ES2898917T3

ES2898917T3 - Tratamiento génico para enfermedades autosómicas dominantes

Info

Publication number: ES2898917T3
Application number: ES16787314T
Authority: ES
Inventors: Wen-Hsuan Wu; Yi-Ting Tsai; Lawrence Chan; Stephen Tsang
Original assignee: Columbia University in the City of New York
Current assignee: Columbia University in the City of New York
Priority date: 2015-04-30
Filing date: 2016-05-02
Publication date: 2022-03-09
Anticipated expiration: 2036-05-02
Also published as: PT3289080T; US20250235556A1; WO2016176690A2; EP3289080A2; WO2016176690A3; EP3289080B1; US20190275168A1; HK1251615A1; EP3289080A4; DK3289080T3; EP4008780A1

Abstract

Una composición que comprende al menos un tipo de vector viral adenoasociado (AAV) recombinante que codifica un sistema CRISPR-Cas dirigido a un gen relacionado con enfermedad autosómica dominante para su uso en el tratamiento de una enfermedad ocular autosómica dominante en un sujeto, el uso comprende administrar al sujeto una cantidad con eficacia terapéutica de la composición, en donde el al menos un tipo de vector AAV comprende: (a) dos secuencias de ARN guía que hibridan con el gen endógeno relacionado con enfermedad autosómica dominante en el sujeto; (b) una segunda secuencia que comprende un gen relacionado con enfermedad autosómica dominante, con modificación de codones, o fragmento de este, en donde al menos una mutación relacionada con la enfermedad se ha corregido en el gen relacionado con enfermedad autosómica dominante, con modificación de codones, o fragmento de este, y en donde el gen relacionado con enfermedad autosómica dominante, con modificación de codones, o fragmento de este no es reconocido por el ARN guía; y (c) una tercera secuencia que codifica una nucleasa Cas, opcionalmente Cas 9, en donde al menos una secuencia de ARN guía se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o combinaciones de estas.

Description

DESCRIPCIÓN

Tratamiento génico para enfermedades autosómicas dominantes

Antecedentes de la descripción

La presente descripción se refiere al uso de métodos basados en CRISPR para realizar la edición de genes en pacientes con el fin de tratar enfermedades autosómicas dominantes.

Actualmente no existen curas para numerosas enfermedades autosómicas dominantes o recesivas que tienen un impacto profundamente negativo en la calidad de vida. Las formas dominantes de retinitis pigmentaria (adRP), distrofias de conos y bastones y degeneraciones maculares juveniles son ejemplos importantes de enfermedades autosómicas dominantes que afectan al ojo. Estas enfermedades autosómicas dominantes se caracterizan por la presencia de un gen mutante que expresa una proteína defectuosa. Por tanto, estas enfermedades no son fácilmente susceptibles a tratamientos que simplemente agregan un gen sano normal (lo que se denomina "suplementación genética" o "adición de genes"), ya que el gen y la proteína que causan la enfermedad todavía están presentes. En cambio, la edición de genes ofrece el único medio para reparar directamente el gen defectuoso y, por lo tanto, la estrategia terapéutica más prometedora.

Las enfermedades degenerativas de la retina afectan al menos a 9 millones de estadounidenses (Friedman DS y otros, Arch Ophthalmol. Abril de 2004; 122 (4): 564-72; Schmier JK y otros, Pharmacoeconomics. 2006; 24 (4): 319 34). Entre las enfermedades degenerativas de la retina más devastadoras se encuentran la retinitis pigmentaria (RP), una forma común de neurodegeneración hereditaria, que afecta a 1,5 millones de personas en todo el mundo y cuyo tratamiento es inadecuado. La RP es una enfermedad ocular degenerativa que produce degeneración de la retina y pérdida de la visión. Las mutaciones hereditarias en el gen de la rodopsina (RHO) son la causa más común de RP autosómica dominante y representan el 20-30 % de los casos. Actualmente, no existe cura para la RP.

El tratamiento génico para la RP se probó en modelos animales de prueba de concepto y después se usó como tratamiento clínico, donde mejoró la visión en hasta la mitad de los pacientes. En estos ensayos, las anomalías genéticas de los pacientes se corrigieron mediante un enfoque de suplementación génica (es decir, rescate mediante la sobreexpresión de un gen natural (wt)). Inicialmente, la suplementación génica pareció funcionar porque los pacientes experimentaron un rescate funcional, pero el examen de seguimiento mostró que la degeneración de los fotorreceptores continuaba y la pérdida de la visión progresaba en 3 años (Cideciyan y otros, Proc Natl Acad Sci USA. 5 de feb de 2013;110(6): E517-25; Bainbridge y otros, N Engl J Med. 14 de may de 2015;372(20):1887-97; Jacobson y otros, N Engl J Med. 14 de mayo de 2015;372(20):1920-6). Los ensayos actuales de tratamiento génico para otros genes de RP también están adoptando un enfoque de suplementación genética y es probable que enfrenten obstáculos similares a menos que se aborden las razones del fracaso. Dado que la suplementación con un gen natural deja intacto el gen mutante del paciente, la presencia del gen mutante puede desencadenar continuamente un daño continuo a pesar de la presencia de un gen natural. El enfoque de edición de genes descrito en la presente descripción supera estos y otros obstáculos para el tratamiento de enfermedades autosómicas dominantes y recesivas.

La solicitud de patente internacional WO2014/204726 describe el uso de sistemas CRISPR-Cas9 para dirigirse a genes en células posmitóticas en tejidos específicos, por ejemplo, tejido retiniano. Se describen AAV-Spguías. Resumen de la invención

La presente invención proporciona una composición que comprende al menos un tipo de vector viral adenoasociado (AAV) recombinante que codifica un sistema CRISPR-Cas dirigido a un gen relacionado con enfermedad autosómica dominante para su uso en el tratamiento de una enfermedad ocular autosómica dominante en un sujeto, el uso comprende administrar al sujeto una cantidad con eficacia terapéutica de la composición, en donde el al menos un tipo de vector AAV comprende:

(a) dos secuencias de ARN guía que hibridan con el gen endógeno relacionado con enfermedad autosómica dominante en el sujeto;

(b) una segunda secuencia que comprende un gen relacionado con enfermedad autosómica dominante, con modificación de codones, o fragmento de este, en donde al menos una mutación relacionada con la enfermedad se ha corregido en el gen relacionado con enfermedad autosómica dominante, con modificación de codones, o fragmento de este, y en donde el gen relacionado con enfermedad autosómica dominante, con modificación de codones, o fragmento de este no es reconocido por el ARN guía; y

(c) una tercera secuencia que codifica una nucleasa Cas, opcionalmente Cas 9,

en donde al menos una secuencia de ARN guía se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o combinaciones de estas.

El gen endógeno relacionado con enfermedad autosómica dominante al que se dirige el presente método puede ser natural y/o mutante.

Se puede introducir en el sujeto de acuerdo con la presente invención un gen relacionado con enfermedad autosómica dominante, con modificación de codones, de longitud completa o un fragmento de este.

En una modalidad, los dos tipos de vectores AAV se pueden administrar al sujeto, donde el primer tipo de vector AAV recombinante comprende (i) la primera secuencia que codifica al menos un ARN guía y (ii) la segunda secuencia que comprende un gen relacionado con enfermedad autosómica dominante, con modificación de codones, o fragmento de este, y el segundo tipo de vector AAV recombinante comprende la tercera secuencia, que codifica la nucleasa Cas.

La enfermedad ocular puede incluir, pero no se limita a, atrofia o degeneración coriorretiniana autosómica dominante, distrofia de conos o bastones autosómica dominante, ceguera nocturna estacionaria congénita autosómica dominante, amaurosis congénita de Leber autosómica dominante, degeneración macular autosómica dominante, enfermedad del desarrollo de la retina ocular autosómica dominante, atrofia óptica autosómica dominante, retinitis pigmentaria autosómica dominante, enfermedades sindrómicas/sistémicas autosómicas dominantes con retinopatía, distrofia macular de Sorsby, degeneración macular relacionada con la edad, enfermedad macular de panal de Doyne y degeneración macular juvenil.

En una modalidad, la enfermedad ocular es retinitis pigmentaria. La retinitis pigmentaria puede ser causada por una mutación en el gen RHO. El gen relacionado con enfermedad autosómica dominante puede ser el gen RHO. En otra modalidad, la enfermedad ocular es la degeneración macular relacionada con la edad. En una tercera modalidad, la enfermedad ocular es enfermedad de panal de Doyne. El panal de Doyne puede ser causado por una mutación en el gen EFEMP1. El gen relacionado con enfermedad autosómica dominante puede ser el gen EFEMP1.

El vector AAV recombinante puede ser un vector AAV2. Alternativamente, el vector AAV es un vector AAV8. También se pueden usar otros vectores AAV adecuados.

La nucleasa Cas puede ser Cas9. El sistema CRISPR-Cas puede estar bajo el control de un promotor que controla la expresión del producto génico relacionado con enfermedad autosómica dominante, con modificación de codones, en las células oculares.

La secuencia del gen relacionado con enfermedad autosómica dominante, con modificación de codones, o un fragmento de esta, puede integrarse en el gen endógeno relacionado con la enfermedad autosómica. Alternativamente, la secuencia o fragmento del gen relacionado con enfermedad autosómica dominante, con modificación de codones, no se integra en el gen endógeno relacionado con la enfermedad autosómica, pero está presente episómicamente.

El gen relacionado con enfermedad autosómica dominante puede incluir, entre otros, PRDM13, RGR, TEAD1, AIPL1, CRX, GUCA1A, GUCY2D, PITPNM3, PROM1, PRPH2, RIMS1, SEMA4A, UNC119, GNAT1, PDE6B, RHO, WSF1, IMPDH1, OTX2, BEST1, C1QTNF5, CTNNA1, EFEMP1, ELOVL4, FSCN2, GUCA1B, HMCN1, IMPG1, RP1L1, TIMP 3, VCAN, MFN2, NR2F1, OPA1, ARL3, CA4, HK1, KLHL7, NR2E3, NRL, PRPF3, PRPF4, PRPF6, PRPF8, PRPF31, RDH12, ROM1, RP1, RP9, RPE65, SNRNP200, SPP2, TOPORS, ABCC6, ATXN7, COL11A1, COL2A1, JAG1, KCNJ13, KIF11, OPA3, PAX2, TREX1, CAPN5, CRB1, FZD4, ITM2B, LRP5, MAPKAPK3, MIR204, OPN1SW, RB1, TSPAN12 y ZNF408.

El vector o los vectores AAV recombinantes pueden administrarse mediante inyección en el ojo.

El gen relacionado con enfermedad autosómica dominante, con modificación de codones, o fragmento de este, se puede seleccionar del grupo que consiste en, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, s Eq ID NO: 27 o combinaciones de estas.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1A es una representación esquemática de los vectores AAV ChopStick. El lado izquierdo muestra una representación esquemática del vector AAV/Cas9. Cas9 de S. pyogenes está dirigido por un promotor de CMV corto de 173 pb (sCMV, SEQ ID NO: 14) y termina por una señal de poli-A sintética de 50 pb (SPA) (SEQ ID NO: 19). El lado derecho muestra una representación esquemática de los ARNsg de RHO y el vector de expresión de ADNc con modificación de codones (RHOcm, (SEQ ID NO: 9). ARNsg1 y ARNsg2 son dirigidos por el promotor de U6 (SEQ ID NO: 12). El ADNc de RHOcm etiquetado con c-Myc en el extremo C terminal es dirigido por el promotor de CBh (SEQ ID NO: 10) y termina con la señal de poli-A de bGH (SEQ ID NO: 11). Las flechas indican la dirección de la transcripción. 5'-y 3'-ITR, repeticiones terminales invertidas de AAV.

La figura 1B es una representación esquemática de la estrategia de tratamiento génico AAV ChopStick. La representación esquemática del lado izquierdo (I) muestra que después de la coinfección de AAV/Cas9 y AAV/ARNsg1y2_RHOcm, la coexpresión de la proteína Cas9 y dos ARNsg específicos del exón 1 de hRHO, ARNsgl y ARNsg2, darán lugar a la deleción de 121 pb en el exón 1 de RHO del huésped. El lado derecho de la figura (II) muestra la secuencia de rodopsina original y con modificación de codones.

Las Figuras 2A-B muestran que el ARNsg doble proporciona un "corte" (“Chop”) de RHO más eficaz que el ARNsg simple. La figura 2A es una representación esquemática de los sitios diana de ARNsg1 y ARNsg2 en RHO. Los dos ARNsg se dirigen al exón 1 de RHO, que es el comienzo de la traducción. Una vez que se produce la edición de genes, independientemente de si se dirige a uno o dos sitios de ARNsg, la mayor parte de la región codificante se verá afectada. Este diseño asegura la mayor alteración de la expresión génica y se puede aplicar a muchos tipos diferentes de mutaciones de RHO. La figura 2B muestra una eficiencia mejorada en el truncamiento de genes mediante la estrategia de "corte" en la línea celular de riñón humano en comparación con el uso de un solo ARNg. Se transfectaron células HEK293FT con el vector de Cas9 (pX459) que porta lo mismo ARNsg1 simple, ARNsg2 simple, ambos o sin ARNsg. Noventa y seis horas después, se extrajo el ADN y el locus RHO se amplificó y analizó mediante el ensayo SURVEYOR de detección de errores de apareamiento. La aplicación de dos ARNsg juntos dio como resultado una deleción génica de aproximadamente 30-40 %, lo que indicó que la estrategia de "corte" (deleción/interrupción de genes) funciona de manera eficiente en células de mamíferos (carril 4). El uso de un ARNsg (carriles 2 y 3) a la vez, por el contrario, no da como resultado un cambio en el tamaño del gen RHO. Aproximadamente el 30 % del ADN genómico experimentó unión de extremos no homólogos (NHEJ) por un ARNsg. Por el contrario, se editó hasta un 80 % (deleción y NHEJ) cuando se utilizaron dos ARNsg. Como control, se utilizó la misma cantidad de ADN plasmídico (1 pg/1 x 105 células 293FT) en cada grupo.

Las Figuras 3A-C muestran una eficacia mejorada de inactivación de un gen mediante ARNsg doble ("corte" o deleción/interrupción del gen) en comparación con un solo ARNsg. La figura 3A es una representación esquemática de los sitios diana de ARNsg1 y ARNsg2 en un vector de expresión de RHO. Los dos ARNsg se dirigen al extremo 5' del ADNc de RHO como se indica. El ADNc de RHO wt fue dirigido por un promotor de CMV. La EGFP dirigida por el promotor de CMV se usó como control interno en el ensayo de inmunotransferencia, que normaliza la diferencia en la eficiencia de transfección y la carga de proteínas. La figura 3B muestra los niveles de proteína medidos por inmunotransferencia cuando las células HEK293FT se cotransfectaron con el vector de expresión de RHO y otro vector que expresa la maquinaria Cas9 (pX459) que porta ARNsg1, ARNsg2 o ambos. El grupo sg3 es un ARNsg de control no específico. La figura 3C indica que, después de la normalización con EGFP, dos ARNsg juntos reducen la expresión de RHO en un 70 %, mientras que el uso de un solo ARNsg reduce la expresión en solo un 0-30 % (en comparación con el grupo de control (sg3)). Este resultado indicó que la estrategia de "corte" se puede utilizar para reducir o inactivar significativamente la expresión de proteínas.

Las Figuras 4A-C muestran que el "corte" (estrategia de deleción o interrupción de genes) tiene el potencial de crear una ruptura de la doble cadena para facilitar la reparación precisa a través de un mecanismo como la recombinación homóloga. La figura 4A es una representación esquemática de la edición de CRISPR mediada por AAV en el modelo de RP RhoD190N de ratón. El tratamiento viral doble del vector AAV/Cas9 y un vector AAV bicistrónico que contiene una plantilla donante wt y un ARNsg dirigido a la mutación D190N daría como resultado una reparación específica de la mutación. La construcción de la plantilla donante contiene una secuencia Rho natural con dos modificaciones: 1) creación de un sitio AflII adicional hacia el extremo 5' del codón D190 para la identificación del reemplazo del ADN después de la recombinación homóloga inducida por CRISPR y 2) introducción de 5 pares de bases oscilantes (bps) para hacer que la plantilla donante sea irreconocible por ARNsg y, por tanto, resistente a Cas9. La figura 4B muestra la eficiencia de edición evaluada mediante el uso del seguimiento de "indel" (inserciones y deleciones) por análisis de descomposición (TIDE) (disponible públicamente en http://tide-calculator.nki.nl: consultado el 30 de abril de 2016) en el ADN de la retina de ratón tratado con los virus AAV mencionados anteriormente, lo que demostró que ~ el 50 % de los fotorreceptores experimentaron NHEJ. La figura 4C es una digestión representativa de AflII de ADN retiniano de un ratón RhoD190N/+ que muestra que una gran parte de los fotorreceptores se reparan mediante recombinación homóloga (carril 2). Los ratones RhoD190N/+ se trataron con el vector de Cas9 con (carril 2) o sin (carril 1) la plantilla donante natural, y el ADN de la retina se extrajo y se amplificó con los cebadores de cribado indicados.

