ES2828657T3 - Composiciones - Google Patents

Abstract

Composición capaz de potenciar una respuesta inmunitaria de IgA y/o una respuesta inmunitaria de IgG para su uso en un método para potenciar y/o provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto, comprendiendo administrar dicha composición que comprende un agente capaz de reducir el nivel de unión de ATP a un receptor P2X7 a un sujeto, donde la composición se administra al sujeto vía oral y donde el agente comprende una enzima hidrolizante de ATP.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones

CAMPO TECNICO

Esta invención pertenece al campo de las composiciones. En particular, la invención se refiere a composiciones inmunogénicas que pueden usarse como vacunas.

ESTADO DE LA TÉCNICA

El intestino actúa como un punto de entrada para una amplia gama de antígenos extraños en forma de alimento. El sistema inmunológico de las mucosas debe garantizar que se eviten las respuestas inmunitarias innecesarias a los antígenos alimentarios, garantizando a la vez que se desencadena una respuesta inmune a cualquier organismo patógeno. Además, el intestino contiene aproximadamente 1014 microorganismos comensales que viven en simbiosis con el huésped. El sistema inmunológico de las mucosas debe garantizar que se genera una respuesta inmune contra estos organismos de forma controlada para permitir el comensalismo. Por tanto, la respuesta inmunitaria de la mucosa debe tolerar un gran número de no auto-antígenos, siendo al tiempo capaz de responder a patógenos.

La clase predominante de anticuerpos que se encuentran en el sistema de las mucosas es la inmunoglobulina A (IgA). Los anticuerpos IgA secretados en el lumen intestinal brindan protección a la mucosa atrapando microorganismos en la mucosidad, permitiendo a la vez el comensalismo.

Generalmente, el intestino colonizado es insensible a inmunógenos administrados vía oral como vacunas y, por tanto, la inducción de una respuesta de IgA de alta afinidad específica de especie mediante la vacunación oral constituye un desafío importante en la inmunología de las mucosas. Por ello, existe una necesidad en la técnica de las composiciones y protocolos de inmunización particulares que son capaces de superar la refractariedad natural del sistema mucoso adaptativo de proporcionar títulos altos de IgA (y anticuerpos IgG) específicos a patógenos de las mucosas.

Sólo se han autorizado dos vacunas bacterianas orales para su uso en humanos, a saber, Salmonella Typhi viva atenuada y Vibrio cholerae muerta.

Los inventores han descrito previamente que el receptor ionotrópico P2X7 regulado por adenosín-trifosfato (ATP) tiene un papel en la regulación de la abundancia de células Tfh1. Se demostró que el ATP extracelular se unía al receptor P2X7 que desencadenaba la muerte de células Tfh. Se ha demostrado que la eliminación de P2X7 en ratones resulta en un aumento de los niveles de IgA intestinal seguido del agotamiento de los comensales.

La WO 2014/052848 A1 describe que la apirasa re-sensibiliza a las bacterias frente a antibióticos y, por tanto, se refiere a la administración combinada de apirasa y un antibiótico, especialmente cuando la última línea de antibióticos ya no es efectiva.

La WO 2014/026078 A1 se refiere a la apirasa para tratar la sepsis o el shock séptico, enfatizándose el efecto protector de la adenosina y, por ello, se utiliza apirasa para metabolizar el ATP para obtener adenosina.

La WO 2012/019991 A1 se refiere a la apirasa en el tratamiento de la infección por VIH, llevando la infección por VIH a una liberación de ATP y del receptor P2Y2 que modula la infección por VIH.

Es un objeto de la invención proporcionar composiciones capaces de provocar y/o potenciar las respuestas inmunitarias de las mucosas y, en particular, las respuestas inmunitarias IgA e IgG y que se puedan administrar vía oral.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Las respuestas de IgA en el intestino son controladas por las células T auxiliares foliculares (Tfh), que promueven la maduración de células B específicas de antígeno a células plasmáticas secretoras de IgA. Las células Tfh promueven la proliferación de células B y facilitan la expresión de la desaminasa inducida por activación (AID), que promueve el cambio de clase de Ig y la hipermutación somática. Nuevos datos de los inventores demuestran que el ATP liberado por los comensales atraviesa el epitelio intestinal, limitando la actividad de las células Tfh.

Sorprendentemente, los inventores han descubierto que las composiciones que incluyen un agente que es capaz de reducir el nivel de unión del ATP a un receptor P2X7, comprendiendo el agente una enzima hidrolizante de ATP, son útiles para provocar una respuesta inmune de IgA y/o IgG eficaz cuando se administran vía oral. Las composiciones pueden comprender además un inmunógeno, de manera que se provoque una respuesta inmunitaria de IgA y/o IgG aumentada después de la administración de la composición que es específica del inmunógeno.

Por consiguiente, la invención proporciona una composición capaz de potenciar una respuesta inmune de IgA y/o una respuesta inmune de IgG para su uso en un método para potenciar y/o provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto que comprende administrar dicha composición que incluye un agente capaz de reducir el nivel de unión del ATP a un receptor P2X7 a un sujeto, donde la composición es administrada al sujeto vía oral y donde el agente comprende una enzima hidrolizante de ATP.

La invención también proporciona una composición para su uso según la invención, para su uso en la prevención o el tratamiento de enfermedades infecciosas.

Composiciones de la invención

Las composiciones de la invención son capaces de potenciar una respuesta inmune.

La respuesta inmune que las composiciones son capaces de potenciar también puede ser provocada por la composición. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la composición es capaz de provocar una respuesta inmune, por ejemplo comprendiendo la composición un inmunógeno. Por otra parte, en otras realizaciones, la composición por sí misma no es capaz de provocar una respuesta inmune específica. Por ejemplo, la composición puede no comprender opcionalmente un inmunógeno (y por ello no ser capaz de provocar una respuesta inmune), pero puede ser capaz de potenciar una respuesta inmunitaria provocada por un inmunógeno administrado de forma separada de la composición de la invención. En esta situación, la composición puede combinarse con una segunda composición que comprende un inmunógeno antes de su uso, de manera que las composiciones combinadas son capaces tanto de provocar como de potenciar una respuesta inmune específica.

Como alternativa, la composición de la invención puede administrarse a un sujeto de forma concomitante o en un momento similar a una segunda composición que es capaz de provocar una respuesta inmune, de manera que la composición de la invención es capaz de mejorar la respuesta inmune provocada por la segunda composición.

Cuando la composición no comprende un inmunógeno, puede administrarse sola y puede ser capaz de potenciar una respuesta inmune provocada por un inmunógeno ya presente en el sujeto. Por ejemplo, la composición puede ser capaz de potenciar una respuesta inmune contra comensales o patógenos ya presentes en el sujeto al que se va a administrar la composición.

Esto es, la composición puede ser capaz de potenciar y opcionalmente provocar una respuesta inmune de IgA y/o una respuesta inmune de IgG. Preferiblemente, la composición es capaz de potenciar y opcionalmente provocar una respuesta inmune de IgA.

Preferentemente, la composición es para su uso para potenciar y opcionalmente provocar una respuesta inmune de las mucosas. Las superficies mucosas de los tractos gastrointestinal, reproductivo y respiratorio están expuestas al ambiente externo y, por tanto, son altamente susceptibles a la invasión por patógenos. Estas superficies de las mucosas están protegidas por la activación y mejora de las respuestas inmunitarias de las mucosas. La composición puede ser para su uso en potenciar y opcionalmente provocar una respuesta inmune en una superficie de la mucosa gastrointestinal, reproductiva o respiratoria. Preferiblemente, la composición es para su uso en mejorar y opcionalmente provocar una respuesta inmune en una superficie de la mucosa gastrointestinal. Tales superficies de la mucosa gastrointestinal incluyen aquella del intestino. El intestino incluye el estómago, el intestino delgado y el intestino grueso.

Agentes capaces de reducir el nivel de unión del ATP a un receptor P2X7

Las composiciones de la invención comprenden al menos un agente capaz de reducir el nivel de unión del ATP a un receptor P2X7, comprendiendo el agente una enzima hidrolizante de ATP. La composición puede comprender múltiples agentes capaces de reducir el nivel de unión del ATP a un receptor P2X7. Por ejemplo, la composición puede comprender 2, 3, 4 o más agentes capaces de reducir el nivel de unión del a Tp a un receptor P2X7.

Estos agentes son capaces de reducir el nivel de unión del ATP a un receptor P2X7. La muerte de las células Tfh normalmente ocurre después de la unión del ATP al receptor P2X7. Por tanto, reducir la unión del ATP a un receptor P2X7 tiene como consecuencia reducir el desencadenamiento de la muerte de células Tfh. Las células Tfh apoyan la maduración de las células B a células plasmáticas secretoras de IgA. Por tanto, ha sido demostrado por los inventores que la reducción de la activación de la muerte de células Tfh conduce a un aumento de la maduración de las células B y la diferenciación de células B en células plasmáticas secretoras de IgA.

