ES2897983T3

ES2897983T3 - Liposomas cargados con IPA-3 y procedimientos de uso de los mismos

Info

Publication number: ES2897983T3
Application number: ES17753707T
Authority: ES
Inventors: Somanath Rammohan Shenoy; Brian S Cummings
Original assignee: University of Georgia; University of Georgia Research Foundation Inc UGARF
Current assignee: University of Georgia; University of Georgia Research Foundation Inc UGARF
Priority date: 2016-02-15
Filing date: 2017-02-14
Publication date: 2022-03-03
Anticipated expiration: 2037-02-14
Also published as: EP3416623A4; EP3416623B1; US11517539B2; WO2017142876A1; US11969396B2; US20210186894A1; ES2897983T8; US20230110087A1; EP3416623A1

Abstract

Un liposoma estéricamente estabilizado que comprende una relación molar de 9:1:5:4 de 1,2-distearoil-sn-glicero- 3-fosfatidilcolina : 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[poli(etilenglicol)-2000] : colesterol : inhibidor dirigido a la activación-3 de la quinasa-1 activada por P21 (PAK1) (DSPC:DSPE-PEG2000:colesterol:IPA-3).

Description

DESCRIPCIÓN

Liposomas cargados con IPA-3 y procedimientos de uso de los mismos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

El campo de la invención se relaciona generalmente con vehículos de suministro basados en lípidos, particularmente liposomas cargados con IPA-3 y procedimientos de uso de los mismos, particularmente en el tratamiento del cáncer de próstata.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las quinasas activadas por P21 (PAK), que existen en 6 isoformas diferentes, se clasifican en PAK del grupo I y del grupo II con base en sus mecanismos de activación claramente diferentes y de su papel no redundante en la regulación de la función celular (Kichina, etal., Expert Opin TherTargets. 2010; 14: 703-25). Las PAK del grupo I, PAK-1 y PAK-2 en particular, han sido implicadas en diversos tipos de cáncer (Radu, et al., Nature reviews Cancer. 2014; 14: 13 25). Aunque PAK-1 es la isoforma PAK más expresada en la mayoría de los tejidos, el nivel de expresión de PAK-1 está por debajo del rango detectable en el tejido prostático normal y en las células epiteliales prostáticas (Kichina, et al., Expert Opin Ther Targets. 2010; 14: 703-25). En cambio, la próstata normal expresa abundantemente las PAK del grupo II, como PAK-4 y PAK-6 (Schrantz, et al., The Journal of biological chemistry. 2004; 279: 1922-31). Un estudio anterior demostró que la remodelación del citoesqueleto mediada por Rac1 es esencial para la invasión del cáncer de próstata (Goc, et al. PLoS One. 2012; 7: e40594). Las PAKs del grupo I son los principales efectores corriente abajo de Racl en la mediación de la remodelación del citoesqueleto (Somanath, et al., Journal of cellular physiology. 2009; 218: 394-404 Parrini, et al., Biochemical Society transactions. 2005; 33: 646-8.), y la investigación posterior del papel de PAK-1 en el cáncer de próstata reveló que, aunque no se detectó en las células epiteliales de la próstata humana, la glándula prostática normal y los tejidos de hiperplasia prostática benigna, PAK-1 se expresa abundantemente en las biopsias de tumores de próstata y en las colonias metastásicas alojadas en los tejidos pulmonares humanos (Goc, et al., J Biol Chem. 2013; 288: 3025-35). También se ha demostrado que PAK-1 es importante para el crecimiento de xenoinjertos tumorales de células PC-3 de próstata en ratones atímicos lampiños, así como para la transición epitelialmesenquimal de células de cáncer de próstata inducida por el factor p de crecimiento por transformación (TGFp) (Al-Azayzih, et al., Biochim Biophys Acta. 2015; 1853: 1229-39).

Entre los inhibidores conocidos de las PAK, un inhibidor fiable y específico de las PAK del grupo I es el "inhibidor dirigido a la activación de PAK-1" (IPA-3), un compuesto identificado a través de un cribado de alto rendimiento (Deacon, et al., Chem Biol., 2008; 15: 322-31). Una de las principales ventajas del IPA-3 es que, a diferencia de otros inhibidores de la quinasa, el IPA-3 no interactúa con el dominio de unión al ATP de la quinasa ni compite por él (Rudolph, et al., J Med Chem. 2015; 58: 111-29). En cambio, es un inhibidor alostérico no competitivo de PAK-1 que inhibe la activación de PAK-1, incluso a niveles más altos de ATP. Sin embargo, la naturaleza química y metabólicamente lábil del IPA-3 se convierte en un importante cuello de botella en su uso con fines terapéuticos (Rudolph, et al., J Med Chem. 2015; 58: 111-29). Aunque IPA-3 inhibe la función celular del cáncer de próstata in vitro y el crecimiento tumoral in vivo, fue necesario aumentar la frecuencia (es decir, diaria) de la administración del fármaco (Goc, et al., J Biol Chem. 2013; 288: 3025-35, Al-Azayzih, et al., Biochim Biophys Acta. 2015; 1853: 1229-39). Además, dado que PAK-1 es necesario para muchos acontecimientos fisiológicos (Ke, et al., Front Med. 2014; 8: 399-403-14 Koth, etal., J PhysiolParis. 2014; 108: 270-7Taglieri, etal., Cellularsignalling. 2014; 26: 2060-9Wang, etal., Frontiers in physiology. 2015; 6: 76). No se pueden descartar los efectos secundarios tóxicos graves de direccionar la PAK-1 con la forma libre de IPA-3.

El documento WO2015/148985 describe procedimientos de fabricación de fármacos terapéuticos encapsulados en liposomas, incluyendo, por ejemplo, estaurosporina, o una sal de la misma, un análogo de la misma, o una sal de un análogo de la misma, y composiciones tampón internas. Se describen además composiciones liposomales que incluyen un fármaco terapéutico, como, por ejemplo, estaurosporina, o una sal de la misma, un análogo de la misma, o una sal de un análogo de la misma, y usos de la misma para tratar un cáncer.

Por lo tanto, se necesitan composiciones y procedimientos mejorados para administrar IPA-3 a las células cancerosas, en particular a las células de cáncer de próstata, in vivo.

Es un objeto de la invención proporcionar composiciones y procedimientos de uso de las mismas que mejoren la estabilidad in vivo, la eficacia o la combinación de las mismas de IPA-3.

Es un objeto adicional de la invención proporcionar composiciones y procedimientos de administración de las mismas que reduzcan la frecuencia de administración del fármaco, reduzcan cualquier efecto secundario potencial, o combinaciones de los mismos de IPA-3.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona liposomas estéricamente estabilizados como se define en la reivindicación 1 y composiciones farmacéuticas que comprenden los liposomas como se define en la reivindicación 3. La presente invención también proporciona los liposomas o composiciones farmacéuticas para su uso en el tratamiento del cáncer como se define en las reivindicaciones 5 y 6.

En el presente documento se describen vehículos de administración basados en lípidos. También se describen composiciones nanoparticuladas que incluyen típicamente un inhibidor de la quinasa activada p21 (PAK) y un vehículo de suministro basado en lípidos. En la presente invención, el vehículo de suministro basado en lípidos es un liposoma estéricamente estabilizado. El liposoma estéricamente estabilizado puede tener un índice de polidispersidad (PDI) de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,139, un potencial zeta de aproximadamente -28,1v, o una combinación de los mismos. El liposoma estéricamente estabilizado puede tener un diámetro de, por ejemplo, aproximadamente 75 nm y 500 nm, o aproximadamente 100 nm y 250 nm, o aproximadamente 125 nm y 150 nm.

En el liposoma estéricamente estabilizado los fosfolípidos son DSPC, DSPE-PEG2000, colesterol e IPA-3 en una relación de 9:1:5:4. La composición nanoparticulada puede incluir un inhibidor de PAK, preferentemente un inhibidor de PAK-1, aunque se contemplan otros agentes activos. Las composiciones pueden aumentar la semivida del agente activo in vitro o in vivo. Un inhibidor ejemplar de PAK-1 es el "Inhibidor direccionadoa la activación-3 de la quinasa-1 activada por P21 (PAK1)" (IPA-3) o un derivado, profármaco o sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Las formulaciones pueden incluir una cantidad eficaz de un inhibidor de p21 a PAK y un vehículo de suministro basado en lípidos para, por ejemplo, inhibir o reducir la carga tumoral en un sujeto que lo necesite. También se proporcionan composiciones farmacéuticas y unidades de dosificación de las mismas que incluyen la composición nanoparticulada y un portador farmacéuticamente aceptable. La unidad de dosificación puede incluir una cantidad efectiva de composición nanoparticulada para tratar el cáncer en un sujeto que lo necesite durante 2 a 5 días, por ejemplo, reduciendo el tamaño del tumor o la carga tumoral o inhibiendo el crecimiento o la progresión de los tumores.

La presente invención también proporciona liposomas estéricamente estabilizados como se ha definido anteriormente y composiciones farmacéuticas que comprenden el liposoma estéricamente estabilizado para su uso en el tratamiento del cáncer. Las células cancerosas pueden expresar PAK-1 a un nivel de expresión más alto que las células no cancerosas del mismo tipo celular. Algunos ejemplos de cánceres que pueden tratarse incluye, pero no se limitan a, el cáncer de próstata y cáncer de mama.

También se describe la reducción de la actividad PAK en un sujeto que la necesita. El sujeto puede tener cáncer de próstata o cáncer de mama.

Los regímenes de dosificación también se describen en el presente documento. Normalmente, una composición nanoparticulada que incluye un agente activo como un inhibidor de PAK puede administrarse con menos frecuencia y lograr el mismo efecto que la administración del fármaco libre. Además, o alternativamente, se puede administrar al sujeto un agente menos activo, como un inhibidor de PAK, formulando el inhibidor de PAK en una composición nanoparticulada.Los liposomas estéricamente estabilizados o las composiciones farmacéuticas que comprenden el liposoma estéricamente estabilizado pueden administrarse a un sujeto entre aproximadamente 1 y 3 veces por semana, como 2 veces por semana.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Las figuras 1A-1C son gráficos lineales que muestran el efecto dependiente de la dosis y el tiempo del IPA-3 libre sobre la tinción de MTT en células de cáncer de próstata humano PC-3 (1A), LNCaP (1B) y DU-145 (1C), 24, 48 y 72 horas después del tratamiento (n = 3). Las figuras 1D y 1E son gráficos de barras que muestran el efecto de IPA-3 libre y SSL-IPA-3 sobre la tinción de MTT en células de cáncer de próstata humano PC-3 (1D) y DU-145 (IE) 72 horas después del tratamiento (n = 3). Las barras abiertas en la Figura 1D y E para el control indican el efecto de los liposomas vacíos. Los datos se presentan como la media ± SEM del cambio en la proporción en la tinción m Tt en función de la concentración de IPA-3; *p < 0,05; "NS"; indica que no es significativo. Las figuras 1F-1H son gráficos de líneas del efecto de IPA-3 libre sobre la tinción de MTT en células de cáncer de próstata humano (DU-145) en tres medios diferentes (EMEM (IF), RPMI (1G) y F-12K (1H)) tras 24, 48 y 72 h de tratamiento. Los datos representan el cambio en la proporción en la tinción MTT en función de la concentración de IPA3. Los datos se presentan como la media ± SEM. La figura 1I es un gráfico de líneas que muestra el porcentaje de IPA-1 retenido a lo largo del tiempo (días). Se evaluó la capacidad de retención de IPA-3 de los SSL durante 72 horas tras la reformulación. La fuga de fármacos de los liposomas se determinó extrayendo porciones de liposomas de un conjunto almacenado a pH 7,4 y 4°C en el punto de tiempo indicado. Después de la diálisis, los liposomas encapsulados con IPA-3 se analizaron para determinar el contenido de IPA-3 como se describe en los procedimientos. Los datos se presentan como la media ± SEM de la cantidad de IPA-3 retenida en función del tiempo.

