ES2899597T3

ES2899597T3 - Colirio para tratar el ojo seco

Info

Publication number: ES2899597T3
Application number: ES18798346T
Authority: ES
Inventors: Zuguo Liu; Xiaobo Zhang; Xiang Lin
Original assignee: Eye Medical Xiamen Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Eye Medical Xiamen Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-05-11
Filing date: 2018-05-10
Publication date: 2022-03-14
Anticipated expiration: 2038-05-10
Also published as: CN107049938A; EP3636252B1; US20200171066A1; CN107049938B; EP3636252A4; EP3636252A1; WO2018205961A1

Abstract

Un colirio para tratar el ojo seco caracterizado porque: un valor de pH del colirio es 5,0-7,0, el colirio comprende 5-hidroxi-1-beta-D-furanosil-1H-imidazol-5-carboxamida, y el colirio comprende los siguientes componentes con el siguiente porcentaje en peso: 0,05 ∼ 0,1% de 5-hidroxi-1-beta-D-furanosil-1H-imidazol-5-carboxamida, una cantidad adecuada de regulador de pH, 0,01 ∼ 3% de un agente isotónico, 0,003 ∼ 0,5% de un agente bacteriostático, 0,001 ∼ 0,5% de un estabilizador, 0,01 ∼ 0,5% de un agente de pegajosidad, 2 ∼ 5% de un solubilizante, y el resto es agua.

Description

DESCRIPCIÓN

Colirio para tratar el ojo seco

Campo de divulgación

La presente divulgación se refiere al campo del tratamiento del ojo seco y, en particular, se refiere a un colirio para tratar el ojo seco.

Antecedentes de la divulgación

El ojo seco es una enfermedad común y frecuente en las clínicas de oftalmología. Según una gran muestra, la encuesta epidemiológica del ojo seco realizada por Schaumberg et al. en los Estados Unidos, la prevalencia de ojo seco en mujeres menores de 50 años es del 5,7% y la tasa de prevalencia aumenta al 9,8% en los mayores de 75 años. Los síntomas del ojo seco son más pronunciados en las mujeres que en los hombres. Cuanto mayor es el nivel de educación, mayor es la tasa de prevalencia. Del mismo modo, la prevalencia de ojo seco en hombres de 50 a 54 años es del 3,9%. Cuando se supera los 80 años, la prevalencia alcanza el 7,67%. Se estima que para 2030, el número de pacientes varones con ojo seco en los Estados Unidos alcanzará los 2,79 millones. En China, según una encuesta epidemiológica realizada por Shi Changhong et al., la tasa de prevalencia de ojo seco fue del 67,9% entre los 31.124 pacientes incluidos, y la tasa en mujeres (72,7%) fue mayor que en hombres (62,8%). La incidencia de ojo seco en varones menores de 25 años es mayor que en mujeres. La prevalencia de ojo seco fue del 54,3% en el grupo de menores de 25 años de edad, del 65,9% en el grupo de 25 a 45 años y del 79,1% en el grupo de más de 45 años. Con el desarrollo de la ciencia y la tecnología, una gran cantidad de productos de alta tecnología se han utilizado ampliamente en la generación más joven, tal como teléfonos móviles y tabletas, lo que aumenta en gran medida la fatiga visual de los jóvenes. Junto con el deterioro del medio ambiente circundante y el aumento de la presión vital, la tasa de prevalencia del ojo seco ha aumentado año tras año y se ha vuelto significativamente más prevalente en las generaciones más jóvenes. El ojo seco puede causar sequedad en los ojos, sensación de cuerpo extraño, fatiga visual, disminución de la visión, etc. El ojo seco grave puede causar una pérdida significativa de la visión e incluso ceguera. Las actividades diarias de los pacientes con ojo seco, tales como leer, trabajar, usar ordenadores, mirar televisión y conducir, se ven afectadas. Se puede decir que el ojo seco afecta gravemente la eficiencia del trabajo humano y la calidad de vida, y el ojo seco se ha convertido en un problema social que la gente moderna tiene que afrontar y necesita resolver con urgencia.