El agente capaz de reducir el nivel de unión del ATP a un receptor P2X7, donde el agente comprende una enzima hidrolizante de ATP, es capaz de reducir la concentración de ATP extracelular.

El agente puede estar presente en la composición como un polipéptido. Como alternativa, el agente puede estar presente en la composición en una bacteria recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica dicho agente, en un bacteriófago que comprende un ácido nucleico que codifica dicho agente o en un vector viral que comprende un ácido nucleico que codifica dicho agente.

Enzimas hidrolizantes de ATP

El agente capaz de reducir el nivel de unión de ATP a un receptor P2X7 es una enzima hidrolizante de ATP. Se puede usar cualquier enzima hidrolizante de ATP como agente capaz de reducir el nivel de unión de ATP a un receptor P2X7 en las composiciones de la invención. Una enzima hidrolizante de ATP se refiere a cualquier enzima que cataliza la hidrólisis de ATP a ADP, de ATP a AMP y/o de ADP a AMP. Tales enzimas incluyen apirasa, ATPasa, ATP-difosfatasa, adenosina-difosfatasa, ADPasa, ATP-difosfohidrolasa y c D39 (ectonucleósido trifosfato difosfohidrolasa 1, ENTPD1).

Preferiblemente, la enzima hidrolizante de ATP es apirasa. Cuando la enzima hidrolizante de ATP es apirasa, la apirasa puede tener la secuencia de una apirasa de cualquier organismo. Preferiblemente, la apirasa es apirasa de Shigelli flexneri. Como alternativa, la apirasa puede ser apirasa de Solanum tuberosum (patata). Las apirasas son NTPasas no acopladas a energía que cambian las proporciones de los portadores de energía como el ATP, el fósforo inorgánico y las moléculas de señalización. La apirasa se encuentra en todos los eucariotas tanto en formas unidas a membrana como en formas solubles secretadas.

La apirasa se puede producir por cualquier medio. Preferiblemente, la enzima hidrolizante de ATP se produce de forma recombinante. Preferiblemente, la enzima hidrolizante de ATP es apirasa producida de forma recombinante. Preferiblemente, la apirasa es una apirasa producida de forma recombinante que tiene la secuencia proporcionada como n° de acceso a GenBank U04539 (incorporada aquí como SEQ ID NO: 1). Como alternativa, la apirasa se puede purificar directamente de su fuente natural. La apirasa se puede purificar a partir de una fuente vegetal, animal o bacteriana. Preferiblemente, la apirasa se purifica a partir de la patata. Vehículo

El agente descrito anteriormente puede estar presente en la composición en un vehículo. Cualquier vehículo que permita el suministro del agente capaz de reducir el nivel de unión del ATP a un receptor P2X7 puede estar incluido en las composiciones de la presente invención.

Vectores de expresión

Los vectores de expresión son capaces de potenciar la expresión de una o más moléculas que han sido insertadas o clonadas en el vector. Ejemplos de tales vectores de expresión incluyen bacteriófagos, secuencias de replicación autónoma (ARS), centrómeros y otras secuencias que son capaces de replicarse o de ser replicadas in vitro o en una célula, o para transportar un segmento de ácido nucleico a una ubicación particular dentro de una célula de un animal. Vectores de expresión como se describen aquí incluyen vectores cromosómicos, episomales y derivados de virus, por ejemplo vectores derivados de plásmidos bacterianos o bacteriófagos y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como cósmidos y fagémidos o vectores basados en virus, tales como adenovirus, AAV, lentivirus.

El vector de expresión puede ser un plásmido. Puede emplearse cualquier vector de expresión plasmídico siempre que sea replicable y viable en el huésped.

El vector de expresión puede ser un minicírculo de ADN. El minicírculo de ADN es útil para niveles persistentemente altos de transcripción de ácidos nucleicos. Los vectores circulares se caracterizan por carecer de secuencias bacterianas que silencian la expresión. Por ejemplo, los vectores minicírculos se diferencian de los vectores plasmídicos bacterianos en que carecen de un origen de replicación y carecen de marcadores de selección de fármacos que se encuentran comúnmente en los plásmidos bacterianos, por ejemplo p-lactamasa, tet. En consecuencia, el minicírculo de ADN se vuelve más pequeño de tamaño, lo que permite un suministro más eficiente.

El vector de expresión puede ser un vector viral.

Puede emplearse cualquier vector viral basado en cualquier virus como vehículo para el agente. Las clases de sistemas virales comúnmente utilizados en la terapia génica se pueden clasificar en dos grupos, según si sus genomas se integran en la cromatina celular del huésped (oncoretrovirus y lentivirus) o persisten en el núcleo celular predominantemente como episomas extracromosómicos (virus adenoasociados, adenovirus y herpesvirus ).

El vector viral puede ser un vector adenoviral (AdV). Los adenovirus son virus de ADN de doble cadena sin envoltura de tamaño mediano con genomas lineales que se encuentran entre 26 y 48 Kbp. Los adenovirus acceden a la célula diana mediante la unión e internalización mediadas por el receptor, penetrando en el núcleo tanto de células que no se dividen como de aquellas que se dividen. Los adenovirus dependen en gran medida de la célula huésped para su supervivencia y replicación y son capaces de replicarse en el núcleo de células de vertebrados utilizando la maquinaria de replicación del huésped.

El vector viral puede ser de la familia Parvoviridae. La Parvoviridae es una familia de pequeños virus de ADN monocatenarios sin envoltura con genomas de aproximadamente 5000 nucleótidos de longitud. El vector viral de la descripción puede ser un virus adenoasociado (AAV). El VAA es un parvovirus dependiente que generalmente requiere una coinfección con otro virus (típicamente un adenovirus o un herpesvirus) para iniciar y mantener un ciclo infeccioso productivo. En ausencia de tal tipo de virus auxiliar, el VAA sigue siendo competente para infectar o transducir una célula diana mediante la unión e internalización mediada por receptor, penetrando en el núcleo tanto de las células que no se dividen como de aquellas que se dividen. Debido a que la progenie viral no se produce a partir de la infección por AAV en ausencia de un virus auxiliar, el grado de transducción se restringe solo a las células iniciales que están infectadas con el virus. A diferencia de los retrovirus, adenovirus y virus del herpes simple, el VAA parece carecer de patogenicidad y toxicidad en humanos2.

Pueden emplearse vectores virales basados en virus de la familia Retroviridae. Los retrovirus comprenden virus animales de ARN monocatenario que se caracterizan por dos características únicas. En primer lugar, el genoma de un retrovirus es diploide, consistiendo en dos copias del ARN. En segundo lugar, este ARN es transcrito por la enzima transcriptasa inversa asociada al virión en ADN de doble hebra. Este ADN de doble hebra o provirus puede luego integrarse en el genoma del huésped y pasar de la célula madre a las células de la progenie como un componente establemente integrado del genoma del huésped.

El vector viral puede ser un vector lentivirus.

Como vehículos para suministrar el agente pueden emplearse otros sistemas virales o no virales conocidos por los expertos en la técnica.

Preferentemente, el vector de expresión es un plásmido. Como alternativa, preferiblemente el vector de expresión es un bacteriófago. Cuando el vector de expresión es un plásmido o un bacteriófago, el vector de expresión puede transformarse en una célula bacteriana y la célula bacteriana puede ser incluida en la composición de la invención. La célula bacteriana puede ser E. coli. Como alternativa, el vehículo bacteriano puede ser Salmonella entérica atenuada. La Salmonella entérica atenuada puede ser del serotipo Salmonella Typhimurium.

Inmunógenos

Las composiciones de la invención pueden incluir inmunógenos capaces de inducir una respuesta inmune específica. La invención puede usarse con una amplia gama de inmunógenos para tratar o proteger frente a una amplia gama de enfermedades. El inmunógeno puede provocar una respuesta inmune que protege contra una enfermedad viral (por ejemplo debida a un virus con o sin envoltura), una enfermedad bacteriana (por ejemplo debido a una bacteria Gram negativa o Gram positiva), una enfermedad fúngica, una enfermedad parasitaria o cualquier otra enfermedad.

El inmunógeno puede adoptar diversas formas, por ejemplo un organismo completo, una vesícula de la membrana externa, una proteína, un sacárido, un liposacárido, un conjugado (por ejemplo de un portador y un hapteno, o de un portador y un sacárido o liposacárido).

En una realización preferente, el inmunógeno puede tomar la forma de un vehículo bacteriano que comprende un ácido nucleico que codifica el agente capaz de reducir la unión del ATP al receptor P2X7. En este caso, el vehículo bacteriano actúa tanto como portador del agente capaz de reducir el nivel de unión del ATP a P2X7 como de inmunógeno. Por ejemplo, la composición puede comprender una bacteria recombinante tal como Escherichia coli o Salmonella entérica atenuada que comprende un ácido nucleico que codifica el agente capaz de reducir la unión del ATP al receptor P2X7. La Salmonella entérica atenuada puede ser del serotipo Salmonella Typhimurium.

