ES2897772T3 - Material hemostático - Google Patents

Abstract

Material hemostático, en donde un agente activador de receptor de trombina se acopla covalentemente a una matriz biocompatible y en donde el agente activador de receptor de trombina tiene una actividad de activación del receptor de trombina después del acoplamiento covalente a la matriz biocompatible.

Description

DESCRIPCIÓN

Material hemostático

La presente invención se refiere a material hemostático y métodos para producir y usar tales materiales.

El sangrado descontrolado todavía es la causa principal de mortalidad y lesiones traumáticas y quirúrgicas.[1] Por lo tanto, desarrollar aproximaciones terapéuticas efectivas para controlar el sangrado es de primordial valor clínico y social. En las últimas décadas, se ha desarrollado una variedad de productos hemostáticos[2], incluyendo pegamento o selladores ^{basados en fibrina},[3 ab] polvos de zeolita,[4 ab] matriz de gelatina reticulada[5 ab] y así sucesivamente. Sin embargo, cada uno de estos productos tiene sus limitaciones respectivas. Los productos de fibrina tienen la desventaja de un alto coste, una corta semivida y una débil resistencia mecánica.[6] Los minerales de zeolita son propensos a provocar quemaduras graves y no son degradables.[6] La matriz de gelatina reticulada podría detener el sangrado en el plazo de minutos solo cuando se combina con altas dosis de trombina. [7] Sin embargo, la trombina es inestable en disolución debido a autoproteólisis. Se sabe que la trombina altamente concentrada induce la apoptosis de queratinocitos humanos y puede provocar alteraciones en la cicatrización de heridas.[8] Por tanto, existe una fuerte necesidad de diseñar materiales hemostáticos alternativos con seguridad mejorada. En particular, diseñar una estrategia efectiva de que evite el uso de trombina altamente concentrada es una solución deseable.

La trombina es una serina proteasa que desempeña importantes papeles en la formación de coágulos de sangre (coagulación). [9 ab] Como proteasa clave de la coagulación, la trombina convierte el fibrinógeno en redes de fibrina reticulada por una transglutaminasa (FXIN).[10] Además, la trombina es el activador más potente de plaquetas al estimular los receptores activados con proteasa (PAR).[11, 12] Tras la activación por la trombina, las plaquetas alteran físicamente la conformación de receptores de GP 11 b/111 a y proporcionan sitios de unión de alta afinidad para fibrinógeno, proporcionando agregación de plaquetas de fibrinógeno reticulado. Tanto PAR-1 como PAR-4 están presentes en las plaquetas humanas, aunque la activación de plaquetas humanas por trombina es mediada principalmente por PAR-1.[13] El mecanismo molecular de activación de PAR-1 por trombina es mostrado en la figura 7A. PAR-1 se expresa altamente en plaquetas,[14 ab] y la activación de PAR-1 se inicia por corte proteolítico de la parte del dominio N-terminal extracelular de receptor PAR-1 por trombina. La proteólisis genera nuevos dominios de ligando N-terminal (SFLLRN (SEQ ID NO:1), también conocido como péptido-6 de agonista de receptor, TRAP6) que interaccionan con el receptor dentro del circuito extracelular 2 y desencadena la ruta de señalización de activación de PAR-1. Se ha demostrado que el péptido TRAP6 corto (SFLLRN) podría funcionar como un potente activador de plaquetas por separado y estimular la agregación de plaquetas por medio de señalización de PAR-1.[15] La prueba de t Ra P Multiplate® se ha convertido en un ensayo in vitro convencional en sangre completa o en plasma rico en plaquetas para la determinación cuantitativa de la función plaquetaria desencadenada por TRAP6. La prueba de TRAP permite el análisis de la función de plaquetas activada a través de la señalización de PAR-1 sin desencadenar la formación de fibrina, lo cual ocurre de otra manera cuando la trombina es la agonista, debido al uso de un inhibidor de trombina en la muestra.

El documento WO 96/40033 A1 describe un material hemostático con agentes hemostáticos, incluyendo ácido aminocaproico épsilon y un péptido activador de receptor de trombina, en donde los agentes hemostáticos se atomizan o se recubren en una matriz hemostática con el fin de obtener una matriz en donde el agente es físicamente (pero no covalentemente) adsorbido sobre la matriz. Tales parches tienen la desventaja de que los agentes hemostáticos provistos con los mismos se liberan fácilmente del parche cuando contactan un área sangrante de un paciente. Así existe el daño potencial de inducir eventos trombóticos sistémicos, en especial debido a que no hay antagonistas circulantes en la circulación.

WO 03/057072 A2 describe composiciones hemostáticas que comprenden celulosa y un polisacárido covalentemente enlazado a la misma.

Un objetivo de la presente invención es proporcionar material hemostático mejorado con agentes activadores de receptor de trombina para controlar el sangrado.

Por tanto, la presente invención proporciona un material hemostático, en el que un agente activador de receptor de trombina se acopla covalentemente a una matriz biocompatible y en el que el agente activador de receptor de trombina tiene una actividad de unión al receptor de trombina después del acoplamiento covalente a la matriz biocompatible.

Con la presente invención, se muestra por primera vez que un agente activador de receptor de trombina puede inmovilizarse covalentemente sobre una matriz biocompatible con el fin de obtener un material hemostático mejorado adecuado para la administración a pacientes humanos en necesidad de lo mismo. Como una realización preferida, el ^{acoplamiento covalente de TRAP}6, TRAP7 o TRAP8 a una matriz de hidrogel sintética (por ejemplo, un polímero basado en poli(alcohol vinílico)) dio como resultado un material hemostático adecuado, manteniendo la actividad para activación de plaquetas en una manera localizada, segura, a lo largo de un periodo considerable con el fin de permitir una hemostasia mejorada, en especial por medio de una agregación inducida de plaquetas.

La matriz biocompatible de acuerdo con la presente invención puede ser cualquier matriz que sea utilizable para administrarse a pacientes humanos, en especial para cobertura de heridas o llenado de defectos volumétricos (por ejemplo, en órganos) de un paciente humano. De acuerdo con la presente invención, se prefiere usar los materiales de matriz que han sido sugeridos en la técnica anterior para tales fines. En general, una matriz “biocompatible” es una matriz que puede administrarse a pacientes humanos y que no induce un efecto negativo en el curso de esta administración y contacto con el paciente. Una matriz “biocompatible” es una matriz que no contiene materiales o componentes que amenacen, envenenen, impidan o afecten adversamente al tejido vivo (por ejemplo, tejido humano que es expuesto a la superficie en heridas). Ejemplos de tales matrices son coberturas de herida "clásicas", tales como parches, esponjas, pero también matrices capaces de fluir o atomizarse, polvos, etc. Tales como FloSeal™ (una matriz de gelatina reticulada), Surgiflo™ (una pasta de gelatina bovina). Mientras que los parches son ventajosos para coberturas de heridas en general, hemostatos no materiales, más prominentemente matrices capaces de fluir, pueden suministrarse dentro de la misma fase en contraposición a aproximaciones de líquido/sólido o pueden usarse para llenar de manera flexible cavidades o proporcionar un andamiaje flexible (“defectos volumétricos”). La matriz debería estar químicamente activa o activarse químicamente de manera que el agente activador de receptor de trombina pueda acoplarse covalentemente a la matriz de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, la matriz puede tener grupos hidroxilo, grupos vinilo, grupos carboxilo o grupos amino para permitir la unión covalente del agente activador de receptor de trombina a la matriz.

Preferiblemente, la matriz es una matriz hemostática, es decir, el material de matriz como tal ya tiene propiedades hemostáticas. Tales materiales están disponibles en la técnica y comprenden, por ejemplo, colágeno, gelatina o quitosán.

Una matriz biocompatible preferida se selecciona del grupo que consiste en un biomaterial, de preferencia una proteína, un biopolímero o una matriz de polisacárido, en especial una matriz de colágeno, gelatina, fibrina, almidón o quitosán; y un polímero sintético, de preferencia, un poli(alcohol vinílico), polietilenglicol, poli(N-isopropilacrilamida), etc.

Preferiblemente, la matriz de la presente invención es biodegradable, es decir, se absorbe naturalmente por el cuerpo del paciente después de algún tiempo. En cualquier forma, el material (incluyendo la matriz) debe ser biocompatible, es decir, no tener efecto dañino al paciente a quien se administra el material. Tales materiales biodegradables son específicamente adecuados en situaciones donde la hemostasia se logra dentro del cuerpo, es decir, en el transcurso de la cirugía y el sitio se cierra después de la cirugía.

De acuerdo con esto, la matriz es de preferencia un biomaterial seleccionado de biopolímeros, tales como una proteína, o un polisacárido. Se prefiere en especial un biomaterial seleccionado del grupo que consiste en colágeno, gelatina, fibrina, un polisacárido, por ejemplo, ácidos hialurónicos, quitosán y un derivado de los mismos, más preferidos colágeno y quitosán, en especial se prefiere colágeno. Tal matriz de colágeno usada para la presente invención puede derivarse de cualquier colágeno adecuado para formar un gel, incluyendo un material a partir de materiales colagenosos líquidos, pastosos, fibrosos o en polvo que pueden procesarse a una matriz porosa o fibrosa así como partículas. La preparación de un gel de colágeno para la producción de una esponja u hoja puede incluir acidificación hasta que ocurre la formación de gel y neutralización de pH subsecuente. Para mejorar las capacidades de formación de gel o solubilidad, el colágeno puede (parcialmente) hidrolizarse o modificarse, siempre y cuando la propiedad para formar una esponja o hoja estable cuando se seque no disminuya. La matriz usada para acoplar el agente activador de receptor de trombina puede ser un biopolímero, es decir, un polímero que se produce de manera natural o un derivado del mismo, o puede ser un polímero sintético. Ejemplos de biopolímeros útiles en un material hemostático de acuerdo con la presente invención incluyen polipéptidos, tales como colágeno, derivados de colágeno tales como gelatina, elastina y derivados de elastina y polisacáridos, tales como ácidos hialurónicos, almidón, celulosa o un derivado de la misma, por ejemplo, celulosa oxidada. Preferiblemente, el biopolímero es un biopolímero humano, el cual puede aislarse de un individuo o puede ser un biopolímero sintético, por ejemplo, un biopolímero recombinantemente producido.

