ES2893100T3

ES2893100T3 - Detección in situ de variantes de nucleótidos en muestras con un elevado nivel de ruido, y composiciones y métodos relacionados con ésta

Info

Publication number: ES2893100T3
Application number: ES16856049T
Authority: ES
Inventors: Yuling Luo; Xingyong Wu; Liuliu Pan; Xiaoming Wang; Xiao-Jun Ma; Nan Su; Steve Chen
Original assignee: Advanced Cell Diagnostics Inc
Current assignee: Advanced Cell Diagnostics Inc
Priority date: 2015-10-12
Filing date: 2016-10-11
Publication date: 2022-02-08
Anticipated expiration: 2036-10-11
Also published as: US20210395806A1; DK3362462T3; WO2017066211A1; US11078528B2; CN108368543A; EP3913068B1; EP3913068A1; US20170101672A1; EP3362462A4; US20250230491A1; EP3362462A1; US20240392355A1; EP3362462B1; CN108368543B

Abstract

Un método de detección in situ de una variación de nucleótido de un ácido nucleico diana en una muestra de células fijadas y permeabilizadas, que comprende: (A) poner en contacto la muestra con una sonda de variación de nucleótido (SP) y una sonda vecina (NP), en el que la SP comprende un segmento de anclaje a diana (SPAT) que puede hibridarse específicamente con una región del ácido nucleico diana que comprende la variación de nucleótido y un segmento de anclaje a preamplificador (SPAP), y en el que la NP comprende un segmento de anclaje a diana (NPAT) que puede hibridarse con una región del ácido nucleico diana adyacente al sitio de unión de la SP y un segmento de anclaje a preamplificador (NPAP); (B) poner en contacto la muestra con un preamplificador de SP (SPM) y un preamplificador de NP (NPM), en el que el SPM comprende un segmento que puede unirse a la SP y comprende dos o más anclajes de colaboración a SP (SPCA), y en el que el NPM comprende un segmento que puede unirse a la NP y comprende dos o más anclajes de colaboración a NP (NPCA); (C) poner en contacto la muestra con un amplificador de colaboración (COM), en el que el COM comprende un primer segmento complementario con el SPCA, un segundo segmento complementario con el NPCA, y un tercer segmento que comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a amplificador de marcador; (D) poner en contacto la muestra con un sistema de sonda marcadora (LPS), en el que el LPS comprende una pluralidad de amplificadores de marcador (LM) y una pluralidad de sondas marcadoras (LP), en el que cada LM comprende un segmento que puede unirse a un segmento de anclaje a amplificador de marcador del COM y una pluralidad de segmentos de anclaje a sonda marcadora, en el que cada LP comprende un marcador detectable y un segmento que se hibrida con el segmento de anclaje a sonda marcadora del LM, en el que las hibridaciones mencionadas forman un complejo generador de señal (SGC) que comprende un ácido nucleico diana con la variación de nucleótido, una SP, una NP, un SPM, un NPM, una pluralidad de COM, una pluralidad de LM, y una pluralidad de LP; y (E) detectar in situ una señal procedente del SGC en la muestra.

Description

DESCRIPCIÓN

Detección in situ de variantes de nucleótidos en muestras con un elevado nivel de ruido, y composiciones y métodos relacionados con ésta

La presente invención se refiere, en general, a la detección de ácidos nucleicos y, más específicamente, a la detección in situ de variantes de ácidos nucleicos.

Antecedentes de la invención

Estudios recientes han revelado una significativa heterogeneidad en las células tumorales, que previamente se habían considerado clones entre sí (Gerlinger et al., N. Engl. J. Med., 366:883-892, 2012), lo cual significa que las células individuales de cáncer en un sitio de tumor o en una biopsia de tumor no son homogéneas. En particular, las células de cáncer vecinas a menudo presentan variaciones de un solo nucleótido ("single nucleotide variations", SNV) en el ADN o el ARN. Por tanto, la medicina de precisión demanda la detección in situ de SNV en biopsias de tejidos, en la que la estructura y el contenido celular debe conservase sustancialmente a través del ensayo. Las complejas estructuras fisioquímicas en células y la enorme cantidad de ácidos nucleicos que no son diana y otras moléculas presentan un entorno con un "alto nivel de ruido", que puede producir un elevado efecto de fondo y que requiere una combinación de alta especificidad y alta sensibilidad que aún no se ha logrado mediante las técnicas de detección de ácidos nucleicos in situ existentes.

La detección de SNV requiere un único conjunto de sondas de diana ("target probes", TP) para capturar un único complejo generador de señal ("signal-generating complex", SGC). Sin embargo, en el diseño de la sonda de "doble Z" previamente descrita divulgada en las patentes de EE. UU. n.os 7.709.198 y 8.658.361, múltiples conjuntos de TP se hibridan con la diana para proporcionar un número suficiente de SGC para generar una señal detectable.

El documento US 2013/023433 describe métodos de detección basados en la hibridación que emplean SGC.

Por tanto, son necesarios métodos para detectar variaciones de un solo nucleótido u otras variaciones de ácido nucleico al nivel de una célula individual in situ, La presente invención satisface esta necesidad y también proporciona ventajas relacionadas.

Sumario de la invención

La invención se refiere a métodos para la detección in situ de una variación de ácido nucleico de un ácido nucleico diana en una muestra, que incluye variaciones de un solo nucleótido o variantes de corte y empalme, y similares. El método puede comprender las etapas de poner en contacto la muestra con una sonda que detecta la variación de ácido nucleico y una sonda vecina; poner en contacto la muestra con preamplificadores que se unen a la sonda de variación de ácido nucleico y la sonda vecina, respectivamente; poner en contacto la muestra con un amplificador de colaboración que se une a los preamplificadores; y poner en contacto la muestra con un sistema de sonda marcadora, en el que la hibridación de los componentes forma un complejo generador de señal (SGC) que comprende un ácido nucleico diana con la variación de ácido nucleico, las sondas y los amplificadores; y detectar in situ la señal procedente del SGC en la muestra. La invención también proporciona muestras, portaobjetos para tejidos y kits relacionados con la detección de variaciones de ácido nucleico de un ácido nucleido diana.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra un ejemplo de configuración de un complejo generador de señal (SGC) para la detección in situ de una variación de un solo nucleótido (SNV) en un ácido nucleico diana. El SGC comprende una sonda de variación de un solo nucleótido ("single nucleotide variation probe") - SP; una sonda vecina ("neighbor probe") - NP; un preamplificador de SP ("SP pre-amplifier") - SPM, que contiene múltiples anclajes de colaboración a SP ("SP collaboration anchors") - SPCA; un preamplificador de NP ("NP pre-amplifier") - NPM, que contiene múltiples anclajes de colaboración a NP ("NP collaboration anchors") - NPCA; un amplificador de colaboración ("collaboration amplifier") - COM; un sistema de sonda marcadora ("label probe system") - LPS, que puede comprender una pluralidad de amplificadores de marcador ("label amplifiers") - LM y cada uno de los cuales, a su vez, puede unirse a una pluralidad de sondas marcadoras ("label probes") - LP.

Las figuras 2A y 2B ejemplifican detalles y orientaciones de SP y NP. Las figuras 2A y 2B muestran en detalle la configuración, la posición y la orientación de SP y NP. La figura 2A muestra que la SP comprende un segmento de anclaje a diana ("target anchor segment", SPAT) complementario con la secuencia diana que contiene la SNV, un segmento de anclaje a preamplificador ("pre-amplifier anchor segment", SPAP) complementario con un segmento en el preamplificador de SP (SPM); una NP que comprende un segmento de anclaje a diana ("target anchor segment", NPAT) complementario con la secuencia diana adyacente al segmento en la diana que contiene la SNV, un segmento de anclaje a preamplificador ("pre-amplifier anchor segment", NPAP) complementario con un segmento en el preamplificador de NP (NPM); y un espaciador opcional entre el SpAt y el SPAP, o entre el NPAT y el NPAP. La figura 2B ilustra ejemplos de diferentes orientaciones de SP y NP con respecto a la diana y el complejo generador de señal (SGC) completo.

Las figuras 3A-3C muestran diferentes orientaciones o posiciones de SPM y NPM. Las figuras 3A y 3B muestran dos ejemplos de diferentes orientaciones o posiciones de SPM y NPM con respecto al SPAP y al NPAP. La configuración mostrada en la figura 3C es la misma que la que se muestra en la figura 3B, en la que, en la figura 3C, refleja la flexibilidad de las moléculas de ácido nucleico y la capacidad de configuración en la figura 3B para proporcionar NPCA y SPCA cercanos entre sí para unirse a un COM.

Las figuras 4A, 4B y 4C muestran diferentes orientaciones de sitios de unión a COM en hibridación colaborativa. Las figuras 4A, 4B y 4C muestran ejemplos de configuraciones, en las que un amplificador de colaboración (COM) se hibrida simultáneamente con un anclaje de colaboración a SP (SPCA) en el SPM y un anclaje de colaboración a NP (NPCA) en el NPM. Las figuras 4A y 4B muestran los dos correspondientes segmentos en COM hibridados con SPCA y NPCA en la misma orientación. La configuración mostrada en la figura 4B puede considerarse como un caso especial del que aparece en la figura 4A. En la figura 4B, el SPCA y el NPCA están colocados con un desplazamiento. Como resultado, el espaciador entre los dos correspondientes segmentos en COM puede acortarse o incluso retirarse, lo cual puede potenciar el efecto de hibridación colaborativa. La figura 4C muestra los dos correspondientes segmentos en COM hibridados con SPCA y NPCA en la orientación inversa.

Las figuras 5A y 5B muestran un ejemplo de configuración en la que dos complejos generadores de señal (SGC) son capturados con una variación de un solo nucleótido (SNV). La figura 5A muestra ambos SGC formados y la unión a un ácido nucleico diana. La figura 5B muestra la unión de un SGC, mientras que el segundo SGC no se une. La falta de unión del segundo SGC puede ser debida a un problema con el acceso de la sonda o la degradación del ácido nucleico diana. En la configuración mostrada, se sigue generando una señal detectable con un SGC unido al ácido nucleico diana.

Las figuras 6A y 6B muestran ejemplos de realizaciones en las que el número de etapas del ensayo se reduce. Las etapas del ensayo pueden reducirse preensamblando componentes del SGC. La figura 6A muestra una realización en la que el SPM y el COM están integrados, y el NPM y el COM están integrados. En la realización mostrada, el SPM está integrado con un COM, y el NPM está integrado con un COM usando una molécula "ramificada". La figura 6B muestra una realización en la que la SP está integrada con el SPM, la NP está integrada con el NPM, y el COM está integrado con el LM.

Las figuras 7A y 7B muestran ejemplos de realizaciones en las que la hibridación colaborativa se mueve a capas diferentes dentro del SGC. La figura 7A muestra un SGC formado con hibridación colaborativa entre el COM y el LM. La figura 7B muestra un SGC formado con hibridación colaborativa entre el LM y la LP.

Las figuras 8A y 8B muestran un ejemplo de realización que incorpora más de una etapa de hibridación colaborativa en el ensamblaje del SGC durante el ensayo. La figura 8A muestra una primera hibridación colaborativa entre el SPM o NPM y la SP y TP, respectivamente. Se muestra una segunda hibridación colaborativa entre el SPM, NPM y COM. La figura 8B muestra una primera hibridación colaborativa entre SP, NP y el ácido nucleico diana, y una segunda hibridación colaborativa entre SPM, NPM y COM.

Las figuras 9A-9C muestran ejemplos de realizaciones para detectar una zona de unión de corte y empalme específica en una secuencia de ácido nucleico diana. La figura 9A muestra un ejemplo de realización, en la que el SPAT se hibrida a lo largo de la zona de unión de corte y empalme, es decir, se hibrida con ambos segmentos de ácido nucleico juntados en la zona de unión de corte y empalme, y el NPAT se hibrida con uno de los segmentos de ácido nucleico. La figura 9B muestra un ejemplo de realización, en la que el SPAT se hibrida con uno de los segmentos de ácido nucleico juntados en la zona de unión de corte y empalme, y el NPAT se hibrida con el otro segmento de ácido nucleico en la zona de unión de corte y empalme. La figura 9C muestra una configuración similar a la mostrada en la figura 9B con respecto a la hibridación de SPAT y NPAT con los respectivos segmentos de ácido nucleico juntados en la zona de unión de corte y empalme, en la que también se produce una hibridación entre secciones complementarias del NPAT y SPAT.

Las figuras 10A-10C muestran ejemplos de realizaciones que utilizan métodos de detección de zona de unión de corte y empalme para detectar moléculas de ARN evitando, al mismo tiempo, la detección del correspondiente ADN. La figura 10A muestra un ejemplo de realización de la detección específica de ARN usando una sonda de diana de puente de zona de unión de exón. La figura 10B muestra un ejemplo de realización de la detección específica de ARN usando un conjunto de sondas de diana (sonda de variación de ácido nucleico y sonda vecina) que se hibridan colaborativamente entre sí. La figura 10C muestra ejemplos de realizaciones de la detección específica de ARN usando un conjunto de sondas de diana (sonda de variación de ácido nucleico y sonda vecina).

Las figuras 11A, 11B y 11C muestran ejemplos de realizaciones de la detección de una secuencia corta.

Las figuras 12A y 12B muestran ejemplos de realizaciones de la detección de múltiples dianas. La figura 12A muestra una estrategia de "agrupamiento", en la que cada diana tiene un SPAT y un NPAT exclusivo en la pareja de SP-NP, pero los otros elementos son los mismos en el resto del SGC. Se detecta una señal común cuando está presente uno cualquiera de los ácidos nucleicos diana. La figura 12B muestra una estrategia "de multiplexación", en la que cada ácido nucleico diana tiene un SGC exclusivo, que proporciona señales exclusivamente identificables para cada ácido nucleico diana.

La figura 13 muestra la detección de BRAF V660E en secciones de sedimentos fijados en formaldehído y sumergidos en parafina ("formalin fixed and paraffin embedded", FFPE) de líneas celulares de melanoma. Se ensayaron las líneas celulares de melanoma negativa (CHL-1, a y a') y positiva (SK-MEL-28, b y b') para la mutación puntual V600E de BRAF. Las células se hibridaron con un sistema de sondas de diana ("target probe system", TPS) que contenía la sonda de detección de tipo salvaje ("wild type detection probe", WDP) (a y b) y un TPS que contenía una sonda de detección de la mutación BRAF V600E (MDP) (a' y b') por separado.

Las figuras 14A y 14B muestran el efecto de SPAT de diversa longitud. La figura 14A muestra un elevado número de falsos positivos con el uso de un SPAT largo. La figura 14B demuestra que el ensayo tiene baja sensibilidad si el SPAT es demasiado corto.

Las figuras 15A y 15B muestran el efecto de incluir bases modificadas en un SPAT. La figura 15A muestra los resultados de la tinción con bases normales en el SPAT. La figura 15B muestra unos resultados mejorados con las bases modificadas usadas en el SPAT.

La figura 16 muestra la detección de BRAF V600E en tejidos de cáncer de colon FFPE que se ha descubierto que son negativos (a y a') y positivos (b y b') para la mutación puntual V600E. Aunque se observaron señales en ambas muestras con una sonda dirigida a ARNm de BRAF de tipo salvaje (a y b), se detectó ARNm de la mutación V600E solo en la muestra positiva para la mutación con una sonda diseñada específicamente para la mutación V600E (b'). Las figuras 17A y 17B muestran la detección de una diana de ARN de muy baja abundancia y/o degradada. La figura 17A muestra el bajo nivel de tinción del ARN diana de HGF, que se ha descubierto que es muy poco abundante y está parcialmente degradado en la muestra usando métodos de detección de ARN tal como se ha descrito en las patentes de EE. UU. n.os 7.709.198 y 8.658.361. La figura 17B muestra una mejor tinción de la misma diana usando una configuración similar a la que se muestra en la figura 11 A.

La figura 18 muestra la sensibilidad potenciada de un ejemplo de un método de la invención para detectar secuencias muy cortas, en comparación con los métodos descritos en las patentes de EE. UU. n.os 7.709.198 y 8.658.361. En la figura 18A, se usó el sistema de detección de las patentes de EE. UU. n.os 7.709.198 y 8.658.361 con una única pareja de sondas de diana para detectar una secuencia de 50 nt en el ARNm de POLR2A en un sedimento de células Hela. En la figura 18B, se usó un único SGC con una configuración similar a la mostrada en la figura 11A para detectar la misma diana en el mismo tipo de muestra.

La figura 19 demuestra la detección in situ de zonas de unión de corte y empalme específicas, que puede usarse para identificar un variante de corte y empalme específico. Se ha descubierto que la línea celular H596 es positiva para META14, es decir, el exón 14 en el gen MET "se ha saltado", lo que provoca el corte y empalme del exón 15 con el exón 13 en el ARN de MET. La línea celular A549 es el tipo salvaje que contiene todos los exones 12-15 en el ARN de MET. Se usaron sondas dirigidas a las zonas de unión de corte y empalme E12/13, E13/14 y E14/15 para detectar la presencia de las correspondientes zonas de unión en sedimentos celulares FFPE (fijados en formaldehído y sumergidos en parafina) de células H596 y A549. Las imágenes de la tinción se muestran en la figura 19, que muestra la detección sensible y específica de las zonas de unión de corte y empalme diana de E13/15 en células H596 y E14/15 en células A549, demostrando que el variante de corte y empalme META14 se había identificado correctamente.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a métodos que proporcionan una detección de alta sensibilidad de variantes de ácido nucleico en una célula. Los métodos son útiles para detectar variaciones de ácido nucleico que pueden tener implicaciones clínicas para el estado de una enfermedad, la progresión de una enfermedad, la respuesta al tratamiento de una enfermedad y similares. Por ejemplo, los cánceres, incluyendo los tumores, no son homogéneos, sino que pueden contener diversos tipos de células y/o células del mismo tipo pero que tienen diferentes niveles de expresión de proteínas y ácidos nucleicos entre ellas. En algunos casos, existen variaciones de ácido nucleico entre las células. Estas variaciones de ácido nucleico pueden incluir, pero no se limitan a variaciones de un solo nucleótido, inserciones y/o deleciones (indels), variaciones de corte y empalme, redisposiciones de genes y similares. Los métodos y las composiciones de la invención, tal como se describen en la presente, pueden usarse para detectar variantes de ácido nucleico al nivel de una célula individual. Por tanto, los métodos proporcionan un sistema de ensayo muy sensible y específico para detectar variaciones de ácido nucleico en especímenes clínicos, proporcionando una información visual más detallada y clínicamente pertinente sobre la expresión de variaciones de ácido nucleico al nivel de una célula individual.