La figura 2 es un gráfico de barras que muestra la cuantificación de la muerte celular determinada por la tinción con anexina V y PI en las células PC-3 de control, expuestas a IPA-3 y expuestas a SSL-IPA-3 después de 48 horas. La tinción de anexina V y PI se determinó mediante citometría de flujo. Los datos se presentan como la media ± SEM del porcentaje de células en tinción de anexina V y PI en función de la concentración de IPA-3; *p < 0,05.

La Figura 3A es un histograma que muestra el análisis de densitometría de la expresión de PAK-1 en diferentes líneas celulares de cáncer de próstata y de mama, según lo determinado por el análisis de inmunotransferencia (n = 5). La Figura 3B es un gráfico que muestra la correlación entre la expresión de PAK-1 y el IC50 (|jM) del inhibidor de PAK-1 IPA-3 (n = 3) (los datos que presentan la correlación lineal entre la expresión de PAK-1 y la toxicidad de IPA-3 se muestran en la Tabla 3 a continuación). Los datos se presentan como la media ± SEM; *p < 0,05.

La figura 4A es un esquema de un ensayo in vivo en el que ratones lampiños atímicos portadores de xenoinjertos tumorales de células PC-3 fueron tratados con vehículo (DMSO), liposomas vacíos, IPA-3 o IPA-3 encapsulado en liposomas (SSL-IPA-3). La figura 4B es un histograma que muestra el peso de los xenoinjertos tumorales de células PC-3 recogidos de ratones atímicos lampiños tratados con vehículo (DMSO), liposomas vacíos, IPA-3 o IPA-3 encapsulado en liposomas el día 25 después de la implantación del tumor y el día 18 después del inicio de los tratamientos (n = 5-6). La Figura 4C es un gráfico de barras que muestra el volumen de los xenoinjertos tumorales de células PC-3 en los días 7, 14, 21 y 25 después de la implantación en ratones lampiños atímicos tratados con vehículo (DMSO), liposomas vacíos, IPA-3 o IPA-3 encapsulado en liposomas, medido con calibradores (n = 5-6). La Figura 4D es un histograma que muestra el peso corporal de los ratones lampiños atímicos portadores de tumores de células PC-3 el día 25 después de la implantación del tumor y el día 18 después del tratamiento con el vehículo (DMSO), liposomas vacíos, IPA-3 o IPA-3 encapsulado en liposomas. Los datos se presentan como la media ± SEM; #p < 0,01.

La figura 5 es un histograma que muestra el número de células apoptóticas (positivas a TUNEL) en secciones de xenoinjertos tumorales de células PC-3 procedentes de ratones lampiños atímicos tratados con vehículo (DMSO), liposomas vacíos, IPA-3 o IPA-3 encapsulado en liposomas el día 25 después de la implantación del tumor y el día 18 después del inicio de los tratamientos. (n = 4). Los datos se presentan como la media ± SEM; *p < 0,05; #p < 0,01.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

I. Definiciones

El término "agente activo", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a una sustancia fisiológica o farmacológicamente activa que actúa de forma local y/o sistémica en el organismo. Un agente activo es una sustancia que se administra a un paciente para el tratamiento(por ejemplo, agente terapéutico), la prevención^ por ejemplo, agente profiláctico) o el diagnóstico^ por ejemplo, agente de diagnóstico) de una enfermedad o trastorno. Un agente activo ejemplar es un inhibidor de PAK-1.

El término "hidrófobo", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula no polar o a una parte de una molécula que no puede formar interacciones energéticamente favorables con las moléculas de agua y, por lo tanto, no se disuelve en agua.

"Hidrofílico", tal como se utiliza en el presente documento, describe una molécula polar o parte de una molécula que forma suficientes interacciones energéticamente favorables con las moléculas de agua para disolverse fácilmente en agua.

El término "anfifílico", tal y como se utiliza aquí, describe una molécula que tiene regiones tanto hidrofóbicas como hidrófobas, como en un fosfolípido o una molécula de detergente.

La "cantidad efectiva" o "cantidad adecuada", tal como se utiliza aquí, es al menos la concentración mínima requerida para efectuar una mejora medible o la prevención de cualquier síntoma o una condición o trastorno particular, para efectuar una mejora medible de la esperanza de vida, o para mejorar en general la calidad de vida del paciente. La cantidad efectiva depende, por tanto, de la molécula biológicamente activa específica y de la afección o el trastorno específico que se vaya a tratar. Con respecto al cáncer, una cantidad efectiva se refiere a una cantidad del agente activo que reduce o inhibe el crecimiento del tumor o la carga tumoral.

"Farmacéuticamente aceptable", tal y como se utiliza aquí, se refiere a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que son, dentro del ámbito del buen juicio médico, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de los seres humanos y los animales sin una toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica u otros problemas o complicaciones acordes con una relación beneficio/riesgo razonable.

Los "liposomas estéricamente estabilizados", tal y como se utilizan en el presente documento, son liposomas con una modificación (por ejemplo, la PEGilación) que aumenta la semivida del liposoma in vivo en relación con el correspondiente liposoma no modificado.

El término "SSL-IPA-3", tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a un liposoma estéricamente estabilizado cargado con un "inhibidor direccionado a la activación-3 de PAK-1" (IPA-3).

II. Composiciones

Se proporcionan vehículos de administración basados en lípidos en forma de liposomas estéricamente estabilizados. También se proporcionan liposomas estéricamente estabilizados que incluyen agentes activos como los definidos en la reivindicación 1, y composiciones farmacéuticas que comprenden los liposomas estéricamente estabilizados.

A. Composiciones nanoparticuladas a base de lípidos

Los liposomas estéricamente estabilizados comprenden una relación molar de 9:1:5:4 de 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina : 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[poli(etilenglicol)-2000]: colesterol: inhibidor dirigido a la activación de la quinasa-1 activada por P21 (PAK1) (DSPC:DSPE-PEG2000:colesterol:IPA-3).El término "liposoma" se refiere a una vesícula esférica compuesta por al menos una bicapa de moléculas anfipáticas que forma una membrana que separa un medio intravesicular de un medio externo. El medio intravesicular constituye el núcleo acuoso interno del liposoma. Las moléculas o componentes hidrofílicos, pueden ser encapsulados dentro del núcleo acuoso interno del liposoma a través de procedimientos activos de encapsulación conocidos en la técnica y descritos a continuación. Las moléculas o componentes hidrófobos pueden quedar atrapados dentro de la membrana.

1. Lípidos

Los liposomas están formados por 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina : 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[poli(etilenglicol)-2000] : colesterol : inhibidor direccionado a la activación-3 de la quinasa-1 activada por P21 (PAK1) (DSPC:DSPE-PEG2000:colesterol:IPA-3).

Otros lípidos y componentes útiles en la preparación de composiciones nanoparticuladas son conocidos en la técnica. Los lípidos neutros y aniónicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, esteroles y lípidos como el colesterol, fosfolípidos, lisolípidos, lisofosfolípidos, esfingolípidos o lípidos pegilados. Los lípidos neutros y aniónicos incluyen, pero no se limitan a, la fosfatidilcolina (PC) (como la PC del huevo, la PC de la soja), incluidas, pero no limitadas a, las 1 ,2-diacilglicero-3-fosfolinas; la fosfatidilserina (PS), el fosfatidilglicerol, el fosfatidilinositol (PI) los glicolípidos; los esfingofosfolípidos como la esfingomielina y los esfingoglicolípidos (también conocidos como 1-ceramidilglucósidos) como la ceramida galactopiranósida, los gangliósidos y los cerebrósidos; ácidos grasos, esteroles, que contienen un grupo de ácido carboxílico, por ejemplo, el colesterol 1 ,2-diacil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, incluyendo, pero sin limitarse a, 1 ,2-dioleilfosfanolamina (DOPE), 1 ,2-dihexadecilfosfanolamina (DHPE), 1 ,2-distearoilfosfatidilcolina (DSPC), 1 ,2-dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), y 1 ,2-dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC). Los lípidos también pueden incluir varios derivados naturales (por ejemplo, L-a-fosfatidil derivados de tejidos: yema de huevo, corazón, cerebro, hígado, soja) y/o sintéticos (por ejemplo, 1,2-diacil-sn-glicero-3-fosfolinas saturadas e insaturadas, 1 -acil-2-acil-snglicero-3-fosfolinas, 1,2-diheptanoyl-SN-glicero-3-fosfolina) de los lípidos. Los liposomas pueden generarse a partir de un solo tipo de lípido o de una combinación de dos o más lípidos.

Los liposomas pueden incluir un metabolito de esfingomielina. Los metabolitos de la esfingomielina utilizados para formular los liposomas incluyen, sin limitación, ceramida, esfingosina o esfingosina 1-fosfato. La concentración de los metabolitos de esfingomielina incluidos en los lípidos utilizados para formular los liposomas puede oscilar entre aproximadamente 0,1 mol % y aproximadamente 10 mol %, o entre aproximadamente 2,0 mol % y aproximadamente 5,0 mol %, o puede estar en una concentración de aproximadamente 1,0 mol %.

Los lípidos catiónicos adecuados en los liposomas pueden incluir, pero no están limitados a, sales de N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetil amonio, también referidas como lípidos TAP, por ejemplo la sal de metilsulfato. Los lípidos TAP adecuados incluyen, pero no se limitan a, DOTAP (dioleoil-), DMTAp (dimiristoil-), DPTAP (dipalmitoil-), y DSTAP (distearoil-). Los lípidos catiónicos adecuados en los liposomas incluyen, pero no se limitan a, el bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB), los propanos de 1 ,2-diacetiloxi-3-trimetilamonio, el N-[1-(2,3-dioloxi)propil]-N,N-dimetilamonio (DODAP), el 1 ,2-diacetiloxi-3-dimetilamonio, N-[1-(2,3-dioloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOt Ma ), 1 ,2-dialquiloxi-3-dimetilamonio propanos, dioctadecilamidoglicolpermina (DOGS), 3-[N-(N',N'-dimetilaminoetano)carbamoil]colesterol (DC-Chol); 2,3-dioleoiloxi-N-(2-(esperminecarboxamido)-etil)-N,N-dimetil-1-propanaminio trifluoroacetato (DOSPA), p-alanil colesterol, bromuro de cetil trimetil amonio (CTAB), diC-M-amidina, N-ferf-butil-N'-tetradecil-3-tetradecilamino-propionamidina, Cloruro de N-(alfa-trimetilamonioacetilo)didodecil-D-glutamato (TMAG), cloruro de ditetradecanoil-N-(trimetilamonio-acetilo)dietanolamina, 1 ,3-dioleoxi-2-(6-carboxi-espermil)-propilamida (DOSPER), y N,N,N',N'-tetrametil-,N'-bis(2-hidroxiletil)-2,3-dioleoxi-1 ,4-butanediamonio yoduro. Los lípidos catiónicos pueden ser derivados de cloruro de 1-[2-(aciloxi)etil]2-alquil(alquenil)-3-(2-hidroxietil)-imidazolinio, por ejemplo, cloruro de 1-[2-(9(Z)-octadecanoiloxi)etil]-2-(8(Z)-heptadecenil-3-(2-hidroxietil)imidazolinio (DOTIM), y cloruro de 1-[2-(hexadecanoiloxi)etil]-2-pentadecil-3-(2-hidroxietil)imidazolinio (DPTIM). Los lípidos catiónicos pueden ser derivados de compuestos de amonio cuaternario 2,3-dialquiloxipropilo que contengan una fracción de hidroxialquilo en la amina cuaternaria, por ejemplo, bromuro de 1,2-dioleoil-3-dimetil-hidroxietil amonio (DORI), bromuro de 1,2-dioleiloxipropil-3-dimetil-hidroxietil amonio (DORIE), bromuro de 1,2-dioleiloxipropil-3-dimetil-hidroxipropil amonio (DORIE- HP), bromuro de 1,2-dioleil-oxipropil-3-dimetil-hidroxibutil amonio (DORIE-HB), bromuro de 1,2-dioleiloxipropil-3-dimetilhidroxipentil amonio (DORIE-Hpe), bromuro de 1,2-dimiristiloxipropil-3-dimetil-hidroxiletil-amonio (DMRIE), bromuro de 1,2-dipalmitiloxipropil-3-dimetil-hidroxietil-amonio (DPRIE) y bromuro de 1,2-disteriloxipropil-3-dimetil-hidroxietilamonio (DSRIE).

