[go: up one dir, main page]

ES2824554T3 - Plataforma de reactividad de células T - Google Patents

Plataforma de reactividad de células T Download PDF

Info

Publication number
ES2824554T3
ES2824554T3 ES16819310T ES16819310T ES2824554T3 ES 2824554 T3 ES2824554 T3 ES 2824554T3 ES 16819310 T ES16819310 T ES 16819310T ES 16819310 T ES16819310 T ES 16819310T ES 2824554 T3 ES2824554 T3 ES 2824554T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
antigen
cell
cells
particle
sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES16819310T
Other languages
English (en)
Inventor
Hans Grönlund
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tcer AB
Original Assignee
Tcer AB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from EP15200619.3A external-priority patent/EP3182125A1/en
Application filed by Tcer AB filed Critical Tcer AB
Application granted granted Critical
Publication of ES2824554T3 publication Critical patent/ES2824554T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Un método in vitro para ensayar la activación de células T específicas de antígeno, que comprende las etapas de: a. Disponer una partícula fagocitable, que tiene un polipéptido antígeno candidato asociado íntimamente a la misma, en donde la partícula con el polipéptido asociado se ha sometido a un lavado de desnaturalización que resulta en un nivel de endotoxina suficientemente bajo para no interferir con las etapas posteriores; b. Disponer una célula presentadora de antígeno viable; c. Poner en contacto la partícula lavada con la célula presentadora de antígeno in vitro en condiciones que permiten la fagocitosis de la partícula por la célula presentadora de antígeno; d. Disponer una muestra de células T a ensayar que comprende células T viables; e. Poner en contacto la muestra de células T con la célula presentadora de antígeno que ha contactado con la partícula in vitro en condiciones que permiten la activación específica de células T en respuesta a un antígeno presentado por una célula presentadora de antígeno; y f. Determinar el grado de activación de células T en la muestra de células T.

Description

DESCRIPCIÓN
Plataforma de reactividad de células T
Campo técnico
La presente invención se refiere al campo de los métodos de diagnóstico y analíticos que implican la determinación de la activación de células T específicas de antígeno.
Antecedentes de la invención
El sistema inmunitario adaptativo constituye la rama del sistema inmunitario que puede adaptarse específicamente y responder a diferentes patógenos o amenazas de daño celular a los que hace frente el organismo, a diferencia del sistema inmunitario innato, que responde de una manera más genérica. El sistema adaptativo incluye la inmunidad humoral, es decir, los anticuerpos secretados por las células B, y la inmunidad mediada por células T. La especificidad del sistema inmunitario adaptativo se basa en los receptores de células B y T expresados en las células B y T. A través de un complicado sistema de mezcla de segmentos génicos, el cuerpo produce una variedad casi infinita de células B y T, cada una de las cuales expresa un receptor específico para una proteína o péptido determinados.
Las células T son linfocitos que forman la parte principal del sistema inmunitario adaptativo, en donde juegan un papel central en la inmunidad mediada por células. El T-cell receptor (receptor de célula T - TCR) definido se expresa en la superficie celular, y cada receptor reconoce un péptido derivado de antígeno presentado en el contexto de una molécula MHC (complejo mayor de histocompatibilidad). Existen varios tipos de células T, cada uno con una función diferente en la respuesta inmunitaria celular.
En resumen, existen dos tipos principales de células T con diferentes funciones. La célula T citotóxica CD8-positiva se unirá a los péptidos presentados en el receptor MHC clase I (en humanos, denominado antígeno de leucocito humano (HLA) clase I) en una célula. Todas las células nucleadas expresan un HLA clase I. Si el péptido presentado se considera como extraño (la mayor parte de las veces, un signo de infección vírica), la célula T citotóxica matará la célula mediante la proteína Granzima B o Perforina. La célula T auxiliar (Th), que expresa el marcador de superficie CD4, no mata, sino que más bien orquesta respuestas inmunitarias mediante la secreción de citoquinas, proteínas que aumentarán tanto las señales proinflamatorias como, en ocasiones, inhibitorias entre las células. Otra función importante de las células T auxiliares consiste en inducir la conmutación de clase de las células B, p. ej., para transformar una célula B de secreción de IgM en una célula de secreción de IgG, lo que aumentará la respuesta inmunitaria humoral contra un antígeno.
Una célula T auxiliar, mediante su TCR, se unirá a su péptido correspondiente presentado en MHC II (en humanos, denominado HLA clase II), un receptor específicamente expresado en las llamadas antigen presenting cells (células presentadoras de antígeno - APC) o células endoteliales. La activación de la célula T depende del micro entorno en el que se produce la interacción Th-APC y del tipo de las llamadas moléculas coestimuladoras que se expresan en el APC. La célula T auxiliar puede diferenciarse en diferentes subconjuntos Th, p. ej., células proinflamatorias, Th1, Th2, Th17 o un tipo de célula T auxiliar inhibitoria denominada célula T reguladora (Treg). El último subconjunto es de gran importancia para controlar respuestas inmunitarias, ya que un sistema inmunitario no restringido es nocivo y puede provocar daños en el tejido y autoinmunidad.
Existen varios métodos adecuados para determinar la existencia de activación de células T específicas de antígeno, que incluyen ELISpot, Fluorospot, tinción intracelular de citoquina con citometría de flujo, FASCIA, ensayos de proliferación (p. ej. incorporación de timidina, tinción CFSE o BrdU), detección TCR específico con tetrámeros MHC-I o II y análisis ELISA o Luminex de citoquinas secretadas.
Con la técnica de ELISpot, se detecta directamente la liberación de una citoquina específica por parte de células en respuesta a un estímulo. Las células se siembran en una membrana y se mide el número de células secretoras de citoquina. Dependiendo de qué citoquina se está midiendo, pueden medirse diferentes variables, tales como activación de macrófagos o células T. El FluoroSpot se basa en la técnica ELISpot y permite lecturas simultáneas de varias citoquinas secretadas diferentes. Esto permite una estimación más exacta y matizada de la activación celular. Ambos métodos ofrecen una forma rápida y fácil de medir la activación de células T.
En los últimos años, grandes colecciones de proteínas expresadas de manera recombinante, es decir, proteínas creadas con técnicas de clonación y sistemas de expresión bacterianos o de mamíferos, se han producido mediante esfuerzos a gran escala, tales como el Human Atlas Project. Los inventores han llegado a la conclusión de que sería de interés científico y práctico significativo seleccionar dichas recolecciones de polipéptidos para buscar antígenos que son específicamente activadores de células T. Por ejemplo, resultaría interesante seleccionar muestras de células T de pacientes afectados, p. ej., por una enfermedad autoinmune, una enfermedad neoplásica, una alergia o una enfermedad infecciosa con respecto a una genoteca de polipéptidos, para determinar a qué epítopos reaccionan las células T del paciente.
En términos generales, los métodos actuales se centran en determinar contra qué epítopos está produciendo anticuerpos el sistema inmunitario del paciente (es decir, la respuesta humoral), no siendo capaces de suministrar información relevante sobre la mayor parte del sistema inmunitario adaptativo, la inmunidad mediada por células T. Por lo tanto, ser capaz de determinar a gran escala los antígenos que resultan en la activación de células T en un paciente o un grupo de pacientes podría permitir descubrir un nuevo conjunto de biomarcadores novedosos para las enfermedades, permitir obtener un mejor diagnóstico, ayudar a controlar la evolución de la enfermedad en un paciente, ayudar a identificar los objetivos terapéuticos, etc.
Por motivos prácticos, las grandes colecciones de polipéptidos que existen actualmente están formadas por proteínas expresadas de E. coli y, por lo tanto, contienen cantidades sustanciales de endotoxinas derivadas de la membrana externa de la célula huésped. Debido a la contaminación ambiental, incluso las colecciones de polipéptidos preparadas en huéspedes eucariotas o preparadas por síntesis de péptidos no biológicos contienen niveles prácticamente significativos de endotoxina. En la preparación de grandes colecciones, es poco práctico establecer un proceso que elimine las endotoxinas a niveles por debajo de la detección, puesto que las endotoxinas tienden a unirse a las proteínas y a menudo son difíciles de eliminar una vez que contaminan una muestra de polipéptido. La patente US-6218132 da a conocer un ensayo altamente sensible para la detección de células T reactivas a un antígeno mediante la detección de un factor soluble cuya secreción es inducida por la estimulación de la célula T por parte del antígeno. El ensayo incluye una proliferación activada por antígenos de células T específicas antes de una reestimulación con antigen presenting cells (células presentadoras de antígeno - APC) y antígeno irradiados.