En varias realizaciones, la matriz comprende un polímero humano recombinante. En particular, el polímero humano recombinante puede ser un colágeno humano recombinante, tal como por ejemplo, colágeno humano recombinante tipo I, colágeno humano recombinante tipo III, o una combinación de los mismos. En una realización, la matriz comprende colágeno humano recombinante tipo III. En otra realización, la matriz comprende colágeno humano recombinante tipo I. Por ejemplo, la gelatina humana recombinante puede derivarse de colágeno humano recombinante tipo III. Todavía en otra realización, la matriz comprende gelatina recombinante derivada de colágeno humano recombinante tipo I. En realizaciones adicionales, la matriz comprende gelatina recombinante producida directamente mediante expresión polinucleótido codificador.

El polisacárido usado como una matriz en la presente invención se selecciona de preferencia a partir del grupo que consiste en celulosa, alquilcelulosa, metilcelulosa, alquilhidroxialquilcelulosa, hidroxialquilcelulosa, sulfato de celulosa, sales de carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa, carboxietilcelulosa, quitina, carboximetilquitina, ácido hialurónico, sales de ácido hialurónico, alginato, ácido algínico, alginato de propilenglicol, glicógeno, dextrano, sulfato de dextrano, curdlano, pectina, pululano, xantana, condroitina, sulfatos de condroitina, carboximetildextrano, carboximetilquitosán, quitosán, heparina, sulfato de heparina, helarán, sulfato de helarán, sulfato de dermatán, sulfato de queratán, carregeninas, quitosán, almidón, amilosa, amilopectina, poli-N-glucosamina, ácido polimanurónico, ácido poliglucurónico, ácido poligulurónico, derivados de dichos polisacáridos o combinaciones de los mismos.

La presente matriz también puede basarse en un polímero sintético. El polímero absorbible sintético puede ser un polímero de poliéster alifático, un copolímero de poliéster alifático o combinaciones de los mismos.

La presente matriz también puede ser provista en la forma de un género tejido o no tejido hecho de fibras. Tales fibras se hacen de preferencia de un material biocompatible y/o biodegradable. Una variedad de tales fibras ha sido usada hasta ahora para proporcionar géneros hemostáticos. En algunas realizaciones, tales fibras no tejidas o tejidas pueden comprender uno o más polisacáridos, tales como pectina, pectina acetilada, ácido hialurónico y derivados de los mismos y similares. En algunas realizaciones, la pectina y/o pectina acetilada puede derivarse de remolachas. En otras realizaciones, el polisacárido puede ser un polisacárido no celulósico. Las fibras tejidas o no tejidas también pueden incluir fibras que comprenden otros polímeros biodegradables que incluyen poliglicólido, poiláctido, poli(láctico-co-glicólido), poli(t-caprolactona), poli(dioxanona), policaprolactona, poli(ácido 3-hidroxibutírico), poli(ácido 3-hidroxibutírico-co-ácido 3-hidroxivalérico), alginatos, colágeno, quitosán, gelatina, fibrinógeno, elastina, poliéteres, polianhídridos, poliésteres, poliortoésteres, polifosfazenos, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, carbonato de politrimetilano y similares. Además, las fibras de proteína natural tales como algodón, seda y lana también pueden usarse.

El material de matriz de acuerdo con la presente invención puede proporcionarse de preferencia como gránulos de varias morfologías, incluyendo polvo o matrices para hemostatos capaces de fluir. Por ejemplo, los gránulos pueden tener un tamaño (partícula promedio) de 1 a 1.000 |jm, de preferencia de 10 a 1.000 |jm, en especial de 200 a 800 |jm. Las matrices adecuadas como hemostatos capaces de fluir se describen, por ejemplo, en WO 98/08550 A o WO 2003/007845 A.

De acuerdo con una realización específicamente preferida, la presente invención usa poli(alcohol vinílico) (PA) como un material de matriz. PVA es un polímero soluble en agua originado a partir de hidrólisis parcial de acetato de polivinilo. Se han usado ampliamente hidrogeles a base de PVA usados como matriz según la presente invención en ingeniería de tejidos y sistemas de administración de fármacos debido a su superior biocompatibilidad (aprobados por la FDA). [16 ab] Además, los hidrogeles de PVA se conocen bien por ser excepcionalmente más fuertes que la mayoría de los demás hidrogeles sintéticos.

La presente invención usa agentes activadores de receptor de trombina unidos covalentemente a una matriz hemostáticamente adecuada. Las realizaciones preferidas de agentes activadores de receptor de trombina son péptidos activadores de receptor de trombina (TRAP). Los TRAP son una familia de péptidos de longitud de aminoácidos variable los cuales corresponden a la nueva región N-terminal del receptor de trombina. Estos péptidos sintéticos o recombinantes imitan la forma activada de la porción extracelular de la proteína receptora de trombina y funcionan como agonistas de trombina.

Los documentos US 5,256,766 A y WO 96/40033 A1 describen compuestos farmacéuticos y parches hemostáticos que contienen TRAP o “agonistas” que son útiles para fomentar la coagulación de sangre, por ejemplo, en aplicación localizada en sitios de sangrado interno en hemofílicos. Los agonistas se dan a conocer como que imitan la capacidad de la trombina para estimular la proliferación de fibroblastos y de manera concomitante, la agregación de plaquetas. Así, los TRAP pueden ser útiles para promover la hemostasia y curación de heridas. Con el uso de TRAP, un material hemostático efectivo y vendaje hemostático pueden proporcionarse los cuales estén completamente libres de compuestos biológicos tales como trombina y fibrinógeno y los peligros concomitantes de contaminación viral.

Los TRAP representativos que pueden incorporarse en un material de acuerdo con la presente invención incluyen péptidos capaces de activar el receptor de trombina, tales como los agonistas identificados en el documento US 5,256,766 A por la fórmula AAx --AAy --(AAi)n--z.

Otros TRAP los cuales han sido descritos, los cuales activan fibroblastos y son implicados en curación de heridas incluyen péptidos TRAP 508-530, aminoácidos AGYKPDEGKRGDACEGDSGGPFV (SEQ ID NO:2); y TRAP 517-530, aminoácidos TGDACEGDSGGPFV (SEQ ID NO:3). Se dan a conocer TRAP adecuados adicionales por Carney et al. J. Clin Invest. 89:14691477 (1992); Furman et al. PNAS 95 (1998), 3082-3087 y Cromack et al., J. Surg. Res. 53: 117 (1992). De acuerdo con esto, TRAP adecuados útiles en la presente invención, por ejemplo, incluyen péptidos SFLLRNPNDKYEPF (SEQ ID NO:4), SFLLRNPNDKYEP (SEQ ID NO:5), SFLLRNPNDKYE (SEQ ID NO:6), SFLLRNPNDKY (SEQ ID NO:7), SFLLRNPNDK (SEQ ID NO:8), SFLLRNPND (SEQ ID NO:9), SFLLRNPN (TRAP 8 (SEQ ID NO:10)), SFLLRNP (TRAP7 (SEQ ID NO:11)), SFLLRN (TRAP6), SFLLR, SFLL y SFL y las formas amidadas de los mismos. Debido a que los TRAP son péptidos pequeños, son más estables que grandes agentes activadores de plaquetas proteínicas, tal como trombina. La estabilidad de TRAP contribuye a las propiedades del material presente, lo cual le permite almacenarse sin refrigeración.

Preferiblemente, los agentes activadores de receptor de trombina (de preferencia el TRAP) es provisto con un enlazador con el fin de acoplar covalentemente el TRAP a la matriz. Los enlazadores preferidos son aminoácidos (aminoácidos simples, tales como cisteína, arginina, lisina, serina, glicina, etc. (de preferencia cisteína), o enlazadores de aminoácidos cortos con, por ejemplo, 2 a 5 residuos de aminoácidos, de preferencia comprendiendo aminoácidos seleccionados del grupo de cisteína, arginina, lisina, prolina, asparagina, glutamina, serina y glicina. Enlazadores dipeptídicos preferidos pueden ser Cys-Gly- (el “-“ terminal indica el enlace al agente activador de receptor de trombina), -Gly-Cys, Cys-Arg-, -Arg-Cys, -Asn-Cys, Cys-Asn-, -Pro-Cys, Cys-Pro-; enlazadores tripeptídicos preferidos pueden ser Cys-Gly-Gly-, -Gly-Gly-Cys, -Pro-Asn-Cys, Cys-Asn-Pro-, Cys-Pro-Asn-, -Asn-Pro-Cys, etc., o cualquier otro enlazador peptídico que comprende 2 a 5 residuos de aminoácidos conocidos para acoplamiento de péptido farmacéutico a portadores o matrices.

De acuerdo con una realización específicamente preferida, el agente activador de receptor de trombina del presente material es un péptido activador de receptor de trombina (TRAP), de preferencia TRAP8, TRAP7, TRAP6, TRAP1-41, SLIGKV (para PAR-2 (humano (SEQ ID NO:12)), TFRGAP (para PAR-3 (humano) (SEQ ID NO:13)), GYPGQV (para PAR-4 (humano) (SEQ ID NO:14)), o formas amidadas de los mismos, así como mezclas de tales agentes.

El material hemostático de acuerdo con la presente invención puede tener cualquier forma adecuada que sea utilizable para el tratamiento de pacientes humanos en necesidad de un material hemostático, es decir, como una forma capaz de fluir o atomizarse; como una forma bidimensional (donde la extensión de tercera dimensión es comparablemente pequeña (por ejemplo, menos de 1/10 o 1/20) comparado con las otras dos dimensiones; o como una forma tridimensional (por ejemplo, una esponja, una pasta, un implante de cavidad, etc.). Una realización bi o tridimensional preferida del material de acuerdo con la presente invención puede ser, por ejemplo, una esponja, un género tejido o no tejido, una configuración preformada, de preferencia como un cilindro o cono (por ejemplo, para extracción de dientes) o como es usado como un andamiaje flexible o no flexible, un material particulado o granulado o una hoja. Se prefiere específicamente si la matriz es capaz de absorber fluido desde la herida con el fin de atraer componentes de coagulación de sangre adicionales desde la herida una vez que el material es aplicado a la herida para lograr la agregación de plaquetas. Adicionalmente, el material es preferiblemente flexible y adecuado para aplicarse en tejidos diversos y ubicaciones con varias formas.

Realizaciones preferidas adicionales del material hemostático de acuerdo con la presente invención comprenden ingredientes adicionales, tales como agentes antibacterianos, agentes coagulativamente activos, agentes inmunosupresores, agentes antiinflamatorios, agentes antifibrinolíticos, tales como aprotinina o ECEA, factores de crecimiento, vitaminas, células, etc. En una realización preferida, sin embargo, el material de acuerdo con la presente invención puede tener o no tales ingredientes adicionales, siempre que el material esté libre de componentes los cuales podrían tener impacto negativo en la capacidad de almacenamiento o administración del material hemostático. De acuerdo con esto, el presente material hemostático está preferible esencialmente libre de cualquier actividad degradante de proteína, en especial libre de actividad de proteasa, específicamente libre de actividad de trombina. La trombina se adiciona con frecuencia a materiales hemostáticos con el fin de promover el corte de fibrina y formación de coágulo; sin embargo, también puede ser proteolítica para el material hemostático, el cual puede ser no deseado en especial durante la producción y almacenamiento de tal material. Con la presente invención, la adición o presencia de trombina o componentes comparables no se requiere y por lo tanto puede omitirse sin impacto negativo sobre las propiedades hemostáticas del material hemostático.