Tal como se describe a continuación con más detalle, se diseña una sonda para detectar variantes de ácido nucleico, tales como variaciones de un solo nucleótido, inserciones y/o deleciones, sitios de corte y empalme, redisposiciones de genes y similares, y dicha sonda se denomina en la presente una SP. En realizaciones de la invención, la SP puede ser una sonda de variante de un solo nucleótido (SNV), que puede detectar una variación de un solo nucleótido en un ácido nucleico diana o, más en general, una sonda que puede detectar un variante de ácido nucleico específico que implica a más de un nucleótido, es decir, un variante de múltiples nucleótidos. Estos variantes de múltiples nucleótidos incluirían una microinserción, una microdeleción o una modificación de más de un nucleótido usando métodos, tales como CRISPER. En particular, una zona de unión o sitio de corte y empalme en un ácido nucleico diana puede considerarse como un tipo especial de variante de múltiples nucleótidos, porque esta zona de unión está relacionada específicamente con los nucleótidos a cada lado de la zona de unión. Se entiende que la descripción de una SP en la presente o la representación en una figura de una SP en la presente puede aplicarse a cualquier tipo de SP, estando diseñada la SP para detectar la SNV o los variantes de múltiples nucleótidos, tales como un sitio de corte y empalme. Por tanto, una descripción en la presente o una configuración en una figura que represente la detección de una SNV usando una SP puede aplicarse, de modo similar, a la detección de variantes de múltiples nucleótidos, que incluyen un sitio de corte y empalme, u otro variante, estando diseñada la SP para detectar un variante de múltiples nucleótidos en lugar de una SNV, siendo el resto de la configuración representada aplicable a la detección de un variante de múltiples nucleótidos en un ácido nucleico diana. De modo similar, una descripción en la presente o una representación en una figura de un sitio de corte y empalme puede aplicarse a la detección de una SNV o de un variante de múltiples nucleótidos, estando la diferencia en que la SP está diseñada para detectar una SNV o un variante de múltiples nucleótidos, tal como un sitio de corte y empalme en un ácido nucleico diana. Por tanto, se entiende que la descripción en la presente de una SP se aplica a la detección de variantes de nucleótido en un ácido nucleico diana, dependiendo de la naturaleza del ácido nucleico diana.

La presente invención proporciona una detección in situ muy sensible y específica de variaciones de ácido nucleico en un entorno con un elevado nivel de ruido, por ejemplo, biopsias de tumores. En una realización, la variación de ácido nucleico es una variación de un solo nucleótido (SNV). En la figura 1 se muestra un ejemplo de realización de la invención y esta se describe a continuación con más detalle.

(1) Sonda de SNV (SP). Tal como se muestra en la figura 1, y en detalle en la figura 2A, una sonda (SP) de variación de un solo nucleótido (SNV) comprende dos regiones no solapantes, un segmento de anclaje a diana (SPAT) y un segmento de anclaje a preamplificador (SPAP), opcionalmente separados por un espaciador o una secuencia conectora. Un SPAT es complementario con una secuencia de ácido nucleico diana que incluye el sitio de SNV y tiene suficiente poder discriminante para distinguir un cambio de una sola base en la secuencia de SNV. Su longitud y otros parámetros se diseñan para hibridarse con la SNV diana, pero no con la secuencia de tipo salvaje o con secuencias de SNV que no son la diana. Un SPAT tiene una longitud, en general, de aproximadamente 10 a 20 nucleótidos, mientras que un SPAP tiene una longitud, en general, de aproximadamente 14 a 28 nucleótidos. El diseño de la sonda SP puede ampliarse con facilidad para detectar inserciones y deleciones (indels) de 1-10.000 bases.

(2) Sonda vecina (NP). También mostrada en la figura 1, y en detalle en la figura 2A, una sonda vecina (NP) comprende dos regiones no solapantes, un segmento de anclaje a diana (NPAT) y un segmento de anclaje a preamplificador (NPAP), opcionalmente separados por un espaciador o una secuencia conectora. Un NPAT es complementario con una región del ácido nucleico diana que está adyacente a la SNV, y tiene una longitud, en general, de aproximadamente 12 a 40 nucleótidos. Un NPAP tiene una longitud, en general, de aproximadamente 14 a 28 nucleótidos.

La NP puede estar a la izquierda o a la derecha (5' o 3') de la SP unida a la SNV diana. En otra realización, la NP y la SP pueden asumir diferentes orientaciones 5' y 3' con relación entre sí y con relación al complejo generador de señal (SGC), como se ilustra en la figura 2. Por ejemplo, como se muestra en la figura 2B, la NP puede tener el NPAT en el extremo 3' y la SP puede tener el SPAT en el extremo 3' (figura 2B, arriba a la izquierda), la NP puede tener el NPAT en el extremo 5' y la SP puede tener el SPAT en el extremo 5' (figura 2B, arriba a la derecha), la NP puede tener el NPAT en el extremo 3' y la SP puede tener el SPAT en el extremo 5' (figura 2B, abajo a la izquierda), o la NP puede tener el NPAT en el extremo 5' y la SP puede tener el SPAT en el extremo 3' (figura 2B, abajo a la derecha). Es posible potenciar aún más la especificidad o la sensibilidad de la detección de la mutación incorporando múltiples NP en la región adyacente a la SNV. En una realización, pueden usarse dos NP situadas a la izquierda y a la derecha (5' o 3', es decir, flanqueantes) de la SP unida a la SNV diana para capturar uno o múltiples SGC y generar una señal detectable (véase la figura 5A, que muestra dos NP que flanquean a la SP).

La NP puede unirse de modo estable a sus regiones complementarias del ácido nucleico diana bajo las condiciones de hibridación empleadas. Por otra parte, el SPAT de la SP en general es corto (10-20 nucleótidos) para potenciar su poder para discriminar una SNV frente a otra secuencia que no es SNV. En una realización, el SPAT es más corto que el NPAT, o la temperatura de fusión del SPAT es menor que la del NPAT. Una SP corta todavía puede hibridarse con el ácido nucleico diana que contiene la SNV en presencia de la NP debido al efecto de hibridación colaborativa, es decir, la temperatura de fusión del ácido nucleico diana que se hibrida simultáneamente con SP y NP es mayor que la temperatura de fusión del ácido nucleico diana que se hibrida solo con SP o con NP. El efecto de hibridación colaborativa puede ser potenciado por las configuraciones de conjuntos de sondas de diana mostradas en las figuras 5 y 8, en las que, en la figura 5A, la SP está flanqueada por dos NP en ambos lados. En la figura 8B, ambas SP y NP contienen un tercer segmento no solapante, que son complementarios entre sí. En estos casos, la temperatura de fusión del ácido nucleico diana que se hibrida simultáneamente con SP y NP es sustancialmente mayor que la temperatura de fusión del ácido nucleico diana que se hibrida solo con SP o con NP. Se genera una señal detectable cuando la SP y la NP se hibridan con regiones adyacentes de un único ácido nucleico diana, mientras que solo aparece una señal débil o indetectable cuando la SP y la NP no se hibridan con regiones adyacentes de un único ácido nucleico diana.

(3) Preamplificador para SP (SPM). Tal como se muestra en la figura 1, y en detalle en la figura 3, un preamplificador para SP (SPM) comprende un ácido nucleico monocatenario con una longitud de entre aproximadamente 50 y 500 nucleótidos. El SPM comprende una pluralidad de secuencias repetidas con una longitud de entre 10 y 20 nucleótidos denominadas anclaje de colaboración a SP (SPCA). El SPM se une a la SP mediante hibridación. El SPM comprende un segmento complementario con el segmento de anclaje a preamplificador de SP (SPAP), que se diseña para unirse a SPAP en diferentes posiciones u orientaciones, como se muestra en la figura 3. En una realización preferida, el SPCA se repite entre 2 y 20 veces en el SPM.

(4) Preamplificador para NP (NPM). Tal como se muestra en la figura 1, y en detalle en la figura 3, un preamplificador para NP (NPM) comprende un ácido nucleico monocatenario con una longitud de entre aproximadamente 50 y 500 nucleótidos. El NPM comprende una pluralidad de secuencias repetidas con una longitud de entre 10 y 20 nucleótidos denominadas anclaje de colaboración a NP (NPCA). El NPM se une a la NP mediante hibridación. El NPM comprende un segmento complementario con el segmento de anclaje a preamplificador de NP (NPAP), que se diseña para unirse a NPAP en diferentes posiciones u orientaciones, como se muestra en la figura 3. En una realización preferida, el NPCA se repite entre 2 y 20 veces en el NPM.

(5) Amplificador de colaboración (COM). Un amplificador de colaboración (COM) comprende un ácido nucleico monocatenario con una longitud de entre aproximadamente 60 y 900 nucleótidos. Tal como se muestra en la figura 1, y con más detalle en la figura 4, el COM comprende tres segmentos no solapantes, un segmento complementario con el anclaje de colaboración a SP (SPCA) del preamplificador de SP (SPM), un segmento complementario con el anclaje de colaboración a NP (NPCA) del preamplificador de NP (NPM), y un segmento que contiene secciones repetidas, cada uno de las cuales puede hibridarse con un sistema de sonda marcadora (LPS) que emite una señal para la detección. El SPCA y el NPCA se hibridan con el COM en colaboración, es decir, la temperatura de fusión del COM que se hibrida simultáneamente con SPCA y NPCA es significativamente mayor que la temperatura de fusión del COM que se hibrida solo con SPCA o con NPCA. Es decir, la condición de hibridación empleada en el ensayo se ajusta para que un COM no pueda unirse de forma estable solo con SPCA o con NPCA. Puesto que SPM y NPM se unen de forma estable a SP y NP, respectivamente, los COM pueden unirse de forma estable con la secuencia diana cuando y solo cuando ambas SP y NP están hibridadas con el ácido nucleico diana y están adyacentes entre sí. Puesto que es extremadamente raro que dicha configuración y colocación exclusivas se produzcan de un modo no específico, esta hibridación de colaboración reduce significativamente la señal de falso positivo provocada por una unión no específica de NPM o SPM en un entorno con un elevado nivel de ruido. Los dos segmentos complementarios con SPCA y NPCA pueden hibridarse con estos en diferentes orientaciones, tal como se muestra en la figura 4. El segmento del COM que se hibrida con el LPS comprende en general una pluralidad de secuencias repetidas con una longitud de entre aproximadamente 15 y 30 nucleótidos, denominadas segmentos de anclaje a amplificador de marcador, que son capaces de hibridarse con el LPS. Además, los segmentos de anclaje a amplificador de marcador pueden estar colocados en cualquiera de los lados o a ambos lados de los segmentos complementarios con SPCA y NPCA.

(6) Sistema de sonda marcadora (LPS). Tal como se muestra en la figura 1, un sistema de sonda marcadora (LPS) se hibrida con el COM. El sistema de sonda marcadora (LPS) comprende una pluralidad de amplificadores, que son ácidos nucleicos que comprenden un segmento que puede hibridarse con secuencias repetidas complementarias del COM. El amplificador también comprende una pluralidad de secuencias repetidas que pueden hibridarse con una sonda marcadora (LP). La sonda marcadora comprende un ácido nucleico que comprende un segmento que puede hibridarse con secuencias repetidas complementarias del amplificador. La sonda marcadora también comprende un marcador detectable. El sistema de sonda marcadora proporciona, por tanto, una pluralidad de sondas marcadores unidas a amplificadores, y una pluralidad de amplificadores que se unen a un COM.

Con más detalle, un LPS comprende una pluralidad de amplificadores de marcador (LM) y una pluralidad de sondas marcadoras (LP), en el que cada LM comprende un segmento que puede unirse a un segmento de anclaje a amplificador de marcador del COM. El LM también comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a sonda marcadora. Cada LP comprende un marcador detectable y un segmento que se hibrida con el segmento de anclaje a sonda marcadora del LM. Cuando se producen hibridaciones entre los componentes, se forma un complejo generador de señal (SGC). El SGC comprende un ácido nucleico diana con la variación de un solo nucleótido, una SP, una NP, un SPM, un NPM, una pluralidad de COM, una pluralidad de LM, y una pluralidad de LP (véase la figura 1).

La invención proporciona un ensayo de alta especificidad y sensibilidad, de modo que puede realizarse la detección in situ de variaciones de ácido nucleico, que incluyen SNV, variantes de múltiples nucleótidos, tales como sitios de corte y empalme, y otros variantes, en muestras con un nivel elevado de ruido. Tal como se ilustra en la figura 1, un SGC proporciona una detección muy sensible y específica de una SNV en un ácido nucleico diana. Tal como se ilustra más a fondo en la figura 1, puede generarse una señal falsa si un COM con un LPS hibridado a él se une de una manera no específica a un componente de la célula. Sin embargo, la naturaleza de la hibridación colaborativa de la invención, según se describe en la presente, proporciona una alta sensibilidad y especificidad porque la señal generada cuando se produce la unión a la diana real es mayor que la señal del COM unido de modo no específico. Tal como se describió anteriormente, el SPCA está repetido al menos 2 veces en el SPM, y el NPCA está repetido al menos 2 veces en el NPM. Esta configuración proporciona una señal de la diana real que es al menos 2 veces mayor que la de un COM unido de modo no específico. La señal diferencial entre COM-LPS unido a la diana real puede aumentar aún más, según se describe en la presente, aumentando el número de repeticiones de SPCA en el

SPM y el número de repeticiones de NPCA en el NPM (véase también la figura 1). En general, el número de repeticiones de SPCA en el SPM será el mismo que el número de repeticiones de NPCA en el NPM, de modo que el COM puede hibridarse colaborativamente con ambos SPM y NPM. Por tanto, la señal diferencial entre la unión del

LPS a la diana real, en comparación con la unión no específica, puede aumentarse para proporcionar una mayor potenciación de la proporción de señal a ruido, proporcionando con ello un método de mayor especificidad y mayor sensibilidad para detectar variaciones de un solo nucleótido en células individuales in situ,

En una realización, la invención proporciona un método para la detección in situ de variaciones de ácido nucleico, por ejemplo, una variación de un solo nucleótido, de un ácido nucleico diana. En una realización de la invención, se proporciona un método de detección in situ de una variación de un solo nucleótido de un ácido nucleico diana en una muestra de células fijadas y permeabilizadas. El método puede comprender las etapas de: (A) poner en contacto la muestra con una sonda de variación de un solo nucleótido (SP) y una sonda vecina (NP), en el que la SP comprende un segmento de anclaje a diana (SPAT) que puede hibridarse específicamente con una región del ácido nucleico diana que comprende la variación de un solo nucleótido y un segmento de anclaje a preamplificador (SPAP), y en el que la NP comprende un segmento de anclaje a diana (NPAT) que puede hibridarse con una región del ácido nucleico diana adyacente al sitio de unión de la SP y un segmento de anclaje a preamplificador (NPAP);

(B) poner en contacto la muestra con un preamplificador de SP (SPM) y un preamplificador de NP (NPM), en el que el SPM comprende un segmento que puede unirse a la SP y comprende dos o más anclajes de colaboración a SP (SPCA), y en el que el NPM comprende un segmento que puede unirse a la NP y comprende dos o más anclajes de colaboración a NP (NPCA); (C) poner en contacto la muestra con un amplificador de colaboración (COM), en el que el COM comprende un primer segmento complementario con el SPCA, un segundo segmento complementario con el NPCA, y un tercer segmento que comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a amplificador de marcador;

(D) poner en contacto la muestra con un sistema de sonda marcadora (LPS), en el que el LPS comprende una pluralidad de amplificadores de marcador (LM) y una pluralidad de sondas marcadoras (LP), en el que cada LM comprende un segmento que puede unirse a un segmento de anclaje a amplificador de marcador del COM y una pluralidad de segmentos de anclaje a sonda marcadora, en el que cada LP comprende un marcador detectable y un segmento que se hibrida con el segmento de anclaje a sonda marcadora del LM, en el que las hibridaciones mencionadas forman un complejo generador de señal (SGC) que comprende un ácido nucleico diana con la variación de un solo nucleótido, una SP, una NP, un SPM, un NPM, una pluralidad de COM, una pluralidad de LM, y una pluralidad de LP; y (E) detectar in situ una señal procedente del SGC en la muestra.

Tal como se describe en la presente, los métodos de la invención se refieren, en general, a la detección in situ de variaciones de ácido nucleico. Los métodos para la detección in situ de ácidos nucleicos son muy conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, el documento US 2008/0038725; el documento US 2009/0081688; Hicks et al,, J. Mol. Histol., 35:595-601 (2004)). Tal como se emplea en la presente, una "hibridación in situ' o "ISH" se refiere a un tipo de hibridación que emplea una hebra de ADN o ARN complementaria marcada directa o indirectamente, tal como una sonda, para unirse y localizar un ácido nucleico específico, tal como ADN o ARN, en una muestra, en particular una porción o sección de un tejido (in situ), Los tipos de sondas pueden ser ADN bicatenario (ADNbc), ADN monocatenario (ADNmc), ARN complementario monocatenario (ARNcmc), ARN mensajero (ARNm), microARN (miARN), ARN ribosómico, ARN mitocondrial y/u oligonucleótidos sintéticos. La expresión "hibridación in situ fluorescente" o "FISH" se refiere a un tipo de ISH que emplea un marcador fluorescente. La expresión "hibridación in situ cromogénica" o "CISH" se refiere a un tipo de ISH con un marcador cromogénico. Los métodos de ISH, FISH y CISH son muy conocidos por los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Stoler, Clinics in Laboratory Medicine , 10(1 ):215-236 (1990); In situ hybridization. A practical approach, Wilkinson, ed., IRL Press, Oxford (1992); Schwarzacher y Heslop-Harrison, Practical in situ hybridization, BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford (2000)).

Para la detección in situ de dianas de ácido nucleico en una célula, la célula opcionalmente se fija y se permeabiliza antes de la hibridación de las sondas de diana. La fijación y la permeabilización de las células puede facilitar que las dianas de ácido nucleico permanezcan en la célula y permite que las sondas de diana, las sondas marcadoras, los amplificadores, los preamplificadores, etc., entren en la célula. La célula opcionalmente se lava para eliminar los materiales no capturados en una diana de ácido nucleico. La célula puede lavarse después de cualquiera de diversas etapas, por ejemplo, después de la hibridación de las sondas de diana con las dianas de ácido nucleico para retirar las sondas de diana no unidas, después de la hibridación de los preamplificadores, amplificadores y/o sondas marcadoras con las sondas de diana y/o similares. Los métodos para fijar y permeabilizar células para la detección in situ de ácido nucleicos, así como los métodos para hibridar, lavar y detectar ácidos nucleicos diana, también son muy conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, el documento US 2008/0038725; el documento US 2009/0081688; Hicks et al,, J. Mol. Histol., 35:595-601 (2004); Stoler, Clinics in Laboratory Medicine, 10(1):215-236 (1990); In situ hybridization. A practical approach, Wilkinson, ed., IRL Press, Oxford (1992); Schwarzacher y Heslop-Harrison, Practical in situ hybridization, BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford (2000)).