Los lípidos pueden estar formados por una combinación de más de un lípido, por ejemplo, un lípido cargado puede combinarse con un lípido no iónico o no cargado a pH fisiológico. Los lípidos no iónicos incluyen, pero no se limitan a, colesterol y DOPE (1,2-dioleolgliceril fosfatidiletanolamina).

Se incluye un componente de esterol para conferir al liposoma un comportamiento físico-químico y biológico adecuado. El componente esterol es el colesterol. El colesterol se utiliza a menudo en la formulación lipídica de los liposomas porque se reconoce generalmente que la presencia de colesterol disminuye su permeabilidad y los protege del efecto desestabilizador de las proteínas plasmáticas o séricas.

2. Procedimientos de fabricación

Los liposomas suelen tener un núcleo acuoso. El núcleo acuoso puede contener agua o una mezcla de agua y alcohol. Los alcoholes adecuados incluyen, pero no se limitan a, metanol, etanol, propanol, (como isopropanol), butanol (como n-butanol, isobuteno, sec-butanol, tart-butanol, pentano (como alcohol amílico, isobutilcarbinol), hexanol (como 1-hexanol, 2-hexanol, 3-hexanol), heptanol (como 1-heptanol, 2-heptanol, 3-heptanol y 4-heptanol) u octanol (como 1-octanol) o una combinación de los mismos.

Los liposomas tienen uno o varios compartimentos acuosos delimitados por una (unilamelar) o varias (multilamelar) bicapas de fosfolípidos (Sapra, et al., Curr. Drug Deliv., 2, 369-81 (2005)). Los liposomas multilamelares tienen más bicapas lipídicas para que se asocien los agentes terapéuticos hidrófobos. De este modo, se dispone de cantidades potencialmente mayores de agente terapéutico dentro del liposoma para alcanzar la célula diana.

Dependiendo del modo de preparación, el tamaño y el grado de laminaridad de las vesículas pueden ser ajustados. En la literatura se han descrito varios procedimientos para preparar vesículas lipídicas unilamelares: evaporación en fase inversa (Szoka et al., PNAS, 1978; 75(9):4191-4198), inyección de etanol (Pons et al. International Journal of Pharmaceutics, 1993; 95(1-3):51-56), procedimiento de calentamiento (Mozafari et al., Journal of Biotechnology, 2007; 129:604-613), pero el más sencillo es el procedimiento de hidratación de la película lipídica (Bangham et al., J. Mol. Bio., 1965; 13:238-252).

En resumen, en el procedimiento de hidratación de la película lipídica, los lípidos se solubilizan en un disolvente orgánico como el cloroformo. Tras la homogeneización de la solución, el disolvente orgánico se evapora bajo una corriente de nitrógeno. A continuación, la película lipídica seca obtenida se hidrata con un medio acuoso a una temperatura superior a la temperatura de transición de fase principal T^m, lo que conduce a la formación de vesículas multilamelares con tamaños que oscilan entre 100 y 800 nm (Mills J. K. et al. Methods in Enzymology 2004; 387:82-113). Los ciclos de deshidratación y rehidratación, mediante la congelación (en nitrógeno líquido) y la descongelación de la solución (a una temperatura superior a la T^m), respectivamente, permiten aumentar el volumen interno acuoso mediante la formación de vesículas unilamelares. Se puede aplicar un proceso que permita calibrar el tamaño de las vesículas para obtener una distribución de tamaños homogénea. La sonicación produce pequeñas vesículas unilamelares (SUV) con un tamaño que oscila entre los 20 y los 50 nm, mientras que el proceso de extrusión a través de una membrana de filtro produce grandes vesículas unilamelares (LUV) con un tamaño que oscila entre los 50 y los 500 nm, dependiendo del tamaño de los poros del filtro. Ambos procesos, la sonicación y la extrusión, se realizan a una temperatura superior a la T^m.

3. Modificaciones

a. Estabilización estérica

En la presente invención, el liposoma es un liposoma estéricamente estabilizado o llamado "sigiloso". Además de modular la composición lipídica, el tamaño y la carga de la vesícula para aumentar la circulación in vivo, las superficies liposomales pueden modificarse, por ejemplo, con glicolípidos o ácido siálico. Un paso importante en el desarrollo de liposomas de larga circulación se produjo con la inclusión del polímero sintético poli(etilenglicol) (PEG) en la composición de los liposomas (véase, por ejemplo Paphajopoulos, et al., PNAS, 88:11460-11464 (1991). Se ha demostrado que la presencia de PEG en la superficie del portador liposomal prolonga el tiempo de circulación de la sangre al tiempo que reduce la captación del sistema fagocítico mononuclear. Además, mediante la modificación sintética de la molécula terminal de PEG, los liposomas sigilosos pueden dirigirse activamente con anticuerpos monoclonales o ligandos. Los liposomas, incluidos los liposomas circulantes largos y los liposomas sigilosos, se revisan en Immordino, et al, Int JNanomedicine, 1(3):297-315 (2006)).

En los liposomas compuestos por fosfolípidos y colesterol, se ha comprobado que la capacidad del PEG para aumentar la vida útil en circulación de los vehículos depende tanto de la cantidad de PEG injertado como de la longitud o el peso molecular del polímero (Allen, et al., Biochim Biophys Acta., 1066:29-36 (1991)). En la mayoría de los casos, los PEG de cadena más larga han producido las mayores mejoras en el tiempo de residencia de la sangre. Por ejemplo, Allen et al informaron de que los niveles en sangre eran más altos para los liposomas SM/PC/CHOL/DSPE-PEG con PEG de peso molecular más largo (es decir, PEG 1900 y PEG 5000) que para los liposomas que contenían PEG-lípido con una cadena más corta de PEG (es decir, PEG 750 y PEG 120). La presencia de PEG 2000 duplicó la cantidad de lípidos restantes en el plasma en comparación con las formulaciones que contenían PEG 350 a 750. En la presente invención, el PEG es PEG 2000.

La composición nanoparticulada es un liposoma esténicamente estabilizado. Los portadores de fármacos nanoparticulados basados en lípidos, como los liposomas estéricamente estabilizados (SSL) de larga circulación, tienen la capacidad de encapsular fármacos de forma estable y facilitar su administración (Muggia, et al., Current Oncol. 2001; 3: 156-62 Zhu, et al., JPharm Sci. 2011; 100: 3146-59 Marra, et al., Biotechnology advances. 2012; 30: 302-9.). Pueden alterar la farmacocinética del fármaco, especialmente en comparación con el fármaco libre, y a veces potenciar su actividad farmacológica (Muggia, et al., Current Oncol. 2001; 3: 156-62). La administración de fármacos específicos para tumores mediante portadores de fármacos nanoparticulados basados en lípidos, como el SSL, se ha utilizado para encapsular y liberar fármacos, a menudo con mayor eficacia en comparación con el fármaco libre (Gabizon, et al., Horiz Biochem Biophys. 1989; 9: 185-211). Se cree que las diferencias en la semivida y/o en la distribución tisular y tumoral son las principales causas de estas acciones. Además, se cree que las SSL también disminuyen la toxicidad de dianas ajenas (Lasic, etal., Biochimica et biophysica acta. 1991; 1070: 187-92, Sharma, et al., Pharm Res. 1997; 14: 992-8). DOXIL® es un ejemplo de nanopartícula clínicamente aprobada que encapsula el fármaco anticanceroso doxorubicina. Además de su capacidad para estabilizar los fármacos y mejorar su biodistribución, las SSL se acumulan de forma pasiva en los tumores sólidos debido a la mayor permeabilidad y al efecto de retención mediado por los defectos de la vasculatura y la falta de linfáticos funcionales (Maeda, et al., J Control Release. 2000; 65: 271-84, Yuan, et al., Cancer research. 1994; 54: 3352-6).

b. Recubrimientos

El liposoma puede incluir un recubrimiento biocompatible que permita o favorezca la estabilidad de los liposomas en una suspensión biocompatible, como un fluido fisiológico (sangre, plasma, suero, etc.), cualquier medio isotónico o medio fisiológico, por ejemplo, un medio que comprenda glucosa (5%) y/o NaCl (0,9%), que se utiliza normalmente para una administración farmacéutica. Este recubrimiento biocompatible puede obtenerse tratando el liposoma con un agente de tratamiento de superficie. La estabilidad puede confirmarse mediante la dispersión de luz dinámica de los liposomas en suspensión biocompatible. El recubrimiento puede preservar la integridad del liposoma in vivo, asegurar o mejorar su biocompatibilidad, facilitar su funcionalización opcional (por ejemplo, con moléculas espaciadoras, polímeros biocompatibles, agentes dirigidos, proteínas, etc.), o una combinación de los mismos.

El recubrimiento puede ser no biodegradable o biodegradable. Ejemplos de recubrimientos no biodegradables son uno o más materiales o agentes de tratamiento de superficie seleccionados en el grupo que consiste en azúcar (agarosa por ejemplo), polímeros de carbono saturados (óxido de polietileno por ejemplo), reticulados o no, modificados o no (polimetacrilato o poliestireno por ejemplo), así como combinaciones de los mismos. Ejemplos de recubrimientos biodegradables son, por ejemplo, uno o más materiales o agentes de tratamiento de superficies seleccionados del grupo que consiste en una molécula biológica, modificada o no, natural o no y un polímero biológico; modificado o no, de forma natural o no. El polímero biológico puede ser un sacárido, un oligosacárido o un polisacárido, polisulfatado o no, por ejemplo dextrano.

c. Direccionamiento

La superficie de los liposomas o de sus componentes puede modificarse para facilitar el direccionamiento mediante la fijación de moléculas de direccionamiento. Las moléculas diana ejemplares incluyen proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, lípidos, sacáridos o polisacáridos que se unen a una o más dianas asociadas a un órgano, tejido, célula o matriz extracelular, o a un tipo específico de tumor o célula infectada. El grado de especificidad con el que se direccionan los lipsomas puede modularse mediante la selección de una molécula de direccionamiento con la afinidad y especificidad adecuadas. Por ejemplo, una fracción de direccionamiento puede ser un polipéptido, como un anticuerpo que reconoce específicamente un marcador tumoral que está presente exclusivamente o en mayores cantidades en una célula maligna ( por ejemplo, un antígeno tumoral). Se conocen en la técnica las moléculas diana adecuadas que pueden utilizarse para dirigir los liposomas a las células y tejidos de interés, por ejemplo el tejido canceroso, así como los procedimientos de conjugación de las moléculas diana con los liposomas. Las moléculas de direccionamiento también pueden incluir neuropilinas y moléculas de direccionamiento endotelial, integrinas, selectinas y moléculas de adhesión. Las moléculas diana pueden unirse covalentemente a los liposomas utilizando una variedad de procedimientos conocidos en la técnica.

El liposoma incluye uno o más lípidos PEGilados. Las moléculas de direccionamiento pueden conjugarse con el extremo de una o más cadenas de PEG presentes en la superficie de la cubierta liposomal.

Los materiales, compuestos o agentes de tratamiento de superficies antes mencionados pueden utilizarse solos o en combinaciones, mezclas o conjuntos, compuestos o no, covalentes o no, opcionalmente en combinación con otros compuestos.

