ES2894201A1 - Compuestos radioactivos basados en proteinas selectivas de bacterias para la deteccion no invasiva de focos infecciosos - Google Patents
Compuestos radioactivos basados en proteinas selectivas de bacterias para la deteccion no invasiva de focos infecciosos Download PDFInfo
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Abstract
Compuestos radioactivos basados en proteínas selectivas de bacterias para la detección no invasiva de focos infecciosos. La presente invención se refiere a compuestos radioactivos, también denominados en la presente invención como radiotrazadores, que comprenden una proteína seleccionada de la lista que comprende: colágeno, fibronectina y fibrinógenouna, unida covalentemente a un agente quelante y un radioisótopo coordinado al agente quelante. La presente invención también se refiere a su procedimiento de preparación y a su uso para la detección no invasiva de focos infecciosos causados por bacterias Gram+ mediante imagen nuclear.
Description
DESCRIPCIÓN
Compuestos radioactivos basados en proteínas selectivas de bacterias para la detección no invasiva de focos infecciosos
La presente invención se refiere a compuestos radioactivos, también denominados en la presente invención como radiotrazadores, basados en proteínas, tales como colágeno, fibronectina y fibrinógeno, para la detección no invasiva de focos infecciosos causados por bacterias Gram+ mediante imagen nuclear.
Por tanto, la presente invención se encuadra en el campo de la medicina y, más concretamente, en el campo del diagnóstico o detección de infecciones bacterianas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Hasta la fecha, las técnicas de imagen empleadas en el diagnóstico de focos infecciosos se basan o en técnicas clásicas como la resonancia magnética (RM) o la tomografía computerizada (TAC). Como principal limitación de estas técnicas destaca su baja sensibilidad, incapaz de detectar focos infecciosos en estadios iniciales. Por otra parte, en el desarrollo de técnicas más selectivas durante los últimos años ha comenzado a usarse la imagen molecular y en especial la imagen nuclear debido a la alta sensibilidad de la técnica. A pesar de la mejora en diagnóstico infeccioso mediante imagen proporcionada por esta metodología, el empleo de radiotrazadodres conocidos y comercialmente accesibles, como es el 18FDG (radiofármaco constituido por un análogo de la glucosa 2-[18F]fluoro-2-desoxi-D-glucosa unido al isótopo radiactivo flúor-18), específicos no solo de bacterias, sino de otras líneas celulares como macrófagos o tumorales, da lugar en muchos casos a falsos positivos.
Por otra parte, el uso de las técnicas clásicas de diagnóstico como los cultivos celulares o bacterianos requieren largos tiempos en el análisis de los resultados (de varios días de incubación), así como la toma de biopsia o sangre.
La presente invención tiene como objetivo solventar la problemática clínica actual, permitiendo un diagnóstico precoz, selectivo y no invasivo de procesos infecciosos.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente memoria describe compuestos radioactivos (también denominadas radiotrazadores, sondas de imagen o, simplemente, sondas) basados en una proteína, como el colágeno u otras proteínas similares afines a las proteínas de unión presentes en la pared bacteriana, para la detección no invasiva de focos infecciosos causados por bacterias Gram positivas mediante imagen nuclear (SPECT/PET, tomografía computarizada por emisión de fotón único/tomografía por emisión de positrones).
En el desarrollo de la nueva sonda de imagen, la proteína, preferiblemente colágeno, es marcada radiactivamente con distintos radioisótopos tales como 99mTc, 68Ga, 18F, 89Zr, 64Cu o 111 ln sin modificar su estructura nativa. Tras la inyección de la sonda radiactiva, ésta actuará uniéndose de forma específica a la pared de las bacterias Gram positivas a través de los receptores de unión a la proteína en cuestión, permitiendo la detección no invasiva y específica de focos infecciosos producidos por dichas bacterias mediante imagen nuclear.
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un compuesto que comprende una proteína unida covalentemente a un agente quelante y un radioisótopo coordinado al agente quelante, donde la proteína es seleccionada de la lista que comprende: colágeno, fibronectina y fibrinógeno, todas ellas moléculas afines a las proteínas ancladas a la pared bacteriana.
El agente quelante es un compuesto o molécula que comprende al menos un primer grupo seleccionado de: amina, maleimida y carboxilo configurado para unirse a las proteínas de manera covalente y al menos un segundo grupo seleccionado de carboxilo, amino y fosfina configurado para coordinarse con el isótopo metálico
En una realización preferida, el agente quelante es seleccionado de la lista que comprende:
- Ácido Pentético, también llamado Pentaacetato de dietilentriamina (DTPA);
- Ácido 1,4,7,10-Tetraazaciclododecane-1,4,7,10-tetraacetico (DOTA) y sus derivados: DOTA-NHS ester, maleimida-DOTA y NH2-DOTA-GA;
- Ácido 1,4,7-Triazaciclononano-1,4,7-triacetico (NOTA) y sus derivados: NOTA-NHS ester, NODAGA-NHS ester, maleimida-NOTA y NH2-NODA-GA;
- Deferoxamina (DFO) y su derivado p-SCN-Bn-Deferoxamina (1-(4-isotiocianatofenil)3-[6,17-dihidroxi-7,10,18,21-tetraoxo-27-(N-acetilhidroxilamino)-6,11,17,22-tetraazaheptaeicosina] tiourea)] y
- Ácido Dietilentriamina-N,N,N”,N”-tetra-tert-butil acetato-N’-acetico,también conocido como DTPA-tetra (t-Bu ester).
