ES2824074T3 - Método para diagnosticar o tratar tumores mediante el uso de liposomas que contienen esfingomielina - Google Patents
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Abstract
Un sistema liposomal compuesto por: (a) una primera capa que contiene esfingomielina o un derivado de la misma con cadenas laterales modificadas o acortadas; (b) una segunda capa que contiene esfingomielina o un derivado de la misma con cadenas laterales modificadas o acortadas; de manera que la primera y segunda capa forman un liposoma bicapa que define un compartimento interior hidrófilo y un compartimento bicapa hidrófobo; (c) al menos un agente terapéutico en el compartimento interior hidrófilo o en el compartimento bicapa hidrófobo; y (d) al menos un agente de formación de imágenes en el compartimento interior hidrófilo o en el compartimento bicapa hidrófobo, de manera que el agente de formación de imágenes es: (i) Cy 5,5 apagado, (ii) un segmento de ADN compuesto por una baliza de ADN que contiene un bucle en horquilla con un par de extinción de CY7-Dabcyl u otro par de extinción de fluoróforos, o (iii) gadolinio y deuterio (D2O).
Description
DESCRIPCIÓN
Método para diagnosticar o tratar tumores mediante el uso de liposomas que contienen esfingomielina ÁMBITO DE LA PRESENTE INVENCIÓN
La presente invención se refiere a sistemas liposomales que contienen esfingomielina y a métodos que utilizan los sistemas liposomales para liberar un agente terapéutico, y a un agente de formación de imágenes para una muestra celular en condiciones in vitro.
ANTECEDENTES DE LA PRESENTE INVENCIÓN
La formación de ceramida puede inducirse por exposición a quimioterapia mediante vías nuevas y de esfingomielinasa (SMasa) y por radiación ionizante, que produce ceramida en la membrana plasmática activando la SMasa ácida. La ceramida inducida por radiación ionizante actúa como un segundo mensajero para iniciar la apoptosis. Gracias a su capacidad para inducir la muerte celular programada (apoptosis), la ceramida puede funcionar como un potente lípido supresor de tumores. La ceramida también puede limitar la proliferación de células cancerosas al bloquear la transición del ciclo celular. La ceramida también puede provocar en las células cancerosas unas respuestas autofágicas, cuyos resultados, sin embargo, pueden ser de supervivencia o letales.
La liberación extracelular de esfingomielinasa ácida (ASMasa, SMasa ácida o SMasa) como respuesta al estrés celular provocado por toxinas, agentes quimioterapéuticos, presencia de inflamación o irradiación sustancial del tipo X o UV inicia una rápida lesión de las células endoteliales mediada por ceramidas que conduce a la apoptosis endotelial (y en menores proporciones en otros tejidos y células tumorales). La SMasa ácida liberada hidroliza la esfingomielina de la superficie endotelial generando la ceramida como segundo mensajero proapoptótico, lo cual supone oportunidades para métodos terapéuticos novedosos dirigidos selectivamente a sitios de estrés celular, en particular al componente vascular de la respuesta tumoral.
Las patentes U.S. n° 7,288,534 y 6,541,462 (Modrak) proponen el uso de lípidos de esfingomielina para el tratamiento del cáncer y la artritis reumatoide. La patente U.S. n° 8,110,217 (Chancellor) se refiere al tratamiento del trastorno de la vejiga hiperactiva con liposomas de esfingomielina. Barenholtz (patente WO 2010/041255) analiza los liposomas que contienen esfingomielina para aumentar la vida útil de los liposomas que encapsulan agentes activos tales como sustancias quimioterapéuticas o analgésicas.
Actualmente hay varios métodos para detectar apoptosis: fragmentación del ADN, anexina V, entre otros. No obstante se necesita un método fiable para detectar la apoptosis in vivo. Solo se ha utilizado la anexina V para la detección de la apoptosis in vivo, tal como se refiere en algunos artículos, pero los resultados parecen contradictorios. Esto puede ser debido a que la anexina V detecta un solo fosfolípido, la fosfatidil serina. La capacidad de definir de modo selectivo y exacto la activación de la vía de SMasa ácida en especies vivas hace posible visualizar y cuantificar una vía clave de la respuesta al estrés celular.
Aunque otros investigadores han explorado varios usos de la esfingomielina y de liposomas que llevan esfingomielina, se necesita una sonda de formación de imágenes moleculares que sea suficientemente específica para interactuar con la ASMasa, con el fin de proporcionar información sobre la apoptosis endotelial y al mismo tiempo un sistema de liberación liposomal de agentes de formación de imágenes tales como sustancias quimioterapéuticas con colorantes fluorescentes y agentes de formación de imágenes por RM (tanto quelatos de gadolinio como agua pesada, D2O). RESUMEN DE LA PRESENTE INVENCIÓN
La presente invención proporciona un método para sondear (visualizar) la función específica y altamente restringida de la ASMasa en aquellos casos en que la ASMasa está sobrerregulada, localizable fuera de las células y activa. Este método combina la función generadora de imágenes y la función activadora de la ASMasa de tal modo que solo la ubicación prevista tenga actividad de ASMasa y sea capaz de realizar la función de focalización y controlar la función de liberación, accediendo a esta biología, obteniendo imágenes de la misma y manipulándola en la proximidad de la ASMasa liberada. Este método emplea el liposoma de SM en cuatro etapas: Imagen objetivo-Activación-Liberación-Imagen de seguimiento (TIARA). La innovación se puede utilizar utilizando algunas de las cuatro etapas.
La presente invención proporciona un sistema liposomal que comprende:
(a) una primera capa que contiene esfingomielina o un derivado de la misma con cadenas laterales modificadas o acortadas;
(b) una segunda capa que contiene esfingomielina o un derivado de la misma con cadenas laterales modificadas o acortadas; de manera que la primera y segunda capa forman un liposoma bicapa que define un compartimento interior hidrófilo y un compartimento bicapa hidrófobo;
(c) al menos un agente terapéutico en el compartimento interior hidrófilo o en el compartimento bicapa hidrófobo; y
(d) al menos un agente de formación de imágenes en el compartimento interior hidrófilo o en el compartimento
bicapa hidrófobo, de modo que el agente de formación de imágenes es: (i) Cy 5,5 apagado, (ii) un segmento de ADN compuesto por una baliza de ADN que contiene un bucle en horquilla con un par de extinción CY7-Dabcyl u otro par de extinción de fluoróforo, o (iii) gadolinio y deuterio (D2O).
La presente invención proporciona además un método para liberar un agente terapéutico y un agente de formación de imágenes, que consiste en: poner en contacto el sistema liposomal según la presente invención con una muestra celular en condiciones in vitro en las cuales la SMasa presente en la muestra celular o liberada por ella puede hidrolizar la esfingomielina en el sistema liposomal para liberar el agente terapéutico y el agente de formación de imágenes del sistema liposomal.