En realizaciones ilustrativas, el ensayo se usa para mejorar los límites de detección de las peripherial blood mononuclear cell (células mononucleares de sangre periférica - PBMC) humanas que secretan interferón -gamma (IFN - gamma) e interleucina-2 (IL-2). El ensayo se puede realizar en PBMC previamente congeladas, permitiendo obtener una mayor comodidad en el procesamiento de muestras, el uso múltiple de una sola muestra como un estándar interno y el análisis simultáneo de las muestras recogidas en diferentes instantes.
Desafortunadamente, un problema común con los ensayos para determinar la activación de células T es que incluso niveles bajos de endotoxinas que entran en contacto con las células T provocan una activación que enmascara el nivel normalmente muy bajo de activación específica de antígeno. Únicamente una pequeña fracción de la población de células T del ensayo reacciona de una manera específica de antígeno a un antígeno determinado (en el orden de 1/10000 en la sangre de un sujeto que se ha encontrado recientemente con el antígeno), mientras que una gran parte de las células responderá a endotoxinas, creando un alto nivel de fondo.
Dado que la contaminación de endotoxinas es omnipresente, no es factible llevar a cabo la selección descrita anteriormente con las colecciones de polipéptidos actuales.
Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad en la técnica de métodos para ensayar la activación de células T específicas de antígeno capaces de tolerar la contaminación de endotoxinas en la preparación de antígeno candidato, permitiendo la selección de grandes colecciones de polipéptidos. Un objetivo de la presente invención es dar a conocer métodos y medios mejorados para ensayar la activación de células T específicas de antígeno.
Definiciones
Las endotoxinas, p. ej., lipopolisacárido (LPS), comprenden subunidades de lípido y polisacárido asociadas de forma covalente presentes en la pared celular exterior de bacterias gramnegativas, tales como Escherichia coli.
Células T CD4 o células T auxiliares son células que orquestan respuestas inmunitarias a través de la secreción de citoquinas. Las mismas pueden suprimir o potenciar otras células inmunitarias, tal como estimular la conmutación de clase de anticuerpo de células B, la expansión de células T citotóxicas o la potenciación de fagocitos. Las mismas se activan mediante presentación de antígenos a través de MHC clase II en APC y expresan un T-cell receptor (receptor de célula T - TCR) específico para un tramo de aproximadamente 15 aminoácidos (un epítopo denominado de célula T) dentro de un antígeno particular.
Células T CD8+ o células T citotóxicas son células T que matan células tumorales, células infectadas u otras células dañadas. A diferencia de las células CD4+ T, las mismas no necesitan APC para la activación. Su receptor de célula T reconoce los péptidos derivados de antígeno (aproximadamente 9-11 aminoácidos de longitud) presentados por MHC clase I, una proteína expresada en todas las células nucleadas.
Activación de células T específicas de antígeno es un proceso que requiere una interacción entre el TCR y un péptido definido presentado en una molécula MHC (HLA) en combinación con coestimulación.
Etiqueta de Firma de Epítopo de Proteína - (PrEST): Los péptidos producidos de manera recombinante, que son fragmentos de proteínas de un huésped (tal como un ser humano), representan secuencias de péptido únicas de la proteína de la que derivan. (Ver Lindskog M, Rockberg J, Uhlen M, Sterky F. Selection of protein epitopes for antibody production. Biotechniques. 2005;38(5):723-7)
Células presentadoras de antígeno (APC) son de forma típica células dendríticas (DC), células B o macrófagos, células que fagocitan o internalizan organismos o proteínas extra celulares, es decir, antígenos, y tras el proceso presentan péptidos derivados de antígeno en MHC clase II a células T CD4+. En la sangre, los monocitos son las células presentadoras de antígeno más abundantes.
Una partícula fagocitable se define como una partícula que puede ser fagocitada por células del sistema inmunitario, en particular, monocitos.
Células mononucleares de sangre periférica, PBMC, son una fracción de sangre humana preparada mediante centrifugación en gradiente de densidad de sangre entera. La fracción de PBMC consiste principalmente en linfocitos (70-90 %) y monocitos (10-30 %), habiéndose eliminado glóbulos rojos, granulocitos y plasma.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Comparación de diferentes lavados para eliminación de endotoxinas. Se evaluó la actividad de monocitos en respuesta a bolitas acopladas a proteína sometidas a diferentes lavados, comparando la eficacia de los distintos lavados de desnaturalización con bolitas no lavadas. Es deseable una activación inferior. Valor P determinado usando ANOVA de una vía. Grapas indican SD.
Figura 2. Medición de activación de células T con un ensayo de proliferación de células. Ensayo de incorporación de timidina mediante el uso de esplenocitos de ratones sensibilizados con ovoalbúmina. Comparación de bolitas acopladas a ovoalbúmina, bolitas acopladas a albúmina de suero bovino y medio. Valor p determinado con prueba T de Student e indicado cuando se encontró p<0,05. Grapas indican SD.
Figura 3. Ensayo IFNy/IL-22/IL-17 Fluorospot comparando la activación de células T en pacientes de esclerosis múltiple (MS) y sujetos de control sanos con estimulación con un autoantígeno sospechoso en MS. Valores P determinados con ensayo Mann-Whitney-U y escritos al encontrarlos. Grapas indican CI95 % de media.
Figura 4. Selección de autoantígenos en pacientes con esclerosis múltiple con respecto a una genoteca de 125 proteínas. Comparación de la activación de células T de PBMC de pacientes de MS con la de PBMC de sujetos de control sanos. Panel A, determinación de activación mediante IL22-FluoroSpot. Panel B, determinación de activación mediante IL-17-FluoroSpot. Panel C, determinación de activación mediante IFNy FluoroSpot. Las células T del paciente reaccionan significativamente más a ciertas proteínas en la genoteca. Los cuadrados abiertos y los círculos llenos indican activación media en PBMC de pacientes y sujetos de control, respectivamente, las grapas indican CI95 % de media. Valor P determinado usando ANOVA de dos vías. Los asteriscos indican valor P.
Figura 5. Efecto del tamaño de las bolitas en la activación de células T. Ensayo de proliferación (con incorporación de timidina) con esplenocitos de ratones sensibilizados con ovoalbúmina. Comparación de ovoalbúmina acoplada a bolitas de diferente tamaño con un diámetro de 5,6 pm, 1 pm y 0,2 pm. Valores P determinados usando ensayo T estudiantes y escritos indicados cuando se encontró p<0,05. Grapas indican SD.
Sumario de la invención
El objeto de la invención se define en la reivindicación 1. Los detalles de la invención se definen en las reivindicaciones 2-15.
Descripción detallada
La presente invención da a conocer métodos y medios para ensayar la activación de células T específicas de antígeno, tal como se describe con mayor detalle más adelante. Al resolver el problema asociado al uso de polipéptidos contaminados con endotoxina en un ensayo para la activación de células T específicas de antígeno, los métodos y medios permiten y facilitan la selección a gran escala de colecciones de polipéptidos nuevas y existentes para el descubrimiento de biomarcadores, el diagnóstico, la monitorización de la evolución de la enfermedad en pacientes, la identificación de objetivos terapéuticos, etc.
Métodos para ensayar la activación de células T específicas de antígeno
En un primer aspecto, la presente invención da a conocer un método in vitro para ensayar la activación de células T específicas de antígeno, que comprende las etapas de:
a. Disponer una partícula fagocitable, que tiene un polipéptido antígeno candidato asociado íntimamente a la misma, en donde la partícula con el polipéptido asociado se ha sometido a un lavado de desnaturalización que resulta en un nivel de endotoxina suficientemente bajo para no interferir con cualquiera de las etapas posteriores (b-f) del método;
b. Disponer una antigen presenting cell (célula presentadora de antígeno - APC) viable;
c. Poner en contacto la partícula lavada con la célula presentadora de antígeno in vitro en condiciones que permiten la fagocitosis de la partícula por la célula presentadora de antígeno;
d. Disponer una muestra de células T a ensayar que comprende células T viables;
e. Poner en contacto la muestra de células T con la célula presentadora de antígeno que ha contactado con la partícula in vitro en condiciones que permiten la activación específica de células T en respuesta a un antígeno presentado por una célula presentadora de antígeno; y
f. Determinar el grado de activación de células T en la muestra de células T.
