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ES2899386T3 - Procedimiento in vitro para identificar cáncer de páncreas o una neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas - Google Patents

Procedimiento in vitro para identificar cáncer de páncreas o una neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas Download PDF

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ES2899386T3
ES2899386T3 ES17720719T ES17720719T ES2899386T3 ES 2899386 T3 ES2899386 T3 ES 2899386T3 ES 17720719 T ES17720719 T ES 17720719T ES 17720719 T ES17720719 T ES 17720719T ES 2899386 T3 ES2899386 T3 ES 2899386T3
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Cos Meritxel Gironella
Garangou Antoni Castells
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Hospital Clinic de Barcelona
Centro de Investigacion Biomedica en Red CIBER
Advanced Marker Discovery SL AMADIX
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Abstract

Procedimiento in vitro para el cribado de sujetos con riesgo de desarrollar cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN) que comprende: (a) medir el patrón de expresión o el nivel de al menos hsa-miR-33a* obtenido de una muestra biológica aislada de los sujetos a cribar; y (b) comparar dicho patrón o nivel de expresión de al menos miR-33a* de los sujetos a cribar con un patrón o nivel de expresión ya establecido, en el que la sobreexpresión de al menos hsa-miR-33a* es indicativa de cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN).

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento in vitro para identificar cáncer de páncreas o una neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas
Campo de la invención
La presente invención puede incluirse en el campo de la medicina personalizada, en la que se utilizan biomarcadores específicos para identificar una enfermedad o trastorno dado. Específicamente, algunos microARN (también denominados miARN o miR-) se usan en la presente invención para identificar sujetos humanos con riesgo de desarrollar cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN), preferentemente adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC).
Antecedentes de la invención
El adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) es la cuarta causa principal de muerte por cáncer en los países occidentales y tiene el peor pronóstico de todas las neoplasias malignas principales con una tasa de sobrevida a cinco años de solo el 6%. En el momento del diagnóstico, la mayoría de los pacientes presentan enfermedad localmente avanzada o metastásica que impide la resección curativa y tienen una sobrevida media de menos de 1 año {Stathis, #2281; Raimondi, 2009 #2150}. Estas terribles estadísticas se deben a la alta agresividad del tumor, la respuesta limitada a los tratamientos disponibles, la resistencia a la quimioterapia y la radiación en la mayoría de los casos y la falta de procedimientos para la detección temprana {Hezel, 2006 #2114; Costello, #3039}.
Actualmente, las mejores pruebas de diagnóstico disponibles incluyen tomografía computarizada (CT), imagenología por resonancia magnética (MRI) combinada con colangiopancreatografía por resonancia magnética (MRCP) y biopsia por aspiración con aguja fina guiada por ecografía endoscópica (EUS-FNA) {Seufferlein, #3163}. Junto con un uso cada vez mayor de estas técnicas de imagenología, el diagnóstico de neoplasia mucinosa papilar intraductal (IPMN), la lesión precursora quística más común de PDAC, ha aumentado incesantemente representando hasta el 25% de las neoplasias pancreáticas resecadas {Andrejevic-Blant, 2007 #3175}. Sin embargo, no son lo suficientemente sensibles para evaluar la malignidad de una IPMN o para detectar el cáncer de páncreas en una etapa temprana de la displasia {Vilmann, 2006 #3195}. Por lo tanto, se requiere con urgencia un conocimiento más profundo de la carcinogénesis molecular de PDAC, nuevos biomarcadores de diagnóstico temprano y dianas terapéuticas efectivas para mejorar el resultado de esta enfermedad maligna.
Los microARN (miARN) son pequeños ARN endógenos no codificantes de 19-25 nucleótidos que regulan negativamente la expresión génica a nivel postranscripcional reprimiendo la traducción del ARNm o dirigiéndose hacia los ARNm para su degradación {Bartel, 2004 #3178}. Se estima que los miARN modulan la traducción de más del 60% de los genes que codifican proteínas y participan en la regulación de una amplia gama de procesos biológicos como la proliferación celular, diferenciación, apoptosis y desarrollo {Esteller, #3179; Di Leva, #3158}. Su desregulación juega un papel esencial en el desarrollo y progresión del cáncer y pueden actuar como supresores de tumores u oncogenes al dirigirse hacia uno o incluso cientos de ARNm {Esquela-Kerscher, 2006 #968}.
Se ha informado ampliamente sobre la expresión aberrante de miARN en cánceres humanos que incluyen PDAC y sus lesiones precursoras {Zhang, 2009 #3189; Yu, #3183}. La expresión diferencial de miARN entre tejidos normales y malignos puede surgir de alteraciones cromosómicas de los genes miARN, muchos de los cuales se encuentran en regiones genómicas asociadas al cáncer, mutaciones puntuales del ADN, mecanismos epigenéticos o alteraciones en la maquinaria de procesamiento de miARN {Di Leva, #3181}. Varios estudios de perfiles de expresión de miARN han definido firmas de miARN para PDAC que están asociadas con el diagnóstico, la estadificación, la progresión, el pronóstico y la respuesta al tratamiento {Jamieson, #3186; Giovannetti, #265; Papaconstantinou, #3193; Giovannetti, #3191}.
US2014100124 divulga un procedimiento para evaluar células neoplásicas pancreáticas pero este documento no usa los biomarcadores ensayados en la presente invención.
WO2012083969 divulga una expresión diferencial significativa de miR-33a* en el adenocarcinoma ampular que afecta al conducto biliar, pero no al páncreas.
EP2518158 divulga miR-33a como marcador de expresión para cáncer de páncreas. Sin embargo, guarda silencio sobre el posible uso de miR-33a*.
Para esta invención, hemos analizado por primera vez el miRNoma de PDAC e IPMN utilizando la técnica de secuenciación de próxima generación. Los inventores han identificado y descubierto nuevos microARN candidatos como biomarcadores para la detección temprana del cáncer de páncreas.
Breve descripción de la invención
La presente invención ofrece una solución clara para el cribado y diagnóstico preciso de sujetos en riesgo de padecer o desarrollar cáncer de páncreas, mediante un procedimiento, preferentemente mínimamente invasivo, capaz de detectar no solo pacientes en riesgo de padecer cáncer de páncreas sino también pacientes que podrían padecer una neoplasia mucinosa papilar intraductal (IPMN) y así poder identificar a los sujetos en riesgo en una etapa temprana.
Breve descripción de las Figuras
Figura 1. Se muestra un diagrama de flujo del diseño del estudio. La secuenciación de próxima generación se realizó en un conjunto de muestras de tejido pancreático para el descubrimiento de biomarcadores. Los miARN candidatos se analizaron mediante qRT-PCR en 2 conjuntos independientes de muestras. FDR: tasa de falsos descubrimientos; FC: cambio múltiplo; IQR: intervalo intercuartílico.
Figura 2. Resultados de secuenciación de próxima generación. A) PDAC vs SALUDABLE. Mapa de calor TOP 50. B) IPMN vs SALUDABLE. Mapa de calor TOP 50. C) Entre grupos de análisis que muestran la agrupación de muestras en función de la expresión de miARN.
Figura 3. Las muestras de PDAC e IPMN comparten microARN desregulados comunes. A) Diagrama de Venn que muestra miARN significativamente desregulados entre los grupos PDAC e IPMN en comparación con muestras pancreáticas normales (grupo sano). B) Gráfico de volcán de datos NGS. Verde: miARN comúnmente desregulado en grupos PDAc e IPMN (FDR < 0,05). Verde oscuro: miARN fuertemente regulado al alza (FC > 2, FDR < 0,05 y recuentos medios en todas las muestras > 400) en los grupos PDAC e IPMN. Cruces naranjas: miARN seleccionado para validación mediante qRT-PCR en un conjunto de entrenamiento.
Figura 4. Flujo de trabajo de los resultados del estudio. Número de miARN significativamente sobreexpresados en muestras de PDAC e IPMN frente a tejido pancreático sano en dos conjuntos independientes de muestras.
Figura 5. Curvas de característica operativa del receptor (ROC) de 8 miARN que ilustran un alto poder discriminatorio para pacientes con PDAC.
Descripción detallada de la invención
Definiciones
Para los objetivos de la presente invención, las siguientes definiciones se incluyen a continuación:
- El término "cribado" se entiende como el examen o prueba de un grupo de individuos pertenecientes a la población general, con riesgo de padecer cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal de páncreas (IPMN), preferentemente derivado de adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), con el objetivo de discriminar a los individuos sanos de aquellos que padecen un cáncer de páncreas no diagnosticado o neoplasia mucinosa papilar intraductal de páncreas (IPMN), o que tienen un alto riesgo de padecer dichas indicaciones.
- El término "cáncer de páncreas" es sinónimo del término "neoplasia pancreática" e incluye la definición médica bien aceptada.
- La expresión "neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN)" se refiere a un tipo de tumor (neoplasia) que crece dentro de los conductos pancreáticos (intraductales) y se caracteriza por la producción de líquido espeso por las células tumorales (mucinoso). Las neoplasias mucinosas papilares intraductales son importantes porque si no se tratan algunas de ellas progresan a un cáncer invasivo (se transforma de un tumor benigno a un tumor maligno). Así como los pólipos de colon pueden convertirse en cáncer de colon si no se tratan, también algunas neoplasias mucinosas papilares intraductales progresan hacia un cáncer de páncreas invasivo. Las neoplasias mucinosas papilares intraductales pueden presentar una oportunidad para tratar un tumor pancreático antes de que se convierta en un cáncer agresivo y difícil de tratar.
- El término "hsa-miR-33a*" también se denomina en la presente memoria hsa-miR-33a-3p MIMAT0004506 y consta de la siguiente secuencia: CAAUGUUUCCACAGUGCAUCAC.
- La expresión "muestra biológica mínimamente invasiva" se refiere a cualquier muestra que se extrae del cuerpo del paciente sin necesidad de utilizar instrumentos dañinos, distintos de las finas agujas que se utilizan para extraer la sangre del paciente y, por consiguiente, sin ser perjudicial para el paciente. Específicamente, muestra biológica mínimamente invasiva se refiere en la presente invención a: muestras de sangre, suero o plasma.