Por último, la capacidad de mezclar agentes de formación de imágenes con agentes terapéuticos habilita la capacidad de leer, visualizar o inducir la liberación de un agente farmacológico. Esta estrategia, conocida como teranóstica, es otra ventaja del método aquí descrito.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Otros objetivos y ventajas de la presente invención resultarán evidentes para los especialistas del sector al analizar la siguiente descripción de las formas de ejecución preferidas, haciendo referencia a las siguientes figuras donde: La figura 1A muestra un esquema de la presente invención. Los liposomas contienen un reactivo (R*) que puede ser una combinación de un fluoróforo, un agente terapéutico, un agente de contraste o un segmento de ADN, mientras que la figura 1B es una distribución del tamaño de los liposomas de esfingomielina por dispersión lateral dinámica, sintetizadas por extrusión manual.
La figura 2A es un diagrama de una horquilla de CY7-Dabcyl liposomal encapsulada en liposomas de SM liberados por SMasa (0,1 unidades/pl en un pocillo de un ml) al medio exterior que contiene el a Dn diana; cuando el ADN diana choca con la horquilla, ésta se libera dando fluorescencia de Cy7 libre.
La figura 2B muestra que el Cy 5,5 se apaga cuando está incluido en los liposomas; y el tratamiento con ASMasa aumenta la señal al romper el liposoma y liberar el colorante. La ASMasa inactivada térmicamente no es capaz de romper el liposoma.
La figura 3 muestra la detección basada en la activación de la apoptosis de los liposomas de SM que contienen el Cy 5,5.
La figura 4 muestra la biodistribución de los liposomas de SM que llevan Cy 5,5 en ratones con xenoinjerto PC3 a las 2 h.
La figura 5A es una imagen fluorescente del tumor necrótico K562 como diana de un liposoma de PC (sin lípido de SM) con Cy 5,5 encapsulado, administrado por inyección iv en la vena de la cola.
La figura 5B es una imagen fluorescente del tumor necrótico K562 como diana de liposomas de SM con Cy 5,5 encapsulado, administrados por inyección iv en la vena caudal.
La figura 6A es una demostración de la activación específica de liposomas cargados con gadolinio. Los liposomas de PC no contienen lípidos de esfingomielina, mientras que el grupo de SM contiene el esfingolípido. Al añadir el enzima activador, la SMasa ácida, las partículas se perforan y la señal de relajación T1 disminuye (se ilumina) solo en los liposomas de SM. La figura 6B muestra el contraste aumentado que se puede lograr cuando el interior del liposoma contiene gadolinio y deuterio (D2O) en comparación con los liposomas convencionales llenos de H2O. La figura 7 muestra la activación de las partículas in vivo para leer la respuesta de las células al estrés externo por liberación de SMasa ácida, con fines diagnósticos. Aquí, en la fila superior tenemos imágenes de animales (con tumores señalados con una flecha) con un tubo de agua como fondo. Estos ratones ya habían sido inyectados con liposomas que contenían esfingomielina cargada con gadolinio. En la fila inferior se muestran los mismos ratones tras la irradiación con una fuente externa a (de izquierda a derecha) 6 Gy, 18 Gy o 29 Gy. Tras la desestabilización del liposoma por la SMasa ácida se registra un aumento de la señal dependiente de la dosis.
La figura 8 son imágenes de RM representativas que demuestran la especificidad de los liposomas que contienen esfingomielina para la activación mediante un fenómeno biológico único: liberación de SMasa ácida. Nuevamente, las flechas blancas apuntan al tumor, con imágenes previas y posteriores a la irradiación en las filas superior e inferior, respectivamente. A la izquierda están los liposomas con esfingomielina que se han administrado a ratones inactivos en SMasa ácida. Estos ratones no expresan el enzima SMasa ácida y se demuestra que la presencia de este enzima es necesaria para la activación del liposoma cargado con contraste de RM. A la derecha hay imágenes representativas de un ratón normal (productor de SMasa ácida) al que se le había inyectado un liposoma que no contenía esfingomielina. Este liposoma no se puede activar y la señal de RM en el liposoma no cambia.
La figura 9 demuestra la especificidad y precisión diagnóstica de los liposomas de esfingomielina cargados con agente de contraste de RM para la detección de la respuesta al estrés celular mediada por SMasa ácida después de la irradiación con rayos X.
La figura 10 son gráficos que muestran el transporte del transporte de SMasa a la valva exterior de la membrana plasmática durante la apoptosis celular.
La figura 11 es un diagrama de diferentes modos de unión de gadolinio a un liposoma para usar en una forma de ejecución de la presente invención.
La figura 12 es un gráfico que muestra la fuga de verde de indocianina (como modelo de liberación de compuestos terapéuticos) desde liposomas SM tras 1 hora de incubación con células endoteliales aórticas humanas (HAoEC) o células prostáticas PC-3 después de haber sido irradiadas con diferentes dosis.
La figura 13 muestra la estructura y la síntesis de lípidos de gadolinio para su uso en una forma de ejecución de la
presente invención.
La figura 14A muestra la preparación de nanoformulaciones liposomales; la figura 14B la purificación de liposomas por cromatografía en columna de exclusión de tamaños; la figura 14C la distribución de tamaño de los liposomas de SM por dispersión dinámica de luz.
La figura 15A muestra la fluorescencia de Cy 5,5. La fluorescencia del Cy 5,5 se apaga cuando se empaqueta en liposomas. El tratamiento con SMasa aumenta la señal al romper el liposoma y liberar el colorante. Cuando se libera Cy 5,5 aumenta la intensidad de la fluorescencia. Como control se emplea SMasa inactivada térmicamente. La figura 15B muestra una horquilla liposomal de CY7-Dabcyl encapsulada en liposomas de SM. Es liberada por SMasa a tres concentraciones de SMasa (1 unidad, 0,5 unidades y 0,1 unidades/ml) al medio exterior que contiene el ADN diana. Cuando la diana choca con la horquilla, ésta se abre y el Cy7 no se apaga. Las figuras 15C/D muestran la detección del estrés celular sensible a la dosis. Secreción de SMasa tras la respectiva irradiación de las células HAoEC (15C) y PC-3 (15D) con varias dosis. La SMasa se detecta utilizando el kit de fluorescencia de SMasa.
La figura 16A muestra el análisis de la morfología de los tumores PC-3 por ultrasonidos, clasificando el tamaño de los tumores con el empleo de ultrasonidos. La figura 16B muestra la biodistribución a las 2 h de liposomas de SM frente a liposomas de PC en ratones con tumores irradiados. Se utilizó ASB radiomarcada como carga útil dentro de los liposomas. La figura 16C muestra la comparación de liposomas de SM con liposomas de PC que contienen el fluoróforo Alexa Fluor 680 en tumores irradiados y no irradiados. Los tumores irradiados están señalados con una flecha. Las imágenes se tomaron inmediatamente después de la irradiación, es decir, 30 minutos después de la inyección y la imagen se obtuvo con una cámara óptica Maestro usando la descomposición espectral. La figura 16D muestra los análisis de ratones con xenoinjerto de tumores PC-3, de la región de interés (RDI) en el sitio del tumor irradiado y de la RDI del control en el mismo sitio de la otra pata trasera en un sitio de tumor similar no irradiado (se usó la intensidad de fluorescencia relativa máxima IRF del sitio).
