ES2820454T3 - Membranas de cromatografía de interacción hidrófoba - Google Patents
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Abstract
Material compuesto, que comprende: un elemento de soporte, que comprende una pluralidad de poros que se extienden a través del elemento de soporte; y un gel reticulado macroporoso, que comprende una pluralidad de macroporos, y una pluralidad de restos hidrófobos colgantes; en el que el gel reticulado macroporoso se ubica en los poros del elemento de soporte; y el diámetro de poro promedio de los macroporos es menor que el diámetro de poro promedio de los poros, caracterizado porque el gel reticulado macroporoso comprende un polímero formado a través de la reacción in situ de un primer monómero y un segundo monómero y un agente de reticulación; y el primer monómero tiene un valor de log P (octanol-agua) de desde 1 hasta 7; y el segundo monómero tiene un valor de log P (octanolagua) de desde -1 hasta 1; y en el que el primer monómero es acrilato de etilo, metacrilato de metilo, acrilato de fenilo, acrilato de n-butilo, metacrilato de n-butilo, acrilato de n-hexilo, acrilato de 2-etilhexilo, acrilato de n-octilo, acrilato de n-decilo, acrilato de laurilo o metacrilato de laurilo; y el segundo monómero es acrilamida, N-vinil-2-pirrolidinona, metacrilato de 2-hidroxietilo, acrilato de metilo o metacrilato de glicidilo; y en el que el agente de reticulación es trimetacrilato de trimetilolpropano.
Description
DESCRIPCIÓN
Membranas de cromatografía de interacción hidrófoba
Antecedentes de la invención
La hidrofobicidad se define generalmente como la repulsión entre un compuesto no polar y un entorno polar, tal como el agua. Las “interacciones” hidrófobas son esencialmente la manifestación física de la tendencia de un entorno polar a excluir compuestos hidrófobos (es decir, no polares), forzando la agregación de los compuestos hidrófobos. El fenómeno de las interacciones hidrófobas puede aplicarse a la separación de proteínas usando una disolución acuosa de sales para forzar a una proteína hidrófoba a agregarse o unirse de manera adsortiva a grupos funcionales hidrófobos fijados a un soporte sólido. Las proteínas adsorbidas se liberan del adsorbente por elución con concentraciones de sal decrecientes, contrarrestando eficazmente el entorno que promovió las interacciones hidrófobas y conduciendo a la pérdida de interacciones hidrófobas entre las proteínas y el soporte. Las proteínas se liberan del soporte en orden de hidrofobicidad creciente (es decir, las proteínas menos hidrófobas se liberan en primer lugar). La cromatografía de interacción hidrófoba (CIH) puede distinguir de la cromatografía de fase inversa en que se usan sales durante la etapa de elución de CIH.
Esencialmente, la cromatografía de interacción hidrófoba es un método para separar biomoléculas basándose en las fuerzas relativas de sus interacciones hidrófobas con un adsorbente hidrófobo. En general, la CIH es una técnica selectiva. La CIH es suficientemente sensible para estar influenciada por grupos no polares normalmente enterrados dentro de la estructura terciaria de proteínas, pero expuestos si la cadena polipeptídica se pliega de manera incorrecta o se daña (por ejemplo, por una proteasa). Esta sensibilidad puede ser útil para separar una proteína correctamente plegada o no dañada de otras formas.
La cromatografía de interacción hidrófoba es también un método muy suave de separación y purificación. El daño estructural a una biomolécula purificada es mínimo, debido en parte a la influencia de estabilización de las sales y también a la interacción bastante débil con la matriz. No obstante, las recuperaciones de material purificado suelen ser elevadas. Por tanto, la CIH combina las características no desnaturalizantes de la precipitación de sales con la precisión de la cromatografía para producir excelentes recuperaciones de actividad.
Por tanto, la CIH es una técnica de cromatografía de líquidos versátil, y debería verse como un componente potencial de cualquier estrategia de purificación, a menudo en combinación con cromatografía de intercambio iónico y filtración en gel. También se ha encontrado que la CIH usa una herramienta analítica en la detección de cambios conformacionales de proteínas. La CIH requiere un mínimo de pretratamiento de la muestra y, por tanto, puede usarse de manera eficaz en combinación con técnicas de precipitación de proteínas tradicionales. La unión de proteínas a adsorbentes de CIH se promueve mediante concentraciones moderadamente altas de sales anticaotrópicas, que pueden tener una influencia de estabilización sobre la estructura de la proteína.
La mayoría de las matrices de CIH disponibles comercialmente están en forma de resinas. Si bien las resinas muestran altas capacidades de unión para diversas moléculas biológicas, los procedimientos de CIH que usan resinas sufren de incrustaciones y bajas capacidades de flujo. Por el contrario, las matrices de cromatografía en forma de membranas presentan capacidades de flujo aumentadas en comparación con sus homólogos de resina. Por tanto, existe la necesidad de una matriz de CIH basada en membranas con alta capacidad de unión para lograr la eficiencia de separación de una resina combinada con los beneficios del procedimiento de una membrana.
Breve sumario de la invención
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a un material compuesto, que comprende:
un elemento de soporte, que comprende una pluralidad de poros que se extienden a través del elemento de soporte; y
un gel reticulado macroporoso, que comprende una pluralidad de macroporos, y una pluralidad de restos hidrófobos colgantes;
en el que el gel reticulado macroporoso se ubica en los poros del elemento de soporte; y el diámetro de poro promedio de los macroporos es menor que el diámetro de poro promedio de los poros, en el que el gel reticulado macroporoso comprende un polímero formado a través de la reacción in situ de un primer monómero y un segundo monómero y un agente de reticulación; y el primer monómero tiene un valor de log P (octanol-agua) de desde 1 hasta 7; y el segundo monómero tiene un valor de log P (octanol-agua) de desde -1 hasta 1; y en el que el primer monómero es acrilato de etilo, metacrilato de metilo, acrilato de fenilo, acrilato de n-butilo, metacrilato de n-butilo, acrilato de n-hexilo, acrilato de 2-etilhexilo, acrilato de n-octilo, acrilato de n-decilo, acrilato de laurilo o metacrilato de laurilo; y el segundo monómero es acrilamida, N-vinil-2-pirrolidinona, metacrilato de 2-hidroxietilo, acrilato de metilo o metacrilato de glicidilo; y en el que el el agente de reticulación es trimetacrilato de trimetilolpropano.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los materiales compuestos mencionados anteriormente, en los que los restos hidrófobos colgantes son grupos etilo, butilo, hexilo, 2-etilhexilo, dodecilo,
estearilo, hidroxipropilo, fenilo, éter o poli(propilenglicol).
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los materiales compuestos mencionados anteriormente, en los que el material compuesto es una membrana.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a un método de elaboración del material compuesto de la invención, que comprende las etapas de:
combinar el primer monómero, el segundo monómero, un fotoiniciador, el agente de reticulación y un disolvente, formando así una mezcla monomérica;
poner en contacto un elemento de soporte con la mezcla monomérica, formando así un elemento de soporte modificado; en el que el elemento de soporte comprende una pluralidad de poros que se extienden a través del elemento de soporte, y el diámetro de poro promedio de los poros es de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 25 |im;
cubrir el elemento de soporte modificado con una lámina polimérica, formando así un elemento de soporte cubierto; e
irradiar el elemento de soporte cubierto durante un periodo de tiempo, formando así un material compuesto.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 representa de manera gráfica la relación entre (i) la razón (C/C0) de la concentración de lisozima en el permeado (C) con respecto a la concentración de lisozima en la muestra inicial (C0) y (ii) la capacidad de unión a lisozima (mg/mlmembrana) para tres membranas de CIH con restos hidrófobos colgantes diferentes.
La figura 2 representa de manera gráfica la relación entre (i) la razón (C/C0) de la concentración de lisozima en el permeado (C) con respecto a la concentración de lisozima en la muestra inicial (C0) y (ii) la capacidad de unión a lisozima (mg/mlmembrana) para tres membranas de CIH con restos colgantes butilo y niveles variables de hidrofobicidad de matriz de gel.
La figura 3 tabula las capacidades de unión (mg/mlgel/membrana) (10% de ruptura) para lisozima y un AcM de: dos resinas de CIH comerciales (TOSOH Bioscience); dos membranas de CIH comerciales (Butyl Sepharose 4 Fast Flow y Sartobind Phenyl); y dos membranas de CIH (butilo y fenilo) de la presente invención.
La figura 4 representa la separación de mioglobina (1), lisozima (2) y a-quimotripsinógeno A (3) mediante cromatografía de interacción hidrófoba. Las proteínas se eluyeron usando un cambio de gradiente de tampón desde tampón A hasta tampón B tal como se indica (línea gris, eje de ordenadas derecho) en una membrana de poli(AAmco-VP-co-BuMe) preparada tal como se describe en el ejemplo 5. Los picos se asignan basándose en los datos de captura/elución individuales de la tabla 2.
La figura 5 tabula un sumario de diversos materiales compuestos de la invención y diversas características de rendimiento. En esta tabla, EGDMA es dimetacrilato de etilenglicol y EGPhA es acrilato de fenil éter de etilenglicol. Descripción detallada de la invención
Resumen
La invención es tal como se establece en las reivindicaciones.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a un material compuesto que comprende un gel macroporoso dentro de un elemento de soporte poroso. Los materiales compuestos son adecuados para la retirada o purificación y recuperación de solutos hidrófobos, tales como proteínas y otras biomoléculas, a través de procedimientos de adsorción/desorción. En determinadas realizaciones, la invención se refiere a un material compuesto que es simple y económico de producir.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a la purificación o separación de biomoléculas basándose en las diferencias en la hidrofobicidad de superficie. En determinadas realizaciones, las biomoléculas pueden purificarse de manera selectiva en una única etapa. En determinadas realizaciones, los materiales compuestos demuestran un rendimiento excepcional en comparación con las resinas o membranas de CIH disponibles comercialmente. En determinadas realizaciones, los materiales compuestos demuestran un rendimiento comparable a velocidades de flujo mayores que pueden lograrse con resinas de CIH disponibles comercialmente.
Diversas características de los materiales compuestos a modo de ejemplo
Composición de los geles macroporosos
En determinadas realizaciones, los geles macroporosos pueden formarse a través de la reacción in situ de uno o
más monómeros polimerizables con uno o más agentes reticulantes. En determinadas realizaciones, los geles macroporosos pueden formarse a través de la reacción de uno o más polímeros reticulables con uno o más agentes reticulantes. En determinadas realizaciones, puede formarse un gel reticulado que tiene macroporos de un tamaño adecuado.