- El término "regulado al alza" o "sobreexpresado" de cualquiera de los micro-ARN o combinaciones de los mismos descritos en la presente invención, se refiere a un aumento en su nivel de expresión con respecto a un "valor umbral" o "valor de corte " en al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 15%, al menos un 20%, al menos un 25%, al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50%, al menos un 55%, al menos un 60%>, al menos un 65%>, al menos un 70%, al menos un 75%, al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 100%, al menos un 110%, al menos un 120%, al menos un 130%, al menos un 140%, al menos un 150% o más.
- El término "valor umbral" o "valor de corte", cuando se refiere a los niveles de expresión de los miARN descritos en la presente invención, se refiere a un nivel de expresión de referencia indicativo de que es probable que un sujeto sufra de cáncer colorrectal o adenoma colorrectal con una determinada sensibilidad y especificidad si los niveles de expresión del paciente están por encima de dicho umbral o niveles de corte o de referencia.
- El término "que comprende" significa que incluye, pero no se limita a, todo lo que sigue al término "que comprende". Por lo tanto, el uso del término "que comprende" indica que los elementos enumerados son requeridos u obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden estar presentes o no.
- Por el término "que consiste en" se entiende que incluye, y se limita a, todo lo que sigue a la frase "que consiste en". Por lo tanto, la frase "que consiste en" indica que los elementos enumerados son requeridos u obligatorios, y que no pueden estar presentes otros elementos.
- También se hace notar que el término "kit", como se usa en la presente memoria, no se limita a ningún dispositivo específico e incluye cualquier dispositivo adecuado para trabajar con la invención, tal como, entre otros, microarreglos, bioarreglos, biochips o conjuntos de biochips.
Se conocen en la técnica anterior una variedad de procedimientos estadísticos y matemáticos para establecer el umbral o nivel de corte de expresión. Puede seleccionarse un umbral o nivel de corte de expresión para un biomarcador particular, por ejemplo, basándose en datos de los gráficos de las Características Operativas del Receptor (ROC), como se describe en los Ejemplos y Figuras de la presente invención. Un experto en la técnica apreciará que estos umbrales o niveles de corte de expresión se pueden variar, por ejemplo, moviéndose a lo largo del gráfico ROC para un biomarcador particular o combinaciones de los mismos, para obtener diferentes valores de sensibilidad o especificidad afectando así el rendimiento general del ensayo. Por ejemplo, si el objetivo es tener un procedimiento de diagnóstico robusto desde el punto de vista clínico, deberíamos intentar tener una alta sensibilidad. Sin embargo, si el objetivo es tener un procedimiento rentable, deberíamos intentar obtener una alta especificidad. El mejor punto de corte se refiere al valor obtenido del gráfico ROC para un biomarcador particular que produce la mejor sensibilidad y especificidad. Los valores de sensibilidad y especificidad se calculan sobre el intervalo de umbrales (puntos de corte). Por lo tanto, los valores umbral o de corte se pueden seleccionar de manera que la sensibilidad y/o especificidad sean al menos aproximadamente del 70%, y pueden ser, por ejemplo, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o al menos el 100% en al menos el 60% de la población de pacientes analizada, o en al menos el 65%, 70%, 75% u 80% de la población de pacientes analizada.
Por consiguiente, cada una de las realizaciones citadas a lo largo de la presente invención se lleva a cabo preferentemente determinando los niveles de expresión de al menos los microARN citados en la presente invención en una muestra aislada de un sujeto a diagnosticar o cribar, y comparar los niveles de expresión de dichos micro­ ARN con valores umbral o de corte predeterminados, en el que dichos valores umbral o de corte predeterminados corresponden al nivel de expresión de dichos micro-ARN que está correlacionado con la mayor especificidad a una sensibilidad deseada en una curva ROC calculada en función de los niveles de expresión de los micro-ARN determinados en una población de pacientes con riesgo de desarrollar cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN), en el que la sobreexpresión de al menos uno de dichos micro-ARN con respecto a dicho valor de corte predeterminado indicativa de que el sujeto padece cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN) con dicha sensibilidad deseada.
Descripción
En este estudio, hemos realizado un perfil de miARN de todo el genoma mediante secuenciación de próxima generación en un grupo de muestras pancreáticas que incluyen PDAC, IPMN y páncreas sano. Nuestros resultados muestran que la expresión de miARN basada en tejidos puede discriminar entre pacientes con PDAC y sujetos de control, y también entre pacientes con la lesión precursora de IPMN e individuos sanos. Hasta donde sabemos, este es uno de los primeros informes que aplican secuenciación paralela masiva para el descubrimiento de biomarcadores en el contexto del cáncer de páncreas. Este análisis de alto rendimiento ha permitido la identificación de un gran número de biomarcadores de miARN putativos útiles para detectar pacientes que albergan PDAC o IPMN. Además, hemos validado en 2 grupos diferentes de muestras el patrón de expresión de 30 miRNA, confirmando así su capacidad de diferenciar PDAC o IPMN de los controles. En este sentido, la lista de los 30 microARN altamente discriminantes arriba mencionados, entre PDAC o IPMN y tejidos sanos es la siguiente: miR-103a, miR-151a-5p, miR-155, miR-16, miR-181a, miR-181b, miR-192, miR-21, miR-221, miR-23a, miR-29a, miR-429, miR-93, miR-320a, let-7e, let-7f, miR-1257, miR-1304, miR-151b, miR-3120-3p, miR-3133, miR-33a*, miR-3714, miR-4468, miR-4639-5p, miR-4713-5p, miR-4714-5p, miR-4770, miR-548d-3p y miR-761. Algunos de estos miARN representan nuevos biomarcadores, no reportados previamente. Finalmente, hemos definido los mejores predictores basados en miARN capaces de discriminar pacientes con PDAC con alta precisión.
La primera asociación de miARN y cáncer provino de un estudio de Calin et al. en el que caracterizaron el cromosoma 13q14 en la leucemia linfocítica crónica (CLL) y mostraron que miR-15 y miR-16 están delecionados o regulados a la baja en aproximadamente el 70% de los casos de CLL {Calin, 2002 #3180}. Desde entonces, se ha descrito una expresión alterada de miARN en varios cánceres humanos como los de mama, pulmón, esófago, próstata y páncreas, entre otros {Piepoli, #3188}. Lu et al., llevaron a cabo un análisis sistemático de 217 miARN de 334 leucemias y cánceres sólidos, y encontraron que los perfiles de expresión de miARN clasifican los cánceres humanos según el linaje de desarrollo y el estado de diferenciación de los tumores {Lu, 2005 #1980}. De acuerdo con esto, nuestro análisis miRNoma de todo el genoma ha demostrado que el PDAC, la IPMN y el tejido pancreático sano tienen un perfil diferencial de miARN. En los últimos años, algunos estudios centrados en perfiles a gran escala de miARN en tejidos pancreáticos han identificado, principalmente mediante microarreglos, tarjetas qRT-PCR o Genechips, una serie de miARN expresados diferencialmente. A pesar de las diferencias en las plataformas de medición y los protocolos de laboratorio, así como en los tamaños de muestra entre los informes anteriores y nuestro estudio, hemos podido confirmar los resultados publicados de diferentes estudios. Entre esos 30 miARN validados por qRT-PCR, hemos encontrado expresión concordante de miARN previamente reportados alterados en tejido PDAC (es decir, regulación al alza de miR-103a, miR-151a-5p, miR-155, miR-16, miR-181a, miR-181b, miR-192, miR-21, miR-221, miR-23a, miR-29a, miR-429 y miR-93) {Jamieson, #3186; Piepoli, #3188; Bloomston, 2007 #3182; Szafranska, 2007 #3190; Lee, 2007 #3192; Bauer, #3207} pero también hemos identificado varios miARN nuevos (17 miARN) que están significativamente regulados al alza en PDAC (miR-320a, let-7e, let-7f, miR-1257, miR-1304, miR-151b, miR-3120-3p, miR-3133, miR-33a*, miR-3714, miR-4468, miR-4639-5p, miR-4713-5p, miR-4714-5p, miR-4770, miR-548d-3p y miR-761).
Además, la Tabla 1 a continuación proporciona una comparación de la expresión entre PDAC o IPMN y pacientes sanos, de 17 miARN de la lista de 30 miARN antes mencionada, analizados en un conjunto de plasma.
T l 1.
Figure imgf000005_0001
Además, la siguiente Tabla 2 proporciona un análisis de la curva ROC de los 17 miARN mencionados anteriormente analizados en el conjunto de plasma.
Tabla 2. Análisis de la curva ROC de los 17 miARN anteriormente mencionados analizados en el conjunto de lasma.
Figure imgf000006_0002
Además, en la presente memoria se proporciona un análisis de la curva ROC de las mejores combinaciones de miARN del conjunto de plasma mencionado anteriormente (véase la Tabla 3 a continuación).
Tabla 3. Análisis de la curva ROC de las mejores combinaciones de miARN del conjunto de
l m l T l 1.
Figure imgf000006_0001
Además, debido a la incidencia creciente y al alto riesgo de malignidad que presentan las lesiones de IPMN, nuestro objetivo fue investigar el miRNoma de IPMN junto con PDAC con el fin de identificar miARN candidatos para la detección de ambas neoplasias pancreáticas. Hasta ahora, pocos estudios han analizado la expresión de miARN en IPMN. Habbe et al. demostraron una sobreexpresión significativa de 10 miARN de los 12 analizados por estar regulados al alza en el cáncer de páncreas {Habbe, 2009 #2164}. Matthaei H el al. y Lubezky S et al. mostraron que ciertos miARN tienen un nivel de expresión diferente en IPMN de bajo grado versus alto grado, que pueden usarse como marcadores de invasividad {Matthaei, #3184; Lubezky, #3185}.
Nuestros resultados de NGS han demostrado que las lesiones de PDAC e IPMN comparten 325 miARN significativamente desregulados. Esto indica que la expresión de miARN aberrante ocurre temprano en el desarrollo del cáncer de páncreas. De los 30 miARN validados como significativamente regulados al alza en IPMN, ya se habían descrito 6 (es decir, miR-155, miR-16, miR-181a, miR-21, miR-221 y miR-93) {Habbe, 2009 #2164; Matthaei, #3184; Lubezky, #3185; Caponi, #3187}. Sin embargo, los otros 24 miARN encontrados desregulados en IPMN no habían sido reportados previamente.