La figura 17 (en las dos imágenes de la parte superior) muestra imágenes ópticas de ratones desnudos con tumores PC-3 irradiados y en la parte inferior una imagen óptica de un ratón SCID con SMasa inactivada y tumores PC 3 en ambos flancos posteriores. Los ratones se inyectaron con liposomas que contenían fluoróforos Alexa Fluor 680 tras la irradiación con 20 Grays. Los tumores irradiados están señalados con una flecha; como control se emplea el tumor en la pierna opuesta. Las imágenes se tomaron inmediatamente después de la irradiación, es decir, 30 minutos después de la inyección, con una cámara óptica Maestro usando la descomposición espectral.
La figura 18 muestra el porcentaje de fuga de Doxorrubicina de los liposomas en 24 horas después de la irradiación de las células endoteliales HAoEC (respecto al control).
La figura 19 muestra el porcentaje de fuga de Doxorrubicina de los liposomas después de una hora de inducción con células PC-3 irradiadas.
La figura 20 es un gráfico del porcentaje de fuga de liposomas frente a la dosis de radiación en células HAoEC y PC-30.
La figura 21 es un gráfico del porcentaje de fuga de liposomas frente al tiempo de incubación con células HAoEC y PC-3 irradiadas.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS FORMAS DE EJECUCIÓN PREFERIDAS
La presente invención aporta un método capaz de amplificar la detección de un mecanismo de respuesta biológica al estrés mediante activación enzimática. El enzima escindirá miles de esfingomielinas a ceramidas en la superficie del liposoma portador y como resultado provocará la rotura o perforación de los liposomas. Este cambio en la integridad del vehículo liposomal conduce a la liberación de una carga útil tal como un agente de formación de imágenes o un agente terapéutico al compartimiento extracelular o intracelular. Esta activación enzimática de las nanopartículas es inducido tras el estrés celular (p.ej. por dosis elevada de radiación X, exposición a luz ultravioleta, ultrasonidos de gran energía; Czarnota y otros, aumento de la respuesta a la radiación tumoral por estimulación acústica de la vasculatura, PNAS, 2012) que desencadena la liberación de la esfingolípido-hidrolasa SMasa ácida.
La detección de este suceso biológico se amplifica acoplando la carga útil de nanopartículas liposomales a fluoróforos o agentes de contraste de IRM o ADN, que se intensificarán cuando estén fuera del liposoma. El método se puede usar en pruebas in vitro con tubos de ensayo y en pruebas in vitro con cultivos celulares para evaluar la respuesta al estrés celular, incluida la que conduce a la apoptosis.
Según una forma de ejecución de la presente invención, para formar los liposomas de la presente invención se puede usar esfingomielina de origen natural, como la que suministra Sigma Chemical, St. Louis, Missouri. La esfingomielina se puede sintetizar siguiendo métodos conocidos; véase la patente U.S. n° 6,541,462. Según la presente invención, la esfingomielina puede ser un derivado o un metabolito de la misma, como la que tiene cadenas laterales modificadas o acortadas.
El lípido formador de liposomas utilizable en la presente invención puede incluir, sin limitarse a ellos, diversos tipos de fosfolípidos, glicolípidos y glicerofosfolípidos. Los lípidos pueden ser catiónicos, monocatiónicos o policatiónicos, siempre que sean compatibles con la esfingomielina y el agente activo o especie indicadora utilizada en la práctica de la presente invención.
Hay varias clases de agentes quimioterapéuticos (aprobados y actualmente en fase de prueba) que se han cargado
en nanopartículas para ser liberados tras el estrés celular, incluidos sin limitación: cis-diaminoplatino(N), doxorrubicina clorhidrato, marimastat, factor de necrosis tisular alfa, paclitaxel, curcumina, prinomastat, ST638, SKI246, dasatnib y péptidos proapoptóticos. La liberación de ASMasa fue estimulada por las células tras la irradiación. La cantidad de fármaco liberado se midió por absorción y mediante la señal de formación de imágenes fluorescentes (del colorante cargado conjuntamente).
Con anterioridad se ha demostrado que la esfingomielinasa rompe liposomas gigantes si entra en contacto con ellos. Recientemente se ha demostrado usando LUV que, a diferencia de la esfingomielina, la ceramida forma microdominios en las membranas de fosfatidilcolina, tanto en estado líquido y como de gel. Al someter GUV o liposomas que llevan esfingomielina a la acción de esfingomielinasa aplicada externamente, en primer lugar se produjo la rápida formación de microdominios enriquecidos en ceramida, con la subsiguiente formación de vesículas “endocitóticas” en la cavidad interna del liposoma gigante (Holopainen y otros, J. Biol. Chem. (2000), v. 275, n° 22, páginas 16484-89; Nurminen y otros, J. Am. Chem. Soc. (2002), 124, 12129-34). Se ha demostrado con anterioridad que la esfingomielinasa puede inducir la gemación vectorial de pequeñas vesículas desde la valva interna o externa de una vesícula gigante de pared simple (diámetro > 100 |jm), dependiendo en qué lado de la bicapa se agrega el enzima (Holopainen y otros). Se ha demostrado que la “endocitosis” también puede ser inducida en las GUV por LDL. Se ha documentado la evidencia de la absorción de colesterol LDL por células lúteas de rata, sin intervención de receptores ni ingestión concomitante de apoB-100 (Holopainen y otros). Recientemente se ha demostrado que la LDL agregada entra en las células a través de compartimentos conectados a la superficie mediante un mecanismo que no involucra al receptor de LDL.
Varios tipos de células presentes en las lesiones ateroscleróticas secretan esfingomielinasa, lo que sugiere un posible papel de este enzima en el desarrollo de la aterosclerosis, por lo cual este dispositivo selectivo y formador de imágenes también podría usarse para la formación de imágenes diagnósticas y el tratamiento de estas enfermedades.
También se ha demostrado que las células apoptóticas transportan esfingomielinasa en la valva exterior de la célula apoptótica, un fenómeno que no ocurre en las células normales. Es importante y deseable conocer la tasa de apoptosis después de un tratamiento, por ejemplo, de radiación. La apoptosis después de la radiación de las células tumorales ha sido demostrada por Rotolo y otros (Rotolo, JA, y otros, J. Biol. Chem. (2005) vol. 280, n° 28, páginas 26425-26434; Charruyer, A. y otros, J. Biol. Chem. (2005); 280: páginas 19196-19204).