La patogenia del ojo seco está relacionada con inflamación, apoptosis, anomalías de la neuromodulación y trastornos de las hormonas sexuales. La importancia de la inflamación en la patogenia del ojo seco ha sido bien documentada en los últimos años. TNF-a, IL-1 p, MMP-9 y otros factores inflamatorios están asociados con el daño epitelial de la superficie ocular en pacientes con ojo seco. La inflamación de la superficie ocular y la glándula lagrimal en pacientes con ojo seco se asocia principalmente con la infiltración masiva y activación de los linfocitos T CD4+. La disminución de las células caliciformes y la metaplasia escamosa se correlacionaron positivamente con la infiltración de células T CD4+ y la expresión de IFN-y en pacientes con ojo seco. Los factores inflamatorios secretados por las células T CD4+ juegan un papel importante en el desarrollo del ojo seco. Por ejemplo, la regulación posterior de la citocina IFN-y de Th1 en la superficie ocular del ojo seco conduce a un gran número de apoptosis de las células epiteliales conjuntivales. La regulación posterior proporcional de IFN-y / 1L-13 conduce a una disminución en la densidad de las células caliciformes conjuntivales. La regulación posterior de la citoquina IL-17A de Th17 da como resultado un daño a la función de barrera corneal. Clínicamente, la expresión de marcadores inflamatorios, tales como HLA clase II, ICAM-1 y CCR5, en el epitelio conjuntival de pacientes con ojo seco aumenta significativamente. Lam et al., confirmaron recientemente que la expresión de las quimiocinas inflamatorias IL-8, MIP-1a y RANTES en las lágrimas de varios pacientes con ojo seco está regulada posteriomente, y las células que presentan antígenos de CD11B+ y CD11c+ están implicadas en la inflamación ocular del ojo seco. Las células T reguladoras juegan un papel importante en la patogenia del ojo seco. CD4+, las células T CD4+, y las células T CD8+ pueden inhibir el aumento de linfocitos T CD4+ patológicos en ojos secos. Las células NK / NKT pueden agravar la función de barrera corneal al promover la respuesta de Th-17 del ojo seco. Los estudios clínicos han demostrado que la administración de fármacos antiinflamatorios, tales como corticosteroides, ciclosporina inmunosupresora y FK506, aplicados tópicamente en el ojo, puede aliviar eficazmente los síntomas y signos del ojo seco.

En 2013, la Corneal Diseases Section of the Chinese Medical Association Ophthalmology Branch alcanzó un consenso sobre el diagnóstico y tratamiento clínico del ojo seco, y estableció especificaciones para una definición, epidemiología y factores de riesgo, clasificación, examen y diagnóstico, y tratamiento del ojo seco. Para el ojo seco de moderado a grave, se recomiendan glucocorticoides, fármacos antiinflamatorios no esteroides y agentes inmunosupresores. Entre ellos, la terapia inmunosupresora es una de las claves para el tratamiento del ojo seco. En la actualidad, los agentes inmunosupresores más utilizados en la práctica clínica son el colirio de ciclosporina A al 0,05% (Ciclosporina) y el colirio de tacrolimus al 0,05% (FK506). Ambos fármacos mostraron una buena eficacia en aplicaciones clínicas. Después de 6 meses de tratamiento tópico con ciclosporina A, la expresión de marcadores relacionados con la inflamación (tal como IL-1, TNF-a, etc.) disminuyó significativamente. Después de 3 meses de tratamiento con ciclosporina A al 0,05%, los síntomas y signos de la superficie ocular se redujeron significativamente y los factores inflamatorios de IL-4, IL-5, IL-17A, TNFa e IFN-y en lágrimas disminuyeron significativamente. El tratamiento tópico con ciclosporina A puede inhibir eficazmente la infiltración de células T CD4+, la apoptosis de las células epiteliales conjuntivales y la pérdida de células caliciformes en la conjuntiva del ojo seco. Los pacientes con síndrome de Sjogren usan 0,03% de tacrolimus para mejorar la estabilidad de la película lagrimal y mantener el estado normal de la superficie ocular. Los experimentos con animales han demostrado que el 0,025% de FK506 aplicado tópicamente al ojo puede inhibir la activación de la vía de señalización de NF-kB en ratones y reducir los signos de la superficie ocular del ojo seco. El 0.02% de las gotas de tacrolimus aplicadas tópicamente en el ojo pueden aumentar significativamente la cantidad de secreción de lágrimas en experimentos de ojo seco utilizando perros. Sin embargo, la ciclosporina A y FK506 son altamente lipofílicos y difícilmente solubles en agua, y en su mayoría se convierten en diversas gotas oftálmicas de aceite vegetal preparadas en el país y en el extranjero. Estas gotas oleosas para los ojos son extremadamente irritantes para los ojos y el paciente suele ser intolerante con ellas. Ocasionalmente, se producen alergias y el fármaco se separa inmediatamente de las lágrimas, lo que reduce la biodisponibilidad intraocular. Con el fin de mejorar la biodisponibilidad intraocular de los dos fármacos, se ha estudiado la preparación de los dos fármacos en microemulsiones, micelas, liposomas, nanopartículas de poli-£-caprolactona, nanopartículas de quitosano y similares. Los procesos anteriores pueden aumentar eficazmente la carga de fármacos de fármacos poco solubles o fármacos insolubles en agua. En particular, la técnica de emulsificación puede reducir la irritación de la aplicación tópica y, como la dispersión de las gotitas de emulsión es grande, la absorción del medicamento es rápida y la biodisponibilidad puede mejorarse de forma eficaz. Aun así, la deficiencia congénita de colirios solubles en grasa todavía no se ha superado por completo en la actualidad. Más de un billón de personas en todo el mundo sufren de ojo seco y existe una gran necesidad de tratamiento para el ojo seco. Por lo tanto, es extremadamente urgente detectar nuevos inmunosupresores de la superficie ocular para el ojo seco, especialmente los inmunosupresores oftálmicos solubles en agua.

