier combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, la presente divulgación también proporciona un compuesto de fórmula IB o fórmula II para su uso en el tratamiento, prevención o retardo de la aparición de infecciones víricas o enfermedades o trastornos asociados con infecciones víricas (por ejemplo, norovirus, citomegalovirus humano (HCMV), virus BK (BKV), virus de Epstein-Barr (EBV), adenovirus, virus j C (JCV), SV40, virus MC (MCV), virus KI (KIV), virus WU (w Uv ), virus de la variolovacuna, virus del herpes simple 1 (HSV-1), virus del herpes simple 2 (HSV-2), virus del herpes humano 6 (HHV-6), virus del herpes humano 8 (HHV-8), virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus de la varicela-zóster (VZV), viruela grave, viruela leve, viruela, viruela vacuna, viruela de camélidos, viruela de simios, poliovirus, picornaviridae (por ejemplo, rinovirus), paramyxoviridae (por ejemplo, virus respiratorio sincitial, RSV), virus del Ébola, virus de Marburgo, virus de Epstein-Barr (EBV), virus de la gripe, enterovirus (por ejemplo, EV68 y EV71, virus del papiloma, virus del Nilo Occidental, virus de la fiebre amarilla, virus de la fiebre aftosa, virus de la fiebre del Valle de la Gran Falla y otros flavivirus, arenavirus, bunyavirus, alfavirus e infecciones por virus de la inmunodeficiencia humana (HIV (o VIH por sus siglas en español)), y cualquier combinación de los mismos) administrando por vía oral a un sujeto una composición farmacéutica que comprende una dosis terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula IB o fórmula II o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en combinación con uno o más de un compuesto o composición seleccionado de un agente inmunodepresor y/o un agente antivírico.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula IB o fórmula II para su uso en el tratamiento, prevención o retardo de la aparición de infección por virus de Marburgo o enfermedad o trastorno asociado con infección por virus de Marburgo, por administración oral a un sujeto que lo necesita.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula IB o fórmula II para su uso en el tratamiento, prevención o retardo de la aparición de infección por virus del Ébola o enfermedad o trastorno asociado con infección por virus del Ébola, por administración oral a un sujeto que lo necesita.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula IB o fórmula II para su uso en el tratamiento, prevención o retardo de la aparición de infección por virus de la gripe o enfermedad o trastorno asociado con infección por virus de la gripe, por administración oral a un sujeto que lo necesita.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula IB o fórmula II para su uso en el tratamiento, prevención o retardo de la aparición de infección por norovirus o enfermedad o trastorno asociado con infección por norovirus, por administración oral a un sujeto que lo necesita.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula IB o fórmula II para su uso en el tratamiento, prevención o retardo de la aparición de infección por virus picornaviridae o enfermedad o trastorno asociado con infección por virus picornaviridae, por administración oral a un sujeto que lo necesita.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula IB o fórmula II para su uso en el tratamiento, prevención o retardo de la aparición de infección por virus paramyxoviridae o enfermedad o trastorno asociado con infección por virus paramyxoviridae, por administración oral a un sujeto que lo necesita.

En algunas realizaciones, la presente divulgación proporciona un compuesto de fórmula IB o fórmula II para su uso en el tratamiento, prevención o retardo de la aparición de infección por enterovirus o enfermedad o trastorno asociado con infección por enterovirus, por administración oral a un sujeto que lo necesita.

En cualquiera de las realizaciones anteriores, el compuesto puede ser compuesto 1.

La presente divulgación también proporciona un compuesto de fórmula IB o fórmula II (por ejemplo, compuesto 1) para su uso en el tratamiento profiláctico, prevención o retardo de la aparición de infección por norovirus o una enfermedad o trastorno asociado con infección por norovirus, administrando por vía oral a un sujeto una composición farmacéutica que comprende una dosis terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula IB o fórmula II o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en combinación con uno o más agentes antivíricos.

La presente divulgación también proporciona un compuesto de fórmula IB o fórmula II para su uso en el tratamiento profiláctico, prevención o retardo de la aparición de infección por enterovirus o una enfermedad o trastorno asociado con infección por enterovirus, administrando por vía oral a un sujeto una composición farmacéutica que comprende una dosis terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula IB o fórmula II o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en combinación con uno o más agentes antivíricos.

En una de las realizaciones, los compuestos de fórmula IB o fórmula II se usan para tratar norovirus. En otra realizaciones, los compuestos de fórmula IB o fórmula II se usan para tratar norovirus asociado con genotipos específicos tales como los de los genogrupos I, II y IV, VI y VII que se sabe que infectan a seres humanos (Phan et al., J. Med. Virol. 2007 septiembre; 79(9): 1388-1400).

Pautas posológicas

La pauta de administración puede lograr lo que constituye una cantidad farmacéuticamente eficaz. Los compuestos de fórmula IB o fórmula II o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos pueden administrarse al sujeto antes o después de la aparición de una enfermedad. Además, pueden administrarse varias dosificaciones divididas, así como dosificaciones escalonadas diaria o secuencialmente, o la dosis puede infundirse de forma continua, o puede ser una inyección en embolada. Además, las dosificaciones pueden aumentarse o disminuirse proporcionalmente según indiquen las exigencias de la situación terapéutica o profiláctica. Además, las dosificaciones pueden coadministrarse en combinación con otro antivírico.

La pauta posológica que utiliza los compuestos también puede seleccionarse de acuerdo con una diversidad de factores que incluyen el tipo, la especie, la edad, el peso, el sexo y el estado clínico del paciente; la gravedad de la afección a tratar; la vía de administración; la función renal y hepática del paciente; y el compuesto particular o sal del mismo empleado. Un médico o veterinario experto en la materia puede determinar fácilmente y prescribir la cantidad eficaz del fármaco requerida para prevenir, contrarrestar o detener el progreso de la afección.

En algunas realizaciones, al sujeto tratado para una infección vírica (por ejemplo, una infección por norovirus o una enfermedad o trastorno asociado con infección por norovirus) se le administra una o dos veces a la semana aproximadamente 40 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 175 mg, 200 mg o 250 mg de un compuesto de fórmula IB o fórmula II o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. La presente divulgación proporciona tratamiento de un sujeto para infección por norovirus o enfermedad o trastorno asociado con infección por norovirus administrando al sujeto una vez a la semana (QW) aproximadamente 200 mg o dos veces a la semana (BIW) aproximadamente 100 mg de un compuesto de fórmula IB o fórmula II, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En una realización, el sujeto se trata dos veces a la semana (BIW) con aproximadamente 100 mg del compuesto. En otra realización, el sujeto se trata una vez a la semana (QW) con aproximadamente 200 mg, o dos veces a la semana (BIW) con aproximadamente 100 mg del compuesto.

En una realización, un compuesto de fórmula IB o fórmula II o sal farmacéuticamente aceptable del mismo que tiene una pureza igual a o mayor de aproximadamente un 91 % se administra por vía oral a un sujeto, por ejemplo, a una dosificación de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg o más, por ejemplo, hasta 100 mg/kg, o hasta 400 mg/kg, o hasta 1000 mg/kg.

En otra realización, un compuesto de fórmula IB o fórmula II o sal farmacéuticamente aceptable del mismo que tiene una pureza igual o mayor de aproximadamente un 91 % p/p se administra a un sujeto a una dosificación de aproximadamente 0,01 mg/kg, 0,05 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 3,5 mg/kg, 4 mg/kg, 4,5 mg/kg, 5 mg/kg, 5,5 mg/kg, 6 mg/kg, 6,5 mg/kg, 7 mg/kg, 7,5 mg/kg, 8 mg/kg, 8,5 mg/kg, 9 mg/kg, 9,5 mg/kg o 10 mg/kg o más o cualquier intervalo en las mismas.

En un aspecto preferido, la enfermedad o afección a tratar es infección vírica.

La dosificación y administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes del uno o más agentes activos o para mantener el efecto deseado. Factores que pueden tenerse en cuenta incluyen la gravedad del estado patológico, la salud general del sujeto, la edad, peso y género del sujeto, la dieta, el tiempo y frecuencia de administración, la o las combinaciones de fármacos, las sensibilidades a reacción y la tolerancia/respuesta al tratamiento. Pueden administrarse composiciones farmacéuticas de acción prolongada cada 3 a 4 días, cada semana, una vez cada dos semanas o mensualmente dependiendo de la semivida y la tasa de eliminación de la formulación particular.

En algunas realizaciones, la administración continúa para un total de diez dosis. Por ejemplo, los compuestos de fórmula IB o fórmula II pueden administrarse a dosificaciones de aproximadamente 100 mg dos veces a la semana durante cinco semanas (es decir, un total de diez dosis). Como alternativa, los compuestos de fórmula IB o fórmula II pueden administrarse con una dosis de carga de aproximadamente 200 mg seguida de dosis de aproximadamente 100 mg que continúan dos veces a la semana. En algunas realizaciones, la administración continúa para un total de diez dosis. Por ejemplo, los compuestos de fórmula IB o fórmula II pueden administrarse a una dosis de carga de aproximadamente 200 mg seguida de nueve dosis adicionales de aproximadamente 100 mg dos veces a la semana para un total de diez dosis. En una de las realizaciones, los compuestos de fórmula IB o fórmula II pueden dosificarse diariamente en el intervalo de aproximadamente 20-200 mg/día o semanalmente en el intervalo de aproximadamente 200 mg-3000 mg.

En una o más realizaciones, los compuestos de la divulgación son útiles en el tratamiento de una infección vírica tal como una infección por norovirus o una enfermedad o trastorno asociado con infección por norovirus. En algunas realizaciones, el tratamiento de la infección, por ejemplo, infección por norovirus, puede comprender dosificación diaria, o dosificación múltiples veces al día. En algunas realizaciones, la pauta de tratamiento total dura solamente mientras la infección por norovirus esté activa (por ejemplo, entre 1-3 días). En algunas realizaciones, los compuestos de la divulgación pueden dosificarse múltiples veces al día durante 1-3 días para tratar una infección por norovirus.

En otra realización, los comprimidos o suspensiones de los compuestos de fórmula IB o fórmula II o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos se administran a una dosis de aproximadamente 40-3000 mg al día, BID, TID, una vez a la semana (QW) o dos veces a la semana (BIW). En otra realización, los comprimidos o suspensiones de los compuestos de fórmula IB o fórmula II o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos se administran a una dosis de aproximadamente 40-400 mg al día, BID, TID, una vez a la semana (QW) o dos veces a la semana (BIW).

En aplicaciones terapéuticas, las dosificaciones de las composiciones farmacéuticas divulgadas en este documento varían dependiendo del agente, la edad, el peso y el estado clínico del paciente destinatario, y la experiencia y criterio del médico o facultativo que administra el tratamiento, entro otros factores que afectan a la dosificación seleccionada. Las dosificaciones pueden variar de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg. En aspectos preferidos, las dosificaciones pueden variar de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. En un aspecto, la dosis estará en el intervalo de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 1 g; de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 500 mg; de aproximadamente 20 mg a aproximadamente 400 mg; de aproximadamente 40 mg a aproximadamente 400 mg; o de aproximadamente 50 mg a aproximadamente 400 mg, en dosis individuales, divididas o continuas (cuya dosis puede ajustarse para el peso del paciente en kg, su área superficial corporal en m2 y su edad en años). En determinadas realizaciones, la cantidad por forma farmacéutica puede ser de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 3000 mg, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 mg, de aproximadamente 0,5 mg, de aproximadamente 1 mg, de aproximadamente 2 mg, de aproximadamente 3 mg, de aproximadamente 4 mg, de aproximadamente 5 mg, de aproximadamente 6 mg, de aproximadamente 7 mg, de aproximadamente 8 mg, de aproximadamente 9 mg, de aproximadamente 10 mg, de aproximadamente 15 mg, de aproximadamente 20 mg, de aproximadamente 25 mg, de aproximadamente 30 mg, de aproximadamente 35 mg, de aproximadamente 40 mg, de aproximadamente 45 mg, de aproximadamente 50 mg, de aproximadamente 55 mg, de aproximadamente 60 mg, de aproximadamente 65 mg, de aproximadamente 70 mg, de aproximadamente 75 mg, de aproximadamente 80 mg, de aproximadamente 85 mg, de aproximadamente 90 mg, de aproximadamente 95 mg , de aproximadamente 100 mg, de aproximadamente 200 mg, de aproximadamente 300 mg, de aproximadamente 400 mg, de aproximadamente 500 mg, de aproximadamente 600 mg, de aproximadamente 700 mg, de aproximadamente 800 mg, de aproximadamente 900 mg, de aproximadamente 1000 mg, de aproximadamente 1250 mg, 1500 mg, de aproximadamente 1750 mg, de aproximadamente 2000 mg, de aproximadamente 2500 mg o de aproximadamente 3000 mg. En una realización, la cantidad puede ser de aproximadamente 20 mg. En una realización, la cantidad puede ser de aproximadamente 50 mg. En otra realización, la dosificación puede ser de aproximadamente 100 mg. En otra realización, la dosis puede ser de 500 mg.

En otra realización, los compuestos de fórmula IB o fórmula II o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos se administran a un sujeto como una sola dosis. En otra realización, los compuestos de fórmula IB o fórmula II o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos se administran a un sujeto en múltiples dosis. Pueden administrarse múltiples dosis de manera regular, por ejemplo, una vez cada 12 horas, una vez al día, cada 2 días, cada 3 días, cada 4 días, cada 5 días, cada 6 días, cada 7 días, cada 8 días, cada 9 días, cada 10 días, cada 11 días, cada 12 días, cada 13 días, cada 14 días o cada 15 días. Por ejemplo, las dosis pueden administrarse dos veces a la semana. Además, cada dosis individual puede administrarse con la misma dosificación o una diferente.

Por ejemplo, a un sujeto se le puede administrar uno cualquiera de los compuestos de fórmula IB o fórmula II o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos con una primera dosis de aproximadamente 1-20 mg/kg (por ejemplo, aproximadamente 1 -1,1 mg/kg, aproximadamente 1,1 -1,2 mg/kg, aproximadamente 1,2 -1,3 mg/kg, aproximadamente 1,3 -1,4 mg/kg, aproximadamente 1,4 -1,5 mg/kg, aproximadamente 1,5 -1,6 mg/kg, aproximadamente 1,6 -1,7 mg/kg, aproximadamente 1.7 - 1,8 mg/kg, aproximadamente 1,8-1,9 mg/kg, aproximadamente 1,9-2,0 mg/kg, aproximadamente 2.0- 2,1 mg/kg, aproximadamente 2 ,1-2 ,2 mg/kg, aproximadamente 2,2-2,3 mg/kg, aproximadamente 2,3-2,4 mg/kg, aproximadamente 2,4-2,5 mg/kg, aproximadamente 2,5-2,6 mg/kg, aproximadamente 2,6-2,7 mg/kg, aproximadamente 2,7-2,8 mg/kg, aproximadamente 2,8-2,9 mg/kg, aproximadamente 2,9-3,0 mg/kg, aproximadamente 3,0-3,1 mg/kg, aproximadamente 3,1-3 ,2 mg/kg, aproximadamente 3,2-3,3 mg/kg, aproximadamente 3,3-3,4 mg/kg, aproximadamente 3,4-3,5 mg/kg, aproximadamente 3,5-3,6 mg/kg, aproximadamente 3,6-3,7 mg/kg, aproximadamente 3,7-3,8 mg/kg, aproximadamente 3.8- 3,9 mg/kg, aproximadamente 3,9-4,0 mg/kg, aproximadamente 4,0-5,0 mg/kg, aproximadamente 5.0- 6,0 mg/kg, aproximadamente 6,0-7,0 mg/kg, aproximadamente 7,0-8,0 mg/kg, aproximadamente 8,0-9,0 mg/kg, aproximadamente 9,0-10,0 mg/kg o aproximadamente 10-20 mg/kg) de uno cualquiera de los compuestos de fórmula IB o fórmula II (o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos) seguido de una o más dosis adicionales a 1-4 mg/kg (por ejemplo, aproximadamente 1 -1,1 mg/kg, aproximadamente 1,1 -1,2 mg/kg, aproximadamente 1,2 -1,3 mg/kg, aproximadamente 1,3 -1,4 mg/kg, aproximadamente 1,4 -1,5 mg/kg, aproximadamente 1.5 - 1,6 mg/kg, aproximadamente 1,6 -1,7 mg/kg, aproximadamente 1,7 -1,8 mg/kg, aproximadamente 1,8-1,9 mg/kg, aproximadamente 1,9-2,0 mg/kg, aproximadamente 2,0-2,1 mg/kg, aproximadamente 2 ,1-2,2 mg/kg, aproximadamente 2,2-2,3 mg/kg, aproximadamente 2,3-2,4 mg/kg, aproximadamente 2,4-2,5 mg/kg, aproximadamente 2,5-2,6 mg/kg, aproximadamente 2,6-2,7 mg/kg, aproximadamente 2,7-2,8 mg/kg, aproximadamente 2,8-2,9 mg/kg, aproximadamente 2,9-3,0 mg/kg, aproximadamente 3,0-3,1 mg/kg, aproximadamente 3,1-3 ,2 mg/kg, aproximadamente 3,2-3,3 mg/kg, aproximadamente 3,3-3,4 mg/kg, aproximadamente 3,4-3,5 mg/kg, aproximadamente 3,5-3,6 mg/kg, aproximadamente 3.6- 3 m,7g/kg, aproximadamente 3,7-3,8 mg/kg, aproximadamente 3,8-3,9 mg/kg o aproximadamente 3,9-4,0 mg/kg) de uno cualquiera de los compuestos de fórmula IB o fórmula II (o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos) en la misma semana o en la siguiente semana. Por ejemplo, a un sujeto se le puede administrar una primera dosis de aproximadamente 3 mg/kg seguida de una o más dosis adicionales a aproximadamente 1 mg/kg. Por ejemplo, a un sujeto se le puede administrar una primera dosis de aproximadamente 2 mg/kg seguida de una o más dosis adicionales a aproximadamente 3 mg/kg. Por ejemplo, a un sujeto se le puede administrar una primera dosis de 4 mg/kg seguida de una o más dosis adicionales a aproximadamente 4 mg/kg.