En una realización particularmente preferente, el inmunógeno puede tener la forma de un vehículo bacteriano que comprende un ácido nucleico que codifica una enzima hidrolizante de ATP, preferiblemente apirasa. El inmunógeno puede tener la forma de un vehículo bacteriano que comprende un ácido nucleico que codifica apirasa de Shigella flexneri.

Como alternativa, el inmunógeno puede comprender un ácido nucleico. El ácido nucleico puede codificar un polipéptido inmunógeno. El ácido nucleico puede estar presente en un vehículo tal como se describió anteriormente. Por ejemplo, el ácido nucleico puede estar presente en un vector de expresión. Tal vector de expresión puede estar presente dentro de una célula.

El inmunógeno y el agente capaz de reducir la unión del ATP al receptor P2X7 pueden incorporarse en el mismo vector de expresión. Como alternativa, el inmunógeno y el agente capaz de reducir la unión del ATP al receptor P2X7 pueden incorporarse en vectores de expresión individuales. Como otra alternativa, uno del inmunógeno y el agente capaz de reducir la unión del ATP al receptor P2X7 puede estar presente en un vector de expresión, mientras que el otro no está presente en un vector de expresión. Por ejemplo, el inmunógeno puede estar presente en un vector de expresión, mientras que el agente capaz de reducir la unión del ATP al receptor P2X7 no lo está. Como alternativa, el agente capaz de reducir la unión del ATP al receptor P2X7 puede estar presente en un vector de expresión, mientras que el agente capaz de reducir la unión del ATP al receptor P2X7 no lo está.

El inmunógeno puede no estar incluido en la composición de la invención. Como alternativa, se puede administrar un inmunógeno individualmente de la composición de la invención. La composición de la invención se puede combinar con una segunda composición que comprende el inmunógeno antes de su uso o la composición de la invención se puede administrar de forma concomitante o en un momento similar a una segunda composición que comprende un inmunógeno.

Como alternativa adicional, puede no administrarse un inmunógeno ni en la composición de la invención ni en una segunda composición. El inmunógeno puede estar ya presente en el sujeto antes de la administración de la composición de la invención.

Especificidad del inmunógeno

Preferentemente, el inmunógeno provoca una respuesta inmune contra un patógeno gastrointestinal o un patógeno sistémico. Preferiblemente, el patógeno sistémico es un patógeno sistémico transmitido por las mucosas.

El inmunógeno puede provocar una respuesta inmune contra cualquier patógeno bacteriano gastrointestinal. Patógenos bacterianos gastrointestinales incluyen Escherichia coli enterootóxica (ETEC), Escherichia coli enteroinvasiva (EIEC), Escherichia coli productora de verotoxina (EHEC), Escherichia coli enteropatógena (EPEC), Salmonella incluyendo Salmonella tifoidea y no tifoidea, por ejemplo Salmonella Typhi, Salmonella Enteritidis, Salmonella Paratyphi, Salmonella Typhimurium y Salmonella Choleraesuis, Campylobacter, Vibrio cholera, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Bacillus cereus, Vibrio parahaemolyticus, Yersinia enterocoliticia, Helicobacter pylori, Staphylococcus aureus y Listeria monocytogenes.

El inmunógeno puede provocar una respuesta inmune contra cualquier patógeno viral gastrointestinal. Patógenos virales gastrointestinales incluyen poliovirus, rotavirus, adenovirus, calcivirus, astrovirus, parvovirus, coronavirus, hepatitis A, D y E, togavirus.

El inmunógeno puede provocar una respuesta inmune contra cualquier patógeno protozoario gastrointestinal Patógenos protozoarios gastrointestinales incluyen Giardia lamlia, Cryptosporidium parvum, Isospora belli, Entamoeba histolytica, Entamoeba coli, Endolimax nana, Iodamoeba butschlii, Dientamoeba fraglis, Balantidium coli y Trichomonas hominis.

El inmunógeno puede provocar una respuesta inmunitaria contra cualquier helminto patógeno gastrointestinal. Helmintos patógenos gastrointestinales incluyen Ascaris lumbricoides, Ancylostoma duodenale, Necator americanus, Strongyloides stercoralis, Taenia saginata, Trichinella spiralis, Capillaria philippinensis, Taenia solium, Diphyllobothrium latum, Hymenolepis nana, Hymenolepis diminuta, Fasciolopsis buski, Metagonimus yokogawi, Heterophyes heterophyes, Gastrodiscoides hominis, Enterobius vermicularis y Trichuris trichiura. El inmunógeno puede provocar una respuesta inmune contra cualquier patógeno sistémico transmitido por las mucosas, como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).

El inmunógeno puede provocar una respuesta inmune en cualquier animal. El animal puede ser un animal vertebrado o no vertebrado. Los animales vertebrados pueden ser mamíferos. Los mamíferos vertebrados pueden ser humanos. Ejemplos de mamíferos incluyen ratón, rata, cerdo, perro, gato, conejo, caballo, vaca, oveja o primate. El animal puede ser un primate. Preferiblemente, el animal es un ser humano. El inmunógeno puede provocar una respuesta inmune contra cualquier patógeno que sea capaz de infectar al animal. Cuando se usa un inmunógeno que es capaz de provocar una respuesta inmune contra un patógeno que es capaz de infectar a un animal o grupo de animales particular, la composición que comprende el inmunógeno es adecuada para la administración a ese animal o grupo de animales particular.

Composiciones farmacéuticas

Las composiciones aquí descritas pueden comprender componentes adicionales distintos del agente y del inmunógeno antes descritos. Por ejemplo, normalmente incluyen uno o más componentes farmacéuticamente aceptables. Una discusión detallada de tales componentes está disponible en la referencia 3.

Una composición puede incluir un conservante como tiomersal o 2-fenoxietanol.

Preferiblemente una composición es estéril. Una composición es preferiblemente no pirogénica, por ejemplo conteniendo <1 EU (unidad de endotoxina, medida estándar) por dosis y preferiblemente <0,1 e U por dosis. Preferiblemente, una composición no contiene gluten.

Las composiciones de la invención pueden ser vacunas.

Kits

También se describen aquí kits que incluyen un primer compartimento que comprende un agente capaz de reducir el nivel de unión del ATP a un receptor P2X7.

Los kits pueden incluir además un segundo compartimento que comprende un inmunógeno.

Métodos de tratamiento y administración de composiciones inmunogénicas.

Las composiciones de la invención están destinadas a la administración a sujetos animales. El sujeto animal puede ser cualquier animal. El animal puede ser un animal vertebrado o no vertebrado. Los animales vertebrados pueden ser mamíferos. Los mamíferos vertebrados pueden ser humanos. Ejemplos de mamíferos incluyen ratón, rata, cerdo, perro, gato, conejo, caballo, vaca, oveja o primate. El animal puede ser un primate. Preferiblemente, el animal es un ser humano. El uso de la composición en un método incluye prevenir o tratar una enfermedad infecciosa en un animal, comprendiendo administrar una composición de la invención.

El uso de la composición en un método para potenciar y/o provocar una respuesta inmune en un sujeto puede implicar inmunizar al sujeto con una composición de la invención.

El medicamento también puede comprender un inmunógeno. Como alternativa, el medicamento puede administrarse en combinación con un inmunógeno.

Las enfermedades infecciosas que pueden prevenirse o tratarse mediante las composiciones de la invención pueden ser cualquier enfermedad causada por un patógeno. El patógeno puede ser un patógeno gastrointestinal o un patógeno sistémico. El patógeno sistémico puede ser un patógeno sistémico transmitido por las mucosas. La enfermedad puede estar causada por patógenos bacterianos, virales, protozoarios o helmintos.

Los patógenos bacterianos gastrointestinales incluyen Escherichia coli enterootóxica (ETEC), Escherichia coli enteroinvasiva (EIEC), Escherichia coli productora de verotoxina (EHEC), Escherichia coli enteropatógena (EPEC), Salmonella, incluyendo Salmonella tifoidea y no tifoidea, por ejemplo Salmonella Typhi, Salmonella Enteritidis, Salmonella Paratyphi, Salmonella Typhimurium y Salmonella Choleraesuis, Campylobacter, Vibrio cholera, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum, Bacillus cereus, Vibrio parahaemolyticus, Yersinia enterocoliticia, Helicobacter pylori, Staphylococcus aureus y Listeria monocytogenes.

Los patógenos virales gastrointestinales incluyen poliovirus, rotavirus, adenovirus, calcivirus, astrovirus, parvovirus, coronavirus, hepatitis A, D y E, togavirus.