Tal como se emplea en la presente, se entiende que el término "pluralidad" significa dos o más. Por tanto, una pluralidad puede referirse, por ejemplo a 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más,

10 o más, 11 o más, 12 o más, 13 o más, 14 o más, 15 o más, 16 o más, 17 o más, 18 o más, 19 o m 21 o más, 22 o más, 23 o más, 24 o más, 25 o más, 26 o más, 27 o más, 28 o más, 29 o más, 30 o m 32 o más, 33 o más, 34 o más, 35 o más, 36 o más, 37 o más, 38 o más, 39 o más, 40 o más, 41 o m 43 o más, 44 o más, 45 o más, 46 o más, 47 o más, 48 o más, 49 o más, 50 o más, 55 o más, 60 o más, 65 o más, 70 o más, 75 o más, 80 o más, 85 o más, 90 o más, 95 o más, 100 o más, 110 o más, 120 o más, 130 o más, 140 o más, 150 o más, 160 o más, 170 o más, 180 o más, 190 o más, 200 o más, 300 o más, 400 o más, 500 o más, 600 o más, 700 o más, 800 o más, 900 o más, o 1000 o más, o incluso un número mayor, si se desea para un uso concreto.

En una realización de la invención, los métodos pueden usarse para detectar una variación de un solo nucleótido de un ácido nucleico diana. Esta variación de un solo nucleótido (SNV) puede ser una mutación puntual o un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP). En una realización de un método de la invención, una muestra que contiene células se pone en contacto con una sonda de variación de un solo nucleótido (SP) y una sonda vecina (NP). La SP comprende un segmento de anclaje a diana (SPAT) que puede hibridarse específicamente con una región del ácido nucleico diana que comprende la variación de un solo nucleótido. Tal como se emplea en la presente, una SP que puede "hibridarse específicamente" con una región del ácido nucleico diana que comprende la SNV se refiere a una SP que puede hibridarse específicamente con un ácido nucleico diana que contiene la SNV, pero no con un ácido nucleico que tiene un nucleótido diferente en la posición de la SNV. Por tanto, una SP puede distinguir entre un ácido nucleico que contiene la SNV y un ácido nucleico que no contiene la SNV. Se entiende que una SP usada en los métodos y las composiciones de la invención se diseña de tal modo que, bajo las condiciones de ensayo utilizadas, la SP puede hibridarse específicamente con un ácido nucleico diana que contiene un nucleótido específico, tal como la SNV, pero no se hibridará con una secuencia de ácido nucleico que contiene un nucleótido diferente en esa posición, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico de tipo salvaje. Por tanto, una SP se selecciona para que tenga un SPAT de una longitud deseada adecuada para mostrar hibridación específica con el ácido nucleico diana que contiene la SNV en la temperatura y los tampones usados para el ensayo de hibridación in situ. La longitud del SPAT puede elegirse para que sea lo suficientemente corta para que no permanezca unida de modo estable al ácido nucleico diana en ausencia de unión de la NP. En general, el SPAT tiene una longitud relativamente corta, por ejemplo, una longitud de aproximadamente 10 a 20 nucleótidos, pero puede ser un poco más corto o largo dependiendo de las condiciones de ensayo usadas, tal como una longitud de aproximadamente 9 a 21 nucleótidos. Así, en general, un SPAT puede tener una longitud de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 nucleótidos.

En la SP, la base complementaria con la variación de nucleótido en el ácido nucleico diana puede estar en cualquier posición dentro del SPAT de la SP, pero en general está cerca del centro del SPAT. Es importante que la SP pueda discriminar entre el ácido nucleico diana que tiene la variación de nucleótido y una secuencia de tipo salvaje u otra secuencia que no contiene la variación de nucleótido. La SP debe proporcionar una buena sensibilidad y especificidad. Para lograrlo, la diferencia de temperatura de fusión entre la unión de la SP a un ácido nucleico que tiene la variación de nucleótido y a una secuencia de tipo salvaje u otra secuencia que no contiene la variación de nucleótido (''dTm'') debe maximizarse. La posición de la base dentro del SPAT que es complementaria con la variación de nucleótido puede seleccionarse para maximizar la dTm. Esto puede realizarse usando algoritmos de cálculo de temperatura de fusión conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, SantaLucia, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95:1460-1465 (1998)). Además, se ha descubierto que bases modificadas artificiales, tales como ácidos nucleicos bloqueados ("Locked Nucleic Acid", LNA) o ácidos nucleicos con puente ("Bridged Nucleic Acid", BNA) y el 2'-O-metil ARN que aparece en la naturaleza, aumentan la potencia de unión entre pares complementarios (Petersen y Wengel, Trends Biotechnol., 21:74-81 (2003); Majlessi et a!, Nucl. Acids Res., 26:2224-2229 (1998)). Estas bases modificadas pueden introducirse estratégicamente en el SPAT de la SP para aumentar aún más la dTm para potenciar la sensibilidad de detección y la especificidad de la SP.

Una estrategia consiste en fabricar todas las bases en el SPAT de la SP con nucleótidos modificados (LNA, BNA o 2'-O-metil ARN). Debido a que cada base modificada puede aumentar la temperatura de fusión, la longitud del SPAT puede acortarse sustancialmente, lo cual hace que la SP sea más sensible a una diferencia de una sola base. Como alternativa, solo se cambia la base complementaria con la variación de nucleótido en el ácido nucleico diana al nucleótido modificado. Debido a que la potencia de unión de una base modificada con su complemento es más fuerte, la diferencia en las temperaturas de fusión (dTm) aumenta entre la unión de la SP a la variación de nucleótido en el ácido nucleico diana y la secuencia de tipo salvaje u otra secuencia que no contiene la variación de nucleótido. Otra realización consiste en usar tres bases modificadas (por ejemplo, tres bases de LNA, BNA o 2'-O-metil ARN, o una combinación de dos o más bases modificadas diferentes) en el SPAT centradas alrededor de la base complementaria con la variación de nucleótido en el ácido nucleico diana.

Una SP también comprende un segmento de anclaje a preamplificador (SPAP). El SPAP es complementario con un segmento del preamplificador de SP (SPM) y proporciona la unión del SPM a la SP unida al ácido nucleico diana. El SPAP tiene una longitud que proporciona una hibridación estable entre la SP y el SPM bajo las condiciones de ensayo utilizadas. Así, el SPAP en general es más largo que el SPAT, por ejemplo, tiene una longitud de aproximadamente 14 a 28 nucleótidos, pero puede ser un poco más corto o largo dependiendo de las condiciones de ensayo usadas, tal como una longitud de aproximadamente 10 a 30 nucleótidos. Así, en general, un SPAP puede tener una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos.

La SP puede incluir opcionalmente un espaciador entre el SPAT y el SPAP. Por tanto, se entiende que una SP puede no tener un espaciador entre el SPAT y el SPAP. Sin embargo, en general, la SP tendrá un espaciador entre el SPAT y el SPAP. Esta configuración permite conseguir una separación espacial deseada del ácido nucleico diana del SGC formado. Un espaciador entre el SPAT y el SPAP en general tendrá una longitud de 1 a 10 nucleótidos, pero se entiende que el espaciador puede ser más largo, si se desea. Por tanto, un espaciador opcional entre el SPAT y el SPAP puede tener una longitud, por ejemplo, de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 nucleótidos. En una realización concreta, el espaciador tiene una longitud de 5 nucleótidos.

En una realización de la invención, la muestra también se pone en contacto con una sonda vecina (NP). La NP comprende un segmento de anclaje a diana (NPAT) que puede hibridarse con una región del ácido nucleico diana adyacente al sitio de unión de la SP. La región del ácido nucleico diana adyacente al sitio de unión de SPAT puede estar inmediatamente adyacente, es decir, puede unirse sin que haya una distancia entre el sitio de unión de SPAT y el sitio de unión de NPAT. Sin embargo, en general, existirá una distancia de 1 a unos pocos nucleótidos entre el sitio de unión de SPAT y el sitio de unión de NPAT, por ejemplo, una distancia de 1 a 50 nucleótidos, y dichos sitios de unión aún se considerarán sitios de unión adyacentes para la unión de la SP y la NP al ácido nucleico diana. La NP se selecciona para que tenga un NPAT de una longitud deseada adecuada para mostrar hibridación específica con el ácido nucleico diana adyacente al sitio de unión de SPAT en la temperatura y los tampones usados para el ensayo de hibridación in situ. Puesto que la NP no tiene que discriminar la variación de un solo nucleótido, el NPAT puede ser relativamente más largo que el SPAT para proporcionar estabilidad, por ejemplo, tener una longitud de aproximadamente 16 a 30 nucleótidos, pero puede ser un poco más corto o largo dependiendo de las condiciones de ensayo usadas, tal como una longitud de aproximadamente 12 a 40 nucleótidos. Así, en general, un NPAT puede tener una longitud de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 nucleótidos.

Una NP también comprende un segmento de anclaje a preamplificador (NPAP). El NPAP es complementario con un segmento del preamplificador de NP (NPM) y proporciona la unión del NPM a la NP unida al ácido nucleico diana. El NPAP tiene una longitud que proporciona una hibridación estable entre la NP y el NPM bajo las condiciones de ensayo utilizadas. Por tanto, el NPAP en general tiene una longitud de aproximadamente 14 a 28 nucleótidos, pero puede ser un poco más corto o largo dependiendo de las condiciones de ensayo usadas, tal como una longitud de aproximadamente 10 a 30 nucleótidos. Así, en general, un NPAP puede tener una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos.

La NP puede incluir opcionalmente un espaciador entre el NPAT y el NPAP. Por tanto, se entiende que una NP puede no tener un espaciador entre el NPAT y el NPAP. Sin embargo, en general, la NP tendrá un espaciador entre el NPAT y el NPAP. Esta configuración permite conseguir una separación espacial deseada del ácido nucleico diana del SGC formado. Un espaciador entre el NPAT y el NPAP en general tendrá una longitud de 1 a 10 nucleótidos, pero se entiende que el espaciador puede ser más largo, si se desea. Por tanto, un espaciador opcional entre el NPAT y el NPAP puede tener una longitud, por ejemplo, de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 nucleótidos. En una realización concreta, el espaciador tiene una longitud de 5 nucleótidos.

En una realización de un método de la invención, la muestra se pone en contacto con un preamplificador de SP (SPM) y un preamplificador de NP (NPM). El SPM comprende un segmento que puede unirse a la SP mediante el SPAP. Así, el segmento del SPM es complementario con el SPAP de la SP. Tal como se describe en la presente, el SPAP en general tiene una longitud que proporciona una hibridación estable entre la SP y el SPM bajo las condiciones de ensayo utilizadas. Por tanto, el segmento del SPM que se complementario con el SPAP en general tiene una longitud de aproximadamente 14 a 28 nucleótidos, pero puede ser un poco más corto o largo dependiendo de la longitud del SPAP y de las condiciones de ensayo usadas, tal como una longitud de aproximadamente 10 a 30 nucleótidos. Así, en general, el segmento es complementario con el SPAP y puede tener una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos.

El SPM también comprende dos o más anclajes de colaboración a SP (SPCA). El SPCA proporciona un sitio de unión para un amplificador de colaboración (COM). La longitud del SPCA en general se elige para que sea lo suficientemente corta para que no permanezca unida de modo estable al COM en ausencia de unión del COM al NPCA del NPM (véase la figura 1). En general, el SPCA tiene una longitud relativamente corta, por ejemplo, una longitud de aproximadamente 10 a 20 nucleótidos. Así, en general, un SPCA puede tener una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos. En una realización concreta, el SPCA tiene una longitud de 14 nucleótidos.

El NPM comprende un segmento que puede unirse a la NP mediante el NPAP. Así, el segmento del NPM es complementario con el NPAP de la NP. Tal como se describe en la presente, el NPAP en general tiene una longitud que proporciona una hibridación estable entre la NP y el NPM bajo las condiciones de ensayo utilizadas. Por tanto, el segmento del NPM que se complementario con el NPAP en general tiene una longitud de aproximadamente 14 a 28 nucleótidos, pero puede ser un poco más corto o largo dependiendo de la longitud del NPAP y de las condiciones de ensayo usadas, tal como una longitud de aproximadamente 10 a 30 nucleótidos. Así, en general, el segmento es complementario con el NPAP y puede tener una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos.

El NPM también comprende dos o más anclajes de colaboración a NP (NPCA). El NPCA proporciona un sitio de unión para un amplificador de colaboración (COM). La longitud del NPCA en general se elige para que sea lo suficientemente corta para que no permanezca unida de modo estable al COM en ausencia de unión del COM al SPCA del SPM (véase la figura 1). En general, el NPCA tiene una longitud relativamente corta, por ejemplo, una longitud de aproximadamente 10 a 20 nucleótidos. Así, en general, un NPCA puede tener una longitud de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos. En una realización concreta, el NPCA tiene una longitud de 14 nucleótidos.

El SPM o el NPM puede incluir opcionalmente un espaciador entre los SPCA o los NPCA. Por tanto, se entiende que un SPM puede no tener un espaciador entre los SPCA, y un NPM puede no tener un espaciador entre los NPCA. Sin embargo, en general, el SPM y el NPM tendrán un espaciador entre los SPCA y los NPCA. Un espaciador opcional entre los SPCA y los NPCA en general tendrá una longitud de 1 a 10 nucleótidos, pero se entiende que el espaciador puede ser más largo, si se desea. Por tanto, un espaciador opcional entre los SPCA y los NPCA independientemente puede tener una longitud, por ejemplo, de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 nucleótidos. En una realización concreta, el espaciador tiene una longitud de 5 nucleótidos. Se entiende que el uso de un espaciador entre cualquiera de los SPCA de un SPM y los NPCA de un NPM es independiente, y que la longitud del espaciador entre los SPCA y los NPCA es independiente. Por ejemplo, si un NPM contiene 4 NPCA, habrá 3 espaciadores opcionales, y estos espaciadores no tienen que tener la misma longitud entre sí, es decir, las longitudes son independientes.

Tal como se describe en la presente, el SPM y el NPM pueden diseñarse para que contengan dos o más SPCA y NPCA, respectivamente. Para aumentar la señal asociada con un SGC, el número de SPCA y NPCA puede aumentar (véase la figura 1). El número de SPCA y NPCA puede seleccionarse para obtener una potencia de señal deseada o una mayor proporción de señal frente al ruido. Tal como se muestra en la figura 1, cada SPCA y NPCA puede unirse a un COM, que, a su vez, se une a un sistema de sonda marcadora (LPS). Si se aumenta el número de SPCA y NPCA en el SPM y NPM, respectivamente, se producirá un correspondiente aumento en el número de sistemas de sonda marcadora (LPS) unidos al ácido nucleico diana. Cada COM que puede unirse a una diana de ácido nucleico a través de hibridación de colaboración en los métodos de la invención aumenta la señal específica de diana frente a la unión no específica de un COM con un componente de la célula (véase la figura 1). El número de SPCA y NPCA en una pareja de SPM y NPM en general será el mismo entre la pareja, en general habrá la misma distancia entre las parejas, y en general habrá de 2 a 20 SPCA y NPCA por pareja, aunque se entiende que puede usarse un número mayor, si se desea. Por tanto, un SPM y NPM en general tendrán 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 SPCA y NPCA, respectivamente.

En una realización de un método de la invención, la muestra se pone en contacto con un amplificador de colaboración (COM). El COM comprende un primer segmento complementario con el SPCA, un segundo segmento complementario con el NPCA, y un tercer segmento que comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a amplificador de marcador. Tal como se describe en la presente y se muestra en la figura 1, el COM proporciona una hibridación de colaboración entre el SPM y el NPM, que están unidos al ácido nucleico diana a través de la SP y la NP, respectivamente. La configuración de la hibridación de colaboración del COM proporciona más especificidad y una mayor proporción de señal frente al ruido, puesto que el sistema de sonda marcadora (LPS) no se unirá al ácido nucleico diana a menos que el COM esté unido a ambos SPM y NPM. Tal como se analizó anteriormente, se proporciona un aumento adicional en la señal aumentando el número de SPCA y NPCA en el SPM y NPM, respectivamente. La hibridación colaborativa de múltiples COM aumenta aún más haciendo que se produzcan múltiples reacciones de hibridación colaborativa cuando el complejo esté unido específicamente al ácido nucleico diana (véase la figura 1).

El COM también comprende un tercer segmento, que comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a amplificador de marcador. Los segmentos de anclaje a amplificador de marcador son complementarios con segmentos de los amplificadores de marcador (LM). La unión del COM a los amplificadores de marcador (LM) es, en general, una hibridación estable. Por tanto, los segmentos de anclaje a amplificador de marcador tienen una longitud, en general, que proporciona una hibridación estable entre COM y los LM bajo las condiciones de ensayo utilizadas. Los segmentos de anclaje a amplificador de marcador en general tienen una longitud de aproximadamente 20 a 28 nucleótidos, pero pueden ser un poco más cortos o largos dependiendo de las condiciones de ensayo usadas, tal como una longitud de aproximadamente 15 a 30 nucleótidos. Así, en general, los segmentos de anclaje a amplificador de marcador pueden tener una longitud de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos.

La longitud de un COM se selecciona basándose en las características deseadas del ensayo. Tal como se describió anteriormente, el COM contendrá un primer segmento complementario con el SPCA, un segundo segmento complementario con el NPCA, y un tercer segmento que comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a amplificador de marcador. Los segmentos de anclaje a amplificador de marcador proporcionan sitios de unión para los amplificadores de marcador (LM). Tal como se muestra en la figura 4, el COM puede contener opcionalmente un espaciador independientemente entre el primer, segundo y/o tercer segmento. La longitud del espaciador y la orientación del primer y segundo segmento entre SPCA y NPCA puede seleccionarse para maximizar el efecto de hibridación colaborativa. El primer y segundo segmento de COM puede hibridarse con SPCA y NPCA en la misma orientación o en diferentes orientaciones, tal como se muestra en las figuras 4A, 4B y 4C, respectivamente. El espaciador, en general e independientemente, tiene una longitud de 1 a 10 nucleótidos. Por tanto, un espaciador entre el primer, segundo y/o tercer segmento de un COM en general puede tener una longitud, independientemente, de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos, dependiendo de la configuración del SGC.

Las bases modificadas, tales como LNA o BNA, pueden usarse en SPCA, NPCA o sus secuencias complementarias en COM, lo cual aumenta la potencia de unión de la base a su base complementaria, permitiendo un aumento de la temperatura de fusión de la hibridación entre SPM y COM o entre NPM y COM individualmente, o una reducción en la longitud de los segmentes de anclaje (véase, por ejemplo, Petersen y Wengel, Trends Biotechnol., 21:74-81 (2003); patente de EE. UU. n.° 7.399.845). De modo más importante, esta estrategia aumenta sustancialmente la diferencia entre las temperaturas de fusión de la hibridación de SPM-COM o NPM-COM individual y la hibridación colaborativa de SPM-NPM-COM. Esta diferencia puede ser importante para la potenciación de la proporción de señal frente al ruido en el ensayo de la invención, porque la unión de COM a un SPM o NPM individual es significativamente más inestable que la unión de COM a una pareja de SPM/NPM. Esto asegura que un SGC solo puede ensamblarse cuando está específicamente asociado en presencia de la diana.