4. Realizaciones ejemplares

El liposoma estéricamente estabilizado incluye una relación molar de 9:1:5:4 de 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina : 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[poli(etilenglicol)-2000]: colesterol: inhibidor dirigido a la activación-3 de la quinasa-1 activada por P21 (PAK1) (DSPC:DSPE-PEG2000:colesterol:IPA-3). Los liposomas se prepararon mediante el procedimiento de hidratación de lípidos finos, seguido de ciclos de congelacióndescongelación y una extrusión a alta presión (Mock, et al., Integr Biol (Camb). 2013; 5: 172-82 y Zhu, et al., J Pharm Sci. 2011; 100: 3146-59). La composición de los liposomas se muestra en la Tabla 1, a continuación. En resumen, el colesterol, los fosfolípidos incluyendo DSPC y DSPE-PEG en cloroformo y el fármaco en etanol pueden añadirse juntos y los disolventes se evaporan al vacío. La película delgada formada puede hidratarse y suspenderse en tampón de fosfato de amonio o tampón salino de fosfato (PBS) para lograr una concentración final de lípidos de aproximadamente 10 ^mol/ml. La formulación puede someterse a ciclos de congelación-descongelación con nitrógeno líquido por encima de la temperatura de transición de fase del lípido primario, y pasar por una extrusora Lipex que utiliza membranas de policarbonato de doble apilado. El exceso de fármaco no encapsulado y de lípidos puede eliminarse mediante diálisis.

B. Agentes activos

1. Inhibidor PAK

Los liposomas estéricamente estabilizados y las composiciones farmacéuticas que comprenden el liposoma estéricamente estabilizado aquí divulgado incluyen un agente activo encapsulado, cargado en, unido a la superficie de, y/o encerrado en el mismo.

Un inhibidor de PAK utilizado en la presente invención tiene la estructura:

o un derivado, profármaco o sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Este inhibidor de la PAK se denomina IPA-3 (1,1'-Ditiodi-2-naftol) y está descrito por Deacon et al. 2008 Chem Biol. 15(4):322-3. El término "derivativo" o "derivado", tal como se utiliza aquí, incluye una o más modificaciones químicas de IPA-3, un enantiómero, un polimorfo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Es decir, un "derivado" puede ser un equivalente funcional de IPA-3, que es capaz de inducir la actividad funcional farmacológica mejorada y/o la respuesta conductual en un sujeto determinado. Un ejemplo de estas modificaciones químicas sería la sustitución del hidrógeno por un grupo halo, un grupo alquilo, un grupo acilo o un grupo amino. Los derivados inactivos o de baja actividad y los parientes como el PIR3.5 pueden ser excluidos como agentes activos.

La modificación química de IPA-3, un enantiómero, un polimorfo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo puede mejorar o reducir la interacción de enlace de hidrógeno, la interacción de carga, la interacción hidrófoba, la interacción de Van Der Waals o la interacción dipolar entre el compuesto y su objetivo.

IPA-3 puede actuar como modelo (por ejemplo, una plantilla) para el desarrollo de otros compuestos derivados que sean un equivalente funcional del compuesto y que sea capaz de inducir la actividad y/o el efecto funcional farmacológico mejorado y/o la respuesta conductual en un sujeto determinado.

Los IPA-3 pueden ser compuestos racémicos y/o isómeros ópticamente activos de los mismos. A este respecto, algunos de los compuestos pueden tener átomos de carbono asimétricos y, por tanto, pueden existir como mezclas racémicas o como isómeros ópticos individuales (enantiómeros). Los compuestos descritos en el presente documento que contienen un centro quiral incluyen todos los posibles estereoisómeros del compuesto, incluyendo composiciones que incluyen la mezcla racémica de los dos enantiómeros, así como composiciones que incluyen cada enantiómero individualmente, sustancialmente libre del otro enantiómero. Así, por ejemplo, se contempla aquí una composición que incluye el enantiómero S de un compuesto sustancialmente libre del enantiómero R, o el enantiómero R sustancialmente libre del enantiómero S. Si el compuesto nombrado incluye más de un centro quiral, el alcance de la presente divulgación también incluye composiciones que incluyen mezclas de proporciones variables entre los diastereómeros, así como composiciones que incluyen uno o más diastereómeros sustancialmente libres de uno o más de los otros diastereómeros. Por "sustancialmente libre" se entiende que la composición incluye menos del 25%, 15%, 10%, 8%, 5%, 3% o menos del 1% del enantiómero o diastereómero menor.

El IPA-3 se discute en la Patente de EE.UU. 8.771.682 y Solicitudes publicadas en EE.UU. n° 2015/359815 y 2008/097062.

Otros inhibidores de PAK son conocidos en la técnica y también pueden ser utilizados. Véase, por ejemplo, Patente de EE.UU. n° 8.771.682, (Eswaran, et al., Structure. 2007; 15:201-213 Nheu et al., Cancer J. 2002; 8:328-336 Porchia, et al., "A Celecoxib Derivative, Directly Targets p21 Activated Kinase." Mol Pharmacol. 2007).

2. Otros agentes activos

Otros agentes activos incluyen, por ejemplo, agentes terapéuticos, nutricionales, de diagnóstico y profilácticos. Los agentes activos pueden ser agentes activos de moléculas pequeñas o biomacromoléculas, como proteínas, polipéptidos o ácidos nucleicos. Los agentes activos de molécula pequeña adecuados incluyen compuestos orgánicos y organometálicos. Los agentes activos de molécula pequeña pueden ser un compuesto hidrofílico, hidrófobo o anfifílico.

Los agentes terapéuticos ejemplares que pueden incorporarse a las composiciones incluyen antígenos tumorales, epítopos de células T CD4+, citoquinas, agentes quimioterapéuticos, radionúclidos, inhibidores de transducción de señales de moléculas pequeñas, antenas fototérmicas, anticuerpos monoclonales, moléculas de señalización de peligro inmunológico, otros inmunoterapéuticos, enzimas, antibióticos antivirales (especialmente inhibidores de la proteasa solos o en combinación con nucleósidos para el tratamiento del VIH o la hepatitis B o C), antiparasitarios (helmintos, protozoos), factores de crecimiento, inhibidores del crecimiento, hormonas, antagonistas hormonales, anticuerpos y fragmentos bioactivos de los mismos (incluidos los anticuerpos humanizados, de cadena única y quiméricos), formulaciones de antígenos y vacunas (incluidos los adyuvantes), fármacos peptídicos antiinflamatorios, inmunomoduladores (incluidos los ligandos que se unen a los receptores tipo Toll(incluidos, pero no limitados a, los oligonucleótidos CpG) para activar el sistema inmunitario innato, moléculas que movilizan y optimizan el sistema inmunitario adaptativo, moléculas que activan o sobrerregulan la acción de los linfocitos T citotóxicos, las células asesinas naturales y las células T auxiliares, y moléculas que desactivan o subregulan las células T supresoras o reguladoras), agentes que promueven la captación de nanolipogeles en las células (incluidas las células dendríticas y otras células presentadoras de antígenos), nutracéuticos como las vitaminas, y fármacos oligonucleótidos (incluidos ADN, ARN, antisentido, aptámeros, los ARN de interferencia corta, ribozimas, secuencias guía externas para la ribonucleasa P y los agentes formadores de tríplex).

Los agentes de diagnóstico ejemplares incluyen moléculas paramagnéticas, compuestos fluorescentes, moléculas magnéticas y radionúclidos, agentes de imagen de rayos X y agentes de contraste.

Los agentes activos representativos, incluidos los agentes quimioterapéuticos, se discuten con más detalle a continuación con respecto a las terapias combinadas.

Los liposomas estéricamente estabilizados o las composiciones farmacéuticas que comprenden el liposoma estéricamente estabilizado pueden contener dos o más agentes activos.

C. Composiciones farmacéuticas

Se proporcionan composiciones farmacéuticas que incluyen liposomas estéricamente estabilizados. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse por vía parenteral (inyección intramuscular, intraperitoneal, intravenosa (IV) o subcutánea), transdérmica (ya sea de forma pasiva o mediante iontoforesis o electroporación) o transmucosa (nasal, vaginal, rectal o sublingual) o mediante inserciones bioerodables, y pueden formularse en formas de dosificación adecuadas para cada vía de administración.

Los liposomas estéricamente estabilizados o las composiciones farmacéuticas que comprenden el liposoma estéricamente estabilizado pueden administrarse sistémicamente, por ejemplo, por administración intravenosa o intraperitoneal, en una cantidad eficaz para la entrega de las composiciones a las células objetivo. Otras vías posibles son la transdérmica o la oral.

Los liposomas estéricamente estabilizados o las composiciones farmacéuticas que comprenden el liposoma estéricamente estabilizado pueden administrarse localmente, por ejemplo, por inyección directamente en un sitio a tratar. Los liposomas estabilizados estéricamente o las composiciones farmacéuticas que comprenden el liposoma estéricamente estabilizado pueden inyectarse o administrarse de otro modo directamente a uno o más tumores. Por lo general, la inyección local provoca un aumento de la concentración localizada de las composiciones que es mayor que la que puede lograrse mediante la administración sistémica. Los liposomas estéricamente estabilizados o las composiciones farmacéuticas que comprenden el liposoma estéricamente estabilizado pueden administrarse localmente a las células apropiadas utilizando un catéter o una jeringa. Otros medios para suministrar dichas composiciones localmente a las células incluyen el uso de bombas de infusión (por ejemplo, de Alza Corporation, Palo Alto, California) o la incorporación de las composiciones en implantes poliméricos (véase, por ejemplo, P. Johnson y J. G. Lloyd-Jones, eds., Drug Delivery Systems (Chichester, Inglaterra: Ellis Horwood Ltd., 1987), que puede efectuar una liberación sostenida del fármaco en la zona inmediata del implante.

Las composiciones liposomales pueden ser suministradas a la célula directamente, como por ejemplo, por contacto con la célula, o indirectamente, como por la acción de cualquier proceso biológico. Por ejemplo, los liposomas pueden formularse en un portador o vehículo fisiológicamente aceptable, e inyectarse en un tejido o fluido que rodee a la célula.

A medida que se realicen estudios adicionales, surgirá información sobre los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento de diversas afecciones en diversos pacientes, y el trabajador con experiencia normal, teniendo en cuenta el contexto terapéutico, la edad y la salud general del receptor, podrá determinar la dosificación adecuada. La dosificación seleccionada depende del efecto terapéutico deseado, de la vía de administración y de la duración del tratamiento deseado. En general, se administran a los mamíferos niveles de dosificación de 0,001 a 10 mg/kg de peso corporal al día. En general, para la inyección o infusión intravenosa, la dosificación puede ser menor. Generalmente, la cantidad total del agente activo asociado al liposoma que se administra a un individuo será menor que la cantidad del agente activo no asociado que debe administrarse para obtener el mismo efecto deseado o previsto y/o puede presentar una toxicidad reducida.

1. Formulaciones para la administración parenteral

Los liposomas estéricamente estabilizados o las composiciones farmacéuticas que comprenden el liposoma estéricamente estabilizado pueden administrarse en una solución acuosa, por inyección parenteral.

La formulación puede estar en forma de suspensión o emulsión. En general, se proporcionan composiciones farmacéuticas que incluyen cantidades efectivas de uno o más agentes activos que opcionalmente incluyen diluyentes, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adyuvantes y/o portadores farmacéuticamente aceptables. Dichas composiciones pueden incluir diluyentes como agua estéril, solución salina tamponada con diversos contenidos de tampón (por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato), pH y concentración iónica; y opcionalmente, aditivos como detergentes y agentes solubilizantes (por ejemplo, TWEEN® 20, TWEEN® 80 también denominado polisorbato 20 u 80), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio) y conservantes (por ejemplo, Thimersol, alcohol bencílico) y sustancias de carga (por ejemplo, lactosa, manitol). Ejemplos de disolventes o vehículos no acuosos son el propilenglicol, el polietilenglicol, los aceites vegetales, como el aceite de oliva y el aceite de maíz, la gelatina y los ésteres orgánicos inyectables, como el oleato de etilo. Las formulaciones pueden ser liofilizadas y redisueltas/resuspendidas inmediatamente antes de su uso. La formulación puede esterilizarse, por ejemplo, mediante la filtración a través de un filtro que retenga las bacterias, incorporando agentes esterilizantes a las composiciones, irradiando las composiciones o calentando las composiciones.