Para garantizar resultados fiables, hemos corroborado el mismo patrón de expresión de los 30 miARN mencionados anteriormente en 3 conjuntos de muestras independientes (conjunto NGS, de entrenamiento y de prueba) y, por consiguiente, hemos observado que el perfil diferencial de miARN en muestras de tejido congelado se correlaciona bien con el de las muestras EUS-FNA. Szafranska et al. reportaron que el análisis de miARN de biopsias de FNA pancreático fresco diferenciaba tejidos malignos de benignos {Szafranska, 2008 #271}. Ali et al. validaron la expresión de 7 miARN en bloques de células incrustadas en parafina fijadas con formalina (FFPE) de FNA de diagnóstico de PDAC {Ali, #3112}.
Por consiguiente, nuestro estudio afirma la viabilidad de detectar miARN en muestras de FNA sometiéndose a la validación de un mayor número de miARN en una cohorte mayor. Es notable señalar la alta precisión discriminativa para PDAC de miR-93, miR16, miR-548d-3p y miR-320a con AUC superior a 0,95 en el conjunto de prueba. Su desempeño en el conjunto de entrenamiento, aunque presenta un AUC superior a 0,8, no es tan preciso como en el conjunto de prueba debido a las diferencias en las características clínicas de los pacientes. En resumen, este estudio identifica nuevos miARN comúnmente desregulados en muestras biológicas de PDAC e IPMN, como una muestra de tumor o de una muestra biológica mínimamente invasiva, como una muestra de plasma, una muestra de sangre, una muestra de líquido cefalorraquídeo (CSF) o una muestra de suero, con potencial utilidad como biomarcadores de diagnóstico. Además, de estos resultados podrían surgir nuevas dianas terapéuticas.
Por lo tanto, la invención se refiere a un procedimiento in vitro para el cribado de sujetos con riesgo de desarrollar cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN) que comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos hsa-miR-33a*, y (b) comparar dicho patrón o nivel de expresión de al menos hsa-miR-33a* de los sujetos a cribar con un patrón o nivel de expresión ya establecido, en el que la sobreexpresión de al menos cualquiera de los miARN mencionados anteriormente es indicativa de cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN).
En una realización preferente del primer aspecto de la invención, el procedimiento in vitro para cribar sujetos comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos hsa-miR-33a* y al menos uno o más del siguiente grupo de miARN: hsa-let-7c, hsa-let-7e, hsa-let-7f, hsa-miR-103a, hsa-miR-1257, hsa-miR-1304, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-151b, hsa-miR-155, hsa-miR-16, hsa-miR-181, hsa-miR-181a, hsa-miR-181b, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsa-miR-221, hsa-miR-23a, hsa-miR-29a, hsa-miR-3120-3p, hsa-miR-3133, hsa-miR-3145-3p, hsa-miR-320a, hsa-miR-3692, hsa-miR-3714, hsa-miR-4256, hsa-miR-429, hsa-miR-4313, hsa-miR-4468, hsa-miR-4639-5p, hsamiR-4642, hsa-miR-4666-3p, hsa-miR-4713-5p, hsa-miR-4714-5p, hsa-miR-4723-5p, hsa-miR-4770, hsa-miR-4801, hsa-miR-548d-3p, hsa-miR-616*, hsa-miR-761 y hsa-miR-93, en el que la sobreexpresión de al menos miR-33a* y al menos uno de los biomarcadores identificados anteriormente es indicativa de cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN).
En una realización que no forma parte de la invención, el procedimiento in vitro para cribar sujetos comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos hsa-miR-320a y al menos uno o más del siguiente grupo de miARN: hsa-let-7c, hsa-let-7e, hsa-let-7f, hsa-miR-103a, hsa-miR-1257, hsa-miR-1304, hsa-miR-151a-5p, hsamiR-151b, hsa-miR-155, hsa-miR-16, hsa-miR-181, hsa-miR-181a, hsa-miR-181b, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsamiR-221, hsa-miR-23a, hsa-miR-29a, hsa-miR-3120-3p, hsa-miR-3133, hsa-miR-3145-3p, hsa-miR-33a*, hsamiR-3692, hsa-miR-3714, hsa-miR-4256, hsa-miR-429, hsa-miR-4313, hsa-miR-4468, hsa-miR-4639-5p, hsa-miR-4642, hsa-miR-4666-3p, hsa-miR-4713-5p, hsa-miR-4714-5p, hsa-miR-4723-5p, hsa-miR-4770, hsa-miR-4801, hsa-miR-548d-3p, hsa-miR-616*, hsa-miR-761 y hsa-miR-93, en el que la sobreexpresión de al menos hsa-miR-320a y al menos uno de los biomarcadores identificados anteriormente es indicativa de cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN).
En una realización que no forma parte de la invención, el procedimiento in vitro para cribar sujetos comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos hsa-let-7e y al menos uno o más del siguiente grupo de miARN: hsa-let-7c, hsa-miR-33a*, hsa-let-7f, hsa-miR-103a, hsa-miR-1257, hsa-miR-1304, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR 151b, hsa-miR-155, hsa-miR-16, hsa-miR-181, hsa-miR-181a, hsa-miR-181b, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsa-miR-221, hsa-miR-23a, hsa-miR-29a, hsa-miR-3120-3p, hsa-miR-3133, hsa-miR-3145-3p, hsa-miR-320a, hsa-miR-3692, hsa-miR-3714, hsa-miR-4256, hsa-miR-429, hsa-miR-4313, hsa-miR-4468, hsa-miR-4639-5p, hsa-miR-4642, hsa-miR-4666-3p, hsa-miR-4713-5p, hsa-miR-4714-5p, hsa-miR-4723-5p, hsa-miR-4770, hsa-miR-4801, hsa-miR-548d-3p, hsa-miR-616*, hsa-miR-761 y hsa-miR-93, en el que la sobreexpresión de al menos hsa-let-7e y al menos uno de los biomarcadores identificados anteriormente es indicativa de cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN).
En una realización que no forma parte de la invención, el procedimiento in vitro para cribar sujetos comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos hsa-let-7f y al menos uno o más del siguiente grupo de miARN: hsa-let-7c, hsa-let-7e, hsa-miR-33a*, hsa-miR-103a, hsa-miR-1257, hsa-miR-1304, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-151b, hsa-miR-155, hsa-miR-16, hsa-miR-181, hsa-miR-181a, hsa-miR-181b, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsa-miR-221, hsa-miR-23a, hsa-miR-29a, hsa-miR-3120-3p, hsa-miR-3133, hsa-miR-3145-3p, hsa-miR-320a, hsa-miR-3692, hsa-miR-3714, hsa-miR-4256, hsa-miR-429, hsa-miR-4313, hsa-miR-4468, hsa-miR-4639-5p, hsa-miR-4642, hsa-miR-4666-3p, hsa-miR-4713-5p, hsa-miR-4714-5p, hsa-miR-4723-5p, hsa-miR-4770, hsa-miR-4801, hsa-miR-548d-3p, hsa-miR-616*, hsa-miR-761 y hsa-miR-93, en el que la sobreexpresión de al menos hsa-let-7f y al menos uno de los biomarcadores identificados anteriormente es indicativa de cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN).
En una realización que no forma parte de la invención, el procedimiento in vitro para cribar sujetos comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos hsa-miR-1257 y al menos uno o más del siguiente grupo de miARN: hsa-let-7c, hsa-let-7e, hsa-let-7f, hsa-miR-103a, hsa-miR-33a*, hsa-miR-1304, hsa-miR-151a-5p, hsamiR-151b, hsa-miR-155, hsa-miR-16, hsa-miR-181, hsa-miR-181a, hsa-miR-181b, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsamiR-221, hsa-miR-23a, hsa-miR-29a, hsa-miR-3120-3p, hsa-miR-3133, hsa-miR-3145-3p, hsa-miR-320a, hsamiR-3692, hsa-miR-3714, hsa-miR-4256, hsa-miR-429, hsa-miR-4313, hsa-miR-4468, hsa-miR-4639-5p, hsa-miR-4642, hsa-miR-4666-3p, hsa-miR-4713-5p, hsa-miR-4714-5p, hsa-miR-4723-5p, hsa-miR-4770, hsa-miR-4801, hsa-miR-548d-3p, hsa-miR-616*, hsa-miR-761 y hsa-miR-93, en el que la sobreexpresión de al menos hsa-miR-1257 y al menos uno de los biomarcadores identificados anteriormente es indicativa de cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN).
En una realización que no forma parte de la invención, el procedimiento in vitro para cribar sujetos comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos hsa-miR-1304 y al menos uno o más del siguiente grupo de miARN: hsa-let-7c, hsa-let-7e, hsa-let-7f, hsa-miR-103a, hsa-miR-33a*, hsa-miR-1257, hsa-miR-151a-5p, hsamiR-151b, hsa-miR-155, hsa-miR-16, hsa-miR-181, hsa-miR-181a, hsa-miR-181b, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsamiR-221, hsa-miR-23a, hsa-miR-29a, hsa-miR-3120-3p, hsa-miR-3133, hsa-miR-3145-3p, hsa-miR-320a, hsamiR-3692, hsa-miR-3714, hsa-miR-4256, hsa-miR-429, hsa-miR-4313, hsa-miR-4468, hsa-miR-4639-5p, hsa-miR-4642, hsa-miR-4666-3p, hsa-miR-4713-5p, hsa-miR-4714-5p, hsa-miR-4723-5p, hsa-miR-4770, hsa-miR-4801, hsa-miR-548d-3p, hsa-miR-616*, hsa-miR-761 y hsa-miR-93, en el que la sobreexpresión de al menos hsa-miR-1304 y al menos uno de los biomarcadores identificados anteriormente es indicativa de cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN).
En una realización que no forma parte de la invención, el procedimiento in vitro para cribar sujetos comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos hsa-miR-151b y al menos uno o más del siguiente grupo de miARN: hsa-let-7c, hsa-let-7e, hsa-let-7f, hsa-miR-103a, hsa-miR-33a*, hsa-miR-1257, hsa-miR-151a-5p, hsamiR-1304, hsa-miR-155, hsa-miR-16, hsa-miR-181, hsa-miR-181a, hsa-miR-181b, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsamiR-221, hsa-miR-23a, hsa-miR-29a, hsa-miR-3120-3p, hsa-miR-3133, hsa-miR-3145-3p, hsa-miR-320a, hsamiR-3692, hsa-miR-3714, hsa-miR-4256, hsa-miR-429, hsa-miR-4313, hsa-miR-4468, hsa-miR-4639-5p, hsa-miR-4642, hsa-miR-4666-3p, hsa-miR-4713-5p, hsa-miR-4714-5p, hsa-miR-4723-5p, hsa-miR-4770, hsa-miR-4801, hsa-miR-548d-3p, hsa-miR-616*, hsa-miR-761 y hsa-miR-93, en el que la sobreexpresión de al menos hsa-miR-151b y al menos uno de los biomarcadores identificados anteriormente es indicativa de cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN).