La administración selectiva de fármacos es posiblemente el objetivo más importante de la industria farmacéutica, ya que la localización estricta de la actividad farmacológica de un medicamento en el sitio u órgano de acción disminuye la dosis de fármaco requerida y su toxicidad sistémica y aumenta la eficacia del tratamiento. Por otra parte, esta selectividad dirigida supone un reto especial cuando las dianas son difíciles de alcanzar por razones anatómicas, en particular por un mal aporte de sangre, o cuando las dianas tienen una gran resistencia a los medicamentos. Además, a pesar de los últimos avances en el desarrollo de las sondas de nanopartículas para biomedicina, la traslación de plataformas de partículas diagnósticas selectivas continúa siendo un desafío. Las nanoestructuras más comúnmente utilizadas para la administración clínica de fármacos incluyen los liposomas y las micelas. Los materiales basados en nanopartículas que se están evaluando actualmente en ensayos clínicos de oncología son en gran parte vehículos de administración no selectivos de fármacos. El efecto EPR se utiliza generalmente para llegar a los sitios del tumor, pero no hay ningún buen sistema de liberación controlada que pueda descargar el fármaco en el momento del uso clínico. Hay activación térmica, pero es problemática por el estrecho margen existente entre la temperatura corporal normal, la temperatura de transición de fase y la temperatura perjudicial para los tejidos. Como los sistemas de administración de fármacos son complicados, es conveniente probar el sistema de administración de fármacos usando técnicas de imagen con el fin de evaluar la eficacia del sistema y utilizar estos datos para desarrollar los sistemas de administración y catalogar el modelo de tumor, así como los estadios posteriores para la selección de los pacientes, y disponer de un verdadero enfoque teranóstico. Además de satisfacer los parámetros críticos de seguridad, las sondas de diagnóstico selectivo de tumores deben elucidar las interacciones específicas con el microambiente y sus efectos en los sistemas biológicos. Se han identificado varios factores clave que limitan la traslación de las sondas de diagnóstico selectivo de tumores: farmacocinética subóptima, nanotoxicidad de la sonda in vivo (4), y consideraciones legales en evolución. Para abordar estos problemas y cumplir las normas legales y de práctica clínica, los métodos rigurosos de obtención de imágenes cuantitativas y las herramientas de análisis como PET serán esenciales para evaluar una diversidad de sondas sometidas a ensayos preclínicos o en fase de ensayos clínicos tempranos. Con la unión de un radiomarcador a la superficie de la partícula, el potencial clínico de estas sondas dirigidas molecularmente se puede definir de forma sensible y exhaustiva de acuerdo con el siguiente conjunto de criterios diagnósticos: distribución favorable y cinética selectiva, tiempos prolongados de circulación (tiempo de permanencia en la sangre), amplificación pronunciada de las señales tisulares y mejor penetración tumoral.
La formación de imágenes moleculares es fundamental para el desarrollo y el éxito de la medicina molecular dirigida porque permite la detección temprana de enfermedades, el control de la eficacia de los fármacos y la identificación de la enfermedad. Por lo tanto hay una gran necesidad de desarrollar nanosondas para dirigir fármacos, para la formación de imágenes funcionales y la aplicación de terapias selectivas.
La detección de la apoptosis es crucial para controlar los resultados terapéuticos en el cáncer. Actualmente hay varios métodos para detectar la apoptosis, incluida la descomposición del ADN, la anexina V y los compuestos activados por caspasa. Sin embargo no existe un buen método para detectar la apoptosis in vivo. En algunos artículos se ha referido
el uso de la anexina V sola para detectar la apoptosis in vivo, pero los resultados han sido contradictorios. Esto no es sorprendente porque la anexina V solo detecta el fosfolípido fosfatidil serina. Por consiguiente serían muy necesarios unos medios que permitieran detectar y amplificar exactamente la molécula diana por activación enzimática al entrar en contacto con las células apoptóticas.
La esfingomielina (SM) y la ceramida se hallan entre los lípidos que tienen un papel especial en las células durante la permeabilización celular, intravasación, apoptosis y formación de dominios. La ceramida no se encuentra normalmente en la superficie exterior. Uno de los enzimas que controlan el equilibrio SM-ceramida es la esfingomielinasa (SMasa). La SMasa hidroliza el grupo de cabeza de la SM dando como resultado fosfocolina y ceramida. Esta ceramida puede formar dominios que luego se integran dentro de una célula.
Además la SMasa rompe los liposomas si está en contacto con ellos. Recientemente se ha demostrado con el uso de vesículas unilaminares gigantes (GUV) que cuando la SMasa está en contacto con SM liposomal se forma ceramida, la cual encabeza microdominios en membranas de fosfatidilcolina, tanto en estado líquido como de gel. La SMasa inmovilizada en una partícula de látex aplicada externamente a GUV que contenían SM produjo la rápida formación de microdominios enriquecidos en ceramida, con la formación subsiguiente de vesículas “endocitóticas” en la cavidad interna del liposoma gigante (Holopainen y otros, Nurminen y otros).
También se ha demostrado que las células apoptóticas transportan SMasa en su valva externa, una circunstancia que nunca ocurrirá en las células sanas. Como la apoptosis es un proceso que ocurre espontáneamente en los tumores y aumenta tras la quimioterapia o radioterapia, sería útil conocer la tasa de apoptosis después de un tratamiento para tener una medida de la eficacia de la terapia. La apoptosis después de la irradiación de las células tumorales ha sido demostrada por Rotolo y otros.
Aquí describimos un método para la detección precisa de SMasa empleando liposomas que pueden ser activados por SMasa. En el caso de apoptosis o ruptura de la membrana, la SMasa es transportada desde las valvas internas de las células hacia sus valvas externas. Sugerimos que el transporte de SMasa también tendrá lugar en el caso del estrés agudo causado por la irradiación de las células y que este fenómeno se puede utilizar para la alteración específica del sitio y la orientación de los liposomas que llevan Sm . También demostramos que las líneas celulares PC-3 y HAoEK secretan SMasa de forma dependiente de la dosis tras la irradiación.
Debido a la versatilidad de nuestro método, la capacidad de localizar tumores de las sondas diagnósticas selectivas del tumor se probará utilizando IRM, SPECT/PET ópticas y realizando estudios de biodistribución. Las nanopartículas dirigidas se compararán con las nanopartículas no dirigidas, se llevarán a cabo estudios de focalización en las líneas celulares y modelos tumorales que no expresen los receptores de unión, y se evaluarán parámetros farmacodinámicos y farmacocinéticos. Basándose en estos resultados se pueden crear nanopartículas que contengan un fármaco contra el cáncer.
Sugerimos que este envío de liposomas dirigido al sitio puede usarse para la administración de fármacos en todas las condiciones posibles en las que el estrés celular induce la secreción de SMasa. En la administración de medicamentos, esto creará un sistema que hará que el fármaco solo esté disponible para las células estresadas con necesidad urgente del medicamento. Una ventaja del sistema propuesto es la posibilidad de amplificar la señal ya que un enzima escindirá miles de SM a ceramidas en la superficie del liposoma portador. Como resultado, los liposomas se rompen y liberan su carga útil al compartimento extracelular o intracelular. Este desencadenamiento enzimático se amplifica aún más al acoplar la carga útil de la nanopartícula liposomal a los fluoróforos o al agente de contraste de IRM o al ADN, que se intensificarán cuando estén fuera del liposoma. Aquí mostramos pruebas en tubos de ensayo in vitro, en ensayos de cultivos celulares in vitro y algunas posibles aplicaciones in vivo de este método versátil.
La siguiente sección experimental pretende ilustrar, pero no limitar, la práctica y el alcance de la presente invención. SECCIÓN EXPERIMENTAL EJEMPLO I
Formulaciones de liposomas
Esfingomielinasa a partir de B. cereus de Sigma
Se prepararon liposomas partiendo de una mezcla de lípidos (Avante Polarlipids), con un contenido total de 20 pM de DSpC/colesterol/esfingomielina lípidos en relación 4/3/3 molar. Los liposomas se prepararon según la técnica de Medina OP y otros. Los lípidos almacenados en cloroformo se pipetearon a un matraz de fondo redondo, se secaron bajo atmósfera de nitrógeno y se liofilizaron durante 2 h para eliminar las trazas de cloroformo. Se dejó que los lípidos se hidrataran durante 30 min a 60°C en soluciones acuosas tamponadas que contenían Cy 5,5 o solución de gadolinio Magnavist o ADN de horquilla. Se extruyó 11 veces a través de una membrana de policarbonato de 100 nm, utilizando una extrusora de pequeño volumen. El trazador liposomal se purificó separándolo del trazador no unido mediante una columna PD-10 o por diálisis durante la noche. Los liposomas se controlaron haciendo mediciones de su tamaño por
dispersión dinámica de luz (Malvern).