El gel macroporoso puede seleccionarse para comprender monómeros hidrófobos. Pueden usarse copolímeros de estos monómeros. Un gel macroporoso que comprende monómeros hidrófobos puede usarse para capturar moléculas de fluidos que pasan a través de los poros mediante interacciones hidrófobas. En determinadas realizaciones, el gel reticulado macroporoso comprende una pluralidad de restos hidrófobos colgantes seleccionados del grupo que consiste en grupos alquilo, alquenilo, arilo, aralquilo, alcarilo y aralcoxilo. En determinadas realizaciones, la porción alquílica puede tener 1-20 átomos de carbono, a los que pueden unirse grupos del tipo hidroxilo o halógeno. En determinadas realizaciones, los grupos alquilo pueden ser ramificados. En determinadas realizaciones, el grupo funcional alquilo ramificado puede tener desde 3 hasta 8 átomos de carbono. En determinadas realizaciones, el grupo funcional alquilo ramificado puede contener un átomo de carbono secundario, un carbono terciario o un carbono neo. En determinadas realizaciones, el grupo funcional alquilo ramificado puede seleccionarse del grupo que consiste en sec-butilo, terc-butilo, terc-pentilo, terc-hexilo y neopentilo. En determinadas realizaciones, el grupo alquilo puede tener desde 3 hasta 8 átomos de carbono. En determinadas realizaciones, el grupo alquilo puede tener más de 8 átomos de carbono. En determinadas realizaciones, el grupo alquilo puede tener más de 8 átomos de carbono y el material compuesto todavía puede ser un medio de cromatografía de interacción hidrófoba eficaz. Este resultado es contrario a al menos una referencia lo que implica que los materiales que tienen grupos colgantes más largos de Ce serán ineficaces como medios de CIH, y funcionarán como medios de cromatografía de fase inversa. Hydrophobic Interaction Chromatography: Principles and Methods; Amersham Pharmacia Biotech AB: Uppsala, Suecia, 2000. En determinadas realizaciones, los grupos arilo pueden ser fenilo o naftilo, opcionalmente sustituidos con uno o más grupos nitro, átomos de halógeno o grupos alquilo. En determinadas realizaciones, el resto hidrófobo colgante puede ser un grupo acilo, tal como alcanoílo o aroílo, que puede contener 2-20 átomos de carbono y puede sustituirse con uno o más átomos de halógeno, grupos nitro o hidroxilo. En determinadas realizaciones, el resto hidrófobo colgante puede ser un grupo aroílo, tal como benzoílo, clorbenzoílo, naftoílo o nitrobenzoílo.
En determinadas realizaciones, los monómeros adecuados pueden seleccionarse basándose en sus coeficientes de reparto. Un coeficiente de reparto (valor de log P) es la razón de las concentraciones de equilibrio de un compuesto no ionizado entre dos disolventes inmiscibles. Dicho de otro modo, los coeficientes son una estimación de la solubilidad diferencial del compuesto entre los dos disolventes. En determinadas realizaciones, una parte de los monómeros usados en la preparación de los materiales compuestos de la invención son hidrófobos. Por ejemplo, el acrilato de etilo tiene un log P estimado (octanol-agua) de aproximadamente 1,2, el acrilato de fenilo tiene un log P estimado (octanol-agua) de aproximadamente 1,9 y el metacrilato de laurilo tiene un log P estimado (octanol-agua) de aproximadamente 6,7. En la presente invención, un primer monómero se copolimeriza con un segundo monómero, en el que el primer monómero tiene un valor de log P (octanol-agua) de desde 1 hasta 7; y el segundo monómero tiene un valor de log P (octanol-agua) de desde -1 hasta 1. En determinadas realizaciones, la razón molar de primer monómero con respecto a segundo monómero puede ser de desde aproximadamente 0,01:1 hasta aproximadamente 1:1. En determinadas realizaciones, la razón molar de primer monómero con respecto a segundo monómero puede ser de desde aproximadamente 0,05:1 hasta aproximadamente 0,5:1. En determinadas realizaciones, la razón molar de primer monómero con respecto a segundo monómero puede ser aproximadamente 0,1:1, aproximadamente 0,15:1 o aproximadamente 0,20:1. Los monómeros y sus valores de log P estimados (octanol-agua) se proporcionan en la tabla 1.
Tabla 1. Valores de log P estimados (octanol-agua) de diversos monómeros
En determinadas realizaciones, el monómero puede comprender un grupo funcional reactivo. En determinadas realizaciones, el grupo funcional reactivo del monómero puede hacerse reaccionar con cualquiera de una variedad de ligandos específicos. En determinadas realizaciones, el grupo funcional reactivo del monómero puede hacerse reaccionar con un resto hidrófobo. En determinadas realizaciones, esta técnica permite el control parcial o completo de la densidad de ligandos o el tamaño de poro. En determinadas realizaciones, la funcionalización del monómero con un resto hidrófobo confiere un carácter hidrófobo adicional al gel resultante. En determinadas realizaciones, el grupo funcional reactivo del monómero puede funcionalizarse antes de la reacción de formación de gel. En determinadas realizaciones, el grupo funcional reactivo del monómero puede funcionalizarse posteriormente a la reacción de formación de gel. Por ejemplo, si el monómero es metacrilato de glicidilo, la funcionalidad epóxido del monómero puede hacerse reaccionar con butilamina para introducir funcionalidad butilo en el polímero resultante. En determinadas realizaciones, pueden funcionalizarse adicionalmente monómeros, tales como metacrilato de glicidilo. En determinadas realizaciones, si se usa esta técnica, no se identifican monómeros adecuados por sus valores de log P, sino por la hidrofobicidad general del polímero resultante después de la funcionalización.
El agente de reticulación es trimetacrilato de trimetilolpropano.
En determinadas realizaciones, el tamaño de los macroporos en el gel resultante aumenta a medida que aumenta la concentración de agente de reticulación. Por ejemplo, la razón molar de agente de reticulación con respecto a monómero(s) puede estar en el intervalo de desde aproximadamente 5:95 hasta aproximadamente 70:30, en el intervalo de desde aproximadamente 10:90 hasta aproximadamente 50:50, o en el intervalo de desde aproximadamente 15:85 hasta aproximadamente 45:55. En determinadas realizaciones, la razón molar de agente de reticulación con respecto monómero(s) puede ser de aproximadamente el 10%, aproximadamente el 11%, aproximadamente el 12%, aproximadamente el 13%, aproximadamente el 14%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 16%, aproximadamente el 17%, aproximadamente el 18%, aproximadamente el 19%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 21%, aproximadamente el 22%, aproximadamente el 23%, aproximadamente el 24% o aproximadamente el 25%.
En determinadas realizaciones, las propiedades de los materiales compuestos pueden ponerse a punto ajustando el diámetro de poro promedio del gel macroporoso. El tamaño de los macroporos depende generalmente de la naturaleza y concentración del agente de reticulación, la naturaleza del disolvente o disolventes en los que se forma el gel, la cantidad de cualquier iniciador o catalizador de polimerización y, si está presente, la naturaleza y concentración de porógeno. En determinadas realizaciones, el material compuesto puede tener una distribución de tamaño de poro estrecha.
Elemento de soporte poroso
En algunas realizaciones, el elemento de soporte poroso se elabora de material polimérico y contiene poros de
tamaño promedio entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 25 |im, y una porosidad volumétrica entre aproximadamente el 40% y aproximadamente el 90%. Muchos sustratos o membranas porosos pueden usarse como elemento de soporte, pero el soporte puede ser un material polimérico. En determinadas realizaciones, el soporte puede ser una poliolefina, que está disponible a bajo coste. En determinadas realizaciones, la poliolefina puede ser poli(etileno), poli(propileno) o poli(difluoruro de vinilideno). Se mencionan las membranas de poliolefina extendidas elaboradas mediante separación de fases inducida térmicamente (SFIT) o separación de fases inducida sin disolventes. En determinadas realizaciones, el elemento de soporte puede elaborarse a partir de polímeros naturales, tales como celulosa o sus derivados. En determinadas realizaciones, los soportes adecuados incluyen membranas de polietersulfona, membranas de poli(tetrafluoroetileno), membranas de nailon, membranas de éster de celulosa o papeles de filtro.
En determinadas realizaciones, el soporte poroso se compone de material fibroso tejido o no tejido, por ejemplo, una poliolefina tal como polipropileno. Tales elementos de soporte tejidos o no tejidos fibrosos pueden tener tamaños de poro mayores que los elementos de soporte de SFIT, en algunos casos de hasta aproximadamente 75 |im. Los poros más grandes en el elemento de soporte permiten la formación de materiales compuestos que tienen macroporos más grandes en el gel macroporoso. También pueden usarse elementos de soporte no poliméricos, tales como soportes basados en cerámica. El elemento de soporte poroso puede tomar diversas conformaciones y tamaños.
En algunas realizaciones, el elemento de soporte está en forma de una membrana que tiene un grosor de desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 2000 |im, desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 1000 |im o desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 500 |im. En otras realizaciones, pueden combinarse múltiples unidades de soporte porosas, por ejemplo, mediante apilado. En una realización, una pila de membranas de soporte porosas, por ejemplo, desde 2 hasta 10 membranas, puede ensamblarse antes de que se forme el gel macroporoso dentro del hueco del soporte poroso. En otra realización, se usan unidades de elemento de soporte únicas para formar las membranas de material compuesto, que se apilan antes de su uso.
Relación entre el gel macroporoso y el elemento de soporte
El gel macroporoso puede anclarse dentro del elemento de soporte. El término “anclado” se pretende que signifique que el gel se mantiene dentro de los poros del elemento de soporte, pero el término no se restringe necesariamente a significar que el gel se une químicamente a los poros del elemento de soporte. El gel puede mantenerse por la restricción física impuesta al enredarse y entrelazarse con elementos estructurales del elemento de soporte, sin injertarse químicamente de manera real en el elemento de soporte, aunque en algunas realizaciones, el gel macroporoso puede injertarse en la superficie de los poros del elemento de soporte.