En una realización que no forma parte de la invención, el procedimiento in vitro para cribar sujetos comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos hsa-miR-3120-3p y al menos uno o más del siguiente grupo de miARN: hsa-let-7c, hsa-let-7e, hsa-let-7f, hsa-miR-103a, hsa-miR-33a*, hsa-miR-1257, hsa-miR-151a-5p, hsamiR-1304, hsa-miR-155, hsa-miR-16, hsa-miR-181, hsa-miR-181a, hsa-miR-181b, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsamiR-221, hsa-miR-23a, hsa-miR-29a, hsa-miR-151b, hsa-miR-3133, hsa-miR-3145-3p, hsa-miR-320a, hsa-miR-3692, hsa-miR-3714, hsa-miR-4256, hsa-miR-429, hsa-miR-4313, hsa-miR-4468, hsa-miR-4639-5p, hsa-miR-4642, hsa-miR-4666-3p, hsa-miR-4713-5p, hsa-miR-4714-5p, hsa-miR-4723-5p, hsa-miR-4770, hsa-miR-4801, hsa-miR-548d-3p, hsa-miR-616*, hsa-miR-761 y hsa-miR-93, en el que la sobreexpresión de al menos hsa-miR-3120-3p y al menos uno de los biomarcadores identificados anteriormente es indicativa de cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN).
En una realización que no forma parte de la invención, el procedimiento in vitro para cribar sujetos comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos hsa-miR-3133 y al menos uno o más del siguiente grupo de miARN: hsa-let-7c, hsa-let-7e, hsa-let-7f, hsa-miR-103a, hsa-miR-33a*, hsa-miR-1257, hsa-miR-151a-5p, hsamiR-1304, hsa-miR-155, hsa-miR-16, hsa-miR-181, hsa-miR-181a, hsa-miR-181b, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsamiR-221, hsa-miR-23a, hsa-miR-29a, hsa-miR-151b, hsa-miR-3120-3p, hsa-miR-3145-3p, hsa-miR-320a, hsamiR-3692, hsa-miR-3714, hsa-miR-4256, hsa-miR-429, hsa-miR-4313, hsa-miR-4468, hsa-miR-4639-5p, hsa-miR-4642, hsa-miR-4666-3p, hsa-miR-4713-5p, hsa-miR-4714-5p, hsa-miR-4723-5p, hsa-miR-4770, hsa-miR-4801, hsa-miR-548d-3p, hsa-miR-616*, hsa-miR-761 y hsa-miR-93, en el que la sobreexpresión de al menos hsa-miR-3133 y al menos uno de los biomarcadores identificados anteriormente es indicativa de cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN).
En una realización que no forma parte de la invención, el procedimiento in vitro para cribar sujetos comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos hsa-miR-3714 y al menos uno o más del siguiente grupo de miARN: hsa-let-7c, hsa-let-7e, hsa-let-7f, hsa-miR-103a, hsa-miR-33a*, hsa-miR-1257, hsa-miR-151a-5p, hsamiR-1304, hsa-miR-155, hsa-miR-16, hsa-miR-181, hsa-miR-181a, hsa-miR-181b, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsamiR-221, hsa-miR-23a, hsa-miR-29a, hsa-miR-151b, hsa-miR-3120-3p, hsa-miR-3145-3p, hsa-miR-320a, hsamiR-3692, hsa-miR-3133, hsa-miR-4256, hsa-miR-429, hsa-miR-4313, hsa-miR-4468, hsa-miR-4639-5p, hsa-miR-4642, hsa-miR-4666-3p, hsa-miR-4713-5p, hsa-miR-4714-5p, hsa-miR-4723-5p, hsa-miR-4770, hsa-miR-4801, hsa-miR-548d-3p, hsa-miR-616*, hsa-miR-761 y hsa-miR-93, en el que la sobreexpresión de al menos hsa-miR-3714 y al menos uno de los biomarcadores identificados anteriormente es indicativa de cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN).
En una realización que no forma parte de la invención, el procedimiento in vitro para cribar sujetos comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos hsa-miR-4468 y al menos uno o más del siguiente grupo de miARN: hsa-let-7c, hsa-let-7e, hsa-let-7f, hsa-miR-103a, hsa-miR-33a*, hsa-miR-1257, hsa-miR-151a-5p, hsamiR-1304, hsa-miR-155, hsa-miR-16, hsa-miR-181, hsa-miR-181a, hsa-miR-181b, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsamiR-221, hsa-miR-23a, hsa-miR-29a, hsa-miR-151b, hsa-miR-3120-3p, hsa-miR-3145-3p, hsa-miR-320a, hsamiR-3692, hsa-miR-3133, hsa-miR-4256, hsa-miR-429, hsa-miR-4313, hsa-miR-3714, hsa-miR-4639-5p, hsa-miR-4642, hsa-miR-4666-3p, hsa-miR-4713-5p, hsa-miR-4714-5p, hsa-miR-4723-5p, hsa-miR-4770, hsa-miR-4801, hsa-miR-548d-3p, hsa-miR-616*, hsa-miR-761 y hsa-miR-93, en el que la sobreexpresión de al menos hsa-miR-4468 y al menos uno de los biomarcadores identificados anteriormente es indicativa de cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN).
En una realización que no forma parte de la invención, el procedimiento in vitro para cribar sujetos comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos hsa-miR-4639-5p y al menos uno o más del siguiente grupo de miARN: hsa-let-7c, hsa-let-7e, hsa-let-7f, hsa-miR-103a, hsa-miR-33a*, hsa-miR-1257, hsa-miR-151a-5p, hsamiR-1304, hsa-miR-155, hsa-miR-16, hsa-miR-181, hsa-miR-181a, hsa-miR-181b, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsamiR-221, hsa-miR-23a, hsa-miR-29a, hsa-miR-151b, hsa-miR-3120-3p, hsa-miR-3145-3p, hsa-miR-320a, hsamiR-3692, hsa-miR-3133, hsa-miR-4256, hsa-miR-429, hsa-miR-4313, hsa-miR-3714, hsa-miR-4468, hsa-miR-4642, hsa-miR-4666-3p, hsa-miR-4713-5p, hsa-miR-4714-5p, hsa-miR-4723-5p, hsa-miR-4770, hsa-miR-4801, hsa-miR-548d-3p, hsa-miR-616*, hsa-miR-761 y hsa-miR-93, en el que la sobreexpresión de al menos hsa-miR-4639-5p y al menos uno de los biomarcadores identificados anteriormente es indicativa de cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN).
En una realización que no forma parte de la invención, el procedimiento in vitro para cribar sujetos comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos hsa-miR-4713-5p y al menos uno o más del siguiente grupo de miARN: hsa-let-7c, hsa-let-7e, hsa-let-7f, hsa-miR-103a, hsa-miR-33a*, hsa-miR-1257, hsa-miR-151a-5p, hsamiR-1304, hsa-miR-155, hsa-miR-16, hsa-miR-181, hsa-miR-181a, hsa-miR-181b, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsamiR-221, hsa-miR-23a, hsa-miR-29a, hsa-miR-151b, hsa-miR-3120-3p, hsa-miR-3145-3p, hsa-miR-320a, hsamiR-3692, hsa-miR-3133, hsa-miR-4256, hsa-miR-429, hsa-miR-4313, hsa-miR-3714, hsa-miR-4468, hsa-miR-4642, hsa-miR-4666-3p, hsa-miR-4639-5p, hsa-miR-4714-5p, hsa-miR-4723-5p, hsa-miR-4770, hsa-miR-4801, hsa-miR-548d-3p, hsa-miR-616*, hsa-miR-761 y hsa-miR-93, en el que la sobreexpresión de al menos hsa-miR-4713- 5p y al menos uno de los biomarcadores identificados anteriormente es indicativa de cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN).
En una realización que no forma parte de la invención, el procedimiento in vitro para cribar sujetos comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos hsa-miR-4714-5p y al menos uno o más del siguiente grupo de miARN: hsa-let-7c, hsa-let-7e, hsa-let-7f, hsa-miR-103a, hsa-miR-33a*, hsa-miR-1257, hsa-miR-151a-5p, hsamiR-1304, hsa-miR-155, hsa-miR-16, hsa-miR-181, hsa-miR-181a, hsa-miR-181b, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsamiR-221, hsa-miR-23a, hsa-miR-29a, hsa-miR-151b, hsa-miR-3120-3p, hsa-miR-3145-3p, hsa-miR-320a, hsamiR-3692, hsa-miR-3133, hsa-miR-4256, hsa-miR-429, hsa-miR-4313, hsa-miR-3714, hsa-miR-4468, hsa-miR-4642, hsa-miR-4666-3p, hsa-miR-4639-5p, hsa-miR-4713-5p, hsa-miR-4723-5p, hsa-miR-4770, hsa-miR-4801, hsa-miR-548d-3p, hsa-miR-616*, hsa-miR-761 y hsa-miR-93, en el que la sobreexpresión de al menos hsa-miR-4714- 5p y al menos uno de los biomarcadores identificados anteriormente es indicativa de cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN).
En una realización que no forma parte de la invención, el procedimiento in vitro para cribar sujetos comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos hsa-miR-4770 y al menos uno o más del siguiente grupo de miARN: hsa-let-7c, hsa-let-7e, hsa-let-7f, hsa-miR-103a, hsa-miR-33a*, hsa-miR-1257, hsa-miR-151a-5p, hsamiR-1304, hsa-miR-155, hsa-miR-16, hsa-miR-181, hsa-miR-181a, hsa-miR-181b, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsamiR-221, hsa-miR-23a, hsa-miR-29a, hsa-miR-151b, hsa-miR-3120-3p, hsa-miR-3145-3p, hsa-miR-320a, hsamiR-3692, hsa-miR-3133, hsa-miR-4256, hsa-miR-429, hsa-miR-4313, hsa-miR-3714, hsa-miR-4468, hsa-miR-4642, hsa-miR-4666-3p, hsa-miR-4639-5p, hsa-miR-4713-5p, hsa-miR-4723-5p, hsa-miR-4714-5p, hsa-miR-4801, hsa-miR-548d-3p, hsa-miR-616*, hsa-miR-761 y hsa-miR-93, en el que la sobreexpresión de al menos hsa-miR-4770 y al menos uno de los biomarcadores identificados anteriormente es indicativa de cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN).
