ES2895153T3 - Compuestos de membrana de ultrafiltración de agarosa para separaciones en base al tamaño - Google Patents

Abstract

Un compuesto de membrana de ultrafiltración de agarosa que tiene un tamaño de poro inferior a 0,1 μm, en donde el compuesto comprende una membrana de soporte porosa que tiene una capa de agarosa sobre la membrana de soporte porosa, en donde la capa de agarosa comprende un grosor que varía de 1 a 100 μm, en donde la capa de agarosa se infiltra de 1 a 15 μm en al menos una porción del grosor de la membrana de soporte porosa y en donde la capa de agarosa se prepara a partir de una solución de agarosa que comprende cloruro de zinc para estabilizar la solución de agarosa a una concentración igual o menor al 15 % en peso y divinilsulfona (DVS) como reticulante al fundir una capa de la solución de agarosa sobre la membrana de soporte porosa y sumergir la membrana de soporte porosa recubierta de agarosa en un baño de agua a una temperatura por debajo del punto de gelificación de la solución de agarosa.

Description

DESCRIPCIÓN

Compuestos de membrana de ultrafiltración de agarosa para separaciones en base al tamaño

Campo

Las modalidades descritas en la presente descripción se refieren a nuevas estructuras compuestas de ultrafiltración que comprenden una capa de agarosa sobre una membrana de soporte porosa y a métodos para producir tales estructuras compuestas de ultrafiltración. También se describen en la presente descripción métodos para usar tales estructuras compuestas de ultrafiltración, por ejemplo, para eliminar virus de una solución biofarmacéutica.

Antecedentes

Las membranas de ultrafiltración se usan típicamente en procesos de filtración impulsados por presión. Los filtros de membrana de eliminación de virus se usan cada vez más en la industria de la biotecnología para proporcionar la seguridad necesaria de los productos terapéuticos fabricados. Estos filtros están destinados a retener una alta proporción de virus que pueden estar presentes en un alimento que contiene el producto terapéutico, mientras el producto fluye a través de la membrana.

Las membranas de ultrafiltración (UF) se usan principalmente para concentrar o diafiltrar macromoléculas solubles tales como proteínas, ADN, virus, almidones y polímeros naturales o sintéticos. En la gran mayoría de aplicaciones, la ultrafiltración se lleva a cabo en el modo de filtración de flujo tangencial (TFF), donde la solución de alimentación pasa a través de la superficie de la membrana y las moléculas que son más pequeñas que el tamaño de poro de la membrana pasan a través (filtrado) y el resto (retenido) permanece en el lado corriente arriba de la membrana. A medida que el fluido pasa a través de la membrana, es necesario reciclarlo o añadirlo al flujo de retenido para mantener una operación de TFF eficiente. Una ventaja de usar un enfoque de TFF es que debido a que el fluido barre constantemente a través de la cara de la membrana, tiende a reducir el ensuciamiento y la polarización de los solutos en y cerca de la superficie de la membrana, lo que prolonga la vida útil de la membrana. Las membranas de ultrafiltración son generalmente membranas asimétricas revestidas, fabricadas en su mayor parte sobre un soporte, que a menudo sigue siendo una parte permanente de la estructura de la membrana. El soporte puede ser una tela no tejida o una membrana preformada. Las membranas de UF se fabrican mediante métodos de fundición por inmersión y tienen revestimiento y son asimétricas. Las aplicaciones comerciales iniciales estaban relacionadas con la concentración de proteínas y las membranas se clasificaron por el peso molecular de la proteína que retendrían, es decir, la clasificación de corte de peso molecular de la membrana (MWCO).

Mientras se realizan clasificaciones de membranas de ultrafiltración en base a ensayos con proteínas, un método común usa macromoléculas no proteicas que tienen una distribución de peso molecular estrecha, tales como polisacáridos (dextranos) o polietilenglicoles (ver, por ejemplo, “A rejection profile test for ultrafiltration membranes and devices”, Biotechnology 9 (1991) 941 - 943).

a) Los métodos de producción de membranas de ultrafiltración mediante fundición por inmersión son bien conocidos. Se ofrece una discusión concisa en “Microfiltration and Ultrafiltration: Principles and Applications”; Marcel Dekker (1996); LJ Zeman y AJ Zydney, eds. Se describe un método de producción ilustrativo que consta de las siguientes etapas:

a) preparación de una solución polimérica específica y bien controlada;

b) fundir la solución de polímero en forma de película delgada sobre un sustrato;

c) coagular la película resultante de la solución de polímero en un no disolvente; y

d) opcionalmente secar la membrana de ultrafiltración.

El control del tamaño de los poros en las membranas de ultrafiltración generalmente no es sencillo. No solo el contenido sólido de la solución fundida tiene un impacto en la porosidad de la membrana y el tamaño de los poros, sino también en las velocidades relativas a las que el no disolvente entra y el disolvente sale de la solución fundida. Si el no disolvente entra en la película antes de que salga el disolvente, el polímero precipita alrededor de un volumen mayor de disolvente (que actúa como formador de poros) lo que resulta en una membrana de UF de alta porosidad y tamaño de poro grande. Lo contrario es cierto si el disolvente sale de la película más rápido de lo que ingresa el no disolvente y la membrana de UF resultante tiene menor porosidad y poros más pequeños. Los aditivos para la solución fundida o el baño no disolvente, así como también el ajuste de temperatura de ambos, se emplean a menudo para controlar la velocidad relativa de entrada de no disolvente y eliminación de disolvente de la película moldeo.

La agarosa es un polisacárido natural que se ha usado ampliamente para producir perlas porosas. Estas perlas encuentran numerosas aplicaciones en separaciones cromatográficas. La técnica más antigua que describía la formación de perlas de agarosa (para aplicaciones cromatográficas) usaba disolventes no acuosos calientes en los que la agarosa se emulsionaba antes de la formación del gel por enfriamiento. Ver, por ejemplo, Hjerten, S. Biochim. Biophys. Acta 1964, 79: 393-398; y Bengtsson y otros, S. Biochim. Biophys. Acta 1964, 79: 399. Otro método para la formación de perlas de agarosa, como se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4,647,536 es dejar caer una emulsión de agarosa en un aceite enfriado. Tal método también se describe en “Methods in Enzymology” Vol. 135 Parte B, p. 401, Academic Press, 1987. El polímero debe calentarse por encima de su temperatura de fusión, que es de aproximadamente 92 °C, y disolverse en presencia de agua. A esa temperatura o por encima de ella, el polímero se funde y luego el polímero fundido se solvata con agua para formar una solución. El polímero permanece soluble en agua siempre que la temperatura esté por encima del punto de gelificación del polímero, que es de aproximadamente 43 °C. En y por debajo del punto de gelificación, la fase de polímero se separa y se convierte en un hidrogel que adquiere la forma que tenía la solución justo antes de la gelificación. Adicionalmente, a medida que la agarosa se acerca a su punto de gel, la viscosidad de la solución se vuelve más y más alta a medida que el hidrogel comienza a formarse.

Tradicionalmente, para las perlas de polisacárido, tales como las que se usan en los medios de cromatografía, la solución calentada se mantiene por encima de su punto de gel y se agita en un fluido calentado inmiscible, tal como un aceite mineral o vegetal, para formar perlas. Luego, se enfría el material de dos fases (perlas de agarosa en el líquido inmiscible) y se recuperan las perlas. Las perlas en sí son porosas por difusión y luego se pueden usar como hechas para cromatografía de exclusión por tamaño. Adicionalmente, pueden procesarse además mediante reticulación, adición de diversas químicas de captura tales como químicas de afinidad o ligandos, carga positiva o negativa, hidrofobicidad o similares o combinaciones de reticulación y químicas para mejorar sus capacidades de captura.

La agarosa se ha usado ampliamente para formar perlas porosas, donde el producto objetivo y/o las impurezas entran y salen de los poros en un proceso impulsado por difusión. El documento WO2005077500 describe un proceso para formar recubrimientos poliméricos solubles en agua a temperatura ambiente sobre sustratos porosos. El documento WO2010096704 describe una red polimérica interpenetrante (IPN) funcional, porosa.

Resumen

Las modalidades descritas en la presente descripción se refieren a nuevas estructuras compuestas de ultrafiltración que incluyen agarosa. Mientras que se pueden encontrar perlas de agarosa en la técnica anterior, la agarosa no se ha usado previamente para crear estructuras porosas planas y continuas que podrían emplearse como membranas de filtración, tal que el producto objetivo y/o las impurezas viajen hacia y a través de los poros en un proceso impulsado por presión, como se describe en la presente descripción.

Los términos “estructura compuesta de ultrafiltración de agarosa” y “compuesto de membrana de ultrafiltración de agarosa” se usan indistintamente en la presente descripción. Los términos “compuesto”, “estructuras compuestas” y “compuestos de membrana”, como se usan indistintamente en la presente descripción, describen estructuras porosas multicapa que contienen al menos una membrana porosa de soporte (también denominada sustrato) y una capa de agarosa porosa depositada sobre la membrana.

La invención se define por las reivindicaciones adjuntas. Las referencias a “modalidades” o “ejemplos” a lo largo de la descripción que no están dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas simplemente representan ejecuciones ilustrativas y no son parte de la presente invención.

Los compuestos de membranas de ultrafiltración descritos en la presente descripción proporcionan varias ventajas sobre las membranas de ultrafiltración que están disponibles actualmente. Específicamente, los compuestos de membrana de ultrafiltración descritos en la presente descripción evitan el uso de disolventes orgánicos peligrosos durante el proceso de fabricación. Esto ayuda a que el proceso de fabricación sea más sencillo, seguro, económico, y más respetuoso con el medio ambiente. Además, no es necesario extraer estos disolventes después de la formación de la membrana. El proceso de formación se simplifica debido a un menor número de etapas del proceso y la capacidad de controlar fácilmente el tamaño de los poros de la membrana de ultrafiltración mediante la manipulación de la concentración de agarosa. Además, los compuestos de membrana de ultrafiltración descritos en la presente descripción exhiben baja unión a proteínas, estabilidad en condiciones de pH alto y tampoco dependen de la presencia de composiciones extraíbles y/o liberables para formar una estructura porosa.

