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ES2826400T3 - Recolección de contraste de colonias - Google Patents

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ES2826400T3
ES2826400T3 ES16720643T ES16720643T ES2826400T3 ES 2826400 T3 ES2826400 T3 ES 2826400T3 ES 16720643 T ES16720643 T ES 16720643T ES 16720643 T ES16720643 T ES 16720643T ES 2826400 T3 ES2826400 T3 ES 2826400T3
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ES16720643T
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English (en)
Inventor
Timothy M Wiles
Raphael Rodolphe Marcelpoil
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BD Kiestra BV
Original Assignee
BD Kiestra BV
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Abstract

Un procedimiento automatizado para evaluar el crecimiento microbiano en medios en placas, comprendiendo el procedimiento: proporcionar un medio de cultivo inoculado con una muestra biológica dispuesta en un recipiente que es sustancialmente ópticamente transparente; incubar el medio de cultivo inoculado en una incubadora; colocar el recipiente transparente que transporta el medio de cultivo inoculado en un aparato de formación de imágenes digitales; obtener una primera imagen digital del medio inoculado por primera vez (t0), donde la primera imagen digital tiene una pluralidad de píxeles; determinar las coordenadas de los píxeles en la primera imagen digital con respecto al recipiente transparente que transporta el medio de cultivo inoculado; retirar el recipiente transparente que transporta el medio de cultivo inoculado del aparato de formación de imágenes digitales y colocar el medio de cultivo inoculado en la incubadora para su posterior incubación; después de una incubación adicional, colocar el recipiente transparente que transporta el medio de cultivo inoculado en el aparato de formación de imágenes digitales; obtener una segunda imagen digital del medio inoculado en una segunda vez (tx), donde la segunda imagen digital tiene una pluralidad de píxeles; alinear la primera imagen digital con la segunda imagen digital, de modo que las coordenadas de un píxel en la segunda imagen digital correspondan a las coordenadas de un píxel correspondiente en la primera imagen digital; comparar los píxeles de la segunda imagen digital con píxeles correspondientes de la primera imagen digital; identificar píxeles que cambiaron entre la primera imagen digital y la segunda imagen digital, donde los píxeles que no han cambiado entre la primera imagen digital y la segunda imagen digital son indicativos del fondo; determinar cuál de los píxeles identificados en la segunda imagen digital tiene un nivel predeterminado de contraste umbral con los píxeles que indican el fondo; identificar uno o más objetos en la segunda imagen digital, cada objeto consiste en píxeles que cumplen con dicho nivel de contraste umbral y que no están separados entre sí por píxeles de fondo; para al menos uno de los objetos identificados, determinar una morfología de objeto a partir de los píxeles del objeto mediante la obtención de características del objeto a partir de la información de píxeles asociada con el objeto, donde las características del objeto comprenden al menos uno de forma del objeto, tamaño del objeto, borde del objeto y color del objeto, donde la morfología del objeto se determina en función de las características del objeto; y de la morfología del objeto, determinar si el objeto es un candidato a colonia; y proporcionar a la memoria las coordenadas de los píxeles asociados con el objeto.

Description

DESCRIPCIÓN
Recolección de contraste de colonias
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica el beneficio de la fecha de presentación de la Solicitud Provisional EE. UU. N.° 62/151.681, presentada el 23 de abril de 2015, y la Solicitud Provisional EE. UU. N.° 62/318.483, presentada el 5 de abril de 2016.
Antecedentes de la invención
Existe una mayor atención sobre las imágenes digitales de placas de cultivo para la detección de crecimiento microbiano. Técnicas para las placas de imágenes para detectar el crecimiento microbiano se describen en la Publicación PCT No. WO2015/114121.
Usando estas técnicas, el personal de laboratorio ya no está obligado a leer las placas por inspección visual directa, sino que puede utilizar imágenes digitales de alta calidad para la inspección de placas. El desplazamiento del flujo de trabajo de laboratorio y la toma de decisiones al examen de imágenes digitales de las placas de cultivo también puede mejorar la eficiencia. Las imágenes pueden ser marcadas por un operador para su posterior trabajo, ya sea por el operador u otra persona con las habilidades apropiadas. También se pueden tomar imágenes adicionales y usarlas para guiar procedimientos secundarios.
La detección de colonias, la enumeración de colonias, la diferenciación de la población de colonias y la identificación de colonias definen los objetivos de un sistema moderno de imágenes microbiológicas. Al lograr estos objetivos lo antes posible se logran las metas de entregar resultados a un paciente rápidamente y proporcionar dichos resultados y análisis de manera económica. Automatizar el flujo de trabajo y la toma de decisiones en el laboratorio puede mejorar la velocidad y el costo a los que se pueden lograr estos objetivos.
Aunque se han logrado avances significativos con respecto a las tecnologías de obtención de imágenes para detectar evidencia de crecimiento microbiano, todavía se busca extender dichas tecnologías de obtención de imágenes para dar soporte a un flujo de trabajo automatizado. Los aparatos y procedimientos para inspeccionar las placas de cultivo en busca de indicaciones de crecimiento microbiano son difíciles de automatizar, debido a la naturaleza altamente visual de la inspección de las placas. En este sentido, es deseable desarrollar técnicas que puedan interpretar automáticamente las imágenes de las placas de cultivo y determinar las siguientes etapas a realizar (por ejemplo, identificación de colonias, pruebas de susceptibilidad, etc.) basado en la interpretación automatizada.
Por ejemplo, identificar y distinguir colonias en un cultivo en placa puede ser difícil, especialmente cuando las colonias son de diferente tamaño y forma y se tocan entre sí. Estos problemas se exacerban cuando el crecimiento ya ha alcanzado la confluencia en algunas regiones de la placa. Por estas razones, es preferible, si es posible, identificar colonias y determinar el crecimiento temprano en el procedimiento. Sin embargo, todavía se necesita tiempo para la incubación para permitir al menos cierto crecimiento de las colonias. Así, por un lado, cuanto más tiempo se permite que las colonias crezcan, más comienzan a contrastar con su fondo y entre sí, y más fácil se hace identificarlas. Sin embargo, por otro lado, si se permite que las colonias crezcan demasiado tiempo y comienzan a llenar la placa y/o tocarse entre sí, se hace más difícil contrastarlas de su fondo y entre sí. Si fuese posible detectar colonias en un momento de incubación cuando las colonias eran todavía lo suficientemente pequeñas como para aislarse unas de otras - a pesar de un contraste relativamente pobre — este problema podría minimizarse o incluso resolverse.
Breve resumen de la invención
La invención es definida por las reivindicaciones 1, 16 y 17. Las realizaciones preferidas de la invención son definidas por las reivindicaciones dependientes. Todas las realizaciones que no caen dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas deben considerarse simplemente como ejemplos adecuados para comprender la invención.
Un aspecto de la presente descripción se refiere a un procedimiento automatizado para evaluar el crecimiento microbiano en medios en placas, que comprende: proporcionar un medio de cultivo inoculado con una muestra biológica dispuesta en un recipiente que es sustancialmente ópticamente transparente; incubar el medio de cultivo inoculado en una incubadora; colocar el recipiente transparente que transporta el medio de cultivo inoculado en el aparato de obtención de imágenes digitales; obtener una primera imagen digital del medio de cultivo inoculado en un primer momento (tü), donde la primera imagen digital tiene una pluralidad de píxeles; determinar las coordenadas de los píxeles en la primera imagen digital con respecto al recipiente que transporta el medio de cultivo inoculado; retirar el recipiente que transporta el medio de cultivo inoculado del aparato de obtención de imágenes digitales y colocar el medio de cultivo inoculado en la incubadora para incubación adicional; después de la incubación adicional, colocar el recipiente que transporta el medio de cultivo inoculado en el aparato de obtención de imágenes digitales; obtener una segunda imagen digital del medio de cultivo inoculado en un segundo momento (tx), la segunda imagen digital tiene una pluralidad de píxeles; alinear la primera imagen digital con la segunda imagen digital, de modo que las coordenadas de un píxel en la segunda imagen digital correspondan a las coordenadas de un píxel correspondiente en la primera imagen digital; comparar los píxeles de la segunda imagen digital con los píxeles correspondientes de la primera imagen digital; identificar los píxeles que cambiaron entre la primera imagen digital y la segunda imagen digital, donde los píxeles que no cambiaron entre la primera imagen digital y la segunda imagen digital son indicativos del fondo; determinar cuáles de los píxeles identificados en la segunda imagen digital tienen un nivel predeterminado de contraste umbral con los píxeles indicativos del fondo; identificar uno o más objetos en la segunda imagen digital, cada
objeto que consiste en píxeles que cumplen con dicho nivel de contraste umbral y que no están separados entre sí por píxeles de fondo; para al menos uno de los objetos identificados, determinar una morfología del objeto a partir de los píxeles del objeto; a partir de la morfología del objeto, determinar si el objeto es un candidato a colonia; y proporcionar a la memoria las coordenadas de los píxeles asociados con el objeto.
En algunos ejemplos, el procedimiento puede comprender además obtener una pluralidad de primeras imágenes digitales por primera vez en función de una serie predeterminada de condiciones de iluminación, donde cada una de las primeras imágenes digitales se obtiene bajo una condición de iluminación diferente, donde cada condición de iluminación comprende una orientación específica del recipiente ópticamente transparente que transporta el medio de cultivo inoculado con respecto a una fuente de iluminación, y un color de fondo específico sobre el cual se coloca el recipiente ópticamente transparente en el aparato de formación de imágenes digitales. Las orientaciones especificadas pueden comprender: la fuente de iluminación dirigida hacia abajo hacia la parte superior del recipiente ópticamente transparente que transporta el medio de cultivo inoculado; la fuente de iluminación dirigida hacia arriba hacia la parte inferior del recipiente ópticamente transparente que transporta el medio de cultivo inoculado; y la fuente de iluminación dirigida hacia un lado del recipiente ópticamente transparente que transporta el medio de cultivo inoculado. Para las orientaciones superior y lateral especificadas, el color de fondo especificado puede ser negro. Para la orientación inferior especificada, el color de fondo especificado puede ser blanco. Las condiciones de iluminación pueden comprender además un espectro de iluminación específico que comprende: una fuente de iluminación que emite longitudes de onda rojas; una fuente de iluminación que emite longitudes de onda verdes; y una fuente de iluminación que emite longitudes de onda azules.
En algunos ejemplos, el procedimiento puede comprender además obtener características del objeto a partir de la información de píxeles asociada con el objeto, donde las características del objeto comprenden al menos una de forma del objeto, tamaño del objeto, borde del objeto y color del objeto, donde la morfología del objeto se determina en función de las características del objeto. El color del objeto puede determinarse a partir de las características espectrales de los píxeles asociados con el objeto. Las características espectrales se pueden seleccionar del grupo que consiste en color de píxeles, matiz, luminancia y crominancia. También se puede obtener información de la característica del fondo. La información de la característica del fondo puede comprender tipo de medio y color del medio, y la morfología del objeto puede determinarse además en función de la información de la característica del fondo. Las características del objeto y la información de la característica del fondo pueden compararse con otras características del objeto y otra información de la característica del fondo almacenadas en la memoria, y un tipo de microorganismo puede determinarse en función de las características del objeto y la información de la característica de fondo.
En algunos ejemplos, alinear la primera imagen digital con la segunda imagen digital puede comprender asignar coordenadas polares a píxeles de cada una de la primera y segunda imágenes digitales de modo que las coordenadas polares de un píxel en la segunda imagen digital sean las mismas que las coordenadas polares de un píxel correspondiente en la primera imagen digital. Además, en algunos ejemplos, se puede proporcionar una pluralidad de medios de cultivo, inoculados con una muestra biológica, dispuestos en uno o más recipientes ópticamente transparentes, incubados en una incubadora y colocados en el aparato de formación de imágenes digitales al mismo tiempo que el fotograma de crecimiento bacteriano, mediante el cual se obtienen la primera y segunda imágenes digitales para cada medio de cultivo. Además, en algunos ejemplos, el procedimiento puede comprender además identificar información de píxeles en la primera imagen digital que es evidencia de condensación en el recipiente ópticamente transparente o medio en placa, y restar la información de píxeles atribuida a la condensación de la imagen. La información de píxeles que es evidencia de condensación puede identificarse en una imagen digital para la cual la fuente de iluminación se dirigió hacia arriba hacia la parte inferior del recipiente ópticamente transparente, y donde la información de píxeles para aquellos píxeles que tienen una densidad óptica por debajo de un valor umbral predeterminado se resta de la imagen.
En algunos ejemplos, el procedimiento puede comprender, además: identificar información de píxeles en cualquiera de la primera y segunda imágenes digitales que es evidencia de polvo; y restar la información de píxeles atribuida al polvo de la imagen. La información de píxeles que es evidencia de polvo se puede identificar en una imagen digital para la cual: el recipiente ópticamente transparente contiene medios de cultivo blancos, la fuente de iluminación se dirige hacia abajo hacia la parte superior del recipiente ópticamente transparente y el color de fondo es negro; el recipiente ópticamente transparente contiene medios de cultivo coloreados u oscuros, la fuente de iluminación se dirige hacia abajo hacia la parte superior del recipiente ópticamente transparente y el color de fondo es blanco; o la fuente de iluminación se dirige hacia arriba hacia la parte inferior del recipiente ópticamente transparente. El polvo puede ser polvo en cualquiera de los medios de cultivo, en el recipiente ópticamente transparente o un componente óptico del aparato de formación de imágenes digitales.
En algunos ejemplos, el procedimiento puede comprender además: obtener una tercera imagen digital del medio inoculado, donde la tercera imagen digital se obtiene en un momento entre el momento en que se adquiere la primera imagen digital y el momento en que se adquiere la segunda imagen digital, donde el medio de cultivo inoculado se retira del aparato de formación de imágenes digitales y se coloca en la incubadora entre la adquisición de la primera y la segunda imágenes digitales y entre la adquisición de la segunda y la tercera imágenes digitales; alinear la tercera imagen digital con la primera imagen digital, de modo que las coordenadas de un píxel en la tercera imagen digital sean las mismas que las coordenadas de un píxel correspondiente en la primera imagen digital; comparar los píxeles de la tercera y la segunda imágenes digitales entre sí; e identificar píxeles que han cambiado entre la tercera y la segunda imágenes digitales. El tiempo de incubación entre la primera y tercera imágenes digitales puede ser igual al tiempo de incubación entre la tercera y segunda imágenes digitales. Al menos uno de los objetos identificados puede estar asociado con los píxeles identificados que cambiaron entre la tercera y segunda imágenes digitales.
En algunos ejemplos, el procedimiento puede comprender además: obtener una tercera imagen digital del medio inoculado, donde la tercera imagen digital se obtiene después del momento en que se obtiene la segunda imagen digital, donde el medio de cultivo inoculado se retira del aparato de formación de imágenes digitales y se coloca en la incubadora entre el momento en que se obtienen la segunda y la tercera imágenes digitales; alinear la tercera imagen digital con la primera y la segunda imágenes digitales, de modo que las coordenadas de un píxel en la tercera imagen digital sean las mismas que las coordenadas de un píxel correspondiente en la primera y la segunda imágenes digitales; comparar los píxeles de la tercera y la segunda imágenes digitales entre sí; identificar píxeles que cambiaron entre la segunda y la tercera imágenes digitales; y determinar que un objeto identificado en la segunda imagen digital ha cambiado en la tercera imagen digital en función de los píxeles comparados de la segunda y la tercera imágenes digitales que se identificaron como modificados. Un objeto identificado en la segunda imagen digital que se ha determinado que cambia en la tercera imagen digital puede ser determinado que es un objeto semilla a partir del cual se evalúa el alcance del cambio determinado. En tal caso, el procedimiento puede comprender además actualizar las coordenadas de los píxeles asociados con el objeto en la memoria en función de los píxeles identificados que han cambiado entre la segunda y la tercera imágenes digitales.
Otro aspecto de la presente descripción se refiere a un procedimiento para identificar el crecimiento microbiano en medios en placas que ha sido inoculado con un cultivo e incubado, el procedimiento comprende: al inicio de la incubación del medio (t0), obtener una primera imagen digital del medio, la primera imagen digital tiene una pluralidad de píxeles; asignar coordenadas a uno o más píxeles de la primera imagen digital; después de un período de incubación para el medio (tx), obtener una segunda imagen digital del medio, la segunda imagen digital tiene una pluralidad de píxeles; alinear la segunda imagen digital con la primera imagen digital, donde dicha alineación se basa en las coordenadas asignadas a los píxeles de la primera imagen y uno o más píxeles de la segunda imagen correspondientes a los píxeles de la primera imagen a los que se les asignaron las coordenadas; generar datos de contraste espacial indicativos de cambios entre píxeles localmente adyacentes de la segunda imagen digital; generar datos de contraste temporal indicativos de cambios entre píxeles correspondientes de la primera y segunda imagen digital; para cada uno de una pluralidad de píxeles de la segunda imagen digital, asignar un valor de contraste al píxel en función de una combinación de los datos de contraste espacial y los datos de contraste temporal del píxel; asociar píxeles adyacentes que tienen valores de contraste que son mayores que un umbral predeterminado y dentro de un margen de error predeterminado entre sí, los píxeles asociados constituyen un objeto identificado; y almacenar cada objeto identificado en memoria como una colonia candidata.
En algunos ejemplos, combinar los datos de contraste espacial y temporal comprende promediar los datos de contraste espacial y temporal. Los datos de contraste espacial y temporal pueden combinarse en función de una media ponderada.