En una realización que no forma parte de la invención, el procedimiento in vitro para cribar sujetos comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos hsa-miR-548d-3p y al menos uno o más del siguiente grupo de miARN: hsa-let-7c, hsa-let-7e, hsa-let-7f, hsa-miR-103a, hsa-miR-33a*, hsa-miR-1257, hsa-miR-151a-5p, hsamiR-1304, hsa-miR-155, hsa-miR-16, hsa-miR-181, hsa-miR-181a, hsa-miR-181b, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsamiR-221, hsa-miR-23a, hsa-miR-29a, hsa-miR-151b, hsa-miR-3120-3p, hsa-miR-3145-3p, hsa-miR-320a, hsamiR-3692, hsa-miR-3133, hsa-miR-4256, hsa-miR-429, hsa-miR-4313, hsa-miR-3714, hsa-miR-4468, hsa-miR-4642, hsa-miR-4666-3p, hsa-miR-4639-5p, hsa-miR-4713-5p, hsa-miR-4723-5p, hsa-miR-4714-5p, hsa-miR-4801, hsa-miR-4770, hsa-miR-616*, hsa-miR-761 y hsa-miR-93, en el que la sobreexpresión de al menos hsa-miR-548d-3p y al menos uno de los biomarcadores identificados anteriormente es indicativa de cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN).
En una realización que no forma parte de la invención, el procedimiento in vitro para cribar sujetos comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos hsa-miR-761 y al menos uno o más del siguiente grupo de miARN: hsa-let-7c, hsa-let-7e, hsa-let-7f, hsa-miR-103a, hsa-miR-33a*, hsa-miR-1257, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-1304, hsa-miR-155, hsa-miR-16, hsa-miR-181, hsa-miR-181a, hsa-miR-181b, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsa-miR-221, hsa-miR-23a, hsa-miR-29a, hsa-miR-151b, hsa-miR-3120-3p, hsa-miR-3145-3p, hsa-miR-320a, hsa-miR-3692, hsa-miR-3133, hsa-miR-4256, hsa-miR-429, hsa-miR-4313, hsa-miR-3714, hsa-miR-4468, hsa-miR-4642, hsamiR-4666-3p, hsa-miR-4639-5p, hsa-miR-4713-5p, hsa-miR-4723-5p, hsa-miR-4714-5p, hsa-miR-4801, hsa-miR-4770, hsa-miR-616*, hsa-miR-548d-3p y hsa-miR-93, en el que la sobreexpresión de al menos hsa-miR-761 y al menos uno de los biomarcadores identificados anteriormente es indicativa de cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN).
En otra realización preferente del primer aspecto de la invención, el procedimiento in vitro para cribar sujetos, comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-16 y hsa-miR-320a, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-181, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-155, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-151b, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-let7e, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-23a, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-151a, o de al menos hsa-miR-33a* y hsamiR-21 y hsa-let7e, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-23a y hsa-miR-21, o de al menos hsa-miR-33a* y hsamiR-93 y hsa-miR-320a, obtenidos de una muestra biológica aislada de los sujetos a cribar; y (b) comparar dicho patrón o nivel de expresión de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-16 y hsa-miR-320a, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-181, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-155, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-151b, o de al menos hsamiR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-let7e, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-23a, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-151a, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-21 y hsa-let7e, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-23a y hsa-miR-21, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-93 y hsa-miR-320a, de los sujetos a cribar con un patrón o nivel de expresión ya establecido, en el que la sobreexpresión de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-16 y hsa-miR-320a, o de al menos hsamiR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-181, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-155, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-151b, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-let7e, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-23a, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsamiR-151a, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-21 y hsa-let7e, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-23a y hsa-miR-21, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-93 y hsa-miR-320a, es indicativa de cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN).
Otra realización que no forma parte de la invención se refiere a un procedimiento in vitro para el cribado de sujetos con riesgo de desarrollar neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN) que comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos hsa-miR-103a, o de al menos hsa-miR-151a-5p, o de al menos hsa-miR-181b, o de al menos hsa-miR-192, o de al menos hsa-miR-23a, o de al menos hsa-miR-29a, o de al menos hsamiR-429, obtenido a partir de una muestra biológica aislada de los sujetos a cribar; y (b) comparar dicho patrón o nivel de expresión de al menos hsa-miR-103a, o de al menos hsa-miR-151a-5p, o de al menos hsa-miR-181b, o de al menos hsa-miR-192, o de al menos hsa-miR-23a, o de al menos hsa-miR-29a, o de al menos hsa-miR-429, de los sujetos a cribar con un patrón o nivel de expresión ya establecido, en el que la sobreexpresión de al menos cualquiera de los miARN mencionados anteriormente es indicativa de neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN).
En otra realización que no forma parte de la invención, el procedimiento in vitro para cribar sujetos comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos hsa-miR-103a y al menos uno o más del siguiente grupo de miARN: hsa-let-7c, hsa-let-7e, hsa-let-7f, hsa-miR-761, hsa-miR-33a*, hsa-miR-1257, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-1304, hsa-miR-155, hsa-miR-16, hsa-miR-181, hsa-miR-181a, hsa-miR-181b, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsa-miR-221, hsa-miR-23a, hsa-miR-29a, hsa-miR-151b, hsa-miR-3120-3p, hsa-miR-3145-3p, hsa-miR-320a, hsa-miR-3692, hsa-miR-3133, hsa-miR-4256, hsa-miR-429, hsa-miR-4313, hsa-miR-3714, hsa-miR-4468, hsa-miR-4642, hsa-miR-4666-3p, hsa-miR-4639-5p, hsa-miR-4713-5p, hsa-miR-4723-5p, hsa-miR-4714-5p, hsa-miR-4801, hsamiR-4770, hsa-miR-616*, hsa-miR-548d-3p y hsa-miR-93, en el que la sobreexpresión de al menos hsa-miR-103a y al menos uno de los biomarcadores identificados anteriormente es indicativa de neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN).
En otra realización que no forma parte de la invención, el procedimiento in vitro para cribar sujetos comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos hsa-miR-151a-5p y al menos uno o más del siguiente grupo de miARN: hsa-let-7c, hsa-let-7e, hsa-let-7f, hsa-miR-761, hsa-miR-33a*, hsa-miR-1257, hsa-miR-103a, hsa-miR-1304, hsa-miR-155, hsa-miR-16, hsa-miR-181, hsa-miR-181a, hsa-miR-181b, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsa-miR-221, hsa-miR-23a, hsa-miR-29a, hsa-miR-151b, hsa-miR-3120-3p, hsa-miR-3145-3p, hsa-miR-320a, hsa-miR-3692, hsa-miR-3133, hsa-miR-4256, hsa-miR-429, hsa-miR-4313, hsa-miR-3714, hsa-miR-4468, hsa-miR-4642, hsa-miR-4666-3p, hsa-miR-4639-5p, hsa-miR-4713-5p, hsa-miR-4723-5p, hsa-miR-4714-5p, hsa-miR-4801, hsamiR-4770, hsa-miR-616*, hsa-miR-548d-3p y hsa-miR-93, en el que la sobreexpresión de al menos hsa-miR-151a-5p y al menos uno de los biomarcadores identificados anteriormente es indicativa de neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN).
En otra realización que no forma parte de la invención, el procedimiento in vitro para cribar sujetos comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos hsa-miR-181b y al menos uno o más del siguiente grupo de miARN: hsa-let-7c, hsa-let-7e, hsa-let-7f, hsa-miR-761, hsa-miR-33a*, hsa-miR-1257, hsa-miR-103a, hsa-miR-1304, hsa-miR-155, hsa-miR-16, hsa-miR-181, hsa-miR-181a, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsamiR-221, hsa-miR-23a, hsa-miR-29a, hsa-miR-151b, hsa-miR-3120-3p, hsa-miR-3145-3p, hsa-miR-320a, hsamiR-3692, hsa-miR-3133, hsa-miR-4256, hsa-miR-429, hsa-miR-4313, hsa-miR-3714, hsa-miR-4468, hsa-miR-4642, hsa-miR-4666-3p, hsa-miR-4639-5p, hsa-miR-4713-5p, hsa-miR-4723-5p, hsa-miR-4714-5p, hsa-miR-4801, hsa-miR-4770, hsa-miR-616*, hsa-miR-548d-3p y hsa-miR-93, en el que la sobreexpresión de al menos hsa-miR-181b y al menos uno de los biomarcadores identificados anteriormente es indicativa de neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN).
En otra realización que no forma parte de la invención, el procedimiento in vitro para cribar sujetos comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos hsa-miR-192 y al menos uno o más del siguiente grupo de miARN: hsa-let-7c, hsa-let-7e, hsa-let-7f, hsa-miR-761, hsa-miR-33a*, hsa-miR-1257, hsa-miR-103a, hsa-miR-1304, hsamiR-155, hsa-miR-16, hsa-miR-181, hsa-miR-181a, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-181b, hsa-miR-21, hsa-miR-221, hsa-miR-23a, hsa-miR-29a, hsa-miR-151b, hsa-miR-3120-3p, hsa-miR-3145-3p, hsa-miR-320a, hsa-miR-3692, hsa-miR-3133, hsa-miR-4256, hsa-miR-429, hsa-miR-4313, hsa-miR-3714, hsa-miR-4468, hsa-miR-4642, hsamiR-4666-3p, hsa-miR-4639-5p, hsa-miR-4713-5p, hsa-miR-4723-5p, hsa-miR-4714-5p, hsa-miR-4801, hsa-miR-4770, hsa-miR-616*, hsa-miR-548d-3p y hsa-miR-93, en el que la sobreexpresión de al menos hsa-miR-192 y al menos uno de los biomarcadores identificados anteriormente es indicativa de neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN).