Preferiblemente, el material hemostático de acuerdo con la presente invención es provisto en un estado en donde es capaz de absorber el material líquido, tal como sangre. La capacidad para absorber sangre (y los componentes en la misma que promueven la formación de coágulos, terminación de sangrado y cierre de herida) mejora significativamente la eficacia global del material hemostático. Por ejemplo, el material hemostático de acuerdo con la presente invención es provisto en una forma seca o en una forma húmeda que permite todavía el material para tomar el material líquido adicional (es decir, ser empapado con líquido en una cantidad, dicha cantidad todavía está bajo su capacidad de absorción). Esto permite que la sangre entre y/o pase a través del material hemostático con el fin de proporcionar los componentes sanguíneos útiles, por ejemplo, en el proceso de cierre de herida en un volumen agrandado o en el volumen total (o virtualmente total) del material aplicado.

De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método para producir el material hemostático de acuerdo con la presente invención. Este método para producir un material hemostático se caracteriza por la etapa de acoplar covalentemente un agente activador de receptor de trombina a una matriz hemostática; en el que el agente activador de receptor de trombina se activa con secuencias de péptido con grupos bioortogonales, y/o en el que la matriz biocompatible se activa con un grupo eno.

Preferiblemente, el agente activador de receptor de trombina es un péptido activador de receptor de trombina (TRAP), de preferencia TRAP8, TRAP7, TRAP6, TRAP1-41, SLIGKV (para PAR-2 (humano), TFRGAP (para PAR-3 (humano)), GYPGQV (para PAR-4 (humano)) o formas amidadas de los mismos, así como mezclas de estos agentes.

Por supuesto, es importante para la presente invención que el agente activador de receptor de trombina mantenga su actividad activadora de receptor de trombina después de acoplamiento covalente a la matriz biocompatible. Ninguna biomolécula puede unirse simplemente a una superficie biocompatible y todavía retener su biofuncionalidad. En el curso de generar la presente invención, resultó que el uso de técnicas de unión convencionales para acoplar covalentemente el extremo C o N de los agentes activadores de receptor de trombina de acuerdo con la presente invención (por ejemplo, péptidos de TRAP6) usualmente da como resultado la pérdida de dicha bioactividad. De acuerdo con esto, la provisión del enfoque de inmovilización covalente que en realidad retenga biofuncionalidad completa del agente activador de receptor de trombina (el cual es un péptido) no es trivial y necesita confiar en la descripción para obtener tales realizaciones funcionales contenidas en ella.

Por ejemplo, el uso de técnicas de acoplamiento tradicionales para péptidos, tales como aquellas que usan EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminoproil)carbodiimida; reacción de extremo C, Asp y Glu) o NHS (N-hidroxisuccinimida; reacción de extremo N, Lys) no dio como resultado agente activador de receptor de trombina inmovilizado activo (debido a que usualmente no son específicas, propensas a reacción lateral con aminoácidos ácidos o lisina, desactivación de péptidos que se basa en el extremo N, etc.[29][30][31]). Las técnicas que usan cisteína y/o adición de Michael también conllevan el riesgo de pérdida de función debido a posibles reacciones laterales con grupos amina[32]. De acuerdo con esto, tales técnicas de acoplamiento tradicionales dan como resultado pérdida de actividad. Aunque se ha notificado una variedad de aproximaciones químicas para inmovilización de péptidos[34], la mayoría de estos métodos se basan en reacciones con grupos carboxilo en el extremo C (por ejemplo, e Dc )[29] o con aminas primarias en el extremo N (por ejemplo, NHS)[30][31] o con residuos de cisteína vía adición de Michael con base en maleimida o grupos de vinil sulfona[32]. Desafortunadamente, las reacciones más reportadas son no específicas y propensas a reacciones laterales, ya sea con aminoácidos ácidos/básicos (para EDC/NHS) o con grupos amina (para adición de Michael), las cuales inducen pérdida desfavorable de actividad de péptido. Por ejemplo, la conjugación de éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) es la aproximación más frecuentemente usada para inmovilizar covalentemente péptidos bioactivos (por ejemplo, RGD adhesivo a célula) sobre substratos de polímero a través de reaccionar con el extremo N de péptido[35]. Aunque las aminas primarias son los grupos más reactivos para ésteres de NHS, estudios recientes han demostrado que una serie de reacciones laterales podrían ocurrir con otros residuos de péptido (por ejemplo, -OH para tirosina, serina, treonina, guanidinio para arginina)[30][31]. Adicionalmente, estudios previos sobre la relación de estructura-función de TRAP (SFLLRN-), resaltan la importancia de los aminoácidos en el extremo N para mantener la actividad de péptido[36]. Con estas consideraciones en mente, se ha encontrado que es importante para la presente invención desarrollar una aproximación de inmovilización de péptido que evite las reacciones laterales con el extremo N del agente activador de receptor de trombina (que es un péptido, tal como TRAP6), con el fin de retener su bioactividad.

Por lo tanto, la presente invención proporciona un agente activo activador de receptor de trombina en forma inmovilizada con actividad retenida. Esto resultó ser imposible de proporcionar mediante aproximaciones del estado de la técnica convencionales para inmovilización de péptido. Por lo tanto, la presente invención también proporciona una selección de técnicas de acoplamiento específicas (mencionadas anteriormente) sin riesgo de reacciones laterales con extremo N o C o aminoácidos ácidos o básicos al usar, por ejemplo, reacciones bioortogonales, tales como conjugación de foto-clic de TRAP6 que contiene cisteína sobre norbornenos de PVA, lo cual ofrece un muy alto grado de eficiencia de conjugación (>95%), especificidad de sitio y modularidad. Está claro que la misma aproximación de conjugación también es aplicable para otros substratos que portan grupos de norborneno, tales como moléculas derivadas de manera natural (gelatina, hialuronano, alginato, etc.) y análogos sintéticos, tal como PEG. Además, los conjugados de péptido activos activadores de receptor de trombina unido a polímero tienen menor probabilidad de ser internalizados por células sanguíneas que formas solubles de los mismos a través de la señalización de receptor de PAR-1, ya que el tamaño de substratos de polímero aplicados como matriz sólida biocompatible para la presente invención, tales como substratos de PVA (cientos de unidades de repetición), es mucho más grande que una secuencia de TRAP6 corta. En total, la aproximación de acuerdo con la presente invención con acoplamiento del agente activo activador de receptor de trombina con actividad retenida a una matriz sólida biocompatible (por ejemplo, mediante conjugación de foto-clic para inmovilización de péptido TRAP6) proporciona valores prácticos significativos para hemostasia local así como otras aplicaciones médicas.

De acuerdo con una realización preferida de este método, la matriz hemostática se funcionaliza con grupos químicos (por ejemplo, alqueno, sulfhidrilo, alquino, azido, hidroazida, hidracina), de preferencia grupos que permite unión covalente de alta eficiencia del agente activador de receptor de trombina vía reacciones bioortogonales (por ejemplo, adición de tioleno, cicloadición de alquino-azida, reacción de Diels-Alder, reacción de hidrazida-hidrazina).

Preferiblemente, el agente activador de receptor de trombina se modifica con secuencias de péptido que están diseñadas con grupos bioortogonales (por ejemplo, alqueno, sulfhidrilo, alquino, azido, hidroazida, hidracina), en especial con una porción de cisteína con un grupo -SH.

En una realización preferida del método de acuerdo con la presente invención, el material hemostático es funcionalizado con un grupo eno, tal como norborneno, maleimida, alilo, éster de vinilo, acrilato, carbonato de vinilo, metacrilato, etc.

De acuerdo con una realización específicamente ventajosa del presente método, el acoplamiento química es realizado por reacciones foto-inducidas, especialmente mediante química de foto-clic de tiol-(norborn-)eno mediada por radical (revistada en [18a]) u (otra) química de clic foto-desencadenada (revisada en [18b]).

El presente material hemostático puede acabarse como un producto comercial mediante los pasos usuales realizados en el presente campo, por ejemplo, mediante pasos de esterilización y envasado apropiados. Por ejemplo, el presente material puede tratarse mediante irradiación UV/vis (200-500 nm), de preferencia con la ayuda de fotoiniciadores con diferentes longitudes de onda de absorción (por ejemplo, Irgacure 184, 2959), de preferencia iniciadores solubles en agua (Irgacure 2959). Tal irradiación se realiza usualmente durante un tiempo de irradiación de 1-60 min, pero también tiempos de irradiación más largos pueden aplicarse, dependiendo del método específico. El material de acuerdo con la presente invención puede envolverse en forma estéril finalmente con el fin de retener la esterilidad hasta el uso y envasarse (por ejemplo, mediante la adición de folletos de información de producto específica) en recipientes adecuados (cajas, etc.).

De acuerdo con otro aspecto, la presente invención también se refiere al material hemostático de acuerdo con la presente invención para usarse en cirugía y/o en el tratamiento de lesiones y/o heridas. El material hemostático de acuerdo con la presente invención es específicamente adecuado y efectivo para aumentar la liberación de factores de crecimiento derivados de plaquetas y para acelerar curación de heridas.

Esto hace el material hemostático de acuerdo con la presente invención una excelente herramienta para sellado de anastomosis, para sellar la línea de sutura y para salvaguardar la hemostasia en sitios de resección.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, el material hemostático de acuerdo con la presente invención también se proporciona en forma de kit combinada con otros componentes necesarios para administración del material al paciente. Por ejemplo, si el material hemostático puede ser provisto en forma seca capaz de fluir (por ejemplo, como gránulos o como un polvo) o como una pasta capaz de fluir, se prefiere proporcionar tal material con una solución amortiguadora adecuada, la cual puede adicionarse poco antes de la administración al paciente. Tal solución amortiguadora contiene usualmente (además de los componentes amortiguadores, tales como fosfato, carbonato, TRIS, etc. sistemas amortiguadores), iones de metales divalentes, de preferencia iones de Ca²⁺ u otros componentes funcionales (si no están ya presentes sobre o en la matriz), tales como agentes antibacterianos, agentes coagulativamente activos, agentes inmunosupresores, agentes antiinflamatorios, agentes antifibrinolíticos, tales como aprotinina o ECEA, factores de crecimiento, vitaminas, células, etc. El kit puede contener además medios para administrar o preparar la administración del material hemostático, tales como jeringas, tubos, catéteres, pinzas, tijeras, almohadillas o lociones esterilizantes, etc.