También pueden administrarse múltiples dosis a intervalos de tiempo variables. Por ejemplo, las primeras 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8 o más dosis pueden administrarse a un intervalo de 6 días seguidas de dosis adicionales administradas a un intervalo de 7 días. Por ejemplo, las primeras 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8 o más dosis pueden administrarse a un intervalo de 7 días seguidas de dosis adicionales administradas a un intervalo de 3 días.

En una realización, los compuestos de fórmula IB o fórmula II o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos se administran a un sujeto una vez a la semana a una dosis de aproximadamente 40-3000 mg, o dos veces a la semana a una dosis de aproximadamente 40-3000 mg.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica de la presente divulgación se administra diariamente, BID, TID, una vez a la semana (QW) o dos veces a la semana (BIW) con aproximadamente 40-3000 mg de compuestos de fórmula IB o fórmula II o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación se administran diariamente, BID, TID, una vez a la semana (QW) o dos veces a la semana (BIW) con aproximadamente 40 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 175 mg, 200 mg, 250 mg, 275 mg, 300 mg, 325 mg, 350 mg, 375 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg, 500-600 mg, 600-700 mg, 700-800 mg, 800-900 mg o 900-1000 mg, o dos veces a la semana (BIW) con aproximadamente 40 mg, 50 mg, 75 mg, 100 mg, 150 mg, 175 mg, 200 mg, 250 mg, 275 mg, 300 mg, 325 mg, 350 mg, 375 mg o 400 mg, 450 mg, 500 mg, 500-600 mg, 600-700 mg, 700-800 mg, 800 900 mg o 900-1000 mg de compuestos de fórmula I, fórmula IA, fórmula IB o fórmula II o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

La presente divulgación proporciona compuestos de fórmula IB o fórmula II administrados a una dosis de aproximadamente 1-100 mg/kg (por ejemplo, 10-20 mg/kg, 20-50 mg/kg, 50-75 mg/kg, 75-100 mg/kg).

Vías de administración

Los compuestos de la presente divulgación, o sales, ésteres o derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos, pueden administrarse por vía oral, nasal, intranasal, transdérmica, pulmonar, por inhalación, por vía yugal, sublingual, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intravenosa, rectal, intrapleural, intratecal y parenteral. En una realización, el compuesto se administra por vía oral. Un experto en la materia reconocerá las ventajas de determinadas vías de administración.

Las formas farmacéuticas para administración tópica o transdérmica de un compuesto de esta divulgación incluyen polvos, pulverizados, pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. En una realización, el compuesto activo se mezcla en condiciones estériles con un vehículo farmacéuticamente aceptable, y con cualquier conservante, tampón o propulsor que se requiera.

Para su administración por inhalación, los compuestos se administran en forma de una pulverización de aerosol desde un recipiente o dosificador presurizado, que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.

La administración sistémica también puede ser por medios transmucosos o transdérmicos. Para administración transmucosa o transdérmica, se usan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera a penetrar. Dichos penetrantes en general son conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosa puede conseguirse a través del uso de pulverizadores nasales o supositorios. Para administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en pomadas, bálsamos, geles o cremas como se conoce en general en la técnica.

Una composición farmacéutica de la divulgación se formula para que sea compatible con su vía de administración pretendida. Ejemplos de vías de administración incluyen administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (tópica) y transmucosa. Las soluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminatetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH pude ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede confinarse en ampollas, jeringas desechables o viales multidosis hechos de vidrio o plástico.

Politerapia

La presente divulgación proporciona métodos para prevenir o tratar una infección vírica en un sujeto (por ejemplo, una infección por norovirus). Los métodos comprenden administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto descrito en este documento. Los compuestos pueden usarse en una pauta de monoterapia o de politerapia.

Como se usa en este documento, "monoterapia" significa o se refiere a la administración de un solo compuesto activo o terapéutico (por ejemplo, un compuesto de fórmula IB o fórmula II) a un sujeto que lo necesita. Preferiblemente, la monoterapia implicará la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto activo. Por ejemplo, la monoterapia contra norovirus con uno de los compuestos de la presente divulgación, o una sal, profármaco, metabolito, análogo o derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, a un sujeto que necesita tratamiento contra norovirus. La monoterapia puede ser opuesta a la politerapia, en que se administra una combinación de múltiples compuestos activos, preferiblemente con cada componente de la combinación presente en una cantidad terapéuticamente eficaz. En un aspecto, la monoterapia con un compuesto de la presente divulgación, o una sal, profármaco, metabolito, polimorfo o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, es más eficaz que la politerapia para inducir un efecto biológico deseado.

Como se usa en este documento, "politerapia" o "tratamiento conjunto" incluye la administración de un compuesto de la presente divulgación, o una sal, profármaco, metabolito, polimorfo o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, y al menos un segundo agente como parte de una pauta de tratamiento específica destinada a proporcionar el efecto beneficioso de la acción conjunta de estos agentes terapéuticos. El efecto beneficioso de la combinación incluye, aunque sin limitación, acción conjunta farmacocinética o farmacodinámica de la combinación de agentes terapéuticos. La administración de estos agentes terapéuticos en combinación típicamente se realiza durante un periodo de tiempo definido (habitualmente minutos, horas, días o semanas dependiendo de la combinación seleccionada). La "politerapia" puede pretender, pero en general no lo hace, abarcar la administración de dos o más de estos agentes terapéuticos como parte de pautas de monoterapia separadas que provocan de manera accidental y arbitraria las combinaciones de la presente divulgación.

La "politerapia" pretende abarcar la administración de estos agentes terapéuticos de una manera secuencial, en la que cada agente terapéutico se administran en un momento diferente, así como la administración de estos agentes terapéuticos, o al menos dos de los agentes terapéuticos, de una manera sustancialmente simultánea. La administración sustancialmente simultánea puede conseguirse, por ejemplo, administrando al sujeto una sola cápsula que tiene una relación fija de cada agente terapéutico o en múltiples cápsulas individuales para cada uno de los agentes terapéuticos. La administración secuencial o sustancialmente simultánea de cada agente terapéutico puede lograrse mediante cualquier vía apropiada incluyendo, aunque sin limitación, vías orales, vías intravenosas, vías intramusculares y absorción directa a través de tejidos de membrana mucosa. Los agentes terapéuticos pueden administrarse por la misma vía o por diferentes vías. Por ejemplo, un primer agente terapéutico de la combinación seleccionada puede administrarse por inyección intravenosa mientras que los otros agentes terapéuticos de la combinación pueden administrarse por vía oral. Como alternativa, por ejemplo, todos los agentes terapéuticos pueden administrarse por vía oral o todos los agentes terapéuticos pueden administrarse por inyección intravenosa. La secuencia en que se administran los agentes terapéuticos no es estrictamente crucial.

"Politerapia" también abarca la administración de los agentes terapéuticos como se describe anteriormente en combinación adicional con otros ingredientes biológicamente activos y tratamientos sin fármacos. Cuando la politerapia comprende además un tratamiento sin fármacos, el tratamiento sin fármacos puede realizarse en cualquier momento adecuado siembre que se consiga un efecto beneficioso de la acción conjunta de la combinación de los agentes terapéuticos y el tratamiento sin fármacos. Por ejemplo, en casos apropiados, el efecto beneficioso aún se consigue cuando el tratamiento sin fármacos se elimina temporalmente de la administración de los agentes terapéuticos, quizás por días o incluso semanas.

La presente divulgación también proporciona un compuesto de fórmula IB o fórmula II para su uso en el tratamiento, prevención o retardo de la aparición de una infección vírica (por ejemplo, infección vírica por norovirus o enfermedad o trastorno asociado con infección vírica por norovirus; infección por virus de la gripe o enfermedad o afección asociada con infección por virus de la gripe), por administración oral a un sujeto que lo necesita de una composición farmacéutica de una dosis terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula IB o fórmula II o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en combinación con uno o más agentes antivíricos.

La presente divulgación también proporciona un compuesto de fórmula IB o fórmula II para su uso en el tratamiento, prevención o retardo de la aparición de una infección vírica por picornaviridae o enfermedad o trastorno asociado con infección vírica por picornaviridae, por administración oral a un sujeto que lo necesita de una composición farmacéutica de una dosis terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula IB o fórmula II o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en combinación con uno o más agentes antivíricos.

La presente divulgación también proporciona un compuesto de fórmula IB o fórmula II para su uso en el tratamiento, prevención o retardo de la aparición de una infección vírica por paramyxoviridae o enfermedad o trastorno asociado con infección vírica por paramyxoviridae, por administración oral a un sujeto que los necesita de una dosis terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula IB o fórmula II o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en combinación con uno o más agentes antivíricos.

En una realización, el método de tratamiento de una infección vírica, por ejemplo, infección por virus de la gripe o norovirus, comprende además administrar al menos un agente antivírico adicional. En una realización, el compuesto de fórmula II puede ser para su uso en combinación con un agente antivírico adicional. En una realización, el agente antivírico adicional es un adamantano. En una realización adicional, el agente antivírico adicional es amantadina o rimantadina. En otra realización, el agente antivírico adicional es un inhibidor de neuraminidasa (por ejemplo, oseltamivir, zanamivir, laninamivir y peramivir). En una realización adicional, el agente antivírico adicional es oseltamivir o zanamivir.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica de la presente divulgación (por ejemplo, un compuesto de fórmula IB o fórmula II) se administra en combinación con uno o más compuestos o composiciones seleccionados de midazolam, ciclosporina A, tacrólimus, ganciclovir, valganciclovir, foscavir, cidofovir, fármacos anti-CMV de segunda línea, fármacos anti-HCV de segunda línea, foscarnet, filgrastim, pegfilgrastim, corticoesteroides tales como budesonida, beclometasona e inhibidor de CYP de amplio espectro aminobenzotriazol o combinaciones de los mismos.

En realizaciones adicionales, el compuesto es para su administración en combinación con al menos otro agente inmunodepresor. En una realización, el agente inmunodepresor se administra simultánea o secuencialmente. Los agentes inmunodepresores incluyen, aunque sin limitación, daclizumab, basiliximab, tacrólimus, sirólimus, micofenolato, ciclosporina A, glucocorticoesteroides, anticuerpos monoclonales anti-CD3, globulina antitimocito, anticuerpos monoclonales anti-CD52, azatioprina, everólimus, dactinomicina, ciclofosfamida, platino, nitrosourea, metotrexato, mercaptopurina, muromonab, IFN gamma, infliximab, etanercept, adalimumab, natalizumab, fingolimod y combinaciones de los mismos.

Los compuestos o composiciones proporcionados en este documento también pueden usarse en combinación con un agente potenciador, con otros ingredientes activos, o con un agente inmunodepresor. En determinadas realizaciones, los compuestos pueden administrarse en combinación, o secuencialmente, con otro agente terapéutico o un potenciador. Dichos otros agentes terapéuticos incluyen los conocidos para el tratamiento, prevención o mejora de uno o más síntomas asociados con infecciones víricas. Debe entenderse que cualquier combinación adecuada de los compuestos proporcionados en este documento con uno o más de los compuestos mencionados anteriormente y opcionalmente una o más sustancias farmacológicamente activas adicionales se considera dentro del alcance de la presente divulgación. En otra realización, el compuesto proporcionado en este documento se administra antes o después del uno o más ingredientes activos adicionales. En una realización, dos o más de los agentes antivíricos divulgados en este documento se administran en serie o en combinación. La cantidad de algunos potenciadores puede seleccionarse usando métodos conocidos en la técnica para potenciar la biodisponibilidad del agente antivírico. Puede usarse cualquier cantidad que proporcione una respuesta deseada por algunos potenciadores. Las dosificaciones pueden variar, en un ejemplo no limitante, de 0,001 mg a aproximadamente 3000 mg de compuesto por kilogramo de peso corporal por día, por ejemplo, de 0,01 a 500 mg/kg, o por ejemplo, 0,1-20 mg/kg.

El comportamiento farmacocinético de una composición variará algo de un sujeto a otro dentro de una población. Los números descritos anteriormente para las composiciones divulgadas en este documento se basan en el comportamiento promedio en una población. La presente divulgación pretende abarcar composiciones que de promedio estén dentro de los intervalos divulgados, aunque se entiende que determinados sujetos pueden estar fuera de los intervalos.

Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse en un recipiente, envase o dosificador junto con instrucciones para su administración. La presente divulgación proporciona un kit que incluye, además de una composición farmacéutica de uno cualquiera de los compuestos divulgados, un recipiente, envase o dosificador con instrucciones para su administración.

Un compuesto de la presente divulgación, o una sal, profármaco, metabolito, análogo o derivado farmacéuticamente aceptable del mismo, puede administrarse en combinación con un segundo compuesto antivírico. Por ejemplo, como se indica anteriormente, las composiciones de la presente divulgación pueden incluir los compuestos como se describen anteriormente en combinación con uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3) agentes activos adicionales tal como se describe en esta sección, de manera análoga a como se conoce en la técnica. Los agentes activos antivíricos adicionales que pueden usarse con los compuestos de la presente divulgación en la realización de los presentes métodos incluyen, aunque sin limitación, los que están dirigidos al canales de iones M2 en virus de la gripe A (por ejemplo, los adamantanos, tales como amantadina y rimantadina); los que inhiben la pérdida de cubierta vírica después de la entrada en la célula, agentes que bloquean la liberación de los viriones recién formados desde la superficie de células infectadas (por ejemplo, los inhibidores de neuraminidasa, tales como oseltamivir y zanamivir). Métodos para preven ir enfermedades o trastornos debidos a reactivación del virus.

En este documento también se divulga un método de prevención de una enfermedad o trastorno en un sujeto en riesgo de reactivación de infección vírica, administrando por vía oral al sujeto una composición farmacéutica de una dosis terapéuticamente eficaz de un compuesto de fórmula IB o fórmula II o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunas realizaciones, el virus en riesgo de reactivación puede ser virus de la gripe, norovirus, EBV, virus del Ébola, picornaviridae, paramyxoviridae y virus de Marburgo. En algunas realizaciones preferidas, el virus en riesgo de reactivación puede ser el virus de la gripe.