Generar datos de contraste espacial puede comprender; obtener una pluralidad de imágenes en el tiempo tx, donde cada una de la pluralidad de imágenes se obtiene en diferentes condiciones de iluminación; procesar datos espaciales en cada una de la pluralidad de imágenes to; y combinar los datos espaciales procesados. El procesamiento de los datos espaciales puede comprender procesar por separado los resultados de datos espaciales para cada condición de iluminación y seleccionar un resultado máximo de los resultados de datos espaciales procesados por separado.
La generación de datos de contraste temporal puede comprender: obtener una pluralidad de imágenes en el tiempo para cada una de la pluralidad de imágenes que se obtienen en diferentes condiciones de iluminación; obtener una pluralidad de imágenes en el tiempo tx, las condiciones de iluminación de cada imagen en el tiempo tx correspondientes a las condiciones de iluminación de una imagen obtenida en el tiempo t0 para; procesar datos temporales en cada una de las imágenes correspondientes a y tx; y combinar los datos temporales procesados. El procesamiento de los datos temporales puede comprender procesar por separado los resultados de datos temporales para cada condición de iluminación y seleccionar un resultado máximo de los resultados de datos temporales procesados por separado.
En algunos ejemplos, el procedimiento puede comprender además, para un objeto identificado dado: obtener una pluralidad de características del objeto a partir de la información de píxeles asociada con el objeto, donde las características del objeto comprenden al menos una característica morfométrica, donde la característica morfométrica es al menos uno de una forma de objeto, área de objeto, perímetro de objeto o borde de objeto; combinar las características del objeto usando un algoritmo de clasificación; comparar las características del objeto combinadas con información de característica del objeto para una pluralidad de microorganismos almacenados en la memoria; y clasificar el objeto identificado como un tipo de microorganismo en función de la comparación. Las características del objeto pueden comprender además al menos un rasgo espectral, donde el rasgo espectral es al menos uno de un color del objeto, brillo del objeto, matiz del objeto, croma del objeto o al menos un rasgo temporal (donde el rasgo temporal es al menos uno de una velocidad de crecimiento del objeto, un cambio en el color del objeto o un tiempo proyectado en el que el objeto se pudo observar visualmente por primera vez). Al menos una de las características del objeto puede obtenerse para cada píxel del objeto identificado y a continuación, combinarse usando uno o más histogramas estadísticos, características. El algoritmo de clasificación puede ser un algoritmo de aprendizaje automático supervisado, donde las características del objeto combinadas se pueden comparar con la información de característica del objeto para cuatro o menos microorganismos almacenados en la memoria.
En algunos ejemplos, el procedimiento puede comprender además, para un objeto identificado dado: para cada píxel del objeto identificado, asignar un valor de contraste temporal al píxel en función de los datos de contraste temporal del píxel; identificar uno o más máximos a partir de los valores de contraste temporal asignados; si se identifica más de un máximo, determinar si los máximos están asociados con un conjunto formador de colonias común o con diferentes conjuntos formadores de colonias; y para cualesquiera dos máximos determinados como asociados con diferentes unidades formadoras de colonias, segmentar el objeto identificado en dos objetos en función al menos en parte de las ubicaciones respectivas de dichos dos máximos. Determinar si dos máximos están asociados con una unidad formadora de colonias común o con diferentes conjuntos formadores de colonias puede comprender además: para cada máximo, determinar una distancia desde el máximo hasta un borde del objeto identificado; calcular un valor del factor de inclusión en función de cada distancia determinada y la distancia entre los dos máximos; y comparar el valor del factor de inclusión con un intervalo predeterminado, donde los máximos están asociados con un conjunto formador de colonias común si el valor del factor de inclusión es menor que el intervalo predeterminado, y los máximos están asociados con diferentes unidades formadoras de colonias si el valor del factor de inclusión es mayor que el intervalo predeterminado. Si el valor del factor de inclusión está dentro del intervalo predeterminado, el procedimiento puede comprender además: para cada máximo, determinar una región que rodea el máximo; y calcular una convexidad de las respectivas regiones que rodean los máximos, donde si la convexidad es mayor que un valor umbral, los máximos se asocian con diferentes unidades formadoras de colonias.
En algunos ejemplos, el procedimiento puede comprender además: identificar uno o más objetos en una imagen digital primero en el tiempo en función de los datos de contraste espacial; y, para un objeto identificado dado en una imagen digital segunda en el tiempo, si los datos de contraste espacial y temporal combinados para el objeto en la imagen digital segunda en el tiempo coinciden con los datos de contraste espacial para un objeto identificado en la imagen digital primera en el tiempo, clasificar el objeto en la segunda imagen digital como un artefacto.
Aun otro aspecto de la presente descripción se refiere a un procedimiento para evaluar el crecimiento microbiano en medio en placa que ha sido inoculado con un cultivo e incubado, el procedimiento comprende: obtener la primera y segunda imágenes digitales del medio en placa, cada imagen digital obtenida después de un período de incubación para el medio inoculado y en un momento diferente; alinear la segunda imagen digital con la primera imagen digital, donde dicha alineación se basa en las coordenadas asignadas a los píxeles de la primera imagen y uno o más píxeles de la segunda imagen correspondiente a los píxeles de la primera imagen a los que se les asignaron las coordenadas; generar datos de contraste temporal indicativos de cambios entre los píxeles correspondientes de la primera y segunda imágenes digitales; identificar un objeto en la segunda imagen digital a partir de los datos de contraste temporal; obtener una o más características del objeto dinámico del objeto identificado a partir de los datos de contraste temporal; clasificar el objeto identificado como un tipo de organismo en función de una o más características del objeto dinámico; y almacenar el objeto identificado y su clasificación en memoria. En algunos ejemplos, la una o más características del objeto dinámico pueden incluir una velocidad de crecimiento del objeto identificado, un cambio a una característica cromática del objeto identificado o un cambio en el crecimiento a lo largo de un eje proximalmente normal al medio en placa.
En algunos ejemplos, el procedimiento puede comprender además: obtener una tercera imagen digital del medio en placa después de un período de incubación para el medio inoculado y en un momento diferente a la primera y segunda imágenes digitales; alinear la tercera imagen digital con la primera y segunda imágenes digitales; y generar datos de contraste temporal indicativos de cambios entre píxeles correspondientes de la segunda y tercera imágenes digitales, donde el objeto se identifica además en función de dichos datos de contraste temporal, y donde la una o más características del objeto dinámicas del objeto identificado incluye una segunda derivada de los datos de contraste temporal. La una o más características del objeto dinámico pueden incluir una velocidad de aceleración de crecimiento de objeto
Sin embargo, un aspecto adicional de la presente descripción se dirige a un medio de almacenamiento de memoria legible por computadora que tiene instrucciones de programa codificadas en este configuradas para hacer que un procesador realice un procedimiento. El procedimiento puede ser cualquiera de los procedimientos anteriores para evaluar el crecimiento microbiano en medios en placas, identificar el crecimiento microbiano en medios en placas que han sido inoculados con un cultivo e incubados, o evaluar el crecimiento microbiano en medios en placas que han sido inoculados con un cultivo e incubados.
Un aspecto aún más de la presente se dirige a un sistema para evaluar el crecimiento en un medio de cultivo inoculado con una muestra biológica. El sistema comprende un dispositivo de adquisición de imágenes para capturar imágenes digitales del medio de cultivo, memoria y uno o más procesadores operables para ejecutar instrucciones para realizar un procedimiento. En algunos ejemplos, la memoria puede almacenar información con respecto a las imágenes digitales capturadas, y el procedimiento realizado por las instrucciones ejecutadas puede ser cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente para evaluar el crecimiento microbiano en medios en placas. En otros ejemplos, la memoria puede almacenar información con respecto a los objetos de colonia candidata identificados en las imágenes digitales capturadas, y el procedimiento realizado por las instrucciones ejecutadas puede ser cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente para identificar el crecimiento microbiano en medios en placas que se han inoculado con un cultivo y se han incubado. En aun ejemplos adicionales, la memoria puede almacenar información con respecto a uno o más objetos identificados en las imágenes digitales capturadas, y una o más clasificaciones de los objetos identificados, y el procedimiento realizado por las instrucciones ejecutadas puede ser cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente para evaluar el crecimiento microbiano en medios en placas que se inocularon con un cultivo y se incubaron.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 es un diagrama esquemático de un sistema, para obtener imágenes que analizan y prueban un cultivo en función de un aspecto de la descripción.
La FIG. 2 es un diagrama de flujo que ilustra una rutina de flujo de trabajo de laboratorio automatizada para la obtención de imágenes que analiza y prueba un cultivo en función de un aspecto de la descripción.
Las FIGS. 3A, 3B y 3C son imágenes que muestran un contraste temporal mediante una representación visual de la morfología de la colonia a medida que cambia con el tiempo en función de un aspecto de la descripción. Las FIGS. 3D y 3E son imágenes que muestran contraste espacial en diferentes condiciones de iluminación. La FIG. 4 es un diagrama de flujo de un ejemplo de rutina para obtener y analizar información de imagen en función de un aspecto de la descripción.
La FIG. 5 es un diagrama de flujo de una rutina ejemplar para obtener contraste espacial en función de un aspecto de la descripción.
La FIG. 6 es un diagrama de flujo de un ejemplo de rutina para obtener contraste temporal en función de un aspecto de la descripción.
La FIG. 7 es un diagrama de flujo de una rutina ejemplar para filtrar artefactos de una imagen en función de un aspecto de la descripción.
La FIG. 8 es un diagrama de flujo de una rutina ejemplar para etiquetar píxeles de una imagen en función de un aspecto de la descripción.
La FIG. 9 es un diagrama de flujo de un ejemplo de rutina para separar colonias en objetos separados en función de un aspecto de la descripción.
La FIG. 10 es un diagrama de flujo de un ejemplo de rutina de segmentación de objetos en función de un aspecto de la descripción.
La FIG. 11 es una ilustración que muestra mediciones de colonias confluentes como parte de la rutina de segmentación de la FIG. 10.
La FIG. 12 es un diagrama de Voronoi en función de un aspecto de la descripción.
Las FIGS. 13A, 13B y 13C son diagramas que ilustran mediciones del factor de aislamiento en función de un aspecto de la descripción.
La FIG. 14 es un diagrama que ilustra regiones de influencia de Voronoi en función de un aspecto de la descripción.
Las FIGS. 15A, 15B y 15C son imágenes que ilustran una caracterización del crecimiento de colonia en función de un aspecto de la descripción.
Las FIGS. 16A y 16B muestran una sección de una placa Imagen, con imágenes ampliadas y reorientadas de colonias de muestra de la imagen.
La FIG. 16C muestra diagramas vectoriales de las respectivas imágenes de la FIG. 16B.
La FIG. 17 representa SHQI, contraste espacial e imágenes de contraste temporal de un espécimen en función de un aspecto de la descripción.
La FIG. 18 es un diagrama de flujo que compara la línea de tiempo de la rutina de la FIG. 2 a la línea de tiempo de una rutina manual comparable.
Descripción detallada
La presente descripción proporciona un aparato, sistemas y procedimientos para identificar y analizar el crecimiento microbiano en medios en placas en función, al menos en parte, del contraste detectado en una o más imágenes digitales del medio en placa. Muchos de los procedimientos descritos en esta invención pueden estar total o parcialmente automatizados, tales como estar integrados como parte de un flujo de trabajo de laboratorio total o parcialmente automatizado.
Los sistemas descritos en esta invención pueden implementarse en sistemas ópticos para la obtención de imágenes de muestras de microbiología para la identificación de microbios y la detección del crecimiento microbiano de dichos microbios. Hay muchos de estos sistemas comercialmente disponibles, que no se describen en detalle en esta invención. Un ejemplo es el sistema de incubación e imagen inteligente BD Kiestra™ ReadA Compact. Otros sistemas de ejemplo incluyen los descritos en la publicación PCT n.° WO2015/114121 y la Publicación de Patente EE. UU.: 2015/0299639.
La FIG. 1 es un esquema de un sistema 100 que tiene un módulo de procesamiento 110 y un dispositivo de adquisición de imágenes 120 (por ejemplo, cámara) para proporcionar imágenes de alta calidad de medios en placas. El módulo de procesamiento y el dispositivo de adquisición de imágenes pueden conectarse adicionalmente a, y por lo tanto interactuar adicionalmente con, otros componentes del sistema, tales como un módulo de incubación (no mostrado) para incubar el medio en placa para permitir el crecimiento de un cultivo inoculado en el medio en placa. Dicha conexión puede automatizarse total o parcialmente usando un sistema de vías que recibe especímenes para incubación y las transporta a la incubadora, y a continuación, entre la incubadora y el dispositivo de adquisición de imágenes.
El módulo de procesamiento 110 puede indicar a los otros componentes del sistema 100 que realicen tareas basadas en el procesamiento de diversos tipos de información. El procesador 110 puede ser hardware que realiza una o más operaciones. El procesador 110 puede ser cualquier procesador estándar, tal como una unidad de procesamiento central (CPU), o puede ser un procesador dedicado, tal como un circuito integrado específico de la aplicación (ASIC) o una matriz de puerta programable de campo (FPGA). Si bien se muestra un bloque de procesador, el sistema 100 también puede incluir múltiples procesadores que pueden funcionar o no en paralelo, u otra lógica y memoria dedicada para almacenar y rastrear información relacionada con los recipientes de muestra en la incubadora y/o dispositivo de adquisición de imágenes 120. En este sentido, el conjunto de procesamiento puede rastrear y/o almacenar varios tipos de información con respecto a un espécimen en el sistema 100, que incluye, de modo no taxativo, la ubicación del espécimen en el sistema (incubadora o dispositivo de adquisición de imágenes, ubicaciones y/u orientación en esta, etc.), el tiempo de incubación, información de píxeles de imágenes capturadas, el tipo de muestra, el tipo de medio de cultivo, información de manejo preventivo (por ejemplo, especímenes peligrosos), etc. En este sentido, el procesador puede ser capaz de automatizar total o parcialmente las diversas rutinas descritas en esta invención. En una realización, las instrucciones para realizar las rutinas descritas en esta invención se pueden almacenar en un medio legible por computadora no transitorio (por ejemplo, un programa de software).
La FIG. 2 es un diagrama de flujo que muestra un ejemplo de rutina de laboratorio automatizada 200 para obtener imágenes, analizar y, opcionalmente, probar un cultivo. La rutina 200 puede implementarse mediante un sistema de laboratorio de microbiología automatizado, tal como la Automatización de Laboratorio Total BD Kiestra™ o la Automatización de Célula de Trabajo BD Kiestra™. Los sistemas de ejemplo incluyen módulos interconectados, cada módulo configurado para ejecutar una o más etapas de la rutina 200.
En 202, se proporciona un medio de cultivo y se inocula con una muestra biológica. El medio de cultivo puede ser un recipiente ópticamente transparente, de modo que la muestra biológica puede observarse en el recipiente mientras se ilumina desde varios ángulos. La inoculación puede seguir un patrón predeterminado. Los patrones de rayado y los procedimientos automatizados para rayar una muestra en una placa son bien conocidos por un experto en la materia y no se discuten en detalle en esta invención. Un procedimiento automatizado utiliza perlas controladas magnéticamente para filetear la muestra en la placa. En 204, el medio se incuba para permitir el crecimiento de la muestra biológica.
En 206, se capturan una o más imágenes digitales del medio y una muestra biológica. Como se describirá con mayor detalle a continuación, las imágenes digitales del medio se pueden realizar múltiples veces durante el procedimiento de incubación (por ejemplo, al inicio de la incubación, en un momento en el medio de la incubación, al final de la incubación) para que se puedan observar y analizar los cambios en el medio. La obtención de imágenes del medio puede implicar retirar el medio de la incubadora. Cuando se toman múltiples imágenes del medio en diferentes momentos, el medio puede devolverse a la incubadora para una incubación adicional entre las sesiones de obtención de imágenes.
En 208, la muestra biológica se analiza en función de la información de las imágenes digitales capturadas. El análisis de la imagen digital puede implicar el análisis de la información de píxeles contenida en la imagen. En algunos casos, la información de píxeles puede analizarse píxel por píxel. En otros casos, la información de píxeles se puede analizar bloque por bloque. En aun casos adicionales, los píxeles se pueden analizar en función de regiones enteras de píxeles, por lo que la información de píxeles individuales en la región se puede derivar combinando información de los píxeles individuales, seleccionando píxeles de muestra o usando otros procedimientos estadísticos tales como las operaciones de histograma estadístico descritas con mayor detalle a continuación. En la presente descripción, las operaciones que se describen como aplicadas a “píxeles” son aplicables de manera similar a bloques u otros grupos de píxeles, y el término “píxel” pretende incluir dichas aplicaciones.
El análisis puede implicar determinar si se detecta crecimiento en el medio. Desde una perspectiva de análisis de imágenes, el crecimiento se puede detectar en una imagen mediante la identificación de un objeto con imágenes (en función de las diferencias entre el objeto y su entorno adyacente) y a continuación, identificar cambios en el objeto a lo largo del tiempo. Tal como se describe con mayor detalle en esta invención, estas diferencias y cambios son ambas formas de “contraste.” Además de detectar el crecimiento, el análisis de imagen en 108 puede implicar además cuantificar la cantidad de crecimiento detectado, identificar colonias distintas, identificar colonias hermanas, etc.
En 210, se determina si la muestra biológica (particularmente, las colonias hermanas identificadas) exhibe un crecimiento cuantitativamente significativo. Si no se encuentra crecimiento, o una cantidad insignificante de crecimiento, a continuación, la rutina 200 puede proceder a 220, en la que se produce un informe final. En el caso de proceder del 210 al 220, el informe final probablemente indicará la falta de crecimiento significativo, o reportará el crecimiento de flora normal.