El método también puede comprender las etapas de (a') asociar íntimamente un polipéptido candidato a una partícula fagocitable y/o (a'') someter un antígeno candidato asociado a una partícula a un lavado de desnaturalización. Por lo tanto, el método del primer aspecto puede comprender las etapas de:
a. Disponer una partícula fagocitable;
b. Asociar íntimamente un polipéptido antígeno candidato a la partícula;
c. Someter la partícula con el polipéptido asociado a un lavado de desnaturalización que resulta en un nivel de endotoxina suficientemente bajo para no interferir con cualquiera de las etapas posteriores (d-h) del método;
d. Disponer una célula presentadora de antígeno viable;
e. Poner en contacto la partícula lavada con la célula presentadora de antígeno in vitro en condiciones que permiten la fagocitosis de la partícula por la célula presentadora de antígeno;
f. Disponer una muestra de células T a ensayar que comprende células T viables;
g. Poner en contacto la muestra de células T con la célula presentadora de antígeno que ha contactado con la partícula in vitro en condiciones que permiten la activación específica de células T en respuesta a un antígeno presentado por una célula presentadora de antígeno; y
h. Determinar el grado de activación de células T en la muestra de células T.
La partícula lavada, la célula presentadora de antígeno y la muestra de células T pueden ponerse en contacto simultáneamente, en el mismo recipiente. Para las condiciones que permiten la activación específica de antígeno de las células, las condiciones en la etapa de poner en contacto la muestra de células T con la célula presentadora de antígeno en contacto con la partícula deben ser tales que el fondo de la activación de células T no específicas de antígeno sea suficientemente bajo para no interferir con el ensayo.
Polipéptido antígeno candidato
El polipéptido antígeno candidato comprende preferiblemente, al menos 50 aminoácidos, aún más preferiblemente, al menos 75 aminoácidos, con máxima preferencia, al menos 100 aminoácidos. El polipéptido antígeno candidato puede tener forma de una Protein Epitope Signature Tag (etiqueta de firma de epítopo de proteína - PrEST). Ya existen grandes genotecas de proteínas de PrEST, por ejemplo, la genoteca creada dentro de1Human Atlas Project (Uhlen M, Fagerberg L, Hallstrom BM, Lindskog C, Oksvold P, Mardinoglu A, y col. Proteomics. Tissue-based map of the human proteome. Science. 2015;347(6220):1260419). Las PrEST contienen secuencias de aminoácidos únicas para la correspondiente proteína de longitud total, y se han utilizado en el proyecto a gran escala Human Atlas Project para generar anticuerpos para la mayor parte de proteínas humanas. El uso de varias PrEST para la misma proteína humana aumenta la posibilidad de encontrar epítopos de célula T relevantes. El hecho de que los polipéptidos de antígeno sean más grandes que los fragmentos presentados por APC también asegura que se presentará una amplia variedad de epítopos de cada antígeno, ya que la degradación del antígeno por las APC no es un proceso uniforme. En otras palabras, el uso de antígenos polipéptidos de ciertos tamaños es posible utilizando la ruta fagocítica de las APC y permite la detección mejorada de antígenos con el uso de menos polipéptidos antígenos, a diferencia de presentar los antígenos en péptidos cortos que son capaces de unirse a receptores MCH directamente sin procesamiento celular.
El polipéptido antígeno candidato se puede derivar de un antígeno conocido o sospechoso de estar asociado a una enfermedad. Por ejemplo, el polipéptido antígeno candidato se deriva de un polipéptido que es:
a. conocido por estar considerablemente expresado en un tejido o célula afectado por una enfermedad autoinmune; Ejemplos son proinsulina, proteínas asociadas a mielina.
b. conocido por estar asociado a una enfermedad neoplásica; Ejemplos son receptor de estrógeno, receptor de factor de crecimiento epidérmico, quinasa 1 dependiente de ciclina.
c. conocido por estar asociado a una enfermedad autoinmune; Ejemplos: Proteína mielina oligodendrocito, proteína básica de mielina, transaldolasa.
d. conocido por estar asociado a una enfermedad infecciosa; Ejemplos: Antígeno de cápside vírica, enterotoxinas bacterianas.
e. conocido por estar asociado a alergia o hipersensibilidad similar; Ejemplos: Can f1, Equ c1, Fel d1.
f. un antígeno tumoral conocido; un neoantígeno formado por mutaciones comunes p. ej., en p53, ERBB2 (Erb-B2 Receptor de tirosina quinasa 2), PIK3CA (fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato 3-quinasa)
g. una proteína modificada conocida, tal como proteína citrulinada, variante o fosforilada.
La muestra de células T y el polipéptido antígeno candidato se derivan de la misma especie o de una especie diferente. Por ejemplo, para estudiar autoinmunidad o enfermedad neoplásica, la muestra de células T y el polipéptido antígeno candidato son preferiblemente derivados de la misma especie. Para estudiar una enfermedad infecciosa, la muestra de células T proviene del huésped, mientras que el polipéptido antígeno candidato se deriva de un patógeno de interés. Para estudiar una alergia o hipersensibilidad similar, la muestra de células T es del sujeto de interés, mientras que el polipéptido antígeno candidato se deriva de una especie diferente conocida o sospechosa de provocar una reacción alérgica u otra reacción hipersensible en el sujeto. La muestra de células T puede ser de un ser humano y la secuencia de polipéptido antígeno candidato puede derivarse de un ser humano.
Propiedades de partícula
La partícula es fagocitable mediante la célula presentadora de antígeno (APC; descrita más adelante). Las APC pueden fagocitar partículas de numerosos materiales y formas diferentes. En cambio, el tamaño de las partículas es limitativo para la fagocitosis. Un tamaño demasiado pequeño hará que las células no se activen para fagocitar la partícula. Un tamaño demasiado grande hará que la célula no sea capaz de fagocitar la partícula, ya que la misma no cabrá en la célula.
Las partículas pueden tener una dimensión máxima inferior a 5,6 pm, preferiblemente, inferior a 4 pm, más preferiblemente, inferior a 3 pm, aún más preferiblemente, en el intervalo de 0,5-2 pm o, con máxima preferencia, de aproximadamente 1 pm. Las partículas pueden ser sustancialmente esféricas, en cuyo caso las dimensiones se refieren al diámetro.
Un tamaño similar al de las bacterias facilita una completa fagocitosis por las APC. Esto sirve para asegurar que el antígeno es degradado por las APC y se presenta posteriormente a las células T a través de MHCII. El tamaño óptimo depende del tipo de APC específico y puede determinarse mediante experimentación rutinaria (ver Ejemplo 5, Figura 5) La partícula puede tener propiedades paramagnéticas, lo que facilita el lavado de desnaturalización descrito más adelante, permitiendo que las partículas se recolecten y/o mantengan en su posición mediante un imán. Sin embargo, también es posible realizar los lavados por otros medios, tales como mantener las partículas en una columna, o sedimentar las partículas por gravedad o mediante centrifugación.
Asociación del polipéptido antígeno y la partícula
El polipéptido antígeno se asocia a la partícula de una manera que permite realizar un lavado de desnaturalización como se describe más adelante sin disociar el antígeno de la partícula.
Una manera posible de asociar el polipéptido a la partícula se muestra en el Ejemplo 1. Sin embargo, la forma precisa de asociación no es crítica para los métodos de la invención. Preferiblemente, el polipéptido antígeno candidato se une de forma covalente a la partícula.
Alternativamente, el polipéptido antígeno candidato se puede asociar a las partículas mediante un quelato de metal. Por ejemplo, las partículas asociadas a un ligando quelante de metal, tal como ácido iminodiacético, pueden unirse a iones de metal tales como Cu2+, Zn2+, Ca2+, Co2+ o Fe3+. Estos quelatos de metal pueden unirse a su vez a proteínas y péptidos que contienen por ejemplo histidina o cisteína con una gran resistencia. Así, las partículas con quelatos de metal pueden adsorber de forma no covalente péptidos/proteínas, de una manera que permite que un lavado riguroso reduzca la cantidad de LPS y otros componentes contaminantes en los péptidos/proteínas unidos.
