ES2811337T3

ES2811337T3 - Microorganismo modificado para la producción optimizada de 2,4-dihidroxibutirato con eflujo de 2,4- dihidroxibutirato aumentado

Info

Publication number: ES2811337T3
Application number: ES16714929T
Authority: ES
Inventors: Wanda Dischert; Laurence Dumon-Seignovert; Perrine Vasseur; Gwénaëlle Bestel-Corre; Philippe Soucaille
Original assignee: Metabolic Explorer SA
Current assignee: Metabolic Explorer SA
Priority date: 2015-04-07
Filing date: 2016-04-07
Publication date: 2021-03-11
Anticipated expiration: 2036-04-07
Also published as: CN107771214A; US10858675B2; EP3280794B1; US20180105845A1; WO2016162442A1; CN107771214B; BR112017021306A2; EP3280794A1

Abstract

Microorganismo Escherichia coli modificado genéticamente para producir 2,4-dihidroxibutirato por fermentación, en el que dicho microorganismo se modifica genéticamente además para reducir la acumulación de 2,4-dihidroxibutirato intracelular, optimizando así la producción de 2,4-dihidroxibutirato, en el que la modificación genética para reducir la acumulación de 2,4-dihidroxibutirato intracelular es: i) una sobreexpresión de por lo menos un gen que codifica un sistema de eflujo seleccionado de entre el grupo que consiste en: ID Nº:5, SEC ID Nº:7, SEC ID Nº:9, SEC ID Nº:11, SEC ID Nº:13, SEC ID Nº:15, SEC ID Nº:17, y SEC ID Nº:19, - sistemas de eflujo de formiato de secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 21, - sistemas de eflujo de lactato de secuencia de aminoácidos SEC ID Nº:23, SEC ID Nº:25, SEC ID Nº:27, SEC ID Nº:29, SEC ID Nº:31, SEC ID Nº:33, SEC ID Nº:35, SEC ID Nº:37, SEC ID Nº:39, SEC ID Nº:41, 2SEC ID Nº:43, SEC ID Nº:45, SEC ID Nº:47, SEC ID Nº:49, SEC ID Nº:51, y SEC ID Nº:53, - sistemas de eflujo de malato de secuencia de aminoácidos SEC ID Nº:55, SEC ID Nº:57, SEC ID Nº:59, y SEC ID Nº:61, - sistemas de eflujo de succinato de secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 63, SEC ID Nº: 65, y SEC ID Nº: 67, - sistemas de eflujo de ácido carboxílico aromático de secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 69 y SEC ID Nº: 71, - variantes funcionales de los mismos que presentan una identidad de secuencia de por lo menos 80% con dichas secuencias de aminoácidos, y - cualquier combinación de los mismos; y/o ii) una atenuación de la expresión o la eliminación de por lo menos un gen que codifica un transportador de captación seleccionado de entre el grupo que consiste en: - transportadores de captación de alfa-cetoglutarato de secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 73, - transportadores de captación de lactato de secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 75, - transportadores de captación de glicolato de secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 77, - transportadores de captación de acetato de secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 79 y SEC ID Nº: 81, - transportadores de captación de propionato de secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 83, - transportadores de captación de pantotenato de secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 85, - transportadores de captación de succinato y acetato de secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 87, - transportadores de captación de acetoacetato de secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 89, - transportadores de captación de gluconato de secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 91, - transportadores de captación de secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 93, - variantes funcionales de los mismos que presentan una identidad de secuencia de por lo menos 80% con dichas secuencias de aminoácidos, y cualquier combinación de los mismos.

Description

DESCRIPCIÓN

Microorganismo modificado para la producción optimizada de 2,4-dihidroxibutirato con eflujo de 2,4-dihidroxibutirato aumentado.

Introducción

Se describe en la presente memoria un microorganismo recombinante capaz de producir 2,4-dihidroxibutirato, que se caracteriza por un aumento de la exportación celular, y preferentemente por una importación celular disminuida, de dicho 2,4-dihidroxibutirato. Asimismo se describe en la presente memoria un método para la producción optimizada de 2,4-dihidroxibutirato cultivando dicho microorganismo en un medio de fermentación y recuperando 2.4- dihidroxibutirato de dicho medio.

El ácido 2,4-dihidroxibutírico (es decir, 2,4-DHB o DHB), asimismo conocido como ácido 2,4-dihidroxibutanoico, 2.4- dihidroxibutirato o ácido 3-desoxi-L-glicero-tetrónico, es un compuesto químico industrial de alto interés económico ya que puede servir como precursor para la síntesis de diversos productos químicos a granel y finos, incluyendo los análogos de metionina-2-hidroxi-4-(metiltio)-butirato (HMTB) y 2-ceto-4(metiltio)butirato (KMTB) (ambos producidos a alrededor de 800.000 toneladas por año), gamma-butirolactona (GBL) (alrededor de 500.000 toneladas/año), así como muchos otros productos biotecnológicos (más de alrededor de 1.000.000 toneladas/año). En particular, HMTB es un aditivo alimentario muy conocido utilizado ampliamente en nutrición animal como un sustituto de aminoácidos de bajo precio (documento US2009/318715), mientras que GBL es un disolvente orgánico conocido que se utiliza para limpiar placas de circuitos, retirar pintura, dar sabor a productos de soja, o incluso para producir el fármaco ácido gamma-hidroxibutírico (GHB).

El ácido 2,4-dihidroxibutírico puede producirse convirtiendo el gliceritol en acroleína, seguido de la hidratación de la 2-desoxiglicerosa resultante (3-hidroxipropanal), posteriormente tratada con cianuro para producir un nitrilo, que entonces se hidroliza y se trata con brucina para aislar el enantiómero L de 2,4-DHB. Sin embargo, esta síntesis petroquímica de DHB no es económicamente viable, ya que depende del uso de materiales y condiciones peligrosas, consume mucho tiempo, y es costosa y, hasta el momento, no se ha identificado ninguna vía metabólica natural para su producción bioquímica.

De este modo, existe la necesidad en la técnica de producir este compuesto altamente relevante mediante métodos alternativos rentables, que reducirán la dependencia de las materias primas de petróleo.

Las rutas metabólicas sintéticas parecen ser particularmente atractivas, ya que proporcionan una forma verde y sostenible de producir 2,4-DHB, a un coste menor. De hecho, recientemente se han desarrollado diversos enfoques de ingeniería metabólica que se basan en la expresión recombinante de enzimas específicas en microorganismos: los documentos WO2012/056318, WO2013/160762, WO2014/009435 y EP14306564.7 describen la producción de 2,4-DHB por fermentación de glucosa en microorganismos genéticamente modificados, a través de diferentes rutas metabólicas. La mayoría de las enzimas identificadas en estas solicitudes de patente se obtuvieron mediante ingeniería racional basada en el conocimiento estructural y mecanicista de enzimas candidatas que actúan sobre sustratos afines estéricamente similares, o mediante la detección de enzimas naturales y una mejora adicional mediante un diseño racional. Más específicamente, el documento WO2012/056318 describe tres enzimas no naturales (malato cinasa, malato semi-aldehído deshidrogenasa y DHB deshidrogenasa, todas mutadas) que pueden sobreexpresarse en un microorganismo para transformar el intermediario metabólico (L)-malato en 2,4-DHB; el documento WO2013/160762 requiere la expresión heterogénea de diversas enzimas, algunas de ellas mutadas para mejorar la actividad enzimática y/o la afinidad del sustrato (malil-CoA sintetasa, y/o succinil-CoA: (L)-malato-CoA transferasa, y/o malil-CoA liasa; malil-CoA reductasa; y DHB deshidrogenasa) para transformar el malato intermediario metabólico, o succinil-CoA, o glicolil-CoA en 2,4-DHB; mientras que el método del documento WO2014/009435 se basa en la conversión del intermediario metabólico (L)-homoserina en 2-oxo-4-hidroxibutirato (OHB) y la reducción de OHB en 2,4-DHB mediante la expresión recombinante de dos enzimas mutadas (una homoserina transaminasa y una DHB reductasa). Recientemente, la compañía METabolic EXplorer diseñó una ruta sintética alternativa para la producción microbiana de ácido 2,4-dihidroxibutírico a partir del intermediario metabólico 1,2,4-butanotriol, en dos únicas etapas que comprenden la oxidación de 1,2,4-butanotriol en 2,4-dihidroxibutanal, seguido de la oxidación de 2,4-dihidroxibutanal en 2,4-DHB (solicitud de patente aún no publicada).

Sin embargo, estos enfoques diferentes requieren mejoras adicionales. De hecho, los microorganismos genéticamente modificados como se describe anteriormente producen 2,4-DHB por fermentación en una cantidad limitada, y una mayor tasa de producción y/o rendimiento en línea con una escala industrial deseable puede estar limitada por la acumulación de 2,4-DHB dentro de las células del microorganismo.

La presente invención aborda la necesidad discutida anteriormente en la técnica.

En particular, en el contexto de la presente invención se ha descubierto de manera sorprendente e inesperada que la producción global de 2,4-DHB puede mejorarse enormemente, independientemente de la ruta metabólica de producción de 2,4-DHB seleccionada, mediante la ingeniería genética de microorganismos, para reducir la acumulación de 2,4-DHB intracelular. Más particularmente, esta acumulación puede reducirse mejorando genéticamente la capacidad de exportación celular de 2,4-DHB del microorganismo de interés, así como atenuando genéticamente su importación intracelular de 2,4-DHB contenido en el medio de cultivo.

Por lo tanto, se proporciona en la presente memoria un microorganismo modificado genéticamente para una producción optimizada de 2,4-dihidroxibutirato. Este microorganismo, diseñado para producir 2,4-DHB, se modifica genéticamente para reducir la acumulación intracelular de 2,4-dihidroxibutirato, a fin de optimizar su producción.

Asimismo se proporciona en la presente memoria un método para la producción optimizada de 2,4-dihidroxibutirato por fermentación, que comprende cultivar el microorganismo de la invención en un medio de cultivo, y recuperar el 2,4-DHB producido a partir del medio de cultivo.

Sumario de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones 1 a 10.

Descripción detallada de la invención

A menos que se indique lo contrario, los términos científicos y técnicos utilizados en relación con la presente invención tendrán los significados que comúnmente entienden los expertos ordinarios en la materia. Además, a menos que el contexto requiera lo contrario, las nomenclaturas utilizadas en la presente memoria y las técnicas de biología molecular, cultivo celular, son las bien conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía (ver Sambrook et al., 2012).

Sin embargo, con respecto al uso de diferentes términos a lo largo de la memoria descriptiva actual, se aplican más particularmente las siguientes definiciones.

Las formas singulares “un”, “una” y “el/la” incluyen en la presente memoria una referencia plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, una referencia a “un microorganismo” incluye una pluralidad de tales microorganismos, y una referencia a “un gen endógeno” es una referencia a uno o más genes endógenos, y así sucesivamente.

Los términos “comprender”, “contener”, “involucrar” o “ incluir”, o variaciones tales como “comprende”, “que comprende”, “que contiene”, “involucrado”, “incluye”, “que incluye”, se usan en la presente memoria de manera inclusiva, es decir, para especificar la presencia de las características indicadas, pero no impedir la presencia o adición de características adicionales en diversas formas de realización de la invención.

El término “microorganismo”, como se usa en la presente memoria, se refiere a un organismo microscópico vivo, que puede ser una sola célula o un organismo multicelular, y que generalmente se puede encontrar en la naturaleza. En el presente contexto, el microorganismo es preferentemente una bacteria, levadura u hongo. Más preferentemente, el microorganismo se selecciona de entre Enterobacteriaceae, Bacillaceae, Clostridiaceae, Streptomycetaceae, Corynebacteriaceae y levadura. Aún más preferentemente, el microorganismo es una especie de Escherichia, Klebsiella, Thermoanaerobacterium, Clostridium Corynebacterium o Saccharomyces. Aún, incluso más preferentemente, el microorganismo se selecciona de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum, Clostridium acetobutylicum, Corynebacterium glutamicum y Saccharomyces cerevisiae. Todavía más preferentemente, el microorganismo de la invención es Escherichia coli.

La expresión “microorganismo recombinante”, “microorganismo modificado genéticamente”, o “microorganismo manipulado genéticamente”, como se usa en la presente memoria, se refiere a un microorganismo como se definió anteriormente que no se encuentra en la naturaleza y, por lo tanto, difiere genéticamente de su contraparte natural. En otras palabras, se refiere a un microorganismo que se modifica por introducción y/o por eliminación y/o por modificación de sus elementos genéticos. Dicha modificación puede realizarse mediante ingeniería genética, forzando el desarrollo y la evolución de nuevas rutas metabólicas cultivando el microorganismo bajo una presión de selección específica, o combinando ambos métodos (véanse, por ejemplo, los documentos WO2005/073364 o WO2008/116852).

Por lo tanto, un microorganismo modificado genéticamente para la producción de 2,4-DHB como se proporciona en la presente memoria significa que dicho microorganismo es un microorganismo recombinante como se definió anteriormente que es capaz de producir 2,4-DHB. En otras palabras, dicho microorganismo ha sido modificado genéticamente para permitir la producción de 2,4-DHB.

Como se explica a continuación, el microorganismo proporcionado en la presente memoria puede modificarse genéticamente modulando el nivel de expresión de uno o más genes endógenos, y/o expresando uno o más genes heterólogos en dicho microorganismo.

Por “gen”, se entiende en la presente memoria una molécula de ácido nucleico o polinucleótido que codifica una proteína particular (es decir, un polipéptido), o en ciertos casos, una molécula de ARN funcional o estructural. Los genes a los que se hace referencia en la presente memoria codifican proteínas, tales como enzimas, sistemas de eflujo, o transportadores de absorción. Los genes proporcionados en la presente memoria son genes endógenos o exógenos. Por “gen endógeno”, se entiende en la presente memoria que dicho gen está naturalmente presente en el microorganismo, mientras que la expresión “gen exógeno” (o alternativamente, “gen heterólogo” o “transgén”) se refiere a un gen que no está presente naturalmente en el microorganismo.

En el presente contexto, si el microorganismo se modifica genéticamente para “modular” el nivel de expresión de uno o más genes endógenos, se quiere decir en la presente memoria que el nivel de expresión de dicho gen está regulado al alza, a la baja (es decir, atenuado), o incluso completamente abolido por comparación con su nivel de expresión natural. Tal modulación puede por lo tanto dar como resultado una mejora de la actividad del producto génico, o alternativamente, una actividad menor o nula del producto génico endógeno.