De modo similar, el tercer segmento de un COM contiene una pluralidad de segmentos de anclaje a amplificador de marcador. Los segmentos de anclaje a amplificador de marcador también pueden tener, opcional e independientemente, un espaciador entre ellos. Así, un espaciador entre los segmentos de anclaje a amplificador de marcador puede tener, independientemente, una longitud de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos. Por tanto, dependiendo de la longitud del primer, segundo y tercer segmento, un COM tendrá, en general, una longitud de aproximadamente 60 a 900 nucleótidos.

En una realización de un método de la invención, la muestra se pone en contacto con un sistema de sonda marcadora (LPS). El LPS comprende una pluralidad de amplificadores de marcador (LM). Cada LM comprende un segmento que puede unirse a un segmento de anclaje a amplificador de marcador del COM. El LM también comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a sonda marcadora. La unión de los LM a las sondas marcadoras (LP) es, en general, una hibridación estable. Por tanto, los segmentos de anclaje a sonda marcadora tienen una longitud, en general, que proporciona una hibridación estable entre el LM y los LP bajo las condiciones de ensayo utilizadas. Los segmentos de anclaje a sonda marcadora en general tienen una longitud de aproximadamente 15 a 28 nucleótidos, pero pueden ser un poco más cortos o largos dependiendo de las condiciones de ensayo usadas, tal como una longitud de aproximadamente 12 a 30 nucleótidos. Así, en general, los segmentos de anclaje a sonda marcadora pueden tener una longitud de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos.

Tal como se describe en la presente, para aumentar aún más la señal asociada con un SGC, el número de LM unidos a un COM puede aumentar (véase la figura 1). El número de LM puede seleccionarse para obtener una potencia de señal deseada o una mayor proporción de señal frente al ruido. Tal como se muestra en la figura 1, una pluralidad de LM puede unirse a un COM a través de los segmentos de anclaje a amplificador de marcador. Si se aumenta el número de segmentos de anclaje a amplificador de marcador en el COM, se aumentará el número de LM unidos al COM. Esto, a su vez, dará como resultado un correspondiente aumento en el número de sondas marcadoras unidas al ácido nucleico diana. El número de LM unidos al COM en general será de 2 a 20, aunque se entiende que puede utilizarse un número más alto, si se desea. Así, un COM tendrá, en general, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 segmentos de anclaje a amplificador de marcador, que proporcionan la unión de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 LM por COM.

El LPS también comprende una pluralidad de sondas marcadoras (LP). Cada LP comprende uno o más marcadores detectables y un segmento que se hibrida con el segmento de anclaje a sonda marcadora del LM. Tal como se emplea en la presente, un "marcador" es un resto que facilita la detección de una molécula. Los marcadores habituales en el contexto de la presente invención incluyen marcadores fluorescentes, luminiscentes, dispersores de luz y/o colorimétricos. Los marcadores adecuados incluyen enzimas y restos fluorescentes y cromogénicos, así como radionúclidos, sustratos, cofactores, inhibidores, restos quimioluminiscentes, partículas magnéticas, metales de tierras raras y similares. En una realización particular de la invención, el marcador es una enzima. Los ejemplos de marcadores de enzimas incluyen, pero no se limitan a peroxidasa de rábano ("Horse Radish Peroxidase", HRP), fosfatasa alcalina ("Alkaline Phosphatase", AP), p-galactosidasa, glucosa oxidasa, y similares, así como diversas proteasas. Otros marcadores incluyen, pero no se limitan a fluoróforos, dinitrofenilo (DNP), y similares. Los marcadores son muy conocidos por los expertos en la técnica, como se describe, por ejemplo, en Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996), y las patentes de EE. UU. n.os 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; y 4.366.241. Muchos marcadores están disponibles en el mercado y pueden usarse en los métodos y los ensayos de la invención, incluyendo combinaciones de enzima detectable/sustrato (Pierce, Rockford IL; Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX; Invitrogen, Carlsbad CA). En una realización particular de la invención, la enzima puede utilizar un sustrato cromogénico o fluorogénico para producir una señal detectable, como se describe en la presente. En la presente se describen ejemplos de marcadores.

Puede utilizarse cualquiera de una serie de marcadores de enzimas o no enzimáticos, con la condición de que pueda detectarse la actividad enzimática o el marcador no enzimático, respectivamente. Por tanto, la enzima produce una señal detectable, que puede utilizarse para detectar un ácido nucleico diana. Las señales detectables particularmente útiles son las señales cromogénicas o fluorogénicas. Por consiguiente, las enzimas particularmente útiles para su uso como marcador incluyen las enzimas para las cuales está disponible un sustrato cromogénico o fluorogénico. Estos sustratos cromogénicos o fluorogénicos pueden ser convertidos, mediante una reacción enzimática, en un producto cromogénico o fluorescentes fácilmente detectable, que pueda ser fácilmente detectable y/o cuantificarse usando microscopía o espectroscopía. Estas enzimas son muy conocidas por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, glucosa oxidasa, y similares (véase, Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996)). Otras enzimas que tienen sustratos cromogénicos o fluorogénicos muy conocidos incluyen diversas peptidasas, en las que los sustratos de péptidos cromogénicos o fluorogénicos pueden utilizarse para detectar reacciones de ruptura proteolítica. El uso de sustratos cromogénicos y fluorogénicos también es muy conocido en los diagnósticos bacterianos, que incluyen, pero no se limitan al uso de a- y p-galactosidasa, p-glucuronidasa, 6-fosfo-p-D-galatosida 6-fosfogalactohidrolasa, pglucosidasa, a-glucosidasa, amilasa, neuraminidasa, esterasas, lipasas y similares (Manafi et al, Microbiol. Rev., 55:335-348 (1991)), y estas enzimas con sustratos cromogénicos o fluorogénicos conocidos pueden adaptarse con facilidad para su uso en los métodos de la presente invención.

Los expertos en la técnica conocen diversos sustratos cromogénicos o fluorogénicos para producir señales detectables y que están disponibles en el mercado. Los ejemplos de sustratos que pueden utilizarse para producir una señal detectable incluyen, pero no se limitan a 3,3'-diaminobenzidina (DAB), 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB), cloronaftol (4-CN)(4-cloro-1-naftol), ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) (ABTS), diclorhidrato de ofenilendiamina (OPD), y 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) para la peroxidasa de rábano; 5-bromo-4-cloro-3-indolil-1-fosfato (BCIP), nitroazul de tetrazolio (NBT), Fast Red (Fast Red TR/AS-MX), y fosfato de p-nitrofenilo (PNPP) para la fosfatasa alcalina; 1-metil-3-indolil-p-D-galactopiranósido y 2-metoxi-4-(2-nitrovinil)fenil p-D-galactopiranósido para la p-galactosidasa; 2-metoxi-4-(2-nitrovinil)fenil p-D-glucopiranósido para la p-glucosidasa; y similares. Los ejemplos de sustratos fluorogénicos incluyen, pero no se limitan a 4-(trifluorometil)umbeliferil fosfato para la fosfatasa alcalina; 4-metilumbeliferil fosfato bis(2-amino-2-metil-1,3-propanediol), 4-metilumbeliferil fosfato bis(ciclohexilamonio) y 4-metilumbeliferil fosfato para las fosfatasas; QuantaBlu™ y QuantaRed™ para la peroxidasa de rábano; 4-metilumbeliferil p-D-galactopiranósido, fluoresceína di(p-D-galactopiranósido) y naftofluoresceína di-(p-D-galactopiranósido) para la p-galactosidasa; 3-acetilumbeliferil p-D-glucopiranósido y 4-metilumbeliferil-p- D-glucopiranósido para la p-glucosidasa; y 4-metilumbeliferil-a-D-galactopiranósido para la a-galactosidasa. También se describen ejemplos de enzimas y sustratos para producir una señal detectable, por ejemplo, en la publicación de EE. UU. 2012/0100540. Diversos sustratos de enzimas detectables, que incluyen sustratos cromogénicos o fluorogénicos, son muy conocidos y están disponibles en el mercado (Pierce, Rockford IL; Santa Cruz Biotechnology, Dallas TX; Invitrogen, Carlsbad CA; 42 Life Science; Biocare). En general, los sustratos se convierten en productos que forman precipitados que se depositan en el sitio del ácido nucleico diana. Otros ejemplos de sustratos incluyen, pero no se limitan a HRP-Green (42 Life Science), Betazoid DAB, Cardassian DAB, Romulin AEC, Bajoran Purple, Vina Green, Deep Space Black™, Warp Red™, Vulcan Fast Red y Ferangi Blue de Biocare (Concord CA; biocare.net/products/detection/chromogens).

La biotina-avidina (o la biotina-estreptavidina) es un sistema de amplificación de señales muy conocido basado en el hecho de que las dos moléculas tienen una afinidad extraordinariamente alta entre sí y que una molécula de avidina/estreptavidina puede unirse a cuatro moléculas de biotina. Los anticuerpos se emplean ampliamente para la amplificación de señales en inmunohistoquímica e ISH. La amplificación de señales de tiramida ("tyramide signal amplification", TSA) se basa en el depósito de un gran número de moléculas de tiramida haptenizadas mediante una actividad peroxidasa. La tiramina es un compuesto fenólico. En presencia de cantidades pequeñas de peróxido de hidrógeno, la peroxidasa de rábano ("Horse Radish Peroxidase", HRP) inmovilizada convierte el sustrato marcado en un intermedio extremadamente reactivo de vida corta. Las moléculas de sustratos activadas después reaccionan muy rápidamente y se unen covalentemente a restos ricos en electrones de las proteínas, tales como tirosina, en el sitio de unión a la peroxidasa o cerca de este. De esta forma, pueden introducirse un gran número de moléculas extra de hapteno conjugadas con tiramida en el sitio de hibridación in situ. Posteriormente, las moléculas de tiramida-hapteno depositadas pueden visualizarse de modo directo o indirecto. Este sistema de detección se describe con más detalle, por ejemplo, en la publicación de EE. UU. 2012/0100540.

Las realizaciones descritas en la presente pueden utilizar enzimas para generar una señal detectable usando sustratos cromogénicos o fluorogénicos apropiados. Se entiende que, como alternativa, una sonda marcadora puede tener un marcador detectable directamente acoplado a la porción de ácido nucleico de la sonda marcadora. Los ejemplos de marcadores detectables son muy conocidos por los expertos en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a marcadores cromogénicos o fluorescentes (véase, Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996)). Los ejemplos de fluoróforos útiles como marcadores incluyen, pero no se limitan a derivados de rodamina, por ejemplo, tetrametilrodamina, rodamina B, rodamina 6G, sulforrodamina B, rojo de Texas (sulforrodamina 101), rodamina 110, y sus derivados, tales como tetrametilrrodamina-5-(o 6), lisamina rodamina B, y similares; 7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol (NBD); fluoresceína y sus derivado; naftalenos, tales como dansilo (5-dimetilaminonaftalen-1-sulfonilo); derivados de cumarina, tales como ácido 7-amino-4-metilcumarin-3-acético (AMCA), 7-dietilamino-3-[(4'-(yodoacetil)amino)fenil]-4-metilcumarina (DCIA), tintes Alexa Fluor (Molecular Probes), y similares; 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno (BODIPY™) y sus derivados (Molecular Probes; Eugene Oreg.); pirenos y pirenos sulfonatados, tales como Cascade Blue™ y sus derivados, que incluyen ácido 8-metoxipiren-1,3,6-trisulfónico, y similares; derivados de piridiloxazol y derivados de dapoxilo (Molecular Probes); amarillo Lucifer (3,6-disulfonato-4-amino-naftalimida) y sus derivados; tintes fluorescentes CyDye™ (Amersham/GE Healthcare Life Sciences; Piscataway NJ), y similares. Los ejemplos de cromóforos incluyen, pero no se limitan a fenolftaleína, verde de malaquita, compuestos nitroaromáticos, tales como nitrofenilo, tintes diazoicos, dabsilo (4dimetilaminoazobencen-4'-sulfonilo), y similares.

Pueden utilizarse métodos muy conocidos, tales como microscopía, citometría (citometría de masas, CyTOF), o espectroscopía, para visualizar las señales detectables cromogénicas o fluorescentes asociadas con los respectivos ácidos nucleicos diana. En general, se utilizarán sustratos cromogénicos o sustratos fluorogénicos, o marcadores cromogénicos o fluorescentes, en un ensayo concreto, si se emplean diferentes marcadores en el mismo ensayo, de modo que puede usarse un único tipo de instrumento para la detección de dianas de ácidos nucleicos en la misma muestra.

Tal como se describe en la presente, para aumentar aún más la señal asociada con un SGC, el número de LP unidos a un LM puede aumentar (véase la figura 1). El número de LP puede seleccionarse para obtener una potencia de señal deseada o una mayor proporción de señal frente al ruido. Tal como se muestra en la figura 1, una pluralidad de LP puede unirse a un LM a través de los segmentos de anclaje a sonda marcadora. Si se aumenta el número de segmentos de anclaje a sonda marcadora en el LM, se aumentará el número de LP unidos al LM. Esto da como resultado un aumento en el número de sondas marcadoras unidas al ácido nucleico diana. El número de LP unidas al LM en general será de 2 a 20, aunque se entiende que puede utilizarse un número más alto, si se desea. Así, un LM tendrá, en general, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 segmentos de anclaje a sonda marcadora, que proporcionan la unión de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 LP por LM.

Cuando los componentes descritos anteriormente se hibridan, se forma un complejo generador de señal (SGC). El SGC comprende un ácido nucleico diana con la variación de nucleótido, por ejemplo, una variación de un solo nucleótido, una variación de múltiples nucleótidos, un sitio de corte y empalme, una inserción/deleción, una redisposición, y similares, una SP, una NP, un SPM, un NPM, una pluralidad de COM, una pluralidad de LM, y una pluralidad de LP. Tras haberse formado el SGC, puede detectarse la señal in situ procedente del SGC en la muestra. Después de ensamblar cada componente, la muestra puede lavarse opcionalmente para retirar el componente no unido antes de añadir la siguiente capa de componente a la muestra.

Las bases modificadas, tales como LNA o BNA, pueden usarse en los segmentos de anclaje de componentes seleccionados de SGC, lo cual aumenta la potencia de unión de la base a su base complementaria, permitiendo una reducción en la longitud de los segmentes de anclaje (véase, por ejemplo, Petersen and Wengel, Trends Biotechnol., 21:74-81 (2003); patente de EE. UU. n.° 7.399.845). Pueden incorporarse bases artificiales que expanden el alfabeto de 4 letras natural, tales como el sistema de información genética expandida artificialmente ("Artificially Expanded Genetic Information System", AEGIS; Yang etal,, Nucl. Acids Res., 34 (21): 6095-6101 (2006)) en los sitios de unión entre los componentes que interaccionan del SGC (por ejemplo, los sitios de hibridación SPAP-SPM, NPAP-NPM, SPCA-COM, NPCA-COM, y LP~LM). Estas bases artificiales pueden aumentar la especificidad de los componentes que interaccionan, lo cual, a su vez, puede permitir que las reacciones de hibridación de menor rigurosidad produzcan una señal mayor.

Puede resultar útil usar una configuración con una NP en cada lado de la SP, tal como se muestra en la figura 5. Esta configuración proporciona la captura de dos SGC en un ácido nucleico diana que contiene un variante de nucleótido, tal como una SNV, un variante de múltiples nucleótidos, un sitio de corte y empalme, una inserción/deleción, una redisposición, y similares. Esta configuración puede utilizarse además para doblar la señal. Como alternativa, también puede usarse para potenciar la robustez del ensayo. Por ejemplo, tal como se muestra en la figura 5B, si el acceso de una NP está bloqueado debido a una permeabilización insuficiente, o si el sitio de unión al ácido nucleico diana se ha perdido debido a la degradación del ARN, el SGC unido a la otra NP aún puede generar una señal detectable.

En una realización de la invención, el ácido nucleico detectado por los métodos de la invención puede ser cualquier ácido nucleico presente en la muestra de células, que incluye, pero no se limita a ARN, que incluye ARN mensajero (ARNm), microARN (miARN), ARN ribosómico (ARNr), a Rn mitocondrial y similares, o ADN y similares. En una realización concreta, el ácido nucleico es ARN.

En otra realización de la invención, las células fijadas y permeabilizadas están inmovilizadas sobre un portaobjetos para tejidos. Los métodos para fijar y permeabilizar células para su inmovilización sobre un portaobjetos para tejidos son muy conocidos en la técnica, tal como se describe en la presente.

Tal como se describe en la presente, la invención se basa en construir un complejo generador de señal (SGC) unido a un ácido nucleico diana para detectar la presencia del ácido nucleico diana en la célula. Los componentes para construir un SGC en general comprenden ácidos nucleicos, de modo que se utilizan reacciones de hibridación de ácidos nucleicos para unir los componentes del SGC al ácido nucleico diana. Los métodos para seleccionar regiones apropiadas y diseñar reactivos específicos y selectivos que se unen a los ácidos nucleicos diana, en particular oligonucleótidos o sondas que se unen específica y selectivamente a un ácido nucleico diana, u otros componentes del SGC, son muy conocidos por los expertos en la técnica (véase, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York (2001); Ausubel et al,, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999)). Puede lograrse una especificidad deseada usando una selección apropiada de regiones de un ácido nucleico diana, así como longitudes apropiadas de un agente de unión, tal como un oligonucleótido o una sonda, y dichos métodos de selección son muy conocidos por los expertos en la técnica. Así, los expertos en la técnica comprenderán con facilidad y también podrán determinar con facilidad los reactivos apropiados, tales como oligonucleótidos o sondas, que pueden utilizarse para dirigirse a un ácido nucleico diana concreto frente a otro ácido nucleico diana, o para proporcionar la unión a los componentes del SGC, tales como SP, NP, SPM, NPM, COM, LM y LP.

Tal como se describe en la presente, las etapas de los métodos de la invención, por las cuales los componentes se ensamblan en un SGC unido a un ácido nucleico diana, pueden realizarse al mismo tiempo o secuencialmente, en cualquier orden, con la condición de que el ácido nucleico diana pueda detectarse. En algunos casos, puede resultar deseable reducir el número de etapas del ensayo, por ejemplo, reducir el número de etapas de hibridación y lavado. Una manera de reducir el número de etapas del ensayo es preensamblar algunos o todos los componentes del SGC antes de ponerlos en contacto con una célula. Este preensamblaje puede realizarse hibridando algunos o todos los componentes del SGC entre sí antes de ponerlos en contacto con el ácido nucleico diana. También es posible reducir las etapas del ensayo prefabricando alguna parte del SGC para integrar múltiples componentes del SGC a través de síntesis química. En la figura 6A se muestra un ejemplo de realización. La figura 6A muestra la integración del SPM con COM y NPM con COM usando una molécula de amplificación prefabricada con una estructura "ramificada". En esta realización mostrada, el SPM y el NPM usan una "rama" de ácido nucleico para conectarse con el COM, en lugar de un SPCA o un NPCA como se muestra en la figura 6A. En este caso, se produce una hibridación colaborativa o de colaboración en la unión del LM al COM de la molécula ramificada de SPM-COM.