Breve resumen de la divulgación

La presente divulgación proporciona un colirio para tratar el ojo seco para resolver las deficiencias de las técnicas existentes.

Una solución técnica de la presente divulgación es la siguiente: un colirio para tratar el ojo seco, un valor de pH del colirio es 5,0-7,0, el colirio comprende 5-hidroxi-1-beta-D-furanosil-1H-imidazol-5-carboxamida (también denominada mizoribina). El colirio comprende los siguientes componentes con los siguientes porcentajes en peso: 0,05 ~ 0,1% de 5-hidroxi-1-beta-D-furanosil-1H-imidazol-5-carboxamida, una cantidad apropiada de regulador de pH, 0,01 ~ 3% de un agente isotónico, 0,003~ 0,5% de un agente bacteriostático, 0,001 ~ 0,5% de un estabilizador, 0,01 ~ 0,5% de un agente de pegajosidad, 2 ~ 5% de un solubilizante y el resto es agua.

En otra realización preferida, el regulador de pH es al menos uno seleccionado de un grupo que consiste en dihidrogeno fosfato de sodio, hidrogeno fosfato de disodio, dihidrogeno fosfato de potasio, hidrogeno fosfato de dipotasio, ácido bórico, bórax, ácido acético, acetato de sodio, ácido cítrico, citrato de sodio, ácido tartárico, tartrato de sodio, carbonato de sodio, carbonato de potasio, hidrogeno carbonato de sodio, hidrogeno carbonato de potasio, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, ácido clorhídrico y ácido fosfórico. El regulador de pH hace que el pH del colirio sea igual o próximo al pH de las lágrimas y reduce la irritación del colirio, estabiliza el fármaco y mejora los efectos del fármaco.

En otra realización preferida, el agente isotónico es al menos uno seleccionado entre cloruro de sodio, cloruro de potasio, ácido bórico, bórax, sulfato de sodio, sulfato de potasio, nitrato de sodio, nitrato de potasio, acetato de sodio, manitol, glicerol, propilenglicol o glucosa. El agente isotónico hace que una presión osmótica del colirio sea igual o próxima a la presión osmótica de las lágrimas, así como que reduzca la irritación del colirio y mejore los efectos del fármaco.

En otra realización preferida, el agente bacteriostático es al menos uno seleccionado de un grupo que consiste en cloruro de benzalconio, bromuro de benzalconio, acetato de clorhexidina, gluconato de clorhexidina, clorobutanol, fenoxietanol, metilparabeno, etilparabeno y propilparabeno. El agente bacteriostático puede hacer que el colirio no se infecte fácilmente con bacterias, lo que garantiza la seguridad del producto.