De acuerdo con esto, la presente invención se refiere a un kit, de preferencia para usarse en cirugía y/o en el tratamiento de lesiones y/o heridas, que comprende

- un material hemostático de acuerdo con la presente invención y

- al menos un dispositivo de administración, seleccionado de preferencia del grupo de solución amortiguadora, en especial una solución amortiguadora que contiene iones de Ca²⁺, una jeringa, un tubo, un catéter, pinzas, tijeras, una almohadilla o loción esterilizante.

Preferiblemente, la solución amortiguadora comprende además un componente seleccionado del grupo de agente antibacteriano, agente coagulativamente activo, agente inmunosupresor, agente antiinflamatorio, agente antifibrinolítico, en especial aprotinina o ECEA, factor de crecimiento, vitamina, célula o mezclas de los mismos. De manera alternativa, el kit también puede comprender además un recipiente con un componente seleccionado del grupo de agente antibacteriano, agente coagulativamente activo, agente inmunosupresor, agente antiinflamatorio, agente antifibrinolítico, en especial aprotinina o ECEA, factor de crecimiento, vitamina, célula o mezclas de los mismos.

La presente invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos y las figuras, aun cuando no está restringida a los mismos.

La figura 1 muestra (A) el esquema de síntesis de PVA-NB y PVA-TRAP6 (reacción en DMSO abs. a 50 °C durante 12 h, TsOH: ácido p-toluenosulfónico, 12959: Irgacure 2959, es decir, un PI soluble en agua comúnmente usado); figura 1B espectros de ¹H-NMR (D²O) de PVA, PVA-NB y conjugado de PVA-TRAP6; y viabilidad normalizada de células C2C12 después de 24/48 h de exposición a soluciones de PVA-NB (figura 1C) y PVA-TRAP6 (figura 1D) con concentraciones de polímero variantes (1 %, 0,5 % y 0,1 %) investigadas mediante ensayo de MTT (n>3).

Las figuras 2A-2C muestran caracterización de ROTEM del proceso de coagulación de sangre completa en respuesta a los materiales investigados (CT: tiempo de coagulación en segundos, es decir, la latencia hasta que el coágulo alcanza una firmeza de 2 mm; MCF: firmeza de coágulo máxima en mm). La figura 2A, curvas ROTEM representadas gráficamente que muestran el proceso de coagulación de sangre completa en respuesta a TRAP6 (0,1 mM), PVA-TRAP6 (0,1 mm TRAP6-), PVA-ⁿ B y control de NaCl al 0,9 %; figura 2B influencia de T^rAP6 no conjugado y conjugado (PVA-TRAP6) a dosis variante (0,01, 0,1, 1 mM) en CT; y figura 2C análisis comparativo en CT entre TRAP6, ^pV^a -TRAP6 y PVA-NB a concentración de TRAP6 óptima (0,1 mM). La figura 2D, análisis Multiplate de función de plaquetas en respuesta a TRAP6 (0,1 mM), PVA-TRAP6 (0,1 mM TRAP6) y PVA-NB; cada medición se realizó por duplicado. La figura 2E, comparación del parámetro clave en Multiplate: área de agregación en unidades.

La figura 3A muestra el análisis FACS de activación de plaquetas mediada por TRAP6 medida mediante determinación de coexpresión de CD62p/CD42 después de 15 min de incubación. Los experimentos se corrieron por duplicado, los datos se presentan como porcentaje de plaquetas positivas tanto para epítopos CD62p como CD41 ± s D. La figura 3B, gráficas de histograma que muestran el valor de la muestra manchada con anticuerpos CD41 PE y CD62p APC específicos. La figura 3C, gráficas de puntos representativas para la expresión de CD62p y CD41 de una muestra tratada con TRAP, una muestra tratada con PVA-TRAP6 y un control tratado con PVA-NB después de 15 min de incubación.

La figura 4A muestra un esquema que muestra la preparación de hidrogeles de PVA-NB mediante fotorreticulación con UV de PVA-NB con ditiotreitol (DTT) a través de química de foto-clic mediada por radicales. La figura 4B, caracterización mecánica de hidrogeles de PVA con proporciones de tiol-a-NB variantes (0,4, 0,8, 1,0 y 1,2) usando foto-reometría oscilatoria in situ: módulo de almacenamiento de gel - G', 10% PVA-NB, 0,5% 12959,60 s de retraso, intensidad de luz: 20 mW cm^{' 2} ; 50 |jm de espesor de abertura, 10 % de tensión, 10 Hz. La figura 4C, representativos de gránulos de hidrogel de PVA-NB fotopolimerizadas (barra de escala: 1 cm). La figura 4D, influencia de la proporción de tiol-a-NB (N) en el valor de meseta - G': N=0,4 (I), 0,8 (II), 1,0 (III), 1,2 (IV). La figura 4E proporciones de hinchamiento de masa de equilibrio de hidrogeles de PVA-NB (I-IV) después de hinchamiento en PBS durante 48 h.

La figura 5A muestra esquemas de la preparación de hidrogel de PVA (I, -SH:-NB=0,4) particulados (PVA-NB-P) mediante liofilización secuencial y criomolienda; (figura 5B esquema de la funcionalización de superficie de PVA-NB-P con péptido de TRAP6 que contiene cisteína por medio de conjugación de tiol-NB desencadenada por luz, -SH:-NB=1,2, 0,1 % PI (Li-TPO) en PBS, 20 mW cm^-2; figuras 5C-5D imágenes SEM de PVA-TRAP6-P, barras de escala: 100 jm , 10 jm (5D).

Las figuras 6A-6B muestran la caracterización de ROTEM del proceso de coagulación de sangre completa en respuesta a la suspensión de PVA-NB-P y PVA-TRAP6-P (10% en peso en solución salina). La figura 6A curvas de ROTEM representadas gráficamente que muestran el proceso de coagulación de sangre completa en respuesta a suspensiones de PVA-NB-P y PVA-TRAP6-P; (figura 6B análisis comparativo en CT entre PVA-NB-P, PVA-TRAP6 y NaCl (control). Las figuras 6C-6F muestran análisis FACS de polímeros particulados. Figura 6C, análisis FACS de activación de plaquetas mediada por TRAP6 medida mediante determinación de coexpresión de CD62p/CD41 después de 15 min de incubación. Los experimentos se repitieron dos veces usando muestras de sangre a partir de diferentes donadores (n=2) y los datos se presentan como porcentaje de plaquetas positivas para tanto epítopos de CD62p como CD41 ± SD. Las figuras 6D-6F, gráficas de puntos representativas para la coexpresión de CD62p y CD41 de una muestra tratada con PVA-NB-P y una muestra tratada con PVA-TRASP6-P (control positivo: 0,1 mM TRAP6, control negativo: NaCl) después de 15 min de incubación.

La figura 7A muestra el mecanismo molecular de activación de receptor 1 activado por proteasa (PAR-1). La figura 7B, motivos de péptido de TRAP6 se inmovilizan covalentemente dentro de los hidrogeles de poli(alcohol vinílico) (PVA) sintéticos, es decir, hidrogeles que presentan TRAP6, los cuales son capaces de activar plaquetas en una manera altamente localizada.

La figura 8 muestran la influencia de TRAP6 (no conjugada, 1 mM) y conjugados de polímero-TRAP6 sobre la coagulación de sangre medida mediante tromboelastometría rotacional (ROTEM). A, tiempo de coagulación (CT). Se preparó PEG-TRAP6 haciendo reaccionar PEG-10k-NHS con el extremo N-terminal de TRAP6, mientras que se preparó PVA-TRAP6 haciendo reaccionar norbornenos de PVA que pueden experimentar foto-clic (22 kDa) con el residuo de cisteína en TRAP6 (SFLLRNPNC). Se usó PEG-10k-glicina como el control de polímero de blanco. Todas las muestras se midieron por triplicado.

La figura 9 muestra la prueba experimental de bioactividad retenida en PVA-TRAP6 (1 mM) en comparación con 1 mM TRAP6, 1 mM PVA-NB y solución salina. La figura 9A, área de agregación de plaquetas total medida mediante el método de Multiplate-TRAP; figura 9B, nivel de coexpresión de CD41/CD62P debido a la activación de plaquetas medida mediante citometría de flujo (FACS).

Ejemplos:

Desarrollo de matrices de hidrogel activadoras de plaquetas sintéticas para inducir hemostasia local

Los presentes ejemplos demuestran la presente invención por medio de un conjugado de PVA-TRAP6 soluble en agua como polímeros activadores de plaquetas modelo así como particulados de hidrogel de PVA-TRAP6 insolubles (reticulados) (PVA-TRAP6-P= para aceleración segura y localizada de la hemostasia. En este trabajo, se demuestra por primera vez que los péptidos activadores de plaquetas de TRAP, tal como TRAP6, pueden inmovilizarse covalentemente en matrices de hidrogel sintéticas (figura 7B) para control de hemorragia. Con este material hemostático, se probó la hipótesis de que los péptidos de TRAP6 conjugados con polímero pueden mantener su actividad para activación de plaquetas con hemostasia acelerante en una manera localizada, segura y no puede ocurrir una liberación sistémica del agente activador de plaquetas. Los conjugados de PVA-TRAP6 solubles en agua se diseñaron como polímeros activadores de plaquetas modelo así como particulados de hidrogel de PVA-TRAP6 insolubles (reticulados) (PVA-TRAP6-P) para aceleración segura y localizada de la hemostasia. Estos nuevos conjugados de polímero-péptido se prepararon usando química de foto-clic de tiol-norborneno altamente eficiente. El grado al cual estos materiales podrían activar las plaquetas fue caracterizado sistemáticamente usando tromboelastografía rotacional (ROTEM), ensayo de agregación de plaquetas (Multiplate) y citometría de flujo (FACS).