Los patógenos protozoarios gastrointestinales incluyen Giardia lamlia, Cryptosporidium parvum, Isospora belli, Entamoeba histolytica, Entamoeba coli, Endolimax nana, Iodamoeba butschlii. Dientamoeba fraglis, Balantidium coli y Trichomonas hominis.

Los helmintos patógenos gastrointestinales incluyen Ascaris lumbricoides, Ancylostoma duodenale, Necator americanus, Strongyloides stercoralis, Taenia saginata, Trichinella spiralis, Capillaria philippinensis, Taenia solium, Diphyllobothrium latum, Hymenolepis nana, Hymenolepis diminuta, Fasciolopsis buski, Metagonimus yokogawi, Heterophyes heterophyes, Gastrodiscoides hominis, Enterobius vermicularis y Trichuris trichiura. Los patógenos sistémicos transmitidos por las mucosas incluyen el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Las composiciones de la invención pueden usarse para prevenir o tratar la enteritis.

Las composiciones de la invención pueden usarse como adyuvantes. Como alternativa, la composición de la invención se puede utilizar como vacuna.

Las composiciones de la invención se usarán generalmente para generar una respuesta de anticuerpos, esto es una respuesta inmune de IgA y/o una respuesta inmune de IgG en un sujeto.

La composición de la invención preferentemente proporciona una respuesta inmunoprotectora, preferiblemente una respuesta de IgA inmunoprotectora en un sujeto.

La composición de la invención preferentemente proporciona una respuesta inmune mejorada en comparación con la respuesta inmune proporcionada por un inmunógeno en ausencia de una composición que comprenda un agente capaz de reducir el nivel de unión del ATP a un receptor P2X7. Preferiblemente, la composición de la invención proporciona una respuesta inmune de IgA mejorada en comparación con la respuesta inmune de IgA proporcionada por un inmunógeno en ausencia de una composición que comprende un agente capaz de reducir el nivel de unión del ATP a un receptor P2X7.

Las composiciones de la invención se administran vía oral. Por tanto, prerentemente la composición se formula para la administración oral.

Cuando la composición se formula para la administración oral, la composición puede estar en forma de comprimidos, cápsulas, bolsitas, grageas, polvos, gránulos, grageas, polvos para la reconstitución, preparaciones líquidas o supositorios.

Para la administración oral, los compuestos de la invención se pueden proporcionar en forma de comprimidos o cápsulas, o como solución, emulsión o suspensión.

Los comprimidos orales pueden incluir una composición según la invención mezclada con excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como diluyentes inertes, agentes disgregantes, agentes aglutinantes, agentes lubricantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes y agentes conservantes. Cargas inertes adecuadas incluyen carbonato de sodio y calcio, fosfato de sodio y calcio, lactosa, almidón, azúcar, glucosa, metilcelulosa, estearato de magnesio, manitol y sorbitol. Ejemplos de excipientes orales líquidos incluyen etanol, glicerol y agua. Agentes disgregantes adecuados son almidón, polivinilpirrolidona (PVP), glicolato de almidón sódico, celulosa microcristalina y ácido algínico. Agentes aglutinantes pueden incluir almidón y gelatina. El agente lubricante, si está presente, puede ser estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Si se desea, los comprimidos pueden recubrirse con un material tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo para retrasar la absorción en el tracto gastrointestinal, o pueden recubrirse con un recubrimiento entérico.

Las cápsulas para la administración oral incluyen cápsulas de gelatina dura y blanda. Para preparar cápsulas de gelatina dura, los compuestos de la invención se pueden mezclar con un diluyente sólido, semisólido o líquido. Las cápsulas de gelatina blanda se pueden preparar mezclando el compuesto de la invención con agua, un aceite, tal como aceite de cacahuete o de oliva, parafina líquida, una mezcla de mono- y diglicéridos de ácidos grasos de cadena corta, polietilenglicol 400 o propilenglicol. .

Los líquidos para la administración oral pueden estar en forma de suspensiones, soluciones, emulsiones o jarabes o pueden liofilizarse o presentarse como un producto seco para reconstituir con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Dichas composiciones líquidas pueden contener opcionalmente: excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como agentes de suspensión (por ejemplo sorbitol, metilcelulosa, alginato de sodio, gelatina, hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa y gel de estearato de aluminio); vehículos no acuosos, por ejemplo aceites (por ejemplo aceite de almendras o de coco fraccionado), propilenglicol, alcohol etílico o agua; conservantes (por ejemplo p-hidroxibenzoato de metilo o de propilo o ácido sórbico); agentes humectantes como lecitina; y, si se desea, agentes aromatizantes o colorantes.

Las composiciones preparadas según la invención pueden usarse como vacunas para tratar tanto a niños como a adultos. Un sujeto puede tener menos de 1 año, 1-5 años, 5-15 años, 15-55 años o al menos 55 años. Los sujetos para recibir las vacunas pueden ser ancianos (por ejemplo > 50 años, > 60 años y preferiblemente > 65 años), jóvenes (por ejemplo < 5 años), sujetos hospitalizados, trabajadores de la salud, personal del servicio armado y militar, mujeres embarazadas, enfermos crónicos, sujetos inmunodeprimidos, personas que viajan al extranjero.

El tratamiento puede ser mediante un programa de dosis única o un programa de multidosis. Pueden usarse la multidosis en un programa de inmunización primaria y/o en un programa de inmunización de refuerzo. En un programa multidosis, las diversas dosis pueden administrarse por la misma vía o por vías diferentes, por ejemplo una preparación parenteral y un refuerzo de la mucosa, un refuerzo de la mucosa y un refuerzo parenteral. La administración de más de una dosis (típicamente dos dosis) es particularmente útil en sujetos naive inmunológicamente. Normalmente, se administrarán múltiples dosis con al menos 1 semana de diferencia (por ejemplo aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas).

General

El término "que comprende" abarca "que incluye" así como "que consiste", por ejemplo una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo más, por ejemplo X Y.

El término "aproximadamente" en relación con un valor numérico x es opcional y significa, por ejemplo, x ± 10%.

A menos que se indique específicamente, un proceso que comprende una etapa de mezclar dos o más componentes no requiere ningún orden específico de mezcla. Así, los componentes se pueden mezclar en cualquier orden. Cuando hay tres componentes, entonces se pueden combinar dos componentes entre sí y luego la combinación se puede combinar con el tercer componente.

Cuando se utilicen materiales animales (y en particular bovinos) en el cultivo de células, deben obtenerse de fuentes libres de encafalopatías espongiformes transmisibles (EET) y, en particular, libres de encefalopatía espongiforme bovina (EEB). En general, se prefiere cultivar células en ausencia total de materiales derivados de animales.

Cuando se administra un compuesto al cuerpo como parte de una composición, ese compuesto puede entonces sustituirse alternativamente por un profármaco adecuado.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: Origen bacteriano del ATP intestinal. (a) concentración de ATP en el lumen del íleon de ratones SPF y libres de gérmenes (GF), bilis, orina y suero, (b) concentración de ATP en medio de cultivo (barras) y crecimiento celular (OD600) de las especies bacterianas indicadas aisladas del intestino delgado, (c) concentración de ATP en suero de las venas portal, yugular y cava inferior (de izquierda a derecha) y del corazón, (d) análisis FACS de bacterias ileales sin tratar (LB) o tratadas con VAM (VAM) para el deterioro de membrana (células DIBAC+, gráficos de puntos superiores), muerte celular (células SybrGren+DAPI+, gráficos de puntos inferiores), (e) concentraciones de ATP (panel superior) y crecimiento de bacterias ileales (panel inferior) en cultivos sin tratar (LB) y tratados con VAM, (f) concentraciones de ATP ileales de ratones alimentados por sonda con PBS (barra izquierda ) o VAM (barra derecha), (g) Análisis por FACS de células Annexin V+ dentro de células Tfh de ratones sin tratar (barra izquierda) o alimentados por sonda oral con VAM (barra derecha) PP de WT y p2rx7'/'.

Figura 2: Inducción eficiente de la respuesta secretoria de IgA anti-E.Coli por apirasa. (a, b) Representación esquemática de la secreción de ATP por E. coli (OM, membrana externa, PS, espacio periplásmico, MI, membrana interna, Cyt, citosol ) (a) e impacto de la apirasa (b); concentraciones de ATP (barras) en medio de cultivo y crecimiento bacteriano (OD600) con el tiempo para pBAD28 (a) o transformantes pHND10 (b). (c) Análisis FACS para IgA anti-E. coli en lavado intestinal de ratones inmunizados con pBAD28 o transformantes pHND10. (d, e) Cuantificación de IgA anti-E. coli intestinal en ratones inmunizados con pBAD28 (d) o pHND10 (e) transfectado con E. coli y analizado con la cepa bacteriana respectiva (d) o recíproca (e). (f) Aumento de la cantidad de ATP ileal en ratones tratados con CA (barras derecha) o PSV (barras izquierda) antes y después (12h) de la alimentación forzada bacteriana. (g) Cuantificación de IgA anti-E. coli en respuesta a pBAD28 o (h) transformantes pHND 10 (escala y diferente), (i) análisis FACS para IgA en líquido intestinal de ratones alimentados por sonda con pBAD28 o E. coli transfectada con pHND10 en las especies bacterianas indicadas.