Debido a que los macroporos están presentes en el gel que ocupa los poros del elemento de soporte, los macroporos del gel deben ser más pequeños que los poros del elemento de soporte. Por consiguiente, las características de flujo y características de separación del material compuesto dependen de las características del gel macroporoso, pero son en gran medida independientes de las características del elemento de soporte poroso, con la condición de que el tamaño de los poros presentes en el elemento de soporte sea mayor que el tamaño de los macroporos del gel. La porosidad del material compuesto puede adaptarse llenando el elemento de soporte con un gel cuya porosidad está determinada parcial o completamente por la naturaleza y cantidades de monómero o polímero, agente de reticulación, disolvente de reacción y porógeno, si se usa. Como los poros del elemento de soporte se llenan con el mismo material de gel macroporoso, se logra un alto grado de coherencia en las propiedades del material compuesto, y para un elemento de soporte particular estas propiedades están determinadas parcialmente, si no completamente, por las propiedades del gel macroporoso. El resultado neto es que la invención proporciona control sobre el tamaño de los microporos, la permeabilidad y el área superficial de los materiales compuestos.
El número de macroporos en el material compuesto no está determinado por el número de poros en el material de soporte. El número de macroporos en el material compuesto puede ser mayor que el número de poros en el elemento de soporte porque los macroporos son más pequeños que los poros en el elemento de soporte. Tal como se mencionó anteriormente, el efecto del tamaño de los poros del soporte material sobre el tamaño de los poros del gel macroporoso es generalmente insignificante. Se encuentra una excepción en los casos en los que el elemento de soporte tiene una gran diferencia en el tamaño de los poros y la distribución de tamaño de poro, y en los que se busca un gel macroporoso que tiene tamaños de los poros muy pequeños y un intervalo estrecho en la distribución de tamaño de poro. En estos casos, grandes variaciones en la distribución de tamaño de poro del elemento de soporte se reflejan de manera débil en la distribución de tamaño de poro del gel macroporoso. En determinadas realizaciones, un elemento de soporte con un intervalo de tamaño de los poros algo estrecho puede usarse en estas situaciones.
Preparación de materiales compuestos
En determinadas realizaciones, los materiales compuestos de la invención pueden prepararse mediante métodos de una única etapa. En determinadas realizaciones, estos métodos pueden usar agua u otros disolventes respetuosos con el medio ambiente como disolvente de reacción. En determinadas realizaciones, los métodos pueden ser
rápidos y, por tanto, pueden conducir a procedimientos de fabricación más rápidos.
En determinadas realizaciones, los materiales compuestos de la invención pueden prepararse mezclando uno o más monómeros, uno o más agentes de reticulación, uno o más iniciadores, y opcionalmente uno o más porógenos, en uno o más disolventes adecuados.
El método de la invención para elaborar el material compuesto comprende las etapas de: combinar el primer monómero, el segundo monómero, un fotoiniciador, el agente de reticulación y un disolvente, formando así una mezcla monomérica;
poner en contacto un elemento de soporte con la mezcla monomérica, formando así un elemento de soporte modificado; en el que el elemento de soporte comprende una pluralidad de poros que se extienden a través del elemento de soporte, y el diámetro de poro promedio de los poros es de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 25 |im;
cubrir el elemento de soporte modificado con una lámina polimérica, formando así un elemento de soporte cubierto; e
irradiar el elemento de soporte cubierto durante un periodo de tiempo, formando así un material compuesto.
En determinadas realizaciones, la mezcla resultante puede ser homogénea. En determinadas realizaciones, la mezcla puede ser heterogénea. En determinadas realizaciones, la mezcla puede introducirse luego en un soporte poroso adecuado, en el que puede tener lugar una reacción de formación de gel.
En determinadas realizaciones, los disolventes adecuados para la reacción de formación de gel incluyen 1,3-butanodiol, propil éter de di(propilenglicol), N,N-dimetilacetamida, acetato de metil éter de di(propilenglicol) (DPMA), agua, dioxano, dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), acetona, etanol, N-metilpirrolidona (NMP), tetrahidrofurano (THF), acetato de etilo, acetonitrilo, tolueno, xilenos, hexano, N-metilacetamida, propanol, metanol, o mezclas de los mismos. En determinadas realizaciones, pueden usarse disolventes que tengan un punto de ebullición mayor, ya que estos disolventes reducen la inflamabilidad y facilitan la fabricación. En determinadas realizaciones, pueden usarse disolventes que tengan una baja toxicidad, de manera que puedan eliminarse fácilmente después de su uso. Un ejemplo de un disolvente de este tipo es monometil éter de dipropilenglicol (DPM). En determinadas realizaciones, un porógeno puede añadirse a la mezcla de reactantes, en las que los porógenos pueden describirse de manera amplia como aditivos que generan poros. En determinadas realizaciones, el porógeno puede seleccionarse del grupo que consiste en disolventes malos termodinámicamente y polímeros extraíbles, por ejemplo, poli(etilenglicol), tensioactivos y sales.
En algunas realizaciones, los componentes de la reacción de formación de gel reaccionan de manera espontánea a temperatura ambiente para formar el gel macroporoso. En otras realizaciones, debe iniciarse la reacción de formación de gel. En determinadas realizaciones, la reacción de formación de gel puede iniciarse mediante cualquier método conocido, por ejemplo, a través de activación térmica o radiación UV. En determinadas realizaciones, la reacción puede iniciarse mediante radiación UV en presencia de un fotoiniciador. En determinadas realizaciones, el fotoiniciador puede seleccionarse del grupo que consiste en 2-hidroxi-1-[4-2(hidroxietoxi)fenil]-2-metil-1-propanona (Irgacure® 2959), 2,2-dimetoxi-2-fenilacetofenona (DMPA), benzofenona, benzoína y éteres de benzoína, tales como etil éter de benzoína y metil éter de benzoína, dialcoxiacetofenonas, hidroxialquilfenonas y ésteres sulfónicos de a-hidroximetilbenzoína. La activación térmica puede requerir la adición de un iniciador térmico. En determinadas realizaciones, el iniciador térmico puede seleccionarse del grupo que consiste en 1,1'-azobis(ciclohexanocarbonitrilo) (catalizador VAZO® 88), azobis(isobutironitrilo) (AIBN), persulfato de potasio, persulfato de amonio y peróxido de benzoílo.
En determinadas realizaciones, la reacción de formación de gel puede iniciarse por radiación UV. En determinadas realizaciones, un fotoiniciador puede añadirse a los reactantes de la reacción de formación de gel, y el elemento de soporte que contiene la mezcla de monómero, agente de reticulación y fotoiniciador puede exponerse a radiación UV a longitudes de onda de desde aproximadamente 250 nm hasta aproximadamente 400 nm durante un periodo de unos pocos segundos a unas pocas horas. En determinadas realizaciones, el elemento de soporte que contiene la mezcla de monómero, agente de reticulación y fotoiniciador puede exponerse a radiación UV a aproximadamente 350 nm durante un periodo de unos pocos segundos a unas pocas horas. En determinadas realizaciones, el elemento de soporte que contiene la mezcla de monómero, agente de reticulación y fotoiniciador puede exponerse a radiación UV a aproximadamente 350 nm durante aproximadamente 10 minutos. En determinadas realizaciones, puede usarse luz de longitud de onda visible para iniciar la polimerización. En determinadas realizaciones, el elemento de soporte debe tener una baja absorbancia a la longitud de onda usada de manera que la energía pueda transmitirse a través del elemento de soporte.
En determinadas realizaciones, la velocidad a la que se lleva a cabo la polimerización puede tener un efecto sobre el tamaño de los macroporos obtenidos en el gel macroporoso. En determinadas realizaciones, cuando la concentración de agente reticulante en un gel se aumenta hasta una concentración suficiente, los constituyentes del gel empiezan a agregarse para producir regiones de alta densidad de polímeros y regiones con pocos o sin
polímeros, cuyas últimas regiones se denominan “macroporos” en la presente memoria descriptiva. este mecanismo está afectado por la velocidad de polimerización. En determinadas realizaciones, la polimerización puede llevarse a cabo de manera lenta, tal como cuando se usa una intensidad de luz baja en la fotopolimerización. En este caso, la agregación de los constituyentes del gel necesita más tiempo para tener lugar, lo que conduce a poros más grandes en el gel. En determinadas realizaciones, la polimerización puede llevarse a cabo a una velocidad alta, tal como cuando se usa una fuente de luz de intensidad alta. En este caso, puede haber menos tiempo disponible para la agregación y se producen poros más pequeños.
En determinadas realizaciones, una vez que se preparan los materiales compuestos, pueden lavarse con diversos disolventes para eliminar cualquier componente sin reaccionar y cualquier polímero u oligómeros que no estén anclados dentro del soporte. En determinadas realizaciones, los disolventes adecuados para el lavado del material compuesto incluyen agua, acetona, metanol, etanol y DMF.
Usos a modo de ejemplo de los materiales compuestos
Se da a conocer y no según la invención reivindicada un método, en el que se hace pasar un fluido a través de los macroporos del gel reticulado macroporoso de uno cualquiera de los materiales compuestos mencionados anteriormente. Adaptando las condiciones para el fraccionamiento, puede obtenerse buena selectividad, incluso para sustancias del mismo tamaño.
Se da a conocer y no según la invención reivindicada un método de separación de biomoléculas, tales como proteínas o inmunoglobulinas, a partir de la disolución basándose en las interacciones específicas que las biomoléculas tienen con los materiales compuestos. Se da a conocer y no según la invención reivindicada un método de purificación de biomoléculas tales como proteínas o inmunoglobulinas. Se da a conocer y no según la invención reivindicada un método de purificación de proteínas o anticuerpos monoclonales con alta selectividad. Se da a conocer y no según la invención reivindicada un método, en el que la molécula biológica o el ion biológico retiene su estructura terciaria o cuaternaria, que puede ser importante en la retención de la actividad biológica. Las moléculas biológicas o iones biológicos que pueden separarse o purificarse incluyen proteínas tales como albúminas, por ejemplo, albúmina sérica bovina y lisozima. Las moléculas biológicas o los iones biológicos que pueden separarse incluyen y-globulinas de orígenes humanos y animales, inmunoglobulinas tales como IgG, IgM o IgE de orígenes humanos y animales, proteínas de origen recombinante y natural que incluyen proteína A, fitocromo, proteasa halófila, poli(3-hidroxibutirato) despolimerasa, aculaecin-A acilasa, polipéptidos de origen sintético y natural, interleucina 2 y su receptor, enzimas tales como fosfatasa, deshidrogenasa, ribonucleasa A, etc., anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos, tripsina y su inhibidor, albúminas de orígenes variables, por ejemplo, alactoalbúmina, albúmina sérica humana, albúmina de huevo de gallina, ovoalbúmina, etc., citocromo C, inmunoglobulinas, mioglobulina, interleucina humana recombinante, proteína de fusión recombinante, productos derivados de ácidos nucleicos, ADN y ARN de origen sintético y natural, plásmidos de ADN, lectina, aquimotripsinógeno, y productos naturales incluyendo moléculas pequeñas. Se da a conocer y no según la invención reivindicada un método de recuperación de un fragmento de anticuerpo a partir de variantes, impurezas o contaminantes asociados con el mismo. La separación o purificación de biomoléculas puede producirse sustancialmente en los macroporos del gel reticulado macroporoso.