En otra realización preferida, el estabilizador es al menos uno seleccionado de un grupo que consiste en sulfito de sodio, bisulfito de sodio, metabisulfito de sodio, nitrito de sodio, tiosulfato de sodio, ácido ascórbico, tiourea, estearato de ascorbilo, dibutil cresol, cisteína, acetato de tocoferilo, dicloroisocianato, etilendiaminotetraacetato de disodio, etilendiaminotetraacetato de sodio y calcio, dimercaptopropanol, glicerol, manitol e hidroxianisol butilado. El estabilizador se configura para aumentar la estabilidad del colirio y mejorar los efectos de los fármacos.

En otra realización preferida, el agente de pegajosidad es al menos uno seleccionado de un grupo que consiste en hialuronato de sodio, carboximetilcelulosa de sodio, celulosa de grado A, polietilenglicol, alcohol polivinílico, carbómero y povidona. El agente de pegajosidad puede aumentar la viscosidad del colirio, prolongar el tiempo de retención del fármaco en la superficie ocular y aumentar la concentración eficaz del fármaco.

En otra realización preferida, el solubilizante es al menos uno seleccionado de un grupo que consiste en polisorbato, éter de glicerilo de aceite de ricino de polioxietileno, éster de ácido graso de polioxietileno, éter del alcohol graso de polioxietileno y poloxámero. El solubilizante puede aumentar la solubilidad del fármaco.

Los efectos beneficiosos de la presente divulgación son los siguientes: el tratamiento tópico del colirio de la presente divulgación puede proteger la función de barrera epitelial corneal de ratones que padecen ojo seco, renovar varias células caliciformes conjuntivales y tener mejores efectos antiinflamatorios e inmunosupresores.

Breve descripción del dibujo

La Figura 1 ilustra un gráfico que muestra un resultado de la tinción fluorescente de la OGD corneal de la realización 10 de la presente divulgación.

La Figura 2 ilustra un gráfico que muestra un resultado de la tinción de PAS de las células caliciformes conjuntivales de la realización 10 de la presente divulgación.

La Figura 3 ilustra un gráfico que muestra el resultado de la tinción de las células T CD4+conjuntivales de la realización 10 de la presente divulgación.

La Figura 4 ilustra un gráfico que muestra un resultado de la PCR en tiempo real de la realización 10 de la presente divulgación.

Descripción detallada de las realizaciones

La presente divulgación se describirá con más detalle a continuación con la combinación de los dibujos adjuntos junto con las realizaciones.

Realización 1

Componentes:

Proceso de preparación:

1. Pesar con precisión 1,00 g de mizoribina, 0,03 g de cloruro de benzalconio, 8,30 g de cloruro de sodio y 30 ml de ácido clorhídrico 0,1 mol / L, agregar 200 ml de agua para inyección, disolver, agitar uniformemente y añadir agua para inyección hasta alcanzar un volumen de 1000 ml para obtener una solución medicinal.

2. Filtrar la solución del medicamento una vez a través de una membrana microporosa de 0,45 pm y luego filtrar dos veces a través de una membrana microporosa de 0,22 pm.

3. Después de las pruebas químicas de la solución del medicamento, en un entorno de nivel A, llenar 5,0 ml de la solución del medicamento en un envase de plástico de dosis única de 5 ml y sellar para obtener el producto. Realización 2

Componentes:

Proceso de preparación:

1. Pesar con precisión 1,00 g de mizoribina, añadir 300 ml de agua para inyección y disolver para obtener una primera solución para su uso posterior.

2. Pesar con precisión 0,05 g de acetato de clorhexidina, 7,20 g de dihidrógeno fosfato de sodio, 0,95 g de hidrógeno fosfato de disodio y 4,79 g de cloruro de sodio, disolver en 200 ml de agua para inyección, y luego agitar y mezclar uniformemente para obtener una segunda solución para su uso posterior.

3. Mezclar la primera solución y la segunda solución, agitar uniformemente y añadir agua para inyección hasta alcanzar un volumen de 1000 ml para obtener una solución del medicamento.