En una realización aún más preferida, el agente quelante o enlazador es el ácido penténico, que se uniría a la proteína a través de un enlace covalente entre un grupo amino de la proteína y un carboxilato del agente quelante y se unirá al radioisótopo por coordinación a través de oxígenos de grupos carboxilo y de los nitrógenos que el ácido penténico comprende en su estructura.
En otra realización preferida, la proteína es colágeno, más preferiblemente colágeno tipo I o tipo IV.
El radioisótopo es seleccionado preferiblemente de la lista que comprende: 99mTc, 68Ga, 18F, 89Zr, 64Cu o 111ln. En una realización más preferida, el radioisótopo es 99mTc y en una realización aún más preferida, el radioisótopo R es 99mTc (IV):
Un radioisótopo (radionucleido, radionúclido, nucleido radioactivo o isótopo radiactivo) tiene el significado convencional es decir, un átomo que tiene un exceso de energía nuclear y que por tanto es radioactivo.
La preparación de los radiotrazadores requiere de dos etapas sintéticas: una primera etapa de formación de enlace covalente entre la proteína con un quelante adecuado, formándose así un conjugado proteína-quelante y una segunda etapa radioquímica basada en el mareaje radioactivo del conjugado proteína-quelante con el radioisótopo correspondiente.
Otro aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende el compuesto definido en el primer aspecto de la invención.
En una realización particular, la composición de la invención es una composición farmacéutica. La composición farmacéutica comprende el compuesto definido en el primer aspecto de la invención y tiene al menos una aplicación en la detección de focos infecciosos provocados por bacterias Gram positivas.
La composición de la invención puede administrarse de cualquiera de las maneras conocidas de administración. En una realización preferida, la composición está configurada para poder administrarse de forma intravenosa, intraperitoneal u oral. De manera aún más preferida, la composición está configurada para ser inyectada por vía intravenosa o intraperitoneal.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso del compuesto de la invención, o de la composición que le comprende, como agente de imagen para la visualización de infecciones o focos infecciosos provocados por bacterias Gram positivas en un sujeto (animal o humano).
En la presente invención, el término “agente de imagen” se refiere a un compuesto químico cuya estructura contiene un isótopo radiactivo (también llamado radiotrazador, radiofármaco) que es capaz de llevar a cabo el seguimiento de un proceso biológico, produciendo una señal que puede ser detectada mediante técnicas de imagen en medicina nuclear, como son la tomografía computarizada por emisión de fotón único y la tomografía por emisión de positrones. Luego, el compuesto actúa como una sonda para la detección de infecciones o focos infecciosos provocados por bacterias Gram positivas.
El término “sonda” se refieren a un compuesto químico capaz de detectar de forma selectiva focos infecciosos provocados por bacterias gran positivas.
En una realización preferida, la visualización de infecciones o focos infecciosos se realiza por la técnica PET (Tomografía por emisión de positrones) o SPECT (Tomografía computarizada por emisión de fotón único).
En una realización preferida, las bacterias Gram positivas son seleccionadas de la lista que comprende: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, Mycobacterium tuberculosis, Enterococcus faecalis, Staphylococcus agalactiae y Clostridioides difficile,
En una realización preferida, la infección provocada por las bacterias Gram positivas es endocarditis infecciosa.
Otro aspecto de la invención se refiere a un método para proporcionar una imagen de focos infecciosos causados por bacterias Gram positivas in vivo en un sujeto, que comprende (i) administrar al sujeto el compuesto de la invención y (ii) escanear al sujeto utilizando imágenes PET o SPECT combinadas con técnica estructural como tomografía anatómica computerizada para obtener una imagen visible.
Un último aspecto de la invención se refiere a un método de detección de focos infecciosos o infecciones en un sujeto que comprende las siguientes etapas:
- administración de una cantidad efectiva del compuesto de la invención a un sujeto, - obtención de una imagen tras la administración del compuesto proporcionando un tiempo adecuado al compuesto administrado para su unión al foco infeccioso diana, - reconstrucción y análisis de la imagen adquirida.
En la presente invención, la expresión “cantidad efectiva” se refiere a aquella cantidad del compuesto que cuando se administra, es suficiente para ser detectado mediante una imagen de resonancia nuclear.
El compuesto radioactivo de la invención, que se utiliza para la detección no invasiva de focos infecciosos de bacterias Gram positivas, se unirá de forma específica a los receptores de unión a la proteína (colágeno preferiblemente) presentes en la pared de las bacterias Gram positivas, permitiendo la detección no invasiva y específica de focos infecciosos producidos por dichas bacterias mediante imagen nuclear.
La ausencia de las proteínas de unión a colágeno (receptores de colágeno) en macrófagos o miocitos permite que el compuesto de la invención detecte únicamente focos infecciosos. Esta detección específica permitirá solventar las principales limitaciones del trazador 18F-FDG empleado actualmente en la clínica. Por un lado, su incapacidad de discernir entre procesos infecciosos e inflamatorios, dando lugar a falsos positivos. Por otro lado, su elevada captación natural en miocardio, la cual puede enmascarar la captación infecciosa.