Se da a conocer y no según la invención reivindicada un método de adsorción reversible de una sustancia. Una sustancia adsorbida puede liberarse cambiando el líquido que fluye a través del gel macroporoso. La captación y liberación de sustancias puede controlarse por variaciones en la composición del gel reticulado macroporoso.
Se da a conocer y no según la invención reivindicada un método, en el que la sustancia puede aplicarse al material compuesto a partir de una disolución tamponada. El tampón puede ser fosfato de sodio. La concentración del tampón puede ser de aproximadamente 25 mM, aproximadamente 50 mM, aproximadamente 0,1 M, o aproximadamente 0,2 M. El pH de la disolución tamponada puede ser de aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6 , aproximadamente 7, aproximadamente 8 o aproximadamente 9.
Se da a conocer y no según la invención reivindicada un método, en el que la sustancia puede eluirse usando concentraciones variables de disoluciones acuosas de sales. La sal puede eluirse del grupo que consiste en (NH4)2SO4, K2SO4, clorhidrato de glicina, fosfato, ácido cítrico, citrato de sodio, NaCl, Na2SO4, NaPO4, acetato de sodio, y NH4CL La concentración de sales puede oscilar desde aproximadamente 3,0 M hasta aproximadamente 0,2 M. La concentración de sales puede ser de aproximadamente 3,0 M, aproximadamente 2,8 M, aproximadamente 2,6 M, aproximadamente 2,4 M, aproximadamente 2,2 M, aproximadamente 2,0 M, aproximadamente 1,8 M, aproximadamente 1,6 M, aproximadamente 1,4 M, aproximadamente 1,2 M, aproximadamente 1,0 M, aproximadamente 0,8 M, aproximadamente 0,6 M, aproximadamente 0,4 M, o aproximadamente 0,2 M.
Se da a conocer y no según la invención reivindicada un método que presenta altas capacidades de unión. Se da a conocer y no según la invención reivindicada un método que presenta capacidades de unión de aproximadamente 10 mg/mlmembrana, aproximadamente 15 mg/mlmembrana, aproximadamente 20 mg/mlmembrana, aproximadamente 25 mg/mlmembrana, aproximadamente 30 mg/mlmembrana, aproximadamente 35 mg/mlmembrana, aproximadamente 40 mg/mlmembrana, aproximadamente 45, mg/mlmembrana, o aproximadamente 50 mg/mlmembrana al 10% de ruptura.
Los métodos pueden dar como resultado capacidades de unión comparables a o mayores que las notificadas con el uso de resinas de CIH convencionales. Sin embargo, los métodos pueden ejecutarse a velocidades de flujo significativamente mayores, debido al flujo convectivo, que las velocidades de flujo logradas en métodos que usan resinas de CIH. Los métodos pueden no sufrir de pérdidas de presión problemáticas asociadas con métodos que usan resinas de CIH. Los métodos también pueden permitir capacidades de unión mayores que las notificadas para membranas de CIH disponibles comercialmente (véase, por ejemplo, la figura 3).
La velocidad de flujo durante la unión (la primera velocidad de flujo) puede ser de desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 10 ml/min. La velocidad de flujo durante elución (la segunda velocidad de flujo) puede ser de desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 10 ml/min. La primera velocidad de flujo o la segunda velocidad de flujo puede ser de aproximadamente 0,1 ml/min, aproximadamente 0,5 ml/min, aproximadamente 1.0 ml/min, aproximadamente 1,5 ml/min, aproximadamente 2,0 ml/min, aproximadamente 2,5 ml/min, aproximadamente 3,0 ml/min, aproximadamente 4,0 ml/min, aproximadamente 4,5 ml/min, aproximadamente 5.0 ml/min, aproximadamente 5,5 ml/min, aproximadamente 6,0 ml/min, aproximadamente 6,5 ml/min, aproximadamente 7,0 ml/min, aproximadamente 7,5 ml/min, aproximadamente 8,0 ml/min, aproximadamente 8,5 ml/min, aproximadamente 9,0 ml/min, aproximadamente 9,5 ml/min, o aproximadamente 10,0 ml/min. La primera velocidad de flujo o la segunda velocidad de flujo puede ser desde aproximadamente 0,5 ml/min hasta aproximadamente 5,0 ml/min.
El flujo de agua, Qh2o (kg/m2h), se calculó usando la siguiente ecuación:
en la que m1 es la masa del envase con la muestra de agua, m2 es la masa del envase, A es el área superficial de membrana activa (38,5 cm2) y t es el tiempo.
La permeabilidad hidrodinámica según la ley de Darcy, k (m2) de la membrana puede calcularse a partir de la siguiente ecuación:
, Qh.oVS
k = ------------------3600dH20AP
en la que n es la viscosidad del agua (Pas), Ses el grosor de membrana (m), dH2o es la densidad del agua (kg/m3), y AP (Pa) es la diferencia de presiones a la que se midió el flujo, Qh2o.
La permeabilidad hidrodinámica según la ley de Darcy de la membrana puede usarse para estimar un radio hidrodinámico promedio de los poros en el gel poroso. El radio hidrodinámico, rh, se define como la razón del volumen de poro con respecto al área superficial mojada de los poros y puede obtenerse a partir de la ecuación de Carman-Kozeny proporcionada en el libro de J. Happel y H. Brenner, Low Reynolds Number Hidrodynamics, Noordhof Int. Publ., Leyden, 1973, pág. 393:
en la que K es la constante de Kozeny y e es la porosidad de la membrana. La constante de Kozeny K = 5 para porosidad 0,5<e<0,7. La porosidad de la membrana puede estimarse a partir de la porosidad del soporte restando el volumen del polímero de gel.
Puede añadirse un aditivo a la disolución de sales de elución (el segundo fluido, o el tercer o posterior fluido). El aditivo puede añadirse en una concentración baja (por ejemplo, menos de aproximadamente 1 M, aproximadamente 0,5 M o aproximadamente 0,2 M). El aditivo puede ser un alcohol soluble en agua, un detergente, dimetilsulfóxido, dimetilformamida o una disolución acuosa de una sal caotrópica. Sin querer restringirse a ninguna teoría particular, el aditivo puede disminuir la tensión superficial del agua, debilitando así las interacciones hidrófobas para proporcionar una disociación posterior del complejo ligando-soluto.
Los métodos pueden ser una etapa posterior en la purificación de materiales que se han precipitado con sulfato de amonio o eluido en altas concentraciones de sales durante la cromatografía de intercambio iónico. Los métodos pueden usarse posteriormente a una etapa de cromatografía de afinidad. Los métodos pueden ser una etapa de purificación intermediada que separa la forma correctamente plegada de una biomolécula, tal como un factor de crecimiento (por ejemplo, IGF-1), de una forma mal plegada, pero estable, que podría generarse en un procedimiento de replegamiento.
Se da a conocer, y no según la invención reivindicada, un método de una etapa de purificación de biomoléculas. Se da a conocer y no según la invención reivindicada un método de separación de biomoléculas que es más fácil de ampliar a escala, requiere menos mano de obra, es más rápido y tiene costos de inversión más bajos que las
técnicas de cromatografía de columna empaquetada convencionales usadas comúnmente.
Materiales compuestos a modo de ejemplo
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a un material compuesto, que comprende:
un elemento de soporte, que comprende una pluralidad de poros que se extienden a través del elemento de soporte; y
un gel reticulado macroporoso, que comprende una pluralidad de macroporos, y una pluralidad de restos hidrófobos colgantes;
en el que el gel reticulado macroporoso se ubica en los poros del elemento de soporte; y el diámetro de poro promedio de los macroporos es menor que el diámetro de poro promedio de los poros, en el que el gel reticulado macroporoso comprende un polímero formado a través de la reacción in situ de un primer monómero y un segundo monómero y un agente de reticulación; y el primer monómero tiene un valor de log P (octanol-agua) de desde 1 hasta 7; y el segundo monómero tiene un valor de log P (octanol-agua) de desde -1 hasta 1; y en el que el primer monómero es acrilato de etilo, metacrilato de metilo, acrilato de fenilo, acrilato de n-butilo, metacrilato de n-butilo, acrilato de n-hexilo, acrilato de 2-etilhexilo, acrilato de n-octilo, acrilato de n-decilo, acrilato de laurilo o metacrilato de laurilo; y el segundo monómero es acrilamida, N-vinil-2-pirrolidinona, metacrilato de 2-hidroxietilo, acrilato de metilo o metacrilato de glicidilo; y en el que el agente de reticulación es trimetacrilato de trimetilolpropano.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los materiales compuestos mencionados anteriormente, en los que los restos hidrófobos colgantes son grupos etilo, butilo, hexilo, 2-etilhexilo, dodecilo, estearilo, hidroxipropilo, fenilo, éter o poli(propilenglicol).