Un gen endógeno puede sobreexpresarse introduciendo secuencias heterólogas que favorecen la regulación positiva además de elementos reguladores endógenos, o sustituyendo esos elementos reguladores endógenos por tales secuencias heterólogas, o introduciendo una o más copias suplementarias del gen endógeno en el cromosoma o un plásmido dentro del microorganismo. La actividad del gen endógeno y/o el nivel de expresión asimismo se pueden modificar mediante la introducción de mutaciones en su secuencia codificante para modificar el producto del gen. Asimismo se puede realizar una eliminación de un gen endógeno para inhibir totalmente su expresión dentro del microorganismo. Otra forma de modular la expresión de un gen endógeno es intercambiar su promotor (es decir, el promotor de tipo salvaje) con un promotor más fuerte o más débil para aumentar o disminuir el nivel de expresión de este gen. Los promotores adecuados para tal fin pueden ser homólogos o heterólogos, y son bien conocidos en la técnica. Resulta evidente para el experto en la materia seleccionar promotores apropiados para modular la expresión de un gen endógeno.

Además, o alternativamente, el microorganismo de la invención puede modificarse genéticamente para expresar uno o más genes exógenos, siempre que dichos genes se introduzcan en el microorganismo con todos los elementos reguladores necesarios para su expresión en el microorganismo hospedante. La modificación o “transformación” de microorganismos con ADN exógeno es una tarea rutinaria para los expertos en la materia. En el contexto de la presente invención, el término “sobreexpresión” o “sobreexpresando” asimismo se usa en la presente memoria en relación con la expresión de genes exógenos en el microorganismo.

Para expresar un gen exógeno en un microorganismo, dicho gen puede integrarse directamente en el cromosoma del microorganismo, o puede expresarse extracromosómicamente por plásmidos o vectores dentro del microorganismo. En la técnica se conoce una variedad de plásmidos, que difieren con respecto a su origen de replicación y su número de copias en una célula, y se pueden seleccionar fácilmente por el profesional experto para tal fin. Los genes exógenos son ventajosamente genes homólogos.

En el presente contexto, la expresión “gen homólogo” u “homólogo” no únicamente se refiere a un gen heredado por dos especies (es decir, especies de microorganismos) por un ancestro genético común teórico, sino que asimismo incluye genes que pueden estar genéticamente no relacionados que, sin embargo, evolucionaron para codificar proteínas que realizan funciones similares y/o tienen una estructura similar (es decir, homólogo funcional). Por lo tanto, la expresión “homólogo funcional” se refiere en la presente memoria a un gen que codifica una proteína funcionalmente homóloga.

Utilizando la información disponible en bases de datos tales como Uniprot (para proteínas), Genbank (para genes), o NCBI (para proteínas o genes), los expertos en la materia pueden determinar fácilmente la secuencia de una proteína específica y/o gen de un microorganismo, e identificar, sobre la base de esta secuencia, la de genes equivalentes, u homólogos, en otro microorganismo. Este trabajo de rutina se puede realizar mediante una alineación de secuencia de una secuencia génica específica de un microorganismo con secuencias genéticas o el genoma de otros microorganismos, que se puede encontrar en las bases de datos mencionadas anteriormente. Dicha alineación de secuencia se puede realizar ventajosamente utilizando el algoritmo BLAST desarrollado por Altschul et al. (1990). Una vez que se ha establecido una homología de secuencia entre esas secuencias, se puede derivar una secuencia de consenso y utilizarla para diseñar sondas degeneradas para clonar el gen homólogo correspondiente del microorganismo relacionado. Estos métodos rutinarios de biología molecular son bien conocidos por los expertos en la materia.

Se entenderá además que, en el contexto de la presente invención, si un gen exógeno que codifica una proteína de interés se expresa en un microorganismo específico, una versión sintética de este gen se construye preferentemente reemplazando codones no preferidos o codones menos preferidos por codones preferidos de dicho microorganismo que codifican el mismo aminoácido. De hecho, es bien conocido en la técnica que el uso de codones varía entre las especies de microorganismos, lo que puede afectar el nivel de expresión recombinante de la proteína de interés. Para superar este problema, se han desarrollado métodos de optimización de codones, y se describen ampliamente en Graf et al. (2000), Deml et al. (2001) o Davis y Olsen (2011). Se han desarrollado varios softwares para la determinación de la optimización de codones, tales como el software GeneOptimizer® (Lifetechnologies) o el software OptimumGene™ (GenScript). En otras palabras, el gen exógeno que codifica una proteína de interés está preferentemente optimizado en sus codones para la expresión en un microorganismo específico.

El microorganismo descrito en la presente memoria asimismo puede modificarse genéticamente para aumentar o disminuir la actividad de una o más proteínas.

El aumento de dicha actividad puede obtenerse mejorando la eficiencia catalítica de la proteína, disminuyendo el recambio de proteínas, disminuyendo el recambio de ARN mensajero (ARNm), aumentando la transcripción del gen, o aumentando la traducción del ARNm.

Mejorar la eficiencia catalítica de la proteína significa aumentar la kcat y/o disminuir la Km para un sustrato y/o un cofactor dado, y/o aumentar la Ki para un inhibidor dado. Kcat, Km y Ki son constantes de Michaelis-Menten que el experto en la materia es capaz de determinar (Segel, 1993). Disminuir el recambio proteico significa estabilizar la proteína. Los métodos para mejorar la eficiencia catalítica de la proteína y/o disminuir el recambio de la proteína son bien conocidos por el experto en la materia. Estos incluyen la manipulación racional con análisis de secuencias y/o estructural y mutagénesis dirigida, así como mutagénesis aleatoria y detección. Las mutaciones pueden introducirse mediante mutagénesis dirigida al sitio mediante métodos convencionales tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), mediante técnicas de mutagénesis al azar, por ejemplo mediante agentes mutágenos (rayos ultravioleta o agentes químicos tales como nitrosoguanidina (NTG) o metanosulfonato de etilo (EMS)) o barajado de ADN o PCR propensa a errores. La estabilización de la proteína asimismo se puede lograr mediante la adición de una secuencia peptídica “etiqueta” en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal de la proteína. Dichas etiquetas son bien conocidas en la técnica e incluyen, entre otras, la glutationa-S-transferasa (GST).

Se puede lograr una disminución del recambio de ARNm modificando la secuencia génica de la región no traducida de 5' (5'-UTR) y/o la región codificante, y/o la 3'-UTR (Carrier y Keasling, 1999).

Se puede aumentar la transcripción de un gen, ya sea endógeno o exógeno, aumentando el número de sus copias dentro del microorganismo y/o utilizando un promotor que conduce a un mayor nivel de expresión del gen en comparación con el promotor de tipo salvaje. En el contexto de la presente invención, el término “sobreexpresión” o “sobreexpresando” asimismo se usa para designar un aumento en la transcripción de un gen en un microorganismo.

Como se indicó anteriormente, para aumentar el número de copias de un gen en el microorganismo, dicho gen puede codificarse cromosómicamente o extracromosómicamente. Cuando el gen de interés se codifica en el cromosoma, se pueden introducir varias copias del gen en el cromosoma mediante métodos de recombinación genética, que son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, reemplazo de genes). Cuando el gen debe codificarse de forma extracromosómica en el microorganismo, puede ser transportado por diferentes tipos de plásmidos que difieren con respecto a su origen de replicación dependiendo del microorganismo en el que pueden replicarse, y por su número de copias en la célula. El microorganismo transformado por dicho plásmido puede contener de 1 a 5 copias del plásmido, o alrededor de 20 copias del mismo, o incluso hasta 500 copias del mismo, dependiendo de la naturaleza del plásmido. ejemplos de plásmidos de bajo número de copias que pueden replicarse en E. coli incluyen, sin limitación, el plásmido pSC101 (replicación estricta), el plásmido RK2 (replicación estricta), así como los plásmidos pACYC y pRSF1010, mientras que un ejemplo de plásmido de alto número de copias que puede replicarse en E. coli es pSK bluescript II.

Los promotores que pueden aumentar el nivel de expresión de un gen asimismo son bien conocidos por el experto en la materia, y pueden ser homólogos (procedentes de la misma especie) o heterólogos (procedentes de una especie diferente). Los ejemplos de tales promotores incluyen, sin limitación, los promotores Ptrc, Ptac, Plac, y el promotor lambda cl. Estos promotores asimismo pueden ser inducidos (“promotores inducibles”) por un compuesto particular o por una condición externa específica tal como temperatura o luz.

El incremento de la traducción del ARNm se puede lograr modificando el sitio de unión al ribosoma (RBS). Un RBS es una secuencia en el ARNm que está unida por el ribosoma cuando se inicia la traducción de proteínas. Puede ser la caperuza de 5' de un ARNm en eucariotas, una región 6-7 nucleótidos en dirección 5' del codón de inicio AUG en procariotas (denominada la secuencia Shine-Dalgarno), o un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) en virus. Al modificar esta secuencia, es posible cambiar la velocidad de inicio de la traducción de proteínas, para alterar proporcionalmente su velocidad de producción, y controlar su actividad dentro de la célula. Asimismo es posible optimizar la fuerza de una secuencia RBS para lograr una tasa de inicio de traducción específica mediante el uso del software RBS CALCULATOR (Salis, 2011). Resulta evidente para el experto en la materia seleccionar la secuencia RBS en función de la naturaleza del ARNm.

Disminuir la actividad de una proteína puede significar disminuir su actividad catalítica específica al mutar el gen que codifica dicha proteína para cambiar la secuencia de aminoácidos correspondiente y/o disminuir las concentraciones de la proteína en la célula al mutar la secuencia nucleotídica o al eliminar la región codificante de dicho gen.

Como se usa en la presente memoria, el término “sistema de eflujo”, “bomba de eflujo”, “transportador de eflujo”, o “exportador”, se refiere a un conjunto de proteínas que exporta moléculas de sustrato desde el citoplasma y/o periplasma de una célula, de manera dependiente de la energía. Por lo tanto, un sistema de eflujo se ubica típicamente en la membrana citoplasmática de la célula (que comprende la membrana citoplasmática). Especialmente, en bacterias gramnegativas, tales como Escherichia coli, el sistema de eflujo puede comprender el espacio periplásmico y asimismo puede haber una porción del sistema de eflujo que se extiende por la membrana externa. Los sistemas de eflujo bacterianos son bien conocidos en la técnica, especialmente por ejemplo a través del sistema de clasificación de mecanismos de transporte descrito por Milton H. Saier Jr. de la University of California en San Diego (sitio web: http://www.tcdb.org/), y generalmente se clasifican como transportadores activos primarios que usan trifosfato de adenosina (ATP) como fuente de energía, o como transportadores activos secundarios en los que el transporte es impulsado por la diferencia de potencial electroquímico del sustrato transportado (uniportadores) o por acoplamiento al transporte de un segundo sustrato (por ejemplo, iones de hidrógeno o sodio) desde o hacia el exterior de la célula (antiportadores y simportadores). Hasta el momento se han identificado cinco superfamilias de transportadores de eflujo bacterianos, en función de su secuencia de aminoácidos y la fuente de energía utilizada para exportar sus sustratos, e incluyen la superfamilia de facilitadores principales (MFS), la superfamilia de casetes de unión a ATP (ABC), la familia de resistencia pequeña a múltiples fármacos (SMR), la superfamilia de resistencia-nodulación-división celular (RND), y la familia de proteínas de extrusión antimicrobiana múltiple (MATE). En el presente contexto, los sistemas de eflujo exportan 2,4-DHB como sustrato del citoplasma celular y/o periplasma en el medio de cultivo en el que se hace crecer el microorganismo. Hasta el momento, tales sistemas de eflujo que exportan 2,4-DHB seguían siendo desconocidos. Los sistemas de eflujo que son capaces de exportar 2,4-DHB se identifican en la presente memoria. La capacidad de un sistema de eflujo candidato para exportar 2,4-DHB de la o las células se puede evaluar midiendo in vitro la cantidad extracelular de 2,4-DHB producida a partir de células que expresan o sobreexpresan naturalmente dicho sistema de eflujo en comparación con las células de control que no expresan este sistema. Esto asimismo se puede hacer midiendo la concentración intracelular de 2,4-DHB en la o las células. La inhibición de la exportación puede evaluarse adicionalmente midiendo la capacidad de un inhibidor conocido de este sistema de eflujo para reducir la exportación de 2,4-DHB de la o las células o para aumentar la concentración de 2,4-DHB dentro de la o las células. Para hacerlo, un experto en la materia puede adaptar los protocolos de acuerdo con la evaluación de los procedimientos de extracción y análisis de metabolitos para evaluar los sistemas de eflujo de diversos sustratos que se han descrito ampliamente en la bibliografía y las solicitudes de patentes (por ejemplo, Kutukova et al., 2005; Hiller et al., 2007; Kiefer et al., 2007; Bolten et al., 2007; Zittrich y Kramer, 1994; Dassler et al., 2000; WO2005/085463; EP1239041). A continuación se describen ejemplos de sistemas de eflujo adecuados, especialmente en la tabla 1.

Por “transportador de captación”, “sistema de captación”, “bomba de captación”, o “portador de captación”, se entiende en la presente memoria un conjunto de proteínas que importa moléculas de sustrato en el citoplasma y/o periplasma de una célula, de manera dependiente o independiente de la energía (captación activa o pasiva). De manera similar a los sistemas de eflujo, los transportadores de captación pueden ubicarse en la membrana citoplasmática y/o periplásmica de una célula. Los transportadores de captación bacterianos son bien conocidos en la técnica, y han sido clasificados, por ejemplo, por Milton H. Saier Jr. de la Universidad de California en San Diego (sitio web: http://www.tcdb.org/)]. En el contexto de la presente invención, los transportadores de captación importan 2,4-DHB como sustrato del medio de cultivo en el que el microorganismo se hace crecer en el citoplasma celular y/o periplasma de dicho microorganismo. Hasta el momento, tales sistemas de eflujo que exportan 2,4-DHB seguían siendo desconocidos. Los transportadores de captación que son capaces de importar 2,4-DHB se identifican en la presente memoria. La capacidad de un transportador de captación candidato para importar 2,4-DHB en la o las células se puede evaluar midiendo la cantidad intracelular de 2,4-DHB contenida en las células que expresan o sobreexpresan naturalmente dicho transportador en comparación con las células de control que no expresan este transportador. La inhibición de la importación puede evaluarse adicionalmente midiendo la capacidad de un inhibidor conocido de este transportador para reducir la captación de 2,4-DHB en la o las células. Para hacerlo, un experto en la materia puede adaptar protocolos para evaluar transportadores de captación de diversos sustratos que se han descrito ampliamente en la bibliografía y la solicitud de patente (Kurihara et al., 2009; Hiller et al., 2007; Kiefer et al., 2007; Bolten et al., 2007; WO2014029592). A continuación se describen adicionalmente ejemplos de transportadores de captación adecuados, en particular en la tabla 1.