El impacto socioeconómico del uso del compuesto de la invención en la detección específica y no invasiva de enfermedades infecciosas permitirá una optimización del tratamiento personalizado en los pacientes, lo que repercutirá en una reducción en los costes asociados al tratamiento de procesos infecciosos, así como en una mejora en la
calidad asistencial en el paciente.
El compuesto de la invención, tal y como se ha demostrado en los ejemplos, presenta alta estabilidad en condiciones fisiológicas, que evitará la liberación del isótopo libre que pudiera dar lugar a falsos diagnósticos; presenta selectividad hacia bacterias Gram positivas frente a otras bacterias Gram negativas (E. coli) u hongos (C. albicans) y una alta sensibilidad al ser capaz de detectar concentraciones de bacterias por debajo de las 10CFU.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1.- Optimización química en la síntesis del radiotrazador 99mTc-DTPA-Colágeno y caracterización fisicoquímica. (A) Rendimiento de mareaje radiactivo en función de la concentración de colágeno I empleada en la radiosíntesis de 99mTc-DTPA-Colágeno. (B) Rendimiento de mareaje del compuesto 99mTc-DTPA-Colágeno frente al control 99mTc -Colágeno en ausencia de quelante. (C) Rendimiento de radiomarcaje en la síntesis de 99mTc-DTPA-Colágeno en función de diversas concentraciones de SnCL. (D) Medida radiactiva por cromatografía en placa fina (TLC) para la determinación de la pureza del compuesto 99mTc-DTPA-Colágeno (izquierda) frente a la medida cromatográfica del radioisótopo libre (99mTc). (E) estudio de estabilidad de 99mTc-DTPA-Colágeno in vitro en PBS mediante cromatografía TLC a lo largo del tiempo
Fig. 2.- Estudio in vitro de captación de la sonda radiactiva 99mTc-DTPA-Colágeno. (A) Rendimiento de unión de la sonda 99mTc-DTPA-Colágeno a la cepa S. aureus a distintos tiempos. (B) Estudio del % de unión del radiotrazador 99mTc-DTPA-Colágeno a la bacteria S. aureus frente al trazador comercial 18F-FDG e isótopo libre 99mTc. (C) Comparativa de % de unión del trazador 99mTc-DTPA-Colágeno frente al isótopo libre 99mTC en presencia de S. aureus. (D) estudio in vitro de unión de la sonda 99mTc-DTPAColágeno en presencia de diversas bacterias y hongos para determinar la selectividad del trazador.
Fig.3 Estudio in vivo de la sonda 99mTc-Colageno en modelo local intramuscular (rata). (A) Imagen PETC/CT in vivo del trazador 99mTc-DTPA-Colágeno en modelo doble de infección local localizada en pata (izquierda S. aureus muerto Vs derecha S. aureus vivo). (B) Estudio ex vivo mediante autorradiografía de tejido muscular inflamado e infectado tras administración intravenosa del trazador.
Fig. 4.- Estudio in vivo del trazador 99mTc-DTPA-Colágeno en modelo animal (rata) de endocarditis infecciosa. (A) Imagen in vivo PET/CT en rata del radiotrazador 99mTc-DTPA-Colágeno en modelo control (sham) y en modelo de El (endocarditis infecciosa). (B) Estudio ex vivo mediante autorradiografía de tejido cardiaco tras la administración del trazador 99mTc-DTPA-Colágeno en modelo control (sham) y de El. (C) Cuantificación ex vivo de % de dosis inyectada por gramo de tejido (corazón) del radiotazador. (D) Estudio histológico con tinción HyE (tinción hematoxilina-eosina) de tejido cardiaco de rata con El.
EJEMPLOS
A continuación, se describe la síntesis del radiotrazador 99mTc-DTPA-Colágeno donde el quelante empleado será el DTPA y el radionúcleido para su mareaje radiactivo el Tecnecio 99 metaestable (99mTc). Además, se presenta su completa caracterización fisicoquímica así como su validación (in vitro e in vivo) como herramienta no invasiva diagnóstica de infecciones causadas por bacterias gram positivas.
En el apartado (A) se indicarán los experimentos o ensayos realizados y en el apartado (B) los resultados y conclusiones de los mismos.
(A) EJEMPLOS REALIZADOS
Ejemplo 1: Preparación del radiotrazador
1.1.- Conjugación de colágeno tipo I con DTPA-bis-anhídrido
A una disolución de colágeno tipo I (Sigma-Aldrich) de 0,7 mg/mL (1 mL, H2O mQ) se le añadió 100 pl de una solución de 10 mg/ml de DTPA-bis-anhídrido (Chematech, Francia) en NaHC0 3 0,1 M. La reacción se mantuvo 20h a 37 ° C con agitación
constante. El producto de la conjugación se centrifugó 35 minutos a 3000 g usando unidades de filtro Amicon Ultra de 100 KDa. Las muestras puras se recuperaron mediante centrifugación de 5 minutos a 3000 g y se elevaron a un volumen final de 400 Mi con PBS 1X.