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los materiales compuestos mencionados anteriormente, en los que el gel reticulado macroporoso comprende un polímero derivado de un primer monómero y un segundo monómero, el primer monómero tiene un valor de log P (octanol-agua) de desde 1 hasta 7; y el segundo monómero tiene un valor de log P (octanol-agua) de desde -1 hasta 1.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los materiales compuestos mencionados anteriormente, en los que la razón molar del primer monómero con respecto al segundo monómero es de aproximadamente 0,01:1 a aproximadamente 1:1.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los materiales compuestos mencionados anteriormente, en los que la razón molar del primer monómero con respecto al segundo monómero es de aproximadamente 0,05:1 a aproximadamente 0,5:1.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los materiales compuestos mencionados anteriormente, en los que la razón molar del primer monómero con respecto al segundo monómero es de aproximadamente 0,1:1, aproximadamente 0,15:1, o aproximadamente 0,20:1.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los materiales compuestos mencionados anteriormente, en los que el gel reticulado macroporoso comprende macroporos; el gel reticulado macroporoso tiene una porosidad volumétrica de desde aproximadamente el 30% hasta aproximadamente el 80%; y los macroporos tienen un diámetro de poro promedio de desde aproximadamente 10 nm hasta aproximadamente 3000 nm.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los materiales compuestos mencionados anteriormente, en los que el gel reticulado macroporoso comprende macroporos; el gel reticulado macroporoso tiene una porosidad volumétrica de desde aproximadamente el 40% hasta aproximadamente el 70%. En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los materiales compuestos mencionados anteriormente en los que el gel reticulado macroporoso comprende macroporos; el gel reticulado macroporoso tiene una porosidad volumétrica de aproximadamente el 40%, aproximadamente el 45%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 55%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 65% o aproximadamente el 70%.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los materiales compuestos mencionados anteriormente, en los que el diámetro de poro promedio de los macroporos es de aproximadamente 25 nm a aproximadamente 1500 nm.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los materiales compuestos mencionados anteriormente, en los que el diámetro de poro promedio de los macroporos es de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 1000 nm. En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los materiales compuestos mencionados anteriormente, en los que el diámetro de poro promedio de los macroporos es de aproximadamente 50 nm, aproximadamente 100 nm, aproximadamente 150 nm, aproximadamente 200 nm, aproximadamente 250 nm, aproximadamente 300 nm, aproximadamente 350 nm, aproximadamente 400 nm, aproximadamente 450 nm, aproximadamente 500 nm, aproximadamente 550 nm, aproximadamente 600 nm, aproximadamente 650 nm o aproximadamente 700 nm.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los materiales compuestos mencionados anteriormente, en los que el diámetro de poro promedio de los macroporos es de desde aproximadamente 300 nm hasta aproximadamente 400 nm.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los materiales compuestos mencionados anteriormente, en los que el material compuesto es una membrana.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los materiales compuestos mencionados anteriormente, en los que el elemento de soporte tiene un volumen de huecos; y el volumen de huecos del elemento de soporte se llena sustancialmente con el gel reticulado macroporoso.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los materiales compuestos mencionados anteriormente, en los que el elemento de soporte comprende un polímero; el elemento de soporte es de aproximadamente 10 |im a aproximadamente 500 |im de grosor; los poros del elemento de soporte tienen un diámetro de poro promedio de desde aproximadamente 0,1 |im hasta aproximadamente 25 |im; y el elemento de soporte tiene una porosidad volumétrica de desde aproximadamente el 40% hasta aproximadamente el 90%.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los materiales compuestos mencionados anteriormente, en los que el elemento de soporte es de aproximadamente 10 |im a aproximadamente 500 |im de grosor. En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los materiales compuestos mencionados anteriormente, en el que el elemento de soporte es de aproximadamente 30 |im a aproximadamente 300 |im de grosor. En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los materiales compuestos mencionados anteriormente, en los que el elemento de soporte es de aproximadamente 30 |im, aproximadamente 50 |im, aproximadamente 100 |im, aproximadamente 150 |im, aproximadamente 200 |im, aproximadamente 250 |im o aproximadamente 300 |im de grosor.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los materiales compuestos mencionados anteriormente, en los que los poros del elemento de soporte tienen un diámetro de poro promedio de desde aproximadamente 0,1 |im hasta aproximadamente 25 |im. En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los materiales compuestos mencionados anteriormente, en los que los poros del elemento de soporte tienen un diámetro de poro promedio de desde aproximadamente 0,5 |im hasta aproximadamente 15 |im. En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los materiales compuestos mencionados anteriormente, en los que los poros del elemento de soporte tienen un diámetro de poro promedio de aproximadamente 0,5 |im, aproximadamente 1 |im, aproximadamente 2 |im, aproximadamente 3 |im, aproximadamente 4 |im, aproximadamente 5 |im, aproximadamente 6 |im, aproximadamente 7 |im, aproximadamente 8 |im, aproximadamente 9 |im, aproximadamente 10 |im, aproximadamente 11 |im, aproximadamente 12 |im, aproximadamente 13 |im, aproximadamente 14 |im o aproximadamente 15 |im.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los materiales compuestos mencionados anteriormente, en los que el elemento de soporte tiene una porosidad volumétrica de desde aproximadamente el 40% hasta aproximadamente el 90%. En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los materiales compuestos mencionados anteriormente, en los que el elemento de soporte tiene una porosidad volumétrica de desde aproximadamente el 50% hasta aproximadamente el 80%. En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los materiales compuestos mencionados anteriormente, en los que el elemento de soporte tiene una porosidad volumétrica de aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70% o aproximadamente el 80%.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los materiales compuestos mencionados anteriormente, en los que el elemento de soporte comprende una poliolefina.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los materiales compuestos mencionados anteriormente, en los que el elemento de soporte comprende un material polimérico seleccionado del grupo que consiste en polisulfonas, polietersulfonas, óxidos de polifenileno, policarbonatos, poliésteres, celulosa y derivados de celulosa.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los materiales compuestos mencionados anteriormente, en los que el elemento de soporte comprende un textil fibroso tejido o no tejido que comprende un polímero; el elemento de soporte es de desde aproximadamente 10 |im hasta aproximadamente 2000 |im de grosor; los poros del elemento de soporte tienen un diámetro de poro promedio de desde aproximadamente 0,1 |im hasta aproximadamente 25 |im; y el elemento de soporte tiene una porosidad volumétrica de desde aproximadamente el 40% hasta aproximadamente el 90%.
Métodos a modo de ejemplo
Se da a conocer, y no según la invención reivindicada, un método, que comprende la etapa de:
poner en contacto a una primera velocidad de flujo un primer fluido que comprende una sustancia con uno
cualquiera de los materiales compuestos mencionados anteriormente, adsorbiendo o absorbiendo así una parte de la sustancia sobre el material compuesto.
Se da a conocer, y no según la invención reivindicada, uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en los que la trayectoria de flujo del fluido del primer fluido es sustancialmente perpendicular a los poros del elemento de soporte.
Se da a conocer, y no según la invención reivindicada, uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en los que la trayectoria de flujo del fluido del primer fluido es sustancialmente a través de los macroporos del material compuesto.
Se da a conocer, y no según la invención reivindicada, uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, que comprende además la etapa de:
poner en contacto a una segunda velocidad de flujo un segundo fluido con la sustancia adsorbida o absorbida sobre el material compuesto, liberando así una parte de la sustancia del material compuesto.
Se da a conocer, y no según la invención reivindicada, uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en los que la trayectoria de flujo del fluido del segundo fluido es sustancialmente perpendicular a los poros del elemento de soporte.
Se da a conocer, y no según la invención reivindicada, uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en los que la trayectoria de flujo del fluido del segundo fluido es sustancialmente a través de los macroporos del material compuesto.
Se da a conocer, y no según la invención reivindicada, uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en los que el gel macroporoso presenta una interacción específica para la sustancia.
Se da a conocer, y no según la invención reivindicada, uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en los que la interacción específica es una interacción hidrófoba.
Se da a conocer, y no según la invención reivindicada, uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en los que la sustancia es una molécula biológica o un ion biológico.
Se da a conocer, y no según la invención reivindicada, uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en los que la molécula biológica o el ion biológico se selecciona del grupo que consiste en albúminas, lisozima, virus, células, y-globulinas de orígenes humanos y animales, inmunoglobulinas de orígenes humanos y animales, proteínas de orígenes recombinantes y naturales, polipéptidos de orígenes sintéticos y naturales, interleucina 2 y su receptor, enzimas, anticuerpos monoclonales, tripsina y su inhibidor, citocromo C, mioglobina, mioglobulina, aquimotripsinógeno, interleucina humana recombinante, proteína de fusión recombinante, productos derivados de ácidos nucleicos, ADN de orígenes sintéticos y naturales y ARN de orígenes sintéticos y naturales.
Se da a conocer, y no según la invención reivindicada, uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en los que la molécula biológica o el ion biológico es lisozima, hIgG, mioglobina, albúmina sérica humana, inhibidor de tripsina de soja, transferrina, enolasa, ovoalbúmina, ribonucleasa, inhibidor de tripsina de huevo, citocromo c, anexina V o a-quimotripsinógeno.
Se da a conocer, y no según la invención reivindicada, uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en los que el primer fluido es un tampón. Se da a conocer, y no según la invención reivindicada, uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en los que la concentración del tampón en el primer fluido es de aproximadamente 25 mM, aproximadamente 50 mM, aproximadamente 0,1 M o aproximadamente 0,2 M. Se da a conocer, y no según la invención reivindicada, uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en los que el pH del primer fluido es de aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8 o aproximadamente 9.
Se da a conocer, y no según la invención reivindicada, uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en los que el segundo fluido es una disolución de sales. Se da a conocer, y no según la invención reivindicada, uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en los que la sal se selecciona del grupo que consiste en (NH4)2SO4, K2SO4, clorhidrato de glicina, fosfato, ácido cítrico, citrato de sodio, NaCl, Na2SO4, NaPO4, acetato de sodio y NH4CL Se da a conocer, y no según la invención reivindicada, uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en los que la concentración de sales en el segundo fluido es de desde aproximadamente 3,0 M hasta aproximadamente 0,2 M. Se da a conocer, y no según la invención reivindicada, uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en los que la concentración de sales es de aproximadamente 3,0 M, aproximadamente 2,8 M, aproximadamente 2,6 M, aproximadamente 2,4 M, aproximadamente 2,2 M, aproximadamente 2,0 M, aproximadamente 1,8 M, aproximadamente 1,6 M, aproximadamente 1,4 M, aproximadamente 1,2 M, aproximadamente 1,0 M, aproximadamente 0,8 M, aproximadamente 0,6 M, aproximadamente 0,4 M o aproximadamente 0,2 M.