Lavado de desnaturalización
El lavado de desnaturalización se lleva a cabo para reducir el nivel de endotoxinas en el polipéptido antígeno candidato hasta un nivel que no interfiere con la etapa posterior de determinación del grado de activación de células T específicas de antígeno.
Dado que las endotoxinas se asocian íntimamente a los polipéptidos, realizar un lavado de desnaturalización que, por definición, altera al menos transitoriamente la estructura secundaria y terciaria resulta altamente ventajoso y, en muchos casos, es esencial para disociar la endotoxina del polipéptido. En la presente solicitud, incluso cantidades muy bajas de endotoxina provocan interferencias.
Las células presentadoras de antígeno degradarán después de la captación el polipéptido de antígeno en fragmentos pequeños, siendo posible por lo tanto tolerar una desnaturalización transitoria e irreversible (alteración de la estructura 3D). La asociación a las partículas descritas en la presente invención permite la manipulación de proteínas desnaturalizadas que, de otro modo, pueden volverse insolubles o agregados.
Tal como se muestra en el Ejemplo 2 y la Figura 1, la manera particular de lavado de desnaturalización no es crítica en el contexto de la presente invención. Por ejemplo, el lavado de desnaturalización puede implicar someter el polipéptido asociado a un pH elevado, a un pH bajo, a una temperatura elevada, a un agente de desnaturalización o a una combinación de los mismos. Preferiblemente, el lavado de desnaturalización implica someter el polipéptido asociado a un pH elevado o a un agente de desnaturalización tal como urea 8M o HCl-guanidina 6M. Con máxima preferencia, el lavado de desnaturalización implica someter el polipéptido asociado a un pH alto de al menos 13,0, más preferiblemente, al menos 14,0, con máxima preferencia, al menos 14,3. La desnaturalización puede implicar someter el polipéptido asociado a un lavado con un álcali fuerte 1-5M, preferentemente, 1-3M, con mayor preferencia, 1,5-2,5m , con máxima preferencia, 2M, tal como NaOH o KOH, preferiblemente NaOH.
El lavado de desnaturalización puede implicar someter la partícula con el polipéptido asociado a una temperatura elevada, tal como al menos 90 °C, más preferiblemente, al menos 920C, con máxima preferencia, al menos 95 °C. El lavado de desnaturalización puede implicar someter la partícula con el polipéptido asociado a un agente de desnaturalización, tal como urea o clorhidrato de guanidina en una concentración suficiente, tal como al menos 5M, 6M, 7M o 8M.
Una ventaja particular con un lavado de desnaturalización es que las condiciones pueden seleccionarse de manera que la preparación con las partículas y los polipéptidos asociados se esterilice. Si la preparación se contamina con microorganismos viables, es probable que las etapas posteriores en el cultivo celular queden comprometidas. En particular, el lavado con pH elevado (p. ej., pH>14) puede esterilizar de forma conveniente, simultánea y rápida la preparación y lograr un lavado de desnaturalización eficaz para eliminar las endotoxinas.
De forma ventajosa, el lavado de desnaturalización es tal que degrada o inactiva las endotoxinas, además de retirarlas. El lavado con pH elevado (p. ej., pH>14) tiene un efecto de inactivación en las endotoxinas.
El lavado puede comprender un solo lavado o varios lavados repetidos, tal como 2, 3, 4 o 5 lavados.
El lavado de desnaturalización debe resultar en un nivel de endotoxinas en el polipéptido antígeno candidato que es compatible con un método para ensayar la activación de células T específicas de antígeno que se describe en la presente descripción, de manera que la endotoxina no provoque una interferencia demasiado alta para detectar de forma adecuada la activación de células T específicas de antígeno. El nivel de endotoxinas remanentes se puede ensayar convenientemente usando un ensayo de activación de monocitos (IL-1 p/IL-6 FluoroSpot) como se describe en la presente descripción en el ejemplo 2. El nivel tolerable de endotoxinas depende de las circunstancias y, en particular, la concentración de antígenos. Sin embargo, la cantidad de endotoxinas en el antígeno es preferiblemente tal que, en el ensayo de activación de células T, la concentración final de endotoxinas es inferior a 100 pg/ml (es decir, 0-100 pg/ml), preferiblemente, inferior a 50 pg/ml, más preferiblemente, inferior a 25 pg/ml, y con máxima preferencia, inferior a 10 pg/ml. Se conocen métodos para medir endotoxinas en una muestra, por ejemplo, el ensayo lAl .
Célula presentadora de antígeno (APC) y la muestra de células T
En el contexto de la presente invención, la APC es una célula presentadora de antígeno profesional, tal como un monocito/macrófago o una célula dendrítica. La APC puede ser una célula primaria o una célula inmortal.
Las APC deben ser compatibles con las células T de la muestra de células T, de modo que sean capaces de presentar antígenos a las células T en un contexto específico de antígeno (restricción MHC) haciendo posible la reacción de las células T. Las APC y la muestra de células T se obtienen preferiblemente de la misma especie y se hacen corresponder con respecto a un donante con respecto a los receptores MHC. Sin embargo, también se contempla el uso de APC modificadas genéticamente de especies diferentes.
Si la célula presentadora de antígeno y la muestra de células T se derivan del mismo individuo, se evita cualquier falta de correspondencia potencial entre las APC y las células T.
La célula presentadora de antígeno y la muestra de células T pueden derivarse de la misma muestra de sangre, lo que resulta ventajoso desde un punto de vista práctico. La célula presentadora de antígeno y la muestra de células T pueden derivarse de una muestra de PBMC de la misma persona. Obtener PBMC de muestras de sangre periférica es un protocolo rutinario, que permite obtener una fuente conveniente de células APC y T al mismo tiempo y del mismo individuo.
La muestra de PBMC puede ser utilizada fresca o ser sometida a congelación. La posibilidad de usar células congeladas resulta una gran ventaja práctica desde un punto de vista logístico.
La muestra de células T puede derivarse de un tumor, preferiblemente, un vaso linfático en un tumor.
La muestra de células T también puede derivarse de ascitis.
La muestra de células T puede comprender células T CD4+ y/o CD8+. La muestra de células T puede comprender PBMC enteras que incluyen células T CD4+ y CD8+, poblaciones de células T purificadas o PBMC de donde se ha retirado una población o poblaciones de células T particulares.
Determinación del grado de activación de células T
El método puede también comprender la etapa de comparar el grado de activación de células T con una referencia pertinente, en donde un mayor grado de activación de células T en la muestra en comparación con la referencia conduce a la conclusión de que el antígeno candidato resulta en la activación de células T específicas de antígeno en la muestra. La referencia es fundamental para definir “activación” , de manera que el grado de activación se define preferiblemente en comparación con muestras de referencia. Las muestras de referencia pueden ser, por ejemplo, muestras de individuos sanos normales al analizar muestras de pacientes, muestras de tejido normal al analizar un tumor o muestras de nódulo linfático de drenaje de tumor o muestras de antes de un tratamiento al seguir los efectos del tratamiento. Las muestras de referencia se utilizan para establecer el umbral de conclusión de diagnóstico/pronóstico, y determinar un positivo específico de antígeno, es decir, activación, o negativo, es decir, regulación a la baja.
Determinar el grado de activación de células T en la muestra de células T puede implicar la determinación de la fracción de células T activadas en la muestra, es decir, el número de células T activadas en relación con el número total de células T en la muestra. La fracción de células activadas en relación con la fracción de células activadas en la muestra de referencia proporcionará una medida de la magnitud de la activación de células T con respecto a antígenos específicos. Preferiblemente, en cada análisis, se determina el nivel de activación espontánea (“ nivel de activación de fondo” ) en muestras individuales en muestras incubadas sin antígeno, es decir, un control negativo. La activación de fondo se puede compensar en el análisis; en otras palabras, es posible calcular fracciones de activación en valores netos en donde la fracción de activación con respecto al control negativo se sustrae.