Varias estrategias hemostáticas se basan en el uso de componentes sanguíneos tales como fibrinógeno y trombina, los cuales sufren de alto costo y corta vida de anaquel. En los presentes ejemplos, se desarrolla un biomaterial sintético de costo efectivo para hemostasia local rápida. En lugar de usar trombina, el péptido 6 de agonista de receptor de trombina (TRAP6) se diseña covalentemente en hidrogeles de poli(alcohol vinílico) (PVA). PVA-TRAP6 soluble se preparó en primer lugar mediante unión covalente de TRAP6 que contiene cisteína sobre el esqueleto de PVA-norbornenos (PVA-NB) a través de foto-conjugación. Los estudios de citotoxicidad que usan mioblastos de C2C12 indicaron que PVA-NB y PVA-TRAP6 son no tóxicos. La tromboelastografía reveló que la actividad hemostática de TRAP6 se retuvo en forma conjugada, la cual fue comparable con soluciones de TRAP6 libres con concentraciones iguales. Una solución de PVA-TRAP6 al 0,1 % puede acortar el tiempo de coagulación (CT) a ~45% de la CTG fisiológica. La alta eficiencia activadora de plaquetas se confirmó adicionalmente mediante ensayo de agregación de plaquetas y FACS. Para aplicaciones clínicas potenciales, los particulados de hidrogel que presentan TRAP6 (PVA-TRAP6-P) se desarrollaron para activación de plaquetas locales y hemostasia. Se preparó PVA-TRAP6-P mediante biofuncionalización de particulados de hidrogel de PVA-NB fotopolimerizados (PVA-NB-P) con TRAP6. Se demostró que PVA-TRAP6-P puede acortar de manera efectiva la CT a ~50%. FACS mostró que PVA-TRAP6-P puede activar plaquetas a un grado comparable con control de TRAP6 soluble. En conjunto, PVA-TRAP6-P representa una clase prometedora de biomateriales para hemostasia segura y curación de heridas.

1. Sección experimental

1.1. Materiales y reactivos

Todos los reactivos se compraron a Sigma-Aldrich y se usaron como se recibieron a menos que se indique de otra manera.

1.2. Síntesis de PVA-norborneno (PVA-NB)

En un matraz de tres cuellos, se disolvieron 10 g de PVA (22 kDa) y 20 mg de ácido p-toluenosulfónico en 250 ml de DMSO anhidro a 60° C durante 1 h bajo atmósfera de argón. En un segundo matraz, bajo atmósfera de argón, se disolvieron 2 g de anhídrido cis-5-norborneno-endo-2,3-dicarboxílico (0,1 eq. para grupos -OH) en 50 ml de DMSO anhidro. La solución obtenida se adicionó en forma de gotas al primer matraz que contiene PVA. La reacción se mantuvo a 50°C durante 12 h. Después de la reacción, el producto crudo se purificó mediante diálisis contra solución de NaHCO³ 10 mM durante 24 h y subsecuentemente contra agua desionizada (DI) durante 12 h. Después de la liofilización, se obtuvo PVA-NB como sólido incoloro en 95% de rendimiento. ¹H-RMN (D²O): 8 (ppm): 6,2 (2H, s, -CH=CH-), 3,3 (2H, s, -C=CCH-CH-), 3,1 (2H, s, -C=C-CH-CH-), 1,3 (2H, s, -CH2-).

Grado de substitución (DS): 7,5 %.

1.3. Síntesis de conjugados de PVA-TRAP6

Se preparó PVA-TRAP6 mediante unión covalente de un péptido de TRAP6 que contiene cisteína (NH-C: SFLLRNPNC (SEQ ID NO: 15), China Peptide Co.) sobre el esqueleto de PVA-NB a través de conjugación de foto-clic de tiol-eno. Específicamente, 60 mg de PVA-NB se disolvieron en solución de PBS de 0,5 % Irgacure 2959 (I2959, BASF) para dar una concentración de macrómero final de 5 %. A esta solución, se adicionaron 100 mg de péptido TRAP6-Cys (1,2 eq. para grupos NB). La solución obtenida se agitó bajo argón y se irradió con luz UV filtrada (320-500 nm) durante 300 s a 20 mW cm^-2. La luz UV fue guiada a partir de una lámpara Omnicure S2000,

1.4. Preparación de hidrogeles de PVA-NB

Se disolvió PVA-NB (DS-7,5 %) en solución de 12959 al 0,5 %, alcanzando una concentración final al 10 %. Entonces, las alícuotas de esta solución se mezclaron con una cantidad apropiada de ditiotreitol (DTT), proporcionando proporciones de -SH/-NB como 0,4 (I), 0,8 (ii), 1,0 y 1,2 (III), respectivamente. Los gránulos de hidrogel se prepararon mediante fotopolimerización en un molde de PDMS de múltiples cavidades (diámetro de cavidad: 6 mm). Específicamente, se pipetearon 200 |jl de soluciones de macrómero entre dos cubreobjetos de vidrio separados por el molde de PDMS (espesor: 1,5 mm) y luego se expusieron a luz UV filtrada (20 mW cm^{’ 2}) durante 600 s. Se desprendieron gránulos de los portaobjetos y se lavaron con p Bs estéril.

1.5. Preparación de particulados de hidrogel de PVA-NB (PVA-NB-P)

Las soluciones de precursor de hidrogel (I-III) se prepararon como se menciona antes y se fotopolimerizaron en las mismas condiciones excepto que se usó un vial de vidrio cilíndrico de 10 ml como el molde. Después de la fotopolimerización, los cilindros de hidrogel se transfirieron a un matraz de 100 ml y se lavaron con PBS (2 cambios) durante 12 h con el fin de remover el polímero sin reaccionar y PI. Posteriormente, los hidrogeles hinchados se congelaron con N² líquidos y se liofilizaron. Finalmente, la matriz de PVA-NB seca se molió en polvos finos usando un RETSCH Cryomill RS232.

1.6. Preparación de particulados de hidrogel de PVA presentando TRAP6 (PVA-TRAP6-P)

Se preparó PVA-TRAP6-P mediante unión covalente de péptido TRAP6-Cys sobre los grupos NB residuales en PVA-NB-P. Específicamente, 100 mg de PVA-NB se dispersaron en solución de PBS de PI de luz visible al 0,1 % (LAP)^[19] para dar un contenido de polímero final de 5 %. A esta suspensión, se adicionaron cantidades específicas de péptido TRAP6-Cys (1,2 eq. para grupos NB). La suspensión obtenida se agitó bajo argón y se irradió con luz UV (365 nm) durante 300 s a 20 mW cm^-2. La luz UV se guio desde una lámpara LED Omnicure LX400,

1.7. Foto-reometría

La foto-reometría se realizó sobre un foto-reómetro modular (Anton Para MCR-302) como se reportó previamente.^[27] De manera específica, MCR302 se integró con luz UV filtrada (320-500 nm) a partir de una guía de luz (Omnicure S2000) al fondo de la placa de vidrio. Específicamente, la foto-reometría oscilatoria de placa-a-placa se aplicó para monitoreo de tiempo real de la cinética de curado de formulaciones de hidrogel durante la fotopolimerización. La intensidad de luz en la superficie de placa fue de ~20 mW-cm^-2 como se determina mediante un espectrómetro Ocean Optics USB 2000+. Tanto los módulos de almacenamiento (G') como los módulos de pérdida (G'') de las muestras pudieron monitorearse como una función de tiempo de irradiación. Se determinó el punto de gel en la cercanía del cruce de G' y G".

1.8. Captación de agua

Las proporciones de hinchamiento de masa de hidrogeles de PVA-NB se probaron usando un protocolo genérico. ^[28] Los gránulos de hidrogel (n=3) se prepararon como se mencionó antes y se permitió que se hincharan en H²O DI durante 24 h a temperatura ambiente. Los gránulos húmedos se pesaron para determinar la masa hinchada de equilibrio (M^s) y entonces se liofilizaron para obtener el peso seco (M^d). La proporción de hinchamiento de masa de equilibrio (Q^m) se calculó como M^s/M^d .

1.9. Ensayo de MTT

Las citotoxicidades de soluciones de macrómero de PVA, PVA-NB y PVA-TRAP6 se evaluaron por medio del ensayo de MTT. Las células de C2C12 se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con suero de ternera fetal al 5 % (FCS), L-glutamina 1 %, penicilina/estreptomicina 1 % (todos de Sigma-Aldrich, Austria). Las soluciones de macrómero con tres concentraciones (5 %, 1 % y 0,1 %) se prepararon en medio de cultivo de DMEM. Las células C2C12 se sembraron entonces en una placa de 96 cavidades a una densidad de 5x10³ células por cavidad en 200 |jl de medio de cultivo. Después de 24 h de incubación (37° C, 5 % CO²), se añadieron 100 |jl de las soluciones de macrómero respectivas a las células por triplicado. Después de 24 h de incubación, las células se lavaron dos veces con PBS estéril antes de la adición de 100 j l de solución de trabajo de bromuro de tetrazolio de azul de tiazolilo (MTT) (5 mg/ml en PBS). Después de 1 h de incubación, el líquido se desechó y se adicionaron 100 j l de DMSO para disolver los cristales de formazán. Finalmente, la absorbancia se midió a 540 nm usando un lector de microplaca.

1.10. Tromboelastometría rotacional (ROTEM)

Se aplicó ROTEM (TEM Innovation, Alemania) para monitorear las interacciones de polímeros activadores de plaquetas y sangre completa durante el tiempo. El sistema de ROTEM contiene una clavija de sensor oscilante que se sumerge en una probeta de temperatura controlada que contiene la muestra de sangre. Cuatro mediciones pueden realizarse en paralelo en el mismo dispositivo. En general, la coagulación de la muestra sanguínea con citrato se inicia mediante recalcificación. La cinética de formación de un coágulo de fibrina podría monitorearse de manera mecánica y calcularse mediante una computadora integrada a las curvas típicas y parámetros numéricos.

La sangre fue recolectada de tres donadores no medicados y saludables usando estasis mínima de una vena antecubital a través de una aguja de calibre 21. Después de desechar los primeros 3 ml, la sangre se recolectó en tubos de 3,5 ml (Vacuette; Greiner Bio-ONe) que contienen 0,3 ml amortiguados con citrato de sodio al 3,2 %. Las muestras se mantuvieron en una etapa de precalentamiento a 37° C durante al menos 10 min antes del análisis y se procesaron dentro de 3 h. El análisis de ROTEM de la muestra de sangre completa se inició mediante recalcificación con la adición de 20 j l de CaCl² (star-TEM®, 200 mM). Se añadieron directamente disoluciones de polímero y/o suspensiones de polímero a la cubeta inmediatamente después de la recalcificación de la sangre con citrato y se mezclaron pipeteando suavemente arriba y abajo tal como se notificó previamente. ^[21] El volumen de reacción final por cubeta de ROTEM fue de 370 jl, que consisten en 300 j l de sangre completa con citrato, 20 j l de CaCh y 50 j l de disolución de polímero o suspensión de polímero.