Las Figuras 5A-B muestran el rescate histológico y funcional mediante reparación mediada por CRISPR/ plantilla donante. Los ratones heterocigotos RhoD190N/+ se trataron con el tratamiento viral doble descrito en la Figura 4A-C mediante inyección subretiniana en el día 3 posnatal. La figura 5B muestra una función visual de los ratones evaluados por ERG después del tratamiento. La figura 5A muestra una evaluación histológica de la sección de tejido retiniano. La tinción de H y E de una sección de la retina muestra el aumento de la supervivencia de los fotorreceptores (capa nuclear externa, ONL) en un 137 %, en comparación con el ojo no tratado (Figura 5A). Las barras rectangulares muestran un área de sección transversal ampliada de una o Nl de fotorreceptores en ojos con CRISPR/Cas9 (inyectado) y control (sin tratar). Los electrorretinogramas (ERG) indican una mejora notable tanto en la onda a como en la onda b, del tratamiento mediado por CRISPR específico del gen de heterocigotos RhoD190N/+ de 3 meses de edad (Figura 5B).

Las Figuras 6A-C describen la generación del modelo animal humanizado para RHO por reemplazo del exón 1 mediado por CRISPR en el locus Rho de ratón. Este sistema permite a los investigadores probar los componentes CRISPR in vivo. La figura 6A es una ilustración de la estrategia de reemplazar el exón 1 de Rho de ratón (m) con el exón 1 de RHO natural (wt) o humano mutante (h). Mediante la coelectroporación del plásmido pX459 que codifica Cas9 y ARNsg específico del exón 1 de Rho, se puede crear una ruptura de la doble cadena en el exón 1 de ratón que facilita la recombinación homóloga en células ES. La figura 6B muestra los resultados del ensayo de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) de ADN de células ES que presentan un sitio AvaII adicional que indica la sustitución del exón 1 de Rho de ratón por el exón 1 de RHO humana (carriles 1 y 2). Figura 6C: El electroferograma de secuencia de amplicones de PCR revela la fusión de la secuencia humana y de ratón de un clon de ES transformado.

Las Figuras 7A-C muestran el reemplazo génico exitoso del alelo D670G en el gen que codifica Pde6a por CRISPR en células madre embrionarias de ratón. La figura 7A es un esquema de la construcción donante que contiene Pde6a con dos cambios: (1) se introdujo una modificación de codones de Pde6a que crea un sitio de Sphl adicional hacia el extremo 5' del codón D670G; y (2) se introdujeron ocho pares de bases oscilantes, lo que hace que la plantilla donante sea resistente al direccionamiento de ARNsg. La figura 7B muestra amplicones de PCR generados a partir de células ES que experimentaron recombinación homóloga. La figura 7C muestra los datos del electroferograma de secuenciación del ADN del clon de ES diana, que presenta un reemplazo esperado del alelo con D670G con la plantilla donante.

Las Figuras 8A-C muestran que "ChopStick" (deleción o alteración génica) se puede utilizar para eliminar y corregir eficazmente una región génica de interés, tal como una que contenga una mutación, en una célula madre pluripotente inducida (iPS) de un paciente con degeneraciones maculares juveniles (OMIM # 126600). La figura 8a es una ilustración esquemática de la introducción de componentes CRISPR en iPSC humanas. El complejo de proteína Cas9/ARNsg (RNP) se conucleofectó en células iPS humanas con una plantilla donante monocatenaria (ssODN). Los clones se seleccionaron y cribaron adicionalmente mediante ensayo de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP). La figura 8B es una representación esquemática del sitio de direccionamiento de ARNsg en este caso. El nucleótido marcado con un punto corresponde al sitio de mutación. La figura 8C es el resultado de la secuenciación de la PCR de colonias, que indica el reemplazo de la plantilla donante.

La figura 9 es una representación esquemática del vector AAV/Cas9 de autoescisión. Cas9 de S. pyogenes, que está dirigido por un promotor de CMV corto de 173 pb (sCMV) y terminado por una señal de poli-A sintética (SPA) de 50 pb, está flanqueado por secuencias diana de ARNsg-Y1 (SEQ ID NO: 7) (GGTTTTGGACAATGGAACCGTg G, derivadas de Drosophila). Una vez que la célula expresa la proteína Cas9 y el ARNsg-Y1 simultáneamente, este vector AAV/Cas9 es destruido por la propia Cas9.

Descripción detallada

El término "nucleasa" se usa para referirse generalmente a cualquier enzima que hidroliza secuencias de ácidos nucleicos.

El término "células oculares" se refiere a cualquier célula del ojo o asociada con su función. El término puede referirse a una o más células fotorreceptoras, incluidos conos, bastones y células ganglionares fotosensibles, células del epitelio pigmentario de la retina (RPE), células de Müeller, células bipolares, células horizontales o células amacrinas. En una modalidad, las células oculares son células bipolares. En otra modalidad, las células oculares son células horizontales. En una tercera modalidad adicional, las células oculares incluyen células ganglionares. Los términos "polinucleótido", "nucleótido", "secuencia nucleotídica", "ácido nucleico" y "oligonucleótido" se usan indistintamente. Estos términos se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos. Los ejemplos de polinucleótidos incluyen, pero no se limitan a, regiones codificantes o no codificantes de un gen o fragmento de gen, exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, ARN ribosómico, ARN de interferencia corto (ARNip), ARN de horquilla corta (ARNhc), microARN (miARN), ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Además, se pueden modificar uno o más nucleótidos dentro de una secuencia polinucleotídica. La secuencia de nucleótidos puede estar interrumpida por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido también se puede modificar después de la polimerización, tal como mediante conjugación con un agente de marcaje.

La presente descripción se basa, en parte, en los hallazgos de que la edición de genes puede usarse para corregir los alelos mutantes causantes de enfermedades, que a su vez se pueden usar para tratamiento génico in vivo para pacientes afectados por enfermedades autosómicas dominantes.

La presente descripción aprovecha el sistema de edición de genes CRISPR, donde el enfoque es utilizar una enzima de edición de genes con una o varias secuencias de ARN guía simple (sg) únicas que se dirigen al alelo o los alelos mutantes específicamente o que se dirigen tanto a los alelos mutantes como a los naturales de un gen que porta una mutación autosómica dominante para su destrucción. A continuación, este direccionamiento es seguido por el suministro del ADNc del gen natural, con modificación de codones para evadir el reconocimiento, por parte del (de los) ARNsg. La deleción de las formas mutante y/o natural del gen, seguida del suministro del ADNc del gen natural que tiene la modificación de codones y que es resistente al reconocimiento por parte de los ARN guía, da como resultado la corrección de la mutación y, por lo tanto, la restauración de un fenotipo encontrado en las enfermedades autosómicas dominantes.

Los inventores de la presente descripción se refieren al sistema de edición de genes descrito aquí como un sistema "ChopStick". La etapa de "corte" (“Chop”) implica la interrupción parcial o completa de i) la copia mutante de un gen que se va a corregir; y/o ii) la copia natural de dicho gen en un paciente que padece una enfermedad autosómica dominante. Por tanto, la etapa de "corte" da como resultado la pérdida parcial o completa de la actividad mutante y/o natural de dicho gen. La etapa de "pegar" (“Stick”) abarca la introducción de un ADNc con modificación de codones de un gen de interés o un fragmento de este (caracterizado por la mutación autosómica dominante), que está destinado a restaurar, corregir, complementar o aumentar el gen o la función del producto génico en las células.

En una modalidad, la etapa de "pegar" da como resultado la integración de una plantilla donante, con modificación de codones, de un gen de interés o fragmento (caracterizado por la mutación autosómica dominante), en el gen endógeno relacionado con la enfermedad autosómica. Dicha integración dirigida se logra mediante recombinación homóloga. En general, una nucleasa de la familia Cas hace que una doble cadena de ADN se rompa en un sitio definido del genoma, que después se puede reparar mediante recombinación homóloga o unión de extremos no homólogos.

Alternativamente, la etapa de "pegar" no da como resultado la integración de una plantilla donante con modificación de codones de un gen de interés o fragmento (caracterizado por la mutación autosómica dominante) en el gen endógeno relacionado con la enfermedad autosómica. Por ejemplo, los vectores extracromosómicos o episómicos (episómicamente) persisten en el núcleo en un estado extracromosómico y ofrecen el suministro y expresión transgénica sin integración en el genoma del huésped. Entre dichos vectores se encuentran los vectores AAV, que son particularmente eficaces en la transducción de células que no se dividen, y donde el genoma del vector persiste predominantemente en forma episómica.

Se puede suministrar una plantilla donante con modificación de codones a las células o a un paciente a través de vectores episómicos. Debido a que los vectores episómicos persisten en múltiples copias por célula, la expresión resultante del gen de interés puede ser comparativamente alta tanto a nivel de ARN como de proteína. En las células que no se dividen, la presencia del vector AAV como elemento de replicación episómico puede ser suficiente para la expresión estable del gen, ARN y/o proteína.

Dados los principios generales del sistema "Chop-Stick" descrito en la presente descripción, el sistema "Chop-Stick" puede usarse como una herramienta de edición de genes para la corrección de la mutación o mutaciones encontradas en cualquier enfermedad autosómica dominante. Por tanto, los métodos de la presente descripción se pueden usar para tratar cualquier enfermedad autosómica dominante, que incluye, entre otros, síndrome acropectoral, porfiria aguda intermitente, adermatoglifia, osteodistrofia hereditaria de Albright, síndrome II de Arakawa, síndrome de exceso de aromatasa, ataxia cerebelosa autosómica dominante, retinitis pigmentaria autosómica dominante, síndrome de Axenfeld, miopatía de Bethlem, síndrome de Birt-Hogg-Dubé, displasia bumerán, síndrome branquio-oto-renal, síndrome de Buschke-Ollendorff, enfermedad de Camurati-Engelmann, enfermedad del núcleo central, enfermedad del colágeno, colagenopatía, tipos II y XI, atrofia muscular espinal distal congénita, distrofia corneal estromal congénita, síndrome de Costello, síndrome de Currarino, enfermedad de Darier, enfermedad de Vivo, atrofia dentato-rubro-pálido-luisiana, dermatopatía pigmentaria reticularis, síndrome de DiGeorge, enfermedad de panal de Doyne, disfibrinogenemia, polineuropatía amiloide familiar, fibrilación auricular familiar, hipercolesterolemia familiar, pubertad precoz familiar limitada al varón, síndrome de Feingold, síndrome de Felty, síndrome de Flynn-Aird, síndrome de Gardner, síndrome de Gillespie, síndrome de plaquetas grises, síndrome de cefalopolisindactilia de Greig, síndrome de Hajdu-Cheney, Hawkinsinuria, síndrome de Hay-Wells, eliptocitosis hereditaria, telangiectasia hemorrágica hereditaria, displasia mucoepitelial hereditaria, esferocitosis hereditaria, síndrome de Holt-Oram, enfermedad de Huntington, miocardiopatía hipertrófica, hipoalfalipoproteinemia, hipocondroplasia, síndrome de Jackson-Weiss, eritema queratolítico invernal, displasia de Kniest, síndrome de Kostmann, síndrome de Langer-Giedion, síndrome de Larsen, síndrome de Liddle, síndrome de Marfan, síndrome de Marshall, enfermedad renal quística medular, metacondromatosis, síndrome de Miller-Dieker, síndrome MOMO, monilethrix, neoplasia endocrina múltiple, neoplasia endocrina múltiple tipo 1, neoplasia endocrina múltiple tipo 2, neoplasia endocrina múltiple tipo 2b, mielocatexis, distrofia miotónica, síndrome de Naegeli-Franceschetti-Jadassohn, síndrome uña-rótula, síndrome de Noonan, distrofia muscular oculofaríngea, paquioniquia congénita, síndrome de Pallister-Hall, síndrome PAPA, síndrome papilorrenal, enanismo parastremmático, anomalía de Pelger-Huet, síndrome de Peutz-Jeghers, polidactilia, síndrome de terigión poplíteo, porfiria cutánea tardía, pseudoacondroplasia, RASopatía, distrofia corneal de Reis-Bucklers, síndrome de Romano-Ward, síndrome de Rosselli-Gulienetti, síndrome de Roussy-Lévy, síndrome de Rubinstein-Taybi, síndrome de Saethre-Chotzen, síndrome de Schmitt Gillenwater Kelly, síndrome de QT corto, síndrome de Singleton-Merten, atrofia muscular espinal con predominio en las extremidades inferiores, ataxia espinocerebelosa, ataxia espinocerebelosa tipo 6, displasia espondiloepifisaria congénita, displasia espondiloperiférica, síndrome de Stickler, síndrome de Tietz, síndrome de Timothy, síndrome de Treacher Collins, esclerosis tuberosa, enfermedad de Upington, porfiria variegata, distrofia macular viteliforme, enfermedad de Von Hippel-Lindau, enfermedad de Von Willebrand, síndrome de Wallis-Zieff-Goldblatt, síndrome de WHIM, nevus esponjoso blanco, síndrome de Worth, zaspopatía, síndrome de Zimmermann-Laband y síndrome de Zori-Stalker-Williams. Por ejemplo, en los Ejemplos proporcionados en la presente descripción, los inventores presentan los datos que realizan "Corte" en células de riñón humano y células iPS (Figura 2 y Figura 8). Estos hallazgos confirman el potencial de los métodos de la presente descripción para usarlos para prevenir, corregir o tratar enfermedades renales autosómicas dominantes tales como angiomiolipomas renales, enfermedad renal quística medular o enfermedad renal poliquística autosómica dominante.

En modalidades adicionales, los métodos de la presente descripción se pueden usar para prevenir, corregir o tratar enfermedades oculares que surgen debido a la presencia de una mutación autosómica dominante. Ejemplos de tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a, atrofia o degeneración coriorretiniana autosómica dominante, distrofia de conos o conos y bastones autosómica dominante, ceguera nocturna estacionaria congénita autosómica dominante, amaurosis congénita de Leber autosómica dominante, degeneración macular autosómica dominante, enfermedad del desarrollo de la retina ocular autosómica dominante, atrofia óptica autosómica dominante, retinitis pigmentaria autosómica dominante, enfermedades sindrómicas/sistémicas autosómicas dominantes con retinopatía, distrofia macular de Sorsby, degeneración macular relacionada con la edad, enfermedad macular de panal de Doyne y degeneración macular juvenil.

Generalmente, en el caso de la retinitis pigmentaria, los pacientes con mutaciones nulas de rodopsina tienen un fenotipo más leve que aquellos con mutaciones de rodopsina dominantes graves. Incluso si el gen de la rodopsina normal se destruye junto con el mutante, se espera que el suministro del exón o ADNc natural (es decir, “Stick”) mejore la función de la retina en el receptor.

Los métodos de la presente descripción se pueden usar para detener la progresión o mejorar la pérdida de visión asociada con la retinitis pigmentaria (RP) en el sujeto. La pérdida de visión relacionada con la retinitis pigmentaria puede incluir disminución de la visión periférica, visión central (de lectura), visión nocturna, visión diurna, pérdida de la percepción del color, pérdida de la sensibilidad al contraste o reducción de la agudeza visual. Los métodos de la presente descripción también se pueden usar para prevenir o detener la pérdida de la función de los fotorreceptores o aumentar la función de los fotorreceptores en el sujeto.

La RP se diagnostica en parte mediante un examen de la retina. El examen del ojo generalmente revela depósitos de pigmentos oscuros y anormales que surcan la retina. Las pruebas adicionales para diagnosticar la RP incluyen electrorretinograma (ERG) y pruebas de campo visual.

Los métodos para medir o evaluar la función visual, la función de la retina (como la capacidad de respuesta a la estimulación con luz) o la estructura de la retina en un sujeto se conocen bien por los expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Kanski's Clinical Ophthalmology: A Systematic Approach, Edición 8, Elsevier Health Sciences, 2015. Los métodos para medir o evaluar la respuesta de la retina a la luz pueden incluir la detección de una respuesta eléctrica de la retina a un estímulo luminoso. Esta respuesta puede detectarse mediante la medición de un electrorretinograma (ERG; por ejemplo, ERG de campo completo, ERG multifocal o prueba de fotoestrés ERG), potenciales evocados visuales o nistagmo optocinético (ver, por ejemplo, Wester y otros, Invest. Oftalmol. Vis. Sci.