Tal como se muestra en el Ejemplo 3, determinar el grado de activación de células T en la muestra de células T puede realizarse utilizando una técnica ELISpot/FluoroSpot o un ensayo de proliferación (es decir, incorporación de timidina). Sin embargo, también se conocen otros ensayos y técnicas adecuados para tal efecto y también pueden usarse. Determinar el grado de activación de células T en la muestra de células T puede comprender determinar la fracción de células T que entran en contacto con la célula presentadora de antígeno que responden mediante la secreción de interferón gamma (IFN-y), interleucina 17 (IL-17), interleucina 22 (IL-22) o una combinación de los mismos, p. ej., mediante un ensayo ELISpot o FluoroSpot. Pueden usarse otros analitos relevantes (combinación o combinaciones de citoquinas) para analizar enfermedades o afecciones específicas. Por ejemplo, cuando se analizan pacientes alérgicos, es posible analizar citoquinas Th2 en vez de citoquinas Th1/Th17. Las citoquinas T-reg pueden ser de interés en el caso de cáncer, alergia y cuando se usan tratamientos de vacuna. Por lo tanto, la técnica FluoroSpot permite el análisis de perfiles de activación relevantes con respecto a diferentes péptidos antígenos candidatos en diversas condiciones. Esto añade información, p. ej., sobre heterogeneidad entre pacientes, severidad y evolución de la enfermedad.
Tal como puede observarse en el Ejemplo 3, la determinación de la secreción de IL-17 y/o IL-22 es sorprendentemente mejor que en el caso de IFN-y para la diferenciación de pacientes de MS con respecto a sujetos de control. Así, determinar el grado de activación de células T en la muestra de células T comprende preferiblemente determinar la fracción de células T en contacto con la célula presentadora de antígeno que responden mediante la secreción de IL-17 y/o IL-22, y el método sirve para diagnosticar esclerosis múltiple o seguir la evolución de la esclerosis múltiple. En otras palabras, una muestra de células T derivada de un sujeto que tiene MS o sospechoso de tener MS se analiza preferiblemente para la secreción de IL-17 y/o IL-22 en respuesta a antígenos candidatos.
Análisis múltiplex
Tal como se muestra en el Ejemplo 4, se pueden analizar varios antígenos candidatos con respecto a la misma muestra de células T. Preferiblemente, al menos 10 antígenos candidatos se ensayan con respecto a la misma muestra de células T. Con el método de la invención, las muestras adicionales no aumentan necesariamente en mucho el trabajo de laboratorio. Aquí se encuentra una fortaleza del método de la invención, por el hecho de que es fácil seleccionar un gran número de antígenos sin mucho esfuerzo. Una ventaja de esto es que, por ejemplo, poder realizar una gran selección de posibles autoantígenos aumenta la posibilidad de encontrar autoantígenos verdaderos.
Diagnosticar auto reactividad
El método del primer aspecto puede ser un método para diagnosticar auto reactividad en un sujeto de ensayo, que comprende las etapas de:
a. Disponer una partícula fagocitable, que tiene un autoantígeno de péptido candidato asociado íntimamente a la misma, en donde la partícula con el polipéptido asociado se ha sometido a un lavado de desnaturalización que resulta en un nivel de endotoxina suficientemente bajo para no interferir con las etapas posteriores;
b. Disponer una muestra de peripherial blood mononuclear cell (células mononucleares de sangre periférica -PBMC) del sujeto de ensayo que comprende células T viables y células presentadoras de antígeno viables; c. Poner en contacto la muestra de PBMC con la partícula in vitro en condiciones que permiten la fagocitosis de la partícula mediante una célula presentadora de antígeno y que permiten la activación específica de células T en respuesta a un antígeno presentado por una célula presentadora de antígeno; d. Cuantificar la fracción de células T activadas en la muestra de PBMC con la que se ha contactado; y e. Comparar la fracción cuantificada con una fracción cuantificada de forma comparable de un sujeto sano, de modo que una fracción más grande de células T activadas en el sujeto de ensayo es indicativa de auto reactividad contra el autoantígeno candidato en el sujeto de ensayo.
Tal como se muestra en el Ejemplo 4, la presente invención da a conocer una herramienta potente para seleccionar rápidamente una gran variedad de autoantígenos al mismo tiempo, y no se limita a MS. Es posible diseñar fácilmente una genoteca de proteínas candidatas que es posible seleccionar dependiendo de la enfermedad y los pacientes. El método puede usarse para otras enfermedades inflamatorias además de las enfermedades autoinmunes, siempre y cuando las células T específicas de antígeno sean una característica de la enfermedad y la genoteca de antígenos se adapte a la enfermedad en cuestión.
El término “que comprende” se interpretará como que incluye, aunque no de forma limitativa. La configuración de la presente descripción en secciones con los encabezados y los subtítulos sirve simplemente para mejorar la legibilidad y no debe interpretarse como limitativa en ningún modo, en particular, la división no requiere de ninguna manera excluir o limitar las características de combinación en los diferentes encabezados y subtítulos entre sí. Ejemplos
Ejemplo 1: Polipéptido de acoplamiento a bolitas
Polipéptidos acoplados de forma covalente a bolitas que contienen grupos de ácido carboxílico libres. En este ejemplo se usaron Dynabeads® MyOne™ Carboxylic Acid (ThermoFischer Scientific) (esferas de 1 gm de diámetro). Se usó un ensayo de proteína de ácido bicinconínico, BCA, para medir la concentración proteica antes y después del acoplamiento para asegurar un acoplamiento exitoso. Se ensayaron varios polipéptidos y se acoplaron un promedio de 48,7 gg (media: 48,7, SD: 20,5, N=10) por 1 mg de bolitas. Según las instrucciones del fabricante, es posible acoplar 50 gg de polipéptido por 1 mg de bolitas, lo que indica que la eficacia del acoplamiento realizado en este ejemplo fue elevada.
Ejemplo 2: Eliminación de endotoxinas mediante lavados de desnaturalización
Para ensayar la eliminación de endotoxinas con diferentes tipos de lavados de desnaturalización, se ensayaron cuatro condiciones de lavado de desnaturalización diferentes: (a) pH elevado (2M NaOH pH 14,3), (b) Calor (95 0C) y agentes de desnaturalización ((c) urea 8M y (d) clorhidrato de guanidina 6M). El nivel de endotoxinas remanentes se ensayó con el uso de un ensayo de activación de monocitos (IL-1 p/IL-6 FluoroSpot) ya que la actividad de monocitos aumenta considerablemente por la endotoxina y, de este modo, la activación de monocitos se puede usar para controlar LPS remanentes.
Todos los tipos de lavados de desnaturalización ensayados consiguieron disminuir significativamente la cantidad de activación de monocitos en comparación con las bolitas sin lavar (ver la Figura 1) (P<0,0001 para todos los lavados). Los lavados de desnaturalización fueron tan eficaces que las bolitas lavadas estimularon las células hasta un grado comparable con el del control negativo. El lavado con NaOH 2M resultó en la cantidad más baja de endotoxina, seguido de cerca por urea 8M.
Ejemplo 3: Ensayos de activación de células T
FluoroSpot
El ensayo FluoroSpot se realizó con muestras de 16 pacientes con esclerosis múltiple y 9 sujetos de control sanos. Se incubaron PBMC de pacientes y sujetos de control junto con un autoantígeno sospechoso en la placa FluoroSpot. Tal como se observa en la Figura 3, varios de los pacientes de MS presentaron un número significativamente mayor de células activadas (panel a). Los pacientes de MS presentaron un número medio de 37,4 (95 %CI 13,0-52,9) de células activadas que secretan IL-22, mientras que los sujetos de control sanos presentaron un número medio de 3,3 (95 %CI 0,97-5,6) de células activadas. Valor P de diferencia = 0,0062. Para las células activadas que secretan IL-17, el número fue de 14,7 (CI95 % 5,3-24,1) en pacientes en comparación con 0,28 (CI95 % -1,4-2,0), P valor de diferencia <0,0007 (panel b). No obstante, para las células que secretan IFNy , la diferencia no fue muy significativa, con un número medio de 80,0 (CI95 % 22,3-138) para pacientes, en comparación con 33 (CI95 % 7,1-59,0) P=0,495 para sujetos de control (panel c). Significación calculada usando ensayo Mann Whitney-U.