En la figura 6B se muestra otra realización. La figura 6B muestra la integración de la SP y la NP con el SMP y el NPM, respectivamente, mediante la extensión de la SP y la NP para producir una secuencia más larga que incluye SPCA y NPCA. El SGC entonces puede ensamblarse con los COM, los LM y las LP, como se muestra en la figura 1, y los COM están unidos a los SPCA y los NPCA de la SP y la NP extendidas, como se muestra en la figura 6B. Como alternativa, el SGC puede ensamblarse con la configuración mostrada en la figura 6B, en la que el COM y el LM se integran usando una configuración "ramificada", como se describió anteriormente. El LM se conecta al COM como un ácido nucleico ramificado, en lugar de unirse mediante los segmentos de anclaje a amplificador de marcador, como se muestra en la figura 1. En esta realización mostrada, la hibridación colaborativa se produce entre la porción de COM de la molécula ramificada de COM-LM y la SP y la NP extendidas, que contienen SPCA y NPCA, respectivamente.

Las moléculas grandes son más propensas a unirse no específicamente o a quedarse atrapadas en la matriz celular durante los ensayos in situ. Esta es una desventaja potencial en la utilización de una molécula "ramificada" que proporciona moléculas más grandes para los ensayos de detección in situ. Sin embargo, los métodos de la invención, tal como se describen en la presente, solucionan este problema porque una única molécula de amplificación grande no puede formar el SGC por sí sola. Por ejemplo, en la realización mostrada en la figura 6A, el SGC no puede formarse sin la presencia de su pareja (SP y NP unidas al ácido nucleico diana), por lo cual no generará ruido o una señal de falso positivo. En la figura 6B, aunque una única molécula grande "ramificada" puede generar ruido de fondo si está unida no específicamente, el nivel de intensidad de una señal verdadera puede ajustarse de modo que el número de marcadores unidos a un ácido nucleico diana sea mayor que el de una molécula ramificada de COM-LM con sondas marcadoras unidas, tal como se describe en la presente (por ejemplo, aumentando el número de SPCA y NPCA en la SP y la TP extendidas).

Así, se entiende que, si se desea, puede incluirse un componente intermedio de modo que la unión de un componente a otro se preensamble mediante un enlace químico. Por ejemplo, en otra realización, el LM puede ser una molécula grande prefabricada que comprende muchos marcadores. En otra realización, el COM+LPS (COM/LM/LP) puede sintetizarse químicamente como una única molécula grande. El uso de dichas moléculas grandes prefabricadas puede reducir con eficacia el número de etapas del ensayo. Los métodos para fabricar dichas configuraciones de ácido nucleico, que incluyen configuraciones de ácido nucleico ramificado como se analizó anteriormente y se muestra en las figuras 6A y 6B, son muy conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n os 5.635.352 y 5.681.697).

Tal como se describe en la presente, los componentes en general se unen directamente entre sí. En el caso de componentes que contienen ácido nucleico, la reacción de unión en general se realiza mediante hibridación. En el caso de una reacción de hibridación, la unión entre los componentes es directa. Si se desea, puede incluirse un componente intermedio de modo que la unión de un componente a otro sea indirecta, por ejemplo, el componente intermedio contiene sitios de unión complementarios para unir dos componentes distintos.

Se entiende que la invención puede realizarse en cualquier orden deseado, con la condición de que se detecte el ácido nucleico diana variante. Por tanto, en un método de la invención, las etapas de poner en contacto una célula con una SP, una NP, un SPM, un NPM, un COM y/o un LPS pueden realizarse en cualquier orden deseado, pueden llevarse a cabo secuencialmente, o pueden llevarse a cabo simultáneamente, o algunas etapas pueden realizarse secuencialmente, mientras que otras se realizan simultáneamente, si se desea, con la condición de que se detecte el ácido nucleico diana. También se entiende que las realizaciones descritas en la presente pueden combinarse independientemente con otras realizaciones descritas en la presente, según se desee, para utilizar diversas configuraciones, tamaños de los componentes, condiciones de ensayo, sensibilidad de ensayo y similares.

Los métodos de la invención y las composiciones relacionadas utilizan la hibridación colaborativa para aumentar la especificidad y para reducir el fondo en la detección in situ de ácidos nucleicos diana, cuando un entorno fisioquímico complejo y la presencia de un enorme número de moléculas que no son diana genera un elevado nivel de ruido. La figura 1 ilustra un ejemplo de realización, en la que la hibridación de colaboración es proporcionada por la unión de un COM a un SPM y NPM. Usando dicho método de hibridación de colaboración, la unión de dos o más COM solo se produce cuando el complejo se une al ácido nucleico diana. Tal como se ilustra en la figura 1, esto permite modificar con facilidad el método para proporcionar una proporción de señal a ruido deseada aumentando el número de COM que pueden unirse al ácido nucleico diana (es decir, aumentando el número de SPCA y NPCA en el SPM y NPM, respectivamente).

En otra realización, la hibridación de colaboración puede aplicarse también a otros componentes del SGC. Por ejemplo, la unión de los LM a los COM puede ser una reacción estable, tal como se describe en la presente, o la unión puede configurarse para requerir una hibridación colaborativa. En este caso, el LM se diseña de modo que el LM contenga dos segmentos que se unen a COM diferentes. Esta configuración sería similar a la relación de un COM con el SPM y NPM, pero, en lugar de esto, el LM se uniría a un COM-1 y un COM-2. El LM y los COM se diseñan para que tengan los segmentos complementarios apropiados, como el COM, SPM y NPM mostrados en la figura 7A, para proporcionar una hibridación de colaboración.

De forma similar, puede utilizarse otra capa de hibridación de colaboración para la unión de las LP al LM. En este caso, la LP se diseña de modo que la LP contenga dos segmentos que se unen a LM diferentes. Esta configuración sería similar a la relación de un COM con el SPM y NPM, pero,a diferencia de esta, la LP se uniría a un LM-1 y un LM-2. La LP y los LM se diseñan para que tengan los segmentos complementarios apropiados, como el COM, SPM y NPM mostrados en la figura 7B, para proporcionar una hibridación de colaboración.

Por tanto, los métodos para detectar una variación de ácido nucleico diana pueden utilizar la hibridación de colaboración para las reacciones de unión entre cualquiera o todos los componentes en el sistema de detección que proporciona un SGC unido específicamente a un ácido nucleico diana. El número de componentes y los componentes concretos a los que aplicar la hibridación de colaboración pueden seleccionarse basándose en las condiciones de ensayo deseadas, el tipo de muestra que se está ensayando, la sensibilidad de ensayo deseada, etc. Puede utilizarse cualquiera o una combinación de reacciones de unión de hibridación de colaboración para aumentar la sensibilidad y la especificidad del ensayo.

La figura 8 muestra dos ejemplos de configuraciones de SGC que emplean la hibridación colaborativa entre más de dos componentes en el complejo. En la configuración mostrada en la figura 8A, deben producirse dos etapas de hibridación colaborativa para construir un andamiaje de SGC estable. En la configuración mostrada, la SP está flanqueada por dos NP. Se produce una primera hibridación colaborativa entre el SPM/NPM y la SP y las dos NP unidas al ácido nucleico diana. Se produce una segunda hibridación colaborativa entre los COM y SPM/NPM. Puesto que la hibridación colaborativa potencia la especificidad y la proporción de señal a ruido, tal como se describe en la presente, dos etapas de hibridación colaborativa pueden aumentar aún más la robustez del ensayo en un entorno de elevado nivel de ruido. La figura 8B muestra una estrategia diferente para utilizar dos etapas de hibridación colaborativa para mejorar la especificidad. En esta realización, la primera hibridación colaborativa se produce entre la SP y la NP, diseñándose la SP y la NP para que tengan secciones complementarias. En esta configuración, la SP y la NP tienen tres segmentos, un primer segmento que contiene un SPAT o NPAT, que se une al ácido nucleico diana (marcado como "T" en la figura 8B), un segundo segmento que contiene una secuencia complementaria con la respectiva NP o SP (marcado como "P" en la figura 8B), y un tercer segmento que contiene un SPAP o NPAP, que puede unirse al COM (marcado como "L" en la figura 8B). La SP y la NP se hibridan con el ácido nucleico diana y entre sí colaborativamente para que el conjunto de sondas de diana (SP y NP) y el ácido nucleico diana puedan formar un andamiaje estable. Después el SMP y el NMP se hibridan individualmente sobre la SP y la NP, respectivamente, y los COM se hibridan colaborativamente con la SP y la NP.

Tal como se describe en la presente, la configuración de diversos componentes puede seleccionarse para proporcionar una reacción de unión de hibridación de colaboración o estable deseada. Se entiende que, aunque una reacción de unión se ejemplifica en la presente como una reacción estable o inestable, puede modificarse cualquiera de las reacciones de unión, si se desea, con la condición de que se detecte el ácido nucleico diana. También se entiende que la configuración puede variarse y seleccionarse dependiendo del ensayo y las condiciones de hibridación que se van a usar. En general, si se desea que una reacción de unión sea estable, los segmentos de una secuencia de ácido nucleico complementaria entre los componentes estarán en el intervalo, en general, de 16 a 30 nucleótidos, o más. Si se desea que una reacción de unión sea relativamente inestable, tal como cuando se emplea una reacción de unión de hibridación de colaboración, los segmentos de una secuencia de ácido nucleico complementaria entre los componentes estarán en el intervalo, en general, de 10 a 18 nucleótidos. Se entiende que las longitudes de nucleótidos pueden ser un poco más cortas o largas para una hibridación estable o inestable, dependiendo de las condiciones empleadas en el ensayo. También se entiende, tal como se describe en la presente, que pueden usarse nucleótidos modificados, tales como LNA o BNA, para reducir la potencia de unión en la base modificada, permitiendo con ello reducir la longitud del segmento de unión. Así, se entiende que, con respecto a la longitud de los segmentos de ácido nucleico que son complementarios con otros segmentos de ácido nucleico, las longitudes descritas en la presente pueden reducirse aún más, si se desea. Por ejemplo, se ha descubierto que el microARN tiene una secuencia corta de aproximadamente 22 nt. Para usar una pareja de SP-NP, puede incorporarse un número concreto de nucleótidos modificados, tales como LNA o BNA, en el SPAT y/o NPAT para reducir su longitud para que uno o más SGC puedan ensamblarse sobre un microARN diana.

La sensibilidad del ensayo puede potenciarse aún más seleccionando el número de componentes y reacciones de unión empleados en el ensayo. Tal como se describe en la presente, además de proporcionar una o más reacciones de unión de hibridación de colaboración, la señal puede aumentar aumentando el número de SPCA y NPCA en el SPM y NPM, respectivamente. Un mayor número de SPCA y NPCA proporciona un mayor número de COM unidos al ácido nucleico diana. De modo similar, la señal también puede aumentar aumentando el número de segmentos de anclaje a amplificador de marcador en el COM. Un número mayor de segmentos de anclaje a amplificador de marcador proporciona un número mayor de LM unidos a un COM. Además, la señal puede aumentar aumentando el número de segmentos de anclaje a sonda marcadora en el LM. Un número mayor de segmentos de anclaje a sonda marcador proporciona un número mayor de LP unidas a un LM. Se entiende que puede aplicarse cualquiera de estas opciones para aumentar la señal, si se desea. De manera similar y dependiendo de la aplicación, la señal puede reducirse reduciendo de modo apropiado el número de segmentos de anclaje mencionados anteriormente. Por tanto, la invención proporciona mayor flexibilidad para modificar la configuración de componentes del ensayo para proporcionar una detección muy sensible de un ácido nucleico diana. Como alternativa, el nivel de señal también puede reducirse eliminando una capa de dichas moléculas de amplificación intermedias. Por ejemplo, una pluralidad de LP puede unirse directamente a un COM, eliminando el LM. Por otra parte, el nivel de señal también puede aumentar añadiendo una o más capas de dichas moléculas de amplificación intermedias.

Tal como se describe en la presente, la presente invención implica construir un SGC alrededor de un ácido nucleico diana que contiene un variante de nucleótido, tal como una SNV, un variante de múltiples nucleótidos, un sitio de corte y empalme, u otra variación de ácido nucleico. El SGC comprende al menos una SP que puede unirse específica y sensiblemente al variante de nucleótido, tal como una SNV, un variante de múltiples nucleótidos, un sitio de corte y empalme, u otra variación de ácido nucleico, del ácido nucleico diana que tiene suficiente discriminación para que la SP no se una a ácidos nucleicos que no son diana, tales como secuencias que no son SNV, secuencias que no son variantes de múltiples nucleótidos, secuencias no cortadas y empalmadas, y similares. Cuando la SP se une a la SNV del ácido nucleico diana junto con una NP, se ensambla un gran SGC con múltiples capas de componentes de amplificación, tales como SPM/NPM, COM y LM encima de ellos, lo cual proporciona un gran número de LP para acumularse en el SGC para generar una señal suficiente para ser detectada. Dicha señal está presente como un "punto" diferenciado en un sistema formador de imágenes. Por ejemplo, si cada pareja de SPM/NPM puede portar un número A1 de moléculas de COM, cada COM puede unirse a un número A2 de moléculas de LM, y cada LM puede unirse a un número A3 de moléculas de LP, entonces el número total de LP en un SGC es A1 x A2 x A3. Suponiendo que A1, A2 y A3 pueden ser, cada uno, tan grande como 20 o mayor, el número total de LP en un SGC puede ser de hasta 8.000 y mayor. Para la presente invención, un "punto" en la imagen de tinción representa distintivamente un ácido nucleico diana que contiene un variante de nucleótido, tal como una SNV, un variante de múltiples nucleótidos, un sitio de corte y empalme, u otro variante de nucleótido, en la célula. El número mínimo de LP necesario en un SGC se determina mediante la sensibilidad del instrumento de detección, así como la cantidad de señal que puede ser generada por cada LP. En una realización en la que la LP comprende tintes fluorescentes, el número mínimo de LP en un SGC es al menos 800, al menos 1200, al menos 1500, al menos 2000, al menos 2500 o al menos 3000 para producir una señal suficiente para ser detectada por un instrumento. En otra realización, la LP comprende una amplificación de la señal adicional, tal como se describe en la presente. El número mínimo de LP necesario en un SGC puede reducirse al menos a 300, al menos a 600, al menos a 1000 o al menos a 1500. Algunos componentes del andamiaje de SGC pueden unirse no específicamente o quedarse atrapados en una célula que puede "recolectar" un cierto número de LP y generar una señal de falso positivo. Un aspecto importante de la invención son los mecanismos de hibridación colaborativa incorporados en la estructura de SGC para que cualquier componente individual dentro del andamiaje de SGC que está unido no específicamente o atrapado en una célula no pueda generar una señal detectable, o al menos solo una señal débil, que pueda ser distinguida por el sistema como ruido de fondo. Por ejemplo, si la hibridación colaborativa se construye entre el COM y SPM+NPM, el nivel máximo de ruido se genera cuando una molécula de COM está unida no específicamente o atrapada con un nivel de señal falsa a A2 x A3 LP. La proporción teórica de señal a ruido del ensayo es A1 (= A1 x A2 x A3/A2 x A3). Si la hibridación colaborativa se construye entre el LM y el COM, tal como se muestra en las figuras 6A y 7A, el nivel máximo de señal falsa se genera cuando un LM está atrapado con un número A3 de LP. La proporción teórica de señal a ruido del ensayo se transforma en A1 x A2. De modo similar, la proporción de señal a ruido del ensayo es A1 x A2 x A3 con la configuración mostrada en la figura 7B. En realizaciones específicas, esta proporción teórica de señal a ruido es al menos 2, 4, 7, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o 200.

Tal como se describió previamente, son necesarias moléculas más largas con más repeticiones para aumentar la señal generada por el SGC. Sin embargo, las moléculas más grandes pueden tener más dificultades para penetrar en la matriz celular para alcanzar sus sitios de hibridación y es más difícil retirarlas mediante lavado cuando están atrapadas, de modo no específico, en las estructuras celulares, con lo cual se genera ruido de fondo. Además, las moléculas más grandes son más caras de producir. Por tanto, es importante descubrir los tamaños optimizados para cada capa de amplificación en el interior. En una realización, A1 es relativamente grande ya que, tal como se analizó previamente, la unión no específica de SPM o NPM por sí solos no producirá una señal falsa, y un A1 mayor conduce a una mayor proporción de señal a ruido. En una realización de esta invención, A1 está en el intervalo de 4 a 20. En otra realización, A1 está preferiblemente en el intervalo de 6 a 16. Opcionalmente, A2 es relativamente más pequeño, porque la unión no específica o el atrapamiento de un solo COM puede dar como resultado un ensamblaje de A2xA3 LP, lo cual genera un nivel equivalente de ruido de fondo. En una realización, A2 está en el intervalo de 3 a 15. En otra realización, A2 está preferiblemente en el intervalo de 5 a 12. Opcionalmente, A3 puede ser relativamente grande comparado con A2, porque la unión no específica o el atrapamiento de una molécula de LM producirá un nivel relativamente bajo de ruido proporcional a A3. Otro método consiste en añadir una o más capas de amplificación adicionales en el SGC para reducir la longitud de la molécula en las capas individuales.

En otra realización, la invención proporciona una muestra de células fijadas y permeabilizadas, que comprende (A) al menos una célula fijada y permeabilizada que contiene un ácido nucleico diana con una variación de un solo nucleótido; (B) una sonda de variación de un solo nucleótido (SP) que comprende un segmento de anclaje a diana (SPAT) hibridado con una región del ácido nucleico diana que comprende la variación de un solo nucleótido, y una sonda vecina (NP) que comprende un segmento de anclaje a diana (NPAT) hibridado con una región del ácido nucleico diana adyacente al sitio de unión de la SP; (C) un preamplificador de SP (SPM) hibridado con la SP, en la que el SPM comprende una pluralidad de anclajes de colaboración a SP (SPCA), y un preamplificador de NP (NPM) hibridado con la NP, en la que el NPM comprende una pluralidad de anclajes de colaboración a NP (NPCA); (D) una pluralidad de amplificadores de colaboración (COM), cada uno hibridado con el SPM y el NPM, en la que cada COM comprende un primer segmento complementario con el SPCA, un segundo segmento complementario con el NPCA, y un tercer segmento que comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a amplificador de marcador; (E) una pluralidad de amplificadores de marcador (LM), cada uno hibridado con un segmento de anclaje a amplificador de marcador del COM, en la que el LM comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a sonda marcadora; y (F) una pluralidad de sondas marcadoras (LP), cada una hibridada con un segmento de anclaje a sonda marcadora del LM, en la que la LP comprende un marcador detectable; en la que las hibridaciones mencionadas forman un complejo generador de señal (SGC) que comprende el ácido nucleico diana con la variación de un solo nucleótido, una SP, una NP, un SPM, un NPM, una pluralidad de COM, una pluralidad de LM, y una pluralidad de LP, y en la que el SGC proporciona una señal que es detectable y distinguible del ruido de fondo.