En algunas modalidades, las membranas de ultrafiltración descritas en la presente descripción son de naturaleza celulósica. En algunas modalidades, se proporciona un método para fabricar un compuesto de membrana de ultrafiltración de agarosa, el método comprende las siguientes etapas: a) proporcionar una membrana de soporte porosa (también denominada sustrato) que tiene un tamaño de poro promedio que varía de 0,01 pm a 1 pm y un grosor promedio que varía de 10 pm a 500 pm, en donde la membrana de soporte porosa comprende un polímero seleccionado del grupo que consiste en poliéster, poliolefina, polietileno (PE), polipropileno, poliamida, tereftalato de polietileno (PET), poli éter-éter cetona (PEEK), polisulfona, polietersulfona (PES), polímeros aromáticos y polímeros fluorados como politetrafluoroetileno y fluoruro de polivinilideno (PVDF); b) proporcionar una solución de agarosa; c) verter una capa de solución de agarosa sobre dicha membrana de soporte porosa a una temperatura que varía de 20 a 90 °C, para formar de esta manera una membrana de soporte porosa recubierta de agarosa; y d) sumergir la membrana de soporte porosa recubierta de agarosa en un baño de agua a una temperatura por debajo del punto de gelificación de la solución de agarosa; para formar de esta manera una membrana de ultrafiltración de agarosa.

El material compuesto de membrana de ultrafiltración de agarosa tiene un tamaño de poro inferior a 0,1 |jm. En algunas modalidades, el baño de agua comprende agua helada.

Los métodos descritos en la presente descripción son útiles para la producción de un compuesto de membrana de ultrafiltración de agarosa que tiene un soporte poroso, donde el compuesto de membrana tiene un valor de corte de peso molecular (MWCO) de 10 - 1000 kDa (R90).

En algunas modalidades, el compuesto de membrana de ultrafiltración de agarosa comprende un soporte poroso hecho de un polímero seleccionado del grupo que consiste en fluoruro de polivinilideno (PVDF), polietileno (PE) y poliétersulfona (PES). En una modalidad particular, el soporte poroso comprende fluoruro de polivinilideno (PVDF) o polietileno de peso molecular ultra alto (UHMW-PE). En algunas modalidades de acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción, se usa una solución de agarosa que tiene una concentración de agarosa que varía de 1 a 12 % en peso. En otras modalidades, se usa una solución de agarosa que tiene una concentración de agarosa que varía de 5 a 11 % en peso. En una modalidad particular, el método se lleva a cabo al proporcionar una solución de agarosa que comprende ZnCh como estabilizador en una concentración de hasta un 15 % en peso.

De acuerdo con la presente invención, se añade un agente de reticulación a la solución de agarosa, para estabilizar de esta manera la capa de agarosa bajo presión transmembrana positiva (TMP), que se refiere a la presión diferencial entre la presión por encima y por debajo de la membrana. En consecuencia, se usa una solución de agarosa en los métodos descritos en la presente descripción que comprende un reticulante o agente reticulante a una concentración que varía de 0,01 % en peso a 1 % en peso. El agente de reticulación o reticulante es divinilsulfona (DVS). En algunas modalidades descritas en la presente descripción, la solución de agarosa se calienta a una temperatura que varía de 20 a 90 °C; o varía de 45 a 75 °C. En una modalidad particular, la solución de agarosa se calienta a una temperatura de 70 °C.

En algunas modalidades, la solución de agarosa calentada se aplica a una membrana de soporte porosa, como se describe en la presente descripción, que también se calienta, por ejemplo, a una temperatura que varía de 20 a 90 °C; o varía de 45 a 75 °C. En una modalidad particular, la membrana de soporte porosa se calienta a una temperatura de 70 °C. La temperatura a la que se calientan la solución de agarosa y la membrana de soporte puede ser la misma temperatura o diferentes temperaturas.

Después de aplicar la solución de agarosa sobre la membrana de soporte porosa, la membrana de soporte porosa recubierta de agarosa se sumerge en un baño de agua a una temperatura menor que el punto de gelificación de la solución de agarosa. El punto de gelificación de la agarosa puede predeterminarse mediante el uso de métodos conocidos en la técnica y los descritos en la presente descripción. Para un experto en la técnica resultará claro cómo determinar el punto de gelificación de una solución de agarosa. En algunas modalidades, el baño de agua se enfría a una temperatura por debajo de la temperatura ambiente. En algunas modalidades, la temperatura varía de 5 -60 °C. En otras modalidades, la temperatura varía de 10 - 40 °C.

En algunas modalidades, la membrana de soporte porosa tiene un grosor promedio que varía de 100 jm a 200 jm y un tamaño promedio de poro de menos de 0,2 jm. En algunas modalidades, la membrana de soporte porosa tiene un grosor que varía de 10 jm a 500 jm.

Los métodos descritos en la presente descripción son útiles para fabricar un material compuesto de membrana de ultrafiltración que comprende una capa de agarosa sobre una membrana de soporte porosa. En algunas modalidades, la capa de agarosa penetra o se infiltra en la membrana de soporte porosa, lo que resulta en un compuesto de membrana que es altamente resistente a la delaminación. Se ha encontrado que una profundidad de infiltración de 1 - 15 jm conduce a una membrana adecuada para la filtración y altamente resistente a la delaminación.

Los compuestos de membranas de ultrafiltración de agarosa descritos en la presente descripción comprenden una capa de agarosa que tiene un grosor que varía de 1 jm a 100 jm; o varía de 1 jm a 20 jm. En una modalidad particular, el grosor de la capa de agarosa varía de 10 jm a 20 jm. En varias modalidades, la capa de agarosa se deposita sobre una membrana de soporte porosa. En algunas modalidades, la deposición de la capa de agarosa sobre la membrana de soporte porosa comprende la penetración o infiltración de la solución de agarosa en la membrana de soporte porosa subyacente, gelificación y posterior solidificación de la solución de agarosa por enfriamiento.

En algunas modalidades, la membrana de soporte porosa es una tela tejida o no tejida hecha de un polímero seleccionado del grupo que consiste en poliéster, poliolefinas, polietileno (PE), polipropileno, tereftalato de polietileno (PET), poli éter-éter cetona (PEEK), poliétersulfona (PES) y un polímero fluorado, tal como politetrafluoroetileno o fluoruro de polivinilideno (PVDF). En algunas modalidades, la membrana de soporte porosa consiste en fibras de polímero tejidas o no tejidas hechas de un polímero seleccionado del grupo que consiste en fluoruro de polivinilideno (PVDF), polietileno (PE), poliétersulfona (PES), tereftalato de polietileno (PET) y poliamidas que incluyen policaprolactama y poli(hexametilenadipamida).

Como se evidencia por los datos experimentales proporcionados en la presente descripción, los compuestos de membrana de ultrafiltración descritos en la presente descripción incluyen una membrana de soporte porosa que tiene un grosor promedio de más de 10 pm. En algunas modalidades, los compuestos de membranas de ultrafiltración descritos en la presente descripción incluyen una membrana de soporte porosa que tiene un grosor que varía de 20 pm a 500 pm. En una modalidad particular, la membrana de soporte porosa tiene un grosor promedio de 100 pm.

También se describen en la presente descripción los procesos para usar compuestos de membrana de ultrafiltración de agarosa descritos en la presente descripción. En algunas modalidades, los compuestos de membrana descritos en la presente descripción son útiles para eliminar partículas virales de una muestra que contiene una proteína de interés. En algunas modalidades, la proteína de interés es una proteína recombinante. En una modalidad particular, la proteína de interés es un anticuerpo monoclonal.

Los compuestos de membrana descritos en la presente descripción se pueden usar en condiciones de filtración de flujo normal o condiciones de filtración de flujo tangencial y se pueden emplear en tales procesos para purificación y/o concentración de soluciones de proteínas. En algunas modalidades, los compuestos de membrana descritos en la presente descripción se empaquetan en un dispositivo de filtración adecuado.

En diversas modalidades, los compuestos de membrana de ultrafiltración de agarosa descritos en la presente descripción se usan para separaciones en base al tamaño. En algunas modalidades, los compuestos de membrana descritos en la presente descripción pueden usarse para eliminar virus o partículas similares a virus de una solución que contiene una proteína de interés, por ejemplo, mediante separación en base al tamaño o exclusión de tamaño.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 (Figuras 1A y 1B) incluye representaciones de configuraciones usadas para la preparación de compuestos de membrana de agarosa descritos en la presente descripción. La Figura 1A representa una configuración (10) que tiene un sustrato microporoso (20) (es decir, la membrana de soporte porosa) hecho de fluoruro de polivinilideno (PVDF), que se coloca sobre una placa caliente o calentada (30) a 70 °C. La solución fundida de agarosa se vierte sobre el sustrato (20) sostenido por cinta (40) sobre una placa de vidrio (50). La Figura 1B muestra un montaje (60) que incluye un sustrato microporoso (PVDF) (es decir, la membrana de soporte porosa) (20) colocado sobre una placa caliente o calentada (30) a 70 °C e intercalada entre una cuña (80) y una lámina de plástico. (70). La cuña (80) se usa para abrir la cuchilla ajustable micrométrica (90) usada para esparcir la solución de agarosa de moldeo, pero se retira antes de que la solución de agarosa de moldeo se vierta entre el sustrato (20) y la lámina de plástico (70), seguido del uso de la cuchilla ajustable micrométrica abierta (90) para esparcir la agarosa. El compuesto de membrana de agarosa resultante se separa rápidamente de la placa caliente y se pone en contacto con hielo durante al menos 2 minutos, seguido de inmersión en un baño de agua mantenido a 20 °C, donde la lámina de plástico (70) se despega con cuidado.

La Figura 2 muestra micrografías SEM de gran aumento de compuestos de membrana de ultrafiltración de agarosa (microscopio electrónico de barrido de emisión de campo) preparados como se describe en el Ejemplo 5. La SEM se lleva a cabo en condiciones criogénicas para preservar la estructura de los poros y las muestras analizadas se enfrían a temperaturas por debajo de - 150 °C. Las Figuras 2A y 2B son secciones transversales que muestran la parte superior e inferior de los compuestos de membrana respectivamente (es decir, la interfaz del sustrato microporoso y la capa de agarosa). La Figura 2C muestra una imagen de superficie. La membrana parece ser ligeramente asimétrica con la superficie superior más abierta que la superficie inferior.