Si se determina que la muestra biológica exhibe un crecimiento cuantitativamente significativo, a continuación, en 212, se pueden seleccionar una o más colonias de las imágenes en función del análisis previo. La recogida de colonias puede ser un procedimiento completamente automatizado, en el cual cada una de las colonias seleccionadas es muestreada y probada. De manera alternativa, la recogida de colonias puede ser un procedimiento parcialmente automatizado, en el que múltiples colonias candidatas se identifican automáticamente y se presentan visualmente en una imagen digital a un operador, de modo que el operador puede ingresar una selección de una o más candidatas para muestreo y pruebas adicionales. El muestreo de colonias seleccionadas o recolectadas puede ser automatizado por el sistema.
En 214, se prepara una colonia muestreada para las pruebas adicionales, tal como mediante la colocación de la muestra en un organismo, suspensión. En 216, la muestra se evalúa utilizando imágenes de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI) para identificar el tipo de espécimen que se muestreó del medio original. En 218, la muestra también, o alternativamente, se somete a pruebas de susceptibilidad a antibióticos (AST) para identificar posibles tratamientos para el espécimen identificado.
En 220, los resultados de las pruebas se generan en un informe final. El informe puede incluir los resultados de MALDI y AST. Tal como se mencionó anteriormente, el informe también puede indicar una cuantificación del crecimiento de especímenes. Por lo tanto, el sistema automatizado es capaz de comenzar con un medio de cultivo inoculado y generar un informe final con respecto a un espécimen encontrado en el cultivo, con poca o ninguna entrada adicional.
En rutinas tales como la rutina ejemplar de la FIG. 2, las colonias detectadas e identificadas a menudo se conocen como Conjuntos Formadores de Colonias (CFC). Los CFC son objetos microscópicos que comienzan como una o unas pocas bacterias. Con el tiempo, las bacterias crecen para formar una colonia. Cuanto antes se colocan las bacterias en la placa, menos bacterias hay que detectar y, en consecuencia, más pequeña es la colonia y menor es el contraste con el fondo. Dicho de otra manera, un tamaño de colonia más pequeño produce una señal más pequeña, y una señal más pequeña en un fondo constante da como resultado un contraste más pequeño. Esto se refleja en la siguiente ecuación:
señal-fondo
(1) Contraste = señal+fondo
El contraste puede desempeñar un papel importante en la identificación de objetos, como CFC u otros artefactos, en las imágenes. Un objeto puede detectarse en una imagen si es significativamente diferente en brillo, color y/o textura de su entorno. Una vez que se ha detectado un objeto, el análisis también puede implicar identificar el tipo de objeto que se ha detectado. Dichas identificaciones también pueden basarse en mediciones de contraste, tales como la suavidad de los bordes del objeto identificado, o la uniformidad (o falta de uniformidad) del color y/o brillo del objeto. Este contraste debe ser lo suficientemente grande como para superar el ruido de la imagen (señales de fondo) para ser detectado por el sensor de imagen.
La percepción humana del contraste (regida por la ley de Weber) es limitada. En condiciones óptimas, los ojos humanos pueden detectar una diferencia de nivel de luz del 1 %. La calidad y confianza de las mediciones de imagen (por ejemplo, brillo, color, contraste) pueden caracterizarse por una relación señal/ruido (SNR) de las mediciones, en la que un valor SNR de 100 (o 40db), independiente de las intensidades de píxeles, coincidiría con las capacidades de detección humana. Las técnicas de obtención de imágenes digitales que utilizan información de obtención de imágenes de alta SNR y la información conocida de SNR por píxel pueden permitir la detección de colonias incluso cuando esas colonias aún no son visibles para los ojos humanos.
En la presente descripción, el contraste se puede recopilar de al menos dos maneras: espacial y temporalmente. El contraste espacial, o contraste local, cuantifica la diferencia de color o brillo entre una región dada (por ejemplo, píxel, grupo de píxeles adyacentes) y sus alrededores en una sola imagen. El contraste temporal, o contraste de tiempo, cuantifica la diferencia de color o brillo entre una región dada de una imagen frente a esa misma región en otra imagen tomada en un momento diferente. La fórmula que rige el contraste temporal es similar a la del contraste espacial;
|s e ñ a l( t0)-s e ñ a l( t]_ ) |
(2) Contraste temporal = señal (t 0)+señal (t1)
en la que t1 es un tiempo posterior a t0. Se pueden usar contrastes espaciales y temporales de una imagen dada para identificar objetos. Los objetos identificados pueden a continuación, someterse a pruebas adicionales para determinar su importancia (por ejemplo, si son CFC, flora normal, polvo, etc.).
Las FIGS. 3A, 3B y 3C proporcionan una demostración visual del efecto que el contraste temporal puede tener en una muestra visualizada. Las imágenes que se muestran en la FIG. 3A se capturaron en diferentes puntos en el tiempo (de izquierda a derecha, de fila superior a fila inferior) mostrando el crecimiento general en la muestra. Si bien el crecimiento es notable en la FIG. 3A, el crecimiento es aún más notable, y se puede notar incluso antes en la secuencia, a partir de las imágenes temporales de contraste correspondientes de la FIG. 3B. A efectos de claridad, la FIG. 3C muestra una sección ampliada de la FIG. 3B. Como se puede observar en la FIG. 3C, cuanto más larga sea la imagen de una porción de una colonia, más brillante será una mancha en la imagen de contraste. De esta manera, el centro de masa de cada colonia puede ser denotado por el centro brillante, o pico, de la colonia. Por lo tanto, los datos de imagen obtenidos a lo largo del tiempo pueden revelar información importante sobre los cambios en la morfología de las colonias.
Para maximizar el contraste espacial o temporal de un objeto contra su fondo, el sistema puede capturar imágenes usando diferentes luces incidentes sobre diferentes fondos. Por ejemplo, cualquiera de la iluminación superior, la iluminación inferior o la iluminación lateral se puede usar sobre un fondo blanco o negro.
Las FIGS. 3D y 3E proporcionan una demostración visual del efecto que las condiciones de iluminación pueden tener en una muestra visualizada. La imagen en la FIG. 3D se capturó usando iluminación superior, mientras que la imagen en la FIG. 3E se capturó aproximadamente al mismo tiempo (por ejemplo, lo suficientemente cerca en el tiempo como para que no se haya producido un crecimiento notable o significativo) usando iluminación inferior. Como se puede observar, cada una de las imágenes en las muestras de las FIGS. 3D y 3E contienen varias colonias, pero se puede ver información adicional sobre las colonias (en este caso, hemólisis) gracias a la retroiluminación o iluminación inferior en la imagen de la FIG. 3D, mientras que esa misma información es difícil de captar en la imagen de la FIG. 3E.
En un momento dado, se pueden capturar múltiples imágenes en múltiples condiciones de iluminación. Las imágenes se pueden capturar usando diferentes fuentes de luz que son espectralmente diferentes debido al nivel de luz de iluminación, ángulo de iluminación y/o filtros desplegados entre el objeto y el sensor (por ejemplo, filtros rojos, verdes y azules). De esta manera, las condiciones de adquisición de imágenes pueden variar en términos de posición de la fuente de luz (por ejemplo, superior, lateral, inferior), fondo (por ejemplo, negro, blanco, cualquier color, cualquier intensidad) y espectro de luz (por ejemplo, canal rojo, canal verde, canal azul). Por ejemplo, una primera imagen puede capturarse usando iluminación superior y un fondo negro, una segunda imagen capturada usando iluminación lateral y un fondo negro, y una tercera imagen capturada usando iluminación inferior y sin fondo (es decir, un fondo blanco). Además, se pueden usar algoritmos específicos para crear un conjunto de condiciones de adquisición de imágenes variables con el fin de maximizar el uso del contraste espacial. Estos u otros algoritmos también pueden ser útiles para maximizar el contraste temporal variando las condiciones de adquisición de imágenes en función de una secuencia dada y/o durante un lapso de tiempo. Algunos de esos algoritmos se describen en la publicación PCT No. WO2015/114121.
La FIG. 4 es un diagrama de flujo que muestra un ejemplo de rutina para analizar una placa con imágenes en función, al menos en parte, del contraste. La rutina de la FIG. 4 se puede considerar como una subrutina de ejemplo de la rutina 200 de la FIG. 2, de modo que 206 y 208 de la FIG. 2 se obtienen al menos en parte usando la rutina de la FIG.
4.
En 402, se captura una primera imagen digital en el momento t0. El tiempo tü puede ser un poco después de que el procedimiento de incubación haya comenzado, de modo que las bacterias en la placa visualizada aún no hayan comenzado a formar colonias visibles.
En 404, las coordenadas se asignan a uno o más píxeles de la primera imagen digital. En algunos casos, las coordenadas pueden ser coordenadas polares, que tienen una coordenada radial que se extiende desde un punto central de la placa visualizada y una coordenada angular alrededor del punto central. Las coordenadas se pueden usar en etapas posteriores para ayudar a alinear la primera imagen digital con otras imágenes digitales de la placa tomadas desde diferentes ángulos y/o en diferentes momentos. En algunos casos, la placa visualizada puede tener un punto de referencia específico (por ejemplo, un punto o línea descentrada), de modo que las coordenadas del píxel o píxeles que cubren el punto de referencia en la primera imagen puedan asignarse al píxel o píxeles que cubren el mismo punto de referencia en las otras imágenes. En otros casos, la propia imagen se puede considerar como una característica para la alineación futura.
En 406, se captura una segunda imagen digital en el tiempo tx. Tiempo tx es un tiempo después de t0 en el cual la bacteria en la placa visualizada ha tenido la oportunidad de formar colonias visibles.
En 408, la segunda imagen digital está alineada con la primera imagen digital en función de las coordenadas asignadas anteriormente. Alinear las imágenes puede implicar además la normalización y estandarización de las imágenes, por ejemplo, utilizando los procedimientos y sistemas descritos en la publicación PCT No. WO2015-114121.
En 410, se determina la información de contraste de la segunda imagen digital. La información de contraste se puede recopilar píxel por píxel. Por ejemplo, los píxeles de la segunda imagen digital se pueden comparar con los píxeles correspondientes (en las mismas coordenadas) de la primera imagen digital para determinar la presencia de contraste temporal. Además, los píxeles adyacentes de la segunda imagen digital se pueden comparar entre sí, o con otros píxeles conocidos por ser píxeles de fondo, para determinar la presencia de contraste espacial. Los cambios en el color y/o brillo de los píxeles son indicativos de contraste, y la magnitud de dichos cambios de una imagen a la siguiente o de un píxel (o región de píxeles) a la siguiente, puede medirse, calcularse, estimarse o determinarse de otra manera. En los casos en los que tanto el contraste temporal como el contraste espacial se determinan para una imagen dada, se puede determinar un contraste general de un píxel dado de la imagen en función de una combinación (por ejemplo, promedio, promedio ponderado) de los contrastes espaciales y temporales de ese píxel dado.
En 412, los objetos en la segunda imagen digital se identifican en función de la información de contraste calculada en 410. Se puede considerar que los píxeles adyacentes de la segunda imagen digital que tienen información de contraste similar pertenecen al mismo objeto. Por ejemplo, si la diferencia de brillo entre los píxeles adyacentes y su fondo, o entre los píxeles y su brillo en la primera imagen digital, es aproximadamente la misma (por ejemplo, dentro de una cantidad umbral predeterminada), a continuación, se puede considerar que los píxeles pertenecen al mismo objeto. Como ejemplo, el sistema podría asignar un “1” a cualquier píxel que tenga contraste significativo (por ejemplo, por encima de la cantidad umbral), y a continuación, identificar un grupo de píxeles adyacentes a todos los que se les asignó “1” como objeto. Al objeto se le puede dar una etiqueta o máscara específica, de modo que los píxeles con la misma etiqueta compartan ciertas características. La etiqueta puede ayudar a diferenciar el objeto de otros objetos y/o fondo durante procedimientos posteriores de la subrutina 400. Identificar objetos en una imagen digital puede implicar segmentar o particionar la imagen digital en múltiples regiones (por ejemplo, primer plano y fondo). El objetivo de la segmentación es cambiar la imagen en una representación de múltiples componentes para que sea más fácil analizar los componentes. La segmentación de imágenes se utiliza para localizar objetos de interés en las imágenes.
En 414, las características de un objeto dado (identificadas en 412) pueden caracterizarse. La caracterización de las características de un objeto puede implicar derivar estadísticas descriptivas del objeto (por ejemplo, área, reflectancia, tamaño, densidad óptica, color, ubicación de placa, etc.). Las estadísticas descriptivas pueden en última instancia describir cuantitativamente ciertas características de una recopilación de información recopilada sobre el objeto (por ejemplo, a partir de una imagen SHQI, a partir de una imagen de contraste). Dicha información puede evaluarse en función de especies, concentraciones, mezclas, tiempo y medios. Sin embargo, en al menos algunos casos, la caracterización de un objeto puede comenzar con una recopilación de información cualitativa con respecto a las características del objeto, mediante la cual la información cualitativa se representa posteriormente cuantitativamente. La Tabla 1 a continuación, proporciona una lista de características ejemplares que pueden evaluarse cualitativamente y posteriormente convertirse en una representación cuantitativa:
Tabla 1: Atributos cualitativos de los objetos y criterios para convertir cuantitativamente los atributos
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Algunas características de un objeto, como la forma o el tiempo hasta que se observa visualmente, se pueden medir una sola vez para el objeto en su conjunto. Otras características pueden medirse varias veces (por ejemplo, para cada píxel, para cada fila de píxeles que tiene una coordenada y común, para cada columna de píxeles que tiene una coordenada x común, para cada rayo de píxeles que tiene una coordenada angular común, para un círculo de píxeles que tiene una coordenada radial común) y a continuación, combinarse, por ejemplo, usando un histograma, en una única medición. Por ejemplo, el color se puede medir para cada píxel, tasa de crecimiento o tamaño para cada fila, columna, rayo o círculo de píxeles, etc.
En 416, se determina si el objeto es un candidato de colonia en función de las características caracterizadas. La determinación del candidato de colonia puede implicar introducir las características cuantitativas (por ejemplo, las puntuaciones mostradas en la Tabla 1, anterior), o un subconjunto de estas, en un clasificador. El clasificador puede incluir una matriz de confusión para implementar un algoritmo de aprendizaje automático supervisado, o una matriz coincidente para implementar un algoritmo de aprendizaje automático no supervisado, para evaluar el objeto. El aprendizaje supervisado puede ser preferido en los casos en que un objeto debe ser discriminado de un conjunto limitado (por ejemplo, dos o tres) de posibles organismos (en cuyo caso el algoritmo podría entrenarse en un conjunto relativamente limitado de datos de entrenamiento). Por el contrario, se puede preferir un aprendizaje no supervisado en los casos en que un objeto debe ser discriminado de toda una base de datos de posibles organismos, en cuyo caso sería difícil proporcionar datos de capacitación completos, o incluso suficientes. En el caso de confusión o una matriz coincidente, la diferenciación podría medirse numéricamente en un intervalo. Por ejemplo, para un par dado de objetos, un “0” podría significar que los dos objetos deben ser discriminados entre sí, mientras que un "1” podría significar que los objetos son difíciles de diferenciar uno del otro.
Los candidatos de colonias pueden almacenarse en una memoria del sistema automatizado para su uso posterior (por ejemplo, pruebas, la rutina de segmentación descrita a continuación, etc.).
USO DE MÚLTIPLES MEDIOS
En los ejemplos anteriores, se describe la evaluación de una cultura para un único medio. Sin embargo, los ejemplos son aplicables de manera similar a las instancias donde una cultura se evalúa en múltiples medios.
Dado que las características de las bacterias (por ejemplo, color, tasa de crecimiento, etc.) pueden variar dependiendo del tipo de medio de cultivo (“medio”) utilizado, se pueden aplicar diferentes matrices de confusión para cada medio durante la clasificación (por ejemplo, 416 de subrutina 400). Por lo tanto, es totalmente razonable que el clasificador para un medio produzca un “0” para dos objetos, mientras que un clasificador para un medio diferente produciría un “1” para los mismos dos objetos. Los resultados colectivos de los clasificadores podrían a continuación, evaluarse juntos (manualmente o en base a otras relaciones controladas por la máquina) para llegar a una diferenciación o clasificación general o final para los objetos.
La evaluación de múltiples medios puede implementarse usando un único recipiente. El único recipiente puede configurarse para contener múltiples medios (por ejemplo, placa bicapa, placa cuádruple tricapa, etc.) de modo que de los múltiples medios puedan obtenerse imágenes juntos al mismo tiempo. De manera alternativa, se pueden evaluar múltiples medios al rayar una muestra de cultivo en varios recipientes, donde cada recipiente contiene uno o más medios. Cada uno de los múltiples recipientes puede a continuación, someterse a las rutinas de formación de imágenes descritas anteriormente. La información derivada de cada uno de los medios (por ejemplo, características caracterizadas) puede a continuación, introducirse colectivamente en el clasificador para hacer una identificación aún más informada del crecimiento detectado en los diversos medios.