48: 4542-4548, 2007). Además, la respuesta de la retina a la luz se puede medir mediante la detección directa de la respuesta de la retina (por ejemplo, mediante el uso de un microelectrodo en la superficie de la retina). El ERG se ha descrito ampliamente por Vincent y otros, Retina, enero de 2013; 33 (1): 5-12. Por tanto, los métodos de la presente descripción se pueden usar para mejorar la función visual, la función de la retina (como la respuesta a la estimulación de la luz), la estructura de la retina o cualquier otro síntoma clínico o cambio fenotípico asociado con enfermedades oculares en sujetos afectados por una enfermedad ocular.

En una modalidad, los métodos de la presente descripción se pueden usar para prevenir el desarrollo y la progresión de una enfermedad autosómica dominante. Por ejemplo, un paciente puede ser portador de una mutación autosómica dominante, pero la expresión fenotípica de una enfermedad aún no se ha manifestado, aunque el defecto genómico se ha identificado mediante cribado. Los métodos de la presente descripción se pueden aplicar a dicho paciente para prevenir la aparición de una enfermedad.

Se han identificado mutaciones en varios genes que dan lugar a enfermedades autosómicas dominantes (dichos genes también se denominan genes relacionados con enfermedades autosómicas dominantes). Los métodos de la presente descripción se pueden usar para corregir total o parcialmente mutaciones en tales genes relacionados con enfermedades autosómicas dominantes, lo que da como resultado la restauración parcial o total del natural.

En todos los casos en los que se utilizan números de acceso, los números de acceso se refieren a una modalidad del gen que puede usarse con los métodos de la presente descripción. En una modalidad, los números de acceso son números de secuencias de referencia (RefSeq) del NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica). Por ejemplo, el gen relacionado con enfermedad autosómica dominante en la retinitis pigmentaria puede incluir, pero sin limitarse a, ARL3(NC_000010.11 (102673727..102714433, complemento)), BEST1(NG_009033.1), CA4(NG_012050.1), CRX(NG_008605.1), FSCN2(NG_ 015964.1), GUCA1B(NG_016216.1), HK1(NG_012077.1), IMPDH1(NG_009194.1),KLHL7(N G_016983.1), NR2E3(NG_009113.2), NRL(NG_011697.1), PRPF3(NG_008245.1), PRPF4(NG _034225.1), PRPF6(NG_029719.1), PRPF8(NG_009118.1), PRPF31(NG_009759.1), PRPH2(N G_009176.1), RDH12(NG_008321.1), RHO(NG_009115.1), ROM1(NG_009845.1), RP1(NG_0 09840.1), RP9(NG_012968.1), RPE65(NG_008472.1), SEMA4A(NG_027683.1), SNRNP200(NG_016973.1), SPP2(NG_008668.1) y TOPORS(NG_017050.1). Los genes y las mutaciones que causan la retinitis pigmentaria autosómica dominante se analizan en detalle por Daiger y otros. (Cold Spring Harb Perspect Med. 10 de octubre de 2014; 5 (10)).

Otro tipo de gen relacionado con enfermedad autosómica dominante es un gen relacionado con la degeneración o atrofia coriorretiniana autosómica dominante, que puede incluir:

PRDM13(NC_000006.12 (99606774..99615578)), RGR(NG_009106.1) y TEAD1(NG-021302.1).

Otro ejemplo de un gen relacionado con enfermedad autosómica dominante es un gen relacionado con la distrofia de conos o conos y bastones autosómica dominante, que puede incluir: AIPL1(NG_008474.1), CRX(NG_008605.1), GUCA1A(NG_009938.1), GUCY2D(NG_009092.1), PITPNM3(NG_016 020.1), PROM1(NG_011696.1), PRPH2(NG_009176.1), RIMS1(NG_016209.1), SEMA4A(NG_ 027683.1) y UNC119(NG_012302.1)).

En una modalidad, el gen relacionado con enfermedad autosómica dominante es un gen relacionado con la ceguera nocturna estacionaria congénita autosómica dominante, que incluye:

GNAT1(NG_009831.1), PDE6B(NG_009839.1) y RHO(NG_009115.1).

En otra modalidad, el gen relacionado con enfermedad autosómica dominante es un gen relacionado con la sordera autosómica dominante (sola o sindrómica) tal como WSF1(NC_000004.12 (6269850..6303265)).

Otro tipo de gen relacionado con enfermedad autosómica dominante es un gen relacionado con la amaurosis congénita de Leber autosómica dominante, que puede incluir: CRX(NG_008605.1), (NG_009194.1) y OTX2(NG_008204.1).

Otro ejemplo de un gen relacionado con enfermedad autosómica dominante es un gen relacionado con la degeneración macular autosómica dominante, que puede incluir: BEST1(NG_009033.1), C1QTNF5(NG_012235.1), CTNNA1(NC_000005.10 (138753396..138935034)), EFEMP1(NG_009098.1), ELOVL4(NG_009108.1), FSCN2(NG_015964.1), GUCA1B(NG_016 216.1), HMCN1(NG_011841.1), IMPG1(NG_041812.1), OTX2(NG_008204.1), PRDM13(NC_ 000006.12 (99606774..99615578)), PROM1(NG_011696.1), PRPH2(NG_009176.1), RP1L1(NG_028035.1) y TIMP3(NG_009117.1).

En una modalidad, el gen relacionado con enfermedad autosómica dominante es un gen relacionado con la enfermedad del desarrollo de la retina ocular autosómica dominante tal como VCAN(NG_012682.1). Los números de acceso se proporcionan como ejemplos específicos de cada gen que pueden usarse con los métodos de la descripción.

En otra modalidad, el gen relacionado con enfermedad autosómica dominante es un gen relacionado con la atrofia óptica autosómica dominante, que incluye: MFN2(NG_007945.1), NR2F1(NG_034119.1) y OPA1(NG_011605.1).

En una modalidad, el gen relacionado con enfermedad autosómica dominante es un gen relacionado con la enfermedad sindrómica/sistémica autosómica dominante con retinopatía, que incluye: ABCC6(NG_007558.2), ATXN7(NG_008227.1), COL11A1(NG_008033.1), COL2A1(NG_008 072.1), JAG1(NG_007496.1), KCNJ13(NG_016742.1), KIF11(NG_032580.1), MFN2(NG_007945.1), OPA3(NG_013332.1), PAX2(NG_008680.2), TREX1(NG_009820.1) y VCAN(NG_012682.1).

Otro ejemplo de un gen relacionado con enfermedad autosómica dominante es un gen relacionado con la retinopatía autosómica dominante, que incluye: BEST1(NG_009033.1), CAPN5(NG_033002.1), CRB1(NG_008483.2), FZD4(NG_011752.1), ITM2B(NG_013069.1), LRP5(NG_015835.1), M APKAPK3(NC_000003.12(50611862..50649297)), MIR204(NR_029621.1), OPN1SW(NG_009 094.1), RB1(NG_009009.1), TSPAN12(NG_023203.1) y ZNF408(NC_000011.10 (46700767..46705916).

Además de usarse para la prevención, corrección o tratamiento de enfermedades autosómicas dominantes, los métodos de la presente descripción se pueden usar para prevenir, corregir o tratar cualquier enfermedad autosómica recesiva. Por tanto, todos los métodos descritos aquí como aplicables a enfermedades autosómicas dominantes y genes o fragmentos autosómicos dominantes pueden adoptarse para su uso en el tratamiento de enfermedades autosómicas recesivas.

En modalidades adicionales, los métodos de la presente descripción se pueden usar para prevenir, corregir o tratar enfermedades oculares que surgen debido a la presencia de una mutación autosómica recesiva. Ejemplos de tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a, ceguera nocturna estacionaria congénita autosómica recesiva, sordera autosómica recesiva sola o sindrómica, amaurosis congénita de Leber autosómica recesiva, atrofia óptica autosómica recesiva, retinitis pigmentaria autosómica recesiva, enfermedades sindrómicas/sistémicas autosómicas recesivas con retinopatía, síndrome de Usher autosómico recesivo, otra retinopatía autosómica recesiva, distrofia de conos o conos y bastones autosómica recesiva, degeneración macular autosómica recesiva y síndrome de Bardet-Biedl autosómico recesivo.

De acuerdo con los métodos descritos aquí, el gen relacionado con una enfermedad autosómica recesiva se corrige y puede restaurar en parte o completamente la función de un gen natural.

Un tipo de gen relacionado con una enfermedad autosómica recesiva es un gen relacionado con la ceguera nocturna estacionaria congénita, que incluye: CABP4(NG_021211.1), GNAT1(NG_009831.1), GNB3(NG_009100.1), GPR179(NG_032655.2), GRK1(NC_000013.11(113667279..113671659)), GRM6(NG_008105.1), LRIT3(NG_033249.1), RDH5(NG_008606.1), SAG(NG_009116.1), SLC24A1(NG_031968.2) y TRPM1(NG_016453.2).

Otro tipo de gen relacionado con una enfermedad autosómica recesiva es un gen relacionado con el síndrome de Bardet-Biedl, que incluye:

ADIPOR1(NC_000001.1(202940825..202958572, complemento)), ARL6(NG_008119.2), BBIP1(NG_041778.1), BBS1(NG_009093.1), BBS2(NG_009312.1), BBS4(NG_009416.2), BBS5(NG_ 011567.1), BBS7(NG_009111.1), BBS9(NG_009306.1),BBS10(NG_016357.1), BBS12(NG_02 1203.1), C8orf37(NG_032804.1), CEP290(NG_008417.1), IFT172(NG_034068.1), IFT27(NG_ 034205.1), INPP5E(NG_016126.1), KCNJ13(NG_016742.1),LZTFL1(NG_033917.1), MKKS(NG_009109.1), MKS1(NG_013032.1), NPHP1(NG_008287.1), SDCCAG8(NG_027811.1), TRI M32(NG_011619.1) y TTC8(NG_008126.1).

Un ejemplo de un gen relacionado con una enfermedad autosómica recesiva es un gen relacionado con la distrofia de conos o conos y bastones, que incluye, pero no se limita a, ABCA4(NG_009073.1), ADAM9(NG_016335.1), ATF6(NG_029773.1), C21orf2(NG_032952.1), C8orf37(NG_032804. 1), CACNA2D4(NG_012663.1), CDHR1(NG_028034.1),CERKL(NG_021178.1), CNGA3(NG _009097.1), CNGB3(NG_016980.1), CNNM4(NG_016608.1), GNAT2(NG_009099.1), KCNV 2(NG_012181.1), PDE6C(NG_016752.1), PDE6H(NG_016859.1), POC1B(NG_041783.1), RA B28(NG_033891.1). RAX2(NG_011565.1), RDH5(NG_008606.1), RPGRIP1(NG_008933.1) y TTLL5(NG_016974.1).

Otro ejemplo del gen relacionado con una enfermedad autosómica recesiva es el gen relacionado con la sordera (sola o sindrómica) que incluye: CDH23(NG_008835.1), CIB2(NG_033006.1), DFNB31(NG_016700.1), MYO7A(NG_009086.1), PCDH15(NG_009191.2), PDZD7(NG_028030.1) y USH1C(NG_011883.1)).

En una modalidad, el gen relacionado con una enfermedad autosómica recesiva es un gen relacionado con la amaurosis congénita de Leber, que incluye: AIPL1(NG 008474.1), CABP4(NG_021211.1), CEP290(NG_008417.1), CLUAP1(NC_000016.10(3500945..3539048)), CRB1(NG_008483.2), CRX(NG_008605.1), DTHD1(NG_032962.1), GDF6(NG_008981.1), GUCY2D(NG_009092.1), IFT140(NG_032783.1), IQCB1(NG_015887.1), KCNJ13(NG_01674 2.1), LCA5(NG_016011.1), LRAT(NG_009110.1), NMNAT1(NG_032954.1), PRPH2(NG_0091 76.1), RD3(NG_013042.1), RDH12(NG_008321.1), RPE65(NG_008472.1), RPGRIP1(NG_008 933.1), SPATA7(NG_021183.1) y TULP1(NG_009077.1).

En otra modalidad, el gen relacionado con una enfermedad autosómica recesiva es un gen relacionado con la atrofia óptica, que incluye: RTN4IP1(NC_000006.12 (106571028..106630500, complemento)), SLC25A46(NC_000005.10(110738136..110765161)) y TMEM126A(NG_017157.1).

Un ejemplo del gen relacionado con una enfermedad autosómica recesiva es un gen relacionado con la retinitis pigmentaria, que incluye: ABCA4(NG_009073.1), AGBL5(NC_000002.12 (27051423..27070622)), ARL6(NG_008119.2), ARL2BP(NG_033905.1), BBS1(NG_009093.1), BBS2(NG_009312.1), BEST1(NG_009033.1), C2orf71(NG_021427.1), C8orf37(NG_032804.1), CERKL(NG_021178.1), CLRN1(NG_009168.1), CNGA1(NG_009193.1), CNGB1(NG_01635 1.1), CRB1(NG_008483.2), CYP4V2(NG_007965.1),DHDDS(NG_029786.1), DHX38(NG_034 207.1), EMC1(NG_032948.1), EYS(NG_023443.2), FAM161A(NG_028125.1), GPR125(NC_0 00004.12 (22387374..22516058, complemento)), HGSNAT(NG_009552.1), IDH3B(NG_012149.1), IFT140(NG_032783.1), IFT172(NG_034068.1), IMPG2(NG_028284.1), KIAA1549(NG_032965.1), KIZ(NG_033122.1), LRAT(NG_009110.1), MAK(NG_030040.1), MERTK(NG_011607.1), MVK(NG_007702.1), NEK2(NG_029112.1), NEUROD1(NG_011820.1), NR2E3(NG_009113.2), NRL(NG_011697.1), PDE6A(NG_009102.1), PDE6B(NG_009839.

1),PDE6G(NG_009834.1), POMGNT1(NG_009205.2), PRCD(NG_016702.1), PROM1(NG_01 1696.1), RBP3(NG_029718.1), RGR(NG_009106.1), RHO(NG_009115.1), RLBP1(NG_008116.1), RP1(NG_009840.1), RP1L1(NG_028035.1), RPE65(NG_008472.1), SAG(NG_009116.1), S LC7A14(NG_034121.1), SPATA7(NG_021183.1), TTC8(NG_008126.1), TULP1(NG_009077. 1), USH2A(NG_009497.1), ZNF408(NC_000011.10 (46700767..46705916)) y ZNF513(NG_028219.1).

Otro ejemplo del gen relacionado con una enfermedad autosómica recesiva es un gen relacionado con la enfermedad sindrómica/sistémica con retinopatía, que incluye: ABCC6(NG_007558.2), ABHD12(NG_028119.1), ACBD5(NG_032960.2), ADAMTS18(NG_031879.1), ADIPOR1(NC _000001.11(202940825..202958572, complemento)), AHI1(NG_008643.1), ALMS1(NG_011690.1), CC2D2A(NG_013035.1), CEP164(NG_033032.1), CEP290(NG_00841 7.1), CLN3(NG_008654.2), COL9A1(NG_011654.1), CSPP1(NG_034100.1), ELOVL4(NG_00 9108.1), EXOSC2(NC_000009.12 (130693760..130704894)), FLVCR1(NG_028131.1 I, FLVCR1(NG_028131.1), GNPTG(NG_016985.1), HARS(NG_032158.1), HGSNAT(NG_0095 52.1), HMX1(NG_013062.2), IFT140(NG_032783.1),INPP5E(NG_016126.1), INVS(NG_0083 16.1), IQCB1(NG_015887.1), LAMA1(NG_034251.1), LRP5(NG_015835.1), MKS1(NG_0130 32.1), MTTP(NG_011469.1), NPHP1(NG_008287.1),NPHP3(NG_008130.1), NPHP4(NG_011 724.2), OPA3(NG_013332.1), PANK2(NG_008131.3), PCYT1A(NG_042817.1), PEX1(NG_00 8341.1), PEX2(NG_008371.1), PEX7(NG_008462.1),PHYH(NG_012862.1), PLK4(NG_04182 1.1), PNPLA6(NG_013374.1), POC1B(NG_041783.1), PRPS1(NG_008407.1), RDH11(NG_04 2282.1), RPGRIP1L(NG_008991.2), SDCCAG8(NG_027811.1), SLC25A46(NC_000005.10(11 0738136..110765161)), TMEM237(NG_032049.1), TRNT1(NG_041800.1), TTPA(NG_016123.1), TUB(NG_029912.1), TUBGCP4(NG_042168.1), TUBGCP6(NG_032160.1), WDPCP(NG_ 028144.1), WDR19(NG_031813.1), WFS1(NG_011700.1) y ZNF423(NG_032972.2).

Un tipo de gen relacionado con una enfermedad autosómica recesiva es el gen relacionado con el síndrome de Usher, que incluye: ABHD12(NG_028119.1), CDH23(NG_008835.1), CEP250(NC_000020.11(35455139..35517531)), CIB2(NG_033006.1), CLRN1(NG_009168.1), DFNB31(NG_016700.1), GPR98(NG_007083.1), HARS(NG_032158.1), MYO7A(NG_009086. 1), PCDH15(NG_009191.2), USH1C(NG_011883.1), USH1G(NG_007882.1) y USH2A(NG_009497.1).