La Figura 3 muestra curvas de rechazo que ilustran el corte de peso molecular de los compuestos de membrana de agarosa representativos descritos en la presente descripción. El eje X representa el punto de corte del peso molecular y el eje Y representa el rechazo. El análisis se lleva a cabo como se describe en el Ejemplo 4.

La Figura 4 es un gráfico que ilustra la dependencia del corte de peso molecular y el flujo de los compuestos de membrana de agarosa en la concentración de la solución fundida de agarosa empleada. Los datos de flujo de agua y R90 se determinan como se describe en los Ejemplos 3 y 4. El eje X representa la concentración de agarosa; el eje Y derecho muestra el flujo en LMH/PSI y el eje Y izquierdo muestra R90, con 1 psi = 6,9 kPa. La Figura 5 es un gráfico que ilustra la dependencia del corte de peso molecular de los compuestos de membrana de agarosa descritos en la presente descripción de la fuerza iónica de la solución fundida de agarosa que se emplea. Los números R90 se determinaron como se describe en el Ejemplo 7. El eje X representa la concentración de ZnCl2 usada y el eje Y derecho y el eje Y izquierdo representan valores R90 de soluciones de agarosa al 7 % en peso y al 10 % en peso, respectivamente. Independientemente de la concentración de agarosa en la solución fundida, una mayor fuerza iónica de la solución fundida dio como resultado una membrana de ultrafiltración más abierta. Como se esperaba, a cualquier fuerza iónica dada, se obtiene una membrana de ultrafiltración más abierta a una concentración más baja de la solución fundida de agarosa.

La Figura 6 es un gráfico que ilustra la reticulación de la capa de agarosa con DVS para evitar que se comprima bajo presión. Se demostró que se puede evitar una pérdida de flujo del 20 % a 15 psi al reticular la capa de agarosa con una solución de DVS al 0,1 %. El eje X muestra la presión en PSI (1 psi = 6,9 kPa) y el eje Y muestra el flujo normalizado en LMH/PSI.

La Figura 7 es un gráfico que ilustra que secar un compuesto de membrana de agarosa húmedo que está en una solución de glicerina al 20 % (en agua) no tiene un impacto negativo en el corte de peso molecular de la membrana, es decir, el proceso de secado no colapsa la estructura de poros de la capa de agarosa.

La Figura 8 es un gráfico que ilustra la profundidad de infiltración de la capa de agarosa en la capa superior del sustrato de PVDF microporoso. Los datos del análisis elemental se obtienen mediante el uso del instrumento SEM-EDS (INCA300, Oxford Instruments, Inglaterra) y se lleva a cabo un análisis de composición de microrregiones (representado por una estrella en el inserto SEM) a intervalos de 5 pm en la dirección Z a partir de la superficie del sustrato microporoso y extendiéndose 40 pm en el sustrato. La señal de flúor se atribuye al sustrato microporoso de PVDF, mientras que la señal de oxígeno se atribuye a la agarosa. La mayor parte de la agarosa se localiza en la primera capa hasta 10 pm de profundidad del sustrato microporoso. El eje X muestra la profundidad en micrones y el eje Y muestra la relación (O/F).

La Figura 9 es un gráfico que ilustra el aumento de viscosidad de una solución de agarosa representativa (7 % en peso) a medida que se alcanza el punto de gel. Se usa un viscosímetro rotacional para realizar el análisis como se describe en la presente descripción. El eje X muestra la temperatura en grados Celsius y el eje Y muestra la viscosidad.

La Figura 10 es un gráfico que ilustra la caída característica del flujo de un compuesto de membrana de ultrafiltración de agarosa y una membrana Viresolve® Pro. Se hace fluir un medio de cultivo celular enriquecido con virus a través de cada dispositivo a presión constante a 69 kPa (10 psi) y se mide el flujo de la membrana. La capacidad de filtración se controla al medir el volumen de permeado en varios puntos de tiempo. El eje X muestra la capacidad de filtración y el eje Y los valores J/Jo. Descripción detallada

Las modalidades descritas en la presente descripción se refieren a compuestos de membranas de ultrafiltración de agarosa y procesos para fabricar y usar los mismos. Específicamente, los compuestos de membrana de ultrafiltración descritos en la presente descripción se producen al fundir una capa de solución de agarosa sobre una membrana de soporte porosa (también denominada sustrato). La solución de agarosa penetra en la membrana de soporte porosa, lo que resulta en un compuesto de membrana de ultrafiltración de agarosa que es altamente resistente a la delaminación.

El término “membrana de ultrafiltración” o “membrana UF” como se usa en la presente descripción, se basa en la definición de la terminología de la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC) para membranas y procesos de membranas, publicada en Pure Appl. Chem., (1996), 68, 1479. de acuerdo con el cual, la microfiltración se define como un proceso de separación a base de membranas impulsado por presión en el que se rechazan partículas y macromoléculas disueltas mayores de 0,1 pm, y la ultrafiltración se define como un proceso de separación a base de membranas impulsado por presión en el que las partículas y macromoléculas disueltas menores de 0,1 pm y mayores de aproximadamente 2 nm son rechazados.

En consecuencia, las membranas de ultrafiltración se definen como capaces de concentrar o diafiltrar macromoléculas solubles que tienen un tamaño en solución de menos de aproximadamente 0,1 pm y son capaces de funcionar continuamente en un modo de flujo tangencial durante períodos de tiempo prolongados, generalmente más de 4 horas y hasta por 24 horas. Por el contrario, las membranas microporosas son capaces de eliminar partículas de más de 0,1 pm y se usan en aplicaciones de filtración sin salida. Las membranas microporosas generalmente permiten que las macromoléculas solubles pasen a través de la membrana.

Los métodos descritos en la presente descripción combinan técnicas de inversión de fase térmica y en solución y eliminan el uso de disolventes orgánicos en la solución fundida o en el baño no disolvente. Los métodos descritos en la presente descripción también permiten un enfoque más sencillo para controlar el tamaño de los poros. Esto se debe, al menos parcialmente, al hecho de que generalmente es más fácil controlar el tamaño de los poros de los geles de agarosa en comparación con los geles de otros compuestos tales como dextranos reticulados o geles de poliacrilamida. Por ejemplo, de acuerdo con la Patente de Estados Unidos Núm. 3,527,712 A, el tamaño de los poros del gel de agarosa depende de la concentración de agarosa en el gel. Se sabe en la técnica que a medida que disminuye la concentración de agarosa, aumenta el tamaño de poro efectivo del gel. Por lo tanto, en dependencia de una concentración particular de agarosa, es posible efectuar la clasificación de moléculas que tienen un peso molecular entre 10 Da y 700 kDa. En orden de procesar la agarosa, el polímero de agarosa debe calentarse por encima de su temperatura de fusión, que es de aproximadamente 92 °C, en presencia de agua. El polímero se funde a esa temperatura y luego el polímero fundido se solvata con agua para formar una solución. El polímero permanece soluble en agua siempre que la temperatura esté por encima del punto de gelificación del polímero, que está en el intervalo de 20 a 43 °C, en dependencia del tipo y concentración de agarosa usada. En el punto de gelificación y por debajo de él, la fase de polímero se separa y se convierte en un hidrogel. Los tipos de agarosa usados para preparar compuestos de membrana descritos en la presente descripción muestran puntos de gel en el intervalo de aproximadamente 35 a 40 °C, o en el intervalo de 37 a 39 °C.

En algunas modalidades, una membrana de ultrafiltración de agarosa descrita en la presente descripción se forma al pasar una membrana de soporte porosa y una solución caliente de agarosa entre dos rodillos de presión formados por: (a) un rodillo de acero inoxidable calentado con o sin una película sobre el mismo; y (b) un cilindro giratorio.

El grosor de la capa de agarosa y el grado de penetración de la agarosa en la membrana de soporte porosa está controlado por la presión de la solución en la entrada al espacio entre los rodillos de presión, el durómetro (dureza) y el diámetro del rodillo, la viscosidad de la solución y la velocidad del proceso.

En otra modalidad, la solución de agarosa se puede aplicar a la membrana de soporte porosa mediante métodos convencionales de recubrimiento con cuchilla sobre rollo o troquel de ranura.

Luego, la membrana de soporte porosa se pone en contacto con un no disolvente para agarosa, tal como agua, a su temperatura de gelificación o por debajo de ella. En algunas modalidades, la capa de agarosa puede someterse a etapas adicionales, tales como reticulación, derivatización química mediante el uso de químicas funcionales y similares.

En otras modalidades más, se forma un compuesto de membrana de ultrafiltración de agarosa al esparcir una solución de agarosa entre una membrana de soporte porosa y una lámina no polimérica antiadherente. La difusión de la solución de agarosa se puede lograr por cualquier medio adecuado. Los ejemplos no limitantes incluyen el uso de un rodillo de goma o una navaja, una cuchilla doctor o similar. La etapa de extensión se puede llevar a cabo en una placa caliente con temperatura por encima del punto de gelificación de la solución de agarosa, para formar de esta manera una capa de ultrafiltración sobre toda la superficie a lo ancho y a lo largo de la membrana de soporte porosa mediante el uso de inversión de fase térmica. Luego, la membrana de soporte porosa recubierta de agarosa se pone en contacto con agua para evitar dañar la capa de agarosa mientras se retira la lámina polimérica antiadherente, lo que deja una membrana de soporte porosa recubierta con una capa delgada de agarosa, que está en el intervalo de ultrafiltración. Opcionalmente, la capa de agarosa formada se puede someter posteriormente a etapas adicionales tales como reticulación, derivatización química mediante el uso de químicas funcionales y similares.

Las membranas de soporte porosas, también denominadas sustratos en la presente descripción, que se pueden usar para fabricar los compuestos de membrana de ultrafiltración de agarosa descritos en la presente descripción, se pueden fabricar a partir de polímeros tales como polietileno, polipropileno, poliéter-éter cetona (PEEK), que se pueden usar en presencia de varios disolventes, tales como DMSO, DMF y NMP.