Ensayos celulares in vitro
El examinó el efecto de liposomas de SM irradiados y no irradiados en células endoteliales aórticas humanas (HAoEC) y en células tumorales de próstata PC-3, exponiendo las células (0,5 millones) a la radiación en un matraz con medio de cultivo celular. Después de la radiación se añadieron al medio liposomas de SM que contenían verde de indocianina (ICG) y se incubaron durante una hora. El medio se pasó por una membrana de diálisis (corte de piel de serpiente de 10 kDa) y se introdujo en tubos Falcon de 50 ml que contenían tampón PBS, se incubó por la noche y al día siguiente se midió cuánto había pasado de los liposomas al medio y al otro lado de la membrana. Se midió la absorbancia de ambos lados de la membrana (abs a 800 nm) y se calculó el % de fuga ((Abs del otro lado/Abs del lado inicial) x 100). Los resultados indican que la radiación tiene efecto tanto en las células PC-3 como en las células HAoEC, pero más en las células HAoEC.
Ensayo de fluorescencia
Los liposomas que contenían Cy 5,5, una vez purificados, se incubaron con unidades de esfingomielina en diferentes proporciones y con esfingomielina inactivada por calor. Los resultados se obtuvieron usando un lector de placas Tecan Sapphire a distintos intervalos de tiempo.
Se realizaron ensayos celulares usando el agente terapéutico etopósido 300 pM en una línea celular prostática PC-3 inducida. Se introdujo etopósido en células PC-3 desnutridas. Tras 72 h de incubación con etopósido, en el pico de la apoptosis, se introdujeron en las células liposomas de esfingomielina que contenían Cy 5,5. Después de seis horas de incubación se leyó la fluorescencia usando un lector de placas Tecan Sapphire. Como control se emplearon células sin el tratamiento de etopósido. También se realizaron ensayos celulares en los que, en lugar del Cy 5,5, se utilizó una baliza de ADN liposomal que contenía un bucle en horquilla con un par de extinción CY7-Dabcyl unido al mismo. La baliza liberada por SMasa al medio exterior que contenía el ADN diana liberó la horquilla y el Cy7, que, como ya no estaba apagado con Dabcyl, dio una señal que se midió con un lector de placas Tecan Sapphire.
Se llevaron a cabo ensayos murinos con ratones desnudos que llevaban un xenoinjerto próstatico de PC-3. Una vez purificados, se administraron al ratón liposomas que contenían Cy 5,5 mediante una inyección de 300 pl de volumen en la vena caudal. Los ratones se escanearon con una cámara de fluorescencia Maestro y las imágenes se observaron mediante el programa Maestro. Se realizaron estudios de biodistribución del ratón una hora después de inyectarle el Cy 5,5 liposomal. Los órganos se lisaron y se suspendieron en 1 ml de PBS y se transfirieron a la placa de 24 pocillos. La fluorescencia se midió con un lector de placas Tecan Sapphire.
Asimismo se inyectaron liposomas en ratones desnudos con tumores implantados de próstata, mama y melanoma, y también en ratones inmunocompetentes (con y sin el gen ASM). Se tomaron imágenes de estos ratones con liposomas cargados con agentes de PET (FDS), agentes de RM (Gd) y agentes ópticos (luciferina).
Estudios de IRM
Se realizaron experimentos murinos con ratones desnudos que llevaban xenoinjerto próstatico de PC-3. Los liposomas se cargaron separadamente con varios agentes de contraste aprobados por la FDA (por ejemplo, gadopentetato de dimeglumina o gadolinio(III) 5,8-bis(carboxilatometil)-2-[2-(metilamino)-2-oxoetil]-10-oxo-2,5,8,11-tetraazadodecano-1-carboxilato hidrato) y una vez purificados se administraron al ratón mediante una inyección de 300 pl de volumen en la vena caudal. En algunas formas de ejecución de la presente invención, los agentes de contraste de RM se liofilizaron y se resuspendieron en deuterio, que carece de la señal de espín del protón del agua endógena. Las propiedades de relajación de las nanopartículas con agentes suspendidos en H2O o D2O se compararon con un relaxómetro de mesa (Bruker mq20). También se determinó el contraste de activación de las nanopartículas después de desestabilizarlas con SMasa ácida.
Para los ensayos in vivo se implantaron a los animales fibrosarcomas murinos por vía subcutánea y se obtuvieron las imágenes IRM de los roedores después de la administración de liposomas de esfingomielina cargados con gadolinio y deuterio. Los resultados se analizaron y visualizaron utilizando un programa convencional de IRM. Tras el ensayo inicial de formación de imágenes, los ratones se sometieron a dosis variables de rayos X de una fuente externa y la activación de los liposomas por SMasa ácida se leyó mediante más imágenes de RM. Se encontró que los ratones de control, que no expresan la proteína SMasa ácida, y las nanopartículas de control (que no contienen esfingolípidos) no producían ninguna respuesta.
Resultados y discusión
Las micelas de liposomas y otras nanopartículas pueden usarse como vehículo de trazadores de imágenes y agentes terapéuticos. Luego los resultados de la formación de imágenes se pueden usar para el tratamiento de los pacientes basado en las pruebas diagnósticas o para el desarrollo y optimización de los sistemas terapéuticos de administración de fármacos. La aplicación de tales plataformas como vehículos para la administración selectiva se puede ampliar con
el acoplamiento de anticuerpos, péptidos y pequeñas moléculas específicas a la superficie del liposoma. En este caso la presente invención aporta funcionalidad a la formulación de los liposomas introduciendo en ella esfingomielina, que luego sirve para liberar el contenido de los liposomas solo en presencia de las células que expresan esfingomielinasa fuera de las células.
El mecanismo de acción en el liposoma de la presente invención consiste en que la esfingomielina que contienen los liposomas se escindirá produciendo la ceramida al entrar en contacto con la esfingomielinasa. Se ha demostrado que, como producto de reacción de la SMasa ácida, la ceramida forma microdominios enriquecidos con ceramida en las membranas de fosfatidilcolina (PC), tanto en estado fluido como de gel. Los dominios segregados tienen propiedades físicas muy diferentes de las de la membrana compuesta de fosfatidilcolina. Se ha sugerido que la segregación de la ceramida es el resultado de un eficiente enlace de hidrógeno intermolecular entre los grupos de cabeza de este lípido. El grupo de cabeza de la ceramida también está débilmente hidratado, lo cual permite un estrecho empaquetamiento lateral en la membrana. Los resultados concuerdan con observaciones anteriores, en las que se inyectó SMasa en la superficie de la vesícula, lo cual produjo la formación de dominios y la gemación vectorial. La formación asimétrica de ceramida en una bicapa, es decir, en las valvas externas o internas, provocará una diferencia de área entre las dos monocapas. La ceramida también tiene tendencia a formar fases no laminares invertidas.