Otro tipo de gen relacionado con una enfermedad autosómica recesiva es un gen relacionado con retinopatía, que incluye: BEST1(NG_009033.1), C12orf65(NG_027517.1), CDH3(NG_009096.1), CNGA3(NG_009097.1), CNGB3(NG_016980.1), CNNM4(NG_016608.1), CYP4V2(NG_0079 65.1), LRP5(NG_015835.1), MFRP(NG_012235.1), MVK(NG_007702.1), NBAS(NG_032964.1), NR2E3(NG_009113.2), OAT(NG_008861.1), PLA2G5(NG_032045.1), PROM1(NG_011696.1), RBP4(NG_009104.1), RGS9(NG_013021.1), RGS9BP(NG_016751.1) y RLBP1(NG_008116.1).

Otro tipo más de gen relacionado con una enfermedad autosómica recesiva es un gen relacionado con la degeneración macular, que incluye: ABCA4(NG_009073.1), CFH(NG_007259.1), DRAM2(NC_000001.11(111117332..111140216, complemento)), IMPG1(NG_041812.1) y MFSD8(NG_008657.1). Además de usarse para la prevención, corrección o tratamiento de enfermedades autosómicas dominantes y recesivas, los métodos de la presente descripción se pueden usar para prevenir, corregir o tratar cualquier enfermedad ligada al cromosoma X. Por tanto, todos los métodos descritos aquí como aplicables a enfermedades autosómicas dominantes y genes o fragmentos autosómicos dominantes pueden adoptarse para su uso en el tratamiento de enfermedades ligadas al cromosoma X.

Además, los métodos de la presente descripción se pueden usar para prevenir, corregir o tratar enfermedades oculares que surgen debido a la presencia de una mutación ligada al cromosoma X. Ejemplos de tales enfermedades incluyen: distrofia de conos o conos y bastones ligada al cromosoma X, ceguera nocturna estacionaria congénita ligada al cromosoma X, degeneración macular ligada al cromosoma X, retinitis pigmentaria ligada al cromosoma X, enfermedades sindrómicas/sistémicas ligadas al cromosoma X con retinopatía, atrofia óptica ligada al cromosoma X y retinopatías ligadas al cromosoma X. De acuerdo con los métodos descritos aquí, el gen relacionado con una enfermedad ligada al cromosoma X se corrige y puede restaurar en parte o completamente la función de un gen natural.

Un ejemplo del gen relacionado con una enfermedad ligada al cromosoma X es un gen relacionado con la distrofia de conos o conos y bastones, que incluye: CACNA1F(NG_009095.2) y RPGR(NG_009553.1).

Otro ejemplo del gen relacionado con una enfermedad ligada al cromosoma X es un gen relacionado con la ceguera nocturna estacionaria congénita, que incluye: CACNA1F(NG_009095.2) y NYX(NG_009112.1).

En una modalidad, el gen relacionado con una enfermedad ligada al cromosoma X es un gen relacionado con la degeneración macular, tal como RPGR(NG_009553.1).

En otra modalidad, el gen relacionado con una enfermedad ligada al cromosoma X es un gen relacionado con la atrofia óptica, tal como TIMM8A(NG_011734.1).

Un tipo de gen relacionado con una enfermedad ligada al cromosoma X es un gen relacionado con la retinitis pigmentaria, que incluye: OFD1(NG_008872.1), RP2(NG_009107.1) y RPGR(NG_009553.1).

Otro tipo de gen relacionado con una enfermedad ligada al cromosoma X es un gen relacionado con la enfermedad sindrómica/sistémica con retinopatía, que incluye: OFD1(NG_008872.1) y TIMM8A(NG_011734.1).

Otro ejemplo más del gen relacionado con una enfermedad ligada al cromosoma X es un gen relacionado con la retinopatía, que incluye: CACNA1F(NG_009095.2), CHM(NG_009874.2), DMD(NG_012232.1), NDP(NG_0 09832.1), OPN1LW(NG_009105.2), OPN1MW(NG_011606.1), PGK1(NG_008862.1) y RS1(NG_008659.3).

En otra modalidad, los métodos de la presente descripción se pueden usar para prevenir, corregir o tratar enfermedades que surgen debido a la presencia de mutación en el ADN mitocondrial. Dichas enfermedades pueden incluir retinopatía causada por mutaciones genéticas en el ADN mitocondrial. Los ejemplos de genes que pueden caracterizarse por la mutación en el ADN mitocondrial que provoca el desarrollo de retinopatía incluyen: MT-ATP6(NC_012920.1 (8527..9207)), MT-TH(NC_012920.1 (12138..12206)), MT-TL1(NC_012920.1 (3230..3304)), MT-TP(NC_012920.1 (15956..16023, complemento) y MT-TS2(NC_012920.1 (12207..12265)).

La Tabla 1 proporciona una lista ilustrativa de enfermedades y genes relacionados con enfermedades (acompañados de los números de acceso correspondientes) que pueden tratarse y/o corregirse mediante el uso de los métodos de la presente descripción.

Tabla 1: Genes y trastornos relacionados con enfermedades

Los métodos de la presente descripción también se pueden usar para prevenir, corregir o tratar cánceres que surgen debido a la presencia de una mutación en un gen supresor de tumores. Los ejemplos de genes de supresión tumoral incluyen: gen de susceptibilidad al retinoblastoma (RB), gen de p53, gen delecionado en el carcinoma de colon (DCC), gen de la poliposis coli adenomatosa (APC), p16, BRCA1, BRCA2, MSH2 y el gen supresor de tumores de la neurofibromatosis tipo 1 (NF-1) (Lee y otros. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2010 Oct; 2 (10:).

Los genes supresores de tumores son genes que, en sus alelos naturales, expresan proteínas que suprimen la proliferación celular anormal. Cuando el gen que codifica una proteína supresora de tumores muta o se elimina, la proteína mutante resultante o la falta total de expresión de la proteína supresora de tumores, puede no regular correctamente la proliferación celular, y puede ocurrir una proliferación celular anormal, particularmente si ya existe daño en el mecanismo regulador celular. Se ha demostrado que varios tumores humanos y líneas de células tumorales bien estudiados tienen ausencia de genes supresores de tumores o estos no son funcionales. Por tanto, una pérdida de función o inactivación de genes supresores de tumores puede desempeñar un papel central en el inicio y/o progresión de un número significativo de tumores malignos humanos.

Los métodos de la presente descripción se pueden usar para tratar pacientes en una etapa diferente de la enfermedad (por ejemplo, temprana, media o tardía). Los presentes métodos se pueden usar para tratar a un paciente una o varias veces. Por tanto, la duración del tratamiento puede variar y puede incluir múltiples tratamientos.

Como se analiza en la presente descripción, los métodos o la presente descripción se pueden usar para corregir o tratar una enfermedad ocular autosómica dominante en un sujeto. Por ejemplo, la etapa de "cortar" implica la deleción de la copia mutante del gen relacionado con enfermedad autosómica dominante ocular que se va a corregir y/o de la copia endógena natural del mismo gen en un paciente que padece de la enfermedad ocular autosómica dominante. Por tanto, la etapa de "corte" da como resultado la pérdida total o parcial de la actividad mutante y/o natural de un gen. El gen relacionado con la enfermedad ocular autosómica dominante se corrige después mediante el uso de la etapa de "pegar", que implica la introducción de una secuencia que codifica un gen modificado relacionado con la enfermedad ocular autosómica dominante o fragmento de este. La secuencia modificada del gen relacionado con la enfermedad ocular autosómica dominante se puede modificar de tal manera que no sea reconocida (irreconocible) por el ARNsg, que se dirige a la forma natural o mutante del gen (forma del gen sin modificación de codones). Esta modificación hace que la plantilla donante con modificación de codones sea resistente a la nucleasa de la familia Cas.

Las construcciones que codifican los componentes de "cortar" y "pegar" se pueden administrar al sujeto mediante el uso de uno o más vectores virales adenoasociados (AAV) recombinantes (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o más vectores AAV). Se pueden empaquetar uno o más ARNsg en (un) solo vector AAV recombinante. El vector AAV recombinante también puede incluir una secuencia del gen relacionado con la enfermedad ocular dominante autosómica dominante, con modificación de codones (plantilla donante). Una nucleasa de la familia Cas puede empaquetarse en los mismos vectores AAV recombinantes o, alternativamente, en vectores separados.

El método descrito aquí también proporciona la corrección de la enfermedad ocular autosómica dominante en un sujeto, que comprende administrar a dicho sujeto mediante inyección una cantidad con eficacia terapéutica de un virus AAV recombinante que codifica una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia polinucleotídica del sistema CRISPR, en donde la secuencia polinucleotídica comprende: (i) una o más secuencias de ARN guía que hibridan con una secuencia génica relacionada con enfermedad autosómica dominante; (ii) una segunda secuencia que codifica un gen relacionado con enfermedad autosómica dominante, con modificación de codones, o un fragmento de este, en donde al menos una mutación relacionada con la enfermedad en el gen o fragmento modificado, relacionado con enfermedad autosómica dominante se ha corregido y el gen o fragmento relacionado con enfermedad autosómica dominante, con modificación de codones, no puede ser reconocido por una o más secuencias de ARN sg que hibridan con una secuencia génica relacionada con la enfermedad autosómica dominante no modificada; y (iii) una secuencia que codifica una enzima de la familia Cas.

Como la capacidad de carga de AAV puede plantear desafíos, se pueden usar dos o más vectores AAV simultáneamente. Por ejemplo, una nucleasa de la familia Cas puede empaquetarse en diferentes vectores AAV. Además, las secuencias que codifican ARNsg, el gen o fragmento relacionado con enfermedad autosómica dominante, con modificación de codones, y una nucleasa de la familia Cas pueden empaquetarse cada uno en un vector AAV separado.

En el caso del tratamiento de RP, los métodos de la presente descripción pueden comprender: administrar a un sujeto mediante inyección una cantidad con eficacia terapéutica de (1) un virus AAV recombinante que codifica una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia polinucleotídica del sistema CRISPR, en donde la secuencia polinucleotídica comprende: (i) dos secuencias de ARN guía que hibridan con secuencias de RHO mutante y natural; (ii) una segunda secuencia que codifica un gen o fragmento de RHO con modificación de codones, donde la mutación o mutaciones del gen RHO endógeno se han corregido y el gen o fragmento de RHO modificado no puede ser reconocido por una o más secuencias de ARNsg que hibridan con la secuencia del gen RHO mutante y natural; y (2) un segundo virus AAV recombinante que codifica una enzima de la familia Cas.

Generalmente, la coexpresión de una enzima de la familia Cas y un ARNsg específico del gen relacionado con enfermedad autosómica dominante en las células oculares conduce al truncamiento del gen relacionado con enfermedad autosómica dominante, evitando así la expresión del gen natural (wt) o el gen mutante causante de la enfermedad. Simultáneamente, el ADNc con modificación de codones del gen relacionado con enfermedad autosómica dominante también se puede suministrar a las células oculares, donde la secuencia codificante del gen relacionado con enfermedad autosómica dominante se modifica de tal manera que es resistente a los ARNsg (y, por lo tanto, resistente a una nucleasa de la familia Cas). Esta estrategia da como resultado la expresión de ADNc con modificación de codones del gen relacionado con enfermedad autosómica dominante, que puede restaurar o corregir la función del gen o fragmento relacionado con enfermedad autosómica dominante después de la deleción de gen(es) o fragmentos endógenos.

El ADNc con modificación de codones (plantilla donante) se puede modificar de tal manera que el (los) ARNsg utilizado(s) para dirigirse al gen(es) relacionado(s) con la enfermedad mutante o natural no puede(n) reconocerlo. Por tanto, las mutaciones deben introducirse en un gen o fragmento de la plantilla donante para evitar el reconocimiento de este gen o fragmento de la plantilla donante por parte del (de los) ARNsg y, en consecuencia, su degradación por la enzima Cas (por ejemplo, una nucleasa Cas9) que se ha introducido en las células. Esto se puede lograr mediante la introducción de una base oscilante en la plantilla donante, que asegura así que el cambio en el ADN dé como resultado una mutación silenciosa, dejando intacto el producto de expresión del gen natural. El término "base oscilante" como se usa en la presente descripción se refiere a un cambio en una o más bases de nucleótidos de una secuencia de nucleótidos de referencia en donde el cambio no cambia la secuencia del aminoácido codificado por el nucleótido con respecto a la secuencia de referencia.

La cantidad de bases oscilantes que deben introducirse en la plantilla donante puede variar de aproximadamente 1 30, aproximadamente 1-20, aproximadamente 2-19, aproximadamente 3-18, aproximadamente 4-17, aproximadamente 5-16, aproximadamente 6-15, aproximadamente 7-14, aproximadamente 8-13, aproximadamente 9-12, aproximadamente 10-11, aproximadamente 9, aproximadamente 8, aproximadamente 7, aproximadamente 6, o aproximadamente 5. Además, dadas las numerosas aplicaciones de programas informáticos disponibles para el modelado predictivo in-silico de ARNsg, se puede realizar un análisis in-silico para probar si el ARNsg reconocería la plantilla donante con modificación de codones. Se puede encontrar un ejemplo de herramienta de ARNsg CRISPR disponible públicamente en http://www.genscript.com/gRNA-design-tool.html: consultado el 30 de abril de 2016.

Alternativamente, si el objetivo del tratamiento es eliminar, destruir o truncar solo la forma mutada de un gen o un fragmento, y dejar intacta la forma natural, la plantilla donante o la secuencia del gen natural que se suministra a las células o a un paciente puede no tener codones modificados. En tales circunstancias, los ARNsg utilizados como parte de los componentes de CRISPR se diseñarían para reconocer y dirigirse solo a la forma mutada de un gen relacionado con la enfermedad (y no reconocer y dirigirse a una forma natural (como la plantilla donante) de dicho gen).

Los métodos de la presente descripción se han aplicado a varios genes, incluidos los genes PDE6A, EFEMP1, rodopsina de ratón (RHO) y RHO humana. La RP puede ser causada por mutaciones autosómicas recesivas en el gen PDE6A o mutaciones autosómicas dominantes en el gen RHO. Las mutaciones en EFEMP1 son responsables de Malattia Leventinese (ML) autosómica dominante y distrofia retiniana en panal de Doyne (DHRD). Además, los métodos se han aplicado a varios tipos de células, que incluyen, pero no se limitan a, células de la retina de ratón, así como células iPS humanas. Además, los métodos descritos aquí también se han aplicado in vivo mediante el uso de un modelo de ratón de enfermedad ocular. Por tanto, los métodos de la presente descripción se pueden aplicar tanto a animales como a seres humanos.

Además, los métodos de la presente descripción que se han aplicado a un modelo de ratón humanizado para genes específicos, así como a células derivadas de pacientes, permiten determinar la eficiencia y eficacia del ARNsg diseñado y la frecuencia de recombinación específica del sitio en células humanas, que después se pueden usar como guía en un entorno clínico.

En una modalidad, el sistema "ChopStick" comprende los siguientes componentes: dos vectores AAV recombinantes: el primero que porta un polinucleótido que codifica la enzima Cas9 para "Cortar" los genes de rodopsina mutante y/o nativa, y el segundo que porta un nucleótido que codifica el ADNc de rodopsina humana con modificación de codones para "Pegar" la rodopsina normal en el paciente. La secuencia de rodopsina humana con modificación de codones o modificada por ingeniería genética, que está dirigida por el promotor de CBh es resistente a la destrucción por la enzima de edición de genes, rescata el fenotipo del paciente.

En una modalidad, el presente método proporciona al menos un 50 % de niveles de rodopsina a partir del ADNc de RHO con modificación de codones dirigido por el promotor CBh, que son suficientes para mejorar la supervivencia. En otra modalidad, no hay una cantidad excesiva de rodopsina expresada con el uso de la secuencia donante de RHO con modificación de codones.

Para los estudios que utilizan células humanas y derivadas de pacientes, los inventores eligieron el vector AAV2 como vector principal para todas las construcciones, ya que se ha demostrado que AAV2 puede transducir iPS humanas de forma más eficaz que otros vectores AAV (Mitsui K y otros, Biochem Biophys Res Commun. 30 de octubre de 2009;388(4):711-7; Deyle DR y otros, Mol Ther. Enero de 2012;20(1):204-13; y Deyle DR y otros, Nucleic Acids Res. Marzo de 2014;42(5):3119-24). Sin embargo, también se puede usar una variedad de otros vectores AAV para llevar a cabo los métodos de la presente descripción.