2. Otras formulaciones

Las composiciones liposomales pueden aplicarse tópicamente. La administración tópica puede incluir la aplicación en la mucosa pulmonar, nasal, oral (sublingual, bucal), vaginal o rectal. Estos procedimientos de administración pueden hacerse efectivos formulando el liposoma con elementos de transporte transdérmico o mucoso. En el caso de la administración transdérmica, estos elementos pueden incluir potenciadores químicos o físicos, como la electroporación o la administración con microagujas. Para la administración en la mucosa se prefiere la PEGilación del liposoma o la adición de quitosano u otros permeantes de la mucosa o elementos protectores del PH para la administración oral.

Los liposomas pueden administrarse a los pulmones (Taylory Newton, Thorax. 1992 Abr; 47(4): 257-259). Se puede utilizar una amplia gama de dispositivos mecánicos diseñados para la administración pulmonar de productos terapéuticos, incluidos, pero no limitados a, los nebulizadores, los inhaladores de dosis medida y los inhaladores de polvo, todos ellos conocidos por los expertos en la técnica. Algunos ejemplos específicos de dispositivos disponibles en el mercado son el nebulizador Ultravent® (Mallinckrodt Inc., St. Louis, Mo.); el nebulizador Acorn® II (Marquest Medical Products, Englewood, Colo.); el inhalador de dosis medida Ventolin® (Glaxo Inc., Research Triangle Park, N.C.); y el inhalador de polvo Spinhaler® (Fisons Corp., Bedford, Mass.). Nektar, Alkermes y Mannkind tienen preparaciones de insulina en polvo inhalable aprobadas o en ensayos clínicos en los que la tecnología podría aplicarse a las formulaciones aquí descritas.

Las formulaciones para la administración a la mucosa serán típicamente partículas de fármaco secadas por pulverización, que pueden incorporarse a un comprimido, gel, cápsula, suspensión o emulsión. Los excipientes farmacéuticos estándar están disponibles en cualquier formulador.

Los liposomas también se han formulado para la administración oral (Woodley, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.

1985;2(1):1-18 Hua, Front Pharmacol. 2014; 5: 138etc.). Las formulaciones orales pueden presentarse en forma de goma masticable, tiras de gel, comprimidos, cápsulas o pastillas. Las formulaciones orales pueden incluir excipientes u otras modificaciones de la partícula que pueden conferir protección entérica o mejorar la administración a través del tracto gastrointestinal, incluidos los epitelios y la mucosa intestinal (véase Samstein, et al., Biomaterials, 29(6):703-8 (2008).

También se pueden preparar formulaciones transdérmicas. Suelen ser pomadas, lociones, aspersiones o parches, que pueden prepararse utilizando tecnología estándar. Las formulaciones transdérmicas pueden incluir potenciadores de la penetración. Los potenciadores químicos y los procedimientos físicos, como la electroporación y las microagujas, pueden funcionar conjuntamente con este procedimiento.

MI. Liposomas y composiciones para su uso

Los liposomas estéricamente estabilizados y las composiciones farmacéuticas que comprenden el liposoma estéricamente estabilizado pueden utilizarse para administrar agentes activos in vitro e in vivo. Un uso típico in vivo incluye la administración a un sujeto que lo necesita de una cantidad eficaz de los liposomas estéricamente estabilizados o de composiciones farmacéuticas que comprenden el liposoma estéricamente estabilizado para reducir uno o más síntomas de una enfermedad o trastorno.

En general, las composiciones divulgadas y sus usos son útiles en el contexto del cáncer, incluyendo la terapia de tumores. En consecuencia, se proporcionan liposomas estéricamente estabilizados y composiciones farmacéuticas que comprenden el liposoma estéricamente estabilizado para su uso en el tratamiento del cáncer. El cáncer es típicamente un cáncer positivo para PAK-1, por ejemplo un cáncer de próstata o un cáncer de mama. Los procedimientos típicamente incluyen la administración a un sujeto que lo necesita de una cantidad efectiva de los liposomas estéricamente estabilizados o de composiciones farmacéuticas que comprenden el liposoma estéricamente estabilizado para reducir uno o más síntomas de cáncer. Por ejemplo, cantidades terapéuticamente efectivas de los liposomas estéricamente estabilizados o de las composiciones farmacéuticas que comprenden el liposoma estéricamente estabilizado utilizadas en el tratamiento del cáncer generalmente matarán las células tumorales o inhibirán la proliferación o la metástasis de las células tumorales o una combinación de ellas. Los síntomas del cáncer pueden ser físicos, como la carga tumoral, o biológicos, como la apoptosis de las células cancerosas. Por ejemplo, de los liposomas estéricamente estabilizados o de las composiciones farmacéuticas que comprenden el liposoma estéricamente estabilizado pueden ser administrados en una cantidad eficaz para matar las células cancerosas, mejorar la supervivencia de un sujeto con cáncer, o una combinación de los mismos. Las cantidades efectivas reales de la composición pueden variar en función de factores como la especificidad, la composición particular formulada, el modo de administración y la edad, el peso, la condición del sujeto que se está tratando, así como la vía de administración y la enfermedad o trastorno.

Una cantidad efectiva de los liposomas estéricamente estabilizados o de las composiciones farmacéuticas que comprenden el liposoma estéricamente estabilizado puede compararse con un control. Los controles adecuados son conocidos en la técnica. Un control típico es la comparación de una condición o síntoma de un sujeto antes y después de la administración de la composición. La condición o síntoma puede ser una lectura bioquímica, molecular, fisiológica o patológica. El control puede ser un sujeto emparejado al que se le administra un agente terapéutico diferente. Por consiguiente, los liposomas estéricamente estabilizados o las composiciones farmacéuticas que comprenden el liposoma estéricamente estabilizado aquí divulgado pueden compararse con otros tratamientos reconocidos en la técnica para la enfermedad o condición a tratar. Los resultados obtenidos con los liposomas estéricamente estabilizados o las composiciones farmacéuticas que comprenden el liposoma estéricamente estabilizado pueden compararse con los resultados obtenidos con el fármaco libre (por ejemplo, el fármaco sin vehículo de suministro).

En un animal maduro, normalmente se mantiene un equilibrio entre la renovación celular y la muerte celular en la mayoría de los órganos y tejidos. Los distintos tipos de células maduras del organismo tienen una vida determinada; a medida que estas células mueren, se generan nuevas células mediante la proliferación y diferenciación de varios tipos de células madre. En circunstancias normales, la producción de nuevas células se regula de tal manera que el número de cualquier tipo de célula se mantiene constante. Sin embargo, en ocasiones surgen células que ya no responden a los mecanismos normales de control del crecimiento. Estas células dan lugar a clones de células que pueden expandirse hasta un tamaño considerable, produciendo un tumor o neoplasia. Un tumor que no es capaz de crecer indefinidamente y que no invade ampliamente el tejido sano circundante es benigno. Un tumor que sigue creciendo y se vuelve progresivamente invasivo es maligno. El término cáncer se refiere específicamente a un tumor maligno. Además del crecimiento incontrolado, los tumores malignos presentan metástasis. En este proceso, pequeños grupos de células cancerosas se desprenden de un tumor, invaden los vasos sanguíneos o linfáticos y son transportados a otros tejidos, donde siguen proliferando. De este modo, un tumor primario en un sitio puede dar lugar a un tumor secundario en otro sitio.

Los liposomas estéricamente estabilizados o las composiciones farmacéuticas que comprenden el liposoma estéricamente estabilizado descrito en el presente documento son útiles para tratar a sujetos que tienen tumores benignos o malignos, retrasando o inhibiendo el crecimiento de un tumor en un sujeto, reduciendo el crecimiento o el tamaño del tumor, inhibiendo o reduciendo la metástasis del tumor, y/o inhibiendo o reduciendo los síntomas asociados con el desarrollo o el crecimiento del tumor.

1. Sujetos que se van a tratar

Los tumores, por ejemplo los tumores malignos, que pueden sertratados se clasifican aquí según el origen embrionario del tejido del que se deriva el tumor. Los carcinomas son tumores que surgen de los tejidos endodérmicos o ectodérmicos, como la piel o el revestimiento epitelial de los órganos y glándulas internas. Los liposomas estéricamente estabilizados divulgados o las composiciones farmacéuticas que comprenden el liposoma estéricamente estabilizado son particularmente eficaces en el tratamiento de carcinomas. Los sarcomas, que surgen con menos frecuencia, se derivan de tejidos conectivos mesodérmicos como el hueso, la grasa y el cartílago. Las leucemias y los linfomas son tumores malignos de las células hematopoyéticas de la médula ósea. Las leucemias proliferan como células individuales, mientras que los linfomas tienden a crecer como masas tumorales. Los tumores malignos pueden aparecer en numerosos órganos o tejidos del cuerpo para establecer un cáncer.

Los tipos de cáncer que pueden tratarse con los liposomas estéricamente estabilizados proporcionados o las composiciones farmacéuticas que comprenden el liposoma estéricamente estabilizado incluyen, pero no se limitan a, cánceres como el vascular, como el mieloma múltiple, adenocarcinomas y sarcomas, de hueso, vejiga, cerebro, mama, cervical, colo-rectal, esofágico, renal, hepático, pulmonar, nasofaríngeo, pancreático, prostático, cutáneo, estomacal y uterino. El cáncer puede ser de próstata o de mama.

Los liposomas estéricamente estabilizados o las composiciones farmacéuticas que comprenden el liposoma estéricamente estabilizado pueden utilizarse para tratar múltiples tipos de cáncer simultáneamente. Los liposomas estéricamente estabilizados o las composiciones farmacéuticas que comprenden el liposoma estéricamente estabilizado también pueden utilizarse para tratar metástasis o tumores en múltiples localizaciones.

Las serina-treonina quinasas PAK, PAK-1 en particular, se han asociado con una variedad de condiciones patológicas, incluyendo el cáncer (Kichina, et al., Expert Opin Ther Targets. 2010; 14: 703-25). La PAK-1 está regulada por autoinhibición, y se cree que es una buena diana terapéutica para el tratamiento del cáncer mediante el uso de pequeñas moléculas que pueden provocar cambios conformacionales en la proteína que perturben su autorregulación (Kichina, et al., Expert Opin Ther Targets. 2010; 14: 703-25, Cheetham, Curr Opin Struct Biol. 2004; 14: 700-5). Estudios anteriores demostraron que Rac1, un regulador corriiente arriba de PAK-1, promueve la supervivencia, la proliferación y la migración transendotelial de las células del cáncer de próstata (Goc, et al., PLoS One. 2012; 7: e40594). Aunque está ausente en los tejidos de la próstata normal y de la hiperplasia prostática benigna humana, los estudios revelaron que PAK-1 se expresa en las células del cáncer de próstata, en los tumores de próstata y en las colonias metastásicas de los pulmones de los pacientes (Goc, et al., J Biol Chem. 2013; 288: 3025-35), y que PAK-1 es importante en la transición epitelial-mesenquimal (EMT) inducida por TGFp en las células de cáncer de próstata (Al-Azayzih, etal., Biochim Biophys Acta. 2015; 1853: 1229-39).

Por lo tanto, el cáncer puede incluir células cancerosas con una PAK elevada, preferentemente PAK-1, en relación con la correspondiente en las células no cancerosas. Véase también, Kumar et al., Nat Rev Cancer. 2006; 6:459-471. IPA-3 también tiene actividad contra otras PAKS del Grupo I, incluidas PAK-2 y PAK-3. Por lo tanto, las células cancerosas pueden tener un nivel elevado de PAK-2 o PAK-3. El cáncer puede ser un cáncer de próstata o un cáncer de mama con una PAK elevada, preferiblemente una PAK-1 elevada. IPA-3 matará preferentemente a las células que expresen o tengan una elevada PAK-1 en relación con las células con baja o nula expresión de PAK-1. Por lo tanto, IPA-3 puede dirigirse a las células que expresan PAK, en particular a las que expresan PAK-1, incluso sin una fracción de direccionamiento.