4. Filtrar la solución del medicamento una vez a través de una membrana microporosa de 0,45 gm y luego filtrar dos veces a través de una membrana microporosa de 0,22 gm.

5. Después de las pruebas químicas de la solución del medicamento, en el entorno de nivel A, llenar 5.0 mL de la solución del medicamento en un envase de plástico de una sola dosis de 5 mL, sellar para obtener el producto.

Realización 3

Componentes:

Proceso de preparación:

1. Pesar con precisión 1,00 g de mizoribina, 0,03 g de bromuro de benzalconio, 6,40 g de dihidrógeno fosfato de sodio, 1,89 g de hidrógeno fosfato de disodio, 4,72 g de cloruro de sodio y 0,10 g de etilendiaminotetraacetato de disodio, añadir 200 ml de agua para inyección, disolver, agitar uniformemente y añadir agua para inyección hasta alcanzar un volumen de 1000 ml para obtener una solución del medicamento.

2. Filtrar la solución del medicamento una vez a través de una membrana microporosa de 0,45 gm y luego filtrar dos veces a través de una membrana microporosa de 0,22 gm.

3. Esterilizar la solución del medicamento filtrada en autoclave a 121 °C durante 8 minutos y enfriar.

4. Después de las pruebas químicas de la solución del medicamento, en el entorno de nivel A, llenar 5,0 ml de la solución del medicamento en un envase de plástico de dosis única de 5 ml y sellar para obtener el producto.

Realización 4

Componentes:

Proceso de preparación:

1. Pesar con precisión 1,00 g de mizoribina, 0,10 g de gluconato de clorhexidina, 19,10 g de ácido bórico y 13,00 g de glicerol, añadir 200 ml de agua para inyección, disolver, agitar uniformemente y añadir agua para inyección hasta alcanzar un volumen de 1000 ml para obtener una solución del medicamento.

3. Después de las pruebas químicas de la solución del medicamento, en el ambiente de nivel A, llenar 5.0mL de la solución del medicamento en un envase de plástico de una sola dosis de 5mL, sellar para obtener el producto.

Realización 5

Componentes:

Proceso de preparación:

1. Pesar con precisión 1,00 g de mizoribina, 0,03 g de cloruro de benzalconio, 7,20 g de dihidrógeno fosfato de sodio, 0,95 g de hidrógeno fosfato de disodio, 14,0 g de glicerol y 0,10 g de etilendiaminotetraacetato de disodio, añadir 200 ml de agua para inyección, disolver, agitar uniformemente y añadir agua para inyección hasta alcanzar un volumen de 1000 ml para obtener una solución del medicamento.

2. Filtrar la solución del medicamento una vez a través de una membrana microporosa de 0,45 gm y luego filtrar una vez a través de una membrana microporosa de 0,22 gm.

Realización 6

Componentes:

Proceso de preparación:

1. Pesar con precisión 0,10 g de hialuronato de sodio, añadir 200 ml de agua para inyección, hinchar y dejar reposar durante la noche mientras se agita durante 5 min cada 1 h.

2. Pesar con precisión 1,00 g de mizoribina, 0,03 g de cloruro de benzalconio, 7,20 g de dihidrógeno fosfato de sodio, 0,95 g de hidrógeno fosfato de disodio, 4,79 g de cloruro de sodio y 0,10 g de etilendiaminotetraacetato de disodio, añadir 200 ml de agua para inyección, disolver, agitar uniformemente, añadir la solución de hialuronato de sodio obtenida en la etapa 1, y luego añadir agua para inyección hasta alcanzar un volumen de 1000 ml para obtener una solución del medicamento.

3. Filtrar la solución del medicamento una vez a través de una membrana microporosa de 0,45 gm y luego filtrar dos veces a través de una membrana microporosa de 0,22 gm.

Realización 7

Componentes:

Proceso de preparación:

Pesar con precisión 0,10 g de hialuronato de sodio, añadir 200 ml de agua para inyección, hinchar, dejar reposar durante 12 h mientras se agita durante 5 min cada 1 h.

2. Pesar con precisión 0,03 g de cloruro de benzalconio y 0,10 g de etilendiaminotetraacetato de disodio, añadir 300 ml de agua para inyección, disolver, agitar uniformemente y luego pesar con precisión 6,40 g de dihidrógeno fosfato de sodio, 1,90 g de hidrógeno fosfato de disodio y 4,70 g de cloruro de sodio para la solución anterior y agitar uniformemente.