INFORMACIÓN DE CONTRASTE
La FIG. 5 es un diagrama de flujo que muestra un ejemplo de subrutina 500 para obtener contraste espacial como parte de 410 de la FIG. 4. La subrutina 500 recibe como entradas: un conjunto de una o más condiciones de fondo e iluminación 551 y un filtro 554. En 502, la imagen digital se obtiene en una condición de iluminación y fondo especificada del conjunto de entrada 551. A continuación, en 504, la imagen se clona. En 506, una de las imágenes clonadas se filtra usando el filtro 554. En el ejemplo de la FIG. 5 se utiliza un núcleo de paso bajo como filtro, pero el experto conoce otros filtros que podrían usarse. En 508, se calcula una relación de la imagen filtrada sustraída de la imagen no filtrada, y la imagen filtrada agregada a la imagen no filtrada. En 510, se obtiene una imagen de contraste espacial basada en la relación calculada de 508. Esta rutina 500 puede repetirse para cada una de las condiciones de fondo e iluminación 551. Cada repetición de la rutina 500 da como resultado otra imagen de contraste espacial, que puede usarse para actualizar iterativamente la imagen de contraste espacial almacenada previamente en 510. Por lo tanto, se puede construir iterativamente una imagen de contraste integral (que incluye contraste de cada una de las condiciones de iluminación). En una realización, en cada iteración, la imagen de contraste despejada, en la que los ajustes de contraste todavía están configurados a cero (en comparación con la imagen de contraste construida iterativamente) puede proporcionarse como una entrada para cada configuración de iluminación. Si se determina en 512 que la última imagen ha sido procesada, a continuación, la rutina 500 termina.
La FIG. 6 es un diagrama de flujo que muestra un ejemplo de subrutina 600 para obtener contraste temporal también como parte de 410 de la FIG. 4. La subrutina 600 recibe como entradas: un conjunto de una o más condiciones de fondo e iluminación 651; y un filtro 655. En 602, se obtiene cada una de la primera y segunda imágenes digitales tomadas bajo condiciones de iluminación y fondo específicas. En 604, se filtra la imagen tü. En el ejemplo de la FIG. 6 se utiliza un núcleo de paso bajo como filtro, pero el experto conoce otros filtros que podrían usarse. En 606, se calcula una relación de la imagen t0 filtrada sustraída de la imagen tx no filtrada, y la imagen t0 filtrada agregada a la imagen tx no filtrada. En 608, se obtiene una imagen de contraste temporal basada en la relación calculada de 606. Esta rutina 600 puede repetirse en diferentes condiciones de iluminación y/o diferentes condiciones de fondo. Cada repetición de la rutina 600 da como resultado otra imagen de contraste temporal, que puede usarse para actualizar iterativamente la imagen de contraste temporal almacenada previamente en 608. Al igual que con la construcción de una imagen de contraste espacial, una imagen de contraste temporal puede construirse iterativamente, con una imagen de contraste despejada que proporciona una entrada para cada condición de iluminación. Si se determina en 610 que la última imagen ha sido procesada, a continuación, la rutina 600 termina.
Los resultados de contraste espacial y temporal pueden combinarse adicionalmente para hacer una determinación integral o general con respecto al contraste. La combinación de contraste espacial y temporal se denomina en esta invención “contraste mixto” (MC). En una realización, el contraste mixto puede derivar de una imagen de contraste espacial (SC) en el tiempo t0 , una imagen de contraste espacial en el tiempo tx y una imagen de contraste temporal (TC) derivada de una comparación de y tx imágenes, en función de la siguiente ecuación:
(3) MC ( t 0ítx ) TCCto'tz) (sC tx ~SCto)
FILTRADO
Se pueden incluir procedimientos adicionales en la subrutina 400 de la FIG. 4 para mejorar el análisis de imagen. Por ejemplo, la primera imagen digital puede analizarse en busca de objetos que aparecen en la imagen en el momento t0. Dado que se sabe que ninguna bacteria ha comenzado a crecer significativamente a to, se puede suponer que cualquier objeto manchado en el tiempo tü es meramente polvo, burbujas de aire, artefactos, condensación, etc. que no constituiría un candidato a colonia.
Un procedimiento de filtrado podría usarse en una imagen capturada para restar polvo y otros artefactos que caen en la placa o lente capturada. Al considerar medios transparentes (por ejemplo, agar de MacConkey, agar CLED, CHROMagar, etc.), se espera que algún nivel de polvo esté presente en una imagen capturada. El impacto del polvo en una imagen dada puede dictarse al menos en parte en función de las condiciones particulares de iluminación y fondo en las que se toma la imagen. Por ejemplo, cuando se utiliza un medio blanco, los artefactos reflectantes y el polvo serán más observables cuando el medio se ilumina desde arriba con fondo negro debajo. Como otro ejemplo adicional, cuando se usan medios de color u oscuros, los artefactos y el polvo serán más observables cuando el medio se ilumina desde arriba con un fondo blanco debajo. Como ejemplo adicional, en la mayoría de los medios, los artefactos y el polvo que absorben la luz serán observables cuando el medio se ilumina desde abajo, independientemente del fondo. En cualquier caso, el manejo del polvo y los artefactos es un desafío complejo de procesamiento de imágenes que puede afectar significativamente la detección del crecimiento microbiano.
El polvo y los artefactos se pueden dividir en dos tipos: (A) aquellos que son capaces de cambiar de posición; y (B) aquellos que no son capaces de cambiar de posición. El polvo y los artefactos pueden acumularse con el tiempo, lo que significa que la cantidad de ambos tipos A y B puede variar con el tiempo. Sin embargo, las observaciones han demostrado que el tipo A es más propenso a cambiar en cantidad con el tiempo que el tipo B. Por supuesto, el tipo A también es más propenso a cambiar, tal como debido a que la placa se mueve dentro o fuera de la cámara de formación de imágenes.
Generalmente, el tipo B es causado por artefactos que están unidos a la placa en sí, tales como puntos de tinta (marca, número de lote e información impresa debajo de la placa), imperfecciones vinculadas al punto de inyección de molde de plástico o una región helada. El tipo B también puede ser causado por polvo o burbujas de aire pegadas en la parte superior del medio, atrapadas dentro del medio o pegadas electrostáticamente a la parte inferior de la placa.
Desde un punto de vista de imagen, incluso el polvo de tipo A y los artefactos son por sí solos en su mayoría inmutables en su posición. Sin embargo, debido al plástico de la placa y el medio que actúa como filtro y lente, las características observadas y la posición de los artefactos de tipo A pueden cambiar ligeramente dependiendo del color del medio, el nivel del medio y el plástico. El polvo y los artefactos de tipo B también permanecen inmutables en su posición. Sin embargo, en la medida en que el polvo y los artefactos de tipo B están conectados al medio, y el medio está sujeto a un ligero movimiento y desplazamiento con el tiempo (principalmente debido a una ligera desecación con el tiempo en la incubadora), el polvo y los artefactos de tipo B pueden moverse con el medio. Por lo tanto, la posición del polvo y los artefactos de tipo B también es al menos algo propensa a cambios sutiles.
En términos de contraste, se puede decir que una mota de polvo de tipo A está presente en la imagen de contraste espacial en una posición "po”, y en la imagen de contraste espacial tx en una posición "px.” Suponiendo que po y px son ubicaciones diferentes, a continuación, el polvo o artefacto también estará presente en una imagen de contraste temporal en ambas ubicaciones (por ejemplo, mostrando contraste positivo en la ubicación px y contraste negativo en la ubicación p0). En comparación, una mota de polvo de tipo B estará presente en una ubicación común de ambas imágenes de contraste espacial en los instantes t0 y tx, pero ausente de la imagen de contraste temporal.
Como se explicó anteriormente, las imágenes de contraste espaciales y temporales se pueden combinar para obtener resultados de contraste mixtos. El impacto del polvo y los artefactos de los tipos A y B puede eliminarse aún más de los resultados de contraste mixto. En una realización, si se identifica un objeto (por ejemplo, un candidato de CFC) en el resultado de contraste mixto, se puede comparar con el polvo y los artefactos detectados con la vecindad N(x,y) del objeto en el resultado de contraste espacial en el tiempo t0. A continuación, si se encuentra un objeto similar en el resultado de contraste espacial en el tiempo t0 , el objeto identificado en el resultado de contraste mixto se marca como un tipo A o tipo B falso positivo. Incluso si un objeto no está marcado como un falso positivo tipo A o tipo B al principio, si con el tiempo se encuentra que el objeto no cambia significativamente de tamaño, aún se puede determinar más tarde que el objeto es un falso positivo tipo B. Los falsos positivos pueden almacenarse y luego aplicarse a imágenes posteriores, tal como a través de las máscaras de filtrado (por ejemplo, máscara binaria) descritas más adelante.
Se podría utilizar otro procedimiento de filtrado para restar la condensación formada en la placa (por ejemplo, durante el tránsito de la nevera a la incubadora al comienzo de una sesión de incubación). En un ejemplo de filtro de condensación, la placa se ilumina usando iluminación inferior, de modo que penetre menos luz a través de ubicaciones de condensación que ubicaciones sin condensación. Luego se puede evaluar la densidad óptica de la imagen y se pueden restar áreas de baja densidad óptica de la imagen.
De manera adicional o alternativa, se podría construir una máscara de imagen para descontar objetos de cualquier análisis de la imagen a la imagen y/o imágenes digitales posteriores. La FIG. 7 es un diagrama de flujo que muestra un ejemplo de rutina 700 para crear una máscara de imagen mediante el uso de contraste espacial de la imagen t0. En el ejemplo de la rutina 700, la única entrada proporcionada es la imagen SHQI 751 tomada en el momento tü. En 702, se determina el contraste espacial de la imagen ta En 704, la información de contraste espacial se utiliza para recopilar información estadística con respecto a los píxeles en la región de interés de la imagen t0 , tal como la media y la desviación estándar (por ejemplo, de brillo). En 706, se ajusta un umbral de contraste para garantizar que un número adecuado de píxeles supere ese umbral. Por ejemplo, si más de un porcentaje dado de píxeles no se consideran fondo de la imagen, a continuación, el umbral puede aumentarse. En 708, el umbral se ajusta adicionalmente en función de la información estadística con respecto a esos píxeles por debajo del umbral. Finalmente, en 710, se genera una máscara binaria. La máscara binaria diferencia entre varios artefactos que no son píxeles válidos, y otros píxeles que se consideran válidos. La máscara binaria podría usarse en un momento posterior cuando hay colonias potenciales para eliminar y para descartar que los objetos que ocupan los píxeles no válidos sean colonias candidatas.
Los procedimientos de filtrado anteriores podrían mejorar la subrutina 400, al evitar la inclusión accidental de polvo, condensación u otros artefactos como objetos, y acelerar la caracterización de la propiedad en 414, ya que dicha caracterización solo tendría que realizarse para píxeles válidos.
DEFINICIÓN DE OBJETOS Y ETIQUETAS
Otro procedimiento que se puede agregar a la subrutina 400 de la FIG. 4 es asignar etiquetas a los objetos identificados en 412. Al objeto se le puede dar una etiqueta específica, de modo que los píxeles con la misma etiqueta compartan ciertas características. La etiqueta puede ayudar a diferenciar el objeto de otros objetos y/o fondo durante procedimientos posteriores de la subrutina 400. La FIG. 8 es un diagrama de flujo que muestra un ejemplo de rutina 800 para etiquetar los píxeles de una imagen tomada en el tiempo tx (o “imagen tx”). En el ejemplo de la FIG. 8, una máscara binaria 851 (por ejemplo, la salida de la rutina 700), una máscara candidata no inicializada 852 para la imagen tx y una imagen de contraste temporal 853 (por ejemplo, la salida de la subrutina 600) se reciben como entradas. En 802, la máscara candidata 852 se inicializa. La inicialización puede implicar identificar una región de interés en la placa visualizada, así como usar la máscara binaria 851 para identificar “píxeles válidos” en la imagen tomada en el tiempo tx. Los píxeles válidos son píxeles de las imágenes que no se han descontado como colonias candidatas, y se considerarán para el etiquetado. En 804, la imagen de contraste temporal 853 se utiliza para recopilar información estadística con respecto a los píxeles válidos en la región de interés de la imagen tx, tal como la desviación media y estándar (por ejemplo, de brillo). Luego, en 806, la información estadística de cada una de la imagen de contraste temporal 853 y la máscara binaria 851 (que preferentemente se generan en condiciones de iluminación y fondo similares) se combinan para formar una imagen de contraste umbral. Usando el umbral definido por la imagen de contraste del umbral, los “componentes connex” de la imagen tx se etiquetan en 808. Un componente connex es efectivamente una etiqueta que indica una conexión entre (o agrupación entre) píxeles adyacentes, lo que a su vez indica que los píxeles son parte del mismo objeto.
Una vez que los componentes connex se han definido para la imagen tx, cada componente connex se puede analizar individualmente (en 810) para validar su estado como un solo objeto. En el ejemplo de la FIG. 8, se realiza un cálculo estadístico de los píxeles asociados con la etiqueta en 812. El cálculo puede utilizar un histograma para determinar la media y/o desviación estándar del brillo o color de los píxeles. En 814, se determina si los píxeles cumplen con un área umbral. Si no se cumple el área de umbral, a continuación, las operaciones proceden a 830, en el que se actualiza la etiqueta. Actualizar una etiqueta puede implicar mantener el componente analizado como una etiqueta o dividir el componente en dos etiquetas. En el caso de que el área umbral no se cumpla, el componente se mantiene como una sola etiqueta. Si se cumple el área umbral, a continuación, en 816, el histograma se suaviza y en 818, se identifican picos de los píxeles etiquetados distribuidos. Los picos pueden definirse adicionalmente al tener un área mínima, ya que esos picos más pequeños que el área mínima pueden ignorarse. En 820, se cuenta la cantidad de picos identificados. Si solo hay un pico, a continuación, las operaciones proceden a 830, y la etiqueta se actualiza, por lo que el componente se mantiene como un objeto. Si hay más de un pico, a continuación, en 824, la imagen de contraste umbral se usa para evaluar adicionalmente si el contraste entre los picos es significativo. Luego, las operaciones proceden a 830, y la etiqueta se actualiza en función de los múltiples picos identificados, mediante los cuales el contraste significativo da como resultado que el componente se divida en dos y, de lo contrario, se mantenga como uno.
SEGMENTACIÓN
Otro procedimiento que puede incluirse como parte de la subrutina 400 es un procedimiento de segmentación para separar colonias confluentes en el tiempo tx en objetos separados. Si en el momento tx las colonias han crecido hasta el punto en que se superponen o se tocan entre sí, puede ser necesario trazar un límite a través de la región confluente para evaluar colonias separadas en la región.
En algunos casos, cuando dos colonias limítrofes tienen características diferentes (por ejemplo, color diferente, textura diferente), la segmentación puede implicar simplemente el análisis de características de la región confluente. Sin embargo, el contraste espacial y temporal por sí solo no siempre es suficiente para identificar un límite entre las colonias. La FIG. 9 es un diagrama de flujo que muestra un ejemplo de rutina 900 para separar dichas colonias en objetos separados (por ejemplo, con etiquetas separadas), o en otros términos, segmentar las colonias. La rutina ejemplar 900 de la FIG. 9 utiliza una primera imagen digital 951 tomada en el tiempo t0 para, una segunda imagen digital tomada en el tiempo tx, y una máscara 953 binaria de imagen t0 (por ejemplo, la máscara generada por la rutina 700) como entradas. En 902, se genera una imagen de contraste temporal basada en las imágenes t0 y tx 951 y 952. En 904, la imagen de contraste temporal se segmenta usando la máscara binaria 953. En 906, las etiquetas se aplican a los segmentos de la imagen. En 908, se identifican picos o máximos de cada etiqueta. El máximo de un segmento dado es, en general, el punto central o centro de masa del segmento. En 910, para cada etiqueta, los máximos (por ejemplo, de la etiqueta bajo análisis, de etiquetas vecinas) se utilizan para hacer determinaciones adicionales en cuanto a si una etiqueta dada es única para sus vecinos, o debe combinarse con una o más etiquetas vecinas. Una vez que las etiquetas se han reducido a sus componentes únicos, la caracterización de las características para cada etiqueta (por ejemplo, las etapas 414 y 416 de la rutina 400) se puede realizar en 912, y una lista global de colonias candidatas se puede generar en 914.
Se pueden aplicar varios factores, tales como factores de inclusión, para determinar si los máximos locales de una etiqueta dada pertenecen a una colonia o a diferentes colonias. Los factores de inclusión son factores que indican si los píxeles vecinos están asociados o no con un objeto adyacente. Dichos factores se pueden usar en una estrategia de segmentación para determinar si se deben dividir dos máximos locales en una etiqueta dada en dos objetos separados, o fusionarlos en un solo objeto.
La FIG. 10 es un diagrama de flujo que muestra dicho ejemplo de estrategia de segmentación. La rutina 1000 se puede usar como una subrutina de la etapa 910 en la FIG. 9. Como se muestra en la FIG. 10, se identifican dos máximos locales 1051 y 1052. En 1002, se identifica una región circundante para cada máximo. En el ejemplo de la FIG. 10, la región “A” rodea el máximo 1051 y la región “B” rodea el máximo 1052. A los efectos de las ecuaciones ejemplares a continuación, se asume que la región A es más grande o igual en tamaño a la región B. En algunos casos, cada región puede tener una forma ovalada que tiene una distancia horizontal (xA, xB) a lo largo de un eje horizontal de la región y una distancia vertical (yA, yB) a lo largo de un eje vertical de la región. La FIG. 11 proporciona una ilustración ejemplar de las regiones A y B y sus respectivos máximos para aclarar la rutina de la FIG. 10.