El grado de mejora de la enfermedad autosómica dominante mediante los métodos de la presente puede variar. Por ejemplo, los métodos de la presente pueden restaurar aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 40 %, más del 10 %, más del 20 %, más del 30 %, más del 40 %, más del 50 %, más del 60 %, más del 70 %, más del 80 % o más del 90 % de la expresión del gen relacionado con enfermedad autosómica dominante, de los niveles normales del producto génico en un sujeto de control, que puede coincidir en edad y sexo. En ciertas modalidades, la expresión de un gen natural (por ejemplo, rodopsina) se puede observar en aproximadamente 2 semanas después de la administración a un sujeto y/o células. La expresión puede mantenerse durante un período de tiempo ilimitado en células somáticas que no se dividen (por ejemplo, fotorreceptores, células neuronales, células musculares, etc.). En una modalidad, la expresión de rodopsina natural se observa en aproximadamente 3 días, en aproximadamente 1 semana, en aproximadamente 3 semanas, en aproximadamente 1 mes, en aproximadamente 2 meses, de aproximadamente 1 semana a aproximadamente 2 semanas, o en diferentes periodos de tiempo.

De acuerdo con las diversas modalidades de la presente descripción, se puede usar una variedad de construcciones virales conocidas para administrar componentes deseados (Cortar y Pegar) tales como nucleasa de la familia Cas, ARNsg, gen natural con modificación de codones (también denominado como plantilla donante con modificación de codones), plantilla donante, etc. a las células diana y/o a un sujeto. Los ejemplos no limitantes de tales virus recombinantes incluyen virus adenoasociados recombinantes (AAV), adenovirus recombinantes, lentivirus recombinantes, retrovirus recombinantes, poxvirus recombinantes y otros virus conocidos en la técnica, así como plásmidos, cósmidos y fagos. Las opciones para las construcciones virales de administración de genes se conocen bien (ver, por ejemplo, Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, 1989; Kay, M.A. y otros, 2001 Nat. Medic. 7(1):33-40; y Walther W. y Stein U., 2000 Drugs, 60(2): 249-71).

Además, se pueden usar vehículos de administración como sistemas de administración de proteínas o ARNm basados en nanopartículas y lípidos como una alternativa a los vectores AAV. Otros ejemplos de vehículos de administración alternativos incluyen vectores lentivirales, sistema de administración basado en lípidos, pistola de genes, microinyección hidrodinámica, por electroporación o nucleofección y biolística. Varios métodos de suministro de genes se analizan en detalle por Nayerossadat y otros. (Adv Biomed Res. 2012; 1: 27) e Ibraheem y otros. (Int J Pharm. 1 de enero de 2014;459(1-2):70-83).

Los presentes métodos pueden utilizar ingeniería genómica mediada por virus adenoasociado (AAV). Los vectores AAV poseen una amplia gama de huéspedes; transducen células en división y células que no están en división in vitro e in vivo y mantienen altos niveles de expresión de los genes transducidos. Las partículas virales son termoestables, resistentes a disolventes, detergentes, cambios de pH, temperatura y pueden concentrarse en gradientes de CsCl. El AAV no se asocia con ningún evento patogénico, y no se ha encontrado que la transducción con vectores de AAV induzca ningún efecto negativo duradero sobre el crecimiento o la diferenciación celular. A diferencia de otros vectores, como los lentivirales, los AAV carecen de maquinaria de integración y han sido aprobados para uso clínico (Wirth y otros, Gene. 10 de agosto de 2013; 525(2): 162-9).

Los vectores virales AAV de ADN monocatenario tienen altas tasas de transducción en muchos tipos diferentes de células y tejidos. Al entrar en las células huésped, el genoma de AAV se convierte en ADN de doble cadena mediante complejos de ADN polimerasa de la célula huésped y existe como un episoma. En las células hospederas que no se dividen, el genoma episómico de AAV puede persistir y mantener la expresión a largo plazo de un transgén terapéutico. (J Virol. Agosto de 2008; 82(16): 7875-7885).

Los vectores AAV y las partículas virales de la presente descripción se pueden emplear en varios métodos y usos. En una modalidad, un método comprende administrar o transferir una secuencia polinucleotídica heteróloga a un paciente o una célula de un paciente e incluye administrar una partícula viral de AAV, una pluralidad de partículas virales de AAV o una composición farmacéutica de una partícula viral de AAV o una pluralidad de partículas virales de AAV a un paciente o una célula del paciente, para suministrar o transferir así una secuencia polinucleotídica heteróloga al paciente o célula del paciente.

En otra modalidad, el método es para tratar a un paciente con deficiencia o necesidad de la expresión o función de una proteína, o con necesidad de una reducción de la expresión o función de una proteína endógena (por ejemplo, una proteína indeseable, aberrante o disfuncional), que incluye proporcionar una partícula viral de AAV recombinante, una pluralidad de partículas virales de AAV recombinantes, o una composición farmacéutica de una partícula viral de AAV recombinante o una pluralidad de partículas virales de AAV; y administrar la partícula viral de AAV recombinante, una pluralidad de partículas virales de AAV recombinantes o una composición farmacéutica de la partícula viral de AAV o una pluralidad de partículas virales de AV al paciente, donde la secuencia polinucleotídica heteróloga se expresa en el paciente, o en donde la secuencia polinucleotídica heteróloga codifica uno o más ARNsg que reducen o eliminan un segmento de ADN endógeno (por ejemplo, un segmento de ADN indeseable, aberrante o disfuncional) en el paciente, y donde la secuencia polinucleotídica heteróloga codifica un gen con modificación de codones o, fragmento de este, que no es reconocible por uno o más ARNsg utilizados para reducir y/o eliminar el segmento de ADN endógeno.

La caracterización de nuevos serotipos de AAV ha revelado que tienen diferentes patrones de transducción en diversos tejidos. Con fines ilustrativos, se usaron AAV2 y AAV8 en los Ejemplos de la presente descripción; sin embargo, para los propósitos de la presente invención, los vectores virales de AAV pueden seleccionarse entre cualquier serotipo de AAV, que incluyen, sin limitación, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 u otros serotipos de AAV conocidos y desconocidos.

El término AAV cubre todos los subtipos, serotipos y pseudotipos, y formas tanto naturales como recombinantes, excepto cuando se requiera lo contrario. El AAV pseudotipado se refiere a un AAV que contiene proteínas de la cápside de un serotipo y un genoma viral de un segundo serotipo.

Para minimizar la intensidad y duración de la expresión de Cas9 y los posibles efectos por acción fuera de la diana, también se han generado vectores de AAV-Cas9 de autoescisión, que tienen la capacidad de inactivar de manera autónoma la expresión de Cas9 poco después de la producción de Cas9. Este enfoque comprende flanquear el gen Cas9 con dos sitios diana de ARNsg-Y1 (similares a los sitios loxP en el sistema de recombinasa Cre) para terminar la propia expresión de Cas9 (como se muestra en la Figura 9). Se prevé que la cantidad de enzima Cas9 presente (antes de que se termine a sí misma) es suficiente para cortar el locus deseado (como el locus Rho o PDE6A, por ejemplo).

El diseño de vectores AAV recombinantes auto-inactivantes (ver Figura 9) permite a los inventores controlar la cantidad y duración de la expresión de Cas9 en las células diana y puede prevenir los efectos no deseados fuera de la diana debido a la expresión excesiva de la proteína Cas9.

Los vectores de la presente descripción pueden comprender cualquiera de varios promotores conocidos en la técnica, en los que el promotor es constitutivo, regulable o inducible, específico del tipo celular, específico de tejido o específico de la especie. Además de la secuencia suficiente para dirigir la transcripción, una secuencia promotora de la invención también puede incluir secuencias de otros elementos reguladores que están implicados en la modulación de la transcripción (por ejemplo, potenciadores, secuencias kozak e intrones). Muchas secuencias promotoras/reguladoras útiles para dirigir la expresión constitutiva de un gen están disponibles en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, CMV (promotor del citomegalovirus), EFla (promotor del factor de elongación humano 1 alfa), SV40 (promotor del virus vacuolizante de simios 40), PGK (promotor de fosfoglicerato quinasa de mamífero), Ubc (promotor de ubiquitina C humana), promotor de beta-actina humana, promotor de betaactina de roedor, CBh (promotor de beta-actina de pollo), CAG (el promotor híbrido que contiene un potenciador de CMV, promotor de beta-actina de pollo y aceptor de empalme de beta-globina de conejo), TRE (promotor del elemento de respuesta a tetraciclina), H1 (promotor de ARN polimerasa III humana), U6 (promotor nuclear pequeño U6 humano) y similares. Además, la expresión inducible y específica de tejido de un ARN, proteínas transmembrana u otras proteínas se puede lograr colocando el ácido nucleico que codifica dicha molécula bajo el control de una secuencia promotora/reguladora inducible o específica de tejido. Ejemplos de secuencias promotoras/reguladoras inducibles o específicas de tejido que son útiles para este propósito incluyen, pero no se limitan a, el promotor de rodopsina, el promotor inducible de LTR MMTV, el potenciador/promotor de SV40 tardío, el promotor de sinapsina 1, el promotor de hepatocitos ET, promotor de g S glutamina sintasa y muchos otros. En http://www.invivogen.com/prom-a-list se pueden encontrar varios promotores ubicuos y específicos de tejido disponibles en el mercado. Además, los promotores que se conocen bien en la técnica que pueden inducirse en respuesta a agentes inductores tales como metales, glucocorticoides, tetraciclina, hormonas y similares, también se contemplan para su uso con la invención. Por tanto, se apreciará que la presente descripción incluye el uso de cualquier secuencia promotora/reguladora conocida en la técnica que pueda dirigir la expresión de la proteína deseada unida operativamente a ella.

Los vectores de acuerdo con la presente descripción se pueden transformar, transfectar o introducir de otro modo en una amplia variedad de células huésped. La transfección se refiere a la captación de un vector por una célula huésped, con expresión o no de secuencias codificantes. El experto en la materia conoce numerosos métodos de transfección, por ejemplo, lipofectamina, coprecipitación con fosfato cálcico, electroporación, tratamiento con DEAE-dextrano, microinyección, infección viral y otros métodos conocidos en la técnica. La transducción se refiere a la entrada de un virus en la célula y la expresión (por ejemplo, transcripción y/o traducción) de secuencias suministradas por el genoma del vector viral. En el caso de un vector recombinante, la "transducción" generalmente se refiere a la entrada del vector viral recombinante en la célula y la expresión de un ácido nucleico de interés suministrado por el genoma del vector.

El método para tratar una enfermedad ocular autosómica dominante en un paciente puede comprender administrar al paciente una concentración eficaz de una composición que comprende cualquiera de los AAV recombinantes descritos en este documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una modalidad, una concentración eficaz de virus es 1X106 - 11X1013 GC/ml (copias del genoma/ml). El intervalo de concentración viral eficaz para el tratamiento puede variar según factores que incluyen, pero no se limitan a, una mutación específica, la edad del paciente y otros parámetros clínicos.

El vector o los vectores recombinantes de AAV que codifican componentes de CRISPR-Cas y/o una plantilla donante con modificación de codones que comprende un gen o fragmento relacionado con enfermedad autosómica dominante pueden producirse in vitro, antes de la administración a un paciente. La producción de vectores AAV recombinantes y su uso en la administración in vitro e in vivo se ha analizado en detalle por Gray y otros. (Curr. Protoc. Neurosci. Octubre de 2011, Capítulo: Unidad 4.17).

El AAV recombinante que contiene el ADN recombinante deseado se puede formular en una composición farmacéutica destinada a inyección subretiniana o intravítrea. Dicha formulación implica el uso de un vehículo o portador farmacéutica y/o fisiológicamente aceptable, particularmente uno adecuado para la administración en el ojo, por ejemplo, mediante inyección subretiniana, como solución salina tamponada u otros tampones, por ejemplo, HEPES, para mantener el pH a niveles fisiológicos adecuados y, opcionalmente, otros agentes medicinales, agentes farmacéuticos, agentes estabilizantes, tampones, vehículos, adyuvantes, diluyentes, etc. Para una inyección, el vehículo será típicamente un líquido. Los vehículos fisiológicamente aceptables ilustrativos incluyen agua estéril sin pirógenos y solución salina tamponada con fosfato estéril y sin pirógenos.

En una modalidad, el vehículo es una solución isotónica de cloruro de sodio. En otra modalidad, el vehículo es una solución salina equilibrada. En una modalidad, el vehículo incluye Tween. Si el virus se va a almacenar a largo plazo, puede congelarse en presencia de glicerol o Tween-20. En otra modalidad, el vehículo farmacéuticamente aceptable comprende un tensioactivo, tal como perfluorooctano (Perfluoron líquido). En determinadas modalidades, la composición farmacéutica descrita anteriormente se administra al sujeto mediante inyección subretiniana. En otras modalidades, la composición farmacéutica se administra mediante inyección intravítrea. Otras formas de administración que pueden ser útiles en los métodos descritos en este documento incluyen, pero no se limitan a, administración directa a un órgano deseado (por ejemplo, el ojo), oral, inhalatoria, intranasal, intratraqueal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica, y otras vías de administración parentales. Además, las vías de administración se pueden combinar, si se desea.

En modalidades preferidas, la vía de administración es inyección subretiniana o inyección intravítrea.

Los métodos para la modificación del ADN genómico se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, los métodos pueden utilizar un agente de digestión de ADN para modificar el ADN mediante la vía de reparación del ADN por unión de extremos no homólogos (NHEJ) o la vía de reparación dirigida por homología (HDR). El término "agente de digestión de ADN" se refiere a un agente que puede escindir enlaces (es decir, enlaces fosfodiéster) entre las subunidades de nucleótidos de los ácidos nucleicos.

En una modalidad, el agente de digestión de ADN es una nucleasa. Las nucleasas son enzimas que hidrolizan los ácidos nucleicos. Las nucleasas se pueden clasificar como endonucleasas o exonucleasas. Una endonucleasa es cualquiera de un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces entre ácidos nucleicos en el interior de una molécula de ADN o ARN. Una exonucleasa es cualquiera de un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis de nucleótidos individuales desde el final de una cadena de ADN o ARN. Las nucleasas también se pueden clasificar sobre la base de si digieren específicamente ADN o ARN. Una nucleasa que cataliza específicamente la hidrólisis de ADN puede denominarse desoxirribonucleasa o ADNasa, mientras que una nucleasa que cataliza específicamente la hidrólisis de ARN puede denominarse ribonucleasa o ARNasa. Algunas nucleasas son específicas de secuencias de ácido nucleico monocatenario o bicatenario. Algunas enzimas tienen propiedades tanto de exonucleasa como de endonucleasa. Además, algunas enzimas pueden digerir secuencias de AdN y ARN.

Los ejemplos no limitantes de las endonucleasas incluyen una nucleasa de dedo de zinc (ZFN), un dímero de ZFN, una ZFNickasa, una nucleasa efectora del tipo activador de la transcripción (TALEN) o una endonucleasa de ADN guiada por ARN (por ejemplo, CRISPR/Cas9). Las meganucleasas son endonucleasas caracterizadas por su capacidad para reconocer y cortar secuencias de ADN grandes (12 pares de bases o más). Se puede usar cualquier meganucleasa adecuada en los métodos de la presente para crear roturas de la doble cadena en el genoma del huésped, incluidas las endonucleasas de la familia LAGLIDADG y PI-Sce.

Un ejemplo de un sistema de nucleasa de secuencia específica que puede usarse con los métodos y composiciones descritos en este documento incluye el sistema CRISpR (Wiedenheft, B. y otros, Nature 482, 331-338 (2012); Jinek, M. y otros, Science 337, 816-821 (2012); Malí, P. y otros, Science 339, 823-826 (2013); Cong, L. y otros, Science 339, 819-823 (2013)). El sistema CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas) aprovecha la unión al ADN guiada por ARN y la escisión específica de secuencia del ADN diana. La combinación de RNA guía/Cas confiere especificidad de sitio a la nucleasa. Un solo ARN guía (ARNsg) contiene aproximadamente 20 nucleótidos que son complementarios a una secuencia de ADN genómico diana hacia el extremo 5' de un sitio PAM genómico (motivos adyacentes a protoespaciador) (NGG) y una región estructural de ARN constante. La proteína Cas (asociada a CRISPR) se une al ARNsg y al ADN diana al que se une el ARNsg e introduce una ruptura de la doble cadena en una ubicación definida hacia el extremo 5' del sitio PAM. Cas9 alberga dos dominios nucleasa independientes homólogos a las endonucleasas HNH y RuvC, y al mutar cualquiera de los dos dominios, la proteína Cas9 se puede convertir en una nickasa que introduce roturas de una sola cadena (Cong, L. y otros, Science 339, 819-823 (2013)). Se contempla específicamente que los métodos y composiciones de la presente descripción se pueden usar con la versión de Cas9 con inducción de cadena simple o doble, así como con otras ADN nucleasas guiadas por ARN, tales como otros sistemas bacterianos similares a Cas9. La nucleasa específica de secuencia de los presentes métodos y composiciones descritas en el presente documento puede estar modificada por ingeniería genética, ser quimérica o puede aislarse de un organismo. La nucleasa se puede introducir en la célula en forma de ADN, ARNm y proteína.