Figura 3: Inducción eficiente de la respuesta secretora de IgA anti-E. Coli por apirasa. (a) Tinción de E. coli por IgA en diluciones seriadas de lavados intestinales; (b) la tabla muestra las concentraciones de IgA intestinal y la media geométrica de anticuerpos específicos de E. coli, (c) Media geométrica de IgA anti-E. coli por FACS frente a la concentración de IgA intestinal total y la función relativa de la curva de ajuste, (d) Diagrama que muestra puntos de tiempo de alimentación forzada de E. coli y mediciones de ATP en presencia de diferentes asociaciones de antibióticos, (e, f) Cuantificación de IgA anti-E. coli en ratones no inmunizados (Unim; barra izquierda) o en respuesta de transformantes pBAD28 (barra derecha) y pHND10 (barra central) en presencia de CA (e) o PSV (f).

Figura 4: Niveles de ATP endoluminal en ratones libres de gérmenes monocolonizados con pBAD28 albergando E. coli (barra central), pHND10 albergando E. coli (barra derecha) y ratones de control libres de gérmenes (GF; barra izquierda).

Figura 5: Análisis del número de células Tfh (gráfico izquierdo) y del número de células del centro germinal (gráfico derecho) en animales monocolonizados con pBAD28 que alberga E. coli (barras del medio), pHND10 que alberga E. coli (barras de la derecha) y ratones de control libres de gérmenes ( GF; barras izquierda).

Figura 6: Media geométrica de IgA anti-E. coli en líquido intestinal por FACS frente a concentración de IgA intestinal total de ratones libres de gérmenes monocolonizados con pBAD28 albergando E. coli, ratones libres de gérmenes colonizados con pHND10 albergando E. coli y ratones de control libres de gérmenes (GF).

Figura 7: Concentraciones de ATP (barras) en medio de cultivo y crecimiento bacteriano (OD600) con el tiempo para albergando pBAD28 (A) o pHND10 (b) albergando S. Typhimurium avirulento.

Figura 8: Media geométrica de IgA anti-S. Typhimurium en líquido intestinal por FACS frente a concentración de IgA intestinal total de ratones de control (barras izquierda), ratones inmunizados con pHND10 que alberga S. Typhimurium atenuado (barras del medio) y ratones inmunizados con pBAD28 que alberga S. Typhimurium atenuado (barras derecha).

Figura 9: Recuperación de Salmonella virulenta de PP, ganglios linfáticos mesentéricos (MLN), bazo e hígado de ratones control no inmunizados (barras izquierda), ratones inmunizados con pHND10 que alberga S. Typhimurium atenuado (barras del medio) y ratones inmunizados con pBAD28 que alberga S. Typhimurium atenuado (barras derecha). CFU, unidad formadora de colonias; CTRL, ratones no inmunizados.

Figura 10: (a) Tamaño del bazo en ratones inmunizados con Salmonella atenuada que porta pBAD28 o pHND10 y luego desafiados con Salmonella virulenta en comparación con los ratones control no tratados, (b) Peso del bazo de ratones control sin tratar (barra izquierda), ratones inmunizados con Salmonella atenuada con pHND10 y luego desafiados con Salmonella virulenta (barra central) y ratones inmunizados con Salmonella atenuada que porta pBAD28 y luego desafiados con Salmonella virulenta (barra derecha). CTRL, ratones no tratados.

Figura 11: (a) Imágenes de tejido hepático de ratones inmunizados con Salmonella atenuada que lleva pBAD28 o Salmonella atenuada que lleva pHND10 y luego desafiados con Salmonella virulenta y de ratones control no tratados, (b) Puntuación histológica hepática de ratones inmunizados con Salmonella atenuada que lleva pBAD28 (barra derecha) o pHND10 (barra central) y luego desafiados con Salmonella virulenta. La barra izquierda muestra la puntuación histológica del hígado de los ratones control no tratados.

Figura 12: Cantidades de dextrano en ratones inmunizados con pHND10 que alberga S. Typhimurium atenuado (barra central), ratones no inmunizados (CTRL; barra izquierda) y ratones inmunizados con pBAD28 que alberga S. Typhimurium atenuado (barra derecha) después de infección con S. Typhimurium.

Figura 13: Número de unidades formadoras de colonias (UFC) virulentas de Salmonella recuperadas de los ganglios linfáticos mesentéricos (MLN), hígado y bazo de ratones deficientes en el gen 1 (Rag-1) activador de recombinasa 48 horas después de la exposición a Salmonella virulenta. Los ratones no inmunizados (CTRL) están representados por las barras de la izquierda, los ratones inmunizados con pBAD28 que alberga S. Typhimurium atenuado por las barras de la derecha y los ratones inmunizados con pHND10 que alberga S. Typhimurium atenuado por las barras del medio.

Figura 14: Concentraciones de IgA fecal en ratones no tratados (barra izquierda - representada por triángulos), ratones tratados con proteínas periplásmicas de pBAD28 que lleva E. coli (barra central - representada por diamantes) y ratones tratados con proteínas periplásmicas de pHND10 que llevan E. coli.

FORMAS DE REALIZACION DE LA INVENCION

Ratones y administración de antibióticos

Ratones C57BL/6J y p2rx7-/- (B6.129P2- P2rx7tm1Gab/J, Jackson Lab) se criaron en instalaciones libres de patógenos específicos (spf) en el Instituto de Investigación en Biomedicina, Bellinzona, Suiza. Los ratones libres de gérmenes C57BL/6J se mantuvieron en aisladores de película flexible en la Clean Animal Facility, Universidad de Berna, Suiza. Para el tratamiento con antibióticos, los ratones recibieron las siguientes asociaciones de antibióticos en el agua de bebida durante 4 semanas: ampicilina 1 g/l y cloranfenicol 0,5 g/l (asociación bactericida activa sobre la flora endógena pero no sobre E. coli transformada con pBAD28) o estretpomicina 1 g/l, penicilina 1 g/l y vancomicina 0,5 g/l (bactericida tanto de bacterias endógenas como transformadas con pBAD28).

Cuantificación de ATP

Para la cuantificación de ATP ileal, se recogió el contenido intestinal mediante lavado con 10 ml de tampón de lavado intestinal (PBS, EDTA 0,5 M, inhibidor de tripsina de soja, PMSF), centrifugado a 14.000 rpm en un tubo estéril, se filtró (0,22 pm) para eliminar cualquier contaminante del tamaño de una bacteria y se congeló inmediatamente en hielo seco. La concentración de ATP en los lavados intestinales se multiplicó por el factor de dilución para obtener la concentración de ATP endoluminal real. Se recogieron bilis y orina de la vesícula biliar y la vejiga mediante punción con una aguja 34G. Para la cuantificación de ATP secretado por bacterias comensales en cultivo, el contenido intestinal se sembró en agar BHI y se cultivó durante 16 horas a 37 °C. Se recogieron las colonias individuales y se cultivaron en caldo BHI. Se centrifugó el medio de cultivo de 16 h de las colonias individuales (15.000xg), se recogió el sobrenadante y se filtró (0,22 pm). Para la cuantificación del ATP en los distritos circulatorios, se expusieron las venas cava inferior, yugular y porta y el corazón y se extrajo sangre mediante punción con una aguja 34G. La sangre se centrifugó a 1000xg y el suero se recogió y se centrifugó una segunda vez a 1000xg. Se descargaron los sueros emolizados. La concentración de ATP extracelular se evaluó mediante un ensayo de bioluminiscencia con luciferasa de luciérnaga recombinante y su sustrato D-luciferina de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Tratamiento del cultivo bacteriano con antibióticos.

Se añadieron ampicilina (2,5 pg/ml), vancomicina (1 pg/ml), metronidazol (1 pg/ml) al cultivo bacteriano intestinal a una DO0,5. Los sobrenadantes de los cultivos bacterianos se recogieron 3, 4 y 5 h después de la adición de antibióticos, se centrifugaron a 14.000 rpm en un tubo estéril y se filtraron (0,22 pm). La concentración de ATP se evaluó mediante un ensayo de bioluminiscencia (ver arriba).

Anticuerpos y citometría de flujo

Los siguientes mAb se adquirieron de BD Biosciences: anti-CXCR5 conjugado con biotina (clon: 2G8, Cat.: #551960) y anti-ICOS conjugado con ficoeritrina (PE) (clon: 7E.17G9, Cat.#: 552146). El anti-CD4 conjugado con PE-Cy7 (Clon: GK1.5, Cat#:100422) y la estreptavidina conjugada con APC (Cat#: 405207) eran de Biolegend. El anti-CD3 conjugado con Percp-eFluor710 (Clon: 17A2, Cat#: 46-0032-80) se obtuvo de eBioscience. La tinción con anexina V se realizó en tampón de unión Biolegend Annexin V (Cat.# 422201) (1x106 células/ml) siguiendo el protocolo del fabricante. Los datos se analizaron utilizando el software FlowJo (TreeStar, Ashland, OR) o el software FACS Diva (BD Biosciences).