3. Pesar con precisión 1,00 g de mizoribina en la solución mixta obtenida en la etapa 2, calentar adecuadamente durante un proceso de disolución, disolver mientras se agita y enfriar a temperatura ambiente si se calienta.

4. Añadir la solución obtenida en la etapa 3 a la solución de hialuronato de sodio disuelto obtenida en la etapa 1, agitar y mezclar uniformemente, y después añadir agua para inyección hasta alcanzar un volumen de 1000mL para obtener una solución del medicamento.

5. Filtrar la solución del medicamento una vez a través de una membrana microporosa de 0,45 pm y luego filtrar dos veces a través de una membrana microporosa de 0,22 pm.

6. Después de las pruebas químicas de la solución del medicamento, en el entorno de nivel A, llenar 5,0 ml de la solución del medicamento en un envase de plástico de dosis única de 5 ml y sellar para obtener el producto.

Realización 8

Componentes:

Proceso de preparación:

1. Pesar con precisión 0,10 g de hialuronato de sodio, añadir 200 ml de agua para inyección, hinchar y dejar reposar durante 12 h mientras se agita durante 5 min cada 1 h.

2. Pesar con precisión 5,00 g de bromuro de benzalconio y 5,00 g de sulfito de sodio, añadir 500 ml de agua para inyección, disolver, agitar uniformemente y después pesar con precisión 6,40 g de dihidrógeno fosfato de sodio, 1,90 g de hidrógeno fosfato de disodio y 4,70 g de cloruro de sodio para la solución anterior y agitar uniformemente.

3. Pesar con precisión 1,00 g de mizoribina a la solución mixta obtenida en la etapa 2, calentar adecuadamente durante un proceso de disolución, agitar y enfriar a temperatura ambiente si se calienta.

5. Filtrar la solución del medicamento una vez a través de una membrana microporosa de 0,45 gm y luego filtrar dos veces a través de una membrana microporosa de 0,22 gm.

Realización 9

Componentes:

Proceso de preparación:

2. Pesar con precisión 6,40 g de dihidrógeno fosfato de sodio y 1,90 g de hidrógeno fosfato de disodio en 300 ml de agua para inyección y agitar uniformemente.

3. Pesar con precisión 1,00 g de mizoribina y 4,70 g de cloruro de sodio, triturar hasta obtener un polvo fino, añadir 30 ml de polisorbato 80 y mezclar uniformemente. Pesar con precisión 0,03 g de cloruro de benzalconio y 0,10 g de etilendiaminotetraacetato de disodio, añadir 300 ml de agua para inyección, disolver, calentar y agitar, mantener la temperatura del agua a 70-80 °C y transferir completamente la mizoribina et al. en la solución acuosa anterior mientras se agita uniformemente, añadir 300 ml de agua para inyección y enfriar a temperatura ambiente para aclarar.

4. Agregar gota a gota la solución obtenida en la etapa 3 a la solución obtenida en la etapa 2, luego añadir lentamente la solución de hialuronato de sodio disuelto, agitar y mezclar uniformemente, y luego añadir agua para inyección hasta lograr un volumen de 1000mL para obtener una solución del medicamento.

En las realizaciones mencionadas anteriormente, se describe una cantidad de preparación de prescripción por medio de 1000 ml. En la producción industrial real, la cantidad de preparación de prescripción puede aumentarse según una proporción de la prescripción.

Realización 10: Evaluación de la eficacia ocular

Efecto terapéutico del 0,1% del colirio de mizoribina en ratones que padecen ojo seco

Método experimental:

1. Establecer un modelo de ratón de ojo seco: Se inyectaron subcutáneamente ratones hembra C57BL / 6 de 10-12 semanas de edad con 0,5 mg / 0,2 ml de escopolamina cuatro veces al día y se mantuvieron en un ambiente seco durante 5 días (RH: 30 ± 3; T: 23-25 °C); el grupo de control normal se mantuvo en un ambiente normal (RH: 60% -80%; T: 23-25°C).