1.2.- Mareaje radiactivo del conjugado DTPA-Colágeno con 99m-Tecnecio, 99mTc (IV) Tras la conjugación de la molécula colágeno con el quelante DTPA se llevó a cabo el mareaje radiactivo del conjugado DTPA-Colágeno con pertecnectato sódico [99mTc-NaTc04 El pertecnectato de sodio comercial [99mTc- NaTc04] fue obtenido a partir del generador de tecnecio99mTcTEKCIS ™ (Curium Pharma, España). Como primera etapa en el radiomarcaje y para la óptima incorporación del radionúcleido en la estructura del colágeno, el radiofármaco comercial 99mTc-NaTc04 (100 pl, 20 mCi) se redujo a 99mTc (IV) en presencia de cloruro estanico (60 pl SnCL en HAc al 10%) durante 5 minutos a 37 0C, bajo atmósfera de N2. La solución final se neutralizó empleando NaOH (10 pl, 2,8 N). El conjugado DTPA-Colágeno (400 pl) se marcó radiactivamente con esta solución de 99mTc (IV) con agitación constante a 370C durante 30 minutos. El producto resultante se centrifugó 10 minutos a 15000 rpm usando unidades de filtro Amicon Ultra de 100 KDa. El producto final radiactivo 99mTc-DTPA-Colágeno se recuperó por centrifugación (5 min, 7500 rpm) y se disolvió en 500 pl de PBS 1X.
El rendimiento de la reacción radioquímica y la pureza del radiotrazador se estimaron mediante análisis cromatográfico ¡TLC (del inglés, Instant Thin Layer Chromatography) empleando como fase estacionaria gel de sílice y fase móvil = 90:10 MeOH: H2O (Merck, Alemania).
Ejemplo 2.- Estudios de estabilidad in vitro
La estabilidad in vitro del radiotrazador 99mTc-DTPA-Colágeno en PBS 1X se evaluó a lo largo del tiempo (0h-50h) incubando 1 mCi a 37 0C con agitación constante. Se analizaron alícuotas de 3 pl de la sonda 99mTc-DTPA-colágeno por cada punto temporal (de 1h a 50h) empleando ¡TLC en placa de gel de sílice (Merck, Alemania) y fase móvil de 90:10 MeOH: H20.
Posteriormente, se evaluó la estabilidad in vitro del radiotrazador en suero de ratón añadiendo 200 pCi del radiotrazador a 1 mi de suero murino e incubando la mezcla a 37 0C con agitación constante. Los puntos de tiempo seleccionados para la evaluación fueron 30 y 120 minutos y la estabilidad también se analizó por ¡TLC en placa de gel de sílice y fase móvil de 90:10 MeOH: H20.
Ejemplo 3.- Determinación de LogP e hidrofobicidad
El procedimiento seleccionado para la evaluación de la hidrofobicidad del radiotrazador fue el método de partición basado en el cálculo del LogP. Para ello se añadieron 200 pl de 99mTc-DTPA-colágeno puro (1 mCi) sobre una mezcla bifásica inmiscible de 500 pl de 1-octanol y 500 pl de PBS 1X. La mezcla se homogeneizo durante dos minutos con agitación vigorosa y posteriormente se dejó decantar durante 30 minutos para la correcta separación de las fases. Finalmente se tomaron 100 pl de cada fase (octanol y PBS) y se midió la actividad presente en cada muestra empleando un contador gamma Genesys (LaboratoryTechnologies Inc., EE. UU.)
Ejemplo 4.- Preparación cepas bacterianas
Para la inoculación de animales se utilizó una cepa ATCC 29213de Staphylococcus aureus, la cual se sembró en agar sangre 24 horas antes de su inoculación in vivo. El día de la inoculación se preparó una suspensión bacteriológica utilizando la cepa de S.aureus y ajustando los estándares de turbidez de McFarland a 0,5; obteniendo una concentración de 108ufc/ml.
Inactivación de la cepa: en aquellos casos en los que se requería inyectar una solución control, se procedió a la inactivación de la cepa de S.aureus utilizando una termobloque a 100°C durante 5 minutos.
Ejemplo 5.- Evaluación in vitro
La capacidad de detección del radiotrazador (sonda) fue inicialmente evaluada mediante estudios in vitro empleando un panel de bacterias tanto gram positivas (S aureus ATCC 29213, S epidermidis (cepa clínica cedida por el servicio de microbiología del hospital Ramón y Cajal de Madrid), S faecalis ATCC 33186) como negativa (E coli ATCC 25922) y hongos (C albicans ATCC 14058). Entre las cepas descritas, las dos últimas categorías fueron empleadas como controles para demostrar la especificidad de la sonda hacia bacterias gram positivas)
Los estudios de unión se realizaron sobre placas de 96 pocilios en los que se encontraban los correspondientes patógenos a diversas concentraciones (desde 101 hasta 108) en forma de biofilm para poder imitar en la mayor medida posible las condiciones encontradas en la práctica clínica. Sobre cada pocilio se añadieron 150uL (10 pCi) de sonda pura 99mTc-NaTc04. Paralelamente controles con 99mTc libre con las mismas actividades se llevaron a cabo a cada CFU para demostrar la especificidad del colágeno. Los estudios de captación se llevaron a cabo a 37°C y a distintos tiempos de
incubación (30 min, 2h y 4h) para la evaluación de la cinética de unión. Pasados los correspondientes tiempos de incubación las muestras se trasladaron a eppendorf y fueron centrifugadas con el objetivo de separar el sobrenadante del pelet bacteriano. Cada fracción fue separada y medida en contador gamma, cuantificando la unión de la sonda a la bacteria en función de la actividad presente en los pellets bacterianos.