Plásmidos

La fusión phoN2::HA de longitud completa de S. flexnerise clonó en el sitio polienlazador del plásmido pBAD28 (ATCC 8739387402), bajo el control del promotor inducible por L-arabinosa P^bad, que genera el plásmido pHND10 (ref. 8).

Inmunización oral con E. coli y citometría de flujo para detección de IgA anti-E. coli

Se inoculó asépticamente E. coli transformada con pBAD28 o pHND10 en medio LB que contenía arabinosa (0,3%) y ampicilina (100 pg/ml) y se incubó a 37 °C durante 18 h. Las bacterias se recolectaron por centrifugación, se lavaron en PBS estéril y se concentraron a una densidad de 2x1010 UFC/ml en PBS. Las suspensiones bacterianas (1010 UFC en 300 pl) se alimentaron al estómago. El procedimiento se repitió cada 3 días durante 3 semanas y los ratones se sacrificaron el día 28. El contenido intestinal se recogió mediante lavados con 5 ml de tampón de lavado intestinal (PBS, EDTA 0,5 M, inhibidor de tripsina de soja, PMSF), se centrifugó a 14.000 rpm en un tubo estéril y se filtró (0,22 pm) para eliminar cualquier contaminante del tamaño de una bacteria4. Para el análisis de citometría de flujo de IgA anti-E. coli, se inocularon 3 ml de caldo LB con colonias individuales y se cultivaron durante una noche a 37 °C. Los cultivos se centrifugaron posteriormente (3 min a 7.000 rpm), se lavaron 3 veces con PBS esterilizado, 2% BSA, 0,005% NaN3y se resuspendieron a una densidad de aproximadamente 107 bacterias por ml. A continuación, se mezclaron los contenidos intestinales y las bacterias y se incubaron a 4 °C durante 1 hora. Las bacterias se lavaron dos veces antes de resuspenderlas en FITC monoclonal anti-IgA de ratón (Southern Biotech, Cat. #: 1040-02, dilución de trabajo 1:200). Después de 1 h de incubación, las bacterias se lavaron dos veces y se resuspendieron en paraformaldehído al 2% en PBS para su adquisición en un FACSCanto usando los parámetros FSC y SSC en modo logarítmico. Para cada animal analizado, se usó ELISA para determinar la concentración de IgA total en una alícuota sin diluir de la misma muestra de lavado intestinal usada para teñir la superficie de E. coli. Este valor se usó para calcular la concentración de IgA total en cada dilución de lavado intestinal usado para la citometría de flujo de E. coli y se representó frente a la fluorescencia media geométrica obtenida en la citometría de flujo.

Inmunización oral con Salmonella Typhimurium atenuada y citometría de flujo para la detección de IgA anti-Salmonella Typhimurium

Se inoculó asépticamente gyrA1816 Acya1 Acrp1 de S. Typhimurium avirulento (con mutaciones en los genes cya y crp e incapaces de producir adenilato ciclasa funcional así como proteína receptora de AMP cíclica) (ATCC® 53648™) transformada con pBAD28 o pHND10 en medio LB conteniendo arabinosa (0,05%) y cloranfenicol (30 pg/ml) y se incubó a 37 °C durante 18 horas. Las bacterias se recolectaron por centrifugación, se lavaron en PBS estéril y se concentraron a una densidad de 5 x 1010 CFU/ml en PBS. Las suspensiones bacterianas (5 x 109 UFC en 100 pl) se inyectaron en el estómago de ratones C57BL/6 normalmente colonizados cada tres días durante tres veces. Se añadió arabinosa al 0,05% en el agua de bebida para asegurar la máxima expresión de apirasa por los transformantes pHND10. Un mes después de la última inmunización, se analizaron los ratones para detectar IgA secretora anti-Salmonella como se describió anteriormente para los ratones colonizados con E. coli.

Ejemplo 1: E. coli en ratones colonizados normalmente

Detección de niveles extracelulares de ATP producidos por comensales

Previamente se había detectado ATP extracelular en el sobrenadante de comensales intestinales cultivados in vitro derivados de heces murinas56. Para determinar si la actividad metabólica de los comensales contribuyó al nivel de ATP intestinal, se observaron los niveles de ATP en el intestino delgado en ratones de una instalación libre de patógenos específicos y en ratones completamente libres de gérmenes. Se detectaron concentraciones micromolares de ATP en los ratones libres de patógenos específicos, mientras que el ATP fue apenas detectable en los ratones completamente libres de bacterias. Se encontró que los fluidos como la orina, la bilis y el suero que se originan de órganos epiteliales o endoteliales estériles (o casi estériles) no presentaban una cantidad sustancial de ATP endoluminal (ver Figura 1 (a)). Este hallazgo indica que la colonización de la mucosa por comensales juega un papel en el aumento de los niveles de ATP extracelular.

Para probar si las bacterias presentes en el intestino delgado liberan ATP, los cultivos de colonias aeróbicas y anaeróbicas aisladas de íleon murino se probaron para detectar ATP en el medio en comparación con el crecimiento celular. La Figura 1 (b) muestra que el ATP en el medio aumentaba proporcionalmente con el crecimiento bacteriano. Por tanto, estos datos demuestran que las bacterias presentes en el intestino delgado contribuyen a la generación de ATP luminal.

Los inventores también investigaron si la muerte celular bacteriana da como resultado un aumento adicional de ATP extracelular debido a la liberación de ATP durante la lisis celular. Los cultivos de células bacterianas ileales se trataron con vancomicina, ampicilina y metronidazol (VAM). La muerte celular se controló utilizando una tinción con DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) y el daño de la membrana se monitorizó utilizando una tinción con DIBAC (ácido bis(1,3-dibutilbarbitúrico)trimetino-oxonol) en citometría de flujo como se describe en la referencia 7. La Figura 1 (d) -(f) muestra que la muerte de las células bacterianas y la permeabilidad de la membrana estaban asociadas con una liberación de ATP prominente. La administración oral in vivo con VAM también resultó en un aumento agudo y significativo de a Tp endoluminal, como se muestra en la figura 1 (g), en asociación con una mayor exposición a fosfatidilserina (que es una señal de muerte celular) en células Tfh de parches de Peyer de ratones de tipo salvaje pero no P2rx7-/-. Esto indica que la liberación de ATP por muerte bactericida afecta la abundancia de células Tfh vía P2X7.

Permeabilidad epitelial al ATP

Con el fin de evaluar la permeabilidad epitelial al ATP del intestino delgado, los ratones se alimentaron diariamente con ATPyS (un análogo no hidrolizable de ATP). Como las células Tfh son sensibles al ATP extracelular vía P2X7, los inventores analizaron la recuperación de las células Tfh en los parches de Peyer dos semanas después del tratamiento. La administración de ATPyS resultó en una reducción significativa de las células Tfh en ratones de tipo salvaje pero no en ratones p2rx7'/_. Este hallazgo sugiere que el ATP luminal puede penetrar en los parches de Peyer y afectar a la abundancia de células Tfh vía P2X7.

El análisis de las concentraciones de ATP en sangre extraída de las venas porta o yugular, la vena cava y el corazón reveló un aumento de 30 a 50 veces en la concentración de ATP en la sangre de la vena porta en comparación con las otras muestras (ver figura 1 (c)), lo que indica que el ATP se absorbe fácilmente en el intestino delgado.

Reducción de los niveles de ATP endoluminal utilizando apirasa

Los inventores utilizaron una cepa de E. coli K-12 recombinante que expresa pHND10 (un plásmido recombinante basado en pBAD28 que lleva la fusión phoN2::HA8 que codifica una apirasa periplásmica (ATP-difosfohidrolasa) de Shigella flexneri9.

El ATP extracelular liberado concomitantemente con el crecimiento de E. coli fue indetectable en bacterias portadoras de pHND10, como se muestra en la figura 2 (a) y (b), lo que indica que la apirasa abrogaba eficazmente la secreción de ATP. La colonización de ratones con E. coli que expresa pHND10 dio como resultado concentraciones de ATP significativamente reducidas en el intestino delgado después de la administración de VAM, lo que indica que la liberación de PhoN2 (apirasa) después de la muerte celular bacteriana hidrolizó eficazmente ATP endoluminal.