Estos resultados muestran que la activación de células T con el antígeno acoplado a las bolitas se puede medir con el ensayo FluoroSpot, y se pueden realizar comparaciones entre pacientes y sujetos de control sanos. Sorprendentemente, el marcador clásico para la activación de células T, IFNy , mostró la diferencia más pequeña en la comparación entre pacientes y sujetos de control. Sin embargo, tanto IL-17 como IL-22 fueron significativamente diferentes entre pacientes y sujetos de control, lo que indica que podrían ser citoquinas más adecuadas para analizar al buscar autoantígenos en MS.
Ensayo de proliferación
Ensayo de proliferación con incorporación de timidina. Esplenocitos de ratones inmunizados con ovoalbúmina (OVA) se incubaron con bolitas acopladas a OVA o BSA para medir la proliferación específica de antígeno. La proliferación de las células incubadas con bolitas se expresó como índice de estimulación (SI). (Tal como se observa en la Figura 2, las células incubadas con bolitas-OVA tuvieron un aumento en la proliferación con un SI de 2,69 (95 %CI 1,6 - 3,78, P<0,005). Las células incubadas con BSA no tuvieron un aumento en la proliferación, con un SI de 0,9 (95 %CI 0,7-1,1, P=0,37).
Estos resultados muestran que la activación de células inmunitarias (esplenocitos en este ejemplo) con antígeno acoplado a bolitas se puede medir mediante un ensayo de proliferación. También muestra que la proliferación observada es específica de antígeno, ya que las bolitas acopladas a OVA estimularon la proliferación, pero las bolitas acopladas a BSA no permitieron en absoluto inducir la proliferación. El experimento muestra que el antígeno acoplado a las bolitas se puede usar para estimulación in vitro de la proliferación de células T específicas de antígeno. La incorporación de timidina es sólo un método para medir la proliferación, por lo que también se pueden aplicar otros métodos para medir la proliferación, p. ej., ensayos de dilución de CFSA e incorporación de BrdU.
Ejemplo 4: Selección de autoantígenos en MS con respecto a una genoteca de 125 proteínas
Identificación de autoantígenos en esclerosis múltiple; Medición de la activación de células T con respecto a un gran número de PrEST acopladas a bolitas, mediante el uso de IFNy /IL-22/IL-17A FluoroSpot como ensayo para la activación de células T. Una selección de este tipo identifica posibles autoantígenos mediante la detección de los antígenos que estimulan una mayor respuesta de células T en PBMC de pacientes con MS en comparación con sujetos de control sanos, y ayuda a decidir qué antígeno se analizará adicionalmente.
Tal como puede observarse en la Figura 4, en esta selección de 16 de pacientes y 9 sujetos de control sanos, se pudo observar una diferencia estadísticamente significativa entre el número de células activadas de un paciente medio y un sujeto de control medio al analizarse usando ANOVA de dos vías. Para células T activadas que secretan IL-22 se observó una diferencia en 5 antígenos, antígeno #6 (P<0,0001), antígeno #18 (P<0,0001), antígeno #23 (P<0,0001), antígeno #29 (P<0,0001) y antígeno #33 (p<0,05) (panel a). Para células T que secretan IL-17 se pudo observar una diferencia entre pacientes y sujetos de control en los mismos 5 antígenos, antígeno #6 (p<0,05), antígeno #18 (P<0,0001), antígeno #23 (P<0,01), antígeno #29 (P<0,0001) y antígeno #33 (p<0,05) (panel b). En el caso de IFNy , solamente pudo observarse una diferencia en el antígeno #18 (P<0,0001) (panel c).
Estos resultados muestran que un método de la presente invención se puede usar como una selección de autoantígenos, una herramienta para identificar posibles nuevos autoantígenos en MS.
Ejemplo 5: Identificación de tamaño de bolitas adecuado para bolitas fagocitables
Se usó un ensayo de proliferación con la incorporación de timidina para ensayar el efecto del tamaño de las bolitas en la activación de células T específicas de antígeno. Esplenocitos de ratones inmunizados con ovoalbúmina (OVA) se estimularon con bolitas acopladas a OVA de diferentes tamaños para medir la proliferación específica de antígeno. Tal como se observa en la Figura 5, las células incubadas con bolitas-OVA con un diámetro de 0,2 pm tuvieron un aumento en la proliferación con un SI medio de 4,1 (95 %CI 2,4 -5,8, P= 0,007). Las células incubadas con bolitas-OVA con un diámetro de 1 pm tuvieron un aumento en la proliferación con un SI medio de 8,4 (95 %CI 6,1-10,6, P< 0,005). Las células incubadas con bolitas-OVA con un diámetro de 5,6 pm no tuvieron una estimulación de proliferación, SI medio de 1,1 (95 %CI 0,4-2,7, P=0,876).
Estos resultados muestran que el antígeno acoplado a bolitas de diferentes tamaños puede estimular la proliferación celular. Parece ser que las bolitas con un diámetro de aproximadamente 1 pm son más eficaces en cuanto a la estimulación de células, aunque las bolitas hasta un tamaño de 0,2 pm siguen funcionando. Es razonable predecir que las bolitas de tamaños más grandes que 1 pm también funcionan, aunque a medida que el diámetro se acerca a 5,6 pm, las bolitas no permiten en absoluto estimular las células. Es razonable suponer que 1 pm es un tamaño óptimo, ya que es similar al tamaño de las bacterias. Nuestro sistema inmunitario ha evolucionado para fagocitar microorganismos/partículas de este tamaño y reaccionar a los mismos. Una célula presentadora de antígeno normal tiene un tamaño en el intervalo de 10-15 pm.
Materiales y métodos
Ejemplo 1
Acoplamiento covalente de proteínas a bolitas paramagnéticas que contienen grupos de ácido carboxílico libres.
En este ejemplo, se usaron Dynabeads® MyOne™ Carboxylic Acid con un diámetro de 1 pm (ThermoFischer Scientific) y el procedimiento de acoplamiento se llevó a cabo según el protocolo de los fabricantes (procedimiento en dos etapas que usa NHS (N-hidroxisuccinimida) y EDC (etil carbodiimida)).
Las bolitas se lavaron dos veces con MES-Buffer (MES 25 mM (ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico), pH 6). Después, se activaron los grupos de ácido carboxílico al agregar 50 mg/ml de NHS (N-hidroxisuccinimida) y 50 mg/ml de EDC (N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida) en MES-Buffer a las bolitas y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las bolitas se recogieron con un imán y el sobrenadante se eliminó y las bolitas se lavaron dos veces con MES-Buffer. La proteína se diluyó en MES-Buffer hasta una concentración de 1 mg/ml, total 100 ug, y se añadió a las bolitas y se incubó durante 1 h a temperatura ambiente. Las bolitas se recogieron con un imán y el sobrenadante se eliminó y se guardó para la medición de la concentración proteica. Los grupos de ácido carboxílico activados sin reacción se enfriaron con Tris 50 mM pH 7, 4 durante 15 minutos. Después, las bolitas se lavaron con PBS pH 7,4 y luego se almacenaron a -80 0C.
Para medir la cantidad de proteína acoplada a las bolitas, se usó un kit de ensayo de proteína BCA (Pierce BCA Protein Assay Kit, ThermoFisher Scientific) para medir la concentración proteica de la proteína antes del acoplamiento, así como en el sobrenadante después del acoplamiento. El ensayo BCA se usó según el protocolo del fabricante.
Ejemplo 2
Eliminación de endotoxinas mediante lavados de desnaturalización.
Las bolitas se acoplaron a una proteína recombinante producida en E. coli. Las bolitas acopladas a proteína se lavaron en varias condiciones de desnaturalización diferentes para asegurar la eliminación de endotoxinas. Las endotoxinas remanentes se midieron usando un ensayo de reactividad de monocitos (ensayo IL1B/IL6 FluoroSpot, MABTECH, Suecia).