Finalmente, con el objetivo de demostrar la mejora de nuestra metodología frente a las técnicas actualmente empleadas en la práctica clínica, se comparó la capacidad de unión de nuestra sonda 99mTc-NaTc04 frente a la comercial 18F-FDG. Para ello se incubaron 10 pCi de cada radiotrazador con 108 CFU de S aureus durante 180min. Se separaron los sobrenadantes de las colonias bacterianas mediante centrifugación y los pelets y sobrenadantes recogidos se midieron en contador gamma para establecer los porcentajes de unión basados en la actividad radiactiva presente en cada fracción.
Ejemplo 6.- Tiempo de vida media en sangre
El tiempo de circulación en sangre del radiotrazador se calculó midiendo la actividad en muestras de sangre tomadas a lo largo del tiempo a partir de la vena de cola. La sonda radiactiva 99mTc-DTPA-Colágeno (910-960 pCi, 250 pL de PBS 1X) se inyectó por vía intravenosa a ratas SD sanas (10 semanas de edad, 210-260 g de peso, n = 3). Las ratas fueron previamente anestesiadas con sevoflurano al 2% (O2 100%; 200-400 cc / min; Zoetis, Bélgica) y se obtuvieron muestras de sangre de la vena safena en ratones despiertos a 5, 15, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 180, 240, 300, 360, 420, 1320, 1440, 1620, 2760, 2880 y 3060 min después de la inyección. Para la normalización de las muestras se pesaron las muestras de sangre y se midió la radiactividad en un contador automático de rayos gamma Wallac Wizard 1480-011 (Perkin Elmer, Waltham, MA). Las mediciones en recuentos por minuto se calcularon como % d e l D / g medio de tejido.
Ejemplo 7.- Imagen in vivo de tomoqrafía de emisión computerizada de fotón único/tomoqrafía computarizada (SPECTI CT. del inglés, single photon emission computed tomograDhv/comDuterized tomoaraohv)
La evaluación in vivo mediante imagen SPECT / CT de 99mTc-colágeno como agente diagnóstico se llevó a cabo en dos modelos de ratas SD (10 semanas de edad, 230-280 g de peso, n = 17 por modelo animal). En ambos casos el radiotrazador 99mTc-DTPA-Colágeno se administró mediante inyección intravenosa a través de la vena lateral de la cola (250 pL en PBS, 1.08 ± 0.15 mCi) 24 h después de generar los modelos de infección. En todos los casos se llevó a cabo un estudio longitudinal a distintos tiempos
tras la inyección (1h, 4h y 24h) para determinar los tiempos óptimos de captación a) Modelo local de infección-inflamación (n=6): Inicialmente se estudió in vivo el radiotrazador en un modelo local doble de patas traseras para demostrar la capacidad de unión únicamente en focos activos infecciosos. En este modelo, la pata trasera izquierda de la rata fue infectada intramuscularmente con un inoculo de S. aureus vivo (0,4 mi, 108 UFC) y la pata trasera derecha otra con la cepa inactiva de la bacteria (0,4 mi, 108 UFC). Para evaluar el efecto de la extensión del proceso infeccioso en la capacidad diagnóstica del radiotrazador, la dosis bacteriana se inoculó en diferentes momentos antes de la administración del radiotrazador (4 h, 24 h, 48 h) y el Servicio de Microbiología del Hospital Gregorio Marañón (Madrid, España) realizó la confirmación ex vivo de la infección positiva.
b) Modelo de endocarditis infecciosa: Una vez demostrada la capacidad del radiotrazador 99mTc-DTPA-Colágeno de detectar focos activados evitando su unión a focos inflamatorios, se llevó a cabo su evaluación in vivo en un modelo localizado cardiaco de endocarditis infecciosa. Para poder desarrollar un modelo similar a la realidad clínica se aplicó el método Durack para generar endocarditis infecciosa en la válvula aórtica y el ventrículo izquierdo de las ratas, cuyo peso se controló antes de la intervención y después de 24 h de la inoculación de bacterias. Brevemente, se introdujo un catéter de polietileno (PE-50) a través de la arteria carótida común derecha. Luego, se insertó el catéter, se fijó y se mantuvo durante toda la evaluación en el ventrículo izquierdo, y se monitorizó su localización mediante TC (utilizando contraste de yodo), ecografía y resonancia magnética. Después de 24 h de la intervención quirúrgica, la cepa activa de S. aureus se inoculó en las ratas mediante administración intravenosa (0,4 mi, 108 UFC). El Servicio de Microbiología del Hospital Gregorio Marañón (Madrid, España) llevó a cabo la confirmación de la infección mediante la evaluación ex vivo del tejido histológico del catéter (n = 11)ydel corazón (n = 8 )y los riñones (n = 6) **.