Preparación del colirio de mizoribina: el grupo de tratamiento del ojo seco utilizó 0,1% de colirio de mizoribina preparado por el método de la Realización 1.

Método del colirio: el tratamiento con el colirio se realizó utilizando el colirio mencionado anteriormente 4 veces al día en ambos ojos.

Indicadores de evaluación y métodos de operación:

1. Tinción fluorescente de OGD de la córnea: se sacrificaron los ratones y se vertieron 0,5 gl de Oregongreen-dextrano (OGD) en el saco conjuntival de los ratones con una pipeta, se realizó un parpadeo manual y se lavó el saco conjuntival con 1 ml de solución salina normal 1 minuto después. Se observó la tinción de fluorescencia del epitelio corneal y se fotografió bajo un microscopio de fluorescencia vivo.

2. Tinción de PAS de células caliciformes conjuntivales: Se cortaron muestras de parafina de los globos oculares completos (saco conjuntival) de los ratones en secciones de 5 gm y se tiñeron con reactivo de ácido periódico-Schiff (PAS) para observar la morfología y el número de células caliciformes conjuntivales.

3. Tinción de células TCD4+ conjuntivales: fijar secciones congeladas con acetona a -20 °C durante 10 minutos, romper con 0,2% de Triton-X PBS durante 10 minutos y usar 0,3% de H²O²para eliminar la peroxidasa endógena, bloquear con un 20% de suero normal de cabra durante 45 minutos. El anti-CD4 primario se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de un lavado extenso (digestión), el anticuerpo biotinilado (segundo) se incubó durante 30 minutos. Finalmente, se utilizó un kit Vectastain Elite ABC para desarrollar el color y teñir el núcleo.

4. PCR en tiempo real:

Preparar la solución de reacción de PCR según los siguientes componentes:

Procedimiento estándar de amplificación por PCR en tres etapas:

Etapa 1: Número de ciclos de desnaturalización previa: 195 °C, 30 s.

Etapa 2: número de ciclos de reacción de PCR: 4095 °C durante 5 segundos. y 60 °C durante 34 s.

Etapa 3: Curva de disolución

El nivel de expresión relativa del gen se analizó mediante el método del Ct relativo, y la expresión específica del gen diana se calculó mediante la siguiente fórmula, es decir, el nivel de expresión relativo = 2-ññCÍ; en donde -AACt = -(ACt, q - ACt, cb), ACt, q = Ct, x - Ct, r, ACt, cb = Ct, cb - Ct, r, donde r = gen de referencia, Cb = valor de calibración, X = gen diana y el umbral del ciclo (C) se determina mediante la señal primaria (fluorescencia).

Resultados experimentales y conclusiones:

1. Los resultados de la tinción de fluorescencia de OGD corneal mostraron que el número de tinciones puntiformes de la córnea se redujo significativamente en el 0,1% del grupo de mizoribina en comparación con el grupo de ojo seco, y no se observó tinción escamosa. Los resultados mostraron que el 0,1% del tratamiento ocular tópico con mizoribina puede reducir significativamente el daño epitelial corneal y tener el efecto de proteger la barrera epitelial corneal (como se muestra en la Figura 1).

2. La tinción de PAS de las células caliciformes conjuntivales mostró un aumento significativo en el número de células caliciformes conjuntivales en el 0,1% del grupo de mizoribina en comparación con el grupo de ojo seco. Los resultados mostraron que: el 0,1% del tratamiento ocular tópico con mizoribina puede restaurar significativamente el número de células caliciformes y asegurar la cantidad de secreción de mucina (como se muestra en la Figura 2).

3. Los resultados de tinción de las células T CD4+ conjuntivales mostraron que la proporción de células de color marrón amarillento en el 0,1% del grupo de tratamiento con mizoribina se redujo significativamente en comparación con el grupo de ojo seco. El análisis estadístico del recuento de las células T CD4+ de los dos grupos mostraron que la diferencia es estadísticamente significativa. Los resultados mostraron que el 0,1% del tratamiento ocular tópico con mizoribina puede reducir significativamente la infiltración de células T CD4+ conjuntivales, con evidente efecto antiinflamatorio (como se muestra en la Figura 3).