Los siguientes parámetros de ROTEM se calcularon a partir de la señal y se incluyeron en el análisis estadístico: tiempo de coagulación (CT) en segundos (s), es decir, la latencia hasta que el coágulo alcanza una firmeza de 2 mm, la cual es una medida de formación de fibrina inicial; tiempo de formación de coágulo (CFTR) en s, es decir, el tiempo de CT hasta que el coágulo alcanza una firmeza de 20 mm, lo cual indica función de plaquetas y calidad de fibrinógeno; a-ángulo, el ángulo (°) entre el eje x y la tangente de la curva formadora que inicia desde el punto CT, el cual es comparable con FT; firmeza de coágulo máxima (MCF) en mm, la amplitud máxima de la curva, la cual indica la fuerza absoluta del coágulo; y A30 (mm), es decir, la firmeza de coágulo después de 30 min.

1.11. Análisis Multiplate

El principio de la prueba Multiplate se basa en el hecho de que las plaquetas se vuelven pegajosas tras la activación y así propensas a adherirse y agregarse en los cables de sensor metálico en la proba de prueba Multiplate. Los cables sensores se hacen de cobre altamente conductor, el cual está recubierto de plata. Las plaquetas activadas se adhieren y agregan en los cables sensores, la resistencia eléctrica entre los cables se eleva, lo cual puede monitorearse en tiempo real. Para cada medición, se añadieron secuencialmente 300 j l de solución salina y 300 j l de sangre completa hirudinizada secuencialmente a una probeta de Multiplate. Después de incubación de 3 min a 37° C, 20 j l de solución de muestra se adicionaron y al mismo tiempo el programa comenzó a recolectar señales. El dispositivo Multiplate permite 4 mediciones en paralelo. Cada medición se realizó durante 6 min y por duplicado.

1.12. Análisis de FACS

La sangre de dos donadores no medicados y saludables se recolectó y estabilizó mediante citrato de sodio. A 110 j l de sangre completa (WB), 20 j l de solución de PVA-TRAP6 (30 mg ml^-1 y 3 mg ml^-1 para obtener concentraciones de TRAP6 finales en la WB de 2 mM y 0,2 mM) se adicionaron e incubaron durante 15 min a 37° C. se adicionaron veinte microlitros de solución de TRAP6-C (14 mg mi^{' 1}) y/o 20 j l de solución de NaCl (0,9 %) se adicionaron como el control positivo y el control negativo, respectivamente. La mezcla incubada se mezcló con 300 j l de paraformaldehído al 1 % durante 15 min a temperatura ambiente. Después de lavado y centrifugación, se realizó un doble inmunomanchado usando 20 j l de anticuerpo monoclonal etiquetado con ficoeritrina (PE) dirigido contra CD41 y 20 j l de anticuerpo monoclonal etiquetado con aloficocianina (APC) dirigido contra CD62P. Los controles de isotipo se incubaron con anticuerpos de IgG de ratón conjugados con tinte de APC o PE, respectivamente (todos los anticuerpos fueron comprados a BD Biosciencies, Heidelberg, Alemania). Después de 30 min de incubación a temperatura ambiente, el estado de activación de las plaquetas fue determinado usando citometría de flujo por fluorescencia. La expresión del marcador de activación de plaquetas CD62P y el marcador de plaquetas constitutivamente presente CD41 fueron detectados usando un Beckmann Coulter Cytomics FC-500 equipado con láser de ion de argón Uniphase, 488 nm, 20 mW de salida. En total se midieron 100,000 plaquetas por muestra y se analizaron con el software Cytomics CXP. El experimento se repitió dos veces.

1.13. Estadística

Todas las barras de error indican la desviación estándar. La significancia estadística se determinó mediante la prueba t de Student, donde “*”, “**”, “***” indican P < 0,05, P < 0,01, P < 0,001, respectivamente.

2. Resultados y discusión

2.1. Diseño y síntesis de materiales

En este estudio, se seleccionó un poli(alcohol vinílico) de polímero sintético lineal (PVA) como el substrato para inmovilización covalente del péptido activador de plaquetas potente (TRAP6) debido a las siguientes razones. En primer lugar, los PVA son polímeros aprobados por la FDA con una eficacia en costo y citocompatibilidad superiores, por lo tanto intrigantes para muchas aplicaciones biomédicas. ^[17] En segundo lugar, la existencia de un alto número de grupos hidroxilo en PVA ofrece libertad significativa para la funcionalización afinable y presentación de ligandos bioactivos, lo cual no está disponible con otros substratos sintéticos tales como polietilenglicol dependiente de brazo (PEG).

Para introducir péptidos TRAP6 sobre PVA, elegimos la fuerte química de foto-clic de tiol-eno como la aproximación de conjugación. Por un lado, se seleccionó el grupo norborneno como la funcionalidad eno debido a su reactividad ultraalta hacia la reacción tiol-eno así como su baja citotoxicidad. ^{[18, 19]} Por otro lado, se diseñó un resto cisteína con un grupo tiol libre en el extremo C-terminal de una secuencia peptídica de TRAP6 (SFLLRNPNC), puesto que se acepta que el extremo N-terminal de la secuencia de TRAP6 es crítico para su capacidad de activar plaquetas. ^[15]

PVA-NB se sintetizó a través de una reacción de esterificación fácil entre PVA y anhídrido de norborneno durante 12 h a 50°C en DMSO (figura 1A). Una ventaja notable de esta aproximación de modificación es que después de la modificación un alto número de grupos de carboxilato podrían neutralizarse en la forma de sal de sodio para proporcionar los productos con buena solubilidad en agua. Los productos en bruto se purificaron mediante diálisis secuencial contra 10 mM NaHCo³ para neutralización y posteriormente contra H²O y finalmente liofilizados (>95% de rendimiento). Para confirmar la síntesis, se analizó PVA-NB usando ¹H-NMR en comparación con PVA sin modificar. Como se muestra en la figura 1B (inferior), el espectro de PVA sin modificar representa dos picos mayores a 4,0 ppm y 1,6 ppm, los cuales son correspondientes a los grupos de -CH- y metileno, respectivamente. El espectro de PVA-NB (figura 1B, en medio) muestra nuevos picos a 6,2 ppm (s, 2H, -CH=CH-), 3,3 ppm (s, 2H, -C=C-CH-CH-), 3,1 ppm (s, 2H, -C=C-CH-CH-) y 1,3 ppm (s, 2H, -CH2-), respectivamente. El grado de substitución (DS) de PVA-NB se determinó al comparar los valores integrales correspondientes a las señales (a, d, f). Al cambiar ya sea la estequiometría entre los reactivos o tiempo de reacción, fue factible controlar de manera precisa DS en un amplio rango desde 5%-50% (tabla S1). Debido a que PVA (22 kDa) es un polímero lineal que consta de ~500 unidades de repetición, seleccionamos PVA-NB con el DS más bajo (DS-7 %) como el precursor, proporcionando ~35 sitios de reacción para foto-conjugación con péptido que contiene cisteína.

Los conjugados de PVA-TRAP6 se prepararon mediante foto-conjugación de péptido de TRAP6 que contiene cisteína con los grupos NB de PVA-NB en solución de PBS de 12959 como fotoiniciador (PI). Para confirmar la eficiencia de conjugación, las reacciones modelo de NMR se realizaron primero en D²O. Con base en la reacción de NMR, la figura 1B (superior) representa el espectro de conjugados de PV-TRAP6. La disminución significativa de señales de protón de NB (a) a 6,2 ppm indica el éxito de la conjugación. Además, el espectro de PVA-TRAP6 también muestra un nuevo pico en 7,4 ppm, correspondiente a los protones aromáticos de porciones de fenilalanina (Phe o F) en la secuencia de TRAP6.

2.2. Citotoxicidad in vitro

Para probar la aplicabilidad de los materiales preparados para aplicaciones biomédicas, se investigó la biocompatibilidad in vitro de soluciones de PVA, PVA-NB y PVA-TRAP6 mediante ensayo MTT usando mioblastos de C2C12. El ensayo de MTT mostró que las soluciones de PVA y PVA-NB (figura 1C) no fueron tóxicas a concentraciones variantes (0,1, 0,5, 1 %) después de 24 h y 48 h de incubación. Para los conjugados de PVA-TRAP6, la actividad metabólica de células C2C12 (figura 1D) después de 24 h de incubación aumentó significativamente cuando se mezcla con 1 % de PVA-TRAP6 (P < 0,001), mientras que no aumentó durante 0,5% y 0,1% PVA-TRAP6. Después de 48 h de incubación, la actividad metabólica para las tres concentraciones aumentó significativamente comparada con el control (P < 0,001). Varios estudios por otros grupos han mostrado que el péptido activante de PAR-1 tal como TRAP6 puede estimular la liberación de citocinas de diferentes tipos de células, incluyendo fibroblastos gingivales humanos, células endoteliales, células epiteliales intestinales y mioblastos musculares humanos. ^{[20 a b c ]} Por tanto, se supone que la actividad metabólica aumentada de mioblastos de C2C12 durante el ensayo de MTT se atribuye a la activación de PAR-1 inducida por TRAP6. Considerando que una solución de PVA-TRAP6 al 1 % da una concentración de TRAP6- de 5 mM mientras que la concentración de TRAP6- efectiva para activación de plaquetas está en el rango de 5-100 ^|jM,[12] los resultados de toxicidad sugieren que PVA-TRAP6 son materiales citocompatibles dentro de su rango efectivo.

2.3. Actividad hemostática

2.3.1. Tromboelastom etría

A continuación estudiamos la eficacia hemostática de PVA-TRAP6 en comparación con TRAP6 y PVA-NB usando tromboelastometría rotacional (ROTEM),^{[21, 22]} la cual es una herramienta diagnóstica clínica que permite la caracterización in situ de propiedades viscoelásticas de coágulo de sangre durante la coagulación. La figura 2a muestra las curvas de ROTEM representadas gráficamente de las muestras estudiadas que se mezclaron con sangre completa recalcificada. El tiempo de coagulación (CT) se refiere a la latencia hasta que el coágulo alcanza una firmeza de 2 mm mientras que la firmeza de coágulo máxima (MCF) se refiere a la amplitud máxima de la curva, lo cual indica la fuerza absoluta del coágulo.

A partir de los resultados de ROTEM, se observó que la CT de PVA-TRAP6 a 0,1 mM fue muy comparable con aquella de TRAP6 a 0,1 mM mientras que la MCF de PVA-TRAP6 fue relativamente menor que aquella del control de TRAP6. La MCF menor pudiera atribuirse a la accesibilidad disminuida de TRAP6- a plaquetas después de la conjugación en PVA-TRAP6, el cual es un conjugado macromolecular (65 kDa) y significativamente mayor que TRAP6 (1 kDa). En comparación, el control de PVA-NB (figura 2C) mostró una curva muy similar a la curva fisiológica (control de NaCl), que no muestra actividad hemostática del esqueleto de PVA-NB.