En otra realización, la invención proporciona un portaobjetos para tejidos, que comprende (A) un portaobjetos que lleva inmovilizada sobre él una pluralidad de células fijadas y permeabilizadas que comprende al menos una célula fijada y permeabilizada que contiene un ácido nucleico diana con una variación de un solo nucleótido; (B) una sonda de variación de un solo nucleótido (SP) que comprende un segmento de anclaje a diana (SPAT) hibridado con una región del ácido nucleico diana que comprende la variación de un solo nucleótido, y una sonda vecina (NP) que comprende un segmento de anclaje a diana (NPAT) hibridado con una región del ácido nucleico diana adyacente al sitio de unión de la SP; (C) un preamplificador de SP (SPM) hibridado con la SP, en la que el SPM comprende una pluralidad de anclajes de colaboración a SP (SPCA), y un preamplificador de NP (NPM) hibridado con la NP, en el que el NPM comprende una pluralidad de anclajes de colaboración a NP (NPCA); (D) una pluralidad de amplificadores de colaboración (COM), cada uno hibridado con el SPM y el NPM, en el que cada COM comprende un primer segmento complementario con el SPCA, un segundo segmento complementario con el NPCA, y un tercer segmento que comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a amplificador de marcador; (E) una pluralidad de amplificadores de marcador (LM), cada uno hibridado con un segmento de anclaje a amplificador de marcador del COM, en el que el LM comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a sonda marcadora; y (F) una pluralidad de sondas marcadoras (LP), cada una hibridada con un segmento de anclaje a sonda marcadora del LM, en el que la LP comprende un marcador detectable; en el que las hibridaciones mencionadas forman un complejo generador de señal (SGC) que comprende el ácido nucleico diana con la variación de un solo nucleótido, una SP, una NP, un SPM, un NPM, una pluralidad de COM, una pluralidad de LM, y una pluralidad de LP, y en el que el SGC proporciona una señal que es detectable y distinguible del ruido de fondo.

En otra realización, la invención proporciona un kit para la detección in situ de una variación de un solo nucleótido de un ácido nucleico diana en una muestra de células fijadas y permeabilizadas, que comprende (A) al menos un reactivo para permeabilizar células; (B) un conjunto de sondas que se hibridan con la diana que comprende una sonda de variación de un solo nucleótido (SP) que comprende un segmento de anclaje a diana (SPAT) capaz de hibridarse con una región del ácido nucleico diana que comprende la variación de un solo nucleótido, y una sonda vecina (NP) que comprende un segmento de anclaje a diana (NPAT) capaz de hibridarse con una región del ácido nucleico diana adyacente al sitio de unión de la SP; (C) un conjunto de preamplificadores que comprende un preamplificador de SP (SPM) que comprende un segmento capaz de hibridarse con la SP, en el que el SPM comprende una pluralidad de anclajes de colaboración a SP (SPCA), y un preamplificador de NP (NPM) que comprende un segmento capaz de hibridarse con la NP, en el que el NPM comprende una pluralidad de anclajes de colaboración a NP (NPCA); (D) un amplificador de colaboración (COM) capaz de hibridarse con el SPM y el NPM, en el que el COM comprende un primer segmento complementario con el SPCA, un segundo segmento complementario con el NPCA, y un tercer segmento que comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a amplificador de marcador; (E) un amplificador de marcador (LM) capaz de hibridarse con el segmento de anclaje a amplificador de marcador del COM, en el que el LM comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a sonda marcadora; y (F) una sonda marcadora (LP) capaz de hibridarse con el segmento de anclaje a sonda marcadora del LM, en el que la LP comprende un marcador detectable; en el que, tras poner en contacto una muestra de células fijadas y permeabilizadas que comprende una célula que contiene un ácido nucleico diana con una variación de un solo nucleótido, los componentes en los anteriores (B)-(F) forman un complejo generador de señal (SGC) que comprende el ácido nucleico diana con la variación de un solo nucleótido, una SP, una NP, un SPM, un NPM, una pluralidad de COM, una pluralidad de LM, y una pluralidad de LP, y en el que el SGC proporciona una señal que es detectable y distinguible del ruido de fondo. Los componentes del kit pueden estar opcionalmente en un recipiente, y pueden proporcionarse opcionalmente instrucciones para usar el kit.

Tal como se describe en la presente, la invención proporciona métodos para detectar variaciones de ácido nucleico, tales como variaciones de un solo nucleótido (SNV). Puesto que la SP tiene la sensibilidad y la especificidad para detectar una variación de un solo nucleótido en una secuencia diana, se entiende que puede aplicarse un principio similar para detectar otras variaciones en un ácido nucleico diana o secuencias cortas que implican a más de un nucleótido, tales como variantes de corte y empalme de ARN, inserciones, deleciones, redisposiciones de genes y microARN. Por tanto, aunque se ejemplifica mediante la detección de una SNV como una variación de un solo nucleótido, se entiende que los métodos pueden aplicarse a otros tipos de variaciones de ácido nucleico. Por ejemplo, la invención puede adoptarse para que detecte una zona de unión exclusiva, J, formada por dos segmentos de secuencias de ácido nucleico cortadas y empalmadas entre sí. Tal como se muestra en la figura 9, puede diseñarse un conjunto de sondas SP-NP con un SPAT que se extiende a través de la zona de unión (figura 9A) o colocando la zona de unión entre NPAT y SPAT (figura 9B). La figura 9C muestra otro diseño similar al de la figura 8B, en el que el SPAT está acortado y ambas NP y SP tienen un segmento que es complementario con la otra. De esta forma, la SP solo puede hibridarse de forma estable con la diana cuando la NP está presente en la posición adyacente. Como alternativa, NPAT o ambos NPAT y SPAT pueden acortarse en este diseño para lograr el mismo efecto. En los tres diseños mostrados en la figura 9, la SP solo puede hibridarse de forma estable justo al lado de la NP para formar un SGC y generar una señal detectable cuando y solo cuando los dos segmentos en la diana se cortan y empalman juntos en la zona de unión.

La capacidad para detectar el corte y empalme de dos segmentos de ácido nucleico tiene muchas aplicaciones. En el caso de un corte y empalme de ARN o transcrito, un gen se transcribe a ARN, el cual es procesado mediante corte y empalme del ARN para eliminar intrones y producir un ARNm con exones contiguos que proporciona una secuencia codificadora. Algunos genes sufren un corte y empalme alternativo, que se produce de modo natural o en un estado patológico. En el caso de un gen cortado y empalmado de modo alternativo, diferentes exones son cortados y empalmados juntos, produciendo una secuencia diferente. Al igual que con la detección de SNV, los métodos de la invención pueden aplicarse con facilidad a la detección de un ARNm cortado y empalmado de modo alternativo. Tal como se describe en la presente, los métodos se basan en la utilización de una sonda que es específica para un ácido nucleico diana que detecta una variación de ácido nucleico. En el caso de una SNV, la variación es un solo nucleótido, mientras que, en el caso de un gen cortado y empalmado de modo alternativo, la variación de la secuencia puede incluir numerosos nucleótidos diferentes, es decir, una secuencia diferente, como resultado de una zona de unión diferente entre dos exones. En este caso, la sonda SP puede diseñarse para que abarque la secuencia de la zona de unión variante, preferiblemente colocando la zona de unión cerca del centro del SPAT. Como alternativa, el punto de la zona de unión variante puede colocarse entre NPAT y SPAT.

Además de detectar variantes de corte y empalme, los métodos de la invención pueden usarse para detectar redisposiciones de genes. Se sabe que muchos cánceres se caracterizan por redisposiciones de genes, en las que se activan oncogenes o se inactivan represores del crecimiento. De modo similar al corte y empalme de transcritos/ARN, la redisposición de genes produce una variación de secuencia con respecto a un gen no redispuesto. Cuando se transcribe, el ARNm también contiene la variación de secuencia como transcritos de fusión. Al igual que con la detección del corte y empalme del ARN, los métodos de la invención pueden aplicarse con facilidad a la detección de redisposiciones de genes o transcritos de fusión. Por ejemplo, la sonda SP puede diseñarse para que abarque la secuencia de la zona de unión variante en el ADN redispuesto o el transcrito de fusión, preferiblemente colocando la zona de unión cerca del centro del SPAT. Como alternativa, la zona de unión variante puede colocarse entre NPAT y SPAT. Puede emplearse una estrategia similar para detectar inserciones y deleciones. Por ejemplo, el punto de una inserción o deleción puede colocarse dentro del SPAT, preferiblemente cerca del centro del SPAT. Como alternativa, el punto de una inserción o deleción puede colocarse entre NPAT y SPAT.

De una manera similar a la detección de variantes de corte y empalme y redisposiciones de genes, los métodos de la invención pueden adoptarse para detectar ARN específicamente sin detectar el correspondiente ADN en la misma célula. La figura 10A muestra una estrategia diferente, en la que el SPAT en la SP se extiende a lo largo de la zona de unión de dos exones adyacentes. Con los exones adyacentes entre sí en el ARNm, la SP puede unirse al ácido nucleico diana justo al lado de la NP, proporcionando el ensamblaje del SGC en el ácido nucleico diana. Con los exones ampliamente distanciados en el ADN, la SP no puede unirse al ácido nucleico diana y, por tanto, el SGC no puede formarse, lo cual conduce a la ausencia de señal.

En la figura 10B se ilustra otra realización. En esta realización, la SP y la NP presentan hibridación colaborativa entre sí, tal como se muestra en la figura 8B, y la SP y la NP solo pueden unirse de modo estable al ácido nucleico diana cuando se hibridan con el ácido nucleico y entre sí simultáneamente. La SP y la NP no pueden unirse al ADN, porque los sitios de unión de SP y NP no están adyacentes, como en el ARNm. Tal como se muestra en la figura 10B, la SP y la NP se diseñan para que cada una se una a exones distintos en el sitio de una zona de unión de exón. La SP y la NP solo pueden unirse de modo estable a un ARNm diana porque los exones a los que se unen la SP y la NP solo están adyacentes en el ARNm. Por tanto, puede formarse un SGC estable en el ARNm, lo cual conduce a una señal detectable. En el caso del ADN, la SP y la NP no pueden unirse de modo estable ácido nucleico diana, porque los respectivos sitios de unión de SP y NP no están adyacentes en el ADN. En esta situación, no se puede formar un SGC (véase la figura 10B). En la figura 10C se muestra otra realización, en la que la zona de unión de corte y empalme de los exones está colocada entre SP y NP. Tal como se muestra en las figuras 10A, 10B y 10C, los exones están separados en el ADN, pero están cortados y empalmados juntos en el transcrito de ARNm, formando zonas de unión exclusivas en el ARNm que pueden detectarse con facilidad usando los métodos mostrados en la figura 9. Puesto que los exones están separados en el ADN, no se hibridará un conjunto de SP-NP estable adyacente entre sí; no puede formarse un SGC, lo cual no conduce a una señal detectable, como se muestra en la figura 10C.

En otra realización, la invención proporciona un método para la detección in situ de un ácido nucleico diana cortado y empalmado en una muestra de células fijadas y permeabilizadas, que comprende (A) poner en contacto la muestra con una sonda de sitio de corte y empalme (SP) y una sonda vecina (NP), en el que la SP comprende un segmento de anclaje a diana (SPAT) que puede hibridarse específicamente con una región del ácido nucleico diana que comprende el sitio de corte ye empalme y un segmento de anclaje a preamplificador (SPAP), y en el que la NP comprende un segmento de anclaje a diana (NPAT) que puede hibridarse con una región del ácido nucleico diana adyacente al sitio de unión de la SP y un segmento de anclaje a preamplificador (NPAP); (B) poner en contacto la muestra con un preamplificador de SP (SPM) y un preamplificador de NP (NPM), en el que el SPM comprende un segmento que puede unirse a la SP y comprende dos o más anclajes de colaboración a SP (SPCA), y en el que el NPM comprende un segmento que puede unirse a la NP y comprende dos o más anclajes de colaboración a NP (NPCA); (C) poner en contacto la muestra con un amplificador de colaboración (COM), en el que el COM comprende un primer segmento complementario con el SPCA, un segundo segmento complementario con el NPCA, y un tercer segmento que comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a amplificador de marcador; (D) poner en contacto la muestra con un sistema de sonda marcadora (LPS), en el que el LPS comprende una pluralidad de amplificadores de marcador (LM) y una pluralidad de sondas marcadoras (LP), en el que cada LM comprende un segmento que puede unirse a un segmento de anclaje a amplificador de marcador del COM y una pluralidad de segmentos de anclaje a sonda marcadora, en el que cada LP comprende un marcador detectable y un segmento que se hibrida con el segmento de anclaje a sonda marcadora del LM, en el que las hibridaciones mencionadas forman un complejo generador de señal (SGC) que comprende un ácido nucleico diana con el sitio de corte y empalme, una SP, una NP, un SPM, un NPM, una pluralidad de COM, una pluralidad de LM, y una pluralidad de LP; y (E) detectar in situ una señal procedente del SGC en la muestra. En una realización, el SPAT puede hibridarse específicamente con uno de los dos segmentos de ácido nucleico cortados y empalmados. En otra realización, el SPAT puede hibridarse específicamente con ambos de los dos segmentos de ácido nucleico cortados y empalmados.

En otra realización, la invención proporciona una muestra de células fijadas y permeabilizadas, que comprende (A) al menos una célula fijada y permeabilizada que contiene un ácido nucleico diana cortado y empalmado; (B) una sonda de sitio de corte y empalme (SP) que comprende un segmento de anclaje a diana (SPAT) hibridado con una región del ácido nucleico diana que comprende el sitio de corte y empalme, una sonda vecina (NP) que comprende un segmento de anclaje a diana (NPAT) hibridado con una región del ácido nucleico diana adyacente al sitio de unión de la SP; (C) un preamplificador de SP (SPM) hibridado con la SP, en la que el SPM comprende una pluralidad de anclajes de colaboración a SP (SPCA), y un preamplificador de NP (NPM) hibridado con la NP, en la que el NPM comprende una pluralidad de anclajes de colaboración a NP (NPCA); (D) una pluralidad de amplificadores de colaboración (COM), cada uno hibridado con el SPM y el NPM, en la que cada COM comprende un primer segmento complementario con el SPCA, un segundo segmento complementario con el NPCA, y un tercer segmento que comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a amplificador de marcador; (E) una pluralidad de amplificadores de marcador (LM), cada uno hibridado con un segmento de anclaje a amplificador de marcador del COM, en la que el LM comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a sonda marcadora; y (F) una pluralidad de sondas marcadoras (LP), cada una hibridada con un segmento de anclaje a sonda marcadora del LM, en la que la LP comprende un marcador detectable; en la que las hibridaciones mencionadas forman un complejo generador de señal (SGC) que comprende el ácido nucleico diana con el sitio de corte y empalme, una SP, una NP, un SPM, un NPM, una pluralidad de COM, una pluralidad de LM, y una pluralidad de LP, y en la que el SGC proporciona una señal que es detectable y distinguible del ruido de fondo.

En otra realización, la invención proporciona un portaobjetos para tejidos, que comprende (A) un portaobjetos que lleva inmovilizada sobre él una pluralidad de células fijadas y permeabilizadas que comprende al menos una célula fijada y permeabilizada que contiene un ácido nucleico diana cortado y empalmado; (B) una sonda de sitio de corte y empalme (SP) que comprende un segmento de anclaje a diana (SPAT) hibridado con una región del ácido nucleico diana que comprende el sitio de corte y empalme, una sonda vecina (NP) que comprende un segmento de anclaje a diana (NPAT) hibridado con una región del ácido nucleico diana adyacente al sitio de unión de la SP; (C) un preamplificador de SP (SPM) hibridado con la SP, en el que el SPM comprende una pluralidad de anclajes de colaboración a SP (SPCA), y un preamplificador de NP (NPM) hibridado con la NP, en el que el NPM comprende una pluralidad de anclajes de colaboración a NP (NPCA); (D) una pluralidad de amplificadores de colaboración (COM), cada uno hibridado con el SPM y el NPM, en el que cada COM comprende un primer segmento complementario con el SPCA, un segundo segmento complementario con el NPCA, y un tercer segmento que comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a amplificador de marcador; (E) una pluralidad de amplificadores de marcador (LM), cada uno hibridado con un segmento de anclaje a amplificador de marcador del COM, en el que el LM comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a sonda marcadora; y (F) una pluralidad de sondas marcadoras (LP), cada una hibridada con un segmento de anclaje a sonda marcadora del LM, en el que la LP comprende un marcador detectable; en el que las hibridaciones mencionadas forman un complejo generador de señal (SGC) que comprende el ácido nucleico diana con el sitio de corte y empalme, una SP, una NP, un SPM, un NPM, una pluralidad de COM, una pluralidad de LM, y una pluralidad de LP, y en el que el SGC proporciona una señal que es detectable y distinguible del ruido de fondo.

En otra realización, la invención proporciona un kit para la detección in situ de un ácido nucleico diana cortado y empalmado en una muestra de células fijadas y permeabilizadas, que comprende (A) al menos un reactivo para permeabilizar células; (B) un conjunto de sondas que se hibridan con la diana que comprende una sonda de sitio de corte y empalme (SP) que comprende un segmento de anclaje a diana (SPAT) capaz de hibridarse con una región del ácido nucleico diana que comprende el sitio de corte y empalme, y una sonda vecina (NP) que comprende un segmento de anclaje a diana (NPAT) capaz de hibridarse con una región del ácido nucleico diana adyacente al sitio de unión de la SP; (C) un conjunto de preamplificadores que comprende un preamplificador de SP (SPM) que comprende un segmento capaz de hibridarse con la SP, en el que el SPM comprende una pluralidad de anclajes de colaboración a SP (SPCA), y un preamplificador de NP (NPM) que comprende un segmento capaz de hibridarse con la NP, en el que el NPM comprende una pluralidad de anclajes de colaboración a NP (NPCA); (D) un amplificador de colaboración (COM) capaz de hibridarse con el SPM y el NPM, en el que el COM comprende un primer segmento complementario con el SPCA, un segundo segmento complementario con el NPCA, y un tercer segmento que comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a amplificador de marcador; (E) un amplificador de marcador (LM) capaz de hibridarse con el segmento de anclaje a amplificador de marcador del COM, en el que el LM comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a sonda marcadora; y (F) una sonda marcadora (LP) capaz de hibridarse con el segmento de anclaje a sonda marcadora del LM, en el que la LP comprende un marcador detectable; en el que, tras poner en contacto una muestra de células fijadas y permeabilizadas que comprende una célula que contiene un ácido nucleico diana con el sitio de corte y empalme, los componentes en los anteriores (B)-(F) forman un complejo generador de señal (SGC) que comprende el ácido nucleico diana con el sitio de corte y empalme, una SP, una NP, un SPM, un NPM, una pluralidad de COM, una pluralidad de LM, y una pluralidad de LP, y en el que el SGC proporciona una señal que es detectable y distinguible del ruido de fondo.