4. Los resultados de la PCR en tiempo real mostraron que, en comparación con el grupo de ojo seco, la expresión de los factores inflamatorios conjuntivales TNF-a, IL-1 p, IFN-y e IL-13 disminuyó significativamente en el 0,1% del grupo de tratamiento con mizoribina, y la diferencia es estadísticamente significante. Los resultados mostraron que el 0,1% del tratamiento ocular tópico con mizoribina tiene mejores efectos antiinflamatorios e inmunosupresores (como se muestra en la Figura 4).

Será evidente para los expertos en la técnica que se pueden realizar diversas modificaciones y variaciones en la presente divulgación sin apartarse del espíritu o alcance de la invención. Por tanto, se pretende que la presente divulgación cubra las modificaciones y variaciones de esta invención siempre que entren dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un colirio para tratar el ojo seco caracterizado porque:

un valor de pH del colirio es 5,0-7,0,

el colirio comprende 5-hidroxi-1-beta-D-furanosil-1H-imidazol-5-carboxamida, y

el colirio comprende los siguientes componentes con el siguiente porcentaje en peso:

0,05 ~ 0,1% de 5-hidroxi-1-beta-D-furanosil-1 H-imidazol-5-carboxamida, una cantidad adecuada de regulador de pH, 0,01 ~ 3% de un agente isotónico,

0,003 ~ 0,5% de un agente bacteriostático,

0,001 ~ 0,5% de un estabilizador,

0,01 ~ 0,5% de un agente de pegajosidad,

2 ~ 5% de un solubilizante, y

el resto es agua.

2. El colirio para el tratamiento del ojo seco según la reivindicación 1, caracterizado porque:

el regulador de pH es al menos uno seleccionado de un grupo que consiste en dihidrógeno fosfato de sodio, hidrógeno fosfato de disodio, dihidrógeno fosfato de potasio, hidrógeno fosfato de dipotasio, ácido bórico, bórax, ácido acético, acetato de sodio, ácido cítrico, citrato de sodio, ácido tartárico, tartrato de sodio, carbonato de sodio, carbonato de potasio, hidrógeno carbonato de sodio, hidrógeno carbonato de potasio, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, ácido clorhídrico y ácido fosfórico.

3. El colirio para el tratamiento del ojo seco según la reivindicación 1, caracterizado porque:

el agente isotónico es al menos uno seleccionado entre cloruro de sodio, cloruro de potasio, ácido bórico, bórax, sulfato de sodio, sulfato de potasio, nitrato de sodio, nitrato de potasio, acetato de sodio, manitol, glicerol, propilenglicol o glucosa.

4. El colirio para el tratamiento del ojo seco según la reivindicación 1, caracterizado porque:

el agente bacteriostático es al menos uno seleccionado de un grupo que consiste en cloruro de benzalconio, bromuro de benzalconio, acetato de clorhexidina, gluconato de clorhexidina, clorobutanol, fenoxietanol, metilparabeno, etilparabeno y propilparabeno.

5. El colirio para el tratamiento del ojo seco según la reivindicación 1, caracterizado porque:

el estabilizador es al menos uno seleccionado de un grupo que consiste en sulfito de sodio, bisulfito de sodio, metabisulfito de sodio, nitrito de sodio, tiosulfato de sodio, ácido ascórbico, tiourea, estearato de ascorbilo, dibutil cresol, cisteína, acetato de tocoferilo, dicloroisocianato, etilendiaminotetraacetato de disodio, etilendiaminotetraacetato de calcio y sodio, dimercaptopropanol, glicerol, manitol e hidroxianisol butilado.

6. El colirio para el tratamiento del ojo seco según la reivindicación 1, caracterizado porque:

el agente de pegajosidad es al menos uno seleccionado de un grupo que consiste en hialuronato de sodio, carboximetilcelulosa de sodio, celulosa de grado A, polietilenglicol, alcohol polivinílico, carbómero y povidona.

7. El colirio para el tratamiento del ojo seco según la reivindicación 1, caracterizado porque:

el solubilizante es al menos uno seleccionado de un grupo que consiste en polisorbato, éter de glicerilo de aceite de ricino de polioxietileno, éster de ácido graso de polioxietileno, éter de alcohol graso de polioxietileno y poloxámero.