Para probar si la actividad hemostática de PVA-TRAP6 es dependiente de la dosis, probamos soluciones de PVA-TRAP6 en comparación con soluciones de TRAP6 en tres concentraciones de péptido (0,01, 0,1, 1 mM) en ROTEM (figura 2B). Se encontró que la concentración hemostática óptica para PVA-TRAP6 fue 0,1 mM mientras que no hubo influencias de dosis significativas para control de TRAP6 en el rango elegido. Esto puede implicar nuevamente la influencia de estructura molecular diferencial en PVA-TRAP6 y péptido TRAP6 sobre el nivel de saturación de TRAP6 para activación de plaquetas.

2.3.2. Análisis Multiplate

Con el fin de cuantificar el grado de activación de plaquetas, utilizamos el ensayo Multiplate para investigar la influencia de PVA-TRAP6, TRAP6 y PVA-NB sobre la agregación de plaquetas. El principio de este método se basa en el hecho de que las plaquetas se vuelven pegajosas tras la activación y así propensas a adherirse y agregarse sobre los cables sensores de metal en la probeta de prueba Multiplate. Conforme las plaquetas activadas se adhieren y agregan sobre los cables sensores, la resistencia eléctrica entre los cables se eleva, lo cual puede monitorearse de manera continua. Una curva de Multiplate típica (figura 2D) representa la acumulación de señales electrónicas correspondientes al grado de agregación de plaquetas. Un parámetro clave de ensayo Multiplate es el área de agregación (en unidades), es decir, el área bajo la curva de agregación. Se observó que PVA-TRAP6 (0,1 mM) indujo una curva de agregación (figura 2D) que fue comparable con aquella de TRAP6 (0,1 mM), mientras que el control de PVA-NB exhibió capacidad despreciable de agregación de plaquetas. El valor de área de agregación (figura 2E) para TRAP6 fue 147 U, mientras que el valor de área para PVA-TRAP6 y PVA-NB fue 130 U y 2 U (p<0,001), respectivamente. Juntos, el ensayo Multiplate probó que PVA-TRAP6 presentó alta eficiencia para activación de plaquetas mientras que el substrato (PVA-NB) no.

2.3.2. FACS del sistema soluble

A continuación utilizamos citometría de flujo (FACS) para cuantificar el grado de activación de plaquetas. Las plaquetas pueden distinguirse de otras células sanguíneas mediante la expresión constitutiva del antígeno de superficie CD41, el cual reconoce la glicoproteína de membrana de plaquetas GpIIb, la cual está asociada con GpIIIa (la cadena de beta integrina 3) para formar el complejo GpIIb/IIIa. De manera importante, la glicoproteína de membrana de CD62p (P-selectina) se expresa exclusivamente sobre plaquetas activadas. El marcador de CD62p se usó para identificar el grado de activación en plaquetas humanas después de la incubación con los materiales estudiados (PVA-TRAP6, TRAP6, PVA-NB y NaCl). La medición de la coexpresión de CD41/CD62p (figuras 3A-3C) en muestras de sangre tratadas con estos materiales durante 15 min reveló que hubo efecto significativo (~80%) de PVA-TRAP6 (0,1 mM) sobre la expresión de CD62p en células positivas de CD41. El porcentaje de fenotipo de plaquetas activadas en términos de células positivas de CD62p permaneció al mismo nivel de la muestra de control tratada con TRAP6 (0,1 mM). En contraste, no hubo efecto significativo (<10 %) de PVA-NB sobre la expresión de CD62p en células positivas de CD41, lo cual fue al mismo nivel de las muestras de control tratadas con NaCl al 0,9 %. En total, el análisis de FACS confirmó además la alta eficiencia de PVA-TRAP6 para activación de plaquetas.

2.4. Preparación y caracterización de hidrogeles de PVA

Debido a que PVA-TRAP6 activador de plaquetas en forma soluble o en forma liberable, tal como en el documento WO 96/40033 A1 tiene el potencial para provocar riesgos trombóticos en la circulación, desarrollamos además un sistema de PVA-TRAP6 insoluble para hemostasia localizada, por lo cual el péptido TRAP6 fue inmovilizado covalentemente en matrices de hidrogel de PVA fotoreticuladas. Seleccionamos fotopolimerización de tiol-NB mediada por radicales como la aproximación para crear matrices de hidrogel de PVA (figura 4A). En contraste con la química de reticulación convencional de los (met)acrilatos, la fotopolimerización de tiol-NB ofrece varias ventajas, incluyendo cinética robusta, excelente control espaciotemporal y condiciones citocompatibles. [19, 23] Por ejemplo, hidrogeles de tiol-NB a base de PEG han permitido la fotoencapsulación in situ de células de mamífero con alta viabilidad (>90 %). [19] En este estudio, se fotopolimerizaron macrómeros de PVA-NB en combinación con un agente de reticulación modelo (ditiotreitol, DTT) bajo irradiación de UV en presencia de 12959 como PI soluble en agua y biocompatible.

2.4.1 Foto-reometría

Utilizamos foto-reometría in situ para probar la fotorreactividad y propiedades mecánicas de hidrogeles de PVA. Se formuló la hipótesis de que las propiedades quimicofísicas de hidrogeles de PVA podrían ajustarse fácilmente al afinar la proporción de tiol a NB. Cuatro formulaciones de PVA-NB/DTT con igual contenido de macrómero (10%) pero proporciones de tiol a NB variantes (0,4, 0,8, 1,0, 1,2) fueron clasificadas en foto-reometría (figura 4B)). Después de un periodo de blanco de 60 s (sin UV), sobre irradiación de UV, los módulos de almacenamiento (G') de hidrogeles de PVA aumentó a diferentes grados (8-120 kPa) en segundos hasta que se alcanzó una meseta de G'. Se encontró que todos los hidrogeles de PVA fotopolimerizados fueron totalmente transparentes (figura 4C). Al aumentar la proporción de tiol a NB de 0,4 a 1.2, los valores de meseta de G' (figura 4D) cambió de 8, 22, 120 a 45 kPa, respectivamente. El valor de meseta de G' más alto fue obtenido para hidrogel (III), por lo cual la proporción de tiol a NB fue 1:1, indicando el grado más alto de reticulación. De manera notable, estos valores de meseta de G' a partir de mediciones de foto-reometría pueden representar solamente los módulos de almacenamiento temporal de hidrogeles de PVA en el estado prehinchado, ya que el proceso de hinchamiento podría afectar a los módulos de almacenamiento de los hidrogeles. ^[24] La investigación adicional de las propiedades mecánicas de hidrogeles de PVA hinchados se justifica usando enfoques alternativos tales como AFM Nanoindentation.

2.4.2. Captación de agua

Analizamos además las propiedades de captación de agua de hidrogeles de PVA (I-IV). Los gránulos de hidrogel de PVA fotopolimerizadas se remojaron en PBS durante 48 h para alcanzar un peso húmedo de equilibrio (m^húmedo), el cual se comparó con el peso seco de polímero (m^seco) después de liofilización y dio la proporción de hinchamiento de masa de equilibrio (Q^m). Como se muestra en la figura 4E, los valores de Q^m de hidrogeles (I-IV) cambió de 130, 45, 10 a 17. En combinación con los valores de meseta de G', estos datos sugieren que el grado de reticulación más alto se obtuvo cuando la proporción de tiol a NB fue 1:1 (III). Esta observación se correlaciona con estudios previos sobre hidrogeles de tiol-NB a base de PEG por otros grupos. ^{[19, 25]} Por ejemplo, Lin et al. demostraron que los hidrogeles de PEG fotopolimerizados con tiol-NB son degradables hidrolíticamente debido a la presencia de enlaces éster. ^[25] La tasa de degradación era dependiente de la densidad de reticulación del gel, que venía dictada por la proporción de tiol con respecto a NB y el contenido de macrómero. Debido a que los hidrogeles de PVA presentados también poseen una variedad de enlaces de éster, anticipamos que estos hidrogeles son hidrolíticamente degradables. Además de DTT, los péptidos sensibles a dicisteína proteasa alternativos también pueden usarse como reticulante enzimáticamente cortable con el fin de fomentar remodelado celular y curación de heridas. No obstante, se necesita investigación adicional en el comportamiento de degradación de hidrogeles de PVA presentados in vitro e in vivo.

2.5. Biofuncionalización

2.5.1. Preparación de particulados de hidrogel funcionalizados con TRAP6

Con el fin de preparar matrices de hidrogel apropiadas para funcionalización de TRAP6, hidrogeles de PVA fotopolimerizados (I, -SH:-NB=0,4) se liofilizaron y criomolieron secuencialmente en particulados finos (figura 5A). Debido a que excesivos grupos NB estuvieron presentes después de la fotopolimerización, estos grupos residuales se aprovecharon para conjugación de foto-clic (figura 5B) con péptido de TRAP6 que contiene cisteína. El análisis SEM (figura 5C) reveló que la escala de longitud de PVA-TRAP6-P estuvo en el rango de 5-50 |jm. La aglomeración parcial de PVA-TRAP6-P se debió presumiblemente a los efectos de carga de grupos NB.

2.5.2. Análisis de ROTEM

Probamos la capacidad hemostática de PVA-TRAP6-P en comparación con PVA-NB-P en ROTEM. Antes de la prueba, estos particulados se mezclaron cuidadosamente con solución salina para formar suspensiones inyectables. Como se muestra en las figuras 6 A-B, la adición de PVA-TRAP6-P en sangre completa indujo una disminución significativa de CT hasta ~50%. De manera interesante, el control de PVA-NB-P también indujo una disminución de CT hasta ~70%. Debido a que las superficies negativamente cargadas son conocidas por contribuir a la coagulación (es decir, la ruta intrínseca),^[26] suponemos que la actividad hemostática observada de PVA-NB-P se debe a los efectos de carga de grupos NB.

2.5.3. Análisis de FACS

Con el fin de cuantificar la capacidad de estos materiales particulados para activar plaquetas, analizamos muestras de sangre completa que se preincubaron con PVA-TRAP6-P y/o PVA-NB-P en FACS. El análisis de FACS (figuras 6C-6F) reveló que el porcentaje de plaquetas activadas (CD41⁺/CD62p⁺) para PVA-TRAP6-P fue tan alto como ~55%, lo cual fue comparable con el control positivo (0,1 mM TRAP6). En contraste, las muestras de sangre incubadas con PVA— NB-P solamente exhibieron una cantidad mínima de plaquetas activadas (<10%). Estos resultados muestran que las matrices de hidrogel que presentan TRAP6 (PVA-TRAP6-P) presentan buena potencia de plaquetas activadoras en una manera localizada.