Se da a conocer, y no según la invención reivindicada, uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en los que la primera velocidad de flujo es de desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 10 ml/min. Se da a conocer, y no según la invención reivindicada, uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en los que la segunda velocidad de flujo es de desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 10 ml/min. Se da a conocer, y no según la invención reivindicada, uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en los que la primera velocidad de flujo o la segunda velocidad de flujo es de aproximadamente 0,1 ml/min, aproximadamente 0,5 ml/min, aproximadamente 1,0 ml/min, aproximadamente 1,5 ml/min, aproximadamente 2.0 ml/min, aproximadamente 2.5 ml/min, aproximadamente 3,0 ml/min, aproximadamente 4,0 ml/min, aproximadamente 4,5 ml/min, aproximadamente 5,0 ml/min, aproximadamente 5,5 ml/min, aproximadamente 6.0 ml/min, aproximadamente 6.5 ml/min, aproximadamente 7,0 ml/min, aproximadamente 7,5 ml/min, aproximadamente 8,0 ml/min, aproximadamente 8,5 ml/min, aproximadamente 9,0 ml/min, aproximadamente 9,5 ml/min o aproximadamente 10,0 ml/min. Se da a conocer, y no según la invención reivindicada, uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en los que la primera velocidad de flujo o la segunda velocidad de flujo es de desde aproximadamente 0,5 ml/min hasta aproximadamente 5,0 ml/min.
Se da a conocer, y no según la invención reivindicada, uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, que comprende además la etapa de:
poner en contacto un tercer fluido con la sustancia adsorbida o absorbida sobre el material compuesto, liberando así una parte de la sustancia del material compuesto; en los que el tercer fluido es una disolución de sales; y la concentración de sales del tercer fluido es menor que la concentración de sales del segundo fluido.
La invención se refiere a un método de elaboración de un material compuesto según la invención, que comprende las etapas de:
combinar el primer monómero, el segundo monómero, un fotoiniciador, el agente de reticulación y un disolvente, formando así una mezcla monomérica;
poner en contacto un elemento de soporte con la mezcla monomérica, formando así un elemento de soporte modificado; en el que el elemento de soporte comprende una pluralidad de poros que se extienden a través del elemento de soporte, y el diámetro de poro promedio de los poros es de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 25 |im;
cubrir el elemento de soporte modificado con una lámina polimérica, formando así un elemento de soporte cubierto; e
irradiar el elemento de soporte cubierto durante un periodo de tiempo, formando así un material compuesto.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, que comprende además la etapa de lavar el material compuesto con un segundo disolvente.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en los que el fotoiniciador está presente en la mezcla monomérica en una cantidad de desde aproximadamente el 0,4% (p/p) hasta aproximadamente el 2,5% (p/p) en relación con el peso total de monómero.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en los que el fotoiniciador está presente en la mezcla monomérica en aproximadamente el 0,6%, aproximadamente el 0,8%, aproximadamente el 1,0%, aproximadamente el 1,2% o aproximadamente el 1,4% (p/p) en relación con el peso total de monómero.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en los que el fotoiniciador se selecciona del grupo que consiste en 1-[4-(2-hidroxietoxi)-fenil]-2-hidroxi-2-metil-1-propan-1-ona, 2,2-dimetoxi-2-fenilacetofenona, benzofenona, benzoína y éteres de benzoína, dialcoxiacetofenonas, hidroxialquilfenonas y ésteres sulfónicos de a-hidroximetilbenzoína.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en los que el disolvente es 1,3-butanodiol, propil éter de di(propilenglicol), N,N-dimetilacetamida, acetato de metil éter de di(propilenglicol) (DPMA), agua, dioxano, dimetilsulfóxido (DMSO), dimetilformamida (DMF), acetona, etanol, N-metilpirrolidona (NMP), tetrahidrofurano (THF), acetato de etilo, acetonitrilo, tolueno, xilenos, hexano, N-metilacetamida, propanol o metanol.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en los que el monómero o el agente de reticulación o ambos están presentes en el disolvente en de aproximadamente el 10% a aproximadamente el 45% (p/p).
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en los que el monómero o el agente de reticulación o ambos estás presentes en el disolvente en una cantidad de aproximadamente el 15%, aproximadamente el 16%, aproximadamente el 17%, aproximadamente el 18%,
aproximadamente el 19%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 21%, aproximadamente el 22% aproximadamente el 23%, aproximadamente el 24%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 26% aproximadamente el 27%, aproximadamente el 28%, aproximadamente el 29%, aproximadamente el 30% aproximadamente el 31%, aproximadamente el 32%, aproximadamente el 33%, aproximadamente el 34% aproximadamente el 35%, aproximadamente el 36%, aproximadamente el 37%, aproximadamente el 38% aproximadamente el 39% o aproximadamente el 40% (p/p).
La invención se refiere a uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en los que el agente de reticulación es trimetacrilato de trimetilolpropano.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en los que el % en moles del agente de reticulación en relación con el monómero es de aproximadamente el 10%, aproximadamente el 11%, aproximadamente el 12%, aproximadamente el 13%, aproximadamente el 14%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 16%, aproximadamente el 17%, aproximadamente el 18%, aproximadamente el 19%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 21%, aproximadamente el 22%, aproximadamente el 23%, aproximadamente el 24% o aproximadamente el 25%.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en los que el elemento de soporte cubierto se irradia a aproximadamente 350 nm.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en los que el periodo de tiempo es de aproximadamente 1 minuto, aproximadamente 5 minutos, aproximadamente 10 minutos, aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 20 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 45 minutos o aproximadamente 1 hora.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en los que el material compuesto comprende macroporos.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a uno cualquiera de los métodos mencionados anteriormente, en los que el diámetro de poro promedio de los macroporos es menor que el diámetro de poro promedio de los poros.
Ejemplificación
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar la invención. Sin embargo, se entenderá que los detalles específicos proporcionados en cada ejemplo se han seleccionado con fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitativos del alcance de la invención. Generalmente, los experimentos se realizaron en condiciones similares a menos que se indique.
Ejemplo 1 - Procedimientos generales
Preparación de materiales compuestos
Se preparó un material compuesto a partir de las disoluciones monoméricas descritas a continuación y el soporte TR0671 B50 (Hollingsworth & Vose) usando la polimerización fotoiniciada según el siguiente procedimiento general. Se colocó un elemento de soporte pesado sobre una lámina de poli(etileno) (PE) y se aplicó una disolución monomérica o polimérica a la muestra. Se cubrió la muestra posteriormente con otra lámina de PE y se pasó un rodillo de caucho por encima de la estructura intercalada para retirar la disolución en exceso. Se indujo la formación de gel in situ en la muestra mediante polimerización iniciada por irradiación con la longitud de onda de 350 nm durante un periodo de 10 minutos. Se lavó detenidamente el material compuesto resultante con agua de OI y se colocó en ácido clorhídrico 0,1 N durante 24 h para hidrolizar grupos epóxido residuales. (Aunque se ejecutó la etapa de hidrólisis de epóxidos en cada uno de los siguientes ejemplos, puede omitirse esta etapa). Se almacenó la membrana en agua durante 24 h y luego se secó a temperatura ambiente. Para determinar la cantidad de gel formado en el soporte, se secó la muestra en un horno a 50°C hasta una masa constante. Se calculó el aumento de masa debido a la incorporación de gel como una razón de masa añadida del gel seco con respecto a la masa inicial del soporte poroso.
Análisis de flujo y capacidad de unión de los materiales compuestos
Se llevaron a cabo mediciones de flujo de agua a través de los materiales compuestos después de haber lavado las muestras con agua. Como un procedimiento convencional, se montó una muestra en forma de disco de 7,8 cm de diámetro sobre una rejilla sinterizada de 3-5 mm de grosor y se ensambló en una celda alimentada con nitrógeno comprimido a una presión controlada. Se llenó la celda con agua desionizada y se aplicó una presión de 100 kPa. Se recogió el agua que se hizo pasar a través del material compuesto en un tiempo especificado en un envase pesado previamente y se pesó. Se llevaron a cabo todos los experimentos a temperatura ambiente y a presión atmosférica en la salida del permeado. Se repitió cada medición tres o más veces para lograr una reproductibilidad de 5%.
Se llevaron a cabo experimentos de adsorción de proteínas con lisozima y hIgG. En una etapa de adsorción, se montó una muestra de material compuesto en forma de un único disco de membrana de 25 mm de diámetro sobre una rejilla sinterizada de 2 mm de grosor en una celda de extremo cerrado.
La disolución de alimentación se suministró a la celda mediante una bomba peristáltica (modelo P-1, Pharmacia Biotech). Se conectó la salida del permeado a un detector UV de longitud de onda múltiple (Waters 490). Se conectó la salida de trazador del detector a un multímetro digital con interfaz de PC y a través del multímetro al PC. Se registró la salida del detector cada minuto con una precisión de 1 mV.
Se cebaron la celda y la muestra de membrana pasando tampón fosfato de sodio 20 mM que contenía sal de sulfato de amonio de diversas concentraciones a pH 7,0 hasta que se estableció una línea base estable en el detector UV a 280 nm. En la siguiente etapa, se vació la celda y se rellenó con la alimentación -- disolución de lisozima o hIgG en los tampones correspondientes. Se filtraron todos los tampones, disoluciones de lisozima y hIgG a través de un filtro de membrana de acetato de celulosa con tamaño de poro de 0,2 |im. Se encendió inmediatamente la bomba junto con el registro del PC de la salida del detector. Se recogieron muestras de permeado y se pesaron para comprobar la velocidad de flujo.
Ejemplo 2 - Material compuesto funcionalizado con butilo
Se preparó una disolución al 23% en peso disolviendo monómero de metacrilato de glicidilo (GMA), comonómero de metacrilato de butilo (BuMe) y agente reticulante de trimetacrilato de trimetilolpropano (TRIM-M) en una razón molar de 1:0,15:0,2, respectivamente, en una mezcla de disolventes que contenía el 22,4% en peso de 1,3-butanodiol, el 54,3% en peso de propil éter de di(propilenglicol) y el 23,3% en peso de N,N'-dimetilacetamida. Se añadió el fotoiniciador Irgacure® 2959 en la cantidad del 1% en peso con respecto a la masa de los monómeros.
Se prepararon varias muestras similares a la descrita anteriormente y se promediaron para estimar el aumento de masa del material compuesto. El sustrato aumentó el 180% del peso original en este tratamiento.