En ambos modelos la adquisición de la imagen in vivo se llevó a cabo mediante el uso del escáner SPECT (MiLabs USPECT II, Boston, MA) y CT (PET / CT SuperArgus, SEDECAL, España). Las ratas se colocaron en posición prona y el campo de visión se ajustó al área de interés. Una vez que se administró el radiotrazador, se adquirió una exploración de 2 cuadros de 30 minutos por animal. Se empleó un colimador multipinhole 1.0 en la adquisición de imágenes SPECT y, para este radionúclido, se seleccionó una ventana de energía de 126 a 154 KeV. La reconstrucción OS-EM se realizó con un tamaño de vóxel de 0,75 mm3, 16 subconjuntos y 1 iteraciones, utilizando un software patentado (MiLabs, Boston, MA). Para corregir los eventos dispersos, se
aplicaron dos ventanas del 20% a la izquierda y a la derecha del pico de tecnecio radiactivo, y la reconstrucción se completó bajo un post-filtro de desenfoque gaussiano con un FWHM entre 0,8 y 0,9 mm. Para la adquisición de imágenes anatómicas, los parámetros de CT seleccionados fueron 40 KeV, 340 pA, 360 proyecciones y binning 2 x2 y 0,12 mm3 de imágenes de tamaño de vóxel se reconstruyeron utilizando el software incorporado PET / CT (SEDECAL, España).
Las imágenes SPECT y CT se registraron conjuntamente usando 3 marcadores previamente cargados con agentes de contraste y radiactivos y empleando el software MMWKS comercializado por la compañía Sedecal.
Ejemplo 8.- Estudios de biodistribución ex vivo
Con el objetivo de cuantificar la captación de la sonda en los órganos principales se realizó el estudio ex vivo de la biodistribución en ratas SD sanas (10 semanas de edad, 210-190 g de peso, n = 3). Para ello se administró la molécula de colágeno radiactivo (250 pL en PBS 1X, 350 pCi, n = 3) mediante inyección intravenosa en la vena lateral de la cola y se dejó circular 1 hora. A continuación, se sacrificaron los animales y se extrajeron los órganos de interés; cerebro, tráquea, pulmones, corazón, hígado, bazo, páncreas, estómago, riñones, intestinos, heces, piel, sangre y orina. La actividad de cada tejido se midió en un contador automático de gamma Wallac Wizard 1480-011 (Perkin Elmer, Waltham, MA), y se expresó como% medio d e l D / g de tejido.
Ejemplo 9.- Análisis ex vivo por autorradioqrafía
La confirmación histológica de los resultados obtenidos in vivo mediante imagen PET/CT fue llevada a cabo mediante autorradiografía. Para ello se inoculó el radiotrazador (X pCi en 250 pL de PBS 1X) en ratas SD con modelo de endocarditis infecciosa (10 semanas de edad, 250-300g, n = 3) por vía intravenosa. Así mismo, como pruebas control se llevó a cabo el mismo procedimiento sobre el modelo Sham (n=4) con cirugía ventricular pero sin infección. Tras de 1 h de circulación del radiotrazador (captación), se sacrificaron los animales y se recogieron bazo, riñones y corazón. Estos órganos se recortaron en secciones, se montaron en portaobjetos de plástico y se colocaron en una imagen de fósforo (BAS-MP 2025, Fujifilm) durante 1 hora a temperatura ambiente. La acumulación de radiotrazadores en los tejidos se midió leyendo la placa a una resolución de 200 p con un lector de placas Bio-lmaging Analyzer BAS-500 (Fujifilm, Japón).
Ejemplo 10.-Análisis Post-Mortem microbiológico
a) Cultivo de Muestras
Todas las muestras de tejido fueron obtenidas por exéresis quirúrgica y enviadas al laboratorio de microbiología en un envase estéril seco y se conservaron en nevera de 2-8°C hasta su procesamiento. Una vez atemperadas las muestras se procedió a su procesamiento, introduciendo el tejido en un mortero estéril con 0,5 mi de suero salino. Del machacado de la muestra se obtuvieron 100p, y se extendió cualitativamente con un asa, sobre la placa de agar sangre.
b) Cultivo de Catéteres
Todas las muestras de catéter fueron obtenidas por exéresis quirúrgica y enviadas al laboratorio de microbiología en un envase estéril seco y se conservaron en nevera de 2-8°C hasta su procesamiento. Una vez atemperadas las muestras se procedió a su procesamiento, utilizando el método semicuantitativo de Maki, es cual consiste en rodar el extremo distal del catéter en una placa estéril de agar sangre.