De manera general, la relevancia de la modificación genética del sistema de eflujo y/o captación específico del 2,4-DHB se monitoriza mediante la mejora de la producción de dicha molécula y/o mediante la resistencia a una gran cantidad de dicha molécula. En este último, la tasa de crecimiento de las cepas recombinantes se mide y se considera como el signo de la reducción de la concentración de 2,4-DHB dentro de la célula.

Por “gen que codifica un sistema de eflujo o un transportador de captación”, se entiende en la presente memoria una secuencia polinucleotídica o de ácido nucleico que codifica dicho sistema o transportador. En el caso de la sobreexpresión de genes exógenos que codifican un sistema de eflujo, un experto en la materia reconocerá fácilmente que la secuencia polinucleotídica insertada no necesita ser idéntica, y puede ser “sustancialmente idéntica” a la secuencia del gen del que deriva. De hecho, debido a la degeneración de los codones, varias secuencias polinucleotídicas codificarán la misma proteína. Además, como se explicó anteriormente, el gen exógeno que codifica una proteína de interés está preferentemente optimizado en sus codones para la expresión en un microorganismo específico. Dicha definición se aplica, mutatis mutandis, a genes que codifican otras proteínas descritas en la presente memoria.

Mediante “variantes funcionales”, se hace referencia en la presente memoria a proteínas que estructuralmente difieren de la secuencia de aminoácidos de una proteína de referencia, pero que generalmente retienen todas las características funcionales esenciales de dicha proteína de referencia. Una variante de una proteína puede ser una variante natural o una variante no natural. Dichas variantes de origen no natural de la proteína de referencia se pueden obtener, por ejemplo, mediante técnicas de mutagénesis en los genes o ácidos nucleicos codificantes, por ejemplo mediante mutagénesis aleatoria o mutagénesis dirigida al sitio.

Las diferencias estructurales pueden estar limitadas de tal manera que la secuencia de aminoácidos de la proteína de referencia y la secuencia de aminoácidos de la variante pueden ser muy similares en general, e idénticas en muchas regiones. Las diferencias estructurales pueden resultar de sustituciones, eliminaciones y/o adiciones de aminoácidos conservativas o no conservativas entre la secuencia de aminoácidos de la proteína de referencia y la variante. La única condición es que, incluso si se sustituyen, eliminan y/o añaden algunos aminoácidos, la variante retiene la actividad biológica de la secuencia de aminoácidos de la proteína de referencia. Es decir, en el presente contexto, la variante de un sistema de eflujo es capaz de exportar 2,4-DHB de la o las células del microorganismo, mientras que la variante de un transportador de captación es capaz de importar 2,4-DHB dentro de la o las células del microorganismo. La capacidad de las variantes para exhibir dicha actividad se puede evaluar de acuerdo con los ensayos in vitro descritos anteriormente. Sin embargo, debe observarse que la actividad de dichas variantes puede diferir en su eficiencia de exportación o importación de 2,4-DHB en comparación con la actividad de las secuencias de aminoácidos de los sistemas de eflujo o los transportadores de captación de referencia.

Las “variantes funcionales” de sistemas de eflujo o transportadores de captación incluyen, pero no se limitan a, proteínas que tienen secuencias de aminoácidos que son por lo menos 80% idénticas después de la alineación con la secuencia de aminoácidos que codifica dichos sistemas de eflujo o transportadores de captación. Preferentemente, dichas variantes tienen una identidad de secuencia de 85%, 90%, 95% con dichos sistemas de eflujo o transportadores de captación, y más preferentemente tienen una identidad de secuencia de 96%, 97%, 98%, 99% o 99,999% de dichos sistemas de eflujo o transportadores de captación.

La identidad de secuencia entre secuencias de aminoácidos se puede determinar comparando una posición en cada una de las secuencias que se pueden alinear a efectos de comparación. Cuando una posición en las secuencias comparadas está ocupada por el mismo aminoácido, entonces las secuencias son idénticas en esa posición. Un grado de identidad de secuencia entre proteínas es una función del número de restos de aminoácidos idénticos en las posiciones compartidas por las secuencias de dichas proteínas.

Para determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos, las secuencias se alinean para una comparación óptima. Por ejemplo, pueden introducirse espacios vacíos en la secuencia de una primera secuencia de aminoácidos para una alineación óptima con la segunda secuencia de aminoácidos. Después se comparan los restos de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo resto de aminoácido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, las moléculas son idénticas en esa posición.

El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias. Por lo tanto, % de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones que solapan X 100.

La alineación óptima de secuencias puede realizarse mediante el algoritmo de alineación de homología global de Needleman y Wunsch (1972), mediante implementaciones computarizadas de este algoritmo, o mediante inspección visual. Se selecciona la mejor alineación (es decir, que da como resultado el mayor porcentaje de identidad entre las secuencias comparadas) generada por los diversos métodos.

Es decir, el porcentaje de identidad de secuencia se calcula comparando dos secuencias alineadas de manera óptima, determinando el número de posiciones en las que se produce el aminoácido idéntico en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones, y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.

La expresión “hidrato de carbono” se refiere en la presente memoria a cualquier fuente de carbono capaz de ser metabolizada por un microorganismo y que contiene por lo menos un átomo de carbono, dos átomos de hidrógeno y un átomo de oxígeno. El hidrato de carbono se selecciona preferentemente de entre el grupo que consiste en monosacáridos tales como glucosa, fructosa, manosa, galactosa, y similares, disacáridos tales como sacarosa, celobiosa, maltosa, lactosa, y similares, oligosacáridos tales como rafinosa, estacquiosa, maltodextrinas, y similares, polisacáridos tales como celulosa, hemicelulosa, almidón, y similares, metanol, formaldehído y glicerol. Preferentemente, la fuente de carbono es ventajosamente un hidrato de carbono que comprende 3, 6 o 12 átomos de carbono, o cualquier combinación de los mismos. Más preferentemente, la fuente de carbono se selecciona de entre xilosa, glicerol, glucosa, galactosa, fructosa, lactosa, maltosa, sacarosa, y cualquier combinación de los mismos.

Reducción de la acumulación DE 2,4-DHB intracelular

En un primer aspecto, se proporciona en la presente memoria un microorganismo modificado genéticamente para producir 2,4-dihidroxibutirato por fermentación, en el que dicho microorganismo se modifica genéticamente para reducir la acumulación intracelular de 2,4-dihidroxibutirato, optimizando así la producción de 2,4-dihidroxibutirato. Preferentemente, la modificación genética para reducir la acumulación de 2,4-dihidroxibutirato intracelular es: i) una sobreexpresión de por lo menos un gen que codifica un sistema de eflujo; y/o

ii) una atenuación de la expresión o la eliminación de por lo menos un gen que codifica un transportador de captación.

El sistema de eflujo que se debe sobreexpresar se selecciona más preferentemente de entre el grupo que consiste en sistemas de eflujo de monocarboxilato, sistemas de eflujo de formiato, sistemas de eflujo de lactato, sistemas de eflujo de malato, sistemas de eflujo de succinato, sistemas de eflujo de ácido carboxílico aromático, variantes funcionales de los mismos, y cualquier combinación de los mismos.

Más preferentemente, dicho sistema de eflujo se selecciona de entre el grupo que consiste en:

° sistemas de eflujo de monocarboxilato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°:1, SEC ID N°:3, SEC ID N°:5, SEC ID N°:7, SEC ID N°:9, SEC ID N°:11, SEC ID N°:13, SEC ID N°:15, SEC ID N°:17, y SEC ID N°:19,

° sistemas de eflujo de formiato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°:21,

° sistemas de eflujo de lactato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°:23, SEC ID N°:25, SEC ID N°:27,

SEC ID N°:29, SEC ID N°:31, SEC ID N°:33, SEC ID N°:35, SEC ID N°:37, SEC ID N°:39, SEC ID N°:41,

SEC ID N°:43, SEC ID N°:45, SEC ID N°:47, SEC ID N°:49, SEC ID N°:51, y SEC ID N°:53,

° sistemas de eflujo de malato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°:55, SEC ID N°:57, SEC ID N°:59, y SEC ID N°:61,

° sistemas de eflujo de succinato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 63, SEC ID N°: 65 y SEC ID N°: 67,

° sistemas de eflujo de ácido carboxílico aromático de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 69 y SEC ID N°: 71,

° variantes funcionales de los mismos que presentan una identidad de secuencia de por lo menos 80% con dichas secuencias de aminoácidos, y

° cualquier combinación de los mismos.

Incluso más preferentemente, dicho sistema de eflujo se selecciona de entre el grupo que consiste en:

° sistemas de eflujo de monocarboxilato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 1,

° sistemas de eflujo de lactato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 23,

° sistemas de eflujo de lactato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 25,

° variantes funcionales de los mismos que tienen una identidad de secuencia de por lo menos 80% con dichas secuencias de aminoácidos, y

° cualquier combinación de los mismos.

El transportador de captación que se debe atenuar o eliminar se selecciona más preferentemente de entre el grupo que consiste en transportadores de captación de alfa-cetoglutarato, transportadores de captación de lactato, transportadores de captación de glicolato, transportadores de captación de acetato, transportadores de captación de propionato, transportadores de captación de pantotenato, transportadores de captación de succinato y acetato, transportadores de captación de acetoacetato, transportadores de captación de gluconato, variantes funcionales de los mismos, y cualquier combinación de los mismos.

Más preferentemente, dicho transportador de captación se selecciona de entre el grupo que consiste en:

° transportadores de captación de alfa-cetoglutarato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 73, ° transportadores de captación de lactato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 75,

° transportadores de captación de glicolato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 77,

° transportadores de captación de acetato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 79 y SEC ID N°: 81, ° transportadores de captación de propionato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 83,

° transportadores de captación de pantotenato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 85,

° transportadores de captación de succinato y acetato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 87, ° transportadores de captación de acetoacetato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 89,

° transportadores de captación de gluconato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 91,

° transportadores de captación de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 93,

° cualquier combinación de los mismos.

Incluso más preferentemente, dicho transportador de captación se selecciona de entre el grupo que consiste en: ° transportadores de captación de alfa-cetoglutarato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 73, ° transportadores de captación de lactato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 75,

° cualquier combinación de los mismos.

Más específicamente, la presente invención se refiere a microorganismos que comprenden las modificaciones definidas en las reivindicaciones 1 a 3.

Los sistemas de eflujo y los transportadores de captación mencionados anteriormente son bien conocidos en la técnica, y se describen a continuación en la tabla 1 y los ejemplos 2 y 3.

Tabla 1: Proteínas y genes para reducir la acumulación intracelular de 2,4 DHB (NA = no disponible; *: sustratos conocidos en la técnica que son exportados desde el citoplasma y/o periplasma de la célula por dichos sistemas de eflujo, o que son importados en el citoplasma y/o periplasma de la célula por dichos transportadores de captación)

Rutas metabólicas para la producción de 2,4-DHB

Como se indicó anteriormente, el microorganismo se modifica genéticamente para producir 2,4-DHB. Resulta evidente para el experto en la materia cómo manipular dicho microorganismo. De hecho, en la técnica se han descrito diversas rutas metabólicas genéticamente manipuladas para producir 2,4-DHB en microorganismos, especialmente en las solicitudes de patentes WO2012/056318, WO2013/160762 y WO2014/009435, dependiendo del intermediario metabólico de interés del que pueda derivar 2,4-DHB. Los ejemplos de dicho intermediario metabólico incluyen, sin limitación, 1,2,4-butanotriol, (L)-malato, (L)malil-CoA y (L)-homoserina.

De este modo, es una forma de realización preferida de la invención proporcionar un microorganismo en el que la acumulación intracelular de 2,4-dihidroxibutirato se reduce por las modificaciones genéticas como se describe anteriormente, y que asimismo se modifica genéticamente para convertir por lo menos uno de los siguientes intermediarios metabólicos en 2,4-dihidroxibutirato:

iii) 1,2,4-butanotriol;

iv) (L)-malato;

v) (L)malil-CoA; y

vi) (L)-homoserina.

El experto en la materia comprenderá fácilmente que las formas de realización preferidas relacionadas con la reducción de la acumulación intracelular de 2,4-dihidroxibutirato como se describe anteriormente se pueden combinar con la forma de realización preferida relacionada con la producción de 2,4-DHB que se describe a continuación.

Producción de 2,4-dihidroxibutirato a través de la ruta del 1,2,4-butanotriol

Una posible ruta sintética para la producción microbiana de ácido 2,4-dihidroxibutírico a partir del intermediario metabólico 1,2,4-butanotriol se puede realizar en dos etapas individuales, que requieren sucesivamente la oxidación de 1,2,4-butanotriol en 2,4-dihidroxibutanal, seguido de la oxidación de 2,4-dihidroxibutanal a 2,4-DHB. Preferentemente, el microorganismo como se describe anteriormente se modifica genéticamente para convertir 1,2,4-butanotriol en 2,4-dihidroxibutirato, de acuerdo con las siguientes modificaciones:

° sobreexpresión de por lo menos un polinucleótido que codifica una oxidorreductasa que actúa sobre el grupo CH-OH de los donantes, convirtiendo así el 1,2,4-butanotriol en 2,4-dihidroxibutanal; y

° sobreexpresión de por lo menos un polinucleótido que codifica una oxidorreductasa que actúa sobre el grupo aldehido u oxo de los donantes, convirtiendo así el 2,4-dihidroxibutanal en 2,4-dihidroxibutirato. Los ejemplos de oxidorreductasas que actúan sobre el grupo CH-OH de los donantes incluyen, sin limitación, las enzimas EC 1.1.1 (oxidorreductasas con NAD+ o NADP+ como aceptor, asimismo conocidas como NAD+/NADP+ oxidorreductasas), enzimas EC 1.1.2 (oxidorreductasas con un citocromo como aceptor), enzimas EC 1.1.3 (oxidorreductasas con oxígeno como aceptor), enzimas EC 1.1.4 (oxidorreductasas con un disulfuro como aceptor), enzimas EC 1.1.5 (oxidorreductasas con una quinona o un compuesto similar como aceptor), enzimas EC 1.1.98 (oxidorreductasas con otros aceptores conocidos), y enzimas EC 1.1.99 (oxidorreductasas con otros aceptores).

Los ejemplos de oxidorreductasas que actúan sobre el grupo aldehído u oxo de los donantes incluyen, sin limitación, enzimas EC 1.2.1 (oxidorreductasas con NAD+ o NADP+ como aceptor, asimismo conocidas como NAD+/NADP+ oxidorreductasas), enzimas EC 1.2.2 (oxidorreductasas con un citocromo como aceptor), enzimas EC 1.2.3 (oxidorreductasas con oxígeno como aceptor), enzimas EC 1.2.4 (oxidorreductasas con un disulfuro como aceptor), enzimas EC 1.2.5 (oxidorreductasas con una quinona o un compuesto similar como aceptor), enzimas EC 1.2.7 (oxidorreductasas con una proteína de hierro-azufre como aceptor), y EC enzimas 1.2.99 (oxidorreductasas con otros aceptores).