El material compuesto producido mediante este método tenía un flujo de agua en el intervalo de 1.200-1.400 kg/m2h a 100 kPa. Se examinaron las características de adsorción de lisozima (LYS) y hIgG del material compuesto usando el procedimiento general para un único disco de membrana tal como se describió anteriormente. La concentración de la lisozima usada en este experimento era de 0,45 g/l en tampón fosfato de sodio 20 mM que contenía (NH4)2SO4 2,0 M, a pH 7,0, y hIgG - 0,5 g/l en tampón fosfato de sodio 20 mM que contenía (NH4)2SO4 1,5 N a pH 7,0. La velocidad de flujo era de 10 volúmenes de lecho (BV)/min. En la figura 1 se muestra un gráfico de la concentración de LYS en el permeado (ruptura de membrana) frente a la capacidad de unión dinámica de LYS (mg/ml). El material compuesto tenía una capacidad de unión de LYS y hIgG de 34 mg/mlmembrana y 41 mg/mlmembrana correspondientemente al 10% de ruptura. Se efectuó la desorción con tampón fosfato de sodio 20 mM. Se recogieron las fracciones de elución para las determinaciones espectrofotométricas a 280 nm. Se estimó la recuperación del volumen y la absorbancia de la muestra de elución. Los resultados indicaron una recuperación de LYS y hIgG del 90% y el 75%, respectivamente.
Ejemplo 3 - Material compuesto funcionalizado con fenilo
Se preparó una disolución al 32% en peso disolviendo monómero de metacrilato de glicidilo (GMA), comonómero de acrilato de fenilo (PhA) y agente reticulante de trimetacrilato de trimetilolpropano (TRIM-M) en una razón molar de 1:0,1:0,13, respectivamente, en una mezcla de disolventes que contenía el 22,3% en peso de 1,3-butanodiol, el 55,0% en peso de propil éter de di(propilenglicol) y el 22,7% en peso de N,N'-dimetilacetamida. Se añadió el fotoiniciador Irgacure® 2959 en la cantidad del 1% en peso con respecto a la masa de los monómeros.
Se prepararon varias muestras similares a la descrita anteriormente y se promediaron para estimar el aumento de masa del material compuesto. El sustrato aumentó el 170% de su peso original en este tratamiento.
El material compuesto producido mediante este método tenía un flujo de agua en el intervalo de 1.200-1.300 kg/m2h a 100 kPa. Se examinaron las características de adsorción de lisozima (LYS) y hIgG del material compuesto usando el procedimiento general para un único disco de membrana descrito anteriormente (ejemplo 2). La concentración de la proteína usada en este experimento y las velocidades de flujo eran las mismas tal como se describió en el ejemplo 2. En la figura 1 se muestra un gráfico de la concentración de LYS en el permeado frente a la capacidad de unión dinámica de LYS (mg/ml). El material compuesto mostró una capacidad de unión de LYS y hIgG de 24 mg/mlmembrana y 28,2 mg/mlmembrana al 10% de ruptura, respectivamente. La recuperación de LYS se encontró en el intervalo del 85-90%, y la de hIgG fue del 70%.
Ejemplo 4 - Material compuesto funcionalizado con dodecilo
Se preparó una disolución al 25,7% en peso disolviendo monómero de metacrilato de glicidilo (GMA), comonómero de metacrilato de laurilo (LMA, metacrilato de dodecilo) y agente reticulante de trimetacrilato de trimetilolpropano (TRIM-M) en una razón molar de 1:0,1:0,23, respectivamente, en una mezcla de disolventes que contenía el 24,3% en peso de 1,3-butanodiol, el 53,6% en peso de propil éter de di(propilenglicol) y el 22,1% en peso de N,N'-dimetilacetamida. Se añadió el fotoiniciador Irgacure® 2959 en la cantidad del 1% en peso con respecto a la masa
de los monómeros.
Se prepararon varias muestras similares a la descrita anteriormente y se promediaron para estimar el aumento de masa del material compuesto. El sustrato aumentó el 180% de su peso original en este tratamiento.
El material compuesto producido mediante este método tenía un flujo de agua en el intervalo de 1.200-1.300 kg/m2h a 100 kPa. En la figura 1 se muestra un gráfico de la concentración de LYS en el permeado frente a la capacidad de unión dinámica de LYS (mg/ml). El material compuesto mostró una capacidad de unión de LYS y hIgG de 41 mg/mlmembrana y 49,4 mg/mlmembrana al 10% de ruptura, respectivamente. Las recuperaciones de LYS y hIgG fueron del 80-85% y el 75%, respectivamente.
Ejemplo 5 - Materiales compuestos funcionalizados con butilo con conmonómeros de vinilpirrolidinona y acrilamida Se preparó una disolución al 19,0% en peso disolviendo monómero de 1 -vinil-2-pirrolidinona (VP), comonómero 1 de acrilamida (AAm), comonómero 2 de metacrilato de butilo (BuMe) y agente reticulante de trimetacrilato de trimetilolpropano (TRIM-M) en una razón molar de 1:0,1:0,14:0,27, respectivamente, en una mezcla de disolventes que contenía el 99% en peso de acetato de metil éter de di(propilenglicol) (DPMA) y el 1% en peso de agua DI. Se añadió el fotoiniciador Irgacure® 2959 en la cantidad del 1% en peso con respecto a la masa de los monómeros. Se prepararon varias muestras similares a la descrita anteriormente y se promediaron para estimar el aumento de masa del material compuesto. El sustrato aumentó el 150% de su peso original en este tratamiento.
El material compuesto producido mediante este método tenía un flujo de agua en el intervalo de 1.000-1.100 kg/m2h a 100 kPa. Se examinaron las características de adsorción de proteína (lisozima (LYS)) y hIgG del material compuesto usando el procedimiento general para un único disco de membrana descrito anteriormente (ejemplo 2). La concentración de lisozima/hIgG usada en este experimento era la misma tal como se describió en el ejemplo 2. La velocidad de flujo era de 8 volúmenes de lecho (BV)/min. En la figura 2 se muestra un gráfico de la concentración de LYS en el permeado frente a la capacidad de unión dinámica de LYS (mg/ml). El material compuesto mostró una capacidad de unión de LYS y hIgG de 15 mg/mlmembrana y 20 mg/mlmembrana al 10% de ruptura, respectivamente. La recuperación de LYS/hIgG estaba en el intervalo del 70-75%.
Ejemplo 6 - Materiales compuestos funcionalizados con butilo con comonómero de metacrilato de hidroxietilo Se preparó una disolución al 36,0% en peso disolviendo monómero de metacrilato de 2-hidroxietilo (HEMA), comonómero de metacrilato de butilo (BuMe) y agente reticulante de trimetacrilato de trimetilolpropano (TRIM-M) en una razón molar de 1:0,1:0,12, respectivamente, en acetato de metil éter de di(propilenglicol) (DPMA). Se añadió el fotoiniciador Irgacure® 2959 en la cantidad del 1% en peso con respecto a la masa de los monómeros.
Se preparó un material compuesto a partir de la disolución y el soporte TR0671 B50 (Hollingsworth & Vose) usando la polimerización fotoiniciada según el procedimiento general descrito anteriormente (ejemplo 1). El tiempo de irradiación usado fue de 10 minutos a 350 nm. Se retiró el material compuesto de entre las láminas de polietileno, se lavó con agua de OI. Se almacenó la membrana en agua durante 24 h y se secó a temperatura ambiente.
Se prepararon varias muestras similares a la descrita anteriormente y se promediaron para estimar el aumento de masa del material compuesto. El sustrato aumentó el 130% de su peso original en este tratamiento.
Se caracterizó la membrana en cuanto a flujo de agua y capacidad de unión de lisozima/hIgG tal como se describe en el ejemplo 2.
El material compuesto producido mediante este método tenía un flujo de agua en el intervalo de 3.200-3.500 kg/m2h a 100 kPa. Se examinó la característica de adsorción de lisozima/hIgG del material compuesto usando el procedimiento general. Se usaron dos discos de membrana. La concentración de lisozima/hIgG usada en este experimento fue la misma que la descrita en el ejemplo 2. La velocidad de flujo era de 5 volúmenes de lecho (BV)/min. En la figura 2 se muestra un gráfico de la concentración de LYS en el permeado frente a la capacidad de unión dinámica de LYS (mg/ml). El material compuesto mostró una capacidad de unión de LYS y hIgG de 15 mg/mlmembrana y 17 mg/mlmembrana al 10% de ruptura, respectivamente. Se encontró que la recuperación de LYS estaba en el intervalo del 80%, y la de hIgG estaba en el intervalo del 70%.
Ejemplo 7 - Cromatografía en gradiente
Para obtener los datos de retención en gradiente lineal de proteínas, se usó una membrana de poli(AAm-co-VP-co-BuMe) preparada tal como se describe en el ejemplo 5 (25 mm de diámetro; 0,14 ml). Se examinaron tres proteínas, variables en peso molecular y en la hidrofobicidad de sus superficies, en un experimento de separación. Se usaron las proteínas: mioglobina (de músculo esquelético equino, PM de 17 kDa), lisozima (de clara de huevo de gallina, PM de 14,3 kDa) y a-quimotripsinógeno A (tipo II, de páncreas bovino, PM de 25,7 kDa) (Sigma-Aldrich). Todas las sales y proteínas de prueba, el sulfato de amonio y el fosfato monobásico y dibásico de sodio se adquirieron de Sigma-Aldrich. Se usó un sistema de HPLC Waters 600E para llevar a cabo los estudios cromatográficos de las membranas. Se usó un bucle de muestra de 2 ml para inyectar disoluciones de proteínas en los experimentos de
separación. Se registraron de manera continua la absorbancia UV (a 280 nm) de la corriente de efluente del soporte de membrana Pall y la presión del sistema. Se eligió una disolución que contenía sulfato de amonio 2 M (pH 7,0) como tampón de unión que se preparó usando tampón fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0) como tampón base. El tampón de unión se denominó tampón A y el tampón de elución - fosfato de sodio 20 mM (pH 7,0) - tampón B. Se disolvieron las proteínas en el tampón de unión (tampón A) para preparar disoluciones de 2 mg/ml. Se mezclaron las disoluciones de proteínas en una razón de 3:1:3 (mioglobina:lisozima:a-quimotripsinógeno A).