Efecto de los alimentos

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica de las presentes realizaciones, por ejemplo, comprimido o suspensión, puede proporcionarse a un sujeto cuando el sujeto está en ayunas o en estado nutrido. En una realización, la composición que comprende un compuesto de fórmula IB o fórmula II (o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo) puede proporcionarse a un sujeto que tiene el estómago vacío, por ejemplo, después de ayudar durante menos de 24 horas, pero más de 12 horas, más de 11 horas, más de 10 horas, más de 8 horas o más de 5 horas.

En otras realizaciones, la composición que comprende un compuesto de fórmula IB o fórmula II (o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo) puede proporcionarse a un sujeto con alimento o después de haber tomado alimento. En una realización, un compuesto de fórmula I, fórmula IA, fórmula IB o fórmula II (o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo) puede tomarlo un sujeto con el estómago vacío.

Población de pacientes

En determinadas realizaciones, los compuestos de fórmula IB o fórmula II (o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos), una composición que comprende un compuesto de fórmula IB o fórmula II, o una politerapia que comprende una composición de fórmula IB o fórmula II se administra a un mamífero que lo necesita (por ejemplo, un ser humano) que es de aproximadamente 1 a 6 meses de edad, de 6 a 12 meses de edad, de 1 a 5 años de edad, de 5 a 10 años de edad, de 10 a 15 años de edad, de 15 a 20 años de edad, de 20 a 25 años de edad, de 25 a 30 años de edad, de 30 a 35 años de edad, de 35 a 40 años de edad, de 40 a 45 años de edad, de 45 a 50 años de edad, de 50 a 55 años de edad, de 55 a 60 años de edad, de 60 a 65 años de edad, de 65 a 70 años de edad, de 70 a 75 años de edad, de 75 a 80 años de edad, de 80 a 85 años de edad, de 85 a 90 años de edad, de 90 a 95 años de edad o de 95 a 100 años de edad. En algunas realizaciones, el mamífero padece una infección vírica (por ejemplo, una infección por virus de ARNmc tal como una infección por norovirus).

En determinadas realizaciones, un compuesto de fórmula IB o fórmula II, una composición que comprende un compuesto de fórmula IB o fórmula II, o una politerapia que comprende un compuesto de fórmula IB o fórmula II se administra a un ser humano en riesgo de desarrollar una infección vírica. En determinadas realizaciones, un compuesto de fórmula IB o fórmula II, una composición que comprende un compuesto de fórmula IB o fórmula II, o una politerapia que comprende un compuesto de fórmula IB o fórmula II se administra a un ser humano con una infección vírica. En determinadas realizaciones, el paciente es un ser humano de aproximadamente 1 a 6 meses de edad, de 6 a 12 meses de edad, de 1 a 5 años de edad, de 5 a 10 años de edad, de 5 a 12 años de edad, de 10 a 15 años de edad, de 15 a 20 años de edad, de 13 a 19 años de edad, de 20 a 25 años de edad, de 25 a 30 años de edad, de 20 a 65 años de edad, de 30 a 35 años de edad, de 35 a 40 años de edad, de 40 a 45 años de edad, de 45 a 50 años de edad, de 50 a 55 años de edad, de 55 a 60 años de edad, de 60 a 65 años de edad, de 65 a 70 años de edad, de 70 a 75 años de edad, de 75 a 80 años de edad, de 80 a 85 años de edad, de 85 a 90 años de edad, de 90 a 95 años de edad o de 95 a 100 años de edad.

En algunas realizaciones, un compuesto de fórmula IB o fórmula II, una composición que comprende un compuesto de fórmula IB o fórmula II, o una politerapia que comprende un compuesto de fórmula IB o fórmula II se administra a un lactante humano. En otras realizaciones, un compuesto de fórmula IB o fórmula II, o una politerapia que comprende un compuesto de fórmula IB o fórmula II se administra a un niño humano. En otras realizaciones, un compuesto de fórmula IB o fórmula II, una composición que comprende un compuesto de fórmula IB o fórmula II, o una politerapia que comprende un compuesto de fórmula IB o fórmula II se administra a un adulto humano. En otras realizaciones más, un compuesto de fórmula IB o fórmula II, una composición que comprende un compuesto de fórmula IB o fórmula II, o una politerapia que comprende un compuesto de fórmula IB o fórmula II se administra a un ser humano anciano.

Todos los porcentajes y relaciones usados en este documento, salvo que se indique de otro modo, son en peso. Otros rasgos característicos y ventajas de la presente divulgación son evidentes a partir de los diferentes ejemplos. Los ejemplos proporcionados ilustran diferentes componentes y metodología útiles en la práctica de la presente divulgación. Los ejemplos no limitan la divulgación reivindicada. Basándose en la presente divulgación, los expertos en la materia pueden identificar y emplear otros componentes y metodología útiles para la práctica de la presente divulgación.

En algunas realizaciones, el compuesto de fórmula II es:

o una sal, solvato, enantiómero, diastereoisómero, racemato o mezcla farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunas realizaciones, los compuestos son:

o sales, solvatos, enantiómeros, diastereoisómeros, racematos o mezclas farmacéuticamente aceptables de los mismos (en los que * indica compuestos que no son de acuerdo con la presente invención.

Los diagramas de HPLC se registraron en una columna Zorbax Eclipse Plus C18 (4,6 x 50 mm x 1,8 pm). La primera fase móvil fue un 97,5 % de agua : 2,5 % de acetonitrilo : 0,05 % de ácido trifluoroacético. La segunda fase móvil fue un 97,5 % de acetonitrilo : 2,5 % de agua : 0,05 % de ácido trifluoroacético.

Las RMN de 1H se registraron a 300 MHz salvo que se indique otra cosa.

Ensayos antivíricos y de citotoxicidad

Cultivo de células y cepas de virus: Se prepararon fibroblastos de prepucio humano (HFF) a partir de tejido de prepucio humano. El tejido se incubó en medio de cultivo celular que consistía en medio esencial mínimo (MEM) con sales de Earle complementado con suero bovino fetal (FBS) al 10 %, y concentraciones convencionales de L-glutamina, fungizone y vancomicina. El tejido entonces se puso en solución salina tamponada con fosfato (PBS), se trituró, se aclaró para retirar los glóbulos rojos y se resuspendió en solución de tripsina/EDTA. La suspensión de tejido se incubó a 37 °C y se agitó suavemente para dispersar las células, que después se recogieron por centrifugación. Las células se resuspendieron en un medio y se pusieron en un matraz de histocultivo y se incubaron a 37 °C en una estufa de incubación de CO²humidificada. El medio entonces se remplazó con medio reciente y se controló el crecimiento celular diariamente hasta que se formó una monocapa de células confluyentes. Las células HFF entonces se expandieron a través de pases en serie en medio de crecimiento convencional de MEM con sales de Earle complementado con FBS al 10 %, L-glutamina, penicilina y gentamicina. Las células se pasaron de manera rutinaria y se usaron para ensayos en o por debajo del pase 10.

Virus de la gripe: Los virus de la gripe se pasaron en células de riñón canino para crear soluciones madre de trabajo, que se usaron para los ensayos antivíricos.

Ensayos antivíricos: Cada experimento que evaluó la actividad antivírica de los compuestos incluyó compuestos tanto de control positivo como de control negativo para garantizar el funcionamiento de cada ensayo. Se realizó evaluación simultánea de la citotoxicidad cuando fue posible a niveles equivalentes de exposición al compuesto. Los métodos se presentan en concentraciones eficaces que dan reducciones de un 50 % en la replicación vírica in vitro (CE⁵⁰), concentraciones que producen un 50 % de reducción en la viabilidad celular (CC⁵⁰) y el índice de selectividad (IS, calculado como CC⁵⁰dividida por CE⁵⁰). Cuando había suficiente material disponible, se realizaron múltiples ensayos para cada evaluación de compuesto para obtener datos estadísticos.

Ensayos de citotoxicidad: Cada ensayo antivírico incluyó un ensayo paralelo de citotoxicidad con las mismas células usadas para cada virus, el mismo número de células, las mismas concentraciones de fármaco y los mismos tiempos de incubación para proporcionar la misma exposición al fármaco. Para garantizar que la citotoxicidad de todos los compuestos pudiera compararse directamente, se realizó un ensayo de citotoxicidad de captación de rojo neutro convencional para todos los compuestos en células HFF confluyentes con un periodo de incubación de 7 días.

Ensayos de citotoxicidad de captación de rojo neutro: Cada compuesto se evaluó en un ensayo de citotoxicidad convencional por métodos convencionales. En resumen, se sembraron células HFF en placas de histocultivo en medio de histocultivo convencional. Después de 24 h de incubación, el medio se remplazó con medio de cultivo celular de mantenimiento y se añadieron los compuestos y después se usaron entonces diluciones en serie de factor 5 para generar una serie de concentraciones de compuesto. Las placas de ensayo se incubaron durante 7 días, y se añadió solución de rojo neutro en PBS a cada pocillo y las placas se incubaron durante 1 h. El colorante entonces se retiró, las placas se aclararon con PBS y el tinte internalizado por las células viables se solubilizó en PBS complementado con etanol al 50 % y ácido acético glacial al 1 %. Entonces se determinó la densidad óptica y se interpolaron los valores de CC⁵⁰a partir de los datos experimentales.

Para todos los ensayos de reducción de placas en células HFF, se realizaron ensayos de citotoxicidad de rojo neutro en un conjunto paralelo de placas de 6 pocillos que contenían células HFF no infectadas que recibieron las mismas concentraciones de compuesto que las usadas para los ensayos antivíricos. Las placas de citotoxicidad se retiraron de la estufa de incubación en el mismo día que cada ensayo antivírico y se tiñó la monocapa de células con una solución de rojo neutro en PBS. El tinte entonces se retiró, se aclaró el tinte residual de las células con PBS, y se inspeccionaron las monocapas de células visualmente para cualquier signo de toxicidad. La viabilidad celular se determinó usando un ensayo de proliferación celular de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ensayos de proliferación celular: La inhibición de la proliferación de células HFF se usó para refinar las estimaciones de citotoxicidad para algunos compuestos y se realizó de acuerdo con un procedimiento convencional usado en el laboratorio. Las células se sembraron a una baja densidad en placas usando medio de cultivo convencional. Después de 24 h, se aspiró el medio y se preparó una serie de soluciones de compuesto en el medio de crecimiento. Las placas se incubaron durante 72 h a 37 °C, y las células entonces se desprendieron con tripsina y se contaron. Las concentraciones de compuesto que reducían la proliferación celular en un 50 % se interpolaron de los datos experimentales.

Citotoxicidad en ensayos de linfocitos: La viabilidad celular en todos los ensayos con linfocitos se evaluó con un ensayo de viabilidad celular luminiscente. En resumen, se incubaron placas de ensayo a temperatura ambiente durante 30 min, después se añadió reactivo luminiscente a cada pocillo y las placas se mezclaron para lisar las células. Las placas entonces se incubaron a temperatura ambiente y se cuantificó la luminiscencia en un luminómetro. Se usaron métodos convencionales para calcular las concentraciones de fármaco que inhibían la proliferación de las células en un 50 % (CC⁵⁰).

Ensayo de norovirus de ratón (MNV): Se incubaron células RAW a 37 °C con un 5 % de CO²en medio de cultivo celular. El aislado de norovirus de ratón usado en este ensayo se aisló de un ratón natural.

Se añadieron diluciones en serie de los compuestos de ensayo en DMEM a placas tratadas con histocultivo. Se añadió suspensión celular a las diluciones de compuesto en la placa, y se incubaron a 37 °C con un 5 % de CO²durante 2 días. Cada placa de ensayo incluía controles de células sin infectar y pocillos de control de virus sin tratar. Después de 2 días de incubación, se añadió reactivo MTS acuoso como indica el fabricante en cada pocillo y se incubó a 37 °C hasta que los controles de células sin tratar revelaron una absorbancia a 490 nm entre 1,1 y 1,8. Se leyeron las lecturas de absorbancia finales y se usó un programa informático para calcular la concentración que protegía las células RAW infectadas con MNV en un 50 % en comparación con controles de células sin infectar (CE50).

Ensayos de norovirus humano: La actividad antivírica contra un norovirus (NoV) humano se evaluó en un ensayo de 3 días usando una línea celular de replicón de norovirus humano de expresión estable, mantenida como cultivos subconfluyentes. En algunas realizaciones, pueden usarse 4 dosis (etapas de factor 10 o factor 3), por triplicado. La actividad antivírica se determinó por análisis de hibridación en transferencia de ARN de NoV intracelular (normalizado al nivel de ARN de p-actina celular en cada muestra de cultivo). La citotoxicidad se evaluó por captación de tinte rojo neutro en cultivos mantenidos en placas paralelas (Korba y Gerin, 1992, Antivir. Res. 19:55).

Los valores de CE⁵⁰y CC⁵⁰se calcularon por análisis de regresión lineal usando datos combinados de todos los cultivos tratados (Korba y Gerin, 1992, Antivir. Res. 19:55; Okuse, et al., 2005, Antivir. Res. 65:23). Las desviaciones típicas para los valores de CE⁵⁰y CE⁹⁰se calcularon a partir de los errores típicos generados por los análisis de regresión. La CE⁵⁰y la CE⁹⁰son concentraciones de fármaco a las que se observa un descenso de factor 2 o factor 10 del ARN de NoV intracelular (con respecto a los niveles promedio en cultivos sin tratar), respectivamente. La CC⁵⁰es la concentración de fármaco a la que se observa un nivel 2 veces menor de captación de tinte rojo neutro (con respecto a los niveles promedio en cultivos sin tratar). El índice de selectividad (I.S.) se calcula como CC⁵⁰/CE⁵⁰. Se usa interferón 2b humano recombinante (PBL laboratories, Inc.) como control de ensayo.

CE ⁵⁰ de BKV en células VERO: Se sembraron placas de histocultivo con células Vero en DMEM que contenía suero bovino fetal convencional Hyclone al 2 % y penicilina y estreptomicina Hyclone al 1 %. Las células se inocularon con BKV. Se añadieron diluciones en serie de compuestos de ensayo a las células y las placas se incubaron durante 10 días a 37 °C en un 5 % de CO². Después de la incubación de 10 días, el sobrenadante se mezcló con tampón de lisis. Cada placa se incubó C. Se midió el ADN de BKV del sobrenadante por reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) usando los cebadores directo e inverso de PCR de BKV, y una sonda marcada con FAM. La cuantificación absoluta del número de copias del virus se realizó usando una curva patrón con diluciones de amplicón de ADN de BKV que contenía secuencias homólogas al fragmento amplificado.

Ensayos de reducción de placas para HSV-1, HSV-2, VZV y HCMV: Se prepararon monocapas de células en placas de seis pocillos y se incubaron para permitir que las células alcanzaran la confluencia. Entonces se aspiró el medio de los pocillos y se añadió virus a cada uno de los tres pocillos para producir 20-30 placas en cada pocillo. Se permitió que el virus se adsorbiera en las células durante 1 h y las placas se balancearon suavemente cada 15 min para redistribuir el medio. Los compuestos se diluyeron en medio de cultivo celular de mantenimiento que consiste en MEM con sales de Earle complementado con FBS al 2 %, L-glutamina, penicilina y gentamicina. Las soluciones se añadieron a pocillos duplicados y las placas se incubaron durante diversos tiempos, dependiendo del virus usado. El ensayo de reducción de placas con la cepa F de HSV-1 se realizó de una manera similar, pero con células Vero infectadas un día después de la siembra en placa. Para HSV-1 y 2, las monocapas se tiñeron con violeta de genciana al 1 % en metanol al 20 % y el tinte no unido se retiró por lavado con dH²O. Para ensayos con HCMV y VZV, la monocapa de células se tiñó con solución de rojo neutro al 1 % durante 4 h, después el colorante se aspiró y las células se lavaron con PBS. Para todos los ensayos, se enumeraron las placas usando un estereomicroscopio y la concentración de compuesto que reducía la formación de placas en un 50 % (CE50) se interpoló de los datos experimentales.

Ensayos de reducción de placas para MCMV: Se prepararon fibroblastos de embrión de ratón a partir de embriones de ratón usando un procedimiento similar al resumido anteriormente para células HFF y se suspendieron en medio de histocultivo como se describe anteriormente y se sembraron en placas y se incubaron. El medio se aspiró y las monocapas de células se infectaron con MCMV. Las células infectadas entonces se incubaron a 37 °C durante 1 h y las placas se balancearon ocasionalmente para garantizar que el medio cubría la monocapa completa. Los compuestos se diluyeron en serie en medio de cultivo celular de mantenimiento de tejidos descrito anteriormente y las soluciones se añadieron a las monocapas infectadas. Las monocapas infectadas se incubaron durante 7 días y después se tiñeron con solución de rojo neutro como se describe anteriormente. Las placas se enumeraron y los valores de CE50 se interpolaron de los datos experimentales por métodos convencionales.