Las enzimas que muestran las actividades anteriores son bien conocidas en la técnica, y el experto en la materia puede identificarlas fácilmente, por ejemplo a partir de bases de datos disponibles públicamente tal como BRENDA.

Para oxidar el 1,2,4-butanotriol en 2,4-dihidroxibutanal, la oxidorreductasa que actúa sobre el grupo CH-OH de los donantes (enzima EC 1.1) se selecciona preferentemente de entre el grupo que consiste en alcohol deshidrogenasas (o aldehído reductasa), lactaldehído reductasas, glioxilato reductasas, dideshidrogluconato reductasas, y cualquier combinación de las mismas. Más preferentemente, dicha oxidorreductasa EC 1.1 es una alcohol deshidrogenasa (o aldehído reductasa) o una lactaldehído reductasa. Aún, incluso más preferentemente, dicha oxidorreductasa EC 1.1 es una NAD+/NADP+ oxidorreductasa que actúa sobre el grupo CH-OH de los donantes (es decir, una enzima EC 1.1.1), o una oxidorreductasa que actúa sobre el grupo CH-OH de los donantes con otros aceptores (es decir, una enzima EC 1.1.99). Todavía más preferentemente, dicha enzima EC 1.1 es una enzima EC 1.1.1. Resulta evidente para el experto en la materia cómo seleccionar las enzimas EC 1.1 que son adecuadas, e identificar sus secuencias de genes correspondientes (es decir, nucleótidos).

Las oxidorreductasas particularmente preferidas que actúan sobre el grupo CH-OH de los donantes (enzimas EC 1.1) se describen en la tabla 2 a continuación: las alcohol deshidrogenasas incluyen, sin limitación, las enzimas de la secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 95 a SEC ID N°: 134; las lactaldehído reductasas incluyen, sin limitación, la enzima de la secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 135; las glioxilato reductasas incluyen, sin limitación, las enzimas de la secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 136 y SEC ID N°: 137, y las dideshidrogluconato reductasas incluyen, sin limitación, las enzimas de la secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 138 y SEC ID N°: 139.

Preferentemente, la oxidorreductasa que actúa sobre el grupo CH-OH de los donantes (enzima EC 1.1) es una enzima de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 130 o SEC ID N°: 135.

Como se indicó anteriormente, para oxidar el 2,4-dihidroxibutanal en 2,4-dihidroxibutirato, el microorganismo se modifica genéticamente para sobreexpresar por lo menos un gen que codifica una oxidorreductasa que actúa sobre el grupo aldehído u oxo de los donantes (enzima EC 1.2).

Por lo tanto, la oxidorreductasa que actúa sobre el grupo aldehído u oxo de los donantes (enzima EC 1.2) se selecciona preferentemente de entre el grupo que consiste en aldehído deshidrogenasas, aldehído oxidasas, y cualquier combinación de las mismas. Más preferentemente, dicha oxidorreductasa EC 1.2 es una aldehído deshidrogenasa. Aún, incluso más preferentemente, dicha oxidorreductasa EC 1.2 es una NAD+/NADP+ oxidorreductasa que actúa sobre el grupo aldehído u oxo de los donantes (es decir, una enzima EC 1.2.1), o una oxidorreductasa que actúa sobre el grupo aldehído u oxo de los donantes con oxígeno como aceptor (es decir, una enzima EC 1.2.3). Todavía más preferentemente, dicha enzima EC 1.2 es una enzima EC 1.2.1. Resulta evidente para el experto en la materia cómo seleccionar las enzimas EC 1.2 que sean adecuadas, e identificar sus secuencias de genes correspondientes (es decir, nucleótidos).

Las oxidorreductasas particularmente preferidas que actúan sobre el grupo aldehído u oxo de los donantes (enzimas EC 1.2) se describen en la tabla 2 a continuación: las aldehído deshidrogenasas incluyen, sin limitación, las enzimas de la secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 140 a SEC ID N°: 154; las aldehído oxidasas incluyen, sin limitación, la enzima de la secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 155.

Preferentemente, la oxidorreductasa que actúa sobre el grupo aldehído u oxo de los donantes (enzima EC 1.2) es una enzima de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 140, SEC ID N°: 148 o SEC ID N°: 149.

Como es bien conocido por los expertos en la materia, el microorganismo puede generar el metabolito intermedio 1,2,4-butanotriol por fermentación de xilosa como fuente de carbono. Dicha conversión puede lograrse mediante ingeniería genética adicional del microorganismo, como se describe en la solicitud de patente EP15305096.8, WO2008/091288 y US2013/0203141.

En consecuencia, el microorganismo preferentemente se modifica genéticamente además para convertir la xilosa en 1,2,4-butanotriol, siendo dicha modificación genética una sobreexpresión de por lo menos uno de los siguientes genes:

° un gen que codifica una xilosa deshidrogenasa,

° un gen que codifica una xilonolactonasa,

° un gen que codifica una xilonato deshidratasa,

° un gen que codifica una 3-desoxi-D-glicero-pentulosonato (DGP) descarboxilasa,

° un gen que codifica 1,2,4-butanotriol deshidrogenasa, y

° cualquier combinación de los mismos.

Dichas enzimas son bien conocidas en la técnica, describiéndose a continuación las enzimas preferidas en la tabla 2 y el ejemplo 1 (ruta 1).

Preferentemente, el microorganismo descrito en la presente memoria se modifica genéticamente de forma adicional para proporcionar potencia reductora y/o energía para la producción de 2,4-dihidroxibutirato y el crecimiento de microorganismos a partir de una fuente de carbono que no sea xilosa, y/o por lo menos parcialmente, de manera totalmente preferida, inhibir la represión del catabolito de carbono.

Dichas modificaciones genéticas son particularmente ventajosas ya que optimizan la producción de 2,4-DHB, al utilizar primero una fuente de carbono alternativa en lugar de xilosa para proporcionar potencia y/o energía reductora, de modo que la xilosa se pueda convertir exclusivamente en 2,4-dihidroxibutirato; y en segundo lugar, al reducir la represión del catabolito de carbono que se observa en microorganismos que pueden favorecer algunas fuentes de carbono sobre otras. Especialmente, la mayoría de los microorganismos naturales, entre ellos Escherichia coli, prefieren usar glucosa sobre otros azúcares, incluso si son capaces de metabolizar una variedad de monosacáridos (Kim et al., 2010). De este modo, se prefiere en la presente memoria inhibir esta represión de catabolitos en microorganismos que no son capaces de coutilizar xilosa y otro azúcar de manera eficaz.

Por lo tanto, para proporcionar potencia reductora y/o energía para la producción de 2,4-dihidroxibutirato y el crecimiento de microorganismos a partir de una fuente de carbono distinta de la xilosa, el microorganismo de acuerdo con la invención se modifica genéticamente preferentemente eliminando y/o atenuando por lo menos un gen seleccionado de entre el grupo que consiste en:

° un gen que codifica una xilosa isomerasa,

° un gen que codifica una xilulosa cinasa,

° un gen que codifica una 3-desoxi-D-glicero-pentulosonato aldolasa,

° un gen que codifica una cetoácido deshidrogenasa, y

° cualquier combinación de los mismos.

Dichas enzimas son bien conocidas en la técnica, y se describen en la solicitud de patente US2013/0203141. Estas enzimas son especialmente conocidas por usar xilosa u otros metabolitos que producen un flujo de carbono que puede competir con la conversión de xilosa en 2,4-dihidroxibutirato. Las enzimas preferidas para proporcionar dicho poder reductor y/o energía se describen a continuación en la tabla 2 y el ejemplo 1 (ruta 1).

Preferentemente, la modificación genética que permite la inhibición de la represión del catabolito de carbono se selecciona de entre por lo menos una de los siguientes:

° eliminación de un gen que codifica una glucosa permeasa del sistema de fosfotransferasa,

° eliminación de un gen que codifica una proteína Hpr fosfoportadora,

° expresión, preferentemente de un promotor constitutivo o inducible no regulado por cAMP-CRP, de un gen y/u operón implicado en un sistema importador de azúcar, en el que dicho azúcar es una fuente de carbono distinta de la xilosa,

° expresión de un gen que codifica un transportador de xilosa, tal como un simportador o un transportador ABC, preferentemente de un promotor constitutivo o inducible no regulado por cAMP-CRP,

° sobreexpresión de un gen que codifica un simportador de glucosa,

° sobreexpresión de un gen que codifica un facilitador de glucosa,

° sobreexpresión de un gen que codifica una glucocinasa,

° modulación de la expresión de un gen involucrado en los niveles de cAMP, preferentemente de un gen que codifica adenilato ciclasa,

° modulación de la expresión de un gen que codifica una CRP y/o una proteína similar a CRP,

° expresión de un gen que codifica una proteína CRP independiente de cAMP, preferentemente de un promotor constitutivo o inducible no regulado por cAMP-CRP, y

° cualquier combinación de las mismas.

Más preferentemente, para la coutilización de xilosa y glucosa, ventajosamente se combina una eliminación de un gen que codifica una fosfotransferasa y/o una proteína Hp fosfoportadora con una sobreexpresión de un gen que codifica una glucosa permeasa o un facilitador de glucosa, junto con una sobreexpresión de un gen que codifica una glucocinasa.

Preferentemente, el microorganismo proporcionado en la presente memoria comprende otra modificación genética de por lo menos un gen implicado en la producción de NADPH como fuente de poder reductor. De hecho, las enzimas reductoras como las deshidrogenasas necesitan poder reductor disponible en el microorganismo, particularmente en forma de NADPH. Las estrategias para aumentar la disponibilidad de NADPH en la célula son bien conocidas en la técnica, y Lee et al. (2013) las han revisado especialmente, y asimismo se han descrito por los documentos US8088620, WO2012/055798 y EP14305691.9.

La modificación genética para mejorar la producción de NADPH, y por lo tanto su disponibilidad en el microorganismo, se selecciona preferentemente de:

° sobreexpresión de un gen u operón que codifica una transhidrogenasa unida a la membrana,

° eliminación o atenuación de un gen que codifica una transhidrogenasa soluble,

° sobreexpresión de un gen que codifica un NADPH que genera la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, ° eliminación o atenuación de un gen que codifica una fosfoglucosa isomerasa,

° eliminación o atenuación de un gen que codifica una fosfofructocinasa,

° sobreexpresión de un gen que codifica una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,

° sobreexpresión de un gen mutante que codifica una lipoamida deshidrogenasa capaz de generar NADPH, ° sobreexpresión de un gen que codifica una enzima de reparación de NAD(P)H-hidrato bi-funcional, y ° cualquier combinación de las mismas.

La eliminación o atenuación de un gen que codifica una fosfofructocinasa se combina más preferentemente con una sobreexpresión de un gen que codifica una glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, para aumentar el flujo de NADPH a través de la ruta de fosfato de pentosa.

Más preferentemente, la modificación genética para mejorar la producción de NADPH se selecciona de entre: ° sobreexpresión de un gen que codifica una transhidrogenasa unida a la membrana,

° eliminación o atenuación de un gen que codifica una fosfoglucosa isomerasa y/o una transhidrogenasa soluble, y

° sobreexpresión de un gen que codifica un NADPH que genera la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa. Dichas enzimas son bien conocidas en la técnica, describiéndose a continuación las enzimas preferidas en la tabla 2 y el ejemplo 1 (ruta 1).

Producción de 2,4-dihidroxibutirato a través de la ruta del (L)-malato

Una ruta sintética alternativa para la producción microbiana de ácido 2,4-dihidroxibutírico utiliza (L)-malato como un intermediario metabólico. Resulta evidente para el experto en la materia cómo manipular microorganismos capaces de convertir (L)-malato en 2,4-DHB. De hecho, los microorganismos genéticamente modificados para convertir el (L)-malato en 2,4-DHB, y los métodos para manipular dichos microorganismos, son bien conocidos en la técnica, y se han descrito especialmente en la solicitud de patente WO2012/056318.

Por lo tanto, el microorganismo de la invención se modifica genéticamente para convertir el (L)-malato en 2,4-dihidroxibutirato, de acuerdo con las siguientes modificaciones:

° sobreexpresión de por lo menos un gen que codifica una malato cinasa, convirtiendo así el malato en 4-fosfo-malato;

° sobreexpresión de por lo menos un gen que codifica una malato semialdehído deshidrogenasa, convirtiendo así 4-fosfo-malato en malato-4-semialdehído; y

° sobreexpresión de por lo menos un gen que codifica una DHB deshidrogenasa, convirtiendo así el malato-4-semialdehído en 2,4-dihidroxibutirato.

Dichas enzimas son bien conocidas en la técnica, describiéndose a continuación las enzimas preferidas en la tabla 2 y el ejemplo 1 (ruta 3).

Preferentemente, dicha malato cinasa es de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 198, dicha malato semialdehído deshidrogenasa es de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 199, y dicha DHB deshidrogenasa es de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 200.

Producción de 2,4-dihidroxibutirato a través de la ruta de (L)malil-CoA

Otra ruta sintética alternativa para la producción microbiana de ácido 2,4-dihidroxibutírico utiliza (L)malil-CoA como intermediario metabólico. Resulta evidente para el experto en la materia cómo manipular microorganismos capaces de convertir (L)malil-CoA en 2,4-DHB. De hecho, los microorganismos genéticamente modificados para convertir (L)malil-CoA en 2,4-DHB, y los métodos para manipular dichos microorganismos, son bien conocidos en la técnica, y se han descrito especialmente en la solicitud de patente WO2013/160762.

En consecuencia, el microorganismo de la invención se modifica genéticamente para convertir (L)malil-CoA en 2,4-dihidroxibutirato, de acuerdo con las siguientes modificaciones:

° sobreexpresión de por lo menos un gen que codifica una malil-CoA reductasa, convirtiendo así malil-CoA en malato-4-semialdehído; y

Aún preferentemente, dicho microorganismo se modifica genéticamente además para convertir:

° (L)malato en (L)malil-CoA por sobreexpresión de por lo menos un gen que codifica una malil-CoA sintetasa; o

° succinilCoA en (L)malil-CoA por sobreexpresión de por lo menos un gen que codifica una succinil-CoA:(L)malato-CoA transferasa; o

° glioxilato en (L)malil-CoA por sobreexpresión de por lo menos un gen que codifica una malil-CoA liasa. Dichas enzimas son bien conocidas en la técnica, describiéndose a continuación las enzimas preferidas en la tabla 2 y el ejemplo 1 (ruta 4).

Preferentemente, dicha malil-CoA reductasa es de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 201, dicha DHB deshidrogenasa es de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 200, y dicha malil-CoA liasa es de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 202.