Es conveniente que las membranas o sustratos de soporte porosos tengan porosidad para el flujo, resistencia mecánica, flexibilidad y resistencia al hinchamiento o disolución por disolventes orgánicos. Las membranas de soporte porosas pueden comprender telas no tejidas o tejidas, que están hechas de polímeros tales como poliéster, poliamida, policaprolactama, poli (hexametilenadipamida), poliolefina, polietileno (PE), polipropileno, polímeros aromáticos, tereftalato de polietileno (PET), poliéter-éter cetona (PEEK), o polímeros fluorados tales como politetrafluoroetileno o fluoruro de polivinilideno (PVDF), polisulfona o poliétersulfona (PES), polímeros halogenados o polímeros fluorados tales como politetrafluoroetileno o fluoruro de polivinilideno (PVDF).

En algunas modalidades, se usan membranas de soporte porosas que son microporosas. Tales membranas microporosas pueden hacerse de polietileno de peso molecular ultra alto (UPE) tal como el que se describe en el documento US 4,778,601 A. Estas membranas microporosas se producen generalmente a partir de polietileno de peso molecular ultra alto. El método emplea la extrusión de una solución de UHMW-PE y un porógeno a través de un tinte de formación seguido de una separación térmica de fases de polímero y porógeno. Las estructuras microporosas se crean posteriormente mediante la eliminación del porógeno.

La fabricación de tales membranas microporosas típicamente incluye las etapas de formar una mezcla de polietileno de peso molecular ultra alto y un porógeno. Esta mezcla se calienta a una temperatura elevada para formar una solución. La solución se extruye a través de un tinte de formación bajo un cizallamiento moderado, para formar así la membrana. El extruido se enfría para provocar la separación de fases en una fase rica en polímero, pobre en porógenos y una fase pobre en polímero y rica en porógenos en la membrana y luego crea una estructura microporosa en la membrana lo que elimina el porógeno. Subsecuentemente se seca la membrana microporosa resultante. Se puede encontrar una descripción detallada del proceso, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Núm. 4,778,601. En algunas modalidades, estas membranas microporosas son adecuadas como sustratos o membranas de soporte para la fabricación de membranas de ultrafiltración en capas descritas en la presente descripción.

Además de los polímeros descritos anteriormente, también es posible usar membranas porosas fabricadas a partir de otros polímeros tejidos o no tejidos para la producción de compuestos de membranas de ultrafiltración descritos en la presente descripción.

En algunas modalidades, las membranas de soporte porosas adecuadas útiles para la preparación de compuestos de membranas de agarosa porosas descritas en la presente descripción tienen un grosor de capa promedio de más de 10 |jm. En otras modalidades, estas membranas de soporte porosas tienen un grosor que varía de 20 jm a 500 jm. En otras modalidades, se emplean membranas de soporte porosas que tienen un grosor de hasta 120 jm. En una modalidad particular, la membrana de soporte porosa tiene un grosor promedio de 100 jm y un tamaño promedio de poro de aproximadamente 0,2 jm.

En algunas modalidades, los compuestos de membrana de ultrafiltración de agarosa descritos en la presente descripción se pueden preparar como se muestra, por ejemplo, en las Figuras 1a) y 1b). Para lograr una buena unión entre la membrana de soporte porosa y la agarosa, se ha encontrado que es ventajoso si la membrana de soporte de polímero se calienta a una temperatura elevada antes de que entre en contacto con la solución de agarosa. En algunas modalidades, la membrana de soporte porosa se calienta a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 20 a 90 °C, o a una temperatura en el intervalo de 45 a 75 °C. En una modalidad particular, la membrana de soporte porosa se calienta a 70 °C. Antes de que la solución de agarosa entre en contacto con la membrana de soporte porosa, también se calienta a una temperatura elevada, por ejemplo, a una temperatura en el intervalo de 20 a 90 °C, o a una temperatura en el intervalo de 45 a 75 °C. Cuando la solución de agarosa se cuela y se extiende sobre la superficie de la membrana de soporte porosa, es conveniente controlar la profundidad de penetración de la solución de agarosa en la membrana de soporte subyacente. Por lo tanto, la membrana de soporte porosa tratada con agarosa se enfría lo más rápidamente posible y se transfiere a un estado sólido. Para la etapa de enfriamiento, la membrana de soporte porosa recubierta con agarosa puede ponerse en contacto con agua helada y luego con un baño de agua, que se mantiene a una temperatura inferior a 25 °C para efectuar la gelificación. La membrana recubierta de agarosa también se puede poner en contacto inmediatamente con agua sin hielo. En algunas modalidades, la temperatura del baño de agua está en el intervalo de 5 a 60 °C. En algunas modalidades, la temperatura del agua se mantiene a una temperatura en el intervalo de 10 a 40 °C.

Para la preparación de la capa de agarosa, típicamente se prepara una solución de agarosa que comprende agarosa a una concentración en el intervalo de 1 -12 % en peso, o en el intervalo de 5-11 % en peso. En algunas modalidades, se usa un tipo de agarosa disponible comercialmente tal como, por ejemplo, HD2, HR, ES 3:1 o LE. Un ejemplo de fuente comercial de agarosa es Hispanagar, SA, España. El polvo de agarosa se mezcla con agua a temperatura ambiente y luego se calienta a temperatura elevada hasta que se forma una solución de agarosa. Cuando la solución de agarosa alcanza una temperatura de aproximadamente 92 °C, que es el punto de fusión de la agarosa, la solución se agita y desgasifica por centrifugación.

En general, la desgasificación se lleva a cabo mediante centrifugación a 3500 rpm y después de enfriar a una temperatura en el intervalo de 20 a 90 °C, o a una temperatura en el intervalo de 45 a 75 °C. En una modalidad particular, la temperatura es de aproximadamente 70 °C. La solución de agarosa se mantiene a esta temperatura hasta que se usa para fundir la película de agarosa.

La solución de agarosa aplicada comprende cloruro de zinc como estabilizador. El estabilizador puede mezclarse con el polvo de agarosa y añadirse a la solución acuosa en una proporción adecuada. De esta manera, se puede preparar una solución fundida que comprenda un estabilizador, por ejemplo, cloruro de zinc a una concentración de hasta el 15 % en peso. En algunas modalidades, agarosa solución comprende ZnCh a una concentración de 10 % en peso. Sin embargo, las soluciones que comprende incluso menos de 5 % en peso de ZnCh se pueden usar. Para asegurar la penetración de la solución de agarosa en la membrana de soporte porosa, la membrana de soporte porosa se calienta a una temperatura de aproximadamente 20 a 90 °C antes de fundir la solución de agarosa sobre la membrana. En algunas modalidades, la membrana de soporte porosa se calienta a una temperatura en el intervalo de 45 a 75 °C, o a una temperatura de aproximadamente 70 °C.

Cuando se aplica la solución de agarosa a la membrana de soporte porosa, es importante asegurarse de que la cantidad justa de solución de agarosa penetre en la membrana de soporte porosa. Además, la obstrucción de los poros de la membrana de soporte porosa por la solución de agarosa es inconveniente. Cuando la solución de agarosa se funde sobre la membrana de soporte porosa, se hace pasar por medios adecuados de manera uniforme sobre la superficie de la membrana. Los medios adecuados incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, el uso de una navaja o una cuchilla Doctor con un hueco. Subsecuentemente, la membrana recubierta se retira inmediatamente de la fuente de calentamiento y la solución de agarosa se enfría y gelifica. En orden de lograr esto, la membrana recubierta se sumerge en un baño de agua y se mantiene a una temperatura en el intervalo de 15 -20 °C, o en el intervalo de 18 a 20 °C. En una modalidad particular, la temperatura es de aproximadamente 20 °C. El enfriamiento también se puede lograr mediante el uso de un baño de hielo y/o al sumergirlo subsecuentemente en un baño de agua.

La capa de agarosa también se puede reticular para aumentar la resistencia a la presión. Además, también se puede realizar una modificación de la superficie de la membrana recubierta de agarosa, en dependencia de la aplicación deseada de dicha membrana, por ejemplo, para su uso como membrana de intercambio iónico.

Para la reticulación de la capa de agarosa, la membrana recubierta de agarosa preparada se puede poner en contacto de una manera adecuada con una solución que comprende un agente de reticulación o reticulante. En otra modalidad, el reticulante se puede añadir a la solución de agarosa antes de que la capa de agarosa se cuele sobre el soporte de la membrana porosa. En algunas modalidades, el reticulante se incluye en la solución de agarosa a una concentración en el intervalo de 0,01 % en peso a 1 % en peso. La adición directa del reticulante asegura que se produzca una reticulación uniforme de la agarosa. Se pueden usar varios métodos de reticulación conocidos en la técnica y los descritos en la presente descripción.

Como se indicó anteriormente, la reacción de reticulación también puede implicar una reacción entre un agente de reticulación disuelto y la capa de agarosa del compuesto de membrana. Una solución de reacción adecuada puede basarse en un disolvente acuoso u orgánico, o en una mezcla acuosa-orgánica. Los ejemplos no limitantes de disolventes orgánicos incluyen N-metil pirrolidona, dimetilacetamida, dimetilsulfóxido, dimetilformamida y disolventes similares.

Los reticulantes ilustrativos incluyen, por ejemplo, epóxidos di- o multifuncionales tales como, por ejemplo, epiclorhidrina, butanodiol diglicidil éter (BUDGe ), etilendiol diglicidil éter (EDGE), polietilenglicol diglicidil éteres y diepóxido de butano. También se pueden usar compuestos de N-metil metoxi multifuncionales como reactivos de reticulación. Los ejemplos incluyen Cymel 385 y Powerlink 1174, ambos disponibles de Cytec Industries de West Patterson, Nueva Jersey. Se ha encontrado que la reacción de reticulación se puede realizar con soluciones en las que el agente de reticulación está presente en una concentración que varía de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 60 % en peso, o de aproximadamente 10 % a aproximadamente 40 % en peso.