En una modalidad, los métodos de la presente descripción comprenden el uso de uno o más ARNsg para "cortar", eliminar o suprimir un gen relacionado con enfermedad autosómica dominante. En otra modalidad, se usa uno o más ARNsg para "cortar", eliminar o suprimir un gen relacionado con enfermedad autosómica dominante. En otra modalidad adicional, se utilizan dos o más ARNsg para "cortar", eliminar o suprimir un gen relacionado con enfermedad autosómica dominante.

En una modalidad, el agente de digestión de ADN puede ser una nucleasa específica de sitio. En otra modalidad, la nucleasa específica de sitio puede ser una nucleasa de la familia Cas. En una modalidad más específica, la nucleasa Cas puede ser una nucleasa Cas9.

En una modalidad, la proteína Cas puede ser un derivado funcional de una proteína Cas de origen natural.

Además del sistema CRISPR-Cas bien caracterizado, recientemente se ha descrito una nueva enzima CRISPR, llamada Cpf1 (proteína Cas 1 del subtipo PreFran) (Zetsche y otros, Cell. pii: S0092-8674 (15) 01200-3. doi: 10.1016/j.cell.2015.09.038 (2015)). Cpf1 es una endonucleasa guiada por un aRn simple que carece de ARNtracr y utiliza un motivo adyacente a un protoespaciador rico en T. Los autores demostraron que Cpf1 media una fuerte interferencia del ADN con características distintas de las de Cas9. Por tanto, en una modalidad de la presente invención, el sistema CRISPR-Cpfl puede usarse para escindir una región deseada dentro del gen diana.

En una modalidad adicional, el agente de digestión de ADN es una nucleasa efectora del tipo activador de la transcripción (TALEN). Las TALEN están compuestas por un dominio efector TAL que se une a una secuencia de nucleótidos específica y un dominio de endonucleasa que cataliza una ruptura de la doble cadena en el sitio diana (publicación de patente PCT núm. WO2011072246; Miller y otros, Nat. Biotechnol. 29, 143-148 (2011); Cermak y otros, Nucleic Acid Res. 39, e82 (2011)). Las endonucleasas específicas de secuencia pueden ser de naturaleza modular y la especificidad de unión al ADN se obtiene al disponer de uno o más módulos. Bibikova y otros, Mol. Cell. Biol. 21, 289-297 (2001). Boch y otros, Science 326, 1509-1512 (2009).

Las ZFN pueden estar compuestas por dos o más (por ejemplo, 2 -8, 3 -6, 6 - 8 o más) dominios de unión al ADN específicos de la secuencia (por ejemplo, dominios de dedos de zinc) fusionados a un dominio efector de endonucleasa (por ejemplo, la endonucleasa FokI). Porteus y otros, Nat. Biotechnol. 23, 967-973 (2005). Kim y otros, (2007) Hybrid restriction enzymes: Zinc finger fusions to Fok I cleavage domain, Proceedings of the National Academy of Sciences of USA, 93: 1156-1160. Patente de Estados Unidos núm. 6,824,978. Publicaciones PCT núms. WO1995/09233 y WO1994018313.

En una modalidad, el agente de digestión de ADN es una nucleasa específica de un sitio del grupo o seleccionada del grupo que consiste en omega, dedo de zinc, TALE y CRISPR/Cas.

La endonucleasa específica de secuencia de los métodos y composiciones descritos aquí puede estar modificada, ser quimérica o aislarse de un organismo. Las endonucleasas se pueden modificar por ingeniería genética para reconocer una secuencia de ADN específica, por ejemplo, mediante mutagénesis. Seligman y otros, (2002) Mutations altering the cleavage specificity of a homing endonuclease, Nucleic Acids Research 30: 3870-3879. El ensamblaje combinatorio es un método en el que las subunidades de proteínas forman diferentes enzimas que pueden asociarse o fusionarse. Arnould y otros, (2006) Engineering of large numbers of highly specific homing endonucleases that induce recombination to novel DNA targets, Journal of Molecular Biology 355: 443-458. En determinadas modalidades, estos dos enfoques, mutagénesis y ensamblaje combinatorio, pueden combinarse para producir una endonucleasa modificada con la secuencia de reconocimiento de ADN deseada.

La nucleasa específica de secuencia se puede introducir en la célula en forma de proteína o en forma de ácido nucleico que codifica la nucleasa específica de secuencia, tal como un ARNm o un ADNc. Los ácidos nucleicos se pueden administrar como parte de una construcción más grande, como un plásmido o un vector viral, o directamente, por ejemplo, mediante electroporación, vesículas lipídicas, transportadores virales, microinyección y biolística. De manera similar, la construcción que contiene el o los transgenes puede administrarse mediante cualquier método apropiado para introducir ácidos nucleicos en una célula.

Los ARN guía simples que se usan en los métodos de la presente descripción pueden diseñarse de modo que dirijan la unión de los complejos Cas-ARNsg a sitios de escisión predeterminados en un genoma. En una modalidad, los sitios de escisión pueden elegirse para liberar un fragmento o secuencia que contenga una región del gen relacionado con enfermedad autosómica dominante. En una modalidad adicional, los sitios de escisión se pueden elegir para liberar un fragmento o secuencia que contenga una región de RHO.

Para que la enzima de la familia Cas (como Cas9) se una con éxito al ADN, la secuencia diana en el ADN genómico debe ser complementaria a la secuencia de ARNsg y debe seguirle inmediatamente el motivo adyacente del protoespaciador correcto o secuencia "PAM". "Complementariedad" se refiere a la capacidad de un ácido nucleico para formar enlace(s) de hidrógeno con otra secuencia de ácido nucleico mediante Watson-Crick tradicional u otros tipos no tradicionales. Un por ciento de complementariedad indica el porcentaje de residuos en una molécula de ácido nucleico, que pueden formar enlaces de hidrógeno (por ejemplo, apareamiento de bases Watson-Crick) con una segunda secuencia de ácido nucleico. No se requiere necesariamente una completa complementariedad, siempre que haya suficiente complementariedad para provocar la hibridación y promover la formación de un complejo CrISPR. Una secuencia diana puede comprender cualquier polinucleótido, como polinucleótidos de ADN o ARN. La proteína Cas9 puede tolerar errores de apareamiento distales del PAM, sin embargo, los errores de apareamiento dentro de los 12 pares de bases (pbs) de la secuencia junto a la secuencia PAM pueden disminuir drásticamente la eficacia de la transformación. La secuencia PAM está presente en la secuencia de ADN diana, pero no en la secuencia de ARNsg. Cas9 se unirá a cualquier secuencia de ADN con la secuencia diana correcta seguida de la secuencia PAM. La secuencia PAM varía según la especie de bacteria de la que se derivó Cas9. El sistema CRISPR más utilizado se deriva de S. pyogenes y la secuencia PAM es NGG ubicada en el extremo 3' inmediato de la secuencia de reconocimiento de ARNsg. Las secuencias PAM de los sistemas CRISPR de especies bacterianas ilustrativas incluyen: Streptococcus pyogenes (NGG), Neisseria meningitidis (NNNNGATT), Streptococcus thermophilus (NNAGAA) y Treponema denticola (NAAAAC).

Los ARNsg usados en la presente descripción pueden tener entre aproximadamente 5 y 100 nucleótidos de longitud, o más (por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 5960, 61, 62, 63, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 nucleótidos de longitud o más). En una modalidad, el (los) ARNsg puede(n) tener entre aproximadamente 15 y aproximadamente 30 nucleótidos de longitud (por ejemplo, aproximadamente 15-29, 15-26, 15-25; 16-30, 16-29, 16-26, 16-25; o aproximadamente 18-30, 18-29, 18-26 o 18-25 nucleótidos de longitud). Para facilitar el diseño de ARNsg, se han desarrollado muchas herramientas computacionales (Ver Prykhozhij y otros. (PLoS ONE, 10(3): (2015)); Zhu y otros. (PLoS ONE, 9(9) (2014)); Xiao y otros. (Bioinformatics. 21 de enero de 2014)); Heigwer y otros. (Nat Methods, 11(2): 122-123 (2014)). Los métodos y herramientas para el diseño de ARN guía son analizados por Zhu (Frontiers in Biology, 10 (4) pp 289-296 (2015)). Además, existe una herramienta informática disponible públicamente que se puede utilizar para facilitar el diseño de los ARNsg (http://www.genscript.com/gRNA-design-tool.html).

Una secuencia modificada de un gen o fragmento relacionado con enfermedad autosómica dominante es una secuencia donante que tiene modificación de codones para que sea irreconocible por el (los) ARNsg utilizado(s) para la transformación o el reconocimiento del gen mutado relacionado con enfermedad autosómica dominante y resistente al direccionamiento del ARNsg. Tal secuencia génica modificada relacionada con enfermedad autosómica dominante es una secuencia donante que codifica al menos un fragmento funcional de la proteína que está ausente o es deficiente en el sujeto con enfermedad autosómica dominante.

Como se mencionó anteriormente, el ADNc con modificación de codones (plantilla donante) se puede modificar de tal manera que lo haga irreconocible por el (los) ARNsg utilizado(s) para transformar genes relacionados con la enfermedad mutantes y naturales. Para lograr esto, las mutaciones deben introducirse en un gen o fragmento de la plantilla donante para hacer que el gen o el fragmento de la plantilla donante sea irreconocible por el (los) ARNsg y, en consecuencia, resistente a la degradación por la enzima Cas (como la nucleasa Cas9) que se ha introducido en las células. El gen de la plantilla donante se puede modificar mediante la introducción de una base o bases oscilantes en la plantilla donante. La introducción de base(s) oscilante(s) en el ADN da como resultado una mutación silenciosa, dejando intacto el producto de expresión del gen natural, pero si la secuencia de nucleótidos se ha cambiado lo suficiente, hará que la secuencia de la plantilla donante sea irreconocible por el (los) ARNsg utilizado(s) para transformar el (los) gen(es) relacionado(s) con la enfermedad mutante y natural, en última instancia resistente a la escisión de la nucleasa Cas. El número de bases oscilantes que deben introducirse en una plantilla donante puede variar, pero debe ser suficiente para evitar la hibridación de ARNg y la formación de un complejo CRISPR. En una modalidad, la secuencia de la plantilla donante puede administrarse mediante el uso del mismo sistema de transferencia de genes que se usó para administrar la nucleasa Cas (incluida en el mismo vector) o puede administrarse mediante el uso de un sistema de administración diferente. En otra modalidad, la secuencia de la plantilla donante puede administrarse mediante el uso del mismo sistema de transferencia que se usa para administrar el (los) ARNsg. En modalidades específicas, el donante se administra mediante el uso de un vector viral (por ejemplo, AAV).

En una modalidad, la presente descripción comprende la integración de la secuencia del gen relacionado con enfermedad autosómica dominante, con modificación de codones, (secuencia de la plantilla donante) en el gen endógeno relacionado con la enfermedad autosómica.

En otra modalidad, la secuencia donante o la secuencia génica relacionada con enfermedad dominante autosómica modificada se integra en el gen endógeno mediante recombinación homóloga (HR).

En modalidades adicionales, la secuencia donante o secuencia génica relacionada con enfermedad dominante autosómica modificada está flanqueada por un brazo de homología hacia el extremo 5' y hacia el extremo 3'. Los brazos de homología, que flanquean la secuencia donante o la secuencia génica modificada relacionada con enfermedad autosómica dominante, corresponden a regiones dentro del locus diana del gen relacionado con enfermedad autosómica dominante. Por ejemplo, las regiones correspondientes dentro del locus objetivo se denominan en el presente documento "sitios diana". Por tanto, en un ejemplo, un vector que porta una secuencia génica donante o modificada relacionada con enfermedad autosómica dominante puede comprender una secuencia génica donante o modificada relacionada con enfermedad autosómica dominante flanqueada por un primer y un segundo brazo de homología.

Un brazo de homología del vector que porta una secuencia génica relacionada con enfermedad autosómica dominante donante o modificada puede tener cualquier longitud que sea suficiente para promover un evento de recombinación homóloga con un sitio diana correspondiente, que incluye, por ejemplo, 50-100 pares de bases, 100 -1000 pares de bases o al menos 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 5-35, 5-40, 5-45, 5-50, 5-55, 5-60, 5-65, 5-70, 5-75, 5 80, 5-85, 5-90, 5-95, 5-100, 100-200 o 200-300 pares de bases de longitud o más.

En una modalidad, la plantilla donante se administra como un ADN de doble cadena. En tales circunstancias, el brazo homólogo puede comprender de 15 a 4000 pares de bases de cada brazo. En otras modalidades, la plantilla donante se administra como un formato de ADN monocatenario. En tales circunstancias, el brazo homólogo puede comprender 8-1000 pbs de cada brazo.

Un brazo de homología y un sitio diana se "corresponden" o son "correspondientes" entre sí cuando las dos regiones comparten un nivel suficiente de identidad de secuencia entre sí para actuar como sustratos para una reacción de recombinación homóloga. Por "homología" se entiende secuencias de ADN que son idénticas o comparten identidad de secuencia con una secuencia correspondiente. La identidad de secuencia entre un sitio diana dado y el brazo de homología correspondiente que se encuentra en el vector que porta una secuencia génica donante o modificada relacionada con enfermedad autosómica dominante puede ser cualquier grado de identidad de secuencia que permita que se produzca la recombinación homóloga. Por ejemplo, la cantidad de identidad de secuencia compartida por el brazo de homología del vector que porta una secuencia génica donante o modificada relacionada con enfermedad autosómica dominante (o un fragmento de esta) y el sitio diana (o un fragmento de este) debe ser 100% de identidad de secuencia, excepto la región con modificación de codones, de modo que las secuencias experimentan recombinación homóloga. Puede tolerarse una identidad de secuencia inferior al 100 %, siempre que la enzima Cas (Cas 9) corte solo el ADN del paciente y no la plantilla donante o el ADN del paciente que se repara/reemplaza por la plantilla donante.

Alternativamente, la plantilla donante (ya sea con modificación de codones o no) de un gen de interés o fragmento no se integra en el gen endógeno relacionado con la enfermedad. La plantilla donante puede empaquetarse en un vector extracromosómico o episómico (como un vector AAV), que persiste en el núcleo en un estado extracromosómico y ofrece el suministro y expresión de la plantilla donante sin integración en el genoma del huésped. El uso de tecnologías de vectores de genes extracromosómicos se ha analizado en detalle por Wade-Martins R (Methods Mol Biol. 2011; 738: 1-17).

Las nucleasas, polinucleótidos que codifican estas nucleasas, polinucleótidos donantes y composiciones que comprenden las proteínas y/o polinucleótidos descritos en la presente descripción pueden suministrarse mediante cualquier medio adecuado. En determinadas modalidades, las nucleasas y/o los donantes se suministran in vivo. En otras modalidades, las nucleasas y/o los donantes se suministran a células aisladas (por ejemplo, células iPS autólogas) para la provisión de células modificadas útiles en la administración in vivo a pacientes afectados por una enfermedad ocular autosómica dominante.

Como alternativa a la inyección de partículas virales que codifican componentes CRISPR descritos en la presente descripción (incluidos ARNsg, secuencias del gen o fragmento de la plantilla donante con modificación de codones y nucleasa de la familia Cas), el tratamiento de reemplazo celular puede usarse para prevenir, corregir o tratar enfermedades, donde los métodos de la presente descripción se aplican a células aisladas del paciente (ex vivo), a lo que le sigue después la inyección de células "corregidas" de nuevo en el paciente.

Para el tratamiento de enfermedades oculares, las células iPS del paciente pueden aislarse y diferenciarse en células del RPE del epitelio pigmentario de la retina ex vivo. Las células del RPE caracterizadas por la mutación en un gen relacionado con enfermedad autosómica dominante pueden manipularse mediante el uso de los métodos de la presente descripción de una manera que dé como resultado la deleción del gen relacionado con enfermedad autosómica dominante y la expresión de un gen relacionado con enfermedad autosómica dominante corregido. Por tanto, la presente descripción proporciona métodos para corregir la enfermedad ocular autosómica dominante en un sujeto, en donde el método da como resultado la recuperación funcional del gen relacionado con la enfermedad ocular autosómica dominante, que comprende administrar al sujeto una cantidad con eficacia terapéutica de células del epitelio pigmentario retiniano RPE diferenciadas autólogas que expresan un gen corregido relacionado con la enfermedad ocular autosómica dominante. La administración de las preparaciones farmacéuticas que comprenden células del RPE autólogas que expresan un gen corregido relacionado con la enfermedad ocular autosómica dominante puede ser eficaz para reducir la gravedad de los síntomas y/o prevenir un deterioro adicional en la afección del paciente. Tal administración puede ser eficaz para restaurar completamente cualquier pérdida de visión u otros síntomas.