Otras modificaciones genéticas preferidas se describen a continuación en el ejemplo 1 (ruta 4).

Producción de 2,4-dihidroxibutirato a través de la ruta de (L)-homoserina

Todavía, otra ruta sintética para la producción microbiana de ácido 2,4-dihidroxibutírico utiliza (L)-homoserina como intermediario metabólico. Resulta evidente para el experto en la materia manipular microorganismos capaces de convertir (L)-homoserina en 2,4-DHB. De hecho, los microorganismos modificados genéticamente para convertir (L)-homoserina en 2,4-DHB, y los métodos para manipular dichos microorganismos, son bien conocidos en la técnica, y se han descrito especialmente en la solicitud de patente WO2014/009435 o en la solicitud de patente EP14306564.7 (aún no publicada).

Por lo tanto, el microorganismo de la invención se modifica genéticamente para convertir (L)-homoserina en 2,4-dihidroxibutirato, de acuerdo con las siguientes modificaciones:

° sobreexpresión de por lo menos un gen que codifica una enzima seleccionada de entre el grupo que consiste en homoserina oxidasas, homoserina deshidrogenasas, homoserina transaminasas, y cualquier combinación de las mismas, convirtiendo así (L)-homoserina en 2-oxo-4-hidroxibutirato; y

° sobreexpresión de por lo menos un gen que codifica una 2-oxo-4-hidroxibutirato (OHB) reductasa, convirtiendo así el 2-oxo-4-hidroxibutirato (OHB) en 2,4-dihidroxibutirato.

Dichas enzimas son bien conocidas en la técnica, describiéndose a continuación las enzimas preferidas en la tabla 2 y el ejemplo 1 (ruta 2).

Preferentemente, dicha homoserina transaminasa es de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 203, y dicha 2-oxo-4-hidroxibutirato (OHB) reductasa es de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 204.

Otras modificaciones genéticas preferidas se describen a continuación en el ejemplo 1 (ruta 2).

Tabla 2: Proteínas y genes para producir 2,4-DHB

Métodos para la producción de 2,4-DHB

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la producción de 2,4-dihidroxibutirato, que comprende:

a) cultivar un microorganismo modificado genéticamente como se describe anteriormente en un medio de cultivo que comprende una fuente de carbono, en condiciones de fermentación que permite la conversión de dicha fuente de carbono en 2,4-dihidroxibutirato, y

b) recuperar el 2,4-dihidroxibutirato de dicho medio de cultivo.

Los medios de fermentación y las fuentes de carbono son bien conocidos en la técnica. Según la invención, las expresiones “proceso fermentativo”, “fermentación” o “cultivo” se usan indistintamente para referirse a las condiciones experimentales que permiten el crecimiento de un microorganismo dado. El crecimiento de un microorganismo se realiza generalmente en fermentadores con un medio de crecimiento apropiado adaptado al microorganismo que se utiliza.

Un “medio de cultivo apropiado” significa en la presente memoria un medio (por ejemplo, un medio líquido estéril) que comprende nutrientes esenciales o beneficiosos para el mantenimiento y/o crecimiento del microorganismo, tales como fuentes de carbono o sustratos de carbono; fuentes de nitrógeno, por ejemplo peptona, extractos de levadura, extractos de carne, extractos de malta, urea, sulfato de amonio, cloruro de amonio, nitrato de amonio y fosfato de amonio; fuentes de fósforo, por ejemplo fosfato monopotásico o fosfato dipotásico; oligoelementos (por ejemplo, sales metálicas), por ejemplo sales de magnesio, sales de cobalto y/o sales de manganeso; así como factores de crecimiento tales como aminoácidos y vitaminas.

En un ejemplo particular de la invención, la fuente de carbono, preferentemente el hidrato de carbono, deriva de una materia prima renovable, tal como la biomasa vegetal.

El experto en la materia puede determinar fácilmente las condiciones de cultivo necesarias para cultivar el microorganismo según la invención. En particular, es bien conocido que las bacterias pueden fermentar a una temperatura comprendida entre 20°C y 55°C, preferentemente entre 25°C y 40°C. E. coli se puede cultivar más particularmente a una temperatura comprendida entre aproximadamente 30°C y aproximadamente 37°C.

El método de la invención puede realizarse en un proceso discontinuo, en un proceso discontinuo alimentado, o en un proceso continuo, y en condiciones aeróbicas, microaeróbicas o anaeróbicas.

Una fermentación “en condiciones aeróbicas” significa que se suministra oxígeno al cultivo al disolver el gas en la fase líquida del cultivo. Esto se puede lograr (1) rociando gas que contiene oxígeno (por ejemplo, aire) en la fase líquida, o (2) agitando el recipiente que contiene el medio de cultivo para transferir el oxígeno contenido en el espacio de cabeza a la fase líquida. La principal ventaja de la fermentación en condiciones aeróbicas es que la presencia de oxígeno como aceptor de electrones mejora la capacidad de la cepa para producir más energía en forma de ATP para los procesos celulares, mejorando así el metabolismo general de la cepa.

Se pueden usar en la presente memoria condiciones microaeróbicas, y se definen como condiciones de cultivo en las que se disuelven en la fase líquida porcentajes bajos de oxígeno (por ejemplo, usando una mezcla de gas que contiene entre 0,1 y 10% de oxígeno, completado al 100% con nitrógeno).

Por el contrario, las “condiciones anaeróbicas” se definen como condiciones de cultivo en las que no se proporciona oxígeno al medio de cultivo. Se pueden obtener condiciones estrictamente anaeróbicas rociando un gas inerte como nitrógeno en el medio de cultivo para eliminar los rastros de otro gas. El nitrato se puede usar como un aceptor de electrones para mejorar la producción de ATP por la cepa y mejorar su metabolismo.

Según un ejemplo particular, el método de la invención comprende además una etapa c) de purificar el 2,4-DHB de la etapa b).

Los métodos para purificar ácidos carboxílicos, y en particular hidroxiácidos, son bien conocidos en la técnica, y se han descrito especialmente en los documentos WO2002/090312, WO2002/022544 y WO2012/153042. La purificación de 2,4-DHB se puede realizar después de que finalice la fermentación, o durante la fermentación, mediante recuperación del producto in situ, incluyendo la fermentación extractiva (Van Hecke et al. 2014).

En cualquier caso, los microorganismos pueden eliminarse haciéndolos pasar a través de un dispositivo, preferentemente a través de un filtro con un corte en el intervalo de 20 a 200 kDa, en el que tiene lugar la separación sólido/líquido. Asimismo es factible utilizar una centrífuga, un dispositivo de sedimentación adecuado, o una combinación de estos dispositivos, siendo especialmente preferido separar primero por lo menos parte de los microorganismos por sedimentación y después alimentar el caldo de fermentación, que ha sido parcialmente liberado de microorganismos, a ultrafiltración o a un dispositivo de centrifugación.

Una vez que se han eliminado los microorganismos, el 2,4-DHB contenido en la disolución de fermentación resultante puede purificarse mediante precipitación con hidróxido de calcio, seguido de una reacidificación con ácido sulfúrico; sin embargo, este procedimiento genera altas cargas de sulfato de calcio que después deben eliminarse (Schügerl, 2000). Alternativamente, el 2,4-DHB puede precipitarse añadiendo a la disolución de fermentación, por ejemplo, compuestos de amonio para producir una sal de amonio de 2,4-DHB. Esta sal de amonio se puede eliminar entonces de la disolución de fermentación añadiendo un extractor orgánico y después calentando la mezcla resultante, por lo que la sal de amonio se concentra en la fase orgánica. El 2,4-DHB puede aislarse entonces de esta fase, por ejemplo mediante etapas de extracción adicionales, para proporcionar 2,4-DHB puro (documento WO2002/090312).

En un procedimiento más simple sin necesidad de etapas adicionales de purificación o extracción, el 2,4-DHB puede purificarse usando carbón activado o resinas funcionalizadas, pero de una manera relativamente ineficiente (Husson y King 1999). Basado en el mismo principio de interacción, el 2,4-DHB puede purificarse por cromatografía de intercambio iónico o cromatografía hidrófoba. Alternativamente, el 2,4-DHB puede purificarse por electrodiálisis, ósmosis inversa, ultrafiltración o nanofiltración (Cho et al., 2012). En ese caso, el 2,4-DHB se recupera como una disolución acuosa.

En el caso de la fermentación extractiva, el 2,4-DHB puede purificarse del caldo de fermentación mediante extracción líquido-líquido, utilizando, por ejemplo, compuestos de amina, tal como tri-n-decilamina (Gao et al., 2009). Alternativamente, el 2,4-DHB puede recuperarse mediante destilación reactiva mediante, por ejemplo, esterificación con un alcohol tal como butanol (Rao et al. 2014).

La presente invención se entenderá mejor a partir de los siguientes ejemplos, que se proporcionan únicamente a título ilustrativo.

Dibujos

La figura 1 representa las cuatro rutas metabólicas para la producción de 2,4-DHB (*: genes que opcionalmente se atenúan o eliminan).

La figura 2 representa la ruta metabólica para la conversión de D-xilosa en 2,4-DHB (*: genes que opcionalmente se atenúan o eliminan).

Ejemplos

La presente invención se define adicionalmente en los siguientes ejemplos. Debe apreciarse que estos ejemplos, aunque indican formas de realización preferidas de la invención, se proporcionan únicamente a título ilustrativo. A partir de la descripción anterior y de estos ejemplos, el experto en la materia puede realizar diversos cambios en la invención para adaptarla a diversos usos y condiciones sin modificar los medios esenciales de la invención.

Se describen genes y enzimas ejemplificativos requeridos para construir microorganismos con estas capacidades, así como métodos para clonar y transformar, monitorizar la formación de productos, y usar los microorganismos manipulados para la producción.

En particular, los ejemplos muestran cepas de Escherichia coli (E. coli) modificadas, pero estas modificaciones pueden realizarse fácilmente en otros microorganismos de la misma familia.

Escherichia coli pertenece a la familia de Enterobacteriaceae, que comprende miembros que son gramnegativos, en forma de varilla, no formadores de esporas, y presentan típicamente una longitud de 1-5 pm. La mayoría de los miembros usan flagelos para moverse, pero algunos géneros no son móviles. Muchos miembros de esta familia son una parte normal de la flora intestinal que se encuentra en los intestinos de los seres humanos y otros animales, mientras que otros se encuentran en el agua o el suelo, o son parásitos en una variedad de animales y plantas diferentes. E. coli es uno de los organismos modelo más importantes, pero otros miembros importantes de la familia de Enterobacteriaceae incluye Klebsiella, en particular Klebsiella terrigena, Klebsiella planticola o Klebsiella oxytoca, Pantoea y Salmonella.

Protocolos

Se han usado varios protocolos para construir cepas productoras de ácido 2,4-dihidroxibutanoico descritas en los siguientes ejemplos.

El protocolo 1 (modificaciones cromosómicas por recombinación homóloga, selección de recombinantes y escisión de casete antibiótico) y el protocolo 2 (transducción del fago P1) utilizados en la presente memoria se han descrito completamente en la solicitud de patente WO2013/001055.

Protocolo 3: Construcción de plásmidos recombinantes

La tecnología de ADN recombinante está bien descrita y es conocida por el experto en la materia.

Brevemente, los fragmentos de ADN se amplifican por PCR usando oligonucleótidos el experto en la materia puede diseñarlos) y ADN genómico de MG1655 E. coli K-12 o de otro microorganismo como matriz (según el gen seleccionado como diana que se debe amplificar). Los fragmentos de ADN y el plásmido seleccionado se digieren con enzimas de restricción compatibles, se ligan, y después se transforman en células competentes. Los transformantes se analizan, y los plásmidos recombinantes de interés se verifican por secuenciación de ADN.

Ejemplo 1: construcción de cepas productoras de 2,4-DHB a partir de 4 rutas metabólicas diferentes en MG1655 E. co li - figura 1 - construcción de cepas 1 a 7

Ruta 1: producción de 2,4-DHB a partir de xilosa por sobreproducción de enzimas a partir de una nueva ruta en MG1655 E. coli - Construcción de cepas 1 a 4.

La cepa MG1655 de Escherichia coli se modificó para producir ácido 2,4-dihidroxibutanoico (2,4-DHB) a partir de D-xilosa utilizando la ruta ilustrada en la figura 2. El trabajo busca maximizar el flujo de carbono hacia la producción de 2,4-DHB y eliminar así todas las enzimas involucradas en otras rutas de consumo de xilosa o involucradas en la conversión de compuestos intermedios de 2,4-DHB, lo que representa una pérdida de producto.

Además de los genes expresados naturalmente por E. coli (gen yjhG de secuencia SEC ID N°: 158 y gen yagF de secuencia SEC ID N°: 159, que codifican xilonato deshidratasas, y el gen adhP de secuencia SEC ID N°: 160 y el gen yqhD de secuencia SEC ID N°: 161 que codifican alcohol deshidrogenasas - 1,2,4-butanotriol deshidrogenasas dependientes de NAD(P)H), los genes que codifican las siguientes enzimas: la xilosa deshidrogenasa y la xilonolactonasa de Caulobacter crescentus (xdh [CC0821 en CauloCyc, SEC ID N°:156] y xylC [CC0820 en CauloCyc, SEC ID N°:157], respectivamente), la 3-desoxi-D-glicero-pentulosonato descarboxilasa de Pseudomonas putida (gen mdlC de secuencia SEC ID N°: 162), la alcohol deshidrogenasa - 2,4-dihidroxi-butanal deshidrogenasa dependiente NAD(P)+ de E. coli o Clostridium butyricum (gen fucO de E. coli que codifica la enzima de secuencia SEC Id N°: 135, o el gen dhaTde C. butyricum que codifica la enzima de secuencia SEC ID N°: 130, respectivamente), y la aldehido deshidrogenasa de E. coli (gen puuC de E. coli que codifica la enzima de secuencia SEC ID N°: 140, o el gen aldB de E. coli que codifica la enzima de secuencia SEC ID N°: 149) se expresaron por separado con un promotor artificial Ptrc (secuencia dada en la patente WO 2007/0770441) y su propio sitio de unión al ribosoma, utilizando un plásmido pCL1920 (Lerner e Inouye, 1990). De hecho, los genes xdh, xylC, mdlC, se clonaron en primer lugar en el plásmido pCL1920, dando el plásmido pDHB0001, y después fucO o dhaT y puuC o aldB se clonaron secuencialmente en el plásmido pDHB0001, dando lugar a las 4 combinaciones, con los plásmidos resultantes pDHB0002 a pDHB0005, como se describe en la tabla a continuación.

Tabla 2b.