Ensayos de cuantificación de ADN para EBV y HHV-6B: Los ensayos para EBV se realizaron en células Akata que se indujeron para que experimentaran una infección lítica con anticuerpo de cabra anti-IgG humana por métodos convencionales. Los compuestos experimentales se diluyeron en placas. Las células Akata se añadieron a las placas y se incubaron. Para HHV-6, los compuestos se diluyeron en serie, después se añadieron células HSB-2 o Molt-3 sin infectar a cada pocillo. La infección se inició añadiendo células H SB-2 infectadas con HHV-6A o células Molt-3 infectadas con HHV-6B, y se incubaron durante 7 días a 37 °C. Para todos los ensayos, se añadió tampón de desnaturalización a cada pocillo para desnaturalizar el ADN y se aspiró una alícuota a través de una membrana de nailon. Entonces se permitió que las membranas se secaran antes de equilibrado en DIG. Se prepararon sondas marcadas con digoxigenina (DIG) específicas para cada virus de acuerdo con el protocolo del fabricante. La detección de la sonda DIG unida específicamente se realizó con anticuerpo anti-DIG usando el protocolo del fabricante. Se capturó una imagen de la película fotográfica y se cuantificó y las concentraciones de compuesto suficientes para reducir la acumulación de ADN vírico en un 50 % (CE50) se interpolaron de los datos experimentales.

Ensayos de cuantificación de ADN para HHV-8: Los compuestos de ensayo se diluyeron en pocillos duplicados. Las células BCBL-1 se indujeron para que experimentaran una infección lítica mediante la adición de 12-miristato 13 -acetato de forbol, las células se añadieron a cada pocillo en la placa. Las células se incubaron durante 7 días a 37 °C en una estufa de incubación con CO ²humidificada, entonces se preparó el ADN total. El ADN vírico se cuantificó mediante PCR ultrarrápida. Las concentraciones de compuesto suficientes para reducir el número de copias del genoma en un 50 % se calcularon a partir de los datos experimentales.

Ensayos celulares para la gripe: Para las curvas de respuesta a la dosis, se añadieron fármacos individuales a células MDCK en microplacas de 96 pocillos. Se incluyeron pocillos sin tratar de células infectadas (controles de virus) y células sin infectar (controles de célula) en cada placa de ensayo. A los tres días después de la infección, los pocillos de control de virus mostraban un 100 % citopatología. El grado de citopatología vírica en cada pocillo se determinó microscópicamente por inspección y por tinción con rojo neutro (NR). En resumen, las células se tiñeron con NR diluido en MEM para determinar la viabilidad celular. Dos horas después, las placas se procesaron para la cuantificación de la captación de NR en células viables. La cantidad de NR recogido por las células se determinó espectrofotométricamente.

Ensayos de qPCR para BKV y JCV: Se realizaron ensayos principales para virus BK en placas de 96 pocillos que contenían monocapas de células HFF. Se prepararon diluciones de compuesto en placas que contenían células que se infectaron posteriormente con la cepa Gardner de virus BK. Después de una incubación de 7 días, se preparó el ADN total con un kit de purificación y se cuantificó el número de copias del genoma por PCR ultrarrápida. Los compuestos que fueron positivos en este ensayo se confirmaron en un ensayo similar en placas de 96 pocillos con los compuestos añadidos 1 h después de la infección para identificar compuestos que inhiben las primeras fases de replicación, incluyendo adsorción y penetración. El número de copias del genoma se determinó por métodos descritos anteriormente.

También se realizó la evaluación principal de los compuestos contra virus JC por métodos similares a los de ensayos principales para virus BK. Se realizaron ensayos secundarios contra JC V en células CO S7 por métodos similar a los del virus b K para identificar compuestos que inhibían la adsorción o penetración del virus.

Ensayos de virus de la hepatitis C: Indicador de luciferasa (replicón)/CytoTox-1 (toxicidad). Los compuestos se cribaron por la actividad anti-HCV usando un criterio de valoración del gen indicador de luciferasa (Luc) en el ensayo principal de HCV. El indicador Luc se usó como medida indirecta de replicación de HCV ya que su actividad es directamente proporcional a los niveles de ARN de HCV. Se realiza evaluación de la citotoxicidad en paralelo. Se prepararon soluciones madre de fármaco en DMSO salvo que se indique otra cosa y se diluyeron con medio de histocultivo hasta la concentración de ensayo alta deseada. Para cada ensayo, los compuestos entonces se diluyeron adicionalmente en medio de histocultivo según lo necesario. Después de incubación, las células se procesaron para derivar, donde fuera aplicable, la CE50 y la CE90 (concentración de compuesto que reduce la replicación del replicón en un 50 % y 90 % respectivamente). Los valores de CC50 (concentración que disminuye la viabilidad celular en un 50 % ) e IS50 (CC50/CE50) se determinaron y se presentaron. Se evaluó la actividad anti-HCV con la actividad Luc derivada del replicón (genotipo 1b o 2a) o el virus HCVcc como lectura; mientras que las concentraciones citotóxicas de fármaco que reducen los números de células se evaluaron mediante el ensayo de proliferación celular CytoTox-1 de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se usó interferón alfa recombinante como fármaco de control positivo para validar el funcionamiento del ensayo.

Los ensayos para el virus de la gripe, RSV y SA RS CoV fueron ensayo de efecto citopático/toxicidad usando CellTiter-Glo. Los ensayos de citoprotección antivírica examina los efectos de los compuestos a concentraciones indicadas de respuesta a dosis en tipos celulares específicos para ensayar la eficacia de los compuestos en la prevención del efecto citopático inducido por el virus. Se incluyó ribavirina como fármaco de control positivo para el virus de la gripe y RSV, mientras que se usó el inhibidor calpaína IV para ensayos antivíricos de SARS. Se sembraron cultivos subconfluyentes de células en placas de 96 pocillos para el análisis de viabilidad celular (citotoxicidad) y actividad antivírica (ECP). Para el ensayo convencional, los fármacos se añadieron a las células 24 horas después. Los pocillos E C P también recibieron 100 dosis infecciones de histocultivo (100 DICT50) de virus valorado. A las 72 horas después se determinó la viabilidad celular.

La medición del ECP inducido por virus se basó en la cuantificación de ATP, un indicador de células metabólicamente activas. El ensayo de ECP empleó un kit de viabilidad celular luminiscente disponible en el mercado, y fue un método fiable para determinar la citotoxicidad y la proliferación celular en cultivo. El procedimiento implicó añadir el reactivo individual directamente a células subconfluyentes previamente cultivadas en el medio. Esto indujo lisis celular y la producción de una señal bioluminiscente (semivida mayor de 5 horas, dependiendo del tipo celular) que fue proporcional a la cantidad de ATP presente (que es un biomarcador de viabilidad).

Ensayos para virus del dengue (DENV), virus del Nilo Occidental (WNV), virus de la fiebre amarilla (YFV), virus de la fiebre del Valle de la Gran Falla (RVFV), virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV):

Ensayo principal de reducción del efecto citopático (ECP). Se realizaron ensayos de inhibición de ECP de cuatro concentraciones. Se prepararon monocapas de cultivo celular confluyentes o casi confluyentes en microplacas. Las células se mantuvieron en MEM o DMEM complementado con FBS según lo necesario para cada línea celular. Para ensayos antivíricos, se usa el mismo medio, pero con FBS reducido hasta un 2 % o menos y complementado con gentamicina. El compuesto de ensayo se preparó a diferentes concentraciones, u. Los pocillos de control de virus y control de célula estaban en cada microplaca. En paralelo, se ensayó un fármaco activo conocido como fármaco de control positivo usando el mismo método que el que se aplicó para los compuestos de ensayo. El control positivo se ensayó con cada desarrollo de ensayo. El ensayo se estableció retirando en primer lugar el medio de crecimiento de las placas de 96 pocillos de células. Después se aplicó el compuesto de ensayo a los pocillos. El virus se puso en aquellos pocillos indicados para infección con virus. Se puso medio desprovisto de virus en los pocillos de control de toxicidad y pocillos de control de célula. Los pocillos de control de virus se trataron de manera similar con virus. Las placas se incubaron a 37 °C con un 5 % de CO²hasta que se observó un ECP máximo en los pocillos de control de virus. Las placas entonces se tiñeron con rojo neutro durante aproximadamente dos horas a 37 °C en una estufa de incubación de un 5 % de CO². El medio de rojo neutro se retiró por aspiración completa, y las células pueden aclararse con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para retirar el tinte residual. La PBS se retiró completamente y el rojo neutro incorporado se eluyó con tampón. El contenido de tinte en cada pocillo se cuantifica usando un espectrofotómetro. El contenido de tinte en cada conjunto de pocillos se convirtió en un porcentaje de tinte presente en pocillos de control sin tratar usando una hoja de cálculo de ordenador de basada en Microsoft Excel. Las concentraciones eficaces al 50 % (CE50) y las concentraciones citotóxicas al 50 % (CC50) se calcularon entonces por análisis de regresión lineal. El cociente de CC50 dividido por CE50 da el valor de índice de selectividad (IS).

Ensayos para adenovirus (AdV), virus del sarampión (MEV), poliovirus (POV) y enterovirus (ENTV): El cribado principal fue un ensayo de reducción del efecto citopático (ECP). En resumen, se infectaron cultivos de células con virus en presencia de compuestos de ensayo y se incubaron durante 4-7 días (dependiendo del virus/células específicos). Cada virus se valoró previamente de modo que los pocillos de control mostraran aproximadamente un 95 % de pérdida de viabilidad celular debido a la replicación del virus. Por lo tanto, se observó efecto antivírico, o citoprotección, cuando los compuestos evitaban la replicación del virus. Cada placa de ensayo contenía pocillos de control de célula (células solamente), pocillos de control de virus (células más virus), pocillos de control de toxicidad del compuesto (células más compuesto solamente), pocillos de control colorimétrico de compuesto (compuesto solamente, sin células o virus), así como pocillos experimentales (compuesto más células más virus). Se evaluó la citoprotección y la citotoxicidad del compuesto por reducción de tinte m Ts . El porcentaje de reducción en el ECP del virus (actividad antivírica) y el porcentaje de viabilidad celular (citotoxicidad) se determinaron y presentaron.

Ensayos para el virus de la variolovacuna (VACV): El ensayo principal fue un ensayo de reducción del efecto citopático (ECP). Células HFF de bajo pase se trataron con tripsina, se contaron y se sembraron en placas de histocultivo. Las células entonces se incubaron durante 24 h a 37 °C. El medio entonces se retiró y se añadió MEM que contenía FBS al 2 % a todas salvo la primera fila. En la primera fila, se añadió medio que contenía el fármaco experimental (por ejemplo, compuesto 1) en pocillos triplicados. Se añadió medio en solitario a los pocillos de control tanto de célula como de virus. El fármaco en la primera fila de pocillos se diluyó entonces en serie 1:5 en todos los pocillos restantes. Las placas entonces se incubaron durante 60 minutos y se añadió una suspensión de virus a cada pocillo, excluyendo los pocillos de control de célula que recibieron MEM. Las placas entonces se incubaron a 37 °C en una estufa de incubación de CO². Después del periodo de incubación, se aspiró el medio y las células se tiñeron con violeta de genciana en formol durante 4 h. El colorante entonces se retiró y las placas se aclararon hasta que se retiró todo el exceso de colorante. Se permitió que las placas se secaran durante 24 h y se determinó la cantidad de ECP en cada fila. Los valores de CE⁵⁰y CC⁵⁰se determinaron comparando las células tratadas con fármaco y sin tratar usando un programa informático.

Como se expone en el ejemplo 1, a continuación, el compuesto 1 tiene actividad contra norovirus de ratón in vitro. En algunas realizaciones, el compuesto 1 tiene un valor de CE⁵⁰de aproximadamente 2,1 y un valor de CC⁵⁰de aproximadamente 114 contra norovirus de ratón. Además, el compuesto 1 tiene actividad contra una amplia serie de virus de ADN y ARN.

Como se expone en el ejemplo 2, a continuación, el compuesto 1 tiene actividad contra norovirus de ratón in vivo. Como se expone en el ejemplo 2, el compuesto 1 pudo reducir la carga vírica en ratones infectados con norovirus murino de una manera dependiente de la dosis. Los resultados se dan en la figura 1A y figura 1B, que muestran la reducción de la concentración vírica en las heces y el tejido, respectivamente, de ratones en el estudio 1. Además, las figuras 2A y 2B muestran la reducción de la concentración vírica en las heces y tejido, respectivamente, de ratones en el estudio 2. Las figuras 3A y 3B muestran la reducción en la concentración vírica en el tejido y heces, respectivamente, de los ratones en el estudio 1. Los resultados se muestran en una escala lineal. Los ratones se trataron con 30 mg/kg/día, o 100 mg/kg/día, o 300 mg/kg/día de compuesto 1 en el estudio 1. Los ratones se trataron con 150 mg/kg/día, o 300 mg/kg/día de compuesto 1 en el estudio 2.

El ejemplo 3 demuestra que el compuesto 1 puede inhibir la polimerasa de norovirus in vitro. Sin el deseo de limitarse a teoría alguna, se propone que el compuesto 1 puede proteger contra y tratar el norovirus inhibiendo la polimerasa de norovirus.

Como se expone en el ejemplo 4, el compuesto 1 se convierte en un trifosfato in vitro. Como se muestra, cuando las células se incubaban con compuesto 1, se producía el trifosfato correspondiente (es decir, compuesto 1-TP). El nivel de compuesto 1-TP fue de 12 a 23 veces mayor que de compuesto 1 después del periodo de incubación.

El ejemplo 5, a continuación, demuestra que el compuesto 1 es más eficaz en inhibir el norovirus de ratón que el compuesto 2, o que el trifosfato de 2'-C-metilcitidina. Se da una comparación con DMSO como control por referencia. El experimento se realizó por duplicado y los resultados se muestran en la figura 4 (primer duplicado) y figura 5 (segundo duplicado). La figura 6 muestra una superposición de los resultados del primer y segundo duplicado del experimento. Como se muestra en las figuras 4, 5 y 6, "A" es DMSO, "B" es compuesto 2, "C" es trifosfato de 2'-C-metilcitidina (2'CmeC TP) y "D" es compuesto 1. Las figuras 4-6 demuestran que la concentración vírica aumentaba casi dos órdenes de magnitud cuando se trataba con solamente DMSO o 2'CmeC TP. Sin embargo, la concentración vírica aumentaba menos de un orden de magnitud en presencia de compuesto 1.

El ejemplo 6 muestra una comparación con el compuesto 1 y otros compuestos de fórmula II (tabla 7) y análogos de los mismos. Sin el deseo de limitarse a teoría alguna, los compuestos que son incluso ligeramente diferentes de la estructura de fórmula I pueden tener actividad sustancialmente reducida in vitro. Por ejemplo, el compuesto 7 tiene un grupo hidroxi en lugar de la arilamina y tiene un valor de CE⁵⁰>38 pM; el compuesto 35 muestra un análogo del compuesto 1 que carece del grupo arilamina, y tiene un valor de CE⁵⁰>100 pM. Además, el compuesto 11 tiene un grupo ciano en lugar de la arilamida y tiene un valor de CE⁵⁰>121 pM. Asimismo, los compuestos 36 y 37 muestran aminas metilsustituidas y tienen valores de CE⁵⁰>100 pM. Los expertos en la materia entenderán comparaciones adicionales.

La figura 7a muestra un dia rama de HPLC del compuesto 1.

Sin el deseo de limitarse a teoría alguna, el pico n.° 2 se identificó como ácido benzoico.

La figura 7b muestra un dia rama de HPLC del compuesto 1 después de suspensión 3 horas a temperatura ambiente.

La figura 7c muestra un dia rama de HPLC del compuesto 1 después de suspensión 3 horas a 50 °C.