En otra realización que no forma parte de la invención, el procedimiento in vitro para cribar sujetos comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos hsa-miR-23a y al menos uno o más del siguiente grupo de miARN: hsa-let-7c, hsa-let-7e, hsa-let-7f, hsa-miR-761, hsa-miR-33a*, hsa-miR-1257, hsa-miR-103a, hsa-miR-1304, hsamiR-155, hsa-miR-16, hsa-miR-181, hsa-miR-181a, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-181b, hsa-miR-21, hsa-miR-221, hsa-miR-192, hsa-miR-29a, hsa-miR-151b, hsa-miR-3120-3p, hsa-miR-3145-3p, hsa-miR-320a, hsa-miR-3692, hsa-miR-3133, hsa-miR-4256, hsa-miR-429, hsa-miR-4313, hsa-miR-3714, hsa-miR-4468, hsa-miR-4642, hsamiR-4666-3p, hsa-miR-4639-5p, hsa-miR-4713-5p, hsa-miR-4723-5p, hsa-miR-4714-5p, hsa-miR-4801, hsa-miR-4770, hsa-miR-616*, hsa-miR-548d-3p y hsa-miR-93, en el que la sobreexpresión de al menos hsa-miR-23a y al menos uno de los biomarcadores identificados anteriormente es indicativa de neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN).
En otra realización que no forma parte de la invención, el procedimiento in vitro para cribar sujetos comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos hsa-miR-29a y al menos uno o más del siguiente grupo de miARN: hsa-let-7c, hsa-let-7e, hsa-let-7f, hsa-miR-761, hsa-miR-33a*, hsa-miR-1257, hsa-miR-103a, hsa-miR-1304, hsamiR-155, hsa-miR-16, hsa-miR-181, hsa-miR-181a, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-181b, hsa-miR-21, hsa-miR-221, hsa-miR-192, hsa-miR-23a, hsa-miR-151b, hsa-miR-3120-3p, hsa-miR-3145-3p, hsa-miR-320a, hsa-miR-3692, hsa-miR-3133, hsa-miR-4256, hsa-miR-429, hsa-miR-4313, hsa-miR-3714, hsa-miR-4468, hsa-miR-4642, hsamiR-4666-3p, hsa-miR-4639-5p, hsa-miR-4713-5p, hsa-miR-4723-5p, hsa-miR-4714-5p, hsa-miR-4801, hsa-miR-4770, hsa-miR-616*, hsa-miR-548d-3p y hsa-miR-93, en el que la sobreexpresión de al menos hsa-miR-29a y al menos uno de los biomarcadores identificados anteriormente es indicativa de neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN).
En otra realización que no forma parte de la invención, el procedimiento in vitro para cribar sujetos comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos hsa-miR-429 y al menos uno o más del siguiente grupo de miARN: hsa-let-7c, hsa-let-7e, hsa-let-7f, hsa-miR-761, hsa-miR-33a*, hsa-miR-1257, hsa-miR-103a, hsa-miR-1304, hsamiR-155, hsa-miR-16, hsa-miR-181, hsa-miR-181a, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-181b, hsa-miR-21, hsa-miR-221, hsa-miR-192, hsa-miR-23a, hsa-miR-151b, hsa-miR-3120-3p, hsa-miR-3145-3p, hsa-miR-320a, hsa-miR-3692, hsa-miR-3133, hsa-miR-4256, hsa-miR-29a, hsa-miR-4313, hsa-miR-3714, hsa-miR-4468, hsa-miR-4642, hsamiR-4666-3p, hsa-miR-4639-5p, hsa-miR-4713-5p, hsa-miR-4723-5p, hsa-miR-4714-5p, hsa-miR-4801, hsa-miR-4770, hsa-miR-616*, hsa-miR-548d-3p y hsa-miR-93, en el que la sobreexpresión de al menos hsa-miR-429 y al menos uno de los biomarcadores identificados anteriormente es indicativa de neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN).
Un segundo aspecto de la invención, se refiere al procedimiento in vitro para el diagnóstico de un sujeto que se sospecha que padece cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN) que comprende las etapas a) y b) de cualquiera de los procedimientos del primer aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferentes, y opcionalmente (c) confirmar la presencia de cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN) mediante un examen clínico.
Un tercer aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para la obtención de datos útiles para el diagnóstico in vitro de cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN) que comprende las etapas a) y b) de cualquiera de los procedimientos de el primer aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferentes.
Un cuarto aspecto de la invención, se refiere a un procedimiento in vitro para clasificar sujetos como sujetos sanos o sujetos que padecen cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN) que comprende las etapas a) y b) de cualquiera de los procedimientos del primer aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferentes.
Un quinto aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para evaluar una opción de tratamiento en sujetos que padecen cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN) que comprende las etapas a) y b) de cualquiera de los procedimientos del primer aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferentes
En una realización preferente del procedimiento, de acuerdo con cualquiera de los procedimientos del primer al quinto aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferentes, el cáncer de páncreas es adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC).
En otra realización preferente del procedimiento, de acuerdo con cualquiera de los procedimientos del primer al quinto aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferentes, la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en una muestra de tumor o de una muestra biológica mínimamente invasiva de los sujetos a cribar, como una muestra de plasma, una muestra de sangre o una muestra de suero.
Un sexto aspecto de la invención, se refiere al uso de un kit que comprende reactivos de detección de biomarcadores para determinar un nivel de expresión diferencial de al menos hsa-miR-33a*, en el que la sobreexpresión de al menos hsa-miR-33a* es indicativa de cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal de páncreas (IPMN), para diagnosticar in vitro el riesgo de cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal de páncreas (IPMN), preferentemente de adenocarcinoma ductal pancreático.
Una realización preferente del séptimo aspecto de la invención, se refiere al uso del kit, en el que dicho kit comprende reactivos para determinar un nivel de expresión diferencial de al menos hsa-miR-33a* y/o al menos hsa-miR-320a y/o al menos hsa-let-7e y opcionalmente al menos uno o más del siguiente grupo de miARN: hsalet-7c, hsa-let-7f, hsa-miR-103a, hsa-miR-1257, hsa-miR-1304, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-151b, hsa-miR-155, hsa-miR-16, hsa-miR-181, hsa-miR-181a, hsa-miR-181b, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsa-miR-221, hsa-miR-23a, hsa-miR-29a, hsa-miR-3120-3p, hsa-miR-3133, hsa-miR-3145-3p, hsa-miR-3692, hsa-miR-3714, hsa-miR-4256, hsa-miR-429, hsa-miR-4313, hsa-miR-4468, hsa-miR-4639-5p, hsa-miR-4642, hsa-miR-4666-3p, hsa-miR-4713-5p, hsa-miR-4714-5p, hsa-miR-4723-5p, hsa-miR-4770, hsa-miR-4801, hsa-miR-548d-3p, hsa-miR-616*, hsamiR-761 y hsa-miR-93, para diagnosticar in vitro el riesgo de cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN).
Otra realización preferente del séptimo aspecto de la invención, se refiere al uso del kit, que comprende reactivos para determinar un nivel de expresión diferencial de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a, o de al menos hsamiR-33a* y hsa-miR-16 y hsa-miR-320a, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-181, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-155, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-151b, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-let7e, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-23a, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-151a, o de al menos hsa-miR-33a* y hsamiR-21 y hsa-let7e, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-23a y hsa-miR-21, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa miR-93 y hsa-miR-320a, obtenidos de una muestra biológica aislada de los sujetos a cribar, para diagnosticar in vitro el riesgo de cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN).
Por otro lado, cabe mencionar que la presente invención se realiza preferentemente en muestras de plasma o suero obtenidas de los pacientes. Por otro lado, es importante destacar que la obtención de preparaciones de suero o plasma a partir de sangre comprende varias etapas que se llevan a cabo por los expertos en la técnica: en el caso del suero, permitir que la sangre se coagule dejándola en reposo a temperatura ambiente, retirar el coágulo por centrifugación y aislar el sobrenadante que está diseñado como suero. En el caso del plasma, también es necesaria la centrifugación. Además, después del proceso de centrifugación, es importante transferir inmediatamente el componente líquido (suero o plasma) a un tubo limpio. Las muestras se mantienen a 2-8 °C mientras son manipuladas. Si el suero o el plasma no se analizan inmediatamente, deben distribuirse en alícuotas, almacenarse y transportarse a -80 °C o menos. Es importante evitar los ciclos de congelación-descongelación porque esto es perjudicial para muchos componentes del suero. Las muestras hemolizadas, ictéricas o lipémicas pueden invalidar determinadas pruebas.
Por otro lado, es importante señalar que hoy en día el procedimiento estándar de oro para el diagnóstico de cáncer de páncreas se basa en técnicas de imagenología (CT o MRI) ya descritas a lo largo de la presente solicitud combinadas con MRCP y EUS-FNA. Sin embargo, dicho procedimiento estándar no es lo suficientemente sensible para evaluar la malignidad de una IPMN o para detectar el cáncer de páncreas en una etapa temprana de la displasia, y se necesitan herramientas destinadas a confirmar el diagnóstico obtenido mediante el uso de dichas técnicas. Por lo tanto, una realización preferente de la presente invención está dirigida a un procedimiento para detectar y/o confirmar IPMN o para detectar y/o confirmar cáncer de páncreas en un sujeto, comprendiendo el procedimiento las etapas de: a) realizar una técnica de imagen y/o una biopsia del sujeto, y b) medir un nivel de expresión de los miARN citados anteriormente de la invención en una muestra biológica obtenida del sujeto que es mayor que el nivel de expresión de dichos miARN en una muestra de control obtenida de un sujeto que no tiene IPMN o cáncer de páncreas. Por ejemplo, en ocasiones la imagen obtenida durante la etapa a) no es lo suficientemente clara para diferenciar la pancreatitis del cáncer de páncreas y, por consiguiente, la etapa b) es necesaria para confirmar que el paciente padece cáncer de páncreas (y para descartar pancreatitis).
Las invenciones descritas ilustrativamente en la presente memoria pueden practicarse de manera adecuada en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones, no descritos específicamente en la presente memoria. De este modo, por ejemplo, los términos "que comprende", "que incluye", "que contiene", etc. deberán ser leídos de forma amplia y sin limitación. Además, los términos y expresiones empleados en la presente memoria se han utilizado como términos de descripción y no de limitación, pero se reconoce que son posibles varias modificaciones dentro del alcance de la invención reivindicada. Por lo tanto, debe entenderse que, aunque la presente invención ha sido divulgada específicamente mediante realizaciones preferentes y características opcionales, los expertos en la técnica pueden recurrir a la modificación y variación de las invenciones incorporadas en la misma descritas en la presente memoria, y que tales modificaciones y variaciones son consideradas dentro del alcance de esta invención.
La invención ha sido aquí descrita de forma amplia y genérica. Cada una de las especies más restringidas y los grupos subgenéricos que caen dentro de la divulgación genérica también forman parte de la invención.