(B) RESULTADOS OBTENIDOS
Síntesis y caracterización fisicoquímica
La optimización en las condiciones de mareaje radiactivo del complejo DTPA-Colágeno mostraron una relación lineal entre las concentraciones de colágeno y los rendimientos de mareaje (Figura 1A). Además, en la evaluación en las condiciones de reducción se observaron menores rendimientos de mareaje a altas (0,2 mM SnCh) y bajas (0.0002 mM SnCh) concentraciones de reductor debido probablemente a un efecto degradativo en presencia de altas concentraciones y a la no reducción total del pertecnectato comercial (99mTc0 4 ) en presencia de bajas concentraciones, lo conlleva la incompleta incorporación del radionúclido en el quelante y por tanto biomolécula. En base a estos resultados, la optimización de las condiciones de síntesis y radiomarcaje determinaron que los parámetros óptimos para obtener los mayores rendimientos radioquímicos fueron 2mg/ml de colágeno y 0,002 mM de SnCh. Empleando dichas condiciones, se obtuvo un rendimiento del 42,86 ± 6,35 % (Fig 1A and C). La pureza radiactiva del compuesto, determinada mediante cromatografía en placa fina, ¡TLC, estableció unos valores del 95,84± 1,85 % (Figura 1.D), confirmando así la pureza ideal para su aplicación in vivo y posible salto traslacional a la práctica clínica. Mediante el coeficiente de partición se determinó experimentalmente un valor de LogP para estos compuestos de -3,69 ± 0,58, confirmando la alta hidrofilia del compuesto. Este dato es determinante
a la hora de administrar el compuesto por vía intravenosa, ya que requiere una alta solubilidad en agua, confirmada en nuestra sonda.
La evaluación de la estabilidad del compuesto en condiciones similares al entorno fisiológico (37°C, pH:7, PBS) confirmaron una estabilidad superior al 90% incluso tras 50h de incubación (Figura 1E). Resultados similares fueron obtenidos en la evaluación del radiotrazador en suero mediante ¡TLC. A 30 min observamos una estabilidad del 92,83 ± 1,48% (n=3), manteniéndose constante hasta los 120 min (92,23 ± 3,45%). Estos resultados apoyan su empleo in vivo al confirmarse la alta estabilidad en condiciones fisiológicas, que evitará la liberación del isótopo libre que pudiera dar lugar a falsos diagnósticos.
Estudio in vitro
Como primera etapa en el estudio in vitro de la sonda se evaluó su capacidad de unión a las bacterias diana (en este caso S. aureus) frente al radioisótopo libre para demostrar la selectividad de la misma hacia las proteínas de unión a colágeno presentes en la pared bacteriana debido a la biomolécula vehículo (Colágeno). Con el objetivo de poder determinar también la cinética de dicha unión, se repitió el estudio a diversos puntos temporales; 15min, 30min, 90 min, 2h y 3h (Fig.lA ). Se observó una relación lineal entre la concentración de bacterias y el porcentaje de unión del trazador, confirmándose así la especificidad de la sonda. Además, en todos los casos la diferencia entre el radiotrazador específico y el isótopo libre fue de al menos 7 veces, llegando a diferencias de incluso a 26 veces superior en el caso de los estudios a 2h min y 108 CFU (Fig 2.C), confirmando la selectividad debido al vector colágeno.
Una vez demostrada la selectividad de la sonda hacia la bacteria S. aureus se llevó a cabo un estudio más amplio en el que se evaluó la selectividad y especificidad de la sonda hacia Gram positivas. Las pruebas realizadas en el panel microbiológico demostraron la selectividad de la sonda hacia Gram positivas frente a otras bacterias Gram negativas (E. coli) u hongos (C. albicans). Dentro de las bacterias Gram positivas la sonda mostró una mayor afinidad por las cepas estafilocócicas (tanto S. aureus como S. epidermidis). Este estudio permitió al mismo tiempo determinar la sensibilidad de la sonda, estableciendo la concentración mínima de bacteria a la que la sonda es capaz de unirse (límite de detección). La alta sensibilidad de nuestro radiotrazador se demostró al ser capaz de detectar concentraciones estafilocócicas por debajo de las 10CFU (Figura 2D).
Como última etapa en el estudio in vitro de la sonda, se evaluó su capacidad de detección frente al radiotrazador estándar empleado en la clínica; el trazador comercial
18F-FDG. Dicho estudio demostró la mayor capacidad de nuestra sonda a unirse a los cultivos estafilocócicos, siendo su sensibilidad 3,5 veces superior a la del trazador comercial (Figura 2B).
Evaluación in vivo del trazador 99mTc-Colágeno
a) Estudio farmacocinético: Dentro de la evaluación farmacocinética del trazador se determinó tanto el tiempo de vida media en sangre del mismo como su biodistribución para determinar sus futuras aplicaciones en diagnóstico infeccioso. Dichos estudios determinaron un tiempo de vida en sangre medio inferior a 20 min (19 ± 2min), lo que apunta a un rápido metabolismo y sugiere el uso de tiempos de captación cortos en el diagnóstico mediante imagen médica. El análisis cuantitativo de la biodistribución de nuestra sonda (1h post inyección) determinó una acumulación principal en hígado (6,11 ± 2,80 %ID/g), bazo (2,06 ± 0,15 %ID/g), confirmando un metabolismo hepatobiliar típico de este tipo de proteínas con gran peso molecular (300KDa). La alta captación presente también en riñones (0,94 ± 0,45 %ID/g) confirma una rápida excreción renal, apoyando los cortos tiempos de circulación en sangre.