De acuerdo con la invención, se usa divinilsulfona o DVS como agente de reticulación. Se ha demostrado que DVS es especialmente adecuado para reticular la capa de agarosa descrita en la presente descripción. Se puede añadir DVS a la solución de agarosa antes de fundir la capa de agarosa y se puede aplicar en una concentración mucho menor en relación con las concentraciones de agentes de reticulación típicamente usados, que se describen anteriormente.

Un experto en la técnica puede determinar fácilmente las condiciones de reacción adecuadas para emplear, por ejemplo, concentraciones, temperatura, presión y ajustes adecuados del equipo usado. Generalmente, se espera que la reacción tenga lugar a una velocidad más rápida a una temperatura más alta; sin embargo, las temperaturas de reacción deben seleccionarse de modo que el material compuesto descrito en la presente descripción se modifique lo más suavemente posible. Además, un experto en la técnica también puede determinar fácilmente la influencia de la escala de reacción. Por ejemplo, un recipiente de reacción más grande requerirá más tiempo para alcanzar la temperatura de reacción y enfriarse. Además, se pueden usar presiones más altas para aumentar la velocidad de reacción. En dependencia del recipiente de reacción, el practicante puede usar un reactor de flujo continuo u otros medios adecuados para mejorar el contacto de los reactivos con la membrana y controlar de esta manera la reacción. Las concentraciones más altas generalmente aumentarán la velocidad de reacción. El tipo de reticulante aplicado, así como también el disolvente elegido, también pueden influir en la determinación del tiempo de reacción necesario. La actividad del ion hidroxilo es otra condición de reacción importante.

Generalmente, los tiempos de reacción que se usan están en el intervalo de aproximadamente dos a aproximadamente cien horas, pero los tiempos de reacción de aproximadamente cuatro a aproximadamente 24 horas son los más típicos. La reacción puede realizarse a temperatura ambiente y hasta aproximadamente 60 °C. En algunas modalidades, la reacción se lleva a cabo a una temperatura que varía de 25 °C a aproximadamente 50 °C. Un experto en la materia podrá modificar o reducir este tiempo al aumentar, por ejemplo, las velocidades de transferencia de masa, mediante el uso de un proceso continuo de rodillo a rodillo o al aumentar aún más las velocidades de reacción al ajustar la temperatura, las concentraciones o cualquier otro parámetro.

Cuando se usa un compuesto epoxi multifuncional como reticulante, la reacción se lleva a cabo en condiciones básicas. Los ejemplos incluyen hidróxidos de sodio o potasio. Típicamente, se usan soluciones de hidróxido de aproximadamente 0,1 M a aproximadamente 1 M. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente cómo equilibrar la reacción frente al deterioro alcalino de la agarosa. Las concentraciones de hidróxido más altas y las temperaturas de reacción más altas generalmente aceleran el deterioro alcalino; mientras que concentraciones más bajas de hidróxido y temperaturas más bajas generalmente ralentizan la velocidad de deterioro así como también la velocidad de la reacción de reticulación.

El Powderlink 1174, Cymel 385 y agentes de reticulación similares (compuestos de N-metil metoxi multifuncionales) reticulan la agarosa a través de los hidroxilos de la agarosa con un catalizador ácido, tal como el ácido toluenosulfónico. Otros catalizadores ácidos similares son los ácidos sulfónicos orgánicos y los ácidos minerales no oxidantes. Generalmente son apropiadas condiciones débiles o moderadamente ácidas de pH de aproximadamente 2 a 4. Un catalizador preferido es Cycyt 4040, catalizador de ácido sulfónico disponible de Cytec Industries. Para un experto en la materia, quedaría muy claro que las condiciones ácidas fuertes pueden causar el deterioro de la membrana y pueden no ser recomendables.

La reacción entre la membrana de agarosa y los reactivos de reticulación se puede realizar en soluciones acuosas, por ejemplo, en agua al 100 % o en agua mezclada con disolventes tales como metiletilcetona, metilpentanodiol, acetona u otras cetonas. Sin embargo, esta lista de soluciones acuosas no es limitante. En una modalidad particular, la etapa de reticulación se realiza en un entorno alcalino.

Los compuestos de membrana de agarosa de ultrafiltración descritos en la presente descripción se pueden modificar mediante el uso de cualquier técnica adecuada conocida en la técnica o las descritas en la presente descripción. En algunas modalidades, se pueden fabricar membranas adecuadas como materiales intercambiadores de iones.

Como se usa en la presente descripción, el término “material intercambiador de iones” se refiere a una matriz de alto peso molecular que tiene sustituyentes cargados unidos covalentemente inmovilizados sobre ella. Para la neutralidad de la carga general, los contraiones unidos de forma no covalente se unen al sustituyente cargado mediante interacciones iónicas. El “material intercambiador de iones” tiene la capacidad de intercambiar sus contraiones unidos no covalentemente por iones o compañeros de unión cargados de manera similar de la solución circundante. En dependencia de la carga de sus contraiones intercambiables, el “material de intercambio iónico” se denomina “material de intercambio catiónico” o “material de intercambio aniónico”. En dependencia de la naturaleza del grupo cargado (sustituyente), el “material de intercambio iónico” se denomina, por ejemplo, en el caso de materiales de intercambio catiónico, ácido sulfónico o resina de sulfopropilo o carboximetilo. Además, en dependencia de la naturaleza química del sustituyente/grupo cargado, el “material de intercambio iónico” puede clasificarse adicionalmente como material de intercambio iónico fuerte o débil, por ejemplo, en base a la fuerza del sustituyente cargado unido covalentemente. Por ejemplo, en algunas modalidades, los materiales de intercambio catiónico fuertes pueden incluir un grupo de ácido sulfónico (por ejemplo, un grupo sulfopropilo) como sustituyente cargado. Los materiales de intercambio catiónico débiles ilustrativos incluyen un grupo ácido carboxílico (por ejemplo, un grupo carboximetilo) como sustituyente cargado. Un material de intercambio aniónico fuerte ilustrativo incluye un grupo de amonio cuaternario; mientras que un material de intercambio aniónico débil ejemplar incluye un grupo dietilaminoetilo como sustituyente cargado.

Además, la superficie de un compuesto de membrana preparado de acuerdo con los métodos descritos en la presente descripción puede incluir una carga negativa, introducida mediante un proceso de una o dos etapas. En el caso de un proceso de una sola etapa, el reactivo modificador de carga se agrega a la solución de reticulación. En el caso del método de dos etapas, la reacción de adición de carga se lleva a cabo antes o después de la reacción de reticulación.

Los reactivos adecuados para formar un compuesto de membrana cargado negativamente incluyen, por ejemplo, compuestos de estructura X(CH² )mA o sales de metales alcalinos de los mismos, donde X es halógeno, preferentemente cloruro o bromuro; A es carboxilo o sulfonato. Se pueden controlar uno o más de los siguientes, por ejemplo, tiempo de reacción, concentración de reactivo, pH y temperatura para controlar la cantidad de carga negativa añadida a la superficie de la membrana.

En algunas modalidades descritas en la presente descripción, la divinilsulfona se usa como agente de reticulación en las condiciones de reacción descritas en la Patente de Estados Unidos Núm. 4,591,640. En algunas modalidades, la reacción de reticulación se realiza a temperatura ambiente a un pH> 11 en presencia de un agente reductor, y los grupos vinilo que no han reaccionado se desactivan mediante una sustancia desactivante hidrófila neutra que comprende varios grupos hidroxilo.

En algunas modalidades, se imparte una carga positiva a la membrana mediante el uso de compuestos de glicidil amonio cuaternario o haluros de alquilo de amonio cuaternario. En algunas modalidades, las moléculas de haluro tendrían la estructura de Y(CH² )mB, donde Y es un halógeno y B es un resto de carga positiva.

En el caso de algunas de las modalidades descritas en la presente descripción, la reacción de reticulación se lleva a cabo antes de añadir grupos cargados a la membrana. Al llevar a cabo la reacción de reticulación antes de añadir los grupos cargados, se puede evitar la repulsión de carga entre grupos cargados similares, lo que evita por tanto el hinchamiento del polímero y la membrana. En otras modalidades, la reticulación se lleva a cabo simultáneamente con la adición de carga. En este caso, es conveniente controlar la reacción de reticulación a una velocidad que evite el hinchamiento cuando se añade la carga.

Se entiende que, en base a las enseñanzas de la técnica junto con las enseñanzas de la presente solicitud, un experto en la técnica sería capaz de producir compuestos de membrana de ultrafiltración de agarosa resistentes a disolventes descritos en la presente descripción que tengan el tamaño de poro conveniente, la carga y otras propiedades materiales.

Mediante el uso de los métodos descritos en la presente descripción, se obtienen compuestos de membrana de ultrafiltración, que incluyen una capa de agarosa y una membrana de soporte porosa, de manera que la agarosa penetra en al menos una parte del grosor de la membrana de soporte porosa, para hacer de esta manera el compuesto de membrana de ultrafiltración de agarosa resultante de alta resistencia a la delaminación. Por ejemplo, en algunas modalidades descritas en la presente descripción, la agarosa penetra en la membrana de soporte porosa, de esta manera alcanza una profundidad de infiltración de 1 a 15 pm.

La capa de agarosa tiene un grosor que varía de 1 pm a 100 pm, o varía de 1 pm a 40 pm. En una modalidad particular, la capa de agarosa tiene un grosor que varía de 10 pm a 20 pm, o que varía de 15 pm a 20 pm. Se entiende que el grosor de la capa de agarosa incluye la agarosa que penetra en la membrana de soporte porosa así como también la que está en la parte superior de la membrana de soporte porosa. En varias modalidades descritas en la presente descripción, la capa de agarosa penetra en al menos una parte del grosor de la membrana de soporte porosa, seguido de gelificación y solidificación por enfriamiento de la agarosa.

Los compuestos de membranas de ultrafiltración de agarosa descritos en la presente descripción tienen varios usos. Los compuestos de membrana se pueden usar en aplicaciones analíticas, así como también la fabricación de productos biológicos a escala industrial. En algunas modalidades, los compuestos de membrana se incorporan a un dispositivo.