La figura 8a muestra un espectro de RMN de 1H del compuesto 1 de aproximadamente -2 a aproximadamente 14 ppm.

La figura 8b muestra un espectro de RMN de 1H del compuesto 1 de aproximadamente 2 a aproximadamente 9 ppm.

La figura 8c muestra un espectro de RMN de 1H del compuesto 1 de aproximadamente 0 a aproximadamente 9 ppm.

EJEMPLOS

Procedimientos generales

Las RMN de 1H se registraron a 500 MHz salvo que se indique otra cosa.

Ejemplo 1 - Ensayos antivíricos y de citotoxicidad

Cultivo de células y cepas de virus: Se prepararon fibroblastos de prepucio humano (HFF) a partir de tejido de prepucio humano obtenido de la instalación de obtención de tejidos de la Universidad de Alabama en Birmingham con la aprobación de su CIR. El tejido se incubó a 4 °C durante 4 h en medio de cultivo celular que consistía en medio esencial mínimo (MEM) con sales de Earle complementado con suero bovino fetal (FBS) (Hyclone, Inc. Logan UT) al 10 %, y concentraciones convencionales de L-glutamina, fungizone y vancomicina. El tejido entonces se puso en solución salina tamponada con fosfato (PBS), se trituró, se aclaró para retirar los glóbulos rojos y se resuspendió en solución de tripsina/EDTA. La suspensión de tejido se incubó a 37 °C y se agitó suavemente para dispersar las células, que después se recogieron por centrifugación. Las células se resuspendieron en 4 ml de medio y se pusieron en un matraz de histocultivo de 25 cm2 y se incubaron a 37 °C en una estufa de incubación de CO²humidificada durante 24 h. El medio entonces se remplazó con medio reciente y se controló el crecimiento celular diariamente hasta que se formó una monocapa de células confluyentes. Las células HFF entonces se expandieron a través de pases en serie en medio de crecimiento convencional de MEM con sales de Earle complementado con FBS al 10 %, L-glutamina, penicilina y gentamicina. Las células se pasaron de manera rutinaria y se usaron para ensayos en o por debajo del pase 10.

Las células Akata infectadas de forma latente con EBV se obtuvieron de John Sixbey (Louisiana State University, Baton Rouge, LA). La cepa GS de HHV-6A se obtuvo a través del AIDS Research and Reference Reagent Program del NIH. Las células HSB-2 y las células BCBL-1 se obtuvieron a través del AIDS Research and Reference Reagent Program del NIH, Division of AIDS, NIAID, NIH. Las células Molt-3 se obtuvieron de Scott Schmid en el Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA. Todos los cultivos de linfocitos se mantuvieron rutinariamente en RPMI 1640 (Mediatech, Inc., Herndon, VA) con FBS al 10 %, L-glutamina y antibióticos y se pasaron dos veces a la semana. Las células Vero se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), y se mantuvieron en medio de crecimiento convencional de MEM con sales de Earle complementado con FBS al 10 %, L-glutamina, penicilina y estreptomicina.

Virus de la gripe: Los virus de la gripe A/Nueva Caledonia/20/99 (H1N1) y A/Sydney/05/97 (H3N2) se proporcionaron por el Centers for Disease Control and Prevention (Atlanta, GA). Los virus se pasaron en células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) (American Type Culture Collection, Manassas, VA) para crear soluciones madre de trabajo, que se usaron para los ensayos antivíricos.

Se usaron las cepas E-377 y DM2.1 de HSV-1, así como las cepas MS y 13078 de HSV-2. La cepa F de HSV-1 se obtuvo de la ATCC. Las cepas de HCMV, AD169 y Merlin se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y C8805/37-1-1 y 759RD100 fueron un obsequio de Karen Biron. La cepa Ellen de VZV se obtuvo de la ATCC. La cepa Z29 de HHV-6B fue un obsequio de Scott Schmid en el Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta GA. El HHV-8 se obtuvo como células BCBL-1 infectadas de forma latente a través del AIDS Research and Reference Reagent Program del NIH.

Ensayos antivíricos: Cada experimento que evaluó la actividad antivírica de los compuestos incluyó compuestos tanto de control positivo como de control negativo para garantizar el funcionamiento de cada ensayo. Se realizó evaluación simultánea de la citotoxicidad cuando fue posible a niveles equivalentes de exposición al compuesto. Los métodos se presentan siguiendo los datos tabulados en concentraciones eficaces que dan reducciones de un 50 % en la replicación vírica in vitro (CE50), concentraciones que producen un 50 % de reducción en la viabilidad celular (CC50) y el índice de selectividad (IS, calculado como CC50 dividida por CE50). Cuando había suficiente material disponible, se realizaron múltiples ensayos para cada evaluación de compuesto para obtener datos estadísticos.

Ensayos de citotoxicidad de captación de rojo neutro: Cada compuesto se evaluó en un ensayo de citotoxicidad convencional por métodos convencionales. En resumen, se sembraron células HFF en placas de histocultivo de 96 pocillos a 2,5 x 104 células/pocillo en medio de histocultivo convencional. Después de 24 h de incubación, el medio se remplazó con medio de cultivo celular de mantenimiento y se añadieron los compuestos a la primera fila y después se usaron entonces diluciones en serie de factor 5 para generar una serie de concentraciones de compuesto con un máximo de 300 pM. Las placas de ensayo se incubaron durante 7 días, y se añadieron 100 pl de una solución de rojo neutro de 0,66 mg/ml en PBS a cada pocillo y las placas se incubaron durante 1 h. El colorante entonces se retiró, las placas se aclararon con PBS y el tinte internalizado por las células viables se solubilizó en PBS complementado con etanol al 50 % y ácido acético glacial al 1 %. Entonces se determinó la densidad óptica a 550 nm y se interpolaron los valores de CC50 de los datos experimentales.

Para todos los ensayos de reducción de placas en células HFF, se realizaron ensayos de citotoxicidad de rojo neutro en un conjunto paralelo de placas de 6 pocillos que contenían células HFF no infectadas que recibieron las mismas concentraciones de compuesto que las usadas para los ensayos antivíricos. Las placas de citotoxicidad se retiraron de la estufa de incubación en el mismo día que cada ensayo antivírico y se tiñó la monocapa de células durante 6 h con 2 ml de una solución de rojo neutro a una concentración de 0,165 mg/ml en PBS. El tinte entonces se retiró, se aclaró el tinte residual de las células con PBS, y se inspeccionaron las monocapas de células visualmente para cualquier signo de toxicidad. El ensayos de citotoxicidad con células Vero se realizó con concentraciones de fármaco que varían de 1 pM a 1 mM. La viabilidad celular se determinó usando ensayo de proliferación celular de una solución acuosa CellTiter 96® (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ensayos de proliferación celular: La inhibición de la proliferación de células HFF se usó para refinar las estimaciones de citotoxicidad para algunos compuestos y se realizó de acuerdo con un procedimiento convencional usado en el laboratorio. Las células se sembraron a una baja densidad en placas de seis pocillos usando 2,5 x 104 células/pocillo y medio de cultivo convencional. Después de 24 h, el medio se aspiró, y se preparó una serie de soluciones de compuesto en el medio de crecimiento partiendo a 300 pM y se añadió a pocillos duplicados. Las placas se incubaron durante 72 h a 37 °C, y las células entonces se desprendieron con tripsina y se contaron en un Beckman Coulter Counter. Las concentraciones de compuesto que reducían la proliferación celular en un 50 % se interpolaron de los datos experimentales.

Citotoxicidad en ensayos de linfocitos: La viabilidad celular en todos los ensayos con linfocitos se evaluó con el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo (Promega). En resumen, se incubaron placas de ensayo a temperatura ambiente durante 30 min, después se añadieron 50 pl de reactivo CellTiter-Glo a cada pocillo y las placas se mezclaron durante 2 min en un agitador orbital para lisar las células. Las placas entonces se incubaron durante 10 min adicionales a temperatura ambiente y se cuantificó la luminiscencia en un luminómetro. Se usaron métodos convencionales para calcular las concentraciones de fármaco que inhibían la proliferación de células Akata, HSB-2, BCLB-1 o Molt-3 en un 50 % (CC⁵⁰).

Tabla 1: Actividad de compuesto 1 contra norovirus de ratón en células RAW

Tabla 2: Actividad de compuesto 1 contra diversos virus de ADN ARN

Ensayo de norovirus de ratón (MNV): Las células RAW (macrófagos de ratón, ATCC TIV-71) se recibieron de la American Type Culture Collection (ATCC). Las células se incubaron a 37 °C con un 5 % de CO²en medio de cultivo celular que consistía en medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM) (ATCC) complementado con suero bovino fetal (FBS) al 10 % (Hyclone, Inc., Logan UT), 100 U/ml de penicilina y 100 ug/ml de estreptomicina (Hyclone), MEM NEAA al 1 % (Gibco), GlutaMAX al 1 % (Gibco) y HEPES al 1 % (Hyclone). El aislado de norovirus de ratón usado en este ensayo se aisló de un ratón natural, se adaptó a cultivo celular, se purificó en placa y se confirmó su secuencia genética por Chimerix, Inc.

Se añadieron 100 pl de diluciones en serie de compuestos de ensayo en DMEM a placas tratadas con histocultivo de 96 pocillos Costar. Se añadieron 100 pl de suspensión celular que contenía 50000 células RAW/pocillos y MNV (MOI = 0,0005) a las diluciones de compuesto en la placa de 96 pocillos, y se incubaron a 37 °C con un 5 % de CO²durante 2 días. Cada placa de ensayo incluía controles de células sin infectar y pocillos de control de virus sin tratar. Después de 2 días de incubación, los pocillos de control de virus sin tratar mostraron un 100 % de ECP. Después de 2 días de incubación, se añadieron 40 pl de reactivo MTS acuoso Cell Titer 96® (Promega, G111) como indica el fabricante a los 200 pl de medio en cada pocillo y se incubaron a 37 °C hasta que los controles de células sin tratar revelaron una absorbancia a 490 nm entre 1,1 y 1,8. Se leyeron las lecturas de absorbancia finales usando un BioTek Synergy 2, y se usó el programa informático Gen 5 (BioTek Instruments, Inc.) para calcular la concentración que protegía las células RAW infectadas con MNV en un 50 % en comparación con controles de células sin infectar (CE50).

Ensayos de norovirus humano: Se evaluó la actividad antivírica contra un norovirus (NoV) humano en un ensayo de 3 días usando la línea celular de replicón de norovirus humano de expresión estable, HG23 (genogrupo I, longitud genómica; línea celular precursora, HuH7) (Chang, et al., 2006, Virol. 353:463) mantenida como cultivos subconfluyentes en placas de 96 pocillos. Típicamente, se usan 4 dosis (etapas de factor 10 o factor 3), por triplicado. La actividad antivírica se determinó por análisis de hibridación en transferencia de ARN de NoV intracelular (normalizado al nivel de ARN de p-actina celular en cada muestra de cultivo). La citotoxicidad se evaluó por captación de tinte rojo neutro en cultivos mantenidos en placas paralelas (Korba y Gerin, 1992, Antivir. Res. 19:55).

Los valores de CE⁵⁰y CC⁵⁰se calculan por análisis de regresión lineal (MS EXCEL®, QuattroPro®) usando datos combinados de todos los cultivos tratados (Korba y Gerin, 1992, Antivir. Res. 19:55; Okuse, et al., 2005, Antivir. Res.

65:23). Las desviaciones típicas para los valores de CE⁵⁰y CE⁹⁰se calcularon a partir de los errores típicos generados por los análisis de regresión. La CE⁵⁰y la CE⁹⁰son concentraciones de fármaco a las que se observó un descenso de factor 2 o factor 10 del ARN de NoV intracelular (con respecto a los niveles promedio en cultivos sin tratar), respectivamente. La CC⁵⁰es la concentración de fármaco a la que se observa un nivel dos veces menor de captación de tinte rojo neutro (con respecto a los niveles promedio en cultivos sin tratar). El índice de selectividad (I.S.) se calculó como CC⁵⁰/CE⁵⁰. Se usa interferón 2b humano recombinante (PBL laboratories, Inc.) como control de ensayo.

CE ⁵⁰ de BKV en células VERO: Se sembraron placas de histocultivo de pocilios Costar 96 con 10000 células Vero/pocillo en DMEM que contenía suero bovino fetal convencional Hyclone al 2 % (FBS, Cat SH30088.03) y penicilina y estreptomicina Hyclone al 1 %. Los pocillos externos no se usaron para minimizar el efecto de borde producido por incubaciones prolongadas. Las células se inocularon con 115 copias de ADN de BKV/célula (ATCC, cepa Gardner). Se añadieron diluciones en serie de compuestos de ensayo a las células y las placas se incubaron durante 10 días a 37 °C en un 5 % de CO². Después de la incubación de 10 días, se mezclaron 50 pl de sobrenadante con 50 pl de tampón de lisis 2X que proporcionó una concentración final de 0,5 mg/ml de proteasa K, KCl 50 mM, T ris-Cl 10 mM pH 8,0, MgCl22,5 mM, IGEPAL al 0,45 % y Tween-20 al 0,45 % disuelto en agua tratada con DEPC. Cada placa se incubó durante 2 horas a 55 °C. Se midió el ADN de BKV del sobrenadante por reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) usando los cebadores directo e inverso de PCR de BKV, y una sonda marcada con FAM. La cuantificación absoluta del número de copias del virus se realizó usando una curva patrón con diluciones de amplicón de ADN de BKV que contenía secuencias homólogas al fragmento amplificado. Se usaron las siguientes condiciones de amplificación por qPCR: 1 ciclo a 95 °C durante 10 minutos, seguido de 45 ciclos de 95 °C durante 15 segundos y 60 °C durante 60 segundos. Las reacciones de qPCR se realizaron usando un sistema de PCR ultrarrápida Applied Biosystems 7500. Se usó el programa informático Gen 5 (BioTek Instruments, Inc.) para calcular la concentración que inhibía los niveles de ADN vírico de células Vero infectadas por BKV en un 50 % (CE50).

Ensayos de reducción de placas para HSV-1, HSV-2, VZV y HCMV: Se prepararon monocapas de células HFF en placas de seis pocillos y se incubaron a 37 °C durante 2 días para permitir que las células alcanzaran la confluencia. Entonces se aspiró el medio de los pocillos y se añadieron 0,2 ml de virus a cada uno de los tres pocillos para producir 20-30 placas en cada pocillo. Se permitió que el virus se adsorbiera en las células durante 1 h y las placas se balancearon suavemente cada 15 min para redistribuir el medio. Los compuestos se diluyeron en medio de cultivo celular de mantenimiento que consiste en MEM con sales de Earle complementado con FBS al 2 %, L-glutamina, penicilina y gentamicina. Las soluciones que varían de 300 pM a 0,1 pM se añadieron a pocillos duplicados y las placas se incubaron durante diversos tiempos, dependiendo del virus usado. El ensayo de reducción de placas con la cepa F de HSV-1 se realizó de una manera similar, pero con células Vero infectadas un día después de la siembra en placa. La concentración final de FBS en este ensayo fue de un 5 %. Para HSV-1 y 2, las monocapas se tiñeron con violeta de genciana al 1 % en metanol al 20 % y el tinte no unido se retiró por lavado con dH²O. Para ensayos con HCMV y VZV, la monocapa de células se tiñó con solución de rojo neutro al 1 % durante 4 h, después el colorante se aspiró y las células se lavaron con PBS. Para todos los ensayos, se enumeraron las placas usando un estereomicroscopio y la concentración de compuesto que reducía la formación de placas en un 50 % (CE50) se interpoló de los datos experimentales.

Ensayos de reducción de placas para MCMV: Se prepararon fibroblastos de embrión de ratón usando un procedimiento similar al resumido anteriormente para células HFF y se suspendieron en medio de histocultivo como se describe anteriormente y se sembraron en placas de 12 pocillos y se incubaron a 37 °C durante 24 h. El medio se aspiró y las monocapas de células se infectaron con la cepa Smith de MCMV en un volumen final de 0,2 ml en cada uno de los pocillos triplicados. Las células infectadas entonces se incubaron a 37 °C durante 1 h y las placas se balancearon ocasionalmente para garantizar que el medio cubría la monocapa completa. Los compuestos se diluyeron en serie 1:5 en medio de cultivo celular de mantenimiento de tejidos descrito anteriormente y las soluciones se añadieron a las monocapas infectadas. Las monocapas infectadas se incubaron durante 7 días y después se tiñeron con 2 ml de un solución de rojo neutro al 1 % como se describe anteriormente. Las placas se enumeraron y los valores de CE⁵⁰se interpolaron de los datos experimentales por métodos convencionales.