En 1004, se determina una distancia desde el máximo hasta un borde del objeto para cada máximo local 1051 y 1052. En algunos casos, la distancia determinada es una distancia media o mediana de la región asignada en 1002, en lo sucesivo denominada mapa de distancia. El mapa de distancia de la región A se denominará en lo sucesivo rA, y el de la región B, rB.
En 1006, un factor de inclusión se calcula basándose en una distancia “d” entre los dos máximos locales y las distancias determinadas en 1004. En una realización, el factor de inclusión se calcula usando la siguiente ecuación:
d - r A r B
(4) Factor de inclusión = 2 rB
En 1008, se determina si el factor de inclusión es menor, mayor o dentro de un intervalo predeterminado (por ejemplo, entre 0,5 y 1). Si el factor de inclusión es menor que el intervalo predeterminado, se determina que los máximos están asociados con el mismo objeto. Si es mayor que el intervalo predeterminado, se determina que los máximos están asociados con objetos separados.
Para los factores de inclusión que caen dentro del intervalo, no está claro inmediatamente si los máximos pertenecen a los mismos o diferentes objetos, y se necesita más procesamiento. La rutina 1000 luego continúa en 1010, en la que la convexidad de las regiones circundantes respectivas de los dos máximos se calcula usando las coordenadas de una tercera región "C” en una posición entre los dos máximos. En algunos casos, la región puede ser un centro ponderado de las dos regiones, de modo que el punto central de la región C esté más cerca de la región B más pequeña que de la región A. Las distancias horizontales y verticales xC e yC, y un mapa de distancia H, también pueden calcularse para la región C. Por ejemplo, la convexidad puede calcularse usando los valores anteriores y d(A,C), que es la distancia entre los puntos centrales de la región C y el máximo A, en función de las siguientes ecuaciones:
xA+(xB-xÁ)*distO ffset
(5) xC d
yA+(yB-yA)*distOffset
(6) yC
(7)
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AH = H - (0.9R)
En 1012, se determina si el valor de convexidad es mayor (más convexo) que un umbral dado. Por ejemplo, AH puede compararse con un valor umbral de 0. Si el valor de convexidad es mayor que el valor umbral, se determina que los máximos están asociados con objetos separados. De lo contrario, en 1014, uno o más parámetros de la región C se actualizan de modo que el tamaño de la región C aumenta. Por ejemplo, distOffset puede actualizarse en función de AH, por ejemplo, AH está limitado a un valor entre 0 y 1 (si AH es mayor que 1, se redondea a 1) y luego se agrega a distOffset.
En 1016, se determina si el tamaño de la región C cumple o excede un valor umbral. Si se alcanza o se supera este valor umbral, se determina que los máximos están asociados con el mismo objeto. En otras palabras, si la diferencia entre las regiones A y B es tan indeterminada que la región C aumenta hasta que comienza a eclipsar las regiones A y B, esto es una buena indicación de que los máximos 1051 y 1052 deberían pertenecer al mismo objeto. En el ejemplo anterior, esto puede indicarse mediante distOffset igualando o superando la distancia d entre los máximos. De lo contrario, las operaciones regresan a 1010, y la convexidad de las regiones A y B se recalcula en función del parámetro o parámetros actualizados de la región C.
Una vez determinadas las asociaciones para cada máximo, las asociaciones determinadas pueden almacenarse, por ejemplo, en una matriz (también denominada matriz de asociación). La información almacenada se puede usar para reducir la lista completa de máximos a una lista final de objetos candidatos. Por ejemplo, en el caso de una matriz de asociación, una lista maestra puede crearse a partir de la lista completa de máximos, y luego cada máximo puede revisarse iterativamente y eliminarse de la lista maestra si un máximo asociado aún permanece en la lista.
En el ejemplo de las FIGS. 9 y 10, el tiempo tx en el que se toma la segunda imagen (y, por lo tanto, el tiempo más temprano en el que se puede ejecutar la rutina 900) puede ser de solo unas pocas horas en el procedimiento de incubación. Dicho tiempo en general se considera demasiado temprano para identificar colonias completamente formadas, pero puede ser suficiente para crear una imagen de segmentación. Opcionalmente, la imagen de segmentación se puede aplicar a imágenes futuras que se toman en un momento posterior. Por ejemplo, se pueden trazar límites entre colonias para predecir un crecimiento esperado de las colonias. Luego, en un caso de confluencia entre las colonias, los límites se pueden utilizar para separar las colonias confluentes.
ANÁLISIS CON DOS O MÁS IMÁGENES DESPUÉS DEL TIEMPO tü
Si bien los procedimientos y rutinas descritos anteriormente requieren solo una imagen tomada después del tiempo t0 para (por ejemplo, una primera imagen digital en el tiempo t0 y una segunda imagen digital en el tiempo tx), otros procedimientos requieren al menos una segunda imagen tomada después del tiempo t0. Por ejemplo, si se descubre que la imagen en el tiempo tx incluye colonias confluentes, otra imagen tomada en el tiempo tn (en la que 0 < n < x) se puede usar para identificar y dividir las colonias individuales.
Por ejemplo, si t0 = 0 horas en incubación (en cuyo momento no ha ocurrido crecimiento) y tx = 24 horas en incubación (en cuyo momento ha ocurrido tanto crecimiento que las colonias ahora son confluentes), una imagen en el momento tn = 12 horas (en cuyo momento las colonias habrían comenzado a crecer, pero aún no son confluentes) revelaría la presencia de colonias individuales. El crecimiento de colonias podría a continuación, proyectarse en función de la imagen en el tiempo tn para estimar los límites entre las colonias confluentes en el tiempo tx. En este sentido, la imagen en el momento tn podría ayudar a diferenciar una colonia de crecimiento rápido de una colonia de crecimiento lento. Los expertos en la materia deben reconocer que a medida que aumenta la cantidad de imágenes tomadas entre el tiempo t0 y el tiempo tx, se puede proyectar con mayor precisión la tasa de crecimiento de las colonias.
En una aplicación del concepto anterior, la imagen tomada en el tiempo tn (o más en general, imágenes tomadas entre los tiempos t0 y tx) podría usarse para identificar semillas de colonias, que son objetos sospechosos de ser colonias que crecerán con el tiempo, y asociar las semillas con máscaras y etiquetas correspondientes. Cada semilla recibiría una etiqueta única y la etiqueta se almacenaría junto con diferentes características (por ejemplo, posición, morfología e histograma basado en imágenes generadas a partir de imágenes SHQI: canal rojo, canal verde, canal azul, luminancia, crominancia, matiz o imagen compuesta) y propiedades (por ejemplo, estado aislado/no aislado, otra información para proyectar propagación cronológica). Algunas características almacenadas (por ejemplo, histograma) también se pueden calcular a nivel de placa, en lugar de atribuirse a una semilla específica, para extraer indicadores globales de placa. Las características almacenadas de semillas podrían a continuación, utilizarse para realizar la extracción de colonias en el tiempo tx, así como proporcionarse como entrada a los clasificadores para el entrenamiento y/o prueba.
El seguimiento de la tasa de crecimiento utilizando múltiples imágenes tomadas después de t0 también podría usarse para detectar polvo, artefactos u otros objetos extraños que aparecen en la placa o en la lente de formación de imágenes en medio de la rutina del flujo de trabajo. Por ejemplo, si una mota de polvo aterrizara en el lente de imagen después de t0 pero antes de tn, el punto creado por la mota podría interpretarse inicialmente como una colonia en crecimiento, ya que no era visible en el momento de hacerlo. Sin embargo, con imágenes posteriores que no revelan ningún cambio en el tamaño de la mancha, se puede determinar que la mancha no está creciendo y, por lo tanto, no es una colonia.
Aparte de rastrear la tasa de crecimiento y la segmentación, otros aspectos de las colonias se pueden rastrear con la ayuda de imágenes adicionales entre t0 y tx. En el caso de cambios morfológicos sutiles que se desarrollan en una colonia lentamente con el tiempo, esos cambios sutiles podrían identificarse más rápidamente capturando más imágenes. En algunos casos, el crecimiento podría medirse a lo largo de un eje z, además de o en lugar de a lo largo de los ejes x e y habituales. Por ejemplo, se sabe que la neumonía por estreptococo forma lentamente un centro hundido cuando se cultiva en agar en sangre, pero el centro hundido en general no es visible hasta el segundo día de análisis. Al observar una progresión temporal del crecimiento de las bacterias, un centro de hundimiento incipiente puede ser eliminado y las bacterias identificadas mucho antes que, si uno debe esperar a que el centro se hunda por completo,
En otros casos, se podría saber que una colonia cambia de color con el tiempo. Por lo tanto, la imagen de una colonia que tiene un primer color (por ejemplo, rojo) en un momento después de t0 , y luego que tiene un segundo color (por ejemplo, verde) en un momento posterior, podría usarse para determinar la identidad de las bacterias que crecen en la colonia. El cambio de color podría medirse como un vector o ruta a través del espacio de color (por ejemplo, RGB, CMYK, etc.) Los cambios en otras características cromáticas de la colonia podrían medirse de manera similar.
CARACTERÍSTICAS DEL OBJETO
Tal como se discutió anteriormente en relación con la FIG. 4, las características de un objeto en una placa con imágenes se pueden caracterizar como parte del análisis de imágenes realizado en la placa con imágenes. Las características caracterizadas pueden incluir tanto características estáticas (pertenecientes a una sola imagen) como imágenes dinámicas (pertenecientes a una pluralidad de imágenes).
Las características estáticas tienen como objetivo reflejar los atributos del objeto y/o el fondo circundante en un momento dado. Las características estáticas incluyen las siguientes:
(i) Centro de gravedad: esta es una característica estática que proporciona un centro de gravedad de un objeto Imagen en un espacio coordinado (por ejemplo, x-y, polar). El centro de gravedad de un objeto, al igual que las coordenadas polares del objeto, proporciona invariancia en el conjunto de características en condiciones de iluminación y fondo dadas. El centro de gravedad se puede obtener determinando primero un centro de masa ponderado para todas las colonias en la imagen (M es la máscara binaria de todas las colonias detectadas). El centro de masa ponderado puede determinarse en función de una suposición de que cada píxel de la imagen es de igual valor. El centro de gravedad para una colonia dada se puede describir en coordenadas x-y mediante la siguiente ecuación (en la que E - {p \p e MJ (E es la máscara binaria de la colonia actual), el intervalo para la coordenada x es [0, ancho de imagen], el intervalo para la coordenada y es [0, altura de imagen], y cada píxel es una unidad):
Figure imgf000017_0001
(9)
(ii) Coordenadas polares: esta es también una característica estática, y se puede utilizar para caracterizar adicionalmente las ubicaciones en la placa visualizada, tal como un centro de gravedad. En general, las coordenadas polares se miden a lo largo de un eje radial (d) y un eje angular (0), siendo las coordenadas del centro de placa [0,0]. Las coordenadas d y 0 de igv(x,y) se proporcionan (en milímetros para d, y en grados para 0) para las siguientes ecuaciones (donde k es una densidad de píxeles correspondiente a píxeles a milímetros, y “código de barras” es una característica emblemática de la placa con imágenes para garantizar la alineación de la placa con imágenes anteriores y/o futuras):
d — k x dist(igv(x y), 0(x,y))
Figure imgf000017_0002
(11) 0 = Ángulo (código de barras, 0(x,y), igv(x,y))
(iii) Vector de imagen: Las coordenadas polares bidimensionales pueden a su vez transformarse en un vector de imagen unidimensional. El vector de imagen puede caracterizar la intensidad de los píxeles de una imagen en función del eje radial (en general, con el centro de la colonia que tiene la mayor intensidad) y/o una función del eje angular. En muchos casos, el vector de imagen puede ser más preciso en la clasificación de similitudes/distinciones entre objetos con imágenes.
(iv) Características morfométricas, que describen la forma y el tamaño de un objeto dado.
a) Área: Esta es una característica morfométrica, y se puede determinar en función del número de píxeles en el objeto de imagen (también denominado “blob”), sin contar agujeros en el objeto. Cuando la densidad de píxeles está disponible, el área puede medirse en tamaño físico (por ejemplo, mm2). De lo contrario, cuando la densidad de píxeles no está disponible, el número total de píxeles puede indicar el tamaño, y la densidad de píxeles (k) se establece en igual a uno. En una realización, el área se calcula usando la siguiente ecuación:
Figure imgf000018_0001
(12)
b) Perímetro: El perímetro del objeto también es una característica morfométrica, y se puede determinar midiendo los bordes de la objeción y sumando la longitud total de los bordes (por ejemplo, un solo píxel que tiene un área de 1 unidad cuadrada tiene un perímetro de 4 unidades). Al igual que con el área, la longitud se puede medir en términos de unidades de píxeles (porejemplo, cuando k no está disponible) o longitudes físicas (por ejemplo, cuando k está disponible). En algunas circunstancias, el perímetro también puede incluir el perímetro de cualquier orificio en el objeto. Además, el efecto escalera (que resulta cuando los bordes diagonales se digitalizan en cajas tipo escalera) se puede compensar contando las esquinas internas como V Z, en lugar de 2. En una realización, el perímetro puede determinarse usando las siguientes ecuaciones:
Figure imgf000018_0002
c) Circularidad: La circularidad del objeto también es una característica morfométrica, y puede
ser determinada en función de una combinación del área y el perímetro. En una realización, la circularidad se calcula usando la siguiente ecuación:
Figure imgf000018_0003
(d) Coeficiente de variación de radio (RCV): Esta es también una característica morfométrica, y se utiliza para indicar la varianza en el radio del objeto al tomar una relación entre el radio medio R del objeto en todas las direcciones N o ángulos G que se extienden desde el centro de gravedad y la desviación estándar de los radios op. En una realización, este valor se puede calcular usando las siguientes ecuaciones:
(¡7)
Figure imgf000018_0004
( 18) a R
Figure imgf000018_0005
( 19)
Figure imgf000018_0006
(v) Características contextuales, que describen las relaciones topográficas vecinales del objeto bajo escrutinio con los otros objetos detectados y los bordes de las paredes de las placas. Por ejemplo, en el caso de una colonia con imágenes, una característica contextual de la colonia puede ser si la colonia es libre, tiene espacio libre limitado o compite por el acceso a los recursos con otras colonias circundantes. Tales características tienden a ayudar a clasificar las colonias que crecen en el mismo entorno percibido y/o las colonias discriminatorias que crecen en diferentes entornos.
(a) Región de Influencia: es una característica contextual que considera el espacio entre un objeto y sus objetos vecinos y predice una región que el objeto bajo análisis puede gastar en ocupar (sin que otros objetos diferentes gasten primero en ocupar esa misma región). La región de influencia puede expresarse en forma de un diagrama de Voronoi, tal como el diagrama que se muestra en la FIG. 12, que muestra una región de influencia (sombreada) basada en la distancia d entre una colonia 1201 y sus colonias vecinas, por ejemplo, 1205. En una realización, la distancia desde el borde del objeto al borde de la región de influencia (Dnc) puede caracterizarse usando la siguiente ecuación:
Figure imgf000019_0001
(b) Distancia a la pared de la placa: esta es una característica contextual que calcula la distancia del borde del objeto desde la pared de la placa más cercana (Dpw). En una realización, esta distancia puede caracterizarse usando la siguiente ecuación:
Figure imgf000019_0002
(c) Factor de aislamiento: esta es una característica contextual que caracteriza el aislamiento relativo de un objeto dado en función del tamaño y la distancia del objeto al borde más cercano (por ejemplo, de otro objeto, una pared de placa). Las FIGS. 13A-C ilustran aspectos del factor de aislamiento. La FIG. 13A ilustra una Instancia en la que el borde más cercano está a una distancia d de la colonia a una pared de placa. Las FIGS.
13B y 13C ilustran una Instancia en la que el borde más cercano pertenece a otra colonia. En tal caso, se dibuja un círculo centrado alrededor de la colonia bajo análisis y luego se expande (primero pequeño, como en la FiG.
13B, luego más grande como en la FIG. 13C) hasta que el círculo toque una colonia vecina. En las realizaciones de las FIGS. 13A-C, el factor de aislamiento (IF) se puede caracterizar usando la siguiente ecuación:
Figure imgf000019_0003
(d) Relación de ocupación vecina: esta es una característica contextual que caracteriza la fracción de área de la región de influencia de Voronoi limitada de una placa (V) dentro de una distancia dada d para un objeto dado. En una realización, la relación de ocupación vecina (OR) puede caracterizarse usando la siguiente ecuación (en la que para esta ecuación, E = {p|p e V, dist(p, igv(x,y) < d}):
Figure imgf000019_0004
(23)
(e) Relación de ocupación vecina relativa: en algunos casos, la distancia dada d puede derivarse utilizando el radio medio del objeto multiplicado por un factor predeterminado (d = x x R). El resultado es una relación de ocupación vecina relativa (RNOR), y se puede derivar para un factor x dado usando las siguientes ecuaciones:
(24) RNOR(x) = NOR(d)
(vi) Características espectrales, que describen las propiedades de luz de un objeto dado. El color (canales de luz rojos, verdes y azules; matiz, luminancia y crominancia, o cualquier otra transformación del espacio de color), textura y contraste (con el tiempo y/o a través del espacio) son ejemplos de dichas características. Las características espectrales se pueden derivar de imágenes capturadas en varios puntos de tiempo y/o bajo diversas condiciones de iluminación durante la incubación usando máscaras de colonia, y además se pueden asociar con una región de influencia de Voronoi para una colonia dada.
(a) Imagen de canal: esta es una característica espectral en la que se usa un canal de color específico (por ejemplo, rojo (R), verde (G), azul (B)) para resolver espectralmente la imagen.
b) Luma: esta es también una característica espectral utilizada para caracterizar el brillo de una imagen utilizando canales RGB como entrada.