Estas propiedades, es decir, la diferencia de áreas entre monocapas adyacentes y la curvatura negativa espontánea de los dominios que contienen ceramida, junto con la gran rigidez a la flexión del dominio enriquecido con ceramida, proporcionan la fuerza impulsora para la formación vectorial de vesículas en la membrana.
EJEMPLO II
Formulación de liposomas
Los lípidos se adquirieron de Avanti Polar Lipids y la SMasa ácida, producida por B. cereus, de Sigma Aldrich. Los liposomas se prepararon con una mezcla de lípidos que constaba de un total de 20 pM de lípidos en relación molar 4/3/3 de DSPC/colesterol/SM. Los liposomas se prepararon del modo descrito en Medina OP y otros. Resumiendo, los lípidos almacenados en cloroformo se pipetearon a un matraz de fondo redondo, se secaron bajo atmósfera de nitrógeno y se liofilizaron durante 2 h para eliminar las trazas de cloroformo. Se dejó que los lípidos se hidrataran durante 30 min a 60°C en soluciones de agua tamponada que contenían Cy 5,5 o ADN en horquilla o estreptavidina-Alexa 680 o albúmina radiomarcada. La extrusión se realizó 11 veces a través de una membrana de policarbonato de 100 nm utilizando una extrusora de pequeño volumen. Los liposomas se purificaron separándolos de los compuestos no unidos mediante una columna PD-10, lo cual reveló que el Alexa 680, el Cy 5,5 y la ABS eran relativamente fáciles de encapsular en los liposomas (figuras 14A y B). Los liposomas se controlaron mediante mediciones de su tamaño por dispersión dinámica de luz (Malvern) y revelaron un diámetro hidrodinámico medio de 100-200 nm [intervalo del 95%] (fig. 14C).
Ensayos in v itro
Ensayos de activación de liposomas
Se incubaron liposomas que contenían Alexa 680 o Cy 5,5 después de la purificación con diferentes cantidades de SMasa, así como con SMasa inactivada por calor. Los resultados se obtuvieron con el lector de placas Tecan Sapphire en diferentes intervalos de tiempo.
El Cy 5,5 se apaga cuando está empaquetado en liposomas. En teoría el tratamiento con SMasa incrementa la señal porque afecta a la bicapa de los liposomas y permite la liberación del colorante. De hecho, esto se observó después de incubar con SMasa purificada los liposomas de SM cargados con Cy 5,5. Así, los liposomas de SM tuvieron fugas tras la introducción en ellos de SMasa, lo cual fue detectado por un aumento de fluorescencia que no podía tener lugar en caso de usar SMasa tratada térmicamente (fig. 15A).
A fin de obtener una correlación válida entre la actividad de la SMasa y la intensidad de la señal se usó otro sistema diferente que produce señales de fondo significativamente más bajas, es decir, se usó una baliza de ADN que contenía un bucle en horquilla con un par de extinción CY7-Dabcyl en lugar de Cy 5,5 como carga útil. Después de la liberación de la baliza de los liposomas por la SMasa al medio exterior que contenía el correspondiente ADN diana, la interacción entre la baliza y la diana produjo la excitación del fluoróforo Cy 7. Las señales resultantes se midieron con un lector de placas Tecan Sapphire.
La fuga general así como la linealidad de la fuga inducida por SMasa se comprobó con una horquilla liposomal CY7-Dabcyl encapsulada en liposomas de SM, mientras la diana de la horquilla se encontraba fuera de los liposomas. Cuando el a Dn diana choca con la horquilla, ésta se lateraliza y se abre. Esto rompe la extinción dando fluorescencia de Cy7 libre (fig. 2B). Medimos la apertura de la horquilla CY7-Dabcyl liberada de los liposomas, con y sin adición de SMasa purificada a tres concentraciones diferentes (1 unidad, 0,5 unidades y 0,1 U unidades por ml), al medio exterior que contenía el ADN diana. Este ensayo indicó que existe una correlación lineal entre la concentración de SMasa y la liberación de la carga de los liposomas de SM.
Ensayo de detección de la actividad enzimática de la SMasa
La actividad del enzima SMasa se visualizó mediante un kit de detección de SMasa (Cayman Chemicals, EUA) según las instrucciones facilitadas. Se añadieron 10 |jl de muestra a por lo menos tres pocilios. Para obtener unos resultados reproducibles, la cantidad de esfingomielinasa agregada a los pocillos debe estar dentro del rango de la curva estándar del ensayo. Si es necesario, las muestras deben diluirse con la solución de SMasa ácida. Pipetear las muestras junto con los controles positivos y negativos a una placa de 96 pocillos.
Para iniciar la reacción, agregue 20 j l del substrato de esfingomielina diluido preparado con solución ácida de SMasa (Cayman Chemicals). Cubra la placa con su tapa e incube treinta minutos a 37°C. Agregue 100 j l de la “solución reveladora” a todos los pocillos que se estén utilizando, incluida la muestra, el fondo de la muestra, el control positivo y los patrones. Cubra e incube durante 30 minutos a 37°C. Retire la tapa de la placa y lea a una longitud de onda de excitación de 530-540 nm y una longitud de onda de emisión de 585-595 nm. Se irradiaron células endoteliales aórticas humanas primarias (HAoEC) y células PC-3 con diferentes dosis que variaban desde 0 a 20 Gy. 10 min después de la irradiación se midió la intensidad de la señal fluorescente correspondiente a la actividad del enzima SMasa con un lector de placas Tecan Sapphire.
Para comprobar la idoneidad del modelo celular en los siguientes ensayos se probó la secreción de SMasa después de inducir el estrés por radiación capaz de producir la apoptosis. La secreción de SMasa tras la irradiación con varias dosis se detectó usando el kit de SMasa (fig. 2B). Las células PC-3 y HAoEC secretaron la SMasa dependiendo de la dosis, desde 5 hasta 30 Grays, lo cual demuestra una dependencia muy fuerte de la dosis de radiación (figs. 15C, D).
Ensayos in vivo
Modelo tumoral
Para evaluar in vivo los liposomas de SM se utilizaron ratones desnudos atímicos que llevaban xenoinjertos prostáticos de PC-3. Se inyectaron 1.000.000 de células en un volumen de 50 j l junto con 50 j l de Matrigel, cada una por vía subcutánea, en ambas extremidades traseras. Se comprobó el crecimiento del tumor, la pérdida de peso y la motilidad general de los animales. Los ensayos se realizaron 3 semanas después de la inyección.