Ensayos de cuantificación de ADN para EBV y HHV-6B: Los ensayos para EBV se realizaron en células Akata que se indujeron para que experimentaran una infección lítica con 50 pg/ml de un anticuerpo de cabra anti-IgG humana por métodos convencionales. Los compuestos experimentales se diluyeron en placas de 96 pocillos de fondo redondo para producir concentraciones que varían de 20 a 0,016 pM. Las células Akata se añadieron a las placas a una concentración de 4*104 células por pocillo y se incubaron durante 72 h. Para HHV-6, los compuestos se diluyeron en serie en placas de 96 pocillos, después se añadieron 1 x 104 células HSB-2 o Molt-3 sin infectar a cada pocillo. La infección se inició añadiendo células HSB-2 infectadas con HHV-6A, o células Molt-3 infectadas con HHV-6B, a una relación de aproximadamente 1 célula infectada por cada 10 células HSB-2 o células Molt-3 sin infectar respectivamente y se incubaron durante 7 días a 37 °C. Para todos los ensayos, se añadieron 100 pl de tampón de desnaturalización (NaOH 1,2 M, 80 NaCl 4,5 M) a cada pocillo para desnaturalizar el ADN y se aspiró una alícuota de 50 pl a través de una membrana de nailon Immobilon (Millipore, Bedford, MA) usando un aparato Biodot (Bio-Rad, Hercules, CA). Entonces se permitió que las membranas se secaran antes de equilibrado en DIG Easy Hyb (Roche Diagnostics, Indianápolis, IN) a 56 °C durante 30 min. Se prepararon sondas marcadas con digoxigenina (DIG) específicas para cada virus de acuerdo con el protocolo del fabricante (Roche Diagnostics). Para EBV, los cebadores 5'-CCC AGG AGT CCC AGT AGT CA-3' y 5'-CAG TTC CTC GCC TTA GGT TG-3 amplificaron un fragmento correspondiente a las coordenadas 96802-97234 en el genoma de EBV (AJ507799). Se preparó una sonda marcada con DIG de HHV-6 específica usando los cebadores 5'-CCT TGA TCA t Tc GAC c Gt TT-3' y 5'-TGG GAT TGG GAT TAG AGC TG-3' para amplificar un segmento de ORF2 (coordenadas 37820-38418 en X83413). Las membranas con ADN de EBV se hibridaron durante una noche a 56 °C seguido de lavados secuenciales en SSC 0,2* con SDS al 0,1 % y SSC 0,1* con SDS al 0,1 % a la misma temperatura. Para las transferencias de HHV-6A y HHV-6B, se permitió que la sonda hibridara durante una noche a 42 °C y las transferencias se aclararon a la misma temperatura con SSC 0,2* con SDS al 0,1 % y SSC 0,1* con SDS al 0,1 %. La detección de la sonda DIG unida específicamente se realizó con anticuerpo anti-DIG usando el protocolo del fabricante (Roche Diagnostics). Se capturó una imagen de la película fotográfica y se cuantificó con el programa informático QuantityOne (Bio-Rad) y las concentraciones de compuesto suficientes para reducir la acumulación de ADN vírico en un 50 % (CE50) se interpolaron de los datos experimentales.

Ensayos de cuantificación de ADN para HHV-8: Los compuestos de ensayo se diluyeron en pocillos duplicados de una placa de 96 pocillos con la máxima concentración final de 20 pM. Las células BCBL-1 se indujeron para que experimentaran una infección lítica mediante la adición de 12-miristato 13-acetato de forbol (Promega, Madison WI) a una concentración final de 100 ng/ml y se añadieron 2* 104 células a cada pocillo en la placa. Las células se incubaron durante 7 días a 37 °C en una estufa de incubación con CO ²humidificada, entonces se preparó el ADN total con un kit de purificación de 96 pocillos Wizard SV (Promega). El ADN vírico se cuantificó por PCR ultrarrápida usando el cebador directo 5'-TTC C C C AGA TAC A C G A^cA GAA TC-3', el cebador inverso 5'-CG G A G C G CA G G C TAC CT-3' y la sonda 5'-(FAM) C C T A C G TG T T C G T C G AC (TAMRA)-3'. Se usó el plásmido pMP218 que contenía secuencias de ADN correspondientes a los nucleótidos 14120 -14182 (AF148805.2) para proporcionar cuantificación absoluta del ADN vírico. Las concentraciones de compuesto suficientes para reducir el número de copias del genoma en un 50 % se calcularon a partir de los datos experimentales.

Ensayos celulares para la gripe: Para las curvas de respuesta a la dosis, se añadieron fármacos individuales a células MDCK en microplacas de 96 pocillos (8 x 104 células/pocillo) usando tres pocillos para cada concentración usada. Los compuestos se añadieron a las siguientes concentraciones: carboxilato de oseltamivir a 0, 0,000032, 0,0001, 0,00032, 0,001, 0,0032, 0,01, 0,032, 0,1, 1,0, 10,0 y 100 pg/ml; amantadina y ribavirina a 0, 0,001, 0,0032, 0,01, 0,032, 0,1, 0,32, 1, 3,2, 10, 32 y 100 pg/ml. Se incluyeron pocillos sin tratar de células infectadas (controles de virus) y células sin infectar (controles de célula) en cada placa de ensayo. A los tres días después de la infección, los pocillos de control de virus mostraban un 100 % citopatología. El grado de citopatología vírica en cada pocillo se determinó microscópicamente por inspección y por tinción con rojo neutro (NR). En resumen, las células se tiñeron con NR al 0,011 % diluido en MEM para determinar la viabilidad celular. Dos horas después, las placas se procesaron para la cuantificación de la captación de NR en células viables. La cantidad de NR recogido por las células se determinó espectrofotométricamente.

Ensayos de qPCR para BKV y JCV: Se realizaron ensayos principales para virus BK en placas de 96 pocillos que contenían monocapas de células HFF. Se prepararon diluciones de compuesto en placas que contenían células que se infectaron posteriormente con la cepa Gardner de virus BK. Después de una incubación de 7 días, se preparó el ADN total con un kit de purificación de 96 pocillos Wizard SV y se cuantificó el número de copias del genoma por PCR ultrarrápida usando los cebadores 5'- A^gT G GA T G G G CA G C C TAT GTA-3', 5'- TCA TAT C T G G G T C C C C^tG GA-3' y la sonda 5'-6-FAM A G G TAG AAG A G G TTA G G G TG T TTG ATG G CA CA G TAMRA-3'. El plásmido pMP526 sirvió como patrón de ADN con fines de cuantificación. Los compuestos que fueron positivos en este ensayo se confirmaron en un ensayo similar en placas de 96 pocillos con los compuestos añadidos 1 h después de la infección para identificar compuestos que inhiben las primeras fases de replicación, incluyendo adsorción y penetración. El número de copias del genoma se determinó por métodos descritos anteriormente.

También se realizó la evaluación principal de los compuestos contra virus JC por métodos similares a los de ensayos principales para virus BK, pero se hicieron en células 293TT y utilizaron la cepa 1-4 de JC V en células 293TT. El ADN vírico se cuantificó usando los cebadores 5'-CTG G TC ATG T G G A TG C T G TCA-3' y 5'-G CC A G C A G G C T G TTG ATA CTG-3' y la sonda 5'-6-FAM -CCC TTT G TT TG G C T G CT-TAM RA-3 junto con el plásmido pMP508 para proporcionar una curva patrón para la cuantificación absoluta. Se realizaron ensayos secundarios contra JC V en células CO S7 por métodos similar a los del virus BK para identificar compuestos que inhibían la adsorción o penetración del virus.

Ensayos de virus de la hepatitis C: Indicador de luciferasa (replicón)/CytoTox-1 (toxicidad). Los compuestos se cribaron por la actividad anti-HCV usando un criterio de valoración del gen indicador de luciferasa (Luc) en el ensayo principal de HCV. El indicador Luc se usó como medida indirecta de replicación de HCV ya que su actividad era directamente proporcional a los niveles de ARN de HCV. Se realiza evaluación de la citotoxicidad en paralelo. Se prepararon soluciones madre de fármaco en DMSO salvo que se indique otra cosa y se diluyen con medio de histocultivo hasta la concentración de ensayo alta deseada. Para cada ensayo, los compuestos entonces se diluyeron adicionalmente en medio de histocultivo según lo necesario. Después de incubación, las células se procesaron para derivar, donde fuera aplicable, la CE50 y la CE90 (concentración de compuesto que reduce la replicación del replicón en un 50 % y 90 % respectivamente). Los valores de CC50 (concentración que disminuye la viabilidad celular en un 50 % ) e IS50 (CC50/CE50) se determinaron y se presentaron. Se evaluó la actividad anti-HCV con la actividad Luc derivada del replicón (genotipo 1b o 2a) o el virus HCVcc como lectura; mientras que las concentraciones citotóxicas de fármaco que reducen los números de células se evaluaron mediante el ensayo de proliferación celular CytoTox-1 (Promega, Madison, WI) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se usó interferón alfa recombinante como fármaco de control positivo para validar el funcionamiento del ensayo.

Ensayos para virus de la gripe, virus respiratorio sincitial (RSV) y SARS CoV: Los virus principales y células usados fueron virus de la gripe cepa A/California/7/2009 (H1N1) en células MDCK, virus respiratorio sincitial cepa A -2 en células Hep2 y SA RS CoV cepa Toronto-2 en células VeroE6.

Los ensayos para el virus de la gripe, RSV y SARS CoV fueron ensayo de efecto citopático/toxicidad usando CelITiter-Glo. Los ensayos de citoprotección antivírica examinaron los efectos de los compuestos a concentraciones indicadas de respuesta a dosis en tipos celulares específicos para ensayar la eficacia de los compuestos en la prevención del efecto citopático inducido por el virus. Se incluyó ribavirina como fármaco de control positivo para el virus de la gripe y RSV, mientras que se usó el inhibidor calpaína IV para ensayos antivíricos de SARS. Se sembraron cultivos subconfluyentes de células en placas de 96 pocillos para el análisis de viabilidad celular (citotoxicidad) y actividad antivírica (ECP). Para el ensayo convencional, los fármacos se añadieron a las células 24 horas después. Los pocillos ECP también recibieron 100 dosis infecciones de histocultivo (100 DICT50) de virus valorado. A las 72 horas después se determinó la viabilidad celular.

La medición del ECP inducido por virus se basó en la cuantificación de ATP, un indicador de células metabólicamente activas. El ensayo de ECP empleó un kit de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo™ disponible en el mercado (Promega, Madison, WI), y fue un método fiable para determinar la citotoxicidad y la proliferación celular en cultivo. El procedimiento implicó añadir el reactivo individual (reactivo CellTiter-Glo™) directamente a células subconfluyentes previamente cultivadas en el medio. Esto indujo lisis celular y la producción de una señal bioluminiscente (semivida mayor de 5 horas, dependiendo del tipo celular) que fue proporcional a la cantidad de ATP presente (que es un biomarcador de viabilidad).

Ensayo principal de reducción del efecto citopático (ECP). Se realizaron ensayos de inhibición de ECP de cuatro concentraciones. Se prepararon monocapas de cultivo celular confluyentes o casi confluyentes en microplacas desechables de 96 pocillos. Las células se mantuvieron en MEM o DMEM complementado con FBS según lo necesario para cada línea celular. Para ensayos antivíricos, se usó el mismo medio, pero con FBS reducido hasta un 2 % o menos y complementado con 50 pg/ml de gentamicina. El compuesto de ensayo se preparó a cuatro log 10 de las concentraciones finales, habitualmente 0,1, 1,0, 10 y 100 pg/ml o pM. Los pocillos de control de virus y control de célula estaban en cada microplaca. En paralelo, se ensaya un fármaco activo conocido como fármaco de control positivo usando el mismo método que el que se aplicó para los compuestos de ensayo. El control positivo se ensayó con cada desarrollo de ensayo. El ensayo se estableció retirando en primer lugar el medio de crecimiento de las placas de 96 pocillos de células. Después, se aplicó el compuesto de ensayo en un volumen de 0,1 ml a los pocillos a concentración 2X. El virus, normalmente a <100 dosis infecciosas de cultivo celular del 50 % (DICC50) en un volumen de 0,1 ml, se puso en los pocillos indicados para infección vírica. Se puso medio desprovisto de virus en los pocillos de control de toxicidad y pocillos de control de célula. Los pocillos de control de virus se trataron de manera similar con virus. Las placas se incubaron a 37 °C con un 5 % de CO²hasta que se observó un ECP máximo en los pocillos de control de virus. Las placas entonces se tiñeron con rojo neutro al 0,011 % durante aproximadamente dos horas a 37 °C en una estufa de incubación de un 5 % de CO². El medio de rojo neutro se retiró por aspiración completa, y las células pueden aclararse 1X con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para retirar el tinte residual. La PBS se retiró completamente y el rojo neutro incorporado se eluye con tampón citrato de Sorensen al 50 %/etanol al 50 % (pH 4,2) durante al menos 30 minutos. El tinte rojo neutro penetra en las células vivas, por tanto, cuando más intenso sea el color rojo, mayor será el número de células viables presentes en los pocillos. El contenido de tinte en cada pocillo se cuantificó usando un espectrofotómetro de 96 pocillos a longitud de onda de 540 nm. El contenido de tinte en cada conjunto de pocillos se convirtió en un porcentaje de tinte presente en pocillos de control sin tratar usando una hoja de cálculo de ordenador de basada en Microsoft Excel. Las concentraciones eficaces al 50 % (CE50) y las concentraciones citotóxicas al 50 % (CC50) se calcularon entonces por análisis de regresión lineal. El cociente de CC50 dividido por CE50 da el valor de índice de selectividad (IS).

Ensayos para adenovirus (AdV), virus del sarampión (MEV), poliovirus (POV) y enterovirus (ENTV): El cribado principal fue un ensayo de reducción del efecto citopático (ECP). En resumen, se infectaron cultivos de 96 pocillos de células con virus en presencia de compuestos de ensayo y se incubaron durante 4-7 días (dependiendo del virus/células específicos). Cada virus se valoró previamente de modo que los pocillos de control mostraran aproximadamente un 95 % de pérdida de viabilidad celular debido a la replicación del virus. Por lo tanto, se observó efecto antivírico, o citoprotección, cuando los compuestos evitaban la replicación del virus. Cada placa de ensayo contenía pocillos de control de célula (células solamente), pocillos de control de virus (células más virus), pocillos de control de toxicidad del compuesto (células más compuesto solamente), pocillos de control colorimétrico de compuesto (compuesto solamente, sin células o virus), así como pocillos experimentales (compuesto más células más virus). Se evaluó la citoprotección y la citotoxicidad del compuesto por reducción de tinte MTS (reactivo CellTiter®96, Promega, Madison WI). El porcentaje de reducción en el ECP del virus (actividad antivírica) y el porcentaje de viabilidad celular (citotoxicidad) se determinaron y presentaron.

Ensayos para el virus de la variolovacuna (VACV): El ensayo principal fue un ensayo de reducción del efecto citopático (ECP). Células HFF de bajo pase (3-10) se trataron con tripsina, se contaron y se sembraron en placas de histocultivo de 96 pocillos en 0,1 ml de MEM complementado con FBS al 10 %. Las células entonces se incubaron durante 24 h a 37 °C. El medio entonces se retiró y se añadieron 100 pl de MEM que contenía FBS al 2 % a todas salvo la primera fila. En la primera fila, se añadieron 125 pl de medio que contenía el fármaco experimental (es decir, compuesto 1) en pocillos triplicados. Se añadió medio en solitario a los pocillos de control tanto de célula como de virus. El fármaco en la primera fila de pocillos se diluyó entonces en serie 1:5 en todos los pocillos restantes. Las placas entonces se incubaron durante 60 minutos y se añadieron 100 pl de una suspensión de virus a cada pocilio, excluyendo los pocilios de control de célula que recibieron 100 pl de MEM. Las placas entonces se incubaron a 37 °C en una estufa de incubación de C O ²durante tres días para VACV. Después del periodo de incubación, se aspiró el medio y las células se tiñeron con violeta de genciana en formol durante 4 h. El colorante entonces se retiró y las placas se aclararon hasta que se retiró todo el exceso de colorante. Se permitió que las placas se secaran durante 24 h y se determinó la cantidad de EC P en cada fila usando un lector automatizado de múltiples placas BioTek. Los valores de C E ⁵⁰y C C ⁵⁰se determinaron comparando las células tratadas con fármaco y sin tratar usando un programa informático.