(c) Matiz: esta es una característica espectral en la que un área de la imagen se caracteriza por parecer similar a un color percibido (por ejemplo, rojo, amarillo, verde, azul) o una combinación de estos. El matiz (H2) se caracteriza en general usando las siguientes ecuaciones;
(25) H2 = atan2(p,a)
J 3
(27) p = ? í ( C - B )
(d) Croma: esta es una característica espectral para caracterizar el colorido de un área de una imagen en relación con su brillo si esa área estuviera iluminada de manera similar en blanco. Croma (C2) se caracteriza en general usando la siguiente ecuación:
Figure imgf000020_0001
(28)
e) Dispersión radial: el análisis de la dispersión radial del matiz y el contraste cromático permite discriminar la hemólisis alfa, beta y gamma.
(f) Contraste máximo: esta característica caracteriza la resolución de la imagen calculando el máximo de un contraste promedio medido para píxeles en un radio dado r desde un punto central de la imagen (por ejemplo, el centro de una colonia de imágenes). Esta característica se puede usar para describir las diferencias de percepción entre una imagen tomada en los momentos t0 y tx en función del crecimiento inducido por el objeto analizado. El contraste máximo puede caracterizarse de la siguiente manera:
(29) C o n t r a s te M á x r = M Á X ( C o n t r a s te M e d io r ) o b j e t o
(vii) Características de fondo, que describen alteraciones en los medios en la vecindad del objeto analizado. Por ejemplo, en el caso de una colonia con imágenes, los cambios podrían ser causados por el crecimiento microbiano alrededor de la colonia (por ejemplo, signos de hemólisis, cambios en PH o reacciones enzimáticas específicas).
Las características dinámicas tienen como objetivo reflejar un cambio en los atributos del objeto y/o el fondo circundante a lo largo del tiempo. El procesamiento de series temporales permite que las características estáticas se relacionen con el tiempo. La primera y segunda derivadas discretas de estas características proporcionan “velocidad” y “aceleración” instantáneas (o estancamiento o desaceleración) del cambio en dichas características que se caracterizarán con el tiempo. Ejemplos de características dinámicas incluyen las siguientes:
(i) Procesamiento de series temporales para rastrear las características estáticas anteriores a lo largo del tiempo. Cada característica medida en un tiempo de incubación dado se puede referenciar en función de su tiempo de incubación relativo para permitir que las características se relacionen con las medidas en tiempos de incubación posteriores. Se puede usar una serie temporal de imágenes para detectar objetos tales como CFIJ que aparecen y crecen con el tiempo, como se describió anteriormente. Los puntos de tiempo para la obtención de imágenes pueden estar preestablecidos o definidos por un procedimiento automatizado basado en el análisis continuo de imágenes capturadas previamente de los objetos. En cada punto de tiempo, la imagen puede ser una configuración de adquisición dada, ya sea para toda la serie de una configuración de adquisición única, o como una serie completa de imágenes capturadas de múltiples configuraciones de adquisición.
(ii) Derivados discretos primero y segundo de las características anteriores para proporcionar velocidad instantánea y aceleración (o estancamiento o desaceleración) de los cambios en dichas características a lo largo del tiempo (por ejemplo, tasa de crecimiento de seguimiento, como se discutió anteriormente):
a) Velocidad: primera derivada de una característica a lo largo del tiempo. La velocidad (V) de una característica x puede caracterizarse en términos de (x unidades) / hora, siendo At un lapso de tiempo expresado en horas, basado en las siguientes ecuaciones:
(30) V = lim
Figure imgf000020_0002
Figure imgf000020_0003
(b) Aceleración: una segunda derivada de la característica en el tiempo, también la primera derivada de la Velocidad. La aceleración (A) puede caracterizarse en función de la siguiente ecuación:
Figure imgf000021_0001
(33)
Las características de la imagen anterior se miden a partir de los objetos o del contexto de los objetos y tienen como objetivo capturar las especificidades de los organismos que crecen en diversos medios y condiciones de incubación. Las características enumeradas no pretenden ser exhaustivas y cualquier persona informada en el campo podría modificar, ampliar o restringir este conjunto de características en función de la variedad de características conocidas basadas en el procesamiento de imágenes conocidas en el campo.
Las características de imagen se pueden recopilar para cada píxel, grupo de píxeles, objeto o grupo de objetos en la imagen. Una distribución de las características recolectadas se puede construir en un histograma para caracterizar más generalmente regiones de la imagen, o incluso toda la imagen. El histograma puede confiar en varias características estadísticas para analizar o procesar de otro modo los datos de características de imagen entrantes.
Las características del histograma estadístico pueden incluir las siguientes:
(i) Mínimo: el valor más pequeño de la distribución capturada dentro del histograma. Esto puede caracterizarse por la siguiente relación:
(34) M in ~ i\{h(i) > 0, Y J JitnK 0 = 0]
(ii) Máximo; el mayor valor de la distribución capturada dentro del histograma. Esto se puede caracterizar en función de la siguiente relación:
Figure imgf000021_0002
iii) Suma: suma de todos los valores individuales capturados en el histograma. La suma puede definirse por la siguiente relación:
Figure imgf000021_0003
(36)
iv) Media: la media aritmética o promedio. Es la suma de todas las puntuaciones divididas por el número de puntuaciones (N) según la siguiente relación:
Media - IBBnM ífi
(37) ' -ti
v) Cuartil 1 (Q1): La puntuación en el percentil 25 de la distribución. El 25 % de las puntuaciones están por debajo de Q1 y el 75 % están por encima de Q1. Esto se describe por la siguiente relación:
(38)
Figure imgf000021_0004
(vi) Mediana (Q2): La puntuación en el percentil 50o de la distribución. El 50 % de las puntuaciones están por debajo de la mediana y el 50 % están por encima de la mediana. La mediana es menos sensible a las puntuaciones extremas que la media y esto, en general, la hace una mejor medida que la media para distribuciones altamente sesgadas. Esto se describe por la siguiente relación:
(39)
Figure imgf000021_0005
(vii) Cuartil 3 (Q3): La puntuación en el percentil 75 de la distribución. 75 % por ciento de las puntuaciones están por debajo del Q3 y 25 % están por encima del Q3. Esto se describe por la siguiente relación:
(40)
Figure imgf000022_0001
viii) Moda: La puntuación más frecuente en una distribución. Esto se utiliza como una medida de la tendencia central. La ventaja del modo como medida de la tendencia central es que su significado es obvio. Además, es la única medida de tendencia central que se puede usar con datos nominales. La moda está altamente sujeta a las fluctuaciones de la muestra y, por lo tanto, en general no se utiliza como la única medida de la tendencia central. Además, muchas distribuciones tienen más de una moda. Estas distribuciones se llaman "multimodales". La moda se describe mediante la siguiente relación:
Figure imgf000022_0002
(41)
ix) Trimedia: Una puntuación calculada sumando el percentil 25 más el doble del percentil 50 (mediana) más el percentil 75 y dividiendo entre cuatro. La trimedia es casi tan resistente a las puntuaciones extremas como la mediana y está menos sujeto a las fluctuaciones de muestreo que la media aritmética en distribuciones sesgadas. Sin embargo, en general es menos eficiente que la media para las distribuciones normales. La trimedia se describe en función de la siguiente relación:
(42)
Figure imgf000022_0003
x) Media recortada: Una puntuación calculada descartando un cierto porcentaje de las puntuaciones más bajas y más altas y a continuación, calculando la media de las puntuaciones restantes. Por ejemplo, una media recortada del 50 % se calcula descartando el 25 % inferior y superior de las puntuaciones y tomando la media de las puntuaciones restantes. Como ejemplo adicional, la mediana es la media recortada 100 % y la media aritmética es la media recortada 0 %. La media recortada es en general menos susceptible a los efectos de las puntuaciones extremas que la media aritmética. Por lo tanto, es menos susceptible a la fluctuación del muestreo que la media para distribuciones sesgadas. En general es menos eficiente que la media para las distribuciones normales. A modo de ejemplo, la media recortada 50 % se describe mediante la siguiente relación:
Figure imgf000022_0004
(43)
xi) Intervalo: La diferencia entre los valores más grandes y los más pequeños. El intervalo puede ser una medida útil de la propagación. Sin embargo, es sensible a las puntuaciones extremas ya que se basa en solo dos valores. Debido a esta sensibilidad, el intervalo en general no se utiliza como la única medida de propagación, pero puede ser informativo si se utiliza como complemento a otras medidas de propagación como la desviación estándar o el intervalo semiintercuartílico.
xii) Intervalo semiintercuartílico: Una medida de propagación calculada como la mitad de la diferencia entre el percentil 75 (Q3) y el percentil 25 (Ql). Dado que la mitad de las puntuaciones en una distribución se encuentran entre Q3 y Q1, el intervalo semiintercuartílico es la mitad de la distancia necesaria para cubrir dicha mitad de las puntuaciones. En una distribución simétrica, un intervalo que se extiende desde un intervalo semiintercuartílico por debajo de la mediana hasta un semiintercuartílico por encima de la mediana contendrá la mitad de las puntuaciones. Sin embargo, esto no es cierto para una distribución sesgada. A diferencia del intervalo, el intervalo semiintercuartílico en general no se ve afectado sustancialmente por las puntuaciones extremas. Sin embargo, está más sujeto a la fluctuación del muestreo en las distribuciones normales que a la desviación estándar y, por lo tanto, no se utiliza con frecuencia para datos aproximadamente distribuidos normalmente. El intervalo semiintercuartílico se define en función de la siguiente relación:
Figure imgf000022_0005
(44)
xiii) Varianza: Una medida de propagación de la distribución. La varianza se calcula tomando la desviación cuadrática media de cada número de su media, en función de la siguiente relación:
Figure imgf000023_0001
(45)
xiv) Desviación estándar: Función de varianza que mide cuán ampliamente se dispersan los valores de una distribución de la media. La desviación estándar es la raíz cuadrada de la varianza. Aunque en general es menos sensible a las puntuaciones extremas que el intervalo, la desviación estándar es generalmente más sensible que el intervalo semiintercuartílico. Por lo tanto, el intervalo semiintercuartílico se puede usar para complementar la desviación estándar cuando existe la posibilidad de puntuaciones extremas.
xv) Asimetría estadística: Medida de la asimetría de una distribución en torno a su media. Una distribución está sesgada si una de sus colas es más larga que la otra. La asimetría positiva indica una distribución con una cola asimétrica que se extiende hacia valores más positivos (mayores que la media). La asimetría negativa indica una distribución con una cola asimétrica que se extiende hacia valores más negativos (menos que la media). La asimetría se puede calcular en función de la siguiente relación:
Figure imgf000023_0002
(46)
xvi) Curtosis: Medida de cuán empinada o plana es una distribución (o un ancho de pico relativo), en comparación con una distribución normal. La curtosis positiva indica una distribución relativamente alta. La curtosis negativa indica una distribución relativamente plana. La curtosis se basa en el tamaño de las colas de una distribución y se determina mediante la siguiente relación:
Figure imgf000023_0003
(47)
Los procedimientos estadísticos anteriores son útiles para analizar las distribuciones espaciales de los valores grises, calculando las características locales en cada punto de la imagen y derivando un conjunto de estadísticas de las distribuciones de las características locales. Con estas estadísticas, los procedimientos, texturas para las regiones analizadas se pueden describir y definir estádicamente.
La textura se puede caracterizar usando descriptores de textura. Los descriptores de textura se pueden calcular en una región dada de la imagen (se analiza con mayor detalle a continuación). Un procedimiento de textura comúnmente aplicado es el procedimiento de co-ocurrencia, introducido por Haralick, R., y col. “Texture features for image classification,” IEEE Transactions of System, Man and Cybernetics, Vol. 3, pp. 610-621 (1973). En este procedimiento, las frecuencias relativas de los pares de píxeles de nivel gris separados por una distancia d en la dirección 0 se combinan para formar un vector de desplazamiento relativo (d, 0). El vector de desplazamiento relativo se calcula y almacena en una matriz, denominada matriz de co-ocurrencia de nivel gris (GLCM). Esta matriz se utiliza para extraer características de textura estadística de segundo orden. Haralick sugiere catorce características diferentes para describir una función de densidad de probabilidad bidimensional p¡, cuatro de las cuales se usan más comúnmente que las otras:
La textura se puede caracterizar usando descriptores de textura. Los descriptores de textura se pueden calcular en una región dada de la imagen (se analiza con mayor detalle a continuación). Un procedimiento de textura comúnmente aplicado es el procedimiento de co-ocurrencia, introducido por Haralick, R., y col. “Texture features for image classification,” IEEE Transactions of System, Man and Cybernetics, Vol. 3, pp. 610-621 * (1973). En este procedimiento, las frecuencias
relativas de pares de píxeles de nivel gris separados por una distancia d en la dirección 0 se combinan para formar un vector de desplazamiento relativo (d, 0). El vector de desplazamiento relativo se calcula y almacena en una matriz, denominada matriz de co-ocurrencia de nivel gris (GLCM). Esta matriz se utiliza para extraer características de textura estadística de segundo orden. Haralick sugiere catorce características diferentes para describir una función de densidad de probabilidad bidimensional p¡, cuatro de las cuales se usan más comúnmente que las otras:
(i) El segundo momento angular (ASM) se calcula mediante lo siguiente:
Figure imgf000023_0004
(48)
(ii) Contraste (Con) se calcula por lo siguiente:
Figure imgf000024_0001
(49)
(iii) La correlación (Cor) se calcula mediante lo siguiente (donde Ox y Oy son desviaciones estándar de las distribuciones correspondientes):
Figure imgf000024_0002
log(p£i)
(iv) Entropía (Ent) se calcula mediante lo siguiente:
Figure imgf000024_0003
Estas cuatro características también se enumeran en Strand, J., y col. “Local frequency features for the texture classification,” Pattern Recognition, Vol. 27, No. 10, pp 1397-1406 (1994).
Para una imagen dada, la región de la imagen sobre la cual se evalúan las características anteriores puede definirse por una máscara (por ejemplo, una máscara de colonia) o por una región de influencia de Voronoi que se extiende más allá de la máscara.
La FIG. 14 ilustra algunas regiones posibles. La Región 1410 es una máscara de colonia que se extiende sólo hasta la propia colonia. La Región 1420 es la región de Voronoi de influencia de la colonia (limitada por el borde de la imagen o la placa). Para ilustración adicional, el píxel 1430 es un píxel dentro de la región 1420 pero fuera de la región 1410. En otras palabras, se espera que la colonia representada por la región 1410 se expanda en el píxel 1630, pero aún no lo ha hecho. El píxel 1440 es un píxel fuera de ambas regiones 1410 y 1420. En otras palabras, no solo la colonia no ocupa el píxel 1410 en el momento de la imagen, sino que tampoco se prevé que sea ocupada por la colonia en ningún momento en el futuro (en este caso, ya está ocupada por una colonia diferente).
Usando máscaras de colonias en los diferentes puntos de tiempo a lo largo del procedimiento de incubación y sus regiones de influencia de Voronoi asociadas como se describió anteriormente, es posible generar múltiples histogramas que representan diferentes aspectos de las colonias y su impacto en los medios de cultivo locales circundantes. Las máscaras de colonias y las propias regiones de influencia de Voronoi pueden ajustarse con el tiempo, por ejemplo, a medida que las colonias crecen. Por ejemplo, las FIGS. 15A-C ilustran cómo el crecimiento de una colonia se puede usar para ajustar una máscara de la colonia con el tiempo. La FIG. 15A es una porción de un hemocultivo después de 24 horas de crecimiento en agar. La FIG. 15B es una imagen de contraste del mismo cultivo, en comparación con una imagen capturada previamente en tü. La FIG. 15C es una imagen en escala de grises que ilustra el crecimiento a las 9 horas (más ligero), 12 horas (medio) y 24 horas (más oscuro). Cada sombra en la FIG.
15C podría usarse para diseñar una máscara diferente para la colonia. Alternativa o adicionalmente, a medida que se produce el crecimiento, las máscaras podrían separarse en función de sus respectivas regiones de influencia de Voronoi.
Cualquiera o una combinación de características en la lista anterior de características puede usarse como un conjunto de características para capturar especificidades de organismos que crecen en diversos medios de una placa con imágenes en diversas condiciones de incubación. Esta lista no pretende ser exhaustiva, y cualquier persona con conocimientos en el campo podría modificar, ampliar o restringir este conjunto de características en función de los objetos previstos que se van a capturar y la variedad de características basadas en el procesamiento de imágenes conocidas en el campo. Por lo tanto, las características ejemplares anteriores se ofrecen a modo de ilustración, no de limitación.
Los expertos en la materia conocen otras mediciones y enfoques para determinar las formas y características de los objetos, y los ejemplos anteriores se ofrecen a modo de ilustración, no de limitación.
CONSTRUCCIÓN DE CONTRASTE
A menudo es difícil predecir inicialmente qué imagen de una serie de imágenes aportará valores para la detección, el conteo o la identificación del crecimiento. Esto se debe en parte a que el contraste de la imagen varía para los diferentes conjuntos formadores de colonias (CFC) y a través de diferentes medios. En una imagen dada de varias colonias, una colonia puede tener un contraste altamente deseable con el fondo, mientras que otra colonia puede no tener un contraste adecuado con el fondo para la detección del crecimiento. Esto también hace que sea difícil utilizar un enfoque único para identificar colonias en los medios de comunicación.