Para aleatorizar los ratones en función del volumen del tumor, excluyendo cualquier efecto del tamaño, se realizó una volumetría del tumor con un dispositivo de ultrasonidos de alta frecuencia Vevo 770, del modo previamente descrito (Hwang y otros, 2010; Zhao y otros, 2010). La máquina iba equipada con transductores de 25 MHz y 55 MHz, y con un motor 3D sobre un sistema de raíles para la adquisición automatizada de pilas 3D. La posición del transductor, los ajustes de ganancia y el enfoque del medio campo se optimizaron inicialmente y se mantuvieron a lo largo de cada ensayo. Los ratones se anestesiaron por inhalación de una mezcla de isoflurano al 1-2% (Baxter Healthcare, Deerfield, IL)/oxígeno gas y se pusieron sobre una plataforma calentada. El transductor se fijó con el sistema de raíles y se colocó centrado por encima el tumor. Las imágenes tridimensionales en modo B se obtuvieron mediante la traslación lineal del transductor controlada por ordenador en toda la longitud del tumor, tomando imágenes bidimensionales cada 100 jm para el análisis morfológico y la volumetría del tumor. La reconstrucción de las imágenes en 3D se realizó de automáticamente mediante el programa Vevo 770 (Visualsonics). En todos los tumores se apreciaron algunas áreas hipoecogénicas relacionadas con necrosis. Los volúmenes tumorales variaron entre 500 mm3 y 3500 mm3 (fig. 16A).
Estudios de biodistribución
El radiomarcado de la albúmina se realizó según el método IODOGEN (Pierce) (10, 50). Las actividades específicas de las fracciones de partículas unidas a I124 eluidas de las columnas PD-10 fueron de ~ 100-1.000 mCi/jm, evaluadas con un calibrador de dosis (Capintec) y radio-CCF. Las placas de CCF se revelaron con una mezcla de ácido acético/ metanol (80:20 v/v) y se secaron; la absorbancia se analizó con un lector de placas de CCF (Bioscan). Se encapsuló albúmina radiomarcada en los liposomas durante la etapa de hidratación. Después de hidratarlos durante 30 minutos y extruirlos 11 veces de a través de un filtro de policarbonato (100 nm de tamaño de poro), los liposomas se purificaron por elución a través de una columna de filtración en gel PD-10. Los liposomas radiomarcados se administraron por inyección en la vena caudal.
La biodistribución de los ratones tratados con liposomas de SM irradiados, comparada con la de los ratones tratados con liposomas de PC irradiados, se realizó a las 2 h. Se usó ABS radiomarcada como carga útil dentro de los liposomas (fig. 16B).
Irradiación de los tumores
Los animales se irradiaron con rayos X, sometiendo a la radiación sólo los tumores y las patas traseras de los ratones sedados y protegiendo el resto del cuerpo con plomo. La dosis administrada fue de 20 Gy. Las imágenes ópticas se tomaron inmediatamente después de la irradiación de los ratones.
Formación de imágenes de fluorescencia
Una vez purificados, se administraron liposomas que contenían el fluoróforo Alexa Fluor 680 mediante una inyección de 300 |jl de volumen en la vena caudal. Se obtuvieron imágenes de los ratones con una cámara de fluorescencia Maestro. Las imágenes se analizaron con el correspondiente programa Maestro. Las mediciones de la biodistribución se realizaron una hora después de las inyecciones del fluoróforo liposomal Alexa Fluor 680. Los órganos se lisaron, se suspendieron en 1 ml de PBS y se transfirieron a la placa de 24 pocillos. La fluorescencia se midió con un lector de placas Tecan Sapphire.
A fin de investigar más a fondo la posibilidad de usar liposomas que contengan SM para detectar daños celulares in vivo usamos ratones desnudos portadores de tumores PC-3 subcutáneos. Cada animal tenía dos tumores, uno a cada lado de la pata trasera.
Uno de los tumores se irradió con 20 Grays, mientras que el otro se protegió de la irradiación con un blindaje de plomo. Se estudió la capacidad de los liposomas de SM para descargar marcadores de imágenes mediante la obtención de imágenes ópticas de ratones desnudos irradiados que tenían tumores PC-3. A los ratones se les inyectaron liposomas que contenían Alexa 680, antes de irradiarlos con 20 Grays, y luego se tomaron las imágenes con la cámara Maestro. Hubo una orientación significativa del fluoróforo Alexa Fluor 680 hacia los tumores. Los tumores irradiados mostraron señales mucho más brillantes que los tumores no irradiados (16C). Las imágenes se tomaron inmediatamente después de la irradiación, es decir, 30 minutos después de la inyección de los liposomas (16D).
Para investigar en qué medida este fenómeno era debido al efecto de aumento de permeabilidad y retención (EPR) y a la fuga de la vasculatura después de la irradiación, comparamos los liposomas de SM con los liposomas de PC, que no deberían tener ninguna función de liberación activa o de direccionalidad. La secuencia de imágenes de irradiación se realizó del modo descrito. Las señales fluorescentes de los tumores irradiados fueron más intensas en el grupo que había recibido liposomas de SM que en el grupo que había recibido liposomas de PC, lo cual indica que las señales detectadas se generaron en gran parte por la activación de los liposomas de SM y no por acumulación inespecífica debido a la mejor permeabilidad vascular tras la irradiación (fig. 16C).
Para determinar si el impacto de la SMasa dependía del tiempo se tomaron repetidamente imágenes de los animales 1 h, 4 h y 24 h tras la inyección de los liposomas y la irradiación de un sitio tumoral según el protocolo descrito. Los datos mostraron las señales más altas en los primeros momentos, así como una eliminación constante en todos los ratones después de varias horas (fig. 16).
El análisis espectral y la cuantificación del Alexa 680 en los tumores indicó que había grandes y reveladoras diferencias de proporciones de Alexa 680 en los tumores, dependiendo de la irradiación del tumor y del tipo de liposoma utilizado como vehículo. Los liposomas que llevaban esfingomielina liberaron Alexa 680 a los tumores irradiados o no irradiados mucho mejor que los liposomas que sólo contenían PC (fig. 16).
Determinación de la fuente principal de SMasa mediante la formación de imágenes por fluorescencia Para investigar más a fondo la principal fuente celular de SMasa utilizamos ratones SCID con SMasa inactivada por carecer de la expresión de la SMasa. Cada animal tenía dos tumores, uno a cada lado de la pata trasera. Los ratones con la SMasa inactivada (fig. 17) se sometieron al mismo protocolo experimental. Solo se pudieron detectar señales débiles en cualquiera de los tumores.
El mecanismo de acción propuesto para nuestros liposomas consiste en que la SM de la capa lipídica se escindirá en ceramida al entrar en contacto con SMasa. Se ha comprobado que la ceramida, el producto de reacción de la SMasa, forma microdominios enriquecidos con ceramida en las membranas de fosfatidilcolina (PC), tanto en el estado líquido como de gel. Los dominios segregados tienen propiedades físicas muy diferentes de las de la membrana compuesta de fosfatidilcolina. Se ha sugerido que la segregación de ceramida es el resultado de un eficiente enlace de hidrógeno intermolecular entre los grupos de cabeza de este lípido. El grupo de cabeza de la ceramida también está débilmente hidratado, lo cual permite un estrecho empaquetamiento lateral en la membrana. Nuestros resultados están basados en nuestras observaciones anteriores, en que se inyectó SMasa en la superficie de la vesícula, lo cual dio lugar a la formación de dominios y a la gemación vectorial. La formación asimétrica de ceramida en una bicapa (es decir, en las valvas externas o internas) provocará una diferencia de área entre las dos monocapas. La ceramida también tiene tendencia a formar fases no laminares invertidas. La diferencia de área entre las monocapas adyacentes y la curvatura negativa espontánea de los dominios que contienen ceramida son características que deberían ser suficientes para aumentar la permeabilidad del liposoma en presencia de ceramidas.