Ejemplo 2 - Determinación de la eficacia de compuesto 1 contra norovirus murino en ratones

Metodología

Dos estudios (estudio n.° 1 y estudio n.° 2) examinaron la capacidad del compuesto 1 de proteger a los ratones contra o de reducir la infección por norovirus murino:

Estudio n.° 1 Se evaluó la eficacia de dosificación dos veces al día de compuesto 1 sobre un intervalo de 30 mg/kg a 300 mg/kg, iniciada antes de la infección de ratones con 106 unidades formadoras de placas (UFP) de norovirus murino (MNV) CR3. También se incluyó un grupo de control de ratones tratados con vehículo. Todas las dosis se iniciaron 2 días (39 horas) antes de la infección. Los grupos de estudio se muestran en la tabla 3.

El compuesto se administró dos veces al día en las dosis indicadas mediante sonda oral. También se incluyó un grupo de control de ratones tratados con vehículo únicamente. Los ratones se infectaron con norovirus murino pipeteando el virus en la boca 2 días después de la primera dosis. Los ratones usados fueron ratones BALB/c hembra de ~20 gramos, 8 -12 semanas de edad en grupos de 5 (los grupos de estudio se muestran en la tabla 3). Los ratones se alojaron en rejillas metálicas y se recogió la producción fecal combinada cada 24 horas. Se recogieron los tejidos (íleon distal y ciego) y los gránulos fecales individuales en el día 3 después de la inoculación. Todas las muestras se valoraron por ensayo de placas.

Tabla 3: Estudio n.° 1: Diseño del estudio para evaluación preliminar de la eficacia de compuesto 1 contra infección or norovirus murino en ratones

Estudio n.° 2 Se evaluó la eficacia de dosificación dos veces al día de compuesto 1 a 150 mg/kg o 300 mg/kg, iniciada antes de la infección de ratones con 104 ufp de MNV CR3. También se incluyó un grupo de control de ratones tratados con vehículo. La dosis de 150 mg/kg se inició 2 días (39 horas) antes de la inoculación, 1 día (15 horas) antes de la inoculación o en el día de (3 horas antes de) la inoculación; la dosis de 300 mg/kg se inició 2 días (39 horas) antes de la infección. Los grupos de estudio se muestran en la tabla 4.

Este estudio ensayó la capacidad del compuesto 1 de proteger a los ratones contra o de reducir la infección por norovirus murino. El compuesto se administró dos veces al día en las dosis indicadas mediante sonda oral empezando 2 días antes de la inoculación, 1 día antes de la inoculación o en el momento de la inoculación. También se incluyó un grupo de control de ratones tratados con vehículo únicamente. Los ratones se infectaron con 104 UFP de norovirus murino pipeteando el virus en la boca 3 horas después de la dosis del día 0. Los ratones usados fueron ratones BALB/c hembra de ~20 gramos, 8 -12 semanas de edad en grupos de 5 (los grupos de estudio se muestran en la tabla 4). Todas las muestras se valoraron por ensayo de placas.

Tabla 4: Estudio n.° 2: Diseño del estudio para evaluación de la eficacia de compuesto 1 contra infección por norovirus murino en ratones

Para ambos estudios, el compuesto se administró mediante sonda oral en las dosis y tiempos antes de la infección indicados. Los ratones se infectaron con norovirus murino CR3 pipeteando el virus en la boca 3 horas después de que se administrara la primera dosis del día 0 del compuesto 1. Después de la infección, el compuesto se administró dos veces al día hasta el día 3 después de la infección.

Los ratones usados fueron ratones BALB/c hembra de ~20 gramos, 8 -12 semanas de edad en grupos de 5. Los ratones se alojaron en rejillas metálicas y se recogió la producción fecal combinada cada 24 horas, empezando el día -1. Se recogieron los tejidos (~1 cm de íleon distal y ciego) y los gránulos fecales individuales en el día 3 después de la infección y se pesaron. Todas las muestras se valoraron por ensayo de placas (qRT-PCR como respaldo cuando las concentraciones son demasiado bajas); las concentraciones se normalizaron a gramo de tejido o heces. En el día 3, se recogieron muestras duplicadas de tejido (~1 cm de íleon distal y ciego), se aclararon en PBS y se congelaron instantáneamente; también se recogió suero y una muestra de heces duplicada en el día 3 y se congelaron instantáneamente; este conjunto de muestra se envió para análisis de MS para evaluar la biodisponibilidad del fármaco.

Resultados

Los resultados del estudio n.° 1 muestran que el tratamiento dos veces al día con compuesto 1, administrado empezando 2 días antes de la infección, era eficaz en reducir la concentración de norovirus murino tanto en tejido como en heces, con una mayor reducción en la concentración vírica observada con concentración creciente de fármaco como se muestra en la figura 1A y figura 1 B. Los datos también demuestran una reducción significativa en la concentración vírica para animales tratados dos veces al día con 300 mg/kg de compuesto 1 tanto en tejido como en heces en comparación con vehículo.

Como se muestra en las figuras 1A y 1B, los ratones se trataron mediante sonda oral con las dosis indicadas de compuesto 1 administradas dos veces al día, empezando 2 días antes de la infección con 106 ufp de norovirus murino como se expone en el "estudio n.° 1".

Los resultados del estudio n.° 2 demuestran que el tratamiento de ratones dos veces al día con 300 mg/kg de compuesto 1, empezando 2 días antes de la infección, reduce significativamente la concentración de norovirus murino tanto en tejido como en heces como se muestra en la figura 2A y la figura 2B. Estos datos confirman los hallazgos del estudio n.° 1 y demuestran que el compuesto 1 es eficaz en reducir la infección por norovirus murino.

Como se muestra en las figuras 2A y 2B, los ratones se trataron mediante sonda oral con las dosis indicadas de compuesto 1 administradas dos veces al día, empezando en los días indicados antes de la infección con 104 UFP de norovirus murino como se expone en el "estudio n.° 1".

Las figuras 3A y 3B muestran el número de unidades formadoras de placas por gramo del estudio 1 en una escala lineal en lugar de una escala logarítmica. Como se muestra en la figura 3A, el compuesto 1 dosificado por vía oral BID (dos veces al día) empezando en el día -2 antes de la infección (n = 5/grupo) mostró una reducción en las UFP/gramo con dosis creciente. Como se muestra en la figura 3A y 3B, el compuesto 1 reduce el norovirus de ratón en tejidos y heces.

Ejemplo 3 - Ensayo de inhibición de la polimerasa de norovirus

Se realizaron reacciones de polimerasa (10 pl) durante 60 minutos a 37 °C. Había trifosfatos nucleosídicos (NTP) presentes a 100 pM cada uno, con 0,05 pCi de a32P-U TP (800 Ci/mmol). Los compuestos se incubaron con la polimerasa (Pol) o pro-polimerasa (ProPol), con o sin genoma de proteínas víricas ligado (VPg) en tampón de reacción en ausencia de NTP durante 10 minutos en hielo. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de NTP, y se terminaron mediante la adición de un volumen igual de tinte de carga Tris 2x/borato/EDTA (TBE)/tampón (Invitrogen, Inc.). Los productos de ARN (100 nt) se resolvieron por electroforesis en geles de TBE al 6 %-urea (Invitrogen, Inc.). Se realizó análisis semicuantitativo de los productos de ARN por exposición de geles secados a tamices G E Healthcare Phosphor, seguido de medición de las intensidades relativas de banda usando el programa informático GelQuant.NET (Biochemlab Solutions, Inc.). Los cálculos de CI⁵⁰y CI⁹⁰se obtuvieron usando regresión lineal. Los resultados se dan a continuación en la tabla 5. Se da una comparación con trifosfato de 2'-C-metilcitidina (2'CmeC TP) por referencia. Tabla 5. En lim r n r ir

Ejemplo 4 - Conversión de compuesto 1 en trifosfato en células RAW

Se incubaron células RAW con compuesto 1 a las concentraciones mostradas en la tabla 6a (ng/célula) y en la tabla 6b (pmol/célula).

Tabla 6a. Conversión de com uesto 1 en trifosfato en n /célula

Tabla 6b. n r i n m 1 n rif f n m l l l

Se incubaron células RAW con cuatro concentraciones diferentes de compuesto 1 durante 48 horas en matraces T75 a una densidad de 1,2 * 107 células/matraz. Después del periodo de incubación, las células se aclararon dos veces con PBS fría y se contaron. El sedimento celular se suspendió en 1000 pl de metanol frío:agua destilada (70:30), se mezcló en agitadora vorticial y se congeló a -80 °C hasta el momento del análisis. Como se muestra en las tablas 6a y 6b, el compuesto 1 y el compuesto 1-T P pudieron detectarse en células RAW tratadas con compuesto 1 a concentraciones de 0,5 pM a 10 pM. La concentración de compuesto 1-T P fue de 12 a 23 veces mayor que de compuesto 1.

Ejemplo 5 - Eficacia del compuesto 1 contra norovirus humano

La eficacia del compuesto 1 para inhibir norovirus se comparó con DMSO (como control), compuesto 2 y trifosfato de 2'-C-metilcitidina (2'CmeC TP). Las células se pretrataron con 25 pM de compuesto experimental durante dos horas. El inóculo del virus se añadió durante dos horas, y el virus no unido se eliminó por lavado y se añadió medio reciente y compuesto experimental reciente.

El experimento se realizó por duplicado y los resultados se muestran en la figura 4 (primer duplicado) y figura 5 (segundo duplicado). La figura 6 muestra una superposición de los resultados del primer y segundo duplicado del experimento. Como se muestra en las figuras 4, 5 y 6, "A" es DMSO, "B" es compuesto 2, "C" es trifosfato de 2 '-C -metilcitidina (2'CmeC TP) y "D" es compuesto 1. Las figuras 4-6 demuestran que la concentración vírica aumentaba casi dos órdenes de magnitud cuando se trataba con solamente DMSO o 2'CmeC TP. Sin embargo, la concentración vírica aumentaba menos de un orden de magnitud en presencia de compuesto 1.

Ejemplo 6 - Concentración eficaz de compuestos de la divulgación y análogos de los mismos

La tabla 7 a continuación muestra los valores de C E ⁵⁰y C C ⁵⁰de algunos compuestos de la divulgación, así como de análogos de los mismos para norovirus murino. En casos donde los compuestos se ensayaron, pero no pudo medirse el valor de C E ⁵⁰, el valor de C E ⁵⁰se da como N/A.

Tabla 7. l r E r m f rm l II

Tabla 8 - l r E r m l i l i n n l l mi m

Ejemplo 7 - Síntesis de compuesto 1

Etapa 1 (protocolo n.° 1): En un reactor encamisado de 100 l se cargaron 4-amino-6-bromo-2-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-5-carbonitrilo (3,00 kg), dibenzoato de (3R,4R,5R)-2-acetoxi-5-((benzoiloxi)metil)tetrahidrofuran-3,4-diilo (6,60 kg) y D CE (18,89 kg). Se inició la agitación y se añadió DBU (3,61 kg). Durante un periodo de 03 h y 14 min, se añadió TMSOTf (8,01 kg) entre 30,6 °C y 37,3 °C. La IPC después de 01 h y 30 min a aprox. 32 °C mostró un 4 % de 4-amino-6-bromo-2-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-5-carbonitrilo (3,00 kg), dibenzoato de (3R,4R,5R)-2-acetoxi-5-((benzoiloxi)metil)tetrahidrofuran-3,4-diilo restante. La IPC después de 03h y 16 min a aprox. 32 °C mostró un 2 % de 4-amino-6-bromo-2-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-5-carbonitrilo (3,00 kg), dibenzoato de (3R,4R,5R)-2-acetoxi-5-((benzoiloxi)metil)tetrahidrofuran-3,4-diilo restante (espec: <3 % ). La mezcla de reacción se diluyó con DCM (39,81 kg) y se inactivó con agua potable (15,02 kg) durante un periodo de 11 min entre 9,5 °C y 15,6 °C. El pretratamiento extractivo (a aprox. 22 °C) se completó mediante una retroextracción de la fase acuosa con DCM (19,90 kg), un lavado con NaHCO3 sat. (1,3 kg de NaHCO3 en 14,9 kg de agua potable), una retroextracción de la fase de bicarbonato con DCM (19,71 kg) y un lavado con salmuera (4,5 kg de NaCl en 14,9 kg de agua potable). Nota: el reactor se limpió con agua potable, acetona y DCM después de cada lavado/retroextracción.

La fase orgánica agitada en tambor que contenía el producto se cargó en el reactor encamisado de 100 l a través de un filtro en línea seguido de un aclarado con DCM del tambor y el filtro con DCM (2,48 kg). Los contenidos del reactor se destilaron a 31 l con la ayuda de vacío durante un periodo de 06 h y 04 min con una temperatura máxima de 50,1 °C. En este punto se había formado una suspensión espesa. Después, durante un periodo de 39 min, se añadió IPAc (41,88 kg) entre 44,5 °C y 49,5 °C y los contenidos del reactor se calentaron hasta 76,9 °C durante un periodo de 01 h y 25 min. Después, los contenidos del reactor se enfriaron hasta 9,9 °C durante un periodo de 04 h y 21 min y se agitaron durante 12 h y 26 min con una temperatura mínima de 1,6 °C.

Etapa 1 (Protocolo n.° 2): En un reactor encamisado de 100 l se cargaron 4-amino-6-bromo-2-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-5-carbonitrilo (3,00 kg), dibenzoato de (3R,4R,5R)-2-acetoxi-5-((benzoiloxi)metil)tetrahidrofuran-3,4-diilo (6,60 kg) y D CE (18,80 kg). Se inició la agitación y se añadió DBU (3,59 kg). Durante un periodo de 01 h y 46 min, se añadió TMSOTf (7,90 kg) entre 30,4 °C y 34,2 °C. La IPC después de 02 h y 49 min a aprox. 34 °C mostró un 1 % de 4-amino-6-bromo-2-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-5-carbonitrilo restante (espec: <3 % ). La mezcla de reacción se diluyó con DCM (40/70 kg) y se inactivó con agua potable (14,97 kg) durante un periodo de 04 min entre 9,9 °C y 18,0 °C. El pretratamiento extractivo (a aprox. 22 °C) se completó mediante una retroextracción de la fase acuosa con DCM (20,34 kg), un lavado con NaHCO3 sat. (1,30 kg de NaHCO3 en 14,90 kg de agua potable), una retroextracción de la fase de bicarbonato con DCM (20,65 kg) y un lavado con salmuera (4,50 kg de NaCl en 14,96 kg de agua potable). Nota: el reactor se limpió con agua potable, acetona y DCM después de cada lavado/retroextracción.

La fase orgánica agitada en tambor que contenía el producto se cargó en el reactor encamisado de 100 l a través de un filtro en línea seguido de un aclarado con DCM del tambor y el filtro con DCM (1,49 kg). Los contenidos del reactor se destilaron con la ayuda de vacío durante un periodo de 04 h y 49 min con una temperatura máxima de 45,6 °C. En este punto se había formado una suspensión espesa. Después, durante un periodo de 27 min, se añadió IPAc (41,70 kg) entre 45,6 °C y 48,2 °C y los contenidos del reactor se calentaron hasta 75,7 °C durante un periodo de 01 h y 20 min. Después, los contenidos del reactor se enfriaron hasta 9,4 °C durante un periodo de 04 h y 15 min y se agitaron durante una noche con una temperatura mínima de 2,3 °C.