Para la eliminación de endotoxinas, las bolitas se lavaron con uno de 3 agentes tampón de lavado diferentes, 2M NaOH pH 14,3, Urea 8M o guanidina 6M (HCl de guanidina), en su totalidad en agua estéril a temperatura ambiente, o se incubaron en PBS a 95 0C. Las bolitas se suspendieron en el agente tampón y se agitaron durante 4 minutos, se recogieron con un imán y se eliminó el sobrenadante. Esto se repitió 3 veces. Las bolitas tratadas con calor se dispusieron en PBS pH 7,4 y se dispusieron en un bloque de calentamiento a 95 0C durante 5 minutos, luego se recogieron con un imán y el sobrenadante se eliminó. Esto se repitió 3 veces. Después, las bolitas se lavaron 3 veces con PBS estéril para eliminar cualquier agente tampón de lavado remanente.
Para medir los niveles de endotoxina, se usó un ensayo de reactividad de monocitos (ensayo IL-1 p/IL-6 FluoroSpot, MABTECH, Suecia). Se aislaron peripherial blood mononuclear cell (células mononucleares de sangre periférica -PBMC) mediante centrifugación en gradiente Ficoll-Paque (GE Healthcare, Uppsala, Suecia). Las células se suspendieron en cRPMI (medio RPMI 1640 que contiene un 10 % de suero fetal bovino, un 1 % de L-glutamina y un 1 % de penicilina-estreptomicina). Se añadieron 3.000.000 de bolitas en cada pocillo en la placa de FluoroSpot por cuadruplicado para cada tipo de bolita y cada tipo de lavado. Se usaron como controles bolitas no lavadas, LPS y medio. Las células se agregaron a la placa de FluoroSpot con una concentración de 10.000 y 5.000 células en 200 pl de cRPMI por pocillo (2 pocillos de cada concentración celular y cada tipo de bolita). La placa se incubó durante 18 h en un ambiente humidificado a 37 °C y con el 5 % de CO2. La placa se desarrolló según el protocolo del fabricante y se leyó en un lector FluoroSpot.
Ejemplo 3
FluoroSpot
El ensayo FluoroSpot para analizar la activación de células T de pacientes con respecto a sujetos de control con respecto a un autoantígeno sospechoso de MS se llevó a cabo con un IFNy /IL17/IL22 FluoroSpot (MABTECH). El protocolo fue exactamente como el descrito en el Ejemplo 4, aunque en este caso solamente se analiza la respuesta a un antígeno, en vez de toda la genoteca de 125 proteínas.
Ensayo de proliferación
Ensayo de proliferación con incorporación de timidina con esplenocitos de ratones sensibilizados con ovoalbúmina. Como estímulos, se usó ovoalbúmina (SigmaAldrich) y BSA (SigmaAldrich) acopladas a bolitas (Dynabeads® MyOne™ Carboxylic Acid).
Los ratones se inmunizaron a ovoalbúmina mediante inyecciones mensuales de 100 pg de ovoalbúmina (Sigma) adsorbida en hidróxido de aluminio. Tres meses después de la primera inyección los ratones se mataron y se recogieron sus bazos. Los esplenocitos se prepararon mediante procedimientos estándar, tal como se describe en Thunberg y col. 2009, Allergy 64:919.
Las células se incubaron en cRPMI con bolitas con ovoalbúmina acoplada o con bolitas con BSA acoplada (10 bolitas por célula) durante 5 días. Todas las células se incubaron durante 6 días en una atmósfera humidificada con el 6 % de CO2 a 37 0C. Se agregó un pCi/pocillo de [3H] timidina a los cultivos celulares para las últimas 18 horas de incubación. Los recuentos por minuto (cpm) medios obtenidos de triplicados estimulados se dividieron por los valores cpm medios de células no estimuladas, expresándose como índices de estimulación (SI). Los valores SI > 2,0 se consideran generalmente positivos.
Ejemplo 4
Una selección de autoantígenos con respecto a una biblioteca de 125 proteínas en esclerosis múltiple usando bolitas con proteína acoplada (Dynabeads® MyOne™ Carboxylic Acid (ThermoFischer Scientific)) como estímulos y FluoroSpot (IFNy/IL17/IL22 FluoroSpot, MABTECH) como ensayo para medir la activación de células T.
Se utilizaron peripherial blood mononuclear cell (células mononucleares de sangre periférica - PBMC) de un total de 18 pacientes con esclerosis múltiple y 9 sujetos de control sanos. Las 125 proteínas diferentes consistían en una amplia variedad de PrEST específicas del Human Atlas Project. Las PrEST se acoplaron a bolitas según el protocolo del fabricante (tal como se describe en el Ejemplo 1).
Las PBMC se aislaron de muestras de sangre venosa (tomadas en tubos BD Vacutainer EDTA) mediante centrifugación en gradiente Ficoll-Paque (GE Healthcare, Uppsala, Suecia) según el protocolo estándar. Las células se congelaron en un medio de congelación (45 % FCS, 45 % RPMI, 10 % DMSO) y se almacenaron a -150 0C.
Las 125 PrEST diferentes se agruparon en 45 bloques diferentes para su correspondencia con el formato de 96 pocillos de FluoroSpot y se lavaron posteriormente en NaOH 2M para eliminar endotoxinas (tal como se describe en el Ejemplo 2). Se añadieron 3.000.000 de bolitas a cada pocillo de la placa FluoroSpot y cada agrupación diferente se procesó por duplicado. Se usó Anti-CD3 como control positivo, solamente medio y medio con bolitas vacías se usaron como controles negativos.
Las PBMC se descongelaron en un baño de agua a 37 0C y se lavaron en cRPMI (RPMI 1640, 10 % FCS, 1 % L-glut y 1 % penicilina-estreptavidina). Se agregaron 250.000 células en 200 pl de cRPMI en cada pocillo y la placa se incubó durante 44 h en un entorno humidificado a 37 0C y con el 5 % de CO2. Después de la incubación, la placa se desarrolló según el protocolo del fabricante (Mabtech) y se leyó en un lector FluoroSpot.
Ejemplo 5
Se usaron esplenocitos de ratones sensibilizados con ovoalbúmina y bolitas acopladas a ovoalbúmina para evaluar la eficacia de bolitas con diferentes tamaños. Bolitas paramagnéticas con un diámetro de 5,6 pm, 1 pm y 0,2 pm con ácido carboxílico en su superficie se acoplaron a ovoalbúmina o albúmina de suero bovino según el protocolo del Ejemplo 1.
Para ensayar la eficacia de las bolitas para estimular la activación de células T específicas de antígeno se usó un ensayo de proliferación (con la incorporación de 3H timidina). La concentración de bolitas con respecto a la concentración celular fue 1:1 para las bolitas de 5,6 pm, 10:1 para las bolitas de 1 pm y 500:1 para las bolitas de 0,2 pm. La concentración total de proteínas durante la incubación con las células se calculó en 125 ng/ml, 160 ng/ml y 160 ng/ml para 5,6 pm, 1 pm y 0,2 pm, respectivamente. El ensayo de proliferación se realizó de la misma manera que en el Ejemplo 3.

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Un método in vitro para ensayar la activación de células T específicas de antígeno, que comprende las etapas de:
    a. Disponer una partícula fagocitable, que tiene un polipéptido antígeno candidato asociado íntimamente a la misma, en donde la partícula con el polipéptido asociado se ha sometido a un lavado de desnaturalización que resulta en un nivel de endotoxina suficientemente bajo para no interferir con las etapas posteriores;
    b. Disponer una célula presentadora de antígeno viable;
    c. Poner en contacto la partícula lavada con la célula presentadora de antígeno in vitro en condiciones que permiten la fagocitosis de la partícula por la célula presentadora de antígeno; d. Disponer una muestra de células T a ensayar que comprende células T viables; e. Poner en contacto la muestra de células T con la célula presentadora de antígeno que ha contactado con la partícula in vitro en condiciones que permiten la activación específica de células T en respuesta a un antígeno presentado por una célula presentadora de antígeno; y
    f. Determinar el grado de activación de células T en la muestra de células T.
  2. 2. El método según la reivindicación 1, en donde el método además comprende las etapas (a') asociar íntimamente un polipéptido candidato a una partícula fagocitable y/o (a'') someter un antígeno candidato asociado a una partícula a un lavado de desnaturalización.
  3. 3. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que además comprende la etapa de comparar el grado de activación de células T con una referencia pertinente, en donde un mayor grado de activación de células T en la muestra en comparación con la referencia es indicativo de la conclusión de que el antígeno candidato resulta en la activación de células T específicas de antígeno en la muestra.