Por tanto es deseable construir contraste a partir de todo el material disponible en el espacio (diferencias espaciales) y el tiempo (diferencias temporales en condiciones de formación de imágenes comunes), así como mediante el uso de diversas condiciones de formación de imágenes (por ejemplo, canales rojos, verdes y azules, fondos claros y oscuros, imágenes espectrales o cualquier otra transformación del espacio de color). También es deseable recopilar contraste de múltiples fuentes disponibles para proporcionar una imagen estandarizada como una entrada a un algoritmo para detectar colonias.
Los datos de imagen se pueden delimitar en función de cualquier número de factores. Por ejemplo, los datos de imagen pueden limitarse a puntos de tiempo particulares y/o información particular buscada (por ejemplo, la información de imagen espacial puede no requerir tantos puntos de tiempo como la información de imagen temporal requiere). Las configuraciones de iluminación y los espacios de color también se pueden seleccionar para lograr objetivos de contraste específicos. Las frecuencias espaciales también se pueden variar para detectar objetos (por ejemplo, colonias) que tienen un tamaño deseado (o tamaño dentro de un intervalo diana).
Para detectar objetos discretos, el contraste puede establecerse en valores absolutos en [0,1] o con signos [- 1,-1]. También se puede especificar una escala y un desplazamiento de la salida de contraste (por ejemplo, para una imagen de 8 bits con desplazamiento de contraste con signo puede ser 127,5 y la escala puede ser 127,5). En un ejemplo en el que el contraste se establece en un extremo, el desplazamiento absoluto puede establecerse en cero y la escala en 256.
El contraste espacial se puede usar para detectar objetos discretos sobre un fondo homogéneo. Se puede utilizar una fórmula para proporcionar una evaluación automatizada del contraste espacial O(Z y ) « una imagen I en la ubicación (x, y) a una distancia r. En una realización, en la que la distancia r está limitada a distancias mayores o iguales a
Figure imgf000025_0001
y se utiliza un operador de contraste K para controlar los ajustes de
contraste, se aplican las siguientes ecuaciones:
Figure imgf000025_0002
El contraste temporal se puede usar para detectar objetos en movimiento u objetos que cambian con el tiempo (tales como CFC que aparecen y/o se gastan en una placa con imágenes). Se puede utilizar una fórmula para proporcionar una evaluación automatizada del contraste temporal en una imagen I en la ubicación (x,y) entre los tiempos t0 y tx. En una realización, se aplica la siguiente ecuación:
Figure imgf000025_0003
La recolección de contraste espacial se puede implementar de manera automatizada mediante la generación de una pluralidad de imágenes SHQI de una placa en función de una secuencia preprogramada. Se generarían múltiples imágenes en un momento de incubación dado para realizar más investigaciones de detección de colonias. En una realización, en la que los datos de imagen (particularmente, un vector "vect" utilizado para proporcionar entradas de contraste al operador de recolección de contraste) se recolectan en varias configuraciones (CFGj a CFGN) en varios radios diferentes de la colonia detectada (Rmln a Rmax) en un momento dado en función de lo siguiente:
Figure imgf000025_0004
Si SNR es conocido por una imagen dada I(xy) (por ejemplo, cuando la imagen SHQI es la fuente), la configuración en la que se maximiza el contraste ponderado SNR puede identificarse como la mejor configuración (Mejor CFG) cuando:
(56)
Figure imgf000025_0005
El operador de contraste K se beneficia además de esta información SNR conocida y la ecuación anterior se convierte en:
Figure imgf000026_0001
(58)
La recolección de contraste temporal también se puede implementar de manera automatizada mediante la generación de una pluralidad de imágenes SHQI de una placa en función de una secuencia preprogramada. Se generarían múltiples imágenes durante múltiples tiempos de incubación, al menos uno de los cuales es t0, para investigaciones adicionales de detección de colonias. En una realización, los datos de imagen se recopilan en varias configuraciones en el tiempo t0 y uno o más tiempos de incubación posteriores hasta el tiempo tx en función de lo siguiente [la ecuación utilizada previamente “N” tanto para el vector como para las configuraciones, que pensé que era confusa... ¿es aceptable la ecuación revisada a continuación, o es necesario volver a poner el Tn en la ecuación?]:
(59)
Figure imgf000026_0002
En el ejemplo anterior, el vector puede ser un vector entre dos puntos de tiempo (por ejemplo, t0 y tx) en función de las diferencias en las imágenes en esos dos momentos. Sin embargo, en otras aplicaciones, en las que se incluyen tiempos adicionales entre t0 y tx, el vector puede mapearse en tantos puntos como momentos en los que se toman imágenes. Matemáticamente hablando, no hay límite a los puntos numéricos que se pueden incluir en el vector.
Al igual que con el contraste espacial, si SNR es conocido por una imagen dada /(x.y), la configuración en la que se maximiza el contraste ponderado SNR puede identificarse como la mejor configuración (Mejor CFG) cuando:
(60)
Figure imgf000026_0003
(61)
El operador de contraste K se beneficia además de esta información SNR conocida y la ecuación anterior se convierte en:
Figure imgf000026_0004
(62)
En los ejemplos anteriores, el operador Max podría ser reemplazado por cualquier otro operador estadístico, como un percentil (por ejemplo, Q1, mediana, Q3 o cualquier otro percentil) o suma ponderada. Los valores ponderados podrían originarse del trabajo previo extraído de una base de datos de entrenamiento, abriendo así el campo de extracción de contraste supervisado a las redes neuronales. Además, se pueden usar múltiples algoritmos, donde los resultados de los múltiples algoritmos se combinan adicionalmente usando otro operador, tal como el operador Max.
ALINEACIÓN DE LA IMAGEN
Cuando se toman varias imágenes a lo largo del tiempo, se necesita una alineación muy precisa de las imágenes para obtener estimaciones temporales válidas a partir de ellas. Dicha alineación se puede lograr mediante un dispositivo de alineación mecánica y/o algoritmos (por ejemplo, seguimiento de imágenes, coincidencia de imágenes). Los expertos en la materia son conscientes de estas soluciones y técnicas para lograr este objetivo.
Por ejemplo, en los casos en que se recogen múltiples imágenes de un objeto en la placa, se pueden determinar las coordenadas de la ubicación de un objeto. Los datos de imagen del objeto recopilados en un momento posterior pueden a continuación, asociarse con los datos de imagen anteriores basados en las coordenadas, y luego usarse para determinar el cambio en el objeto a lo largo del tiempo.
Para un uso rápido y valioso de las imágenes (por ejemplo, cuando se utilizan como entrada a los clasificadores), es importante almacenar las imágenes en una referencia espacial para maximizar su invariancia. Como el descriptor de forma básico para una colonia es generalmente circular, se puede usar un sistema de coordenadas polares para almacenar imágenes de colonias. El centro de masa de la colonia puede identificarse como el centro de la ubicación de la colonia cuando se detecta por primera vez la colonia. Ese punto central puede servir más tarde como centro de origen para una transformación polar de cada imagen posterior de la colonia. La FIG. 16A muestra una parte ampliada de una placa con imágenes que tiene un punto central “O.” Se muestran dos rayos “A” y “B” que se extienden desde el punto “O” (para fines de claridad) superpuestos en la imagen. Cada rayo se cruza con una colonia respectiva (en círculos). Las colonias en círculos de la FIG. 16A se muestra con aún mayor detalle en las imágenes 1611 y 1612 de la FIG. 16B. En la FIG. 16B, la imagen 1611 (el rayo de intersección de colonia “A”) se reorienta hacia la imagen 1613 (“A”’) de modo que el eje radial de la imagen 1613 está alineado con el de la imagen 1612, de modo que la parte más izquierda de la imagen reorientada está más cerca del punto “O” de la FIG. 16A, y la parte más a la derecha de la imagen reorientada está más lejos del punto “O.” Esta reorientación polar permite un análisis más fácil de las colonias de orientación diferente (con respecto a factores tales como la iluminación) de una placa con imágenes.
En la FIG. 16C, se completa una transformación polar para cada una de las imágenes 1611, 1612 y 1613 de la FIG.
16B. En las imágenes de transformación polar 1621, 1622 y 1623, el eje radial de las imágenes reorientadas respectivas 1611, 1612 y 1613 (que se extienden desde el centro de cada colonia visualizada respectiva) se grafican de izquierda a derecha en las imágenes de la FIG. 16C, y el eje angular (de las colonias respectivas) se grafica de arriba a abajo.
Para cada imagen polar, se pueden generar conjuntos de vectores unidimensionales resumidos usando, por ejemplo, características de forma y/o características de histograma (por ejemplo, desviación promedio y/o estándar de color o intensidad de un objeto) a lo largo del eje radial y/o angular. Incluso si las características de forma e histograma son en su mayoría invariantes cuando se considera la rotación, es posible que algunas características de textura muestren variaciones significativas cuando se giran; por lo tanto, la invariancia no está garantizada. Por lo tanto, existe un beneficio significativo al presentar cada una de las imágenes de colonia desde el mismo punto de vista o iluminación en ángulo, ya que las diferencias de textura de los objetos pueden usarse para discriminarse entre sí. Como las condiciones de iluminación muestran principalmente variaciones vinculadas a la posición angular alrededor de un centro de obtención de imágenes de placa, el rayo que pasa a través de la colonia y el centro de placa (que se muestra como una línea en cada una de las imágenes 1611, 1612 y 1613 de la FIG. 16B) puede servir como origen (0) para cada transformada polar de imagen.
Un desafío de alineación adicional surge del hecho de que el medio de placa no está absolutamente congelado y rígido, y por lo tanto puede cambiar ligeramente de uno tomado al siguiente. Por lo tanto, no se puede suponer absolutamente que la región de una placa en ciertas coordenadas de una imagen tomada en un momento necesariamente se alineará perfectamente con la región de la placa en las mismas coordenadas tomadas en un momento posterior. Dicho de otra manera, ligeras deformaciones del medio pueden conducir a una pequeña incertidumbre con respecto a la coincidencia exacta de un píxel dado, con el píxel correspondiente capturado en un punto de tiempo diferente durante el procedimiento de incubación.
Para explicar esta incertidumbre, un valor de intensidad de píxel dado en el tiempo ta, Ita(x,y) se puede comparar con el valor de intensidad más cercano en la vecindad local N(x, y) de este píxel en un punto de tiempo diferente tb, ItbN(x,y). La selección de una vecindad local puede implicar determinar uno o más errores o inexactitudes en el reposicionamiento de la placa visualizada de una vez a la siguiente (por ejemplo, un error de precisión de posición debido al reposicionamiento imperfecto del medio visualizado, un error de paralaje debido a una altura desconocida del medio visualizado de una vez a la siguiente). En un ejemplo, se ha observado que la configuración de “x” e "y” dentro del intervalo de aproximadamente 3 a aproximadamente 7 píxeles es adecuada para una imagen con una resolución de aproximadamente 50 micras por píxel.
Cualquiera experto en el campo reconocerá como una solución eficiente para generar dos imágenes tb a partir de la imagen fuente tb: la primera corresponde a una dilatación de nivel gris de tb (denominada DlLtb 'd), y la segunda a una erosión de nivel gris de tb, (denominada EROtb'd), ambas con un tamaño de núcleo que coincide con la incertidumbre de distancia de reposicionamiento d.
ERO tb,d
i ta < D i rtb.d
(x,y) '(x ,y) s U1L (x,y)
Si entonces el contraste es 0, de lo contrario el contraste se estima desde el valor n i r tb ’d
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000028_0002
u 1" (x,y)
más cercano a entre y utilizando lo siguiente:
Figure imgf000028_0003
p o n k A _ , k f i i i h A r^a 1)
(64) V w ) = eK:Í, Si ( c t íU {xsy), x,y) < U !L (x,y) (x ,y)\)
(65)
Figure imgf000028_0004
MEJORA DE SNR
En condiciones de iluminación típicas, el ruido de disparo de fotones (variación estadística en la tasa de llegada de fotones incidentes en el sensor) limita el SNR del sistema de detección. Los sensores modernos tienen una capacidad total de pozo que es de aproximadamente 1.700 a aproximadamente 1.900 electrones por micrón cuadrado activo. Por lo tanto, al obtener imágenes de un objeto en una placa, la preocupación principal no es la cantidad de píxeles utilizados para crear imágenes del objeto, sino más bien el área cubierta por el objeto en el espacio del sensor. Aumentar el área del sensor mejora el SNR para el objeto de imagen.
La calidad de imagen puede mejorarse capturando la imagen con condiciones de iluminación en las que el ruido de fotones gobierna el SNR (ruido de fotones = señal) sin saturar el sensor (número máximo de fotones que se pueden registrar por píxel por fotograma). Para maximizar el SNR, se utilizan comúnmente técnicas de promediación de imágenes. Estas técnicas se utilizan para abordar imágenes con diferencias significativas de brillo (o color), ya que el SNR de las regiones oscuras es mucho menor que el SNR de las regiones brillantes, como se muestra en la siguiente fórmula:
Figure imgf000028_0005
(66)
Donde I es la corriente media creada por la corriente de electrones en el sensor. A medida que los colores se perciben debido a una diferencia en la absorción de materia y luz a través del espectro electromagnético, la confianza en los colores capturados dependerá de la capacidad del sistema para registrar la intensidad con un SNR alto. Los sensores de imagen (por ejemplo, sensores CCD, sensores CMOS, etc.) son bien conocidos por un experto en la materia y no se describen en detalle en esta invención,
Para superar las limitaciones clásicas de formación de imágenes SNR, el sistema de formación de imágenes puede llevar a cabo el análisis de una placa visualizada durante la adquisición de imágenes y ajustar las condiciones de iluminación y los tiempos de exposición en tiempo real en función del análisis. Este procedimiento se describe en la publicación PCT N° WO2015/114121, una j generalmente conocida como
Imágenes de alta calidad supervisadas (SHQI). El sistema también puede personalizar las condiciones de imagen para las diversas regiones de brillo de la placa dentro de los diferentes canales de color.
Para un píxel dado x,y de una imagen, la información SNR del píxel adquirido durante un fotograma actual N puede combinarse con información SNR del mismo píxel adquirido durante fotogramas adquiridos anteriores o posteriores (por ejemplo, N-1, N+1). Por ejemplo, el SNR combinado está dictado por la siguiente fórmula:
(67)
Figure imgf000028_0006
Después de actualizar los datos de imagen con una nueva adquisición, el sistema de adquisición es capaz de predecir el mejor tiempo de adquisición siguiente que maximizaría SNR en función de las restricciones ambientales (por ejemplo, SNR mínimo requerido por píxel dentro de una región de interés). Por ejemplo, el promedio de 5 imágenes capturadas en condiciones no saturadas aumentará el SNR de una región oscura (10 % de intensidad máxima) en V5, al fusionar la información de dos imágenes capturadas en condiciones brillantes y oscuras, la iluminación óptima aumentará las regiones oscuras SNR por V11 en solo dos adquisiciones.
MODELADO DE IMÁGENES
En algunas circunstancias, al calcular el contraste espacial o temporal entre píxeles de una o más imágenes, el píxel, la información para una imagen dada puede no estar disponible o puede degradarse. La indisponibilidad puede ocurrir, por ejemplo, si una imagen de la placa no se capturó dentro del tiempo antes del crecimiento bacteriano (por ejemplo, la placa no se capturó en el tiempo t0 o poco después. Degradación de la señal La información puede ocurrir, por ejemplo, cuando una imagen se captura en el tiempo t0, pero los píxeles de la imagen capturada no reflejan con precisión la placa capturada antes del crecimiento bacteriano. Dichas inexactitudes pueden ser causadas por artefactos temporales que no reaparecen en imágenes posteriores de la placa de la serie de cal (por ejemplo, condensación que se forma temporalmente debajo de la placa debido a un choque térmico cuando la placa se coloca por primera vez en la incubadora).
En tales circunstancias, la imagen no disponible o degradada (o ciertos píxeles de la imagen) se puede reemplazar o mejorar con una imagen modelo de una placa. La imagen de modelo puede proporcionar información de píxeles que refleja cómo se espera que la placa mire la cal particular de la imagen no disponible o degradada. En el caso de una imagen de modelo en el tiempo t0 , el modelo puede ser una imagen simple o estándar de una placa, y puede construirse matemáticamente usando técnicas de modelado/formación de imágenes tridimensionales. El modelo puede incluir cada uno de los parámetros de diseño físico (por ejemplo, diámetro, altura, divisores para alojar múltiples medios, material plástico, etc.), parámetros de iluminación (por ejemplo, tipo de medio, composición del medio, altura 0 grosor del medio, etc.) parámetros de iluminación (por ejemplo, ángulo de la fuente de luz, color o longitud de onda de la fuente de luz, color de fondo, etc.) y parámetros de posicionamiento (por ejemplo, posición de la placa en la cámara de formación de imágenes) con el fin de producir un modelo lo más real posible.
En el caso de una imagen degradada, la mejora de la imagen degradada se puede lograr usando la restauración de señal para aguzar las características de píxeles degradados de la imagen cuando la información de píxeles no es tan nítida como el resto de la imagen (por ejemplo, debido a la condensación debajo que impide que cierta luz pase a través de la placa y, por lo tanto, hace que la sección de la placa con condensación sea ligeramente menos transparente). La restauración de señal puede implicar determinar la información de intensidad para el resto de la imagen, identificar una intensidad media de la información de intensidad y luego reemplazar la información de intensidad para las regiones menos nítidas de la imagen con la intensidad media del resto de la imagen.