2.6. Comparación de técnicas de inmovilización convencional con técnicas de acoplamiento que conservan la actividad de agente activador de receptor de trombina peptídico

Para mostrar la importancia de elegir de manera diligente la técnica de inmovilización adecuada, una comparación de métodos de inmovilización de péptido convencionales (por ejemplo, conjugación de NHS) y métodos los cuales han sido seleccionados en el curso de la presente invención, tal como la conjugación de foto-clic, se realizó para el proceso de unión covalente del péptido TRAP6 a substratos poliméricos. Resultó que los métodos de inmovilización de péptido convencionales conducen a la pérdida de su bioactividad. Esto da como resultado, una falta de activación de receptor de trombina y a no inducción de coagulación de sangre, haciendo no útiles a los materiales resultantes para hemostasia local.

Para preparar polímero-TRAP6 vía conjugación de NHS, se usó polietilenglicol (10 kDa) con grupo NHS terminal (PEG-10k-NHS) como el substrato polimérico. TRAP6 se enlazó a PEG-10k-NHS a través de reacción en el extremo N y grupos NHS sin reaccionar se bloquearon con glicina. Adicionalmente, PEG-100k-NHS reaccionado con excesiva glicina se preparó como el control negativo. Después de diálisis contra agua destilada y liofilización, los conjugados fueron obtenidos en altos rendimientos y subsecuentemente se analizaron en tromboelastometría rotacional estándar (ROTEM) para estudiar sus efectos sobre coagulación de sangre. Con el fin de comparar la bioactividad de conjugados de polímero-TRAP6 preparados mediante diferentes aproximaciones, PVA-TRAP6 preparado por nuestra aproximación reclamada (es decir, conjugación de foto-clic) se incluyó como el control positivo. Las muestras consisten en 1 mM TRAP6, 1 mM PEG-TRAP6, 1 mM PEG-glicina, 1 mM PVA-TRAP6 y solución salina.

Como se muestra en las figuras 8A-8B, TRAP6 no conjugado (1 mM) indujo una disminución significativa de tiempo de coagulación (CT) y tiempo de formación de coagulación (CFT) en comparación con el control de solución salina. Sin ^{embargo, este efecto se perdió cuando se conjugó TRAP}6 al PEG10k usando el procedimiento de conjugación de NHS convencional. Efectos similares pueden ser observados también para el control de conjugado de PEG-glicina, mostrando ^{efectos mínimos del esqueleto polimérico y el procedimiento de preparación. No obstante, los conjugados de PVA-TRAP}6 preparados mediante conjugación de foto-clic todavía podrían acortar significativamente CT y CFT, mostrando que la bioactividad de TRAP6 se retiene. En resumen, estos datos muestran que la aproximación de inmovilización de NHS tradicional falla en retener la bioactividad de TRAP6. En contraste, la aproximación de inmovilización covalente basada en conjugación de foto-clic de tiol-norborneno puede retener casi la biofuncionalidad completa del péptido de TRAP6.

Para demostrar adicionalmente la capacidad de conjugados de PVA-TRAP6 para activación de plaquetas, probamos las muestras en ensayo de agregación de plaquetas estándar (Multiplate) y citometría de flujo (FACS). Como se muestra en la figura 9A, el área de agregación de plaquetas total de PVA-TRAP6 es comparable con aquella de TRAP6 a igual concentración de péptido, mientras que el control de substrato de PVA-NB y control de solución salina muestran nivel despreciable de agregación de plaquetas. Adicionalmente, los resultados de FACS (figura 9B) confirman que los conjugados de PVA-TRAP6 preparados mediante conjugación de foto-clic pueden inducir activación de plaquetas (es decir, coexpresión de CD417D62P) a un nivel muy similar que el control de TRAP6 (1 mM), aunque no pudo observarse activación de plaquetas significativa para PVA-NB y control de solución salina. Estos hallazgos prueban que nuestra aproximación de conjugación en realidad puede retener la bioactividad de TRAP6, incluso cuando es inmovilizada covalentemente a PVA.

En contraste con aproximaciones del estado de la técnica para inmovilización de péptido, la aproximación de la presente invención se basa en técnicas de acoplamiento específicas sin riesgo de reacciones laterales con extremo N o C o aminoácidos ácidos o básicos al usar, por ejemplo, reacciones bioortogonales, tales como conjugación de foto-clic de TRAP6 que contiene cisteína sobre norbornenos de PVA, lo cual ofrece un muy alto grado de eficiencia de conjugación (>95%), especificidad de sitio y modularidad. La misma aproximación de conjugación también es aplicable para otros substratos que portan grupos de norborneno, tales como moléculas derivadas de manera natural (gelatina, hialuronano, alginato, etc.) y análogos sintéticos, tal como PEG. Además, los conjugados de TRAP6 unidos a polímero tienen menor probabilidad de ser internalizados por células de sangre que péptido TRAP6 soluble a través de señalización de receptor de PAR-1, ya que el tamaño de substrato de PVA (cientos de unidades de repetición) es mucho mayor que una secuencia ^{de TRAP}6 corta. En total, la aproximación de acuerdo con la presente invención con acoplamiento de agente activo activador de receptor de trombina con actividad retenida (por ejemplo, conjugación de foto-clic para inmovilización de péptido de TRAP6) proporciona valores prácticos significativos para hemostasia local así como otras aplicaciones médicas.

3. Conclusión

En este trabajo, desarrollamos un sistema hemostático sintético que puede activar de manera eficiente plaquetas y acelerar la hemostasia en una manera localizada. El uso de proteasa altamente potente, trombina, es evitado en este sistema. En su lugar, el péptido agonista de receptor de trombina (TRP) se diseñó de manera covalente sobre hidrogeles de PVA citocompatibles vía fotoconjugación de tiol-norborneno altamente eficiente. La aproximación de funcionalización de TRAP6 presentada también es aplicable, pero no restringida a otros materiales/hidrogeles sintéticos, tal como PEG así como hidrogeles derivados de manera natural, tales como gelatina y ácido hialurónico. Desde un punto de vista biológico, las plaquetas activadas son conocidas por liberar factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDNF), los cuales regulan la proliferación celular y juegan un papel significativo en formación de vasos sanguíneos (angiogénesis). Por lo tanto anticipamos que estas matrices de hidrogel activadoras de plaquetas son biomateriales versátiles no solo para hemostasia segura sino también para aplicaciones potenciales en regeneración de tejido y curación de heridas.

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2014, 5 (6523)).

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Material hemostático, en donde un agente activador de receptor de trombina se acopla covalentemente a una matriz biocompatible y en donde el agente activador de receptor de trombina tiene una actividad de activación del receptor de trombina después del acoplamiento covalente a la matriz biocompatible.

2. Material hemostático según la reivindicación 1, en donde la matriz biocompatible es una matriz hemostática y se selecciona del grupo que consiste en un biomaterial, de preferencia una proteína, un biopolímero o una matriz de polisacárido, en especial una matriz de colágeno, gelatina, fibrina, almidón o quitosán; y un polímero sintético, de preferencia un poli(alcohol vinílico), polietilenglicol o poli(N-isopropilacrilamida).

3. Material hemostático según la reivindicación 1 o 2, en donde el agente activador de receptor de trombina es un péptido activador de receptor de trombina (TRAP), de preferencia TRAP8, TRAP7, TRAP6, T^rA ^p 1-41, SLIGKV (para ^pA ^r -2 (humano)), TFRGAP (para PAR-3 (humano)), GYPGQV (para PAR-4 (humano)) o formas amidadas de los mismos, así como mezclas de los mismos.

4. Material hemostático según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la matriz es una esponja, un género tejido o no tejido, una configuración preformada, de preferencia como un cilindro o cono para extracción de dientes, un particulado o material granulado o una lámina.

5. Material hemostático según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la matriz comprende poli(alcohol vinílico).

6. Método para producir un material hemostático según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde se acopla covalentemente un agente activador de receptor de trombina a una matriz biocompatible; en donde el receptor activador de receptor de trombina se activa con secuencias de péptido con grupos bioortogonales y/o en donde la matriz biocompatible se activa con un grupo eno.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el agente activador de receptor de trombina es un péptido activador de receptor de trombina (TRAP), de preferencia TRAP8, TRAP7, TRAP6, ^t R^a P1-41, SLIGKV (para ^pA ^r -2 (humano)), TFRGAP (para PAR-3 (humano)), GYPGQV (para PAR-4 (humano)), o formas amidadas de los mismos, así como mezclas de los mismos.

8. Método según la reivindicación 6 o 7, en donde el agente activador de receptor de trombina se activa con secuencias de péptido con grupos bioortogonales, y en donde el grupo bioortogonal es alqueno, sulfhidrilo, alquino, azido, hidroazida o hidrazina, especialmente un resto cisteína con un grupo -SH.

9. Método según una cualquiera de la reivindicación 6 a 8, en donde la matriz biocompatible se activa con un grupo eno, y en donde el grupo eno es norborneno, maleimida, alilo, éster de vinilo, acrilato, carbonato de vinilo o metacrilato.

10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, en donde el acoplamiento químico se realiza mediante una fotorreacción, de preferencia mediante química de clic foto-desencadenada (reacciones biortogonales fotodesencadenadas).

11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en donde el acoplamiento químico se realiza mediante química de foto-clic de tiol-norborneno.

12. Material hemostático según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso en cirugía y/o en el tratamiento de lesiones y/o heridas.

13. Kit, preferiblemente para su uso en cirugía y/o en el tratamiento de lesiones y/o heridas que comprende

- un material hemostático según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y

- al menos un dispositivo de administración, seleccionado de preferencia del grupo de solución amortiguadora, en especial una solución amortiguadora que contiene iones de Ca2+, una jeringa, un tubo, un catéter, pinzas, tijeras, una almohadilla o loción esterilizante.

14. Kit según la reivindicación 13, en donde la solución amortiguadora comprende además un componente seleccionado del grupo de agente antibacteriano, agente coagulativamente activo, agente inmunosupresor, agente antiinflamatorio, agente antifibrinolítico, en especial aprotinina o ECEA, factor de crecimiento, vitamina, célula o mezclas de los mismos.

15. Kit según la reivindicación 13, que comprende además un recipiente con un componente seleccionado del grupo de agente antibacteriano, agente coagulativamente activo, agente inmunosupresor, agente antiinflamatorio, agente antifibrinolítico, en especial aprotinina o ECEA, factor de crecimiento, vitamina, célula o mezclas de los mismos.