Además, para bloquear la ruta catabólica nativa de xilosa, los genes que codifican la D-xilosa isomerasa (gen xylA de secuencia SEC ID N°: 163) y la D-xilulosa cinasa (gen xylB de secuencia SEC ID N°: 164) se eliminaron del cromosoma de E. coli MG1655 utilizando la estrategia de recombinación homóloga descrita por Datsenko y Wanner, 2000, y de acuerdo con el Protocolo 1. Más precisamente, para eliminar el operón xylAB, un producto de PCR que porta el gen de resistencia a antibióticos junto con sitios FRT, rodeados de secuencias homólogas a las regiones en dirección 5' y en dirección 3' del operón xylAB, se generó con cebadores de SEC ID N°: 205 y SEC ID N°: 206, y se introdujo en la cepa seleccionada MG1655 de E. coli, en la que el vector pKD46 se transformó previamente.

Para evitar la degradación del ácido 3-desoxi-D-glicero pentulosónico (DGP), los genes que codifican las cetoácido deshidrogenasas (gen yiaE de secuencia SEC ID N°: 167; y el gen ycdW de secuencia SEC ID N°: 168) y las DGP aldolasas (gen yjhH de secuencia SEC ID N°: 165; y gen yagE de secuencia SEC ID N°: 166) asimismo se eliminaron usando la misma estrategia de recombinación homóloga. Más precisamente, para eliminar gen el yjhH (SEC ID N°: 165), un producto de PCR portador del gen de resistencia a antibióticos junto con sitios FRT, rodeados de secuencias homólogas a las regiones en dirección 5' y en dirección 3' del gen yjhH, se generó con cebadores de SEC ID N°: 207 y SEC ID N°: 208, y se introdujo en la cepa seleccionada MG1655 de E. coli, en la que el vector pKD46 se transformó previamente. Para eliminar el gen yagE (SEC ID N°: 166), un producto de PCR portador del gen de resistencia a antibióticos junto con sitios FRT, rodeados de secuencias homólogas a las regiones en dirección 5' y en dirección 3' del gen yagE, se generó con cebadores de SEC ID N°: 209 y SEC ID N°: 210, y se introdujo en la cepa seleccionada MG1655 de E. coli, en la que el vector pKD46 se transformó previamente. Para eliminar el gen yiaE (SEC ID N°: 167), un producto de PCR portador del gen de resistencia a antibióticos junto con sitios FRT, rodeados de secuencias homólogas a las regiones en dirección 5' y en dirección 3' del gen yiaE, se generó con cebadores de SEC ID N°: 211 y SEC ID N°: 212, y se introdujo en la cepa seleccionada MG1655 de E. coli, en la que el vector pKD46 se transformó previamente. Para eliminar el gen ycdW (SEC ID N°: 168), un producto de PCR portador del gen de resistencia a antibióticos junto con sitios FRT, rodeados de secuencias homólogas a las regiones en dirección 5' y en dirección 3' del gen ycdW, se generó con cebadores de SEC ID N°: 213 y SEC ID N°: 214, y se introdujo en la cepa seleccionada MG1655 de E. coli, en la que el vector pKD46 se transformó previamente.

Puesto el gen yjhH pertenece junto con yjhG (SEC ID N°: 158) e yjhl al operón yjhIHG, las secuencias homólogas a las regiones en dirección 5' y en dirección 3' de yjhH deben seleccionarse para no alterar la expresión de los genes circundantes. Fue lo mismo para el gen yagE (SED ID N°: 166), que pertenece al operón yagEF. El experto en la materia conoce cómo eliminar una secuencia de ADN de un operón mientras mantiene el marco de lectura abierto del resto del operón.

Para suprimir la represión del catabolito, la enzima glucosa fosfotransferasa IIBC(Glc) codificada por el gen ptsG (SEC ID N°: 169) se eliminó usando la estrategia de recombinación homóloga descrita por Datsenko y Wanner, 2000 (según el Protocolo 1) como se describe en la solicitud de patente EP 14305691.9, en particular en el ejemplo 2 de dicho documento (denominado en la presente memoria SEC ID N°: 215 y SEC ID N°: 216). El producto de PCR apropiado se introdujo en la cepa seleccionada MG1655 de E. coli, en la que el vector pKD46 se transformó previamente.

Cada vez se usó un gen de resistencia a antibióticos diferente entre kanamicina, cloranfenicol, gentamicina, tetraciclina, blasticidina o espectinomicina.

Antes de usar la cepa optimizada MG1655 de E. coli, los casetes de antibióticos se eliminaron de las modificaciones AxylAB, AyjhH, AyagE, AyiaE, AycdW y AptsG usando la Flp recombinasa como se describe por Datsenko y Wanner, 2000 (de acuerdo con el Protocolo 1).

Mejora de la producción de ácido 2,4-DHB al aumentar la disponibilidad de NADPH de la cepa productora

Las 1,2,4-butanotriol deshidrogenasas, codificadas por adhP e yqhD, necesitan poder reductor disponible en el organismo, particularmente en forma de NADPH, de modo que se sobreexpresaron los genes involucrados en la producción de NADPH.

La piridina nucleótido transhidrogenasa translocante de protones unida a la membrana, codificada por el operón pntAB (SEC ID N°: 188), se sobreprodujo reemplazando el promotor endógeno y el sitio de unión al ribosoma de gen pntA de MG1655 de Escherichia coli por el promotor Ptrc inducible (del plásmido pTRC99A, Amersham Pharmacia) y el sitio de unión al ribosoma definido RBS120 (del software RBS Calculator), como se describe en la solicitud de patente EP 14305691.9, en particular en el ejemplo 4 de dicho documento (denominado en la presente memoria s Ec ID N°: 217). El producto de PCR apropiado descrito en la solicitud de patente EP 14305691.9 se generó e introdujo en la cepa seleccionada MG1655 de E. coli, en la que el vector pKD46 se transformó previamente.

El piridina nucleótido transhidrogenasa soluble, codificada por el gen sthA (anteriormente conocido como udhA, y de secuencia SEC ID N°: 189), se eliminó usando la estrategia de recombinación homóloga descrita por Datsenko y Wanner, 2000 (según el Protocolo 1) y como se describe en la solicitud de patente WO 2012/055798, en particular en el ejemplo 2 de dicha solicitud (denominado en la presente memoria SEC ID N°: 218 y SEC ID N°: 219). El producto de PCR apropiado se generó e introdujo en la cepa seleccionada MG1655 de E. coli, en la que el vector pKD46 se transformó previamente.

La fosfofructocinasa codificada por el gen pfkA (SEC ID N°: 193) se eliminó utilizando la estrategia de recombinación homóloga descrita por Datsenko y Wanner, 2000 (según el Protocolo 1), y como se describe en la solicitud de patente EP 14305691.9, en particular en el ejemplo 5 de dicho documento (denominado en la presente memoria s Ec ID N°: 220 y SEC ID N°: 221). El producto de PCR apropiado se generó e introdujo en la cepa seleccionada MG1655 de E. coli, en la que el vector pKD46 se transformó previamente.

Antes de usar la cepa optimizada de MG1655 de E. coli, los casetes de antibióticos se eliminaron de los loci pntAB, sthA y pfkA utilizando la Flp recombinasa de acuerdo con el Protocolo 1. Finalmente, cada plásmido pDHB0002, pDHB0003, pDHB0004 o pDHB0005 descrito anteriormente se introdujo en diferentes cepas mutantes derivadas de MG1655 de E. coli.

En la tabla 3 se enumeran ejemplos no exclusivos de cepas construidas.

Tabla 3.

Ruta 2: producción de 2,4-DHB a partir de homoserina por sobreproducción de enzimas homoserina transaminasa y 2-oxo-4-hidroxibutirato reductasa en MG1655 de E. coli - construcción de la cepa 5.

La ruta sintética para la conversión de homoserina en 2,4-DHB se expresa en una cepa MG1655 de E. coli con mayor producción de homoserina.

Para mejorar la producción de homoserina, el alelo mutado que codifica la aspartocinasa/homoserina deshidrogenasa bifuncional de E. coli con resistencia de retroalimentación reducida a treonina (gen thrA*1 de secuencia SEC ID N°: 222 con mutación puntual para cambiar el aminoácido fenilalanina en la posición 318 a serina) y el gen que codifica la piruvato carboxilasa de Rhizobium etli (gen pycre de secuencia SEC ID N°: 223) se sobreexpresaron por separado (no en un operón) del plásmido pCL1920 (Lerner e Inouye, 1990). Más precisamente, el gen thrA*1 se sobreexpresó a partir del promotor trc inducible por IPTG (SEC ID N°: 224) regulado por el represor LacI codificado por el gen lacI, ambos obtenidos del plásmido pTRC99A (Stratagene), y el gen pycre se sobreexpresó del promotor del gen gapA (SEC ID N°: 225), proporcionando el plásmido pME101-thrA*1-PgapA-pycre-TT07. Más precisamente, un ejemplo de plásmido pME101-thrA*1 se describe en la patente WO2007/077041, añadida como referencia en esta solicitud de patente. En la patente WO2012/055798, añadida como referencia en esta solicitud de patente, se describe un ejemplo de obtención del amplicón PgapA-pycre-TT07 y clonación del mismo en un vector pCL1920.

Para evitar la degradación de la homoserina, los genes que codifican la homoserina cinasa (gen thrB de secuencia SEC ID N°: 226), la treonina sintasa (gen thrC de secuencia SEC ID N°: 227) y la homoserina O-succiniltransferasa (gen meta de secuencia SEC ID N°: 228) se atenuaron en el cromosoma de MG1655 de E. coli.

Para atenuar la expresión del operón thrBC, el promotor natural del operón thrBC y el sitio de unión al ribosoma (RBS) del gen thrB se reemplazaron por uno artificial utilizando la estrategia de recombinación homóloga descrita por Datsenko y Wanner, 2000 (según el Protocolo 1). Más precisamente, un producto de PCR, que porta el terminador transcripcional (terminador transcripcional T7Te del bacteriófago T7, Harrington et al., 2001, SEC ID N°: 229), el promotor artificial trc y el RBS (SEC ID N°: 230) y un gen de resistencia a antibióticos junto con los sitios FRT, rodeados de secuencias homólogas al gen thrB y a la región en dirección 5' del gen thrB en el cromosoma (SEC ID N°: 231 y SEC ID N°: 232), se introdujo en la cepa seleccionada de MG1655 de E. coli, en la que el vector pKD46 se transformó previamente.

El gen meta se atenuó de la misma manera. Más precisamente, un producto de PCR, que porta el terminador transcripcional (terminador transcripcional T7Te del bacteriófago T7, Harrington et al., 2001, SEC ID N°: 229), el promotor artificial trc y RBS (SEC ID N°: 230) y un gen de resistencia junto con los sitios FRT, rodeados de secuencias homólogas al gen meta y a la región en dirección 5' del gen meta en el cromosoma (SEC ID N°: 233 y SEC ID N°: 234), se introdujo en la cepa seleccionada de MG1655 de E. coli, en la que el vector pKD46 se transformó previamente.

Para convertir la homoserina en 2,4-DHB, los genes que codifican la homoserina transaminasa de E. coli (gen ilvE de E. coli que codifica la enzima de secuencia SEC ID N°: 203) y la 2-oxo-4-hidroxibutirato (OHB) reductasa de Lactococcus lactis (gen ldhA de L. lactis que codifica la enzima de secuencia SEC ID N°: 204) se sobreexpresaron en un mismo operón del promotor tac inducible por IPTG (SEC ID N°: 235) obtenido del plásmido pEXT20 (Dykxhoorn et al., 1996) y el T7 RBS (SEC ID N°: 236) obtenido del plásmido pET28a (Novagen) en el vector pEXT20, dando el plásmido pEXT20-DHB. Más precisamente, un ejemplo de construcción del plásmido pEXT20-DHB se describe en la patente WO2014/009435.

Para optimizar el flujo de carbono en la ruta de biosíntesis de 2,4-DHB, los genes que codifican la D-lactato deshidrogenasa (gen ldhA de E. coli que codifica la enzima de secuencia SEC ID N°: 237), la alcohol deshidrogenasa (gen adhE de secuencia SEC ID N°: 238), y las piruvato cinasas (gen pykA de secuencia SEC ID N°: 239 y gen pykF de secuencia SEC ID N°: 240) asimismo se eliminaron del cromosoma de MG1655 de E. coli.

Más precisamente, un ejemplo de construcción de las eliminaciones génicas AldhA y AadhE en una cepa productora y la escisión del gen de resistencia se describen en la patente WO2014/009435. Un ejemplo de construcción de las eliminaciones génicas ApykA y ApykF en una cepa productora y la escisión del gen de resistencia se describen en la patente WO2009/043803, añadida como referencia en esta solicitud de patente.

Para aumentar la importación de glucosa en la célula, se eliminó el gen dgsA (o mlc) (gen dgsA de secuencia SEC ID N°: 241), que codifica el regulador dual transcripcional que controla la expresión de varios genes que codifican enzimas de los sistemas de fosfotransferasa (PTS) y fosfoenolpiruvato (PEP) de Escherichia coli. Otra forma de aumentar la importación de glucosa en la célula fue sobreproducir PtsG (IICGlc) (gen ptsG de E. coli que codifica la enzima de secuencia SEC ID N°: 169), la pareja transmembránica del sistema de fosfotransferencia de glucosa. Un ejemplo de construcción de la eliminación génica AdgsA y la introducción en una cepa productora y la escisión del gen de resistencia se describe en la patente WO2013/001055, añadida como referencia en esta solicitud de patente. Un ejemplo de sobreexpresión del gen ptsG es construir e introducir el siguiente plásmido pCC1BACVB01-Placlq-lacI-TT02-Ptrc01/OP01/RBS01*2-ptsG-TT07 en una cepa productora, como se describe en la patente WO2013/001055.

De acuerdo con la combinación deseada de la eliminación, cada eliminación se introdujo en una cepa de construcción previamente transformada con el plásmido pKD46. Cada vez se usó un gen de resistencia a antibióticos diferente entre kanamicina, cloranfenicol, gentamicina, tetraciclina, blasticidina o espectinomicina. Cuando fue necesario, y antes de la introducción del plásmido, los casetes antibióticos se eliminaron de los loci thrBC, metA, IdhA, adhE, dgsA, pykA o pykF usando la Flp recombinasa como se describe por Datsenko y Wanner, 2000 (de acuerdo con el Protocolo 1).

Los diferentes plásmidos se introdujeron en diferentes cepas mutantes derivadas de MG1655 de E. coli.

Un ejemplo no exclusivo de cepas construidas se proporciona en la tabla 4.

Tabla 4.

Ruta 3: producción de 2,4-DHB a partir de malato por sobreproducción de enzimas de una ruta sintética, que comprende malato cinasa, malato semialdehído deshidrogenasa y 2,4-DHB deshidrogenasa en MG1655 de E. coli - construcción de la cepa 6

La ruta sintética para la conversión de malato en 2,4-DHB se expresa en una cepa MG1655 de E. coli.