  4. 4. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la determinación del grado de activación de células T en la muestra de células T implica determinar la fracción de células T activadas en la muestra.
  5. 5. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde varios antígenos candidatos se ensayan con respecto a la misma muestra de células T.
  6. 6. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la partícula tiene una dimensión más grande inferior a 5,6 pm.
  7. 7. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el lavado de desnaturalización implica someter la partícula con el polipéptido asociado a un pH elevado, a un pH bajo, a una temperatura elevada y/o a un agente de desnaturalización.
  8. 8. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el lavado de desnaturalización resulta en una cantidad de endotoxinas en el antígeno tal que, en el ensayo de activación de células T, la concentración final de endotoxinas es inferior a 100 pg/ml.
  9. 9. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el polipéptido antígeno candidato se asocia de forma covalente a la partícula o en donde el polipéptido antígeno candidato se asocia a la partícula mediante un quelato de metal.
  10. 10. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la célula presentadora de antígeno y la muestra de células T se derivan del mismo individuo.
  11. 11. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la célula presentadora de antígeno y la muestra de células T se derivan de la misma muestra de sangre.
  12. 12. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la partícula lavada, la célula presentadora de antígeno y la muestra de células T se ponen en contacto simultáneamente.
  13. 13. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la determinación del grado de activación de células T en la muestra de células T comprende determinar la fracción de células T que han contactado con la célula presentadora de antígeno con respuesta mediante secreción de IFN-y , IL-17, IL-22 o una combinación de los mismos.
  14. 14. El método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el método sirve para diagnosticar esclerosis múltiple o seguir la evolución de la esclerosis múltiple, y en donde la determinación del grado de activación de células T en la muestra de células T comprende determinar la fracción de células T que han contactado con la célula presentadora de antígeno con respuesta mediante secreción de IL-17 y/o IL-22.
  15. 15. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para diagnosticar auto reactividad en un sujeto de ensayo, que comprende las etapas de:
    a. Disponer una partícula fagocitable, que tiene un autoantígeno de péptido candidato asociado íntimamente a la misma, en donde la partícula con el polipéptido asociado se ha sometido a un lavado de desnaturalización que resulta en un nivel de endotoxina suficientemente bajo para no interferir con las etapas posteriores;
    b. Disponer una muestra de peripherial blood mononuclear cell (células mononucleares de sangre periférica - PBMC) obtenida del sujeto de ensayo que comprende células T viables y células presentadoras de antígeno viables;
    c. Poner en contacto la muestra de PBMC con la partícula in vitro en condiciones que permiten la fagocitosis de la partícula mediante una célula presentadora de antígeno y que permiten la activación específica de células T en respuesta a un antígeno presentado por una célula presentadora de antígeno;
    d. Cuantificar la fracción de células T activadas en la muestra de PBMC con la que se ha contactado; y
    e. Comparar la fracción cuantificada con una fracción cuantificada de forma comparable de un sujeto sano, de modo que una fracción más grande de células T activadas en el sujeto de ensayo es indicativa de auto reactividad contra el autoantígeno candidato en el sujeto de ensayo.
ES16819310T 2015-12-16 2016-12-15 Plataforma de reactividad de células T Active ES2824554T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15200619.3A EP3182125A1 (en) 2015-12-16 2015-12-16 T-cell reactivity platform
SE1650493 2016-04-12
PCT/EP2016/081141 WO2017102921A1 (en) 2015-12-16 2016-12-15 T-cell reactivity platform

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2824554T3 true ES2824554T3 (es) 2021-05-12

Family

ID=57629580

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16819310T Active ES2824554T3 (es) 2015-12-16 2016-12-15 Plataforma de reactividad de células T

Country Status (11)

Country Link
US (2) US11360079B2 (es)
EP (1) EP3391047B1 (es)
JP (1) JP6812439B2 (es)
KR (1) KR102653721B1 (es)
CN (2) CN108369226B (es)
AU (1) AU2016369318B2 (es)
CA (1) CA3005393C (es)
DK (1) DK3391047T3 (es)
ES (1) ES2824554T3 (es)
WO (1) WO2017102921A1 (es)
ZA (1) ZA201804159B (es)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110836966A (zh) * 2018-08-15 2020-02-25 王镕 用于抗原特异性t细胞含量检测的检测纳米颗粒、检测方法及试剂盒等
GB201821205D0 (en) * 2018-12-24 2019-02-06 Tcer Ab Immunotherapy
GB201821207D0 (en) * 2018-12-24 2019-02-06 Tcer Ab Immunotherapy therapy

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU5801896A (en) * 1995-05-23 1996-12-11 Scripps Research Institute, The Antigen-specific activation of unprimed cd8+ t cells
US5750356A (en) * 1996-05-31 1998-05-12 Anergen, Inc. Method for monitoring T cell reactivity
AU2006200045B2 (en) * 2000-09-14 2008-07-10 Px Biosolutions Pty Ltd Composition comprising immunogenic microparticles
EP1390065A2 (en) * 2001-05-14 2004-02-25 Duotol Ab Methods for promoting antigen presentation and modulating immune responses using cholera toxin and its b subunit
US7501134B2 (en) 2002-02-20 2009-03-10 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Microparticles with adsorbed polypeptide-containing molecules
EP1356826A1 (en) * 2002-04-22 2003-10-29 BIOMAY Produktions- und Handels- Aktiengesellschaft Microparticles comprising carbohydrate beads covalently linked with allergen
EP1648919B1 (en) 2003-07-22 2010-11-17 Beckman Coulter, Inc. Methods for detecting activation of t-cells by mhc binding peptides
US9651543B2 (en) * 2005-08-31 2017-05-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Malaria antigen screening method
EP2409995A3 (en) 2007-02-28 2012-08-15 Lipoxen Technologies Limited Reduction of endotoxin in polysialic acids
CN101614734A (zh) * 2009-07-20 2009-12-30 安徽省药物研究所 一种体外热原的测定方法
JP2014511704A (ja) * 2011-04-13 2014-05-19 イミュニカム・エイビイ Ｔ細胞のプライミングのための方法
CN104144939A (zh) * 2012-02-29 2014-11-12 霍夫曼-拉罗奇有限公司 柱上酶切割
CN102978260A (zh) * 2012-11-28 2013-03-20 康普药业股份有限公司 一种硫酸软骨素粗品精制的方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP6812439B2 (ja) 2021-01-13
KR102653721B1 (ko) 2024-04-01
CN108369226A (zh) 2018-08-03
CN113552343A (zh) 2021-10-26
CN108369226B (zh) 2022-06-07
AU2016369318A1 (en) 2018-06-07
US20220381771A1 (en) 2022-12-01
JP2019500604A (ja) 2019-01-10
US11360079B2 (en) 2022-06-14
ZA201804159B (en) 2024-10-30
CA3005393A1 (en) 2017-06-22
DK3391047T3 (da) 2020-11-16
EP3391047A1 (en) 2018-10-24
EP3391047B1 (en) 2020-08-12
CA3005393C (en) 2023-08-29
AU2016369318B2 (en) 2021-03-25
US20200309764A1 (en) 2020-10-01
WO2017102921A1 (en) 2017-06-22
KR20180108585A (ko) 2018-10-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220381771A1 (en) T-cell reactivity platform
CN104597239B (zh) 用于检测结核分枝杆菌感染的抗原刺激物、试剂盒及其应用
US12153042B2 (en) Cell mediated immune response assay
CN110785487B (zh) T细胞扩增方法及用途
CA2934070A1 (en) Methods of t cell epitope profiling, making t cell compositions, and treating diseases
CN107110862B (zh) 结核分枝杆菌蛋白
AU2019203459A1 (en) PIF binding as a marker for immune dysregulation
Kidzeru et al. Myeloid-derived suppressor cells and their association with vaccine immunogenicity in South African infants
HK1262952B (en) T-cell reactivity platform
HK1262952A1 (en) T-cell reactivity platform
JP2013539977A (ja) 対象におけるＴｒ１細胞治療の有効性を評価するための方法
Bestard Matamoros et al. Monitoring alloimmune response in kidney transplantation