Tabla 1. Valores de % Dosis inyectada / gramo de tejido para la biodistribución ex vivo
b) Evaluación in vivo en modelo de infección en pata: Como evaluación inicial de la capacidad de nuestra sonda para detectar mediante imagen focos infecciosos, el trazador 99mTc-Colágeno se analizó en un modelo de infección-inflamación local con
infección intramuscular. En dicho modelo el trazador demostró mediante imagen SPECT-CT, su habilidad para unirse mayoritariamente en las regiones donde se encontraba la cepa activa (viva), con escasa o nula unión a los tejidos inoculados con cepa inactivada (muerta por calor). De esta manera el trazador de la presente invención puso de manifiesto su capacidad de detectar focos infecciosos activos frente a inactivos. Los resultados observados mediante imagen in vivo fueron confirmados mediante medidas ex vivo de biodistibución y autoradiografía (Figura 3B).
c) Evaluación in vivo en modelo de endocarditis infecciosa (El): Una vez confirmada la efectividad del trazador en un modelo local sencillo (intramuscular) se evaluó la capacidad de detección de la sonda en modelo más complejo de endocarditis infecciosa similar a la patología clínica. Al igual que ocurrió en pruebas anteriores tras la administración intravenosa del compuesto radiactivo, nuestro trazador fue capaz de unirse de manera específica en el foco de la infección localizado en la válvula cardiaca. Para confirmar la habilidad del trazador para discernir entre procesos infecciosos e inflamatorios y evitar así falsos positivos, se llevó a cabo la imagen en modelo control sham, el cual presentaba cirugía, pero no infección. En este caso, no se observó captación del trazador en la zona dañada, demostrando así su selectividad únicamente hacia focos infecciosos. Estas observaciones fueron confirmadas ex vivo mediante autorradiografía (Figura 4B) donde se puede observar claramente la elevada captación cardiaca en el modelo de El pero no en el control. La validación histológica (Fig. 4D) confirmó el daño y colonización bacteriana. La confirmación microbiológica del modelo fue llevada a cabo mediante estudios de sembrado bacteriano, confirmando la presencia del microorganismo S. aureus en los corazones y catéteres infectados pero no en los controles.
Claims (15)
1. - Compuesto que comprende una proteína unida covalentemente a un agente quelante y un radioisótopo coordinado al agente quelante, donde la proteína es seleccionada de la lista que comprende: colágeno, fibronectina y fibrinógeno.
2. - Compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 donde la proteína es colágeno.
3. - Compuesto de acuerdo con la reivindicación 2 donde el colágeno es colágeno de tipo I o tipo IV.
4. - Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 3 donde el agente quelante es seleccionado de la lista que comprende:
- ácido Pentético,
- ácido 1,4,7,10-Tetraazaciclododecane-1,4,7,10-tetraacetico (DOTA) y sus derivados: DOTA-NHS ester, maleimida-DOTA y NH2-DOTA-GA,
- ácido 1,4,7-Triazaciclononano-1,4,7-triacetico (NOTA) y sus derivados: NOTA-NHS ester, NODAGA-NHS ester, maleimida-NOTA y NH2-NODA-GA,
- deferoxamina (DFO) y su derivado p-SCN-Bn-Deferoxamina y
- ácido Dietilentriamina-N,N,N”,N”-tetra-tert-butil acetato-N’-acetico.
5. - Compuesto según reivindicación 4 donde el agente quelante es el ácido pentético.
6. - Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 5 donde el radioisótopo es seleccionado de la lista que comprende: 99mTc, 68Ga, 18F, 89Zr, 64Cu o 111ln.
7. - Compuesto de acuerdo con la reivindicación 6 donde el radioisótopo es99mTc.
8. Procedimiento para la preparación del compuesto definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 que comprende una primera etapa de formación de enlace covalente entre la proteína conel quelante, formándose así un conjugado proteínaquelante, y una segunda etapa basada en el mareaje radioactivo del conjugado proteínaquelante con el radioisótopo correspondiente.
9. - Composición que comprende el compuesto descrito en cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1a7.
10. - Composición según reivindicación 9 caracterizada por estar configurada para poder administrarse de forma intravenosa, intraperitoneal u oral
11. - Uso del compuesto descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o de la composición descrita en la reivindicación 9 o 10, como agente de imagen para la visualización de infecciones o focos infecciosos provocados por bacterias Gram positivas en un sujeto.
12. - Uso según reivindicación 11 donde las bacterias Gram positivas son seleccionadas de la lista que comprende: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, Mycobacterium tuberculosis, Enterococcus faecalis, Staphylococcus agalactiae y Clostridioides difficile,
13. - Uso según reivindicación 12 donde la infección provocada por las bacterias Gram positivas es endocarditis infecciosa.
14. - Uso según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 donde la visualización de infecciones o focos infecciosos se realiza por la técnica PET o SPECT.
15. - Método para proporcionar una imagen de focos infecciosos causados por bacterias Gram positivas in vivo en un sujeto, que comprende (i) administrar al sujeto el compuesto definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y (ii) escanear al sujeto utilizando imágenes PET o SPECT combinadas con técnica estructural como tomografía anatómica computarizada para obtener una imagen visible.
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| GIRAUDO CHIARA ET AL. ¿Molecular imaging of pulmonary inflammation and infection¿. International journal of molecular sciences, 30/01/2020, Vol. 21, Páginas 894 todo el documento. * |
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