Los liposomas estabilizados estéricamente o las composiciones farmacéuticas que comprenden el liposoma estéricamente estabilizado pueden utilizarse para tratar una enfermedad no cancerosa en la que una PAK, particularmente la PAK-1, está elevada.

2. Regímenes de dosificación

En un proceso de cribado de inhibidores alostéricos que direccionan la activación de PAK-1, se identificó a IPA-3 como una pequeña molécula inhibidora de PAK-1, y se propuso entonces como un potencial candidato terapéutico para varias patologías humanas, incluyendo el cáncer (Deacon, et al., Chem Biol. 2008; 15: 322-31). Sin embargo, el IPA-3 en su forma libre tiene una semivida muy corta in vivo debido a su rápido metabolismo (Rudolph, et al., J Med Chem.

2015; 58: 111-29). Así, la naturaleza metabólicamente lábil de IPA-3 se convierte en un importante cuello de botella para su uso con fines terapéuticos. Aunque la forma libre de IPA-3 fue eficaz para inhibir el crecimiento del cáncer de próstata en nuestros estudios, esto requirió la administración diaria del fármaco (Al-Azayzih, et al., Biochim Biophys Acta. 2015; 1853: 1229-39). Esto exigía un procedimiento fiable para administrar específicamente IPA-3 a las células del cáncer de próstata in vivo que mejorara la estabilidad y la eficacia de IPA-3, redujera la frecuencia de administración del fármaco y evitara los posibles efectos secundarios de IPA-3 libre.

Al igual que en el caso de IPA-3, la mayor parte de la investigación basada en el laboratorio sobre el cáncer de próstata no llega a la clínica debido a diversas cuestiones relacionadas con la dosis, la frecuencia de administración del fármaco, la estabilidad del fármaco particular in vivo y las reacciones adversas. La principal limitación de muchos fármacos anticancerígenos se debe a su rápido metabolismo y/o a sus efectos secundarios tóxicos. Una formulación ideal de dosificación de fármacos para la terapia anticancerosa tiene que presentar un suministro específico de una dosis eficaz de fármaco en el tejido objetivo durante el período de tiempo requerido.

Los Ejemplos que se presentan a continuación muestran que los liposomas estéricamente estabilizados divulgados o las composiciones farmacéuticas que comprenden el liposoma estéricamente estabilizado pueden administrarse con menos frecuencia pero, sin embargo, tienen un mayor impacto en el fármaco libre de cáncer. En consecuencia, se proporcionan regímenes de dosificación preferidos. Los liposomas estéricamente estabilizados o las composiciones farmacéuticas que comprenden el liposoma estéricamente estabilizado pueden administrarse con menos frecuencia que el fármaco libre para conseguir un efecto similar, igual o mayor, preferiblemente con menos toxicidad. La dosificación de los liposomas estéricamente estabilizados o de las composiciones farmacéuticas que comprenden el liposoma estéricamente estabilizado puede incluir la misma cantidad o menos de fármaco que la dosificación de fármaco libre.

La frecuencia de administración puede ser, por ejemplo, una, dos, tres, cuatro o más veces al día, semanalmente, cada dos semanas o mensualmente Los liposomas estéricamente estabilizados o las composiciones farmacéuticas que comprenden el liposoma estéricamente estabilizado pueden administrarse a un sujeto una vez cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o 31 días. La frecuencia de administración puede ser una, dos o tres veces por semana, o es una, dos o tres veces cada dos semanas, o es una, dos o tres veces cada cuatro semanas. Los liposomas estéricamente estabilizados o las composiciones farmacéuticas que comprenden el liposoma estéricamente estabilizado pueden administrarse a un sujeto con cáncer de 1 a 3 veces, preferiblemente 2 veces, a la semana.

3. Terapias de combinación

También se divulgan terapias combinadas. Los liposomas estéricamente estabilizados divulgados o las composiciones farmacéuticas que comprenden el liposoma estéricamente estabilizado pueden incluir, o pueden ser administrados a un sujeto que los necesite solos o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Los agentes terapéuticos adicionales se seleccionan en función de la afección, el trastorno o la enfermedad a tratar. Por ejemplo, los liposomas estéricamente estabilizados o las composiciones farmacéuticas que comprenden el liposoma estéricamente estabilizado pueden coadministrarse con uno o más agentes adicionales que tratan el cáncer. El agente terapéutico adicional puede dirigirse a una vía diferente, de modo que el efecto combinado de las terapias sea mayor que el de cada una por separado.

El término "combinación" o "combinado" se utiliza para referirse a la administración concomitante, simultánea o secuencial de dos o más agentes. Por lo tanto, las combinaciones pueden administrarse de forma concomitante (por ejemplo, como una mezcla), de forma separada pero simultánea (por ejemplo, a través de líneas intravenosas separadas en el mismo sujeto), o de forma secuencial (por ejemplo, uno de los compuestos o agentes se administra primero seguido del segundo). Los agentes terapéuticos adicionales pueden administrarse local o sistémicamente al sujeto, o recubrirse o incorporarse a un dispositivo o injerto. El agente o agentes adicionales pueden formar parte del mismo liposoma, añadirse a diferentes liposomas u otros vehículos de administración, como las nanopartículas poliméricas, o administrarse como fármaco libre.

Entre los agentes terapéuticos adicionales se encuentran las terapias convencionales contra el cáncer, como los agentes quimioterapéuticos, las citoquinas, las quimiocinas y la radioterapia. La mayoría de los fármacos quimioterapéuticos pueden dividirse en: agentes alquilantes, antimetabolitos, antraciclinas, alcaloides vegetales, inhibidores de la topoisomerasa y otros agentes antitumorales. Todos estos fármacos afectan de alguna manera a la división celular o a la síntesis y función del ADN. Otras terapias son los anticuerpos monoclonales y los nuevos inhibidores de la tirosina quinasa, por ejemplo, el mesilato de imatinib (GLEEVEC® o GLIVEC®), que se dirige directamente a una anomalía molecular en determinados tipos de cáncer (leucemia mielógena crónica, tumores del estroma gastrointestinal).

Los agentes quimioterapéuticos representativos incluyen, entre otros, amsacrina, bleomicina, busulfán, capecitabina, carboplatino, carmustina, clorambucil, cisplatino, cladribina, clofarabina, crisantaspasa, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, dactinomicina, daunorubicina, docetaxel, doxorubicina, epipodofilotoxinas, epirubicina, etopósido, fosfato de etopósido, fludarabina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxicarbamida, idarubicina, ifosfamida, irinotecán, leucovorina, doxorubicina liposomal, daunorubicina liposomal , lomustina, mecloretamina, melfalán, mercaptopurina, mesna, metotrexato, mitomicina, mitoxantrona, oxaliplatino, paclitaxel, pemetrexed, pentostatina, procarbazina, raltitrexed, satraplatino, estreptozocina, tenipósido, tegafur-uracilo, temozolomida, tenipósido, tiotepa, tioguanina, topotecán, treosulfán, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina, taxol y sus derivados, trastuzumab (HERCEPTIN®), cetuximab y rituximab (RITUXAN® o MABTHERA®), bevacizumab (AVASTIN®) y sus combinaciones. Los agentes pro-apoptóticos representativos incluyen, pero no se limitan a, fludarabinetaurosporina, cicloheximida, actinomicina D, lactosilceramida, 15d-PGJ(2)y combinaciones de los mismos.

Ejemplos

Ejemplo 1: Formulación y caracterización de SSL-IPA-3

Materiales y procedimientos

Productos químicos y reactivos

El IPA-3 se adquirió de Tocris Bioscience (Bristol, Reino Unido). Los fosfolípidos, 1, 2-distearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DSPC), 1, 2-distearoil-snglicero-3-fosfatidiletanolamina (DSPE), y 1, 2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[poli (etilenglicol) 2000 (DSPE-PEG) se adquirieron de Avanti Polar Lipids, Inc (Alabaster, Alabama). El colesterol y el MTT [bromuro de 3-(4, 5-dimetiltiazol-2il)-2, 5-difeniltetrazolio] se adquirieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri). Los medios de cultivo celular F-12K, EMEM y RPMI y sus suplementos, incluidos los antibióticos y el suero fetal bovino (FBS), se adquirieron de ATCC. Todos los demás productos químicos y disolventes eran de grado analítico y se obtuvieron de Fisher Scientific (Pittsburgh, PA).

Preparación de liposomas IPA-3 estabilizados estéricamente (SSL-IPA-3)

Los liposomas se prepararon utilizando el procedimiento de hidratación de lípidos finos seguido de ciclos de congelación-descongelación y una extrusión de alta presión como se ha descrito anteriormente Mock, et al., Integr Biol (Camb). 2013; 5: 172-82y Zhu, et al., J Pharm Sci. 2011; 100: 3146-59). La composición de los liposomas se muestra en la Tabla 1. En un matraz de fondo redondo se añadieron colesterol (5 pmol/ml), fosfolípidos incluyendo DSPC (9 pmol/ml) y DSPE-PEG (1 pmol/ml) en cloroformo e IPA-3 (4 pmol/ml) en etanol, y los disolventes se evaporaron al vacío en un baño de agua a 65°C utilizando un evaporador rotatorio (Buchi Labortechnik AG, Postlfach, Suiza). A continuación, la película fina formada se hidrató y se suspendió en tampón de fosfato de amonio (250 mM, pH 7,4) o en tampón salino de fosfato (PBS) para conseguir una concentración final de lípidos de 10 pmol/ml. A continuación, la formulación se sometió a cinco ciclos de congelación-descongelación con nitrógeno líquido por encima de la temperatura de transición de fase del lípido primario, antes de pasar cinco veces por una extrusora Lipex (Northern Lipids, Inc, Burnaby, BC Canadá) a 65°C utilizando membranas de policarbonato de doble apilado (80 nm, GE Osmonics, Trevose, Pennsylvania). El exceso de IPA-3 no encapsulado y de lípidos se eliminó mediante diálisis en sacarosa al 10% (p/v) durante al menos 20 horas (hrs) con tres cambios del medio de diálisis. El diámetro del liposoma se determinó utilizando un analizador de tamaño de partículas por dispersión de luz dinámica (Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments, Enigma Business Park, Grovewood Road, Malvern, Worcestershire, Reino Unido).

El tamaño de los liposomas se confirmó además utilizando imágenes de microscopía electrónica en tándem (TEM). Las suspensiones de liposomas se almacenaron a 4°C, protegidas de la luz, y se utilizaron entre 24 y 48 horas después de su preparación. También se formularon SSL vacías (hechas sin encapsulación de IPA-3) y se utilizaron como controles de vehículos. Se colocaron 10 pl de suspensión liposomal en una rejilla de cobre recubierta de carbono y pioloformo y se dejaron secar durante la noche. Las muestras se analizaron al día siguiente mediante TEM.

Cuantificación de IPA-3 en liposomas

Las suspensiones de SSL se recolectaron después de una diálisis nocturna y el IPA-3 se cuantificó mediante un procedimiento espectroscópico basado en su absorbancia a 360 nm. Se hicieron diluciones seriadas de la solución madre de IPA-3 en etanol ácido. La absorbancia a 360 nm se registró con un lector de microplacas Spectra Max M2 (MTX Lab Systems, Inc. Vienna, Virginia 22182 U.S.A.) y se representó frente a la concentración de IpA-3. Se utilizó una curva estándar (R2 > 0,99) para determinar la concentración de IPA-3 en SSL.