Etapa 2: En el reactor se cargaron dibenzoato de (2R,3R,4R,5R)-2-(4-amino-6-bromo-5-ciano-2-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-5-((benzoiloxi)metil)tetrahidrofuran-3,4-diilo (10,0 kg), Pd al 10 % sobre C (Degussa, tipo E101NE/W ), trimetilamina (7,3 kg) y THF (44,5 kg). Se envió hidrógeno al reactor y la mezcla se agitó durante 03 h y 54 min entre 24,7 °C y 19,6 °C a aprox. 212,35 kPa (30,8 psig). La IPC (HPLC) mostró que ya no podía detectarse dibenzoato de (2R,3R,4R,5R)-2-(4-amino-6-bromo-5-ciano-2-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-5-((benzoiloxi)metil)tetrahidrofuran-3,4-diilo.

La mezcla de reacción se filtró sobre Celite (7,2 kg) y un filtro de pulido y el residuo del filtro se lavó con THF (5,2 kg). El filtrado y el lavado combinados se transfirieron a un reactor encamisado de 100 l con la ayuda de un lavado con THF (2,12 kg). Los contenidos del reactor se destilaron al vacío con una temperatura discontinua máxima de 30,0 °C durante un periodo de 05 h y 38 min hasta un volumen final de 27 l. Se cargó IPA (31,48 kg) durante un periodo de 40 min al reactor entre 39,7 °C y 53,2 °C. Los contenidos del reactor se destilaron al vacío con una temperatura discontinua máxima de 53,2 °C durante un periodo de 03 h y 02 min hasta un volumen final de 33 l. Se cargó IPA (48,99 kg) durante un periodo de 43 min al reactor entre 53,1 °C y 57,1 °C. Los contenidos del reactor se calentaron hasta 60,2 °C , se agitaron durante 12 min y se enfriaron durante un periodo de 04 y 28 min hasta 5,4 °C. Se continuó la agitación en frío durante un periodo de 08 h y 55 min con una temperatura mínima de 1,1 °C . La suspensión se filtró y se lavó con IPA (9,41 kg, a aprox. 4,5 °C). El residuo se secó al vacío con un purga de nitrógeno durante un periodo de 11 h y 44 min a una temperatura máxima de 44,0 °C para proporcionar un LOD de un 0,36 % . Rendimiento: 6,58 kg (73,9 % ). La RMN de 1H confirma la estructura. Pureza: 97,78 % (HPLC, ABC).

Etapa 3 :

Materiales PM Equiv./vol Cantidad mmoles Lote n.°

1 100 g de NaOH disueltos en agua potable hasta un volumen total de 1 l; 2500 ml diluidos

de HCl conc. en 2 l en total con agua potable

Una solución de dibenzoato de (2R,3R,4R,5R)-2-(4-amino-5-ciano-2-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-5-((benzoiloxi)metil)tetrahidrofuran-3,4-diilo y THF se calentó hasta 54 °C y se inició la adición de NaOH 2,5 M. La adición inicial dio una mezcla bifásica y respuesta endotérmica (la temperatura bajó hasta 50 °C), pero según continuó la adición se formó una solución transparente de una sola fase que estuvo acompañada de una exotermia rápida hasta 61 °C ; la temperatura de reacción se mantuvo a 60 °C hasta 61 °C durante el resto de la adición y durante 2 A h adicionales. La IPC mostró que no quedaba dibenzoato de (2R,3R,4R,5R)-2-(4-amino-5-ciano-2-metil-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-7-il)-5-((benzoiloxi)metil)tetrahidrofuran-3,4-diilo.

La mezcla de reacción se enfrió hasta 21 °C y se neutralizó con HCl 3 N con enfriamiento externo hasta pH = 7,06 (pehachímetro Denver Instrument UB-10 equipado con un electrodo de pH Sartorius P-P11, el electrodo se comprobó con soluciones tamponantes de pH = 4,00 y pH = 7,00); la mezcla continuó hasta enfriarse a 8 °C. La mezcla neutralizada resultante se destiló al vacío con una temperatura de recipiente de 45 °C a 50 °C hasta que se observó la aparición de sólidos en el recipiente. La suspensión se enfrió y se agitó durante 2 h a 2 °C. La suspensión beis se filtró para producir un filtrado oscuro; el residuo blanquecino se lavó una vez con agua fría (500 ml, 5 °C). Un primer LOD después de 16 h dio un valor de un 18,73 %. La HPLC del material de secado mostró la presencia de un 1,6 % de benzoato.

Se ejecutó un breve estudio de revisión para el compuesto 1 (que contenía un 1,6 % de ácido benzoico por ABC, HPLC) en 10 vol de agua (1 g en 10 ml):

3 h de suspensión a temperatura ambiente

3 h de suspensión a 50 °C

24 h de suspensión a temperatura ambiente

Los tres experimentos dieron el compuesto 1 con menos de un 0,1 % de ácido benzoico (ABC, HPLC). Las suspensiones fueron fluidas, se agitaron fácilmente y la filtración fue rápida. El secado breve en el filtro dio un sólido parecido a polvo que indica que no se necesita un lavado de desplazamiento con un disolvente orgánico. Sin el deseo de limitarse a teoría alguna, se espera una pérdida de NMT menor de un 1 % (solubilidad de 1 mg/ml). Los datos de HPLC para el compuesto 1 se obtuvieron con un método adecuado para compuestos polares usando una columna Zorbax Eclipse Plus C18 (agua / ACN / TFA, 97,5 / 2,5 / 0,05). Esta es la misma columna usada para las etapas 1 y 2.

La suspensión de producto frío se filtró y el reactor y el residuo se lavaron con IPAc frío (aprox. 7,5 °C, 13,16 kg y 13,62 kg) hasta que se hubo obtenido un filtrado incoloro. El residuo se secó al vacío y una purga de nitrógeno < 45 °C durante un periodo de 65 h y 19 min hasta un LOD de un 0 %. Rendimiento: 5,87 kg (70,7 %), la RMN de 1H confirmó la identidad; pureza por Hp Lc de un 98,84 % (ABC).

La divulgación puede plasmarse en otras formas específicas sin alejarse de las características esenciales de la misma. Las realizaciones anteriores, por lo tanto, tienen que considerarse en todos los aspectos ilustrativas en lugar de limitantes de la divulgación descrita en este documento. El alcance de la divulgación, por tanto, se indica mediante las reivindicaciones adjuntas en lugar de mediante la descripción anterior.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de fórmula IB:

A es:

X¹es -CR¹¹R¹²- o -OCH²CH²-, en el que el átomo de oxígeno está distal al resto RIB en A;

R¹¹y R¹²son independientemente hidrógeno o alquilo C ¹-C⁴, en el que el alquilo está opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, -OH, -SH o -NH2;

X2 está ausente, es -O-, -C(O)O-, o -OCH2-, en el que el átomo de oxígeno está distal al resto RIB en A;

cada RIB es independientemente hidrógeno, -alquilo C¹-C⁶,

v es 0 o 1;

n es 0, 1,2 o 3 y cuando X²es -C(O)O-, n es 0;

p es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11;

q es 1,

2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18;

Rz es hidrógeno, halógeno, -alquiltio C¹-C⁴, -alcoxi C¹-C⁴, -alquilo C¹-C⁴, -alquenilo C²-C⁴, -alquinilo C²-C⁴, arilo, heteroarilo, -cicloalquilo C³-C⁸, -cicloalquenilo C⁴-C⁸o heterociclo no aromático de 3 a 5 miembros, en el que cada alquiltio, alcoxi, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o heterociclo está opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, -OH, -SH o -NH²;

Ra, Rb, Rx y Ry cada uno se selecciona independientemente del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, -OH, -SH, -alcoxi C¹-C⁶, ariloxi, -alquiltio C¹-C⁶, ariltio, -OC(O)alquilo C¹-C⁶, -OC(O)arilo, -alquilo C¹-C⁶, -alquenilo C²-C⁶, -alquinilo C²-C⁶, arilo, heteroarilo, -cicloalquilo C³-C⁸y -cicloalquenilo C⁴-C⁸, en el que cada alcoxi, ariloxi, alquiltio, ariltio, alquilo, arilo, alquenilo, alquinilo, heteroarilo, cicloalquilo o cicloalquenilo está opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, -OH, -SH o -NH2;

o dos Ra o Rb cualesquiera, junto con el átomo al que están unidos ambos, pueden combinarse para formar un espirocicloalquilo C³-C⁸o espiroheterociclo de 3 a 8 miembros;

o dos Ra o Rb cualesquiera, cuando están en átomos adyacentes, pueden combinarse para formar un arilo, heteroarilo, -cicloalquilo C³-C¹⁰, -cicloalquenilo C⁴-C¹⁰o heterociclo de 5 a 10 miembros en el anillo;

o cualquier CRaRb puede remplazarse por -O-, -S-, -S(O)- o -SO²-;

o dos Rx o Ry cualesquiera, junto con el átomo al que están unidos ambos, pueden combinarse para formar un -espirocicloalquilo C³-C⁸o espiroheterociclo de 3 a 8 miembros;

o dos Rx o Ry cualesquiera, cuando están en átomos adyacentes, pueden combinarse para formar un arilo, heteroarilo, -cicloalquilo C³-C¹⁰, -cicloalquenilo C⁴-C¹⁰o heterociclo de 5 a 10 miembros en el anillo;

o cualquier CRxRy puede remplazarse por -O-, -S-, -S(O)- o -SO²-;

R¹y R⁴⁵cada uno es independientemente hidrógeno, halógeno, -N3, -OH, -NH2, -SH, -alquilo C¹-C⁶, -cicloalquilo C³-C6, -alquenilo C²-C⁶, -cicloalquenilo C⁴-C⁸, -alquinilo C²-C⁶, -cicloalquinilo C⁸-C¹², -alcoxi C¹-C⁶o -alquiltio C¹-C⁶en el que cada alquilo, cicloalquilo, alquenilo, cicloalquenilo, alquinilo, cicloalquinilo, alcoxi o alquiltio está independientemente sustituido con uno o más de halógeno, -N3, -OH, -NH2 o -SH;

R², R³, R⁴y R⁴⁴cada uno es independientemente hidrógeno, halógeno, -N³, -OH, -NH², -SH, -alquilo C¹-C⁶, -alcoxi C¹-C6 o -alquiltio C¹-C⁶, en el que cada alquilo, alcoxi o alquiltio está opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, -N3, -OH, -NH2 o -SH;

o R³y uno de R⁴y R⁴⁴, junto con los átomos a los que están unidos pueden formar un doble enlace carbono-carbono; R⁵es independientemente hidrógeno, -RIB, M+, arilo, aralquilo, -alquilo C¹-C⁶, -heteroalquilo C¹-C⁶, cicloalquilo, anillo heterocíclico no aromático o heteroarilo, en el que M+ es un catión y en el que cada arilo, aralquilo, alquilo, heteroalquilo, cicloalquilo, heterociclo o heteroarilo está opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, -N3, -OH, -NH2 o -SH, y en el que R⁵no es un aminoácido; y

Rc es -alquilo C¹-C⁶, -cicloalquilo C³-C⁶, -alquenilo C²-C⁶, -cicloalquenilo C⁴-C⁸, -alquinilo C²-C⁶, -cicloalqui o arilo, en el que cada alquilo, cicloalquilo, alquenilo, cicloalquenilo o arilo está opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, -N3, -OH, -NH2 o -SH.

3. El compuesto de la reivindicación 1, en el que A es

4. El compuesto de la reivindicación 1 o 2, en el que A es

5. El compuesto de la reivindicación 1 o 2, en el que A es

6. El compuesto de la reivindicación 1,2 o 4, en el que A es

7. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que: (a) Ri es -H; y/o

(b) R²es -OH; y/o

(c) R⁴es -OH; y/o

(d) R³es -H; y/o

(e) R⁴⁴es -H; y/o

(f) RIB es -H; y/o

(g) Rc es -C H ³; y/o

(h) v es 1, X ²es -O-, n es 0 y RIB es -H; y/o

(i) R⁵es -H o M+, en el que M+ es Na+,

, Mg2+ o NRgRdReRf+, y en el que Rg, independientemente hidrógeno o -alquilo C ¹-C ⁵.

8. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que RIB es:

-H;

Ċ

9. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el compuesto es de fórmula l-a:

o una sal, solvato, enantiómero, diastereoisómero, racemato o mezcla farmacéuticamente aceptable del mismo; o en el que el compuesto es de fórmula l-b:

o una sal, solvato, enantiómero, diastereoisómero, racemato o mezcla farmacéuticamente aceptable del mismo; o en el que el compuesto es de fórmula l-c:

o una sal, solvato, enantiómero, diastereoisómero, racemato o mezcla farmacéuticamente aceptable del mismo; o en el que el compuesto es de fórmula l-d:

o una sal, solvato, enantiómero, diastereoisómero, racemato o mezcla farmacéuticamente aceptable del mismo; o en el que el compuesto es:

10. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el compuesto es:

11. Un compuesto de fórmula II:

Y es -C O)-, o

en la que X 1 es independientemente O, NH o S, X 2 es independientemente un enlace, -O-, -S - o -NH-, y X 3 es independientemente -OR, -NHR o -SR;

cada R es independientemente -H, -alquilo C ¹-C ²⁰, -alquenilo C ²-C ²⁰, -alquinilo C ²-C ^{2 0}, -cicloalquilo C ³-C ⁸, -cicloalquenilo C ⁴-C ⁸, arilo, heteroarilo o heterociclilo, en el que cada alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, arilo, heteroarilo o heterociclilo está opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, oxo, R1, -O R1, -N R 1R2, -S R 1, -OC(O)R1,-C(O)OR1, -NHC(O)OR1 o - NHC(O)R1;

Ra y Rb son cada uno independientemente, cada vez que aparecen, -H, -alquilo C ¹-C ²⁰, -alquenilo C ²-C ²⁰, -alquinilo C ²-C ²⁰, -cicloalquilo C ³-C ⁸, -cicloalquenilo C ⁴-C ⁸, arilo, heteroarilo o heterociclilo, en el que cada alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, arilo, heteroarilo o heterociclilo está opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, oxo, -O R 1, -N R 1R2, -S R 1, -OC(O)R1, -C(O)OR1, -NHC(O)OR1 o -NHC(O)R1;

R1 y R2 son cada uno independientemente, cada vez que aparecen, -H, -alquilo C ¹-C ²⁰, -alquenilo C ²-C ²⁰, -alquinilo C ²-C ²⁰, -cicloalquilo C ³-C ⁸, -cicloalquenilo C ⁴-C ⁸, arilo, heteroarilo o heterociclilo, en el que cada alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, arilo, heteroarilo o heterociclilo está opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, oxo, -R 3, -R 4, -O R3, -N R3R4, -S R 3, -OC(O)R3, -C(O)OR3, -NHC(O)OR3 o -NHC(O)R3;

R3 y R4 son cada uno independientemente, cada vez que aparecen, -H, -alquilo C ¹-C ²⁰, -alquenilo C ²-C ²⁰, -alquinilo C ²-C ²⁰, -cicloalquilo C ³-C ⁸, -cicloalquenilo C ⁴-C ⁸, arilo, heteroarilo o heterociclilo, en el que cada alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, arilo, heteroarilo o heterociclilo está opcionalmente sustituido con uno o más de halógeno, oxo, arilo, heteroarilo, -OH, -NH², -SH, -OC(O)H, -C(O)OH, -NHC(O)OH o -NHC(O)H;

Rd es independientemente -H o -D; y

n es independientemente 0, 1,2 o 3.

12. El compuesto de la reivindicación 11, en el que:

(a) Ra es -H; y/o

(b) Rb es -H; y/o

(c) Rd es -H; y/o

(d) n es 0; y/o

(e) Ra, Rb y Rd son -H; y/o

(f) Ra, Rb y Rd son -H y n es 0.

13. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 11 -12 , en el que el compuesto es:

o una sal, solvato, enantiómero, diastereoisómero, racemato o mezcla farmacéuticamente aceptable del mismo o en el que el compuesto es:

14. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, o una sal, solvato, enantiómero, diastereoisómero, racemato o mezcla farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

15. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, para su uso en el tratamiento de una enfermedad.

16. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 o una composición farmacéutica de la reivindicación 14, para su uso en el tratamiento de una infección vírica o una enfermedad o trastorno asociado con infección vírica.

17. Un compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13 o una composición de la reivindicación 14, para su uso en la prevención de una infección vírica o una enfermedad o trastorno asociado con infección vírica.

18. El compuesto o composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 16 o reivindicación 17, en el que la infección vírica es infección por norovirus.