Por ejemplo, las células de fibroblastos del paciente pueden obtenerse de la biopsia de piel y transformarse en células iPS. Dimos JT y otros, (2008) Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science 321: 1218-1221, Nature Reviews Neurology 4, 582-583 (noviembre de 2008). Luo y otros, Generation of induced pluripotent stem cells from skin fibroblasts of a patient with olivopontocerebellar atrophy, Tohoku J. Exp. Med. 2012, 226(2): 151-9. La corrección mediada por CRISPR se puede realizar en esta etapa. El clon celular corregido se puede cribar y seleccionar mediante un ensayo RFLP. A continuación, el clon de células corregidas se diferencia en células del RPE y se analizan sus marcadores específicos de RPE (Bestrofina1, RPE65, proteína de unión al retinaldehído celular y MFRP). Las células del RPE bien diferenciadas se pueden trasplantar de forma autóloga al paciente donante.

Las células del RPE autólogas bien diferenciadas descritas en la presente descripción pueden formularse con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, las células del RPE autólogas se pueden administrar solas o como un componente de una formulación farmacéutica. Las células del RPE autólogas de la presente descripción se pueden administrar en combinación con una o más soluciones acuosas o no acuosas isotónicas estériles farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, solución salina equilibrada (BSS)), dispersiones, suspensiones o emulsiones, o polvos estériles que pueden reconstituirse en soluciones o dispersiones inyectables estériles justo antes de su uso, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos, solutos o agentes de suspensión o espesantes.

Las células del RPE autólogas de la presente descripción pueden suministrarse en una formulación oftálmica farmacéuticamente aceptable mediante inyección intraocular. Las concentraciones para inyecciones pueden ser de cualquier cantidad que sea eficaz y no sea tóxica. Las preparaciones farmacéuticas de células del RPE autólogas de la presente descripción para el tratamiento de un paciente se pueden formular en dosis de al menos aproximadamente 104 células/ml. Las preparaciones de células del RPE para el tratamiento de un paciente se pueden formular en dosis de al menos aproximadamente 103, 104, 105, 106 l07’ 108, 109, o 1010 células del RPE/ml. Los sujetos, que pueden tratarse de acuerdo con la presente invención, incluyen todos los animales que pueden beneficiarse de la presente invención. Dichos sujetos incluyen mamíferos, preferiblemente humanos (bebés, niños, adolescentes y/o adultos), pero también pueden ser animales como perros y gatos, animales de granja como vacas, cerdos, ovejas, caballos, cabras y similares, y animales de laboratorio (por ejemplo, ratas, ratones, cobayas y similares).

Ejemplos

Ensayo Surveyor

El ensayo de detección de mutaciones Surveyor proporciona un método simple y robusto para detectar mutaciones y polimorfismos en una mezcla de ADN. El componente clave del kit es la nucleasa Surveyor, un miembro de la familia CEL de nucleasas específicas de errores de apareamiento derivadas del apio. La nucleasa Surveyor reconoce y escinde los errores de apareamiento debido a la presencia de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) o pequeñas inserciones o deleciones.

La nucleasa Surveyor escinde con alta especificidad en el lado 3' de cualquier sitio con error de apareamiento en ambas cadenas de ADN, incluidas todas las sustituciones de bases e inserciones/deleciones de hasta al menos 12 nucleótidos. La tecnología de nucleasa Surveyor implica cuatro etapas: (i) PCR para amplificar el ADN diana de las muestras de células o tejido sometidas a escisión mediada por nucleasa Cas9 (aquí esperamos ver un patrón no homogéneo o en mosaico del tratamiento con nucleasa en las células, en algunas células se realizó el corte, en otras no); (ii) hibridación para formar heterohíbridos entre el ADN afectado y el no afectado (debido a que la secuencia de ADN afectada será diferente de la afectada, se puede formar una estructura abultada resultante del error de apareamiento después de la desnaturalización y renaturalización); (iii) tratamiento del ADN hibridado con nucleasa Surveyor para escindir los heterohíbridos (cortar los abultamientos); y (iv) análisis de los productos de ADN digeridos mediante el uso de la plataforma de detección/separación de elección, por ejemplo, electroforesis en gel de agarosa. La eficacia de la escisión mediada por nucleasa Cas9 se puede estimar mediante la proporción de ADN digerido con nucleasa Surveyor con respecto al ADN no digerido. La tecnología es muy sensible y detecta mutantes raros presentes en tan solo 1 de cada 32 copias. Los kits de ensayo de mutaciones Surveyor están disponibles comercialmente en Integrated DNA Technologies (IDT), Coraville, IA.

Análisis de RFLP

El análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) es una técnica que los expertos en la técnica conocen bien. RFLP se basa en las variaciones en secuencias de ADN homólogas. La técnica básica para detectar RFLP implica la fragmentación de una muestra de ADN mediante una enzima de restricción, que puede reconocer y cortar el ADN dondequiera que ocurra una secuencia corta específica, en un proceso conocido como digestión de restricción. Los fragmentos de ADN resultantes se separan después por longitud en una electroforesis en gel de agarosa para su análisis. Para la detección de la sustitución de la plantilla donante (también conocida como corrección génica), se introducen uno o varios tipos de sitios de enzimas de restricción adicionales en la plantilla donante mediante modificación de codones, sin afectar la longitud total. Después de usar PCR para amplificar la secuencia de ADN diana de muestras de tejido, el amplicón de PCR puede ser evaluado por la(s) enzima(s) de restricción mencionada(s) anteriormente para la detección de las muestras que se sometieron a corrección génica.

Los siguientes ejemplos de aspectos específicos para llevar a cabo la presente invención se ofrecen únicamente con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente invención de ninguna manera.

Ejemplo 1

Evaluación de la estrategia de tratamiento génico con AAV ChopStick

El presente ejemplo describe la estrategia detrás del tratamiento génico con AAV ChopStick. El enfoque se basa en el uso de una enzima de edición de genes con una o más secuencias únicas de ARN guía simple (ARNsg) que se dirigen a las formas mutante y natural de rodopsina para su destrucción. A esta etapa inicial les sigue después el suministro a las células de un ADNc de rodopsina con modificación de codones naturales. Una ventaja significativa de este sistema es que el ADNc de rodopsina con modificación de codones no es reconocible por el (los) ARNsg y, por tanto, es resistente a la escisión por la nucleasa.

Como se muestra en la Figura 1, el sistema "ChopStick" descrito aquí está empaquetado en dos vectores AAV recombinantes (Fig. 1A). El primer vector porta la secuencia polinucleotídica que codifica la enzima Cas9 (SEQ ID NO: 17), que puede "cortar" los genes de rodopsina mutante y nativo, mientras que el segundo vector contiene un polinucleótido que codifica la rodopsina humana con modificación de codones para "pegar" la rodopsina normal de nuevo en el paciente. La secuencia de rodopsina humana con modificación de codones, que en este ejemplo está dirigida por el promotor de CBh (SEQ ID NO: 10), es resistente a la destrucción por la enzima de edición de genes (Cas9 en este caso) y permite el rescate del fenotipo del paciente. Además de portar una secuencia de rodopsina humana con modificación de codones, el segundo vector porta dos ARN guías simples (ARNsg1 y ARNsg2) que actúan como una guía para definir el sitio diana para introducir la ruptura de la doble cadena del ADN y, por lo tanto, actúa como dispositivo guía para dirigir la nucleasa Cas9. Cada par de vectores AAV recombinantes se puede utilizar para dirigirse a genes de rodopsina. La secuencia con modificación de codones se muestra en la Figura 1B sección II. Cada sitio de direccionamiento de ARNsg comprende cuatro errores de apareamiento que están subrayados.

AAV tiene una capacidad de empaque de 4,5~4,9 Kb. Dado que la secuencia codificante de spCas9 es ~ 4,2 Kb y las dos repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV es ~ 0,3 Kb, hay aproximadamente 0,4 Kb de espacio para el promotor y la señal de terminación de poli-adenina. Los inventores de la presente descripción utilizaron un promotor de CMV corto de 173 pb y una señal de poli-adenina sintética de 50 pb para construir el vector AAV de Cas. La secuencia detallada se enumera y todos los componentes del vector AAV recombinante se muestran a continuación: Subrayado y negrita: ITR (SEQ ID NO: 13); Subrayado: promotor corto de CMV; Negrita: etiqueta Flag (SEQ ID NO: 15) y NLS de SV40 (SEQ ID NO: 16); MAYÚSCULAS: CDS de spCas9 (SEQ ID NO: 17); Enmarcado: sitio de poli A sintético

(SPA)ggccttaattaggctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgt ggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttccttgtagttaatgattaacccgcc; ctacttatctacgtagccatgctctaggaagatccactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggc aaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaataaccccgccccgttgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctataü cagagctcgtttagtgaaccgtgctagcatggactataaggaccacgacggagactacaaggatcatgatattgattacaaaga< tgacgataagatggccccaaagaagaagcggaaggtcggt ATCC AC GG AGT C CC AGC AGC C G AC A AG GTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACC ACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGC AGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAAACAGCCí GGCCACCCGGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAGAACCC ATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGC1 CTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAGCACGAGCGt ACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCAC ATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGG 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En este ejemplo, los inventores ensayaron a continuación la estrategia de RHO por CRISPR descrita anteriormente en la línea celular de riñón embrionario humano (HEK293FT). Se transfectaron células HEK293FT con el vector de Cas9 (pX459) (SEQ ID NO: 22) que no portaba ARNsg, o que portaba ARNsg1 (SEQ ID NO: 1), ARNsg2 (SEQ ID NO: 2) o ambos. Noventa y seis horas después, se extrajo el ADN y el locus RHO se amplificó y analizó mediante el ensayo SURVEYOR de detección de errores de apareamiento. La aplicación de dos ARNsg juntos dio como resultado la eliminación del gen (~ 30-40 %), lo que indicó que la estrategia de "Corte" funciona eficazmente en células de mamíferos (Fig. 2B, izquierda, carril 4). El uso de un ARNsg (carriles 2 y 3) a la vez no produce cambios de tamaño. Aproximadamente el 30 % del ADN genómico se sometió a unión de extremos no homólogos (NHEJ) por un ARNsg, y hasta el 80 % se editó (deleción y NHEJ) cuando se utilizaron dos ARNsg. Se utilizó igual cantidad de ADN plasmídico (1 mg/1 x 105 células 293FT) en cada grupo. Estos hallazgos indican que la aplicación de dos ARNsg puede destruir, eliminar o degradar la secuencia de RHO humana endógena de manera más eficiente.

Los inventores probaron además si el "Corte" puede disminuir la expresión del gen de RHO wt. En este experimento, se transfectó una construcción bicistrónica en células HEK293 para expresar ADNc de RHO wt (SEQ ID NO: 8) y EGFP (Fig. 3A). Tanto la expresión de ADNc de RHO como de EGFP (SEQ ID NO: 21) fueron dirigidas por un promotor de CMV (SEQ ID NO: 20) de forma independiente y simultánea, de modo que la expresión de EGFP se puede utilizar como control interno en la transferencia Western, que normaliza la diferencia en eficiencia de transfección y carga de proteínas. La figura 3A también ilustra los sitios diana de ARNsg1 (SEQ ID NO: 1) y ARNsg2 (SEQ ID NO: 2) en este vector de expresión de RHO. Cuando las células HEK293FT se cotransfectaron con el vector de expresión de RHO y otro vector que expresa los componentes de Cas9 (pX459) que portan ARNsg1 y ARNsg2, el nivel de expresión de la proteína RHO fue mucho más bajo (Fig. 3B). El grupo sg3 es un ARNsg de control no específico. Estos resultados se normalizaron aún más con el control interno, que se muestra en la Figura 3C. Estos hallazgos indican que, la aplicación de dos ARNsg juntos reduce la expresión de RHO aproximadamente en un 70 %, mientras que el uso de un solo ARNsg la reduce en un 0-30 % en comparación con el grupo de control (sg3). Juntos, estos resultados indican que la estrategia de "Corte" puede abolir o inactivar significativamente la expresión de la proteína RHO wt.

Ejemplo 2

La edición de genes

inducida por CRISPR/Cas9 en un modelo de ratón de retinitis pigmentaria retrasa la progresión de la enfermedad

A continuación, los inventores verificaron la viabilidad y eficacia del sistema de endonucleasa CRISPR/Cas9 como una modalidad de tratamiento de edición de genes en un modelo de ratón de RP con la mutación dominante de rodopsina D190N. En estos experimentos, se utilizaron dos vectores AAV8 que contenían la secuencia codificante de Cas9 y el ARNsg (SEQ ID NO: 4) /plantilla donante marcada con un sitio de restricción de AflII. La inserción del sitio de restricción de AflII permite la identificación de células que han experimentado recombinación homóloga (Figuras 4A-4C). Brevemente, se transdujo RhoD190N/+ heterocigoto en el ojo derecho antes del día 5 postnatal con los vectores AAV8 recombinantes descritos anteriormente. La frecuencia de transformación de ARNsg y la recombinación de la plantilla donante (SEQ ID # 23) se verificaron mediante la herramienta de seguimiento de indel TIDE (Brinkman y otros, Nucleic Acid Res. 16 de diciembre de 2014, 42(22): e168) y digestión enzimática con AflII (Fig. 4). Aproximadamente el 50 % de las células experimentaron NHEJ (en su mayoría son la inserción de 1 pb) y aproximadamente el 10 % de las células incorporaron la plantilla donante con éxito. La preservación estructural se evaluó mediante tinción de H y E, y el rescate de la función retiniana se evaluó mediante electrorretinografía (ERG) a los 3 meses de edad (Figs. 5A y 5B). En los ratones RhoD190N/+ de 3 meses de edad, los ojos tratados mostraron una mayor supervivencia de los fotorreceptores que los ojos que no recibieron la inyección de AAV (Fig. 5A). Además, la función retiniana medida por ERG también aumentó en los ojos tratados en comparación con los ojos de control a los 3 meses de edad (Fig. 5B). En conjunto, estos resultados demuestran que la edición de genes mediante CRISPR-Cas9 descrita en la presente descripción puede usarse para corregir in vivo el fenotipo de RP. La secuencia donante con modificación de codones se muestra como sigue: Subrayado y en negrita: brazo homólogo; Negrita: sitio de AflII; Subrayado: 5 nucleótidos oscilantes con modificación de codón;

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Ejemplo 3

Exón 1 humanizado mediado por CRISPR en el locus Rho del ratón

Los inventores de la presente descripción probaron a continuación la capacidad para reemplazar el locus Rho de ratón con el exón 1 de RHO natural (wt) (s Eq ID NO: 24) o humano mutante (H) (Se Q ID n O: 25) en células madre embrionarias (ES) de ratón (Fig. 6). Brevemente, las células ES se cotransfectaron (mediante electroporación) con el vector de expresión de Cas9 que porta un ARNsg específico del exón 1 de Rho (ARNsg-exón 1 de Rho, SEQ ID NO: 5) dirigido al exón 1 de Rho de ratón) y un vector de transformación que porta una plantilla donante de RHO humana, que contenía una secuencia del exón 1 de hRHO flanqueado por un brazo homólogo de ~ 750 pb en cada lado (Fig. 6A). Se espera que la plantilla donante de RHO humana reemplace al exón 1 de ratón y confiera resistencia al ARNsg-exón 1 de Rho. Siete días después de la electroporación, se seleccionaron los clones de ES y se extrajo el ADN y se amplificó con cebadores de cribado. Se detectaron dos de los 96 clones con reemplazo del exón humano 1 mediante análisis de RFLP (Fig. 6B). Como se muestra en la Fig. 6C, los electroferogramas de secuencia de amplicones muestran una secuencia de ratón y humano fusionadas perfectamente de un clon ES transformado (carril 2, Fig. 6B). Los clones transformados correctos se pueden usar adicionalmente para producir el modelo de ratón con el exón 1 de RHO humanizado. Este sistema de ratón humanizado específico del paciente permite a los inventores probar varios ARNsg que se pueden usar para transformar la secuencia genómica humana por la estrategia ChopStick in vivo. Las ventajas de utilizar estos modelos de ratón también permiten la validación de la eficacia y seguridad de "ChopStick" a través de métodos de evaluación funcional como la función visual, la obtención de imágenes de tejido rescatado en animales vivos para observaciones a largo plazo. La secuencia de ARNsg se menciona anteriormente y la secuencia de la plantilla donante se menciona a continuación: Subrayado y negrita: brazo homólogo; MAYÚSCULAS: exón 1 de RHO humana

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Ejemplo 4

Reparación del alelo Pde6a D670G de ratón en células madre

Las mutaciones en los genes que codifican subunidades de la enzima específica de bastones, monofosfato de guanosina cíclico (cGMP) fosfodiesterasa 6 (PDE6A y PDE6B), son responsables de aproximadamente 72 000 casos de RP en todo el mundo cada año, lo que hace que el modelado terapéutico sea muy relevante para desarrollar tratamientos basados en mecanismos. En el presente ejemplo, los inventores utilizaron el sistema de edición de genes CRISPR/ Cas9 para corregir mutaciones de genes de los fotorreceptores en células ES de ratón. Para estos estudios, los inventores utilizaron células ES aisladas del modelo de ratón Pde6aD670G/D670G (Wert KJ y otros, Hum Mol Genet. 20131 de febrero; 22 (3): 558-67; Wert KJ y otros, J Vis Exp. 25 de noviembre de 2012;(69)). Como se muestra en la Fig. 7A, una construcción donante (SEQ ID NO: 26) usada en este ejemplo contiene dos modificaciones: 1) una modificación de codones de Pde6a que crea un sitio de SphI adicional hacia el extremo 5' del codón D670G, donde la digestión con enzima SphI puede identificar las células ES que experimentaron recombinación homóloga mediada por CRISPR; y 2) se introdujeron ocho pares de bases oscilantes, que hacen que la plantilla donante sea irreconocible para el ARNg (SEQ ID NO: 6) y, por lo tanto, resistente a Cas9, y que dio como resultado el cambio de la secuencia de aminoácidos mutante a la secuencia de aminoácidos natural. Por tanto, tras el corte de Cas9 y la recombinación homóloga, el alelo muíante endógeno se reemplaza (es decir, se repara). En la Figura 7A, el triángulo indica el sitio diana del ARNsg, mientras que las dos flechas representan los pares de cebadores utilizados para la amplificación por PCR. Como se muestra en la Figura 7B, los amplicones generados a partir de células recombinadas eran de 303 pb y 402 pb, mientras que el amplicón sin editar es de 705 pb. Además, mediante el uso de la secuenciación directa del ADN genómico de un clon diana, los inventores confirmaron la sustitución prevista del exón D670G con la plantilla donante (Fig. 7C). Este es un ejemplo en el que no hay un sitio diana de ARNsg en el sitio de mutación, pero los investigadores aún pueden diseñar ARNsg cerca y reemplazar con éxito el alelo mutante mediante recombinación homóloga.