Caracterización del tamaño, el potencial zeta y la estabilidad física de los liposomas IPA-3

Se evaluó la estabilidad física de los liposomas de larga circulación que contenían IPA-3 en las condiciones de almacenamiento a 4°C. La fuga del fármaco de los liposomas se determinó extrayendo porciones de la suspensión de liposomas de un conjunto almacenado a pH 7,4 y 4°C a varios tiempos. Los liposomas IPA-3 se sometieron a diálisis y se volvieron a analizar para determinar el contenido de IPA-3 como se ha descrito anteriormente. Un cambio significativo en el contenido de IPA-3 se utilizó como indicación de la estabilidad del liposoma. Los cambios en el diámetro medio y el potencial zeta de los liposomas también se utilizaron para evaluar la estabilidad y se controlaron en tiempo extra utilizando un Zetasizer Malvern de dispersión de luz dinámica. Las muestras se diluyeron 1 en 10 (v/v) con PBS para las mediciones de tamaño y potencial zeta. Como los liposomas IPA-3 iban a ser utilizados para estudios in vivo después de la reconstitución, se evaluó la estabilidad de IPA-3 después de la reconstitución durante períodos de tiempo crecientes, incluyendo 3 días, el tiempo correspondiente a la dosificación in vivo . El análisis mostró que más del 80% de IPA-3 se mantenía en la SSL después de 3 días (Figura 1I). De hecho, parece que se mantiene una buena estabilidad hasta al menos 7 días en los liposomas reconstituidos.

Resultados

SSL-IPA-3 (Tabla 1) tenía un diámetro hidrodinámico de partículas de aproximadamente 139 nm, y este valor no cambió significativamente durante un período de dos semanas (Tabla 2). El índice de polidispersidad (PDI), una medida de la distribución de los diámetros, se mantuvo en valores inferiores a 0,14 hasta 14 días. Estos valores de PDI están dentro del tamaño recomendado para aplicaciones médicas, que es un PDI inferior a 0,3 (De La Vega, et al., Nanomedicine (Londres, Inglaterra). 2013; 8: 265-85). El potencialzeta (la carga superficial global de las partículas) tampoco cambió significativamente durante este tiempo.

La prueba de estabilidad mostró que el 70% de IPA-3 fue retenido por estos liposomas después de 7 días postformulación, y el 50% fue retenido después de 14 días. Las pruebas de estabilidad también mostraron que una alta cantidad de iPA-3 se retuvo en la SSL después de la reconstitución para la dosificación, hasta el 80% después de 3 días, y más del 60% después de 7 días post reconstitución (Fig. 1I). La fuga de fármacos de los liposomas se determinó extrayendo porciones de liposomas de un conjunto almacenado a pH 7,4 y 4°C en el punto de tiempo indicado. Después de la diálisis, los liposomas encapsulados con IPA-3 se analizaron para determinar el contenido de IPA-3 como se describe en los procedimientos. Los datos se presentan como la media ± SEM de la cantidad de IPA-3 retenida en función del tiempo.

Tabla 1. Composición del SSL-IPA-3

Tabla 2. Caracterización física de SSL-IPA-3

Ejemplo 2: SSL-IPA-3 tiene actividad antitumoral en diversas líneas celulares de cáncer de próstata humano.

Materiales y procedimientos

Líneas celulares y cultivo de células

Las líneas celulares de cáncer de próstata humano PC-3, LNCaP y DU-145 y las líneas celulares de cáncer de mama MCF-7 y MDA-231 se adquirieron de ATCC (Manassas, VA). Las células Pc -3, LNCaP y DU-145 se cultivaron en F12K, RPMI y EMEM, respectivamente. Las células MCF-7 y MDA-231 se cultivaron en RPMI. Todos los medios de cultivo se complementaron con un 10% de FBS y un 1% de antibióticos de penicilina/estreptomicina (ATCC). Todas las células se mantuvieron a 37°C en incubadoras con 5% de CO2 y atmósfera humidificada.

Citotoxicidad in vitro de IPA-3 liposomal medida utilizando tinción MTT

La citotoxicidad del IPA-3 liposomal así como del IPA-3 libre se determinó en tres líneas celulares de cáncer de próstata (PC-3, LNCaP y DU-145) utilizando el ensayo MTT (Twentyman, et al., Br J Cancer. 1987; 56: 279-85). Para la comparación se utilizaron IPA-3 libre y SSL-IPA-3. Las células se sembraron en 4 placas de cultivo de tejidos de 48 pocillos a 5 x 10 células/ml y se incubaron a 37°C en un incubador con 5% de CO2 durante 24 horas. Este tiempo fue suficiente para que las células se adhirieran y reanudaran su crecimiento. Los liposomas se diluyeron en los diferentes medios de cultivo hasta sus concentraciones finales y los experimentos se realizaron por triplicado. Las células también se trataron con IPA-3 libre (1,56, 3,125, 6,25, 12,5, 25 y 50 j M), DMSO (vehículo para IPA-3) y liposomas vacíos (vehículos para IPA-3 encapsulado; indicados con barras blancas en los controles de la Figura 1D e IE) como controles. Las células se incubaron durante 24, 48 y 72 horas. Se añadió MTT en cada punto de tiempo, a una concentración final de 0,25 mg/ml y las placas se incubaron a 37°C. El MTT no reducido y el medio se aspiraron después de 2 horas y se sustituyeron por DMSo para disolver los cristales de formazen del MTT. Las placas se agitaron durante 15 minutos y la absorbancia se leyó a 590 nm utilizando un lector de placas Spectra Max M2 (BMG Lab Technologies, Inc., Durham, NC). La concentración de IPA-3 que produce una inhibición del crecimiento del 50% (IC50) se estimó a partir de la curva de concentración-efecto.

Citotoxicidad in vitro de IPA-3 liposomal medida utilizando tinción con anexina VyPI

Para evaluar la muerte de las células NRK se utilizó la tinción con anexina V y PI, además de la citometría de flujo, como se describió previamente con modificaciones (Cummings, et al., The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 2002; 302: 8-17). En resumen, las células se sembraron y se dejaron crecer durante 24 horas antes de añadir IPA-3 libre, SSL-IPA-3 o liposomas vacíos. Tras el tiempo indicado, se eliminó el medio y las células se lavaron dos veces con PBS y se incubaron en tampón de unión (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, pH 7,4) que contenía anexina VFITC (25 mg/ml) y PI (25 mg/ml) durante 10 minutos. A continuación, las células se lavaron tres veces con tampón de anexión, se liberaron de las monocapas utilizando un policía de goma y se cuantificó la tinción utilizando un citómetro de flujo Dako Cyan ADP 9 color (Beckman Coulter, Inc., Miami, FL). Para cada medición se contaron 10.000 eventos.

Análisis de inmunotransferencia

Las proteínas de las diferentes líneas celulares se recolectaron en el tampón RIPA, que contenía un cóctel de inhibidores de la proteasa (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Las concentraciones de proteínas se determinaron mediante el ensayo BCA. Se separaron muestras de proteínas de 40 jg en geles de SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa, que se bloquearon en leche seca desgrasada al 5% (p/v) en solución salina tamponada con Tris-Tween 20 (TBS-T) durante 2 horas. A continuación, las membranas se incubaron con un anticuerpo PAK-1 de conejo a una dilución de 1:500 en TBS-T al 1% (p/v) de BSA durante toda la noche. Se utilizaron anticuerpos contra GAPDH (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) a una dilución de 1:200 en BSA al 1% (p/v) en TBST durante 1 hora. A continuación, las membranas se incubaron con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa apropiado (Promega, Madison, WI) utilizado a una dilución de 1:2500. A continuación, se lavó la membrana con TBS-T tres veces durante 10 minutos cada una y se obtuvieron imágenes con un generador de imágenes digitales Fluorchem SP (Alpha Innotech, San Leandro, CA, EE.UU.). La densitometría se realizó utilizando el software National Institutes of Health Image J.

Análisis estadístico

Todos los experimentos in vitro se repitieron al menos tres veces (n = 3) por triplicado. Los resultados se muestran como la media de todas las réplicas ± SEM. Para determinar si las diferencias entre los grupos de tratamiento con IPA-3 libre y SSL-IPA-3 eran estadísticamente significativas, se utilizó una prueba ANOVA de dos vías seguida de un postest de Bonferroni. Se utilizó una prueba t de student de dos colas para comparar las diferencias en la expresión de PAK-1 entre las diferentes líneas celulares de cáncer, y para la comparación directa de los pesos de los xenoinjertos tumorales. El nivel de significación (alfa) se fijó en 0,05 (marcado con símbolos siempre que los datos son estadísticamente significativos).

Resultados

La actividad antitumoral de IPA-3 libre se determinó inicialmente in vitro para verificar que este compuesto inhibía el crecimiento de las células de cáncer de próstata. Nuestros datos mostraron que el IPA-3 libre, en concentraciones de 5-30 |jM, indujo disminuciones dependientes de la concentración y del tiempo en la tinción de MTT con un IC50 entre 10 y 35 j M, dependiendo de la línea celular. Curiosamente, las células DU-145 fueron menos susceptibles a la toxicidad de IPA-3 en comparación con las células PC-3 y LNCaP (Figuras 1A-C). Esta diferencia no fue resultado de las diferencias en la composición del medio (Figuras 1F-1H). El tratamiento de las células PC-3 con SSL-IPA-3 también disminuyó la tinción de MTT. SSL-IPA-3 no fue tan tóxico para estas células como el IPA-3 libre (Figuras 1D-1E). Todavía se detectaron disminuciones en la tinción de MTT a dosis de 20 j M y superiores en las células PC-3. SSLIPA-3 fue incapaz de inducir una disminución significativa de la tinción MTT en las células DU-145, incluso con la máxima eficacia de encapsulación de 30 j M de IPA-3. Estos datos demuestran que SSL-IPA-3 presenta una actividad anticancerígena in vitro.

La tinción con anexina V y PI se evaluó mediante citometría de flujo para estudiar más a fondo la muerte inducida por IPA-3 y SSL-IPA-3 en las células PC-3 (Figura 2). El tratamiento de las células con liposomas vacíos no aumentó de forma apreciable el porcentaje de células que se tiñeron de forma positiva, ni para la anexina V sola ni para la anexina y el PI después de 48 horas. Por el contrario, el tratamiento con iPA-3 libre (20-30 j M) aumentó significativamente el porcentaje de células con tinción positiva para la anexina V sola, así como aquellas con tinción positiva tanto para la anexina V como para el PI, lo que indica que el IPA-3 está induciendo la muerte celular a través de la apoptosis. El aumento de la tinción de anexina V y PI también dependió del tiempo. El SSLIPA-3 también aumentó el porcentaje de células con tinción positiva para la anexina V sola, pero pareció tener un efecto mayor en las células con tinción positiva para la anexina V y el PI. Además, SSL-IPA-3 también aumentó el número de células con tinción positiva para PI solo, lo que sugiere que la presencia de necrosis. El aumento de la tinción celular positiva para los marcadores de apoptosis tardía, así como la necrosis, sugieren que la encapsulación de IPA-3 en liposomas mejoró la muerte celular y puede ser más eficaz para eliminar las células tumorales in vivo.

Para comprobar si la sensibilidad diferencial de IPA-3 en las células DU-145 y PC-3 se debía a las diferencias en la actividad de PAK-1, se determinó la expresión de la proteína PAK-1 en las células PC-3, DU-145 y LNCaP, y se comparó con dos líneas celulares de cáncer de mama (MDA-231 y MCF-7). Los resultados indicaron que la expresión de PAK-1 era variable en todas las líneas celulares analizadas, detectándose niveles más altos en las células DU-145 y el nivel más bajo en las células MDA-231 (Figuras 3A). La comparación del nivel de expresión proteica de PAK-1 con el IC50 de IPA-3 libre mostró una excelente correlación con un R2 de 0,92 (Figuras 3B, Tabla 3). Las células con los niveles más altos de expresión de PAK-1 (DU-145 y MCF-7) tuvieron los IC50 más altos (~32 y 25 j M, respectivamente), mientras que las células con menor expresión de PAK-1 (células MDA-231 y LNCaP) tuvieron los IC50 más bajos (8 y 10 j M) respectivamente. Estos datos indican que las diferencias en la sensibilidad de las células a la SSL-IPA-3 están mediadas no por diferencias en la sensibilidad a las nanopartículas, sino más bien por diferencias en la expresión de PAK-1.