Como se describe en la presente descripción, los compuestos de membrana de ultrafiltración de agarosa descritos en la presente descripción no solo son muy adecuados para filtrar moléculas de un cierto tamaño, sino que son útiles para la purificación de virus en el formato de flujo normal o flujo tangencial.

Los compuestos de membrana descritos en la presente descripción son de alta resolución que son útiles para eliminar virus de una solución que contiene proteínas recombinantes. El uso de dichos compuestos de membrana para la eliminación de virus tiene varias ventajas, por ejemplo, alta capacidad (por ejemplo, medida por la cantidad de proteína de interés procesada a través de una unidad de área de compuesto de membrana) y alta eficiencia (por ejemplo, medida por valor de reducción logarítmica, LRV).

Por ejemplo, cuando se filtra una solución de proteína acuosa a través de una membrana para eliminar virus, la membrana normalmente tiene un tamaño de poro suficientemente pequeño para retener virus mientras permite que la proteína de interés pase a través de la membrana. Generalmente es conveniente que tales membranas tengan una alta retención de virus y al mismo tiempo una alta capacidad de filtración.

La retención de virus se define como el valor de reducción logarítmica (LRV), que se define como un logaritmo de la relación entre la concentración de virus (valoración) en el alimento y la del filtrado. La capacidad de filtración se define como el volumen de solución de proteína que puede pasar a través de un área determinada de la membrana antes de que se produzca un ensuciamiento completo. Como se usa en la presente descripción, el término “ensuciamiento completo” se refiere a una condición de la membrana en la que se observa menos del 10 % del flujo original de la membrana cuando se efectúa la filtración con la membrana para lograr la retención de virus de un LRV de 3,5 o mayor. En general, se observa que un mayor flujo a través de la membrana y una baja unión a proteínas de la superficie de la membrana conducen a una mayor capacidad de filtración. Los valores de capacidad de filtración de una membrana determinada varían mucho en dependencia el tipo y la concentración de la solución de proteína, la presión, la fuerza iónica y otras condiciones de ensayo. En condiciones de proceso típicas, las membranas de ultrafiltración satisfactorias tienen una capacidad de filtración de aproximadamente 1000 L/m2 o más.

Un indicador de rendimiento más representativo de una membrana retentiva de virus es el área de la membrana que se calcula de acuerdo con el método Vmáx Se pueden encontrar más detalles sobre este método en el documento EP 1775016 B1.

En algunas modalidades, la eliminación de virus implica hacer fluir una solución que contiene proteína recombinante a través de un dispositivo de filtración que contiene los compuestos de membrana de ultrafiltración de agarosa descritos en la presente descripción en condiciones adecuadas para permitir el paso de la proteína recombinante a través del compuesto de membrana, mientras se evita el paso de virus a través del compuesto de membrana.

En algunas modalidades descritas en la presente descripción, los compuestos de membrana de ultrafiltración de agarosa usados para la eliminación de virus son de naturaleza sustancialmente hidrófila, es decir, fácilmente humectables con agua. En varias modalidades descritas en la presente descripción, es la capa de agarosa en la membrana la que hace que la membrana sea hidrófila. Como se describió anteriormente, cuando se usa para la eliminación de virus, es conveniente que los compuestos de membranas de ultrafiltración de agarosa eviten el paso de los virus a través del compuesto de membranas, lo que permite al mismo tiempo el paso de una proteína de interés. Esto se logra, al menos en parte, al tener una capa de agarosa sobre una membrana de soporte porosa, ya que los poros de la capa de agarosa aplicada son lo suficientemente pequeños como para retener los virus, lo que permite al mismo tiempo el paso de la proteína de interés a través de la membrana.

En algunas modalidades, los compuestos de membrana descritos en la presente descripción se empaquetan en un dispositivo. En algunas modalidades, el dispositivo es una cápsula de filtración que comprende un tubo plisado formado por uno, dos o tres compuestos de membrana de ultrafiltración de agarosa descritos en la presente descripción. En algunas modalidades, dicho dispositivo se usa para eliminar virus. Sin embargo, sin desear estar ligado a ninguna teoría, se contempla que se pueda usar cualquier formato de dispositivo adecuado que incorpore los compuestos de membrana descritos en la presente descripción.

En algunas modalidades, los compuestos de membrana descritos en la presente descripción (ya sea solos o incorporados en un dispositivo adecuado) se pueden usar para eliminar virus de manera efectiva a un LRV mayor que 6 para un virus comparativamente grande (por ejemplo, virus de leucemia murina) o a un LRV mayor que 4 de un virus comparativamente más pequeño (por ejemplo, parvovirus).

En algunas modalidades, un dispositivo para eliminar virus de una solución que contiene proteínas comprende una carcasa adecuada para contener un material de filtración compuesto de membrana descrito en la presente descripción y además incluye una entrada para recibir el fluido a filtrar y una salida para eliminar el filtrado, donde el material de filtración comprende una, dos o tres membranas compuestas libres de huecos, donde la capa aguas arriba está orientada de manera que su lado más apretado mire aguas abajo.

En general, se ha observado que mediante la incorporación de múltiples membranas de ultrafiltración asimétricas, dispuestas en una configuración plisada, con las membranas en orientación “lado apretado corriente abajo”, la cápsula de filtro resultante tendrá buenas capacidades de retención viral, mientras mantiene un buen flujo.

En una modalidad particular, una cápsula de filtración usada para eliminar virus comprende una carcasa tubular y un tubo de filtración plegado sustancialmente coaxialmente encerrado dentro de dicha carcasa. El alojamiento tubular de la cápsula de filtración puede construirse para contener y canalizar una corriente de proceso de fluido a través de él y, en consecuencia, está provisto de una entrada de fluido y una salida de filtrado. La corriente de proceso de fluido, aguas arriba del tubo de filtración plegado, se introduce en la cápsula de filtración a través de la entrada de fluido. Aguas abajo del tubo de filtración plegado, la corriente de proceso de fluido se libera de la cápsula de filtración a través de la salida de filtrado.

Para obtener más detalles sobre la construcción y el funcionamiento de tales dispositivos, se puede hacer referencia al documento EP 2163296 A1 y al documento US 5,736,044 A1. Específicamente, se pueden emplear aspectos de los cartuchos de filtro en la construcción de una cápsula de filtro que incorpore los compuestos de membrana descritos en la presente descripción, sin apartarse del alcance de la invención como se describe en la presente descripción.

Para eliminar los virus de una solución de proteína, una solución que contenga una o más proteínas de interés y uno o más tipos de virus se somete a un paso de filtración mediante el uso de uno o más compuestos de membrana de ultrafiltración de agarosa, cuya filtración se puede realizar ya sea en el modo TFF o el modo NFF. En cualquier modo, la filtración se realiza en condiciones para retener el virus que generalmente tiene un diámetro de 20 a 100 nanómetros (nm), mientras se permite el paso de una o más proteínas a través del compuesto de membrana. Además, cuando se completa la filtración de la solución, la membrana se lava con agua o una solución tampón acuosa para eliminar las proteínas retenidas. El uso de la etapa de lavado permite obtener un alto rendimiento de solución de proteína sustancialmente libre de virus.

La presente descripción, junto con el conocimiento de la técnica, permite a un experto en la técnica practicar los métodos descritos en la presente descripción de forma exhaustiva.

Además, no hace falta decir al experto en la técnica que, tanto en los ejemplos dados como en el resto de la descripción, las cantidades de componentes presentes en las composiciones siempre solo suman 100 % en peso o % en moles, en base a la composición en su conjunto, y no puede exceder esto, incluso si pudieran surgir valores más altos de los intervalos de porcentajes indicados. A menos que se indique lo contrario, los datos de % son % en peso o % en moles, con la excepción de las relaciones, que se muestran en datos de volumen, tales como, por ejemplo, eluyentes, para cuya preparación se usan disolventes en determinadas relaciones de volumen en una mezcla.

Las temperaturas dadas en los ejemplos y la descripción, así como también en las reivindicaciones, están siempre en °C.

Las modalidades se ilustran adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1: Preparación de una solución de agarosa

Este es un ejemplo representativo para preparar una solución de agarosa al 10 % en peso. Se añaden 10 g de agarosa en polvo (tipo HD2, obtenido de Hispanagar, y tipos HR, ES, 3:1 y LE, obtenidos de Aquapor) a 90 g de agua y se mezclan a temperatura ambiente durante 30 min. La mezcla de agarosa hidratada se calienta luego en un microondas hasta que se forma una solución de agarosa. La solución se desgasifica sustancialmente mediante centrifugación a 3500 rpm y 70 °C durante 5 min. Las características de flujo libre de la solución se conservan a esta temperatura. La solución se mantiene en el hibridador a 70 °C hasta que se usa para fundir una película o capa delgada de agarosa. Otras concentraciones de solución de agarosa se preparan de manera similar mediante el uso de la proporción relativa apropiada de agarosa y agua.

Ejemplo 2: Preparación de una solución de agarosa con otros aditivos

Este es un ejemplo representativo para preparar una solución de agarosa al 10 % en peso (Tipo HR) que contiene cloruro de zinc al 10 % en peso.

Se prepara inicialmente una solución de agarosa como se describe en el Ejemplo 1. Se añaden 10 g de cloruro de zinc (98 %, obtenido de Acros) a la solución de agarosa al 10 % en peso y se mezclan en el hibridador a 70 °C hasta que se disuelve la sal. Las características de flujo libre de la solución se conservan en estas condiciones. Luego, la solución se mantiene en el hibridador a 70 °C hasta que se usa para fundir una película delgada de agarosa. Otras concentraciones de solución de agarosa que comprenden diferentes concentraciones de cloruro de zinc se preparan de manera similar mediante el uso de la proporción relativa apropiada de agarosa, cloruro de zinc y agua.