Otras realizaciones se encuentran dentro de las siguientes reivindicaciones y ejemplos no limitantes. Además, cuando las características o aspectos de la invención se describen en términos de grupos, los expertos en la técnica reconocerán que la invención también se describe en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo.
Ejemplos
MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS
- Pacientes y recolección de muestras
De manera prospectiva, en este estudio se incluyó un total de 165 pacientes de1Hospital Clínico de Barcelona desde febrero de 2008 hasta enero de 2013. Se obtuvieron muestras de páncreas de todos los sujetos. Ninguno de ellos había recibido quimioterapia o radioterapia antes de la recolección de la muestra. Se utilizó un conjunto inicial de 18 muestras quirúrgicas de tejido pancreático macrodisecado (11 PDAC; 4 IPMN; 3 controles sanos (H)) para el perfil de miARN de todo el genoma. Las muestras pancreáticas normales (H) corresponden ya sea a los tejidos adyacentes no tumorales de algunas lesiones de PDAC e IPMN o al tejido sano de pacientes que se sometieron a cirugía por otras razones (es decir, ampuloma o cistadenoma). La validación de los miARN candidatos se realizó mediante PCR cuantitativa con transcriptasa inversa (qRT-PCR) en otras 2 cohortes independientes: un conjunto de entrenamiento de 52 muestras de tejido (24 PDAC; 7 IPMN; 6 CP (pancreatitis crónica), 15H) y un conjunto de prueba de 95 muestras de aspiración con aguja fina guiada por ecografía endoscópica (EUS-FNA) (60 PDAC; 9 IPMN; 26 H). FNA se realizó con una aguja estándar de 22G. Los tejidos pancreáticos se mantuvieron en hielo seco en todo momento durante la manipulación y todas las muestras se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta el aislamiento del ARN. Las características clínico-patológicas de los participantes incluidos en el estudio se detallan en la Tabla 4 a continuación.
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Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Institucional del Hospital Clínico de Barcelona y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes de acuerdo con la Declaración de Helsinki.
- Extracción de miARN
Se aisló ARN total a partir de tejidos macrodisecados congelados o aspirados con aguja usando el Mini Kit miRNeasy (Qiagen, Valencia, CA, EE. UU.), de acuerdo con el protocolo del fabricante. El volumen de elución final fue de 30 pl. Las concentraciones y la pureza del ARN se evaluaron con el espectrofotómetro NanoDrop 1000 (Wilmington, DE, EE. UU.) y la calidad del ARN se determinó mediante Bioanalyzer 2100 (Agilent, CA, EE. UU.).
- Perfilado de miARN en todo el genoma mediante Secuenciación de Próxima Generación (NGS)
La cantidad inicial fue de 1 pg de ARN total y el protocolo de preparación se realizó de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se aisló ARN pequeño del ARN total en un gel Novex TBE-Urea PAGE al 15%. El área que representa el tamaño de banda de 18-30 nucleótidos (nt) se cortó y se fragmentó, el ARN se eluyó en NaCl 0,3 M y se purificó en una columna Spin X. El adaptador 5' se ligó durante 6 horas a 20 °C. Se aisló ARN pequeño con adaptador 5' ligado en un gel Novex TBE-Urea PAGE al 15% (Invitrogen, CA, EE. UU.). Se cortó y fragmentó la banda de 40-60 nt, el ARN se eluyó en NaCl 0,3 M y se purificó en una columna Spin X. El adaptador 3' se ligó durante 6 horas a 20 °C. Los ARN pequeños con adaptadores 5' y 3' ligados se aislaron en un gel Novex TBE-Urea PAGE al 10%, la banda de 70-90 nt se cortó y se fragmentó, el ArN se eluyó en NaCl 0,3 M y se limpió en una columna Spin X. Luego se añadió GlycoBlue y etanol seguido de precipitación durante 30 minutos a -80 °C y centrifugación a 14000 rpm durante 25 minutos. El gránulo de ARN se disolvió en 4,5 pl de agua libre de ARNasa. Se llevó a cabo la transcripción inversa y la amplificación y el pl se separó en un gel Novex TBE PAGE al 6%. La banda de pl amplificada se cortó y se fragmentó; el ARN se eluyó en tampón de elución en gel y se purificó en una columna Spin X. Luego se agregó glucógeno y etanol para precipitación seguido de centrifugación a 14000 rpm y 4 °C durante 20 minutos. El sedimento de |jl se disolvió en 10 |jl de tampón de resuspensión. La biblioteca de |jl generada se evaluó con una PCR cuantitativa en tiempo real para garantizar una calidad aceptable y confirmar que los adaptadores fueron agregados correctamente. La secuenciación de alto rendimiento del j l se realizó en una ejecución de lectura de un solo extremo de 38 pb en un Illumina Genome Analyzer IIx (Illumina, CA, EE. UU.). El análisis de imágenes y la llamada de bases se realizaron con la versión 1.5.1 del software de canalización Illumina GA. Se filtraron las secuencias con castidad inferior a 0,6 en dos o más bases entre las primeras 25 bases.
- Análisis de la expresión de miARN mediante qRT-PCR en tiempo real
La expresión de los miARN más discriminantes identificados en la secuenciación de alto rendimiento se evaluó mediante qRT-PCR singleplex usando Ensayos de miARN TaqMan (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, EE. UU.). Un protocolo de dos pasos implica la transcripción inversa con un cebador específico de miARN, seguido de una PCR en tiempo real con sondas TaqMan. En resumen, se utilizó 5 ng de ARN total por reacción de transcripción inversa realizada en un volumen final de 7,5 j l (2,5 j l de ARN, 0,075 j l de dNTP 100 mM, 0,5 j l de Transcriptasa Inversa Multiscribe (50 U jl-1), 0,75 j l de tampón 10X RT, 0,095 j l de inhibidor de RNasa (20 U jl-1), 1,5 j l de cebador RT de tallo y 2,08 j l de agua libre de nucleasas) y se incubó durante: 30 minutos, 16 °C; 30 minutos, 42 °C; 5 minutos, 85 °C; mantener a 4 °C. La mezcla de PCR de 10 j l incluía 2 j l de jl, 5 j l de TaqMan 2X Universal PCR Master Mix sin AmpErase UNG y 0,5 j l de Ensayo TaqMan 20X MicroARN. Las reacciones de PCR se incubaron en una placa óptica de 384 pocillos y se procesaron en el Sistema Viia7 Real-Time PCR (Applied Biosystems, Inc.) de la siguiente manera: 95 °C durante 10 min y 50 ciclos de 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 1 min. Todas las muestras se amplificaron por duplicado.
Los datos de amplificación se normalizaron frente a RNU6B como control endógeno. Los valores de Ct se calcularon a partir del umbral automático. Ningún control de plantilla mostró amplificación alguna. Los niveles de expresión relativa de miARN seleccionados se calcularon para cada muestra como valores de -Act [-ACt = - (Ct de miARN diana -Ct de miARN de control endógeno)].
- Análisis de los datos
Los datos de la secuenciación de alto rendimiento se obtuvieron en formato FASTQ, un archivo de datos por línea de secuenciación. Posteriormente, los adaptadores de secuenciación se recortaron y eliminaron utilizando el FASTX-Toolkit, lo que no permitió desajustes para la identificación del adaptador. Los datos de secuenciación restantes se colapsaron aún más y se contaron en grupos de secuencias idénticas. Los datos de secuenciación se procesaron aún más para identificar los miR del repositorio de datos de miRBase (versión 18). También evalúa la alineación de secuencias con otras entidades a través de las bases de datos RefSeq y Rfam. Los datos de la secuencia se alinearon con la referencia del genoma de Homo Sapiens hg18 permitiendo un desajuste. La expresión diferencial (DE) de los miR identificados de miRBase se calculó con la versión 2.13.0 de R utilizando el paquete DESeq 1.4.1 disponible en la versión 2.8 de Bioconductor. Los datos de recuento se normalizaron a los factores de tamaño estimados y se analizó la expresión diferencial (cambio de veces) de miR conocidos entre grupos, como la relación entre los datos de recuento normalizados para muestras tumorales y normales. Los valores p se ajustan para pruebas múltiples utilizando el procedimiento de Benjamini y Hochberg. Solo los miR con un cambio de veces con un valor p ajustado con una tasa de descubrimiento falso (FDR) <0,05) se consideran significativos.
Ejemplo 1. El perfil de expresión de miARN analizado por NGS discrimina entre IPMN, PDAC y páncreas normal.
- Descripción general
En la Figura 1 se proporciona un diagrama de flujo del diseño del estudio. Este es uno de los primeros estudios en investigar el perfil de expresión de miARN en PDAC e IPMN utilizando secuenciación de próxima generación. El estudio se llevó a cabo en 2 etapas principales: un perfil de miARN de todo el genoma para descubrir nuevos biomarcadores potenciales y una validación de los resultados más significativos mediante qRT-PCR en dos grupos independientes de muestras. Nos enfocamos en los miARN comúnmente desregulados tanto en IPMN como en PDAC con el objetivo de encontrar buenos biomarcadores candidatos para la detección de ambas lesiones neoplásicas, debido al alto riesgo de malignidad que tienen las lesiones de IPMN.
- Resultados
Primero analizamos el miRNoma de 11 PDAC, 4 IPMN y 3 tejidos pancreáticos sanos usando el Genome Analyzer (Illumina). Al realizar la técnica de secuenciación de próxima generación, encontramos un total de 1733 miARN representados en las 18 muestras. Los perfiles de expresión de los 50 miARN con el mayor cambio múltiplo significativo entre pacientes con PDAC e individuos sanos se representan en la Figura 2A y los 50 más desregulados en IPMN frente a páncreas sano se representan en la Figura 2B. A continuación, se realizó un gráfico BGA para representar visualmente la proximidad entre los pacientes que padecían PDAC o IPMN y los controles, de acuerdo con la expresión de miARN. Como se muestra en la Figura 2C, los perfiles de expresión de miARN de muestras secuenciadas con NGS se pueden clasificar entre PDAC, IPMN y grupos sanos.