Para convertir el malato en 2,4-DHB, el alelo mutado de lysC de E. coli que codifica la malato cinasa (gen lysC E119G E250K de E. coli que codifica la enzima de secuencia SEC ID N°: 198 con mutaciones puntuales para cambiar el aminoácido glutamato en la posición 119 en glicina, y el aminoácido glutamato en la posición 250 en lisina), el alelo mutado de asd de E. coli que codifica la malato semialdehído deshidrogenasa (gen asd E241Q de E. coli que codifica la enzima de secuencia SEC ID N°: 199 con mutación puntual para cambiar el aminoácido glutamato en la posición 241 en glutamina), y el alelo mutado de ssr de Metallosphaera sedula que codifica la DHB deshidrogenasa (gen ssr H39R-N43H de M. sedula que codifica la enzima de secuencia SEC ID N°: 200 con mutaciones puntuales para cambiar el aminoácido histidina en la posición 39 en arginina, el aminoácido asparagina en la posición 43 en histidina, y otras mutaciones silenciosas para optimizar la secuencia codificante para la máxima expresión en E. coli, utilizando el software GeneOptimizer® de Geneart (Life Technologie)) se sobreexpresaron en un mismo operón a partir del promotor tac inducible por IPTG (SEC ID N°: 235) obtenido del plásmido pEXT20 (Dykxhoorn et al., 1996) y el T7 RbS (SEC ID N°: 236) obtenido del plásmido pET28a (Novagen) en el vector pET28a, proporcionando el plásmido pTAC-DHB. Más precisamente, un ejemplo de construcción del plásmido pTAC-DHB se describe en la patente WO2012/056318, añadida como referencia en esta solicitud de patente.

El plásmido pTAC-DHB se introdujo en la cepa MG1655 de E. coli, dando lugar a la cepa 27.

Un ejemplo no exclusivo de cepa construida se proporciona en la tabla 5.

Tabla 5.

Ruta 4: producción de 2,4-DHB a partir de malato y/o succinil-CoA y/o glioxilato por sobreproducción de enzimas de una ruta sintética, que comprende una malil-CoA sintetasa y/o succinil-CoA:(L)-malato CoA transferasa y/o una malil-CoA liasa, una malil-CoA reductasa y una DHB deshidrogenasa en MG1655 de E. coli - construcción de la cepa 7.

La ruta sintética para la conversión de glioxilato en 2,4-DHB se expresa en una cepa MG1655 de E. coli.

Para convertir el glioxilato en 2,4-DHB, los genes que codifican la malil-CoA liasa de Methylobacter extorquens (gen mcl de M. extorquens que codifica la enzima de secuencia SEC ID N°: 202 optimizada para la expresión en E. coli), la malil-CoA reductasa (malonil-CoA reductasa) de Sulfolobus tokodaii (gen mcr de S. tokodaii que codifica la enzima de secuencia SEC ID N°: 201 con mutación puntual para cambiar el aminoácido tirosina en la posición 206 en prolina), y la DHB deshidrogenasa (semialdehído reductasa succínica) de Metallosphaera sedula (gen ssr de M. sedula que codifica la enzima de secuencia SEC ID N°: 200 optimizada para la expresión en E. coli y con la mutación puntual para cambiar el aminoácido histidina en la posición 39 en arginina y la mutación puntual para cambiar el aminoácido asparagina en la posición 43 en histidina) se sobreexpresaron en un mismo operón a partir del promotor tac inducible por IPTG (SEC ID N°: 236) obtenido del plásmido pACT3 (Dykxhoorn et al. 1996), plásmido en el que se clonaron los 3 genes, dando el plásmido pACT3-MCL-DHB. Más precisamente, un ejemplo de construcción del plásmido pACT3-MCL-DHB se describe en la patente WO2013/160762.

Para optimizar el flujo de carbono en la ruta de biosíntesis de 2,4-DHB, y en particular la disponibilidad de glioxilato, los genes que codifican la fosfato acetiltransferasa (gen pta de secuencia SEC ID N°: 242), la malato sintasa (gen aceB de secuencia SEC ID N°: 243), y el regulador transcripcional del operón de derivación de glioxilato (gen iclR de secuencia SEC ID N°: 244) se eliminaron del cromosoma de MG1655 de E. coli.

Más precisamente, un ejemplo de construcción de las eliminaciones génicas Apta, AaceB y AiclR, la introducción en una cepa productora y la escisión del gen de resistencia se describe en la patente WO2013/160762.

De acuerdo con la combinación deseada de la eliminación, cada eliminación se introdujo en una cepa de construcción previamente transformada con el plásmido pKD46. Cada vez se usó un gen de resistencia a antibióticos diferente entre kanamicina, cloranfenicol, gentamicina, tetraciclina, blasticidina o espectinomicina. Cuando fue necesario, y antes de la introducción del plásmido, los casetes antibióticos se eliminaron de los loci pta, aceB, o iclR usando la Flp recombinasa como se describe por Datsenko y Wanner, 2000 (de acuerdo con el Protocolo 1).

El plásmido pACT3-MCL-DHB se introdujo en diferentes cepas mutantes derivadas de MG1655 de E. coli optimizadas para la producción de 2,4-DHB.

Un ejemplo no exclusivo de cepa construida se proporciona en la tabla 6.

Tabla 6.

Ejemplo 2: optimización de la producción de 2,4-DHB por sobreproducción del exportador de 2,4-DHB en cepas productoras de 2,4-DHb a partir de 4 rutas metabólicas diferentes en MG1655 de E. co li -construcción de cepas 8 a 38

Para promover la exportación de 2,4-DHB, y en consecuencia mejorar la producción de 2,4-DHB, uno de los siguientes genes que codifican exportadores se sobreexpresó con un promotor artificial Ptrc (secuencia proporcionada en la patente WO 2007/0770441) y su propio sitio de unión al ribosoma, utilizando un plásmido pCLl920 (Lerner e Inouye, 1990). Los genes sobreexpresados son genes que codifican el transportador de tipo MFS monocarboxilato (superfamilia de facilitadores principales) de E. coli (gen yhjX de secuencia SEC ID N°: 2), el transportador de ácido carboxílico (lactato) de S. cerevisiae (gen JEN1 de secuencia SEC ID N°: 24), la proteína de transporte del metabolito de la membrana interna (lactato) de E. coli (gen yhjE de secuencia SEC ID N°: 26) y la proteína de transporte de ácido málico de Schizosaccharomyces pombe (gen mae1 de secuencia SEC ID N°: 58). De acuerdo con la ruta de producción de 2,4-DHB optimizada en cepas modificadas con MG1655 de E. coli, el gen que codifica el exportador se clonó en un plásmido pCL1920 vacío o en un plásmido pCL1920 que porta genes para la producción de 2,4-DHB y como se describe anteriormente (pDHB0002 a pDHB0005, más pME101-thrA*1-PgapA-pycre-TT07).

Los plásmidos resultantes son pDHB0006 a pDHB00029, como se describe en la tabla a continuación.

Tabla 6b.

Estos plásmidos se introdujeron por separado en diferentes cepas mutantes derivadas de MG1655 de E. coli optimizadas para la producción de 2,4-DHB y en MG1655 de tipo salvaje.

Un ejemplo no exclusivo de cepas construidas se proporciona en la tabla 7.

Tabla 7.

Ejemplo 3: optimización de la producción de 2,4-DHB por sobreproducción del exportador de 2,4-DHB combinado con la eliminación del importador de 2,4-DHB en cepas productoras de 2,4-DHB a partir de 4 rutas metabólicas diferentes en MG1655 de E. co li - construcción de cepas 39 a 131

Para evitar la reimportación de 2,4-DHB, y en consecuencia mejorar la producción de 2,4-DHB, uno de los siguientes genes que codifica importadores se eliminó del cromosoma de MG1655 de E. coli usando la estrategia de recombinación homóloga descrita por Datsenko y Wanner, 2000, y de acuerdo con el Protocolo 1. Los genes eliminados son los genes que codifican la alfa-cetoglutarato permeasa (gen kgtP de secuencia SEC ID N°: 74), la L-lactato permeasa (gen IldP de secuencia SEC ID N°: 76) y la glicolato permeasa (gen glcA de secuencia SEC ID N°: 78). Más precisamente, para eliminar el gen kgtP, un producto de PCR portador del gen de resistencia a antibióticos junto con sitios FRT rodeados de secuencias homólogas a las regiones en dirección 5' y en dirección 3' del gen kgtP, se generó con cebadores de SEC ID N°: 245 y SEC ID N°: 246, y se introdujo en la cepa seleccionada MG1655 de E. coli, en la que el vector pKD46 se transformó previamente. Para eliminar el gen IldP, un producto de PCR portador del gen de resistencia a antibióticos junto con sitios FRT rodeados de secuencias homólogas a las regiones en dirección 5' y en dirección 3' del gen IldP, se generó con cebadores de SEC ID N°: 247 y SEC ID N°: 248, y se introdujo en la cepa seleccionada MG1655 de E. coli, en la que el vector pKD46 se transformó previamente. Para eliminar el gen glcA, un producto de PCR portador del gen de resistencia a antibióticos junto con sitios FRT rodeados de secuencias homólogas a las regiones en dirección 5' y en dirección 3' del gen glcA, se generó con cebadores de SEC ID N°: 249 y SEC ID N°: 250, y se introdujo en la cepa seleccionada MG1655 de E. coli, en la que el vector pKD46 se transformó previamente.

Cada vez se seleccionó un gen de resistencia a los antibióticos entre kanamicina, cloranfenicol, gentamicina, tetraciclina, blasticidina o espectinomicina. Cuando fue necesario, y antes de la introducción del plásmido, los casetes antibióticos se eliminaron del locus kgtP o IldP o glcA utilizando la Flp recombinasa como se describe por Datsenko y Wanner, 2000 (de acuerdo con el Protocolo 1).

Cada eliminación se introdujo por separado en diferentes cepas mutantes derivadas de MG1655 de E. coli optimizadas para la producción de 2,4-DHB y en MG1655 de tipo salvaje. Las cepas resultantes se proporcionan en la tabla a continuación.

Un ejemplo no exclusivo de cepas construidas se proporciona en la tabla 8.

Tabla 8.

Ejemplo 4: crecimiento de bacterias y producción de ácido 2,4-dihidroxibutanoico en presencia de una gran cantidad de 2,4-DHB en caldo de medio

Condiciones de cultivo para cepas portadoras de la Ruta 1:

Las cepas de producción se evaluaron en matraces Erlenmeyer con deflectores de 500 ml utilizando medio M9 modificado (Anderson, 1946) que se complementó con 30 g/l de MOPS, 20 g/l de D-xilosa y 10 g/l de glucosa, y se ajustó a pH 6,8. Se añadió espectinomicina a una concentración de 50 mg.M cuando fue necesario en precultivo y cultivo. Se cultivó un precultivo a 37°C en medio LB (Sigma). Después de 24 horas de crecimiento, se usó para inocular un cultivo de 50 ml de medio M9 modificado hasta una OD⁶⁰⁰de aproximadamente 0.2, a 30°C y 200 rpm.

Condiciones de cultivo para cepas portadoras de las Rutas 2, 3 y 4:

Las cepas de producción se evaluaron en matraces Erlenmeyer con deflectores de 500 ml utilizando medio M9 modificado (Anderson, 1946) que se complementó con 20 g.l-1 de MOPS y 20 g.l-1 de glucosa, y se ajustó a pH 6,8. Se añadió espectinomicina a una concentración de 50 mg.l-1, ampicilina a 100 mg.l-1 y cloranfenicol a 25 mg.l-1 cuando fue necesario en precultivo y cultivo. Se cultivó un precultivo a 37°C en medio Lb (Sigma). Después de 24 horas de crecimiento, se usó para inocular un cultivo de 50 ml de medio M9 modificado hasta una OD⁶⁰⁰de alrededor de 0.2, a 30°C y 200 rpm. Se añadió IPTG a una concentración comprendida entre 100 y 1000 pmol.l'1 de acuerdo con el número de copias del plásmido utilizado en la célula al comienzo del cultivo o cuando la OD⁶⁰⁰de los cultivos de crecimiento alcanzó 1.

Cuando los azúcares en el medio de cultivo se agotaron, el cultivo se centrifugó, y el caldo se analizó para determinar el ácido 2,4-dihidroxibutanoico por LC-MS/MS.

El título del ácido 2,4-dihidroxi-butanoico se expresó como sigue:

ácido 2,4 - dihidroxi - bu tan oico (m g )

Título DHB

volum en (L)

La tasa de crecimiento de cada cepa asimismo se monitorizó como indicativo de tolerancia hacia altas concentraciones de 2,4-dihidroxibutanoico en medio de cultivo. En tal caso, las cepas se evaluaron en matraces Erlenmeyer con deflectores de 250 ml. Se cultivó un precultivo a 37°C en medio LB (Sigma), y después de 24 horas, se usó para inocular hasta una OD⁶⁰⁰de aproximadamente 0.2 un cultivo de 25 ml de medio M9 modificado, que se complementó con 10 g/l de glucosa (más 10 g/l de xilosa en el caso de cepas que contienen la ruta 1 (cepas 1 a 4; cepas 8 a 23 y cepas 39 a 86)), a 30°C y 200 rpm. Se añadió o no una concentración de 10 g/l de 2,4-DHB (subcontratación de Sigma Aldrich) al caldo de medio, y después de 24 horas de crecimiento, se midió la OD⁶⁰⁰, y se comparó la tasa de crecimiento calculada de cada cepa entre las dos condiciones.

Tabla 9: Impacto de 10 g/l de 2,4-DHB en el medio sobre la tasa de crecimiento de MG1655 modificada para reducir la acumulación de 2,4-DHB dentro de las células. Signos (-): significa un crecimiento 5% más lento en presencia de 2,4-DHB en comparación con la tasa de crecimiento en ausencia de 2,4-DHB; (- -): significa un crecimiento 10% más lento; (=): significa la misma tasa de crecimiento (sin impacto de la concentración de DHB en el medio); (+): significa un crecimiento 5% más rápido, y (++): significa un crecimiento 10% más rápido en presencia de 2,4-DHB.

Como se puede apreciar en la tabla 9 anterior, la tasa de crecimiento de la MG1655 en presencia de 10 g/l de 2,4-DHB se restablece tras la sobreexpresión de genes que codifican un sistema de eflujo específico (cepas 35 a 38), e incluso mejora un poco cuando ambos sistemas de captación se eliminan y el sistema de eflujo se sobreproduce (cepas 120 a 122).

La combinación de las dos modificaciones para reducir la acumulación de 2,4-DHB en la bacteria se ensayó para todos los sistemas exportadores con resultados similares como se muestran anteriormente (datos no representados para las cepas 123 a 131).