APLICACIONES
La presente descripción se basa en gran medida en las pruebas realizadas en solución salina en diversas diluciones para simular cantidades típicas de notificación de orina (grupos de Balde CFC/ml). Se ajustó una suspensión para cada aislado a un estándar de McFarland 0,5 y se utilizó para preparar diluciones a una cantidad estimada de 1 X 106, 1 X 105, 5 X 104, 1 X 104, 1 X 103 y 1 X 102 CFC/ml de suspensión en tubos BD Vacutainer Urine (Cat. N.° 364951). Los tubos de especímenes se procesaron usando Kiestra InoqulA (WCA1) con el patrón de rayado de orina estándar - #4 Zigzag (dispensación de 0,01 ml por placa).
Las placas se procesaron usando el RcadA Compact (35°C, sin CO2) y se obtuvieron imágenes cada 2 horas durante las primeras 24 horas y cada 6 horas durante las segundas 24 horas con una incubación total de 48 horas. Los tiempos de incubación se introdujeron como primera lectura a 1 hora con el margen permitido establecido como /- 15 minutos. Para la próxima lectura en 2-24 horas se establecieron para cada dos horas con un margen permitido de /- 30 minutos. Para la lectura, se establecieron 24-48 para cada 6 horas con márgenes permitidos de /-30 minutos. Después de los estudios de viabilidad pura, esto se modificó para eliminar el margen permitido. Esto se hizo para mejorar las adquisiciones de imágenes en el intervalo de tiempo deseado de 18 a 24 horas.
En otros casos, las imágenes pueden obtenerse en un lapso de 48 horas, a intervalos de dos horas durante las primeras 24 horas y luego a intervalos de 6 horas durante las siguientes 24 horas. En tales casos, se obtendría un total de diecisiete imágenes en el lapso de 48 horas, incluida una imagen obtenida del tiempo t0 (0 horas).
Todas las imágenes adquiridas se corrigieron por aberraciones geométricas y cromáticas de la lente, espectralmente equilibradas, con tamaño de píxel de objeto conocido, condiciones de iluminación normalizadas y alta relación señal/ruido por banda por píxel. Las cámaras adecuadas para su uso en los procedimientos y sistemas descritos en esta invención son bien conocidas por un experto en la materia y no se describen en detalle en esta invención. A modo de ejemplo, el uso de una cámara de 4 megapíxeles para capturar una imagen de placa de 90 mm debe permitir la enumeración de hasta 30 colonias de densidades locales (>105 CFC/placa) cuando las colonias están en el intervalo de 100 gm de diámetro con contraste adecuado.
Se utilizaron los siguientes medios para evaluar el contraste de las colonias cultivadas en ellos:
TSAII 5 % Sangre de oveja (BAP): un medio sin selección con uso mundial para el cultivo de orina.
BAV: utilizado para la enumeración de colonias y la identificación presuntiva basada en la morfología y hemólisis de las colonias.
Agar MacConkey II (MAC): un medio selectivo para los patógenos Gram negativos más comunes de ITU. MAC se utiliza para la diferenciación de colonias productoras de lactosa. MAC también inhibe el enjambre de Proteus. BAP y MAC se utilizan comúnmente en todo el mundo para el cultivo de orina. Algunos medios no se recomiendan para el conteo de colonias debido a la inhibición parcial de algunos gram negativos.
Agar ácido nalidíxico de colistina (CNA): un medio selectivo para la mayoría de los patógenos de ITU gram positivo. CNA no se usa tan comúnmente como MAC para el cultivo de orina, pero ayuda a identificar colonias si se produce un crecimiento excesivo de colonias Gram negativas.
Orientación CHROMAgar (CHROMA): un medio sin selección utilizado en todo el mundo para el cultivo de orina. CHROMA se utiliza para la enumeración de colonias y la identificación basada en el color y morfología de la colonia. E. coli y Enterococcus son identificados por los medios y no requieren pruebas confirmatorias. CHROMA se utiliza menos que BAP debido al coste. Para muestras mixtas, también se utilizó medio CLED.
Agar con deficiencia de electrolitos de lactosa cistina (CLED): utilizado para la enumeración de colonias y la identificación presuntiva de patógenos urinarios basados en la fermentación de lactosa.
El Procesamiento de Especímenes BD Kiestra™ InoqulA™ se utilizó para automatizar el procesamiento de especímenes de bacteriología para permitir la estandarización y garantizar rayado consistente y de alta calidad. El procesador de especímenes BD Kiestra™ InoqulA™ utiliza una tecnología de perlas de laminación magnética para rayar las placas de medios utilizando patrones personalizables. La perla laminada magnética tiene 5 mm de diámetro.
La FIG. 17 ilustra un ejemplo de rendimiento del algoritmo de recolección de contraste en la recuperación del crecimiento de Morganella morganii en medios CHROMagar (imágenes superiores) y agar sanguíneo (imágenes inferiores). CHROMagar y BAP son medios de cultivo no selectivos comúnmente utilizados en laboratorios de microbiología. Cada una de las imágenes intermedias de la FIG. 17 presenta una placa con imágenes iluminada por una luz sobre la placa (iluminación superior). Las imágenes de la izquierda presentan el contraste espacial correspondiente de las imágenes intermedias. El contraste espacial se basa en un núcleo mediano de 1 milímetro. Por último, las imágenes de la derecha presentan contraste temporal de la imagen media. El contraste temporal se compila a partir de imágenes capturadas entre 0 horas (to) y 12 horas (tx) de incubación utilizando diversas condiciones de iluminación (diferentes canales de color, ajustes de iluminación, etc.) en cada tiempo de captura de imagen.
Como se muestra en la FIG. 17, el contraste local tiene sus limitaciones cuando se trata de colonias semitransparentes, especialmente cuando las transiciones de borde son pequeñas, ya que solo las regiones de confluencia más contrastadas pueden seleccionarse de la imagen usando el algoritmo de contraste espacial solo, el contraste espacial puede no captar el objeto También evidente de la FIG. 17 es la eficiencia del contraste temporal en colonias aisladas.
La FIG. 17 (particularmente las imágenes de agar en sangre en la parte inferior) también resalta los problemas de usar contraste espacial solo para detectar el crecimiento en medios transparentes. La tinta impresa en la caja transparente tiene bordes muy fuertes, y por lo tanto un fuerte contraste espacial. Esto termina haciendo que cualquier otro contraste espacial sea muy difícil de ver, ya que las colonias no tienen bordes tan fuertemente definidos. Por lo tanto, el uso del contraste temporal junto con el contraste espacial es de considerable beneficio en la presente descripción.
En última instancia, el resultado de las determinaciones de contraste descritas anteriormente es que se pueden automatizar procedimientos para la detección e identificación rápida de colonias en un medio de obtención de imágenes. Los procedimientos automatizados proporcionan ventajas significativas sobre procedimientos manuales comparables.
La FIG. 18 muestra un par de diagramas de flujo que comparan una línea de tiempo de un procedimiento de prueba automatizado 1800 (por ejemplo, la rutina 200 de la FIG. 2) a una línea de tiempo de un procedimiento no 1805 comparable realizado manualmente. Cada procedimiento comienza con el espécimen para pruebas que se recibe en un laboratorio 1810, 1815. Cada procedimiento procede a continuación, con la incubación 1820, 1825, durante la cual el espécimen puede ser visualizado varias veces. En el procedimiento automatizado, se realiza una evaluación automatizada 1830 después de aproximadamente 12 horas de incubación, después de lo cual se puede determinar definitivamente si no hay crecimiento (o crecimiento normal) en el espécimen 1840. Como se muestra a partir de los resultados en la FIG. 17, el uso de contraste temporal en el procedimiento automatizado mejora en gran medida la capacidad de detectar colonias, incluso después de solo 12 horas. Por el contrario, en el procedimiento manual, no se puede realizar una evaluación manual 1835 hasta casi 24 horas después del procedimiento de incubación. Sólo después de 24 horas se puede determinar definitivamente si no hay crecimiento (o crecimiento normal) en el espécimen 1845.
El uso de un procedimiento automatizado también permite realizar pruebas AST y MALDI más rápidas. . Dichas pruebas 1850 en un procedimiento automatizado pueden comenzar poco después de la evaluación inicial 1830, y los resultados se pueden obtener 1860 e informar 1875 por la marca de 24 horas. Por el contrario, dichas pruebas 1855 en un procedimiento manual a menudo no comienzan hasta cerca de la marca de 36 horas, y tardan entre 8 y 12 horas en completarse antes de que los datos puedan revisarse 1865 e informarse 1875.
En conjunto, se muestra que el procedimiento de prueba manual 1805 toma hasta 48 horas, requiere un período de incubación de 18-24 horas, solo después del cual se evalúa el crecimiento de la placa, y además no tiene manera de hacer un seguimiento del tiempo que una muestra ha estado en incubación. Por el contrario, debido a que el procedimiento de prueba automatizado 1800 puede detectar incluso un contraste relativamente pobre entre colonias (en comparación con el fondo y entre sí), y puede realizar imágenes e incubación sin que un microbiólogo tenga que realizar un seguimiento del tiempo, solo se necesitan 12-18 horas de incubación antes de que el espécimen pueda identificarse y prepararse para pruebas adicionales (por ejemplo, AST, MALDI), y todo el procedimiento se puede completar dentro de aproximadamente 24 horas. Por lo tanto, el procedimiento automatizado de la presente descripción, ayudado con el procesamiento de contraste descrito en esta invención, proporciona pruebas más rápidas de muestras sin afectar negativamente la calidad o precisión de los resultados de la prueba.

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento automatizado para evaluar el crecimiento microbiano en medios en placas, comprendiendo el procedimiento:
proporcionar un medio de cultivo inoculado con una muestra biológica dispuesta en un recipiente que es sustancialmente ópticamente transparente;
incubar el medio de cultivo inoculado en una incubadora;
colocar el recipiente transparente que transporta el medio de cultivo inoculado en un aparato de formación de imágenes digitales;
obtener una primera imagen digital del medio inoculado por primera vez (to), donde la primera imagen digital tiene una pluralidad de píxeles;
determinar las coordenadas de los píxeles en la primera imagen digital con respecto al recipiente transparente que transporta el medio de cultivo inoculado;
retirar el recipiente transparente que transporta el medio de cultivo inoculado del aparato de formación de imágenes digitales y colocar el medio de cultivo inoculado en la incubadora para su posterior incubación;
después de una incubación adicional, colocar el recipiente transparente que transporta el medio de cultivo inoculado en el aparato de formación de imágenes digitales;
obtener una segunda imagen digital del medio inoculado en una segunda vez (tx), donde la segunda imagen digital tiene una pluralidad de píxeles;
alinear la primera imagen digital con la segunda imagen digital, de modo que las coordenadas de un píxel en la segunda imagen digital correspondan a las coordenadas de un píxel correspondiente en la primera imagen digital; comparar los píxeles de la segunda imagen digital con píxeles correspondientes de la primera imagen digital;
identificar píxeles que cambiaron entre la primera imagen digital y la segunda imagen digital, donde los píxeles que no han cambiado entre la primera imagen digital y la segunda imagen digital son indicativos del fondo;
determinar cuál de los píxeles identificados en la segunda imagen digital tiene un nivel predeterminado de contraste umbral con los píxeles que indican el fondo; identificar uno o más objetos en la segunda imagen digital, cada objeto consiste en píxeles que cumplen con dicho nivel de contraste umbral y que no están separados entre sí por píxeles de fondo;
para al menos uno de los objetos identificados, determinar una morfología de objeto a partir de los píxeles del objeto mediante la obtención de características del objeto a partir de la información de píxeles asociada con el objeto, donde las características del objeto comprenden al menos uno de forma del objeto, tamaño del objeto, borde del objeto y color del objeto, donde la morfología del objeto se determina en función de las características del objeto; y
de la morfología del objeto, determinar si el objeto es un candidato a colonia; y
proporcionar a la memoria las coordenadas de los píxeles asociados con el objeto.
2. El procedimiento de la reivindicación 1 que comprende además obtener una pluralidad de primeras imágenes digitales por primera vez en función de una serie predeterminada de condiciones de iluminación, donde cada una de las primeras imágenes digitales se obtiene bajo una condición de iluminación diferente, donde cada condición de iluminación comprende una orientación específica del recipiente ópticamente transparente que transporta el medio de cultivo inoculado con respecto a una fuente de iluminación, y un color de fondo específico sobre el que se coloca el recipiente ópticamente transparente en el aparato de formación de imágenes.
3. El procedimiento de la reivindicación 2, donde las orientaciones especificadas comprenden:
la fuente de iluminación dirigida hacia abajo hacia la parte superior del recipiente ópticamente transparente que transporta el medio de cultivo inoculado;
la fuente de iluminación dirigida hacia arriba hacia la parte inferior del recipiente ópticamente transparente que transporta el medio de cultivo inoculado; y
la fuente de iluminación dirigida hacia un lado del recipiente ópticamente transparente que transporta el medio de cultivo inoculado.
4. El procedimiento de la reivindicación 3, donde para las orientaciones superior y lateral especificadas, el color de fondo especificado es negro; y para la orientación inferior especificada, el color de fondo especificado es blanco.
5. El procedimiento de la reivindicación 4, donde cada condición de iluminación comprende además un espectro de iluminación especificado que comprende:
una fuente de iluminación que emite longitudes de onda rojas; una fuente de iluminación que emite longitudes de onda verdes; y
una fuente de iluminación que emite longitudes de onda azules.
6. El procedimiento de la reivindicación 1, donde el color del objeto se determina a partir de las características espectrales de los píxeles asociados con el objeto.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, donde las características espectrales se seleccionan del grupo que consiste en color de píxeles, matiz, luminancia y crominancia.
8. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además obtener información de antecedentes, donde la información de la característica de fondo comprende el tipo de medio y el color del medio, en el que la morfología del objeto se determina además en función de la información de la característica del fondo.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, que además comprende:
comparar las características del objeto y la información de la característica de fondo con las características del objeto y la información de la característica del fondo almacenada en la memoria; y determinar el tipo de microorganismo en función de las características del objeto y la información de características de fondo.
10. El procedimiento de la reivindicación 1, donde alinear la primera imagen digital con la segunda imagen digital comprende asignar coordenadas polares a píxeles de cada una de la primera y segunda imágenes digitales de modo que las coordenadas polares de un píxel en la segunda imagen digital sean las mismas que las coordenadas polares de un píxel correspondiente en la primera imagen digital.
11. El procedimiento de la reivindicación 1, donde se proporcionan múltiples medios de cultivo, se inoculan con una muestra biológica, se disponen en uno o más recipientes ópticamente transparentes, se incuban en una incubadora y se colocan en un aparato de formación de imágenes digitales al mismo tiempo que el fotograma de crecimiento bacteriano, mediante el cual se obtienen la primera y segunda imágenes digitales para cada medio de cultivo.
12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 -10, que comprende, además:
obtener una tercera imagen digital del medio inoculado, donde la tercera imagen digital se obtiene en un momento entre el momento en que se adquiere la primera imagen digital y el momento en que se adquiere la segunda imagen digital, donde el medio de cultivo inoculado se retira del aparato de formación de imágenes y se coloca en la incubadora entre la adquisición de la primera y la segunda imagen digital y entre la adquisición de la segunda y la tercera imagen digital;
alinear la tercera imagen digital con la primera imagen digital, de modo que las coordenadas de un píxel en la tercera imagen digital sean las mismas que las coordenadas de un píxel correspondiente en la primera imagen digital;
comparar los píxeles de la tercera y segunda imágenes digitales entre sí; e identificar píxeles que cambiaron entre la tercera y segunda imágenes digitales.
13. El procedimiento de la reivindicación 12, donde el tiempo de incubación entre la primera y tercera imágenes digitales es igual al tiempo de incubación entre la tercera y segunda imágenes digitales.
14. El procedimiento de la reivindicación 12, donde al menos uno de los objetos identificados está asociado con los píxeles identificados que cambiaron entre la tercera y segunda imágenes digitales.
15. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 -10, que comprende, además:
obtener una tercera imagen digital del medio inoculado, donde la tercera imagen digital se obtiene después del momento en el que se obtiene la segunda imagen digital, donde el medio de cultivo inoculado se retira del aparato de formación de imágenes y se coloca en la incubadora entre el momento en el que se obtienen la segunda y la tercera imagen digital;
alinear la tercera imagen digital con la primera y segunda imágenes digitales, de modo que las coordenadas de un píxel en la tercera imagen digital sean las mismas que las coordenadas de un píxel correspondiente en la primera y segunda imágenes digitales;
comparar los píxeles de la tercera y la segunda imagen digital entre sí; identificar píxeles que cambiaron entre la segunda y la tercera imagen digital; y determinar que un objeto identificado en la segunda imagen digital ha cambiado en la tercera imagen digital en función de los píxeles comparados de la segunda y la tercera imagen digital que se identificó que habían cambiado.
16. Un medio de almacenamiento de memoria legible por computadora que tiene instrucciones de programa codificadas en el mismo configuradas para hacer que un procesador realice un procedimiento para evaluar el crecimiento microbiano en medios en placas, el procedimiento comprende cualquiera de los procedimientos de las reivindicaciones 1-15.
17. Un sistema para identificar el crecimiento en un medio de cultivo inoculado con una muestra biológica y dispuesto en un recipiente ópticamente transparente, comprendiendo el sistema:
un dispositivo de adquisición de imágenes para capturar imágenes digitales del medio de cultivo; memoria que almacena información con respecto a las imágenes digitales capturadas; y uno o más procesadores operables para ejecutar instrucciones para realizar un procedimiento según cualquiera de los procedimientos de las reivindicaciones 1-15.
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