Tabla 3: Comparación del nivel de expresión proteica de PAK-1 con el IC50 de IPA-3 libre

Ejemplo 3: SSL-IPA-3 inhibe el crecimiento de xenoinjertos de tumores de próstata in vivo

Materiales y procedimientos

Xenoinjerto de tumor de próstata in vivo

Todos los procedimientos con animales enumerados en este artículo se llevaron a cabo según el protocolo aprobado por el Institutional Animal Care and Use Committee atthe Charlie Norwood Veterans Affairs Medical Center, Augusta, GA (protocolo # 12-06-049). Las células PC-3 se cultivaron hasta un 60-70 % de confluencia en frascos de 225 ml. A continuación, se recolectaron las células y se suspendieron en solución salina normal estéril. La suspensión celular (3 millones de células/ratón) se inyectó por vía subcutánea (SC) en ratones lampiños atímicos macho de 6-8 semanas de edad (Harlan, Indianápolis, IN) (n = 5-6). Todos los tratamientos (DMSO, liposomas vacíos, IPA-3 libre (5 mg/Kg), y SSL-IPA-3 (5 mg/kg) se iniciaron el día 7 desde la implantación del tumor, y se administraron dos veces por semana (i.p.). Los diámetros de los tumores se midieron 3 con calibradores digitales en los días 7, 14, 21 y 25, y el volumen del tumor en mm se calculó mediante la fórmula elipsoidal modificada (Volumen del tumor = 1'¿[longitud * anchura]). El tamaño medio de los tumores antes del tratamiento con 3 IPA-3 libres y SSL-IPA-3 era de 42 mm3. Los ratones fueron sacrificados el día 25 y los tumores fueron disecados, pesados y congelados para su posterior análisis inmunohistoquímico.

Ensayo TUNEL

El ensayo TUNEL para la detección in situ de la apoptosis se llevó a cabo utilizando el kit de detección de apoptosis in situ con fluoresceína ApopTag® (Millipore, MA) como se ha descrito anteriormente8. Las secciones congeladas tomadas de xenoinjertos de tumores de próstata se fijaron en paraformaldehído al 2% a 4°C durante 30 minutos. A continuación, los tejidos fijados se permeabilizaron en (etanol: ácido acético [2:1]) y se marcaron con fluoresceína 12-dUTP utilizando desoxinucleotidil transferasa terminal. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Las secciones de tejido se analizaron en busca de células apoptóticas con fluorescencia verde localizada utilizando un microscopio de fluorescencia invertido (Zeiss Axiovert100M, Carl Zeiss, Alemania).

Resultados

La inhibición de PAK-1 con IPA-3 redujo el crecimiento de xenoinjertos de tumores de próstata en ratones lampiños atímicos con administración diaria (Al-Azayzih, et al., Biochim Biophys Acta. 2015; 1853: 1229-39.). Se diseñó un ensayo para determinar si la administración de 2 días/semana de SSL-IPA-3 puede inhibir el crecimiento del xenoinjerto tumoral de células PC-3 in vivo, en comparación con la misma frecuencia de IPA-3 libre. Los resultados indicaron que la administración de 2 días/semana de SSL-IPA-3 fue efectivamente suficiente para inhibir el crecimiento de xenoinjertos tumorales de células PC-3, en comparación con los grupos administrados con liposomas vacíos e IPA-3 libre (Figuras 4A-4C). De hecho, la administración de dosis similares de IPA-3 libre (2 días/semana) no tuvo un efecto significativo sobre el crecimiento del xenoinjerto tumoral PC-3. No hubo ningún efecto significativo de la administración de liposomas vacíos, IPA-3 libre o SSL-IPA-3 sobre el peso corporal de los ratones incluso después de 25 días (Figura 4D). Estos datos muestran que SSL-IPA-3 es eficaz para inhibir el crecimiento de xenoinjertos de tumores de próstata in vivo.

El efecto de SSL-IPA-3 y de IPA-3 libre sobre la apoptosis en los xenoinjertos de tumores de próstata de células PC-3 in vivo se probó utilizando la tinción TUNEL. Los resultados indicaron que tanto los tratamientos con SSL-IPA-3 como con iPA-3 libre dieron lugar a aumentos significativos del número de células apoptóticas por campo en comparación con los grupos de control, pero el efecto sobre la apoptosis fue mayor en el grupo tratado con SSL-IPA-3, en comparación con el grupo tratado con IPA-3 libre (Figura 5). Así, la mayor capacidad de SSL-IPA-3 para limitar el crecimiento de los tumores de próstata in vivo se correlaciona con el aumento de la apoptosis.

Los Ejemplos anteriores muestran que el IPA-3 se encapsuló de forma eficaz y estable en el SSL. El análisis del potencial zeta y el tamaño indicaron que estas nanopartículas serían funcionales para su aplicación clínica, y la actividad de estas formulaciones se verificó in vitro. Los SSL-IPA-3 no fueron tan eficaces como los IPA-3 libres in vitro e in vivo, como se observa habitualmente en muchos estudios (Zhu, et al., JPharm Sci. 2011; 100: 3146-59 Mock, et al., Integr Biol (Camb). 2013; 5: 172-82; Quach, et al., Mol Pharm. 2014; 11: 3443-51). Sin embargo, se demostró que el efecto de SSL-IPA-3 depende del tipo de célula y está mediado por el nivel de expresión de PAK-1. La menor susceptibilidad de las células DU-145 a los liposomas SSL-IPA-3 reflejaba efectivamente su menor susceptibilidad al IPA-3 libre. Estas diferencias no se debieron a la diferencia de sensibilidad a la formulación utilizada, ya que las células DU-145 y PC-3 fueron igualmente sensibles a otro fármaco anticanceroso, la doxorrubicina, encapsulado en SSL y en una formulación liposomal modificada (Mock, et al., Integr Biol (Camb). 2013; 5: 172-82 Zhu, et al., J Pharm Sci. 2011; 100: 3146-59). Los estudios in vitro también revelaron que IPA-3 libre muestra una mayor actividad antitumoral que SSL-IPA-3. El IPA-3 encapsulado en SSL debe liberarse primero de los liposomas antes de actuar sobre su objetivo PAK-1. Estos datos también indican que la eficacia terapéutica de SSL-IPA-3 puede ser limitada en los cánceres que expresan altos niveles de PAK-1. También es posible que la expresión diferencial de las PAKen estos cánceres pueda mitigar la toxicidad.

La caracterización biofísica de SSL-IPA-3 mostró una excelente estabilidad, basada en el mantenimiento del potencial zeta, el tamaño y los niveles de IPA-3 durante al menos 7 días. Debido a su lipofilicidad, es probable que el IPA-3 se incorpore mayoritariamente a la bicapa de fosfolípidos de los liposomas, lo que proporciona un entorno hidrófobo. Una vez atrapados, los IPA-3 pueden permanecer en la bicapa liposomal debido a su menor afinidad por las regiones acuosas interna y externa de los liposomas (Allen, et al., Drugs. 1998; 56: 747-56 Immordino, et al., Revista internacional de nanomedicina. 2006; 1: 297-315). Sin embargo, si se le da suficiente tiempo, el IPA-3 puede disociarse del SSL. Esta puede ser la causa de la disminución de los niveles de IPA-3 observada en estas formulaciones después de 14 días. No obstante, los resultados muestran que la SSL-IPA-3 es razonablemente estable y terapéuticamente activa, incluso en fluidos biológicos. La liofilización es un enfoque prometedor para garantizar la extensión de la vida útil y la estabilidad a largo plazo de los liposomas. Así pues, también podrían utilizarse procedimientos como la sustitución del agua y la vitrificación para producir una vida útil prolongada (Chen, et al., Journal of controlled release : official journal ofthe Controlled Release Society. 2010; 142: 299-311).

Los resultados también muestran que la administración de 2 días/semana de SSL-IPA-3 es eficaz para disminuir el crecimiento de células de próstata humanas in vitro y de xenoinjertos tumorales (PC-3) in vivo. Además, los datos mostraron una mayor eficacia de SSL-IPA-3 en comparación con el IPA-3 libre, lo que indica que la actividad de SSL-IPA-3 es más eficaz en un entorno in vivo. Se cree que el aumento de la eficacia del SSL-IPA-3, en comparación con el IPA-3 libre, se debe, al menos en parte, a que la encapsulación del IPA-3 en el SSL prolonga la semivida del IPA-3 y supera su rápido metabolismo en su forma libre. Las implicaciones de estos hallazgos son significativas porque indican una disminución de la dosificación, con una mayor eficacia, lo que podría disminuir los efectos secundarios y otras toxicidades de dianas ajenas asociadas a los agentes anticancerígenos. Aunque los experimentos de este estudio se centran en la actividad de SSL-IPA-3 en el cáncer de próstata, esta estrategia de direccionamiento puede utilizarse además para atacar otros tipos de cáncer, como el de cáncer de mama, tal y como demostraron los estudios in vitro.

En conclusión, la formulación de nanopartículas basada en SSL ejemplificada es razonablemente estable y muestra una excelente eficacia tanto in vitro como in vivo. Estos datos indican que SSL-IPA-3 es una estrategia de direccionamiento eficaz para inhibir el crecimiento del cáncer de próstata. Los datos de este estudio también indican que la actividad de IPA-3 depende de las células y está mediada por el nivel de expresión de PAK-1 en las células cancerosas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un liposoma estéricamente estabilizado que comprende una relación molar de 9:1:5:4 de 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina : 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[poli(etilenglicol)-2000]: colesterol: inhibidor dirigido a la activación-3 de la quinasa-1 activada por P21 (PAK1) (DSPC:DSPE-PEG2000:colesterol:IPA-3).

2. Un liposoma estéricamente estabilizado según la reivindicación 1 que tiene

(i) un diámetro de aproximadamente 75 nm a aproximadamente 500 nm, o de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 250 nm, o de aproximadamente 125 nm a aproximadamente 150 nm,

(ii) un índice de polidispersidad (PDI) de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,139,

(iii) un potencial zeta de aproximadamente -28,1v, o

(iv) una combinación de los mismos.

3. Una composición farmacéutica que comprende el liposoma estéricamente estabilizado según la reivindicación 1 o 2 y un portador farmacéuticamente aceptable.

4. Una composición farmacéutica según la reivindicación 3 que comprende una cantidad eficaz del liposoma estéricamente estabilizado para tratar el cáncer en un sujeto que lo necesita durante 2 a 5 días.

5. Una composición farmacéutica según la reivindicación 3 o 4 para su uso en el tratamiento del cáncer.

6. Un liposoma estéricamente estabilizado según la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento del cáncer.

7. Una composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 5 o un liposoma estéricamente estabilizado para su uso según la reivindicación 6, en el que las células del cáncer expresan PAK-1 a un nivel de expresión mayor que las células normales del mismo tipo.

8. Una composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 5 o un liposoma estéricamente estabilizado para su uso según la reivindicación 6, en el que el cáncer es cáncer de próstata.

9. Una composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 5 o un liposoma estéricamente estabilizado para su uso según la reivindicación 6, en el que el cáncer es cáncer de mama.

10. Una composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 5 o un liposoma estéricamente estabilizado para su uso según la reivindicación 6, en el que el cáncer es un cáncer de hueso o un cáncer de pulmón.

11. Una composición farmacéutica según la reivindicación 4 o 5 o un liposoma estéricamente estabilizado según la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de una metástasis de cáncer.

12. Una composición farmacéutica para su uso según la reivindicación 5 o un liposoma estéricamente estabilizado para su uso según la reivindicación 6, donde el uso comprende administrar la composición farmacéutica o el liposoma estéricamente estabilizado al sujeto de 1 a 3 veces por semana.

13. Una composición farmacéutica o un liposoma estéricamente estabilizado para su uso según la reivindicación 8, en la que el uso comprende administrar al sujeto con cáncer de próstata una cantidad eficaz de la composición o del liposoma para tratar al sujeto durante 2-5 días.

14. Una composición farmacéutica o un liposoma estéricamente estabilizado para su uso según la reivindicación 9, en la que el uso comprende administrar al sujeto con cáncer de mama una cantidad eficaz de la composición o del liposoma para tratar al sujeto durante 2-5 días.