Tabla 10: Impacto de 10 g/l de 2,4-DHB en el medio sobre la tasa de crecimiento de cepas productoras de 2,4-DHB modificadas para reducir la acumulación de 2,4-DHB dentro de las células. Signos (-): significa un crecimiento 5% más lento en presencia de 2,4-DHB en comparación con la tasa de crecimiento en ausencia de 2,4-DHB; (--): significa un crecimiento 10% más lento; (=): significa la misma tasa de crecimiento (sin impacto de la concentración de DHB en el medio); (+): significa un crecimiento 5% más rápido, y (++): significa un crecimiento 10% más rápido en presencia de 2,4-DHB.

Como se puede apreciar en la tabla 10 anterior, las cepas 5 y 6, modificadas con la ruta 2 o 3 para la producción de 2,4-DHb , son sensibles a la alta concentración de 2,4-DHB, ya que su tasa de crecimiento disminuye en presencia de 10 g/l de 2,4-DHB. Sin embargo, su tasa de crecimiento respectiva puede restablecerse tras la sobreexpresión de genes que codifican un sistema de eflujo de 2,4-DHB específico, e incluso se puede mejorar un poco cuando ambos sistemas de captación se eliminan y el sistema de eflujo se sobreproduce. Se descubre que las modificaciones para reducir la acumulación de 2,4-DHB dentro de la célula mejoran la tasa de crecimiento de las cepas.

La combinación de las dos modificaciones para reducir la acumulación de 2,4-DHB en la bacteria se ensayó para todas las cepas productoras (rutas 1 y 4), con resultados similares como se muestran anteriormente (datos no representados para las cepas 8 a 23 y 31 a 34; cepas 39 a 86 y cepas 108 a 119).

Tabla 11: Concentración de ácido 2,4-dihidroxi-butanoico (DHB) en el medio para cada cultivo.

Como se puede apreciar en la tabla 11 anterior, la producción de ácido 2,4-dihidroxibutanoico (DHB) mejora con la sobreexpresión del sistema de exportación de DHB o por la combinación de la sobreexpresión del sistema de salida y la eliminación del sistema de captación, por cada cepa productora de 2,4-DHB.

La mejora de la producción de DHB se observó para todos los antecedentes diferentes de cepas productoras (rutas 1, 2, 3 y 4) que portan por lo menos una modificación para reducir la acumulación de 2,4-DHb en la célula. La concentración intracelular de 2,4-DHB se midió para todas las cepas analizadas de acuerdo con el siguiente protocolo.

- Se recogieron muestras durante la fase exponencial y se almacenaron en hielo (sin enfriamiento) - Se realizaron 2 etapas de lavado a 4°C con una disolución salina fisiológica concentrada 3X para evitar la fuga de metabolitos con los que lavamos las células.

Se realizaron algunos ensayos para seleccionar la mejor disolución entre agua, agua fisiológica y agua fisiológica concentrada 3X, 5X o 10X. El glutamato se utilizó como referencia (Bolten et al, 2007).

- Los sedimentos celulares se recuperaron y se mantuvieron a -20°C o se extrajeron.

- La extracción se realizó con etanol caliente en amortiguador HEPES

- La cuantificación de 2,4-DHB se realizó por GCMS

El valor teórico utilizado en los cálculos para el volumen citoplasmático de la célula es 2,3-2,5 ml/g de peso seco de la célula.

Los resultados para las cepas fueron consistentes con las mutaciones respectivas. En presencia de la sobreexpresión del sistema de eflujo de 2,4-DHB, así como para la combinación de la sobreexpresión de la exportación y la atenuación del sistema de captación de 2,4-DHB, la concentración intracelular de dicho compuesto disminuye en comparación con el microorganismo no modificado.

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LISTADO DE SECUENCIAS

<110> METABOLIC EXPLORER

<120> Microorganismo modificado para la producción optimizada de 2,4-dihidroxibutirato con eflujo de 2,4-dihidroxibutirato aumentado

<130> B370193 D34827

<150> EP 15305514.0

<151> 2015-04-07

<160> 250

<170> PatentIn versión 3.5

<210> 1

<211> 402

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 1

Met Thr Pro Ser Asn Tyr Gln Arg Thr Arg Trp Leu Thr Leu l i e Gly

1 5 10 15

Thr l i e l i e Thr Gln Phe A la Leu Gly Ser Val Tyr Thr Trp Ser Leu

20 25 30

Phe Asn Gly A la Leu Ser A la Lys Leu Asp A la Pro Val Ser Gln Val

35 40 45

A la Phe Ser Phe Gly Leu Leu Ser Leu Gly Leu A la l i e Ser Ser Ser

50 55 60

Val A la Gly Lys Leu Gln Glu Arg Phe Gly Val Lys Arg Val Thr Met

65 70 75 80

A la Ser Gly l i e Leu Leu Gly Leu Gly Phe Phe Leu Thr A la His Ser

85 90 95

Asp Asn Leu Met Met Leu Trp Leu Ser A la Gly Val Leu Val Gly Leu

100 105 110

A la Asp Gly A la Gly Tyr Leu Leu Thr Leu Ser Asn Cys Val Lys Trp

115 120 125

Phe Pro Glu Arg Lys Gly Leu l i e Ser A la Phe A la l i e Gly Ser Tyr

130 135 140

Gly Leu Gly Ser Leu Gly Phe Lys Phe l i e Asp Thr Gln Leu Leu Glu

145 150 155 160

<210>2

<211> 1209

<212> ADN

<213> Escherichia coli

a tgacacc tt caaa tta tca gcgtacccgc tggctgacac tca tcgg tac ta tc a tta c c 60 cag tttgcgc tggggtcgg t t ta ta c c tg g a g c c tg ttta atggcgcgct ttccgccaag 120 ctggatgcgc cggtaagcca g g tc g c tt tc tc t t tc g g c t tg t ta a g tc t ggggctggca 180 a t t t c g t c t t c tg ttgcggg caaattacag g a a c g ttttg gcgttaaacg cgtcaccatg 240 gcttccggca t t t tg c tg g g a tta g g c ttc ttcc tg a ca g cg ca ttc tga caacctgatg 300 a tg c tg tg g t taagcgccgg tg tg c tg g tg ggactggcag atggcgcggg t ta tc tg c tg 360 a cg c tc tc ta actg tg tgaa g tg g ttcccg gagcgtaaag g tc tg a tc tc cg cg ttcg c t 420 a tc g g t tc t t a tgg tc tggg tagcc tggg t t tc a a a t t ta tcgacacgca gctgctggaa 480 acggtcggtc tggaaaaaac c t t t g tg a t t tggggagcga t tg c g c tg t t g a tg a ttg t t 540 ttcggcgcaa cg ttaa tgaa agacgcacca aaacaggaag tgaaaaccag caa tgg tg tg 600 gtggagaaag a ttacacgc t ggcagagtcg atgcgtaaac cgcagtactg ga tg ttagcg 660 g ta a tg ttc c tgaccgcctg catgagcggc ctg tacg tga ttggggtagc gaaagatatc 720 gcccaaagtc tggcacacct tg a tg tg g tt tccgcagcca atgcagtcac tg t t a t t t c c 780 atcgccaacc tt tc a g g tc g tc tg g tg c tg g g ta t tc tg t ctgacaaaat cgcccgta tc 840 c g tg t ta t ta cca ttg g tca gg tga ta tcg ctgg tggg ta tggcggccct g c tg tttg c a 900 cca ttgaa tg cag tgacg tt c tttg ca g cg a ttgcc tgcg tg g c a ttta a c tttggcggc 960 ac ta tta ccg t c t t t c c g tc actgg tcag t g a g t tc t t tg gcctcaataa cctggcgaaa 1020 aactacggtg t g a t t t a t c t c g g tttc g g t atcggtagca t t t g tg g t t c g a tta tcg cc 1080 tc a c tg t t tg g cg g c ttc ta tg tg a c c ttc ta c g tg a t t t tcg ccc tg c t g a ttc tg tc a 1140 t tg g c g c t t t ctacgacgat tcgtcagcca gagcagaaaa tg ttg c g tg a ggcgcatggc 1200 tc c c t t ta a 1209 <210>3

<211> 486

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400>3

Met Pro Leu Ser Lys Val Glu His Tyr Leu Ser Tyr His Thr Arg Leu

1 5 10 15

Claims

REIVINDICACIONES

1. Microorganismo Escherichia coli modificado genéticamente para producir 2,4-dihidroxibutirato por fermentación, en el que dicho microorganismo se modifica genéticamente además para reducir la acumulación de 2,4-dihidroxibutirato intracelular, optimizando así la producción de 2,4-dihidroxibutirato,

en el que la modificación genética para reducir la acumulación de 2,4-dihidroxibutirato intracelular es:

i) una sobreexpresión de por lo menos un gen que codifica un sistema de eflujo seleccionado de entre el grupo que consiste en:

• sistemas de eflujo de monocarboxilato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°:1, SEC ID N°:3, SEC ID N°:5, SEC ID N°:7, SEC ID N°:9, SEC ID N°:11, SEC ID N°:13, SEC ID N°:15, SEC ID N°:17, y SEC ID N°:19,

• sistemas de eflujo de formiato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 21,

• sistemas de eflujo de lactato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°:23, SEC ID N°:25, SEC ID N°:27, SEC ID N°:29, SEC ID N°:31, SEC ID N°:33, SEC ID N°:35, SEC ID N°:37, SEC ID N°:39, SEC ID N°:41, SEC ID N°:43, SEC ID N°:45, SEC ID N°:47, SEC ID N°:49, SEC ID N°:51, y SEC ID N°:53,

• sistemas de eflujo de malato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°:55, SEC ID N°:57, SEC ID N°:59, y SEC ID N°:61,

• sistemas de eflujo de succinato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 63, SEC ID N°: 65, y SEC ID N°: 67,

• sistemas de eflujo de ácido carboxílico aromático de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 69 y SEC ID N°: 71,

• variantes funcionales de los mismos que presentan una identidad de secuencia de por lo menos 80% con dichas secuencias de aminoácidos, y

• cualquier combinación de los mismos; y/o

ii) una atenuación de la expresión o la eliminación de por lo menos un gen que codifica un transportador de captación seleccionado de entre el grupo que consiste en:

• transportadores de captación de alfa-cetoglutarato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 73, • transportadores de captación de lactato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 75,

• transportadores de captación de glicolato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 77,

• transportadores de captación de acetato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 79 y SEC ID N°: 81, • transportadores de captación de propionato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 83,

• transportadores de captación de pantotenato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 85,

• transportadores de captación de succinato y acetato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 87, • transportadores de captación de acetoacetato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 89,

• transportadores de captación de gluconato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 91,

• transportadores de captación de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 93,

• cualquier combinación de los mismos.

2. Microorganismo E. coli según la reivindicación 1, en el que dicho sistema de eflujo se selecciona de entre el grupo que consiste en:

° sistemas de eflujo de lactato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 23,

° sistemas de eflujo de lactato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 25,

° cualquier combinación de los mismos.

3. Microorganismo E. coli según la reivindicación 1, en el que dicho transportador de captación se selecciona de entre el grupo que consiste en:

° transportadores de captación de alfa-cetoglutarato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 73,

° transportadores de captación de lactato de secuencia de aminoácidos SEC ID N°: 75,

° cualquier combinación de los mismos.

4. Microorganismo E. coli según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el microorganismo se modifica genéticamente para convertir por lo menos uno de los intermediarios metabólicos siguientes en 2,4-dihidroxibutirato:

iii) 1,2,4-butanotriol;

iv) (L)-malato;

v) (L)malil-CoA; y

vi) (L)-homoserina.

5. Microorganismo E. coli según la reivindicación 4, en el que el microorganismo se modifica genéticamente para convertir la xilosa en el intermediario metabólico 1,2,4-butanotriol, siendo dicha modificación genética una sobreexpresión de por lo menos uno de los genes siguientes:

° un gen que codifica una xilosa deshidrogenasa,

° un gen que codifica una xilonolactonasa,

° un gen que codifica una xilonato deshidratasa,

° un gen que codifica 1,2,4-butanotriol deshidrogenasa, y

° cualquier combinación de los mismos.

6. Microorganismo E. coli según la reivindicación 5, que comprende además la eliminación y/o la atenuación de por lo menos un gen seleccionado de entre el grupo que consiste en:

° un gen que codifica una xilosa isomerasa,

° un gen que codifica una xilulosa cinasa,

° un gen que codifica una 3-desoxi-D-glicero-pentulosonato aldolasa,

° un gen que codifica una cetoácido deshidrogenasa, y

° cualquier combinación de los mismos.

7. Microorganismo E. coli según la reivindicación 4, en el que el microorganismo se modifica genéticamente para convertir el intermediario metabólico (L)-malato en 2,4-dihidroxibutirato, comprendiendo dicha modificación genética:

° la sobreexpresión de por lo menos un gen que codifica una malato cinasa, convirtiendo así el malato en 4-fosfo-malato;

° la sobreexpresión de por lo menos un gen que codifica una malato semialdehído deshidrogenasa, convirtiendo así el 4-fosfo-malato en malato-4-semialdehído; y

° la sobreexpresión de por lo menos un gen que codifica una DHB deshidrogenasa, convirtiendo así el malato-4-semialdehído en 2,4-dihidroxibutirato.

8. Microorganismo E. coli según la reivindicación 4, en el que el microorganismo se modifica genéticamente para convertir el intermediario metabólico (L)malil-CoA en 2,4-dihidroxibutirato, comprendiendo dicha modificación genética:

° la sobreexpresión de por lo menos un gen que codifica una malil-CoA reductasa, convirtiendo así malil-CoA en malato-4-semialdehído; y

9. Microorganismo E. coli según la reivindicación 4, en el que el microorganismo se modifica genéticamente para convertir el intermediario metabólico (L)-homoserina en 2,4-dihidroxibutirato, comprendiendo dicha modificación genética:

a. la sobreexpresión de por lo menos un gen que codifica una enzima seleccionada de entre el grupo que consiste en homoserina oxidasas, homoserina deshidrogenasas, homoserina transaminasas y cualquier combinación de las mismas, convirtiendo así la (L)-homoserina en 2-oxo-4-hidroxibutirato; y

b. la sobreexpresión de por lo menos un gen que codifica una 2-oxo-4-hidroxibutirato (OHB) reductasa, convirtiendo así el 2-oxo-4-hidroxibutirato (OHB) en 2,4-dihidroxibutirato.

10. Método para la producción de 2,4-dihidroxibutirato, que comprende:

a) cultivar un microorganismo genéticamente modificado como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en un medio de cultivo que comprende una fuente de carbono, en condiciones de fermentación que permiten la conversión de dicha fuente de carbono en 2,4-dihidroxibutirato, y

b) recuperar el 2,4-dihidroxibutirato de dicho medio de cultivo.