Por tanto, en este ejemplo, los inventores verificaron la capacidad del sistema CRISPR/Cas9 para editar el locus PDE6a del ratón y rescatar a los fotorreceptores.

Ejemplo 5

Edición de genes in vivo inducida por CRISPR/Cas9 en el modelo de ratón Pde6aD670G/Pde6aD670G

Los inventores verificaron el uso del sistema CRISPR/Cas9 para editar el locus Rho del ratón y rescatar los fotorreceptores (Ejemplo 2). Además, como se muestra en el Ejemplo 4, los inventores pudieron reparar el alelo Pde6a D670G de ratón en células ES. A continuación, los inventores realizarán experimentos in vivo, donde los ratones Pde6aD670G/Pde6aD670G del día postnatal (P) 5 recibirán transducciones subretinianas de AAV8-Cas9 y AAV8-ARNsg recombinantes con el ADN donante resistente a Cas9 con optimización de codones (validado en el Ejemplo 4) en un ojo. En los animales de control, se transducirá un ojo con un vector AAV8 vacío o AAV8-Cas9 como control negativo.

A continuación, los inventores realizarán la validación cuantitativa de la recombinación y la corrección de uno de los alelos Pde6aD670G en un mutante homocigoto. Brevemente, un mes después de la inyección (antes del inicio de la degeneración), se disecarán las retinas, se aislará el ADN, se realizará la PCR y se verificará el sitio de restricción de Sphl (mediante el uso de RFLP). Las muestras de PCR se analizarán por triplicado. A las 3 semanas de edad, se extraerán las retinas de 3 ratones y se cuantificarán los niveles de Pde6a mediante inmunotransferencia, como se describe.

Para evaluar cuantitativamente la función y la supervivencia de los fotorreceptores, los inventores realizarán AF cuantitativo del adelgazamiento del segmento externo en SD-OCT, ERG y densidad de bastones y conos a las 8, 16 y 24 semanas (n = 36 animales en total) mediante el uso de técnicas previamente publicadas (Woodruff y otros, J Neurosci. 27 de febrero de 2008; 28 (9): 2064-74; Janisch y otros, Biochem Biophys Res Commun 390, 1149-1153 (2009).); Tsang y otros, Science. 17 de mayo de 1996; 272 (5264): 1026-9; Davis y otros, Invest Ophthalmol Vis Sci. Noviembre de 2008; 49 (11): 5067-76.) Todas las mediciones se realizarán en ambos ojos.

Los inventores también determinarán la eficacia de la función PDE. Como indicador bioquímico clave del rescate, los inventores medirán si se restauran los niveles totales de GMPc y la actividad de PDE de las retinas adaptadas a la luz y la oscuridad. Se analizarán tres ojos derechos de muestra adicionales, tratados en los días P18, P21, P28 y P35, y los ojos izquierdos controles de Pde6aD670G/D670G. La GUCY2E (guanilato ciclasa) debe permanecer estable para todos los experimentos y se determinará como se describió anteriormente (Tsang y otros, Science. 17 de mayo de 1996; 272(5264): 1026-1029; Science. 2 de octubre de 1998; 282(5386): 117-21).

Ejemplo 6

Eficacia y frecuencia de la recombinación homóloga frente a la unión de extremos no homólogos (NEHJ) para editar PD6A en células madre específicas del paciente

En este ejemplo, los inventores verificarán que el sistema AAV2-Cas9 puede editar el locus 6 de PDE6A humano. Con este objetivo, se cotransducirán 0,25 * 106 iPS de pacientes en una placa de 6 pocillos recubiertos con matrigel (en medios de cultivo NutriStem XF/FF, Stemgent, Cambridge) con la mezcla del vector de AAV2-plantilla donante y AAV2-Cas9 (MOI: 2000) para reparar PDE6A. Después de 48 horas, las iPS se pasarán con Accutase a placas de cultivo de 10 cm, regulares, recubiertas con matrigel.

A continuación, se seleccionarán 1000 clones de iPS de pacientes PDE6AR102C/PDE6AS303C y se aislará el ADN para PCR; (Cebadores: directo: GCAGACTGCAAAACTGCCAT; inverso: TGTCACCAGCCTTGTCTTGG). Los productos de PCR se cortarán con BsiWI para identificar los clones que han experimentado una recombinación homóloga. Después de la digestión con BsiWI, el amplicón generado a partir de las iPS que experimentaron recombinación homóloga produce bandas a 271 pb y 380 pb, en comparación con la secuencia original, que produce sólo una banda a 651 pb.

Para determinar el porcentaje de clones que experimentaron NHEJ (a diferencia de los que experimentaron reparación dirigida por homología), se analizará el ADN de los clones sin el sitio de BsiWI (es decir, no transducidos, transducidos fuera de la diana o NHEJ) y se determinará la frecuencia de la interrupción del alelo PDE6A. El ADN se analizará mediante el ensayo de detección de errores de apareamiento SURVEYOR y las muestras de ADN positivas se someterán a subclonación en vectores plasmídicos como el vector pCR™4Blunt-TOPO® y después se enviarán para secuenciación Sanger. Además, la evaluación de la transformación fuera de la diana en iPS y ratones vivos son requisitos previos antes de la aplicación a seres humanos. Los sitios fuera de la diana se analizarán por secuenciación del genoma completo mediante el uso de la secuenciación de próxima generación de Illumina.

Los inventores anticipan una tasa mucho mayor de recombinación homóloga mediada por AAV8 en fotorreceptores in vivo, en comparación con las iPS del paciente. Esto se debe a que AAV8 introduce ARNsg en los fotorreceptores a una frecuencia mucho más alta que la transducción en iPS. El AAV8 introduce en los fotorreceptores aproximadamente 10 000 copias del ARNsg y Cas9, a diferencia de la lipofección y la electroporación, que generalmente introducen una única copia de ADN en cada célula.

Es probable que el porcentaje de clones transducidos que experimentan NHEJ sea mayor que los que experimentan recombinación homóloga, aproximadamente 10 % vs. 1%, respectivamente, con una plantilla donante de 90 pb en células madre pluripotentes inducidas en humanos.

Ejemplo 7

Uso del sistema CRISPR para reemplazar el alelo mutante R345W en células iPS aisladas de un paciente con panal de Doyne

La distrofia retiniana de panal de Doyne (DHRD) es una enfermedad hereditaria que afecta los ojos y causa pérdida de la visión. Se caracteriza por pequeñas manchas blancas redondas (drusas) que se acumulan alrededor del epitelio pigmentario de la retina. Con el tiempo, las drusas pueden crecer y unirse, para crear un patrón de panal. Por lo general, comienza en la edad adulta temprana, pero la edad de aparición varía. El grado de pérdida de la visión también varía. La DHRD está causada por mutaciones R345W en el gen EFEMP1, que se heredan de forma autosómica dominante.

En este ejemplo, los inventores utilizaron componentes CRISPR y una plantilla donante (SEQ ID NO: SEQ ID 27) para corregir la mutación R345W en las células iPS derivadas de fibroblasto de un paciente con panal de Doyne (Figura 8A). Las células iPS resultantes comprenden una secuencia de EFEMP1 natural con modificación de codones, que confiere resistencia al corte adicional por Cas9. Estas células se pueden usar para trasplantes autólogos después de la diferenciación en células del RPE para la cura de DHRD.

Brevemente, los inventores obtuvieron las iPS derivadas del paciente con DHRD. La proteína Cas9 y el ARNsg-EFEMP1 (SEQ ID NO: 3) (Figura 8B) se mezclaron y se cotransdujeron con la plantilla donante en forma de oligodesoxinucleótido monocatenario (ssODN) (secuencia: tagttagtaaactctttgaccctacatctctacagatataaatgagtgtgagaccacaaaCgaGtgcCgggaggatgaaatgtgttggaatt atcatggcggcttccgttgttatccacgaaatcctt) en células iPS mediante nucleofección. La plantilla donante tiene codones modificados para evitar que los componentes CRISPR reconozcan y corten repetidamente. La colonia con secuencia corregida se confirmó mediante un ensayo RFLP con el sitio de restricción de ScrFI adicional. El genotipo de la célula iPS se confirma además mediante secuenciación (Figura 8C).

Este experimento proporciona la evidencia de que la estrategia de "Corte" tiene potencial para tratar enfermedades autosómicas dominantes distintas de la retinitis pigmentaria autosómica dominante.

La Tabla 2 proporciona secuencias de ARNsg, secuencias modificadas de plantillas donantes y experimentos adicionales usados en los Ejemplos de la presente descripción.

Tabla 2.

Claims

REIVINDICACIONES

i . Una composición que comprende al menos un tipo de vector viral adenoasociado (AAV) recombinante que codifica un sistema CRISPR-Cas dirigido a un gen relacionado con enfermedad autosómica dominante para su uso en el tratamiento de una enfermedad ocular autosómica dominante en un sujeto, el uso comprende administrar al sujeto una cantidad con eficacia terapéutica de la composición, en donde el al menos un tipo de vector AAV comprende:

(a) dos secuencias de ARN guía que hibridan con el gen endógeno relacionado con enfermedad autosómica dominante en el sujeto;

(b) una segunda secuencia que comprende un gen relacionado con enfermedad autosómica dominante, con modificación de codones, o fragmento de este, en donde al menos una mutación relacionada con la enfermedad se ha corregido en el gen relacionado con enfermedad autosómica dominante, con modificación de codones, o fragmento de este, y en donde el gen relacionado con enfermedad autosómica dominante, con modificación de codones, o fragmento de este no es reconocido por el ARN guía; y

(c) una tercera secuencia que codifica una nucleasa Cas, opcionalmente Cas 9,

en donde al menos una secuencia de ARN guía se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o combinaciones de estas.
2. Una composición que comprende al menos un tipo de vector viral adenoasociado (AAV) recombinante que codifica un sistema CRISPR-Cas dirigido a un gen relacionado con enfermedad autosómica dominante para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la composición comprende dos tipos de vectores AAV recombinantes para su administración al sujeto, en donde un primer tipo de vector AAV recombinante comprende las secuencias de ARN guía y la segunda secuencia, y en donde un segundo tipo de vector AAV recombinante comprende la tercera secuencia.
3. Una composición que comprende al menos un tipo de vector viral adenoasociado (AAV) recombinante que codifica un sistema CRISPR-Cas dirigido a un gen relacionado con enfermedad autosómica dominante para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la enfermedad ocular se selecciona del grupo que consiste en, atrofia o degeneración coriorretiniana autosómica dominante, distrofia de conos o bastones y conos autosómica dominante, ceguera nocturna estacionaria congénita autosómica dominante, amaurosis congénita de Leber autosómica dominante, degeneración macular autosómica dominante, enfermedad del desarrollo de la retina ocular autosómica dominante, atrofia óptica autosómica dominante, retinitis pigmentaria autosómica dominante, enfermedades sindrómicas/sistémicas autosómicas dominantes con retinopatía, distrofia macular de Sorsby, degeneración macular relacionada con la edad, enfermedad macular de panal de Doyne y degeneración macular juvenil.
4. Una composición que comprende al menos un tipo de vector viral adenoasociado (AAV) recombinante que codifica un sistema CRISPR-Cas dirigido a un gen relacionado con enfermedad autosómica dominante para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la enfermedad ocular es retinitis pigmentaria, degeneración macular relacionada con la edad o panal de Doyne.
5. Una composición que comprende al menos un tipo de vector viral adenoasociado (AAV) recombinante que codifica un sistema CRISPR-Cas dirigido a un gen relacionado con enfermedad autosómica dominante para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el gen relacionado con enfermedad autosómica dominante es el gen RHO o el gen EFEMP1.
6. Una composición que comprende al menos un tipo de vector viral adenoasociado (AAV) recombinante que codifica un sistema CRISPR-Cas dirigido a un gen relacionado con enfermedad autosómica dominante para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el vector AAV recombinante es un vector AAV2 o un vector AAV8.
7. Una composición que comprende al menos un tipo de vector viral adenoasociado (AAV) recombinante que codifica un sistema CRISPR-Cas dirigido a un gen relacionado con enfermedad autosómica dominante para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el sistema CRISPR-Cas está bajo el control de un promotor que controla la expresión del producto génico relacionado con enfermedad autosómica dominante, con modificación de codones, en las células oculares.
8. Una composición que comprende al menos un tipo de vector viral adenoasociado (AAV) recombinante que codifica un sistema CRISPR-Cas dirigido a un gen relacionado con enfermedad autosómica dominante para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde (i) el gen relacionado con enfermedad autosómica dominante, con modificación de codones, o fragmento de este, se integra en el gen endógeno relacionado con enfermedad autosómica dominante, o en donde (ii) el gen relacionado con enfermedad autosómica dominante, con modificación de codones, o fragmento de este, no se integra en el gen endógeno relacionado con enfermedad autosómica dominante.
9. Una composición que comprende al menos un tipo de vector viral adenoasociado (AAV) recombinante que codifica un sistema CRISPR-Cas dirigido a un gen relacionado con enfermedad autosómica dominante para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el gen relacionado con enfermedad autosómica dominante es un gen seleccionado del grupo que consiste en PRDM13, RGR, TEAD1, AIPL1, CRX, GUCA1A, GUCY2D, PITPNM3, PROM1, PRPH2, RIMS 1, SEMA4A, UNCI 19, GNAT1, PDE6B, RHO, WSF1, IMPDH1, OTXTNA1, CTQN1, EFEMP1, ELOVL4, FSCN2, GUCA1B, HMCN1, IMPG1, RP1L1, TIMP3, VCAN, MFN2, NR2F1, OPA1, ARL3, CA4, HK1, KLHL7, NR2E3, NRL, PRPF1, PRPF6, PRPF8, PRPF31, PRPF12, ROM1, RP1, RP9, RPE65, SNRNP200, SPP2, TOPORS, ABCC6, ATXN7, COL11A1, COL2A1, JAG1, KCNJ13, KIF11, OPA3, PAX2, TREX1, CAPN5, CRB 1, FZD4, ITM2B, LRP5, MAPKAPK3, MIR204, OPN1SW, RB I, TSPAN12 y ZNF408.
10. Una composición que comprende al menos un tipo de vector viral adenoasociado (AAV) recombinante que codifica un sistema CRISPR-Cas dirigido a un gen relacionado con enfermedad autosómica dominante para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el vector AAV recombinante es adecuado para su administración mediante inyección en el ojo.
11. Una composición que comprende al menos un tipo de vector viral adenoasociado (AAV) recombinante que codifica un sistema CRISPR-Cas dirigido a un gen relacionado con enfermedad autosómica dominante para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el gen relacionado con enfermedad autosómica dominante, con modificación de codones, o fragmento de este, se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 27 o combinaciones de estas.
12. Una composición que comprende al menos un tipo de vector viral adenoasociado (AAV) recombinante que codifica un sistema CRISPR-Cas dirigido a un gen relacionado con enfermedad autosómica dominante para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el gen endógeno relacionado con enfermedad autosómica dominante es natural y/o mutante.