Los métodos de detección de ácidos nucleicos in situ previamente descritos tiene dificultad para detectar secuencias de ácido nucleico más que cortas que 300 a 150 bases. En la presente invención, puesto que puede generarse una señal detectable con un solo SGC y la longitud combinada de SPAT y NPAT puede ser tan corta como de 20 bases, los métodos de la invención pueden adaptarse con facilidad a la detección de una secuencia de ácido nucleico corta o sustancialmente rota, tal como microARN, una microinserción o una microdeleción. Para la detección de una secuencia de ácido nucleico corta o sustancialmente rota, se diseñan conjuntos de sondas de diana (TP), análogos a los conjuntos de SP-NP descritos en la presente, para hibridarse específicamente con regiones no solapantes adyacentes en el ácido nucleico diana, similar a la función de los conjuntos de sondas de diana que contienen ambas SP y NP, como se describe en la presente. En general, el segmento de la sonda de diana que se une al ácido nucleico diana, TPAT, análogo al SPAT y NPAT, tiene la misma longitud o una longitud similar. Si la secuencia diana es más larga, pueden usarse múltiples conjuntos de TP con múltiples SGC, como se muestra en la figura 11. El uso de múltiples SGC en esta situación puede usarse para aumentar la sensibilidad de detección o para aumentar la robustez de la detección, puesto que uno cualquiera de los múltiples SGC formados con éxito en la diana puede generar una señal detectable. Estas configuraciones son particularmente útiles para detectar dianas de ácido nucleico largas, pero muy degradadas. Pueden diseñarse muchos conjuntos de TP para que sean complementarios con regiones no solapantes del ácido nucleico diana. Debido a que el ácido nucleico diana está en un estado muy degradado, solo son accesibles un número limitado de segmentos cortos. Una señal detectable puede generarse con la condición de que una pareja de TP pueda hibridarse con éxito con la secuencia diana. La figura 11 muestra tres ejemplos de configuraciones. En la figura 11A, hay una pareja de TP en un SGC. El número máximo de SGC que pueden alojarse debe ser al menos múltiples longitudes de SPAT+NPAT. En la figura 11B, al menos una TP de un SGC contiene dos segmentos TPAT que se unen a regiones no solapantes del ácido nucleico diana, siendo esto análogo a la integración de una SP y una NP en una sola sonda. En la configuración mostrada en la figura 11B, el número máximo de SGC dentro de la misma longitud de una secuencia diana puede aumentar, en comparación con la configuración mostrada en la figura 11A, mejorando así la sensibilidad y/o la robustez de la detección. Todas las configuraciones de un solo SGC y las opciones de orientación de los componentes mostradas en las figuras 1 a 8 pueden expandirse, de modo similar, a un escenario de múltiples SGC para detectar secuencias diana más largas. Por ejemplo, la figura 11C muestra múltiples SGC en una configuración similar a la mostrada en la figura 8A cuando se toma en cuenta la flexibilidad espacial de las moléculas de ácido nucleico.

En muchas aplicaciones, resulta muy deseable detectar múltiples dianas en el mismo ensayo. La presente invención proporciona dos estrategias diferentes para satisfacer esta necesidad. La primera estrategia consiste en agrupar, en la que, tal como se muestra en la figura 12A, se ensambla un SGC para cada diana, en la que se proporcionan NPAT y SPAT exclusivos para cada diana, y NPAP y SPAP son los mismos a través de diferentes conjuntos de NP y SP para cada diana. Esto permite que todos los demás componentes del SGC, es decir, NPM, SPM, COM y LPS, sean iguales para todos los SGC. El agrupamiento proporciona una señal detectable cuando una cualquiera de las múltiples dianas está presente en la muestra y es muy útil cuando un grupo de dianas proporciona la misma utilidad biológica o clínica o una utilidad biológica o clínica similar. La segunda estrategia es la multiplexación, en la que, tal como se muestra en la figura 12B, se ensambla un SGC para cada diana y los componentes de cada SGC son exclusivos para ese SGC, y las secuencias de esos componentes se diseñan para asegurarse de que no se produzca hibridación cruzada entre los diferentes SGC. Puesto que la sonda marcadora (LP) en cada SGC tiene un marcador exclusivo y distinguible, puede detectarse una señal exclusivamente distinguible y diferente para la presencia de cada diana. La estrategia de multiplexación es útil en aplicaciones en las que diferentes dianas proporcionan diferentes utilidades biológicas o clínicas. Se entiende que las estrategias de agrupamiento y multiplexación pueden usarse en combinación para detectar múltiples grupos de dianas.

En otra realización, la invención proporciona un método de detección in situ de un ácido nucleico diana, en el que el ácido nucleico diana tiene una longitud de 300 bases o menos, en una muestra de células fijadas y permeabilizadas. Este método puede comprender las etapas de (A) poner en contacto la muestra con un conjunto de sondas de diana (TP), en el que el conjunto comprende al menos dos sondas de diana, en el que cada TP comprende un segmento de anclaje a diana (TPAT) que puede hibridarse específicamente con una región del ácido nucleico diana y un segmento de anclaje a preamplificador (TPAP), en el que el conjunto comprende parejas de TP que pueden unirse a regiones adyacentes no solapantes del ácido nucleico diana; (B) poner en contacto la muestra con un conjuntos de preamplificadores de (TPM), en el que el conjunto comprende al menos una pareja de TPM, en el que cada TPM comprende un segmento que puede unirse a un miembro de la pareja de TP que se une a regiones adyacentes del ácido nucleico diana, y en el que cada TPM comprende dos o más anclajes de colaboración a TP (TPCA); (C) poner en contacto la muestra con un amplificador de colaboración (COM), en el que el COM comprende un primer segmento complementario con el TPCA de un miembro de la pareja de TPM, un segundo segmento complementario con el TPCA del segundo miembro de la pareja de TPM, y un tercer segmento que comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a amplificador de marcador; (D) poner en contacto la muestra con un sistema de sonda marcadora (LPS), en el que el LPS comprende una pluralidad de amplificadores de marcador (LM) y una pluralidad de sondas marcadoras (LP), en el que cada LM comprende un segmento que puede unirse a un segmento de anclaje a amplificador de marcador del COM y una pluralidad de segmentos de anclaje a sonda marcadora, en el que cada LP comprende un marcador detectable y un segmento que se hibrida con el segmento de anclaje a sonda marcadora del LM, en el que las hibridaciones mencionadas forman un complejo generador de señal (SGC) que comprende el ácido nucleico diana, al menos una pareja de TP, al menos una pareja de TPM, una pluralidad de COM, una pluralidad de LM, y una pluralidad de LP; y (E) detectar in situ una señal procedente del SGC en la muestra.

En una realización concreta, el conjunto de sondas de diana comprende una sonda de corte y empalme, SP, y una sonda vecina, NP. La SP comprende un SPAT capaz de hibridarse con una región del ácido nucleico diana que contiene un sitio de corte y empalme, y otra región, SPAP, capaz de hibridarse con un segmento en el preamplificador de SP (SPM). La NP comprende un NPAT capaz de hibridarse con una región del ácido nucleico diana adyacente a la región hibridada con SPAT, y otra región, NPAP, capaz de hibridarse con un segmento en el preamplificador de NP (NPM). El SPM y el NPM comprenden además uno o más segmentos de SPCA y NPCA, respectivamente. Se proporcionan uno o más amplificadores de colaboración, COM, en el que cada uno comprende un primer segmento complementario con el SPCA, un segundo segmento complementario con el NPCA, y un tercer segmento que comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a amplificador de marcador. Cada COM puede unirse a NPM y SPM de forma estable cuando, y solo cuando, el NPCA y el SPCA están presente en proximidad, de modo que se hibrida a NPCA y SPCA colaborativamente. Se proporcionan múltiples amplificadores de marcador (LM) capaces de hibridarse con el segmento de anclaje a amplificador de marcador, en el que el LM comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a sonda marcadora. Se proporcionan múltiples sondas marcadoras (LP) capaces de hibridarse con el segmento de anclaje a sonda marcadora del LM, en el que la LP comprende un marcador detectable. El SPM, NPM, COM, LM y LP forman un complejo generador de señal (SGC) que contiene un número suficiente de marcadores capaces de ser detectados. Cada SGC puede aparecer en un sistema formador de imágenes como un foco de señal. Si no existe la zona de unión de corte y empalme específica, es decir, los dos segmentos dianas no están cortados y empalmados juntos, la SP no se hibridará adyacente a la NP, el SPM no estará presente en proximidad al NPM, lo cual no permite que el COM sea capturado de modo estable a la diana, y no se formará el SGC; por tanto, no puede detectarse ninguna señal.

En una realización, la invención proporciona un método para la detección in situ de una variación de nucleótido de un ácido nucleico diana en una muestra de células fijadas y permeabilizadas, que comprende: (A) poner en contacto la muestra con una sonda de variación de nucleótido (SP) y una sonda vecina (NP), en el que la SP comprende un segmento de anclaje a diana (SPAT) que puede hibridarse específicamente con una región del ácido nucleico diana que comprende la variación de nucleótido y un segmento de anclaje a preamplificador (SPAP), y en el que la NP comprende un segmento de anclaje a diana (NPAT) que puede hibridarse con una región del ácido nucleico diana adyacente al sitio de unión de la SP y un segmento de anclaje a preamplificador (NPAP); (B) poner en contacto la muestra con un preamplificador de SP (SPM) y un preamplificador de NP (NPM), en el que el SPM comprende un segmento que puede unirse a la SP y comprende dos o más anclajes de colaboración a SP (SPCA), y en el que el NPM comprende un segmento que puede unirse a la NP y comprende dos o más anclajes de colaboración a NP (NPCA); (C) poner en contacto la muestra con un amplificador de colaboración (COM), en el que el COM comprende un primer segmento complementario con el SPCA, un segundo segmento complementario con el NPCA, y un tercer segmento que comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a amplificador de marcador; (D) poner en contacto la muestra con un sistema de sonda marcadora (LPS), en el que el LPS comprende una pluralidad de amplificadores de marcador (LM) y una pluralidad de sondas marcadoras (LP), en el que cada LM comprende un segmento que puede unirse a un segmento de anclaje a amplificador de marcador del COM y una pluralidad de segmentos de anclaje a sonda marcadora, en el que cada LP comprende un marcador detectable y un segmento que se hibrida con el segmento de anclaje a sonda marcadora del LM, en el que las hibridaciones mencionadas forman un complejo generador de señal (SGC) que comprende un ácido nucleico diana con la variación de nucleótido, una SP, una NP, un SPM, un NPM, una pluralidad de COM, una pluralidad de LM, y una pluralidad de LP; y (E) detectar in situ una señal procedente del SGC en la muestra.

En otra realización, la invención proporciona una muestra de células fijadas y permeabilizadas, que comprende (A) al menos una célula fijada y permeabilizada que contiene un ácido nucleico diana con una variación de nucleótido; (B) una sonda de variación de nucleótido (SP) que comprende un segmento de anclaje a diana (SPAT) hibridado con una región del ácido nucleico diana que comprende la variación de nucleótido, y una sonda vecina (NP) que comprende un segmento de anclaje a diana (NPAT) hibridado con una región del ácido nucleico diana adyacente al sitio de unión de la SP; (C) un preamplificador de SP (SPM) hibridado con la SP, en la que el SPM comprende una pluralidad de anclajes de colaboración a SP (SPCA), y un preamplificador de NP (NPM) hibridado con la NP, en la que el NPM comprende una pluralidad de anclajes de colaboración a NP (NPCA); (D) una pluralidad de amplificadores de colaboración (COM), cada uno hibridado con el SPM y el NPM, en la que cada COM comprende un primer segmento complementario con el SPCA, un segundo segmento complementario con el NPCA, y un tercer segmento que comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a amplificador de marcador; (E) una pluralidad de amplificadores de marcador (LM), cada uno hibridado con un segmento de anclaje a amplificador de marcador del COM, en la que el LM comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a sonda marcadora; y (F) una pluralidad de sondas marcadoras (LP), cada una hibridada con un segmento de anclaje a sonda marcadora del LM, en la que la LP comprende un marcador detectable; en la que las hibridaciones mencionadas forman un complejo generador de señal (SGC) que comprende el ácido nucleico diana con la variación de nucleótido, una SP, una NP, un SPM, un NPM, una pluralidad de COM, una pluralidad de LM, y una pluralidad de LP, y en la que el SGC proporciona una señal que es detectable y distinguible del ruido de fondo.

En otra realización, la invención proporciona un portaobjetos para tejidos, que comprende: (A) un portaobjetos que lleva inmovilizada sobre él una pluralidad de células fijadas y permeabilizadas que comprende al menos una célula fijada y permeabilizada que contiene un ácido nucleico diana con una variación de nucleótido; (B) una sonda de variación de nucleótido (SP) que comprende un segmento de anclaje a diana (SPAT) hibridado con una región del ácido nucleico diana que comprende la variación de nucleótido, y una sonda vecina (NP) que comprende un segmento de anclaje a diana (NPAT) hibridado con una región del ácido nucleico diana adyacente al sitio de unión de la SP; (C) un preamplificador de SP (SPM) hibridado con la SP, en la que el SPM comprende una pluralidad de anclajes de colaboración a SP (SPCA), y un preamplificador de NP (NPM) hibridado con la NP, en el que el NPM comprende una pluralidad de anclajes de colaboración a NP (NPCA); (D) una pluralidad de amplificadores de colaboración (COM), cada uno hibridado con el SPM y el NPM, en el que cada COM comprende un primer segmento complementario con el SPCA, un segundo segmento complementario con el NPCA, y un tercer segmento que comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a amplificador de marcador; (E) una pluralidad de amplificadores de marcador (LM), cada uno hibridado con un segmento de anclaje a amplificador de marcador del COM, en el que el LM comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a sonda marcadora; y (F) una pluralidad de sondas marcadoras (LP), cada una hibridada con un segmento de anclaje a sonda marcadora del LM, en el que la LP comprende un marcador detectable; en el que las hibridaciones mencionadas forman un complejo generador de señal (SGC) que comprende el ácido nucleico diana con la variación de nucleótido, una SP, una NP, un SPM, un NPM, una pluralidad de COM, una pluralidad de LM, y una pluralidad de LP, y en el que el SGC proporciona una señal que es detectable y distinguible del ruido de fondo.

En otra realización, la invención proporciona un kit para la detección in situ de una variación de nucleótido de un ácido nucleico diana en una muestra de células fijadas y permeabilizadas, que comprende: (A) al menos un reactivo para permeabilizar células; (B) un conjunto de sondas que se hibridan con la diana que comprende una sonda de variación de nucleótido (SP) que comprende un segmento de anclaje a diana (SPAT) capaz de hibridarse con una región del ácido nucleico diana que comprende la variación de nucleótido, y una sonda vecina (NP) que comprende un segmento de anclaje a diana (NPAT) capaz de hibridarse con una región del ácido nucleico diana adyacente al sitio de unión de la SP; (C) un conjunto de preamplificadores que comprende un preamplificador de SP (SPM) que comprende un segmento capaz de hibridarse con la SP, en el que el SPM comprende una pluralidad de anclajes de colaboración a SP (SPCA), y un preamplificador de NP (NPM) que comprende un segmento capaz de hibridarse con la NP, en el que el NPM comprende una pluralidad de anclajes de colaboración a NP (NPCA); (D) un amplificador de colaboración (COM) capaz de hibridarse con el SPM y el NPM, en el que el COM comprende un primer segmento complementario con el SPCA, un segundo segmento complementario con el NPCA, y un tercer segmento que comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a amplificador de marcador; (E) un amplificador de marcador (LM) capaz de hibridarse con el segmento de anclaje a amplificador de marcador del COM, en el que el LM comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a sonda marcadora; y (F) una sonda marcadora (LP) capaz de hibridarse con el segmento de anclaje a sonda marcadora del LM, en el que la LP comprende un marcador detectable; en el que, tras poner en contacto una muestra de células fijadas y permeabilizadas que comprende una célula que contiene un ácido nucleico diana con una variación de nucleótido, los componentes en los anteriores (B)(F) forman un complejo generador de señal (SGC) que comprende el ácido nucleico diana con la variación de nucleótido, una SP, una NP, un SPM, un NPM, una pluralidad de COM, una pluralidad de LM, y una pluralidad de LP, y en el que el SGC proporciona una señal que es detectable y distinguible del ruido de fondo. En realizaciones concretas de las realizaciones de la invención descritas anteriormente, la variación de nucleótido se selecciona del grupo que consiste en una variación de un solo nucleótido, una variación de múltiples nucleótidos, un sitio de corte y empalme, una inserción, una deleción, una redisposición, y similares.

Se entiende que también se proporcionan las modificaciones que no afectan sustancialmente a la actividad de las diversas realizaciones de esta invención, dentro de la definición de la invención proporcionada en la presente. Por consiguiente, los siguientes ejemplos pretenden ilustrar, pero no limitar, la presente invención.

Ejemplo I: Detección de mutaciones puntuales

Este ejemplo describe dos ejemplos de aplicaciones de la invención para detectar mutaciones puntuales en muestras de tejido.

La figura 13 muestra la detección de ARNm de BRAF en secciones de sedimentos fijados en formaldehído y sumergidos en parafina (FFPE) de líneas celulares de melanoma. Se ensayaron las líneas celulares de melanoma negativa (CHL-1, a y a') y positiva (SK-MEL-28, b y b') para la mutación puntual V600E de BRAF. Las células se hibridaron con un sistema de sondas de diana (TPS) que contenía la sonda de detección de tipo salvaje (WDP, secuencia: gagatttcA*ctgtagc, A* es una base modificada BNA) (a y b) y un TPS que contiene una sonda de detección de la mutación BRAF V600E (MDP, secuencia: gagatttcT*ctgtagc, T* es una base modificada BNA) (a' y b') por separado. Se usó una configuración de SGC sustancialmente similar a la mostrada en la figura 1. Se observó una señal con la sonda dirigida a BRAF de tipo salvaje solo en células de tipo salvaje (a), mientras que la mutación V600E fue detectada solo en células V600E positivaS con V600E MDP (b').

La figura 14 muestra el efecto de SPAT de diversa longitud, en el que se usó una configuración de SGC sustancialmente similar a la mostrada en la figura 1. En la figura 14A, se hibridaron células CHL-1 (sin la mutación V600E) con una sonda de mutación V600E que tenía un SPAT de 22 nucleótidos (nt) y mostraron una señal de falso positivo. Por tanto, la figura 14A muestra un alto número de falsos positivos con el uso de un SPAT largo. En la figura 14B, se hibridaron células SK-MEL-28 que contienen una mutación V600E con una sonda de mutación V600E de 15 nt, y mostraron señales específicas. Por tanto, la figura 14B demuestra que el ensayo tiene una mayor especificidad con SPAT más cortos.

La figura 15 muestra el efecto de incluir bases modificadas en un SPAT, en el que se usó una configuración de SGC sustancialmente similar a la mostrada en la figura 1. En la figura 15A, se hibridaron célula SK-MEL-28 (que contienen la mutación V600E) con una sonda de SPAT V600E de 16 nt con bases normales. Así, la figura 15A muestra los resultados de la tinción con bases normales en el SPAT. En la figura 15B, se hibridaron células SK-MEL-28 una sonda de mutación SPAT V600E de 16 nt que contiene una base BNA modificada complementaria con la mutación, y mostraron una mayor sensibilidad con más señales (puntos). Así, la figura 15B muestra unos resultados mejorados con bases modificadas usadas en el SPAT.