Empleando el paquete DESeq para un análisis comparativo inicial, encontramos 607 y 396 miARN significativamente desregulados (FDR < 0,05) en muestras de PDAC e IPMN en comparación con controles sanos, respectivamente. Además, tanto PDAC como IPMN compartieron 325 miARN significativamente desregulados (Figura 3A). De estos miARN comúnmente desregulados, había 107 miARN que tenían un cambio múltiple mayor de 2 y recuentos medios superiores a 400. A continuación, para seleccionar un grupo de miARN para llevar a cabo una validación experimental adicional, tomamos en cuenta aquellos miARN con un intervalo intercuartílico máximo logaritmo de 1,4 para asegurar la selección de los miARN que muestran menos dispersión intragrupo. Un total de 40 miARN cumplieron con todos los criterios mencionados anteriormente (FDR < 0,05, FC > 2, recuentos medios > 400 y log de IQR intragrupo <= 1,4) y comúnmente se regularon al alza en PDAC e IPMN (Tabla 5). El diagrama de volcán de los datos de NGS en la Figura 3B representa gráficamente estos resultados del análisis de expresión diferencial de miARN. En conclusión, los datos de NGS dieron como resultado la identificación de varios miARN capaces de discriminar la lesión premaligna de IPMN del páncreas sano, tejido PDAC del páncreas sano y también entre IPMN y PDAC.
Ejemplo 2. La validación de la expresión de miARN basada en tejido mediante qRT-PCR reprodujo la mayoría de los resultados de NGS.
Para confirmar los resultados de NGS, primero analizamos la expresión de los 40 miARN seleccionados usando TaqMan qRT-PCR en 52 muestras del conjunto de entrenamiento (24 PDAC, 7 IPMN, 6 CP, 15 H). Pudimos validar la regulación al alza de 31 miARN (23 con p < 0,05 y 8 con p < 0,1) en muestras de PDAC y 24 miARN también se regularon al alza en muestras de iPm N (18 con p < 0,05 y 6 con p < 0,1) (Tabla 2).
Ninguno de los 40 miARN analizados por qRT-PCR mostró una diferencia significativa en la expresión entre el tejido de pancreatitis crónica analizado y el páncreas sano (datos no mostrados). A continuación, para corroborar los resultados anteriores, empleamos qRT-PCR para investigar más a fondo la expresión de 31 miARN validados en el conjunto de entrenamiento en otro conjunto independiente de 95 muestras pancreáticas EUS-FNA (conjunto de prueba). Confirmamos el patrón de expresión de 30 miARN que se regularon significativamente al alza (30 con p < 0,05) en 60 pacientes con PDAC en comparación con 26 controles sanos. Con respecto al grupo IPMN (n = 9), validamos 30 miARN como sobreexpresados (26 con p < 0,05 y 4 con p < 0,1) en comparación con el grupo sano (n = 26). Los resultados de estos experimentos se muestran en la Tabla 5 y se esquematizan en la Figura 4.
En general, el análisis de qRT-PCR en 2 cohortes diferentes confirmó la mayoría de los resultados de NGS. Identificamos y validamos 30 miARN cuya expresión aumenta significativamente en las lesiones de PDAC e IPMN.
Ejemplo 3. Varios miARN validados en el conjunto de prueba muestran una alta precisión para discriminar entre pacientes con PDAC y controles.
En cuanto a la capacidad discriminatoria para distinguir a los pacientes con PDAC de los controles, los 30 miARN validados en el conjunto de prueba presentaron áreas bajo la curva ROC (AUC) que variaban desde 0,69 (IC del 95%: 0,75-0,64) a 1 (IC del 95%: 1-0,99). Específicamente, 13 de estos 30 miARN (miR-93, miR-16, miR-548d-3p, miR-320a, miR-4468, miR-3120-3p, miR-4713-5p, miR-103a, miR-155, miR-4770, miR-181a, miR-221 y miR-151b) demostraron una alta precisión en la discriminación de pacientes con PDAC de controles sanos con un AUC superior a 0,9 (Tabla 3). La Figura 5 muestra las curvas ROC de 8 miARN con la mayor capacidad discriminativa para pacientes con PDAC. Finalmente, cabe destacar el rendimiento del miR-93, que es un miARN único basado en tejido alterado significativamente en PDAC con una excelente sensibilidad y especificidad para diferenciar el tejido canceroso del páncreas normal.
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Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento in vitro para el cribado de sujetos con riesgo de desarrollar cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN) que comprende: (a) medir el patrón de expresión o el nivel de al menos hsa-miR-33a* obtenido de una muestra biológica aislada de los sujetos a cribar; y (b) comparar dicho patrón o nivel de expresión de al menos miR-33a* de los sujetos a cribar con un patrón o nivel de expresión ya establecido, en el que la sobreexpresión de al menos hsa-miR-33a* es indicativa de cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN).
2. Procedimiento in vitro para el cribado de sujetos, de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a obtenido a partir de una muestra biológica aislada de los sujetos a cribar; y (b) comparar dicho patrón o nivel de expresión de los sujetos a cribar con un patrón o nivel de expresión ya establecido, en el que la sobreexpresión de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a es indicativa de cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN).
3. Procedimiento in vitro para el cribado de sujetos, de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos hsa-miR-33a* y al menos uno o más del siguiente grupo de miARN: hsa-let-7c, hsa-let-7e, hsa-let-7f, hsa-miR-103a, hsa-miR-1257, hsa-miR-1304, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-151b, hsa-miR-155, hsa-miR-16, hsa-miR-181, hsa-miR-181a, hsa-miR-181b, hsa-miR-192, hsamiR-21, hsa-miR-221, hsa-miR-23a, hsa-miR-29a, hsa-miR-3120-3p, hsa-miR-3133, hsa-miR-3145-3p, hsamiR-320a, hsa-miR-3692, hsa-miR-3714, hsa-miR-4256, hsa-miR-429, hsa-miR-4313, hsa-miR-4468, hsamiR-4639-5p, hsa-miR-4642, hsa-miR-4666-3p, hsa-miR-4713-5p, hsa-miR-4714-5p, hsa-miR-4723-5p, hsamiR-4770, hsa-miR-4801, hsa-miR-548d-3p, hsa-miR-616*, hsa-miR-761 y hsa-miR-93 obtenido de una muestra biológica aislada de los sujetos a cribar; y (b) comparar dicho patrón o nivel de expresión de los sujetos a cribar con un patrón o nivel de expresión ya establecido, en el que la sobreexpresión de al menos miR-33a* y al menos uno de los biomarcadores identificados anteriormente es indicativa de cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN).
4. Procedimiento in vitro para el cribado de sujetos, de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende: (a) medir el patrón o nivel de expresión de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-16 y hsa-miR-320a, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-181, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-155, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-151b, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-let7e, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsamiR-23a, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-151a, o de al menos hsa-miR-33a* y hsamiR-21 y hsa-let7e, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-23a y hsa-miR-21, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-93 y hsa-miR-320a, obtenidos de una muestra biológica aislada de los sujetos a cribar; y (b) comparar dicho patrón o nivel de expresión de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a, o de al menos hsamiR-33a* y hsa-miR-16 y hsa-miR-320a, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-181, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-155, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsamiR-151b, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-let7e, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-23a, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-151a, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-21 y hsa-let7e, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-23a y hsa-miR-21, o de al menos hsamiR-33a* y hsa-miR-93 y hsa-miR-320a, de los sujetos a cribar con un patrón o nivel de expresión ya establecido, en el que la sobreexpresión de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-16 y hsa-miR-320a, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-181, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-155, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsamiR-151b, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-let7e, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-23a, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-151a, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-21 y hsa-let7e, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-23a y hsa-miR-21, o de al menos hsamiR-33a* y hsa-miR-93 y hsa-miR-320a, es indicativa de cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN).
5. Procedimiento in vitro para el diagnóstico de un sujeto que se sospecha que padece cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN) que comprende las etapas a) y b) de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y opcionalmente (c) confirmar la presencia de cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal de páncreas (IPMN) mediante examen clínico.
6. Procedimiento in vitro para la clasificación de sujetos como sujetos que no padecen cáncer de páncreas o como sujetos que padecen cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN) que comprende las etapas a) y b) de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
7. Procedimiento para la evaluación de una opción de tratamiento en sujetos que padecen cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN) que comprende las etapas a) y b) de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
8. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en una muestra de tumor o de una muestra biológica mínimamente invasiva de los sujetos a cribar tal como una muestra de plasma, muestra de sangre o una muestra de suero.
9. Uso de un kit que comprende reactivos de detección de biomarcadores para determinar un nivel de expresión diferencial de al menos hsa-miR-33a*, en el que la sobreexpresión de al menos hsa-miR-33a* es indicativa de cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN), para diagnosticar in vitro el riesgo de cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal del páncreas (IPMN), preferentemente de adenocarcinoma ductal pancreático.
10. Uso del kit, de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende reactivos para determinar un nivel de expresión diferencial de al menos hsa-miR-33a* y al menos uno o más del siguiente grupo de miARN: hsa-let-7c, hsalet-7e, hsa-let-7f, hsa-miR-103a, hsa-miR-1257, hsa-miR-1304, hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-151b, hsa-miR-155, hsa-miR-16, hsa-miR-181, hsa-miR-181a, hsa-miR-181b, hsa-miR-192, hsa-miR-21, hsa-miR-221, hsamiR-23a, hsa-miR-29a, hsa-miR-3120-3p, hsa-miR-3133, hsa-miR-3145-3p, hsa-miR-320a, hsa-miR-3692, hsa-miR-3714, hsa-miR-4256, hsa-miR-429, hsa-miR-4313, hsa-miR-4468, hsa-miR-4639-5p, hsa-miR-4642, hsa-miR-4666-3p, hsa-miR-4713-5p, hsa-miR-4714-5p, hsa-miR-4723-5p, hsa-miR-4770, hsa-miR-4801, hsa-miR-548d-3p, hsa-miR-616*, hsa-miR-761 y hsa-miR-93, para diagnosticar in vitro el riesgo de cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal de páncreas (IPMN).
11. Uso del kit, de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende reactivos para determinar un nivel de expresión diferencial de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-16 y hsa-miR-320a, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-181, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-155, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-151b, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-let7e, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-23a, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-320a y hsa-miR-151a, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-21 y hsa-let7e, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-23a y hsa-miR-21, o de al menos hsa-miR-33a* y hsa-miR-93 y hsa-miR-320a, obtenidos de una muestra biológica aislada de los sujetos a cribar, para diagnosticar in vitro el riesgo de cáncer de páncreas o neoplasia mucinosa papilar intraductal de páncreas (IPMN).
12. Uso, de acuerdo con las reivindicaciones 9 a 11, en el que el cáncer de páncreas es un adenocarcinoma ductal pancreático.
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