Ejemplo 3: Mediciones del flujo de agua de compuestos de membrana de ultrafiltración de agarosa

Las mediciones del flujo de agua se llevan a cabo mediante el uso de una celda agitada Amicon (EMD Millipore Corp., Billerica). Se coloca una membrana humedecida (en una mezcla 50:50 de IPA: agua) en la celda. La celda se llena con agua desionizada, se conecta a un suministro de aire presurizado y se presuriza hasta un manómetro de 172 kPa (25 psig). El efluente se recoge durante un tiempo de ensayo estándar y el flujo se calcula mediante el uso del área conocida de la membrana. Alternativamente, se puede usar instrumentación de ensayo de flujo automática para probar los compuestos de membrana. Ejemplo 4: Determinación del punto de corte del peso molecular de los compuestos de membrana de ultrafiltración de agarosa

El rechazo de los solutos modelo es el método más común para evaluar el rendimiento de las membranas de ultrafiltración. Por tanto, los límites de peso molecular nominal (NMWL) se pueden determinar con una variedad de solutos; con frecuencia se usan proteínas. El NMWL de una membrana de UF es típicamente la masa molecular de la proteína más pequeña que la membrana rechaza en un nivel o rechazo elegido, generalmente del 90 al 95 %. Otros solutos que pueden usarse para caracterizar membranas de UF incluyen dextranos, que están disponibles en una amplia gama de pesos moleculares. Todo el espectro de rechazo, desde moléculas de aproximadamente 1000 Da de pesos moleculares a moléculas de hasta aproximadamente 2000 000 Da, se puede medir en un solo ensayo.

La determinación del punto de corte del peso molecular se basa en métodos publicados, entre otros, por L. Zeman y M. Wales, en Separation Science and Technology, 16 (3), pág. 275 - 290 (1981). Los compuestos de membranas a caracterizar se desafían con soluciones que contienen dextranos polidispersos con pesos moleculares que varían de 1000 a 2000 000 Da en un dispositivo adecuado. La tasa de permeabilidad durante el ensayo se controla a bajo flujo para minimizar la polarización de la concentración. Las corrientes de alimentación y permeado se muestrean y analizan mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y los datos cromatográficos se usan para calcular el rechazo en función de la masa molecular del dextrano.

El rechazo (R) con masa molecular de dextrano es R = 1-Cp/Cf, donde Cp y Cf son la concentración de dextrano de una masa molecular dada en la alimentación y el permeado, respectivamente. El peso molecular al que la membrana retiene el 90 % de la alimentación de dextrano es el valor de rechazo de dextrano al 90 % (R90).

Los datos típicos de NMWL obtenidos de este análisis para compuestos de membrana de agarosa representativos se muestran en la Figura 3.

Ejemplo 5: Método de fabricación de un compuesto de membrana de ultrafiltración de agarosa NMWL de 65 kDa, 120 kDa y 250 kDa

Este ejemplo ilustra un proceso para hacer un compuesto de membrana de ultrafiltración de agarosa de corte de peso molecular nominal de 65 kDa.

Como sustrato de la membrana microporosa se empleó una membrana microporosa de fluoruro de polivinilideno (PVDF), que tenía un tamaño de poro promedio de 0,2 pm y un grosor medio de 100 pm. El sustrato microporoso se unió a una placa caliente y se mantuvo a una temperatura de 70 °C.

Se vertió una solución de polímero que contenía 10 % en peso de agarosa (Tipo ES) preparada como se describe en el Ejemplo 1, sobre la membrana de PVDF microporosa calentada mediante el uso de una cuchilla ajustable micrométrica con un espacio de 25 pm. La membrana recubierta de agarosa se retiró rápidamente de la placa calentada y se sumergió en un baño de agua mantenido a una temperatura de 20 °C (como se muestra en la Figura 1A).

La imagen de la membrana se llevó a cabo en una plataforma criogénica fabricada por Gatan, modelo Alto 2500. El Alto 2500 tiene una cámara de preparación dedicada que se conecta directamente a un microscopio electrónico de barrido (SEM) de alta resolución. La cámara incluye una cuchilla de fractura enfriada que asegura una fractura de profundidad controlada. Se usa una estación de congelación rápida separada de dos recipientes para congelar las muestras. En las Figuras 2A-2C se muestra una sección transversal del compuesto de membrana producido. El grosor del recubrimiento de agarosa por encima de la superficie del sustrato microporoso es de aproximadamente 15 pm.

El compuesto de membrana está libre de defectos y tiene las características de flujo y retención (determinadas como se describe en los Ejemplos 3 y 4) enumeradas en la Tabla 1.

Se preparó un compuesto de membrana de ultrafiltración de agarosa NMWL de 120 kDa como sigue. Como sustrato de la membrana microporosa se emplea una membrana microporosa de fluoruro de polivinilideno (PVDF), que tiene un tamaño de poro promedio de 0,2 pm y un grosor promedio de 100 pm. El sustrato microporoso se fija a una placa caliente y se mantiene a una temperatura de 70 °C.

Una solución de polímero que contiene 10 % en peso de agarosa (Tipo 3:1), preparada como se describe en el Ejemplo 1, se vierte sobre la membrana de PVDF microporosa calentada mediante el uso de una navaja o micrómetro ajustable con un espacio de 25 pm. Luego, la membrana recubierta de agarosa se retira rápidamente de la placa caliente y se sumerge en un baño de agua mantenido a una temperatura de 20 °C.

El grosor del recubrimiento de agarosa por encima de la superficie del sustrato microporoso es de aproximadamente 18 pm, según se determina mediante SEM. El compuesto de membrana está libre de defectos y tiene las características de flujo y retención (determinadas como se describe en los Ejemplos 3 y 4) enumeradas en la Tabla 1. Por último, se prepara un compuesto de membrana de ultrafiltración de agarosa NMWL de 250 kDa como sigue. Como sustrato de membrana microporosa se emplea una membrana microporosa de fluoruro de polivinilideno (PVDF), que tiene un tamaño medio de poro de 0,2 micrómetros y un grosor promedio de 100 pm. El sustrato microporoso se fija a una placa caliente y se mantiene a una temperatura de 70 °C.

Una solución de polímero que contiene 10 % en peso de agarosa (Tipo HR) preparada como se describe en el Ejemplo 1, se funde sobre la membrana de PVDF microporosa calentada mediante el uso de una navaja con un espacio de 25 pm. A continuación, la membrana revestida se retira rápidamente de la placa caliente y se sumerge en un baño de agua mantenido a una temperatura de 20 °C.

El grosor del recubrimiento de agarosa por encima de la superficie del sustrato microporoso es de aproximadamente 15 pm, según se determina mediante SEM. El compuesto de membrana está libre de defectos y tiene las características de flujo y retención (determinadas como se describe en los Ejemplos 3 y 4) enumeradas en la Tabla 1.

Tabla 1: Características de flujo y retención de diferentes compuestos de membranas de ultrafiltración de agarosa

Ejemplo 6: Dependencia del corte del peso molecular del compuesto de la membrana de agarosa y del flujo de agua de la concentración de agarosa en la solución fundida.

La configuración usada para preparar los compuestos de membrana de agarosa se destaca en la Figura 1. Primero se pega una lámina de plástico no poroso (70) a una placa caliente o calentada (30) mantenida a 70 °C. Se coloca un sustrato de membrana microporosa de PVDF (20) (tamaño de poro nominal de 0,2 pm) encima de la lámina de plástico (70) y se cura en su lugar al pegarla con cinta adhesiva a la lámina de plástico (70). Una solución de polímero que contiene 5, 7 y 10 % en peso de agarosa (Tipo ES) preparada como se describe en el Ejemplo 1, se extiende como una capa delgada entre el sustrato de la membrana de PVDF (20) y la lámina de plástico (70) mediante el uso de un cuchillo ajustable por micrómetro ajustable (90) con un espacio de alrededor de 35 pm. El par de membrana-lámina recubierto de agarosa se retira luego de la placa caliente o calentada (30) y se coloca en un baño de hielo para efectuar la gelificación de agarosa y formar la capa de ultrafiltración mediante una inversión de fase térmica. El par de láminas de membrana se pone en contacto con agua (en un baño mantenido a 20 °C) para evitar dañar la capa de ultrafiltración de agarosa mientras se retira la lámina de plástico (70), lo que deja un sustrato microporoso recubierto con una fina capa de ultrafiltración de agarosa.

Como se muestra en la Figura 4, el corte del peso molecular de la membrana y el flujo son una función de la concentración de agarosa en la solución fundida. Se obtiene un R90 (flujo) de 25 kDa (1,2 LMH/PSI), 47 kDa (3,7 LMH/Psi) y 1200 kDa (5,4 LMH/PSI) a una concentración de solución de agarosa de 10, 7 y 5 % en peso, respectivamente, (1 psi = 6,9 kPa).

Ejemplo 7: Dependencia del punto de corte del peso molecular del compuesto de membrana de agarosa de la concentración de cloruro de zinc en la solución fundida.

Se prepara un compuesto de membrana representativo como se describe en el Ejemplo 6, con la única diferencia de que se usa una solución fundida de agarosa (7 y 10 % en peso de agarosa de tipo HR) preparada como se describe en el Ejemplo 2. Como se muestra en la Figura 5, concentraciones de sal más altas en la solución fundida dan como resultado una membrana de UF más abierta. A una concentración de solución fundida de agarosa al 7 % en peso que comprende 0, 5, 10, 12 y 14 % en peso de ZnCl2, se obtienen los siguientes R90 respectivos: 35 kDa, 31 kDa, 44 kDa, 70 kDa y 300 kDa, respectivamente. A una concentración de solución fundida de agarosa al 10 % en peso que comprende 0, 5, 10, 15 % en peso de ZnCl2, se obtuvieron los siguientes R90 respectivos: 15 kDa, 16 kDa, 26 kDa y 1350 kDa.

Ejemplo 8: Reticulación de un compuesto de membrana de agarosa con DVS para evitar la compresión de la capa de agarosa bajo presión.

Se prepara un compuesto de membrana de agarosa representativo como se describe en el Ejemplo 5. Se sumergen tres discos de membrana compuesta de membrana (de 25 mm de diámetro cada uno) (todos a la vez) en una solución de carbonato de sodio de 20 ml (0,5 M a pH 11) que comprende una solución de mercaptoetanol al 0,1, 0,5 y 1 % (obtenida de Sigma-Aldrich) en agua desionizada y mezclada durante 6 horas. Luego, las membranas se ensayan como se describe en el Ejemplo 3.