La figura 16 muestra la detección de ARNm de BRAF en 2 tejidos de cáncer de colon FFPE que se ha descubierto que son negativos (a y a') y positivos (b y b') para la mutación puntual V600E, en la que se usó una configuración de SGC sustancialmente similar a la mostrada en la figura 1. Aunque se observaron señales en ambas muestras con una sonda dirigida a ARNm de BRAF de tipo salvaje (a y b), se detectó ARNm de la mutación V600E solo en la muestra positiva para la mutación con una sonda diseñada específicamente para la mutación V600E (b'). La presencia de señales de WDP en la segunda muestra indica que tenía una mutación BRAF V600E heterocigótica. En todas las sondas de SNV diseñadas en los ejemplos mostrados en la figura 16, se incorporó una sola base modificada BNA en el SPAT en la ubicación complementaria con el sitio de mutación.

La figura 17 muestra la detección de ARN de muy baja abundancia y degradado. La diana fue el ARNm de HGF, que tiene una longitud mayor que 1000 nt, pero que se ha descubierto que se expresa a un nivel muy bajo. Además, se descubrió que el ARN estaba al menos parcialmente degradado en esta muestra, que es cáncer de pulmón en forma de secciones de tejido fijadas en formaldehído y sumergidas en parafina (FFPE). La figura 17A muestra la imagen de la tinción usando métodos como se describen en las patentes de EE. UU. n.os 7.709.198 y 8.658.361, y un conjunto de sondas de diana que contiene 30 parejas de TP. La sensibilidad de la detección fue baja debido a una combinación de baja expresión y degradación parcial del ARN. La figura 17B muestra una mejor tinción usando el método de la invención con 30 parejas de TP y una configuración de SGC sustancialmente similar a la mostrada en la figura 11A.

La figura 18 demuestra que la invención descrita en la presente proporciona una actuación mejorada en la detección de dianas de ácido nucleico corto, en comparación con los métodos previamente descritos. En la figura 18A, se usó el sistema de detección descrito en las patentes de EE. UU. n.os 7.709.198 y US8.658.361 con una sola pareja de sondas de diana para detectar una secuencia de aproximadamente 50 nt en el ARNm de POLR2A en un sedimento de células Hela. La figura 18A(a) representa la señal generada usando la sonda de diana de POLR2A. La figura 18A(a') representa el nivel de fondo generado usando una sonda de diana contra dapB, un gen de control negativo.

En la figura 18B, se usó un único SGC con una configuración similar a la mostrada en la figura 11A para detectar la misma diana en el mismo tipo de muestra. La figura 18B(b) representa la señal generada usando una pareja de TP dirigida a la misma secuencia de ARNm de POLR2A. La figura 18B(b') representa el nivel de fondo generado dirigiéndose a dapB, un gen de control negativo.

La pareja de sondas de diana en los métodos previamente descritos y en el método mostrado en la figura 18B tienen la misma configuración, es decir, cada sonda comprende un segmento que se une a la secuencia diana y otro segmento que se une a un miembro del sistema de amplificación. En los métodos previamente descritos, este miembro es el preamplificador/amplificador (es decir, dos sondas de diana en la pareja se unen a la misma molécula de preamplificador/amplificador). En la realización específica de la invención usada en la figura 18B, un miembro de la pareja de sondas se une a NPM, y el otro se une a SPM. Los segmentos que se unen a la diana de la pareja de sondas en ambos métodos son iguales. La diferencia aparece en el otro segmento. En los métodos previamente descritos, el otro segmento (que se une al preamplificador/amplificador) es corto, de modo que el preamplificador/amplificador se une a una sola sonda en la pareja de modo inestable. Cuando y solo cuando ambos miembros de la pareja de sondas de diana están presentes en proximidad, el preamplificador/amplificador se unirá a ambas sondas colaborativamente en un estado estable. En esta realización específica del método de la invención, la otra sección es más larga y hace posible que NPM o SPM se unan a NP y SP de forma estable. No se produce una hibridación colaborativa entre SP-SPM o NP-NPM. La hibridación colaborativa en el método de la invención en este ejemplo concreto mostrado en la figura 18B se produce entre COM y SPM+NPM.

La figura 19 demuestra la detección in situ de zonas de unión de corte y empalme específicas que pueden usarse para identificar un variante de corte y empalme específico. Se ha descubierto que la línea celular H596 es positiva para META14, es decir, el exón 14 en el gen MET "se ha saltado", lo que provoca el corte y empalme del exón 15 con el exón 13 en el ARN de MET. La línea celular A549 es el tipo salvaje que contiene todos los exones 12-15 en el ARN de MET. Se usaron sondas dirigidas a las zonas de unión de corte y empalme E12/13, E13/14 y E14/15 para detectar la presencia de las correspondientes zonas de unión en sedimentos celulares FFPE (fijados en formaldehído y sumergidos en parafina) de células H596 y A549. Las imágenes de la tinción se muestran en la figura 19, que muestra la detección sensible y específica de las zonas de unión de corte y empalme diana de E13/15 en células H596 y de E14/15 en células A549, demostrando que el variante de corte y empalme META14 se había identificado correctamente.

Estos resultados demuestran que los métodos para utilizar la hibridación colaborativa pueden utilizarse para detectar variaciones de un solo nucleótido en un ácido nucleico diana en un ensayo in situ.

Claims

REIVINDICACIONES

1 Un método de detección in situ de una variación de nucleótido de un ácido nucleico diana en una muestra de células fijadas y permeabilizadas, que comprende:

(A) poner en contacto la muestra con una sonda de variación de nucleótido (SP) y una sonda vecina (NP), en el que la SP comprende un segmento de anclaje a diana (SPAT) que puede hibridarse específicamente con una región del ácido nucleico diana que comprende la variación de nucleótido y un segmento de anclaje a preamplificador (SPAP), y en el que la NP comprende un segmento de anclaje a diana (NPAT) que puede hibridarse con una región del ácido nucleico diana adyacente al sitio de unión de la SP y un segmento de anclaje a preamplificador (NPAP);

(B) poner en contacto la muestra con un preamplificador de SP (SPM) y un preamplificador de NP (NPM), en el que el SPM comprende un segmento que puede unirse a la SP y comprende dos o más anclajes de colaboración a SP (SPCA), y en el que el NPM comprende un segmento que puede unirse a la NP y comprende dos o más anclajes de colaboración a NP (NPCA);

(C) poner en contacto la muestra con un amplificador de colaboración (COM), en el que el COM comprende un primer segmento complementario con el SPCA, un segundo segmento complementario con el NPCA, y un tercer segmento que comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a amplificador de marcador;

(D) poner en contacto la muestra con un sistema de sonda marcadora (LPS), en el que el LPS comprende una pluralidad de amplificadores de marcador (LM) y una pluralidad de sondas marcadoras (LP), en el que cada LM comprende un segmento que puede unirse a un segmento de anclaje a amplificador de marcador del COM y una pluralidad de segmentos de anclaje a sonda marcadora, en el que cada LP comprende un marcador detectable y un segmento que se hibrida con el segmento de anclaje a sonda marcadora del LM, en el que las hibridaciones mencionadas forman un complejo generador de señal (SGC) que comprende un ácido nucleico diana con la variación de nucleótido, una SP, una NP, un SPM, un NPM, una pluralidad de COM, una pluralidad de LM, y una pluralidad de LP; y

(E) detectar in situ una señal procedente del SGC en la muestra.
2. - Una muestra de células fijadas y permeabilizadas, que comprende:

(A) al menos una célula fijada y permeabilizada que contiene un ácido nucleico diana con una variación de nucleótido;

(B) una sonda de variación de nucleótido (SP) que comprende un segmento de anclaje a diana (SPAT) hibridado con una región del ácido nucleico diana que comprende la variación de nucleótido, y una sonda vecina (NP) que comprende un segmento de anclaje a diana (NPAT) hibridado con una región del ácido nucleico diana adyacente al sitio de unión de la SP;

(C) un preamplificador de SP (SPM) hibridado con la SP, en la que el SPM comprende una pluralidad de anclajes de colaboración a SP (SPCA), y un preamplificador de NP (NPM) hibridado con la NP, en la que el NPM comprende una pluralidad de anclajes de colaboración a NP (NPCA);

(D) una pluralidad de amplificadores de colaboración (COM), cada uno hibridado con el SPM y el NPM, en la que cada COM comprende un primer segmento complementario con el SPCA, un segundo segmento complementario con el NPCA, y un tercer segmento que comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a amplificador de marcador;

(E) una pluralidad de amplificadores de marcador (LM), cada uno hibridado con un segmento de anclaje a amplificador de marcador del COM, en la que el LM comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a sonda marcadora; y

(F) una pluralidad de sondas marcadoras (LP), cada una hibridada con un segmento de anclaje a sonda marcadora del LM, en la que la LP comprende un marcador detectable;

en la que las hibridaciones mencionadas forman un complejo generador de señal (SGC) que comprende el ácido nucleico diana con la variación de nucleótido, una SP, una NP, un SPM, un NPM, una pluralidad de COM, una pluralidad de LM, y una pluralidad de LP, y en la que el SGC proporciona una señal que es detectable y distinguible del ruido de fondo.
3. - Un portaobjetos para tejidos, que comprende:

(A) un portaobjetos que tiene inmovilizada sobre él una pluralidad de células fijadas y permeabilizadas que comprende al menos una célula fijada y permeabilizada que contiene un ácido nucleico diana con una variación de nucleótido;

(B) una sonda de variación de nucleótido (SP) que comprende un segmento de anclaje a diana (SPAT) hibridado con una región del ácido nucleico diana que comprende la variación de nucleótido, y una sonda vecina (NP) que comprende un segmento de anclaje a diana (NPAT) hibridado con una región del ácido nucleico diana adyacente al sitio de unión de la SP;

(C) un preamplificador de SP (SPM) hibridado con la SP, en el que el SPM comprende una pluralidad de anclajes de colaboración a SP (SPCA), y un preamplificador de NP (NPM) hibridado con la NP, en el que el NPM comprende una pluralidad de anclajes de colaboración a NP (NPCA);

(D) una pluralidad de amplificadores de colaboración (COM), cada uno hibridado con el SPM y el NPM, en el que cada COM comprende un primer segmento complementario con el SPCA, un segundo segmento complementario con el NPCA, y un tercer segmento que comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a amplificador de marcador;

(E) una pluralidad de amplificadores de marcador (LM), cada uno hibridado con un segmento de anclaje a amplificador de marcador del COM, en el que el LM comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a sonda marcadora; y

(F) una pluralidad de sondas marcadoras (LP), cada una hibridada con un segmento de anclaje a sonda marcadora del LM, en el que la LP comprende un marcador detectable;

en el que las hibridaciones mencionadas forman un complejo generador de señal (SGC) que comprende el ácido nucleico diana con la variación de nucleótido, una SP, una NP, un SPM, un NPM, una pluralidad de COM, una pluralidad de LM, y una pluralidad de LP, y en el que el SGC proporciona una señal que es detectable y distinguible del ruido de fondo.
4. - Un kit para la detección in situ de una variación de nucleótido de un ácido nucleico diana en una muestra de células fijadas y permeabilizadas, que comprende:

(A) al menos un reactivo para permeabilizar células;

(B) un conjunto de sondas que se hibridan con la diana que comprende una sonda de variación de nucleótido (SP) que comprende un segmento de anclaje a diana (SPAT) capaz de hibridarse con una región del ácido nucleico diana que comprende la variación de nucleótido, y una sonda vecina (NP) que comprende un segmento de anclaje a diana (NPAT) capaz de hibridarse con una región del ácido nucleico diana adyacente al sitio de unión de la SP;

(C) un conjunto de preamplificadores que comprende un preamplificador de SP (SPM) que comprende un segmento capaz de hibridarse con la SP, en el que el SPM comprende una pluralidad de anclajes de colaboración a SP (SPCA), y un preamplificador de NP (NPM) que comprende un segmento capaz de hibridarse con la NP, en el que el NPM comprende una pluralidad de anclajes de colaboración a NP (NPCA);

(D) un amplificador colaboración (COM) capaz de hibridarse con el SPM y el NPM, en el que el COM comprende un primer segmento complementario con el SPCA, un segundo segmento complementario con el NPCA, y un tercer segmento que comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a amplificador de marcador;

(E) un amplificador de marcador (LM) capaz de hibridarse con el segmento de anclaje a amplificador de marcador del COM, en el que el LM comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a sonda marcadora; y

(F) una sonda marcadora (LP) capaz de hibridarse con el segmento de anclaje a sonda marcadora del LM, en el que la LP comprende un marcador detectable;

en el que, tras poner en contacto la muestra de células fijadas y permeabilizadas que comprende una célula que contiene un ácido nucleico diana con la variación de nucleótido, los componentes en los anteriores (B)-(F) forman un complejo generador de señal (SGC) que comprende el ácido nucleico diana con la variación de nucleótido, una SP, una NP, un SPM, un NPM, una pluralidad de COM, una pluralidad de LM, y una pluralidad de LP, y en el que el SGC proporciona una señal que es detectable y distinguible del ruido de fondo.
5. - El método de la reivindicación 1, la muestra de la reivindicación 2, el portaobjetos para tejidos de la reivindicación 3, o el kit de la reivindicación 4, en los que la variación de nucleótido se selecciona del grupo que consiste en:

(a) una variación de un solo nucleótido, en los que la SP es una sonda de variación de un solo nucleótido;

(b) una variación de múltiples nucleótidos, en los que la SP es una sonda de variación de múltiples nucleótidos; (c) un sitio de corte y empalme, en los que la SP es una sonda de sitio de corte y empalme;

(d) una inserción, en los que la SP es una sonda para detectar la inserción;

(e) una deleción, en los que la SP es una sonda para detectar la deleción; y

(f) una redisposición, en los que la SP es una sonda para detectar la redisposición.
6. - El método, la muestra, el portaobjetos para tejidos, o el kit de la reivindicación 5(c), en los que el SPAT puede hibridarse específicamente con uno de los dos segmentos de ácido nucleico cortados y empalmados, o con ambos de los dos segmentos de ácido nucleico cortados y empalmados.
7. - El método, la muestra, el portaobjetos para tejidos, o el kit de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en los que:

(a) el ácido nucleico diana es ARN; y/o

(b) las células fijadas y permeabilizadas están sobre un portaobjetos para tejidos.
8. - El método, la muestra, el portaobjetos para tejidos, o el kit de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en los que:

(a) el SPAT tiene una longitud de 10 a 20 nucleótidos;

(b) el SPAP tiene una longitud de 14 a 28 nucleótidos; y/o

(c) la SP comprende un espaciador entre el SPAT y el SPAP, en los que el espaciador tiene una longitud de 1 a 10 nucleótidos.
9. - El método, la muestra, el portaobjetos para tejidos, o el kit de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en los que:

(a) el NPAT tiene una longitud de 16 a 30 nucleótidos;

(b) el NPAP tiene una longitud de 14 a 28 nucleótidos; y/o

(c) la NP comprende un espaciador entre el NPAT y el NPAP, en los que el espaciador tiene una longitud de 1 a 10 nucleótidos.
10. - El método, la muestra, el portaobjetos para tejidos, o el kit de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en los que:

(a) el SPM tiene una longitud de 50 a 500 nucleótidos;

(b) el SPCA tiene una longitud de 10 a 20 nucleótidos; y/o

(c) el SPM comprende un espaciador entre los dos o más SPCA, en los que el espaciador entre el SPCA independientemente tiene una longitud de 1 a 10 nucleótidos.
11. - El método, la muestra, el portaobjetos para tejidos, o el kit de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en los que:

(a) el NPM tiene una longitud de 50 a 500 nucleótidos;

(b) el NPCA tiene una longitud de 10 a 20 nucleótidos; y/o

(c) el NPM comprende un espaciador entre los dos o más NPCA, en los que el espaciador entre el NPCA independientemente tiene una longitud de 1 a 10 nucleótidos.
12. - El método, la muestra, el portaobjetos para tejidos, o el kit de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en los que:

(a) el COM tiene una longitud de 60 a 900 nucleótidos; y/o

(b) el COM comprende un espaciador entre el primer, segundo y/o tercer segmento, en los que el espaciador entre el primer, segundo y tercer segmento independientemente tiene una longitud de 1 a 10 nucleótidos.
13. - El método, la muestra, el portaobjetos para tejidos, o el kit de la reivindicación 12(b), en los que el tercer segmento del COM comprende un espaciador entre la pluralidad de segmentos de anclaje a amplificador de marcador, en los que el espaciador independientemente tiene una longitud de 1 a 10 nucleótidos.
14. - El método, la muestra, el portaobjetos para tejidos, o el kit de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en los que:

(a) la pluralidad de COM unidos al SPM y al NPM está en el intervalo de 2 a 20;

(b) la pluralidad de LM unidos al COM está en el intervalo de 2 a 20; y/o

(c) la pluralidad de LP unidas al LM está en el intervalo de 2 a 20.
15.- Un método de detección in situ de un ácido nucleico diana, en el que el ácido nucleico diana tiene una longitud de 300 bases o menos, en una muestra de células fijadas y permeabilizadas, que comprende:

(A) poner en contacto la muestra con un conjunto de sondas marcadoras (TP), en el que el conjunto comprende al menos dos sondas de diana, en el que cada TP comprende un segmento de anclaje a diana (TPAT) que puede hibridarse específicamente con una región del ácido nucleico diana y un segmento de anclaje a preamplificador (TPAP), en el que el conjunto comprende parejas de TP que pueden unirse a regiones no solapantes adyacentes del ácido nucleico diana;

(B) poner en contacto la muestra con un conjunto de preamplificadores de TP (TPM), en el que el conjunto comprende al menos una pareja de TPM, en el que cada TPM comprende un segmento que puede unirse a un miembro de la pareja de TP que se une a regiones adyacentes del ácido nucleico diana, y en el que cada TPM comprende dos o más anclajes de colaboración a TP (TPCA);

(C) poner en contacto la muestra con un amplificador de colaboración (COM), en el que el COM comprende un primer segmento complementario con el TPCA de un miembro de la pareja de TPM, un segundo segmento complementario con el TPCA del segundo miembro de la pareja de TPM, y un tercer segmento que comprende una pluralidad de segmentos de anclaje a amplificador de marcador;

(D) poner en contacto la muestra con un sistema de sonda marcadora (LPS), en el que el LPS comprende una pluralidad de amplificadores de marcador (LM) y una pluralidad de sondas marcadoras (LP), en el que cada LM comprende un segmento que puede unirse a un segmento de anclaje a amplificador de marcador del COM y una pluralidad de segmentos de anclaje a sonda marcadora, en el que cada LP comprende un marcador detectable y un segmento que se hibrida con el segmento de anclaje a sonda marcadora del LM, en el que las hibridaciones mencionadas forman un complejo generador de señal (SGC) que comprende el ácido nucleico diana, al menos una pareja de TP, al menos una pareja de TPM, una pluralidad de COM, una pluralidad de LM, y una pluralidad de LP; y (E) detectar in situ una señal procedente del SGC en la muestra.