En los experimentos cromatográficos, se pasó tampón A a través de la membrana hasta que se obtuvo una línea base estable de absorbancia UV. A continuación, se inyectó 150 pl de mezcla de proteínas usando un bucle de muestra de 2 ml. Se pasó tampón de unión durante 5 min a 2 ml/min. Posteriormente, se logró la elución en 15 min en un gradiente descendiente de sales de 2 ml/min (0% de tampón B -100% de tampón B). La figura 4 muestra una muy buena separación analítica de mioglobina, lisozima y a-quimotripsinógeno usando un disco de membrana a una velocidad de flujo de 2 ml/min. El primer pico en la figura 4 fue debido a la mioglobina unida y posteriormente eluida. El segundo pico es lisozima y el tercer pico es a-quimotripsinógeno. Se confirmaron las identidades de los picos en experimentos de una única proteína. Los tiempos de elución (tR) de estas proteínas se presentan en la tabla 2. Tabla 2. Tiempo de retención de proteínas basándose en experimentos de captura/elución individuales
Ejemplo 8 - Rendimiento de las membranas
La figura 5 tabula un sumario de diversos materiales compuestos de la invención y diversas características de rendimiento. Se elaboró cada una de las muestras, se hidrolizó con HCl 0,1 M, se secó en un horno a 50°C y se volvió a humedecer para su uso, una consideración importante para un material práctico.
Ejemplo 9 - Materiales compuestos funcionalizados con fenilo (ejemplo de referencia)
Este ejemplo ilustra un método de preparación de un material compuesto de la presente invención con grupo funcional fenilo.
Se preparó una disolución al 32% en peso disolviendo monómero de metacrilato de glicidilo (GMA), comonómero de metacrilato de fenil éter de etilenglicol (EGPhA) y agente reticulante de trimetacrilato de trimetilolpropano (TRIM-M) en una razón molar de 1:0,2:0,18, respectivamente, en una mezcla de disolventes que contenía el 23,1% en peso de 1,3-butanodiol, el 54,0% en peso de propil éter de di(propilenglicol) y el 22,9% en peso de N,N'-dimetilacetamida. Se añadió el fotoiniciador Irgacure® 2959 en la cantidad del 1% en peso con respecto a la masa de los monómeros. Se preparó un material compuesto a partir de la disolución y el soporte TR0671 B50 (Hollingsworth & Vose) usando la polimerización fotoiniciada según el procedimiento general descrito anteriormente (ejemplo 1). El tiempo de irradiación usado fue de 10 minutos a 350 nm. Se retiró el material compuesto de entre las láminas de polietileno, se lavó con agua de OI y se colocó en ácido clorhídrico 0,1 N durante 24 h para hidrolizar los grupos epoxi. Se almacenó la membrana en agua durante 24 h y luego se secó a temperatura ambiente.
Se prepararon varias muestras similares a la descrita anteriormente y se promediaron para estimar el aumento de masa del material compuesto. El sustrato aumentó el 180% del peso original es este tratamiento.
El material compuesto producido mediante este método tenía un flujo de agua de 2.200 kg/m2h a 100 kPa. Se examinaron las características de adsorción de hIgG del material compuesto usando una única capa insertada en un soporte de disco Natrix de acero inoxidable unido al equipo del sistema de HPLC Waters 600E. La concentración de la hIgG usada en este experimento fue de 0,5 g/l en tampón fosfato de sodio 50 mM que contenía (NH4)2SO40,8 M, a pH 7,0. La velocidad de flujo era de 10 volúmenes de lecho (BV)/min. El material compuesto mostró una capacidad de unión de hIgG de 31,2 mg/mlmembrana al 10% de ruptura. La recuperación para hIgG fue del 99,8% usando tampón de elución que contenía fosfato de sodio 50 mM con isopropanol al 5% (p/p), pH 7,0.
Claims (10)
1. Material compuesto, que comprende:
un elemento de soporte, que comprende una pluralidad de poros que se extienden a través del elemento de soporte; y
un gel reticulado macroporoso, que comprende una pluralidad de macroporos, y una pluralidad de restos hidrófobos colgantes;
en el que el gel reticulado macroporoso se ubica en los poros del elemento de soporte; y el diámetro de poro promedio de los macroporos es menor que el diámetro de poro promedio de los poros, caracterizado porque el gel reticulado macroporoso comprende un polímero formado a través de la reacción in situ de un primer monómero y un segundo monómero y un agente de reticulación; y el primer monómero tiene un valor de log P (octanol-agua) de desde 1 hasta 7; y el segundo monómero tiene un valor de log P (octanolagua) de desde -1 hasta 1; y en el que el primer monómero es acrilato de etilo, metacrilato de metilo, acrilato de fenilo, acrilato de n-butilo, metacrilato de n-butilo, acrilato de n-hexilo, acrilato de 2-etilhexilo, acrilato de n-octilo, acrilato de n-decilo, acrilato de laurilo o metacrilato de laurilo; y el segundo monómero es acrilamida, N-vinil-2-pirrolidinona, metacrilato de 2-hidroxietilo, acrilato de metilo o metacrilato de glicidilo; y en el que el agente de reticulación es trimetacrilato de trimetilolpropano.
2. Material compuesto según la reivindicación 1, se aplica uno cualquiera o más de los siguientes,
a) los restos hidrófobos colgantes son grupos etilo, butilo, hexilo, 2-etilhexilo, dodecilo, estearilo, hidroxipropilo, fenilo, éter o poli(propilenglicol);
b) la razón molar del primer monómero con respecto al segundo monómero es de 0,01:1 a 1:1;
c) la razón molar del primer monómero con respecto al segundo monómero es de 0,05:1 a 0,5:1;
d) la razón molar del primer monómero con respecto al segundo monómero es de 0,1:1, 0,15:1 o 0,20:1; e) el gel reticulado macroporoso tiene una porosidad volumétrica de desde el 30% hasta el 80%; y los macroporos tienen un diámetro de poro promedio de desde 10 nm hasta 3000 nm, en el que se aplica opcionalmente uno cualquiera de los siguientes,
i) el diámetro de poro promedio de los macroporos es de 25 nm a 1500 nm;
ii) el diámetro de poro promedio de los macroporos es de 50 nm a 1000 nm; y
iii) el diámetro de poro promedio de los macroporos es de desde 300 nm hasta 400 nm; y
f) el material compuesto es una membrana.
3. Material compuesto según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el elemento de soporte tiene un volumen de huecos; y el volumen de huecos del elemento de soporte está sustancialmente lleno con el gel reticulado macroporoso.
4. Material compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que se aplica uno cualquiera de los siguientes,
a) el elemento de soporte comprende un polímero; el elemento de soporte es de 10 |im a 500 |im de grosor; los poros del elemento de soporte tienen un diámetro de poro promedio de desde 0,1 |im hasta 25 |im; y el elemento de soporte tiene una porosidad volumétrica de desde el 40% hasta el 90%;
b) el elemento de soporte comprende una poliolefina;
c) el elemento de soporte comprende un material polimérico seleccionado del grupo que consiste en polisulfonas, polietersulfonas, óxidos de polifenileno, policarbonatos, poliésteres, celulosa y derivados de celulosa; y
d) el elemento de soporte comprende un textil fibroso tejido o no tejido que comprende un polímero; el elemento de soporte es de desde 10 |im hasta 2000 |im de grosor; los poros del elemento de soporte tienen un diámetro de poro promedio de desde 0,1 |im hasta 25 |im; y el elemento de soporte tiene una porosidad volumétrica de desde el 40% hasta el 90%.
5. Método de elaboración del material compuesto según la reivindicación 1, que comprende las etapas de: combinar el primer monómero, el segundo monómero, un fotoiniciador, el agente de reticulación y un disolvente, formando así una mezcla monomérica;
poner en contacto un elemento de soporte con la mezcla monomérica, formando así un elemento de soporte modificado; en el que el elemento de soporte comprende una pluralidad de poros que se extienden a través del elemento de soporte, y el diámetro de poro promedio de los poros es de 0,1 a 25 |im; cubrir el elemento de soporte modificado con una lámina polimérica, formando así un elemento de soporte cubierto; e
irradiar el elemento de soporte cubierto durante un periodo de tiempo, formando así un material compuesto.
6. Método según la reivindicación 5, en el que el método comprende además la etapa de lavar el material compuesto con un segundo disolvente.
7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, en el que
a) el fotoiniciador está presente en la mezcla monomérica en una cantidad de desde el 0,4% (p/p) hasta el 2,5% (p/p) en relación con el peso total de monómero, o
b) el fotoiniciador está presente en la mezcla monomérica en el 0,6%, el 0,8%, el 1,0%, el 1,2% o el 1,4% (p/p) en relación con el peso total de monómero.
8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 5-7, en el que
a) el fotoiniciador se selecciona del grupo que consiste en 1-[4-(2-hidroxietoxi)-fenil]-2-hidroxi-2-metil-1-propan-1-ona, 2,2-dimetoxi-2-fenilacetofenona, benzofenona, benzoína y éteres de benzoína, dialcoxiacetofenonas, hidroxialquilfenonas y ésteres sulfónicos de a-hidroximetilbenzoína; y/o
b) el disolvente es 1,3-butanodiol, propil éter de di(propilenglicol), N,N-dimetilacetamida, acetato de metil éter de di(propilenglicol), agua, dioxano, dimetilsulfóxido, dimetilformamida, acetona, etanol, N-metilpirrolidona, tetrahidrofurano, acetato de etilo, acetonitrilo, tolueno, xilenos, hexano, N-metilacetamida, propanol o metanol.
9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 5-8, en el que
a) el monómero o el agente de reticulación o ambos están presentes en el disolvente en del 10% al 45% (p/p); o
b) el monómero o el agente de reticulación o ambos están presentes en el disolvente en una cantidad del 15%, el 16%, el 17%, el 18%, el 19%, el 20%, el 21%, el 22%, el 23%, el 24%, el 25%, el 26%, el 27%, el 28%, el 29%, el 30%, el 31%, el 32%, el 33%, el 34%, el 35%, el 36%, el 37%, el 38%, el 39% o el 40% (p/p).
10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 5-9, en el que se aplica uno o más de los siguientes, a) la razón molar de agente de reticulación con respecto a monómero es del 10%, el 11%, el 12%, el 13%, el 14%, el 15%, el 16%, el 17%, el 18%, el 19%, el 20%, el 21%, el 22%, el 23%, el 24% o el 25%;
b) el elemento de soporte cubierto se irradia a 350 nm;
c) el periodo de tiempo es de 1 minuto, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 45 minutos o 1 hora.
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