Como se muestra en la Figura 6, la membrana compuesta preparada es comprimible bajo presión, lo que resulta en una pérdida del 20 % de flujo de agua a 103 kPa (15 psi). La reticulación con dVs mejora las propiedades mecánicas de la capa de gel de agarosa y evita su colapso bajo presión. Sólo es necesaria una solución de DVS al 0,1 % en peso.

Ejemplo 9: Secado de compuestos de membranas de agarosa

Este ejemplo ilustra el secado de un compuesto de membrana de agarosa que está en una solución de glicerina al 20 % (en agua).

Se prepara un compuesto de membrana de agarosa representativo como se describe en los Ejemplos anteriores. El corte de peso molecular y el flujo del compuesto de membrana se determinan como se describe en los Ejemplos 3 y 4. El compuesto de membrana se retira de la celda agitada de prueba, se lava con agua y se trata con una solución acuosa de glicerina al 20 % en volumen, que actúa como humectante. Subsecuentemente, el compuesto de membrana se seca en condiciones ambientales durante 3 días.

Como se muestra en la Figura 7, el límite de peso molecular del compuesto de membrana no cambia después del secado. El flujo del compuesto de membrana antes y después del secado permanece sin cambios a 0,7 LMH/psi, (1 psi = 6,9 kPa).

Ejemplo 10: Evaluación de la infiltración de agarosa en el sustrato

Este ejemplo ilustra la evaluación de la profundidad de la infiltración de agarosa en un sustrato de PVDF microporoso.

Es necesaria cierta penetración de la agarosa en el sustrato microporoso para obtener una unión suficientemente fuerte entre el sustrato y la capa de ultrafiltración de agarosa y para hacer que el compuesto de membrana de agarosa sea altamente resistente a la delaminación. El análisis de la profundidad de infiltración se lleva a cabo mediante el uso de un instrumento de espectroscopía dispersiva de energía de microscopio electrónico de barrido (SEM-EDS) (INCA300, Oxford Instruments, Inglaterra). El análisis de composición de microrregiones se lleva a cabo a intervalos de 5 pm en la dirección Z comenzando desde la superficie del sustrato microporoso y extendiéndose 40 pm en el sustrato.

Se prepara un compuesto de membrana de agarosa representativo como se describe en el Ejemplo 5. Los datos del análisis elemental obtenidos del SEM-EDS se usan para determinar las concentraciones relativas de átomos de oxígeno y flúor presentes en la muestra. La señal de flúor se atribuye al sustrato microporoso de PVDF, mientras que la señal de oxígeno se atribuye a la agarosa. Como se muestra en la Figura 8, la profundidad de la infiltración de agarosa en el sustrato de PVDF es de aproximadamente 10 pm.

Ejemplo 11: Determinación del punto de gelificación de los diferentes grados de agarosa

Este ejemplo ilustró la determinación del punto de gelificación de diferentes grados de agarosa mediante el uso de un viscosímetro rotacional.

Se preparan soluciones de agarosa al 7 % en peso representativas como se describe en el Ejemplo 1 y se almacenan en el hibridador a 70 °C. Se usa un estándar de viscosidad Brookfield (lote # 112305) para comprobar la calibración del instrumento: informado/observado, 489/502 ± 6 cp. (Se usa un protector de piernas para establecer condiciones de contorno, velocidad de 50 RPM, husillo LV2).

Se vierten 16 ml de solución de agarosa en una cámara de muestra que encaja en una camisa de agua montada en un viscosímetro Brookfield Modelo DV-II+Pro (Brookfield Engineering Labs Inc.). La temperatura de la cámara de muestra se establece en 55 °C mediante el uso de un baño de temperatura circulante (que contiene agua, VWR Scientific Products Modelo # 1130-1) y se proporciona una lectura directa de la temperatura de la cámara mediante el uso de un sensor RTD integrado conectado al viscosímetro DV-II-Pro. Cada muestra de solución de agarosa se deja equilibrar durante 10 minutos a 55 °C en la cámara de temperatura controlada antes de comenzar la recopilación de puntos de datos. Las mediciones se adquieren mediante el uso del software Wingather V3.0 (Brookfield Engineering Labs Inc.) con un husillo SC4-25 a una velocidad de rotación de 2 rpm y un par de arranque del 2 %.

La temperatura de la cámara que contiene la solución de agarosa se reduce al agregar continuamente hielo al baño de temperatura circulante hasta que se alcanza el punto de gel, evidenciado por un aumento de primer orden en la viscosidad, como se muestra en la Figura 9. La recopilación de datos se detiene y el viscosímetro se apaga una vez que el par se extiende en un 95 %. La temperatura de inicio de la gelificación se registra en la Tabla 2 para un conjunto representativo de diferentes grados de agarosa al 7 % en peso.

Tabla 2: Temperatura de inicio de la gelificación para diferentes soluciones de grado de agarosa (7 % en peso) determinada mediante el uso de un viscosímetro rotacional

Ejemplo 12: Características de capacidad de filtración y retención de virus de un compuesto de membrana de ultrafiltración de agarosa mediante el uso de una solución que contiene medio de cultivo celular

Para estudios de capacidad de filtración y retención de virus con medios de cultivo celular, se preparan compuestos de membrana de ultrafiltración de agarosa como se describe en el Ejemplo 1 mediante el uso de agarosa al 7 % en peso (tipo 3:1) y GEHP (PES hidrófobo 0,2 |j) como sustrato microporoso. El compuesto de membrana tiene un R90 de 485 kDa y una permeabilidad al agua de 4 LMH/psi, (1 psi = 6,9 kPa). Se corta un disco compuesto de membrana (25 mm) y se coloca en un dispositivo portafiltros Swinnex® con un área de filtración de 4,5 cm2. Se usa una capa de tela no tejida de poliéster en la parte inferior/lado de salida del dispositivo. Se usa un dispositivo Viresolve® Pro de 25 mm como control. El compuesto de membrana tiene un R90 de 100 kDa y una permeabilidad al agua de 14 LMH/psi.

La permeabilidad al agua, la capacidad de filtración de los medios de cultivo celular y la retención de virus se ensayan en una configuración de presión constante equipada con una celda de carga. Para el estudio se usa un medio de cultivo celular definido químicamente patentado por EMD Millipore Corp. para el crecimiento de células de ovario de hámster chino (CHO).

El virus modelo, el bacteriófago PhiX-174, se añade a un tampón de acetato a pH 5, conductividad 13,5 mS/cm, a una concentración de 1,4*107 UFP/ml. Los dispositivos se enjuagaron con tampón durante 10 min, la alimentación se cambió al recipiente con virus y el medio de cultivo celular con virus se hizo fluir a través de cada dispositivo a una presión constante de 69 kPa (10 psi). La capacidad de filtración se controló al medir el volumen de permeado en varios puntos de tiempo.

Las muestras para los ensayos de virus se recolectaron a varias capacidades de filtración (15, 250 y 500 L/m2) y los resultados de LRV se muestran en la Tabla 3. La Figura 10 muestra la descomposición del flujo para compuestos de membranas de ultrafiltración de agarosa y membranas Viresolve® Pro. Los compuestos de membranas de ultrafiltración de agarosa descritos en la presente descripción muestran un comportamiento de taponamiento diferente al de Viresolve® Pro, donde el flujo decae a un ritmo más rápido antes de que se alcance la capacidad de la membrana.

Tabla 3: Resultados de LRV para compuestos de membranas de ultrafiltración de agarosa y membranas Viresolve®

Pro desafiadas con la corriente de alimentación del virus modelo

La descripción se comprende más a fondo a la luz de las enseñanzas de las referencias citadas en la descripción. Las modalidades dentro de la descripción proporcionan una ilustración de las modalidades y no deben interpretarse como limitantes en su alcance. El experto (profesional) reconoce fácilmente que muchas otras modalidades se abarcan en esta descripción.

Las modalidades específicas que se describen en la presente descripción se ofrecen solo a modo de ejemplo y no pretenden ser limitantes de ninguna manera. Se pretende que la descripción y los ejemplos se consideren ilustrativos solamente, con un verdadero alcance de la descripción que se indica por las siguientes reivindicaciones.

Claims (5)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de membrana de ultrafiltración de agarosa que tiene un tamaño de poro inferior a 0,1 |jm, en donde el compuesto comprende una membrana de soporte porosa que tiene una capa de agarosa sobre la membrana de soporte porosa, en donde la capa de agarosa comprende un grosor que varía de 1 a 100 jm, en donde la capa de agarosa se infiltra de 1 a 15 jm en al menos una porción del grosor de la membrana de soporte porosa y en donde la capa de agarosa se prepara a partir de una solución de agarosa que comprende cloruro de zinc para estabilizar la solución de agarosa a una concentración igual o menor al 15 % en peso y divinilsulfona (DVS) como reticulante al fundir una capa de la solución de agarosa sobre la membrana de soporte porosa y sumergir la membrana de soporte porosa recubierta de agarosa en un baño de agua a una temperatura por debajo del punto de gelificación de la solución de agarosa.

2. El material compuesto de membrana de ultrafiltración de agarosa de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la capa de agarosa comprende un grosor que varía de 1 a 20 jm.

3. El compuesto de membrana de ultrafiltración de agarosa de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la membrana de soporte porosa comprende material polimérico tejido o no tejido, en cuyo caso opcionalmente, en donde el material polimérico tejido o no tejido se selecciona del grupo que consiste en poliéster, poliamidas, poliolefinas, polietileno (PE), policaprolactama, poli(hexametilenadipamida), polipropileno, polímeros aromáticos, tereftalato de polietileno (PET), poliéter-éter cetona (PEEK), polisulfona, polietersulfona (PES), polímeros halogenados y polímeros fluorados.

4. El material compuesto de membrana de ultrafiltración de agarosa de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el polímero fluorado se selecciona entre politetrafluoroetileno y fluoruro de polivinilideno (PVDF).

5. El material compuesto de membrana de ultrafiltración de agarosa de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la membrana de soporte porosa comprende un grosor promedio que varía de 20 jm a 500 jm.