Mejora de las respuestas inmunitarias específicas de antígeno

Los inventores demostraron la mejora de la respuesta de IgA anti-E. coli usando PhoN2. Los ratones C57BI/6 se alimentaron por sonda con E. coli albergando el plásmido pHND10 y el plásmido pBAD28 (que no codifica la apirasa PhoN2). El nivel de IgA específica de E. coli aumentó significativamente en ratones alimentados por sonda con bacterias transfectadas con pHND10 (que codifica apirasa). Por tanto, el ATP liberado por las bacterias limita el desarrollo de una respuesta de IgA de alta afinidad y la reducción de los niveles de ATP mediante la expresión de apirasa, como se demostró, permite que se produzca una respuesta de IgA de alta afinidad, como se muestra en las figuras 2 (c) y 3. La IgA anti-E. coli provocada por bacterias que expresan apirasa fue igualmente reactiva en bacterias que contenían pBAD28 y pHND10, lo que indica que la apirasa no promovió una respuesta de IgA “específica de apirasa” (véanse las figuras 2 (d) y (e)).

Los inventores abordaron el papel de la apirasa como adyuvante para la respuesta de IgA de alta afinidad midiendo el ATP endoluminal y la IgA anti-E. coli después de la administración oral de cloranfenicol y ampicilina (CA; que son activos en la flora endógena pero no de E. coli transformada con pBAD28) o penicilina/estreptomicina/vancomicina (PSV; que son bactericidas tanto de bacterias endógenas como bacterias transformadas con pBAD28). La IgA anti-E. coli de ratones alimentados por sonda con bacterias transformadas con pBAD28 se redujo por la administración de PSV, pero no de CA, concomitantemente con un aumento del ATP endoluminal. Ni la respuesta del ATP endoluminal ni de IgA anti E. coli se vio influida por CA o PSV en ratones colonizados con bacterias portadoras de pHND10 (ver figuras 2 (f) -(h)).

Se encontró que el hallazgo explicado anteriormente era específico de la bacteria en la que se administró la apirasa, es decir, E. coli. Se analizaron los anticuerpos IgA específicos para otras especies bacterianas y no se registró ningún aumento cuando se administró a los ratones pHND10 que albergaba E. coli en comparación a cuando se administró E. coli que albergaba pBAD28, como se muestra en la figura 2 (i).

Por tanto, los datos aquí proporcionados demuestran que las composiciones que comprenden apirasa u otro agente capaz de reducir el nivel de unión del ATP al receptor P2X7 pueden aumentar la respuesta de IgA específica a un inmunógeno incluido en la composición. Por tanto, las composiciones de la invención pueden resultar útiles como vacunas.

Ejemplo 2: E. coli en ratones monocolonizados libres de gérmenes

Los inventores monocolonizaron ratones libres de gérmenes con el fin de demostrar el efecto de la apirasa sobre los niveles de ATP endoluminal, el número de células de Tfh y del centro germinal y los niveles de IgA anti-E. coli en un entorno experimental controlado en el que estaban presentes la misma cantidad de estímulos bacterianos en el intestino además del ATP extracelular.

Reducción del ATP endoluminal en presencia de apirasa en ratones monocolonizados

Se monoclolonizaron ratones libres de gérmenes con E. coli transformada con pHND10 o pBAD28. La Figura 4 muestra que los ratones monocolonizados con pHND10 que alberga E. coli mostraron una concentración significativamente reducida de ATP endoluminal en el intestino en comparación con los ratones monocolonizados con pBAD28 que albergaba E. coli y los ratones control. Se utilizaron como control ratones libres de gérmenes que no estaban colonizados con E. coli.

El número de células Tfh y células B del centro germinal aumenta en presencia de apirasa en ratones monocolonizados

Los ratones libres de gérmenes monocolonizados con E. coli transformados con pHND10 o pBAD28 se analizaron para determinar el número de células Tfh (CD3+CD4+CXCR5+ICOS+) y el número de células B del centro germinal (CD19+Fas+PNA+) enumerando el total de células en los parches de Peyer y extrapolando las abundancias relativas de células Tfh y células B GC por sus frecuencias en FACS. La Figura 5 muestra que el número de células Tfh y células B del centro germinal aumentó en ratones monocolonizados con pHND10 que albergaba E. coli en comparación con ratones monocolonizados con pBAD28 que albergaba E. coli o ratones de control.

Este hallazgo es consistente con que el ATP endoluminal tiene un papel en la regulación de las células Tfh y las células B del centro germinal en las placas de Peyer del intestino delgado. La presencia de apirasa expresada en el pHND10 que alberga E. coli reduce los niveles de ATP endoluminal, lo que evita que el ATP reduzca el número de células Tfh y células del centro germinal.

La IgA anti-E. coli aumenta en presencia de apirasa en ratones monocolonizados

Los ratones libres de gérmenes monocolonizados con E. coli transformados con pHND10 o pBAD28 se ensayaron para la IgA anti-E. coli como se describió anteriormente. La Figura 6 muestra que el nivel de IgA específica de E. coli aumentó significativamente en ratones monocolonizados con pHND10 en comparación con ratones monocolonizados con pBAD28 o ratones de control.

Este hallazgo confirma que la IgA producida como resultado de la presencia de apirasa es específica de un inmunógeno administrado simultáneamente con la apirasa.

Ejemplo 3: Salmonella typhim urium atenuada en ratones colonizados normalmente

Generación de Salmonella Typhimurium que expresa apirasa

Para abordar si la expresión de apirasa en Salmonella Typhimurium viva atenuada podría aumentar la respuesta de IgA específica y conferir una mayor protección contra la infección por una cepa virulenta, los inventores utilizaron gyrA1816 Acyal Acrpl de Salmonella Typhimurium avirulenta (ATCC® 53648™) (que incluye mutaciones en cya y genes crp y es incapaz de producir adenilato ciclasa funcional así como proteína receptora de AMP cíclica) como vacuna modelo. Los inventores transformaron S. Typhimurium,con pBAD28 o pHND10 como se describió anteriormente. Como se observa en E. coli, la figura 7 muestra que el ATP era indetectable en el medio de cultivo de S. Typhimurium que llevaba pHND10 (y por tanto expresaba apirasa) (ver figura 7b), pero se detectó en cantidades crecientes que se correlacionaron con la densidad de células bacterianas en S. Typhimurium portando pBAD28 (y por tanto no expresaba apirasa) (ver figura 7a).

La Iga de anti-S. Typhimurium aumenta en presencia de apirasa

Los ratones normalmente colonizados se inmunizaron por sonda cada tres días tres veces con 5 x 109 S. Typhimurium avirulenta transformado con pHND10 o pBAD28. Se añadió arabinosa al 0,05% al agua de bebida de los animales para asegurar la máxima expresión de apirasa por los transformantes pHND10 durante la inmunización. Después de un mes desde la última inmunización, los ratones se ensayaron para detectar IgA secretado anti-Salmonella como se describió anteriormente para los ratones colonizados con E. coli. La Figura 8 muestra que la respuesta de IgA específica de Salmonella aumentó significativamente en ratones inmunizados per os con pFTND10 que portaba S. Typhimurium atenuada en comparación con S. Typhimurium atenuada que portaba pBAD28 o ratones de control.

Este hallazgo confirma que la IgA producida como resultado de la presencia de apirasa es específica del inmunógeno administrado simultáneamente con la apirasa.

La inmunización con apirasa portadora de S. Typhimurium atenuada protege contra S. Typhimurium virulento

La resistencia a la colonización por la flora comensal limita la infección por S. Typhimurium virulento. Por el contrario, el pretratamiento de ratones con estreptomicina permite el desarrollo eficiente de enterocolitis y tifoidea. Se probó la inmunización de ratones con S. Typhimurium atenuado transformado con pFTND10 o pBAD28 para determinar su capacidad para proteger contra la infección en 5 x 107 Salmonella virulenta (S. Tm wt:SB300 S. enterica serotipo Thyphimurium SL1344 (tipo salvaje) resistente a estreptomicina, como se describe en la referencia 10) tras la administración de estreptomicina un mes después de la última inmunización. La infección de ratones inmunizados previamente con Salmonella avirulenta que lleva pHND10 resultó en una recuperación significativamente reducida de Salmonella virulenta de los parches de Peyer y niveles apenas detectables de Salmonella virulenta en los ganglios linfáticos mesentéricos (MLN), el bazo y el hígado en comparación con los ratones inmunizados con transformantes pBAD28 o ratones control no inmunizados 48 h después de la infección (ver figura 9).

Esto es consistente con la disminución de los cambios fisiopatológicos después de la infección observada en ratones inmunizados con pHND10 que contiene S. Typhimurium atenuada en comparación con ratones inmunizados con pBAD28 que contiene S. Typhimurium o ratones no inmunizados. La Figura 10 muestra que el tamaño y el peso del bazo aumentan considerablemente en ratones infectados inmunizados con pBAD28 que alberga S. Typhimurium, pero no en ratones infectados inmunizados con pHND10 que alberga S. Typhimurium atenuada en comparación con un bazo de control de ratones no tratados. La Figura 11 muestra que la histología del hígado empeora en ratones infectados inmunizados con pBAD28 que alberga S. Typhimurium, pero no en ratones infectados inmunizados con pHND10 que alberga S. Typhimurium atenuada en comparación con un hígado de control de ratones no tratados.