Existen varias afecciones en las que interviene la SMasa, como por ejemplo en diversos tipos de células presentes en las lesiones ateroscleróticas que secretan SMasa, lo cual sugiere un posible papel de este enzima en el desarrollo de la aterosclerosis. Por consiguiente este dispositivo de obtención de imágenes y de orientación también se podría usar para la toma de imágenes diagnósticas y el tratamiento de estas enfermedades.
Aquí demostramos que es posible diseñar liposomas con contenido de SM que liberan su carga útil in vitro al entrar
en contacto con SMasa. Nuestro estudio demostró que las células PC-3 secretan SMasa de forma dependiente de la dosis cuando son irradiadas con 5 Gr hasta 30 Gr. También observamos que las células endoteliales HAoEK secretan SMasa de forma similar cuando se irradian. Por lo tanto, tanto las células endoteliales como las células cancerosas podrían ser la fuente de SMasa durante el estrés inducido por la irradiación (véanse las figuras 19-21). La fluorescencia en los liposomas tratados con SMasa respecto a los liposomas no tratados con SMasa aumenta aproximadamente el doble. Esto se debe a la liberación de Cy 5,5, que está autoapagado en los liposomas cuando se hallan en estrecho contacto entre sí a concentraciones elevadas. Además, la SMasa inactivada no aumentó la fluorescencia.
En todos los intervalos de tiempo de los ensayos in vivo de este estudio, el Alexa 680 libre se eliminó rápidamente de la circulación y solo fue detectable en la vejiga. Pero en el caso de la formulación liposomal hubo una clara orientación del Alexa 680 liposomal hacia los tumores. Esto era debido posiblemente a los efectos pasivos de EPR. No obstante hubo una clara tendencia a un aumento de la orientación del fluoróforo hacia los tumores irradiados en el caso de los liposomas que contenían SM, lo cual no se observó con los liposomas de PC o en el caso de los ratones con SMasa inactivada, incluso cuando se irradiaron los tumores. Esto sugiere que existen mecanismos específicos de SM para la liberación de la carga útil a los tumores. Cuando éstos se irradian, las dos posibles fuentes de secreción de SMasa son los vasos endoteliales de los tumores y las células tumorales. Sin embargo, según los resultados de los ratones modificados genéticamente, parece más probable que las células endoteliales sean la fuente principal de SMasa.
Los liposomas, las micelas y otras nanopartículas se pueden emplear como vehículo de trazadores de imágenes y los resultados de la formación de imágenes se pueden utilizar para desarrollar y optimizar los sistemas terapéuticos de administración de fármacos. Las aplicaciones de tales plataformas como vehículos para la administración selectiva se pueden ampliar mediante el acoplamiento de anticuerpos, péptidos y pequeñas moléculas específicas a la superficie del liposoma. En este caso hemos aportado funcionalidad a la formulación liposomal incluyendo SM en la formulación de los liposomas y usándola luego para liberar el contenido de los liposomas solo en presencia de células que expresen la SMasa fuera de las mismas. Así se puede lograr un perfil farmacodinámico más beneficioso de los medicamentos, de ADN/ARN o de péptidos potentes, comparado con los fármacos libres o con el sistema de administración liposomal sin SM. La disrupción de los liposomas provocada por la SMasa podría permitir la administración del fármaco antes de una radiación, con lo cual el fármaco se liberaría inmediatamente solo en el sitio irradiado, al producirse la radiación. Como la secreción de SMasa no se limita solo a la radiación, cabe la posibilidad de crear sistemas de administración autorregulados para otras afecciones, por ejemplo en el caso de tejidos apoptóticos o de inflamaciones.
Algunos productos liposomales ya han sido aprobados por la FDA para formulaciones intravenosas, lo cual debería facilitar el paso de los sistemas de nanoadministración a ensayos clínicos. Estos liposomas activados por apoptosis liposomal se pueden usar en la formación de imágenes ópticas de resonancia magnética, la administración selectiva de fármacos y la administración de genes. En un método teranóstico, la formación de imágenes se puede utilizar para evaluar primero las capacidades de administración de fármacos y luego los modos de tratamiento.
Claims (13)
1. Un sistema liposomal compuesto por:
(a) una primera capa que contiene esfingomielina o un derivado de la misma con cadenas laterales modificadas o acortadas;
(b) una segunda capa que contiene esfingomielina o un derivado de la misma con cadenas laterales modificadas o acortadas;
de manera que la primera y segunda capa forman un liposoma bicapa que define un compartimento interior hidrófilo y un compartimento bicapa hidrófobo;
(c) al menos un agente terapéutico en el compartimento interior hidrófilo o en el compartimento bicapa hidrófobo; y
(d) al menos un agente de formación de imágenes en el compartimento interior hidrófilo o en el compartimento bicapa hidrófobo, de manera que el agente de formación de imágenes es: (i) Cy 5,5 apagado, (ii) un segmento de ADN compuesto por una baliza de ADN que contiene un bucle en horquilla con un par de extinción de CY7-Dabcyl u otro par de extinción de fluoróforos, o (iii) gadolinio y deuterio (D2O).
2. Un sistema liposomal según la reivindicación 1, en el cual el agente terapéutico es un agente quimioterapéutico.
3. Un sistema liposomal según la reivindicación 1, en el cual el agente de formación de imágenes y el agente terapéutico se liberan del sistema liposomal después del contacto del sistema liposomal con SMasa.
4. Un sistema liposomal según la reivindicación 1 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
5. El sistema liposomal según la reivindicación 1, en el cual el agente de formación de imágenes no está apagado después del contacto del sistema liposomal con SMasa.
6. El sistema liposomal según la reivindicación 1, en el cual el agente de formación de imágenes no está apagado cuando se libera del sistema liposomal.
7. El sistema liposomal según la reivindicación 1, en el cual la primera y segunda capa contienen una mezcla de lípidos DSPC/colesterol/esfingomielina en relación molar 4/3/3.
8. Un método para administrar un agente terapéutico y un agente de formación de imágenes, que consiste en: poner en contacto un sistema liposomal según la reivindicación 1 con una muestra celular en condiciones in vitro, de manera que la SMasa presente en la muestra celular o liberada por ella es capaz de hidrolizar la esfingomielina en el sistema liposomal para liberar el agente terapéutico y el agente de formación de imágenes del sistema liposomal.
9. El método según la reivindicación 8, que además que consiste en medir una señal generada por el agente de formación de imágenes.
10. El método según la reivindicación 9, en el cual la señal generada por el agente de formación de imágenes se utiliza para controlar la actividad de la SMasa en la muestra celular.
11. El método según la reivindicación 9, en el cual la señal generada por el agente de formación de imágenes se utiliza para determinar respuesta al estrés en la muestra celular.
12. El método según la reivindicación 8, que además que consiste en medir una señal generada por el agente de formación de imágenes como lectura de la liberación del agente terapéutico.
13. El método según la reivindicación 8, en el cual el agente terapéutico es un agente quimioterapéutico.
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