Una forma adicional en la que los inventores demostraron que la inmunización con pHND10 que contenía S. Typhimurium atenuada dio como resultado que la protección contra Salmonella virulenta era controlada en un grado en que la infección con Salmonella virulenta causa fugas de la barrera endotelial intestinal. Esta fuga se controló analizando la permeabilidad del intestino al dextrano administrado a los ratones por sonda. Con este fin, los ratones C57BL/6J inmunizados con Salmonella avirulenta se infectaron vía oral con 5 x 107 Salmonella virulenta y fueron alimentados por sonda con 5 mg de dextrano FITC de 70 KDa. Después de 4 horas, se recogió sangre periférica y se analizó la presencia del fluoróforo en el suero. De cada valor, se restó el valor de fluorescencia de fondo del suero recogido de ratones no tratados.

Los ratones que habían sido protegidos eficazmente de los efectos de la infección virulenta por Salmonella no mostraban permeabilidad intestinal al dextrano, por lo que los sueros de dichos ratones contenían menos dextrano que los ratones que padecían los efectos de la infección virulenta por Salmonella (es decir. que habían sido protegidos de manera menos eficiente).

La Figura 12 muestra que los sueros de ratones inmunizados con pHND10 que albergaban S. Typhimurium atenuada contenían cantidades significativamente reducidas de dextrano después de la infección con S. Typhimurium virulenta en comparación con ratones de control no inmunizados y ratones inmunizados con pBAD28 que albergaban S. Typhimurium atenuada. Estos resultados indican que la respuesta de IgA proporcionada por la inmunización con bacterias que expresan apirasa confiere protección contra la propagación sistémica de Salmonella.

Las IgA adaptativas son responsables de la protección observada en presencia de apirasa.

Los inventores inmunizaron ratones deficientes en el gen 1 (Rag-1) que activa la recombinasa con S. Typhimurium atenuada que portaba pBAD28 o pHND10, como se describió anteriormente para los ratones C57BL/6, con el fin de observar el efecto que dicha inmunización tenía en ratones incapaces de producir linfocitos B o T maduros. La presencia de apirasa (en ratones inmunizados con S. Typhimurium atenuada que porta pHND10) no dio como resultado una protección mejorada contra la infección por Salmonella virulenta, como se muestra en la figura 13, con números comparables de unidades formadoras de colonias (UFC) virulentas de Salmonella recuperadas de los ganglios linfáticos mesentéricos ( MLN), hígado y bazo de ratones de control no inmunizados o ratones inmunizados con pBAD28 o pHND10 que albergan S. Typhimurium 48 h después del desafío con Salmonella virulenta. Estos resultados indican que los linfocitos (por ejemplo, las IgA adaptativas) son responsables de la protección observada por inmunización en ratones de tipo salvaje.

Ejemplo 4: Tratamiento de ratones con una composición de apirasa en ausencia de un inmunógeno en forma de vehículo bacteriano

Extracción de proteínas periplásmicas

Se inoculó asépticamente E. coli transformada con pBAD28 o pHND10 en medio LB que contenía arabinosa (0,3%) y ampicilina (100 |jg/ml) y se incubó a 37 °C durante 18 horas. Las bacterias (1011) se centrifugaron a 6.000 rpm durante 20 min a 4 °C, se lavaron dos veces en PBS, se resuspendieron en 1 ml de Tris-HCl 30 mM (pH 8,0), EDTA 4 mM, PMSF 1 mM, sacarosa al 20% y 0,5 mg/ml de lisozima y se incubaron durante 3 min a 30 °C; entonces se añadió MgCh a una concentración final de 10 mM y las bacterias se incubaron durante 1 hora a 30 °C. La suspensión de bacterias se centrifugó a 10.000 rpm durante 10 min a 4 °C y se administraron 100 |JÍ de sobrenadante (es decir, proteínas periplásmicas) a ratones C57BL/6 por sonda.

La IgA fecal aumentó en ratones tratados con proteínas periplásmicas de apirasa portadora de E. coli

Las concentraciones de IgA fecal se midieron en ratones que no se trataron o se sometieron a alimentación por sonda diariamente durante 15 días con proteínas periplásmicas de transformantes de E. coli pBAD28 (vector vacío) inducidos por arabinosa o pHND10 (vector portador de apirasa).

La Figura 14 muestra que los ratones tratados con una composición que contiene apirasa tienen un aumento de IgA fecal en comparación con los ratones no tratados o con los ratones tratados con una composición que no contiene apirasa. Estos datos indican que la apirasa es capaz de proporcionar una respuesta inmune de IgA dentro de una composición inmunológicamente inerte en el intestino (como se muestra por la falta de modificación de la concentración de IgA por proteínas periplásmicas de los transformantes pBAD28) y en ausencia de un inmunógeno en forma de vehículo bacteriano.

REFERENCIAS

[1] Proietti et al. (2014) Immunity 41, 789-801

[2] Kay et al. (2003) Nature. 424: 251

[3] Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472.

[4] Hapfelmeier et al., (2010)

[5] Atarashi, K. et al. (2008) Nature 455, 808-812

[6] Iwase, T. et al. (2010) J Clin Microbiol 48, 1949-1951

[7 ] Maurice, C.F. & Turnbaugh, P.J. (2013) Methods in enzymology 531, 91-107

[8] Scribano, D. et al. (2014) PloS one 9, e90230

[9] Santapaola, D. et al. (2006) Journal of bacteriology 188, 1620-1627

[10] Hoiseth, S.K. and Stocker, B.A. (1981) Nature 291: 238-239

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   i. Composición capaz de potenciar una respuesta inmunitaria de IgA y/o una respuesta inmunitaria de IgG para su uso en un método para potenciar y/o provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto, comprendiendo administrar dicha composición que comprende un agente capaz de reducir el nivel de unión de ATP a un receptor P2X7 a un sujeto, donde la composición se administra al sujeto vía oral y donde el agente comprende una enzima hidrolizante de ATP.

   2. Composición para su uso según la reivindicación 1, donde la enzima hidrolizante de ATP es apirasa.

   3. Composición para uso según la reivindicación 2, donde la apirasa es apirasa de Shigella flexneri. 4. Composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la composición comprende además un inmunógeno.

   5. Composición para su uso según la reivindicación 4, donde el inmunógeno es capaz de provocar una respuesta inmunitaria contra un patógeno gastrointestinal o un patógeno sistémico.

   6. Composición para su uso según la reivindicación 4 o la reivindicación 5, donde el inmunógeno es un antígeno bacteriano, un antígeno parasitario o un antígeno viral, donde el inmunógeno preferiblemente es capaz de provocar una respuesta inmune contra un patógeno seleccionado del grupo consistente en Vibrio cholerae, Clostridium difficile, Clostridium botulinum, Escherichia coli, Shigella boydii, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella sonnei, Salmonella enterica, Salmonella bognori, helmintos como Ascaris lumbricoides, protozoos como Giardia lamblia o Entamoeba histolytica, poliovirus, rotavirus, Adenovirus, virus de la Hepatitis A y virus de la inmunodeficiencia humana.

   7. Composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la composición no comprende un inmunógeno.

   8. Composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la composición comprende una bacteria recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica el agente capaz de reducir la unión de ATP al receptor P2X7.

   9. Composición para su uso según la reivindicación 8, donde la bacteria recombinante comprende además un ácido nucleico que codifica un inmunógeno.

   10. Composición para su uso según la reivindicación 8 o la reivindicación 9, donde la bacteria es Escherichia coli o Salmonella enterica atenuada.

   11. Composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la composición comprende un bacteriófago que comprende un ácido nucleico que codifica el agente capaz de reducir la unión de ATP al receptor P2X7 y, opcionalmente, donde el bacteriófago comprende además un ácido nucleico que codifica un inmunógeno.

   12. Composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la composición comprende un vector viral que comprende un ácido nucleico que codifica el agente capaz de reducir la unión de ATP al receptor P2X7.

   13. Composición para su uso según la reivindicación 12, donde el vector viral comprende además un ácido nucleico que codifica un inmunógeno.

   14. Composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la respuesta inmune de IgA y/o la respuesta inmune de IgG es una respuesta de la mucosa o donde la respuesta inmune de IgA y/o la respuesta inmune de IgG está en el intestino.

   15. Composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 en un método para prevenir o tratar una enfermedad infecciosa.

   16. Composición para su uso según la reivindicación 15, donde la enfermedad infecciosa está provocada por un patógeno gastrointestinal.

   17. Composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la composición está formulada para su administración en una nanocápsula.

   18. Composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la composición es una vacuna.